KR920009523B1 - 토끼암괴사인자를 코우드하는 dna 및 토기암괴사인자 폴리 펩티드의 제조방법 - Google Patents
토끼암괴사인자를 코우드하는 dna 및 토기암괴사인자 폴리 펩티드의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 토끼암괴사인자 mRNA의 산성요소 아가로스겔 전기영동(acid-urea agarose gel electrophoresis)에 의한 분획도(分劃圖).
제2도는 토끼암괴사인자를 코우드하는 클론화 DNA(Plasmid No. pRTNF 802)의 염기배열 결정에 사용된 제한 효소절단부위의 위치와 크기를 도시한 것[실시예 1의 (8)].
제3도는 형질발현 플라스미드 pRTT22의 구축공정(실시예 2)을 도시한 것.
제4도는 형질발현 플라스미드 pRTTG의 구성방법(실시예 3)을 도시한 것.
본 발명은 토끼암괴사인자(rabbit Tumor Necrosis Factor) 또는 그의 주요부를 코드화하는 클론화 DNA의 제조방법 및 상기의 토끼암괴사인자 또는 그의 주요부를 갖거나 또는 함유하는 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 토끼암괴사인자 폴리펩티드 또는 그의 주요부의 아미노산 배열 또는 그의 일부가 변성된 아미노산 배열에 대응하는 염기배열을 갖거나 또는 함유하는 DNA의 제조방법 및 이 토끼암괴사인자 또는 그들과 실질적으로 동등한 생물활성을 갖고 또한 면역학적으로 교차하는 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
카이스웰(Carswell)등은 이미 바실루스 칼메테구에린(Bacillus Calmette-Guerin=Bcg)으로 감염시킨 다음에 엔도톡신으로 처리한 마우스의 혈청중에는 이식한 Meth A 육종에 의한 암을 괴사시키는 물질이 함유되어 있다는 것을 발견하였고, 이 물질을 암괴사인자(Tumor necrosis Factor)라고 명명하였다[Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72, 3666(1975)].
암괴사인자는 마크로파지(macrophage, 大食細胞)로부터 방출되는 생리활성물질로 생각되며, 그의 특징으로는, (i) 어떤 종류의 암세포(예를 들면 Meth A육종)를 이식한 동물에 투여하면 그의 암을 괴사시켜서 치유시키는 것과 (ii) 시험관내에서 어떤 종류의 암세포(예를 들면 마우스의 암세포에 있는 L세포, 인간암 유래의 PC-10 세포)를 상해하지만 정상세포에는 거의 유해한 작용을 미치지 않는 것과, (iii)그의 작용이 종특이적(species specificity)이 아니라는 것이 알려져 있다.
이와 같은 특징을 갖기때문에 암괴사인자는 새로운 타입의 항종양제로서의 개발이 강력히 요망되고 있다. 이와 같은 종류의 암괴사인자에 대해서는 다음과 같이 몇종의 문헌에 보고되어 있고, 또는 특허출원 공개되어 있다.
[Green et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 73, 381(1976),
Matthews et al., Br. J. Cancer, 42, 416(1980),
Ruff et al, J. Immunol., 125, 1671(1980),
Mannel et al., Infect. Immunity, 28, 204(1980),
Haranaka et al., Japan J. Exp. Med. 51, 191(1981),
일본특허공개 소화 57-140725호
" 57-140726호
" 58-141785호
" 58-21621호]
그러나 이들 종래 공지된 것은 토끼, 생쥐, 햄스터(hamster), 또는 모르모트의 체액(예를 들면 혈액)또는 조직을 원료로 하여 이것을 정제하는 것을 특징으로 하는 것으로서, 생산물의 실체가 그다지 명확히 되어 있지 않을 뿐만아니라 원료 공급면, 정제물의 순도의 면 등 스스로도 여러가지 제약이 있다는 것이 확실하다.
그러므로 본 발명자등은 유전자 재조합 기술 응용에 착안하고, 여러 가지 검토를 계속한 결과 토기암괴사인자 유전자의 클로닝에 성공하고 토끼암괴사인자의 실체를 규명하여 본 발명을 완성하였다.
이를 다시 상술하면, 본 발명자들은 우선 토기 마크로파지를 시험관에서(in Vitro) 적당한 유도제와 함께 배양함에 의하여 배양액중에 암괴사인자가 생산유출된다는 것을 확인하고, 다음에 암괴사인자 mRNA를 높은 농도로 마크로 파지중에 생산 축적시켜서 배양조건을 알아내었다.
또 다시 주의하여 연구한 결과 이 암괴사인자를 코드화하는 DNA의 클로닝에 성공하고, 그의 염기 배열을 결정하였다.
이와 같이 하여 상기 클론화 DNA를 삽입한 형질발현벡타(形質發現Vector)로써 형질전환시킨 숙주(宿主)중에서 토끼암괴사인자폴리펩티드를 생산시키는 것에 성공한 것이다.
따라서 이 연구과정에 있어서 상기 암괴사인자가 전구체(煎軀體)로서 작용한다는 것도 발견하였다.
본 발명에 속하는 토끼암괴사인자 또는 그의 주요부를 코우드하는 전형적인 DNA는 다음과 같은 식[1]의 염기배열로서 표시된다.
상기 식[Ⅰ]로서 표시되는 염기배열을 갖는 DNA는 다음의 식[A]로서 표시되는 폴리펩티드를 코우드한다.
토끼암괴사인자를 코우드하는 DNA[1]은 전구체 구조를 취하고, 그의 전구체는 다음의 식[Ⅱ]로서 표시되는 염기배열로 표시되는 DNA 또는 5' 말단에 ATG가 부가된 DNA중에 코우드되어 있다.
상기 식[Ⅱ]로 표시되는 염기배열을 갖는 DNA는 다음의 식[B]로 표시되는 폴리펩티드를 코우드한다.
본 발명 방법을 실시함으로써 얻게 되는 토끼암괴사인자 폴리펩티드 또는 그의 주요부를 코우드하는 DNA에는 상기 식[Ⅰ] 또는 [Ⅱ]의 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA 또는 그의 부분변성된 DNA, 이들의 대립 유전자변이체 DNA도 본 발명의 성질상 당연히 포함되는 것으로 이해하여야 한다.
이하에 이들 DNA를 "본 발명에 속하는 DNA"로 총칭한다.
따라서 이들 유전자를 삽입한 형질발현 벡터로 형질전환된 숙주에 의하여 생산되는 폴리펩티드 또는 그의 분해물이 토끼암괴사인자의 실질적으로 동등한 생물활성을 나타내는 것으로서 상기 토끼암괴사인자와 면역학적으로 교차하는한, 이와 같은 폴리펩티드는 본 발명 방법을 실시함으로써 얻게 되는 폴리펩티드에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
이하 이들 폴리펩티드를 "본 발명에 속하는 폴리펩티드"로 총칭한다.
또한 상기한 부분적으로 변성된 DNA로는 상기 식[Ⅰ] 또는 [Ⅱ]로 표시되는 염기배열에 있어서, (i) 그의 염기배열 일부의 코돈이 결실된 염기배열, 및/또는 (ii) 그의 염기배열 일부의 코돈이 다른 코돈으로 치환된 염기배열을 갖거나 또는 함유하는 DNA 이다.
다음에, 본 발명에 속하는 DNA 및 본 발명에 속하는 폴리펩티드의 제조방법에 대하여 순서에 따라 설명한다.
본 발명에 속하는 토끼암괴사인자 또는 그의 주요부를 코우드하는 DNA는 토끼 마크로파지를 유도제와 함께 배양하고, 이 마크로파지로부터 토끼암괴사인자 mRNA를 함유하는 분획을 분리하고 이것을 함께하여 cDNA 라이브러리(Library)를 작성하고 라이브러리 화법에 의하여 토끼암괴사인자 cDNA를 클론화함에 의하여 제조할 수가 있다.
또한 본 발명방법에 의하여 상기의 토끼암괴사인 cDNA로부터 유도된 DNA를 삽입함에 의하여 형질전환한 숙주를 적당한 배지(培地)중에서 배양하고, 그 숙주의 ce 1ℓ중 도는 배지중으로부터 본 발명에 속하는 토끼암괴사인자 또는 그의 주요부를 갖거나 또는 함유하는 폴리펩티드를 취득할 수 있다.
상기의 토끼암괴사인자 또는 그의 주요부를 갖거나 함유하는 DNA는 상술한바와 같이 그 자체 종래기지의 수법을 이용하여 (i) 그의 염기배열의 일부 코돈이 결실(缺失)한 염기배열, 그리고/또는 (ii) 그 염기배열의 일부 코돈이 다른 코돈으로 치환된 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA로 변성시킬 수 있다.
또한 상기의 DNA 또는 그의 변성된 물질은 그의 코돈 일부를 대응되는 측퇴성 코돈으로 치환하는 것도 가능하다.
이와 같이 하여, 본발명에 의하면 (a) 토끼 마크로파지를 유도제와 함께 배양한다.
(b) 상기 마크로 파지로부터 토끼암괴사인자 mRNA를 함유하는 분획을 분리한다.
(c) 상기 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 단일 스트랜드 cDNA를 합성하고, 다음에 2중 스트랜드 cDNA로 변환한다.
(d) 상기 DNA를 플라스미드에 삽입한다.
(e) 상기 삽입 플라스미드를 숙주에 도입하여 형질전환시키고, cDNA라이브러리를 작성한다.
(f) 상기 라이브러리로부터 혼성화법에 의하여 토끼암괴사인자를 코우드하는 cDNA를 클로닝한다.
(g) 다음에 요망에 따라 상기 cDNA를 부분적으로 변성한다. 는 것에 의하여 토끼암괴사인자 폴리펩티드 또는 그의 주요부를 코우드 하는 염기배열 또는 그의 변성체를 갖거나 함유하는 새로운 클리닝 DNA를 제조할 수가 있다.
이와 같이 하여 얻게되는 DNA를 형질발현 벡터에 삽입하고 이 벡터를 사용하여 숙주를 형질전환하고 그 숙주를 배양함에 의하여 토끼암괴사인자 또는 그의 주요부를 갖거나 함유하는 폴리펩티드를 제조할 수가 있다.
이하 본 발명에 속하는 신규한 DNA의 제조방법 및 이를 사용하는 토끼암괴시인자 또는 그의 주요부를 갖거나 함유하는 폴리펩티드의 제조방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.
Ⅰ. 본발에 속하는 클론화 DNA의 제조.
I-1. 토끼암괴사인자 mRNA의 조제
본 발명 방법에 의하면, 토끼암괴사인자 mRNA를, 예를 들면 이하에 설명하는 방법에 의하여 얻을 수 있다.
토끼에 프로피오니박테리움 아크네스(propionibacteriumacnes), BCG, Zymosan과 같은 세망내피계 활성제를 정맥내 또는 복강내에 주사한다.
투여 7-14 일후에 토끼를 도살하고, 폐포(肺胞), 복강, 혈액, 기타의 조직으로부터 마크로파지를 얻는다.
이 마크로파지를 배양기면 1cm2당 약 2×104∼1×106개 파종하고, 35 내지 38℃, 바람직하게는 약 37℃, 약 5 내지 10% 탄산가스함유 공기중에서, 습도 약 90 내지 100%로 약 30분 내지 2시간 전배양한다.
다음에 유도제로서, 예를 들면 그람음성균으로부터 얻은 엔도톡신, 비람직하게는 예를 들면 대장균, 늑능균, 티프스균 유래의 리포폴리 사카라이드 (lipopolysaccharide)를, 그 다음에는 단백합성 저해제로서, 예를 들면 시클로헥시미드를 가하고, 또다시 배양을 3내지 8시간 계속하여 토끼암괴사인자 mRNA를 상기 마크로 파지중에 축적시킨다.
그러나 전배양은 생략해도 좋다.
엔도톡신의 첨가량은 일반적으로 약 0.1 내지 1000μg/ml 이다.
이때 포르볼(phorbol)-12-미리스테이트-13-아세테이트, 포르볼-12,13-디대카노에이트, 포르볼-12,13-디벤조에이트와 같은 포르볼 에스테르류를 유도제로 하여 약 1∼2000ng/ml를 더 첨가해도 좋다.
단백질합성 저해제의 첨가량은 화합물의 종류등에 따라 다르지만, 예를 들면 시클로헥시미드의 경우 0.1∼50μg/ml이다.
배지로서는 고등동물세포의 배양에 적합한 각종 합성배지가 사용되며, 예를 들면 RPMI-1640, 이글(Eagle)의 MEM배지, 덜베코(Dulbecco)변법에 의한 MEM 배지[이상의 배지조성에 대하여는 예를 들면 宗村庚修編"세포배양매뉴얼", 講談杜(1982) 또는 "Cell and Tissue Culture, J. Paul, E. S. Livingstone Ltd.(1970)에 기재되어 있다]가 열거된다.
배지에는 전체 배지액량의 약 1∼20%의 동물혈청(예를 들면, 소의 태아혈청=Fetal borine serum, 송아지혈청)을 가해 놓는 것이 바람직하다.
배양종료후 세포로부터 통상적인 방법, 예를 들면 키르권(Chirgwin)씨 등의 방법 Biochemistry, 18, 5294(1979)에 의하여 전체 RNA를 추출하고, 다음에 이것을 통상적인 방법에 따라 올리고(dT) 셀룰로즈 또는 폴리(U) 세파로즈(Pharmacia 社) 등을 사용하여 흡착컬럼 크로마토그라피에 가하거나, 또는 뱃취법(batch method)에 의하여 폴리(A) mRNA분획을 분리한다.
상기의 폴리(A)mRNA 분획을 산성요소 아가로스 겔 전기영동 도는 슈코로즈 밀도 구배원심분리에 의하여 토끼암괴사인자 mRNA를 함유하는 mRNA를 농축할 수 있다.
여기에서 얻어진 mRNA가 목적으로 하는 토끼암괴사인자를 코드하는 mRNA를 함유하는 것임을 확인하기 위하여는 mRNA를 단백질로 번역시켜서 그의 생성활성을 조사는 것이 바람직하다.
예를 들면 제노퍼스 래비스(Xenophus laevis=남아프리카산 有瓜雌蛙의 난모세포, 망상적혈구 용해물, 소맥배아와 같은 적당한 단백합성계에 mRNA를 주입 또는 첨가하여 단백질로 번역시키고, 그의 단백질이 마우스 L-929 세포에 대하여 세포상해 활성을 나타내는 것 및 이것의 세포상해 활성이 토끼혈장으로부터 단리한 정제 토끼 암괴사인자(참고예 1에 그의 제조법을 나타내었다)에 대하여 항체(참고예 3에 그의 제작방법을 나타내었다)에 의하여 중화되었다는 것을 확인함으로써 행하여진다.
Ⅰ-2. 토끼암괴사인자 cDNA의 클로닝
Ⅰ-1의 공정에서 얻어진 mRNA를 주형으로 하고 올리고(dT)또는 토끼암괴사인자의 부분 아미노산배열에 대응하는 것으로 생각되는 염기배열을 갖는 합성 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 하여 dATP, dGTP, dCTP, dTTP의 존재하에서 역전사 효소(예를 들면 조류골수성 백혈병 바이러스(AMVC avian myiloblastosis virus)에 의하여 mRNA와 상보적인 단일 스트랜드 cDNA를 합성하고, 알칼리 처리하여 주형 mRNA를 분해, 제거한다.
다음에 이의 단일 스트랜드 cDNA를 주형으로 하여 역전사효소 또는 대장균 DNA중합효소 Ⅰ-큰 단편을 사용해서 2중 스트랜드 cDNA를 합성한다.
여기에서 얻어진 cDNA를 폴리(dG)-폴리(dG) 또는 폴리(dA)-폴리(dT) 단일중합체 신장법[homopolymeric extension method, Noda, M., et al., Nature, 295, 202(1982): Nelson, T.S., "Methods in Enzymology", 68, 41(1979), Academic Press Inc., New York]과 같은 통상의 방법에 따라서 예를 들면 플리스미드 Pbr322의 제한효소 PstⅠ절단부위에 삽입시킨다.
얻어진 재조합 플라스미드를 예를 들면 코헨씨등의 방법[Cohen, Proc. Nat, Acad, Sci, USA, 69, 2110, (1972)]에 준하여 예를 들면 E.coli 1776주와 같은 숙주에 도입하여 형질전환시키고, 테트라사이클린 내성균주를 선택하여 cDNA라이브러리를 제작한다.
이와 같은 cDNA 라이브러리에 대하여는, 플러스·아미너스법에 의한 콜로니·혼성화 시험(Hanahan, D. et.al., Gene, 10, 63, 1980)에 의하여, 목적으로 하는 토끼암괴사인자를 코우드하는 cDNA에 의하여 형질전환시킨 숙주의 클론을, 예를 들면 이하에 기술하는 방법을 사용하여 스크리닝한다.
I-1의 공정에서 얻어진 토끼암괴사인자 mRNA를 함유하는 mRNA를 주형으로 하여32P 표지의 cDNA를 합성하고, 유도 마이너스·플러스로 한다.
전술한 cDNA 라이브러리중에서 유도 플러스·프로브와 강하게 결합하고, 유도 마이너스·프로브와는 거의 결합하지 않는 클론을 선택한다.
여기에서 얻어진 클론이 목적하는 토끼암괴사인자를 코우드하는 cDNA를 함유하는 플라스미드에 의하여 형질 전환된 숙주의 클론이 확인하고, 또다시 스크리닝 하기 위하여 이하의 방법을 행한다.
즉, 상기의 클론으로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 가열 또는 알카리변성에 의하여 단일 스트랜드 cDNA로 하여 니트로셀룰로오스 필터에 고정한다.
여기에 토끼암괴사인자 mRNA를 함유하는 mRNA 분획을 가하여 혼성화시킨후 결합된 mRNA를 용출회수한다. 이것을 지노퍼스 레비스의 난모세포에 주입하고, 회수된 상기의 mRNA도 토끼암괴사인자를 코우드하고 있는지의 여부를 시험한다(이하 혼성화-번역 측정이라고 칭한다).
이상의 방법에 의하여 토끼암괴사인자의 mRNA와 상보성이 있는 염기배열을 하는 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 갖는 형질전환체의 클론을 얻을 수 있다. 이 형질전환체의 클론화 DNA가 토끼암괴사인자의 전체 영역을 코우드하지 않은 경우에는, 또다시 이 형질전환체의 클론화 DNA 단편을 적당한 제한효소에서 잘라내어 이것을32P로 표시한 것을 프로브로 하여 사용하고, 전술한 cDNA 라이브러리를 재스크리닝함에 의하여 보다 큰 크기의 cDNA를 선택하면 좋다.
이와 같이 하여 얻은 몇개의 클론화 DNA 단편에 대하여는 예를 들면 맥삼-길버어트법[Maxam-Gilbert Proc. Nat. Acad. Sici. USA, 74, 560, (1977)]에 따라서 염기배열을 해석하고, 참고 예 2에서 얻어진 공지된, 즉 토끼의 혈장으로부터 별개로 얻어진 토끼암괴사인자의 부분아미노산배열(N말단 및 C말단을 포함)을 코우드하는 염기배열을 탐색하고, 암괴사인자의 전체 번역 영역에 대응하는 염기배열 {상기에서[Ⅰ]로 표시된 염기배열}을 함유하는 cDNA를 선택해 냄에 의하여 토끼암괴사인자의 아미노산 배열을 함유하는 폴리페티드를 코우드하는 염기배열을 갖는 클론화 DNA를 최종적으로 얻을수 있다.
이 클론화된 DNA에는 후술하는 그의 염기배열의 결정에 의하여 전술한 식[Ⅱ]의 염기배열을 갖는 DNA, 즉 식[Ⅱ]의 염기배열에 있어서 제87번째의 코든에 있는 AGT가 GGT로 치환된 염기배열을 갖는 DNA도 존재한다는 것이 분석되었다.
또한 본 발명자등의 연구에 의하면 토끼암괴사인자 또는 그의 주요부의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA는 상기식[Ⅱ]의 염기배열중에 전술한 식[Ⅰ]의 염기배열 또는 그의 제7번째의 코든인 AGT가 GGT로 치환된 염기배열을 갖는다는 것이 밝혀졌다.
이와 같이 하여 얻어진 클론하 DNA는 그대로 사용할수 있으나 필요에 따라 통상적인 방법에 의하여, (i) 그의 염기배열 일부의 코든이 결실한 염기배열, 그리고/또는 (ii) 그의 염기배열 일부의 코든이 다른 코든으로 치환된 염기배열, 을 갖거나 또는 함유하는 DNA로 수정될수 있다.
또한 본 발명의 상기한 클론화 DNA 또는 그의 수정체는 그의 일부 코돈을 대응하는 변질 코돈으로 치환해도 좋다.
II. 토끼암괴사인자 폴리펩티드의 제조
이하에는, 상기한 본 발명에 속하는 클론화 DNA를 사용하여 본 발명의 토끼암괴사인자 또는 그의 주요부를 갖거나 또는 함유하는 폴리펩티드의 제조방법을 상세히 기술한다.
본 발명에 속하는 클론화 DNA를 적당한 형질발현 벡터에 삽입하여 토끼암괴사인자 생산용 벡터를 얻을 수 있다.
벡터로서는 형질 전환시킨 미생물중에서 증식하는 것은 모두 사용할수 있다.
예를 들면 플라스미드(대장균 플라스미드, pBR 322등), 파지(phage, λphage 유도체등), 바이러스(SV40등)가 열거된다.
이들은 단독으로 또는 이들을 조합시켜서, 예를 들면 pBR 322-SV 40혼성체 플라스미드 등의 형으로 사용해도 좋다.
그의 DNA삽입부위도 임의로 선택할 수 있다.
즉 적당한 형질발현 벡터의 적당한 위치를 통상적인 방법에 의하여 적당한 제한효소를 작용시켜서 개열시키고, 그 개열부위에 상기 클론화 DNA를 적당한 길이로 처리하여 삽입시킬 수 있다.
다시 상세히 설명하면, 전술한 식[A]의 아미노산 배열을 코우드하는 DNA 염기배열식 [Ⅰ]의 5'말단에 개시코돈 ATG를 부가하고, 또한 3'말단에 종지코돈(TAA, TAG 또는 TGA)을 함유하는 염기배열을 갖는 DNA단편을 적당한 프로모터 및 샤인·달가노배열(SD)에 연속하여 벡터(예를 들면 플라스미드)에 삽입시켜 상기 비융합형 폴리펩티드 생산용 형질발현 벡터를 구성한다.
또한 상기 융합형 폴리펩티드 생산용 형질발현 벡터는 숙주중에서 발현하여 얻은 오페론의 구조유전자의 코드영역(coding region) 도중에 판독 프레임을 맞추어서 상기 염기배열[Ⅰ]을 포함하는 DNA단편을 삽입하면 좋다.
프로모터로 해서는 예를 들면 lac, tac, phoS, phoA
PL, SV 40초기 프로모터등이 열거된다.
이들 형질발현 벡터를 미생물 또는 동식물세포와 같은 숙주, 예를 들면 대장균에 코헨씨등의 방법 Cohen, proc, Nat, Acad, Sci, USA, 69, 2110(1972)에 의하여 도입함으로써 형질전환체를 얻고, 다음에 이 형질전환체를 배양함에 의하여 폴리펩티드[A]또는 그의 N말단에 메티오닌이 부가된 폴리펩티드(이하 N말단에 메티오닌이 부가된 폴리펩티드[A]를 포함해서, 단지 폴리펩티드[A]로 생략하기도 한다)를 생산시킬 수 있다. 이 생산물은 사용한 프로모터와 형질발현 벡터의 구성법에 의하여, 숙주중의 세포질내 또는 세포질외의 어느것도 축적시킬수 있다.
세포질외에 분비시키는 것에는 분비형 단백의 유전자, 예를 들면 알카리 포스파타제 유전자(phoA)나 인산결합 단백유전자(phoS)를 사용하고, 그들의 시그널 펩티드(signal peptide)를 코우드하는 영역에 연속하여 폴리펩티드[A]를 코우드하는 DNA를 결합시킨 형질발현 벡타를 구축하면 좋다.
이와 같이 하여 얻어진 형질전환체를 각각의 형질전환체에 대응된 적당한 배양조건하에서 목적의 폴리펩티드[A]가 충분히 생산될때까지 배양한후, 배양물로부터 폴리펩티드[A]를 추출한다.
생산된 폴리펩티드[A]가 세포질내에 축적되는 경우는 예를 들면 리소자임 소화와 동결융해(Freezing and thawing)나 초음파 파쇄(sonication), 프렌치프레스 (French press)등에 의하여 숙주세포를 파괴한후 원심분리 또는 여과에서 추출액을 수집한다.
또한 세포질외에 축적된 경우는 예를 들면 윌스키등의 방법(Willsky, J. Bacteriol., 127, 595(1976)]에 따라서 추출할 수 있다.
이와 같이 제조된 폴리펩티드[A]는 일반적인 단백질 정제법, 예를 들면 한외여과, 추석, 이온교환 프로마토그라피, 겔여과, 전기영동, 흡착크로마토그라피등을 조합시킴에 의하여 정제할 수 있다.
폴리펩티드[A] 및 그의 N말단에 메티오닌이 부가된 폴리펩티드 이외의 본발명에 속하는 폴리펩티드는 상기의 방법에 준하거나 또는 공지의 방법을 적당히 조합시켜서 실시함에 의하여 제조할 수 있다.
본발명에 속하는 폴리펩티드의 제재화에 있어서는 용액 및 동결 건조품중 어느것도 좋으나 장기안정성의 점으로부터는 부형제나 안정제를 첨가하는 것이 좋다. 안정화제로서는 예를 들면 알부민, 글로불린, 젤라틴, 푸로타민, 푸로타민염, 갈락토즈, 키시토즈, 만니트, 글루쿠론산, 트레할로즈, 덱스트란, 히드록시에틸 전분, 비이온계면활성제(폴리옥시에틸렌 지방상에스테트, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시 푸로필렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시 푸로필렌 블록폴리마, 소르비탄 지방산에스테르, 서당 지방산에스테르, 글리세린 지방사에스테르)등이 열거된다.
본발명에 속하는 폴리펩티드는 종양세포를 선택적으로 상해시켜서, 암을 갖는 동물의 종양을 치유시키는 것이기 때문에 항종양제로서 유용하다.
투여방법으로 해서는 바람직하게는 비경구투여 또는 국소투여가 있다.
종양세포가 광범위하게 퍼져있는 경우나 전이해서 있는 경우, 새로운 것이 예방등을 목적으로 하는 경우, 정맥내 투여나 근육내투여의 비경구투여가 사용된다.
또한 국소적으로 존재하는 종양조직에 대해서는 직접적인 종양내투여가 요망된다.
투여량는 종양의 종류, 크기, 증상 및 투여방법에 의하여 상이하지만 보통 1회당 5×102∼5×107단위/kg, 바람직하게는 5×103∼5×106단위/kg이다(후기하는 참고예 2 참조)>
본명세서에서는 기재의 간략화를 위하여 다음과 같은 약호를 사용한다.
이하에 실시예 및 참고예를 들어 본 발명방법을 다시 구체적으로 설명하지만, 본발명방법은 이들 실시예에 한정시키는 것은 아니다.
또한 다음과 같은 실시예 설명의 이해를 용이하게 하기 위하여 제1∼제4도를 나타낸다.
제1도는 토끼암괴사인자 mRNA의 산성요소 아가로스 겔 전기영동에 의한 분획도이다[실시예 1의 (1)].
제2도는 토끼암괴사인자를 코우드하는 클론화 DNA(플라스미드 No. pRTNF 802)의 염기배열결정에 사용된 제한효소 절단부위의 크기를 나타낸다[실시예 1의 (8)].
제3도는 형질발현 플라스미드 pRTT22의 구성방법(실시예 2)을 도시하는 것이고, 제4도는 형질발현 플라스미드 pRTTG의 구성방법(실시예 3)을 나타낸다.
[실시예 1]
(1) 토끼 폐포 마크로파지로부터의 암괴사인자 mRNA의 조제 토끼(체중 약 2.5kg)에 푸로피오니박테리움 아크네스 사균체(死菌體)를 1미리당 100mg의 투여량으로 정맥내에 주입하고, 8일후에 도살하였다.
즉시 흉부를 열고 기관을 절개하고, 기관내에 삽입한 튜우브를 끼워서 인산완충화된 생리식염액을 사용하여 폐세정을 반복하고, 폐포마크로파지를 채취하였다.
12마리의 토끼로부터 약 3×109개의 폐포 마크로파지를 10%소의 태아혈청을 함유하는 RPMI-1640배지에 현탁시켜서 펫트리접시(직경 8cm)에 1매당 2×108개 되도록 파종하고, 37℃에서 5% 탄산가스 함유공기 중 습도 90-100%에서 전배양 하였다.
1시간의 전배양후 엔도톡신(대장균 유래의 리포폴리삭카라이드), TPA(포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트) 및 시클로헥시미드(단백합성 저해제)를 각각 최종농도가 10μg/ml, 10ng/ml 및 1μg/ml로 되도록 첨가혼합하고, 다시 배양을 계속하였다.
4∼4.5시간후(통산 5∼5.5 시간)에 배양액을 흡인제거하고, 접시상에 잔류한 마크로파지를 0.6%라우로일사루코신산 나트륨(sodium lauroyl sarcosine)과 6mM 구연산나트륨을 함유하는 5M 구아니딜티오시아네이트 액에 용해하고 균질화 하였다. 이 균질물을 0.1M EDTA를 함유하는 5.7M 염화세슘 수용액상에 가하여 층을 쌓고, 초원심분리기(RPS 27-2 로우터, 日立工機)를 사용하여 26,500rpm에서 20시간 원심분리하고 전체 RNA 분획을 펠리트로서 얻었다. 이것을 0.35M NaCl, 200mM Tris 및 20mM EDTA를 함유하는 7M 요소액 소량에 용해하고, 에탄올 침전으로 하여 회수하였다. 12마리의 토끼로부터 전체 RNA로서 5.2mg이 얻어졌다.
이 전체 RNA 분획을 1mM EDTA를 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH7.4)(이하 TE액이라 한다) 2ml에 용해하고, 65℃에서 5분간 가열하였다.
여기에 NaCl 용액을 0.5M로 되도록 가한후 미리 0.5M NaCl을 함유하는 TE 액에서 평형화한 올리고(dT) 셀루로오즈 컬럼에 가하고, 흡착된 폴리(A) mRNA를 TE액에서 용출함에 의하여 314μg의 폴리(A) mRNA를 얻었다. 여기에서 얻을 폴리(A)mRNA의 200μg을 아가로스 겔 전기영동(겔농도 1%, 6M 요소존재하 pH4)에 가하여, 그의 분자크기에 따라서 7개의 분획으로 나누고, 겔을 용해(70℃, 10분간)시킨후, 물로 포화된 페놀에 의한 추출과 클로로포름에 의한 추출후, 에탄올에 의하여 침전시켜서 각 분획으로부터 폴리(A) mRNA를 회수하였다.
각 분획의 폴리(A) mRNA에 대하여 제노퍼스 래비스의 난모세포를 사용하는 방법으로 토끼암괴사인자 mRNA양을 측정하였다.
난모세포 1개당 약 50ng의 mRNA를 마이크로 인젝션법으로 주입하고, 그의 10개를 100μl의 바아스 배양액(Barth Medium) Gurdon, J. B., J. Embryol. Exp. Morphol., [20], 401(1968)주에서 22℃로 24시간 배양하고 균질화한 후, 그의 원심분리 상징액(10,000rpm, 10분간)을 검체로 하여 L-900 세포상에 활성(참고예 2를 참조)을 지표로 하여 암괴사인자 활성을 측정하였다.
분자크기로 하여 1.6∼2.7kb에 상당하는 분획에 토끼암괴사인자 mRNA를 고농도로 회수하였다.
이 정제폴리(A) mRNA의 비활성은 약 1,230단위/μg RNA이고, 미정제폴리(A) mRNA조제품의 비활성 약320단위/μg RNA에 비하여 약4배로 농축시켰다(제1도).
이 정제폴리(A) mRNA를 주형으로 하여 지노퍼스 래비스의 난모세포 중에서 번역합성된 단백질이 토끼혈장으로부터 조제한 암괴사인자와 동일하다는 것을 참고예3에서 조제한 정제항 토끼혈청 암괴사인자 항체를 사용하여 확인하였다.
즉 폴리(A) mRNA를 지노퍼스 래비스의 난모세포에 주입하고, 바아스 배양액에서 22℃, 24시간 배양한후 균질화하고 그의 원심상징액을 검체로 하였다.
이 검체 100μl에 정제 항 토끼암괴사인자 항혈청 20μl를 가하여 37℃에서 2시간 반응 시킨후, L-929 세포에 대한 세포상해 활성을 측정하였는바, 완전히 중회되었다.
즉 난모세포중에서 번역합성된 단백질은 토끼혈청 암괴사인자와 면역학적으로 동일한 것으로 간주된다.
여기에서 얻어진 정제 폴리(A) mRNA를 이하의 실험에서 사용하였다.
(2) cDNA의 합성
정제 폴리(A) mRNA 4μg을 사용하여 이하에 나타내는 조건에서 cDNA를 합성하였다.
반응액량 : 100μl
50mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.3) : 10mM MgCl2: 70mM CHl: 1mM 디티오트레이틀: 0.5mM dTTP, dCTP, dGTP(단, dCTP는32P로 표시, 비활성 4.4x106cpm/n mole):
30μg 올리고(dT) 12-18' 80단위 조류 골수성백혈병 바이러스 유래역전 사효소.
43℃에서 90분간 반응시킨후 EDTA 수용액으로 반응을 정지시켰다.
페놀클로로포름 혼액(1;1)에 의하여 cDNA-mRNA 복합체를 추출하고, 에탄올에 의하여 침저시켜 회수하였다.
또다시 알칼리 가온처리함에 의하여 mRNA를 분해 제거한후 합성된 단일 스트랜드 cDNA를 에탄올에 의하여 침전시켜 회수하였다.
이의 단일 스트랜드 cDNA의 침전을 하기 조성의 반응완충액 40μl에 용해하였다.
반응완충액 :
0.5mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP : 50mM MgCl2: 70mM KCI: 1.5mM β-메르캅토에탄올: 8단위 대장균 DNA 중합효소 Ⅰ대분획을 함유하는 0.1M 헤페스(Hepes) 완충액(pH6.9).
15℃에서 20시간 반응시켜 2중스트랜드 cDNA를 합성하였다. 반응액에 도데실 황산나트륨 수용액을 가하여 반응을 정시키키고, 2중 스트랜드 cDNA를 페놀-클로로포름 혼액에서 추출하고, 에탄올에 의하여 침저시켜서 회수하였다.
얻어진 2중 스트랜드 cDNA의 침전을 50M초산나트륨(pH 4.5) 1mM ZnSO4, 200mM NaCl, 0.5% 글리세롤 및 S1 뉴클레아제 0.5단위를 함유하는 수용액 100μl에 용해하고, 37℃에서 20분간 반응시켜서 헤어핀구조를 개열시켰다.
EDTA 수용액을 첨가해서 반응을 정지시키고, 페놀-클로로포름 혼액에서 추출하고, 또다시 에테르에서 재추출한후 에탄올에 의하여 침전시켜 cDNA를 회수하였다.
(3) 올리고(dC)테일부가 cDNA의 조재
상기에 의하여 얻어진 2중 스트랜드에 다음 조성의 반응완충액 100μl를 가하여 37℃에서 20분간 반응시켜 2중쇠 cDNA에 올리고(dc)테일을 부가시켰다.
반응완충액 :
1mM CoCl2, 0.1mM 디티오트레이톨, 0.2μg폴리(A), 0.1mM3H/H-dCTP(비활성 5400cpm/pmole) 및 10단위 터미널 데옥시뉴클레오티딜 전이 효소를 함유하는 130mM 카코딜산나트륨-30mm 트리스-HCl 완충액(pH 6.8).
반응은 EDTA 수용액을 첨가해서 정지시키고, 페놀클로로포름 혼액에서 추출하고, 또다시 에테르에서 재추출한후 올리고(dC) 테일부가 cDNA를 에탄올에 의하여 침전시켜 회수하였다.
이것을 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.4), 1mM EDTA 및 100mM NaCl을 함유하는 수용액에 1ml 당 0.2μg의 올리고(dC)테일부가 cDNA를 함유하도록 용해하였다.
(4) 올리고(dC) 테일부가 폴라스미드 pBR322 DNA의 조제
20mM 트리스 HCl 완충액(pH 7.4), 10mM MgCl2, 50mM(NH4)2SO4및 1ml 당 0.1mg의 소혈청(bovine serum) 알부민을 함유하는 수용액 100μl에 pBR322를 10μg 용해하고, 제한효소 pst Ⅰ 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease pst Ⅰ) 15단위를 가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다.
반응종료후 반응액을 페놀 추출하고, 수층으로부터 에탄올 침전에 의하여 DNA를 회수하였다.
얻어진 DNA를 전술한 올리고(dC) 테일부가에 사용한 반응완충액(단3H-dCTP 대신에3H-dGTP 및 80단위의 터미널 데옥시 뉴클레오티딜 전이효소를 함유)의 200μl에 용해하고, 37℃에서 20분간반응시키고, 약 10-15개의 dG잔기를 취하여 넣었다.
반응액을 수포화 페놀-클로로포름 혼액에서 추출하고, 수층으로부터 에탄올 침전에 의하여 올리고(dG) 테일부가 cDNA의 경우와 동일한 완충액에 1ml당 2μg의 올리고(dG) 테일부가 플라스미드 pBR 322 DNA를 함유하도록 용해하였다.
(5) 재조합 플라스미드의 제조
올리고(dG) 테일부가 cDNA 용액 50μl를 올리고(dG)테일부가 pBR 322 DNA용액 50μl와 혼합하고 65℃에서 10분간, 57℃에서 120분간, 45℃에서 60분간 및 실온에서 60분간 배양해서 어닐링을 행하고, 재조합 플라스미드 용액을 조제하였다.
(6) 형질전환체의 선택
상기에서 얻어진 재조합 플라스미드 용액을 사용하여, E. coli×1776 주를 형질전환시켰다.
즉 E. coli×1776주를 디아미노피델산 100μg/ml 및 티미딘 400μg/ml를 보충한 L-브로스(조성 : 1l당 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaC5g, 포도당 1g: pH 7.2) 20ml 중에서, 37℃에서의 흡광도(600nm)가 0.5로 될때까지 배양하고, 균체를 냉각기가 부착된 원심분리기에 수집하고, 50mM CaCl2함유 10mM트리스-HCl 완충액 (pH 7.3) 10ml에 분산시키고, 0℃에서 또다시 원심분리하여 침전시켰다.
수집된 균체를 동일한 완충액 2ml에 분산하고, 0℃에서 5분간 조용히 방치하였다.
이 분산액 0.2ml에 상기의 재조합 플라스미드 용액 0.1ml를 첨가, 혼합하고 0℃에서 15분간 조용히 방치하고, 또다시 42℃에서 2분간 유지시킨후, 전술한 배양에서 사용한 것과 동일조성의 L-브로스 0.5ml를 가하여 1시간 흔들어서 배양시켰다.
이 배양액의 일부를 취하여 상기한 성분과는 달리 테트라사이클린 15μg/ml를 함유하는 L-브로스 한천 플레이트에 펴놓고 37℃에서 약 12시간 배양하고, 테트라사이클린 내성균을 선택하여 cDNA 라이브러리를 제작하였다.
(7) 혼성화 시험
상기의 cDNA 라이브러리에 대하여 토끼암괴사인자를 코우드하는 cDNA를 함유하는 플라스미드를 갖는 형질 전환체를 스크리닝하기 위하여32P 표지의 cDNA를 프로브를 사용하여 콜로니·혼성화 시험을 하나만씨등의 방법[Hanahan, Gene, [10], 63, (1986)]에 따라서 행하였다.
유도플러스 및 유도마이너스의32P 표지의 단일 스트랜드 프로브는 각각 유도플러스 및 유도마이너스 폐포 마크로파지로부터 상기(1)항의 방법에서 얻은 mRNA를 주형으로 하여 (2)항의 방법으로 합성하였다.
단32P-dCTP는 고방사능 비활성의 것을 사용하고, 고농도로 표지화하였다.
이 시험에 의하여 유도플러스의 프로브와 강하게 결합하고, 유도 마이너스의 프로브와는 혼성화하지 않는 염기배열을 포함하는 재조합 플라스미드를 갖는 형질전환체를 선별하였다.
약 2만개의 콜로니로부터 50개의 콜로니가 선택되었다.
다음에 이들 선택된 균주중 20개의 콜로니에 대하여 혼성화·번역 시험을 매니아티스, 티.씨등(Maniatis, T., et al.,(ed) "Molecular Cloning", 329(1980), Cold Spring Harbor Lab]에 기재된 방법에 따라서 행하였다.
각각의 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 니트로셀룰로오스 필터상에서 가열변성시킨후 고정하고, 여기에 상기(1) 항에서 얻어진 토끼암괴사인자 mRNA를 함유하는 폴리(A) mRNA 분획을 가하고, 50℃에서 30분간 반응시키고, 혼성화를 행하였다.
결합된 mRNA를 용출회수한 후 지노퍼스 래비스의 난모세포에 주입하고. 회수된 mRNA가 토끼암괴사인자 mRNA인가 아닌가를 검정하였다.
이 시험에 의하여 토끼암괴사인자 mRNA와 강하게 혼성화되는 cDNA가 함유된 플라스미드를 가지는 균주 3개를 발견하였다. 그중 가장 긴 cDNA(약 750bp)를 갖는 플라스미드로부터 제한효소 Dde Ⅰ에서 DNA 단편을 절취하여 내어서 2차 스크리닝용의 프로브로 하였다.
이 DNA단편을32p로 표시하고, 상기(6)항에서 얻은 cDNA 라이브러리에 대하여 또다시 콜로니·혼성화 시험을 행하고, 표지프로브와 강하게 결합하는 cDNA를 함유하는 플라스미드를 갖는 형질전환체를 선택하였다.
cDNA 라이브러리의 약 6만개의 콜로니중 98개가 양성 콜로니었다.
이들로부터 cDNA를 제한효소 PstⅠ에서 절취하여 내고, 그의 크기를 폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 조사하여 1kbp 이상의 크기를 갖는 17개의 클론을 선택하였다.
이들 중 가장 큰 cDNA를 함유하는 형질전환체(균체번호: χ1776/pRTNF 802, 플라스미드번호: pRTNF 802)에 대하여 클론화 DNA를 단리하고 하기의 방법에서 염기배열을 결정하였다.
(8) 클론화 DNA의 염기배열의 결정
(7) 항에서 선택된 균주(x1776/pRTNF 802)를 디아미노 피멜산 및 티미민 첨가한 L-부로스에서 배양해서 균사체를 얻었다.
이 균사체를 윌키씨등의 방법[Wilkie, Nucleic Acids Res., [7], 859, (1979)]에 따라서 처리하고, 플라스미드 DNA를 얻었다.
이 플라스미드 DNA를 제한효소 pstⅠ으로 분해하고, 정제 분리하여 클론화 DNA를 얻었다.
이 클론화 DNA 단편을 여러가지의 제한효소로 분해하고, 적당한 제한효소 단편에 대하여 각각의 염기배열을 맥샘-길버어트(Maxam-Gilbert) 법에 따라서 탈인산환,32P에 의한 말단표지, 염기특이적 화학분해 반응겔 전기영동 및 방사선 사신등을 결정하였다.
제2도에 염기배열 결정에 사용한 제한효소 절단부와 염기배열을 결정한 방향 및 범위를 화살표로 나타내었다.
그의 염기배열은 다음의 표 1과 같다.
제1∼15번은 cDNA를 벡타에 삽입하기 위하여 부가한 G연쇄 테일이다.
제34∼276번은 암괴사인자의 전구체를 구성하는데 필요한 폴리펩티드를 코우드하는 것으로 추정된 염기배열이다. 제277∼291번의 염기는 참고예 2에서 나타낸 토끼 혈장암괴상니자에 대하여 밝혀진 N말단부분에 상당하는 아미노산 배열을 코우드하고, 제715∼738번의 염기는 C말단부분의 아미노산 배열을 코우드하고 있다(표 1에서으로 둘러싸인 배열).
말단 아미노산(토이신)의 코돈에 연속하여 종지코돈(TGA)이 있다.
[표 1]
토끼암괴사인자의 폴리펩티드를 코우드하는 영역의 염기배열(제277∼738)로부터 번역되는 아미노산잔기수는 154개이고, 그의 아미노산 조성 및 계산분자량을 표 2에 나타낸다.
참고 예 2에서 나타낸 토끼혈장암괴사인자의 아미노산 조성 및 측정분자량과 측정오차의 범위내에서 일치하였다.
[표 2]
[실시예 2]
토끼암괴사인자폴리펩티드의 생산
실시예 1에서 얻어진 토끼암괴사인자를 코우드하는 클론화 DNA(표 1 참조)로부터 제한효소 Ava Ⅰ과 HaeⅡ에 의한 513bp의 DNA 단편을 절취하여 내고, 이것을 tac 푸로모우터영역을 함유하는 DNA 단편의 하향류에 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터를 사용하여 결합시키고, 또다시 플라스미드 pBR322의 테트라싸이클린 내성유전자중에 삽입하고, 형질발현 플라스미드를 구성시켰다.
그의 상세한 것은 이하와 같다(제3도 참조).
실시예 1의 (7)항에서 얻어진 토끼암괴사인자를 코우드하는 DNA의 삽입된 플라스미드 pRTNF802의 305μg에 제한효소 HaeⅡ(600단위) 및 Tth 111Ⅰ(840단위)를 37℃, 60분간 작용시킨후 또다시 65℃, 60분간 작용시키고, DNA 단편을 에탄올 침전으로 하여 회수하였다.
이것을 0.6ml의 TBE액(50mM 트리스, 50mM 붕산, 1mM EDTA]에서 용해시킨후 5%폴리아크릴아미드 전기 영동에서 토끼암괴사인자를 코우드하는 영역을 포함하는 677bp의 DNA 단편(이하 RTNF DNA 단편이라고 칭한다)과 227bp의 DNA단편(이하 HaeⅡ-HaeⅡ 단편이라고 칭한다)를 단리하였다.
이의 RTNF DNA 단편은 표 1중 제121∼797번의 염기 배열에 상당한다.
이의 RTNF DNA 단편 20μg을 제한효소 Ava Ⅰ(320 단위)을 포함하는 0.4ml의 반응완충액[10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5), 50mM NaCl, 6mM MgCl2, 6mM 2-메트캅토에탄올] 중에서 37℃, 35분간 반응시키고, DNA단편을 에탄올 침전으로 하여 회수하였다. 이것을 1mM EDTA를 포함하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH8.0)에 용해하고, 5% 폴리아크릴아미드겔 전기영동에서 표 1중 제258번 내지 제797번에 상당하는 513bp의 DNA 단편(이하 RTNF' DNA단편이라고 칭한다)을 분리하였다.
tac 푸로모우터-여역은 tac프로모우터 벡터-pDR540(Russell, D. R. et al., Gene, 20, 231(1982):P-L Biochemical사(U. S. A로부터 구입)로부터, 제한효소 HineⅢ과 BamHⅠ에서 절취하여 내고, 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동에서 tac 푸로모우터 영역을 포함하는 92bp의 DNA단편(이하 tac 푸로모우터-단편이라고 칭한다)을 단리하였다.
상기 tac 푸로모우터 단편과 RTNF DNA 단편과를 트리에스테르법에서 화학합성한 올리고뉴클레오티드어댑터를 거쳐서 결합시켰다.
이의 합성 어댑터는 다음 식으로 나타내고, 그의 양단이 각각 제한효소 BamHⅠ와 Ava Ⅰ의 인식배열(recognition sequence)을 갖고 있다.
이상의 조작에 의하여 tac 푸로모우터에 연속하여 개시코돈 ATG, 또한 토끼암괴사인자를 코우드하는 전체영역을 포함하는 DNA단편(이하 tac 푸로모우터·RTNF DNA 단편이라고 칭한다)을 얻었다.
플라스미드 pRTNF 802로부터 절취하여 낸 HaeⅡ-HaeⅡ 단편 6μg에 제한효소 SalⅠ(1600단위를 포함하는 반응완충액 10ml 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)200mM NaCl, 6mM MgCl2, 6mM 2-메트캅토에탄올 중에서 37℃, 90분간 반응시킨후 상기와 동일하게 에탄올 침전과 폴리아크리아미드겔 전기 영동에서 99bp의 DNA단편(이하 HaeⅡ-SalⅠ 단편이라고 칭한다.)을 얻었다.
별도로 통상적인 방법에 따라서 플라스미드 pBR322(4362bp)에 제한효소 HindⅢ과 SalⅠ을 작용시켜 암피실린 내성유전자를 포함하는 3741 bp의 DNA단편(이하 HindⅢ-SalⅠ 단편이라고 칭한다)을 절취하여 내었다.
이의 HindⅢ-SalⅠ단편에 앞서 조제한 tac 프로모우터 RTNF DNA 단편과 HaeⅡ-SalⅠ단편을 T4DNA리가제로 결합시킨 것에 의하여 토끼암괴사인자 생산용 형질발현 플라스미드(pRTT 22)를 구성하였다(제3도 참조).
이의 재조합 플라스미드 pRTT 22를 다음과 같은 방법에 따라서 칼슘처리한 E. coli JM 103[lac ⅠQ: Russell, D. R. et al. Gene, 20, 231(1982): P-L Biochemicals 로부터 구입]에 도입하여 형질전환체를 얻었다.
E. coli JM 103의 칼슘처리법은 다음과 같다.
JM 103 주를 LB브로수(조성: 1l당 트립톤 10g, 효모추출물 5g, NaCl 10g: pH7.5) 5ml에 접종하고, 37℃에서 하룻밤 배양시켰다.
그의 균체현탁액 1ml를 100ml의 LB 브로스에 접종하고, 탁도(흡광도 650nm)가 0.6에 될때까지 37℃에서 배양하였다.
빙수중에서 30분간 조용히 방치한후 균체를 원심분리에 의하여 수집하고, 이것을 50ml의 50mM CaCl2에 현탁하고, 0℃에서 60분간 정치하였다.
다음에 원심분리에 의하여 균체를 수집하고, 20%글리세린을 함유하는 50mM CaCl 10mM 다시 현탁하고, 이것을 칼슘처리 E. coli JM 103로 하였다.
재조합 플라스미드 pRTT22를 칼슘처리된 E. coli JM 현탁액에 첨가 혼합시키고, 이것을 빙수중에서 20분간, 42℃에서 1분간, 실온에서 10분간 배양한후, LB 브로스를 가하고 37℃에서 60분간 진탕하였다.
그의 균제현탁액 일부를 25μg/ml의 암피실린을 포함하는 LB한천 플레이트에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 배양한후, 암피실린 내성주를 선택하여 형질전환체를 얻었다.
이의 토끼암괴사인자 생산용의 형질전환체 JM 103/pRTT22로 명명하였다.
이 형질전환체를 암피실린(25μg/ml)을 함유하는 1b브로스에 하룻밤 배양하고, 이 배양액을 10배량의 개량 M9 배지(조성 : 0.7% Na2HPO·12H29 : 0.3% KH2POt0.05NaCl: 0.1% NHtCl: 2mg/1 비타민 B1;p 0.45% 카사미노산; 1mM MgSO40.1mM CaCl: 0.5% 포도당: 25μg/ml 암피실린)에 접종하고, 37에서 1시간 배양한후 이소푸로필-β-D-티오갈락 도시드를 최종농도 1mM이 되도록 첨가하고, 다시 4시간 배양을 계속한 후 원심분리에 의하여 균체를 수집하였다. 균체를 배지용량의 1/10용량의 0.1% 리소자임과 30mM NaCl을 함유하는 50mM 트리스-염산 완충액(pH8.0)에 현탁시키고 0℃에서 30분간 정치하였다.
또 다시 드라이아이스/에탄올욕에서의 동결과 37℃에서의 융해를 반복한후 원심분리에 의하여 균체잔사를 제거한 청정한 추출액을 얻었다. 이의 추출액중의 암괴사인자 활성(L-929 세표상해 활성)은 2.4×103단위/ml이었다. 그리고, 이 세포상태 활성은 참고예 3에 표시한 토끼 혈장으로부터 단리정제한 암괴사인자에 대하는 항체에 의하여 완전히 중화하였다.
[실시예 3]
실시예 1의 (7)항에 나타낸것과 같이 cDNA 라이브러리로부터 콜로니-혼성화에 의한 2차 스크리닝에서 선택된 97개의 양성 콜로니중 1kbp이상의 크기를 갖는 cDNA가 삽입된 것은 17콜로니였다.
이의 17클론에 대하여 각각 cDNA를 제한효소 PstⅠ로 절취하여 내고, 각종 제한효소를 사용하여 제한효소 지도를 작성하였더니 15클론에 대해서는 실시예 1에 나타낸것과 같이 cDNA를 포함하는 것이었으나 2클론에 대하여는 토끼암괴사 인자를 코우드하는 영역으로부터 약 250bp 하향류에 제한효소 Ava Ⅰ의 절단인식부위를 새롭게 갖는 것이었다. 이 Ava Ⅰ절단 인식부위는 상기 실시예 1에서 사용한 15클론에는 인지되지 않는다.
이의 별종의 cDNA의 삽입된 플라스미드(pRTNF865)에 대하여 실시예 1의 (8)항에 나타낸 것과 동일하게 맥삼-길버어트법에서 암괴사인자를 코우드하는 영역에 대하여 염기배열을 결정하였다.
그 결과 표 1에 나타낸 염기배열의 제285번으로부터 741번의 종지코돈 TGA의 범위내에서 유일한 제295번의 A가 G로 변환하였다.
이것은 실시예 1에서 얻어진 cDNA의 대립유전자변이체로 생각된다. 거기에서 이 플라스미드 pRTNF865에 삽입된 cDNA의 암괴사인자 코우드영역으로 여겨지는 단편, 즉 표 1중 제285번으로부터 제583번에 상당하고, 단 295번의 염기가 G인 단편을 제한효소 Ava Ⅰ에서 절취해 내었다(이하 AvaⅠ-AvaⅠ단편이라고 칭한다).
이 AvaⅠ-AvaⅠ단편을, 실시예 2에 나타낸 형질발현 플라스미드 pRTT22로부터 암괴사인자 코우드 영역중의 동일한 위치가 제한효소 AvaⅠ의 부분소화로 발취된 플라스미드에 삽입하고, AvaⅠ-AvaⅠ단편이 정확한 배양으로 삽입된 것을 선택하고, 이 플라스미드를 pRTTG로 명명하였다.(제4도 참조).
이 형질발현 플라스미드를 실시예 2에 나타낸 것과 동일한 방법으로 E. coli JM 103에 도입하고, 형질전환체를 얻어서 또다시 배양을 행하고, 그의 균체로부터 추출액을 얻었다. 이 추출액중의 암괴사인자 활성을 측정하였더니 2.6×103단위/ml이었다.
이것은 실시예 1에 나타낸 암괴사인자와는 유일한 1개소만 아미노산이 다르고, 즉 N말단으로부터 7번째의 아미노산(개시코돈 ATG에 유래하는 Met를 제거)이 Ser로부터 Gly로 변한 폴리펩티드가 생산되고, 또한 본물질이 암괴사인자 활성을 갖고 있는 것을 나타내는 것이다.
[참고예 1]
토끼혈장암괴사인자의 단리정제
토R(체중 2.5∼3.0kg)에 푸로피온박테리움 아크네스 균사체 50ml을 귀의 정맥에 주사하였다.
8일후에 엔도톡신(대장균 유래의 리포폴리사카라이드)100μg을 귀 정맥에 의하여 주사하고, 2시간후엔 심장으로부터 전체 채혈하였다.
채취한 혈액에 100ml당 100단위의 헤파린나트륨을 가한후, 5,000rpm으로 30분간 냉각 원심분리를 행하고, 혈구 및 불용고형물을 제거하였다.
400마리의 토끼로부터 혈장 24l가 얻어졌다.
이 혈장 24l에 EDTA 24g 및 셀라이트 240g을 가하여 1시간 교반한후 구공직경 3μ, 1μ 및 0.2μ의 필터에서 순차 여과하였다.
여액 24l에 0.04M 트리스-HCl 완충액(pH 7.8) 12l를 가한후, 0.1M NaCl을 함유하는 0.04M 트리스-HCl 완충액(pH 7.8)으로 충분히 평형화한 DEAE-세팔로스 CL-6B(팔마시아사)의 컬럼(27×45cm)에 부가하였다. 다음에 컬럼 평형화 완충액 75l 및 0.15M NaCl을 함유하는 0.04M트리스-HCl 완충액(pH 7.8) 50l로 순차적으로 세정한후, 0.18M NaCl을 포함하는 0.04M 트리스-HCl 완충액(pH 7.2)을 사용하며 용출하였다. 용출액은 8l씩 분획하여 활성분획을 수립하였다. 이 활성분획에 동일 용량의 0.04M트리스-HCl 완충액(pH 7.8)을 가해서 희석한후 DEAE-셀팔로즈 CL-6B의 컬럼(10×13cm)에 부가하였다.
다음에 0.1M NaCl을 함유하는 0.04M 트리스-HCl 완충액(pH 7.8) 1l를 사용하여 세정한후 0.18M NaCl을 함유하는 0.04M 트리스-HCl 완충액(pH 7.2) 5l를 사용하여 용출하였다.
용출액을 250ml씩 분획하여 L-929세포에 대하는 세포상해 활성을 갖는 분획을 수집하였다.
다음에 이 용출액을 용기에 옮겨 70℃의 탕욕중에 침잠시키고 교반하면서 용출액의 온도가 60℃로 될때까지 가열하였다.
그후 60℃의 다른 탕욕에 옮기고, 30분간 가열처리한 후, 신속하게 4℃로 냉각하였다.
가열처리한 용액을 한외여과에 의하여 농축하였다.
0.1M NaCl을 함유하는 0.005M 인산 완충액(pH 7.4)으로 충분히 평형화한 세파크릴 S-200(팔마시아社)의 컬럼(5×80cm)에 상기 농축액을 가하고, 이 완충액으로 용출하였다.
40ml씩 분획하여 활성분획을 채취하고, 한외여과에 의하여 농축하였다.
겔여과에 의하여 얻어진 활성분획의 농축액을 Zn2+킬레이트 세팔로즈 컬럼에 가하였다.
포라드, 제이씨등이 기재한 방법(porath, J. et al., Nature, 258, 598, 1975)에서 얻어진 킬레이트 세팔로즈(이미노 디아세트산 고정화수지)를 충전한 컬럼(1.6×20cm)에 1mg/ml의 염화아연 수용액 120ml을 흐르게 하였다. 다음에 0.1M NaCl을 함유하는 0.05M 인산 완충액(pH 7.4)으로 충분히 평형화한후, 상기의 공정에서 얻어진 농축액을 가하고, 이 완충액으로 용출한 비흡착분획을 채취하였다.
앞의 정제공정에서 얻어진 활성분획을 농축하고, 0,15M NaCl을 함유하는 0.005M 인산 완충액(pH 7.4)에서 충분히 평형화한 도요파알 HW-55(동양소다주식회사)의 컬럼(1.5×90cm)에 가하였다.
이 완충액으로 용출하여 활성분획을 채취하고, 이것을 정제 토끼혈장암괴사인자로 하였다.
[참고예 2]
토끼혈장암괴사인자의 여러가지 성징
참고예 1에서 단리정제한 토기혈장암괴사인자에 대하여(i)마우스 L-929세포에 대하는 세포상해 활성, 및 (마우스에 이식한 Meth A육종에 대한 항종양 활성을 평가하였다.
L-929 세포상해의 측정법은 다음과 같다.
검체를 순차적으로 배지에서 희석한 시료 0.1ml와 악티노마이신 D(2μg/ml)를 포함하는 L-929세포의 5×105개/ml의 현탁액 0.1ml을 96개 접시의 조직배양용 마이크로플레이트(플로우·래버로토리 社)에 가한다. 배지는 1v/v%의 소 태아혈텅을 포함하는 이글(Eeagl)의 미니엄·에센셜 배지를 사용한다.
마이크로플레이트를 5%의 탄산가스를 함유하는 공기중에서 37℃로 18시간 배양한다.
배양종료후 글루타트알데히드 20μl를 가하고, 생성된 잔류세포를 고정한다.
고정후 마이크로플레이트를 세정 건조하여, 0.05%메틸렌블루 용액을 0.1ml가하고, 고정된 세포를 염색한다. 여분의 메틸렌블루를 씻어내고 건조한후 고정된 세포에 부착된 메틸렌블루를 0.36N 염산으로 추출하고, 그의 665nm에 있어서 흡광도를 타이터-텍크·멀티스캔(플로우·래보러토리 社)으로 측정한다. L-929세포의 50%를 치사시키는데 필요한 생리활성량을 1단위/ml로 정의하고, 시료를 가하지 않은 대조흡광도의 50%값에 상당하는 시료의 희석율을 그라프 또는 계산에 의하여 구하고, 그 희석율의 역수를 시료의 생리활성량(단위/ml로 표기한다)으로 한다.
정제 토끼혈장암괴사인자 1mg 단백당의 L-929 세포상해 활성을 약 3×107단위이었다.
Meth A 육종담암 마우스(肉腫擔癌mouse)에 대한 항종양효과의 평가방법은 다음과 같다.
BAL B/C 마우스의 복부내피에 2×105개의 Meth A 세포를 이식하고, 7일후에 6∼7mm 직경의 종양이 형성된 마우스를 선택하고, 그의 종양국소에 정제 토끼혈장암 괴사인자 3×104단위를 투여하였다.
투여후 24시간이내에 종양부위의 괴사반응을 인지하고, 14일이내에 완치하였다.
정제된 토끼 혈장암괴사인자에 대하여 그의 분자량을 8M 요소존재하 및 비존재하에 있어서 고속 액체크로마토그라피에 의한 겔여과 분석으로 측정하였다.
그 결과 토끼 혈장유래의 암괴사인자의 분자량을 요소 비존재하에서는 약 4.5만 달톤, 요소존재하에서는 단일의 폴리펩티드로 해리하고, 그의 분자량은 약1.6만 달톤으로 구하여졌다.
요소존재하에서, 즉 완전해리상태의 분자량이 토끼암괴사인자의 기본구성단위의 분자량이라고 생각된다.
토끼혈장암괴사인자의 아미노산 조성은 염산 가수분해 한후 올토알데히드를 사용한 형광법에 의한 미량 아미노산 분석시스팀(鳥津製作所)에 의하여 구하였다.
그 결과를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
또한, N말단 C말단을 포함하는 부분 아미노산 배열을 각각 에드만 분해법 및 히드라진 분해법과 카드복시펩티다제를 사용하는 효소법으로 분석하였다.
그 결과 N말단 C말단부분의 아미노산 배열은 이하에 나타내는 구조로 되어 있었다.
[참고예 3]
항토끼혈장암괴사인자 항체의 제조
참고예 1에서 얻어진 정제 토끼혈장암괴사인자 1×106단위를 호함하는 용액을 동량의 프로인드 완전 보조제에 유락화하고, 그것을 모르모토의 동쪽 피하 여러곳에 주사하였다.
그후, 1, 3 및 6주후에 동일한 방법로 면역하였다.
다시 8주후에 동량의 정제 토끼혈장암괴사인자를 수산화 알루미늄겔과 함께 복강내에 주사하였다.
최초면역으로부터 9주후에 심장으로부터 전체 채혈하고, 원심분리에 의하여 혈청을 분리함에 의하여 항토끼혈장 암괴사인자 항체를 포함하는 항혈정을 얻었다.
이 항혈청을, 정상토끼 혈청성분을 흡착시킨 세팔로스4B(팔마시아 社) 컬럼에 3회 반복하여 통과시킴에 의하여 비특이적인 항체를 제거하고, 토끼혈장암괴사인자에 대한 특이항체만을 포함하는 정제 항혈청을 얻었다.
이 항혈청은 면역전기영동법 및 겔내 2중확산법에 의하여 정제 토끼혈장암괴사인자와의 사이에만 단일의 침강선을 형성하였다. 이 정제 항혈청을 약 60,000배 희석한 것은 토끼혈장암괴사인자의 L-929세포상해활성(cytotoxic activity)500단위를 50%중화하는 능력을 갖는다.
Claims (22)
- 토끼 마크로파지를 유도제와 함께 배양하고, 그의 마크로파지로부터 토끼암괴사인자 mRNA가 함유된 분획을 분리하고, 이것을 기초로 하여 cDNA 라이브러리를 작성하고, 혼성화법에 의하여 토끼암괴사인자 cDNA를 클론화하는 것을 특징으로 하는, 토끼암괴사인자 또는 그의 주요부를 코우드하는 DNA의 제조방법.
- 토끼 마크로파지를 유도제와 함께 배양하고, 그의 마크로파지로부터 토끼암괴사인자 mRNA를 함유하는 분획을 분리하고, 이것을 기초로 하여 cDNA 라이브러리를 작성하고, 혼성화법에 의하여 토끼암괴사인자 cDNA를 클론화하고, 다음에 이것의 클론화한 DNA 또는 이것의 변형체를 형질발현벡터에 삽입하여 형질전환시킨 숙주를 배양하고, 생산된 토끼암괴사인자 또는 그의 주요부를 갖거나 또는 함유하는 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법.
- 토끼암괴사인자의 아미노산배열 또는 그의 주요부를 코우드하는 염기배열 또는 그의 변형된 염기배열을 갖거나 또는 함유하는 DNA를 형질발현벡터에 삽입하고, 그의 벡터를 이용하여 숙주를 형질전환시키고, 이 숙주를 배양하고, 이 숙주로부터 생산되는 토끼암괴사인자 또는 그의 주요부를 갖거나 또는 함유하는 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법.
- 토끼암괴사인자 폴리펩티드 또는 그의 주요부를 코우드하는 염기배열 또는 그의 변형체를 갖는 DNA를 제조할 때 다음과 같은 (1) 내지 (7)의 공정을 행하는 것을 특징으로 하는 DNA의 제조방법:(1) 토끼 마크로파지를 유도제와 함께 배양한다:(2) 이 마크로파지로부터 토끼암괴사인자 mRNA를 포함하는 분획을 분리한다:(3) 상기 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 단일 스트랜드 cDNA를 합성하고, 다음에 2중 스트랜드 cDNA로 변환한다:(4) 상기 DNA를 플라스미드에 삽입한다:(5) 상기 변환 플라스미드를 숙주에 도입하여 형질전환시켜 cDNA 라이브러리를 작성한다:(6) 상기 라이브러리로부터 혼성화법에 의하여 토끼암괴사인자를 코우드하는 cDNA를 클로닝한다:(7) 다음에 소망에 따라 상기 cDNA를 부분적으로 변형한다.
- 제1 또는 4항에 있어서, 상기 식 [A]로 표시되는 아미노산 배열에서 7번째의 Ser이 Gly로 변환된 아미노산 배열에 대응하는 염기배열을 갖거나 또는 함유하는 DNA를 제조하는 것을 특징으로 하는 DNA의 제조방법.
- 제1 또는 제4항에 있어서, 상기 식[Ⅰ]로 표시되는 제조방법에서 제7번째의 코돈이 AGT가 GGT 또는 그의 변질된 코돈으로 변환된 염기배열을 갖거나 또는 함유하는 DNA를 제조하는 것을 특징으로 하는 DNA의 제조방법.
- 제1 또는 제4항에 있어서, 상기 식[B]로 표시된 아미노산 배열에서, 제87번째의 Ser가 Gly로 변환된 아미노산 배열에 대응하는 염기배열 또는 그의 변형체를 갖거나 함유하는 DNA를 제조하는 것을 특징으로 하는 DNA의 제조방법.
- 제1 또는 제4항에 있어서, 상기 식[Ⅱ]로 표시되는 염기배열에서 제87번의 코돈인 AGT가 GGT 또는 그의 변질된 코돈으로 변환된 염기배열을 갖는 DNA를 제조하는 것을 특징으로 하는 DNA의 제조방법.
- 제5항 내지 제12항중 어느 하나에 있어서, 상기 DNA의 5' 말단에 개시코돈 ATG를 갖는 염기배열을 갖거나 또는 함유하는 DNA를 제조하는 것을 특징으로 하는 DNA의 제조방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 대장균중에서 증식하여 얻은 플라스미드를 벡터로서 사용하는 것을 특징으로 하는 토끼암괴사인자 또는 그의 주요부를 갖거나 또는 함유하는 폴리펩티드의 제조방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 대장균을 숙주로 사용하는 것을 특징으로 하는 토끼암괴사인자 또는 그의 주요부를 갖거나 또는 함유하는 폴리펩티드의 제조방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 토끼암괴사인자의 아미노산 배열 또는 그의 주요부를 갖거나 또는 함유하는 폴리펩티드에서 그 자체 또는 그의 분해물이 토끼암괴사인자 폴리펩티드와 실질적으로 동등한 생물활성을 갖고, 또한 면역학적으로 교차하는 폴리펩티드를 제조하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법:
- 제2 또는 제3항에 있어서, 상기 식[A]로 표시되는 아미노산 배열에서 제7번의 Ser가 Gly로 변환된 아미노산 배열을 갖거나 또는 함유하는 폴리펩티드를 제조하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 식[B]로 표시되는 아미노산 배열에서 제8번의 Ser이 Gly로 변환된 아미노산 배열을 갖거나 또는 함유하는 폴리펩티드를 제조하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 식 [A] 혹은 [B] 또는 식[A]의 제7번 식 [B]의 제87번의 Ser이 Gly로 변한된 폴리펩티드의 N말단 그리고/또는 C말단에 다른 아미노산 또는 펩티드가 결합되어 있는 폴리펩티드를 제조하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법.
- 제21항에 있어서, 상기의 다른 아미노산이 Met인 폴리펩티드를 제조하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법.
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