JPH0696599B2 - 化学修飾リンホカインおよびその製造法 - Google Patents
化学修飾リンホカインおよびその製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、化学修飾リンホカインおよびその製造法に関
する。
する。
従来の技術 従来から、インターフェロン（以下IFNと略記すること
がある）あるいはインターロイキン−２（以下IL−２と
略記することがある）など有用なリンホカインが知られ
ていたが、近年、遺伝子組み換え技術の発展にともな
い、これらリンホカインを大量に合成することが可能に
なってきた。しかしながら、生体に投与されたリンホカ
インの生体内におけるクリアランスは、一般に非常に早
いことが知られている。またリンホカインが異種動物か
ら得られたものである場合には、場合により、抗体が産
生され、重篤な症状を引き起こす危険が予想される。従
って、これらを医薬として用いるに際しては、その活性
を保持したまま、クリアランスを遅延させ、さらにその
抗原性を減弱させる技術の開発が望まれている。この目
的を達成するために、リンホカインを化学的に修飾する
方法はきわめて有効な手段である。すなわち化学修飾に
よつて、上記の生体内におけるクリアランスの遅延，抗
原性の減弱，さらには生理活性の増強が期待され、リン
ホカインの化学修飾の実用的意義はきわめて大きい。
がある）あるいはインターロイキン−２（以下IL−２と
略記することがある）など有用なリンホカインが知られ
ていたが、近年、遺伝子組み換え技術の発展にともな
い、これらリンホカインを大量に合成することが可能に
なってきた。しかしながら、生体に投与されたリンホカ
インの生体内におけるクリアランスは、一般に非常に早
いことが知られている。またリンホカインが異種動物か
ら得られたものである場合には、場合により、抗体が産
生され、重篤な症状を引き起こす危険が予想される。従
って、これらを医薬として用いるに際しては、その活性
を保持したまま、クリアランスを遅延させ、さらにその
抗原性を減弱させる技術の開発が望まれている。この目
的を達成するために、リンホカインを化学的に修飾する
方法はきわめて有効な手段である。すなわち化学修飾に
よつて、上記の生体内におけるクリアランスの遅延，抗
原性の減弱，さらには生理活性の増強が期待され、リン
ホカインの化学修飾の実用的意義はきわめて大きい。
発明が解決しょうとする問題点 一般に生理活性蛋白質の化学修飾を行うにあたっては、
それらの生理活性を保持したまま、化学修飾を行ない得
る方法が必要である。ポリエチレングリコールメチルエ
ーテルは、このもの自体が抗原性を有しないと考えられ
ているため、蛋白質の化学修飾に用いられているが、該
物質の蛋白質への導入は塩化シアヌルを用いる方法が一
般的である。しかしながら、同時に結合基として導入さ
れる塩化シアヌルはそれ自体安全性に問題があり、かつ
またその生体内における分解物の安全性についても解明
されておらず、その使用は慎重を期す必要がある。また
反応に際しても、アルカリ側のpHを必要とし、アルカリ
性で失活しやすい蛋白質に関しては、本法を適用できな
い欠点がある。
それらの生理活性を保持したまま、化学修飾を行ない得
る方法が必要である。ポリエチレングリコールメチルエ
ーテルは、このもの自体が抗原性を有しないと考えられ
ているため、蛋白質の化学修飾に用いられているが、該
物質の蛋白質への導入は塩化シアヌルを用いる方法が一
般的である。しかしながら、同時に結合基として導入さ
れる塩化シアヌルはそれ自体安全性に問題があり、かつ
またその生体内における分解物の安全性についても解明
されておらず、その使用は慎重を期す必要がある。また
反応に際しても、アルカリ側のpHを必要とし、アルカリ
性で失活しやすい蛋白質に関しては、本法を適用できな
い欠点がある。
また米国特許第4,002,531号は酵素のモノアルキルポリ
エチレングリコール誘導体の製造法を開示しているが、
そこに開示されたpH8.5で水素化ホウ素ナトリウムを用
いる方法をリンホカインに適用すると、その生理活性を
失活されるおそれがあり有効な製造法とはなり得ず、さ
らに該特許文献は酵素誘導体の生体内におけるクリアラ
ンスの遅延効果に関し示唆すらなく、その効果について
は不明である。
エチレングリコール誘導体の製造法を開示しているが、
そこに開示されたpH8.5で水素化ホウ素ナトリウムを用
いる方法をリンホカインに適用すると、その生理活性を
失活されるおそれがあり有効な製造法とはなり得ず、さ
らに該特許文献は酵素誘導体の生体内におけるクリアラ
ンスの遅延効果に関し示唆すらなく、その効果について
は不明である。
さらに、生理活性蛋白質にホルムアルデヒド，アセトア
ルデヒド，ベンツアルデヒド，ピリドキサールなどの低
分子のアルデヒドをホウ素系還元剤の存在下に導入する
方法［メソッドインエンザイモロジー，第47巻,469−47
8頁（1977）］；特開昭58−154596号公報］が知られて
いる。しかしながら当該方法をリンホカインに適用して
も有効なクリアランスの遅延化は達成されず、抗原性の
低下は期待されないのみならず、導入された低分子のア
ルデヒドがハプテンとして作用して該リンホカインに免
疫原性を与える可能性がある。
ルデヒド，ベンツアルデヒド，ピリドキサールなどの低
分子のアルデヒドをホウ素系還元剤の存在下に導入する
方法［メソッドインエンザイモロジー，第47巻,469−47
8頁（1977）］；特開昭58−154596号公報］が知られて
いる。しかしながら当該方法をリンホカインに適用して
も有効なクリアランスの遅延化は達成されず、抗原性の
低下は期待されないのみならず、導入された低分子のア
ルデヒドがハプテンとして作用して該リンホカインに免
疫原性を与える可能性がある。
本発明者らは、これらの欠点を解決すべく、鋭意研究を
行ない、本発明を完成した。
行ない、本発明を完成した。
問題を解決するための手段 本発明は、分子中の少なくとも１個の一級アミノ基に、
ＲＯ−CH2−CH2 n基（I:Rは末端酸素の保護基,nは７
〜120の正の整数）を直接結合してなる化学修飾リンホ
カインおよびその製造法を提供するものである。
ＲＯ−CH2−CH2 n基（I:Rは末端酸素の保護基,nは７
〜120の正の整数）を直接結合してなる化学修飾リンホ
カインおよびその製造法を提供するものである。
本願明細書において、リンホカインは、リンパ球から遊
離する細胞性免疫に関与する可溶性因子およびそれらと
同等の生理活性を有する物質を総称する。
離する細胞性免疫に関与する可溶性因子およびそれらと
同等の生理活性を有する物質を総称する。
すなわち、リンホカインは遺伝子工学産物，ヒトを含む
各種動物由来のもの，合成品等いずれでもよく、さらに
これらと類似構造を有し、同様の生理活性を有する物質
をも包含する。
各種動物由来のもの，合成品等いずれでもよく、さらに
これらと類似構造を有し、同様の生理活性を有する物質
をも包含する。
例えば、各種IFN［インターフェロン−α（IFN−α），
インターフェロン−β（IFN−β），インターフェロン
−γ（IFN−γ）］,IL−2,マクロファージ分化因子（MD
F），マクロファージ活性化因子（MAF），テッシュプラ
スミノーゲン活性化因子（TAP）やこれら物質に構造が
類似しかつ同様の生理活性を有する物質が挙げられる。
インターフェロン−β（IFN−β），インターフェロン
−γ（IFN−γ）］,IL−2,マクロファージ分化因子（MD
F），マクロファージ活性化因子（MAF），テッシュプラ
スミノーゲン活性化因子（TAP）やこれら物質に構造が
類似しかつ同様の生理活性を有する物質が挙げられる。
上記リンホカインに構造が類似しかつ同様の生理活性を
有する物質として、例えばIFN−γにおいてはそのＮ末
端アモノ酸が２〜４個欠損したもの（PCT/JP84/00292明
細書,1984年６月６日出願）やＣ末端部分を欠いた各種I
FN−γフラグメント（15Kスピーシーズなど）［特願昭5
9−196498号明細書，昭和59年９月19日出願］、またIL
−２においてはそのＮ末端から１個のアミノ酸（EPC公
開91539号公報）または４個のアミノ酸（特願昭58−235
638号明細書、昭和58年12月13日出願）を欠損したもの
をさらにその構成アミノ酸の一部が欠損しているか他の
アミノ酸に置換されたもの、例えば125位のシステイン
がセリンに置換されたもの（特開昭59−93093公報）な
どが挙げられる。とりわけリンホカインがIFN−α,IFN
−γ［146個のアミノ酸からなり、たとえばEPC公開第00
89676号公報に開示されているもの］またはそのＮ末端
アミノ酸が２個欠損したもの（IFN−γd2）もしくは３
個欠損したもの（IFN−γd3），またはIL−2,であるこ
とが好ましい。
有する物質として、例えばIFN−γにおいてはそのＮ末
端アモノ酸が２〜４個欠損したもの（PCT/JP84/00292明
細書,1984年６月６日出願）やＣ末端部分を欠いた各種I
FN−γフラグメント（15Kスピーシーズなど）［特願昭5
9−196498号明細書，昭和59年９月19日出願］、またIL
−２においてはそのＮ末端から１個のアミノ酸（EPC公
開91539号公報）または４個のアミノ酸（特願昭58−235
638号明細書、昭和58年12月13日出願）を欠損したもの
をさらにその構成アミノ酸の一部が欠損しているか他の
アミノ酸に置換されたもの、例えば125位のシステイン
がセリンに置換されたもの（特開昭59−93093公報）な
どが挙げられる。とりわけリンホカインがIFN−α,IFN
−γ［146個のアミノ酸からなり、たとえばEPC公開第00
89676号公報に開示されているもの］またはそのＮ末端
アミノ酸が２個欠損したもの（IFN−γd2）もしくは３
個欠損したもの（IFN−γd3），またはIL−2,であるこ
とが好ましい。
本発明のリンホカインはその分子量が５千〜５万とりわ
け１万〜３万であることが好ましい。
け１万〜３万であることが好ましい。
リンホカインの一級アミノ基として、Ｎ末端のα−アミ
ノ基およびリジン残基のε−アミノ基が挙げられる。
ノ基およびリジン残基のε−アミノ基が挙げられる。
上記（Ｉ）で表わされる基に関し、Ｒで示される末端酸
素の保護基としては、アルキル，アルカノイルなどが挙
げられ、アルキルとして具体的には、C1-18のもの、と
りわけメチル，エチル，プロピル,i−プロピル，ブチ
ル,i−ブチル,sec−ブチル,t−ブチルなど低級（C1-4）
アルキルが好ましい。アルカノイルとして具体的には、
C1-8のもの、とりわけホルミル，アセチル，プロピオニ
ル，ブチリル,i−ブチリル，カプロイルなど低級
（C1-6）アルカノイルが好ましい。ｎは７〜120の正の
整数である。
素の保護基としては、アルキル，アルカノイルなどが挙
げられ、アルキルとして具体的には、C1-18のもの、と
りわけメチル，エチル，プロピル,i−プロピル，ブチ
ル,i−ブチル,sec−ブチル,t−ブチルなど低級（C1-4）
アルキルが好ましい。アルカノイルとして具体的には、
C1-8のもの、とりわけホルミル，アセチル，プロピオニ
ル，ブチリル,i−ブチリル，カプロイルなど低級
（C1-6）アルカノイルが好ましい。ｎは７〜120の正の
整数である。
式（Ｉ）で表わされる基の分子量として2.5万以下、と
りわけ350〜6000のものが好ましい。生理活性の維持お
よびクリアランス遅延化効果の面からリンホカインの分
子量の１〜10％、とりわけ２〜５％の分子量を有する式
（Ｉ）で表わされる基が好ましい。
りわけ350〜6000のものが好ましい。生理活性の維持お
よびクリアランス遅延化効果の面からリンホカインの分
子量の１〜10％、とりわけ２〜５％の分子量を有する式
（Ｉ）で表わされる基が好ましい。
本発明の化学修飾リンホカインは、リンホカインの一級
アミノ基の少なくとも一部に直接結合した式（Ｉ）で表
わされる基を有するものである。
アミノ基の少なくとも一部に直接結合した式（Ｉ）で表
わされる基を有するものである。
一級アミノ基としてＮ末端α−アミノ基のみを有する場
合は、そのアミノ基に直接結合した式（Ｉ）で表わされ
る基を有するものである。またリンホカイン分子中に１
個以上のリジンを有する場合は、そのε−アミノ基の一
部に、好ましくはそれらε−アミノ基の15〜80％（平
均）に、直接結合した式（Ｉ）で表わされる基を有する
ものであり、この場合、Ｎ末端α−アミノ基は、直接結
合した式（Ｉ）で表わされる基を有しても、有しなくて
もよい。
合は、そのアミノ基に直接結合した式（Ｉ）で表わされ
る基を有するものである。またリンホカイン分子中に１
個以上のリジンを有する場合は、そのε−アミノ基の一
部に、好ましくはそれらε−アミノ基の15〜80％（平
均）に、直接結合した式（Ｉ）で表わされる基を有する
ものであり、この場合、Ｎ末端α−アミノ基は、直接結
合した式（Ｉ）で表わされる基を有しても、有しなくて
もよい。
本発明の化学修飾リンホカインは、例えばリンホカイン
とＲＯ−CH2CH2 n-1Ｏ−CH2CHO（II:Rおよびｎは前
記と同意義）で示されるアルデヒドとをシアノ水素化ホ
ウ素ナトリウムの存在下で反応させることより製造する
ことができる。
とＲＯ−CH2CH2 n-1Ｏ−CH2CHO（II:Rおよびｎは前
記と同意義）で示されるアルデヒドとをシアノ水素化ホ
ウ素ナトリウムの存在下で反応させることより製造する
ことができる。
反応に際しては、アルデヒド（II）をリンホカインに対
して、１〜10,000倍モル程度、ホウ素系還元剤はアルデ
ヒド（II）に対して１〜100倍モル程度用いればよく、
リンホカインとアルデヒド（II）のモル比を増減するこ
とによって修飾の程度を任意に選択することができる。
反応に用いる溶媒は、反応を妨害しないものであればい
ずれでもよいが、例えばリン酸緩衝液，ホウ酸緩衝液な
どの緩衝液が挙げられる。また、リンホカインを失活さ
せず、反応の支障にならない低級アルカノール（例、メ
タノール，エタノール,i−プロパノール），アセトニト
リルなどの有機溶媒を添加してもよい。反応のpHは３〜
14の広い範囲で可能であるが、中性付近（pH6.5〜7.5）
が望ましい。反応温度は０°〜80℃でリンホカインが変
性しない温度であれば、いずれでもよいが、０°〜50℃
の範囲がより好ましい。反応時間は0.5〜100時間、通常
は10〜80時間程度で十分である。反応液は、透析，塩
析，イオン交換クロマトグラフィー，ゲルろ過，高速液
体クロマトグラフィー，電気泳動等通常の蛋白質の精製
法で精製し、所望の化学修飾リンホカインを得ることが
できる。またアミノ基の修飾の程度は、例えば酸分解の
あと、アミノ酸分析を行なって算出することができる。
して、１〜10,000倍モル程度、ホウ素系還元剤はアルデ
ヒド（II）に対して１〜100倍モル程度用いればよく、
リンホカインとアルデヒド（II）のモル比を増減するこ
とによって修飾の程度を任意に選択することができる。
反応に用いる溶媒は、反応を妨害しないものであればい
ずれでもよいが、例えばリン酸緩衝液，ホウ酸緩衝液な
どの緩衝液が挙げられる。また、リンホカインを失活さ
せず、反応の支障にならない低級アルカノール（例、メ
タノール，エタノール,i−プロパノール），アセトニト
リルなどの有機溶媒を添加してもよい。反応のpHは３〜
14の広い範囲で可能であるが、中性付近（pH6.5〜7.5）
が望ましい。反応温度は０°〜80℃でリンホカインが変
性しない温度であれば、いずれでもよいが、０°〜50℃
の範囲がより好ましい。反応時間は0.5〜100時間、通常
は10〜80時間程度で十分である。反応液は、透析，塩
析，イオン交換クロマトグラフィー，ゲルろ過，高速液
体クロマトグラフィー，電気泳動等通常の蛋白質の精製
法で精製し、所望の化学修飾リンホカインを得ることが
できる。またアミノ基の修飾の程度は、例えば酸分解の
あと、アミノ酸分析を行なって算出することができる。
前記したアルデヒド（II）は、例えばＲＯ−CH2CH2
nOH（III:Rおよびｎは前記と同意義）示されるエチレン
グリコール誘導体から製造できるが、下記の方法は、対
応するカルボン酸の副成が少なく有利な製造法である。
nOH（III:Rおよびｎは前記と同意義）示されるエチレン
グリコール誘導体から製造できるが、下記の方法は、対
応するカルボン酸の副成が少なく有利な製造法である。
すなわち、化合物（III）を塩化メチレン，クロロホル
ムなどハロゲン化アルキル溶媒中、クロルクロム酸ピリ
ジニウムで酸化する。この場合、クロルクロム酸ピリジ
ニウムを化合物（III）に対し１〜３モル量用い、−10
°〜50℃、好ましくは室温で、１〜30時間反応させる。
ムなどハロゲン化アルキル溶媒中、クロルクロム酸ピリ
ジニウムで酸化する。この場合、クロルクロム酸ピリジ
ニウムを化合物（III）に対し１〜３モル量用い、−10
°〜50℃、好ましくは室温で、１〜30時間反応させる。
また化合物（III,但しｎ−１）をｔ−ブタノール中でカ
リウムｔ−ブトキシドで処理した後、ブロモアセタール
で反応させ、ついで有機酸（トリフルオロ酢酸など）ま
たは無機酸（塩酸，硫酸など）などの酸で処理すことに
より化合物（III）より−OCH2CH2−鎖長の長い対応する
アルデヒド（II）を製造することができる。この場合、
まずカリウムｔ−ブトキシドを上記化合物（III）に対
し10〜30モル量を加えて溶解させ、これにブロモアセタ
ールを化合物（III）に対し３〜15モル量加えて、10°
〜80℃で0.5〜５時間反応させ、常法により後処理後、
上記酸の希薄水溶液に溶かし、５分〜２時間加熱する。
リウムｔ−ブトキシドで処理した後、ブロモアセタール
で反応させ、ついで有機酸（トリフルオロ酢酸など）ま
たは無機酸（塩酸，硫酸など）などの酸で処理すことに
より化合物（III）より−OCH2CH2−鎖長の長い対応する
アルデヒド（II）を製造することができる。この場合、
まずカリウムｔ−ブトキシドを上記化合物（III）に対
し10〜30モル量を加えて溶解させ、これにブロモアセタ
ールを化合物（III）に対し３〜15モル量加えて、10°
〜80℃で0.5〜５時間反応させ、常法により後処理後、
上記酸の希薄水溶液に溶かし、５分〜２時間加熱する。
上記いずれの反応液も、抽出，濃縮，再結晶，再沈澱，
クロマトグラフィー，蒸留など通常の化学的処理により
精製することができる。
クロマトグラフィー，蒸留など通常の化学的処理により
精製することができる。
本発明の化学修飾リンホカインは、対応する公知の非修
飾リンホカインと同様の有用な生理活性を有し、医薬品
などとして有用である。
飾リンホカインと同様の有用な生理活性を有し、医薬品
などとして有用である。
本発明の化学修飾リンホカインは、対応する公知の非修
飾リンホカインに比し、生体内におけるクリアランスが
遅延され、長時間有効にその活性を示すのみならず、毒
性，抗原性も低く、公知のリンホカインと同様の目的
に、同様の用法で安全に使用することができる。
飾リンホカインに比し、生体内におけるクリアランスが
遅延され、長時間有効にその活性を示すのみならず、毒
性，抗原性も低く、公知のリンホカインと同様の目的
に、同様の用法で安全に使用することができる。
本発明の化学修飾リンホカインは、通常自体公知の担
体，希釈剤等を用い適宜の医薬組成物として経口的また
は非経口的に哺乳動物（サル，イヌ，ブタ，ウサギ，マ
ウス，ヒト）に投与することができる。
体，希釈剤等を用い適宜の医薬組成物として経口的また
は非経口的に哺乳動物（サル，イヌ，ブタ，ウサギ，マ
ウス，ヒト）に投与することができる。
例えば、本発明の化学修飾IFN−αを抗ウイルス剤とし
て使用する場合、成人１日１回１×104〜１×109国際単
位を静注により投与するのがよい。
て使用する場合、成人１日１回１×104〜１×109国際単
位を静注により投与するのがよい。
本明細書中、アミノ酸に関し略号で表示する場合は、IU
PAC−IUB（Commission of Biological Nomenclature）
による略号に基づくものである。
PAC−IUB（Commission of Biological Nomenclature）
による略号に基づくものである。
なお下記参考例に開示している形質転換体エシエリヒア
コリ（Escherichia coli）294/pH I Ttrp 1101−d2は
財団法人発酵研究所（Institute for Fementation,Osak
a）に寄託番号IFO−14350として、昭和59年６月６日か
ら通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（FRI）
に受託番号FERM BP−703として寄託されている。
コリ（Escherichia coli）294/pH I Ttrp 1101−d2は
財団法人発酵研究所（Institute for Fementation,Osak
a）に寄託番号IFO−14350として、昭和59年６月６日か
ら通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（FRI）
に受託番号FERM BP−703として寄託されている。
またエシウリヒア コリDHI/pTF4は財団法人発酵研究所
に寄託番号IFO−14299として、昭和59年４月６日からFR
IにFERM BP−628として寄託されている。
に寄託番号IFO−14299として、昭和59年４月６日からFR
IにFERM BP−628として寄託されている。
作用および実施例 以下実施例および参考例によって本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
実施例１ポリエチレングリコールメチルエーテル修飾IF
N−αの製造 （ｉ）IFN−α（rIFN−αＡ）の溶液5ml（蛋白質量にし
て4.8mg）をとり、0.2Mリン酸緩衝液（pH7.0）＋0.15M
食塩に対し、４℃で12時間透析した。透析液を取り出
し、これに参考例１で得たポリエチレングリコールメチ
ルエーテルアルデヒド（平均分子量1900）（260mg），
ついでシアノ水素化ホウ素ナトリウム（140mg）を加
え、37℃で40時間かきまぜた。反応液をセファデックス
Ｇ−75のカラム（3.0×43.0cm）に注ぎ込み、25mM酢酸
アンモニウム緩衝液（pH5.0）＋0.15M食塩で展開した。
5mlづつ分取し、目的物を含むフラクション（100〜150m
l）を集めた。このフラクションの蛋白質含量は牛血清
アルブミンを標準としてローリ−（Lowry）法で測定す
ると84μg/mlであった。また酸分解物（6N塩酸,110℃24
時間）中のアミノ酸分析値は以下の如くであった。:As
p,12.2（12）;Thr,10.4（10）;Ser,16.0（14）;Glu,24.
8（26）;Pro,6.0（５）;Gly,6.3（５）;Ala8.6（８）;V
al,6.5（７）;Met,4.5（５）;Ile,7.6（８）;Leu,21.0
（21）;Tyr,5.2（５）;Phe,9.9（10）;Lys,6.5;His,3.8
（３）;Arg,9.1（９）;Cys,Trp,分解、rIFN−αＡには1
1個のLysが含まれているので、上記の結果から、インタ
ーフェロンα中のLysのε−アミノ基の約41％がポリエ
チレングリコールメチルエーテル（平均分子量1,900）
で修飾されていることが分かった。本品は酵素免疫測定
法［メソットインエンザイモロジー，第79巻,589−595
頁（1981）］で測定した結果1.51×107国際単位/mgで、
ジャーナルオブビロロジー，第37巻755−758頁（1981）
に記載の方法に従い測定した抗ウイルス活性は0.57×10
7国際単位/mgであった。本品（IFN−３）を後述のラッ
トにおけるクリアランスの実験に供した。
N−αの製造 （ｉ）IFN−α（rIFN−αＡ）の溶液5ml（蛋白質量にし
て4.8mg）をとり、0.2Mリン酸緩衝液（pH7.0）＋0.15M
食塩に対し、４℃で12時間透析した。透析液を取り出
し、これに参考例１で得たポリエチレングリコールメチ
ルエーテルアルデヒド（平均分子量1900）（260mg），
ついでシアノ水素化ホウ素ナトリウム（140mg）を加
え、37℃で40時間かきまぜた。反応液をセファデックス
Ｇ−75のカラム（3.0×43.0cm）に注ぎ込み、25mM酢酸
アンモニウム緩衝液（pH5.0）＋0.15M食塩で展開した。
5mlづつ分取し、目的物を含むフラクション（100〜150m
l）を集めた。このフラクションの蛋白質含量は牛血清
アルブミンを標準としてローリ−（Lowry）法で測定す
ると84μg/mlであった。また酸分解物（6N塩酸,110℃24
時間）中のアミノ酸分析値は以下の如くであった。:As
p,12.2（12）;Thr,10.4（10）;Ser,16.0（14）;Glu,24.
8（26）;Pro,6.0（５）;Gly,6.3（５）;Ala8.6（８）;V
al,6.5（７）;Met,4.5（５）;Ile,7.6（８）;Leu,21.0
（21）;Tyr,5.2（５）;Phe,9.9（10）;Lys,6.5;His,3.8
（３）;Arg,9.1（９）;Cys,Trp,分解、rIFN−αＡには1
1個のLysが含まれているので、上記の結果から、インタ
ーフェロンα中のLysのε−アミノ基の約41％がポリエ
チレングリコールメチルエーテル（平均分子量1,900）
で修飾されていることが分かった。本品は酵素免疫測定
法［メソットインエンザイモロジー，第79巻,589−595
頁（1981）］で測定した結果1.51×107国際単位/mgで、
ジャーナルオブビロロジー，第37巻755−758頁（1981）
に記載の方法に従い測定した抗ウイルス活性は0.57×10
7国際単位/mgであった。本品（IFN−３）を後述のラッ
トにおけるクリアランスの実験に供した。
（ii）参考例１で得た平均分子量750のポリエチレング
リコールメチルエーテルアルデヒド100mg,シアノ水素化
ホウ素ナトリウム100mgを用いて、（ｉ）と同様にrIFN
−αＡを処理すると130μg/mlの蛋白質量のポリエチレ
ングリコールメチルエーテル修飾IFN−αの溶液30mlが
得られた。酸分解物（6N塩酸,110℃,24時間）中のアミ
ノ酸分析値は以下の如くであった。:Asp,12.1（12）;Th
r,10.1（10）;Ser,13.6（14）;Glu,26.7（26）;Pro,5.5
（５）;Gly,5.6（５）;Ala,8.4（８）;Val,6.7（７）;M
et,5.5（５）;Ile,7.4（８）;Leu,21.0（21）;Thr,5.1
（５）;Phe,9.6（10）;Lys,4.7;His,3.5（３）;Arg,9.1
（９）;Trp,1.8（２）;Cys,分解、この結果から、本品
は約57％のLysのε−アミノ基が修飾されており、
（ｉ）と同様に酵素免疫法で測定した結果５×106国際
単位/mgで、抗ウイルス活性は0.14×108国際単位/mgで
あった。
リコールメチルエーテルアルデヒド100mg,シアノ水素化
ホウ素ナトリウム100mgを用いて、（ｉ）と同様にrIFN
−αＡを処理すると130μg/mlの蛋白質量のポリエチレ
ングリコールメチルエーテル修飾IFN−αの溶液30mlが
得られた。酸分解物（6N塩酸,110℃,24時間）中のアミ
ノ酸分析値は以下の如くであった。:Asp,12.1（12）;Th
r,10.1（10）;Ser,13.6（14）;Glu,26.7（26）;Pro,5.5
（５）;Gly,5.6（５）;Ala,8.4（８）;Val,6.7（７）;M
et,5.5（５）;Ile,7.4（８）;Leu,21.0（21）;Thr,5.1
（５）;Phe,9.6（10）;Lys,4.7;His,3.5（３）;Arg,9.1
（９）;Trp,1.8（２）;Cys,分解、この結果から、本品
は約57％のLysのε−アミノ基が修飾されており、
（ｉ）と同様に酵素免疫法で測定した結果５×106国際
単位/mgで、抗ウイルス活性は0.14×108国際単位/mgで
あった。
（iii）参考例１で得た平均分子量750のポリエチレング
リコールメチルエーテルアルデヒド27mg,シアノ水素化
ホウ素ナトリウム27mgを用いて（ｉ）と同様に処理する
と、45μg/mlの蛋白質量のポリエチレングリコールメチ
ルエーテ修飾IFN−α50mlが得られた。酸分解物（6N塩
酸,110℃,24時間９中のアミノ酸分析値は以下の如くで
あった。:Asp,13.6（12）;Thr,10.4（10）;Ser,14.9（1
4）;Glu,26.6（26）;Pro,5.5（５）;Gly,6.1（５）;Al
a,8.3（８）;Val,6.6（７）;Met,5.2（５）;Ile,7.4
（８）;Leu,21.0（21）;Thr,5.3（５）;Phe,10.2（1
0）;Lys,9.0;His,3.6（３）;Arg,9.1（９）;Trp,2.3
（２）;Cys,分解、この結果から、本品は約18％のLysの
ε−アミノ基が修飾されており、（ｉ）と同様に酵素免
疫法で測定した結果1.09×108国際単位/mgで抗ウイルス
活性は1.53×108国際単位/mgであった。
リコールメチルエーテルアルデヒド27mg,シアノ水素化
ホウ素ナトリウム27mgを用いて（ｉ）と同様に処理する
と、45μg/mlの蛋白質量のポリエチレングリコールメチ
ルエーテ修飾IFN−α50mlが得られた。酸分解物（6N塩
酸,110℃,24時間９中のアミノ酸分析値は以下の如くで
あった。:Asp,13.6（12）;Thr,10.4（10）;Ser,14.9（1
4）;Glu,26.6（26）;Pro,5.5（５）;Gly,6.1（５）;Al
a,8.3（８）;Val,6.6（７）;Met,5.2（５）;Ile,7.4
（８）;Leu,21.0（21）;Thr,5.3（５）;Phe,10.2（1
0）;Lys,9.0;His,3.6（３）;Arg,9.1（９）;Trp,2.3
（２）;Cys,分解、この結果から、本品は約18％のLysの
ε−アミノ基が修飾されており、（ｉ）と同様に酵素免
疫法で測定した結果1.09×108国際単位/mgで抗ウイルス
活性は1.53×108国際単位/mgであった。
（iv）上記（ｉ）で得た本発明の化学修飾IFN−α（IFN
−３）を、1.274×106単位づつ、雌性７週令のSDラット
の大腿部筋肉に１群３匹づつ注射した。一定時間後に、
尾部静脈より採血し、血漿中のIFN−α力価を実施例１
（ｉ）に記載の酵素免疫法および抗ウイルス活性により
測定した。非修飾のインターフェロンα（rIFN−αＡ）
を1.259×106単位づつを投与した群に比較して明らかな
クリアランスの遅延化が認められた。
−３）を、1.274×106単位づつ、雌性７週令のSDラット
の大腿部筋肉に１群３匹づつ注射した。一定時間後に、
尾部静脈より採血し、血漿中のIFN−α力価を実施例１
（ｉ）に記載の酵素免疫法および抗ウイルス活性により
測定した。非修飾のインターフェロンα（rIFN−αＡ）
を1.259×106単位づつを投与した群に比較して明らかな
クリアランスの遅延化が認められた。
これらの結果を第１図に示す。
実施例２ 実施例１（ｉ）で得た本発明の化学修飾IFN−α（IFN−
３）の溶液5mlに250mgのヒト血清アルブミンをくわえて
溶かす。本溶液をメンブランフイルター（ポアーサイ
ズ:0.2μｍ）でろ過し、５個のバイアルに小分けする。
無菌的に凍結乾燥して保存し、使用直前に注射用蒸留水
1mlに溶かして使用に供する。
３）の溶液5mlに250mgのヒト血清アルブミンをくわえて
溶かす。本溶液をメンブランフイルター（ポアーサイ
ズ:0.2μｍ）でろ過し、５個のバイアルに小分けする。
無菌的に凍結乾燥して保存し、使用直前に注射用蒸留水
1mlに溶かして使用に供する。
実施例３ポリエチレングリコールメチルエーテル修飾IF
N−α，およびアルカノイルポリエチレングリコール修
飾IFN−αの製造 （ｉ）参考例１および参考例２で得たポリエチレングリ
コールメチルエーテルアルデヒド，またはアルカノイル
ポリエチレングリコールアルデヒドを用い、実施例１で
述べた方法で題記化合物を合成した。合成した誘導体の
各種データを第１表に、アミノ酸分析値を第２表に示し
た。
N−α，およびアルカノイルポリエチレングリコール修
飾IFN−αの製造 （ｉ）参考例１および参考例２で得たポリエチレングリ
コールメチルエーテルアルデヒド，またはアルカノイル
ポリエチレングリコールアルデヒドを用い、実施例１で
述べた方法で題記化合物を合成した。合成した誘導体の
各種データを第１表に、アミノ酸分析値を第２表に示し
た。
（ii）上記（ｉ）で得た本発明の化学修飾IFN−α（化
合物No.2及び８）を3.12×106単位及び2.66×106単位づ
つ、雌性７週令のSDラットの大腿部筋肉に一群３匹づつ
注射した。一定時間後に、尾部静脈より採血し、血漿中
のIFN−α力価を酵素免疫法により測定した。非修飾のI
FN−αを3.82×106単位づつを投与した群に比較して明
らかなクリアランスの遅延化が認められた。
合物No.2及び８）を3.12×106単位及び2.66×106単位づ
つ、雌性７週令のSDラットの大腿部筋肉に一群３匹づつ
注射した。一定時間後に、尾部静脈より採血し、血漿中
のIFN−α力価を酵素免疫法により測定した。非修飾のI
FN−αを3.82×106単位づつを投与した群に比較して明
らかなクリアランスの遅延化が認められた。
これらの結果を第２図に示す。
実施例４ポリエチレングリコールメチルエーテル修飾イ
ンターフェロン−γの製造 （ｉ）遺伝子組換え技術で製造されたインターフェロン
−γ蛋白質（以下rIFN−γと略記する:EPC公開第110044
号公報参照）の溶液5ml（蛋白質量にして5.95mg）をと
り、セファデックスＧ−25のカラム（2.0×60.0cm）に
注ぎ込み、0.2Mリン酸緩衝液（pH7.0）で展開した。5ml
づつ分取し、フラクションNo.11〜13を集めた。同じ緩
衝液で100mlに希釈し、これにポリエチレングリコール
メチルエーテルアルデヒド（平均分子量750）（225m
g）、ついでシアノ水素化ホウ素ナトリウム（300mg）を
加え、37℃で、72時間振とうした。生成する沈澱を遠心
により除いた。上清はダイアフロー（アミコン社製）を
用いて10mlまで濃縮した。これをセファデックスＧ−75
のカラム（3.0×43.0cm）に注ぎ込み、25mM酢酸アンモ
ニウム緩衝液（pH6.0）＋0.15M食塩＋10mMグルタチオン
で展開した。5mlづつ分取し、目的物を含むフラクショ
ンNo.17−24を集めた。このフラクションの蛋白含量は
牛血清アルブミンを標準として、ブラッドフォード（Br
adford）法で測定すると7.73μg/mlであった。また酸分
解物（6N塩酸,110℃,24時間）中のアミノ酸分析値は以
下の如くであった。Asp,19.6（20）;Thr,4.7（５）;Se
r,8.3（11）;Glu,18.5（18）;Pro,2.1（２）;Gly,5.4
（５）;Ala,7.5（８）;Val,8.4（８）;Met,3.7（４）;I
le,7.1（７）;Leu,9.7（10）;Thr,5.3（５）;Phe,9.7
（10）;Lys,17.6;His,2.0（２）;Arg,5.0（８）;Cys,Tr
p,分解、rIFN−γには20個のLysが含まれているので、
上記の結果から、rIFN−γ中のLysのε−アミノ基の約1
2％がポリエチレングリコールメチルエーテル（平均分
子量750）で修飾されていることが分った。本品の抗ウ
イルス活性は1.3×106国際単位/mgであった。また本品
をラットに投与すると、明らかな血中クリアランスの遅
延化が認められた。一方、沈澱は6M塩酸グアニジンにと
かし、ついで25mM酢酸アンモニウム（pH6.0）＋0.15M食
塩＋10mMグルタチオンに対して、４℃で一晩透析し、上
記と同様にセファデックスＧ−75のゲルろ過で精製し
た。この画分（25ml）の蛋白質含量は126μg/mlで、酸
分解物（6N塩酸,110℃,24時間）のアミノ酸分析値は以
下の如くであった。Asp,20.0（20）;Thr,5.2（５）;Se
r,9.5（11）;Glu,27.8（18）;Pro,2.7（２）;Gly,14.6
（５）;Ala,8.1（８）;Val,8.5（８）;Met,4.3（４）;I
le,7.2（７）;Leu,10.2（10）;Thr,5.8（５）;Phe,10.1
（10）;Lys,14.7;His,2.0（２）;Arg,7.3（８）;Thr,0.
7（１）;Cys,分解、GluとGlyの値が理論値より高いのは
グルタチオンの混入のためと思われる。rIFN−γには20
個のLysのε−アミノ基が含まれているので、上記の結
果から、rIFN−γ中のLysのε−アミノ基の約26.5％が
ポリエチレングリコールメチルエーテルで修飾されてい
ることが分った。
ンターフェロン−γの製造 （ｉ）遺伝子組換え技術で製造されたインターフェロン
−γ蛋白質（以下rIFN−γと略記する:EPC公開第110044
号公報参照）の溶液5ml（蛋白質量にして5.95mg）をと
り、セファデックスＧ−25のカラム（2.0×60.0cm）に
注ぎ込み、0.2Mリン酸緩衝液（pH7.0）で展開した。5ml
づつ分取し、フラクションNo.11〜13を集めた。同じ緩
衝液で100mlに希釈し、これにポリエチレングリコール
メチルエーテルアルデヒド（平均分子量750）（225m
g）、ついでシアノ水素化ホウ素ナトリウム（300mg）を
加え、37℃で、72時間振とうした。生成する沈澱を遠心
により除いた。上清はダイアフロー（アミコン社製）を
用いて10mlまで濃縮した。これをセファデックスＧ−75
のカラム（3.0×43.0cm）に注ぎ込み、25mM酢酸アンモ
ニウム緩衝液（pH6.0）＋0.15M食塩＋10mMグルタチオン
で展開した。5mlづつ分取し、目的物を含むフラクショ
ンNo.17−24を集めた。このフラクションの蛋白含量は
牛血清アルブミンを標準として、ブラッドフォード（Br
adford）法で測定すると7.73μg/mlであった。また酸分
解物（6N塩酸,110℃,24時間）中のアミノ酸分析値は以
下の如くであった。Asp,19.6（20）;Thr,4.7（５）;Se
r,8.3（11）;Glu,18.5（18）;Pro,2.1（２）;Gly,5.4
（５）;Ala,7.5（８）;Val,8.4（８）;Met,3.7（４）;I
le,7.1（７）;Leu,9.7（10）;Thr,5.3（５）;Phe,9.7
（10）;Lys,17.6;His,2.0（２）;Arg,5.0（８）;Cys,Tr
p,分解、rIFN−γには20個のLysが含まれているので、
上記の結果から、rIFN−γ中のLysのε−アミノ基の約1
2％がポリエチレングリコールメチルエーテル（平均分
子量750）で修飾されていることが分った。本品の抗ウ
イルス活性は1.3×106国際単位/mgであった。また本品
をラットに投与すると、明らかな血中クリアランスの遅
延化が認められた。一方、沈澱は6M塩酸グアニジンにと
かし、ついで25mM酢酸アンモニウム（pH6.0）＋0.15M食
塩＋10mMグルタチオンに対して、４℃で一晩透析し、上
記と同様にセファデックスＧ−75のゲルろ過で精製し
た。この画分（25ml）の蛋白質含量は126μg/mlで、酸
分解物（6N塩酸,110℃,24時間）のアミノ酸分析値は以
下の如くであった。Asp,20.0（20）;Thr,5.2（５）;Se
r,9.5（11）;Glu,27.8（18）;Pro,2.7（２）;Gly,14.6
（５）;Ala,8.1（８）;Val,8.5（８）;Met,4.3（４）;I
le,7.2（７）;Leu,10.2（10）;Thr,5.8（５）;Phe,10.1
（10）;Lys,14.7;His,2.0（２）;Arg,7.3（８）;Thr,0.
7（１）;Cys,分解、GluとGlyの値が理論値より高いのは
グルタチオンの混入のためと思われる。rIFN−γには20
個のLysのε−アミノ基が含まれているので、上記の結
果から、rIFN−γ中のLysのε−アミノ基の約26.5％が
ポリエチレングリコールメチルエーテルで修飾されてい
ることが分った。
（ii）平均分子量750のポリエチレングリコールメチル
エーテルアルデヒド225mg,シアノ水素化ホウ素ナトリウ
ム120mgを用い、２−メルカプトエタノール（２％）の
存在下、（ｉ）と同様にrIFN−γを処理すると236μg/m
lの蛋白質量のポリエチレングリコールメチルエーテル
修飾rIFN−γの溶液30mlが得られた。酸分解物（6N塩
酸,110℃,24時間）のアミノ酸分析値は以下の如くであ
った。Asp,20.0（20）;Thr,5.2（５）;Ser,9.6（11）;G
lu,33.6（18）;Pro,1.8（２）;Gly,19.9（５）;Ala,8.2
（８）;Val,8.9（８）;Met,4.6（４）;Ile,7.4（７）;L
eu,10.2（10）;Tyr,5.9（５）;Phe,10.7（10）;Lys,10.
2;His,2.3（２）;Arg,7.9（８）;Trp,0.6（１）;Cys,分
解、GluとGlyの値が理論値より高いのはグルタチオンの
混入のためと思われる。rIFN−γには20個のLysのε−
アミノ基が含まれているので、上記の結果から、rIFN−
γ中のLysのε−アミノ基の約50％がポリエチレングリ
コールメチルエーテルで修飾されていることが分った。
エーテルアルデヒド225mg,シアノ水素化ホウ素ナトリウ
ム120mgを用い、２−メルカプトエタノール（２％）の
存在下、（ｉ）と同様にrIFN−γを処理すると236μg/m
lの蛋白質量のポリエチレングリコールメチルエーテル
修飾rIFN−γの溶液30mlが得られた。酸分解物（6N塩
酸,110℃,24時間）のアミノ酸分析値は以下の如くであ
った。Asp,20.0（20）;Thr,5.2（５）;Ser,9.6（11）;G
lu,33.6（18）;Pro,1.8（２）;Gly,19.9（５）;Ala,8.2
（８）;Val,8.9（８）;Met,4.6（４）;Ile,7.4（７）;L
eu,10.2（10）;Tyr,5.9（５）;Phe,10.7（10）;Lys,10.
2;His,2.3（２）;Arg,7.9（８）;Trp,0.6（１）;Cys,分
解、GluとGlyの値が理論値より高いのはグルタチオンの
混入のためと思われる。rIFN−γには20個のLysのε−
アミノ基が含まれているので、上記の結果から、rIFN−
γ中のLysのε−アミノ基の約50％がポリエチレングリ
コールメチルエーテルで修飾されていることが分った。
実施例５ポリエチレングリコールメチルエーテル修飾IF
N−γd2の製造 （ｉ）参考例３で得られたIFN−γd2の溶液5ml（蛋白量
にして4.95mg）をとり、セファデックスＧ−25のカラム
（2.0×60.0cm）の注ぎ込み、0.2Mリン酸緩衝液（pH7.
0）で展開する。5mlづつ分取し、フラクションNo.11〜1
3を集める。同じ緩衝液で100mlに希釈し、これにポリエ
チレングリコールメチルエーテルアルデヒド（平均分子
量750）（200mg）、ついでシアノ水素化ホウ素ナトリウ
ム（300mg）を加え、37℃で、72時間振とうする。生成
する沈澱を遠心により除く、上清はダイアフロー（アミ
コン社製）を用いて10mlまで濃縮する。これをセファデ
ックスＧ−75のカラム（3.0×43.0cm）に注ぎ込み、25m
M酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.0）＋0.15M食塩＋10mM
グルタチオンで展開する。5mlづつ分取し、分子中のLys
のε−アミノ基がポリエチレングリコールメチルエーテ
ルで修飾されたIFN−γd2を含む画分を集める。本品を
ラットに投与すると明らかな血中クリアランスの遅延化
が認められる。
N−γd2の製造 （ｉ）参考例３で得られたIFN−γd2の溶液5ml（蛋白量
にして4.95mg）をとり、セファデックスＧ−25のカラム
（2.0×60.0cm）の注ぎ込み、0.2Mリン酸緩衝液（pH7.
0）で展開する。5mlづつ分取し、フラクションNo.11〜1
3を集める。同じ緩衝液で100mlに希釈し、これにポリエ
チレングリコールメチルエーテルアルデヒド（平均分子
量750）（200mg）、ついでシアノ水素化ホウ素ナトリウ
ム（300mg）を加え、37℃で、72時間振とうする。生成
する沈澱を遠心により除く、上清はダイアフロー（アミ
コン社製）を用いて10mlまで濃縮する。これをセファデ
ックスＧ−75のカラム（3.0×43.0cm）に注ぎ込み、25m
M酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.0）＋0.15M食塩＋10mM
グルタチオンで展開する。5mlづつ分取し、分子中のLys
のε−アミノ基がポリエチレングリコールメチルエーテ
ルで修飾されたIFN−γd2を含む画分を集める。本品を
ラットに投与すると明らかな血中クリアランスの遅延化
が認められる。
一方、沈澱は6M塩酸グアニジンにとかし、ついで25mM酢
酸アンモニウム（pH6.0）＋0.15M食塩＋10mMグルタチオ
ンに対して、４℃で一晩透析し、上記同様にセファデッ
クスＧ−75のゲルろ過で精製し、分子中のLysのε−ア
ミノ基がポリエチレングリコールメチルエーテルで修飾
されたIFN−γd2を含む画分を得る。
酸アンモニウム（pH6.0）＋0.15M食塩＋10mMグルタチオ
ンに対して、４℃で一晩透析し、上記同様にセファデッ
クスＧ−75のゲルろ過で精製し、分子中のLysのε−ア
ミノ基がポリエチレングリコールメチルエーテルで修飾
されたIFN−γd2を含む画分を得る。
実施例６ポリエチレングリコールメチルエーテル修飾IF
N−γd3の製造 （ｉ）参考例４で得られたIFN−γd3の溶液5ml（蛋白質
量にして、5.5mg）をとり、セファデックスＧ−25のカ
ラム（2.0×60.0cm）に注ぎ込み、0.2Mリン酸緩衝液（p
H7.0）で展開する。5mlづつ分取し、フラクションNo.11
〜13を集める。これにポリエチレングリコールメチルエ
ーテルアルデヒド（平均分子量750）（225mg）、ついで
シアノ水素化ホウ素ナトリウム（120mg）を加え、37℃
で、24時間振とうする。反応液をセファデックスＧ−75
のカラム（3.0×43.0cm）に注ぎ込み、25mM酢酸アンモ
ニウム（pH6.0）で展開し、分子中のLysのε−アミノ基
がポリエチレングリコールメチルエーテルで修飾された
IFN−γd3を含む画分を得る。本品をラットに投与する
と、明らかな血中クリアランスの遅延化が認められる。
N−γd3の製造 （ｉ）参考例４で得られたIFN−γd3の溶液5ml（蛋白質
量にして、5.5mg）をとり、セファデックスＧ−25のカ
ラム（2.0×60.0cm）に注ぎ込み、0.2Mリン酸緩衝液（p
H7.0）で展開する。5mlづつ分取し、フラクションNo.11
〜13を集める。これにポリエチレングリコールメチルエ
ーテルアルデヒド（平均分子量750）（225mg）、ついで
シアノ水素化ホウ素ナトリウム（120mg）を加え、37℃
で、24時間振とうする。反応液をセファデックスＧ−75
のカラム（3.0×43.0cm）に注ぎ込み、25mM酢酸アンモ
ニウム（pH6.0）で展開し、分子中のLysのε−アミノ基
がポリエチレングリコールメチルエーテルで修飾された
IFN−γd3を含む画分を得る。本品をラットに投与する
と、明らかな血中クリアランスの遅延化が認められる。
実施例７ポリエチレングリコールメチルエーテル修飾IL
−２の製造 （ｉ）参考例５で得られたインターロイキン−２（rIL
−２と略称する）の溶液5ml（蛋白質量にして5.0mg）を
とり、0.2Mリン酸緩衝液（pH7.15）に対して、12時間透
析した。透析液にポリエチレングリコールメチルエーテ
ルアルデヒド（平均分子量750）（97mg）、ついでシア
ノ水素化ホウ素ナトリウム（100mg）を加え、37℃で24
時間かきまぜた。生成した沈澱を遠心により除いた。上
清を5mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH5.0）に対して５時
間透析した。透析した液をそのままセファデックスＧ−
75のカラム（3.0×43.0cm）にかけ、同じ溶媒系で展開
した。5mlづつ分取し、目的物を含むフラクションNo.21
〜29を集めた。このフラクションの蛋白質含量は牛血清
アルブミンを標準として、ブラッドフォード（Bradfor
d）法で測定すると25μg/mlであった。また酸分解物（6
N塩酸,110℃,24時間）のアミノ酸分析値は以下の如くで
あった。Asp,12.0（12）;Thr,12.5（13）;Ser,7.1
（８）;Gly,18.6（18）;Pro,5.5（５）;Gly,2.2（２）;
Ala,5.0（５）;Val,3.7（４）;Met,3.9（４）;Ile,8.1
（８）;Leu,22.2（22）;Thr,3.0（３）;Phe,6.0（６）;
Lys,7.3;His,3.0（３）;Arg,3.9（４）;Cys,Trp,分解、
rIL−２には11個のLysが含まれているので、上記の結果
から、rIL−２中のLysのε−アミノ基の約33.6％がポリ
エチレングリコールメチルエーテルで修飾されているこ
とが分った。本品について、IL−２依存性マウスナチュ
ラルキラー細胞株（NKC3）の生育を［3H］−チミジンの
DNAへの取り込みを指標として測定する日沼ら［バイオ
ケミカルアンドバイオフイジカリリサーチコンミュニケ
イション109巻363〜369頁（1982）］の方法に従って、I
L−２活性を求めると22998単位/mgであった。rIL−２を
40000単位/mgとする57.7％の活性を保持していることに
なる。また本品をラットに投与すると、明らかな血中ク
リアランスの遅延化が認められた。
−２の製造 （ｉ）参考例５で得られたインターロイキン−２（rIL
−２と略称する）の溶液5ml（蛋白質量にして5.0mg）を
とり、0.2Mリン酸緩衝液（pH7.15）に対して、12時間透
析した。透析液にポリエチレングリコールメチルエーテ
ルアルデヒド（平均分子量750）（97mg）、ついでシア
ノ水素化ホウ素ナトリウム（100mg）を加え、37℃で24
時間かきまぜた。生成した沈澱を遠心により除いた。上
清を5mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH5.0）に対して５時
間透析した。透析した液をそのままセファデックスＧ−
75のカラム（3.0×43.0cm）にかけ、同じ溶媒系で展開
した。5mlづつ分取し、目的物を含むフラクションNo.21
〜29を集めた。このフラクションの蛋白質含量は牛血清
アルブミンを標準として、ブラッドフォード（Bradfor
d）法で測定すると25μg/mlであった。また酸分解物（6
N塩酸,110℃,24時間）のアミノ酸分析値は以下の如くで
あった。Asp,12.0（12）;Thr,12.5（13）;Ser,7.1
（８）;Gly,18.6（18）;Pro,5.5（５）;Gly,2.2（２）;
Ala,5.0（５）;Val,3.7（４）;Met,3.9（４）;Ile,8.1
（８）;Leu,22.2（22）;Thr,3.0（３）;Phe,6.0（６）;
Lys,7.3;His,3.0（３）;Arg,3.9（４）;Cys,Trp,分解、
rIL−２には11個のLysが含まれているので、上記の結果
から、rIL−２中のLysのε−アミノ基の約33.6％がポリ
エチレングリコールメチルエーテルで修飾されているこ
とが分った。本品について、IL−２依存性マウスナチュ
ラルキラー細胞株（NKC3）の生育を［3H］−チミジンの
DNAへの取り込みを指標として測定する日沼ら［バイオ
ケミカルアンドバイオフイジカリリサーチコンミュニケ
イション109巻363〜369頁（1982）］の方法に従って、I
L−２活性を求めると22998単位/mgであった。rIL−２を
40000単位/mgとする57.7％の活性を保持していることに
なる。また本品をラットに投与すると、明らかな血中ク
リアランスの遅延化が認められた。
参考例１ ポリエチレングリコールメチルエーテルアル
デヒドの合成 （ｉ）ポリエチレングリコールメチルエーテル（5g,平
均分子量5,000）を塩化メチレン（100ml）に溶かし、ク
ロルクロム酸ピリジニウム（330mg）を加え、室温で12
時間かきまぜた。反応液を２倍量の塩化メチレンでうす
めて、フロリジルのカラム（６×10cm）を注ぎ込み、カ
ラムを塩化メチレン，ついでクロロホルムで洗ったの
ち、メタノール−クロロホルム（1:9）で溶出した。2,4
−ジニトロフェニルヒドラジンテストで陽性の画分を集
めて、溶媒を減圧留去し、結晶性のワックスを得た。収
量1.5g（30％），薄層クロマトグラフイー:Rf＝0.08
（クロロホルム：メタノール：酢酸＝9:1:0.5,シリカゲ
ル），13C−NMRで96.2PPMに水和した型 でアルデヒド基の吸収を認めた。
デヒドの合成 （ｉ）ポリエチレングリコールメチルエーテル（5g,平
均分子量5,000）を塩化メチレン（100ml）に溶かし、ク
ロルクロム酸ピリジニウム（330mg）を加え、室温で12
時間かきまぜた。反応液を２倍量の塩化メチレンでうす
めて、フロリジルのカラム（６×10cm）を注ぎ込み、カ
ラムを塩化メチレン，ついでクロロホルムで洗ったの
ち、メタノール−クロロホルム（1:9）で溶出した。2,4
−ジニトロフェニルヒドラジンテストで陽性の画分を集
めて、溶媒を減圧留去し、結晶性のワックスを得た。収
量1.5g（30％），薄層クロマトグラフイー:Rf＝0.08
（クロロホルム：メタノール：酢酸＝9:1:0.5,シリカゲ
ル），13C−NMRで96.2PPMに水和した型 でアルデヒド基の吸収を認めた。
（ii）ポリエチレングリコールメチルエーテル（10g,平
均分子量5,000）を三級ブタノール（100ml）に溶かし、
カリウム三級ブトキシド（4.17g）を加え、ついでブロ
ムアセタール（2.56ml）を加え、40℃で２時間かきまぜ
た。三級ブタノールを減圧下留去し、残留物に水を加
え、ついでクロロホルム（200ml×２）で抽出した。水
で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。クロロホルム
を減圧下留去し、残留物に石油ベンジンを加え、生ずる
結晶性残渣をろ取し、エーテルで洗浄して対応するポリ
エチレングリコールメチルエーテルジエチルアセタール
9.5g（95％）が得られた。この内5gを取り、0.05Mトリ
フルオロ酢酸50mlに溶かし、沸とう水中で30分間処理し
たあと凍結乾燥し、（ｉ）で得たものよりも−Ｏ−CH2C
H2だけ鎖長の長いポリエチレングリコールメチルエーテ
ルアルデヒドが得られた。
均分子量5,000）を三級ブタノール（100ml）に溶かし、
カリウム三級ブトキシド（4.17g）を加え、ついでブロ
ムアセタール（2.56ml）を加え、40℃で２時間かきまぜ
た。三級ブタノールを減圧下留去し、残留物に水を加
え、ついでクロロホルム（200ml×２）で抽出した。水
で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。クロロホルム
を減圧下留去し、残留物に石油ベンジンを加え、生ずる
結晶性残渣をろ取し、エーテルで洗浄して対応するポリ
エチレングリコールメチルエーテルジエチルアセタール
9.5g（95％）が得られた。この内5gを取り、0.05Mトリ
フルオロ酢酸50mlに溶かし、沸とう水中で30分間処理し
たあと凍結乾燥し、（ｉ）で得たものよりも−Ｏ−CH2C
H2だけ鎖長の長いポリエチレングリコールメチルエーテ
ルアルデヒドが得られた。
（iii）ポリエチレングリコールメチルエーテル（5.7g,
平均分子量1,900）を塩化メチレン（100ml）に溶かし、
クロルクロム酸ピリジニウム（970mg）を加え、室温で1
2時間かきまぜた。反応液を塩化メチレンで希釈し、フ
ロリジルのカラム（6.0×10.0cm）を注ぎ込み、カラム
を塩化メチレン，ついでクロロホルムで洗ったあと、10
％メタノール／クロロホルムで溶出した。2,4−ジニト
ロフェニルヒドラジンテストで陽性の画分を集めて、溶
媒を留去すると結晶性のワックスを得た。収量1.8g（30
％），薄層クロマトグラフイー:Rf＝0.10（クロロホル
ム：メタノール：酢酸＝9:1:0.5,シリカゲル），13C−N
MRで96.2PPMに水和した形 でアルデヒド基の吸収を認めた。
平均分子量1,900）を塩化メチレン（100ml）に溶かし、
クロルクロム酸ピリジニウム（970mg）を加え、室温で1
2時間かきまぜた。反応液を塩化メチレンで希釈し、フ
ロリジルのカラム（6.0×10.0cm）を注ぎ込み、カラム
を塩化メチレン，ついでクロロホルムで洗ったあと、10
％メタノール／クロロホルムで溶出した。2,4−ジニト
ロフェニルヒドラジンテストで陽性の画分を集めて、溶
媒を留去すると結晶性のワックスを得た。収量1.8g（30
％），薄層クロマトグラフイー:Rf＝0.10（クロロホル
ム：メタノール：酢酸＝9:1:0.5,シリカゲル），13C−N
MRで96.2PPMに水和した形 でアルデヒド基の吸収を認めた。
（iv）ポリエチレングリコールメチルエーテル（19.5g,
平均分子量1900）を三級ブタノール（100ml）に溶か
し、カリウム三級ブトキシド（10.4g）を、ついでブロ
ムアセタール（6.4ml）を加え、40℃で２時間かきまぜ
た。三級ブタノールを減圧で留去し、残留物に水を加
え、ついでクロロホルム（200ml×２）で抽出した。反
応液を水洗，ついで無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ク
ロロホルムを減圧下留去し、残留物に石油ベンジンを加
え、生ずる結晶性残留物をろ取し、エーテルで洗浄しア
セタール8.5g（89.5％）を得た。この内3gを0.05Mトリ
フルオロ酢酸に溶かし、沸とう水中で30分間処理したあ
と、凍結乾燥し、（iii）で得たものよりも−Ｏ−CH2CH
2−だけ鎖長の長いポリエチレングリコールメチルエー
テルアルデヒドが得られた。
平均分子量1900）を三級ブタノール（100ml）に溶か
し、カリウム三級ブトキシド（10.4g）を、ついでブロ
ムアセタール（6.4ml）を加え、40℃で２時間かきまぜ
た。三級ブタノールを減圧で留去し、残留物に水を加
え、ついでクロロホルム（200ml×２）で抽出した。反
応液を水洗，ついで無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ク
ロロホルムを減圧下留去し、残留物に石油ベンジンを加
え、生ずる結晶性残留物をろ取し、エーテルで洗浄しア
セタール8.5g（89.5％）を得た。この内3gを0.05Mトリ
フルオロ酢酸に溶かし、沸とう水中で30分間処理したあ
と、凍結乾燥し、（iii）で得たものよりも−Ｏ−CH2CH
2−だけ鎖長の長いポリエチレングリコールメチルエー
テルアルデヒドが得られた。
（ｖ）平均分子量750,550,350のポリエチレングリコー
ルメチルエーテルを上記と同様の方法で対応するアルデ
ヒドに導いた。
ルメチルエーテルを上記と同様の方法で対応するアルデ
ヒドに導いた。
参考例２ アルカノイルポリエチレングリコールアルデ
ヒドの合成 （ｉ）平均分子量1500のポリエチレングリコール1540
（和光純薬製）15gをピリジン50mlに溶かし無水酢酸1.8
5mlを添加し、かきまぜながら40℃で２時間、さらに室
温で16時間反応させ、反応後、溶媒を減圧留去した。ク
ロロホルムに溶解し、水洗後、クロロホルム層を無水硫
酸ナトリウムで乾燥、クロロホルムを減圧留去した。残
留物を少量のクロロホルムに溶解し、石油ベンジン−エ
ーテル（2:1）混液を加えて放置し、結晶性のワックス1
4g（90％）を得た。この内1.4gをとり50mlの塩化メチレ
ンに溶解、クロルクロム酸ピリジニウム300mgを加えて
室温で18時間かきまぜながら反応させた。反応液をシリ
カゲルＣ−200（和光純薬製）のカラム（３×50cm）に
通し、５％メタノール−クロロホルム（200ml）で洗っ
たのち、10％メタノール−クロロホルムで溶出した。2,
4−ジニトロフェニルヒドラジンテスト陽性画分を集め
て溶媒を減圧留去して、結晶性ワックスを得た。収量58
0mg（41％） （ii）平均分子量1000のポリエチレングリコール1000
（和光純薬製）20gを塩化メチレン50mlに溶解、無水ｎ
−カプロン酸5.15gを加えて70℃で２時間反応させた。
溶媒を留去し、シリカゲルＣ−200（３×50cm）カラム
を用いて、酢酸エチル−メタノール（4:1）で溶出して
精製し、冷蔵庫中では固化する油状物14.9g（60％）を
得た。（ｉ）と同様にクロルクロム酸ピリジニウムで酸
化してアルデヒド体を得た。
ヒドの合成 （ｉ）平均分子量1500のポリエチレングリコール1540
（和光純薬製）15gをピリジン50mlに溶かし無水酢酸1.8
5mlを添加し、かきまぜながら40℃で２時間、さらに室
温で16時間反応させ、反応後、溶媒を減圧留去した。ク
ロロホルムに溶解し、水洗後、クロロホルム層を無水硫
酸ナトリウムで乾燥、クロロホルムを減圧留去した。残
留物を少量のクロロホルムに溶解し、石油ベンジン−エ
ーテル（2:1）混液を加えて放置し、結晶性のワックス1
4g（90％）を得た。この内1.4gをとり50mlの塩化メチレ
ンに溶解、クロルクロム酸ピリジニウム300mgを加えて
室温で18時間かきまぜながら反応させた。反応液をシリ
カゲルＣ−200（和光純薬製）のカラム（３×50cm）に
通し、５％メタノール−クロロホルム（200ml）で洗っ
たのち、10％メタノール−クロロホルムで溶出した。2,
4−ジニトロフェニルヒドラジンテスト陽性画分を集め
て溶媒を減圧留去して、結晶性ワックスを得た。収量58
0mg（41％） （ii）平均分子量1000のポリエチレングリコール1000
（和光純薬製）20gを塩化メチレン50mlに溶解、無水ｎ
−カプロン酸5.15gを加えて70℃で２時間反応させた。
溶媒を留去し、シリカゲルＣ−200（３×50cm）カラム
を用いて、酢酸エチル−メタノール（4:1）で溶出して
精製し、冷蔵庫中では固化する油状物14.9g（60％）を
得た。（ｉ）と同様にクロルクロム酸ピリジニウムで酸
化してアルデヒド体を得た。
参考例３ IFN−γd2の製造 （ｉ）形質転換体の製造 IFN−γ発現プラスミドpHITtrp1101［EPC公開第110044
号公報実施例２（iii）参照］を制限酵素AvaII,PstIで
消化し、IFN−γ遺伝子部分を含むAvaII−Pst 1kbDNA断
片を分取した。このDNA断片に、トリエステル法によっ
て化学合成した蛋白合成開始コドンを含むオリゴヌクレ
オチドアダプター CGATAATGTGCCAG TATTACACGGTCCTG をT4DNAリガーゼを用いてAvaIIののりしろ部分に結合さ
せた。
号公報実施例２（iii）参照］を制限酵素AvaII,PstIで
消化し、IFN−γ遺伝子部分を含むAvaII−Pst 1kbDNA断
片を分取した。このDNA断片に、トリエステル法によっ
て化学合成した蛋白合成開始コドンを含むオリゴヌクレ
オチドアダプター CGATAATGTGCCAG TATTACACGGTCCTG をT4DNAリガーゼを用いてAvaIIののりしろ部分に結合さ
せた。
プラスミドptrp771上記公開公報実施例２（ii）参照］
を制限酵素ClaI,PstIで切断して得たDNA断片のtrpプロ
モーターの下流に上記アダプターを結合させた上記遺伝
子を挿入して、 欠落IFN−γのポリペプチドをコードする発現プラスミ
ドpHITtrp 1101−d2を構築した（第３図）。
を制限酵素ClaI,PstIで切断して得たDNA断片のtrpプロ
モーターの下流に上記アダプターを結合させた上記遺伝
子を挿入して、 欠落IFN−γのポリペプチドをコードする発現プラスミ
ドpHITtrp 1101−d2を構築した（第３図）。
このプラスミドpHI Ttrp 1101−d2を用いてCohenらの方
法［プロシージングオブナショナルアカデミーオブサイ
エンスUSA,第69巻,2110頁（1972）］に従って大腸菌294
を形質転換し、このプラスミドを含む形質転換体エシエ
リヒアコリ（Escherichia coli＝E.coli）294/pHITtrp
1101−d2を得た。
法［プロシージングオブナショナルアカデミーオブサイ
エンスUSA,第69巻,2110頁（1972）］に従って大腸菌294
を形質転換し、このプラスミドを含む形質転換体エシエ
リヒアコリ（Escherichia coli＝E.coli）294/pHITtrp
1101−d2を得た。
（ii）形質転換体の培養 上記（ｉ）で構築したプラスミドを含む菌株E.coli294/
pHITtrp1101−d2を８μg/mlのテトラサイクリン,0.4％
カザミノ酸,1％グルコースを含むM9培地を用いて37℃で
培養し、生育がKU220に達した時に３βインドリルアク
リル酸（IAA）を25μg/mlになるように加えて更に４時
間培養した。培養後、遠心分離して菌体を集め、これを
1/10量の10％蔗糖を含む0.05M Tris−HCl pH7.6に懸濁
した。この懸濁液にフェニルメチルスルフォニルフルオ
ライド,NaCl,エチレンジアミンテトラアセテート（EDT
A），スペルミジン，リゾチームをそれぞれ1mM,10mM,40
mMおよび200μg/mlとなるように加えて、０℃で１時間
放置したのち、37℃で３分処理して溶菌液を得た。
pHITtrp1101−d2を８μg/mlのテトラサイクリン,0.4％
カザミノ酸,1％グルコースを含むM9培地を用いて37℃で
培養し、生育がKU220に達した時に３βインドリルアク
リル酸（IAA）を25μg/mlになるように加えて更に４時
間培養した。培養後、遠心分離して菌体を集め、これを
1/10量の10％蔗糖を含む0.05M Tris−HCl pH7.6に懸濁
した。この懸濁液にフェニルメチルスルフォニルフルオ
ライド,NaCl,エチレンジアミンテトラアセテート（EDT
A），スペルミジン，リゾチームをそれぞれ1mM,10mM,40
mMおよび200μg/mlとなるように加えて、０℃で１時間
放置したのち、37℃で３分処理して溶菌液を得た。
この溶菌液を４℃,20000rpm（サーバル遠心機SS−34ロ
ーターで30分間遠心分離して、IFN−γd2ポリペプチド
を含む上清を得た。この上清の抗ウイルス活性を測定す
ると、2.87×108U/培養液であった。
ーターで30分間遠心分離して、IFN−γd2ポリペプチド
を含む上清を得た。この上清の抗ウイルス活性を測定す
ると、2.87×108U/培養液であった。
（iii）IFN−γd2の精製 上記（ii）と同様の方法で得た凍結菌体5.9gを7M塩酸グ
アニジンおよび2mMフェニルメチルスルホニルフルオラ
イドを含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH7.0）18mlに懸濁
し、４℃で１時間撹拌したのち10,000×ｇで30分間遠心
分離にかけて上清20mlを得た。この上清に137mM塩化ナ
トリウム,2.7mM塩化カリウム,8.1mMリン酸二ナトリウム
および1.5mMリン酸一カリウムから成る緩衝液（pH7.4）
（以下PBSと略す）260mlを加えて希釈し、抗体カラム
（Moγ２−11.1,カラム容量12ml）に流速1ml/分でかけ
た。そののち、0.5M塩酸グアニジンを含む20mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.0）60mlでカラムを洗浄し、つい
で、2M塩酸グアニジンを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝
液（pH7.0）36mlで溶出し、抗ウイルス活性を有する画
分20mlを得た。
アニジンおよび2mMフェニルメチルスルホニルフルオラ
イドを含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH7.0）18mlに懸濁
し、４℃で１時間撹拌したのち10,000×ｇで30分間遠心
分離にかけて上清20mlを得た。この上清に137mM塩化ナ
トリウム,2.7mM塩化カリウム,8.1mMリン酸二ナトリウム
および1.5mMリン酸一カリウムから成る緩衝液（pH7.4）
（以下PBSと略す）260mlを加えて希釈し、抗体カラム
（Moγ２−11.1,カラム容量12ml）に流速1ml/分でかけ
た。そののち、0.5M塩酸グアニジンを含む20mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.0）60mlでカラムを洗浄し、つい
で、2M塩酸グアニジンを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝
液（pH7.0）36mlで溶出し、抗ウイルス活性を有する画
分20mlを得た。
この画分20mlをあらかじめ1mMエチレンジアミン四酢酸,
0.15M塩化ナトリウム,10mMシステインおよび2M塩酸グア
ニジンを含む25mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.0）で
平衡化したセファクリルＳ−200（ファルマシア社製）
のカラム（2.6×94cm,カラム容量500ml）にかけ、同一
緩衝液で溶出して抗ウイルス活性を有する画分37mlを得
た。
0.15M塩化ナトリウム,10mMシステインおよび2M塩酸グア
ニジンを含む25mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.0）で
平衡化したセファクリルＳ−200（ファルマシア社製）
のカラム（2.6×94cm,カラム容量500ml）にかけ、同一
緩衝液で溶出して抗ウイルス活性を有する画分37mlを得
た。
ここで得られた のポリペプチド（IFN−γd2）は5.9mgであり比活性は
（1.0×107U/mg）であった。
（1.0×107U/mg）であった。
参考例４ IFN−γd3の製造 （ｉ）形質転換体の製造 IFN−γ発現プラスミドpRC23/IFI−900［EPC公開第0089
676号公報実施例７参照］を制限酵素NdeI,NcoIで消化
し、IFN−γ遺伝子部分を含むNdeI−NcoI 710bp DNA断
片（Ａ）を分取した。一方、プラスミドpRC23を制限酵
素Bgl II,EcoRIで消化し、λPLプロモーターを含む265b
pのDNA断片（Ｂ）を分取した。（Ａ），（Ｂ）と化学合
成して得た蛋白合成開始コドンを含むオリゴヌクレチド
アダプター AATTCATGCAGGATCCA GTACGTCCTAGGTAT をT4DNAリガーゼを用いてNdeIとEcoRIののりしろ部分に
結合させた。得られたDNA断片をNcoIとBgl IIで処理し
て得たプラスミドpRC23/IFI−900に結合させ、 のポリペプチドをコードする発現プラスミドpLC2を構築
した。（第４図）このプラスミドpLC2を用いてCohenら
の方法［前出］に従って大腸菌RRI（pRK248 cIts）を形
質転換し、形質転換体エシエリヒアコリ（Escherichia
coli＝E.coli）RRI（pLC2,pRK248cIts）を得た。
676号公報実施例７参照］を制限酵素NdeI,NcoIで消化
し、IFN−γ遺伝子部分を含むNdeI−NcoI 710bp DNA断
片（Ａ）を分取した。一方、プラスミドpRC23を制限酵
素Bgl II,EcoRIで消化し、λPLプロモーターを含む265b
pのDNA断片（Ｂ）を分取した。（Ａ），（Ｂ）と化学合
成して得た蛋白合成開始コドンを含むオリゴヌクレチド
アダプター AATTCATGCAGGATCCA GTACGTCCTAGGTAT をT4DNAリガーゼを用いてNdeIとEcoRIののりしろ部分に
結合させた。得られたDNA断片をNcoIとBgl IIで処理し
て得たプラスミドpRC23/IFI−900に結合させ、 のポリペプチドをコードする発現プラスミドpLC2を構築
した。（第４図）このプラスミドpLC2を用いてCohenら
の方法［前出］に従って大腸菌RRI（pRK248 cIts）を形
質転換し、形質転換体エシエリヒアコリ（Escherichia
coli＝E.coli）RRI（pLC2,pRK248cIts）を得た。
（ii）形質転換体の培養 上記（ｉ）で構築したプラスミドを含む菌株E.coli RRI
（pLC2,pRK248cIts）を１％バクトトリプトン,0.5％酵
母エキス,0.5％食塩,7μg/mlテトラサイクリンを含む液
体培地50ml中で35℃,12時間振とう培養を行った。培養
液を0.5％カザミノ酸,0.5％グルコース,7μg/mlのテト
ラサイクリンを含むM9培地2.5に移し、35℃で４時間、
ついで42℃で３時間培養した。遠心分離して菌体を集
め、−80℃で保存した。
（pLC2,pRK248cIts）を１％バクトトリプトン,0.5％酵
母エキス,0.5％食塩,7μg/mlテトラサイクリンを含む液
体培地50ml中で35℃,12時間振とう培養を行った。培養
液を0.5％カザミノ酸,0.5％グルコース,7μg/mlのテト
ラサイクリンを含むM9培地2.5に移し、35℃で４時間、
ついで42℃で３時間培養した。遠心分離して菌体を集
め、−80℃で保存した。
（iii）IFN−γd3の精製 上記（ii）と同様の方法で得た凍結菌体7.1gを7M塩酸グ
アニジンおよび2mMフェニルメチルスルフォニルフルオ
ライドを含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH7.0）22mlに懸
濁し、４℃で１時間撹拌したのち10,000×ｇで30分間遠
心分離にかけて上清24mlを得た。この上清に137mM塩化
ナトリウム,2.7mM塩化カリウム,8.1mMリン酸二ナトリウ
ムおよび1.5mMリン酸一カリウムから成る緩衝液（pH7.
4）300mlを加えて希釈し、抗体カラム（Mo γ２−11.1,
カラム容量15ml）に流速1ml/分でかけた。そののち、0.
5M塩酸グアニジンを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.0）60mlでカラムを洗浄し、ついで、2M塩酸グア
ニジンを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）45m
lで溶出し、抗ウイルス活性を有する画分25mlを得た。
この画分25mlをあらかじめ1mMエチレンジアミン四酢酸,
0.15M塩化ナトリウム,10mMシステインおよび2M塩酸グア
ニジンを含む25mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.0）で
平衡化したセファクリルＳ−200（ファルマシア社製）
のカラム（2.6×94cm），カラム容量500mlにかけ、同一
緩衝液で溶出して抗ウイルス活性を有する画分40mlを得
た。
アニジンおよび2mMフェニルメチルスルフォニルフルオ
ライドを含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH7.0）22mlに懸
濁し、４℃で１時間撹拌したのち10,000×ｇで30分間遠
心分離にかけて上清24mlを得た。この上清に137mM塩化
ナトリウム,2.7mM塩化カリウム,8.1mMリン酸二ナトリウ
ムおよび1.5mMリン酸一カリウムから成る緩衝液（pH7.
4）300mlを加えて希釈し、抗体カラム（Mo γ２−11.1,
カラム容量15ml）に流速1ml/分でかけた。そののち、0.
5M塩酸グアニジンを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.0）60mlでカラムを洗浄し、ついで、2M塩酸グア
ニジンを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）45m
lで溶出し、抗ウイルス活性を有する画分25mlを得た。
この画分25mlをあらかじめ1mMエチレンジアミン四酢酸,
0.15M塩化ナトリウム,10mMシステインおよび2M塩酸グア
ニジンを含む25mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.0）で
平衡化したセファクリルＳ−200（ファルマシア社製）
のカラム（2.6×94cm），カラム容量500mlにかけ、同一
緩衝液で溶出して抗ウイルス活性を有する画分40mlを得
た。
ここで得られた のポリペプチド（INF−γd3）は、7.0mgであり比活性は
2.72×107U/mgであった。
2.72×107U/mgであった。
参考例５ 非グリコシル化ヒトIL−２の製造 （ｉ）形質転換体の培養 形質転換体E,coil DHI/pTF 4［特願昭58−225079（昭和
58年11月28日出願）明細書参照］を250ml容三角フラス
コ内のバクト・トリプトン（デイフコ・ラボラトリー
ズ，アメリカ）１％，バクトイーストエキス（デイフコ
・ラボラトリーズ，アメリカ）0.5％，食塩0.5％および
テトラサイクリン７μg/mlを含む液体培地（pH7.0）50m
lに接種して37℃で１晩回転振盪培養した。この培養液
をカザミノ酸0.5％，グルコース0.5％およびテトラサイ
クリン７μg/mlを含むM9培地2.5の入った５容ジャーフ
ァーメンターに移し37℃で４時間、ついで３−β−イン
ドリルアクリル酸（25μg/ml）を添加して、さらに４時
間通気撹拌培養して培養液2.5を得た。この培養液を遠
心分離し、菌体を集め、−80℃で凍結して保存した。
58年11月28日出願）明細書参照］を250ml容三角フラス
コ内のバクト・トリプトン（デイフコ・ラボラトリー
ズ，アメリカ）１％，バクトイーストエキス（デイフコ
・ラボラトリーズ，アメリカ）0.5％，食塩0.5％および
テトラサイクリン７μg/mlを含む液体培地（pH7.0）50m
lに接種して37℃で１晩回転振盪培養した。この培養液
をカザミノ酸0.5％，グルコース0.5％およびテトラサイ
クリン７μg/mlを含むM9培地2.5の入った５容ジャーフ
ァーメンターに移し37℃で４時間、ついで３−β−イン
ドリルアクリル酸（25μg/ml）を添加して、さらに４時
間通気撹拌培養して培養液2.5を得た。この培養液を遠
心分離し、菌体を集め、−80℃で凍結して保存した。
（ii）抽出 上記で得た凍結保存菌体12.1gを7M塩酸グアニジン,0.1M
Tris・HCIを含む抽出液（pH7.0）100mlに均一に懸濁
し、４℃で１時間撹拌した。この溶菌液を28,000×ｇで
20分間遠心分離して上清93mlを得た。
Tris・HCIを含む抽出液（pH7.0）100mlに均一に懸濁
し、４℃で１時間撹拌した。この溶菌液を28,000×ｇで
20分間遠心分離して上清93mlを得た。
（iii）IL−２蛋白質の精製 上記で得た上清を0.01M Tris・HCl緩衝液（pH8.5）に対
して透析後19,000×ｇで10分間遠心分離して透析上清94
mlを得た。この透析上清を0.01M Tris・HCl緩衝液（pH
8.5）で平衡化したDE52（DEAE−セルロース，ワットマ
ン社製，イギリス）カラム（50ml容）に通して蛋白を吸
着後、NaCl濃度直線勾配（０〜0.15M NaCl,1）を作成し
てIL−２を溶出させ、活性画分53mlを得た。
して透析後19,000×ｇで10分間遠心分離して透析上清94
mlを得た。この透析上清を0.01M Tris・HCl緩衝液（pH
8.5）で平衡化したDE52（DEAE−セルロース，ワットマ
ン社製，イギリス）カラム（50ml容）に通して蛋白を吸
着後、NaCl濃度直線勾配（０〜0.15M NaCl,1）を作成し
てIL−２を溶出させ、活性画分53mlを得た。
上記の活性画分53mlをYM−５メンブラン（アミコン社
製，アメリカ）を用いて4.8mlに濃縮し、0.1M Tris・HC
l（pH8.0）−1M NaCl緩衝液で平衡化したセファクリル
Ｓ−200（ファルマシア社製，スェーデン）カラム（500
ml容）を用いてゲルろ過を行った。活性画分28mlをYM−
５メンブランで25mlに濃縮した。得られた濃縮液をウル
トラポアRPSC（アルテックス社製，アメリカ）カラムに
吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出
溶媒とする高速液体クロマトグラフィーを行った。カラ
ム，ウルトラポアRPSC（4.6×75mm）；カラム温度,30
℃；溶出溶媒A,0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％水；溶
出溶媒B,0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％アセトニトリ
ル；溶出プログラム,0分（68％Ａ＋32％Ｂ）−25分（55
％Ａ＋45％Ｂ）−35分（45％Ａ＋55％Ｂ）−45分（30％
Ａ＋70％Ｂ）−48分（100％Ｂ）；溶出速度,0.8ml/min;
検出波長,230nm。本条件で保持時間約39分の活性画分を
集め、非グリコシル化ヒトIL−２蛋白質0.53mg［比活
性,40,000U/mg,出発材料からの活性回収率,30.6％；蛋
白質の純度,99％（デンシトメトリーによる）］を含む
溶液10mlを得た。
製，アメリカ）を用いて4.8mlに濃縮し、0.1M Tris・HC
l（pH8.0）−1M NaCl緩衝液で平衡化したセファクリル
Ｓ−200（ファルマシア社製，スェーデン）カラム（500
ml容）を用いてゲルろ過を行った。活性画分28mlをYM−
５メンブランで25mlに濃縮した。得られた濃縮液をウル
トラポアRPSC（アルテックス社製，アメリカ）カラムに
吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出
溶媒とする高速液体クロマトグラフィーを行った。カラ
ム，ウルトラポアRPSC（4.6×75mm）；カラム温度,30
℃；溶出溶媒A,0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％水；溶
出溶媒B,0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％アセトニトリ
ル；溶出プログラム,0分（68％Ａ＋32％Ｂ）−25分（55
％Ａ＋45％Ｂ）−35分（45％Ａ＋55％Ｂ）−45分（30％
Ａ＋70％Ｂ）−48分（100％Ｂ）；溶出速度,0.8ml/min;
検出波長,230nm。本条件で保持時間約39分の活性画分を
集め、非グリコシル化ヒトIL−２蛋白質0.53mg［比活
性,40,000U/mg,出発材料からの活性回収率,30.6％；蛋
白質の純度,99％（デンシトメトリーによる）］を含む
溶液10mlを得た。
発明の効果 本発明の化学修飾リンホカインは、リンホカインの生理
活性を維持し、生体内でのクリアランスが遅延化され、
抗原性も低下している。
活性を維持し、生体内でのクリアランスが遅延化され、
抗原性も低下している。
第１図は実施例１（iv）に開示したラット血漿中のクリ
アランス遅延化効果を示す。○（酵素免疫測定法）およ
び□（抗ウイルス活性）は実施例１（ｉ）で得た本発明
の化学修飾IFN−αの●（酵素免疫測定法）および■
（抗ウイルス活性）は対照としたrINF−αＡの測定結果
をそれぞれ示す。 第２図は実施例３（ii）に開示したラット血漿中のクリ
アランス遅延化効果を示す。△および□はそれぞれ第１
表の化合物NO.8およびNO.2の、●は対照としてのrINF−
αＡの酵素免疫測定結果を示す。 第３図は参考例３（ｉ）開示した発現プラスミドpHIT t
rp1101−d2に構築図を、第４図は参考例（ｉ）ｉ開示し
た発現プラスミドpLC2の構築図をそれぞれ示す。
アランス遅延化効果を示す。○（酵素免疫測定法）およ
び□（抗ウイルス活性）は実施例１（ｉ）で得た本発明
の化学修飾IFN−αの●（酵素免疫測定法）および■
（抗ウイルス活性）は対照としたrINF−αＡの測定結果
をそれぞれ示す。 第２図は実施例３（ii）に開示したラット血漿中のクリ
アランス遅延化効果を示す。△および□はそれぞれ第１
表の化合物NO.8およびNO.2の、●は対照としてのrINF−
αＡの酵素免疫測定結果を示す。 第３図は参考例３（ｉ）開示した発現プラスミドpHIT t
rp1101−d2に構築図を、第４図は参考例（ｉ）ｉ開示し
た発現プラスミドpLC2の構築図をそれぞれ示す。
Claims (3)
- 【請求項１】分子中の少なくとも１個の一級アミノ基
に、ＲO-CH2CH2 n基（Ｒは末端酸素の保護基、ｎは
７〜120の正の整数）を直接結合してなる化学修飾リン
ホカイン。 - 【請求項２】リンホカインとＲO-CH2CH2 n-1O-CH2CH
O（Ｒは末端酸素の保護基、ｎは７〜120の正の整数）で
示されるアルデヒドとを、シアノ水素化ホウ素ナトリウ
ムの存在下で反応させることを特徴とする、分子中の少
なくとも１個の一級アミノ基に、ＲO-CH2CH2 n基
（Ｒおよびｎは前記と同意義）を直接結合してなる化学
修飾リンホカインの製造法。 - 【請求項３】反応を中性付近で行うことを特徴とする特
許請求の範囲第２項記載の製造法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| WO84/00085 | 1984-03-06 | ||
| PCT/JP1984/000085 WO1985003934A1 (en) | 1984-03-06 | 1984-03-06 | Chemically modified protein and process for its preparation |
| WO84/00575 | 1984-12-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60226821A JPS60226821A (ja) | 1985-11-12 |
| JPH0696599B2 true JPH0696599B2 (ja) | 1994-11-30 |
Family
ID=13818260
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60027283A Expired - Lifetime JPH0676439B2 (ja) | 1984-03-06 | 1985-02-13 | 化学修飾ペプチドホルモンおよびその製造法 |
| JP60037936A Expired - Lifetime JPH0696599B2 (ja) | 1984-03-06 | 1985-02-26 | 化学修飾リンホカインおよびその製造法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60027283A Expired - Lifetime JPH0676439B2 (ja) | 1984-03-06 | 1985-02-13 | 化学修飾ペプチドホルモンおよびその製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | USH1662H (ja) |
| JP (2) | JPH0676439B2 (ja) |
| KR (1) | KR920007681B1 (ja) |
| AU (1) | AU2867784A (ja) |
| WO (2) | WO1985003934A1 (ja) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3676670D1 (de) * | 1985-06-26 | 1991-02-07 | Cetus Corp | Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung. |
| US5214131A (en) * | 1988-05-06 | 1993-05-25 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof |
| JP2958019B2 (ja) * | 1988-05-06 | 1999-10-06 | 住友製薬株式会社 | ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法 |
| GB8824591D0 (en) * | 1988-10-20 | 1988-11-23 | Royal Free Hosp School Med | Fractionation process |
| US5349052A (en) * | 1988-10-20 | 1994-09-20 | Royal Free Hospital School Of Medicine | Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| JP2997004B2 (ja) * | 1989-05-26 | 2000-01-11 | 住友製薬株式会社 | ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法 |
| US5342940A (en) * | 1989-05-27 | 1994-08-30 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same |
| FR2675807B1 (fr) * | 1991-04-23 | 1994-07-01 | Medgenix Group Sa | Conjugue de calcitonine et de polyethylene glycol. |
| US5382657A (en) * | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
| US5359030A (en) * | 1993-05-10 | 1994-10-25 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| JP2001508783A (ja) * | 1997-01-29 | 2001-07-03 | ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー | Ｐｅｇ化法 |
| ES2344679T3 (es) | 2000-08-11 | 2010-09-03 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Polipeptidos que controlan el metabolismo del acido fosforico, el metabolismo del calcio, el metabolismo de la calcificacion y de la vitamina d y moleculas de adn que los codifican. |
| KR101016476B1 (ko) | 2001-12-28 | 2011-02-24 | 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 | 섬유아세포 증식 인자-23에 대한 항체 |
| EP3669887A1 (en) * | 2002-01-18 | 2020-06-24 | Biogen MA Inc. | Polyalkylene polymer compounds and uses thereof |
| EA008866B1 (ru) | 2002-12-26 | 2007-08-31 | Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк. | ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ |
| KR101162908B1 (ko) * | 2002-12-26 | 2012-07-06 | 마운틴 뷰 파마슈티컬즈, 인크. | 수용체-결합 활성이 보존된, 사이토카인, 케모카인,성장인자, 폴리펩티드 호르몬 및 이들의 길항제의 중합체접합체 |
| PT1666496E (pt) | 2003-08-25 | 2014-06-24 | Toray Industries | Composto de interferão β |
| US7498415B2 (en) | 2003-09-24 | 2009-03-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Recombinant antibody against human insulin-like growth factor |
| US20080199423A1 (en) * | 2004-06-18 | 2008-08-21 | Genentech, Inc. | Methods of Using Apo2l Receptor Agonists and Ink Cell Activators |
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