JP5830032B2 - インターフェロンアルファ5を生産する方法 - Google Patents
インターフェロンアルファ5を生産する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5830032B2 JP5830032B2 JP2012550482A JP2012550482A JP5830032B2 JP 5830032 B2 JP5830032 B2 JP 5830032B2 JP 2012550482 A JP2012550482 A JP 2012550482A JP 2012550482 A JP2012550482 A JP 2012550482A JP 5830032 B2 JP5830032 B2 JP 5830032B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ifna5
- coli
- protein
- hifna5
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
a)IFNa5産生E.coli宿主細胞を用意する工程と;
b)発酵培地中で前記組換えIFNa5産生E.coli宿主細胞が前記IFNa5タンパク質を発現するのに有効な条件下でIFNa5産生E.coli宿主細胞を、炭素供給液を添加しながら培養する工程であって、ここで、
−前記発酵培地は、動物起源または酵母起源由来の成分を含まず、かつ
−前記炭素供給液は、炭素源、および添加される炭素供給液1リットルあたり約3.0〜約3.7mLの微量元素溶液を含んでなる工程と;
c)発現したIFNa5タンパク質を単離し、そして必要に応じて精製する工程とを少なくとも含んでなることを特徴とする方法に関する。
E.coli宿主細胞を溶解する工程と、
その後、封入体(IB)を可溶化に付し、そして、得られた混合物を酸化再生に付し、さらに下記を含む一連のクロマトグラフィー:
1)再生IFNa5を含んでなる混合物を、疎水性相互作用クロマトグラフィーに付す工程;
2)工程1)で得られた溶液を、陰イオン交換クロマトグラフィーに付す工程;
3)工程2)で得られた溶液を、第1の陽イオン交換クロマトグラフィーに付す工程;および
4)工程3)で得られた溶液を、第2の陽イオン交換クロマトグラフィーに付す工程であって、ここで、前記溶液を、必要に応じて、メチオニンを含む緩衝液で希釈する工程、
に付すことによって、前記IFNa5タンパク質を前記IBの形態で単離する工程と、を含んでなる。
本発明の理解を促すために、本発明との関係において使用されるいくつかの用語および表現の意味をここに提供する。
−非極性R基を有するアミノ酸:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン;
−無電荷極性R基を有するアミノ酸:グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン;
−電荷極性R基(pH6.0において負に帯電)を有するアミノ酸:アスパラギン酸、グルタミン酸;
−塩基性アミノ酸(pH6.0において正に帯電):リジン、アルギニン、ヒスチジン(pH6.0において);
−フェニル基を有するアミノ酸:フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
によって置き換えられていることを意味する。
正電荷が維持され得るような、LysのArgへの置換、その逆もまた同様;
負電荷が維持され得るような、GluのAspへの置換、その逆もまた同様;
遊離−OHが維持され得るような、SerのThrへの置換;ならびに
遊離NH2が維持され得るような、GlnのAsnへの置換。
一つの態様において、本発明は、IFNa5産生Escherichia coli宿主細胞における発現によってインターフェロンアルファ5(IFNa5)タンパク質を生産する方法(以下「本発明の方法」という。)であって、そのプロセスが:
a)IFNa5産生E.coli宿主細胞を用意する工程と;
b)発酵培地中で前記組換えIFNa5産生E.coli宿主細胞が前記IFNa5タンパク質を発現するのに有効な条件下でIFNa5産生E.coli宿主細胞を、炭素供給液を添加しながら培養する工程であって、ここで、
−前記発酵培地は、動物起源または酵母起源由来の成分を含まず、かつ
−前記炭素供給液は、炭素源、および添加される炭素供給液1リットルあたり約3.0〜約3.7mLの微量元素溶液を含んでなる、工程と;
c)発現したIFNa5タンパク質を単離し、そして必要に応じて精製する工程とを少なくとも含んでなることを特徴とする方法に関する。
−前記発酵培地は、動物起源または酵母起源由来の成分を含まず、かつ
−前記炭素供給液は、炭素源、および添加される炭素供給液1リットルあたり約3.0〜約3.7mLの微量元素溶液を含んでなる。
1)再生IFNa5を含んでなる前記混合物を、疎水性相互作用クロマトグラフィーに付す工程;
2)工程1)で得られた溶液を、陰イオン交換クロマトグラフィーに付す工程;
3)工程2)で得られた溶液を、第1の陽イオン交換クロマトグラフィーに付す工程;および
4)工程3)で得られた溶液を、第2の陽イオン交換クロマトグラフィーに付す工程であって、ここで、前記溶液を、必要に応じてメチオニンを含む緩衝液で希釈する、工程。
IFNa5を発現するE.coli株の構築
この実施例は、組換えヒトインターフェロンアルファ−5(hIFNa5)を産生するE.coli株の開発および構築を開示する。つまり、hIFNa5遺伝子のクローニングおよび発現、ならびに組換えIFNa5タンパク質を産生する細菌株の構築は、以下の工程:hIFNa5をコードするcDNA遺伝子のクローニング、E.coliにおけるその発現が最適となるような前記遺伝子のDNA配列の改変、発現プラスミドの構築、選択されたプラスミドを好適なE.coli株へ導入する形質転換、そして発現/誘導条件の選択、を用いることによって、以下に記載するように行った。
hIFNa5のクローニングおよび発現では、従来の方法およびプロトコルを用いた[Sambrook et al.Molecular cloning:A Laboratory Manual.Second ed.,CSH Laboratory,Cold Spring Harbor,1989;Current Protocols in Molecular Biology,vol.1−3(Ausubel F.M.et al.,ed.)John Wiley & Sons,Inc.,Brooklyn,New York,1994−1998]。
hIFNa5産生E.coliの構築は、図1に示す遺伝的構築物の開発のフローチャートに示す工程に従って行った。
hIFNa5コード配列(シグナルペプチドを含まない)を、インフォームドコンセント後、非肝臓病変のための開腹手術を受けた匿名のドナー患者から得た正常肝臓組織から以下のとおりクローニングした:正常肝臓組織を1mLのUltraspec溶液(Biotex)中でホモジナイズし、全RNAをDnase(Gibco−BRL,Paisley,U.K.)で処理した後、RnaseOUT(Gibco−BRL)の存在下でM−MLV逆転写酵素(Gibco−BRL)を用いて逆転写を行った。予め得ていた相補的DNA(cDNA)から、下記上流プライマーおよび下流プライマー(5’−3’)を用いて、hIFNa5コード配列(シグナルペプチドを含まない)をPCR増幅した:
コドン最適化を含む、hIFNa5コード遺伝子のPCR増幅
鋳型としてプラスミドpET28−IFNアルファ−5を使用することによって、PCR増幅を行った。以下のオリゴヌクレオチドを合成した:
センスプライマー(SP):5’−CATATGTGTGATCTGCCGCAGACCCACTCCCTGTCTAACCGTCGTACTCTGATGATCATGGCACAGATGGGTCGTATCTCTCCTTTC[配列番号4]
アンチセンスプライマー(ASP):5’−CTGCAGTTATTCCTTACGACGTAAACGTTCTTGCAAG[配列番号5]
E.coliにおいて使用頻度が最も低いコドンを置換するために、SP[配列番号4]およびASP[配列番号5]プライマーを適用した。コドン最適化は、主に、アルギニンコドンAGAおよびAGGに関する。
約500bpの精製された増幅産物を、Rapid DNA ligation Kit(#K1421,Fermentas,Lithuania)を用いて、pUC57/Tプラスミド(#SD0171 Fermentas,Lithuania)にクローニングし、E.coli JM109(ATCC53323,ATCC Bacteria and Bacteriophages,19th edition,1996)に形質転換した。組換えクローンを制限酵素解析によって選択した(図3)。2つのクローンを選択し、抽出されたプラスミドを配列決定した。
ヌクレオチド配列解析によって、hIFNa5コード部分の配列を確認し、その配列を図4に示す。
非発現宿主においてプラスミドpET21−IFNアルファ−5を確立した(安定化した)後、それを、標的タンパク質の発現に対して関連する遺伝因子を有する宿主E.coli BL21(DE3)に形質転換することにより、E.coli BL21(DE3)pET21−IFNa−5株を得た。hIFNa5の発現を、1mM IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)で誘導し、その結果を図6に示す。
産生株によるhIFNa5の生合成プロセス
E.coli BL21(DE3)pET21−IFNa−5株(実施例1)を、以下の組成(g/L)を有する培地中で培養した:
a)フラスコ内における接種材料の調製(培養)用(g/L):リン酸水素二ナトリウム(17.0)、リン酸二水素カリウム(1.82)、硫酸アンモニウム(3.0)、硫酸マグネシウム七水和物(0.5)、D(+)−グルコース一水和物(15.0)および微量元素原液e)(0.16mL);
b)発酵用(g/L):第二リン酸アンモニウム(4.0)、硫酸マグネシウム七水和物(0.5)、リン酸二水素カリウム(13.3)、クエン酸一水和物(1.6)、D(+)−グルコース一水和物(30.0)および微量元素原液e)(0.25mL);
c)供給液A(g/L):D(+)−グルコース一水和物(700.0)、硫酸マグネシウム七水和物(20.7)および微量元素原液e)(3.4mL/L);
d)供給液B(g/L):第二リン酸アンモニウム(360.0)およびリン酸二水素カリウム(306.7);ならびに
e)微量元素(痕跡元素)原液(g/L):塩化鉄(III)六水和物(30.0)、塩化カルシウム二水和物(4.05)、硫酸亜鉛(II)七水和物(6.75)、硫酸マンガン(II)一水和物(1.5)、硫酸銅(II)五水和物(3.0)、塩化コバルト(II)六水和物(1.14)、モリブデン酸ナトリウム二水和物(0.3)およびホウ酸(0.69)。
産生株からhIFNa5を単離および精製するプロセス
1.バイオマスの均質化、破砕、および封入体(IB)の単離
実施例2で得られた680.0〜700.0gのバイオマスを、再懸濁緩衝液(2mM EDTA、0.1%TritonX−100および1mM PMSFを含む0.1M Tris−HCl,pH7.80〜8.00)中で、1/10(w/v)の比、すなわち、1gの湿バイオマス/10mLの再懸濁緩衝液中で、ホモジナイズした。
単離されたIBの予備洗浄を、洗浄緩衝液I〜IIIを用いて連続した4工程のプロセスによって行った:
洗浄緩衝液I:1M NaCl、0.1%Polysorbate−80を含む、10mM Tris−HCl緩衝液,pH7.45〜7.55;
洗浄緩衝液II:6M尿素を含む、10mM Tris−HCl緩衝液,pH8.00〜8.20;
洗浄緩衝液III:10mM Tris−HCl緩衝液,pH8.00〜8.20。
a)最初の2回の洗浄(工程1および2)、IBを洗浄緩衝液Iで洗浄した;
b)3番目の洗浄(工程3)、IBを洗浄緩衝液IIで洗浄した;そして
c)4番目の洗浄(工程4)、IBを洗浄緩衝液IIIで洗浄した。
IBを可溶化するために、可溶化緩衝液(6M GdmHClを含む、50mMグリシン/NaOH緩衝液,pH9.55〜9.65)を使用した。可溶化の比率:2〜8℃で、2時間、6mLの可溶化緩衝液中において1gのバイオマスからIBを単離し、そしてその後8,000rpmで25〜30分間遠心分離。
再生緩衝液:1.2M NaCl、0.22M L−アルギニン、2.85mM GSH(還元型グルタチオン)、0.285mM GSSG(酸化型グルタチオン)を含む、50mMグリシン/NaOH緩衝液,pH9.55〜9.65、4〜10℃における伝導率110〜110mS/cm。
hIFNa5を、以下で述べるように4工程のクロマトグラフィープロセスによって精製した。
Phenyl−Sepharoseカラムは、再生したhIFNa5を残留カオトロピック剤GdmHClから分離することを目的としている。さらに、再生したhIFNa5と吸着剤の疎水性表面との接触が、IFNa5の成熟を促進させる。
クロマトグラフィー媒体:Phenyl−Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech AB);
使用カラム:BPG100×500mm,直径10cm;
線流速:60cm/時;
クロマトグラフィー媒体ベッド体積:2.7±0.3L
平衡緩衝液:1.5M塩化ナトリウムを含む20mM Tris−HCl緩衝液,pH8.00〜8.20、15〜25℃における伝導率115〜125mS/cm(4〜10℃では110〜120mS/cm);
溶出緩衝液:10mM Tris−HCl緩衝液,pH9.20〜9.25、15〜25℃における伝導率0.1〜0.2mS/cm;
溶出を、6カラム体積(CV)[すなわち、6CV]にわたる溶離緩衝液で行う。回収されたタンパク質溶液2〜6CV。
Q−Sepharoseカラムは、hIFNa5モノマーをその凝集型から分離するために使用される。
クロマトグラフィー媒体:Q−Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech AB);
使用カラム:BPG140×500MM,直径14cm;
線流速:60cm/時;
クロマトグラフィー媒体ベッド体積:3.3±0.3L
平衡緩衝液:0.12M塩化ナトリウムを含む20mM Tris−HCl緩衝液,pH8.75〜8.85、15〜25℃における伝導率13.00〜14.00mS/cm;
溶出緩衝液:0.23mM塩化ナトリウムを含む20mM Tris−HCl緩衝液,pH8.75〜8.85、15〜25℃における伝導率23.00〜25.00mS/cm;
溶出:5カラム体積(5CV)にわたる100%までの直線勾配の溶出緩衝液、および5CVの100%溶出緩衝液。
N−メチオニル−hIFNa5およびアセチル化hIFNa5(翻訳後修飾の産物である形態)のような荷電アイソフォームから主要なhIFNa5型を分離するために、SP−Sepharoseカラムを3番目および4番目のクロマトグラフィー工程のために使用する。
クロマトグラフィー媒体:SP−Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech AB);
使用カラム:BPG100×500mm,直径10cm;
線流速:60cm/時;
クロマトグラフィー媒体ベッド体積:3.3±0.3L
平衡緩衝液:50mM塩化ナトリウムを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液,pH5.15〜5.20、15〜25℃における伝導率6.00〜7.00mS/cm;
溶出緩衝液:2mM L−メチオニンおよび0.1M NaClを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液,pH5.15〜5.20、15〜25℃における伝導率11.00〜13.00mS/cm;
溶出を、10カラム体積(10CV)にわたる溶出緩衝液で行った。
つまり、ローディング溶液[第1のSP−Sepharoseカラム(工程5.3)から回収したタンパク質画分のプール]を、2mM L−メチオニンを含む5mM酢酸ナトリウム緩衝液,pH5.00〜5.20で希釈し、15〜25℃において0.200〜0.800mS/cmという伝導率から15〜25℃において6.00〜7.00mS/cmという伝導率に調整した。室温で行われるクロマトグラフィー中のhIFNa5の酸化を防止するために、ローディング溶液に2mM L−メチオニンを加えた。ローディング溶液を、以下のプロセスパラメータを用いてSP−Sepharoseクロマトグラフィーカラムに適用した:
クロマトグラフィー媒体:SP−Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech AB);
使用カラム:BPG100×500mm,直径10cm;
線流速:60cm/時;
クロマトグラフィー媒体ベッド体積:3.0±0.3L
平衡緩衝液:50mM塩化ナトリウムを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液,pH5.15〜5.20、15〜25℃における伝導率6.00〜7.00mS/cm;
溶出緩衝液:0.1M NaClを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液,pH5.15〜5.20、15〜25℃における伝導率11.00〜13.00mS/cm;
溶出線流速:45cm/時;
溶出:20カラム体積(20CV)にわたる100%までの溶出緩衝液の直線勾配。
製剤化緩衝液:0.1M塩化ナトリウムを含む25mMリン酸ナトリウム,pH6.80〜7.20、15〜25℃における伝導率10.00〜14.00mS/cm。
組換えヒトIFNアルファ−5の生合成に対する微量元素濃度およびグルコース濃度の影響の評価
この実施例の目的は、組換えヒトIFNアルファ−5(hIFNa5)の翻訳後修飾に対する微量元素の影響を確認すること、炭素供給液中の臨界微量元素濃度の限界を確定すること、および組換えhIFNa5の生合成に対するグルコース濃度の影響を評価することであった。したがって、この実施例は、本試験中に行われた解析および得られた結果を説明し、そして組換えhIFNa5の生合成プロセスにおける炭素供給液中の微量元素濃度の根拠およびグルコース濃度の根拠としての役割を果たす。
実験の計画をデザインし、「実験計画法」(DOE)の助けを借りてモニターし、それを表1に示す。
−フラスコ内での培養用の無機塩/グルコース培地の組成(g/L):リン酸水素二ナトリウム−17.0、リン酸二水素カリウム−1.82、硫酸アンモニウム−3.0、硫酸マグネシウム七水和物−0.5、D(+)−グルコース一水和物−15.0、微量元素原液−0.16mL。
−微量元素(痕跡元素または金属)原液(g/L):塩化鉄(III)六水和物−30.0、塩化カルシウム二水和物−4.05、硫酸亜鉛(II)七水和物−6.75、硫酸マンガン(II)一水和物−1.5、硫酸銅(II)五水和物−3.0、塩化コバルト(II)六水和物−1.14、モリブデン酸ナトリウム二水和物−0.3、ホウ酸−0.69。
−発酵用の無機塩/グルコース培地の組成(g/L):第二リン酸アンモニウム−4.0、硫酸マグネシウム七水和物−0.5、リン酸二水素カリウム−13.3、クエン酸一水和物−1.6、D(+)−グルコース一水和物−30.0、微量元素原液−0.25mL。
−炭素供給液:70.0%グルコース、2.1%MgSO4×7H2Oおよび実験計画に応じた微量元素原液。
本試験中に行った解析および得られた結果から、E.coliにおいて産生された組換えhIFNa5タンパク質の翻訳後修飾が、培養培地中の微量元素の濃度に依存することが裏付けられた。
−最大量の酸化型のメチオニル化hIFNa5において、最小含有量のアセチル化hIFNa5が観察され、その逆もまた同じである(ショートバッチNo.M−83、M−84、M−85およびM−86);
−微量元素(原液)の濃度が、3.0〜3.7mL/L炭素供給液の限度内(ショートバッチNo.M−80、M−81、M−92、M−82およびM−87)または0.95〜1.23mL/L実際の最終懸濁液体積の限度内であるとき、アセチル化hIFNa5の量は、約8〜11%である(表3);並びに
−炭素供給液中の微量元素の濃度が、4mL/Lを超えるかまたは1.23mL/L実際の最終細胞懸濁液体積を超えるとき、さらなる未知(未同定)の型が検出された[それは、主要ピークおよびアセチル化型の2つのピークの後に観察される(データ示さず)]。
−本試験において得られた結果は、組換えhIFNa5の生合成プロセスにおける炭素供給液中の微量元素濃度の根拠およびグルコース濃度の根拠としての役割を果たす。
−微量元素の濃度が、3.0mL/L炭素供給液以上であるか、または0.95mL/L実際の最終懸濁液体積より高く、かつ誘導後の平均比増殖速度(μ)が、0.17以上であるとき、酸化型のメチオニル化hIFNa5タンパク質は、排除される。
−微量元素の濃度が、約3.0〜約3.7mL/L炭素供給液の限度内であるか、または約0.95〜約1.23mL/L実際の最終懸濁液体積の限度内であるとき、アセチル化hIFNa5タンパク質は、約8〜11%である。
−炭素供給液中の微量元素の濃度が、3.7mL/Lより高いか、または1.23mL/L実際の最終懸濁液体積より高いとき、未知(未同定)タンパク質型が合成される。
−最大収率を決定する微量元素の至適濃度および標的hIFNa5タンパク質の最高の質は、約3.0〜約3.7mL/L炭素供給液の限度内である。
−17g/L〜22g/Lの範囲内のグルコース濃度は、実際には、標的タンパク質(組換えhIFNa5)の質およびバイオマス収率に影響しない。
Claims (12)
- Escherichia coli宿主細胞における発現によってインターフェロンアルファ5(IFNa5)タンパク質を生産する方法であって、該方法が:
a)IFNa5産生E.coli宿主細胞を用意する工程と;
b)発酵培地中で前記組換えIFNa5産生E.coli宿主細胞が前記IFNa5タンパク質を発現するのに有効な条件下で、前記IFNa5産生E.coli宿主を、炭素供給液を添加しながら培養する工程であって、ここで
−前記発酵培地は、動物起源または酵母起源由来の成分を含まず、かつ
−前記炭素供給液は、炭素源、ならびに添加される炭素供給液1リットルあたり、90〜111mgの塩化鉄(III)六水和物、12.15〜14.985mgの塩化カルシウム二水和物、20.25〜24.975mgの硫酸亜鉛(II)七水和物、4.5〜5.55mgの硫酸マンガン(II)一水和物、9〜11.1mgの硫酸銅(II)五水和物、3.42〜4.218mgの塩化コバルト(II)六水和物、0.9〜1.11mgのモリブデン酸ナトリウム二水和物、および2.07〜2.553mgのホウ酸を含んでなる工程と;
c)発現したIFNa5タンパク質を単離し、そして必要に応じて精製する工程であって、ここで、前記炭素供給液が添加された前記発酵培地1リットルあたりの各濃度が、塩化鉄(III)六水和物が28.5〜36.9mgの範囲に、塩化カルシウム二水和物が3.8475〜4.9815mgの範囲に、硫酸亜鉛(II)七水和物が6.4125〜8.3025mgの範囲に、硫酸マンガン(II)一水和物が1.425〜1.845mgの範囲に、硫酸銅(II)五水和物が2.85〜3.69mgの範囲に、塩化コバルト(II)六水和物が1.083〜1.4022mgの範囲に、モリブデン酸ナトリウム二水和物が0.285〜0.369mgの範囲に、およびホウ酸が0.6555〜0.8487mgの範囲にある工程とを少なくとも含んでなることを特徴とする、方法。 - E.coli宿主細胞が、誘導性プロモーターの制御下で、IFNa5タンパク質をコードする配列を含んでなるベクターで形質転換されてなるものである、請求項1に記載の方法。
- E.coli宿主細胞が、E.coliプロテアーゼ欠損株である、請求項1または2に記載の方法。
- E.coliプロテアーゼ欠損株が、E.coli Ion − /ompT − プロテアーゼ欠損宿主株である、請求項3に記載の方法。
- E.coli Ion − /ompT − プロテアーゼ欠損宿主株が、E.coli BL21(DE3)株である、請求項4に記載の方法。
- E.coli宿主細胞がE.coli BL21(DE3)株であり、工程b)の条件がIPTGによる誘導を含んでなるものである、請求項3に記載の方法。
- 誘導後の平均比増殖速度(μ)が、0.17以上である、請求項6に記載の方法。
- リフォールディング後の酸化型Met IFNa5の量が、1%以下である、請求項7に記載の方法。
- 前記IFNa5タンパク質が、hIFNa5である、請求項1に記載の方法。
- IFNa5タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記工程b)においてIFNa5が封入体(IB)として得られた場合、
前記IBを可溶化に付して、変性IFNa5を含んでなる混合物を得て、
次いで、それを酸化再生処理に付して、再生IFNa5を含んでなる混合物を得て、
そして、再生IFNa5を含んでなる前記混合物を精製工程に付して、精製IFNa5を得ることによって、IFNa5タンパク質を、前記IFNa5タンパク質を前記IBの形態で含んでなる混合物から単離し、そして必要に応じて精製することを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 再生IFNa5を含んでなる混合物を、下記4工程を含むクロマトグラフィー処理に付すことによって、前記混合物を精製することを特徴とする、請求項11に記載の方法:
1)再生IFNa5を含んでなる前記混合物を、疎水性相互作用クロマトグラフィーに付す工程;
2)工程1)で得られた溶液を、陰イオン交換クロマトグラフィーに付す工程;
3)工程2)で得られた溶液を、第1の陽イオン交換クロマトグラフィーに付す工程;および
4)工程3)で得られた溶液を、第2の陽イオン交換クロマトグラフィーに付す工程であって、ここで、前記溶液を、必要に応じて、メチオニンを含む緩衝液で希釈する、工程。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP10382019.7 | 2010-02-01 | ||
EP10382019 | 2010-02-01 | ||
PCT/ES2011/070057 WO2011092367A1 (es) | 2010-02-01 | 2011-01-31 | Procedimiento para la producción de interferón alfa 5 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013517788A JP2013517788A (ja) | 2013-05-20 |
JP2013517788A5 JP2013517788A5 (ja) | 2014-03-20 |
JP5830032B2 true JP5830032B2 (ja) | 2015-12-09 |
Family
ID=43920729
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012550482A Active JP5830032B2 (ja) | 2010-02-01 | 2011-01-31 | インターフェロンアルファ5を生産する方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8709757B2 (ja) |
EP (1) | EP2532734B1 (ja) |
JP (1) | JP5830032B2 (ja) |
KR (1) | KR101858598B1 (ja) |
CN (1) | CN102869767B (ja) |
AU (1) | AU2011209506A1 (ja) |
BR (1) | BR112012018956B1 (ja) |
CA (1) | CA2788607C (ja) |
MX (1) | MX2012008893A (ja) |
NZ (1) | NZ601616A (ja) |
RU (1) | RU2575598C9 (ja) |
WO (1) | WO2011092367A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103864915B (zh) * | 2012-12-07 | 2016-06-08 | 天津未名生物医药有限公司 | 纯化重组人干扰素α2b的方法和试剂盒 |
CN104356223B (zh) * | 2014-11-26 | 2017-11-10 | 安徽安科生物工程(集团)股份有限公司 | 高纯度重组人干扰素α2b的制备方法 |
LT6861B (lt) | 2021-04-02 | 2021-11-10 | Kauno technologijos universitetas | Maitinimo profilių, skirtų valdyti pusiau-periodinius rekombinantinių E. coli kultivavimo procesus, formavimo ir adaptavimo būdas |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4973479A (en) | 1982-01-15 | 1990-11-27 | Cetus Corporation | Interferon-α61 |
WO1983002461A1 (en) | 1982-01-19 | 1983-07-21 | Cetus Corp | Multiclass hybrid interferons |
US4511502A (en) | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4855238A (en) * | 1983-12-16 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor |
DE3511011A1 (de) | 1985-03-27 | 1986-10-02 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur isolierung und reinigung von (alpha)-interferonen |
US4765903A (en) | 1987-10-06 | 1988-08-23 | Interferon Sciences, Inc. | Purification of monomeric interferon |
US5814485A (en) * | 1995-06-06 | 1998-09-29 | Chiron Corporation | Production of interferon-β (IFN-β) in E. coli |
AR005035A1 (es) * | 1995-12-11 | 1999-04-07 | Merck Patent Ges Mit Beschränkter Haftung | Procedimiento para preparar proteinas recombinantes en e. coli, mediante fermentacion con gran concentracion de celulas. |
ES2138565B1 (es) | 1998-05-13 | 2000-08-16 | Inst Cientifico Tecnol Navarra | Uso del interferon alfa 5 en el tratamiento de las hepatopatias viral es. |
ITMI20012345A1 (it) | 2001-11-08 | 2003-05-08 | Internat Ct For Genetic En Gin | Procedimento per la produzione di interferone alfa di grado terapeutico |
ZA200504990B (en) * | 2003-01-09 | 2006-08-30 | Genentech Inc | Purification of polypeptides |
WO2005087940A1 (en) * | 2004-03-11 | 2005-09-22 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Genetically altered microorganisms with modified metabolism |
AU2006255122B2 (en) * | 2005-06-03 | 2010-10-21 | Ambrx, Inc. | Improved human interferon molecules and their uses |
EP1990349A1 (en) | 2007-05-09 | 2008-11-12 | Institut Pasteur | Method for the production of high-level soluble human recombinant interferon alpha in E. coli and vectors useful for such a production |
-
2011
- 2011-01-31 BR BR112012018956-5A patent/BR112012018956B1/pt active IP Right Grant
- 2011-01-31 CN CN201180013665.0A patent/CN102869767B/zh active Active
- 2011-01-31 WO PCT/ES2011/070057 patent/WO2011092367A1/es active Application Filing
- 2011-01-31 MX MX2012008893A patent/MX2012008893A/es active IP Right Grant
- 2011-01-31 JP JP2012550482A patent/JP5830032B2/ja active Active
- 2011-01-31 KR KR1020127023051A patent/KR101858598B1/ko active IP Right Grant
- 2011-01-31 US US13/576,068 patent/US8709757B2/en active Active
- 2011-01-31 CA CA2788607A patent/CA2788607C/en active Active
- 2011-01-31 EP EP11712277.0A patent/EP2532734B1/en not_active Not-in-force
- 2011-01-31 RU RU2012137428A patent/RU2575598C9/ru active
- 2011-01-31 NZ NZ601616A patent/NZ601616A/xx unknown
- 2011-01-31 AU AU2011209506A patent/AU2011209506A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ601616A (en) | 2013-04-26 |
CN102869767B (zh) | 2016-03-09 |
KR20120125641A (ko) | 2012-11-16 |
RU2012137428A (ru) | 2014-03-10 |
CA2788607C (en) | 2018-03-20 |
RU2575598C2 (ru) | 2016-02-20 |
AU2011209506A1 (en) | 2012-08-23 |
JP2013517788A (ja) | 2013-05-20 |
US8709757B2 (en) | 2014-04-29 |
BR112012018956A2 (pt) | 2015-09-15 |
CN102869767A (zh) | 2013-01-09 |
EP2532734B1 (en) | 2017-03-15 |
EP2532734A1 (en) | 2012-12-12 |
MX2012008893A (es) | 2013-02-27 |
KR101858598B1 (ko) | 2018-05-16 |
CA2788607A1 (en) | 2011-08-04 |
BR112012018956B1 (pt) | 2022-05-31 |
WO2011092367A1 (es) | 2011-08-04 |
RU2575598C9 (ru) | 2016-04-27 |
US20120309057A1 (en) | 2012-12-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4317890B2 (ja) | 疎水性ポリペプチドの細菌生産 | |
JP4637913B2 (ja) | ヒトインターフェロンベータ変異体 | |
HU202921B (en) | Process for producing coding dns for human tumor necrosis factor the corresponding polypeptide with utilizing them and pharmaceutical compositions containing this polypeptide as active component | |
WO2008096370A2 (en) | An efficient and novel purification method of recombinant hg-csf | |
US6773899B2 (en) | Phage-dependent superproduction of biologically active protein and peptides | |
JP5830032B2 (ja) | インターフェロンアルファ5を生産する方法 | |
Ayed et al. | High level production and purification of human interferon α2b in high cell density culture of Pichia pastoris | |
JP5093783B2 (ja) | Hgf前駆体蛋白質改変体及びその活性型蛋白質 | |
JP2001008697A (ja) | E.コリでの非融合タンパク質の調製方法 | |
JP2022527082A (ja) | コラーゲン7組成物を産生するための系および方法 | |
US20060173167A1 (en) | Process for the purification of recombinant polypeptides | |
EP3057982B1 (en) | Fused proteins of interferon alpha 5 with another cytokine and a process for producing thereof | |
ES2281822T3 (es) | Vectores de expresion, celulas huesped transformadas y procedimiento de fermentacion para la produccion de polipeptidos recombinantes. | |
RU2764787C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая химерный интерферон alpha2b, рекомбинантный штамм дрожжей P. pastoris X33 - продуцент химерного интерферона alpha2b и способ получения указанного белка | |
RU2812047C1 (ru) | Вариант интерферона-бета человека с двойной мутацией и способ улучшения стабильности варианта интерферона-бета человека | |
JPS615096A (ja) | 新規ポリペプチドおよびその製造法 | |
JP2584206B2 (ja) | ヒト癌壊死因子 | |
JPH10234386A (ja) | 成長ホルモン類の製造方法 | |
JP2890326B2 (ja) | 遺伝子及びその製造法 | |
JP2859577B2 (ja) | 肝実質細胞増殖因子 | |
JP3003135B2 (ja) | ポリペプチドの発現ベクター及びポリペプチドの製造法 | |
EP2912173B1 (en) | Process for preparation and purification of recombinant human oncostatin m protein | |
JPH03259092A (ja) | 蛋白質の製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140130 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140130 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150407 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150703 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150929 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151023 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5830032 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |