JPH0229317B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は遺伝子組換体より生産される生理活性
物質の精製法に関するものである。詳しくは遺伝
子組換操作によつて人工的に作られた微生物（細
菌、酵母など）の培養液、もしくは該培養微生物
の破砕抽出液より本発明の生理活性物質を単離精
製する工程において、粗精製状態、または精製が
進んだ状態で、該生理活性物質の水溶液を色素結
合セフアロースカラムクロマトグラフイーに付す
工程を経ることを特徴とする該生理活性物質の精
製法に関する。 （従来技術） ヒトTNF様物質の精製法としては特開昭58−
138383号に限外濾過法、透析法、イオン交換法、
アフイニテイークロマト法、ゲル濾過法、電気泳
動法等を組み合わせた方法の記載があり、更に効
果よく安価に精製するには特異抗体を吸着体とし
たアフイニテイークロマト法を用いることが有効
であるとの記載がある。 （発明が解決しようとする問題点） しかし、前述の種々の方法を組み合わせた場合
には精製操作が繁雑になり、収量の低下を招くこ
とが必至であつた。また特異抗体を用いたアフイ
ニテイークロマト法を用いる場合には抗体の供給
が問題となるばかりか均一なカラムを作製するこ
とが難しく、安定した精製を行なうことが困難で
あるという欠点があつた。 このような精製法ではヒトTNF様物質を安定
して効率的に大量供給することは非常に難しい。 （問題点を解決するための手段） そこで本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、該
生理活性物質の粗精製物をブルーセフアロース、
レツドセフアロースなどの色素結合セフアロース
カラムクロマトグラフイーにかけたところ該生理
活性物質のみが特異的に吸着し、塩濃度あるいは
PHを上げて溶出すると極めて高い回収率で高純度
の該物質を安定して得ることができることを見出
し、本発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明は遺伝子組み換え体により生
産され、Ｌ―Ｍ細胞に対して細胞障害活性を有
し、かつMeth Ａ sarcoma癌細胞を移植した
BALB／ｃマウスに投与した場合にその腫瘍部
位に出血性壊死反応を起こさせる性質を有する生
理活性物質の粗精製液を色素結合セフアロースカ
ラムクロマトグラフイーに付す工程を経ることを
特徴とする該生理活性物質の精製法である。 本発明における生理活性物質とは、遺伝子組換
体より得られる蛋白質であつて、後述のようにＬ
―Ｍ細胞に対して細胞障害活性を有し、マウス
Meth Ａ sarcoma癌細胞を移植したBALB／ｃ
マウスに投与した場合、腫瘍部位に出血性の壊死
反応を起こさせる性質を有する。また、上記の性
質の外に、in vitroで正常細胞にはほとんど有害
な作用をおよぼさないという特徴をもつ。さら
に、本文中で示されるように該生理活性物質は、
ヒト遺伝子に由来するものである。詳しくはウサ
ギの腫瘍壊死因子（以下TNFと略す。）のアミノ
酸配列構造をもとにヒト染色体遺伝子より、通常
の遺伝子組換操作の手法を使つて取り出した
DNAを用いて、人工的に新規のDNAを構築し、
該DNAを組み込んで作成した遺伝子組換体より
生産される蛋白質である。ヒトTNF様物質と考
えられる該生理活性物質は、本来ヒトが備えてい
る蛋白質であることから考えて、安定性があり効
果も高い制癌剤として期待のもてる物質である。 さらに詳しくは、本発明に用いられる生理活性
物質は少なくとも下記のアミノ酸配列を含む蛋白
質である。 Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys
Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln
Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val
Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro
Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Gys Pro Ser
Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val
Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys
Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly
Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg
Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr
Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr
Phe Gly Ile Ile Ala Leu なお、上記配列は下記の略号のＬ―アミノ酸か
らなり、配列の左から右への方向はＮ末端からＣ
末端への方向を示すものである。 Cys：システイン残基 Gln：グルタミン残基 Asp：アスパラギン酸残基 Pro：プロリン残基 Tyr：チロシン残基 Val：バリン残基 Lys：リジン残基 Glu：グルタミン酸残基 Ala：アラニン残基 Asn：アスパラギン残基 Leu：ロイシン残基 Phe：フエニルアラニン残基 Gly：グリシン残基 His：ヒスチジン残基 Ser：セリン残基 Thr：スレオニン残基 Ile：イソロイシン残基 Trp：トリプトフアン残基 Arg：アルギニン残基 本発明に用いられる遺伝子組換体は少なくとも
下記のDNA配列を含むものである。 TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT
GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA
GCA AAC CCH CAA GCT GAG GGG GAG
CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC
AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG
GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG
GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC
CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC
AAG GGC CAA GGC TGG CCC TCC ACC
CAT GTG CTC CTC ACC CAC ATG AGG
CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC
AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC
AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC
CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC
TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG
GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG
GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC
AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT
GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT
GGG ATC ATT GCC CTG なお、上記DNA配列は下記の略号を使用し、
配列の左から右への方向は5′から3′への方向を示
すものである。 Ａ：2′―デオキシアデニル酸残基 Ｃ：2′―デオキシシチジル酸残基 Ｇ：2′―デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 次に、該生理活性物質は以下のようにして得る
ことができる。 １ パクテリオフアージλ／ウサギ染色体遺伝子
ライブラリーとパクテリオフアージλ／ヒト染
色体遺伝子ライブラリーは、ハーバード大学生
化学および分子生物学部（7Divinity Avenue，
Cambridge，Massachusetts 02138，U.S.A.）
のT.Maniatis教授より得ることができる。こ
れらのライブラリーは次の方法によつて作るこ
とができる。〔セル，15巻，687頁1978年
（Ce11，15，p.687（1978））参照〕 (1) ウサギあるいはヒトの組織、たとえばウサ
ギあるいはヒトのすい臓を凍結粉末にし、
RNAと蛋白成分を分解処理し、沈澱によつ
てウサギあるいはヒトの高分子DNAを得る。 (2) この高分子は遺伝子座位をランダムに切る
ために、部分的に分解する。 (3) 得られたDNA断片から分子量分画によつ
て、15から20キロ塩基対（kb）の大きさの
断片を得る。 (4) 得られたDNA断片をλCharon30フアージ
ベクターを用いてクローン化する。 (5) 得られたベクターを、rDNAを含む感染性
のフアージ粒子にin vitroで組み入れ、上記の
ウサギあるいはヒト染色体遺伝子ライブラリー
を得る。 ２ ウサギTNFのcDNAは、P.W.J.Rigdyらの
ニツクトランスレーシヨン法ジヤーナル オブ
モレキユラー バイオロジー113巻 237頁
1977年（j.Mol.Biol.113，p237（1977））参照〕
によつて、 ³²Pでラベル化する。 ３ パクテリオフアージλ／ウサギ染色体遺伝子
ライブラリーとバクテオフアージλ／ヒト染色
体遺伝子ライブラリーのそれぞれを、バクテリ
アの均一層の上に密にプラークができるように
植えつけ、 ³²PでラベルしたウサギTNFの
cDNAとハイブリダイズさせてスクリーニング
した。 ４ 適当なクローンより、対応するDNAを単離
し、制限酵素地図を作り、Southernハイブリ
ダイズ法〔イー・エム・サザン，ジヤーナル
オブ モレキユラー バイオロジー98巻，503
頁，1957年（E.M.Southern，J.Mol.Biol.，98，
p.503（1957））参照〕によつて解析する。 ウサギTNFと該生理活性物質の遺伝子を含
む制限酵素分解された断片を、プラスミドベク
ター中に導入し塩基配列を解析する。 ５ ウサギTNFのcDNA（取得方法は特願昭59−
115496号参照）とウサギTNF遺伝子の塩基配
列を比較して、ウサギTNF遺伝子のエクソン
（ウサギTNFのアミノ酸配列をコードする塩基
配列）とイントロン（ウサギTNFのアミノ酸
配列をコードしない塩基配列）を決定する。 ６ そして、ウサギTNF遺伝子と該生理活性物
質の遺伝子を比較して、該生理活性物質のエク
ソンとイントロンを決定する。 ７ ウサギTNF遺伝子のイントロンを削除しエ
クソンを結合することによつて得られた塩基配
列より決められたウサギTNFのアミノ酸配列
は、ウサギTNFのcDNAの塩基配列より決め
られる同アミノ酸配列と一致することで確認さ
れる。 ８ 次に、該生理活性物質遺伝子のイントロンを
削除しエクソンを結合することによつて得られ
た塩基配列より該生理活性物質のアミノ酸配列
が決められる。該生理活性物質のアミノ酸配列
は、ウサギTNFのアミノ酸配列と部分的に一
致することで確認される。 ９ その後、該生理活性物質をコードするDNA
をin vitroで修飾し、適当な表現ベヒクルに導
入し、そのDNAを含む組換DNAを作成する。 10 このようにして得られた該生理活性物質はそ
の成熟型で、セリンから始まる155個のアミノ
酸残基を持つ。一方、その前配列としてシグナ
ルペプチドを持つ。 各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗号）の使
用頻度が異る等の理由により、アミノ酸配列を変
えることなく、塩基配列の一部または全部を、有
機化学的に合成された人工のDNAに置換えるこ
とも可能である。 該生理活性物質はまた、細胞内で未成熟形態
（プレまたはプレプロペプチド）で産生され成熟
過程（プロセシング）により中間体を経由して成
熟した該生理活性物質となることが推定される。
該生理活性物質のこのような未成熟形態は、該生
理活性物質遺伝子の塩基配列から推定することが
できる。未成熟形態及び中間体の該生理活性物質
をコードする遺伝子を含む該生理活性物質遺伝子
もまた、天然のまたは人工的DNAを用いて組換
を行うことができる。 これらの方法の応用形態の１つは、メチオニン
コドン（ATG）を成熟あるいは未成熟あるいは
中間体TNF遺伝子の5′端に導入することである。
このようにすることにより、適当なプロモータに
よつて合成されるmRNAから成熟あるいは未成
熟あるいは中間体の該生理活性物質が産生され
る。この様にＮ末端に付加されたメチオニン配列
は宿主によつては自然に除去される。 また別の形態としては、シグナル配列と呼ばれ
る疎水性に富んだ配列を付加することにより、宿
主細胞の外またはグラム陰性細菌においては、ペ
リプラズムと呼ばれる部分へ、分泌させることも
可能である。 また、開始コドンを組込んであるベクターの場
合は、ベクターから由来するペプチドと該生理活
性物質との融合ペプチドを形成するが、この場合
は化学的または酵素的に切断するか、もしくは該
生理活性物質の主たる活性に変化がなければ、そ
のまま用いることができる。 このように得られた該生理活性物質遺伝子を、
正しく転写、翻訳が行われるような配列において
プロモーター等の5′領域の遺伝子配列に接続し、
細菌または高等生物細胞中で複製可能なペクター
と接続した組換遺伝子を得、この組換遺伝子によ
つて細菌または高等生物細胞を形質転換し、この
形質転換体を増殖せしめ、該生理活性物質遺伝子
を発現せしめることにより該生理活性物質を得る
ことができる。 宿主として大腸菌を用いる場合は好適にはE.
coli K12株の種々の変異株、例えばHB101
（ATCC33694）、C600K（ATCC33955）、D1210、
RRI（ATCC31343）、MC1061、LE392
（ATCC33572）、JM101（ATCC33876）、JM83、
JM103、x1776（ATCC31244）などが用いられ
る。 大腸菌を宿主とする場合のベクターとしては、
pBR322、pBR325、pBR327、pUC8、pUC9、
pMB9（ATCC37019）、pJB8（ATCC37074）、
pKC7（ATCC37084）等のプラミスドあるいは
λgt、λB、シヤロン4Aのようなλフアージ、
M13フアージなどが用いられる。 大腸菌の菌体中に該生理活性物質を産生させる
ために、大腸菌の遺伝子またはフアージ遺伝子の
プロモーターが使用される。このようなプロモー
ターとして、好適にはラクトース分解酵素
（LAC）のプロモーター及びそのUV5変異、ペニ
シリナーゼ（BLA）、トリプトフアン合成酵素
（TRP）のプロモーター、λフアージのP_Lプロモ
ーターあるいはトリプトフアン合成酵素と、ラク
トース分解酵素の融合プロモーターであるTAC
プロモーター等が用いられる。 枯草菌を宿主とする場合にはBD170株
（ATCC33608）、BR151株（ATCC33677）、
MI112株（ATCC33712）などが用いられ、ベク
ターとしてはpC194（ATCC37034）、pUB110
（ATCC37015）、pSA2100（ATCC37014）、pE194
などのプラスミドなどが用いられる。 枯草菌を宿主とする場合のプロモーターとして
は、クロラムフエニコールアセチル化酵素
（CAT）やペニシリナーゼ、エリスロマイシン耐
性等の遺伝子のプロモーターが用いられる。 酵母を宿主とする場合は、サツカロマイセス・
セレビシエ（Saccharomyces cereviseae）の
RH218株（ATCC44076）、SHY1株
（ATCC44769）、SHY3株（ATCC44771）、
D131A株、483株、830株などが用いられ、その
ベクターとしてはYEp13（ATCC37115）、YEp6、
YRp7、XIp5などのプラスミドが用いられる。 酵母を宿主とする場合、プロモーターとしては
酸性ホスフアターゼ、アルコールデヒドロゲナー
ゼ（ADHI）、トリプトフアン合成酵素（TRP）、
ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）、チトクロ
ームＢ（COB）、アクチン等の遺伝子のプロモー
ターが用いられる。 以上のようにして作成した遺伝子組換体微生物
を通常の方法で大量に培養した後、目的とする該
生理活性物質を産生させ、次いで目的とする該生
理活性物質を抽出単離精製する。 本発明に用いる該生理活性物質の粗精製液とし
ては微生物菌体除去後の培養液、もしくは菌体の
破砕抽出液、あるいは好ましくは硫安分画処理除
核酸処理などの前処理を施したものやイオン交換
樹脂などを用いて部分精製を行なつたものが適当
である。 また本発明でいう色素結合セフアロースとは
Bo¨hmeらのトリアジンカツプリング法〔ジヤー
ナル オブ クロマトグラフイー69巻，209−214
頁，1972年（J.Chromatogr.69（1972）209−
214）〕などによつて種々の色素をセフアロースに
共有結合させたものを指し、具体的な色素の代表
例としてCibacron Blue F3GA（構造式(1)）、
Procion Red HE3B（構造式(2)）がある。 なお色素結合セフアロースとして一般に市販さ
れているものとしては、ブルーセフアロースCL
―6B（フアルマシア社製）、Dye―Matrex〔ブル
ーＡセフアロース、レツドＡセフアロース、グリ
ーンＡセフアロース〕（アミコン社製）などがあ
る。 さらにこれらの色素結合セフアロースを用いた
クロマトの一例を次に示す。 まず該樹脂をカラムに詰めた後0.1M塩化ナト
リウムを含むPH６付近のリン酸緩衝液などで十分
に平衡化し、次いで該生理活性物質を含む粗精製
液を該カラムに供する。その後同緩衝液で十分に
洗浄してから塩化ナトリウム濃度を上げるか、PH
を８以上に上げると該生理活性物質のみが特異的
に溶出してくる。 この際平衡化に使用する緩衝液及びカラムに供
するサンプルのPHは5.5〜6.5の範囲に調整するこ
とが好ましい。 尚、本発明の精製方法によつて得られた精製生
理活性物質の約300単位は、後述のMeth Ａ
sarcoma坦癌マウスを用いる生理活性評価におい
て（＋）の活性を示した。更に、マウス結腸癌
Colon26で坦癌させたBALB／ｃマウスに生理活
性物質の精製物を投与した場合、対照群（生理食
塩水投与群）に比して有意の差を持つて、癌増殖
抑制および退縮効果が認められた。また培養を37
℃で72時間で行なう以外は、後述のＬ―Ｍ細胞に
対する細胞障害活性評価と同様な実験方法で、各
種ヒト癌細胞に対する活性の評価をおこなつた。
用いた細胞は、KB細胞（鼻咽喉癌）、PC―８細
胞（肺癌）、比較対照細胞として正常細胞（ヒト
胎児腎細胞、ヒト胎児***細胞）であつた。その
結果、正常細胞には、ほとんど細胞障害活性が認
められなかつたにもかかわらず、癌細胞には強い
細胞障害活性が認められた。 すなわち本発明の生理活性物質の精製物は、極
めて優れた制癌活性を持ち、しかも、ヒト由来の
蛋白質であることから、今後有用な制癌剤として
期待できるものである。 次に、本発明を実施するにあたつて、行なう評
価方法について以下に詳細を述べる。 (1) in vivo活性測定（Meth Ａ sarcoma坦癌
マウスを用いる活性測定） in vivo法としては、たとえば、Carswellら
の方法、プロシーデイングズ オブ ザ ナシ
ヨナル アカデミー オブ サイエンス オブ
ザ ユナイテツド ステイツ オブ アメリ
カ、72巻，3666頁，1975年（Proc.Nat.Acad.
Sci.USA，72（1975）3666）があげられる。 本発明者らが用いている方法は、これを改良
したものであり、移植したMeth Ａ sarcoma
による腫瘍を該生理活性物質が壊死させる効果
を測定するものである。すなわち、BALB／
ｃマウスの下部皮内に２×10⁵個のMeth Ａ
sarcoma細胞を移植する。７日後、移植した腫
瘍の大きさが直径７〜８mmとなり、出血性壊死
などがなく良好な血行状態にあるマウスを選
び、尾静脈より生理食塩水で希釈した0.5mlの
該生理活性物質試料を注射し、24時間後に次の
判定基準により判定を行なう。 （−）：変化なし （＋）：かすかな出血性壊死 （）： 中程度の出血性壊死（移植ガン表面
の真中から50％以上にわたつて壊死） （）： 顕著な出血性壊死（移植ガンの中央
部が重度に壊死し、周囲のガン組織がわずか
に残つた状態） (2) in vitro活性測定（Ｌ―Ｍ細胞を用いる活性
測定） in vitro法による該生理活性物質活性測定
は、たとえば、ラフ著「リンフオカインズ」イ
ー・ピツク編アカデミツク プレス社肝ニユー
ヨーク1980年，235頁〔Ruff，Lymphokines
Vcl.11，ed.by E.Pick，Academic Press，N.
Y.（1980）235〕、あるいは〔ジヤーナル オブ
イムノロジー，126巻（1981年）1279頁（J.
Immunol.，126（1981）1279）〕の方法があげら
れる。 本発明者らが用いている方法は、これらを改
良したものであり、該生理活性物質がＬ―Ｍ細
胞（アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレク
シヨン、CCL1.2）を殺す効果を測定するもの
である。すなわち、順次培地で希釈した該生理
活性物質試料0.1mlと10⁵個／mlの濃度のＬ―Ｍ
細胞の培地懸濁液0.1mlを96穴の組織培養用マ
イクロプレート（フロー・ラボラトリー社）に
加える。培地は10V／Ｖ％のウシ胎児血清を含
むイーグルのミニマム・エツセンシヤル培地
（その組成は、たとえば、「組織培養」中井順之
助他編修、朝倉書店、1967年に記載されてい
る）を用いる。マイクロプレートを５％の炭酸
ガスを含む空気中、37℃で48時間培養する。培
養終了後、20％グルタルアルデヒド水溶液20μ
を加え細胞を固定する。固定後、マイクロプ
レートを洗浄、乾燥して、0.05％メチレンブル
ー溶液を0.1ml加え、生き残つた細胞を染色す
る。余分なメチレンブルーを洗し流し乾燥した
後、残つたメチレンブルーを３％塩酸溶液で抽
出し、その665nmにおける吸光度をタイターテ
ツク・マルチスキヤン（フロー・ラボラトリー
社）で測定する。この吸光度は、生き残つた細
胞数に比例する。該生理活性物質試料を加えな
い対照の吸光度の50％の値に相当する該生理活
性物質の希釈率を、グラフあるいは計算によつ
て求め、その希釈率を単位（Ｕ）／mlと定義す
る。以下、本発明における該生理活性物質のin
vitro活性は、すべてこの単位で表示される。 (3) 蛋白質定量 蛋白質はローリー等，ジヤーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー，193巻，265頁，
1951年〔Lowry et al.，J.Biol.Chem.，
193p265（1951）〕の方法に従い測定し算出し
た。 なお本発明の実施にあたり、組換DNAの作製
組換体の微生物への導入は、特願昭59−115497に
記載されている方法に従つて実施した。 実施例 １ 特願昭59−115497に記載された方法で調製した
遺伝子組換体pHTNF―Iac UV5―１を含有する
大腸菌を、通常の方法で培養した後、集菌し、該
菌体を0.02Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.8）２
中で破砕して該生理活性物質を含む菌体抽出溶液
を得た。この溶液は5.2×10⁵U／mlの活性を示し、
比活性は4.2×10⁴U／mgであつた。 次いで該抽出液に最終濃度0.7％となるように
ストレプトマイシンを加え、沈澱してきた核酸類
を遠心操作で除いた後の上清を0.02Mトリス―塩
酸緩衝液（PH8.0）で平衡化したDEAEセフアロ
ースCL―6B（フアルマシア社）のカラムに添加
した。同緩衝液で洗浄した後0.1M塩化ナトリウ
ムを含む10mMリン酸緩衝液（PH7.5）で溶出し、
比活性3.90×10⁵U／mgの粗精製液(A)を得た。 上記粗製液(A)を塩酸を用いてPH6.0に調整した
後、0.1M塩化ナトリウムを含む10mMリン酸緩
衝液（PH6.0）で平衡化したブルーセフアロース
のカラムに添加し、十分洗浄してから0.5M塩化
ナトリウムを含む10mMリン酸緩衝液（PH8.0）
で溶出した。その結果を表１に示した。 実施例 ２ 次に実施例１で得た粗精製液(A)を実施例１の方
法でブルーセフアロースによつて精製した場合と
モノクローナル抗体カラムで精製した場合の比較
実験の結果を表２に示した。 なお抗体カラムは0.15M塩化ナトリウムを含む
50mMリン酸緩衝液（PH7.5）で平衡化した後、
粗精製液(A)を添加し、十分洗浄してから0.15M塩
化ナトリウムを含む0.1Mグリシン―水酸化ナト
リウム（PH10.0）で溶出した。 実施例 ３ 実施例１，２ではブルーセフアロースによる精
製の結果を示したが、同じ条件で精製を行なつた
場合、これはレツドセフアロース、グリーンセフ
アロースなどでも代用できることがわかつたので
その結果を表３に示した。 【表】 【表】 【表】 （発明の効果） 以上述べたように本発明の精製方法を用いれ
ば、本発明でいう生理活性物質を極めて高い回収
率で高純度の該物質を安定して得ることができ
る。更に本発明で用いる色素結合セフアロースは
かなり過激な条件下でも繰り返しの使用が可能で
あり、大量スケールへの適応も容易であるという
利点をもつ。 なお本発明者らは該生理活性物質に対するモノ
クローナル抗体を用いたアフイニテイークロマト
グラフイーによる精製も試み、良好な結果を得て
いるが、色素結合セフアロースを用いた場合でも
モノクローナル抗体カラムを用いた時と同等の純
度のものが得られることを確認した。 さらにモノクローナル抗体カラムに比べてパイ
ロジエンフリー化が容易なこと、及び該生理活性
物質に対する吸着容量が大きいという点で色素結
合セフアロースの方が工業的スケールでの精製を
行なう上で優れている。 （吸着容量は例えばブルーセフアロースの場合
には４×10⁶U／１ml樹脂であるが本発明者らが
作成したモノクローナル抗体カラムでは１×
10⁶U／１ml樹脂程度であつた。）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 遺伝子組み換え体により生産され、Ｌ―Ｍ細
   胞に対して細胞障害活性を有し、かつMeth Ａ
   sarcoma癌細胞を移植したBALB／ｃマウスに投
   与した場合にその腫瘍部位に出血性壊死反応を起
   こさせる性質を有する生理活性物質の粗精製液を
   色素結合セフアロースカラムクロマトグラフイー
   に付す工程を経ることを特徴とする該生理活性物
   質の精製法。