JP2020520671A - 抗体−サイトカイングラフト化タンパク質及び使用方法 - Google Patents

抗体−サイトカイングラフト化タンパク質及び使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、細胞内シグナル伝達を刺激する、且つ癌、免疫療法及び代謝障害の治療において有用であるものを含めた、抗体サイトカイングラフト化（ＡＣＥ）タンパク質を提供する。詳細には、提供されるＡＣＥタンパク質組成物は野生型サイトカインタンパク質と比べて好ましい生物学的効果を提供する。例えば、提供されるＡＣＥタンパク質は、対応する組換えサイトカイン製剤と比べて向上した半減期、安定性及び産生性を付与し得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／５１０５７３号の利益を主張するものであり、この仮特許出願の内容は、全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、抗体−サイトカイングラフト化（ＡＣＥ）タンパク質、化合物、及び治療方法に関する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。２０１８年５月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５７６２４−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、４，３８９，０５５バイトのサイズである。
ヘリカルサイトカインは、総ヘリックス含有量が７０〜９０％の、４〜７個のαヘリックスで構成されるコンパクトな分子である。いずれのヘリカルサイトカインもシグネチャエレメントは４ヘリックス束であり、その両親媒性ヘリックスはほぼ逆平行の形で配置され、疎水性アミノ酸の大部分がヘリックス束の内側にある内部疎水性コアの形成に関与する。
４αヘリックス束は、ある共通の特徴を呈する。初めて４ヘリックス束タンパク質を調べたのはＷｅｂｅｒ及びＳａｌｅｍｍｅであった（Ｗｅｂｅｒ ａｎｄ Ｓａｌｅｍｍｅ，Ｎａｔｕｒｅ １９８０；２８７：８２−８４）。その研究の中では、考察された４−ヘリックス束は、アップ−ダウン−アップ−ダウントポロジーで配置された逆平行ヘリックスであった。Ｐｒｅｓｎｅｌｌによる研究において、ヘリックスがアップ−アップ−ダウン−ダウンコンホメーションで配置されたヘリカルサイトカインのトポロジーを含め、この種のタンパク質トポロジーが、より大規模なデータセットを使用して更に定義付けられた（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ １９８９；８６：６５９２−６５９６）。
幾つかの４ヘリックス束タンパク質は、ＩＬ−６、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）、ＩＬ−１１及びＩＬ−３１を含め、シグナル伝達が受容体サブユニットＧＰ１３０によって媒介されるサイトカインファミリーに属する（Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ １９９９；２７４：５７５５−５７６１）。従って、これらのサイトカインは、一部には、何らかのユニークな生物学的活性にも関わらず機能上の重複を示す（Ｎｅｇａｈｄａｒｉｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．２０１６；３２：４１−６１）。ＧＰ１３０に加えて、幾つかの他の受容体サブユニットがこのファミリーのシグナル伝達に関与し得る。
説明
本開示は、抗体のＣＤＲ配列にグラフト化されたサイトカインを提供し、今後、これらの抗体サイトカイングラフト化タンパク質（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｅｎｇｒａｆｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＡＣＥタンパク質として知られることになる。詳細には、提供されるＡＣＥタンパク質組成物は、野生型サイトカインタンパク質と比べて好ましい生物学的効果を提供する。例えば、提供されるＡＣＥタンパク質は、対応する組換えサイトカイン製剤と比べて向上した半減期、安定性及び産生性を付与し得る。本開示は、
（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；及び（ｂ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）；及び（ｃ）ＶＨ又はＶＬのＣＤＲにグラフト化されたサイトカイン分子を含むＡＣＥタンパク質を提供する。一部の実施形態において、サイトカイン分子はＣＤＲに直接グラフト化される。一部の実施形態において、サイトカイン分子はインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）でない。
一部の実施形態において、サイトカイン分子は重鎖ＣＤＲにグラフト化される。
一部の実施形態において、重鎖ＣＤＲは、相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）又は相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）から選択される。
一部の実施形態において、サイトカイン分子はＨＣＤＲ１にグラフト化される。
一部の実施形態において、サイトカイン分子はＨＣＤＲ２にグラフト化される。
一部の実施形態において、サイトカイン分子はＨＣＤＲ３にグラフト化される。
一部の実施形態において、サイトカイン分子は軽鎖ＣＤＲにグラフト化される。
一部の実施形態において、軽鎖ＣＤＲは、相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）又は相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）から選択される。
一部の実施形態において、サイトカイン分子はＬＣＤＲ１にグラフト化される。
一部の実施形態において、サイトカイン分子はＬＣＤＲ２にグラフト化される。
一部の実施形態において、サイトカイン分子はＬＣＤＲ３にグラフト化される。
一部の実施形態において、サイトカイン分子はペプチドリンカーなしにＣＤＲに直接グラフト化される。
一部の実施形態において、サイトカイン（ｃｙｔｏｌｉｎｅ）分子は、表１から選択される分子である。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質はＩｇＧクラス抗体重鎖を更に含む。
一部の実施形態において、ＩｇＧクラス重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４から選択される。
一部の実施形態において、標的タンパク質に対するＣＤＲの結合特異性はグラフト化サイトカイン分子によって低下する。
一部の実施形態において、標的タンパク質に対するＣＤＲの結合特異性がグラフト化サイトカイン分子によって１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％低下する結合。
一部の実施形態において、標的タンパク質に対するＣＤＲの結合特異性はグラフト化サイトカイン分子の存在下で保持される。
一部の実施形態において、標的タンパク質に対するＣＤＲの結合特異性はグラフト化サイトカイン分子の存在下で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％保持される。
一部の実施形態において、ＣＤＲの結合特異性はサイトカイン分子の結合特異性と異なる。
一部の実施形態において、ＣＤＲの結合特異性は非ヒト抗原に対するものである。
一部の実施形態において、非ヒト抗原はウイルスである。
一部の実施形態において、ウイルスは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である。
一部の実施形態において、ＲＳＶは、ＲＳＶサブグループＡ又はＲＳＶサブグループＢから選択される。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質の抗体足場部分はヒト化又はヒトである。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質の抗体足場はパリビズマブである。
一部の実施形態において、受容体に対するグラフト化サイトカイン分子の結合親和性は遊離サイトカイン分子と比較して増加する。
一部の実施形態において、受容体に対するグラフト化サイトカイン分子の結合親和性は遊離サイトカイン分子と比較して低下する。
一部の実施形態において、受容体に対するグラフト化サイトカイン分子の結合アビディティは遊離サイトカイン分子と比較して増加する。
一部の実施形態において、受容体に対するグラフト化サイトカイン分子の結合アビディティは遊離サイトカイン分子と比較して低下する。
一部の実施形態において、２つ以上の受容体に対するグラフト化サイトカイン分子の差次的結合親和性又はアビディティは遊離サイトカイン分子と比較して変化する。
一部の実施形態において、グラフト化サイトカイン分子の活性は遊離サイトカイン分子と比較して増加する。
一部の実施形態において、グラフト化サイトカイン分子の活性は遊離サイトカイン分子と比較して低下する。
本明細書に開示される一部の実施形態は、（ａ）ＨＣＤＲ１、（ｂ）ＨＣＤＲ２、及び（ｃ）ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、ＨＣＤＲ配列の各々が表２に示される重鎖可変領域と、（ｄ）ＬＣＤＲ１、（ｅ）ＬＣＤＲ２、及び（ｆ）ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＬＣＤＲ配列の各々が表２に示される軽鎖可変領域とを含むＡＣＥタンパク質を提供し、ここでＣＤＲにサイトカイン分子がグラフト化される。
本明細書に開示される一部の実施形態はＡＣＥタンパク質を提供し、但し、ＩＬ１０サイトカインを含むＡＣＥタンパク質は除外するものとする。
本明細書に開示される一部の実施形態はＡＣＥタンパク質を提供し、但し、表３に示されるＡＣＥタンパク質は除外するものとする。
本明細書に開示される一部の実施形態は、表２に示されるＶＨを含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、表２に示されるＶＬを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＡＣＥタンパク質を提供し、ここでＶＨ又はＶＬにサイトカイン分子がグラフト化される。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質は、低下したエフェクター機能に対応する修飾Ｆｃ領域を更に含む、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
一部の実施形態において、修飾Ｆｃ領域は、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの１つ以上から選択される突然変異を含む、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
一部の実施形態において、修飾Ｆｃ領域は、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの１つ以上から選択される突然変異の組み合わせを含む、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
一部の実施形態において、Ｆｃ領域突然変異はＤ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａである。
本明細書に開示される一部の実施形態は、表２に示されるとおりの重鎖可変領域及び／又は表２に示されるとおりの軽鎖可変領域を含むＡＣＥタンパク質をコードする単離核酸を提供し、ここで重鎖可変領域又は軽鎖可変領域にサイトカイン分子がグラフト化される。
本明細書に開示される一部の実施形態は、本明細書に開示される核酸を含む、ＡＣＥタンパク質の産生に好適な組換え宿主細胞を提供する。
一部の実施形態において、組換え宿主細胞は哺乳類細胞株である。
一部の実施形態において、哺乳類細胞株はＣＨＯ細胞株である。
本明細書に開示される一部の実施形態は、ＡＣＥタンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
本明細書に開示される一部の実施形態は、それを必要としている個体の疾患を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書に開示される医薬組成物の治療有効量を個体に投与することを含む。
一部の実施形態において、疾患は癌である。
一部の実施形態において、癌は、黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌及びリンパ腫からなる群から選択される。
一部の実施形態において、医薬組成物は別の治療剤と併用して投与される。
一部の実施形態において、治療剤は免疫チェックポイント阻害薬である。
一部の実施形態において、免疫チェックポイントに対するアンタゴニストは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲからなる群から選択される。
一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は抗ＴＩＭ３抗体である。
一部の実施形態において、疾患は免疫関連障害である。
一部の実施形態において、免疫関連障害は、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、乾癬、Ｉ型糖尿病、急性膵炎、ぶどう膜炎、シェーグレン病、ベーチェット病、サルコイドーシス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、全身性エリテマトーデス、白斑、慢性予防的急性移植片対宿主病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｃｕｔｅ ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）（ｐＧｖＨＤ）、ＨＩＶ誘発性脈管炎、円形脱毛症、全身性硬化症モルフェア（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｍｏｒｐｈｏｅａ）、及び原発性抗リン脂質症候群からなる群から選択される。
一部の実施形態において、医薬組成物は別の治療剤と併用して投与される。
一部の実施形態において、治療剤は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、ナタリズマブ、及びベドリズマブからなる群から選択される抗ＴＮＦ剤である。
一部の実施形態において、治療剤は、スルファサラジン、メサラミン、バルサラジド、オルサラジン及び他の５−アミノサリチル酸誘導体からなる群から選択されるアミノサリチル酸剤である。
一部の実施形態において、治療剤は、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、ブデソニド（ｂｕｄｅｎｉｓｏｎｉｄｅ）、メサラミン、及びデキサメタゾンからなる群から選択されるコルチコステロイドである。
一部の実施形態において、治療剤は抗細菌剤である。
本明細書に開示される一部の実施形態は、疾患の治療における、（ａ）ＨＣＤＲ１（ｂ）ＨＣＤＲ２（ｃ）ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、ＨＣＤＲ配列の各々が表２に示される重鎖可変領域と、（ｄ）ＬＣＤＲ１、（ｅ）ＬＣＤＲ２、及び（ｆ）ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＬＣＤＲ配列の各々が表２に示される軽鎖可変領域とを含むＡＣＥタンパク質の使用を提供し、ここでＣＤＲにサイトカイン分子がグラフト化される。
一部の実施形態において、疾患は癌である。
一部の実施形態において、癌は、黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌及びリンパ腫からなる群から選択される。
一部の実施形態において、医薬組成物は別の治療剤と併用して投与される。
一部の実施形態において、治療剤は免疫チェックポイント阻害薬である。
一部の実施形態において、免疫チェックポイントに対するアンタゴニストは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲからなる群から選択される。
一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は抗ＴＩＭ３抗体である。
一部の実施形態において、疾患は免疫関連障害である。
一部の実施形態において、免疫関連障害は、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、乾癬、Ｉ型糖尿病、急性膵炎、ぶどう膜炎、シェーグレン病、ベーチェット病、サルコイドーシス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、全身性エリテマトーデス、白斑、慢性予防的急性移植片対宿主病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｃｕｔｅ ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）（ｐＧｖＨＤ）、ＨＩＶ誘発性脈管炎、円形脱毛症、全身性硬化症モルフェア（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｍｏｒｐｈｏｅａ）、及び原発性抗リン脂質症候群からなる群から選択される。
一部の実施形態において、医薬組成物は別の治療剤と併用して投与される。
一部の実施形態において、治療剤は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、ナタリズマブ、及びベドリズマブからなる群から選択される抗ＴＮＦ剤である。
一部の実施形態において、治療剤は、スルファサラジン、メサラミン、バルサラジド、オルサラジン及び他の５−アミノサリチル酸誘導体からなる群から選択されるアミノサリチル酸剤である。
一部の実施形態において、治療剤は、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、ブデソニド（ｂｕｄｅｎｉｓｏｎｉｄｅ）、メサラミン、及びデキサメタゾンからなる群から選択されるコルチコステロイドである。
一部の実施形態において、治療剤は抗細菌剤である。
特定の実施形態において、ＡＣＥタンパク質はＩｇＧクラス抗体Ｆｃ領域を含む。詳細な実施形態において、抗体Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４サブクラスＦｃ領域から選択される。一部の実施形態において、抗体は、任意選択で、Ｆｃ受容体への抗体の結合を調節する（即ち増加又は低下させる）少なくとも１つの修飾を含む。抗体Ｆｃ領域は、任意選択で、修飾されたエフェクター機能を付与する修飾を含み得る。詳細な実施形態において、抗体Ｆｃ領域は、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａのいずれかから選択されるエフェクター機能の低下を付与する突然変異を含み得る。一部の実施形態において、Ｆｃ突然変異はＤ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａである。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質はまた、野生型サイトカイン又はその変異体も含む。この変異は、単一のアミノ酸変化、単一のアミノ酸欠失、複数のアミノ酸変化及び複数のアミノ酸欠失であってもよい。例えば、分子のサイトカイン部分の差異（ｖａｒａｔｉｏｎ）により、サイトカイン受容体に対するＡＣＥタンパク質の親和性が減少又は増加し得る。
一部の実施形態において、ＩＬ１０野生型又は変異体サイトカインは除外される。他の実施形態において、表３に開示されるとおりのＩＬ１０ ＡＣＥタンパク質は除外される。一部の実施形態において、実施例３９、実施例４０、実施例４１、実施例４２、実施例４３、実施例４４、実施例４５、実施例４６、実施例４７、実施例４８、実施例４９、実施例５０、又は実施例４１からのＩＬ１０ ＡＣＥタンパク質は除外される。
更には、本開示は、本明細書に記載されるとおりのＡＣＥタンパク質の少なくとも重鎖及び／又は軽鎖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。別の関連する態様において、本開示は、本明細書に記載されるとおりのＡＣＥタンパク質の産生に好適な宿主細胞を更に提供する。詳細な実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載のＡＣＥタンパク質をコードする核酸を含む。更に別の態様において、ＡＣＥタンパク質の作製方法が提供され、この方法は、ＡＣＥタンパク質の発現、形成、及び分泌に好適な条件下で本明細書に記載されるとおりの提供される宿主細胞を培養すること、及び培養物からＡＣＥタンパク質を回収することを含む。更なる態様において、本開示は、本明細書に記載されるとおりのＡＣＥタンパク質を含むキットを更に提供する。
別の関連する態様において、本開示は、本明細書に記載されるとおりのＡＣＥタンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物を更に提供する。一部の実施形態において、本開示は、個体に投与するためのＡＣＥタンパク質を含む医薬組成物を提供する。
定義
「抗体」は、四量体構造単位を含む免疫グロブリンファミリーの分子を指す。各四量体が２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対が、ジスルフィド結合で結び付けられた１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）とを有する。認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκ又はλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、又はεに分類され、ひいてはこれが免疫グロブリンクラス、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを定義する。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）、又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）であり得る。
軽鎖及び重鎖は両方とも、構造的及び機能的相同性領域に分けられる。構造的及び機能的に、用語「定常」及び「可変」が用いられる。各鎖のＮ末端は、抗原認識に一義的に関与する約１００〜１１０アミノ酸又はそれ以上の可変（Ｖ）領域又はドメインを画成する。用語の可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）は、それぞれ軽鎖及び重鎖のこれらの領域を指す。ＶＨとＶＬとが共に対になって単一の抗原結合部位を形成する。Ｖ領域に加え、重鎖及び軽鎖は両方とも定常（Ｃ）領域又はドメインを含む。分泌型の免疫グロブリンＣ領域は、３つのＣドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、任意選択でＣＨ４（Ｃμ）、及びヒンジ領域で構成される。膜結合型の免疫グロブリンＣ領域はまた、膜ドメイン及び細胞内ドメインを有する。各軽鎖はＮ末端にＶＬを有し、続いてその他端に定常ドメイン（Ｃ）を有する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合など、重要な生物学的特性を付与する。慣習上、定常領域ドメインの番号は、抗原結合部位又は抗体のアミノ末端から遠位になるに従い大きくなる。Ｎ末端が可変領域であり、Ｃ末端が定常領域である；実際にはＣＨ３及びＣＬドメインが、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端ドメインを含む。ＶＬはＶＨと整列し、及びＣＬは重鎖の第１の定常ドメインと整列する。本明細書で使用されるとき、「抗体」は、従来の抗体構造及び変種の抗体を包含する。従って、この概念の範囲内には、ＡＣＥタンパク質、完全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びその抗体断片がある。
抗体は、インタクトな免疫グロブリン鎖として存在するか、又は様々なペプチダーゼによる消化によって産生される幾つもの十分に特徴付けられた抗体断片として存在する。用語「抗体断片」は、本明細書で使用されるとき、６つのＣＤＲを保持している抗体の１つ以上の一部分を指す。従って、例えば、ペプシンがヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化すると、それ自体軽鎖がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結したものであるＦａｂ’の二量体、Ｆ（ａｂ）’２が産生される。Ｆ（ａｂ）’２を穏和条件下で還元するとヒンジ領域のジスルフィド結合が壊れ、それによりＦ（ａｂ）’２二量体がＦａｂ’単量体に変換され得る。Ｆａｂ’単量体は本質的に、ヒンジ領域の一部分を有するＦａｂである（Ｐａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３ｄ ｅｄ．（１９９３））。様々な抗体断片がインタクトな抗体の消化という観点で定義されているが、当業者は、かかる断片が化学的に、或いは組換えＤＮＡ方法を用いることによりデノボ合成されてもよいことを理解するであろう。本明細書で使用されるとき、「抗体断片」は、全抗体の修飾によって作製されるか、又は組換えＤＮＡ方法を用いてデノボ合成されるかのいずれかの、結合特異性及び機能活性を保持している抗体の１つ以上の一部分を指す。抗体断片の例としては、同じ結合特異性を備えたＦｖ断片、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ（Ｖｈ及びＣＨ１ドメイン）、ｄＡｂ（Ｖｈ及び単離ＣＤＲ）；及びこれらの断片の多量体型（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）が挙げられる。ＡＣＥタンパク質はまた、所望の結合特異性及び活性を実現するのに必要な抗体断片も含み得る。
「Ｆａｂ」ドメインは、この文脈で使用されるとき、重鎖可変ドメイン、定常領域ＣＨ１ドメイン、軽鎖可変ドメイン、及び軽鎖定常領域ＣＬドメインを含む。これらのドメインの相互作用はＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間のジスルフィド結合によって安定している。一部の実施形態において、Ｆａｂの重鎖ドメインはＮ末端からＣ末端にＶＨ−ＣＨの順序であり、Ｆａｂの軽鎖ドメインはＮ末端からＣ末端にＶＬ−ＣＬの順序である。一部の実施形態において、Ｆａｂの重鎖ドメインはＮ末端からＣ末端にＣＨ−ＶＨの順序であり、Ｆａｂの軽鎖ドメインはＣＬ−ＶＬの順序である。Ｆａｂ断片は歴史的にはインタクトな免疫グロブリンのパパイン消化によって同定されたが、この開示の文脈において、「Ｆａｂ」は、典型的には任意の方法により組換えで作製される。各Ｆａｂ断片は抗原結合に関して一価であり、即ちそれは単一の抗原結合部位を有する。
「相補性決定ドメイン」又は「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）は、同義的に、ＶＬ及びＶＨの超可変領域を指す。ＣＤＲは、抗体鎖の中でかかる標的タンパク質に対する特異性を備えた標的タンパク質結合部位である。各ヒトＶＬ又はＶＨ中に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３、Ｎ末端から連続的に番号付けされる）があり、可変ドメインの約１５〜２０％を占める。ＣＤＲは、標的タンパク質のエピトープに対して構造的に相補的であり、したがって、結合特異性に直接関与している。ＶＬ又はＶＨの残りの区間、いわゆるフレームワーク領域（ＦＲ）は、アミノ酸配列の変化をあまり示さない（Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ４．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００）。
ＣＤＲ及びフレームワーク領域の位置は、当該技術分野における様々な周知の定義、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及びＡｂＭ（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２，Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２０５−２０６（２００１）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３（１９８９）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７９９−８１７（１９９２）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７−７４８（１９９７）を参照）を用いて決定され得る。抗原結合部位の定義は、以下にも記載されている：Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２１９−２２１（２０００）；及びＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２０７−２０９（２００１）；（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２７，５５−７７（２００３）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２−７４５（１９９６）；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９２６８−９２７２（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０３：１２１−１５３（１９９１）；及びＲｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１４１−１７２（１９９６）。
Ｋａｂａｔに基づけば、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基は３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と付番され；及びＶＬのＣＤＲアミノ酸残基は２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と付番される。Ｃｈｏｔｈｉａに基づけば、ＶＨのＣＤＲアミノ酸は２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と付番され；及びＶＬのアミノ酸残基は２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と付番される。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲはヒトＶＨにおいてアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）、及びヒトＶＬにおいてアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）からなる。
「抗体可変軽鎖」又は「抗体可変重鎖」は、本明細書で使用されるとき、それぞれＶＬ又はＶＨを含むポリペプチドを指す。内因性ＶＬは遺伝子セグメントＶ（可変）及びＪ（連結）によってコードされ、及び内因性ＶＨはＶ、Ｄ（多様性）、及びＪによってコードされる。ＶＬ又はＶＨの各々はＣＤＲ並びにフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。用語「可変領域」又は「Ｖ領域」は、同義的に、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む重鎖又は軽鎖を指す。Ｖ領域は天然に存在するもの、組換え又は合成であってもよい。本願において、時折、抗体軽鎖及び／又は抗体重鎖はまとめて「抗体鎖」と称することができる。本明細書に提供され及び更に記載されるとおり、「抗体可変軽鎖」又は「抗体可変重鎖」及び／又は「可変領域」及び／又は「抗体鎖」は任意選択で、ＣＤＲに組み込まれたサイトカインポリペプチド配列を含む。
本明細書における免疫グロブリン重鎖の、例えばＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＣ末端部分は、「Ｆｃ」ドメインである。「Ｆｃ領域」は、本明細書で使用されるとき、第１の定常領域（ＣＨ１）免疫グロブリンドメインを除外した抗体の定常領域を指す。Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらのドメインの可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧについては、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３並びにＣγ１とＣγとの間のヒンジを含む。当該技術分野においては、Ｆｃ領域の境界は様々であり得るが、しかしながらヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常は残基Ｃ２２６又はＰ２３０〜そのカルボキシル末端まで（使用する付番はＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａ．）にあるＥＵインデックスに従う）を含むと定義されることが理解される。「Ｆｃ領域」は、この領域を単独で指すこともあり、又は抗体若しくは抗体断片のコンテクストでこの領域を指すこともある。「Ｆｃ領域」は、例えばエフェクター機能を調節する修飾を含め、Ｆｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体を例えばＣＨ２及びＣＨ３領域に含む。Ｆｃ領域はまた、生物学的機能に変化をもたらさない変異体も含む。例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から、生物学的機能を実質的に失うことなく１つ以上のアミノ酸が欠失される。例えば、特定の実施形態においてＣ末端リジンが修飾され、置き換えられ、又は除去される。詳細な実施形態においてＦｃ領域の１つ以上のＣ末端残基が変更又は除去される。特定の実施形態においてＦｃの１つ以上のＣ末端残基（例えば、末端リジン）が欠失される。特定の他の実施形態においてＦｃの１つ以上のＣ末端残基が別のアミノ酸で置換される（例えば、末端リジンが置き換えられる）。かかる変異体は、活性に及ぶ効果が最小限となるように当該技術分野において公知の一般的規則に従い選択される（例えば、Ｂｏｗｉｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：３０６−１３１０，１９９０を参照のこと）。Ｆｃドメインは、ＦｃＲなどの細胞受容体によって認識される免疫グロブリン（Ｉｇ）の一部分であり、そこに補体活性化タンパク質Ｃ１ｑが結合する。ＣＨ２エクソンの５’部分にコードされる下方のヒンジ領域は、ＦｃＲ受容体への結合のための抗体内の可動性を提供する。
「キメラ抗体」は、（ａ）異なる又は変更されたクラス、エフェクター機能及び／又は種の定常領域、又はそのキメラ抗体に新規特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、及び薬物に抗原結合部位（可変領域）が連結するように定常領域、又はその一部分が変更され、置き換えられ、又は交換されている；又は（ｂ）異なる又は変更された抗原特異性を有する可変領域によって可変領域、又はその一部分が変更され、置き換えられ、又は交換されている抗体分子である。
「ヒト化」抗体は、ヒトにおいて免疫原性が低いながらも非ヒト抗体の反応性（例えば、結合特異性、活性）を保持している抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、且つ抗体の残りの部分をヒト対応物に置き換えることによって実現し得る。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，３１（３）：１６９−２１７（１９９４）を参照のこと。
「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方が、ヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。更に、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列、又はヒト生殖系列配列の突然変異型、又は例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，２０００）に記載されるような、ヒトフレームワーク配列分析から得られるコンセンサスフレームワーク配列を含む抗体に由来する。ヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異によって、又はインビボでの体細胞突然変異によって、又は安定性若しくは製造を促進するための保存的置換によって導入される突然変異）。
「対応するヒト生殖系列配列」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変領域配列によってコードされる全ての他の公知の可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列又はサブ配列との最も高い決定されたアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列又はサブ配列をコードする核酸配列を指す。対応するヒト生殖系列配列はまた、全ての他の評価された可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列又はサブ配列との最も高いアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列又はサブ配列を指し得る。対応するヒト生殖系列配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワーク及び相補性決定領域、可変セグメント（上で定義されるような）、又は可変領域を含む配列若しくはサブ配列の他の組み合わせであり得る。配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又は当該技術分野において公知の別のアラインメントアルゴリズムを用いて、２つの配列を整列する、本明細書に記載される方法を用いて決定され得る。対応するヒト生殖系列核酸又はアミノ酸配列は、参照可変領域核酸又はアミノ酸配列との少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有し得る。
用語「価数」は、本明細書で使用されるとき、ポリペプチド中の潜在的な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、１つの標的分子又は標的分子の特異的部位に特異的に結合する。ポリペプチドが２つ以上の標的結合部位を含むとき、各標的結合部位は同じ又は異なる分子に特異的に結合し得る（例えば、異なる分子、例えば異なる抗原、又は同じ分子上の異なるエピトープに結合し得る）。従来の抗体は、例えば２つの結合部位を有し、二価であり；「三価」及び「四価」は、抗体分子にそれぞれ３つの結合部位及び４つの結合部位が存在することを指す。ＡＣＥタンパク質は、一価（即ち、１つの標的分子に結合する）、二価、又は多価（即ち、２つ以上の標的分子に結合する）であり得る。
語句「特異的に結合する」は、標的（例えば、タンパク質）とＡＣＥタンパク質との間の相互作用について記載する文脈で使用されるとき、タンパク質及び他の生物学的物質の異種集団中、例えば、生体試料、例えば、血液、血清、血漿又は組織試料中の標的の存在を決定付ける結合反応を指す。従って、特定の指定される条件下では、特定の結合特異性を有するＡＣＥタンパク質は特定の標的にバックグラウンドの少なくとも２倍結合し、その試料中に存在する他の標的に有意な量で結合することは実質的にない。一実施形態において、指定される条件下では、特定の結合特異性を有するＡＣＥタンパク質は特定の抗原にバックグラウンドの少なくとも１０倍結合し、その試料中に存在する他の標的に有意な量で結合することは実質的にない。かかる条件下でのＡＣＥタンパク質との特異的結合には、ＡＣＥタンパク質が特定の標的タンパク質に対するその特異性に関して選択されている必要があり得る。本明細書で使用されるとき、特異的結合は、ヒトサイトカイン受容体に選択的に結合するＡＣＥタンパク質を含み、例えば他のサイトカイン受容体スーパーファミリーメンバーと交差反応するＡＣＥタンパク質を含まない。一部の実施形態において、ヒトサイトカイン受容体に選択的に結合し、且つ非ヒト霊長類サイトカイン受容体（例えばカニクイザル）と交差反応するＡＣＥタンパク質が選択される。一部の実施形態において、ヒトサイトカイン受容体に選択的に結合し、且つ更なる標的と反応する抗体グラフト化タンパク質が選択される。特定の標的タンパク質と特異的反応性を示すＡＣＥタンパク質の選択には、種々のフォーマットが用いられ得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが、タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するのに日常的に使用される（例えば、特異的免疫反応性を決定するのに使用され得るイムノアッセイ形式及び条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８）を参照されたい）。典型的に、特異的又は選択的結合反応は、バックグラウンドシグナルの少なくとも２倍、より典型的に、バックグラウンドより少なくとも１０〜１００倍、シグナルを生成するであろう。
「平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）」という用語は、解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を結合速度定数（ｋａ、時間−１、Ｍ−１）で除算した値を指す。平衡解離定数は、当該技術分野における任意の公知の方法を用いて測定され得る。ＡＣＥタンパク質は、一般に、約１０−７又は１０−８Ｍ未満、例えば、約１０−９Ｍ又は１０−１０Ｍ未満、ある実施形態において、約１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ又は１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数を有するであろう。
本明細書で使用されるとき、用語「エピトープ」又は「結合領域」は、抗体ＣＤＲと抗原タンパク質との間の特異的結合に関与する抗原タンパク質におけるドメインを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「受容体−サイトカイン結合領域」は、グラフト化されたサイトカインとその受容体との間の特異的結合に関与するＡＣＥタンパク質のグラフト化されたサイトカイン部分におけるドメインを指す。各ＡＣＥタンパク質に少なくとも１つのかかる受容体−サイトカイン結合領域が存在し、結合領域の各々は他と同一であることも、又は異なることもある。
用語「アゴニスト」は、受容体を活性化させて完全な又は部分的な受容体媒介性応答を誘導する能力を有する抗体を指す。例えば、サイトカイン受容体のアゴニストは受容体に結合し、サイトカイン媒介性細胞内シグナル伝達、細胞活性化及び／又はＴ細胞増殖を誘導する。ＡＣＥタンパク質アゴニストは、幾つかの点で天然サイトカインと同様にＩＬ２高親和性受容体を通じたシグナル伝達を刺激する。例えば、サイトカインがその受容体に結合すると下流シグナル、例えばＪａｋ１及びＪａｋ３活性化が誘導され、それによりＳＴＡＴ５リン酸化がもたらされる。一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質アゴニストは、その受容体に結合し、且つ細胞増殖などの生物学的効果又はＳＴＡＴ５リン酸化を誘導するその能力によって同定することができる。
用語「ＡＣＥタンパク質」又は「抗体サイトカイングラフト化分子」又は「グラフト化された」は、少なくとも１つのサイトカインが抗体のＣＤＲ内に直接取り込まれ、ＣＤＲの配列に割り込んでいることを意味する。サイトカインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２又はＬＣＤＲ３内に取り込むことができる。サイトカインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２又はＬＣＤＲ３内に取り込み、ＣＤＲのＮ末端配列の方に、又はＣＤＲのＣ末端配列の方に取り込むことができる。ＣＤＲ内に取り込まれたサイトカインは、元の標的タンパク質に対する抗体部分の特異的結合を中断させてもよく、又はＡＣＥタンパク質は、その標的タンパク質に対するその特異的結合を保持していてもよい。
用語「単離された」は、核酸又はタンパク質に適用されるとき、核酸又はタンパク質に自然状態でそれが関連している他の細胞成分が本質的に含まれないことを意味する。これは好ましくは均一状態にある。これは乾燥又は水溶液のいずれかである。純度及び均一性は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を用いて決定される。調製物中に存在する優勢種であるタンパク質が、実質的に精製される。詳細には、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接し、且つ目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと分離されている。用語「精製される」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルに本質的に１つのバンドを生じさせることを意味する。特に、これは核酸又はタンパク質が少なくとも８５％純度、より好ましくは少なくとも９５％純度、及び最も好ましくは少なくとも９９％純度であることを意味する。
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、一本鎖形態又は二本鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びこれらのポリマーを指す。具体的に限定しない限り、この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、且つ天然に存在するヌクレオチドと同じように代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸が包含される。特に指示されない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に指示される配列のみならず、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選ばれた（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基に置換されている配列を作成することにより実現し得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では、アミノ酸残基のポリマーを指して同義的に使用される。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
「アミノ酸」という用語は、天然、及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合されたα−炭素を指す。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一の若しくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定される全ての位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変化させずに、記載される対応するコドンのいずれかに変化され得る。このような核酸変化は、「サイレント変異」であり、これは、保存的に修飾された変異の１種である。ポリペプチドをコードする、本明細書における全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を説明する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常はトリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一の分子を生じるように修飾され得ることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、それぞれの記載される配列において黙示的なものである。
アミノ酸配列に関して、コード配列における単一のアミノ酸又はごく一部のアミノ酸を変化させ、付加し又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加は、その変化が化学的に同様のアミノ酸によるアミノ酸置換をもたらす場合に「保存的に修飾された変異体」であることは、当業者であれば認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である。このような保存的に修飾された変異体は、多型変異体、種間相同体、及び対立遺伝子に対して追加的なものであり、それらを除外しない。以下の８つの群の各々は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。
「配列同一性パーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントした配列を比較ウィンドウにわたって比較することにより決定され、ここでポリヌクレオチド配列のうち比較ウィンドウ内にある部分は、２つの配列の最適アラインメントのため、付加又は欠失を含まない参照配列（例えばポリペプチド）と比較したとき付加又は欠失（即ちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が現れる位置の数を決定してマッチする位置の数を求め、そのマッチする位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性パーセンテージを求めることにより計算される。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一である」又はパーセント「同一性」という用語は、２つ以上の配列又はサブ配列が同じ配列でこと程度を指す。以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、又は手作業でのアラインメント及び目視検査によって測定したとき、２つの配列が比較ウィンドウ、又は指示領域にわたって最大限対応するように比較及びアラインメントしたときに同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドを指定のパーセンテージだけ有する（即ち、参照配列の指定の領域にわたって、又は指定されない場合には配列全体にわたって少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する）場合に、２つの配列は「実質的に同一である」。本開示は、本明細書に例示されるそれぞれポリペプチド又はポリヌクレオチド（例えば、表２の配列番号のいずれか１つに例示される可変領域と実質的に同一であるポリペプチド又はポリヌクレオチドを提供する。同一性は、参照配列の少なくとも約１５、２５又は５０ヌクレオチド長の領域にわたって、又はより好ましくは１００〜５００又は１０００ヌクレオチド長又はそれ以上の領域にわたって、又は完全長にわたって存在する。アミノ酸配列に関して、同一性又は実質的な同一性は、参照配列の少なくとも５、１０、１５又は２０アミノ酸長、任意選択で少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５又は１００アミノ酸長、任意選択で少なくとも約１５０、２００又は２５０アミノ酸長の領域にわたって、又は完全長にわたって存在し得る。より短いアミノ酸配列、例えば、２０アミノ酸以下のアミノ酸配列に関しては、１又は２アミノ酸残基が本明細書に定義される保存的置換に従い保存的に置換されているとき、実質的な同一性が存在する。
配列比較のために、典型的に、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列が、コンピュータに入力され、サブ配列が、指定され、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータが使用され得るか、又は代替パラメータが指定され得る。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比べた試験配列に対する配列同一性パーセントを計算する。
本明細書において使用される際の「比較ウィンドウ」は、２つの配列が最適に整列された後、配列が、同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る、２０〜６００、通常、約５０〜約２００、より通常は、約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの部分相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は手動によるアラインメント及び視覚的検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５補遺）を参照）によって行われ得る。
配列同一性及び配列類似性パーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎによって公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列される場合、いくつかの正の値の閾値スコア（ｓｏｍｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｖａｌｕｅｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｃｏｒｅ）Ｔと一致するか、又はそれを満たす、クエリー配列中の短いワード長Ｗを同定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．上掲）。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見するための検索を開始させるためのシードとして働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿った両方の方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基のペアに関する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致の残基に関するペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するのに使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘだけ減少する場合；１つ又は複数の負のスコアの残基アラインメントの累積のため、累積スコアが、ゼロ以下になる場合；又はいずれかの配列の末端に到達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）、及び５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照）アラインメントｓ（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７，を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは、約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列と類似すると考えられる。
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、後述されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応することである。従って、例えば、２つのペプチドの保存的置換のみが異なる場合、ポリペプチドは、典型的に、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、後述されるように、２つの分子又はその補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることの更に別の指標は、同じプライマーを用いて、配列を増幅することができることである。
用語「連結」又は「連結された」は、本発明のＡＣＥタンパク質内で結合領域がどのようにつながっているかについて記載する文脈で使用されるとき、それらの領域を物理的に結び付ける可能なあらゆる手段を包含する。多数の結合領域が高頻度で共有結合（例えば、ペプチド結合又はジスルフィド結合）又は非共有結合などの化学結合によって結び付けられ、これは直接結合（即ち、２つの結合領域間にリンカーなし）又は間接的結合（即ち、２つ以上の結合領域間に少なくとも１つのリンカー分子の助けを借りる）のいずれかであり得る。
用語「対象」、「患者」、及び「個体」は、同義的に、哺乳類、例えばヒト又は非ヒト霊長類哺乳類を指す。哺乳類はまた、実験動物哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターであることもある。一部の実施形態において、哺乳類は、農業動物哺乳類（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）又は家庭内動物哺乳類（例えば、イヌ、ネコ）であることもある。
本明細書において使用される際、任意の疾患又は障害の「治療する」、「治療すること」、又は「治療」という用語は、一実施形態において、疾患又は障害を改善すること（即ち、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つの発生を減速するか又は停止させるか又は軽減すること）を指す。別の実施形態において、「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、患者によって認識できないものを含む少なくとも１つの物理的パラメータを軽減又は改善することを指す。更に別の実施形態において、「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、疾患又は障害を、身体的に、（例えば、認識できる症状の安定化）、生理学的に、（例えば、物理的パラメータの安定化）、又はその両方で調節することを指す。更に別の実施形態において、「治療する」、「治療している」、又は「治療」は、疾患又は障害の発生又は発症又は進行を妨げる又は遅らせることを指す。
「治療的に許容できる量」又は「治療的に有効な用量」という用語は、所望の結果（即ち、腫瘍容積の低減）をもたらすのに十分な量を同義的に指す。ある実施形態において、治療的に許容できる量は、望ましくない副作用を誘導しないか、又は引き起こさない。治療的に許容できる量は、最初は低用量を投与し、次に、所望の効果が達成されるまでその用量を徐々に増加することによって決定され得るＡＣＥタンパク質の「予防的に有効な投与量」、及び「治療的に有効な投与量」は、癌に関連する症状を含む疾患の症状の、開始を防止するか、又はその重症度の低下及び癌治療をもたらし得る。
「同時投与する」という用語は、個体中の２つ（以上）の活性薬剤の同時の存在を指す。同時投与される活性薬剤は、同時に又は連続的に送達され得る。
本明細書で使用されるとき、語句「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、方法又は組成物に含まれる医薬活性薬剤の属又は種、並びにその方法又は組成物の意図される目的のための任意の不活性担体又は賦形剤を指す。一部の実施形態において、語句「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、ＡＣＥタンパク質以外の１つ以上の追加的な活性薬剤の包含を明示的に除外する。一部の実施形態において、語句「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、ＡＣＥタンパク質以外の更なる追加的な活性薬剤及び第２の共投与される薬剤の包含を明示的に除外する。
用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象を含む。
図１Ａ〜図１Ｃは、４ヘリックス束サイトカイントポロジーの概略図である。ａ）上記出典（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９８９）に見られるとおりのＡ〜Ｄの番号を付したヘリックスの左巻き配置。ｂ）短鎖及び長鎖サイトカインファミリーについてのヘリックスの二次元接続概略図。ｃ）ｂ）と比べてＡ／Ｂ及びＣ／Ｄオーバーハンドループに挿入されたヘリックスを示すインターフェロンファミリー、ＩＬ１０の二次元接続概略図。 図２Ａ〜図２Ｄは、種々の４ヘリックス束サイトカインファミリーの構造の多様性の例を示し、ヘリックスには、Ｎ末端からＣ末端に、文字による連続番号を付す。ａ）短鎖サイトカインＩＬ４、ｂ）長鎖サイトカイン、ＩＬ６、ｃ）別のＩＬ単量体と互いにかみ合わせて機能性二量体を生じさせるために利用されるＥＦヘリックスモチーフの単量体ＩＬ１０配置を示すＩＬ１０ファミリー、ｃ）この場合は単量体６ヘリックス束を形成するＩＬ１０ファミリーの別のメンバー、ＩＬ２２。 図３：図３Ａ〜図３Ｂは、ＣＤ８及びＣＤ４細胞上のＩＬ７ ＡＣＥタンパク質の活性を示す。 （上記の通り。） 図４：図４ＡはＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞に対するＩＬ７ ＡＣＥタンパク質のｐＳＴＡＴ５活性を比較する。図４ＢはｐＳＴＡＴ５によって測定したときのＣＤ８ Ｔ細胞に対するＩＬ７ ＡＣＥタンパク質の濃度増加の効果を示す。図４ＣはｐＳＴＡＴ５によって測定したときのＣＤ４ Ｔ細胞に対するＩＬ７ ＡＣＥタンパク質の濃度増加の効果を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） 図５：図５Ａ〜図５Ｄは、ＣＤ８ Ｔ細胞増殖の増加を実証するＩＬ７ ＡＣＥタンパク質の薬力学を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 図６：図６Ａ〜図６ＢはＩＬ７ ＡＣＥタンパク質が単剤として腫瘍成長を低下させることを実証する。図６Ｃは血中のＣＤ８ Ｔ細胞の増加を示す。図６ＤはＩＬ７ ＡＣＥタンパク質の投与時のＣＤ８腫瘍浸潤リンパ球の増加を示す。図６ＥはＩＬ７ ＡＣＥタンパク質の投与時のＣＤ４腫瘍浸潤リンパ球の増加を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） ＩＬ７ ＡＣＥタンパク質と抗ＰＤ−Ｌ１抗体との相乗的併用のグラフ表示である。 それぞれＨＣＤＲ２又はＨＣＤＲ３に挿入されたＩＬ７の構造図である。 様々なＩＬ７抗体サイトカイングラフト化タンパク質によるＲＳＶへの結合のグラフである。 ＩＬ７抗体サイトカイングラフト化タンパク質が組換えＩＬ７よりも長い半減期を有することを示すＧｙｒｏｓアッセイである。 ＩＬ７抗体サイトカイングラフト化タンパク質を単剤として投与したとき、及びＩＬ７抗体サイトカイングラフト化タンパク質を抗ＰＤ−Ｌ１抗体と併用して投与したときの血中でのＣＤ８＋細胞の拡大を示すＦＡＣＳプロット及びグラフである。 ＩＬ７抗体サイトカイングラフト化タンパク質が、単独でも、又は抗ＰＤ−Ｌ１との併用でも、Ｔｉｍ−３の低下を誘導することを示す。 ＩＬ７抗体サイトカイングラフト化タンパク質の投与時の血中のナイーブ、セントラルメモリー及びエフェクターメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞の総数の増加を示す。 ＩＬ７抗体サイトカイングラフト化タンパク質の投与がＣＤ８＋ ＰＤ−１＋細胞の増加もまた誘導することを実証する。 ＩＬ７抗体サイトカイングラフト化タンパク質の投与が、単剤として、又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体との併用で、ウイルス負荷を低減可能であったことを示す。 ＩＬ７抗体サイトカイングラフト化タンパク質の投与が、抗ＰＤ−Ｌ１との併用で、ＩＦＮ−γの増加を生じさせたことを実証する。 ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１がＴｒｅｇを優先的に拡大することを示す、抗体サイトカイングラフト化構築物の表である。この図はまた、作り出された幾つものＡＣＥタンパク質も示す。６つ全てのＣＤＲ及びＨＣＤＲ１のＮ末端（ｎＨ１）、ＨＣＤＲ１のＣ末端（ｃＨ１）、ＨＣＤＲ２のＮ末端（ｎＨ２）、及びＨＣＤＲ２のＣ末端（ｃＨ２）に野生型ＩＬ２をクローニングした。野生型をＬＣＤＲ２にグラフト化すると、ＡＣＥタンパク質は発現しなかった。 抗体サイトカイングラフト化タンパク質を組換えＩＬ２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））と比較する表である。ＳＴＡＴ５リン酸化によって測定したとき、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１分子はＴｒｅｇ細胞上のＩＬ２受容体を刺激するが、Ｔエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）又はＮＫ細胞上のＩＬ２受容体は刺激しないことに留意されたい。この分子はまた、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）より長い半減期も有し、インビボで一層のＴｒｅｇ細胞拡大を引き起こす。 種々の免疫調節細胞型のパネルにおける等モル用量の抗体サイトカイングラフト化タンパク質、例えば、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１をＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比較したときの変化倍数の表である。 Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比較したときの、及びＳＴＡＴ５リン酸化によって測定したときの、抗体サイトカイングラフト化タンパク質によるＩＬ２低親和性又は高親和性受容体の差次的活性化に関する実験データを示す。ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１が、Ｔｒｅｇ細胞に発現するがＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔｃｏｎ細胞には発現しない高親和性ＩＬ２受容体を刺激することに留意されたい。 抗体サイトカイングラフト化タンパク質（例えばＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１）で拡大したＴｒｅｇがＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）よりも良好な抑制因子であるというグラフを示す（上のパネルを参照）。下のパネルは、抗体サイトカイングラフト化タンパク質によって拡大したＴｒｅｇ細胞が、Ｆｏｘｐ３タンパク質発現により、及びＦｏｘｐ３メチル化により安定することを示す。 抗体サイトカイングラフト化タンパク質が、ＩＬ２低親和性受容体を発現するＮＫ細胞に効果をほとんど乃至全く及ぼさないことを示す。対照的に、ｐＳＴＡＴ５活性化によって測定したときＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）はＮＫ細胞を刺激する。 カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）におけるＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比較した抗体サイトカイングラフト化タンパク質の薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）及び毒性プロファイルを示す。例えば、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比べてはるかに低い好酸球増加毒性プロファイルを有する。 ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９．Ｈ１の半減期延長を示すグラフである。 マウスＧｖＨＤモデルにおける抗体サイトカイングラフト化タンパク質分子に関するグラフの例示を示す。これは、このモデルにおける抗体サイトカイングラフト化タンパク質による治療がＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも良好にＴｒｅｇを拡大する一方、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ細胞又はＮＫ細胞にはほとんど乃至全く効果を及ぼさないことを示す。 ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９．Ｈ１の投与に伴う体重減少がほとんどない一方での、ＧｖＨＤマウスモデルにおけるＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）治療に伴う体重減少に関するグラフを示す。 前糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおける抗体サイトカイングラフト化タンパク質とＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）との比較を示し、このモデルでＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１が１型糖尿病を予防することを実証する。 前糖尿病ＮＯＤマウスモデルにおけるＴｒｅｇ対ＣＤ８ Ｔエフェクター細胞比の比較を示す。 １．３ｍｇ／ｋｇ用量でのＮＯＤマウスモデルにおけるＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１の薬物動態を示す。 ０．４３ｍｇ／ｋｇ用量でのＮＯＤマウスモデルにおけるＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１の薬物動態を示す。 前糖尿病ＮＯＤマウスモデルにおいて使用した用量範囲の表であり、等モル量のＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）を比較する。 ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９．Ｈ１で処理したヒト細胞上のｐＳＴＡＴ５活性化の量を図示する一連のグラフである。細胞は、健常ドナー及び白斑を有するドナーから採取した。 ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９．Ｈ１で処理したヒト細胞上のｐＳＴＡＴ５活性化の量を図示する一連のグラフである。細胞は、健常ドナー及び１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）から採取した。 様々なＩＬ２抗体サイトカイングラフト化タンパク質によるＲＳＶへの結合のグラフである。 ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１の単回投与後のカニクイザルにおけるＴｒｅｇ拡大を示す。 例示的ＩＬ２抗体サイトカイングラフト化タンパク質及びＣＤ８ Ｔエフェクター細胞に対するその活性を要約した表である。 ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも長い半減期を有することを示す。ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１はグラフに示されるとおり１２〜１４時間の半減期を有する一方、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は４時間未満のＴ１／２を有し、グラフ上に図示することができない。 図３８：図３８Ａ〜図３８Ｃは、４日目、８日目及び１１日目の時点で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて１００μｇ等価用量のＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）又はＩＬ２−Ｆｃ融合分子よりも有効に且つ低い毒性でＣＤ８＋ Ｔエフェクター細胞を拡大することを実証する。図３８Ｄ〜図３８Ｆは、４日目、８日目及び１１日目の時点で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて５００μｇ等価用量のＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）又はＩＬ２−Ｆｃ融合分子よりも有効に且つ低い毒性でＣＤ８＋ Ｔエフェクター細胞を拡大することを実証する。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 図３９：図３９ＡはＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がＮＯＤマウスにおいてＣＤ８ Ｔエフェクターを選択的に拡大し、且つＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも良好に忍容されることを示す。図３９ＢはＮＯＤマウスにおけるＣＤ８ Ｔエフェクターに対するＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｆ７１Ａ．Ｈ１の活性の増加を示す表である。 （上記の通り。） ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の単剤有効性のグラフである。 Ｂ１６メラノーママウスモデルにおける単剤としての、又は抗体との併用でのいずれかでのＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のデータを提示する。このグラフは、抗ＴＲＰ１抗体であるＴＡ９９と併用したＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１が、ＴＡ９９単独、ＩＬ２−Ｆｃ融合分子単独又はＴＡ９９＋ＩＬ２−Ｆｃ融合物よりも有効であることを示す。１００及び５００μｇ用量のＴＡ９９及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１で相乗作用が見られた。 ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２にグラフトしたＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１をＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）及び天然ＩＬ−２（ムテインなし）と比較するヒト細胞のパネルにおけるｐＳＴＡＴ５をモニタする値のグラフである。 様々なＩＬ２抗体サイトカイングラフト化タンパク質によるＲＳＶへの結合のグラフである。 等モル量の天然ヒトＩＬ−６又はＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質で刺激したヒト全血中におけるＩＬ−６依存性ｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ４、及びｐＳＴＡＴ５シグナル伝達のＣｙＴＯＦ分析の結果を示す。 ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞等に対する様々なＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質のｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ３、及びｐＳＴＡＴ５活性のＣｙＴＯＦデータの結果を示す。 図４６：図４６Ａ〜図４６Ｂは、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＤＩＯマウスでのＩＬ−６Ｆｃ ＧｙｒｏｓアッセイにおけるＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質ＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｈ２及びＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｈ３の半減期を示す折れ線グラフを示す。 （上記の通り。） 皮下投与後にホスホ−Ｓｔａｔ３（ｐＳＴＡＴ３）によって測定したＣ５７Ｂｌ／６ ＤＩＯマウスの脂肪及び筋組織におけるＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質のインビボ活性を示すドットプロットを示す。 図４８：図４８Ａ〜図４８Ｃは、皮下投与後の体重（Ａ）、脂肪組織（Ｂ）及び除脂肪組織（Ｃ）の変化によって測定したＣ５７Ｂｌ／６ ＤＩＯマウスにおけるＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質のインビボ活性を示す折れ線グラフを示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） 図４９：図４９Ａ〜図４９Ｃは、投与前（Ａ）、皮下投与後３〜５日目（Ｂ）及び７〜９日目（Ｃ）の呼吸交換比（ＲＥＲ）によって測定したＣ５７Ｂｌ／６ ＤＩＯマウスにおけるＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質のインビボ活性を示す折れ線グラフを示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） 図５０：図５０Ａ〜図５０Ｅは、皮下投与後の体重（Ａ）、摂餌量（Ｂ）、全体脂肪量（Ｃ）、除脂肪量（Ｄ）及び前脛骨筋重量（７Ｅ）の変化によって測定したペアフィードＣ５７Ｂｌ／６ ＤＩＯマウスにおける摂餌量に対するＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質のインビボ活性を示すグラフを示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 図５１：図５１Ａ〜図５１Ｂは、組換えヒトＩＬ１０（ｒｈＩＬ１０、灰色の四角）及びＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３抗体サイトカイングラフト化タンパク質（黒色の三角）のインビトロ生物学的アッセイの結果を示す。図５１Ａは、ＣＤ８ Ｔ細胞アッセイにおけるＩＦＮγ誘導によって測定したとき、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３がｒｈＩＬ１０と比較して炎症誘発活性の低下を実証したことを示す。同様の差次的活性がヒト初代ＮＫ細胞、Ｂ細胞、及びマスト細胞において、並びにグランザイム−Ｂをリードアウト測定値として使用して見られた。図５１Ｂは、全血アッセイにおけるＴＮＦαの阻害によって測定したときｒｈＩＬ１０及びＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３が同様の抗炎症活性を実証することを示す。 （上記の通り。） 等モル量の組換えヒトＩＬ１０ ｒｈＩＬ１０（左側のパネル）又はＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３（右側のパネル）で刺激したヒト全血におけるＩＬ１０依存性ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のＣｙＴＯＦ分析の結果を示す。ＩＬ１０は単球において抗炎症活性を誘導する；及びＴ、Ｂ又はＮＫ細胞の活性化は炎症誘発性サイトカインを誘導する。非刺激と比べた細胞活性の変化倍数の結果をヒートマップ（陰影の変化）によって示す。左側のパネルは、ｒｈＩＬ１０が全てのＩＬ１０感受性細胞型にわたって刺激を付与すること（囲み線）を示す；しかしながら、右側のパネルに見られるとおり、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３はＴ、Ｂ、及びＮＫ細胞に対して非刺激細胞と同程度か、又はそれをやや上回るレベルの効力の低い刺激を付与する；一方で単球（囲み線を付す）及びｍＤＣ細胞の刺激の効力が同程度であることがＩｇＧ−ＩＬ１０及びｒｈＩＬ１０で実証された。これらの関連性のある細胞型（単球、ｍＤＣ）は、炎症性腸疾患における腸の恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｓ）維持の鍵となる細胞である。 図５３：図５３Ａ〜図５３Ｄは、インビボアッセイにおける抗体サイトカイングラフト化タンパク質ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３の向上した特性を示す。図５３Ａ〜図５３Ｂは、ｒｈＩＬ１０及びＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３の薬物動態試験の結果を示す。静脈内投与後、抗体サイトカイングラフト化タンパク質が４．４日後にもなお検出可能である（図５３Ｂ）のに対し、ｒｈＩＬ１０は約１時間の半減期を有した（図５３Ａ）とおり、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３は長い薬物動態（半減期）を実証した。図５３Ｃ及び図５３Ｄは、抗体サイトカイングラフト化タンパク質のインビボ活性の薬力学アッセイの結果を示す。図５３Ｃは、投与後７２時間のｐＳＴＡＴ３シグナル伝達によって測定したときの結腸組織におけるインビボ活性を示す。図５３Ｄは、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３投与後のＬＰＳチャレンジに応答したＴＮＦαの阻害によって測定したときのｒｈＩＬ１０と比較したＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３のインビボ応答の持続期間の向上を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） ＬＰＳチャレンジモデルの結果であり、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３がＬＰＳチャレンジ後４８時間においてＴＮＦα誘導を低下させることを実証する。 ＩＬ１０抗体サイトカイングラフト化タンパク質の％ＣＭＡＸの向上を表すグラフである。 ｒｈＩＬ１０又はＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３で刺激したときの健常対象及び患者からの様々な免疫細胞におけるｐＳＴＡＴ３活性のＣｙＴＯＦデータを示す。 ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３がｒｈＩＬ１０と比較してＰＨＡ刺激ヒト全血において低下した炎症誘発活性を有することを実証するグラフ表現である。 ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３がｒｈＩＬ１０と比較してＰＨＡ刺激ヒト全血において低下した炎症誘発活性を有することを実証するグラフ表現である。 ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３がｒｈＩＬ１０と比較してＰＨＡ刺激ヒト全血において低下した炎症誘発活性を有することを実証するグラフ表現である。 ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３がｒｈＩＬ１０と比較してＰＨＡ刺激ヒト全血において低下した炎症誘発活性を有することを実証するグラフ表現である。 ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３がｒｈＩＬ１０と比較してＰＨＡ刺激ヒト全血において低下した炎症誘発活性を有することを実証するグラフ表現である。 ｒｈＩＬ１０及びＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３によるタイトレーション実験のグラフを示す。 抗体サイトカイングラフト化タンパク質の凝集特性と比較した、Ｆｃにリンカーを介してコンジュゲートしたときのＩＬ１０野生型又は単量体の凝集特性を示す。 抗体サイトカイングラフト化タンパク質の凝集特性と比較した、Ｆｃにリンカーを介してコンジュゲートしたときのＩＬ１０野生型又は単量体の凝集特性を示す。 ＩＬ１０抗体サイトカイングラフト化タンパク質がなおもＲＳＶに結合することを示すＥＬＩＳＡデータである。 ＩＬ１０抗体サイトカイングラフト化タンパク質の作用機構の表現である。左側のパネルは、正常なｒｈＩＬ１０二量体がどのようにＩＬ−１０Ｒ１に結合し、強力なｐＳＴＡＴ３シグナル伝達を惹起するかを示す。右側のパネルは、抗体のＣＤＲにグラフト化されたＩＬ１０単量体がどのようにＩＬ−１０Ｒ１に対して低効率の結合となるように制約され、ひいては弱いｐＳＴＡＴ３シグナルを生じるかを示す。 図６７Ａ〜図６７Ｃは、パリビズマブのＬＣＤＲ１にグラフト化されたＩＬ１０単量体の結晶構造分解である。 異なる抗体足場にグラフト化されたＩＬ１０ ＡＣＥタンパク質のＩＣ５０値を示すグラフ及び表である。 異なる抗体足場にグラフト化されたＩＬ１０ ＡＣＥタンパク質のＩＣ５０値を示すグラフ及び表であり、ここでＩＬ１０サイトカインは異なるＣＤＲにグラフト化される。 図７０：図７０Ａは異なる抗体足場にグラフト化したＩＬ２ ＡＣＥタンパク質による治療後のマウスモデルにおけるＣＤ８＋ Ｔエフェクター細胞の拡大を示す。図７０Ｂは異なる抗体足場にグラフト化したＩＬ２ ＡＣＥタンパク質による治療後のマウスモデルにおけるＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞の拡大を示す。図７０Ｃは異なる抗体足場にグラフト化したＩＬ２ ＡＣＥタンパク質による治療後のマウスモデルにおけるＮＫ細胞の拡大を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 そのそれぞれのＡＣＥタンパク質についてのｐＳＴＡＴ活性を示すＣｙＴＯＦデータである。 Ｈ１、Ｈ３及びＬ３ Ｆｌｔ３Ｌグラフトが組換えヒトＦｌｔ３Ｌで観察されるものと同等のＢ２２０＋ ＣＤ１１ｃ＋形質細胞ＤＣ分化（上のパネル）及びＣＤ３７０＋ ＤＣ１分化（下のパネル）の誘導能を有することを示す。上のプロットは生存シングレット細胞でゲーティングしている。下のプロットは、ＣＤ１１ｃ＋である生存シングレット細胞でゲーティングしている。 ＧＭ−ＣＳＦサイトカイングラフトが、細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮの上方制御及びＣＤ１４の下方制御からも明らかなとおり、単球ＤＣ分化の誘導能を有することを示す。イベントは、パリビズマブグラフト対照がこれらの細胞変化を誘導しなかったとおり、ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ含有グラフトと培養した細胞に特異的であった。 ＧＭ−ＣＳＦグラフトで生成された単球ＤＣがＴＬＲ７／８活性化に対する応答能を有することを示す。十分に特徴付けられたＴＬＲ７／８アゴニストであるＲ８４８と細胞を一晩インキュベートし、細胞活性化のマーカーとして細胞表面ＣＤ８６上方制御を測定した。野生型ヒトＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦグラフトで生成された単球ＤＣも等しくＲ８４８シミュレーション後にＣＤ８６の上方制御能を有したことから、ＧＭ−ＣＳＦグラフトで生成された単球ＤＣが機能性であることが指摘される。
ＡＣＥタンパク質
本明細書に開示される実施形態は、（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び（ｂ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；及び（ｃ）ＶＨ又はＶＬのＣＤＲにグラフト化されたサイトカイン分子を含むＡＣＥタンパク質を提供する。
一部の実施形態において、サイトカイン分子はＣＤＲに直接グラフト化される。一部の実施形態において、サイトカイン分子はペプチドリンカーなしにＣＤＲに直接グラフト化され、ＣＤＲ配列とサイトカイン配列との間に追加的なアミノ酸はない。
一部の実施形態において、ＣＤＲにグラフト化されるサイトカイン分子は４ヘリックス束サイトカインファミリーに属する。例えば、サイトカイン分子は、表１に挙げられるものから選択されてもよい。一部の実施形態において、サイトカイン分子はインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）ではない。一部の実施形態において、完全長サイトカイン分子がＣＤＲにグラフト化される。一部の実施形態において、シグナルペプチドのないサイトカイン分子がＣＤＲにグラフト化される。
理論によって拘束されるものではないが、サイトカイン分子を抗体足場のＣＤＲ配列に直接グラフト化することにより、サイトカインの天然コンホメーションがＣＤＲ配列又は抗体足場の他の部分によって修飾されることも、又は修飾されないこともあり、その結果、グラフト化サイトカイン分子の特性に変化が起こり得ることが企図される。例えば、サイトカイン分子がグラフト化されるＣＤＲ配列の長さに応じて、１つ又は複数の受容体へのその結合、並びに１つ又は複数の受容体を介したそのシグナル伝達が負又は正の影響を受け得る。
従って、一部の実施形態において、受容体に対するＡＣＥタンパク質のグラフト化サイトカイン分子の結合親和性は遊離サイトカイン分子と比較して増加する。例えば、受容体に対するＡＣＥタンパク質のグラフト化サイトカイン分子の結合親和性は遊離サイトカイン分子と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１，０００倍、又はそれ以上増加する。
一部の実施形態において、受容体に対するＡＣＥタンパク質のグラフト化サイトカイン分子の結合親和性は遊離サイトカイン分子と比較して低下する。例えば、受容体に対するＡＣＥタンパク質のグラフト化サイトカイン分子の結合親和性は遊離サイトカイン分子と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％低下する。
一部の実施形態において、受容体に対するＡＣＥタンパク質のグラフト化サイトカイン分子の結合アビディティは遊離サイトカイン分子と比較して増加する。例えば、受容体に対するＡＣＥタンパク質のグラフト化サイトカイン分子の結合アビディティは遊離サイトカイン分子と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１，０００倍、又はそれ以上増加する。
一部の実施形態において、受容体に対するＡＣＥタンパク質のグラフト化サイトカイン分子の結合アビディティは遊離サイトカイン分子と比較して低下する。例えば、受容体に対するＡＣＥタンパク質のグラフト化サイトカイン分子の結合アビディティは遊離サイトカイン分子と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％低下する。
一部の実施形態において、２つ以上の受容体に対するＡＣＥタンパク質のグラフト化サイトカイン分子の差次的結合親和性又はアビディティは遊離サイトカイン分子と比較して変化する。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質のグラフト化サイトカイン分子の活性は遊離サイトカイン分子と比較して増加する。例えば、ＡＣＥタンパク質のグラフト化サイトカイン分子の活性、例えば、細胞増殖活性、抗細胞増殖活性、アポトーシス活性、炎症誘発活性、抗炎症活性等は、遊離サイトカイン分子と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１，０００倍、又はそれ以上増加する。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質のグラフト化サイトカイン分子の活性は遊離サイトカイン分子と比較して低下する。例えば、ＡＣＥタンパク質のグラフト化サイトカイン分子の活性、例えば、細胞増殖活性、抗細胞増殖活性、アポトーシス活性、炎症誘発活性、抗炎症活性等は、遊離サイトカイン分子と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％低下する。
一部の実施形態において、グラフト化される抗体サイトカインは、遊離サイトカイン分子よりも優れた抗炎症特性を付与する。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、遊離サイトカイン分子と比較したときＴｒｅｇ細胞に対する活性の増加を付与する一方で、比例した炎症誘発活性の低下を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、Ｔｅｆｆ細胞、Ｔｃｏｎ細胞、及び／又はＮＫ細胞と比べたＴｒｅｇ細胞の優先的活性化を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、Ｔｅｆｆ細胞、Ｔｃｏｎ細胞、及び／又はＮＫ細胞と比べたＴｒｅｇ細胞の優先的拡大を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ＣＤ８ Ｔエフェクター細胞又はＮＫ細胞の拡大なしにＴｒｅｇ細胞の拡大増加を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０である、およそそれである、それより大きいＴｒｅｇ細胞：ＮＫ細胞拡大比を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０である、およそそれである、それより大きいＴｒｅｇ細胞：ＣＤ８ Ｔエフェクター細胞拡大比を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０である、およそそれである、それより大きいＴｒｅｇ細胞：ＣＤ４ Ｔｃｏｎ細胞拡大比を提供する。
一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、遊離サイトカイン分子と比較してＣＤ４ Ｔｃｏｎ細胞において低下するＩＬ−２Ｒシグナル伝達効力を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、遊離サイトカイン分子と比較してＣＤ８ Ｔｅｆｆ細胞において低下した受容体シグナル伝達効力を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、遊離サイトカイン分子と比較してＮＫ細胞において低下した受容体シグナル伝達効力を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、遊離サイトカイン分子の約１，０００倍、約２，０００倍、約３，０００倍、約４，０００倍、約５，０００倍、約６，０００倍、約７，０００倍、約８，０００倍、約９，０００倍、約１０，０００倍、又はそれ以上高いＣＤ４ Ｔエフェクター細胞と比べたＴｒｅｇ細胞の特異的活性化を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、遊離サイトカイン分子の約１００倍、約２００倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍、約１，０００倍、又はそれ以上高いＣＤ８ Ｔエフェクター細胞と比べたＴｒｅｇ細胞の特異的活性化を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、遊離サイトカイン分子の約１００倍、約２００倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍、約１，０００倍、又はそれ以上高いＣＤ８ Ｔエフェクター／記憶細胞と比べたＴｒｅｇ細胞の特異的活性化を提供する。
一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、遊離サイトカイン分子と比較して、毒性の低下を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、４時間超、６時間超、８時間超、１２時間超、２４時間超、４８時間超、３日超、４日超、７日超、１４日超、又はそれ以上など、半減期の増加を提供する。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、サイトカイン分子の結合特異性と異なる標的に対する免疫グロブリン可変ドメインの結合特異性を有する重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。一部の実施形態において、免疫グロブリン可変ドメインのその標的に対する結合特異性は、グラフト化サイトカインの存在下で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％保持される。特定の実施形態において、保持される結合特異性は非ヒト標的に対するものである。特定の実施形態において、保持される結合特異性はウイルス、例えばＲＳＶに対するものである。他の実施形態において、結合特異性は、サイトカイン分子と併せて治療的有用性を有するヒト標的に対するものである。特定の実施形態において、免疫グロブリンの結合特異性のターゲティングにより、サイトカインに追加的な治療利益が付与される。特定の実施形態において、免疫グロブリンのその標的に対する結合特異性により、サイトカインとの相乗活性が付与される。
なおも他の実施形態において、免疫グロブリンのその標的に対する結合特異性は、サイトカイン分子のグラフト化によって１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％低下する。
ＩＬ７Ｒａを標的とするＡＣＥタンパク質
本明細書には、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）にグラフト化されたＩＬ７分子を含むＡＣＥタンパク質が提供される。本開示のＡＣＥタンパク質はヒト患者における使用に好適な特性を示し、例えば、天然又は組換えヒトＩＬ７と同様の免疫刺激活性を保持している。他の活性及び特徴もまた、本明細書全体を通じて実証される。従って、これまでに公知のＩＬ７及び修飾ＩＬ７治療剤と比べて向上した治療プロファイルを有するＡＣＥタンパク質、及び提供されるＡＣＥタンパク質の癌治療における使用方法が提供される。
従って、本開示は、選択的活性プロファイルを備えた、ＩＬ７ＲａのアゴニストであるＡＣＥタンパク質を提供する。提供されるＡＣＥタンパク質は免疫グロブリン重鎖配列と免疫グロブリン軽鎖配列とを含む。各免疫グロブリン重鎖配列は重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）とを含み、ここで重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３定常領域からなる。各免疫グロブリン軽鎖配列は軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む。各ＡＣＥタンパク質において、ＩＬ７分子はＶＨ又はＶＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）に取り込まれる。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質は、重鎖ＣＤＲに取り込まれたＩＬ７分子を含む。特定の実施形態において、ＩＬ７は重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ７は重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ７は重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）に取り込まれる。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質は、軽鎖ＣＤＲに取り込まれたＩＬ７を含む。特定の実施形態において、ＩＬ７は軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ７は軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ７は軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）に取り込まれる。
一部の実施形態において、ＡＣＥは、ＣＤＲに取り込まれたＩＬ７配列を含み、これによりＩＬ７配列はＣＤＲ配列に挿入される。挿入は、ＣＤＲのＮ末端領域若しくはその近傍、ＣＤＲの中央領域又はＣＤＲのＣ末端領域若しくはその近傍であってもよい。他の実施形態において、ＡＣＥは、ＣＤＲに取り込まれたＩＬ７を含み、これによりＩＬ７配列がＣＤＲ配列をフレームシフトさせることはない。
一部の実施形態において、ＩＬ７はペプチドリンカーなしにＣＤＲに直接グラフト化され、ＣＤＲ配列とＩＬ７配列との間に追加的なアミノ酸はない。
一部の実施形態においてＡＣＥタンパク質はＩｇＧクラス抗体重鎖の免疫グロブリン重鎖を含む。特定の実施形態において、ＩｇＧ重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４サブクラスのいずれか１つである。
ＩＬ２高親和性受容体を標的とするＡＣＥタンパク質
本明細書には、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）にグラフト化されたＩＬ２を含むタンパク質構築物が提供される。抗体サイトカイングラフト化タンパク質はヒト患者における使用に好適な特性を示し、例えば、天然又は組換えヒトＩＬ２と同様のＴｒｅｇ細胞に対する免疫刺激活性を保持している。しかしながら、負の効果、例えばＮＫ細胞の刺激は減少している。他の活性及び特徴もまた、本明細書全体を通じて実証される。従って、これまでに公知のＩＬ２及び修飾ＩＬ２治療剤と比べて向上した治療プロファイルを有する抗体サイトカイングラフト化タンパク質、及び提供される抗体サイトカイングラフト化タンパク質の療法における使用方法が提供される。
従って、本開示は、選択的活性プロファイルを備えた、ＩＬ２高親和性受容体のアゴニストである抗体サイトカイングラフト化タンパク質を提供する。免疫グロブリン重鎖配列と免疫グロブリン軽鎖配列とを含む提供される抗体サイトカイングラフト化タンパク質。各免疫グロブリン重鎖配列は重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）とを含み、ここで重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３定常領域からなる。各免疫グロブリン軽鎖配列は軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む。各抗体サイトカイングラフト化タンパク質においてＩＬ２分子は抗体のＶＨ又はＶＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）に取り込まれる。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、重鎖ＣＤＲに取り込まれたＩＬ２を含む。特定の実施形態において、ＩＬ２は重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ２は重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）に取り込まれる。特定の実施形態において単量体ＩＬ２は重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）に取り込まれる。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、軽鎖ＣＤＲに取り込まれたＩＬ２を含む。特定の実施形態において、ＩＬ２は軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ２は軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ２は軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）に取り込まれる。
一部の実施形態において、グラフト化される抗体サイトカインは、ＣＤＲに取り込まれたＩＬ２配列を含み、これによりＩＬ２配列はＣＤＲ配列に挿入される。挿入は、ＣＤＲの始端若しくはその近傍、ＣＤＲの中央領域又はＣＤＲの終端若しくはその近傍であってもよい。他の実施形態において、グラフト化された抗体サイトカインは、ＣＤＲに取り込まれたＩＬ２を含み、これによりＩＬ２配列がＣＤＲ配列の全て又は一部を置き換える。置き換えは、ＣＤＲの始端又はその近傍、ＣＤＲの中央領域又はＣＤＲの終端又はその近傍であってもよい。置き換えはＣＤＲ配列のうち僅か１又は２アミノ酸ほどであってもよく、又はＣＤＲ配列全体もの多さであってもよい。
一部の実施形態において、ＩＬ２はペプチドリンカーなしにＣＤＲに直接取り込まれ、ＣＤＲ配列とＩＬ２配列との間に追加的なアミノ酸はない。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質はＩｇＧクラス抗体重鎖の免疫グロブリン重鎖を含む。特定の実施形態において、ＩｇＧ重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４サブクラスのいずれか１つである。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、公知の臨床的に利用されている免疫グロブリン配列から選択される重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。特定の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ヒト化配列である重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。他の特定の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ヒト配列である重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、生殖細胞系列免疫グロブリン配列から選択される重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ＩＬ２分子の結合特異性と異なる標的に対する免疫グロブリン可変ドメインの結合特異性を有する重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。一部の実施形態において、免疫グロブリン可変ドメインのその標的に対する結合特異性は、グラフト化の存在下で保持される。特定の実施形態において、保持される結合特異性は非ヒト標的に対するものである。他の実施形態において、結合特異性は、ＩＬ２療法と併せて治療的有用性を有するヒト標的に対するものである。特定の実施形態において、免疫グロブリンの結合特異性のターゲティングにより、ＩＬ２成分に追加的な治療利益が付与される。特定の実施形態において、免疫グロブリンのその標的に対する結合特異性により、ＩＬ２との相乗活性が付与される。
なおも他の実施形態において、免疫グロブリンのその標的に対する結合特異性はＩＬ２分子のグラフト化によって低下する。
ＩＬ２低親和性受容体を標的とするＡＣＥタンパク質
本明細書には、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）にグラフト化されたＩＬ２分子を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質が提供される。本開示の抗体サイトカイングラフト化タンパク質はヒト患者における使用に好適な特性を示し、例えば、天然又は組換えヒトＩＬ２と同様の免疫刺激活性を保持している。しかしながら、負の効果は減少している。例えば、Ｔｒｅｇ細胞の刺激が低く、及びＣＤ８ Ｔエフェクター細胞の応答が向上する。他の活性及び特徴もまた、本明細書全体を通じて実証される。従って、これまでに公知のＩＬ２及び修飾ＩＬ２治療剤と比べて向上した治療プロファイルを有する抗体サイトカイングラフト化タンパク質、及び提供される抗体サイトカイングラフト化タンパク質の癌治療における使用方法が提供される。
従って、本開示は、選択的活性プロファイルを備えた、ＩＬ２低親和性受容体のアゴニストである抗体サイトカイングラフト化タンパク質を提供する。提供される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は免疫グロブリン重鎖配列と免疫グロブリン軽鎖配列とを含む。各免疫グロブリン重鎖配列は重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）とを含み、ここで重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３定常領域からなる。各免疫グロブリン軽鎖配列は軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む。各抗体サイトカイングラフト化タンパク質においてＩＬ２分子はＶＨ又はＶＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）に取り込まれる。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、重鎖ＣＤＲに取り込まれたＩＬ２分子を含む。特定の実施形態において、ＩＬ２は重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ２は重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ２は重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）に取り込まれる。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、軽鎖ＣＤＲに取り込まれたＩＬ２を含む。特定の実施形態において、ＩＬ２は軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ２は軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ２は軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）に取り込まれる。
一部の実施形態において、グラフト化される抗体サイトカインは、ＣＤＲに取り込まれたＩＬ２配列を含み、これによりＩＬ２配列がＣＤＲ配列に挿入される。挿入は、ＣＤＲのＮ末端領域若しくはその近傍、ＣＤＲの中央領域又はＣＤＲのＣ末端領域若しくはその近傍であってもよい。他の実施形態において、グラフト化された抗体サイトカインは、ＣＤＲに取り込まれたＩＬ２を含み、これによりＩＬ２配列がＣＤＲ配列をフレームシフトさせることはない。
一部の実施形態において、ＩＬ２はペプチドリンカーなしにＣＤＲに直接グラフト化され、ＣＤＲ配列とＩＬ２配列との間に追加的なアミノ酸はない。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質はＩｇＧクラス抗体重鎖の免疫グロブリン重鎖を含む。特定の実施形態において、ＩｇＧ重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４サブクラスのいずれか１つである。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、公知の臨床的に利用されている免疫グロブリン配列から選択される重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。特定の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ヒト化配列である重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。他の特定の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ヒト配列である重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、生殖細胞系列免疫グロブリン配列から選択される重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ＩＬ２分子の結合特異性と異なる標的に対する免疫グロブリン可変ドメインの結合特異性を有する重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。一部の実施形態において、免疫グロブリン可変ドメインのその標的に対する結合特異性は、グラフト化の存在下で保持される。特定の実施形態において、保持される結合特異性は非ヒト標的に対するものである。他の実施形態において、結合特異性は、ＩＬ２療法と併せて治療的有用性を有するヒト標的に対するものである。特定の実施形態において、免疫グロブリンの結合特異性のターゲティングにより、ＩＬ２成分に追加的な治療利益が付与される。特定の実施形態において、免疫グロブリンのその標的に対する結合特異性により、ＩＬ２との相乗活性が付与される。
なおも他の実施形態において、免疫グロブリンの結合特異性はＩＬ２分子のグラフト化によって低下する。
ＩＬ６受容体を標的とするＡＣＥタンパク質
本明細書には、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）にグラフト化されたＩＬ６分子を含むＡＣＥタンパク質が提供される。本開示のＡＣＥタンパク質はヒト患者における使用に好適な特性を示し、例えば、天然又は組換えヒトＩＬ６と同様の活性を保持している。他の活性及び特徴もまた、本明細書全体を通じて実証される。従って、これまでに公知のＩＬ６及び修飾ＩＬ６治療剤と比べて向上した治療プロファイルを有するＡＣＥタンパク質、及び提供されるＡＣＥタンパク質の癌治療における使用方法が提供される。
従って、本開示は、選択的活性プロファイルを備えた、ＩＬ６受容体のアゴニストであるＡＣＥタンパク質を提供する。提供されるＡＣＥタンパク質は免疫グロブリン重鎖配列と免疫グロブリン軽鎖配列とを含む。各免疫グロブリン重鎖配列は重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）とを含み、ここで重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３定常領域からなる。各免疫グロブリン軽鎖配列は軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む。各ＡＣＥタンパク質においてＩＬ６分子はＶＨ又はＶＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）に取り込まれる。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質は、重鎖ＣＤＲに取り込まれたＩＬ６分子を含む。特定の実施形態において、ＩＬ６は重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ６は重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ６は重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）に取り込まれる。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質は、軽鎖ＣＤＲに取り込まれたＩＬ６を含む。特定の実施形態において、ＩＬ６は軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ６は軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）に取り込まれる。特定の実施形態において、ＩＬ６は軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）に取り込まれる。
一部の実施形態において、ＡＣＥは、ＣＤＲに取り込まれたＩＬ６配列を含み、これによりＩＬ６配列がＣＤＲ配列に挿入される。挿入は、ＣＤＲのＮ末端領域若しくはその近傍、ＣＤＲの中央領域又はＣＤＲのＣ末端領域若しくはその近傍であってもよい。他の実施形態において、ＡＣＥは、ＣＤＲに取り込まれたＩＬ６を含み、これによりＩＬ６配列がＣＤＲ配列をフレームシフトさせることはない。
一部の実施形態において、ＩＬ６はペプチドリンカーなしにＣＤＲに直接グラフト化され、ＣＤＲ配列とＩＬ６配列との間に追加的なアミノ酸はない。
一部の実施形態においてＡＣＥタンパク質はＩｇＧクラス抗体重鎖の免疫グロブリン重鎖を含む。特定の実施形態において、ＩｇＧ重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４サブクラスのいずれか１つである。
一部の実施形態においてＡＣＥタンパク質は、公知の臨床的に利用されている免疫グロブリン配列から選択される重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。特定の実施形態においてＡＣＥタンパク質は、ヒト化配列である重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。他の特定の実施形態においてＡＣＥタンパク質は、ヒト配列である重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。
一部の実施形態においてＡＣＥタンパク質は、生殖細胞系列免疫グロブリン配列から選択される重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。
一部の実施形態においてＡＣＥタンパク質は、サイトカイン分子の結合特異性と異なる標的に対する免疫グロブリン可変ドメインの結合特異性を有する重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。一部の実施形態において、免疫グロブリン可変ドメインのその標的に対する結合特異性は、グラフト化サイトカインの存在下で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％保持される。特定の実施形態において、保持される結合特異性は非ヒト標的に対するものである。他の実施形態において、結合特異性は、療法と併せて治療的有用性を有するヒト標的に対するものである。特定の実施形態において、免疫グロブリンの結合特異性のターゲティングにより、サイトカイン成分に追加的な治療利益が付与される。特定の実施形態において、免疫グロブリンのその標的に対する結合特異性により、サイトカインとの相乗活性が付与される。
なおも他の実施形態において、免疫グロブリンの結合特異性はサイトカイン分子のグラフト化によって１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％低下する。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質は、修飾されたエフェクター機能を付与する修飾Ｆｃを有する修飾免疫グロブリンＩｇＧを含む。特定の実施形態において修飾Ｆｃ領域は、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの１つ以上から選択される突然変異を含む。詳細な実施形態において免疫グロブリン重鎖は、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａのいずれかから選択されるエフェクター機能の低下を付与する突然変異又は突然変異の組み合わせを含み得る。一部の実施形態において、Ｆｃ突然変異はＤ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａである。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質は、（ｉ）表２に記載の重鎖可変領域と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域及び（ｉｉ）表２に記載の軽鎖可変領域と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。免疫グロブリン鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４から選択されるＩｇＧクラスである。特定の実施形態において免疫グロブリンは、任意選択で、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａのいずれかから選択されるエフェクター機能の低下を付与する突然変異又は突然変異の組み合わせを含む。一部の実施形態において、Ｆｃ突然変異はＤ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａである。
操作及び／又は修飾されたＡＣＥタンパク質
特定の態様において、ＡＣＥタンパク質は、サイトカイン配列を免疫グロブリン足場のＣＤＲ領域に操作することにより作成される。重鎖及び軽鎖の両方の免疫グロブリン鎖が作製されて、最終的な抗体グラフト化タンパク質が生じる。ＡＣＥタンパク質は、天然又は組換えヒトサイトカイン又はＦｃ融合サイトカインと比較して、Ｔ細胞、及びＡＣＥタンパク質に好ましい治療活性を付与する。
ＡＣＥタンパク質を操作するため、サイトカイン配列が免疫グロブリン鎖足場タンパク質のＣＤＲループに挿入される。グラフト化ＡＣＥタンパク質は、臨床セッティングで利用されている種々の公知の免疫グロブリン配列、現在創薬及び／又は臨床開発中の公知の免疫グロブリン配列、ヒト生殖細胞系列抗体配列、並びに新規抗体免疫グロブリン鎖の配列のいずれを使用して調製してもよい。構築物は、関連性のある配列をコードする組換えＤＮＡを利用した標準的な分子生物学的方法を用いて作製される。ＧＦＴＸ３ｂ、及びＧＦＴＸと称される例示的足場におけるサイトカインの配列を表２に示す。挿入点は、利用可能な構造又は相同性モデルデータに基づきループの中間点となるように選択されたが、しかしながら挿入点はＣＤＲループのいずれかの末端の方に調整することができる。一部の実施形態において、グラフト化構築物は、いかなる抗原に対しても結合特異性を有しない免疫グロブリン足場を使用して調製することができる。一部の実施形態において、グラフト化構築物は、ヒト抗原に対して結合特異性を有しない免疫グロブリン足場を使用して調製することができる。一部の実施形態において、グラフト化構築物は、腫瘍抗原など、ヒト抗原に対して結合特異性を有する免疫グロブリン足場（ｓｃｏｆｆｏｌｄ）を使用して調製することができる。
従って本開示は、グラフト化タンパク質が作成されるように異種抗体タンパク質又はポリペプチドに組み換えで挿入されたサイトカインタンパク質を含むサイトカイン受容体に特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。詳細には、本開示は、本明細書に記載される抗体又は抗体の抗原結合断片又は任意の他の関連性のある足場抗体ポリペプチド（例えば、完全抗体免疫グロブリンタンパク質、Ｆａｂ断片、Ｆｃ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメイン、ＶＬ ＣＤＲ等）と、異種サイトカインタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドとを含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質を提供する。タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを抗体又は抗体断片と融合又はコンジュゲートする方法は当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、及び同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書及び同第３６７，１６６号明細書；国際公開第９６／０４３８８号パンフレット及び同第９１／０６５７０号パンフレット；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００；及びＶｉｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３３７−１１３４１を参照のこと。加えて、ＡＣＥタンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、及び／又はコドンシャッフリング（まとめて「ＤＮＡシャフリング」と称される）の技法によって作成することができる。ＤＮＡシャフリングは、グラフト化タンパク質構築物を調製するため、及び／又は抗体又はその断片の活性を変化させる（例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する抗体又はその断片）ために用いることができる。概して、米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、同第５，８３４，２５２号明細書、及び同第５，８３７，４５８号明細書；Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３；Ｈａｒａｙａｍａ，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２；Ｈａｎｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６；及びＬｏｒｅｎｚｏ ａｎｄ Ｂｌａｓｃｏ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−３１３を参照のこと。抗体若しくはその断片、又はコードされる抗体若しくはその断片は、組換え前にエラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入又は他の方法によるランダム突然変異誘発に供することにより変化させることができる。目的の抗原タンパク質に特異的に結合する抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドが、本明細書に提供されるとおりのＡＣＥタンパク質の調製のため、１つ以上の異種サイトカイン分子、１つ以上の成分、モチーフ、セクション、パート、ドメイン、断片等で組み換えられてもよい。
抗体Ｆａｂは、サイトカインタンパク質の潜在的な挿入部位として働き得る６つのＣＤＲループ、軽鎖に３つ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）及び重鎖に３つ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）を含む。どの１つ又は複数のＣＤＲループにサイトカインを挿入すべきかの決定には、構造的及び機能的考慮点が勘案される。ＣＤＲループのサイズ及びコンホメーションは異なる抗体間で大きく変わるため、挿入に最適なＣＤＲは、各詳細な抗体／タンパク質の組み合わせについて実験的に決定されてもよい。加えて、サイトカインタンパク質はＣＤＲループに挿入されることになるため、これがサイトカインタンパク質の構造に更なる制約を課し得る。
免疫グロブリン鎖のＣＤＲは、本明細書に記載されるものを含め、当該技術分野において公知の周知の付番方式によって決定される。例えば、ＣＤＲは、（１）Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」付番スキーム），ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２；及び（２）Ｃｈｏｔｈｉａに記載される付番方式を用いることにより識別及び定義されており、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）“Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８を参照のこと。２０アミノ酸長未満の識別されるＣＤＲアミノ酸配列については、所望の特異的結合及び／又はアゴニスト活性をなお保持しながら、１又は２つの保存的アミノ酸残基置換が許容され得る。
ＡＣＥタンパク質は更に、出発抗体グラフト化タンパク質から特性が変化していてもよい修飾ＡＣＥタンパク質を操作するための出発材料として、本明細書（例えば表２）に示されるＣＤＲ及び／又はＶＨ及び／又はＶＬ配列のうちの１つ以上を有する抗体を使用して調製することができる。或いは、修飾ＡＣＥタンパク質を操作するための足場として任意の公知の抗体配列を利用してもよい。例えば、任意の公知の臨床で利用されている抗体を抗体グラフト化タンパク質の調製用の出発材料足場として利用してもよい。公知の抗体及び対応する免疫グロブリン配列としては、例えば、パリビズマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペンブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、エクリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ナタリズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、ムロモナブ、又はこれらの修飾体が挙げられる。公知の抗体及び免疫グロブリン配列としてはまた、生殖細胞系列抗体配列も挙げられる。フレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベース又は既発表の参考文献から入手することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列については、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース並びにＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．ｆｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；及びＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｅｕｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６を参照することができる。なおも他の例では、初期創薬及び／又は薬剤開発中であり得る他の公知の実体からの抗体及び対応する免疫グロブリン配列が、同様に修飾ＡＣＥタンパク質を操作するための出発材料として適合し得る。
結果として生じるポリペプチドがサイトカインの取り込みに適応した少なくとも１つの結合領域を含む限り、多種多様な抗体／免疫グロブリンフレームワーク又は足場を用いることができる。かかるフレームワーク又は足場は、ヒト免疫グロブリン、又はその断片の５つの主要なイディオタイプを含み、他の動物種の、好ましくはヒト化及び／又はヒトの側面を有する免疫グロブリンを含む。新規抗体、フレームワーク、足場及び断片が当業者により継続的に発見及び開発される。
抗体は、当該技術分野において公知の方法を用いて作成することができる。モノクローナル抗体の調製には、当該技術分野において公知の任意の技法を用いることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ．７７−９６．Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５を参照のこと）。単鎖抗体の作製技法（米国特許第４，９４６，７７８号明細書）は、ＡＣＥタンパク質に使用するための抗体の作製に適合させることができる。また、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳類などの他の生物を使用して霊長類化若しくはヒト化抗体又はヒト抗体を発現させ、同定してもよい。或いは、ファージディスプレイ技術を用いて、ＡＣＥタンパク質に使用するための選択の抗原に特異的に結合する抗体及びヘテロマーＦａｂ断片を同定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．、前掲；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３，（１９９２）を参照のこと）。
霊長類化又はヒト化非ヒト抗体のための方法は当該技術分野において周知である。概して、霊長類化又はヒト化抗体は、そこに非霊長類又は非ヒトの供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。かかる非霊長類又は非ヒトアミノ酸残基は多くの場合に移入残基（ｉｍｐｏｒｔ ｒｅｓｉｄｕｅ）と称され、これは典型的には移入可変ドメイン（ｉｍｐｏｒｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）から取られる。ヒト化は、本質的にＷｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法に従い（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと）、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列に置換することにより実施し得る。従って、かかるヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、ここでは実質的にインタクトに満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、霊長類化又はヒト化抗体は典型的には、霊長類又はヒト抗体であって、一部の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）残基及び場合により一部のフレームワーク（「ＦＲ」）残基が結合特異性を付与するため由来種（例えばげっ歯類抗体）の類似部位からの残基によって置換されているものである。
それに代えて又は加えて、非ヒト抗体と比べて同じ結合特性を維持しつつ又はより良好な結合特性を提供しつつ抗体においてヒト可変領域で非ヒト抗体可変領域を置き換えるインビボ方法を利用して非ヒト抗体を操作されたヒト抗体に変換してもよい。例えば、米国特許出願公開第２００５０００８６２５号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号明細書を参照のこと。或いは、逐次的なカセット置換によりヒトＶセグメントライブラリを作成することができ、ここでは初めに参照抗体Ｖセグメントの一部のみがヒト配列のライブラリに置き換えられ；次に残りの参照抗体アミノ酸配列のコンテクストで結合を支持する同定されたヒト「カセット」が第２のライブラリスクリーニングで組み換えられて完全ヒトＶセグメントが作成される（米国特許出願公開第２００６／０１３４０９８号明細書を参照のこと）。
ＡＣＥタンパク質の調製に使用するための様々な抗体又は抗原結合断片は、インタクトな抗体の酵素的又は化学的修飾によって作製することができ、又は組換えＤＮＡ方法を用いてデノボ合成することができ（例えば単鎖Ｆｖ）、又はファージディスプレイライブラリを用いて同定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４，１９９０を参照のこと）。例えばミニボディは、当該技術分野において、例えばＶａｕｇｈａｎ ａｎｄ Ｓｏｌｌａｚｚｏ，Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．４：４１７−３０ ２００１に記載される方法を用いて作成することができる。二重特異性抗体は、ハイブリドーマのグラフト化又はＦａｂ’断片の連結を含め、種々の方法によって作製することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。単鎖抗体は、ファージディスプレイライブラリ又はリボソームディスプレイライブラリ、遺伝子シャフリングライブラリを用いて同定することができる。かかるライブラリは、合成、半合成又は天然及び免疫適格供給源から構築することができる。従って、本明細書に提供されるとおりのＡＣＥタンパク質構築物の調製においては、選択の免疫グロブリン配列を利用し得る。
本開示の抗体、抗原結合分子又はＡＣＥ分子は、二重特異性抗体を更に含む。二重特異性又は二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。他の抗原結合断片又は抗体部分としては、二価ｓｃＦｖ（ダイアボディ）、抗体分子が２つの異なるエピトープを認識する二重特異性ｓｃＦｖ抗体、シングル結合ドメイン（ｄＡｂ）、及びミニボディが挙げられる。従って、本明細書に提供されるとおりのＡＣＥタンパク質構築物の調製においては、選択の免疫グロブリン配列を利用することができる。
抗体の抗原結合断片、例えばＦａｂ断片、ｓｃＦｖを構成要素として使用してＡＣＥタンパク質を構築することができ、任意選択で多価形態が含まれてもよい。一部の実施形態において、かかる多価分子は抗体の定常領域（例えばＦｃ）を含む。
ＡＣＥタンパク質は、抗体の一方又は両方の可変領域（即ち、ＶＨ及び／又はＶＬ）内、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を修飾することにより操作することができ、及びかかる適合されたＶＨ及び／又はＶＬ領域配列は、サイトカインのグラフト化に、又はサイトカイングラフト化の調製に利用することができる。抗体は、主に６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を通じて標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個々の抗体間の多様性がＣＤＲ外の配列よりも高い。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用に関与し、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列にグラフトされた特異的抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより特異的抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３；Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，２２５，５３９号明細書、並びにＱｕｅｅｎらに対する米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書を参照のこと）。特定の例では、フレームワーク領域内の残基を突然変異させることにより抗体の抗原結合能力を維持又は増強することが有益である（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌに対する米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書を参照のこと）。
一部の態様において、目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善するための、「親和性成熟」として知られるＶＨ及び／又はＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基の突然変異が、例えばサイトカイングラフト化タンパク質のコンテクストと併せた抗体の抗原結合の最適化に有益であり得る。部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して１つ又は複数の突然変異を導入することができ、及び抗体結合への効果、又はその他の目的の機能特性について、本明細書に記載されるとおりのインビトロ若しくはインビボアッセイ及び／又は当該技術分野において公知の代替的若しくは追加的アッセイで評価することができる。保存的修飾を導入することができる。突然変異はアミノ酸置換、付加又は欠失であってもよい。更に、典型的にはＣＤＲ領域内の１、２、３、４又は５つ以下の残基を変化させる。
操作された抗体又は抗体断片は、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に例えば抗体の特性を改善するため修飾が行われたものを含む。一部の実施形態においてかかるフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、一つの手法は、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に変更することである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、その抗体の由来である生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。かかる残基は、抗体フレームワーク配列をその抗体の由来である生殖系列配列と比較することにより同定し得る。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列構成に戻すため、体細胞突然変異を例えば部位特異的突然変異誘発によって生殖系列配列に「復帰突然変異」させることができる。追加的なフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内、又は更には１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を突然変異させてＴ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。この手法は「脱免疫化」とも称され、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書に更に詳細に記載されている。
ＡＣＥタンパク質の調製に利用される抗体又は抗体断片の定常領域は、適宜、任意のタイプ又はサブタイプであってよく、本方法によって治療される対象の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類又は他の哺乳類、例えば、農業動物哺乳類（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）、家庭用動物哺乳類（例えば、イヌ、ネコ）又はげっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ）から選択することができる。一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質に利用される抗体は、ヒト化抗体又はＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）抗体が作成されるように操作される。一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質に利用される抗体はヒト抗体である。一部の実施形態において、抗体定常領域アイソタイプはＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４である。特定の実施形態において、定常領域アイソタイプはＩｇＧ１である。一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質はＩｇＧを含む。一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質はＩｇＧ１ Ｆｃを含む。一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質はＩｇＧ２ Ｆｃを含む。
フレームワーク又はＣＤＲ領域内に行われる修飾に加えて、又はそれに代えて、ＡＣＥタンパク質の調製に利用される抗体又は抗体断片は、典型的には抗体の１つ以上の機能特性、例えば血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存性細胞傷害などを変化させるため、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作されてもよい。更に、抗体、その抗体断片、又はＡＣＥタンパク質は、この場合もやはりＡＣＥタンパク質の１つ以上の機能特性を変化させるため、化学的に修飾することができ（例えば、１つ以上の化学的部分を抗体に付加することができる）又はそのグリコシル化が変化するように修飾することができる。
一実施形態では、ヒンジ領域のシステイン残基の数が変化する、例えば増加又は減少するようにＣＨ１のヒンジ領域が修飾される。例えば、この手法は更にＢｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書に記載され、ここでは例えば軽鎖及び重鎖のアセンブリが促進されるように、又はＡＣＥタンパク質の安定性が増加若しくは減少するように、ＣＨ１のヒンジ領域にあるシステイン残基の数を変化させる。別の実施形態では、ＡＣＥタンパク質の生物学的半減期が変化するように抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させる。より具体的には、ＡＣＥタンパク質のブドウ球菌プロテインＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）（ＳｐＡ）結合が天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比べて損なわれるように、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン接合部領域に１つ以上のアミノ酸突然変異が導入される。この手法については、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書に更に詳細に記載されている。
本開示は、長いインビボ半減期を有するサイトカイン受容体に特異的に結合するＡＣＥタンパク質を提供する。別の実施形態において、ＡＣＥタンパク質は、その生物学的半減期が増加するように修飾される。様々な手法が可能である。インビボ半減期が増加したＡＣＥタンパク質はまた、１つ以上のアミノ酸修飾（即ち、置換、挿入又は欠失）をＩｇＧ定常ドメイン、又はそのＦｃＲｎ結合断片（好ましくはＦｃ又はヒンジＦｃドメイン断片）に導入して作成することもできる。例えば、Ｗａｒｄに対する米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載されるとおり、以下の突然変異のうちの１つ以上を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。例えば、国際公開第９８／２３２８９号パンフレット；国際公開第９７／３４６３１号パンフレット；及び米国特許第６，２７７，３７５号明細書を参照のこと。或いは、生物学的半減期を増加させるため、ＡＣＥタンパク質は、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書及び同第６，１２１，０２２号明細書に記載されるとおり、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含むようにＣＨ１又はＣＬ領域内で変化させる。更に他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置き換えることによりＦｃ領域を変化させて、ＡＣＥタンパク質のエフェクター機能を変化させる。例えば、エフェクターリガンドに対する親和性は変化しているが、親抗体の抗原結合能力は保持しているＡＣＥタンパク質となるように、１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基に置き換えることができる。親和性を変化させる対象のエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）又は補体のＣ１成分であってもよい。この手法については、いずれもＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号明細書及び同第５，６４８，２６０号明細書に更に詳細に記載されている。
別の実施形態では、ＡＣＥタンパク質のＣ１ｑ結合が変化し及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が低下又は消失するように、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基に置き換えることができる。この手法については、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号明細書に更に詳細に記載されている。
かかる突然変異を含むＡＣＥタンパク質によって媒介される抗体依存細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は低下し、又は全くなくなる。一部の実施形態では、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｌ２３４及びＬ２３５がＡｌａ２３４及びＡｌａ２３５に置換される。一部の実施形態では、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｎ２６７がＡｌａ２６７に置換される。
別の実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基を変化させて、それによりＡＣＥタンパク質の補体結合能力を変化させる。この手法については、Ｂｏｄｍｅｒらによる国際公開第９４／２９３５１号パンフレットに更に記載されている。
更に別の実施形態では、抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力が増加するように及び／又はＦｃγ受容体に対するＡＣＥタンパク質の親和性が増加するように、Ｆｃ領域が１つ以上のアミノ酸の修飾によって修飾される。この手法については、Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第００／４２０７２号パンフレットに更に記載されている。更に、ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が改善した変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ．２７６：６５９１−６６０４を参照のこと）。
なおも別の実施形態において、ＡＣＥタンパク質のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化ＡＣＥタンパク質を作ることができる（即ち、このＡＣＥタンパク質はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を増加させるため変化させることができる。かかる糖質修飾は、例えば抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変化させることにより達成し得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それにより当該部位でのグリコシル化を除去する１つ以上のアミノ酸置換を作ることができる。かかる非グリコシル化は抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。かかる手法については、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書に更に詳細に記載されている。
それに加えて又は代えて、フコシル残基の量が低下した低フコシル化ＡＣＥタンパク質又は二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体など、変化したタイプのグリコシル化を有するＡＣＥタンパク質を作ることができる。かかる変化したグリコシル化パターンは、抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）能力を増加させることが実証されている。かかる糖質修飾は、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞においてＡＣＥタンパク質を発現させることにより達成し得る。グリコシル化機構が変化した細胞については当該技術分野において記載されており、組換えＡＣＥタンパク質を発現して、それによりグリコシル化が変化したＡＣＥタンパク質を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、機能が破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株について記載しており、この遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをコードするため、かかる細胞株において発現するＡＣＥタンパク質は低フコシル化を呈することになる。Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットは、フコースをＡｓｎ（２９７）結合糖質に付加する能力が低下した変異ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞について記載し、これもまた当該宿主細胞において発現するＡＣＥタンパク質の低フコシル化をもたらす（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０もまた参照のこと）。Ｕｍａｎａらによる国際公開第９９／５４３４２号パンフレットは、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株について記載しており、この操作された細胞株で発現するＡＣＥタンパク質は二分ＧｌｃＮａｃ構造の増加を呈し、それにより抗体のＡＤＣＣ活性の増加がもたらされる（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０もまた参照のこと）。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質の１つ以上のドメイン、又は領域は、当該技術分野において周知のものなど、リンカー、例えばペプチドリンカーを介して接続される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，ＲＪ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。ペプチドリンカーは長さが様々であってよく、例えばリンカーは１〜１００アミノ酸長であることができ、典型的にはリンカーは５〜５０アミノ酸長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０アミノ酸長である。
一部の実施形態において、サイトカインは、任意選択で１つ以上のペプチドリンカー配列を用いてＣＤＲ配列にグラフト化される。特定の実施形態において、１つ以上のペプチドリンカーは、（Ｇｌｙｎ−Ｓｅｒ）ｍ配列（配列番号３９７４）、（Ｇｌｙｎ−Ａｌａ）ｍ配列（配列番号３９７５）、又は（Ｇｌｙｎ−Ｓｅｒ）ｍ／（Ｇｌｙｎ−Ａｌａ）ｍ配列の任意の組み合わせ（配列番号３９７４−３９７５）［式中、各ｎは独立に１〜５の整数であり、各ｍは独立に０〜１０の整数である］から独立して選択される。リンカーの例としては、限定はされないが、グリシンベースのリンカー又はｇｌｙ／ｓｅｒリンカーＧ／Ｓ、例えば（ＧｍＳ）ｎ［式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に等しい正の整数であり、ｍは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に等しい整数である］（配列番号３９７６）が挙げられる。特定の実施形態において、１つ以上のリンカーはＧ４Ｓ（配列番号３９７２）リピート、例えばＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（Ｇ４Ｓ）ｎ［式中、ｎは１以上の正の整数である（配列番号３９７２）。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５及びｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９及びｎ＝１０］を含む。一部の実施形態において、ＳｅｒはＡｌａに置き換えることができ、例えば、（ＧｍＡ）ｎ［式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に等しい正の整数であり、ｍは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に等しい整数である］（配列番号３９７７）などのリンカーＧ／Ａである。特定の実施形態において、１つ以上のリンカーはＧ４Ａ（配列番号３９７３）リピート、（Ｇ４Ａ）ｎ［式中、ｎは１以上の正の整数である（配列番号３９７３）。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３。ｎ＝４、ｎ＝５及びｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９及びｎ＝１０］を含む。一部の実施形態において、リンカーはリンカーの複数のリピートを含む。他の実施形態において、リンカーは組み合わせ及び複数のＧ４Ｓ（配列番号３９７２）及びＧ４Ａ（配列番号３９７３）を含む。
リンカーの他の例としては、リンカー及び接合部によって生じる免疫原性を最小限に抑えるため、抗体において天然に存在する可動性リンカー配列をベースとするものが挙げられる。例えば、抗体分子構造の可変ドメインとＣＨ１定常ドメインとの間には天然の可動性連結がある。この天然の連結は、ＶドメインのＣ末端から４〜６残基が寄与し且つＣＨ１ドメインのＮ末端から４〜６残基が寄与する約１０〜１２アミノ酸残基を含む。ＡＣＥタンパク質は、例えば、ＣＨ１の末端５〜６アミノ酸残基、又は１１〜１２アミノ酸残基をリンカーとして取り込むリンカーを用いることができる。ＣＨ１ドメインのＮ末端残基、特に最初の５〜６アミノ酸残基は、強力な二次構造のないループコンホメーションをとり、従って可動性リンカーとして働くことができる。ＣＨ１ドメインのＮ末端残基は、それがＩｇ配列の一部であるとおり、可変ドメインの天然の伸長部であり、従ってリンカー及び接合部によって潜在的に生じる可能性のある任意の免疫原性を大幅に最小限に抑える。一部の実施形態においてリンカー配列は、ヒンジ配列をベースとする修飾ペプチド配列を含む。
更に、ＡＣＥタンパク質は、ＡＣＥタンパク質の精製を促進するためペプチドなどのマーカー配列を含むことができる。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ，９１３１１）に提供されるタグなど、ヘキサヒスチジン（配列番号３９７８）ペプチドであり、その多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４に記載されるとおり、例えばヘキサヒスチジン（配列番号３９７８）は、グラフト化タンパク質の好都合な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定はされないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３７：７６７）、及び「ｆｌａｇ」タグが挙げられる。
抗体はまた固体支持体に付加されてもよく、これは標的抗原のイムノアッセイ又は精製に特に有用である。かかる固体支持体としては、限定はされないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンが挙げられる。
ＡＣＥタンパク質活性のアッセイ
ＡＣＥタンパク質を同定するためのアッセイは当該技術分野において公知であり、本明細書に記載される。アゴニストＡＣＥタンパク質はそのコグネイトサイトカイン受容体に結合し、細胞内シグナル伝達を促進し、誘導し、刺激して、細胞内シグナル伝達並びに他の生物学的効果を生じさせる。
ＡＣＥタンパク質によるそれらの受容体への結合は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて決定することができる。例えば、受容体への結合は、限定なしに、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）、及びフローサイトメトリーを含めた公知の技法を用いて決定することができる。
サイトカイン受容体を通じた細胞内シグナル伝達は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて測定することができる。例えば、ＩＬ７によるＩＬ７Ｒａの活性化はＳＴＡＴ５活性化及びシグナル伝達を促進する。ＳＴＡＴ５活性化の測定方法は当該技術分野において標準的である（例えば、ＳＴＡＴ５タンパク質のリン酸化状態、レポーター遺伝子アッセイ、下流シグナル伝達アッセイ等）。別の例として、ＩＬ７Ｒａを通じた活性化はＴ細胞を拡大し、そのためＴ細胞の絶対数をアッセイすることができる。加えて、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋ Ｔ細胞のいずれかを独立してアッセイすることができる。細胞増殖の測定方法は当該技術分野において標準的である（例えば、３Ｈ−チミジン取込みアッセイ、ＣＦＳＥ標識）。サイトカイン産生の測定方法は当該技術分野において周知である（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）。インビトロアッセイの実施においては、ＡＣＥタンパク質に接触させた試験細胞又は試験細胞からの培養上清と、ＡＣＥタンパク質に接触させていない対照細胞又は対照細胞からの培養上清及び／又は組換えヒトサイトカイン又はサイトカインＦｃ融合分子と接触させたものとを比較することができる。
ＡＣＥタンパク質の活性はまた、エキソビボ及び／又はインビボで測定することができる。一部の態様において、未治療の対照動物及び／又は天然サイトカインで同様に治療した動物と比較したときのＡＣＥタンパク質で治療した動物からエキソビボで様々な細胞型にわたって受容体活性化を測定する方法を用いて、細胞型間でのアゴニスト抗体グラフト化タンパク質の差次的活性を示すことができる。好ましいアゴニストＡＣＥタンパク質は細胞内シグナル伝達の誘導能を有する。１型糖尿病及びＳＬＥにおけるアゴニストＡＣＥタンパク質の有効性は、治療有効量のＡＣＥタンパク質を対象に投与し、ＡＣＥタンパク質の投与前及び投与後の対象を比較することにより決定し得る。１型糖尿病及びＳＬＥに対する療法におけるアゴニストＡＣＥタンパク質の有効性はまた、治療有効量のＡＣＥタンパク質を試験対象に投与し、試験対象を抗体未投与の対照対象と比較すること及び／又は天然サイトカインで同様に治療した対象との比較によっても決定し得る。
ＡＣＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド
別の態様において、ＡＣＥタンパク質の重鎖及び軽鎖タンパク質をコードする単離核酸が提供される。ＡＣＥタンパク質は、限定はされないが、組換え発現、化学合成、及び抗体四量体の酵素消化を含め、当該技術分野において公知の任意の手段により作製することができる。組換え発現は、当該技術分野において公知の任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳類宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞等からであってよい。
本明細書では、表２に例示される可変領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、表２に示されるとおりの可変重鎖又は可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の核酸配列同一性を有する配列を含む。
ポリヌクレオチドは、ＡＣＥタンパク質の可変領域配列のみをコードすることができる。ポリヌクレオチドはまた、ＡＣＥタンパク質の可変領域及び定常領域の両方をコードすることもできる。一部のポリヌクレオチド配列は、ＡＣＥタンパク質のうちの１つの重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。他の一部のポリヌクレオチドは、ＡＣＥタンパク質のうちの１つの重鎖及び軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一の２つのポリペプチドセグメントをコードする。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡを含む。他の実施形態において、ポリヌクレオチド又は核酸はＲＮＡを含み、これは一本鎖であっても又は二本鎖であってもよい。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質の１つ以上の免疫グロブリンタンパク質鎖、及び任意選択で分泌シグナルをコードする核酸を含む組換え宿主細胞が提供される。特定の実施形態において組換え宿主細胞は、１つの免疫グロブリンタンパク質鎖と分泌シグナルとをコードするベクターを含む。他の特定の実施形態において組換え宿主細胞は、ＡＣＥタンパク質の２つの免疫グロブリンタンパク質鎖と分泌シグナルとをコードする１つ以上のベクターを含む。一部の実施形態において組換え宿主細胞は、ＡＣＥタンパク質の２つの免疫グロブリンタンパク質鎖と分泌シグナルとをコードするシングルベクターを含む。一部の実施形態において組換え宿主細胞は、１つがＡＣＥタンパク質の重鎖免疫グロブリンタンパク質鎖をコードし、もう１つが軽鎖免疫グロブリンタンパク質鎖をコードする２つのベクターを含み、各々が分泌シグナルを含む。組換え宿主細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。一部の実施形態において宿主細胞は真核細胞株である。一部の実施形態において宿主細胞は哺乳類細胞株である。
加えて、ＡＣＥタンパク質の作製方法が提供される。一部の実施形態において、この方法は、（ｉ）ＡＣＥタンパク質の免疫グロブリンタンパク質鎖をコードする１つ以上のベクターを含む宿主細胞をＡＣＥタンパク質の発現、形成、及び分泌に好適な条件下で培養する工程、及び（ｉｉ）ＡＣＥタンパク質を回収する工程を含む。
ポリヌクレオチド配列は、ＡＣＥタンパク質のポリペプチド鎖をコードする既存の配列（例えば、本明細書に記載される配列）のデノボ固相ＤＮＡ合成又はＰＣＲ突然変異誘発によって生成され得る。核酸の直接化学合成が、Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０，１９７９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９，１９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９、１９８１のジエチルホスホロアミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体担体法などの、当該技術分野において公知の方法によって行われ得る。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入が、例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（Ｅｄ．），Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：９６７，１９９１；及びＥｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：１７，１９９１に記載されるように行われ得る。
本開示ではまた、上記に記載されるＡＣＥタンパク質を作製するための発現ベクター及び宿主細胞も提供される。ＡＣＥタンパク質の免疫グロブリンポリペプチド鎖、又は断片をコードするポリヌクレオチドを発現させるため、様々な発現ベクターを用いることができる。哺乳類宿主細胞における免疫グロブリンタンパク質の作製には、ウイルスベースの発現ベクター及び非ウイルス発現ベクターの両方を使用することができる。非ウイルスベクター及び系としては、典型的に、タンパク質又はＲＮＡを発現するための発現カセットを含む、プラスミド、エピソームベクター、及びヒト人工染色体（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １５：３４５，１９９７を参照）が挙げられる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞内でのＡＣＥタンパク質ポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、Ｂ ＆ Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、Ｂ ＆ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、及び他のタンパク質を発現するための当該技術分野において公知の多くの他のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター及びセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．、上掲；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７，１９９５；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３，１９９２を参照されたい。
発現ベクターの選択は、ベクターが発現される意図される宿主細胞に応じて決まる。典型的に、発現ベクターは、ＡＣＥタンパク質の免疫グロブリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーター及び他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有する。ある実施形態において、誘導性プロモーターが、誘導条件下を除いて挿入された配列の発現を防止するのに用いられる。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター又は熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転換された生物の培養物が、発現生成物が宿主細胞によってより良好に許容されるコード配列について集団を偏らせずに非誘導条件下で拡張され得る。プロモーターに加えて、他の調節エレメントもＡＣＥタンパク質の免疫グロブリン鎖又はフラグメントの効率的発現のために必要とされるか又は所望され得る。これらのエレメントは、典型的に、ＡＴＧ開始コドン及び隣接するリボソーム結合部位又は他の配列を含む。更に、発現の効率が、使用の際に細胞系への適切なエンハンサーの包含によって高められ得る（例えば、Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４；及びＢｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７を参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーは、哺乳動物宿主細胞内での発現を増加させるのに使用され得る。
発現ベクターはまた、細胞から運び出されて培養培地中に入るＡＣＥタンパク質を形成するように分泌シグナル配列位置も提供することができる。特定の態様において、挿入されるＡＣＥタンパク質の免疫グロブリン配列は、ベクターに含める前にシグナル配列に連結される。免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変ドメインをコードする配列を受け取るために使用されるベクターは、時にまた定常領域又はその一部もコードする。かかるベクターは、定常領域を含むグラフト化タンパク質としての可変領域の発現を可能にし、それによりインタクトなＡＣＥタンパク質又はその断片の作製につながる。典型的には、かかる定常領域はヒトである。
ＡＣＥタンパク質鎖を担持及び発現するための宿主細胞は、原核又は真核のいずれかであり得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本開示のポリヌクレオチドをクローニングし、発現するのに有用な１つの原核宿主である。使用するのに好適な他の微生物宿主としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの桿菌、並びにサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び様々なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などの他の腸内細菌科が挙げられる。これらの原核宿主においては、典型的に、宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製起点）を含む発現ベクターを作製することもできる。更に、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、又はラムダファージに由来するプロモーター系などの、任意の数の様々な周知のプロモーターば存在することになる。プロモーターは、典型的に、任意選択的に、オペレーター配列と共に発現を制御し、転写及び翻訳を開始及び完了させるためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物も、ＡＣＥタンパク質ポリペプチドを発現するのに用いられ得る。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用され得る。
一部の好ましい実施形態では、ＡＣＥタンパク質ポリペプチドの発現及び作製に哺乳類宿主細胞が使用される。例えば、それは外因性発現ベクターを有するいずれかの哺乳類細胞株であってもよい。これらは、任意の正常な死滅する又は正常若しくは異常な不死の動物又はヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換されたＢ細胞及びハイブリドーマを含む、無傷の免疫グロブリンを分泌することが可能ないくつかの好適な宿主細胞株が開発されている。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養物の使用は、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７に一般に記載されている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、及びエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９−６８，１９８６を参照）、並びにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列などの必要なプロセッシング情報部位を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。好適なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的、及び／又は調節可能又は制御可能であり得る。有用なプロモーターとしては、限定はされないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト最初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、及び当該技術分野において公知のプロモーター−エンハンサーの組み合わせが挙げられる。
対象とするポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿主の型に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが、原核細胞のために一般的に用いられるが、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションが、他の細胞宿主のために使用され得る（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上掲を参照）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介性形質転換、インジェクション及びマイクロインジェクション、弾道法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２へのグラフト化（Ｅｌｌｉｏｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ ８８：２２３，１９９７）、ＤＮＡの薬剤促進性取り込み、及びエクスビボ形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期の高収率の生成のために、安定した発現が望ましいことが多い。例えば、ＡＣＥタンパク質鎖を安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点又は内因性発現エレメントと、選択マーカー遺伝子とを含有する発現ベクターを用いて調製され得る。ベクターの導入後、細胞が、富化培地中で１〜２日間成長されてから、選択培地に切り替えられる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在が、選択培地中で導入された配列を首尾よく発現する細胞の成長を可能にする。耐性の安定にトランスフェクトされた細胞が、細胞型にとって適切な組織培養技術を用いて増殖され得る。
ＡＣＥタンパク質を含む医薬組成物
薬学的に許容可能な担体と共に製剤化されたＡＣＥタンパク質を含む医薬組成物が提供される。任意選択で、医薬組成物は、所与の障害の治療又は予防に好適な他の治療剤を更に含む。薬学的に許容可能な担体は組成物を増強し、若しくは安定化させるか、又は組成物の調製を促進する。薬学的に許容可能な担体としては、生理的に適合性のある溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。
本開示の医薬組成物は、当該技術分野において公知の種々の方法によって投与することができる。投与経路及び／又は投与様式は所望の結果に応じて変わる。投与が非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、動脈内、又は皮下のいずれかから選択される）によるか、又は標的部位の近位に投与されることが好ましい。薬学的に許容可能な担体は、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、動脈内、皮下、鼻腔内、吸入、脊髄又は表皮投与（例えば、注射により）のうちの任意の１つ以上による投与に好適である。投与経路に応じて、活性化合物、例えばＡＣＥタンパク質は、酸の作用及びその他、化合物を不活性化し得る天然条件から化合物を保護する材料でコーティングすることができる。一部の実施形態において、医薬組成物は静脈内投与用に製剤化される。一部の実施形態において、医薬組成物は皮下投与用に製剤化される。
ＡＣＥタンパク質は、単独で、又は他の好適な成分と組み合わせて、吸入によって投与するためのエアロゾル製剤にされてもよい（即ち、それは「噴霧化」されてもよい）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など、加圧された許容可能な噴射剤の中に置かれ得る。
一部の実施形態において、医薬組成物は無菌且つ流動体である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散剤の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、マンニトール又はソルビトールなどの多価アルコール類、及び塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを組成物中に含めることにより、注射用組成物の長期吸収をもたらすことができる。特定の実施形態では、組成物は、適切な賦形剤（例えばスクロース）を使用して凍結乾燥形態での貯蔵用に調製することができる。
医薬組成物は、当該技術分野において周知の常法に従い調製することができる。薬学的に許容可能な担体は、一部には、投与される詳細な組成物、並びに組成物の投与に用いられる詳細な方法によって決まる。従って、医薬組成物の好適な製剤の種類は幅広くある。ＡＣＥタンパク質の製剤化並びに適切な投与及びスケジュールの決定に適用可能な方法については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）；及びＭａｒｔｉｎｄａｌｅ：Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｄｒｕｇ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｓｗｅｅｔｍａｎ，２００５，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ．、及びＭａｒｔｉｎｄａｌｅ，Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ：Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，３１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ．，１９９６，Ａｍｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｎ、及びＳｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照することができる。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。典型的には、医薬組成物中には治療有効用量又は効果的用量のＡＣＥタンパク質が利用される。ＡＣＥタンパク質は、当業者に公知の従来方法によって薬学的に許容可能な剤形に製剤化される。投薬量レジメンは、所望の応答（例えば治療応答）を提供するように調整される。治療上又は予防上有効な用量の決定においては、低用量を投与し、次に望ましくない副作用は最小限として又は全くなく所望の応答が達成されるまで漸増させることができる。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、数回に分割された用量が時間をかけて投与されてもよく、又は治療状況の危急性が示すところに従い用量を比例的に増減させてもよい。特に、容易な投与及び投薬量の均一性のため、非経口組成物を投薬量単位形態で製剤化することが有利である。投薬量単位形態は、本明細書で使用されるとき、治療対象への単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位が、必要な医薬担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定の分量の活性化合物を含有する。
医薬組成物中にある活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって毒性でなく、詳細な患者、組成物、及び投与様式に対して所望の治療応答を実現するのに有効な活性成分の量に達するように変えられてもよい。選択される投薬量レベルは、用いられる詳細な組成物、又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる詳細な化合物の***速度、治療継続期間、他の薬物、用いられる詳細な組成物と併用して使用される化合物及び／又は材料、治療下の患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康及び前病歴などの要因を含め、種々の薬物動態学的要因に依存する。
製品／キット
一部の態様において、ＡＣＥタンパク質は製品（即ちキット）で提供される。提供されるＡＣＥタンパク質は、概してバイアル又は容器内にある。従って、製品は、容器及び容器上にある又はそれと関連付けられたラベル又は添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、溶液バッグ等が挙げられる。適宜、ＡＣＥタンパク質は液体又は乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態）であってもよい。容器は、それ自体で、又は別の組成物との組み合わせで、癌の治療、予防及び／又は改善用の組成物の調製に有効な組成物を保持する。ラベル又は添付文書は、組成物が免疫関連障害の治療、予防及び／又は改善に使用されることを指示する。本明細書に記載されるとおりのＡＣＥタンパク質を含む製品（キット）は、任意選択で１つ以上の追加的薬剤を含む。一部の実施形態において、製品（キット）はＡＣＥタンパク質と薬学的に許容可能な希釈剤とを含む。一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質は、製品（キット）において１つ以上の追加的な活性薬剤と共に同じ製剤に（例えば、混合物として）提供される。一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質は製品（キット）において第２又は第３の薬剤と共に別個の製剤に（例えば、別個の容器に）提供される。特定の実施形態において、製品（キット）はＡＣＥタンパク質のアリコートを含み、ここでアリコートは１用量以上を提供する。一部の実施形態において複数回投与用のアリコートが提供され、ここで用量は均一であるか、又は変化する。詳細な実施形態において、変化する投与レジメンは、適宜、漸増又は漸減するものである。一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質及び第２の薬剤の投薬量は、独立に均一であるか、又は独立に変化する。特定の実施形態において、製品（キット）は、抗癌剤又は免疫チェックポイント分子などの追加的薬剤を含む。１つ以上の追加的薬剤の選択は、投薬量、送達、及び治療しようとする疾患状態に依存することになる。
治療方法及び治療のための医薬組成物の使用
癌の治療
ＡＣＥタンパク質は、癌の治療、改善又は予防に用途が見出される。一態様において、本開示は、それを必要としている個体の癌の治療方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるとおりのＡＣＥタンパク質の治療有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体の癌の治療又は予防における治療剤としての使用のためのＡＣＥタンパク質が提供される。更なる態様において、本開示は、それを必要としている個体の癌の治療又は改善における使用のためのかかるＡＣＥタンパク質を含む組成物を提供する。
治療の対象となる病態には、様々な癌疾患が含まれる。治療目的では、個体は癌と診断された。防御又は予防目的では、個体は癌からの寛解期にあってもよく、又は将来の発症が見込まれてもよい。一部の実施形態において、患者は癌を有するか、癌を有する疑いがあるか、又は癌からの寛解期にある。ＡＣＥタンパク質による治療の対象となる癌は、通常、本明細書に記載されるとおり、サイトカインシグナル伝達の活性化から利益を得る。治療の対象となる癌疾患としては、限定なしに：黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌及びリンパ腫が挙げられる。
免疫関連障害の治療
ＡＣＥタンパク質は、免疫関連障害の治療、改善又は予防に使用が見出される。一態様において、本開示は、それを必要としている個体の免疫関連障害の治療方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるとおりのＡＣＥタンパク質の治療有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体の免疫関連障害の治療又は予防における治療剤としての使用のための抗体サイトカイングラフト化タンパク質が提供される。更なる態様において、本開示は、それを必要としている個体の免疫関連障害の治療又は改善における使用のためのかかるＡＣＥタンパク質を含む組成物を提供する。
治療の対象となる病態としては、様々な免疫関連障害が挙げられる。治療目的については、個体は免疫関連障害と診断された。防御又は予防目的については、個体は、免疫関連障害から寛解していてもよく、又は将来的な発生が予測されてもよい。一部の実施形態において、患者は免疫関連障害を有するか、免疫関連障害を有する疑いがあるか、又は免疫関連障害から寛解している。ＡＣＥタンパク質による治療の対象となる免疫関連障害は、通常、本明細書に記載されるとおりのサイトカインシグナル伝達の活性化から利益を得る。治療の対象となる免疫関連障害としては、限定なしに：炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、乾癬、Ｉ型糖尿病、急性膵炎、ぶどう膜炎、シェーグレン病、ベーチェット病、サルコイドーシス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、全身性エリテマトーデス、白斑、慢性予防的急性移植片対宿主病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｃｕｔｅ ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）（ｐＧｖＨＤ）、ＨＩＶ誘発性脈管炎、円形脱毛症、全身性硬化症モルフェア（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｍｏｒｐｈｏｅａ）、及び原発性抗リン脂質症候群が挙げられる。
肥満の治療
ＡＣＥタンパク質は、肥満の治療、改善又は予防に用途が見出される。一態様において、本開示は、それを必要としている個体の肥満の治療方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるとおりのＡＣＥタンパク質の治療有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体の肥満の治療又は予防における治療剤としての使用のためのＡＣＥタンパク質が提供される。更なる態様において、本開示は、それを必要としている個体の肥満の治療又は改善における使用のためのかかるＡＣＥタンパク質を含む組成物を提供する。
治療の対象となる病態には様々な肥満疾患が含まれる。治療目的では、個体は肥満と診断された。防御又は予防目的では、個体は将来の肥満発症が見込まれてもよい。一部の実施形態において、患者は肥満を有するか、肥満を有する疑いがあるか、又は肥満から回復中である。抗体サイトカイングラフト化タンパク質による治療の対象となる肥満は、本明細書に記載されるとおりのサイトカインシグナル伝達の活性化から利益を得てもよい。
ＡＣＥタンパク質の投与
医師又は獣医師は、医薬組成物中に用いるＡＣＥタンパク質の用量を所望の治療効果の実現に必要な用量よりも低いレベルで開始し、所望の効果が実現するまで投薬量を徐々に増加させることができる。一般に、組成物の有効用量は、治療されることになる具体的な疾患又は病態、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトか、それとも動物か、投与されている他の薬物療法、及び治療が予防的か、それとも療法的かを含め、多くの異なる要因に応じて変わる。治療投薬量は、安全性及び有効性を最適化するため典型的には滴定が必要である。ＡＣＥタンパク質を伴う投与について、投薬量は宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、及びより通常は０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば投薬量は１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。投与は必要又は所望に応じて毎日、毎週、隔週、毎月、又はそれより多い若しくは少ない頻度であってもよい。例示的治療レジームは必然的に、週１回、２週間毎に１回又は月１回又は３〜６ヵ月毎に１回の投与を伴う。
ＡＣＥタンパク質は単回用量又は分割用量で投与することができる。ＡＣＥタンパク質は通常、複数の機会に投与される。単回投薬量間の間隔は、必要又は所望に応じて毎週、隔週、毎月又は毎年であってもよい。間隙はまた、患者におけるＡＣＥタンパク質の血中レベルの測定によって指示されるとおり不規則であってもよい。一部の方法では、投薬量は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、及び一部の方法では２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿ＡＣＥタンパク質濃度が実現するように調整される。或いは、ＡＣＥタンパク質は徐放製剤として投与することができ、この場合より低い頻度での投与が必要である。投薬量及び頻度は患者におけるＡＣＥタンパク質の半減期に応じて変わる。一般に、ヒト化抗体を含む抗体グラフト化タンパク質は天然サイトカインよりも長い半減期を示す。投薬量及び投与頻度は、治療が予防的か、それとも療法的かに応じて変わり得る。一部の患者は、その生涯にわたって治療を受け続ける。一般に予防適用については、比較的低い投薬量が比較的低い頻度間隔で長期にわたって投与される。一般に療法適用については、疾患の進行が減少又は終了するまで、及び好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投薬量が時に必要となる。その後、患者は予防レジームを投与されてもよい。
第２の薬剤との共投与
用語「併用療法」は、本開示に記載される治療上の病態又は障害を治療するための２つ以上の治療剤の投与を指す。このような投与は、固定比の活性成分を有する単一のカプセルなどの、実質的に同時の様式でのこれらの治療剤の同時投与を包含する。或いは、このような投与は、各活性成分について、複数の、又は別々の容器（例えば、カプセル、粉末、及び液体）中での同時投与を包含する。粉末及び／又は液体は、投与前に所望の用量に再構成又は希釈され得る。更に、このような投与は、ほぼ同時に又は異なる時間に、連続的様式での、それぞれのタイプの治療剤の使用も包含する。いずれの場合も、治療計画は、本明細書に記載される病態又は障害を治療する際に薬物の組み合わせの有益な効果を提供する。
併用療法は「相乗作用」を提供することができ、「相乗的」である、即ち、活性成分を併せて使用したときに達成される効果が、それらの化合物を個別に使用して得られる効果の総和より高いことが判明し得る。相乗効果は、活性成分が（１）共製剤化されて投与されるか、又は組み合わせた単位投薬量製剤で同時に送達されるとき；（２）別個の製剤として交互に又は並行して送達されるとき；又は（３）他の何らかのレジメンによるとき、達成され得る。交互投与療法で送達される場合、相乗効果は、化合物が例えば別個のシリンジでの異なる注射によって逐次的に投与又は送達されるときに達成され得る。一般に、交互投与療法に際して、各活性成分の有効投薬量は逐次的に、即ち連続的に投与され、一方併用療法では、２つ以上の活性成分の有効投薬量は一緒に投与される。
一態様において、本開示は、限定はされないが、ＥＧＦＲ阻害薬、Ｈｅｒ２阻害薬、Ｈｅｒ３阻害薬、ＩＧＦＲ阻害薬、及びＭｅｔ阻害薬を含めた１つ以上のチロシンキナーゼ阻害薬と併用してＡＣＥタンパク質をそれを必要としている対象に投与することによる癌の治療方法を提供する。
例えば、チロシンキナーゼ阻害薬としては、限定はされないが、エルロチニブ塩酸塩（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；リニファニブ（Ｎ−［４−（３−アミノ−１Ｈ−インダゾール−４−イル）フェニル］−Ｎ’−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）尿素、別名ＡＢＴ ８６９、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能）；リンゴ酸スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；ボスチニブ（４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル、別名ＳＫＩ−６０６、及び米国特許第６，７８０，９９６号明細書に記載される）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））；パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））；Ｚａｃｔｉｍａ（ＺＤ６４７４）；ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ（登録商標））；レゴラフェニブ（Ｓｔｉｖａｒｇａ（登録商標））及びイマチニブ又はメシル酸イマチニブ（Ｇｉｌｖｅｃ（登録商標）及びＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標））が挙げられる。
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害薬としては、限定はされないが、エルロチニブ塩酸塩（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｎｉｂ）（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））；Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３”Ｓ”）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド、Ｔｏｖｏｋ（登録商標））；バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（登録商標））；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；カネルチニブ二塩酸塩（ＣＩ−１０３３）；６−［４−［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン（ＡＥＥ７８８、ＣＡＳ ４９７８３９−６２−０）；ムブリチニブ（ＴＡＫ１６５）；ペリチニブ（ＥＫＢ５６９）；アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６）；Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリンアミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ ７８１６１３−２３−８）；及び４−［４−［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール（ＰＫＩ１６６、ＣＡＳ １８７７２４−６１−４）が挙げられる。
ＥＧＦＲ抗体としては、限定はされないが、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））；マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）；ニモツズマブ（ｈＲ３）；ザルツムマブ；ＴｈｅｒａＣＩＭ ｈ−Ｒ３；ＭＤＸ０４４７（ＣＡＳ ３３９１５１−９６−１）；及びｃｈ８０６（ｍＡｂ−８０６、ＣＡＳ ９４６４１４−０９−１）が挙げられる。
ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２受容体）（別名Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０、又はｐ１８５）阻害薬としては、限定はされないが、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；ペルツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標））；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２、（２Ｅ）−Ｎ−［４−［［３−クロロ−４−［（ピリジン−２−イル）メトキシ］フェニル］アミノ］−３−シアノ−７−エトキシキノリン−６−イル］−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミド、及び国際公開第０５／０２８４４３号パンフレットに記載される）；ラパチニブ又は二トシル酸ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；（２Ｅ）−Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３Ｓ）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド（ＢＩＢＷ−２９９２、ＣＡＳ ８５０１４０−７２−６）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ ５９９６２６、ＣＡＳ ７１４９７１−０９−２）；カネルチニブ二塩酸塩（ＰＤ１８３８０５又はＣＩ−１０３３）；及びＮ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリンアミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ ７８１６１３−２３−８）が挙げられる。
ＨＥＲ３阻害薬としては、限定はされないが、ＬＪＭ７１６、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ−８８８、ＲＧ７１１６、ＲＥＧＮ−１４００、ＡＶ−２０３、ＭＰ−ＲＭ−１、ＭＭ−１１１、及びＭＥＨＤ−７９４５Ａが挙げられる。
ＭＥＴ阻害薬としては、限定はされないが、カボザンチニブ（ＸＬ１８４、ＣＡＳ ８４９２１７−６８−１）；フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９、旧ＸＬ８８０、ＣＡＳ ８４９２１７−６４−７）；チバンチニブ（ＡＲＱ１９７、ＣＡＳ １０００８７３−９８−２）；１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（５−（７−メトキシキノリン−４−イルオキシ）ピリジン−２−イル）−５−メチル−３−オキソ−２−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＡＭＧ ４５８）；クリゾチニブ（Ｃｒｙｚｏｔｉｎｉｂ）（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標）、ＰＦ−０２３４１０６６）；（３Ｚ）−５−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イルスルホニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＳＵ１１２７１）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１２７４）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−｛［３，５−ジメチル−４−（３−モルホリン−４−イルプロピル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン｝−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１６０６）；６−［ジフルオロ［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］メチル］−キノリン（ＪＮＪ３８８７７６０５、ＣＡＳ ９４３５４０−７５−８）；２−［４−［１−（キノリン−６−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピラジン−６−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］エタノール（ＰＦ０４２１７９０３、ＣＡＳ ９５６９０５−２７−４）；Ｎ−（（２Ｒ）−１，４−ジオキサン−２−イルメチル）−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］スルファミド（ＭＫ２４６１、ＣＡＳ ９１７８７９−３９−１）；６−［［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］チオ］−キノリン（ＳＧＸ５２３、ＣＡＳ １０２２１５０−５７−７）；及び（３Ｚ）−５−［［（２，６−ジクロロフェニル）メチル］スルホニル］−３−［［３，５−ジメチル−４−［［（２Ｒ）−２−（１−ピロリジニルメチル）−１−ピロリジニル］カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＰＨＡ６６５７５２、ＣＡＳ ４７７５７５−５６−７）が挙げられる。
ＩＧＦ１Ｒ阻害薬としては、限定はされないが、ＢＭＳ−７５４８０７、ＸＬ−２２８、ＯＳＩ−９０６、ＧＳＫ０９０４５２９Ａ、Ａ−９２８６０５、ＡＸＬ１７１７、ＫＷ−２４５０、ＭＫ０６４６、ＡＭＧ４７９、ＩＭＣＡ１２、ＭＥＤＩ−５７３、及びＢＩ８３６８４５が挙げられる。レビューについては、例えば、Ｙｅｅ，ＪＮＣＩ，１０４；９７５（２０１２）を参照のこと。
別の態様において、本開示は、限定はされないが、ＭＥＫ阻害薬、Ｂｒａｆ阻害薬、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害薬、ＳＨＰ２阻害薬、及びまたｍＴｏｒ阻害薬を含めた１つ以上のＦＧＦ下流シグナル伝達経路阻害薬と併用してＡＣＥタンパク質をそれを必要としている対象に投与することによる癌の治療方法を提供する。
例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）阻害薬としては、限定はされないが、ＸＬ−５１８（別名ＧＤＣ−０９７３、ＣＡＳ番号１０２９８７２−２９−４、ＡＣＣ Ｃｏｒｐ．から入手可能）；２−［（２−クロロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４−ジフルオロ−ベンズアミド（別名ＣＩ−１０４０又はＰＤ１８４３５２及び国際公開第２００００３５４３６号パンフレットに記載される）；Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（別名ＰＤ０３２５９０１及び国際公開第２００２００６２１３号パンフレットに記載される）；２，３−ビス［アミノ［（２−アミノフェニル）チオ］メチレン］−ブタンジニトリル（別名Ｕ０１２６及び米国特許第２，７７９，７８０号明細書に記載される）；Ｎ−［３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６−メトキシフェニル］−１−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロピル］−シクロプロパンスルホンアミド（別名ＲＤＥＡ１１９又はＢＡＹ８６９７６６及び国際公開第２００７０１４０１１号パンフレットに記載される）；（３Ｓ，４Ｒ，５Ｚ，８Ｓ，９Ｓ，１１Ｅ）−１４−（エチルアミノ）−８，９，１６−トリヒドロキシ−３，４−ジメチル−３，４，９，１９−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾオキサシクロテトラデシン−１，７（８Ｈ）−ジオン］（別名Ｅ６２０１及び国際公開第２００３０７６４２４号パンフレットに記載される）；２’−アミノ−３’−メトキシフラボン（別名ＰＤ９８０５９ Ｂｉａｆｆｉｎ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．，ＫＧ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）；ベムラフェニブ（ＰＬＸ−４０３２、ＣＡＳ ９１８５０４−６５−１）；（Ｒ）−３−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４，７（３Ｈ，８Ｈ）−ジオン（ＴＡＫ−７３３、ＣＡＳ １０３５５５５−６３−５）；ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６、ＣＡＳ １２０４５３１−２６−９）；及びトラメチニブジメチルスルホキシド（ＧＳＫ−１１２０２１２、ＣＡＳ １２０４５３１−２５−８０）が挙げられる。
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬としては、限定はされないが、４−［２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）ピペラジン−１−イル］メチル］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル］モルホリン（別名ＧＤＣ ０９４１並びに国際公開第０９／０３６０８２号パンフレット及び国際公開第０９／０５５７３０号パンフレットに記載される）；２−メチル−２−［４−［３−メチル−２−オキソ−８−（キノリン−３−イル）−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］フェニル］プロピオニトリル（別名ＢＥＺ ２３５又はＮＶＰ−ＢＥＺ ２３５、及び国際公開第０６／１２２８０６号パンフレットに記載される）；４−（トリフルオロメチル）−５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）ピリジン−２−アミン（別名ＢＫＭ１２０又はＮＶＰ−ＢＫＭ１２０、及び国際公開第２００７／０８４７８６号パンフレットに記載される）；トザセルチブ（ＶＸ６８０又はＭＫ−０４５７、ＣＡＳ ６３９０８９−５４−６）；（５Ｚ）−５−［［４−（４−ピリジニル）−６−キノリニル］メチレン］−２，４−チアゾリジンジオン（ＧＳＫ１０５９６１５、ＣＡＳ ９５８８５２−０１−２）；（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）−５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペニルアミノ）メチレン］−４，４ａ，５，６，６ａ，８，９，９ａ−オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチル）−４ａ，６ａ−ジメチル−シクロペンタ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２，７，１０（１Ｈ）−トリオン（ＰＸ８６６、ＣＡＳ ５０２６３２−６６−８）；及び８−フェニル−２−（モルホリン−４−イル）−クロメン−４−オン（ＬＹ２９４００２、ＣＡＳ １５４４４７−３６−６）が挙げられる。
ｍＴｏｒ阻害薬としては、限定はされないが、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標））；リダフォロリムス（正式には別名デフォロリムス（ｄｅｆｅｒｏｌｉｍｕｓ）、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、別名ＡＰ２３５７３及びＭＫ８６６９、及び国際公開第０３／０６４３８３号パンフレットに記載される）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）又はＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、シロリムス（登録商標））；セマピモド（ｓｉｍａｐｉｍｏｄ）（ＣＡＳ １６４３０１−５１−３）；（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［トランス−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ １０１３１０１−３６−４）；及びＮ２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−（配列番号３９７９として開示される「Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン」）、内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ ９３６４８７−６７−１）が挙げられる。
更に別の態様において、本開示は、限定はされないが、ＩＡＰ阻害薬、Ｂｃｌ２阻害薬、ＭＣＬ１阻害薬、Ｔｒａｉｌ薬剤、Ｃｈｋ阻害薬を含めた１つ以上のアポトーシス促進物質と併用してＡＣＥタンパク質をそれを必要としている対象に投与することによる癌の治療方法を提供する。
例えば、ＩＡＰ阻害薬としては、限定はされないが、ＮＶＰ−ＬＣＬ１６１、ＧＤＣ−０９１７、ＡＥＧ−３５１５６、ＡＴ４０６、及びＴＬ３２７１１が挙げられる。ＩＡＰ阻害薬の他の例としては、限定はされないが、国際公開第０４／００５２８４号パンフレット、国際公開第０４／００７５２９号パンフレット、国際公開第０５／０９７７９１号パンフレット、国際公開第０５／０６９８９４号パンフレット、国際公開第０５／０６９８８８号パンフレット、国際公開第０５／０９４８１８号パンフレット、米国特許出願公開第２００６／００１４７００号明細書、米国特許出願公開第２００６／００２５３４７号明細書、国際公開第０６／０６９０６３号パンフレット、国際公開第０６／０１０１１８号パンフレット、国際公開第０６／０１７２９５号パンフレット、及び国際公開第０８／１３４６７９号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
ＢＣＬ−２阻害薬としては、限定はされないが、４−［４−［［２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキセン−１−イル］メチル］−１−ピペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（４−モルホリニル）−１−［（フェニルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−［（トリフルオロメチル）スルホニル］フェニル］スルホニル］ベンズアミド（別名ＡＢＴ−２６３及び国際公開第０９／１５５３８６号パンフレットに記載される）；テトロカルシンＡ；アンチマイシン；ゴシポール（（−）ＢＬ−１９３）；オバトクラックス；エチル−２−アミノ−６−シクロペンチル−４−（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチル）−４Ｈクロモン−３−カルボキシレート（ＨＡ１４−１）；オブリメルセン（Ｇ３１３９、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標））；Ｂａｋ ＢＨ３ペプチド；（−）−ゴシポール酢酸（ＡＴ−１０１）；４−［４−［（４’−クロロ［１，１’−ビフェニル］−２−イル）メチル］−１−ピペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−［（フェニルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−ニトロフェニル］スルホニル］−ベンズアミド（ＡＢＴ−７３７、ＣＡＳ ８５２８０８−０４−９）；及びナビトクラクス（ＡＢＴ−２６３、ＣＡＳ ９２３５６４−５１−６）が挙げられる。
限定はされないが、デュラネルミン（ＡＭＧ−９５１、ＲｈＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ）；マパツムマブ（ＨＲＳ−ＥＴＲ１、ＣＡＳ ６５８０５２−０９−６）；レクサツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＡＳ ８４５８１６−０２−６）；Ａｐｏｍａｂ（Ａｐｏｍａｂ（登録商標））；コナツムマブ（ＡＭＧ６５５、ＣＡＳ ８９６７３１−８２−１）；及びチガツズマブ（ＣＳ１００８、ＣＡＳ ９４６４１５−３４−５、第一三共（Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ）から入手可能）を含め、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１）及びＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２）を含めたアポトーシス促進性受容体作動薬（ＰＡＲＡ）。
チェックポイントキナーゼ（ＣＨＫ）阻害薬としては、限定はされないが、７−ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ−０１）；６−ブロモ−３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（３Ｒ）−３−ピペリジニル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（ＳＣＨ９００７７６、ＣＡＳ ８９１４９４−６３−６）；５−（３−フルオロフェニル）−３−ウレイドチオフェン−２−カルボン酸Ｎ−［（Ｓ）−ピペリジン−３−イル］アミド（ＡＺＤ７７６２、ＣＡＳ ８６０３５２−０１−８）；４−［（（３Ｓ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタ−３−イル）アミノ］−３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−６−クロロキノリン−２（１Ｈ）−オン（ＣＨＩＲ １２４、ＣＡＳ ４０５１６８−５８−３）；７−アミノダクチノマイシン（７−Ａｍｉｎｏｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）（７−ＡＡＤ）、イソグラヌラチミド、デブロモヒメニアルジシン；Ｎ−［５−ブロモ−４−メチル−２−［（２Ｓ）−２−モルホリニルメトキシ］−フェニル］−Ｎ’−（５−メチル−２−ピラジニル）尿素（ＬＹ２６０３６１８、ＣＡＳ ９１１２２２−４５−２）；スルホラファン（ＣＡＳ ４４７８−９３−７、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネート）；９，１０，１１，１２−テトラヒドロ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１，３（２Ｈ）−ジオン（ＳＢ−２１８０７８、ＣＡＳ １３５８９７−０６−２）；及びＴＡＴ−Ｓ２１６Ａ（Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ ２００７；６（１）：１４７−１５３）、及びＣＢＰ５０１が挙げられる。
一態様において、本開示は、１つ以上のＦＧＦＲ阻害薬と併用してＡＣＥタンパク質をそれを必要としている対象に投与することによる癌の治療方法を提供する。例えば、ＦＧＦＲ阻害薬としては、限定はされないが、ブリバニブアラニネート（ＢＭＳ−５８２６６４、（Ｓ）−（（Ｒ）−１−（４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ）プロパン−２−イル）２−アミノプロパノエート）；バーガテフ（ＢＩＢＦ１１２０、ＣＡＳ ９２８３２６−８３−４）；ドビチニブ二乳酸（ＴＫＩ２５８、ＣＡＳ ８５２４３３−８４−２）；３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素（ＢＧＪ３９８、ＣＡＳ ８７２５１１−３４−７）；ダヌセルチブ（ＰＨＡ−７３９３５８）；及び（ＰＤ１７３０７４、ＣＡＳ ２１９５８０−１１−７）が挙げられる。ある具体的な態様において、本開示は、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシフェニル）−１−（６（（４−（４−エチルピペラジン−１−イル）フェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）−１−メチル尿素（別名ＢＧＪ−３９８）；又は４−アミノ−５−フルオロ−３−（５−（４−メチルピペラジン１−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン（別名ドビチニブ又はＴＫＩ−２５８）、ＡＺＤ４５４７（Ｇａｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７２，２０４５−５６、Ｎ−［５−［２−（３，５−ジメトキシフェニル）エチル］−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−４−（３Ｒ，５Ｓ）−ジメチルピペラジン（ｄｉｅｍｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ）−１−イル）ベンズアミド）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４；Ｇｏｚｇｉｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，１１；６９０−９９；３−［２−（イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）エチニル］−４−メチル−Ｎ−｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］−３−（トリフルオロメチル）フェニル｝ベンズアミド、ＣＡＳ ９４３３１９−７０−８）などのＦＧＦＲ２阻害薬と併用して抗体薬物コンジュゲートをそれを必要としている対象に投与することによる癌の治療方法を提供する。
ＡＣＥタンパク質はまた、別のサイトカイン、又はＡＣＥタンパク質と併用して投与することもできる。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ１５、ＩＬ１５−Ｆｃ、ＩＬ１５受容体又はＩＬ１５／可溶性ＩＬ１５Ｒａのｓｕｓｈｉドメインに連結したＩＬ１５である。一部の実施形態において、サイトカインは、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）又は白血病抑制因子（ＬＩＦ）である。
ＡＣＥタンパク質はまた、免疫チェックポイント阻害薬と併用して投与することもできる。一実施形態において、ＡＣＥタンパク質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４又はＴＧＦＲのうちの１つ以上から選択される免疫チェックポイント分子の阻害薬と併用して投与することができる。一実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は抗ＰＤ−１抗体であり、ここで抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ又はピジリズマブから選択される。一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体分子はニボルマブである。ニボルマブの別名には、ＭＤＸ−１１０６、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８、又はＢＭＳ−９３６５５８が含まれる。一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体はニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４−９４−４）である。ニボルマブは、ＰＤ１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブ（クローン５Ｃ４）及びその他の、ＰＤ１に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体が、米国特許第８，００８，４４９号明細書及び国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットに開示されている。
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体はペンブロリズマブである。ペンブロリズマブ（別名ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＭＫ０３４７５、ＳＣＨ−９００４７５又はＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）；Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブ及び他のヒト化抗ＰＤ−１抗体について、Ｈａｍｉｄ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６９（２）：１３４−４４、米国特許第８，３５４，５０９号明細書及び国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットに開示されている。
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体はピジリズマブである。ピジリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｃｕｒｅ Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピジリズマブ及び他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体について、国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットに開示されている。
他の抗ＰＤ１抗体としては、ＡＭＰ ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）及び、例えば、米国特許第８，６０９，０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０２８３３０号明細書、及び／又は米国特許出願公開第２０１２／０１１４６４９号明細書及び米国特許出願公開第２０１６／０１０８１２３号明細書に開示される抗ＰＤ１抗体が挙げられる。
一部の実施形態において、ＡＣＥタンパク質は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号明細書に開示される抗Ｔｉｍ３抗体と共に投与することができる。他の実施形態において、ＡＣＥタンパク質は、米国特許出願公開第２０１６／０１０８１２３号明細書に開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ（登録商標）（ＭＥＤＩ４７３６）、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（登録商標）（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）又はＡｖｅｌｕｍａｂ（登録商標）、又は国際公開第２０１６／０６１１４２号パンフレットに開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体と共に投与することができる。
一部の実施形態において、薬理組成物は、抗体サイトカイングラフト化タンパク質と１つ以上の追加的な薬理学的薬剤との混合物を含む。本抗体サイトカイングラフト化タンパク質と共に混合物に含められる例示的な第２の薬剤としては、限定なしに、抗炎症剤、免疫調節剤、アミノサリチル酸、及び抗生物質が挙げられる。適切な選択は、好ましい製剤、投薬量及び／又は送達方法に依存し得る。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は抗炎症剤と共製剤化される（即ち、混合物として提供されるか、又は混合物に調製される）。詳細な実施形態において、コルチコステロイド抗炎症剤を抗体サイトカイングラフト化タンパク質と併せて使用することができる。使用のためのコルチコステロイドは、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、ブデソニド（ｂｕｄｅｎｉｓｏｎｉｄｅ）、メサラミン、及びデキサメタゾンのいずれかから選択することができる。適切な選択は、製剤及び送達優先性に依存することになる。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は免疫調節剤と共製剤化される。詳細な実施形態において、免疫調節剤は、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、タクロリムス、及びメトトレキサートのいずれかから選択される。詳細な実施形態において、免疫調節剤は、抗ＴＮＦ剤（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ）、ナタリズマブ、及びベドリズマブから選択される。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質はアミノサリチル酸剤と共調製される。詳細な実施形態においてアミノサリチル酸は、スルファサラジン、メサラミン、バルサラジド、オルサラジン又は他の５−アミノサリチル酸誘導体から選択される。
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は抗細菌剤と共調製される。例示的抗細菌剤としては、限定なしに、スルホンアミド類（例えば、スルファニルアミド、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、スルフイソオキサゾール、スルファセタミド）、トリメトプリム、キノロン類（例えば、ナリジクス酸、シノキサシン、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、フレロキサシン、ペフロキサシン（ｐｅｒｌｏｘａｃｉｎ）、レボフロキサシン、ガレノキサシン及びゲミフロキサシン）、メテナミン、ニトロフラントイン、ペニシリン類（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリンオキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン（ｎａｆｃｉｌｉｎ）、アンピシリン、アモキシシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、及びピペラシリン）、セファロスポリン類（例えば、セファゾリン、セファレキシン、セファドロキシル、セフォキシチン、セファクロル、セフプロジル、セフロキシム、セフロキシムアキセチル（ｃｅｆｕｒｏｘｉｍｅ ａｃｅｔｉｌ）、ロラカルベフ、セフォテタン、セフォラニド、セフォタキシム、セフポドキシムプロキセチル、セフチブテン（ｃｅｆｉｂｕｔｅｎ）、セフジニル、セフジトレンピボキシル（ｃｅｆｄｉｔｏｒｅｎ ｐｉｖｏｒｘｉｌ）、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、及びセフェピム（ｃｅｆｅｐｉｎｅ））、カルバペネム類（例えば、イミペネム、アズトレオナム）、及びアミノグリコシド類（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン（ｔｏｒａｍｙｃｉｎ）、ネチルマイシン、及びアミカシン）が挙げられる。
実施例１：ＡＣＥタンパク質構築物の創製
サイトカイン配列を様々な免疫グロブリン足場のＣＤＲ領域内に操作することによりＡＣＥタンパク質を作成し、次に重鎖及び軽鎖の両方の免疫グロブリン鎖を使用して最終的なＡＣＥタンパク質を作成した。ＡＣＥタンパク質はサイトカインの好ましい治療特性を付与し；及び半減期の増加、及び製造し易さなど、更なる有益な効果を有する。
ＡＣＥタンパク質を創製するため、成熟型のサイトカイン配列を免疫グロブリン鎖足場のＣＤＲループに挿入した。ＡＣＥタンパク質に選択したサイトカインは、ＩＬ２ ＡＣＥ分子の追加を伴い、表１に挙げる。臨床的セッティングで利用されている種々の公知の免疫グロブリン配列並びに生殖細胞系列抗体配列を使用してＡＣＥタンパク質を調製した。ＧＦＴＸ３ｂ及びＧＦＴＸと称される例示的足場におけるサイトカインの配列を表２に示す。挿入点は、利用可能な構造的又は相同性モデルデータに基づいて、ＣＤＲループの中間点であると選択された。抗体サイトカイン移植タンパク質を、関連する配列をコードする組換えＤＮＡを用いる標準的な分子生物学方法を用いて生成した。
サイトカイングラフト化にどのＣＤＲを選ぶかの選択は、以下のパラメータに関する：要求される生物学、生物物理学的特性及び好ましい開発プロファイル。どのＣＤＲ及びＣＤＲ内のどの位置が所望のパラメータを提供することになるかを予測する際にモデル化ソフトウェアが部分的にのみ有用であったため、従って６つ全ての可能な抗体サイトカイングラフトを作り、次に生物学的アッセイで評価する。要求される生物学的活性が実現する場合、次にＡＣＥ分子とそれぞれのサイトカイン受容体との相互作用の性質を解く。
ＡＣＥタンパク質について、初めにサイトカイングラフト化に考えられる抗体候補の構造を解いた。グラフト化技術に起因して、各ＡＣＥタンパク質は、異なる長さ、配列及び構造環境のＣＤＲループによって制約を受ける。そのため、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３に対応する６つ全てのＣＤＲに各サイトカインをグラフト化した。
挿入点の選択については、ＣＤＲループの構造中心が、いずれの側にも最も大きい（直線サイズ３．８Å×隣接する側にある残基数の）間隔をもたらし得ることに伴い選ばれ、及びいかなる一つの理論によっても拘束されるものではないが、これはサイトカインのより容易な折り畳みを独立に可能にすることにより安定分子を提供した。グラフト足場ＧＦＴＸ３ｂ及びＧＦＴＸの構造は既に分かっていたため、各ＣＤＲの構造中心もまた分かっていた。これは、通常Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式を用いて定義したときのＣＤＲループ配列の中心と一致した。
要約すれば、構造基盤に基づき各ＣＤＲにおける挿入点を選択し、そのサイトカインにどのＣＤＲグラフトが最良かは所望の生物学及び生物物理学的特性に基づいた。サイトカイン受容体の性質、サイトカイン／受容体相互作用及びシグナル伝達機構もまた役割を果たしたと共に、これは各個別の抗体サイトカイン分子をそのそれぞれの特性に関して比較することにより調査した。
実施例２：マウス脾細胞におけるＡＣＥタンパク質のインビトロ活性
マウス脾臓から細胞を単離し、各ウェルに単一細胞懸濁液を加えた。ウェルに各ＩＬ７ ＡＣＥタンパク質、組換えヒトＩＬ７、又はＩＬ７−Ｆｃ分子を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。２０分後、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（ＢＤ＃５５４６５５）で固定し、洗浄して表面マーカーで染色した。室温で３０分後、試料を洗浄し、再懸濁した細胞ペレットを−２０℃ Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤ＃５５８０５０）で透過処理し、洗浄してｐＳＴＡＴ５ Ａｂ（ＢＤ＃６１２５６７）で染色した。細胞をＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａで捕捉し、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。データはＰｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアでグラフ化した。
マウス脾細胞上のＩＬ７Ｒａに対する刺激に関してＩＬ７ ＡＣＥタンパク質を評価した。ＩＬ７ ＡＣＥタンパク質は全て、等モル量の組換えヒトＩＬ７（ｒｅｃ ｈＩＬ７）、並びにＦｃ部分と組み合わせたヒトＩＬ−７と比較したとき、ＣＤ８（図３Ａ）及びＣＤ４（図３Ｂ）Ｔ細胞の両方でＩＬ７Ｒａ経路の活性化の増加を示した。従って、ＩＬ７をグラフト化するとサイトカインの効力が増加する。
実施例３：ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ７ＡＣＥタンパク質のインビトロ活性
ＰＢＭＣ細胞を無血清試験培地に置き、細胞にＩＬ７ ＡＣＥタンパク質又は組換えヒトＩＬ７を加えて３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、細胞を１．６％ホルムアルデヒドで固定し、洗浄して表面マーカーで染色した。室温で３０分後、試料を洗浄し、再懸濁した細胞ペレットを−２０℃メタノールで透過処理し、洗浄して、ｐＳＴＡＴ５ Ａｂ（ＢＤ＃６１２５６７）及びＤＮＡインターカレーターで染色した。細胞をＣｙｔｏｆにかけ、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。
試験した分子は全て、そのフォーマットとは無関係に、野生型足場又は非刺激細胞と比較したときＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞の両方でＩＬ７Ｒａ経路の活性化を誘導したが、Ｂ細胞又はＮＫ細胞については誘導しなかった（図４Ａ）。加えて、ＣＤ８（図４Ｂ）及びＣＤ４（図４Ｃ）Ｔ細胞は両方とも、組換えｈＩＬ７、又はＩＬ７ ＡＣＥタンパク質ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ３及びＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２のいずれによっても、及び使用した濃度とは無関係に、強力に活性化された。従って、ｈＩＬ７ ＡＣＥタンパク質は、Ｂ細胞又はＮＫ細胞は刺激することなく、ＣＤ８及びＣＤ４ヒトＴ細胞の両方を強力に刺激する。
実施例４：Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるｈＩＬ７ ＡＣＥタンパク質のインビボ活性
Ｂ６雌マウスにｈＩＬ７、ｈＩＬ７−Ｆｃ及びＩＬ７ ＡＣＥタンパク質を１日１回、４日間にわたり種々の濃度で投与した。最終回治療の翌日（５日目）、脾臓を処理して単一細胞懸濁液を入手し、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）で洗浄した。赤血球を赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ ＃Ｒ７７５７）で溶解させ、細胞数及び生存能に関して細胞をカウントした。ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ナトリウムアジド）を使用した標準プロトコルに基づきＦＡＣＳ染色を実施した。細胞を表面抗体：ラット抗マウスＣＤ８−ＢＵＶ７３７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６４２９７）、ラット抗マウスＣＤ１９−ＰｅＣＦ５９４／ＴＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６２２９１）、ラット抗マウスＣＤ３−ＰｅｒＣＰ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃１００２１８）、ラット抗マウスＣＤ１２７−ｅ４５０（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃４８−１２７３−８２）、ラット抗マウスＣＤ４−ＢＶ５１０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６３１０６）、ラット抗マウスＣＤ４４−ＢＶ７１１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６３９７１）、ラット抗マウスＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６０５１４）で染色し、続いて固定／透過処理し、ラット抗マウスＫｉ−６７−ｅ６６０（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃５０−５６９８−８２）及びＦｏｘＰ３の両方に関して抗マウス／ラットＦｏｘＰ３ ＦＩＴＣ染色セット（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃７１−５７７５−４０）に従い染色した。細胞をＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ又はＢＤ ＦＡＣＳ ＬＳＲ ＩＩで分析し、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。データはＰｒｉｓｍソフトウェアでグラフ化した。
試験した６つの異なるＩＬ７ ＡＣＥタンパク質から、４日連続の１日１回ＩＰ投与後にＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ３及びＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２がＣＤ８ Ｋｉ６７＋ Ｔ細胞（図５Ａ〜図５Ｂ）、並びにエフェクターメモリー（ＣＤ４４ｈｉｇｈ ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）Ｔ細胞の頻度（図５Ｃ〜図５Ｄ）を一貫して増加させた。ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ３及びＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２はＣＤ４＋ Ｔ細胞も同様に一貫して増加させた（データは示さず）。注目すべきことに、ＩＬ７ ＡＣＥタンパク質のモル量が、Ｆｃ融合物ＩＬ７についてＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の同じ相対的拡大を実現するのに使用した量の５分の１であった。ＩＬ７ ＡＣＥタンパク質は全て、マウスによって良好に忍容され、有害な効果は認められなかった。
実施例５：ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルにおけるＩＬ７ＡＣＥタンパク質のインビボ活性
ＣＴ２６（ＡＴＣＣ）細胞は、高悪性度の未分化ヒト結腸直腸癌株であり、同系マウスモデルにおける分子の抗癌活性の試験によく使用される。ＣＴ２６細胞を５％ＣＯ２の３７℃インキュベーターにおいて無菌条件で成長させた。細胞は、１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。細胞は３〜４日毎に継代した。注射当日、細胞を継代１１代目で回収し、ＨＢＳＳ中に２．５×１０６／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞をマイコプラズマ及びマウスウイルスに関してＲａｄｉｌ試験した。各マウスにつき０．２５×１０６細胞を２８ｇ針（１００μｌ注射容積）を使用して右側腹部に皮下注射で移植した。移植後、腫瘍が触知可能になったら、動物を週３回ノギスで測り、秤量した。ノギス測定値は（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２を用いて計算した。マウスには通常食を与え、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）及び動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の規定に従いＳＰＦ動物施設で飼育した。
腫瘍が約１００ｍｍ３に達したとき、マウスに２０〜１００μｇのＩＬ７−ｆｌａｇ、ＩＬ７−Ｆｃ融合物、又はＩＬ７ ＡＣＥタンパク質ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ３及びＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２を週２回、合計４用量にわたり腹腔内投与した。腫瘍を週２回測定した。Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ）ソフトウェアを使用して平均腫瘍容積をプロットした。腫瘍サイズが１０００ｍｍ３の容積に達したとき、有効性試験のエンドポイントが実現した。注射後、マウスはまた、臨床的増悪の徴候についても注意深くモニタした。呼吸窮迫、背弯姿勢、活動性低下、後肢完全麻痺、胸水の徴候としての頻呼吸、２０％又は１５％に近い体重減少＋他の徴候を含めた何らかの病的状態の徴候、又は通常の活動（摂餌、移動）を行う能力がどうかに関してマウスをモニタした。
最終回治療の翌日（１３日目）、脾臓及び腫瘍を採取した。脾臓を処理して単一細胞懸濁液を入手し、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）で洗浄した。赤血球を赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ ＃Ｒ７７５７）で溶解させ、細胞数及び生存能に関して細胞をカウントした。ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ナトリウムアジド）を使用した標準プロトコルに基づきＦＡＣＳ染色を実施した。細胞を以下の表面抗体：ラット抗マウスＣＤ８−ＢＵＶ７３７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６４２９７）、ラット抗マウスＣＤ１９−ＰｅＣＦ５９４／ＴＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６２２９１）、ラット抗マウスＣＤ３−ＰｅｒＣＰ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃１００２１８）、ラット抗マウスＣＤ１２７−ｅ４５０（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃４８−１２７３−８２）、ラット抗マウスＣＤ４−ＢＶ５１０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６３１０６）、ラット抗マウスＣＤ４４−ＢＶ７１１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６３９７１）、ラット抗マウスＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６０５１４）で染色し、続いて固定／透過処理し、ラット抗マウスＫｉ−６７−ｅ６６０（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃５０−５６９８−８２）及びＦｏｘＰ３の両方に関して抗マウス／ラットＦｏｘＰ３ ＦＩＴＣ染色セット（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃７１−５７７５−４０）に従い染色した。細胞をＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）又はＢＤ ＦＡＣＳ ＬＳＲ ＩＩで分析し、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。腫瘍をホルマリンで固定し、パラフィン包埋して、マウスＣＤ８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１４−０８０８−８２）及びマウスＣＤ４（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ１８３６８５）に対する免疫組織化学染色を行った。Ｍａｔｌａｂソフトウェア（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）を使用して陽性細胞数を定量化し、データをＰｒｉｓｍソフトウェアでグラフ化した。
ＡＣＥタンパク質ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ３及びＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２について、ＣＴ２６腫瘍に対するその有効性をインビボで試験した。ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２又はＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２の投与により、等モル用量のＩＬ７ ｆｌａｇタンパク質又はＩＬ７−Ｆｃ融合物と比較したとき腫瘍成長が有意に減少した（図６Ａ）。低用量でも同じ傾向が観察された（図６Ｂ）。また、エフェクターメモリー（ＣＤ４４ｈｉｇｈ／ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度もまた、４用量のうちの最終回の翌日、ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ３及びＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２で治療したマウスで対照群と比較して有意に増加した（図６Ｃ）。加えて、高用量のＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ３及びＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２では、対照群と比較してＣＤ８及びＣＤ４＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の両方の頻度が増加した（それぞれ図６Ｄ、及び図６Ｅ）。従って、ＡＣＥタンパク質ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ３及びＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２は、組換えＩＬ７と比較したときＩＬ７活性の亢進、単剤としての腫瘍容積の低下、ＴＩＬ数の増加を示した。
実施例６：エキソビボ消耗モデルにおけるＩＬ７ ＡＣＥタンパク質の活性
Ｂ６雌マウスを２×１０６ＰＦＵのリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）クローン１３に静脈内（ｉｖ）感染させた。感染３週間後、脾臓を採取して処理することにより単一細胞懸濁液を得た。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｂ細胞枯渇キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を使用してＢ細胞を枯渇させた後、細胞をウェルに加え、抗ＰＤ−Ｌ１抗体有り（培地＋抗ＰＤ−Ｌ１）又は無し（培地）の、３つのＭＨＣ−Ｉと１つのＭＨＣ−ＩＩ ＬＣＭＶ特異的ペプチドとのカクテルを含有するＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）に入れた。２４時間後にＥＬＩＳＡによってＩＮＦγを測定し、Ｐｒｉｓｍソフトウェアでデータをグラフ化した。
ＡＣＥタンパク質ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ３は抗ＰＤ−Ｌ１抗体との相乗作用でＩＦＮ−γ産生を増加させた。組換えヒトＩＬ７を加えても、抗ＰＤ−Ｌ１治療（ＤＭＳＯ）と比べてそれ以上のＩＦＮ−γ産生の増加は生じなかったが、ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ３を加えるとＩＦＮ−γの有意な増加が生じた（図７）。従って、ＩＬ７ ＡＣＥタンパク質はエキソビボモデルにおいて消耗表現型のＣＤ８＋ Ｔ細胞を復帰させることが可能であった。
実施例７：ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ３及びＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２の構造分解
図８は、Ｆａｂ断片に挿入されたときのそれぞれＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２及びＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ３の構造図である。ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ３については、図８は、ＩＬ７をＨＣＤＲ２又はＨＣＤＲ３のいずれかにグラフト化することにより、ＩＬ７分子が露出し、ＩＬ７Ｒａとの結合に利用可能になること、及びＩｇＧ配列が妨げにならないことを実証している。
実施例８：抗体サイトカイングラフト化タンパク質の結合
ＩＬ７配列を免疫グロブリン鎖足場のＣＤＲループに挿入した。臨床的セッティングで利用されている種々の公知の免疫グロブリン配列並びに生殖細胞系列抗体配列を使用して抗体サイトカイングラフト化タンパク質を調製した。使用した抗体のうちの１つは、その標的抗原としてＲＳＶを有する。ＩＬ７をこの抗体のＣＤＲにグラフト化するとＲＳＶへの結合が低下したかどうかを決定するため、ＲＳＶタンパク質をＰＢＳ又は炭酸塩緩衝液のいずれかでＥＬＩＳＡアッセイにかけた。図９に示すとおり、これは、ＩＬ７グラフト化にどのＣＤＲを選択したかによって影響を受けるように見える。例えば、重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｈ１）にグラフト化したＩＬ７は、元の非グラフト化（非修飾）抗体と同様のＲＳＶ結合を有する。対照的に、ＩＬ７を重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ−Ｈ２）及びＣＤＲ−Ｈ３にグラフト化すると、ＲＳＶへの結合が低下する。軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ−Ｌ３）にグラフト化したＩＬ７はＲＳＶ結合をほとんど有しない。予想どおり、ＩｇＥを標的とするＧＦＴＸ抗体足場にグラフト化したＩＬ２は結合を生じない。これは、抗体サイトカイングラフト化タンパク質が抗体足場の元の標的に対する結合を保持し得ること、又はこの結合を低減し得ることを実証している。
実施例９：ＣＤ１マウスにおけるＩＬ７抗体サイトカイングラフト化タンパク質のインビボ薬物動態
ＣＤ１雌マウスに等モル量のＩＬ７、ＩＬ７−Ｆｃ及びＩＬ７サイトカイングラフト化タンパク質の単回用量を投与し、種々の時点で血清試料中のＩＬ７タンパク質をＧｙｒｏｓアッセイによって測定した（図１０）。データを分析し、Ｐｒｉｓｍソフトウェアでグラフ化した。
試験した６つの異なるＩＬ７タンパク質から、他のフォーマットと比較したときＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２が最良の曝露を示した（図１０）。注目すべきことに、組換えヒトＩＬ７の量が僅か６時間後に定量限界（ＬＯＱ）を下回った一方、同じことがＦｃ融合物ＩＬ７についても２４時間後に認められた。ＩＬ７抗体サイトカイングラフト化タンパク質は全て、最長７２時間まで測定可能であった。
実施例１０：インビボＴ細胞消耗モデルにおけるＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２サイトカイングラフト化タンパク質の活性
Ｂ６雌マウスを２×１０６ＰＦＵのリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）クローン１３に静脈内（ｉｖ）感染させた。感染３週間後、マウスに２００μｇのアイソタイプ対照抗体単独、１００μｇのＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２単独、２００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１単独、又は１００μｇのＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２＋２００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１との併用用量を週２回、２週間にわたって投与した。最終回用量の３日後（３５日目）、血液、脾臓細胞及び肝臓を分析した。
脾臓及び血液を処理して単一細胞懸濁液を得て、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）で洗浄した。赤血球を赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ ＃Ｒ７７５７）で溶解させ、細胞数及び生存能に関して細胞をカウントした。ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ナトリウムアジド）を使用した標準プロトコルに基づきＦＡＣＳ染色を実施した。細胞を以下の表面抗体及び四量体分子：ラット抗マウスＣＤ８−ＰｅｒＣＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５５３０３６）、ラット抗マウスＣＤ１９−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６０１４３）、ラット抗マウスＫＬＲＧ１−ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６０７３３）、ラット抗マウスＣＤ１２７−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６０７３３）、ラット抗マウスＣＤ４−ＢＵＶ３９５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６３７９０）、ラット抗マウスＣＤ４４−ＢＵＶ７３７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６４３９２）、ラット抗マウスＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣ（Ｔｏｎｂｏ ＃３５−０６２１−Ｕ１００）、ラット抗マウスＣＤ３６６−ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃１１９７０６）、ラット抗マウスＣＤ２７９−ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃１３５２１９）、Ｔ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｈ−２Ｄｂ ＬＣＭＶ ｇｐ３３（Ｃ９Ｍ）四量体−ＰＥ（ＭＢＬ ＃ＴＳ−Ｍ５１２−１）及びＴ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｈ−２Ｄｂ ＬＣＭＶ ｇｐ２７６−２８６ 四量体−ＢＶ４２１（ＭＢＬ ＃ＴＢ−５００９−４）で染色した。細胞をＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）又はＢＤ ＦＡＣＳ ＬＳＲ ＩＩで分析し、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。データはＰｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアでグラフ化した。
抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在とは無関係に、血中においてＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２抗体サイトカイングラフト化タンパク質の投与を受けたウイルス特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増加が観察された（図１１）。血中においてＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２サイトカイングラフト化タンパク質の投与を受けたナイーブ、セントラルメモリー及びエフェクターメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞の総数の増加もまた観察されたが、抗ＰＤ−Ｌ１単独では観察されなかった（図１３）。脾臓細胞の分析もまた、ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２抗体サイトカイングラフト化タンパク質が、単独でも、又は抗ＰＤ−Ｌ１との併用でも、別のチェックポイント分子Ｔｉｍ−３の減少を誘導することを示した（図１２）。加えて、ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２サイトカイングラフト化タンパク質の投与はまた、ＰＤ−１遮断療法に対する最良のレスポンダーであることが公知のＣＤ８＋ ＰＤ−１＋細胞の増加も誘導する（図１４）。
ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２サイトカイングラフト化タンパク質を抗ＰＤ−Ｌ１との併用で加えると、ＩＦＮ−γの有意な増加が生じた（図１６）。まとめると、これらのデータから、ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２抗体サイトカイングラフト化タンパク質がインビボモデルでＣＤ８＋ Ｔ細胞の消耗表現型を復帰させたことが示された。肝臓におけるウイルスＲＮＡの分析からは、ＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２の投与が単剤としてウイルス負荷を低減可能であったことが示される（図１５）。抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びＩｇＧ．ＩＬ７．Ｈ２と抗ＰＤ−Ｌ１抗体との併用は、ウイルス負荷を更に低減した（図１５）。
実施例１１：抗体サイトカイングラフト化タンパク質はＴｒｅｇ細胞に対するより高い活性及び増加した半減期を示す
Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）を上回る所望の生物学的効果を実現したことに伴いＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１及びＩｇＧ．ＩＬ２．Ｌ３を選択した（図１７に相対的変化をまとめている）。これらの効果には以下が含まれる；Ｔｃｏｎ及びＮＫ細胞よりも優先的なＴｒｅｇ上のＩＬ−２Ｒ選択性、マウスにおけるＴｃｏｎ及びＮＫ細胞と比べたＴｒｅｇのより大きい半減期拡大。
高親和性ＩＬ−２受容体刺激の評価においては、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１グラフトの両方がＴｒｅｇ細胞上で同等のシグナル効力を示したが、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と異なり、ＣＤ８ Ｔエフェクター細胞及びＮＫ細胞の両方で低下した活性乃至無活性を示した。ＣＤＲＬ３にグラフト化されたＩＬ２（ＩｇＧ．ＩＬ２．Ｌ３）は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも低いＴｒｅｇ上でのシグナル効力を示したが、ＮＫ細胞上では活性を示さなかった。ＨｅｍａＣａｒｅ Ｃｏｒｐ．からヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ）を購入し、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１又はＩｇＧ．ＩＬ２．Ｌ３のいずれかによってインビトロで試験してＩＬ−２高親和性受容体に対する選択的活性を評価した。細胞を無血清試験培地中に静置し、各ウェルに加えた。ウェルに抗体サイトカイングラフト化タンパク質又は天然ヒトＩＬ−２のいずれかを加え、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、細胞を固定し、表面マーカーで染色し、透過処理し、ＳＴＡＴ５抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で製造者の指示に従い染色した。
血漿中でのＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１又はＩｇＧ．ＩＬ２．Ｌ３の薬物動態は、僅か１用量後にＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比べて半減期の延長を示した。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）又はグラフトのいずれかによる１回の治療後８日における前糖尿病ＮＯＤマウスの脾臓で細胞拡大を評価した。ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１はＴエフェクター細胞及びＮＫ細胞と比べて優れたＴｒｅｇ拡大を実現し、前糖尿病マウスにおいてＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも良好に忍容された。ＳＴＡＴ５刺激、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１及びＩｇＧ．ＩＬ２．Ｌ３のＰＫ／ＰＤの要約を図１８に示す。これは、抗体サイトカイングラフト化タンパク質がＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも長い半減期を有するのみならず、Ｔエフェクター細胞及びＮＫ細胞の望ましくない刺激なしに標的Ｔｒｅｇ細胞を刺激できることを示している。
実施例１２：抗体サイトカイングラフト化タンパク質はＴｒｅｇ細胞に対してより高い活性を示す
前糖尿病ＮＯＤマウスに等モルのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（週３回）及び種々の抗体サイトカイングラフト化タンパク質（１回／週）を投与した。初回治療から８日後、脾臓を処理して単一細胞懸濁液を入手し、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）で洗浄した。赤血球を赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ ＃Ｒ７７５７）で溶解させて、細胞を細胞数及び生存率に関してカウントした。標準プロトコルに基づきＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ナトリウムアジド）を使用してＦＡＣＳ染色を実施した。細胞を表面抗体：ラット抗マウスＣＤ３−ＢＶ６０５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５６３００４）、ラット抗マウスＣＤ４−パシフィックブルー（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５８１０７）、ラット抗マウスＣＤ８−ＰｅｒＣｐ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５３０３６）、ＣＤ４４ ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５３１３３）ラット抗マウスＣＤ２５−ＡＰＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１７−０２５１）で染色し、続いて固定／透過処理し、抗マウス／ラットＦｏｘＰ３染色セットＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃７２−５７７５）に従いＦｏｘＰ３に関して染色した。細胞はＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）又はＢＤ ＦＡＣＳ ＬＳＲ ＩＩ（登録商標）で分析し、及びデータはＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。図１９は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ１１３Ａ．Ｈ１をＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比較した、各脾臓から絶対数として計算した倍数値及び比を示す。ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１によるＣＤ８ Ｔエフェクター細胞又はＮＫ細胞の拡大のないＴｒｅｇ細胞の拡大の増加が一番上の列に示される。これは、全ての細胞型の拡大につながる低用量及び高用量Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と対照的である。
実施例１３：インビトロでＩＬ−２Ｒシグナル伝達効力はＣＤ４ Ｔｃｏｎ及びＣＤ８ Ｔｅｆｆにおいて低下するがＴｒｅｇにおいては低下しない
Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１を両方ともにＩＬ−２Ｒに対するシグナル効力に関してヒトＰＢＭＣ及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）ＰＢＭＣの両方でインビトロで試験した。等モルＩＬ２濃度のＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は両方ともに、高親和性ＩＬ−２Ｒを発現するＴｒｅｇ細胞に対しては同様のシグナル効力を示したが、低親和性ＩＬ−２受容体を発現する従来のＣＤ４及びＣＤ８ Ｔエフェクター細胞に対してはＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１のみが効力の低下を示した。これらの結果はヒト及びカニクイザルの両方のＰＢＭＣで観察された。このアッセイについて、ＰＢＭＣ細胞は無血清試験培地中に静置し、各ウェルに加えた。ウェルにＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）のいずれかを加え、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、細胞を固定し、表面マーカーで染色し、透過処理し、ＳＴＡＴ５抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で製造者の指示に従い染色した。細胞はＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）で分析し、及びデータはＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。
これは、図２０に示されるとおりの結果が特に明らかであった。ヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ）の両方のＰＢＭＣにおいて、ＴｒｅｇでＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１によるｐＳＴＡＴ５活性化が見られ、これはＣＤ８ Ｔエフェクターではほとんど見られなかった。
実施例１４：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１はインビトロで機能性安定Ｔｒｅｇを拡大する
Ｔｒｅｇ選択性の改善には機能的効果が伴う。ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１で拡大したＴｒｅｇは、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）で拡大したＴｒｅｇと比べて同等か又はより良好なＴエフェクターの抑制因子である。このアッセイのため、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ カタログ番号１７−１４４０−０３）で遠心することにより全血からヒトＰＢＭＣを精製した。ＰＢＭＣをＲＢＣ溶解させた（Ａｍｉｍｅｄ カタログ番号３−１３Ｆ００−Ｈ）。ＥａｓｙＳｅｐ ＣＤ４＋ Ｔ細胞エンリッチメントキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号１９０５２）を使用してＣＤ４＋ Ｔ細胞をエンリッチした。エンリッチしたＣＤ４＋をＶ５００抗ＣＤ４（クローンＲＰＡＴ４）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗ＣＤ１２７（及びＡＰＣ抗ＣＤ２５で染色し、ＣＤ４＋ＣＤ１２７−ＣＤ２５＋天然調節性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）及びＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２５− Ｔレスポンダー（Ｔｒｅｓｐ）を単離するため選別した。選別したＴｒｅｇを培地を満たした９６ウェル丸底マイクロプレートにレプリケートでプレーティングし（１×１０５／１００μｌ／ウェル）、等モルＩＬ２濃度の１又は０．３ｎＭ Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）又はＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１の存在下において３：１のビーズ対細胞比でマイクロビーズによって刺激した。３７℃で２４時間インキュベートした後、ウェルに同じＩＬ２濃度を含む１００μｌ培地を補充した。３日目、培養物を懸濁し、半分に分割し、同じＩＬ２濃度を含む１００μｌ培地を補充した。６日目、培養物を３日目と同じく処理した。８日目、細胞を回収し、チューブにプールし、チューブをマルチスタンド磁石上に１〜２分間置くことによりビーズを除去した。細胞を含有する上清を収集し、室温下２００ｇで５分間遠心した。次に細胞をカウントし、元のＩＬ２濃度の５分の１を含む培地を補充した４８ウェル平底マイクロプレートに約５×１０５／ｍｌで再びプレーティングした。２日間静置した後、細胞を回収し、カウントし、分析するか、又は抑制アッセイに使用した。拡大したＴｒｅｇ及び新鮮に解凍したＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２５− Ｔレスポンダー（Ｔｒｅｓｐ）細胞をそれぞれ０．８μＭ ＣＴＶｉｏｌｅｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号Ｃ３４５５７）及び１μＭ ＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号Ｃ３４５５４）で製造者の指示に記載されるとおり標識した。拡大したＴｒｅｇの抑制特性を評価するため、３×１０４ ＣＦＳＥ標識Ｔｒｅｓｐを単独で、又はＣＴＶｉｏｌｅｔ標識Ｔｒｅｇと共に（異なるＴｒｅｓｐ：Ｔｒｅｇ比）トリプリケートでプレーティングし、Ｄｙｎａｂｅａｄｓによって１：８のビーズ対細胞比で刺激した（最終容積２００μｌ／ウェル）。４〜５日後、細胞を収集し、レスポンダー細胞の増殖をフローサイトメトリーによって判定した。
新鮮な拡大したＴｒｅｇにおいて、Ｔｒｅｓｐ細胞と比較してメチル化状態を判定した。ＱｉａｇｅｎからのＡｌｌｐｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ（カタログ番号８０２０４）を使用して＞５．００Ｅ＋０５細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した。次に、ＳｉｇｍａからのＩｍｐｒｉｎｔ（登録商標）ＤＮＡ修飾キット（カタログ番号ＭＯＤ５０）を使用して２００ｎｇのｇＤＮＡを処理し、非メチル化シトシンをウラシルに変換した（一方でメチル化シトシンは変化しないままとした）。次に、ＥｐｉＴｅｃｔ ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（登録商標）ＰＣＲ＋ＲＯＸ（Ｑｉａｇｅｎ カタログ番号５９４９６）、Ｅｐｉｔｅｃｔ対照ＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ カタログ番号５９６９５）、標準メチル化（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２ＡＡＺ７ＦＰ）及び非メチル化（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２ＡＡＺ７ＦＰ）プラスミド、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）、メチル化及び非メチル化フォワード及びリバースプライマー、及びプローブ（ＭｉｃｒｏＳｙｎｔｈ）を利用した配列特異的プローブベースのリアルタイムＰＣＲを用いて８ｎｇの亜硫酸水素変換ｇＤＮＡに関して定量的メチル化を判定した。メチル化％はＥｐｉＴｅｃｔ ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（登録商標）ＰＣＲハンドブックに記載されるとおり計算した。
図２１は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１で拡大したＴｒｅｇによるＦｏｘｐ３遺伝子座の安定脱メチル化をグラフで示す。インビトロでＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１によって拡大したヒトＴｒｅｇはＦｏｘｐ３発現及び脱メチル化によって安定し、これが安定Ｔｒｅｇ細胞につながる。
実施例１５：インビトロでＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９．Ｈ１によるＩＬ−２Ｒシグナル伝達に対する効力はヒトＮＫにおいて低下した
ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１は等モル濃度のＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比較してＮＫ細胞におけるシグナル伝達効力の低下を示した。ＰＢＭＣ細胞を無血清試験培地中に静置し、各ウェルに加えた。ウェルにＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）のいずれかを加え、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、細胞を１．６％ホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、表面マーカーで染色した。室温で３０分後、試料を洗浄し、再懸濁した細胞ペレットを−２０℃メタノールで透過処理し、洗浄して、ＳＴＡＴ５及びＤＮＡインターカレーターで染色した。細胞をＣｙｔｏｆにかけ、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。結果は図２２に示し、ここでＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１はＮＫ細胞にほとんど乃至全く効果を及ぼさなかった。対照的に、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）治療は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）治療の望ましくない副作用として、ＮＫ細胞上のｐＳＴＡＴ５活性を増加させた。
実施例１６：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１の薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）、及び毒性効果の判定
カニクイザルにおけるＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１は、薬物動態の延長、Ｔエフェクター細胞よりも優先的な優れたＴｒｅｇ拡大及び低用量Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも低い毒性を示した。この非臨床的実験室試験は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ実験動物委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）が承認済みの一般的プロトコル第ＴＸ ４０３９号、本プロトコル及び施設内標準実施要領（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ：ＳＯＰ）に従い行われた。
試験初日に動物にＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）のいずれかを皮下投与した。試験における各用量レベルで全ての動物から血液を採取した。投与１日前、投与後１時間、６時間及び１２時間、その後２、３、４、５、６、７、８、１０、１２日目。薬物動態学及び薬力学用の血液試料は全て遠心し、血漿試料を入手した。得られた血漿試料を単一ポリプロピレンチューブに移し、−７０℃以下で凍結した。全ての試料を分析し、血漿中のＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）の濃度を免疫アッセイを用いて測定した。半減期などの薬物動態パラメータを計算し、薬力学用にＦＡＣＳによって細胞の免疫表現型を決定した。ＩＬ−２／ＩＬ−２ Ｇｙｒｏｓアッセイプロトコルは以下のとおりである。各試料はデュプリケートで実行し、デュプリケートの分析の各々に５μＬの１：２０希釈した試料が必要であった。捕捉抗体はヤギ抗ヒトＩＬ−２ビオチン化抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＦ２０２）であり、Ａｌｅｘａ ６４７抗ヒトＩＬ−２、クローンＭＱ１−１７Ｈ１２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ５００３１５）ＬＯＱ：０．０８ｎｇ／ｍｌで検出し、イムノアッセイは全て、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ２００（登録商標）をＧｙｒｏｓ ＣＤ−２００（登録商標）と共に使用して行った。
図２３は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１とＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）との対比を示す。ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１は１２時間の半減期を有し、一方、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は３時間の半減期を有する。ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１の半減期の延長に伴いＴｒｅｇ活性が増加し、好酸球増加毒性がはるかに低くなる。
実施例１７：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）を上回る半減期の延長を示す
ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１は、単回投与後にＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）の４時間の半減期と比較して約１２時間の半減期を示した。ナイーブＣＤ−１動物に静脈内又は皮下投与し、投与前、投与後１時間、３、７、２４、３１、４８、５５及び７２時間に全ての動物から血液を採取した。血液試料を遠心し、血漿試料を入手した。得られた血漿試料を単一ポリプロピレンチューブに移し、−８０℃で凍結した。全ての試料を分析し、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１の血漿中濃度をイムノアッセイを用いて測定した。ＩＬ−２／ＩＬ−２ Ｇｙｒｏｓアッセイプロトコルは以下のとおりである。各試料はデュプリケートで実行し、デュプリケートの分析の各々に５μＬの１：２０希釈した試料が必要であった。捕捉抗体はヤギ抗ヒトＩＬ−２ビオチン化抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＦ２０２）であり、Ａｌｅｘａ ６４７抗ヒトＩＬ−２、クローンＭＱ１−１７Ｈ１２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ５００３１５）ＬＯＱ：０．０８ｎｇ／ｍｌで検出し、イムノアッセイは全て、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ２００（登録商標）をＧｙｒｏｓ ＣＤ−２００（登録商標）と共に使用して行った。このアッセイは、実施例１６の半減期の決定を更に展開したものである。このアッセイの結果は図２４に示し、ここでＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１の半減期は１２〜１４時間であると決定され、これは４時間の半減期を有するＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と対照的である。
実施例１８：異種ＧｖＨＤマウスにおいてヒトＴｒｅｇは拡大するが、Ｔエフェクター又はＮＫ細胞は拡大しない
ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１は異種ＧｖＨＤモデルにおいてＴエフェクター又はＮＫ細胞と比べてＴｒｅｇを選択的に拡大するが、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）ではこれはない。ＮＯＤ−ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγヌルマウス（ＮＳＧ）に健常ドナーからのｈＰＢＭＣを腹腔内注射によって注射した（ＨｅｍａＣａｒｅ Ｃｏｒｐ）。注射２４時間後、動物にＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１ １回／週又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）５回／週を試験期間中にわたって毎週投与した。試験期間中にわたって体重を週２回モニタした。初回投与の２８日後に各群４匹のマウスを回収し、脾臓を処理して単一細胞懸濁液を入手し、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）で洗浄した。赤血球を赤血球溶解緩衝液で溶解させて、細胞を細胞数及び生存率に関してカウントした。標準プロトコルに基づきＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ナトリウムアジド）を用いてＦＡＣＳ染色を実施した。細胞を表面抗体で染色し、続いて固定／透過処理し、抗マウス／ラットＦｏｘＰ３染色セットＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃７２−５７７５）に従いＦｏｘＰ３に関して染色した。細胞をＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）で分析し、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。倍数値及び比は各脾臓絶対数から計算した相対数に基づく。図２５は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１がこのマウスモデルにおいてＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりもはるかに良好にＴｒｅｇ細胞を拡大し、またＴｃｏｎ及びＮＫ細胞の望ましくない拡大も低減することを示している。
異種ＧｖＨＤマウスをＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９．Ｈ１で治療し、それにヒトＰＢＭＣ（外来細胞）を注射したとき、マウスは治療経過中、正常体重を維持した。対照的に、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）で治療したマウスには重篤な体重減少があった。体重は試験期間中にわたって週２回モニタし、パーセント体重は、登録時点における動物の初期体重を考慮に入れて計算した。この改善は、このモデルにおいてＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１がＴｒｅｇ増強に及ぼす効果と関連付けられ、データは図２６にグラフで示す。このデータは、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１及び他の抗体サイトカイングラフト化タンパク質がより高い治療指数及び安全性の幅を有することを示している。
実施例１９：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１はＮＯＤマウス糖尿病モデルにおいて１型糖尿病の発症を予防する
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは１型糖尿病を自然発症し、ヒト１型糖尿病の動物モデルとして用いられることが多い。前糖尿病ＮＯＤ雌に等モルのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（週３回）及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１（１回／週）を腹腔内注射によって投与した。試験の継続期間中（初回投与後４ヵ月）、血糖及び体重に関してマウスを週２回モニタした。図２７は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１治療マウスが低血糖値を維持することを示す。このように、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１で治療したマウスでは顕性１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）に進行しなかった。対照的に、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）治療マウスは初めは低血糖値であったが、しかしこれは時間が経つと上昇し、１型糖尿病の症状をもたらした。
実施例２０：前糖尿病ＮＯＤマウスにおける低用量Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比べたＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１
ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１はＮＯＤマウスモデルにおいて３用量のＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比較して１用量で優れたＴｒｅｇ拡大、より良好な忍容性及び有害事象なしを示した。前糖尿病ＮＯＤ雌に低用量等モルＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（週３回）及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１（１回／週）を腹腔内注射によって投与した。初回投与後４日で各群４匹のマウスを取り、脾臓を処理して単一細胞懸濁液を入手し、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）で洗浄した。赤血球を赤血球溶解緩衝液で溶解させて、細胞を細胞数及び生存率に関してカウントした。標準プロトコルに基づきＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ナトリウムアジド）を用いてＦＡＣＳ染色を実施した。細胞を表面抗体：ラット抗マウスＣＤ３−ＢＶ６０５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５６３００４）、ラット抗マウスＣＤ４−パシフィックブルー（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５８１０７）、ラット抗マウスＣＤ８−ＰｅｒＣｐ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５３０３６）、ＣＤ４４ ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５３１３３）ラット抗マウスＣＤ２５−ＡＰＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１７−０２５１）で染色し、続いて固定／透過処理し、抗マウス／ラットＦｏｘＰ３染色セットＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃７２−５７７５）に従いＦｏｘＰ３に関して染色した。細胞をＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）又はＢＤ ＦＡＣＳ ＬＳＲ ＩＩ（登録商標）で分析し、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。倍数値及び比は各脾臓絶対数から計算した相対数に基づく。ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１の単回用量の投与は、図２８に示されるとおり、ＮＯＤマウスモデルにおいてＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）の反復投与よりも大きいＴｒｅｇ拡大を示した。
実施例２１：ＮＯＤマウスモデルにおける効果的用量のＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１の薬物動態
１．３ｍｇ／ｋｇ及び０．４３ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１の薬物動態を１用量後に４８時間まで血漿中でアッセイした。前糖尿病１０週齢ＮＯＤマウスに２つの異なる濃度のＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１を腹腔内投与し、投与後１時間、３、７、２４及び４８時間に全ての動物から血液を採取した。血液試料を遠心し、血漿試料を入手した。得られた血漿試料を単一ポリプロピレンチューブに移し、−８０℃で凍結した。Ｇｙｒｏｓプラットフォームに適合させた３つの異なる方法：１）ＩＬ２ベースの捕捉及び検出、２）ＩＬ２ベースの捕捉及びｈＦｃベースの検出、及び３）ｈＦｃベースの捕捉及び検出を用いて各試料を分析することによりＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１血漿濃度を検出した。
各試料はデュプリケートで実行し、デュプリケートの分析の各々に５μＬの１：２０希釈した試料が必要であった。Ｇｙｒｏｓ ＩＬ−２／ＩＬ−２アッセイは捕捉ヤギ抗ヒトＩＬ−２ビオチン化抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＦ２０２）を使用し、Ａｌｅｘａ ６４７抗ヒトＩＬ−２、クローンＭＱ１−１７Ｈ１２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ５００３１５）で検出する。ＩＬ−２／Ｆｃ検出には、捕捉ヤギ抗ヒトＩＬ−２ビオチン化抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＦ２０２）を使用し、検出には、Ａｌｅｘａ ６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ １０９−６０５−０９８）抗体を使用する。ヒトＦｃ／Ｆｃアッセイには、捕捉ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−０６５−０９８）を使用した。検出工程にはＡｌｅｘａ ６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−６０５−０９８）を使用した。イムノアッセイは全て、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ２００（登録商標）をＧｙｒｏｓ ＣＤ−２００と共に用いて行った。このマウスモデルにおける定量限界（ＬＯＱ）は、図２９に示されるとおり４８時間である。図３０においてこれをＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）及びＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質と比較する。このグラフは、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９．Ｈ１などの抗体サイトカイン（ｃｙｏｋｉｎｅ）グラフト化タンパク質についてＬＯＱがより高いことを示している。
実施例２２：前糖尿病ＮＯＤマウスにおける用量範囲設定
ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１は、同じ等モル濃度のＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比較したときＣＤ４ Ｔｃｏｎ及びＣＤ８ Ｔエフェクターのいずれよりも優先的な優れたＴｒｅｇ拡大を示した。最も高いＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）群では死亡などの有害事象が認められ、いずれの用量のＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９．Ｈ１で治療したマウスにも死亡は見られなかった。
前糖尿病ＮＯＤ雌に低用量等モルＩＬ−２（週３回）及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１（１回／週）を腹腔内注射によって投与した。初回投与後８日で各群３匹のマウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。脾臓を処理して単一細胞懸濁液を入手し、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）で洗浄した。血液を採取し、赤血球を赤血球溶解緩衝液で溶解させて、細胞を細胞数及び生存率に関してカウントした。標準プロトコルに基づきＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ナトリウムアジド）を用いてＦＡＣＳ染色を実施した。細胞を表面抗体で染色し、続いて固定／透過処理し、抗マウス／ラットＦｏｘＰ３染色セットＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃７２−５７７５）に従いＦｏｘＰ３に関して染色した。細胞をＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）で分析し、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。比は、各脾臓から計算した相対細胞数に基づく。このデータは図３１に提供される。この表は抗体サイトカイングラフト化タンパク質の用量範囲フォーマットを提供する。これはまた、投与がより広い範囲にわたって良好に忍容されたことに伴いＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１がＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも高い治療指数を有したことも実証する。対照的に、高用量のＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）の投与ではマウスに罹患及び死亡が生じた。
実施例２３：ヒトＰＢＭＣ上でのＳＴＡＴ５シグナル伝達
ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１は、健常ドナーヒトＰＢＭＣ並びに自己免疫性ドナーからのＰＢＭＣにおいてＴｃｏｎ及びＮＫよりも優先的にＴｒｅｇ活性化に選択的であった。ＳＴＡＴ５シグナル伝達効力は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９．Ｈ１によるインビトロ治療後にＴｃｏｎでは低下したが、Ｔｒｅｇでは低下しなかった。健常及び自己免疫性患者からのヒトＰＢＭＣ（Ｈｅｍａｃａｒｅ Ｃｏｒｐ）細胞を無血清試験培地に静置し、各ウェルに加えた。ウェルにＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、細胞を固定し、表面マーカーで染色し、透過処理し、ＳＴＡＴ５抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で製造者の指示に従い染色した。細胞をＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）で分析し、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。図３２のデータは、ヒト白斑患者から採取したＰＢＭＣのＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１治療について、Ｔｒｅｇ活性が維持された一方で、ＮＫ、ＣＤ４ Ｔｃｏｎ、又はＣＤ８ Ｔエフェクター細胞の活性化がほとんどなかったことを示している。この結果はまた、ＳＬＥ及び橋本病患者から採取されたＰＢＭＣにおいても観察された（データは示さず）。図３３は、１型糖尿病（Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｉｅｓ）（Ｔ１Ｄ）のヒト患者から採取してＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）で治療したＰＢＭＣにおいて、ＮＫ細胞、ＣＤ８ Ｔエフェクター細胞又はＣＤ４ Ｔｃｏｎ細胞上のｐＳＴＡＴ５活性が大きく低下していたことを示している。ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１治療が正常ＰＢＭＣで有効であったと共にＴ１Ｄ患者から採取されたＰＢＭＣで良好に忍容されたことに伴い、これは、患者がインスリン療法を受けている場合であっても、抗体サイトカインタンパク質がＴ１Ｄの治療において有用となるであろうことを示している。これは、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１がこれらの免疫関連障害を有する患者で良好に忍容されるであろうこと、及びこれらの免疫関連障害への対処において有効であることを示している。
実施例２４：抗体サイトカイングラフト化タンパク質の結合
抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、臨床セッティングで利用されている種々の既知の免疫グロブリン配列並びに生殖細胞系列抗体配列を使用して調製した。使用した抗体のうちの１つはその抗原としてＲＳＶを有する。ＩＬ２をこの抗体のＣＤＲにグラフト化するとＲＳＶへの結合が低下又は消失したかどうかを決定するため、ＰＢＳ又は炭酸塩緩衝液のいずれかにおいてＲＳＶタンパク質に関するＥＬＩＳＡアッセイを行った。図３４に示すとおり、これはＩＬ２グラフト化にどのＣＤＲを選択したかに影響を受けるように見える。例えば、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１は、元の非グラフト化（非修飾）抗体と同様のＲＳＶ結合を有する。対照的に、ＩＬ２をＣＤＲ３の軽鎖（ＣＤＲ−Ｌ３）又はＣＤＲ−Ｈ３にグラフト化すると、結合が低下する。予想どおり、ＩｇＥを標的とするＧＦＴＸ抗体足場にグラフト化したＩＬ２は結合を生じない。これは、抗体サイトカイングラフト化タンパク質が抗体足場の元の標的に対する結合を保持し得ること、又はこの結合が低下し得ることを実証している。
実施例２５：非ヒト霊長類におけるＴｒｅｇ拡大
ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１を２用量群（３匹の雄／群）間で交互に４週間の無投与間隔を伴い与える２つの単回漸増皮下投与でカニクイザルに投与した。この後、緩衝液又は５ｍｇ／ｋｇ ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１の６回の皮下用量（隔日で２週間）を受けた２群（３匹の雄／群）における２週間複数回投与相が続いた。「単回投与相」（２９日の間隔を空けて２用量が投与された）からのフローサイトメトリー（免疫表現型タイピング）によって評価したリンパ球集団の変化を図３５に示す。１２５及び３７５μｇ／ｋｇ用量では、Ｔｃｏｎ又はＮＫ細胞に対する明らかな効果は何らなしに、Ｔｒｅｇ絶対数の３〜４倍及び最大５．５倍の増加が観察された。最大のＴｒｅｇ拡大は４日目に見られたと共に、Ｔｒｅｇ数は１０日目までにほぼベースラインに戻る。ＩｇＧ．ＩＬ２Ｄ４９Ａ．Ｈ１は安全で且つ良好に忍容され、死亡、臨床徴候、又は体重、摂食量、サイトカインレベル若しくは臨床病理の変化はなかった。更に、この試験において最高２．４ｍｇ／ｋｇの単回投与後又は２週間にわたる５ｍｇ／ｋｇの隔日の複数回投与後に心血管効果（ＥＣＧ又は血圧）は観察されなかった。血液漏出の徴候又は他のＣＶ関連所見はなかった。
実施例２６：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１活性及び半減期の延長
Ｒ６７Ａ又はＦ７１Ａムテインのいずれかを含むＩＬ２を、ＬＣＤＲ−１、ＬＣＤＲ−２、ＬＣＤＲ−３及びＨＣＤＲ−１、ＨＣＤＲ−２及びＨＣＤＲ−３に対応する６つ全てのＣＤＲにグラフト化した。図３６の表から、ＣＤＲ２の軽鎖にグラフト化されたＩＬ２（ＧＦＴＸ３ｂ−ＩＬ２−Ｌ２）が発現しなかったことを含め、抗体サイトカイングラフト化タンパク質がその活性の点で異なることが明らかである。また、Ｆｃ機能の改変（例えばＦｃサイレント）を伴いＨＣＤＲ１にグラフト化したときのＩＬ２がＣＤ８＋ Ｔエフェクターの拡大に関してより良好な生物学的結果を有したことも観察された。
半減期決定のため、ナイーブＣＤ−１マウスにＩ．Ｐ．投与し、投与前、投与後１時間、３、７、２４、３１、４８、５５及び７２時間で全ての動物から採血した。血液試料を遠心し、血漿試料を入手した。得られた血漿試料を単一のポリプロピレンチューブに移し、−８０℃で凍結した。全ての試料を分析し、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の血漿濃度をイムノアッセイを用いて測定した。半減期などの薬物動態パラメータを計算した。各試料はデュプリケートで実行し、デュプリケート分析の各々には、１：２０希釈した５μＬの試料が必要であった。捕捉：ヤギ抗ヒトＩＬ−２ビオチン化抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＦ２０２）検出：Ａｌｅｘａ ６４７抗ヒトＩＬ−２、クローンＭＱ１−１７Ｈ１２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ５００３１５） イムノアッセイは全て、Ｇｙｒｏｌａｂ（登録商標）Ｂｉｏａｆｆｙ２００をＧｙｒｏｓ ＣＤ−２００と共に使用して行った。図３７のグラフに示されるとおり、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の半減期は約１２時間であり、次にその後４８時間かけて減少する。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）半減期は、その半減期が約４時間であるため、このグラフには図示できなかった。
実施例２７：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１は正常Ｂ６マウスにおいてＣＤ８ Ｔエフェクターを選択的に拡大し、且つＩＬ−２ Ｆｃ又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも良好に忍容される
ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１は、Ｔｒｅｇと比べてＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）投与で見られる有害事象を引き起こすことなくＣＤ８ Ｔエフェクターを増大させる。１日目のマウスへの投与後、４日目、８日目及び１１日目にＣＤ８ Ｔエフェクターの拡大をモニタした。各時点でＣＤ８ Ｔエフェクター細胞集団は大幅に拡大し、Ｔｒｅｇの拡大はなかった。これは、等モル用量のＩＬ−２で死亡及び罹患が観察されたＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）及びＩＬ−２Ｆｃ融合物と対照的であった。
Ｂ６雌マウスにＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（週５回）、ＩＬ−２ Ｆｃ及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１（１回／週）を等モル濃度で投与した。初回治療から８日後、脾臓を処理して単一細胞懸濁液を入手し、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）で洗浄した。赤血球を赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ ＃Ｒ７７５７）で溶解させて、細胞数及び生存能に関して細胞をカウントした。標準プロトコルに基づきＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ナトリウムアジド）を使用してＦＡＣＳ染色を実施した。細胞を表面抗体：ラット抗マウスＣＤ３−ｅｆｌｕｏｒ４５０（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃４８−００３２）、ラット抗マウスＣＤ４−パシフィックブルー（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５８１０７）、ラット抗マウスＣＤ８−ＰｅｒＣｐ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５３０３６）、ラット抗マウスＣＤ４４ ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５３１３３）、ラット抗マウスＣＤ２５−ＡＰＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１７−０２５１）、ラット抗マウスＮｋ１．１（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃９５−５９４１）で染色し、続いて固定／透過処理し、抗マウス／ラットＦｏｘＰ３染色セットＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃７２−５７７５）に従いＦｏｘＰ３染色した。細胞をＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）又はＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ ＬＳＲ ＩＩ（登録商標）で分析し、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。
図３８Ａ〜図３８Ｃは、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（週５回）、ＩＬ２−Ｆｃ及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１（１回／週）をＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）等モル濃度（ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１／ＩＬ２−Ｆｃ １００μｇ 約１ｎｍｏｌ ＩＬ２当量）で投与した後のＢ６雌マウスにおけるＣＤ８ Ｔエフェクター細胞の優先的拡大を示す。これらのグラフのデータは、ＣＤ８ Ｔエフェクター細胞がＴｒｅｇの同様の増殖を伴うことなく増殖することを実証している。このデータは、ＣＤ８ Ｔエフェクター及びＴｒｅｇの両方を拡大したＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と対照的である。ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がＣＤ８ Ｔエフェクター細胞拡大の絶対数及びＣＤ８ Ｔエフェクター細胞：Ｔｒｅｇ比の両方の点でＩＬ２−Ｆｃ融合構築物より優れていたことに留意されたく、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１構築物に構造的及び機能的基礎があることを実証している。図３８Ｄ〜図３８Ｆは、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の有益な効果が高用量ほど一層明らかであることを示す。５００μｇ（５ｎｍｏｌ ＩＬ２当量）のＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１をＢ６マウスに投与したとき、低用量と同様に、Ｔｒｅｇ細胞と比べたＣＤ８ Ｔエフェクター細胞の優先的拡大が見られた。しかしながら、ＩＬ２−Ｆｃ治療群では、より高レベルのときマウスは僅か単回の投与後に死亡しているのが見つかった（データは示さず）。このことから、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がＩＬ２−Ｆｃ融合構築物よりも高い治療指数を有し、より幅広い投薬量範囲で安全に投与できることが指摘される。
実施例２８：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１はＮＯＤマウスにおいてＣＤ８ Ｔエフェクター細胞を選択的に拡大し、且つＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも良好に忍容される
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは１型糖尿病を自然発症し、ヒト１型糖尿病の動物モデルとして使用されることが多い。実施例２７に記載されるＢ６マウスについての同じプロトコルを用いて、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１、ＩＬ２−Ｆｃ及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）をＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）等モル当量でＮＯＤマウスに投与した。この場合もやはり、図３９Ａのグラフに示されるとおり、この用量のＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の投与はＴｒｅｇと比べてＣＤ８ Ｔエフェクター細胞を優先的に拡大した。加えて、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の投与はＮＯＤマウスにおいて有害事象を示さなかったが、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）治療群では５匹の瀕死マウス及び２匹の死亡があった。図３９Ｂは、ＮＯＤマウスモデルからの投薬量、細胞変化倍数及び細胞型を報告するグラフである。
実施例２９：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１はＣＴ２６結腸腫瘍マウスモデルにおいて単剤有効性を示す
ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の安全性を調べた後、ＣＴ２６マウスモデルでその単剤有効性を試験した。マウスＣＴ２６細胞株は、５００を超える既発表の研究で使用されている、急速に成長するグレードＩＶ結腸癌細胞株であり、薬剤開発においてよく使用されるモデルの１つである。
ＣＴ２６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６３８）細胞を５％ＣＯ２の３７℃インキュベーターにおいて無菌条件で成長させた。細胞は、１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。細胞は３〜４日毎に継代した。注射当日、細胞を回収し（継代１１代目）、ＨＢＳＳ中に２．５×１０６／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞をマイコプラズマ及びマウスウイルスに関してＲａｄｉｌ試験した。Ｂａｌｂｃマウスを使用した。各マウスにつき０．２５×１０６細胞を２８ｇ針（１００μｌ注射容積）を使用して右側腹部に皮下注射で移植した。移植後、腫瘍が触知可能になったら、動物を週３回ノギスで測り、秤量した。ノギス測定値は（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２を用いて計算した。マウスには通常食を与え、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）及び動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の規定に従いＳＰＦ動物施設で飼育した。
腫瘍が約１００ｍｍ３に達したとき、マウスに１２．５〜１００μｇのＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１を腹腔内経路によって投与した。腫瘍を週２回測定した。Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標））ソフトウェアを使用して平均腫瘍容積をプロットした。腫瘍サイズが１０００ｍｍ３の容積に達したとき、有効性試験のエンドポイントが実現した。注射後、マウスはまた、臨床的増悪の徴候についても注意深くモニタした。マウスが何らかの理由で、呼吸窮迫、背弯姿勢、活動性低下、後肢完全麻痺、胸水の徴候としての頻呼吸、２０％又は１５％に近い体重減少＋他の徴候を含めた何らかの病的状態の徴候を示した場合、又は通常の活動（摂餌、移動）を行う能力が損なわれた場合、マウスは安楽死させた。
２０日間試験で１７日間にわたるＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の４回の投与としたとき、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１はＣＴ２６マウスモデルにおいて１２．５μｇ〜１００μｇの範囲の用量で効果的であった。図４０に示される腫瘍容積曲線は、腫瘍容積が１５日間にわたり２００ｍｍ未満に保たれ、次に残りの５日間は４００ｍｍ未満に保たれたことに伴い、本試験におけるＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の有効性を示すものである。
実施例３０：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１及び追加的な癌療法薬はＢ１６マウスモデルにおいて有効性を示す
他の癌療法薬と併用したＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の有効性を評価するため、Ｂ１６Ｆ１０メラノーママウスモデルを使用した。Ｂ１６Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６４７５）を５％ＣＯ２の３７℃インキュベーターにおいて無菌条件で２週間成長させた。Ｂ１６Ｆ１０細胞はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養した。細胞を回収し、ＦＢＳ不含培地ＤＭＥＭに１×１０６／１００μｌの濃度で再懸濁した。Ｂ１６Ｆ１０細胞をマイコプラズマ及びマウスウイルスに関してＲａｄｉｌ試験した。２８ゲージ針（１００μｌ注射容積）を使用して細胞をＢ６マウスの右側腹部に移植した。移植後、腫瘍が触知可能になったらマウスを週２回ノギスで測り、秤量した。ノギス測定値は（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２を用いて計算した。
この試験では、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１を単剤として、又は抗ＴＲＰ１抗体（Ｔｒｐ１はＢ１６Ｆ１０細胞に高度に発現する）であるＴＡ９９抗体との併用で使用した。ＩＬ２−Ｆｃ融合物を単剤として、又はＴＡ９９抗体との併用で投与した。対照として、ＴＡ９９抗体を単剤として投与した。
意外にも、このモデルでは、５００μｇ用量の単剤として投与したときのＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１が最も効果的な治療であった（図４１）。次に良い治療は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１（１００μｇ）とＴＡ９９との併用であった。この併用は、１００μｇの単剤としてのＩｇＧ．ＩＬ２Ｆ７１Ａ．Ｈ１、５００μｇのＩｇＧ．ＩＬ２Ｆ７１Ａ．Ｈ１と併用したＴＡ９９、及び単剤としての、又はＩＬ２−Ｆｃ／ＴＡ９９併用としてのＩＬ２−Ｆｃよりも効果的であった。ＴＡ９９を単剤として投与したとき効果はなく、平均腫瘍容積は未治療の対照と同程度であった。このデータは、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がメラノーママウス腫瘍モデルにおいて単剤として効果的であるが、それがまた、別の抗癌剤と組み合わせたときも効果的であることを実証している。
実施例３１：ヒト細胞におけるＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｆ７１Ａ．Ｈ１の活性
ヒトＣＤ８ Ｔエフェクターに対するＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の活性を試験するため、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をｐＳＴＡＴ５活性に関してアッセイした。ＰＢＭＣ細胞を無血清試験培地中に静置し、プレーティングした。ＰＢＭＣにＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｆ７１Ａ．Ｈ１又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、細胞を１．６％ホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、表面マーカーで染色した。室温で３０分後、試料を洗浄し、再懸濁した細胞ペレットを−２０℃メタノールで透過処理し、洗浄し、ｐＳＴＡＴ５及びＤＮＡインターカレーターに関して染色した。細胞をＣｙｔｏｆ（登録商標）にかけ、データをＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアで分析することによりｐＳＴＡＴ５活性レベルを定量化した。図４２の表は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がヒトＣＤ８ Ｔエフェクター細胞に対して有する、且つＴｒｅｇ細胞の活性化を最小限に抑える優先的活性化を実証する。
実施例３２：抗体サイトカイングラフト化タンパク質の結合
臨床的セッティングで利用されている種々の公知の免疫グロブリン配列並びに生殖細胞系列抗体配列を使用して抗体サイトカイングラフト化タンパク質を調製した。使用した抗体のうちの１つはその抗原としてＲＳＶを有する。ＩＬ２をこの抗体のＣＤＲにグラフト化するとＲＳＶへの結合が低下又は消失したかどうかを決定するため、ＲＳＶタンパク質をＰＢＳ又は炭酸塩緩衝液のいずれかでＥＬＩＳＡアッセイにかけた。図４３に示されるとおり、これはＩＬ２グラフト化にどのＣＤＲを選択したかによって影響を受けるように見える。例えば、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１は、元の非グラフト化（非修飾）抗体と同様のＲＳＶ結合を有する。対照的に、ＩＬ２をＣＤＲ３の軽鎖（ＣＤＲ−Ｌ３）又はＣＤＲ−Ｈ３にグラフト化すると、結合は低下する。予想どおり、ＩｇＥを標的とするＧＦＴＸ抗体足場にグラフト化したＩＬ２は結合を生じない。これは、抗体サイトカイングラフト化タンパク質が抗体足場の元の標的に対する結合を保持し得ること、又はこの結合を低減し得ることを実証している。
実施例３３：ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質のインビトロ活性
ＣｙＴＯＦは、マスサイトメトリーを組み合わせるＦＡＣＳベースの方法であり、フローサイトメトリー技術を飛行時間型誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）と共に取り込む。これは、単一細胞からの４０を超えるパラメータの検出及び定量化を同時に行うことが可能である。これは、特異的細胞表面又は細胞内分子に対する希土類金属コンジュゲートモノクローナル抗体を利用する。ＣｙＴＯＦを用いて、ＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質に関してｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ４、及びｐＳＴＡＴ５検出により評価したヒトＰＢＭＣにおけるインビトロシグナル伝達試験を実施した。
ＩＬ−６のモル当量のアイソタイプ対照、ＩＬ−６グラフト（ＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｌ２、ＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｌ３、ＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｈ２及びＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｈ３）、又は天然ＩＬ−６でヒトＰＢＭＣを３０分間処理した。細胞を１．６％ＰＦＡで固定して、シグナル伝達分子のリン酸化状態を保存した。次に、特異的系統に対する細胞表面受容体とＪＡＫ／Ｓｔａｔ経路の細胞内シグナル伝達分子との組み合わせで細胞を染色した。次に試料を入手し、ＣｙＴＯＦで分析した。結果は、ＩＬ−６グラフトが天然ＩＬ−６と同程度の生物活性を有することを示している（図４４）。ＩＬ−６グラフトはまた、同様の細胞集団（ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞）に対し、及び同じＪＡＫ／Ｓｔａｔ経路を通じてシグナルを送る。
実施例３４：Ｃ５７Ｂｌ６ ＤＩＯマウスにおけるＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質のインビボ活性
マウスの免疫細胞をＣｙＴＯＦ分析にかけた。マウスインビボ研究については、Ｃ５７／Ｂｌ６ ＤＩＯマウスに５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｌ３、ＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｈ２及びＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｈ３を１回皮下投与し、ナイーブマウスと比較した。２用量後に全血を採取し、１．６％ＰＦＡで固定してシグナル伝達分子のリン酸化状態を保存した。次に、特異的系統に対する細胞表面受容体とＪＡＫ／Ｓｔａｔ経路の細胞内シグナル伝達分子との組み合わせで細胞を染色した。次に試料を入手し、ＣｙＴＯＦで分析した。
図４５のグラフに示されるとおり、ＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ｐＳＴＡＴ１、及びｐＳＴＡＴ３レベルによって測定したとき、ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞の両方を刺激した。ｐＳＴＡＴ３レベルによって測定したとき、単球の刺激もまた観察された。
実施例３５：ＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質の薬物動態学及び薬力学判定
Ｃ５７Ｂｌ／６ ＤＩＯマウスにおいて抗体サイトカイングラフト化タンパク質の半減期を評価した。抗体サイトカイングラフト化タンパク質を０．９％生理食塩水中０．５、２、５及び１０ｍｇ／ｋｇ（１０ｍｌ／ｋｇ用量容積）で皮下注射し、注射後２時間から始まって注射後２４０時間まで血液を試料採取した。各時点で全血をヘパリン処理済みチューブに採取し、４℃において１２，５００ｒｐｍで１０分間遠心した。血漿上清を回収し、全時点を収集し終えるまで−８０℃で保存した。３つの異なるイムノアッセイ方法を用いて血漿中の抗体サイトカイングラフト化タンパク質レベルを測定し、抗体サイトカイングラフト化タンパク質のＩＬ−６及び抗体ドメインの両方の検出を可能にした。第１のアッセイは、インハウスビオチン標識ヤギ抗ヒトＩＬ−６捕捉（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＦ−２０６−ＮＡ）及びａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的検出（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−６０５−０９８）からなった。第２のアッセイは、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的検出（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−０６５−０９８）及びａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的検出（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−６０５−０９８）からなった。及び第３のアッセイは、インハウスビオチン標識ヤギ抗ヒトＩＬ−６捕捉（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＦ−２０６−ＮＡ）及びインハウスａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ヒトＩＬ−６検出（Ｒ＆Ｄ Ｄｕｏｓｅｔ ＤＹ２０６−０５ Ｐａｒｔ＃ ８４０１１３）からなった。３つのアッセイは全て、ＧｙｒｏＬａｂ（登録商標）ｘＰワークステーション（Ｇｙｒｏｓ ＡＢ Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）で実行した。アッセイは２００ｎＬ ＣＤ（Ｇｙｒｏｓ ＃Ｐ０００４１８０）でＧｙｒｏｓ承認ウィザード方法を用いて実行した。使用した緩衝液は標準及び試料希釈についてＲｅｘｘｉｐ Ａ（登録商標）（Ｇｙｒｏｓ ＃Ｐ０００４８２０）及び検出調製についてＲｅｘｘｉｐ Ｆ（登録商標）（Ｇｙｒｏｓ ＃Ｐ０００４８２５）であった。結果の分析はＧｙｒｏｌａｂ（登録商標）データ分析ソフトウェアを使用して行った。図４６Ａ〜図４６Ｂに示すとおり、ＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｈ２及びＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｈ３は１２〜１４時間の半減期を示し、両方とも天然ＩＬ−６より長い。
半減期の延長と一致して、抗体サイトカイングラフト化タンパク質はまた、薬力学の向上も実証した。皮下投与後に標的組織（筋肉及び脂肪）においてＩＬ−６活性化のマーカーであるホスホ−ｓｔａｔ３（ｐＳＴＡＴ３）をモニタした。抗体サイトカイングラフト化タンパク質ＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｈ２を０．９％生理食塩水中０．１（１０ｍｌ／ｋｇ用量容積）で皮下注射した。注射４時間後に末端四頭筋及び生殖腺脂肪（各１ｃｍ）を回収した。筋肉及び脂肪組織は、５００μｌ ＭＳＤ溶解緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｋ１５０ＳＶＤ−２、ロット番号Ｚ００５５５２２）及びスチールビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、＃６９９８９）が入ったチューブに収集した。組織を組織溶解装置によって室温において３０ｒｐｓで５分間ホモジナイズした。溶解した組織を４℃において１４，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を収集し、ホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイまで氷上で保存した。
組織収集及び処理と同じ日にホスホ−Ｓｔａｔ３アッセイプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ｐＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）アッセイ）を実行した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて組織上清タンパク質検出を実施した。次にホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイプレートに５０μｌ／ウェルでタンパク質をプレーティングした。プレートを室温で２時間インキュベートし、洗浄し、ホスホ−ＳＴＡＴ３又は全ＳＴＡＴ３抗体（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で処理した。ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で相対蛍光単位（ＲＦＵ）に関してプレートを分析した。タンパク質ホスホ−ＳＴＡＴ３ ＲＦＵは、負荷したタンパク質濃度に対して正規化した。投与後４時間の時点で脂肪組織においてはｐＳＴＡＴ３シグナルの増強が検出されるが、筋肉では検出されない（図４７）。
実施例３６：Ｃ５７Ｂｌ６ ＤＩＯマウスにおけるＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質のインビボ活性
グラフトのうちの２つについての有効性の用量反応を実施した。この実験では、Ｃ５７／Ｂｌ６ ＤＩＯマウスに、媒体、５、１０、又は２０ｍｇ／ｋｇのＨ２及びＨ３の両方のバージョンの抗体ＩＬ−６グラフト化タンパク質を１日１回皮下投与した。１日目及び１３日目に投与後２、６及び２４時間の時点で全血を収集した。各時点で全血はヘパリン処理済みチューブに収集し、４℃において１２，５００ｒｐｍで１０分間遠心した。血漿上清を回収し、全時点を収集し終えるまで−８０℃で保存した。試料を上記のとおりＰＫ分析にかけた。隔日で体重を測り、体重減少をモニタした。週１回、ＮＭＲ分析を行い、ナイーブ通常食対照マウスと比較したときのボディマス組成を評価した。２０日目、マウスに投与し、次に一晩絶食させた。翌朝、グルコースチャレンジ（２０％グルコース１ｇ／ｋｇボーラス）を受けた。グルコース投与後２０、４０、６０及び１２０分の時点でマウスを採血し、グルコメータで血糖値を測定した。
両方のグラフト及び全ての用量レベルで体重及び体脂肪量の急激な減少が認められる（図４８Ａ及び図４８Ｂ）。恐らくは用量反応で、除脂肪画分への効果はそれほど顕著でない（図４８Ｃ）。除脂肪量に対する効果は時間が経つと低下するように見え、一方、脂肪減少に対する効果は持続する。
実施例３７：Ｃ５７Ｂｌ６ ＤＩＯマウスにおける呼吸交換比（ＲＥＲ）に対するＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質のインビボ活性
呼吸交換比に対する抗体サイトカイングラフト化タンパク質ＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｈ３の効果を試験する研究を設計した。Ｃ５７／Ｂｌ６ ＤＩＯマウスに媒体又は５ｍｇ／ｋｇのＨ３バージョンの抗体ＩＬ−６グラフト化タンパク質を１日１回皮下投与した。投与は実験の１〜３及び５〜７日目に実施し、一方でＯ２消費量、及びＣＯ２産生量を−１〜１、３〜５及び７〜９日目にＯｘｙｍａｘ間接熱量測定ケージで４８時間増分ずつ評価し、その時間の間、マウスは平穏に保たれた。隔日で体重を測り、体重減少をモニタした。測定されたＯ２消費量及びＣＯ２産生量から呼吸交換比（ＲＥＲ）を計算した。
投与前ＲＥＲは実験コホート間で等しかった（図４９Ａ）。対照的に、３〜５日目、媒体対照と比べてＨ３グラフト投与動物においてＲＥＲの明らかな低下が認められ、これは脂肪利用の方へのシフトを示すものであった（図４９Ｂ）。この差異は７〜９までに正常化した（図４９Ｃ）。
実施例３８：ペアフィードＣ５７Ｂｌ６ ＤＩＯマウスにおける摂餌量に対するＩＬ−６抗体サイトカイングラフト化タンパク質のインビボ活性
ペアフィードモデルにおいて摂餌量に対する抗体サイトカイングラフト化タンパク質ＩｇＧ．ＩＬ−６．Ｈ３の効果を試験する研究を設計した。Ｃ５７／Ｂｌ６ ＤＩＯマウスに媒体又は５ｍｇ／ｋｇのＨ３バージョンの抗体ＩＬ−６グラフト化タンパク質を１日１回皮下投与した。試験開始時及びその後１日２回、飼料を秤量することにより摂餌量を評価した。ペアフィード群は、投与２日目に開始して朝及び午後の各々に投与群が消費したのと同じだけの飼料を与えられた。投与１、３、５、及び７日目にＮＭＲ分析を行い、ボディマス組成を評価した。
Ｈ３抗体グラフト投与動物は急激な体重減少を実証し、治療６日目までに約１５％の体重減少に達した（図５０Ａ）。この効果には摂餌量の有意な低下が付随し、摂餌量は投与３日目に最下点に達し、続いてベースラインの摂餌レベルに徐々に増加した（図５０Ｂ）。ペアフィード動物はＨ３グラフト投与動物と同様の体重減少の程度を実証したことから、グラフト化抗体治療によって引き起こされた体重減少が大部分は摂餌量の減少を反映することが示される（図５０Ａ）。Ｈ３抗体グラフト投与動物及びペアフィード動物の両方の体重減少とも、７日目の時点で全体脂肪量の約３０〜４０％の減少が付随した（図５０Ｃ）；対照的に、除脂肪量はペアフィードでは有意に低下したが、Ｈ３抗体グラフト投与動物では低下しなかった（図５０Ｄ）。Ｈ３抗体グラフト投与動物又はペアフィード動物のいずれにおいても、単離した前脛骨筋の重量の有意な低下はなかった（図５０Ｅ）。
実施例３９：ＩＬ１０抗体サイトカイングラフト化タンパク質の創製
単量体ＩＬ１０配列を様々な免疫グロブリン足場のＣＤＲ領域に操作することによりＩＬ１０ ＡＣＥタンパク質を作成し、次に重鎖及び軽鎖免疫グロブリン鎖の両方を作製して最終的なタンパク質構築物を作成した。ＩＬ１０ ＡＣＥタンパク質はＩＬ１０の好ましい治療的抗炎症特性を付与する；しかしながら、ＩｇＧＩＬ１０Ｍグラフト化構築物は、ｒｈＩＬ１０と比較したとき比例した炎症誘発活性が低下している。
抗体サイトカイングラフト化タンパク質を創製するため、残基１３４と１３５との間に６アミノ酸リンカーを有する完全長ＩＬ１０の残基１９〜１７８を含む単量体ＩＬ１０（ＩＬ１０Ｍ）を免疫グロブリン鎖足場の様々なＣＤＲループに挿入した。臨床的セッティングで利用されている種々の公知の免疫グロブリン配列並びに生殖細胞系列抗体配列を使用してグラフト化構築物を調製した。ＧＦＴＸ及びＧＦＴＸ３ｂと称される２つの例示的足場におけるＩＬ１０Ｍの配列、ＧＦＴＸ ＡＣＥタンパク質は表２に掲載し、ＧＦＴＸ３ｂタンパク質は表３に掲載する。挿入点は、利用可能な構造又は相同性モデルデータに基づきＣＤＲループの中間点となるように選択された。抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、関連性のある配列をコードする組換えＤＮＡを利用した標準的な分子生物学的方法論を用いて作製した。
例えば、６つのＣＤＲのうちの１つに挿入されたＩＬ１０Ｍを含む各抗体の可変領域を合成した。可変領域をコードするＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、得られた断片を、軽鎖定常領域又は重鎖定常のいずれか及びＦｃ領域を含むベクターにサブクローニングした。このようにして、６つのＣＤＲ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）の各々へのＩＬ１０Ｍの挿入に対応するＩＬ１０Ｍ抗体サイトカイングラフト化タンパク質を作り出した。得られた構築物は表２又は表３に示す。重鎖及び軽鎖ベクターの適切な組み合わせをトランスフェクトすると、２つのグラフト化ＩＬ１０Ｍ分子を有する組換え抗体の発現が生じた（各Ｆａｂアームに１つのＩＬ１０単量体）。
サイトカイングラフト化にどのＣＤＲを選ぶかの選択は、以下のパラメータに関して選択される：要求される生物学、生物物理学的特性及び好ましい開発プロファイル。現段階では、どのＣＤＲ及びＣＤＲ内のどの位置が所望のパラメータを提供することになるかを予測する際にモデル化ソフトウェアが部分的にのみ有用であるため、従って６つ全ての可能な抗体サイトカイングラフトを作り、次に生物学的アッセイで評価する。要求される生物学的活性が実現した場合、次に抗体サイトカイングラフト化分子の構造分解など、生物物理学的特性を解いた。
ＩＬ１０をＣＤＲにグラフト化したおかげで、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の抗体部分は、以下で考察するとおりＩＬ１０受容体との結合に影響を与えるユニークな構造を備えたＩＬ１０単量体を呈する。抗体部分に起因したオフターゲット効果はない。加えて、抗体サイトカイングラフト化タンパク質のＦｃ部分は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に関して完全にサイレントであるように修飾されている。
要約すれば、ＣＤＲ内にグラフトすることによりあるレベルの立体障害がＩＬ１０受容体の個々のサブユニットにもたらされ得るという仮説の下、構造に基づき各ＣＤＲにおける挿入点を選択した。特定のサイトカインにどのＣＤＲグラフトが最良かについての最終的な選択は、所望の生物学及び生物物理学的特性に基づく。サイトカイン受容体の性質、サイトカイン／受容体相互作用及びシグナル伝達機構もまた役割を果たしたと共に、これは各個別の抗体サイトカイングラフト化分子をそのそれぞれの特性に関して比較することにより解いた。例えば、ＩＬ１０を軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）にグラフト化すると、単球を活性化させるがＮＫ細胞などの他の細胞は活性化させないという所望の生物学的活性が生じた。これは例示的抗体サイトカイングラフト化タンパク質ＩｇＧＩＬ１０Ｍ７及びＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３において見られた。
実施例３９：抗体サイトカイングラフト化タンパク質は抗炎症活性を有する
臨床でのｒｈＩＬ１０の炎症誘発活性の裏付けるものとして開発されたアッセイを用いて（Ｌａｕｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６５（５）：２７８３−９）、ヒト全血中のＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３の炎症誘発活性を評価した。炎症誘発活性を評価するため、抗体サイトカイングラフト化タンパク質が活性化初代ヒトＣＤ８ Ｔ細胞においてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）又はグランザイムＢを誘導するその能力についてプロファイリングした。ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３などの抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ＩＦＮγ産生によって測定したとき、組換えヒトＩＬ１０（ｒｈＩＬ１０）よりも有意に低い炎症誘発活性を示したことが分かった。このデータは図５１Ａに示される。グランザイムＢを測定するアッセイにおいても（データは示さず）、並びに他の例示的抗体サイトカイングラフト化タンパク質（ＩｇＧＩＬ１０Ｍ７）で、同様の結果が見出された。ｒｈＩＬ１０と比較したときＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３によって実証された炎症誘発活性の有意な減少は、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３の方がより幅広い用量範囲にわたって投与できる可能性があるため、それが免疫関連障害の治療に関してｒｈＩＬ１０よりも優れていることを示している。
抗炎症活性を調べるため、抗体サイトカイングラフト化タンパク質及びｒｈＩＬ１０がヒト全血中のＬＰＳ誘導性ＴＮＦαを阻害するその能力を試験した。このデータは図５１Ｂに示され、ここでは漸増濃度のｒｈＩＬ１０又はＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３のいずれもＴＮＦα産生を低下させた。ｒｈＩＬ１０及びＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３曲線は同様であることに留意されたく、これは両方の分子が強力な抗炎症活性を有したことを示している。
要約すれば、これらの結果は、抗体サイトカイングラフト化タンパク質が、ＩＬ１０と同様の抗炎症特性を有するが、用量制限的でなく、及び望ましくない炎症誘発特性がないという所望の特性を有することを示している。
実施例４０：ＩＬ１０依存的シグナル伝達
ヒトＰＢＭＣ及び全血におけるインビトロシグナル伝達試験は、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３などの抗体サイトカイングラフト化タンパク質がｒｈＩＬ１０と比較したときより特異的なシグナル伝達プロファイルを有したことを示している。質量分析法を利用するＦＡＣＳベースの方法であるＣｙＴＯＦを用いて、全血中の複数の異なる細胞集団における抗体サイトカイングラフト化タンパク質シグナル伝達をｐＳＴＡＴ３検出によって評価した（図５２）。ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３などの抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、単球、マクロファージ及び形質細胞様樹状細胞上でのみμＭ濃度を上回るｐＳＴＡＴ３シグナルを誘導した（最高１．８μＭ）。これらの細胞型は全て、ＩＬ１０受容体の発現が増加していることが公知である。ｒｈＩＬ１０は単球で、しかしＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞などの追加的な細胞型でもｐＳＴＡＴ３シグナルを誘導した。これは低いｎＭ濃度のｒｈＩＬ１０であっても見られた。１００ｎＭの濃度のｒｈＩＬ１０で処理した全血では、単球及び骨髄樹状細胞に最も強いｐＳＴＡＴ３シグナルが見られ、更にＴ、ＮＫ、Ｂ細胞、及び顆粒球の中程度の活性化があった。ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達の機能的影響は、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞からのＩＦＮγ及びグランザイムＢ産生の増加につながる。ｒｈＩＬ１０シグナル伝達に応答したＢ細胞の増殖もまたある。ヒト全血中におけるｒｈＩＬ１０のこの炎症誘発活性は、抗炎症ＩＣ９０の５倍未満の曝露で観察される。ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３などの抗体サイトカイングラフト化タンパク質のより選択的な細胞プロファイルは炎症誘発活性の低下を生じさせ、より良好な抗炎症有効性につながった。
実施例４１：様々な種における抗体サイトカイングラフト化タンパク質シグナル伝達
ｒｈＩＬ１０はヒト単球、ＰＢＭＣ、及び全血におけるＬＰＳ誘導性炎症誘発性サイトカイン産生を強力に阻害する。抗体サイトカイングラフト化タンパク質ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３は標的細胞に対してｐＭ力価を呈するが、力価はｒｈＩＬ１０の１０分の１である。表４は、ヒト全血並びに選択された毒性種の全血におけるＩＬ１０又はＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３活性の力価比較である。
力価計算はマウス、カニクイザル又はヒトのいずれかからのエキソビボ全血アッセイに基づく。試験した各種について、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦα産生を阻害する能力に関してＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３又はｒｈＩＬ１０を力価決定し、評価した。ＩＣ５０は、総ＴＮＦαシグナルの５０％阻害を生じさせる分子レベルとして計算した。ＩＣ９０及びＩＣ３０は、各アッセイについてＨｉｌｌの傾き値を考慮に入れて以下の式：ｌｏｇＥＣ５０＝ｌｏｇＥＣＦ−（１／Ｈｉｌｌの傾き）＊ｌｏｂ（Ｆ／１００−Ｆ））［式中、ＥＣＦは、総ＴＮＦαシグナルのＦパーセントの応答を生じる濃度である］で計算した。
実施例４２：抗体サイトカイングラフト化タンパク質薬物動態の判定
ｒｈＩＬ１０は半減期が短いため、その標的組織曝露が限られており、患者は複数回投与を受ける必要がある。抗体サイトカイングラフト化タンパク質の半減期をＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて評価した。抗体サイトカイングラフト化タンパク質（例えばＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３）を０．２ｍｇ／ｋｇで皮下注射し、注射後５分から始まって注射後１４４時間まで血液試料を採取した。約１時間の半減期を有したｒｈＩＬ１０と比較して（図５３Ａ）、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３では約４．４日の有意な半減期延長があった（図５３Ｂ）。
実施例４３：抗体サイトカイングラフト化タンパク質薬力学の判定
半減期の延長と一致して、抗体サイトカイングラフト化タンパク質はまた、薬力学の向上も実証した。マウス結腸においてＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３の皮下投与後にＩＬ１０受容体活性化及びシグナル伝達のマーカーであるホスホ−ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）をモニタした。投与後少なくとも７２時間まで、結腸においてｐＳＴＡＴ３シグナルの増強が検出され、投与後１４４時間までに存在しなくなった。図５３Ｃを参照のこと。このプロファイルは、投与後２４時間までにそのシグナルが存在しなくなるｒｈＩＬ１０と比べて劇的な向上である。図５３Ｄは、抗体サイトカイングラフト化タンパク質投与後のＬＰＳチャレンジに応答した血中のＴＮＦαの阻害によって測定したときのｒｈＩＬ１０と比較したＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３のインビボ応答の持続期間の向上を示す。
実施例４４：マウスモデルにおける抗体サイトカイングラフト化タンパク質の有効性
ＬＰＳチャレンジ後のＴＮＦα阻害についての有効性の直接的な比較を実施した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、媒体、又は組換えＩＬ１０及びＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３の両方について計算した１１０ｎｍｏｌ／マウスの等モルレベルのＩＬ１０を皮下投与した。次にマウスにＬＰＳを腹腔内送達してチャレンジし、ＴＮＦαレベルのＩＬ１０依存的阻害を評価した。ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３は、０．５時間の初期評価時間でｒｈＩＬ１０と同等の有効性を実証したが、しかしながら、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３は、投与後少なくとも４８時間まで、ＴＮＦα産生によって測定したときｒｈＩＬ１０よりも優れた有効性が持続した。このデータは図５４に示す。
実施例４５：抗体サイトカイングラフト化タンパク質は向上した曝露を有する
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて抗体サイトカイングラフト化タンパク質のピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）を評価した。抗体サイトカイングラフト化タンパク質を０．９％生理食塩水中０．２ｍｇ／ｋｇ（１０ｍｌ／ｋｇ用量容積）で皮下注射し、注射後１時間から始めて注射後１４４時間まで血液を試料採取した。各時点でヘパリン処理済みチューブに全血を収集し、４℃において１２，５００ｒｐｍで１０分間遠心した。血漿上清を回収し、全時点を収集し終えるまで−８０℃で保存した。２つの異なるイムノアッセイ方法を用いて血漿中の抗体サイトカイングラフト化タンパク質レベルを測定し、抗体サイトカイングラフト化タンパク質のＩＬ１０及び抗体ドメインの両方の検出を可能にした。図５５に示すとおり、抗体サイトカイングラフト化タンパク質（例えばＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３）は過去１００時間にわたり６０％より高いＣｍａｘを維持した。対照的に、ｒｈＩＬ１０レベルは３．５時間以内に２０％を下回るＣｍａｘに下がった。
実施例４６：抗体サイトカイングラフト化タンパク質はヒト患者において特定の細胞型にのみ作用する
ヒト健常ドナー及びクローン病患者からの免疫細胞を先述のとおりＣｙＴＯＦにかけた。図５６のグラフに示されるとおり、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３は単球のみを刺激したと共に、ｐＳＴＡＴ３レベルによって測定したときの刺激はｒｈＩＬ１０と同等である。単球は、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症関連障害の標的細胞であり、を極めて高レベルのＩＬ１０受容体を発現する。しかしながら、図５６はまた、ｒｈＩＬ１０の望ましくない炎症誘発作用、例えば、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞上でのｐＳＴＡＴ３シグナル伝達の増加も示す。ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３が正常ヒト細胞又はクローン病患者から採取した細胞のいずれにおいてもこの望ましくない炎症誘発作用を示さないことは注目に値する。抗体サイトカイングラフト化タンパク質の投与が所望の細胞型にのみ作用し、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの免疫関連障害を悪化させるのみであり得るＣＤ８ Ｔ細胞などの他の細胞型には作用しないであろうとおり、これはＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３がより高く、より安全な治療指数を有することを実証している。
実施例４７：ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３はｒｈＩＬ１０と比較してＰＨＡ刺激ヒト全血中で低下した炎症誘発活性を有する
遺伝的ＩＬ１０枯渇をＩＢＤ感受性と関連付ける広範な臨床データにも関わらず、ｒｈＩＬ１０はＩＢＤ臨床試験において弱い有効性を示すに過ぎなかった（Ｈｅｒｆａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ ２００２：５０（２）：１４６−１４７）。試験データの後ろ向き分析からは、ｒｈＩＬ１０の有効性が、ＩＦＮγの産生亢進など、その固有の炎症誘発活性によって制限されたことが示唆される。先に考察したとおり、ヒト機能性細胞ベースアッセイでは、ｒｈＩＬ１０シグナル伝達はＴ細胞及びＮＫ細胞からのＩＦＮγ及びグランザイムＢの産生につながる。
クローン病患者から全血を採取し、ｒｈＩＬ１０、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３及びＰＨＡ単独での刺激後にＩＦＮγレベルを測定した。このデータは図５７〜図６１に示される。漸増用量のｒｈＩＬ１０はＩＦＮγ産生の急激な増加を引き起こし、これは次にはプラトーに達する。対照的に、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３によるこれらの細胞の処理では、ＩＦＮγの産生はほとんど乃至全く見られなかったことから、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３がＴ細胞又はＮＫ細胞からのＩＦＮγ産生を誘導しなかった、又はごく低いレベルしか誘導しなかったことが指摘される。
これらの患者ドナー試料で追加的なタイトレーション実験を実施した。この実験では、ドナー患者血清からのＩＬ１０レベルを測定し、１．５〜５フェムトモル濃度（ｆＭ）の範囲であることが見出されたが、科学文献には、患者ＩＬ１０レベルは２０ｆＭもの高さであり得ることが報告されている（Ｓｚｋａｒａｄｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ Ｅｘｐ ２００９：５７（４）：２９１−２９４）。ドナー患者細胞にｒｈＩＬ１０を２フェムトモル濃度（ｆＭ）、２ｐＭ、２ｎＭ及び２００ｎＭの一定濃度で投与した。これらの一定濃度のｒｈＩＬ１０に対し、漸増濃度の抗体サイトカイングラフト化タンパク質ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３を投与し、ＩＦＮγ産生をアッセイした。データは図６２に示す。２ｆＭ及び２ｐＭの一定濃度では、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３はｒｈＩＬ１０と競合し、ＩＦＮγの産生をベースラインレベルまで低下させた。２ｎＭの一定濃度では、ＩＦＮγ産生はナノモル濃度のＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３によって低下した。最後に、２００ｎＭ ｒｈＩＬ１０の一定の過剰濃度では、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３によるＩＦＮγ産生のごく僅かな低下が見られたに過ぎなかった。これは、生理的レベルのＩＬ１０では、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３はＩＬ１０と競合し尽くし、ＩＦＮγの産生、及び望ましくない炎症誘発作用が低下することを示している。
実施例４８：抗体サイトカイングラフト化タンパク質の凝集特性
ＩＢＤに関する臨床試験では、ｒｈＩＬ１０は極めて短い半減期を有することが観察された；しかしながら、半減期を延長させるためのＩＬ１０二量体との単純なＦｃ融合物は、かかる分子の凝集特性を所与として探究されなかった。図６３は、Ｆｃに連結したＩＬ１０野生型及びＦｃに連結したＩＬ１０単量体の両方の凝集を示す。しかしながら、図６４に示されるとおり、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の抗体構造がＩＬ１０凝集を妨げ、ひいては投与し易さが促進される。加えて、凝集の低下には、療法薬に対する免疫応答、及び抗薬物抗体の発生を低減するという利益がある。
実施例４９：抗体サイトカイングラフト化タンパク質の結合保持
パリビズマブは抗ＲＳＶ抗体であり、サイトカイングラフト化用の抗体構造として選択した。この抗体は、構造が分かっており、その標的が非ヒト標的のＲＳＶであるという利点があった。非ヒト標的の選択は、オフターゲットヒト抗原への抗体サイトカイングラフト化タンパク質結合に伴う毒性がないことを確実にするためであった。ＩＬ１０Ｍをパリビズマブにグラフト化した後、最終的なＩＬ１０抗体サイトカイングラフト化タンパク質がなおもＲＳＶ標的タンパク質に結合するかどうかは不明であった。ＥＬＩＳＡによるアッセイのとおり、ＩＬ１０Ｍの存在にも関わらず、ＩＬ１０抗体サイトカイングラフト化タンパク質はなおもＲＳＶ標的タンパク質に結合した。このデータは図６５に示す。
実施例５０：抗体サイトカイングラフト化タンパク質の構造コンホメーションは細胞型間で差次的活性を生じさせる
抗体サイトカイングラフト化タンパク質（例えばＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３）は抗体の軽鎖ＣＤＲ １に単量体ＩＬ１０を取り込む。ＩＬ１０のヘリックスＤとＥとの間に６アミノ酸グリシン−セリンリンカーを挿入すると、通常はヘテロ二量体である分子がドメイン交換二量化能力を有しないものになる。そのため、ＩＬ１０Ｍを抗体にグラフト化すると、２つの単量体ＩＬ１０分子を有する抗体サイトカイングラフト化タンパク質が生じる。しかしながら、抗体Ｆａｂアームの可動性に起因して、野生型ＩＬ１０二量体のようにＩＬ１０単量体間の角度及び距離は固定的でなく、ひいてはＩＬ１０Ｒ１／Ｒ２受容体複合体とのその相互作用に影響が及ぶ。これは図６６にグラフで示される。具体的には、抗体グラフト化に起因して、グラフト化されたＩＬ１０二量体の角度はより大きく可変的であり、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞などの炎症促進細胞型で見られるとおりのＩＬ１０Ｒ１及びＲ２の発現レベルが低い細胞上でシグナル伝達が低効率になる。対照的に、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、単球などの高いＩＬ−１０Ｒ１及びＲ２発現を有する細胞上でより高い効率でシグナルを送る。ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３のクラス平均陰性染色ＥＭ試験では、更なる可動性及び単量体間のより大きい角度が強調され、ｒｈＩＬ１０と比較して幾何学が変化していることが確認された。ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３におけるＩＬ１０二量体の制約の低い幾何学は、ＩＬ１０Ｒ複合体とのその相互作用を変化させる。結果として、ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３抗体サイトカイングラフト化タンパク質の構造は、高度なＩＬ１０Ｒ１及びＲ２発現を有する細胞型に対してのみ生産的シグナルを生じるという生物学的効果を生じる。
実施例５１：ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３の結晶構造
ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３ Ｆａｂを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中１６．２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、懸滴蒸気拡散結晶化試験に直接使用した。０．２μｌのタンパク質溶液を０．２μｌのリザーバ溶液と混合することにより結晶化スクリーニングをセットアップし、５０μｌの同じリザーバ溶液に対して平衡化させた。２０℃で３〜４週間後に、２０％ＰＥＧ３３５０、２００ｍＭ酢酸マグネシウム、ｐＨ７．９のリザーバ溶液からデータ収集用の結晶が現れた。データ収集前に、２０％エチレングリコールを補足したリザーバ溶液に結晶を浸漬し、液体窒素でフラッシュ冷却した。ＡＤＳＣ Ｑｕａｎｔｕｍ ３１５Ｒ検出器を備えたＡＬＳ ｂｅａｍｌｉｎｅ ５．０．３で回折データを収集した。ＨＫＬ２０００ソフトウェアパッケージを用いてデータを指数付け及びスケーリングした（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｍｉｎｏｒ．（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２７６：Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，ｐａｒｔ Ａ，ｐ．３０７−３２６）。ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３ Ｆａｂのデータは、格子サイズａ＝８０．６Å、ｂ＝１０４．７Å、ｃ＝８２．８Å、α＝９０°、β＝１１５．３°、γ＝９０°の空間群Ｐ２１における２．４０Åと処理された。ＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．４０：６５８−６７４）を用いてパリビズマブＦａｂ構造（ＰＤＢコード：２ＨＷＺ）及び単量体ＩＬ１０構造（ＰＤＢコード：１ＬＫ３鎖Ａ）をサーチモデルとした分子置換法により構造を解いた。上位分子置換解には非対称単位にＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３ Ｆａｂの２つの分子が含まれた。最終的なモデルはＣＯＯＴで構築し（Ｅｍｓｌｅｙ ＆ Ｃｏｗｔａｎ（２００４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６０：２１２６−２１３２）、ＰＨＥＮＩＸで精密化した（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６，２１３−２２１）。Ｒｗｏｒｋ値及びＲｆｒｅｅ値はそれぞれ１８．８％及び２３．９％であり、理想結合長及び結合角からの根平均二乗（ｒ．ｍ．ｓ）偏差値はそれぞれ０．００５Å及び０．８８２°であった。
全体構造
ＩｇＧＩＬ１０Ｍ１３ Ｆａｂは非対称単位に２つの分子で結晶化し、両方とも同様のコンホメーションを有した。電子密度マップは両方の分子とも同様であった。全体構造（図６７Ａ）は、Ｆａｂ及びグラフト化単量体ＩＬ１０（ＩＬ１０Ｍ）が共線的配置をとり得ることを示す（Ｆａｂ軽鎖は白色、Ｆａｂ重鎖は黒色、ＩＬ１０Ｍは濃い灰色）。図６７Ｂは、ＣＤＲ−Ｌ１におけるグラフト化点の拡大図を示す。３つの隣接するＣＤＲ残基が濃い灰色のスティックで示される。破線は、構造のうち、恐らくはこれらの範囲の構造上の可動性に起因した、電子密度の欠損によりモデルにフィットさせることができなかった部分を示す。これらの２つの範囲は、グラフト化点のすぐ後のＩＬ１０ＭのＮ末端にある６残基及び挿入された６残基リンカーを包含するＩＬ１０Ｍのヘリックス４と５との間にある８残基を含む。また、グラフト化ＩＬ１０Ｍ分子とＦａｂ重鎖の部分との間に３対の水素結合相互作用もある（図６７Ｃ）。これらには、Ｒ１３８及びＮ１０４（側鎖）、Ｒ１３５及びＤ５６（側鎖）、並びにＮ３８及びＫ５８（骨格／側鎖）が含まれる。
実施例５２：代替的な足場を用いたＡＣＥタンパク質
ＡＣＥタンパク質は、当初、抗ＲＳＶ抗体であるＧＦＴＸ３ｂを足場として使用して構築した。しかしながら、ＡＣＥタンパク質はまた、追加的な足場としてＧＦＴＸ、及び抗ＩｇＥ抗体も使用して構築した。天然ＩＬ１０はホモ二量体としてシグナルを送るため、ＩＬ１０ ＡＣＥタンパク質は、同じ抗体「アーム」にＩＬ１０を使用して構築した。例えば、ＩＬ１０をＧＦＴＸ足場の可変重鎖の第３のＣＤＲ（ＣＤＲＨ３）にグラフト化することにより、抗体の両方のＣＤＲＨ３「アーム」にＩＬ１０分子があるＡＣＥ分子を生じさせた。加えて、可変軽鎖の第１のＣＤＲ（ＣＤＲＬ１）にＩＬ１０分子があり、且つＣＤＲＨ３にＩＬ１０分子があるＡＣＥタンパク質を構築した。これにより、ＩＬ１０サイトカインがＧＦＴＸ足場内の２つの離れた異なる位置にグラフト化されたＡＣＥタンパク質が作り出された。両方のタイプのＧＦＴＸ ＡＣＥタンパク質を天然ＩＬ１０サイトカイン及びＩＬ１０Ｆｃ融合タンパク質と比較した。
Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｎｏｒｍａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｄｏｎｏｒ Ｓｅｒｖｉｃｅからヒト全血を入手した。全血ドナーは匿名扱いであったが、抗炎症薬物治療を受けていないものを依頼した。受け取り後、全血は分離前にアッセイの調製のため１時間にわたり３７℃に置かれた。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号０７８５１、ロット番号１２ＩＳｆ１１）を使用して１５ｍｌの全血を１０ｍｌのグラジエントに層状に重ねることにより全血をＰＢＭＣに処理し、８００×Ｇで２０分間、中断なしに室温で遠心した。密度勾配界面からＰＢＭＣを収集し、培地で２回洗浄した。１ドナー当たり５０ｍｌの血液についてこれを繰り返した。ＰＢＭＣは２．２ｅ６細胞／ｍｌ（４５ｕｌ容積の３８４ウェルプレートにおいて１００，０００細胞／ウェル）で調製した。
ＧＦＴＸ構築物及びｒｈＩＬ−１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を解凍し、リンパ球培養培地（ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＢＳ、５０μＭ ＢＭＥ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭグルタミン、１×ヒトインスリントランスフェリンセレン、６０ｍｇ／ｍｌ Ｐｅｎ／１００ｍｇ／ｍｌ Ｓｔｒｅｐ）中の１０００ｎｇ／ｍＬのワーキング溶液に希釈した［アッセイにおける最終１００ｎｇ／ｍＬ］。このワーキング溶液を出発濃度として使用し、各後続濃度について培地中１：３希釈を実施して１１ポイント用量タイトレーションを調製した。ＬＰＳ（１００μｇ／ｍｌストック）を調製し、解凍し、アッセイまで氷上に置いた。
タイトレーション曲線を作成した。「ＬＰＳなし」対照ウェルについては、３８４ウェルプレートのそれぞれのウェルに４５μｌ／ウェルのＰＢＭＣを分注し、培地で５０μｌにした。ＬＰＳ刺激については、ヒトＰＢＭＣが入った５０ｍｌコニカルにＬＰＳを加えて１．１ｎｇ／ｍｌのワーキング濃度とした［アッセイにおける最終１ｎｇ／ｍＬ］。ＰＢＭＣ及びＬＰＳを十分に混合し、次にプレート上の指定のウェルに４５μｌ／ウェル、続いて５μｌ／ウェルの指定のＩＬ−１０製剤を分注した。アッセイプレートを十分に混合し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて２０時間インキュベートした。
翌日、アッセイプレートを混合し、室温において１４００ｒｐｍで５分間遠心した。各ウェルから上清（約１０μｌ）を取り出し、３８４ウェルプロキシプレートに移した。ＨＴＲＦアッセイのため、ＴＮＦａに対する抗体を、ＨＴＲＦキット（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）に提供される再構成緩衝液に１：４０で再構成した。次にプロキシウェルにＨＴＲＦ混合物を加え（１０μｌ／ウェル）、プロキシプレートを暗所下室温で３時間インキュベートした。次に試料を波長６６５ｎｍのＦＲＥＴに関して分析した。各ドナーについて、ドナーの最も低いタイトレーション結果をベースラインをとして使用してデータを正規化した。各ドナーについて、「ＬＰＳなし」ウェルを使用してＬＰＳ誘導を計算した。非線形回帰を用いてデータを分析し、各ドナーについてＩＣ５０を計算した。
図６８に示すとおり、ＩＬ１０を同じＣＤＲ（例えば、ＣＤＲＨ１）にグラフト化したＩＬ１０抗体サイトカインタンパク質は、組換えヒトＩＬ１０（ｒｈＩＬ１０）及びＩＬ−１０ Ｆｃ融合物（Ｆｃ野生型融合物又はＦｃサイレンシング突然変異を含む融合物（ＬＡＬＡ又はＤＡＰＡ）のいずれも）と同様のＩＣ５０力価を示す。対照的に、図６９に示されるとおり、ＩＬ１０が同じＡＣＥタンパク質の異なるＣＤＲ（例えば、ＣＤＲＬ１及びＣＤＲＨ１）にグラフト化される場合、ＩＬ−１０Ｍ Ｆｃ融合物（野生型Ｆｃ又はＤＡＰＡ Ｆｃ）と比較したときより低いＩＣ５０力価が見られる。
ＩＬ２についてもまた代替的な足場を構築した。ＩＬ１０と対照的に、ＩＬ２は単量体として働くことができ、そのためＩＬ２は同じＣＤＲ（例えばＣＤＲＬ３）にグラフト化し、ＩＬ２が同じ抗体の異なるＣＤＲ（例えば、ＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ１）にグラフト化されたＡＣＥタンパク質は作らなかった。
前糖尿病ＮＯＤ雌に低用量等モルＩＬ２（週５回）又はＩＬ２をＣＤＲ３にグラフト化したＩＬ２ ＡＣＥタンパク質（１回／週）を腹腔内注射によって投与した。初回投与７日後に各群５匹のマウスを解体し、脾臓を処理して単一細胞懸濁液を入手し、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）で洗浄した。赤血球を赤血球溶解緩衝液で溶解させて、細胞数及び生存能に関して細胞をカウントした。ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ナトリウムアジド）を使用した標準プロトコルに基づきＦＡＣＳ染色を実施した。細胞を表面抗体：ラット抗マウスＣＤ３−ＢＶ６０５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５６３００４）、ラット抗マウスＣＤ４−パシフィックブルー（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５８１０７）、ラット抗マウスＣＤ８−ＰｅｒＣｐ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５３０３６）、ＣＤ４４ ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５３１３３）ラット抗マウスＣＤ２５−ＡＰＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１７−０２５１）で染色し、続いて固定／透過処理し、抗マウス／ラットＦｏｘＰ３染色セットＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃７２−５７７５）に従いＦｏｘＰ３に関して染色した。細胞をＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）又はＢＤ ＦＡＣＳ ＬＳＲ ＩＩで分析し、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。
図７０Ａに示すとおり、ＩＬ２ ＡＣＥタンパク質（ＧＦＴＸＩＬ３＿ＩＬ−２）はＣＤ８＋ Ｔエフェクターを組換えヒトＩＬ２（ｈＩＬ−２）よりも有効に拡大する。Ｆｃサイレント修飾を有するＩＬ２ ＡＣＥタンパク質（ＧＦＴＸＬ３ＬＡＬＡ＿ＩＬ２）もまたＣＤ８＋ Ｔエフェクターを組換えヒトＩＬ２よりも有効に拡大する。図７０Ｂは、ＩＬ２ ＡＣＥタンパク質（ＧＦＴＸＩＬ３＿ＩＬ−２）がＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞を組換えヒトＩＬ２（ｈＩＬ−２）よりも有効に拡大することを実証する。ＮＫ細胞に対する効果が図７０Ｃに示され、ここで組換えヒトＩＬ２はＮＫ細胞をＦｃサイレンシング突然変異有り又は無しのいずれのＩＬ２ ＡＣＥタンパク質よりも有効に拡大する。要約すれば、このデータは、ＩＬ２ ＡＣＥタンパク質が異なる抗体足場を使用しても有効であり得ることを示している。
実施例５３：ＡＣＥタンパク質のＣｙＴＯＦデータ
ＣｙＴＯＦは、マスサイトメトリーを組み合わせるＦＡＣＳベースの方法であり、フローサイトメトリー技術を飛行時間型誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）と共に取り込む。これは、単一細胞からの４０を超えるパラメータの検出及び定量化を同時に行うことが可能である。これは、特異的細胞表面又は細胞内分子に対する希土類金属コンジュゲートモノクローナル抗体を利用する。ＣｙＴＯＦを用いて、ＡＣＥタンパク質に関してｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ４、及びｐＳＴＡＴ５検出により評価したヒトＰＢＭＣにおけるインビトロシグナル伝達試験を実施した。
ＡＣＥタンパク質の足場に使用した野生型抗体又はそれぞれのＡＣＥタンパク質でヒトＰＢＭＣを処理した。利用可能な場合には、天然サイトカイン（例えばＩＬ３）もまた対照として含めた。細胞を１．６％ＰＦＡで固定して、シグナル伝達分子のリン酸化状態を保存した。次に、特異的系統に対する細胞表面受容体とＪＡＫ／Ｓｔａｔ経路の細胞内シグナル伝達分子との組み合わせで細胞を染色した。次に試料を捕捉し、ＣｙＴＯＦで分析した。各ＡＣＥタンパク質の結果を図７１〜図１００に示す。
実施例５４：ＤＣ分化を誘導するＦｌｔ３Ｌグラフト
大腿骨及び脛骨を完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ及びβメルカプトエタノール）でフラッシュすることにより、Ｃ５７／ＢＬ６マウスからマウス骨髄を分離した。骨髄を遠心によってペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ａ１０４９２０１）を加えることにより赤血球を溶解させた。１０．５３ｎＭの組換えヒトＦｌｔ３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃３００−１９−５０ＵＧ）又はモル当量用量のＨ１、Ｈ３又はＬ３ヒトＦｌｔ３Ｌグラフトを含有する完全ＲＰＭＩに細胞を２×１０６／ｍＬでプレーティングし、３７℃で５日間培養した。フローサイトメトリー分析用にピペッティングによって細胞を回収し、ＣＤ１０３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃１２１４２２）、ＣＤ１１ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃１０１２５７）、ＣＤ１１ｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃１１７３０６）、ＭＨＣＩＩ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃１０７６２８）、ＣＤ３７０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃１４３５０４）及びＢ２２０（ＢＤ ＃５５２７７２）に対する抗体で染色した。ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用した標準プロトコルに基づきＦＡＣＳ染色を実施した。図１０１は、Ｈ１、Ｈ３及びＬ３ Ｆｌｔ３Ｌグラフトが組換えヒトＦｌｔ３Ｌで観察されるものと同等のＢ２２０＋ ＣＤ１１ｃ＋形質細胞ＤＣ分化（上のパネル）及びＣＤ３７０＋ ＤＣ１分化（下のパネル）の誘導能を有することを示す。
実施例５５：ＤＣ分化を誘導するＧＭ−ＣＳＦグラフト
白血球アフェレーシスからポジティブ選択（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１７８５８）を用いてヒトＣＤ１４＋単球を単離した。単球樹状細胞（ＤＣ）分化を誘導するため、完全ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ及びβメルカプトエタノール）中の２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００−０４−１００ＵＧ）及び様々な濃度の組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃３００−０３−１００ＵＧ）又はＧＭ−ＣＳＦグラフトの存在下に細胞をデュプリケートで培養した。非グラフト化パリビズマブを対照として使用した（グラフト足場対照）。
３７℃で培養して６日後、細胞を回収し、フローサイトメトリー分析のため、ＣＤ１６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３０２０３２）、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０７６４４）、ＣＤ８６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３０５４１４）、ＤＣ−ＳＩＧＮ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３３０１０６）、ＣＤ２４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１１１３４）、ＣＤ８０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３０５２１８）、ＣＤ４０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３１３００８）、ＣＤ１１ｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃５６−０１１６−４２）及びＣＤ１４（ＢＤ ＃５５７８３１）に関して染色した。ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用した標準プロトコルに基づきＦＡＣＳ染色を実施した。
Ｒ８４８刺激のため、上記に記載したとおり細胞を６日間培養した（組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦグラフトには３．９ｎＭ ＧＭ−ＣＳＦを使用した）。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４培地を洗い流し、完全ＲＭＰＩ中で細胞を様々な濃度のＲ８４８（インハウスで作成）と一晩インキュベートした。翌朝、フローサイトメトリー分析のため細胞を上記に記載したとおり染色した。図１０２は、ＧＭ−ＣＳＦサイトカイングラフトが、細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮの上方制御及びＣＤ１４の下方制御からも明らかなとおり、単球ＤＣ分化の誘導能を有することを示す。図１０３は、ＧＭ−ＣＳＦグラフトで生成された単球ＤＣがＴＬＲ７／８活性化に応答する能力を有することを示す。
本明細書に記載される例及び実施形態は例示を目的とし、それらを踏まえた様々な修正又は変更が当業者に提案され得ると共に本願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲に包含されるべきであることが理解される。本明細書に引用される刊行物、配列受託番号、特許、及び特許出願は全て、本明細書によってあらゆる目的から全体として参照により援用される。

Claims (65)

  1. （ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び
    （ｂ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；及び
    （ｃ）前記ＶＨ又は前記ＶＬのＣＤＲにグラフト化されたサイトカイン分子
    を含むＡＣＥタンパク質であって、
    前記サイトカイン分子が前記ＣＤＲに直接グラフト化され、及び前記サイトカイン分子がインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）でない、ＡＣＥタンパク質。
  2. 前記サイトカイン分子が重鎖ＣＤＲにグラフト化されている、請求項１に記載のＡＣＥタンパク質。
  3. 前記重鎖ＣＤＲが、相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）から選択される、請求項２に記載のＡＣＥタンパク質。
  4. 前記サイトカイン分子が軽鎖ＣＤＲにグラフト化されている、請求項１に記載のＡＣＥタンパク質。
  5. 前記軽鎖ＣＤＲが、相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）から選択される、請求項４に記載のＡＣＥタンパク質。
  6. 前記サイトカイン分子がペプチドリンカーなしに前記ＣＤＲに直接グラフト化される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  7. 前記サイトカイン分子が、表１から選択される分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  8. ＩｇＧクラス抗体重鎖を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  9. 前記ＩｇＧクラス重鎖が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４から選択される、請求項８に記載のＡＣＥタンパク質。
  10. 前記標的タンパク質に対する前記ＣＤＲの結合特異性が前記グラフト化サイトカイン分子によって低下する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  11. 前記結合、前記標的タンパク質に対する前記ＣＤＲの結合特異性が前記グラフト化サイトカイン分子によって１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％低下する、請求項１０に記載のＡＣＥタンパク質。
  12. 前記標的タンパク質に対する前記ＣＤＲの結合特異性が前記グラフト化サイトカイン分子の存在下で保持される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  13. 前記標的タンパク質に対する前記ＣＤＲの結合特異性が前記グラフト化サイトカイン分子の存在下で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％保持される、請求項１２に記載のＡＣＥタンパク質。
  14. 前記ＣＤＲの結合特異性が前記サイトカイン分子の結合特異性と異なる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  15. 前記ＣＤＲの結合特異性が非ヒト抗原に対するものである、請求項１４に記載のＡＣＥタンパク質。
  16. 前記非ヒト抗原がウイルスである、請求項１５に記載のＡＣＥタンパク質。
  17. 前記ウイルスが呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である、請求項１６に記載のＡＣＥタンパク質。
  18. 前記ＲＳＶが、ＲＳＶサブグループＡ又はＲＳＶサブグループＢから選択される、請求項１７に記載のＡＣＥタンパク質。
  19. 前記ＡＣＥタンパク質の前記抗体足場部分がヒト化又はヒトである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  20. 受容体に対する前記グラフト化サイトカイン分子の結合親和性が遊離サイトカイン分子と比較して増加する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  21. 受容体に対する前記グラフト化サイトカイン分子の結合親和性が遊離サイトカイン分子と比較して低下する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  22. 受容体に対する前記グラフト化サイトカイン分子の結合アビディティが遊離サイトカイン分子と比較して増加する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  23. 受容体に対する前記グラフト化サイトカイン分子の結合アビディティが遊離サイトカイン分子と比較して低下する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  24. ２つ以上の受容体に対する前記グラフト化サイトカイン分子の差次的結合親和性又はアビディティが遊離サイトカイン分子と比較して変化する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  25. 前記グラフト化サイトカイン分子の活性が遊離サイトカイン分子と比較して増加する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  26. 前記グラフト化サイトカイン分子の活性が遊離サイトカイン分子と比較して低下する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  27. 前記グラフト化サイトカイン分子が表１の分子である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  28. （ａ）ＨＣＤＲ１、（ｂ）ＨＣＤＲ２、及び（ｃ）ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、ＨＣＤＲ配列の各々が表２に示される重鎖可変領域、及び
    （ｄ）ＬＣＤＲ１、（ｅ）ＬＣＤＲ２、及び（ｆ）ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＬＣＤＲ配列の各々が表２に示される軽鎖可変領域
    を含むＡＣＥタンパク質であって、
    ＣＤＲにサイトカイン分子がグラフト化される、ＡＣＥタンパク質。
  29. 表２に示されるＶＨを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び
    表２に示されるＶＬを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
    を含むＡＣＥタンパク質であって、
    ＶＨ又はＶＬにサイトカイン分子がグラフト化される、ＡＣＥタンパク質。
  30. 低下したエフェクター機能に対応する修飾Ｆｃ領域を更に含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質。
  31. 前記修飾Ｆｃ領域が、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの１つ以上から選択される突然変異を含む、請求項３０に記載のＡＣＥタンパク質。
  32. 前記修飾Ｆｃ領域が、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの１つ以上から選択される突然変異の組み合わせを含む、請求項３１に記載のＡＣＥタンパク質。
  33. 前記Ｆｃ領域突然変異がＤ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａである、請求項３２に記載のＡＣＥタンパク質。
  34. 表２に示されるとおりの重鎖可変領域、及び
    表２に示されるとおりの軽鎖可変領域
    を含むＡＣＥタンパク質をコードする単離核酸であって、
    前記重鎖可変領域又は前記軽鎖可変領域にサイトカイン分子がグラフト化される、単離核酸。
  35. 請求項３４に記載の単離核酸と、任意選択で分泌シグナルとを含む、ＡＣＥタンパク質の産生に好適な組換え宿主細胞。
  36. 哺乳類細胞株である、請求項３５に記載の組換え宿主細胞。
  37. 前記哺乳類細胞株がＣＨＯ細胞株である、請求項３６に記載の組換え宿主細胞。
  38. 請求項１〜３３のいずれか一項に記載のＡＣＥタンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  39. それを必要としている個体の疾患を治療する方法であって、請求項３８に記載の医薬組成物の治療有効量を前記個体に投与することを含む方法。
  40. 前記疾患が癌である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記癌が、黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記医薬組成物が別の治療剤と併用して投与される、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記治療剤が免疫チェックポイント阻害薬である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記免疫チェックポイントが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記免疫チェックポイント阻害薬が抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記免疫チェックポイント阻害薬が抗ＴＩＭ３抗体である、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記疾患が免疫関連障害である、請求項３９に記載の方法。
  48. 前記免疫関連障害が、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、乾癬、Ｉ型糖尿病、急性膵炎、ぶどう膜炎、シェーグレン病、ベーチェット病、サルコイドーシス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、全身性エリテマトーデス、白斑、慢性予防的急性移植片対宿主病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｃｕｔｅ ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）（ｐＧｖＨＤ）、ＨＩＶ誘発性脈管炎、円形脱毛症、全身性硬化症モルフェア（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｍｏｒｐｈｏｅａ）、及び原発性抗リン脂質症候群からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記医薬組成物が別の治療剤と併用して投与される、請求項３９、４７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記治療剤が、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、ナタリズマブ、及びベドリズマブからなる群から選択される抗ＴＮＦ剤である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記治療剤が、スルファサラジン、メサラミン、バルサラジド、オルサラジン及び他の５−アミノサリチル酸誘導体からなる群から選択されるアミノサリチル酸剤である、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記治療剤が、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、ブデソニド（ｂｕｄｅｎｉｓｏｎｉｄｅ）、メサラミン、及びデキサメタゾンからなる群から選択されるコルチコステロイドである、請求項４９に記載の方法。
  53. 前記治療剤が抗細菌剤である、請求項４９に記載の方法。
  54. 疾患の治療における、
    （ａ）ＨＣＤＲ１、（ｂ）ＨＣＤＲ２、及び（ｃ）ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、ＨＣＤＲ配列の各々が表２に示される重鎖可変領域、及び
    （ｄ）ＬＣＤＲ１、（ｅ）ＬＣＤＲ２、及び（ｆ）ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＬＣＤＲ配列の各々が表２に示される軽鎖可変領域
    を含むＡＣＥタンパク質の使用であって、ＣＤＲにサイトカイン分子がグラフト化される、使用。
  55. 前記ＡＣＥタンパク質が別の治療剤と併用して投与される、請求項５４に記載の使用。
  56. 前記疾患が癌である、請求項５４又は５５に記載の使用。
  57. 前記治療剤が免疫チェックポイント阻害薬である、請求項５６に記載の使用。
  58. 前記免疫チェックポイントが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲからなる群から選択される、請求項５７に記載の使用。
  59. 前記免疫チェックポイント阻害薬が抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項５８に記載の使用。
  60. 前記免疫チェックポイント阻害薬が抗ＴＩＭ３抗体である、請求項５８に記載の使用。
  61. 前記疾患が免疫関連障害である、請求項５４又は５５に記載の使用。
  62. 前記治療剤が、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、ナタリズマブ、及びベドリズマブからなる群から選択される抗ＴＮＦ剤である、請求項６１に記載の使用。
  63. 前記治療剤が、スルファサラジン、メサラミン、バルサラジド、オルサラジン及び他の５−アミノサリチル酸誘導体からなる群から選択されるアミノサリチル酸剤である、請求項６１に記載の使用。
  64. 前記治療剤が、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、ブデソニド（ｂｕｄｅｎｉｓｏｎｉｄｅ）、メサラミン、及びデキサメタゾンからなる群から選択されるコルチコステロイドである、請求項６１に記載の使用。
  65. 前記治療剤が抗細菌剤である、請求項６１に記載の使用。
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