CN111107868A - 抗体细胞因子移植蛋白及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了抗体细胞因子移植(ACE)蛋白,包括刺激细胞内信号传导并且可用于治疗癌症、免疫疗法和代谢障碍的那些。特别地,所提供的ACE蛋白组合物提供了优于野生型细胞因子蛋白的生物学效应。例如,所提供的ACE蛋白比相应的重组细胞因子配制品传达了改善的半衰期、稳定性和可生产性。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月24日提交的美国临时申请号62/510,573的权益,将其内容特此通过引用以其全文并入。
技术领域
本发明涉及抗体细胞因子移植(ACE)蛋白、组合物以及治疗方法。
序列表
本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并且特此通过引用以其全文并入的序列表。所述ASCII副本创建于2018年5月14日,名称为PAT057624-WO-PCT_SL.txt,大小为4,389,055字节。
背景技术
螺旋细胞因子是由四到七个α螺旋组成的紧密分子,螺旋总含量为70%-90%。所有螺旋细胞因子的标志性元素是四螺旋束,其两亲性螺旋以几乎反平行的方式排列,因此大多数疏水性氨基酸参与了螺旋束内部的内部疏水核的形成。
四个α螺旋束显示出一些共同的特征。Weber和Salemme是最早研究四螺旋束蛋白的人(Weber和Salemme,Nature[自然]1980;287:82-84)。在这项工作中,所考虑的四螺旋束是排列在上-下-上-下拓扑结构中的反平行螺旋。使用更大的数据集,Presnell在工作中进一步定义了这种蛋白质拓扑结构,包括螺旋细胞因子的拓扑结构,其螺旋结构以上-上-下-下构象排列(Presnell和Cohen,PNAS USA[美国国家科学院院刊]1989;86:6592-6596)。
若干种四螺旋束蛋白(包括IL-6、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、心肌营养因子1(CT-1)、心肌营养蛋白样细胞因子(CLC)、IL-11和IL-31)属于细胞因子家族,其中信号传导是通过受体亚基GP130介导的(Barton等人,J.Biol.Chem[生物化学杂志]1999;274:5755-5761)。因此,尽管具有一些独特的生物学活性,这些细胞因子部分显示出功能重叠(Negahdaripour等人,Cytokine and Growth Factor Rev.[细胞因子与生长因子综述]2016;32:41-61)。除GP130外,该家族的信号传导可能还涉及若干其他受体亚基。
具体实施方式
本披露内容提供了植入抗体的CDR序列中的细胞因子,并且因此,这些抗体细胞因子移植蛋白将被称为ACE蛋白。特别地,所提供的ACE蛋白组合物提供了优于野生型细胞因子蛋白的生物学效应。例如,所提供的ACE蛋白比相应的重组细胞因子配制品传达了改善的半衰期、稳定性和可生产性。本披露提供了一种ACE蛋白,其包含:(a)重链可变区(VH),所述重链可变区包含互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2、HCDR3;和(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3;以及(c)移植到所述VH或所述VL的CDR中的细胞因子分子。在一些实施例中,所述细胞因子分子直接被移植到CDR中。在一些实施例中,所述细胞因子分子不是白细胞介素-10(IL-10)。
在一些实施例中,所述细胞因子分子被移植到重链CDR中。
在一些实施例中,所述重链CDR选自互补决定区1(HCDR1)、互补决定区2(HCDR2)或互补决定区3(HCDR3)。
在一些实施例中,所述细胞因子分子被移植到HCDR1中。
在一些实施例中,所述细胞因子分子被移植到HCDR2中。
在一些实施例中,所述细胞因子分子被移植到HCDR3中。
在一些实施例中,所述细胞因子分子被移植到轻链CDR中。
在一些实施例中,所述轻链CDR选自互补决定区1(LCDR1)、互补决定区2(LCDR2)或互补决定区3(LCDR3)。
在一些实施例中,所述细胞因子分子被移植到LCDR1中。
在一些实施例中,所述细胞因子分子被移植到LCDR2中。
在一些实施例中,所述细胞因子分子被移植到LCDR3中。
在一些实施例中,将所述细胞因子分子直接移植到没有肽接头的CDR中。
在一些实施例中,所述细胞因子分子是选自表1的分子。
在一些实施例中,ACE蛋白进一步包含IgG类抗体重链。
在一些实施例中,所述IgG类重链选自IgG1、IgG2或IgG4。
在一些实施例中,所述CDR与靶蛋白的结合特异性通过所移植的细胞因子分子降低。
在一些实施例中,所述结合其中所述CDR与靶蛋白的结合特异性,通过所移植的细胞因子分子,降低了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。
在一些实施例中,所述CDR与靶蛋白的结合特异性,在存在所移植的细胞因子分子的情况下保留了。
在一些实施例中,所述CDR与靶蛋白的结合特异性,在存在所移植的细胞因子分子的情况下,降低了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。
在一些实施例中,所述CDR的结合特异性不同于所述细胞因子分子的结合特异性。
在一些实施例中,所述CDR的结合特异性是针对非人抗原的。
在一些实施例中,所述非人抗原是病毒。
在一些实施例中,所述病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)。
在一些实施例中,所述RSV选自RSV亚组A或RSV亚组B。
在一些实施例中,所述ACE蛋白的抗体支架是人源化的或人的。
在一些实施例中,所述ACE蛋白的抗体支架是帕利珠单抗。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子与受体的结合亲和力增加。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子与受体的结合亲和力降低。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子与受体的结合亲合力增加。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子与受体的结合亲合力降低。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子与两个或更多个受体的不同的结合亲和力(affinity)或亲合力(avidity)发生了变化。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子的活性增加。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子的活性降低。
本文披露的一些实施例提供了ACE蛋白,所述ACE蛋白包含:重链可变区,所述重链可变区包含:(a)HCDR1、(b)HCDR2和(c)HCDR3,其中所述HCDR序列中的每个在表2中列出,以及轻链可变区,所述轻链可变区包含:(d)LCDR1、(e)LCDR2和(f)LCDR3,其中所述LCDR序列中的每个在表2中列出,其中细胞因子分子被移植到CDR中。
本文披露的一些实施例提供了ACE蛋白,条件是排除包含IL10细胞因子的ACE蛋白。
本文披露的一些实施例提供了ACE蛋白,条件是排除表3中列出的ACE蛋白。
本文披露的一些实施例提供了ACE蛋白,所述ACE蛋白包含:重链可变区(VH),所述重链可变区包含表2中列出的VH,以及轻链可变区(VL),所述轻链可变区包含表2中列出的VL,其中细胞因子分子被移植到VH或VL中。
在一些实施例中,ACE蛋白进一步包含与效应子功能降低相对应的修饰的Fc区。
在一些实施例中,该经修饰的Fc区包含选自D265A、P329A、P329G、N297A、L234A和L235A中的一个或多个的突变。
在一些实施例中,所述经修饰的Fc区包含选自D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的一个或多个的突变的组合。
在一些实施例中,所述Fc区突变为D265A/P329A。
本文披露的一些实施例提供了编码ACE蛋白的分离的核酸,所述ACE蛋白包含:表2中列出的重链可变区,和/或表2中列出的轻链可变区,其中细胞因子分子被移植到所述重链可变区或所述轻链可变区。
本文披露的一些实施例提供了适合于产生ACE蛋白的重组宿主细胞,所述重组宿主细胞包含本文披露的核酸,以及任选地,分泌信号。
在一些实施例中,重组宿主细胞是哺乳动物细胞系。
在一些实施例中,所述哺乳动物细胞系是CHO细胞系。
本文披露的一些实施例提供了药物组合物,所述药物组合物包含本文披露的ACE蛋白和药学上可接受的载体。
本文披露的一些实施例提供了在有需要的个体中治疗疾病的方法,所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本文披露的药物组合物。
在一些实施例中,疾病是癌症。
在一些实施例中,癌症选自下组,该组由以下组成:黑色素瘤、肺癌、大肠癌、***癌、乳腺癌和淋巴瘤。
在一些实施例中,所述药物组合物与另一种治疗剂组合施用。
在一些实施例中,所述治疗剂是免疫检查点抑制剂。
在一些实施例中,所述免疫检查点的拮抗剂选自下组,所述组由以下组成:PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM3、CTLA-4、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFR。
在一些实施例中,免疫检查点抑制剂是抗PD-L1抗体。
在一些实施例中,免疫检查点抑制剂是抗TIM3抗体。
在一些实施例中,疾病是免疫相关障碍。
在一些实施例中,所述免疫相关障碍选自下组,所述组由以下组成:炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病、急性胰腺炎、葡萄膜炎、斯耶格伦氏病、白塞病、结节病、移植物抗宿主病(GVHD)、***性红斑狼疮、白癜风、慢性预防性急性移植物抗宿主病(pGvHD)、HIV诱导的血管炎、斑秃、全身性硬化症和原发性抗磷脂综合征。
在一些实施例中,所述药物组合物与另一种治疗剂组合施用。
在一些实施例中,所述治疗剂是选自下组的抗TNF剂,所述组由以下组成:英夫利昔单抗、阿达木单抗、西妥珠单抗、戈利木单抗、那他珠单抗和维多珠单抗。
在一些实施例中,所述治疗剂是选自下组的氨基水杨酸酯试剂,所述组由以下组成:柳氮磺胺吡啶、美沙拉敏、巴拉萨德、奥沙拉嗪和5-氨基水杨酸的其他衍生物。
在一些实施例中,所述治疗剂是选自下组的皮质类固醇,所述组由以下组成:甲基***龙、氢化可的松、强的松、布***、美沙拉敏和***。
在一些实施例中,所述治疗剂是抗细菌剂。
本文披露的一些实施例提供了ACE蛋白在治疗疾病中的用途,所述ACE蛋白包含:重链可变区,所述重链可变区包含:(a)HCDR1、(b)HCDR2、(c)HCDR3,其中所述HCDR序列中的每个在表2中列出,以及轻链可变区,所述轻链可变区包含:(d)LCDR1、(e)LCDR2和(f)LCDR3,其中所述LCDR序列中的每个在表2中列出,其中细胞因子分子被移植到CDR中。
在一些实施例中,疾病是癌症。
在一些实施例中,癌症选自下组,该组由以下组成:黑色素瘤、肺癌、大肠癌、***癌、乳腺癌和淋巴瘤。
在一些实施例中,所述药物组合物与另一种治疗剂组合施用。
在一些实施例中,所述治疗剂是免疫检查点抑制剂。
在一些实施例中,所述免疫检查点的拮抗剂选自下组,所述组由以下组成:PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM3、CTLA-4、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFR。
在一些实施例中,免疫检查点抑制剂是抗PD-L1抗体。
在一些实施例中,免疫检查点抑制剂是抗TIM3抗体。
在一些实施例中,疾病是免疫相关障碍。
在一些实施例中,所述免疫相关障碍选自下组,所述组由以下组成:炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病、急性胰腺炎、葡萄膜炎、斯耶格伦氏病、白塞病、结节病、移植物抗宿主病(GVHD)、***性红斑狼疮、白癜风、慢性预防性急性移植物抗宿主病(pGvHD)、HIV诱导的血管炎、斑秃、全身性硬化症和原发性抗磷脂综合征。
在一些实施例中,所述药物组合物与另一种治疗剂组合施用。
在一些实施例中,所述治疗剂是选自下组的抗TNF剂,所述组由以下组成:英夫利昔单抗、阿达木单抗、西妥珠单抗、戈利木单抗、那他珠单抗和维多珠单抗。
在一些实施例中,所述治疗剂是选自下组的氨基水杨酸酯试剂,所述组由以下组成:柳氮磺胺吡啶、美沙拉敏、巴拉萨德、奥沙拉嗪和5-氨基水杨酸的其他衍生物。
在一些实施例中,所述治疗剂是选自下组的皮质类固醇,所述组由以下组成:甲基***龙、氢化可的松、强的松、布***、美沙拉敏和***。
在一些实施例中,所述治疗剂是抗细菌剂。
在某些实施例中,ACE蛋白包含IgG类抗体Fc区。在特定的实施例中,抗体Fc区选自IgG1、IgG2或IgG4亚类Fc区。在一些实施例中,抗体任选地含有至少一种修饰,所述修饰调节(即,增加或降低)抗体与Fc受体的结合。抗体Fc区可任选地包含赋予经修饰的效应子功能的修饰。在特定的实施例中,抗体Fc区可包含选自以下中任一种的赋予降低的效应子功能的突变:D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A。在一些实施例中,所述Fc突变为D265A/P329A。
在一些实施例中,ACE蛋白还包含野生型细胞因子或其变体。所述变异可以是单个氨基酸变化、单个氨基酸缺失、多个氨基酸变化和多个氨基酸缺失。例如,分子中细胞因子部分的变化可以降低或增加ACE蛋白对细胞因子受体的亲和力。
在一些实施例中,排除IL10野生型或变体细胞因子。在其他实施例中,排除了如表3中所披露的IL10 ACE蛋白。在一些实施例中,排除来自实例39、实例40、实例41、实例42、实例43、实例44、实例45、实例46、实例47、实例48、实例49、实例50、或实例41的IL10 ACE蛋白。
此外,本披露提供了编码如本文所述的ACE蛋白的至少重链和/或轻链蛋白的多核苷酸。在另一相关方面,提供了适合于产生如本文所述的ACE蛋白的宿主细胞。在特定的实施例中,宿主细胞包含编码如本文所述的ACE蛋白的核酸。在仍另一方面,提供了产生ACE蛋白的方法,这些方法包括在适合于ACE蛋白的表达、形成和分泌条件下培养如本文所述的提供的宿主细胞,并且从培养物中回收ACE蛋白。在另一方面,本披露进一步提供了试剂盒,这些试剂盒包含ACE蛋白,如本文所述。
在另一相关方面,本披露进一步提供了组合物,这些组合物包含ACE蛋白,如本文所述,和药学上可接受的载体。在一些实施例中,本披露提供了用于向个体施用的包含ACE蛋白的药物组合物。
定义
“抗体”是指包含四聚体结构单元的免疫球蛋白家族的分子。每个四聚体由两对相同的多肽链组成,每对具有通过二硫键连接的一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因,以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε,这些分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体可以是任何同种型/类别(例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。
将轻链和重链二者分成结构同源性区和功能同源性区。所述术语“恒定”和“可变”是在结构和功能上使用。每个链的N端定义了具有约100至110个或更多个氨基酸的一个可变(V)区或结构域,主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指轻链和重链的这些区域。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。除V区外,重链和轻链均含有恒定的(C)区或结构域。免疫球蛋白C区的分泌形式由三个C结构域,CH1、CH2、CH3,任选地CH4(Cμ),和一个铰链区组成。膜结合形式的免疫球蛋白C区也具有膜结构域和细胞内结构域。每个轻链在N端都具有一个VL,在其另一端带有一个恒定结构域(C)。轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要生物学特性例如分泌、经胎盘移动性(transplacentalmobility)、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例,恒定区结构域离抗体的抗原结合位点或者氨基末端越远,它的编号越大。N末端是可变区并且在C末端是恒定区;CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端结构域。VL与VH对齐并且CL与重链的首个恒定结构域对齐。如本文所用,“抗体”涵盖常规抗体结构和抗体的变异。因此,在该概念的范围内的是ACE蛋白、全长抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及其抗体片段。
抗体以完整的免疫球蛋白链形式存在,或以用各种肽酶消化产生的许多充分表征的抗体片段形式存在。如本文所用,术语“抗体片段”是指保留六个CDR的抗体的一个或多个部分。因此,例如,胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下方的抗体,以产生F(ab)’2,这是Fab′的二聚体,其本身是一条通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)’2可以在温和的条件下还原,以破坏铰链区的二硫键,从而将F(ab)’2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体本质上是具有一部分铰链区的Fab(Paul,Fundamental Immunology[基础免疫学]第3版(1993))。虽然就完整抗体的消化而言定义了各种抗体片段,但是技术人员将理解,可以化学或通过使用重组DNA方法从头合成此类片段。如本文所用,“抗体片段”是指抗体的一个或多个部分,其通过修饰完整抗体或使用重组DNA方法从头合成而产生,其保留结合特异性和功能活性。抗体片段的实例包括Fv片段,单链抗体(ScFv)、Fab、Fab′、Fd(Vh和CH1结构域)、dAb(Vh和分离的CDR)以及具有相同的结合特异性的这些片段的多聚体形式(例如,F(ab′)2)。ACE蛋白也可以包含实现所期望的结合特异性和活性所必需的抗体片段。
在上下文中使用的“Fab”结构域包含重链可变结构域、恒定区CH1结构域、轻链可变结构域和轻链恒定区CL结构域。结构域之间的相互作用通过CH1和CL结构域之间的二硫键稳定。在一些实施例中,Fab的重链结构域按从N末端至C末端的顺序,为VH-CH,并且Fab的轻链结构域按从N末端至C末端的顺序,为VL-CL。在一些实施例中,Fab的重链结构域按从N末端至C末端的顺序,为CH-VH,并且Fab的轻链结构域按顺序,为CL-VL。在本披露的上下文中,尽管Fab片段在历史上是通过木瓜蛋白酶消化完整的免疫球蛋白来鉴定的,但是“Fab”通常是通过任何方法重组产生的。每个Fab片段在抗原结合方面是单价的,即,它具有单个抗原结合位点。
“互补性决定结构域”或“互补决定区”(“CDR”)可互换地是指VL和VH的高变区。CDR是抗体链的靶蛋白结合位点,该结合位点携带针对这种靶蛋白的特异性。每种人VL或VH中存在三个CDR(CDR1-3,从N末端顺序编号),构成约15%-20%的可变结构域。CDR在结构上与靶蛋白的表位互补并且因此直接负责结合特异性。剩余的VL或VH区段(所谓的框架区(FR))表现出较少的氨基酸序列变异(Kuby,Immunology[免疫学],第4版,第4章,弗里曼出版公司(W.H.Freeman&Co.),纽约,2000)。
CDR和框架区的位置可以使用本领域熟知的多种定义确定,例如,卡巴特(Kabat)、乔西亚(Chothia)、和AbM(参见,例如,Kabat等人1991 Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学相关蛋白序列],第五版,U.S.Department of Healthand Human Services[美国卫生与公众服务部],NIH公开号91-3242,Johnson等人,NucleicAcids Res.[核酸研究],29:205-206(2001);Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196:901-917(1987);Chothia等人,Nature[自然],342:877-883(1989);Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],227:799-817(1992);A1-Lazikani等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],273:927-748(1997))。抗原结合位点的定义还在以下文献中描述:Ruiz等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],28:219-221(2000);和Lefranc,M.P.,Nucleic AcidsRes.[核酸研究],29:207-209(2001);(免疫遗传学(IMGT)编号)Lefranc,M.-P.,TheImmunologist[免疫学家],7,132-136(1999);Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育与比较免疫学],27,55-77(2003);MacCallum等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],262:732-745(1996);和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],86:9268-9272(1989);Martin等人,Methods Enzymol.[酶学方法],203:121-153(1991);和Rees等人,于:Sternberg M.J.E.(编辑),Protein Structure Prediction[蛋白结构预测],Oxford University Press[牛津大学出版社],Oxford[牛津],141-172(1996)。
根据卡巴特,将VH中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)、和95-102(HCDR3);并且将VL中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)、和89-97(LCDR3)。根据乔西亚,将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3);并且将VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合卡巴特和乔西亚二者的CDR定义,CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。
如本文所用,“抗体可变轻链”或“抗体可变重链”分别指包含VL或VH的多肽。内源性VL由基因区段V(可变)和J(连接)编码,并且内源性VH由V、D(多样性)和J编码。VL或VH中的每个都包括CDR和构架区(FR)。术语“可变区”或“V区”可互换地是指包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的重链或轻链。V区可以是天然存在的、重组的或合成的。在本申请中,抗体轻链和/或抗体重链有时可统称为“抗体链”。如本文提供和进一步描述的,“抗体可变轻链”或“抗体可变重链”和/或“可变区”和/或“抗体链”任选地包含并入CDR中的细胞因子多肽序列。
本文的包含例如CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链的C末端部分是“Fc”结构域。如本文所用,“Fc区”是指除了第一恒定区(CH1)免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区。Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域,以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域,以及在这些结构域的N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM,Fc可包括J链。对于IgG,Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1与Cγ之间的铰链。在本领域中应理解,Fc区的边界可以变化,然而,人IgG重链Fc区通常被定义为在其羧基末端包含残基C226或P230,其使用根据EU索引的编号,如见于Kabat等人(1991,NIH公开91-3242,NationalTechnical Information Service[国家技术信息服务],斯普林菲尔德,弗吉尼亚州)。“Fc区”可以指分离的该区域或在抗体或抗体片段的上下文中的该区域。“Fc区”包括例如在CH2和CH3区中的Fc区的天然存在的等位基因变体,包括例如调节效应子功能的修饰。Fc区还包括不会导致生物学功能改变的变体。例如,从免疫球蛋白的Fc区的N端或C端缺失一个或多个氨基酸,而没有生物学功能的实质损失。例如,在某些实施例中,将C末端赖氨酸修饰、替换或去除。在特定的实施例中,Fc区中的一个或多个C末端残基被改变或去除。在某些实施例中,Fc中一个或多个C末端残基(例如末端赖氨酸)被缺失。在某些其他实施例中,Fc中的一个或多个C末端残基被替代氨基酸取代(例如,末端赖氨酸被替换)。根据本领域已知的一般规则选择这样的变体,从而对活性具有最小的影响(参见,例如,Bowie等人,Science[科学]247:306-1310,1990)。Fc结构域是免疫球蛋白(Ig)的一部分,该免疫球蛋白可被细胞受体(例如FcR)识别,并且与补体激活蛋白C1 q结合。在CH2外显子的5′部分中编码的下部铰链区在抗体内提供了与FcR受体结合的灵活性。
“嵌合抗体”是一种抗体分子,其中(a)恒定区或其一部份被改变、替换或交换,这样使得抗原结合位点(可变区)被连接至不同的或改变的类别、效应子功能和/或种类的恒定区,或连接至赋予该嵌合抗体新特性的完全不同的分子,例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等;或(b)所述可变区或其部分被改变、替换或更换为具有不同或改变的抗原特异性的可变区。
“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性(例如,结合特异性,活性)同时在人中具有较低免疫原性的抗体。例如,这可以通过保留非人CDR区并且将抗体的其余部分替换为人对应物来实现。参见,例如,Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],81:6851-6855(1984);Morrison和Oi,Adv.Immunol.[免疫学进展],44:65-92(1988);Verhoeyen等人,Science[科学],239:1534-1536(1988);Padlan,Molec.Immun.[分子免疫学],28:489-498(1991);Padlan,Molec.Immun.[分子免疫学],31(3):169-217(1994)。
“人抗体”包括具有可变区的抗体,其中框架区和CDR区两者均衍生自人来源的序列。此外,如果抗体含有恒定区,则恒定区也衍生自此类人序列,例如人种系序列,或人种系序列的突变形式或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗体,例如如Knappik等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]296:57-86,2000中所述。人抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如,通过在体外随机诱变或位点特异性诱变、或通过在体内体细胞突变、或保守取代来引入突变以促进稳定性或制造)。
术语“相应的人种系序列”是指编码人可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列,与由人种系免疫球蛋白可变区序列编码的所有其他已知的可变区氨基酸序列相比,该人可变区氨基酸序列或子序列与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高确定的氨基酸序列同一性。相应的人种系序列还可以是指与全部其他评价的可变区氨基酸序列相比,与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或子序列。相应的人种系序列可以是仅框架区、仅互补性决定区、框架区和互补性决定区、可变区段(如上文所定义)、或包含可变区的序列或子序列的其他组合。可以使用本文所述的方法,例如,使用BLAST、ALIGN或本领域已知的另一种比对算法比对两个序列,确定序列同一性。相应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。
如本文所用,术语“价”是指多肽中潜在靶结合位点的数目。每个靶结合位点特异性结合一个靶分子或靶分子上的特定位点。当多肽包含多于一个的靶结合位点时,每个靶结合位点可以特异性结合相同或不同的分子(例如,可以结合不同的分子,例如不同的抗原或相同分子上的不同表位)。例如,常规抗体具有两个结合位点并且是二价的;“三价”和“四价”是指在抗体分子中分别存在三个结合位点和四个结合位点。ACE蛋白可以是单价的(即结合一个靶分子)、二价的或多价的(即结合多个靶分子)。
当在描述靶(例如,蛋白)与ACE蛋白之间的相互作用的上下文中使用时,短语“特异性结合”是指结合反应,该结合反应决定了蛋白质和其他生物制剂的异质群体中,例如,在生物样品(例如血液、血清、血浆或组织样品)中,靶的存在。因此,在某些指定条件下,具有特定结合特异性的ACE蛋白与特定靶的结合至少是背景的两倍,并且基本上不与样品中存在的其他靶大量结合。在一个实施例中,在指定条件下,具有特定结合特异性的ACE蛋白与特定抗原的结合至少是背景的十(10)倍,并且基本上不与样品中存在的其他靶大量结合。在这种条件下,与ACE蛋白的特异性结合可能需要针对其对特定靶蛋白的特异性来选择ACE蛋白。如本文所用,特异性结合包括与人细胞因子受体选择性结合的ACE蛋白,并且不包括与例如其他细胞因子受体超家族成员交叉反应的ACE蛋白。在一些实施例中,选择与人细胞因子受体选择性结合并且与非人灵长类细胞因子受体(例如,食蟹猴)交叉反应的ACE蛋白。在一些实施例中,选择与人细胞因子受体选择性结合并且与另外的靶反应的抗体移植蛋白。可以使用多种形式来选择与特定靶蛋白特异性反应的ACE蛋白。例如,固相ELISA免疫测定常规地用来选择与蛋白特异性免疫反应的抗体(关于可以用来确定特异免疫反应性的免疫测定方式和条件的描述,参见,例如Harlow和Lane,Using Antibodies,A LaboratoryManual[使用抗体:实验室手册](1998))。典型地,特异性或选择性结合反应将产生高于背景信号至少2倍和更典型地高于背景至少10至100倍的信号。
术语“平衡解离常数(KD,M)”是指解离速率常数(kd,时间-1)除以缔合速率常数(ka,时间-1,M-1)。可以使用本领域的任何已知方法,测量平衡解离常数。ACE蛋白通常将具有小于约10-7或10-8M,例如,小于约10-9M或10-10M,在一些实施例中,小于约10-11M、10-12M或10-13M的平衡解离常数。
如本文所用,术语“表位”或“结合区”是指抗原蛋白中负责抗体CDR与抗原蛋白之间的特异性结合的结构域。
如本文所用,术语“受体-细胞因子结合区”是指ACE蛋白的移植的细胞因子部分中的结构域,其负责移植的细胞因子与其受体之间的特异性结合。在每个ACE蛋白中存在至少一个这样的受体-细胞因子结合区,并且结合区中的每个可以彼此相同或不同。
术语“激动剂”是指能够激活受体以诱导完全或部分受体介导的反应的抗体。例如,细胞因子受体的激动剂与受体结合并且诱导细胞因子介导的细胞内信号传导、细胞激活和/或T细胞增殖。在某些方面,与天然细胞因子相似,ACE蛋白激动剂通过其受体刺激信号传导。例如,细胞因子与其受体的结合诱导下游信号传导,例如,Jak1和Jak3激活,其导致STAT5磷酸化。在一些实施例中,ACE蛋白激动剂可以通过其结合受体并诱导生物学效应(例如,细胞增殖或STAT磷酸化)的能力来鉴定。
术语“ACE蛋白”或“抗体细胞因子移植分子”或“移植物”意指至少一个细胞因子直接并入抗体的CDR内,中断CDR的序列。可以将细胞因子并入HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3中。可以将细胞因子并入HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3中,并且向CDR的N末端序列或CDR的C末端序列并入。并入CDR的细胞因子可以破坏抗体部分与原始靶蛋白的特异性结合,或者ACE蛋白可以保留其与靶蛋白的特异性结合。
当应用于核酸或蛋白时,术语“分离的”表示该核酸或蛋白基本上不含天然状态下与其结合的其他细胞组分。它优选处于同质状态。它可以是干燥的或者是水溶液。纯度和均质性典型地是使用分析化学技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来确定的。作为制剂中存在的主要种类的蛋白基本上得到纯化。特别地,分离的基因与该基因侧翼的并且编码蛋白的可读框分开,除了目的基因。术语“纯化的”表示核酸或蛋白在电泳凝胶中基本上产生一条带。特别地,这意味着核酸或蛋白为至少85%纯、更优选地至少95%纯、以及最优选地至少99%纯。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定,否则所述术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸,这些核酸具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。除非另外指出,否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体(例如,简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。具体地,简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得,在这些序列中,一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081(1991);Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608(1985);和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物,其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸,以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸,以及后来修饰的那些氨基酸,例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-邻磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的α-碳)的化合物,例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如,正亮氨酸)或经修饰的肽骨架,但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有如下结构的化合物,该结构与氨基酸的一般化学结构不同但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用。
“经保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列,经保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸,或者在该核酸不编码氨基酸序列的情况下,是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性,大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如,密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此,在密码子指定丙氨酸的每个位置,该密码子可以改变为任何所述的相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”,其是经保守修饰变异中的一种。本文编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员应认识到,核酸中的每个密码子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常是色氨酸的唯一密码子的TGG)均可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此,在每个所述序列中均隐含了编码多肽的核酸的每一种沉默变异。
对于氨基酸序列,熟练的技术人员应当认识到,对一种核酸、肽、多肽或蛋白序列进行的单个取代、删除或添加(这在经编码的序列中改变、增加或删去一个单一氨基酸或小百分数的氨基酸)是一种“经保守修饰的变体”,其中该改变导致一种氨基酸被一种化学上相似的氨基酸取代。提供在功能上相似的氨基酸的保守取代表在本领域是熟知的。此类经保守修饰的变体相对于多态性变体、物种间同源物和等位基因是额外的并且不排除它们。以下八组含有互为保守取代的氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见,例如,Creighton,Proteins[蛋白](1984))。
通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定“序列一致性的百分比”,其中比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包含与不包含添加或缺失的参考序列(例如,多肽)相比的添加或缺失(即,缺口)以使两个序列最佳比对。可以通过以下方法计算所述百分比:测定在这两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数,将所述匹配位置数除以所述比较窗口中的位置总数,并且将结果乘以100,从而得到序列同一性百分比。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下,术语“相同”或“同一性”百分比可以指两个或更多个作为相同序列的序列或子序列。当在比较窗口或指定区域内进行比较和比对以寻求使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的最大对应时,如果两个序列具有规定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即,在规定区域上或当没有规定时则在参考序列的整个序列上,至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性),则两个序列是“基本上相同的”。本披露提供分别与本文例示的多肽或多核苷酸基本上相同的多肽或多核苷酸(例如,以表2中序列中的任何一个为例的可变区)。同一性存在于长度为至少约15、25或50个核苷酸的区域上、或更优选地长度为100至500个或1000个或更多个核苷酸的区域上、或参考序列的全长上。关于氨基酸序列,同一性或基本同一性可以存在于长度为至少约5、10、15或20个核苷酸的区域上、任选地长度为至少约25、30、35、40、50、75或100个核苷酸的区域上、任选地长度为至少约150、200或250个核苷酸的区域上、或参考序列的全长上。关于较短的氨基酸序列,例如20个或更少的氨基酸的氨基酸序列,根据本文所定义的保守取代,当一个或两个氨基酸残基被保守取代时,存在实质同一性。
对于序列比较,典型地一个序列充当参考序列,将测试序列与该参考序列比较。当使用序列比较算法时,将测试序列和参考序列输入到计算机中,必要时指定子序列坐标,并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数,或者可以指定替代参数。然后,序列比较算法将基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用,“比较窗口”包括提及选自下组的多个邻接位置中的任何一个的区段,所述组由以下组成:20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150,其中在两个序列最佳比对后,可以将序列与相同数目的邻接位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下来进行:例如,通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482c的局部同源性算法;通过Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443的同源比对算法;通过搜索Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444的相似性方法;通过这些算法的计算机化实现(科学路575号,麦迪逊市,威斯康星州)的遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA);或通过手动校准和目视检查(参见,例如,Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology[当代分子生物学实验指南](1995增刊))。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法,它们分别描述于Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402,和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开地获得。此算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP),当与数据库序列中的相同长度的字比对时,该长度为W的短字匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等人,同上)。这些最初的邻域字命中点作为种子,用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。字命中点沿着每个序列在两个方向上扩展,远至可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列,使用参数M(一对匹配残基的奖励得分;总是>0)和N(错配残基的罚分;总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列,使用评分矩阵来计算累积得分。当出现以下情形时,字命中点向各方向的延伸终止:累积比对得分从其最大获得值跌落数量X;由于一个或多个负评分残基比对的累积,累积得分走向零或更低;或到达任一序列的一端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M=5、N=-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列,BLASTP程序默认使用字长为3、期望值(E)为10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M=5、N=-4和两条链的比较。
该BLAST算法还对两个序列之间的相似度进行统计学分析(参见,例如,Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N)),其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如,如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2、更优选地小于约0.01、最优选地小于约0.001,则认为核酸与参考序列相似。
两个核酸序列或多肽基本上相同的指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体进行免疫交叉反应,如下所述。因此,多肽典型地与第二多肽基本上相同,例如其中两种肽仅通过保守取代而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或它们的补体在严格条件下彼此杂交,如下所述。两个核酸序列基本上相同的又另一个指示是可使用相同的引物来扩增序列。
当在描述结合区如何在本发明的ACE蛋白内连接的上下文中使用时,术语“连接(link或linked)”涵盖用于物理上连接区的所有可能手段。多个结合区通常通过化学键连接,例如共价键(例如,肽键或二硫键)或非共价键,其可以是直接键(即,两个结合区之间没有接头)或间接键(即,借助两个或更多个结合区域之间的至少一个接头)。
术语“受试者”,“患者”和“个体”可互换地是指哺乳动物,例如人或非人的灵长类哺乳动物。哺乳动物也可以是实验室哺乳动物,例如小鼠、大鼠、兔子、仓鼠。在一些实施例中,哺乳动物可以是农业哺乳动物(例如马、羊、牛、猪、骆驼科动物)或家养哺乳动物(例如犬科动物、猫科动物)。
在一个实施例中,如本文所用,术语任何疾病或障碍的“治疗(treat、treating或treatment)”是指缓解疾病或障碍(即,减慢或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施例中,“治疗(treat、treating或treatment)”是指减轻或缓解至少一种身体参数、包括不能被患者辨别的那些。在又另一个实施例中,“治疗(treat、treating或treatment)”是指在身体上(例如,可辨别的症状的稳定化)、在生理上(例如,身体参数的稳定化)或二者调节疾病或障碍。在又另一个实施例中,“治疗(treat、treating或treatment)”是指预防或延缓疾病或障碍的发作或发展或进展。
术语“治疗上可接受的量”或“治疗有效剂量”可互换地指足以实现所期望结果(即,肿瘤体积减小)的量。在一些实施例中,治疗上可接受的量不诱导或不引起不期望的副作用。可以通过首先施用低剂量并且随后递增地增加该剂量直至实现所期望效果来确定治疗上可接受的量。ACE蛋白的“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”可以分别防止疾病症状的发作或导致严重程度的减轻,这些疾病症状包括与癌症和癌症治疗有关的症状。
术语“共同施用”是指个体中同时存在两种(或更多种)活性剂。共同施用的活性试剂可以并行或依序递送。
如本文所用,短语“基本上由......组成”是指方法或组合物中所包含的活性试剂以及对该方法或组合物的预期目的而言任何无活性的载体或赋形剂的类属或种类。在一些实施例中,短语“基本上由......组成”明确地排除包括除ACE蛋白之外的一种或多种另外的活性剂。在一些实施例中,短语“基本上由......组成”明确地排除包括除ACE蛋白和第二共同施用的试剂之外的多种另外的活性剂。
除非上下文另外清楚指出,术语“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物。
附图说明
图1A/C是四螺旋束细胞因子拓扑结构的示意图,a)编号A-D的螺旋的左手排列,如从上所见,编号为A-D的螺旋的左手排列,改编自(Presnell和Cohen,1989),b)短链和长链细胞因子家族的螺旋的二维连接示意图,c)IL10干扰素家族的二维连接示意图,显示了相对于b)在A/B和C/D反手环(overhand loop)中***的螺旋。
图2A/D证明了不同的四螺旋束细胞因子家族结构多样性的实例,螺旋从N末端到C末端按字母顺序编号,a)短链细胞因子IL4,b)长链细胞因子,IL6,c)IL10家族,所述IL10家族显示了EF螺旋基序的单体IL10排列,用于与另一种IL单体相互交错以生成功能性二聚体,c)IL22,IL10家族的另一个成员这次形成了单体六螺旋束。
图3A/B显示了IL7 ACE蛋白对CD8和CD4细胞的活性。
图4A将IL7 ACE蛋白对CD4 T细胞、CD8 T细胞、B细胞和NK细胞的pSTAT5活性进行了比较。图4B显示了增加浓度的IL7 ACE蛋白对CD8 T细胞的作用,如通过pSTAT5所测量的。图4C显示了增加浓度的IL7 ACE蛋白对CD4 T细胞的作用,如通过pSTAT5所测量的。
图5A-5D显示了IL7 ACE蛋白的药效学,证明CD8 T细胞增殖增加。
图6A-6B证明IL7 ACE蛋白作为单一试剂减少肿瘤的生长。图6C显示了血液中CD8T细胞的增加。图6D显示了施用IL7 ACE蛋白时CD8肿瘤浸润淋巴细胞的增加。图6E显示了施用IL7 ACE蛋白时CD4肿瘤浸润淋巴细胞的增加。
图7是IL7 ACE蛋白与抗PD-L1抗体的协同组合的图示。
图8是分别***HCDR2或HCDR3的IL7的结构图。
图9是各种IL7抗体细胞因子移植蛋白与RSV的结合的图。
图10是Gyros测定,其显示了IL7抗体细胞因子移植蛋白具有比重组IL7更长的半衰期。
图11是FACS图和图表,其显示了在将IL7抗体细胞因子移植蛋白作为单一试剂施用时以及在将IL7抗体细胞因子移植蛋白与抗PD-L1抗体结合施用时血液中CD8+细胞的扩增。
图12显示了IL7抗体细胞因子移植蛋白单独或与抗PD-L1组合诱导Tim-3的减少。
图13显示了给药IL7抗体细胞因子移植蛋白时,血液中初始、中枢记忆和效应记忆CD8+ T细胞总数的增加。
图14证明IL7抗体细胞因子移植蛋白的施用还诱导了CD8+PD-1+细胞的增加。
图15显示了作为单一试剂或与抗PD-L1抗体组合施用IL7抗体细胞因子移植蛋白能够降低病毒载量。
图16证明与抗PD-L1组合施用IL7抗体细胞因子移植蛋白导致IFN-γ的增加。
图17是抗体细胞因子移植构建体的表,表明IgG.IL2D49A.H1优先扩增Treg。此图还显示了许多所制成的ACE蛋白。将野生型IL2克隆到所有六个CDR和HCDR1(nH1)的N末端,HCDR1(cH1)的C末端,HCDR2(nH2)的N末端和HCDR2(cH2)的C末端。将野生型移植到LCDR2中会产生不表达的ACE蛋白。
图18是将抗体细胞因子移植蛋白与重组IL2进行比较的表。请注意,如通过STAT5磷酸化所测量的,IgG.IL2D49.H1分子刺激Treg细胞上的IL2受体,但不刺激T效应细胞(Teff)或NK细胞上的IL2受体。该分子还具有比更长的半衰期,并且在体内引起Treg细胞更大的扩增。
图20表示了与相比,并且如通过STAT5磷酸化所测量的,通过抗体细胞因子移植蛋白对IL2低亲和力或高亲和力受体差异激活。请注意,IgG.IL2D49A.H1刺激Treg细胞上表达的高亲和力IL2受体,但不会刺激CD4+或CD8+ Tcon细胞上表达的高亲和力IL2受体。
图21以图形形式显示了表明用抗体细胞因子移植蛋白(例如,IgG.IL2D49A.H1)扩增的Treg是T效应细胞(Teff)的更好抑制剂(参见上图)。下图显示了通过抗体细胞因子移植蛋白扩增的Treg细胞通过Foxp3蛋白表达和通过Foxp3甲基化稳定。
图24是描述IgG.IL2D49.H1的延长的半衰期的图。
图28在前期糖尿病NOD小鼠模型中比较Treg与CD8 T效应细胞的比例。
图29显示了在1.3mg/kg剂量的NOD小鼠模型中IgG.IL2D49A.H1的药代动力学。
图30显示了在0.43mg/kg剂量的NOD小鼠模型中IgG.IL2D49A.H1的药代动力学。
图32-33是一系列图,描述了用IgG.IL2D49.H1处理的人细胞上pSTAT5激活的量。细胞取自正常供体、患有白癜风的供体(图32)和患有1型糖尿病(T1D)的供体(图33)。
图34是各种IL2抗体细胞因子移植蛋白与RSV的结合的图。
图35显示了单剂量IgG.IL2D49A.H1后食蟹猴中Treg扩增。
图36是总结示例性IL2抗体细胞因子移植蛋白及其在CD8 T效应细胞上的活性的表。
图38A-38C证明,在C57BL/6小鼠中,在100μg当量剂量,下,在第4天、第8天以及第11天时间点,IgG.IL2R67A.H1比或IL2-Fc融合分子更有效扩增CD8+ T效应细胞,并且毒性更小。
图38D-38F证明,在C57BL/6小鼠中,在500μg当量剂量下,在第4天、第8天以及第11天时间点,IgG.IL2R67A.H1比或IL2-Fc融合分子更有效扩增CD8+ T效应细胞,并且毒性更小。
图39B是描绘了在NOD小鼠中在CD8 T效应子上IgG.IL2R67A.H1和IgG.IL2F71A.H1的增加的活性的表。
图40是在CT26肿瘤模型中IgG.IL2R67A.H1的单一试剂功效的图。
图41呈现了在B16黑色素瘤小鼠模型中IgG.IL2R67A.H1作为单一试剂或与抗体组合的数据。图显示了IgG.IL2R67A.H1与TA99,抗TRP1抗体组合比单独的TA99、单独的IL2-Fc融合分子或TA99加IL2-Fc融合物更有效。在100和500μg剂量下,TA99和IgG.IL2R67A.H1具有协同作用。
图43是各种IL2抗体细胞因子移植蛋白与RSV的结合的图。
图44描绘了用等摩尔量的天然人IL-6或IL-6抗体细胞因子移植蛋白刺激的人全血中IL-6依赖性pSTAT1、pSTAT3、pSTAT4和pSTAT5信号传导的CyTOF分析结果。
图45描述了各种IL-6抗体细胞因子移植蛋白对CD4 T细胞、CD8 T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞等的pSTAT1、pSTAT3、和pSTAT5活性的CyTOF数据的结果。
图46A和46B显示了线图,其说明了在C57Bl/6 DIO小鼠中的IL-6Fc Gyros测定中IL-6抗体细胞因子移植蛋白IgG.IL-6.H2和IgG.IL-6.H3的半衰期。
图47显示了点图,其说明了在皮下给药后通过磷酸Stat3(pSTAT3)测量的C57Bl/6DIO小鼠的脂肪和肌肉组织中IL-6抗体细胞因子移植蛋白的体内活性。
图48A、48B和48C显示了线图,其说明了在皮下给药后通过体重(A),脂肪组织(B)和瘦肉组织(C)的变化测量的C57Bl/6 DIO小鼠中IL-6抗体细胞因子移植蛋白的体内活性。
图49A、49B和49C显示了线图,其说明了通过在给药前(A)、在皮下给药后在第3-5天(B)以及在第7-9天(C)呼吸交换率(RER)测量的C57Bl/6 DIO小鼠中IL-6抗体细胞因子移植蛋白的体内活性。
图50A、50B、50C、50D和50E显示了图,其说明了在皮下给药后通过体重(A)、食物摄入(B)、总脂肪量(C)、瘦肉质量(D)和胫骨前肌重量(7E)的变化测量的成对喂食的C57Bl/6DIO小鼠中IL-6抗体细胞因子移植蛋白对食物摄入的体内活性。
图51A-51B描绘了重组人IL10(rhIL10,灰色方块)和IgGIL10M13抗体细胞因子移植蛋白(黑色三角形)的体外生物学测定的结果。图51A说明了如在CD8 T细胞测定中通过IFNγ诱导所测量的,与rhIL10相比,IgGIL10M13证明了降低的促炎活性。在人原代NK细胞、B细胞和肥大细胞上以及使用粒酶B作为读数测量值时,发现了相似的差异活性。图51B说明了rhIL10和IgGIL10M13证明相似的抗炎活性,如通过在全血测定中抑制TNFα所测量的。
图52描绘了用等摩尔量的重组人IL10 rhIL10(左图)或IgGIL10M13(右图)刺激的人全血中IL10依赖性pSTAT3信号传导的CyTOF分析结果。IL10诱导了单核细胞的抗炎活性;并且T、B或NK细胞的激活诱导了促炎性细胞因子。通过热图(阴影的变化)描绘了细胞活性在未刺激下的倍数变化的结果。左图表示rhIL10赋予所有IL10敏感细胞类型刺激(带有轮廓);然而,如右图所示,IgGIL10M13对T、B和NK细胞的刺激作用较小,其中与未刺激细胞相似或略高于未刺激细胞的水平;而在IgG-IL10M和rhIL10情况下,证明了单核细胞(轮廓)和mDC细胞的刺激的相似的效力。这些相关的细胞类型(单核细胞,mDC)是维持炎症性肠病中肠道动态平衡的关键细胞。
图53A-53D说明了在体内测定中抗体细胞因子移植蛋白IgGIL10M13的改善的特征。图53A-53B描述了rhIL10和IgGIL10M13的药代动力学研究的结果。静脉内施用后,IgGIL10M13证明延长的药代动力学(半衰期),因为在4.4天后仍可检测到抗体细胞因子移植蛋白(图53B),而rhIL10的半衰期约为1小时(图53A)。图53C和53D描绘了抗体细胞因子移植蛋白体的内活性的药效学测定的结果。图53C描绘了在给药后七十二(72)小时如通过pSTAT3信号传导所测量的结肠组织的体内活性。图53D描绘了如与rhIL10相比,如通过在施用IgGIL10M13后响应LPS激发抑制TNFα所测量的IgGIL10M13的体内反应的改善的持续时间。
图54是LPS激发模型的结果,证明IgGIL10M13在LPS激发后48小时减少了TNFα诱导。
图55是表示IL10抗体细胞因子移植蛋白的改善的%CMAX的图。
图56描绘了当用rhIL10或用IgGIL10M13刺激时,来自健康受试者和患者的各种免疫细胞中的pSTAT3活性的CyTOF数据。
图57-61是图形表示,证明了与rhIL10相比,IgGIL10M13在PHA刺激的人全血中具有降低的促炎活性。
图62显示了用rhIL10和IgGIL10M13进行滴定实验的图。
图63-64描绘了与抗体细胞因子移植蛋白的聚合特性相比,当IL10野生型或单体通过接头与Fc缀合时的聚合特性。
图65是ELISA数据,其显示了IL10抗体细胞因子移植蛋白仍与RSV结合。
图66表示了IL10抗体细胞因子移植蛋白的作用机理。左图显示了正常的rhIL10二聚体如何结合IL-10R1,并启动强pSTAT3信号传导。右图描绘了如何限制移植到抗体的CDR中的IL10单体与IL-10R1的结合效率较低,并且从而产生较弱的pSTAT3信号。
图67A-C是移植到帕利珠单抗的LCDR1中的IL10单体的晶体结构分辨率。
图68是显示移植到不同抗体支架中的IL10 ACE蛋白的IC 50值的图和表。
图69是显示移植到不同抗体支架中的IL10 ACE蛋白的IC 50值的图和表,其中IL10细胞因子被移植到不同的CDR中。
图70A显示了在用移植到不同抗体支架中的IL2 ACE蛋白处理后,小鼠模型中CD8+T效应细胞的扩增。
图70B显示了在用移植到不同抗体支架中的IL2 ACE蛋白处理后,小鼠模型中CD4+Treg细胞的扩增。
图70C显示了在用移植到不同抗体支架中的IL2 ACE蛋白处理后,小鼠模型中NK细胞的扩增。
图71-100是Cytof数据,显示了其各自ACE蛋白的pSTAT活性。
图101显示了,与用重组人Flt3L观察到的结果相当,H1、H3和L3 Flt3L移植物能够诱导B220+ CD11c+浆细胞样DC分化(上图)和CD370+ DC1分化(下图)。上图是对活的、单细胞进行门控。下图是对作为CD11c+的活的、单细胞进行门控。
图102显示了GM-CSF细胞因子移植物能够诱导单核细胞DC分化,如通过细胞上DC-SIGN的上调和CD14的下调所证明的。该事件特定于用GM-CSF或含有GM-CSF的移植物培养的细胞,因为帕利珠单抗移植物对照未诱导这些细胞变化。
图103显示了用GM-CSF移植物生成的单核细胞DC能够响应TLR7/8激活。将细胞与R848,充分表征的TLR7/8激动剂孵育过夜,并测量细胞表面CD86上调作为细胞激活的标志物。用野生型人GM-CSF或GM-CSF移植物生成的单核细胞DC在R848模拟后同样能够上调CD86,表明用GM-CSF移植物生成的单核细胞DC的功能。
ACE蛋白
本文披露的实施例提供了ACE蛋白,所述ACE蛋白包含:(a)重链可变区(VH),所述重链可变区包含互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2、HCDR3;和(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3;以及(c)移植到所述VH或所述VL的CDR中的细胞因子分子。
在一些实施例中,所述细胞因子分子直接被移植到CDR中。在一些实施例中,将细胞因子分子直接移植到没有肽接头的CDR中,在CDR序列和细胞因子序列之间没有另外的氨基酸。
在一些实施例中,移植到CDR中的细胞因子分子属于4螺旋束细胞因子家族。例如,所述细胞因子分子可以选自表1中列出的那些。在一些实施例中,所述细胞因子分子不是白细胞介素-10(IL-10)。在一些实施例中,所述全长细胞-因子分子被移植到CDR中。在一些实施例中,所述没有信号肽的细胞因子分子被移植到CDR中。
不受理论束缚,预期通过将细胞因子分子直接移植到抗体支架的CDR序列中,细胞因子的天然构象可能会或可能不会被CDR序列或抗体支架的其他部分修饰,这可能导致移植的细胞因子分子的特性发生变化。例如,取决于移植到细胞因子分子中的CDR序列的长度,其与受体的结合可能受到消极或正向影响,以及其通过受体信号传导。
因此,在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所述ACE蛋白的所移植的细胞因子分子与受体的结合亲和力增加。例如,与游离细胞因子分子相比,所述ACE蛋白的移植的细胞因子分子与受体的结合亲和力增加了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1,000倍或更多。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所述ACE蛋白的所移植的细胞因子分子与受体的结合亲和力降低。例如,与游离细胞因子分子相比,所述ACE蛋白的移植的细胞因子分子与受体的结合亲和力降低了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、100%。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所述ACE蛋白的所移植的细胞因子分子与受体的结合亲合力增加。例如,与游离细胞因子分子相比,所述ACE蛋白的移植的细胞因子分子与受体的结合亲合力增加了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1,000倍或更多。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所述ACE蛋白的所移植的细胞因子分子与受体的结合亲合力降低。例如,与游离细胞因子分子相比,所述ACE蛋白的移植的细胞因子分子与受体的结合亲合力降低了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、100%。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所述ACE蛋白的所移植的细胞因子分子与两个或更多个受体的不同的亲和力(affinity)或亲合力(avidity)发生了变化。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所述ACE蛋白的所移植的细胞因子分子的活性增加。例如,与游离细胞因子分子相比,所述ACE蛋白的移植的细胞因子分子的活性(例如,细胞增殖活性、抗细胞增殖活性、凋亡活性、促炎活性、抗炎活性等)增加了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1,000倍或更多。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,所述ACE蛋白的所移植的细胞因子分子的活性降低。例如,与游离细胞因子分子相比,所述ACE蛋白的移植的细胞因子分子的活性(例如,细胞增殖活性、抗细胞增殖活性、凋亡活性、促炎活性、抗炎活性等)降低了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、100%。
在一些实施例中,移植的抗体细胞因子赋予抗炎特性,其优于游离细胞因子分子。在一些实施例中,如与游离细胞因子分子相比,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白赋予了对Treg细胞增加的活性,同时提供了降低比例的促炎活性。在一些实施例中,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了超过Teff细胞、Tcon细胞和/或NK细胞的Treg细胞的优先激活。在一些实施例中,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了超过Teff细胞、Tcon细胞和/或NK细胞的Treg细胞的优先扩增。在一些实施例中,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了Treg细胞的增加的扩增,而没有扩增CD8 T效应细胞或NK细胞。在一些实施例中,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了Treg细胞:NK细胞的扩增比例:即,约等于、大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些实施例中,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了Treg细胞:CD8 T效应细胞的扩增比例:即,约等于、大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些实施例中,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了Treg细胞:CD4Tcon细胞的扩增比例:即,约等于、大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了在CD4 Tcon细胞中降低的受体信号传导效力。在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了在CD8 Teff细胞中降低的受体信号传导效力。在一些实施例中,与游离细胞因子分子相比,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了在NK细胞中降低的受体信号传导效力。在一些实施例中,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了比游离细胞因子分子高约1,000倍、约2,000倍、约3,000倍、约4,000倍、约5,000倍、约6,000倍、约7,000倍、约8,000倍、约9,000倍、约10,000倍、或更多的超过CD4 T效应细胞的Treg细胞的特异性激活。在一些实施例中,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了比游离细胞因子分子高约100倍、约200倍、约300倍、约400倍、约500倍、约600倍、约700倍、约800倍、约900倍、约1,000倍、或更多的超过CD8 T效应细胞的Treg细胞的特异性激活。在一些实施例中,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了比游离细胞因子分子高约100倍、约200倍、约300倍、约400倍、约500倍、约600倍、约700倍、约800倍、约900倍、约1,000倍、或更多的超过CD8 T效应/记忆细胞的Treg细胞的特异性激活。
在一些实施例中,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了比游离细胞因子降低的毒性。在一些实施例中,本文披露的抗体细胞因子移植蛋白提供了增加的半衰期,例如超过4小时、超过6小时、超过8小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时、超过3天、超过4天、超过7天、超过14天或更长时间。
在一些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其具有免疫球蛋白可变结构域与不同于细胞因子分子结合特异性的靶的结合特异性。在一些实施例中,在存在该移植的细胞因子的情况下,免疫球蛋白可变结构域与其靶的结合特异性保留了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%。在某些实施例中,保留的结合特异性是针对非人靶的。在某些实施例中,保留的结合特异性是针对病毒,例如,RSV。在其他实施例中,结合特异性是针对结合细胞因子分子具有治疗效用的人靶。在某些实施例中,靶向免疫球蛋白的结合特异性将另外的治疗益处传递给细胞因子。在某些实施例中,免疫球蛋白与其靶的结合特异性传达了与细胞因子的协同活性。
在仍其他实施例中,免疫球蛋白与其靶的结合特异性通过移植细胞因子分子降低了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%。
靶向IL7Ra的ACE蛋白
本文提供了包含IL7分子的ACE蛋白,该IL7分子被移植到抗体的互补决定区(CDR)中。本披露的ACE蛋白显示出适合用于人患者的特性,例如,它们保留了与天然或重组人IL7相似的免疫刺激活性。在整个说明书中还证明了其他活性和特征。因此,提供了ACE蛋白,所述ACE蛋白具有比先前已知的IL7和经修饰的IL7治疗剂改善的治疗特性,以及在癌症治疗中使用所提供的ACE蛋白的方法。
因此,本披露提供了ACE蛋白,其是IL7Ra的激动剂,具有选择活性特性。所提供的ACE蛋白包含免疫球蛋白重链序列和免疫球蛋白轻链序列。每个免疫球蛋白重链序列包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH),其中重链恒定区由CH1、CH2和CH3恒定区组成。每个免疫球蛋白轻链序列包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。在每种ACE蛋白中,IL7分子被并入到VH或VL的互补决定区(CDR)中。
在一些实施例中,ACE蛋白包含并入重链CDR中的IL7分子。在某些实施例中,将IL7并入重链互补决定区1(HCDR1)中。在某些实施例中,将IL7并入重链互补决定区2(HCDR2)中。在某些实施例中,将IL7并入重链互补决定区3(HCDR3)中。
在一些实施例中,ACE蛋白包含并入轻链CDR中的IL7。在某些实施例中,将IL7并入轻链互补决定区1(LCDR1)中。在某些实施例中,将IL7并入轻链互补决定区2(LCDR2)中。在某些实施例中,将IL7并入轻链互补决定区3(LCDR3)中。
在一些实施例中,ACE包含并入CDR中的IL7序列,由此将IL7序列***CDR序列中。***可以在CDR的N末端区域处或附近,在CDR的中间区域中或在CDR的C末端区域处或附近。在其他实施例中,ACE包含并入CDR中的IL7,由此IL7序列不会将CDR序列移码。
在一些实施例中,将IL7直接移植到没有肽接头的CDR中,在CDR序列和IL7序列之间没有另外的氨基酸。
在一些实施例中,ACE蛋白包含IgG类抗体重链的免疫球蛋白重链。在某些实施例中,IgG重链是IgG1、IgG2或IgG4亚类中的任何一种。
靶向IL2高亲和力受体的ACE蛋白
本文提供了包含IL2的蛋白构建体,该IL2被移植到抗体的互补决定区(CDR)中。抗体细胞因子移植蛋白显示出适合用于人患者的特性,例如,它们保留了与天然或重组人IL2相似的对Treg细胞的免疫刺激活性。然而,负面影响会减少,例如刺激NK细胞。在整个说明书中还证明了其他活性和特征。因此,提供了具有超过先前已知的IL2和经修饰的IL2治疗剂改善的治疗特性的抗体细胞因子移植蛋白,以及在疗法中使用所提供的抗体细胞因子移植蛋白的方法。
因此,本披露提供了抗体细胞因子移植蛋白,其是IL2高亲和力受体的激动剂,具有选择活性特性。提供了包含免疫球蛋白重链序列和免疫球蛋白轻链序列的抗体细胞因子移植蛋白。每个免疫球蛋白重链序列包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH),其中重链恒定区由CH1、CH2和CH3恒定区组成。每个免疫球蛋白轻链序列包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。在每种抗体细胞因子移植蛋白中,IL2分子被并入到抗体的VH或VL的互补决定区(CDR)中。
在一些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含并入重链CDR中的IL2。在某些实施例中,将IL2并入重链互补决定区1(HCDR1)中。在某些实施例中,将IL2并入重链互补决定区2(HCDR2)中。在某些实施例中,将单体IL2并入重链互补决定区3(HCDR3)中。
在一些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含并入轻链CDR中的IL2。在某些实施例中,将IL2并入轻链互补决定区1(LCDR1)中。在某些实施例中,将IL2并入轻链互补决定区2(LCDR2)中。在某些实施例中,将IL2并入轻链互补决定区3(LCDR3)中。
在一些实施例中,移植的抗体细胞因子包含并入CDR中的IL2序列,由此将IL2序列***CDR序列中。***可以在CDR的起始处或附近,在CDR的中间区域中或在CDR的端处或附近。在其他实施例中,移植的抗体细胞因子包含并入CDR中的IL2,由此IL2序列替换了全部或部分CDR序列。替换可以在CDR的起始处或附近,在CDR的中间区域中或在CDR的端处或附近。替换可以是CDR序列或多达整个CDR序列中少至一个或两个氨基酸。
在一些实施例中,将IL2直接并入没有肽接头的CDR中,在CDR序列和IL2序列之间没有另外的氨基酸。
在一些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含IgG类抗体重链的免疫球蛋白重链。在某些实施例中,IgG重链是IgG1、IgG2或IgG4亚类中的任何一种。
在一些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其选自已知的临床上使用的免疫球蛋白序列。在某些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其是人源化序列。在其他实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其是人序列。
在一些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其选自种系免疫球蛋白序列。
在一些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其具有免疫球蛋白可变结构域与不同于IL2分子结合特异性的靶的结合特异性。在一些实施例中,在存在该移植物的情况下,免疫球蛋白可变结构域与其靶的结合特异性保留了。在某些实施例中,保留的结合特异性是针对非人靶的。在其他实施例中,结合特异性是针对结合IL2疗法具有治疗效用的人靶。在某些实施例中,靶向免疫球蛋白的结合特异性将另外的治疗益处传递给IL2组分。在某些实施例中,免疫球蛋白与其靶的结合特异性传达了与IL2的协同活性。
在仍其他实施例中,免疫球蛋白与其靶的结合特异性通过移植IL2分子降低了。
靶向IL2低亲和力受体的ACE蛋白
本文提供了包含IL2分子的抗体细胞因子移植蛋白,该IL2分子被移植到抗体的互补决定区(CDR)中。本披露的抗体细胞因子移植蛋白显示出适合用于人患者的特性,例如,它们保留了与天然或重组人IL2相似的免疫刺激活性。然而,负面影响已减小。例如,存在较少的Treg细胞的刺激,以及改善的CD8 T效应细胞的应答。在整个说明书中还证明了其他活性和特征。因此,提供了抗体细胞因子移植蛋白,所述抗体细胞因子移植蛋白具有比先前已知的IL2和经修饰的IL2治疗剂改善的治疗特性,以及在癌症治疗中使用所提供的抗体细胞因子移植蛋白的方法。
因此,本披露提供了抗体细胞因子移植蛋白,其是IL2低亲和力受体的激动剂,具有选择活性特性。所提供的抗体细胞因子移植蛋白包含免疫球蛋白重链序列和免疫球蛋白轻链序列。每个免疫球蛋白重链序列包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH),其中重链恒定区由CH1、CH2和CH3恒定区组成。每个免疫球蛋白轻链序列包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。在每种抗体细胞因子移植蛋白中,IL2分子被并入到VH或VL的互补决定区(CDR)中。
在一些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含并入重链CDR中的IL2分子。在某些实施例中,将IL2并入重链互补决定区1(HCDR1)中。在某些实施例中,将IL2并入重链互补决定区2(HCDR2)中。在某些实施例中,将IL2并入重链互补决定区3(HCDR3)中。
在一些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含并入轻链CDR中的IL2。在某些实施例中,将IL2并入轻链互补决定区1(LCDR1)中。在某些实施例中,将IL2并入轻链互补决定区2(LCDR2)中。在某些实施例中,将IL2并入轻链互补决定区3(LCDR3)中。
在一些实施例中,移植的抗体细胞因子包含并入CDR中的IL2序列,由此将IL2序列***CDR序列中。***可以在CDR的N末端区域处或附近,在CDR的中间区域中或在CDR的C末端区域处或附近。在其他实施例中,移植的抗体细胞因子包含并入CDR中的IL2,由此IL2序列不会将CDR序列移码。
在一些实施例中,将IL2直接移植到没有肽接头的CDR中,在CDR序列和IL2序列之间没有另外的氨基酸。
在一些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含IgG类抗体重链的免疫球蛋白重链。在某些实施例中,IgG重链是IgG1、IgG2或IgG4亚类中的任何一种。
在一些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其选自已知的临床上使用的免疫球蛋白序列。在某些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其是人源化序列。在其他实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其是人序列。
在一些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其选自种系免疫球蛋白序列。
在一些实施例中,抗体细胞因子移植蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其具有免疫球蛋白可变结构域与不同于IL2分子结合特异性的靶的结合特异性。在一些实施例中,在存在该移植物的情况下,免疫球蛋白可变结构域与其靶的结合特异性保留了。在某些实施例中,保留的结合特异性是针对非人靶的。在其他实施例中,结合特异性是针对结合IL2疗法具有治疗效用的人靶。在某些实施例中,靶向免疫球蛋白的结合特异性将另外的治疗益处传递给IL2组分。在某些实施例中,免疫球蛋白与其靶的结合特异性传达了与IL2的协同活性。
在仍其他实施例中,免疫球蛋白的结合特异性通过移植IL2分子降低了。
靶向IL6受体的ACE蛋白
本文提供了包含IL6分子的ACE蛋白,该IL6分子被移植到抗体的互补决定区(CDR)中。本披露的ACE蛋白显示出适合用于人患者的特性,例如,它们保留了与天然或重组人IL6相似的活性。在整个说明书中还证明了其他活性和特征。因此,提供了ACE蛋白,所述ACE蛋白具有比先前已知的IL6和经修饰的IL6治疗剂改善的治疗特性,以及在癌症治疗中使用所提供的ACE蛋白的方法。
因此,本披露提供了ACE蛋白,其是IL6受体的激动剂,具有选择活性特性。所提供的ACE蛋白包含免疫球蛋白重链序列和免疫球蛋白轻链序列。每个免疫球蛋白重链序列包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH),其中重链恒定区由CH1、CH2和CH3恒定区组成。每个免疫球蛋白轻链序列包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。在每种ACE蛋白中,IL6分子被并入到VH或VL的互补决定区(CDR)中。
在一些实施例中,ACE蛋白包含并入重链CDR中的IL6分子。在某些实施例中,将IL6并入重链互补决定区1(HCDR1)中。在某些实施例中,将IL6并入重链互补决定区2(HCDR2)中。在某些实施例中,将IL6并入重链互补决定区3(HCDR3)中。
在一些实施例中,ACE蛋白包含并入轻链CDR中的IL6。在某些实施例中,将IL6并入轻链互补决定区1(LCDR1)中。在某些实施例中,将IL6并入轻链互补决定区2(LCDR2)中。在某些实施例中,将IL6并入轻链互补决定区3(LCDR3)中。
在一些实施例中,ACE包含并入CDR中的IL6序列,由此将IL6序列***CDR序列中。***可以在CDR的N末端区域处或附近,在CDR的中间区域中或在CDR的C末端区域处或附近。在其他实施例中,ACE包含并入CDR中的IL6,由此IL6序列不会将CDR序列移码。
在一些实施例中,将IL6直接移植到没有肽接头的CDR中,在CDR序列和IL6序列之间没有另外的氨基酸。
在一些实施例中,ACE蛋白包含IgG类抗体重链的免疫球蛋白重链。在某些实施例中,IgG重链是IgG1、IgG2或IgG4亚类中的任何一种。
在一些实施例中,ACE植蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其选自已知的临床上使用的免疫球蛋白序列。在某些实施例中,ACE蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其是人源化序列。在其他实施例中,ACE蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其是人序列。
在一些实施例中,ACE蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其选自种系免疫球蛋白序列。
在一些实施例中,ACE蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列,其具有免疫球蛋白可变结构域与不同于细胞因子分子结合特异性的靶的结合特异性。在一些实施例中,在存在该移植的细胞因子的情况下,免疫球蛋白可变结构域与其靶的结合特异性保留了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%。在某些实施例中,保留的结合特异性是针对非人靶的。在其他实施例中,结合特异性是针对结合疗法具有治疗效用的人靶。在某些实施例中,靶向免疫球蛋白的结合特异性将另外的治疗益处传递给细胞因子组分。在某些实施例中,免疫球蛋白与其靶的结合特异性传达了与细胞因子的协同活性。
在仍其他实施例中,免疫球蛋白的结合特异性,通过移植细胞因子分子降低了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%。
在一些实施例中,ACE蛋白包含具有赋予经修饰的效应子功能的经修饰的Fc的经修饰的免疫球蛋白IgG。在某些实施例中,该经修饰的Fc区包含选自D265A、P329A、P329G、N297A、L234A和L235A中的一个或多个的突变。在特定的实施例中,免疫球蛋白重链可以包含选自以下中任一种的赋予降低的效应子功能的突变或突变组合:D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A、和P329G/L234A/L235A。在一些实施例中,所述Fc突变为D265A/P329A。
在一些实施例中,ACE蛋白包含(i)与表2中列出的重链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%氨基酸序列同一性的重链可变区,以及(ii)与表2中列出的轻链可变区具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%氨基酸序列同一性的轻链可变区。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施例中,免疫球蛋白任选地包含赋予减少的效应子功能的突变或突变的组合,这些突变选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A、和P329G/L234A/L235A中的任一个。在一些实施例中,所述Fc突变为D265A/P329A。
工程化的和/或修饰的ACE蛋白
在某些方面,通过将细胞因子序列工程化到免疫球蛋白支架的CDR区中来产生ACE蛋白。重链和轻链免疫球蛋白链均产生,以产生最终的抗体移植蛋白。如与天然或重组人细胞因子或与Fc融合的细胞因子相比,ACE蛋白对T细胞赋予了优选的治疗活性,并且ACE蛋白。
为了工程化ACE蛋白,将细胞因子序列***免疫球蛋白链支架蛋白的CDR环中。可以使用已在临床环境中使用的多种已知免疫球蛋白序列、当前发现和/或临床开发中的已知免疫球蛋白序列、人种系抗体序列以及新颖抗体免疫球蛋白链的序列来制备移植的ACE蛋白。使用标准分子生物学方法、利用编码相关序列的重组DNA产生构建体。表2中描述了称为GFTX3b和GFTX的示例性支架中的细胞因子的序列。基于可用的结构或同源性模型数据,将***点选择为环的中点,然而,可以朝CDR环的一端或另一端调整***点。在一些实施例中,可以使用与任何抗原不具有结合特异性的免疫球蛋白支架来制备移植的构建体。在一些实施例中,可以使用与人抗原不具有结合特异性的免疫球蛋白支架来制备移植的构建体。在一些实施例中,可以使用对人抗原例如肿瘤抗原具有结合特异性的免疫球蛋白支架制备移植的构建体。
因此,本披露提供了抗体或其片段,其特异性与细胞因子受体结合,所述细胞因子受体包含重组***异源抗体蛋白或多肽中以产生移植的蛋白的细胞因子蛋白。特别地,本披露提供了移植的蛋白,其包含本文所述的抗体或抗体的抗原结合片段或任何其他相关支架抗体多肽(例如,全抗体免疫球蛋白、Fab片段、Fc片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VHCDR、VL结构域、VL CDR等)和异源细胞因子蛋白、多肽或肽。将蛋白、多肽或肽与抗体或抗体片段融合或缀合的方法是本领域已知的。参见,例如,美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、和5,112,946;欧洲专利号EP 307,434和EP 367,166;国际公开号WO 96/04388和WO 91/06570;Ashkenazi等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:10535-10539;Zheng等人,1995,J.Immunol.[免疫学杂志]154:5590-5600;和Vil等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:11337-11341。可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术生成另外的ACE蛋白。可采用DNA改组来制备移植的蛋白构建体和/或改变抗体或其片段(例如,具有较高亲和力和较低解离速率的抗体或其片段)的活性。通常参见,美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、和5,837,458;Patten等人,1997,Curr.Opinion Biotechnol.[当前生物技术观点]8:724-33;Harayama,1998,TrendsBiotechnol.[生物技术趋势]16(2):76-82;Hansson等人,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:265-76;以及Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques[生物技术]24(2):308-313。抗体或其片段、或编码的抗体或其片段可以通过在重组之前通过易错PCR、随机核苷酸***或其他方法进行随机诱变来改变。编码特异性结合目的抗原蛋白的抗体或其片段的多核苷酸可以与一种或多种异源细胞因子分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组,用于制备如本文提供的ACE蛋白。
抗体Fab含有六个CDR环,轻链中的3个(CDRL1、CDRL2、CDRL3)和重链中的3个(CDRH1、CDRH2、CDRH3),它们可以用作细胞因子蛋白的潜在***位点。为了确定***细胞因子的CDR环,考虑了结构和功能上的考虑。由于不同抗体之间的CDR环大小和构象差异很大,因此对于每种特定的抗体/蛋白组合,可以凭经验确定最佳的***CDR。另外,由于将细胞因子蛋白***CDR环,因此这可以对细胞因子蛋白的结构施加另外的限制。
免疫球蛋白链的CDR通过本领域已知的熟知的编号***来确定,包括本文所述的那些。例如,CDR已经通过如下鉴定并且定义:(1)使用以下中所述的编号***:Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白序列],”第5版Public Health Service[公共卫生服务],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达市,马里兰州(“Kabat”编号方案),NIH公开号91-3242;以及(2)乔西亚,参见Al-Lazikani等人,(1997)“Standard conformations for the canonicalstructures of immunoglobulins[免疫球蛋白规范结构的标准构象],”J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]273:927-948。对于鉴定的长度少于20个氨基酸的CDR氨基酸序列,一个或两个保守氨基酸残基取代可以耐受,同时仍保留所期望的特异性结合和/或激动剂活性。
还可以使用抗体作为起始材料来工程化经修饰的抗体细胞因子移植蛋白,从而制备ACE蛋白,该抗体具有本文所示的一个或多个CDR和/或VH和/或VL序列(例如,表2),该经修饰的ACE蛋白可以具有与起始抗体移植蛋白相比改变的特性。可替代地,任何已知的抗体序列都可以用作支架以工程化经修饰的ACE蛋白。例如,可以将任何已知的临床上使用的抗体用作制备抗体移植蛋白的起始材料支架。已知的抗体和相应的免疫球蛋白序列包括,例如帕利珠单抗、阿利库单抗、美泊利单抗、耐昔妥珠单抗、纳武单抗、地那昔单抗、苏金单抗、依伏库单抗、博纳吐单抗、派姆单抗、雷莫芦单抗、维多珠单抗、司妥昔单抗、奥妥珠单抗、曲妥单抗、雷珠单抗、帕妥珠单抗、贝利单抗、伊匹单抗、地诺单抗、托珠单抗、奥法木单抗、康纳单抗、戈利木单抗、优特克单抗、赛妥珠单抗、卡妥索单抗、依库丽单抗、兰尼单抗、帕尼单抗、那他珠单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、依法利珠单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、吉妥珠单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、利妥昔单抗、阿昔单抗、莫罗单抗、或其修饰。已知的抗体和免疫球蛋白序列也包括种系抗体序列。框架序列可以从包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开参考文献获得。例如,人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库中找到,以及在卡巴特,E.A.,等人,1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学相关蛋白序列],第五版,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and HumanServices),NIH公开号91-3242;Tomlinson,I.M.等人,1992 J.fol.Biol.[分子生物学杂志]227:776-798;和Cox,J.P.L.等人,1994 Eur.J Immunol.[欧洲免疫学杂志]24:827-836中找到。在仍其他实例中,可以将来自可能处于早期发现和/或药物开发中的其他已知实体的抗体和相应的免疫球蛋白序列类似地用作起始材料,以工程化经修饰的ACE蛋白。
只要所得多肽包括至少一个容纳细胞因子并入的结合区,可以使用各种各样的抗体/免疫球蛋白构架或支架。此类框架或支架包括5种主要独特型的人免疫球蛋白或其片段,并且包括其他动物物种的免疫球蛋白,优选具有人源化和/或人方面。本领域技术人员将继续发现和开发新颖抗体、框架、支架和片段。
可以使用本领域已知的方法产生抗体。为了制备单克隆抗体,可以使用本领域已知的任何技术(参见,例如,Kohler&Milstein,Nature[自然]256:495-497(1975);Kozbor等人,Immunology Today[今日免疫学]4:72(1983);Cole等人,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy[单克隆抗体与癌症治疗],第77-96页艾伦丽思出版社公司(Alan R.Liss,Inc.)1985)。产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)可适于产生用于ACE蛋白的抗体。同样,转基因小鼠或其他生物,例如其他哺乳动物,可用于表达和鉴定灵长类或人源化或人抗体。可替代地,可以使用噬菌体展示技术来鉴定与选择的抗原特异性结合的抗体和异源Fab片段,以用于ACE蛋白(参见,例如,McCafferty等人,同上;Marks等人,Biotechnology[生物技术],10:779-783,(1992))。
灵长类化或人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。通常,灵长类化或人源化抗体具有从非灵长类或非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非灵长类或非人氨基酸残基通常称为输入残基,这些残基典型地取自输入可变结构域。基本上可遵循Winter和同事的方法(参见,例如,Jones等人,Nature[自然]321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature[自然]332:323-327(1988);Verhoeyen等人,Science[科学]239:1534-1536(1988)和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学最新观点]2:593-596(1992)),通过将啮齿动物CDR或CDR序列取代为相应的人抗体序列进行人源化。因此,这种人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567),其中基本上小于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列取代。在实践中,灵长类或人源化抗体通常是灵长类或人抗体,其中一些互补决定区(“CDR”)残基以及可能地一些构架(“FR”)残基被来自起源物种(例如,啮齿动物抗体)中类似位点的残基取代以赋予结合特异性。
可替代地或另外,可以使用体内方法,用于用抗体中的人可变区替换非人抗体可变区,同时保持相对于非人抗体的相同结合特征或提供更好的结合特征,以将非人抗体转化为工程化人抗体。参见,例如,美国专利公开号20050008625,美国专利公开号2005/0255552。可替代地,人V区段文库可以通过顺序的卡盒替换来生成,其中最初,参考抗体V区段的仅一部分被人序列文库替换;并且然后在第二个文库筛选中重组在剩余参考抗体氨基酸序列的背景下支持结合的已鉴定人“盒”,以生成完整的人V区段(参见,美国专利公开号2006/0134098)。
用于制备ACE蛋白的各种抗体或抗原结合片段可通过对完整抗体进行酶促或化学修饰来产生,或使用重组DNA方法(例如,单链Fv)从头合成,或使用噬菌体展示文库进行鉴定(参见,例如McCafferty等人,Nature[自然]348:552-554,1990)。例如,可以使用本领域所述的方法产生小抗体,例如,Vaughan和Sollazzo,Comb.Chem.High Throughput Screen[组合化学和高通量筛选]4:417-30 2001。可以通过多种方法产生双特异性抗体,包括移植杂交瘤或连接Fab′片段。参见,例如,Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.[临床与实验免疫学]79:315-321(1990);Kostelny等人,J.Immunol.[免疫学杂志]148,1547-1553(1992)。可以使用噬菌体展示文库或核糖体展示文库、基因改组文库来鉴定单链抗体。可以从合成的、半合成的或天然的和免疫活性来源构建此类文库。因此,可以将选择的免疫球蛋白序列用于制备如本文提供的ACE蛋白构建体。
本披露中使用的抗体、抗原结合分子或ACE分子进一步包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。其他抗原结合片段或抗体部分包括二价scFv(双抗体),双特异性scFv抗体,其中抗体分子识别两个不同的表位,单结合域(dAb)和小抗体。因此,可以将选择的免疫球蛋白序列用于制备如本文提供的ACE蛋白构建体。
抗体的抗原结合片段,例如Fab片段,scFv,可以用作构建ACE蛋白的构件,并且可以任选地包括多价形式。在一些实施例中,这样的多价分子包含抗体(例如,Fc)的恒定区。
可以通过修饰抗体的一个或两个可变区(即,VH和/或VL)内,例如,在一个或多个CDR区内的一个或多个残基来工程化ACE蛋白,并且这样的适应的VH和/或VL区序列被用于移植细胞因子或用于制备细胞因子移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此,CDR内的氨基酸序列在单个抗体之间比CDR外部的序列更加多样化。CDR序列负责大多数抗体抗原相互作用,可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体的特性的重组抗体,所述表达载体包括被移植在来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上的来自所特异性抗体的CDR序列(参见,例如,Riechmann,L.等人,1998 Nature[自然]332:323-327;Jones,P.等人,1986 Nature[自然]321:522-525;Queen,C.等人,1989 Proc.Natl.Acad.,U.S.A.[美国国家科学院院刊]86:10029-10033;Winter的美国专利号5,225,539和Queen等人的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。在某些情况下,使框架区内的残基突变以维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(参见,例如,Queen等人的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。
在某些方面,VH和/或VL CDR1、CDR2、和/或CDR3区内的氨基酸残基的突变,从而改善目的抗体的一种或多种结合特性(例如,亲和力),即“亲和力成熟”,可能是有益的,例如,结合细胞因子移植蛋白来优化抗体的抗原结合。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入一个或多个突变,并且可以在如本文所述的体外或体内测定中和/或本领域已知的替代或另外的测定中评估对抗体结合或其他目的功能特性的影响。可以引入保守修饰。所述突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外,通常CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基被改变。
抗体片段的工程化抗体包括如下那些:其中已对VH和/或VL内的框架残基进行了修饰,例如以改善抗体的特性。在一些实施例中,进行这种框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如,一种方法是将一个或多个框架残基变为对应的种系序列。更确切地,已经历体细胞突变的抗体可以含有与衍生抗体的种系序列不同的框架残基。可以通过将抗体框架序列与衍生抗体的种系序列进行比较来鉴定此类残基。为了使框架区序列恢复为其种系构型,可以通过例如定点诱变将体细胞突变“回复突变”为种系序列。另外的框架修饰包括使框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变以去除T细胞表位,从而降低抗体的潜在免疫原性。此方法也称为“去免疫化”,并且在Carr等人的美国专利公开号20030153043中有进一步详细描述。
用于制备ACE蛋白的抗体或抗体片段的恒定区可以适当地是任何类型或亚型,并且可以选自通过本发明方法要治疗的受试者的物种(例如,人、非人灵长类动物或其他哺乳动物,例如,农业哺乳动物(例如马、羊、牛、猪、骆驼科动物),家养哺乳动物(例如犬科动物、猫科动物)或啮齿动物(例如大鼠、小鼠、仓鼠、兔子)。在一些实施例中,将ACE蛋白中使用的抗体工程化以产生人源化或抗体。在一些实施例中,在ACE蛋白中使用的抗体是人抗体。在一些实施例中,抗体恒定区同种型是IgG,例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。在某些实施例中,恒定区同种型是IgG1。在一些实施例中,ACE蛋白包含IgG。在一些实施例中,ACE蛋白包含IgG1 Fc。在一些实施例中,ACE蛋白包含IgG2 Fc。
除了在框架或CDR区内进行的修饰之外或作为在框架或CDR区内进行的修饰的替代方案,可以将在制造ACE蛋白中使用的抗体或抗体片段工程化以包括Fc区内的修饰,通常是为了改变抗体的一种或多种功能特性,例如像血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外,抗体、其抗体片段、或ACE蛋白可以经化学修饰(例如,一个或多个化学部分可以附接至抗体)或经修饰以改变其糖基化,从而再次改变ACE蛋白的一种或多种功能特性。
在一个实施例中,经修饰CH1的铰链区,使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变,例如增加或减少。例如,该方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述,其中改变CH1铰链区中半胱氨酸残基的数目,以便例如促进轻链和重链的组装或增加或降低ACE蛋白的稳定性。在另一个实施例中,使抗体的Fc铰链区突变以改变ACE蛋白生物半衰期。更具体地,将一个或多个氨基酸突变引入到Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域中,使得ACE蛋白具有相对于天然Fc铰链结构域SpA结合而言受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。该方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中进一步详细描述。
本披露提供了特异性地结合细胞因子受体的ACE蛋白,其在体内具有延长的半衰期。在另一个实施例中,修饰ACE蛋白以增加其生物半衰期。可以采用各种方法。还可以生成具有增加的体内半衰期的ACE蛋白,其将一个或多个氨基酸修饰(即,取代、***或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链Fc结构域片段)。例如,可以引入以下突变中的一种或多种:如在美国专利号6,277,375中由Ward所述的T252L、T254S、T256F。参见,例如,国际公开号WO 98/23289;国际公开号WO 97/34631;和美国专利号6,277,375。可替代地,为了增加生物半衰期,在CH1或CL区内改变ACE蛋白,以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位,如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。在又其他实施例中,通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区,以改变ACE蛋白的效应子功能。例如,可以用不同的氨基酸残基替换一个或多个氨基酸,使得ACE蛋白对效应配体具有改变的亲和力,但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应配体可以是例如Fc受体(FcR)或补体的C1组分。该方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述。
在另一个实施例中,选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基替换,使得ACE蛋白具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中进一步详细描述。
含有此类突变的ACE蛋白介导降低的或没有的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施例中,IgG1恒定区的氨基酸残基L234和L235被取代为Ala234和Ala235。在一些实施例中,IgG1恒定区的氨基酸残基N267被取代为Ala267。
在另一个实施例中,改变一个或多个氨基酸残基,从而改变ACE蛋白固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中进一步描述。
在又另一个实施例中,修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰一个或多个氨基酸来增加ACE蛋白对Fcγ受体的亲和力。该方法由Presta在PCT公开WO 00/42072中进一步描述。此外,已经绘制了人IgG1上针对FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点,并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见Shields,R.L.等人,2001 J.Biol.Chen.[生物化学杂志]276:6591-6604)。
在还另一个实施例中,修饰ACE蛋白的糖基化。例如,可以制备无糖基化ACE蛋白(即,ACE蛋白缺少糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对“抗原”的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如,可以进行一个或多个氨基酸取代,这导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点,从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。此类的方法在Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述。
另外或可替代地,可以制备具有改变的糖基化类型的ACE蛋白,如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化ACE蛋白或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明这类改变的糖基化模式增加了抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)能力。这种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达ACE蛋白来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域中描述,并且可用作宿主细胞,在该宿主细胞中表达重组ACE蛋白,从而产生具有改变的糖基化的ACE蛋白。例如,Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系,其编码岩藻糖基转移酶,使得在这种细胞系中表达的ACE蛋白显示出低岩藻糖基化。Presta在PCT公开WO 03/035835中描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞,其将岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低,还导致在所述宿主细胞中表达的ACE蛋白的低岩藻糖基化(还参见Shields,R.L.等人,2002 J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342描述了如下细胞系,该细胞系被工程化以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如,β(1,4)-N乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII)),使得在工程化细胞系中表达的ACE蛋白显示出增加的二等分GlcNac结构,该二等分GlcNac结构导致抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等人,1999 Nat.Biotech.[自然生物技术]17:176-180)。
在一些实施例中,ACE蛋白的一个或多个结构域、或区通过接头,例如肽接头,例如本领域熟知的接头,连接(参见例如,Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:6444-6448;Poljak,RJ.等人(1994)Structure[结构]2:1121-1123)。肽接头的长度可以变化,例如接头的长度可以是1-100个氨基酸,通常接头的长度是5至50个氨基酸,例如长度是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个氨基酸。
在一些实施例中,细胞因子任选地与一个或多个肽接头序列一起被移植到CDR序列中。在某些实施例中,一个或多个肽接头独立地选自(Glyn-Ser)m序列(SEQ ID NO:3974)、(Glyn-Ala)m序列(SEQ ID NO:3975)或(Glyn-Ser)m/(Glyn-Ala)m序列(SEQ ID NOS:3974-3975)的任何组合,其中每个n独立地是1到5的整数,并且每个m独立地是0到10的整数。接头的实例包括但不限于:基于甘氨酸的接头或gly/ser接头G/S,例如(GmS)n,其中n是等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10的正整数,并且m是等于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10的整数(SEQ IDNO:3976)。在某些实施例中,一个或多个接头包括G4S(SEQ ID NO:3972)重复序列,例如,Gly-Ser接头(G4S)n,其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:3972)。例如,n=1,n=2,n=3,n=4,n=5,以及n=6,n=7,n=8,n=9,以及n=10。在一些实施例中,Ser可以用Ala替换,例如接头G/A,例如(GmA)n,其中n是等于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的正整数,并且m是等于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数(SEQ ID NO:3977)。在某些实施例中,一个或多个接头包括G4A(SEQ ID NO:3973)重复序列,(G4A)n,其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:3973)。例如,n=1,n=2,n=3,n=4,n=5,以及n=6,n=7,n=8,n=9,以及n=10。在一些实施例中,接头包括接头的多个重复序列。在其他实施例中,接头包括G4S(SEQ ID NO:3972)和G4A(SEQ ID NO:3973)的组合和倍数。
接头的其他实例包括基于柔性接头序列的那些,其在抗体中天然存在以使由接头和连接产生的免疫原性最小化。例如,抗体分子结构中的可变结构域和CH1恒定域之间存在天然的柔性键。该天然键包含约10-12个氨基酸残基,由V结构域C端的4-6个残基和CH1结构域N端的4-6个残基贡献。ACE蛋白可以,例如,使用并入CH1的末端5-6个氨基酸残基或11-12个氨基酸残基的接头作为接头。CH1结构域的N末端残基,特别地前5-6个氨基酸残基,具有没有强二级结构的环构象,并且因此可以充当柔性接头。CH1结构域的N末端残基是可变结构域的自然延伸,因为它们是Ig序列的一部分,并且因此,在很大程度上将接头和连接可能引起的任何免疫原性减至最小。在一些实施例中,接头序列包括基于铰链序列的经修饰的肽序列。
此外,ACE蛋白可以包括标志物序列例如肽,以促进ACE蛋白的纯化。在优选的实施例中,标志物氨基酸序列是六组氨酸(SEQ ID NO:3978)肽,例如pQE运载体中提供的标签(凯杰公司(QIAGEN,Inc.),伊顿大街(Eton Avenue)9259号,加利福尼亚州查茨沃思(Chatsworth),91311)等,其中许多是商购可得的。如Gentz等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:821-824中所述,例如六组氨酸(SEQID NO:3978)提供了移植的蛋白质的方便纯化。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,1984,Cell[细胞]37:767)的血凝素(“HA”)标签和“flag”标签。
抗体也可以附接至固体支持物,这特别地可用于免疫测定或靶抗原的纯化。这种固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
ACE蛋白活性的测定
用于鉴定ACE蛋白的测定是本领域已知的并且在本文中描述。激动剂ACE蛋白与其同源细胞因子受体结合并且促进、诱导、刺激细胞内信号传导,从而导致细胞内信号传导以及其他生物学效应。
ACE蛋白与其受体的结合可以使用本领域已知的任何方法来确定。例如,可以使用已知技术确定与受体的结合,包括但不限于ELISA、蛋白印迹、表面等离振子共振(SPR)(例如,BIAcore)和流式细胞仪。
通过细胞因子受体的细胞内信号传导可以使用本领域已知的任何方法来测量。例如,通过IL7激活IL7Ra促进STAT5激活和信号传导。用于测量STAT5激活的方法是本领域中标准的(例如,STAT5蛋白的磷酸化状态、报道基因测定、下游信号传导测定等)。作为另一个实例,通过IL7Ra的激活使T细胞扩增,因此可以测定T细胞的绝对数量。此外,可以独立地测定CD8+或CD4+ T细胞。测量细胞增殖的方法是本领域标准的(例如,3H-胸苷并入测定,CFSE标记)。测量细胞因子产生的方法是本领域熟知的(例如,ELISA测定,ELISpot测定)。在进行体外测定时,可以将与ACE蛋白接触的测试细胞或来自测试细胞的培养上清液与尚未与ACE蛋白接触和/或与重组人细胞因子或细胞因子Fc融合分子接触的对照细胞或来自对照细胞的培养上清液进行比较。
ACE蛋白的活性也可以离体和/或体内测量。在一些方面,如与未经治疗的对照动物和/或经天然细胞因子类似治疗的动物相比,从用ACE蛋白治疗的动物离体测量各种细胞类型中的受体激活的方法可用于显示细胞类型中的ACE蛋白的差异活性。优选的激动剂ACE蛋白具有诱导细胞内信号传导的能力。ACE蛋白的功效可以通过向受试者施用治疗有效量的ACE蛋白并且在施用ACE蛋白之前和之后比较受试者来确定。ACE蛋白的功效还可以通过向测试受试者施用治疗有效量的ACE蛋白并且将测试受试者与未施用抗体的对照受试者进行比较和/或与类似用天然细胞因子治疗的受试者的比较来确定。
编码ACE蛋白的多核苷酸
在另一方面,提供了编码ACE蛋白的重链和轻链蛋白的分离的核酸。ACE蛋白可以通过本领域已知的任何手段产生,包括但不限于抗体四聚体的重组表达、化学合成、和酶促消化。重组表达可以来自本领域已知的任何适当的宿主细胞,例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本文提供了编码表2中例示的可变区的多核苷酸。在一些实施例中,编码重链可变区的多核苷酸包含与编码表2中列出的可变重链或可变轻链的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性的序列。
多核苷酸只能编码ACE蛋白的可变区序列。它们还可以编码ACE蛋白的可变区和恒定区。一些多核苷酸序列编码包含一种ACE蛋白的重链和轻链的可变区的多肽。一些其他多核苷酸编码两种多肽区段,这两种多肽区段分别与一种ACE蛋白的重链和轻链的可变区基本相同。
在某些实施例中,多核苷酸或核酸包含DNA。在其他实施例中,多核苷酸或核酸包含RNA,其可以是单链或双链的。
在一些实施例中,提供了重组宿主细胞,其包含编码ACE蛋白的一个或多个免疫球蛋白链,以及任选地,分泌信号的核酸。在某些实施例中,重组宿主细胞包含编码一个免疫球蛋白链和分泌信号的载体。在其他某些实施例中,重组宿主细胞包含一个或多个编码ACE蛋白和分泌信号的两条免疫球蛋白链的载体。在一些实施例中,重组宿主细胞包含单一载体,其编码ACE蛋白和分泌信号的两条免疫球蛋白链。在一些实施例中,重组宿主细胞包含两个载体,一个载体编码ACE蛋白的重链免疫球蛋白链,另一个编码轻链免疫球蛋白链,每个包括分泌信号。重组宿主细胞可以是原核或真核细胞。在一些实施例中,宿主细胞是真核细胞系。在一些实施例中,宿主细胞是哺乳动物细胞系。
另外提供了用于产生ACE蛋白的方法。在一些实施例中,该方法包括以下步骤:(i)在适合于表达、形成和分泌ACE蛋白的条件下,培养包含一种或多种编码ACE蛋白的免疫球蛋白链的载体的宿主细胞,并且(ii)回收ACE蛋白。
多核苷酸序列可以通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变编码ACE蛋白的多肽链的现有序列(例如,如本文所述的序列)来产生。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法完成,如Narang等人,Meth.Enzymol.[酶学方法]68:90,1979;Brown等人的磷酸二酯方法,Meth.Enzymol.[酶学方法]68:109,1979;Beaucage等人的二乙基亚磷酰胺方法,Tetra.Lett.[四面体快报],22:1859,1981;和美国专利号4,458,066的固体支持方法。通过PCR向多核苷酸序列引入突变可以如以下文献中所述进行,例如PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification[PCR技术:DNA扩增的原理和应用],H.A.Erlich(编辑),Freeman Press[弗里曼出版社],纽约,纽约州,1992;PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications[PCR方案:方法和应用指南],Innis等人,(编辑),Academic Press[学术出版社],圣地亚哥,加利福尼亚州,1990;Mattila等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]19:967,1991;以及Eckert等人,PCR Methods andApplications[PCR方法和应用]1:17,1991。
本披露还提供了表达载体和宿主细胞,用于产生上述ACE蛋白。可以使用各种表达载体来表达编码ACE蛋白的免疫球蛋白多肽链或片段的多核苷酸。基于病毒的载体和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生免疫球蛋白。非病毒载体和***包括质粒、附加型载体(典型地具有用于表达蛋白或RNA的表达盒)以及人类人工染色体(参见,例如,Harrington等人,Nat.Genet.[自然遗传学]15:345,1997)。例如,可用于哺乳动物(例如人)细胞中表达ACE蛋白多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(英杰公司(Invitrogen),加利福尼亚州圣地亚哥)、MPSV载体和本领域已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体,基于SV40、***瘤病毒、HBP EB病毒、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)(SFV)的载体。参见,Brent等人,同上;Smith,Annu.Rev.Microbiol.[微生物学年度评论]49:807,1995;和Rosenfeld等人,Cell[细胞]68:143,1992。
表达载体的选择取决于要表达该载体的预期宿主细胞。典型地,表达载体含有与编码ACE蛋白的免疫球蛋白的多核苷酸可操作地连接的启动子和其他调节序列(例如,增强子)。在一些实施例中,采用诱导型启动子以防止***的序列在诱导条件之外的条件下表达。诱导型启动子包括例如***糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可以在非诱导条件下、而不在偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体的情况下扩大经转化的生物体的培养。除了启动子以外,还可能需要或期望其他调节元件以有效表达免疫球蛋白链或ACE蛋白的片段。这些元件典型地包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外,通过包含适合于使用中的细胞***的增强子,可以提高表达效率(参见,例如,Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.[细胞分化中的结果和问题]20:125,1994;和Bittner等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],153:516,1987)。例如,SV40增强子或CMV增强子可以用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置,以形成ACE蛋白,该ACE蛋白从细胞中输出并且进入培养基。在某些方面,ACE蛋白的***的免疫球蛋白序列在包含在载体中之前与信号序列连接。用于接收编码免疫球蛋白轻链和重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。此类载体允许将可变区表达为具有恒定区的移植的蛋白,从而导致产生完整ACE蛋白或其片段。典型地,此类恒定区是人的。
用于携带和表达ACE蛋白链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆并且表达本披露多核苷酸的原核宿主。适合使用的其他微生物宿主包括杆菌(如枯草杆菌)和其他肠杆菌科(如沙门氏菌属、沙雷氏菌属)以及各种假单胞菌属的物种。在这些原核宿主中,还可以制备表达载体,其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如,复制的起点)。此外,将存在任何数量的多种熟知的启动子,如乳糖启动子***、色氨酸(trp)启动子***、β-内酰胺酶启动子***或来自噬菌体λ的启动子***。启动子典型地任选使用操纵基因序列控制表达,并且具有核糖体结合位点序列等,以用于启动和完成转录和翻译。其他微生物,例如酵母,也可以用于表达ACE蛋白多肽。也可以使用与杆状病毒载体组合的昆虫细胞。
在一些优选的实施例中,哺乳动物宿主细胞用于表达和产生ACE蛋白多肽。例如,它们可以是含有外源表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常的必死或正常或异常的永生的动物或人细胞。例如,已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系,包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。利用哺乳动物组织细胞培养表达多肽一般在例如Winnacker,FROM GENES TO CLONES[从基因到克隆],VCH出版商,纽约,纽约州,1987中讨论。哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列如复制的起点、启动子和增强子(参见,例如,Queen等人,Immunol.Rev.[免疫学评论]89:49-68,1986)和必要的处理信息位点如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或衍生自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调控的或可调节的。可用启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、***诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人CMV立即早期启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如,氯化钙转染通常用于原核细胞,而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主(通常参见Sambrook等人,同上)。其他方法包括例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、冲击法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、所移植到的疱疹病毒结构蛋白VP22(Elliot和O′Hare,Cell[细胞]88:223,1997)、试剂增强的DNA摄取和离体转导。对于重组蛋白的长期高产量产生,通常期望稳定的表达。例如,可以使用含有病毒复制起点或内源性表达元件和可选择标志物基因的表达载体来制备稳定表达ACE蛋白免疫球蛋白链的细胞系。在引入载体之后,可以使细胞在富集的培养基中生长1-2天,之后将它们转换至选择性培养基。选择性标志物的目的是赋予选择抗性,并且它的存在允许在选择性培养基中成功地表达引入的序列的细胞的生长。可以使用适合于细胞类型的组织培养技术来增殖抗性、稳定转染的细胞。
包含ACE蛋白的药物组合物
提供了药物组合物,其包含与药学上可接受的载体一起配制的ACE蛋白。任选地,药物组合物另外包含适合于治疗或预防给定障碍的其他治疗剂。药学上可接受的载体使组合物强化或稳定,或促进组合物的制备。药学上可接受的载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
本披露的药物组合物可通过本领域已知的各种方法施用。施用途径和/或方式根据所期望的结果而变化。优选的是通过肠胃外施用(例如,选自静脉内,肌肉内,腹膜内,鞘内,动脉内或皮下中的任何一种)进行施用,或者在靶部位附近施用。药学上可接受的载体适合通过静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、动脉内、皮下、鼻内、吸入、脊椎或表皮施用中的任何一种或多种(例如,通过注射)施用。取决于施用途径,可以将活性化合物(例如,ACE蛋白)包被在材料中,以保护该化合物免受酸和可能使该化合物失活的其他自然条件的作用。在一些实施例中,将药物组合物配制成用于静脉内施用。在一些实施例中,将药物组合物配制成用于皮下施用。
可以将ACE蛋白单独或与其他合适的成分组合制成气雾剂(即可以“雾化”)以通过吸入施用。可以将气溶胶配制品放入加压的可接受的推进剂中,例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
在一些实施例中,药物组合物是无菌的和流体的。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下,优选在组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨糖醇)和氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝或明胶)来实现可注射组合物的长期吸收。在某些实施例中,可以使用合适的赋形剂(例如,蔗糖)将组合物制备成冻干形式储存。
药物组合物可以按照本领域熟知和常规实施的方法制备。药学上可接受的载体部分地通过所施用的具体组合物、连同通过施用该组合物所使用的具体方法来确定。因此,存在多种合适的药物组合物配制品。例如在以下文献中可以找到用于配制ACE蛋白并且确定适当给药和时序安排的适用方法,Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿:药学科学与实践],第21版,费城科学大学,编辑,Lippincott Williams&Wilkins(2005);以及Martindale:The Complete Drug Reference[马丁代尔:完整的药物参考],Sweetman,2005,London:Pharmaceutical Press.[伦敦:制药出版社],以及Martindale,Martindale:The Extra Pharmacopoeia[马丁代尔:额外的药典],第31版.,1996,AmerPharmaceutical Assn[美国医药协会],以及Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems[持续控制释放药物输送***],J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约,1978。药物组合物优选在GMP条件下制造。典型地,在药物组合物中采用治疗有效剂量或有效剂量的ACE蛋白。通过本领域技术人员已知的常规方法将ACE蛋白配制成药学上可接受的剂型。调整剂量方案以提供所期望反应(例如,治疗反应)。在确定治疗或预防有效剂量时,可先施用低剂量,并且然后逐渐增加剂量,直至获得所期望的反应,具有极少或没有不期望的副作用。例如,如由治疗情况的紧急状态所指示的,可以施用单次推注,可以随着时间的推移施用若干个分次剂量,或可以按比例地减少或增加剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便施用和剂量统一。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于要治疗的受试者的单元剂量的物理上离散的单位;每个单位含有经计算与所要求的药物载体联合产生所期望的治疗效果的预定量的活性化合物。
可以改变药物组合物中活性成分的实际剂量水平,以便获得一定量的活性成分,该活性成分的量有效地实现对于特定的患者、组合物和施用方式的所期望的治疗反应,而对该患者没有毒性。所选的剂量水平取决于多种药代动力学因素,包括所用的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的特定化合物的***速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和既往病史。
制品/试剂盒
在某些方面,在制品(即,试剂盒)中提供了ACE蛋白。提供的ACE蛋白通常在小瓶或容器中。因此,制品包含容器和在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括,例如,瓶,小瓶,注射器,溶液袋等。适当地,ACE蛋白可以是处于液体中或干燥(例如冻干)形式。该容器装有一种组合物,该组合物本身或与另一种组合物可有效地制备用于治疗、预防和/或缓解癌症的组合物。标签或包装说明书表明该组合物用于治疗、预防和/或缓解癌症。如本文所述,包含ACE蛋白的制品(试剂盒)任选地含有一种或多种另外的试剂。在一些实施例中,制品(试剂盒)含有ACE蛋白和药学上可接受的稀释剂。在一些实施例中,在制品(试剂盒)中提供了ACE蛋白,其在相同配制品中(例如,作为混合物)具有一种或多种另外的活性剂。在一些实施例中,在制品(试剂盒)中提供了ACE蛋白,其在分开的配制品中(例如,在分开的容器中)具有第二或第三试剂。在某些实施例中,制品(试剂盒)包含ACE蛋白的等分试样,其中等分试样提供了一个或多个剂量。在一些实施例中,提供了用于多次施用的等分试样,其中剂量是均匀的或变化的。在特定的实施例中,适当时,变化的给药方案是逐步增加或减少。在一些实施例中,ACE蛋白和第二试剂的剂量独立地均匀或独立地变化。在某些实施例中,制品(试剂盒)包含另外的试剂,例如抗癌剂或免疫检查点分子。一种或多种另外的试剂的选择将取决于剂量、递送和要治疗的疾病状况。
治疗方法和用于治疗的药物组合物的用途
癌症的治疗
ACE蛋白可用于治疗、缓解或预防癌症。在一方面,本披露提供了在有需要的个体中治疗癌症的方法,这些方法包括向该个体施用治疗有效量的ACE蛋白,如本文所述。在一些实施例中,提供了ACE蛋白,以用作治疗剂,用于治疗或预防个体中的癌症。在另一方面,本披露提供了组合物,其包含用于治疗或缓解有需要的个体中的癌症的这种ACE蛋白。
经受治疗的病症包括各种癌症适应症。出于治疗目的,个人被诊断出患有癌症。出于预防或预防目的,个体可以从癌症中缓解或可以预期将来发作。在一些实施例中,患者患有癌症,被怀疑患有癌症或从癌症中缓解。经受用ACE蛋白的治疗的癌症通常受益于细胞因子信号传导的激活,如本文所述。经受治疗的癌症适应症包括但不限于:黑色素瘤、肺癌、大肠癌、***癌、乳腺癌和淋巴瘤。
免疫相关障碍的治疗
ACE蛋白可用于治疗、缓解或预防免疫相关障碍。在一方面,本披露提供了在有需要的个体中治疗免疫相关障碍的方法,这些方法包括对该个体施用治疗有效量的ACE蛋白,如本文所述。在一些实施例中,提供了ACE蛋白,以用作治疗剂,用于治疗或预防个体中的免疫相关障碍。在另一方面,本披露提供了组合物,其包含用于治疗或缓解有需要的个体中的免疫相关障碍的这种ACE蛋白。
经受治疗的病症包括各种免疫相关障碍。出于治疗目的,个体被诊断患有免疫相关障碍。出于预防或预防目的,个体可以从免疫相关障碍缓解或可以预期将来发作。在一些实施例中,患者患有免疫相关障碍,被怀疑患有免疫相关障碍,或处于免疫相关障碍的缓解中。经受用ACE蛋白的治疗的免疫相关障碍通常受益于细胞因子信号传导的激活,如本文所述。经受治疗的免疫相关障碍包括但不限于:炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病、急性胰腺炎、葡萄膜炎、斯耶格伦氏病、白塞病、结节病、移植物抗宿主病(GVHD)、***性红斑狼疮、白癜风、慢性预防性急性移植物抗宿主病(pGvHD)、HIV诱导的血管炎、斑秃、全身性硬化症和原发性抗磷脂综合征。
肥胖症的治疗
ACE蛋白可用于治疗、缓解或预防肥胖症。在一方面,本披露提供了在有需要的个体中治疗肥胖症的方法,这些方法包括向该个体施用治疗有效量的ACE蛋白,如本文所述。在一些实施例中,提供了ACE蛋白,以用作治疗剂,用于治疗或预防个体中的肥胖症。在另一方面,本披露提供了组合物,其包含用于治疗或缓解有需要的个体中的肥胖症的这种ACE蛋白。
经受治疗的病症包括各种肥胖症适应症。出于治疗目的,个人被诊断出患有肥胖症。出于预防或预防目的,个体可以预期肥胖的未来发作。在一些实施例中,患者患有肥胖症,被怀疑患有肥胖症或从肥胖症中恢复。经受用抗体细胞因子移植蛋白的治疗的肥胖症可以受益于细胞因子信号传导的激活,如本文所述。
ACE蛋白的施用
医生或兽医可以以低于达到期望治疗效果所需的水平开始药物组合物中使用的ACE蛋白的剂量,并且逐渐增加剂量直至达到期望效果。通常,组合物的有效剂量取决于许多不同因素而变化,这些因素包括要治疗的具体疾病或病症、施用手段、靶位点、患者的生理状态,无论患者是人还是动物,所施用的其他药物,以及治疗是预防性还是治疗性。治疗剂量通常需要滴定以优化安全性和功效。对于用ACE蛋白施用,剂量范围为约0.0001至100mg/kg宿主体重,且更通常为0.01至5mg/kg宿主体重。例如,剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重、或在1-10mg/kg的范围内。根据需要或期望,给药可以是每天、每周、每两周、每月一次或更经常或不经常地进行。示例性治疗方案需要每周一次、每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。
ACE蛋白可以单剂量或分剂量施用。ACE蛋白通常在多种情况下施用。根据需要或期望,单次剂量之间的间隔可以是每周、每两周、每月或每年。如通过测量患者中ACE蛋白的血液水平所示,间隔也可以是无规律的。在一些方法中,调节剂量以实现1-1000μg/mL的血浆ACE蛋白浓度,并且在一些方法中是25-300μg/mL。可替代地,ACE蛋白可以作为持续释放配制品施用,在这种情况下需要不太频繁的施用。剂量和频率根据ACE蛋白在患者体内的半衰期而变。通常,包含人源化抗体的抗体移植蛋白的半衰期比天然细胞因子更长。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。通常,对于预防性应用,在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者在其一生中继续接受治疗。通常,对于预防性应用,有时需要以相对较短的间隔用相对较高的剂量直至疾病进展减少或终止,并且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全缓解。此后,可以向患者施用预防性方案。
与第二试剂共同施用
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗在本披露中描述的所治疗的病症或障碍。这种施用涵盖以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂,如以具有固定比例的活性成分的单个胶囊施用。可替代地,这种施用涵盖在多个容器中或在每种活性成分的独立容器(例如,胶囊、粉末和液体)中共同施用。可以将粉末和/或液体在施用之前重构或稀释到所期望的剂量。此外,这种施用也涵盖在大致相同的时间或在不同的时间以依序方式使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下,治疗方案将在治疗本文所述的病症或障碍方面提供药物组合的有益作用。
组合疗法可提供“协同作用”并证明是“协同的”,即,当活性成分一起使用时实现的效果大于单独使用化合物所产生的效果的总和。当将活性成分为下述情形时可以获得协同效应:(1)共同配制并以组合的单位剂量配制品的形式同时施用或递送;(2)以单独配制品的形式交替或平行递送;或(3)通过一些其他方案进行。当以交替疗法递送时,可以在依序(例如通过在单独注射器中不同的注射)施用或递送化合物时获得协同效应。通常,在交替疗法期间,将有效剂量的每种活性成分依序地即顺次地施用,而在组合疗法中,将有效剂量的两种或更多种活性成分一起施用。
在一方面,本披露提供了一种通过向有需要的受试者施用与一种或多种酪氨酸激酶抑制剂组合的ACE蛋白来治疗癌症的方法,该一种或多种酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于EGFR抑制剂、Her2抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂和Met抑制剂。
例如,酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于盐酸埃罗替尼(erlotinib)利尼法尼(Linifanib)(N-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N′-(2-氟-5-甲基苯基)脲,也称为ABT 869,可购自基因泰克公司(Genentech));苹果酸舒尼替尼柏舒替尼(Bosutinib)(4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈,也称为SKI-606,并且描述于美国专利号6,780,996中);达沙替尼帕唑帕尼索拉非尼凡德他尼(ZD6474);尼洛替尼(nilotinib)瑞戈非尼(Regorafenib)和伊马替尼或甲磺酸伊马替尼(和)。
表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂包括但不限于盐酸埃罗替尼(erlotinib)吉非替尼N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3″S″)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺.);凡德他尼(Vandetanib)拉帕替尼(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514);二盐酸卡奈替尼(CI-1033);6-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯基乙基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(AEE788,CAS 497839-62-0);木利替尼(Mubritinib)(TAK165);培立替尼(EKB569);阿法替尼(BIBW2992);来那替尼(Neratinib)(HKI-272);N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-氨基甲酸,(3S)-3-吗啉基甲酯(BMS599626);N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊二烯并[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647,CAS 781613-23-8);和4-[4-[[(1R)-1-苯乙基]氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚(PKI166,CAS 187724-61-4)。
EGFR抗体包括但不限于西妥昔单抗帕尼单抗马妥珠单抗(EMD-72000);尼妥珠单抗(Nimotuzumab)(hR3);扎妥木单抗(Zalutumumab);TheraCIM h-R3;MDX0447(CAS 339151-96-1);和ch806(mAb-806,CAS 946414-09-1)。
人表皮生长因子受体2(HER2受体)(也称为Neu、ErbB-2、CD340或p185)抑制剂包括但不限于曲妥珠单抗帕妥珠单抗来那替尼(HKI-272,(2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2-基)甲氧基]苯基]氨基]-3-氰基-7-乙氧喹啉-6-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺,并且描述于PCT公开号WO 05/028443);拉帕替尼或二甲苯磺酸拉帕替尼(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514);(2E)-N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(BIBW-2992,CAS 850140-72-6);N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-氨基甲酸、(3S)-3-吗啉基甲酯(BMS 599626,CAS 714971-09-2);二盐酸卡奈替尼(PD183805或CI-1033);和N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647,CAS 781613-23-8)。
HER3抑制剂包括但不限于LJM716、MM-121、AMG-888、RG7116、REGN-1400、AV-203、MP-RM-1、MM-111、和MEHD-7945A。
MET抑制剂包括但不限于卡博替尼(Cabozantinib)(XL184,CAS 849217-68-1);氟列替布(Foretinib)(GSK1363089,以前称为XL880,CAS 849217-64-7);替万替尼(Tivantinib)(ARQ197,CAS 1000873-98-2);1-(2-羟基-2-甲基丙基)-N-(5-(7-甲氧基喹啉-4-基氧基)吡啶-2-基)-5-甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1H-吡唑-4-甲酰胺(AMG458);克唑替尼(PF-02341066);(3Z)-5-(2,3-二氢-1H-吲哚-1-基磺酰基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮(SU11271);(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-N-甲基-2-氧代吲哚啉-5-磺酰胺(SU11274);(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-{[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-甲基-2-氧代吲哚啉-5-磺酰胺(SU11606);6-[二氟[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-***并[4,3-b]哒嗪-3-基]甲基]-喹啉(JNJ38877605,CAS 943540-75-8);2-[4-[1-(喹啉-6-基甲基)-1H-[1,2,3]***并[4,5-b]吡嗪-6-基]-1H-吡唑-1-基]乙醇(PF04217903,CAS 956905-27-4);N-((2R)-1,4-二噁烷-2-基甲基)-N-甲基-N′-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-氧代-5H-苯并[4,5]环庚并[1,2-b]吡啶-7-基]磺酰胺(MK2461,CAS 917879-39-1);6-[[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-***并[4,3-b]哒嗪-3-基]硫代]-喹啉(SGX523,CAS 1022150-57-7);以及(3Z)-5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]磺酰基]-3-[[3,5-二甲基-4-[[(2R)-2-(1-吡咯烷基甲基)-1-吡咯烷基]羰基]-1H-吡咯-2-基]亚甲基]-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮(PHA665752,CAS477575-56-7)。
IGF1R抑制剂包括但不限于BMS-754807、XL-228、OSI-906、GSK0904529A、A-928605、AXL1717、KW-2450、MK0646、AMG479、IMCA12、MEDI-573和BI836845。参见例如,Yee,JNCI[国家癌症研究所杂志],104;975(2012)的综述。
在另一方面,本披露提供了一种通过向有需要的受试者施用与一种或多种FGF下游信号传导途径抑制剂组合的ACE蛋白来治疗癌症的方法,该一种或多种FGF下游信号传导途径抑制剂包括但不限于MEK抑制剂、Braf抑制剂、PI3K/Akt抑制剂、SHP2抑制剂、以及还有mTor抑制剂。
例如,促***原激活蛋白激酶(MEK)抑制剂包括但不限于XL-518(也称为GDC-0973、Cas号1029872-29-4,可从ACC集团(ACC Corp.)获得);2-[(2-氯-4-碘苯基)氨基]-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟-苯甲酰胺(也称为CI-1040或PD184352,并描述于PCT公开号WO2000035436);N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺(也称为PD0325901,并描述于PCT公开号WO 2002006213);2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(也称为U0126,并描述于美国专利号2,779,780);N-[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6-甲氧基苯基]-1-[(2R)-2,3-二羟基丙基]-环丙烷磺酰胺(也称为RDEA119或BAY869766,并描述于PCT公开号WO 2007014011);(3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(乙基氨基)-8,9,16-三羟基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氢-1H-2-苯并氧杂环四癸炔-1,7(8H)-二酮](也称为E6201,并描述于PCT公开号WO 2003076424);2′-氨基-3′-甲氧基黄酮(也称为PD98059,可从德国比亚芬股份有限公司(Biaffin GmbH&Co.,KG)获得);威罗菲尼(PLX-4032,CAS 918504-65-1);(R)-3-(2,3-二羟基丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯基氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮(TAK-733,CAS 1035555-63-5);匹玛舍替(Pimasertib)(AS-703026,CAS1204531-26-9);和二甲亚砜曲美替尼(GSK-1120212,CAS1204531-25-80)。
磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂包括但不限于4-[2-(1H-吲哚-4-基)-6-[[4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉(也称为GDC 0941并且描述于PCT公开号WO 09/036082和WO 09/055730);2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈(也称为BEZ 235或NVP-BEZ 235,并且描述于PCT公开号WO 06/122806);4-(三氟甲基)-5-(2,6-二吗啉代嘧啶-4-基)吡啶-2-胺(也称为BKM120或NVP-BKM120,并且描述于PCT公开号WO2007/084786中);托扎舍替(Tozasertib)(VX680或MK-0457,CAS 639089-54-6);(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮(GSK1059615,CAS 958852-01-2);(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基-环戊二烯并[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H)-三酮(PX866,CAS 502632-66-8);和8-苯基-2-(吗啉-4-基)-色烯-4-酮(LY294002,CAS 154447-36-6)。
mTor抑制剂包括但不限于坦罗莫司地磷莫司(ridaforolimus)(正式地称为deferolimus,(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯,也称为AP23573和MK8669,并且描述于PCT公开号WO03/064383中);依维莫司(或RAD001);雷帕霉素(AY22989,);塞马莫德(simapimod)(CAS 164301-51-3);(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055);2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502,CAS1013101-36-4);和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-(“L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸”披露为SEQ ID NO:3979)、内盐(SF1126,CAS 936487-67-1)。
在又又一方面,本披露提供了一种通过向有需要的受试者施用与一种或多种促凋亡剂组合的ACE蛋白来治疗癌症的方法,该一种或多种促凋亡剂包括但不限于IAP抑制剂、Bc12抑制剂、MCL1抑制剂、Trail剂、Chk抑制剂。
例如,IAP抑制剂包括但不限于NVP-LCL161、GDC-0917、AEG-35156、AT406、和TL32711。IAP抑制剂的其他实例包括但不限于WO 04/005284、WO 04/007529、WO 05/097791、WO 05/069894、WO 05/069888、WO 05/094818、US 2006/0014700、US 2006/0025347、WO 06/069063、WO 06/010118、WO 06/017295、和WO 08/134679中披露的那些。
BCL-2抑制剂包括但不限于4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(4-吗啉基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-[(三氟甲基)磺酰基]苯基]磺酰基]苯甲酰胺(也称为ABT-263,并描述于PCT公开号WO 09/155386);四制癌素A;抗霉素;棉酚((-)BL-193);奥巴妥拉(Obatoclax);乙基-2-氨基-6-环戊基-4-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧乙基)-4H色酮-3-甲酸酯(HA14-1);奥利默森(Oblimersen)(G3139,);Bak BH3肽;(-)-棉酚乙酸(AT-101);4-[4-[(4′-氯[1,1′-二苯基]-2-基)甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(二甲基氨基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰基]-苯甲酰胺(ABT-737,CAS 852808-04-9);和那维托克莱克斯(Navitoclax)(ABT-263,CAS 923564-51-6)。
促凋亡受体激动剂(PARA)包括DR4(TRAILR1)和DR5(TRAILR2),包括但不限于度拉纳明(Dulanermin)(AMG-951,RhApo2L/TRAIL);玛帕妥木单抗(Mapatumumab)(HRS-ETR1,CAS 658052-09-6);来沙木单抗(Lexatumumab)(HGS-ETR2,CAS 845816-02-6);Apomab西他土珠(Conatumumab)(AMG655,CAS 896731-82-1);和替加珠单抗(Tigatuzumab)(CS1008,CAS 946415-34-5,可购自第一三共株式会社(Daiichi Sankyo))。
检查点激酶(CHK)抑制剂包括但不限于7-羟基星形孢菌素(UCN-01);6-溴-3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-(3R)-3-哌啶基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(SCH900776,CAS891494-63-6);5-(3-氟苯基)-3-脲基噻吩-2-羧酸N-[(S)-哌啶-3-基]酰胺(AZD7762,CAS860352-01-8);4-[((3S)-1-氮杂二环[2.2.2]辛-3-基)氨基]-3-(1H-苯并咪唑-2-基)-6-氯喹啉-2(1H)-酮(CHIR 124,CAS 405168-58-3);7-氨基更生霉素(7-AAD)、Isogranulatimide、debromohymenialdisine;N-[5-溴-4-甲基-2-[(2S)-2-吗啉基甲氧基]-苯基]-N′-(5-甲基-2-吡嗪基)脲(LY2603618,CAS 911222-45-2);萝卜硫素(CAS4478-93-7、4-甲基亚磺酰基丁基异硫氰酸盐);9,10,11,12-四氢-9,12-环氧-1H-二吲哚[1,2,3-fg:3′,2′,1′-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氮芳辛-1,3(2H)-二酮(SB-218078,CAS 135897-06-2);和TAT-S216A(Sha等人,Mol.Cancer.Ther[分子癌症治疗学]2007;6(1):147-153),和CBP501。
在一方面,本披露提供了一种通过向有需要的受试者施用与一种或多种FGFR抑制剂组合的ACE蛋白来治疗癌症的方法。例如,FGFR抑制剂包括但不限于丙氨酸布立尼布(BMS-582664,(S)-((R)-1-(4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基氧基)丙烷-2-基)2-氨基丙酸酯);维加特(Vargatef)(BIBF1120,CAS928326-83-4);多韦替尼二乳酸(Dovitinib dilactic acid)(TKI258,CAS 852433-84-2);3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲(BGJ398,CAS 872511-34-7);达鲁舍替(Danusertib)(PHA-739358);和(PD173074,CAS 219580-11-7)。在一具体方面,本披露提供了一种通过向有需要的受试者施用与FGFR2抑制剂组合的抗体药物缀合物来治疗癌症的方法,所述FGFR2抑制例如3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-(6((4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)-1-甲基脲(也称为BGJ-398);或4-氨基-5-氟-3-(5-(4-甲基哌嗪1-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)喹啉-2(1H)-酮(也称为多韦替尼(dovitinib)或TKI-258)。AZD4547(Gavine等人,2012,Cancer Research[癌症研究]72,2045-56,N-[5-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙基]-2H-吡唑-3-基]-4-(3R,5S)-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺)、Ponatinib(AP24534;Gozgit等人,2012,MolCancer Ther.[分子癌症治疗学],11;690-99;3-[2-(咪唑[1,2-b]哒嗪-3-基)乙炔基]-4-甲基-N-{4-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-3-(三氟甲基)苯基}苯甲酰胺,CAS943319-70-8)。
ACE蛋白也可以与另一种细胞因子或ACE蛋白组合施用。在一些实施例中,细胞因子是与IL15受体或IL15/可溶性IL15Ra的sushi结构域连接的IL15、IL15-Fc、IL15。在一些实施例中,细胞因子是白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素11(IL-11)、睫状神经营养因子(CNTF)、制瘤素M(OSM)或白血病抑制因子(LIF)。
ACE蛋白也可以与免疫检查点抑制剂组合施用。在一个实施例中,可以将ACE蛋白与选自以下中一个或多个的免疫检查点分子的抑制剂组合施用:PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM3、CTLA-4、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR。在一个实施例中,免疫检查点分子抑制剂是抗PD-1抗体,其中所述抗PD-1抗体选自纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)或皮地利珠单抗(Pidilizumab)。在一些实施例中,抗PD-1抗体分子是纳武单抗。纳武单抗的替代性名称包括MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些实施例中,该抗PD-1抗体是纳武单抗(CAS登记号:946414-94-4)。纳武单抗是特异性阻断PD1的完全人IgG4单克隆抗体。在US 8,008,449和WO 2006/121168中披露了与PD1特异性结合的纳武单抗(克隆5C4)和其他人单克隆抗体。
在一些实施例中,抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗(也称为Lambrolizumab,MK-3475,MK03475,SCH-900475或默克公司(Merck)是与PD-1结合的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗和其他人源化抗PD-1抗体在Hamid,O.等人(2013)New EnglandJournal of Medicine[新英格兰医学杂志]369(2):134-44、US 8,354,509和WO 2009/114335中披露。
在一些实施例中,该抗PD-1抗体是匹地利珠单抗。匹地利珠单抗(CT-011;治疗科技公司(Cure Tech))是与PD1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。匹地利珠单抗和其他人源化抗PD-1单克隆抗体公开于WO 2009/101611中。
其他抗PD1抗体包括AMP 514(安普利穆尼公司),以及例如US 8,609,089、US2010/028330、和/或US 2012/0114649和US 2016/0108123中披露的抗PD1抗体。
在一些实施例中,可以将ACE蛋白与US 2015/0218274中所披露的抗Tim3抗体一起施用。在其他实施例中,可以将ACE蛋白与US 2016/0108123中所披露的抗PD-L1抗体、(MEDI4736)、(MPDL3280A)或或WO2016/061142中所披露的抗PD-L1抗体一起施用。
在一些实施例中,药理组合物包含抗体细胞因子移植蛋白和一种或多种另外的药理剂的混合物。与本发明抗体细胞因子移植蛋白的混合物中包括的示例性第二试剂包括但不限于抗炎剂、免疫调节剂、氨基水杨酸酯和抗生素。适当的选择可以取决于优选的配制品、剂量和/或递送方法。
在一些实施例中,将抗体细胞因子移植蛋白与抗炎剂共同配制(即,以混合物形式提供或以混合物形式制备)。在特定的实施例中,皮质类固醇抗炎剂可以与抗体细胞因子移植蛋白一起使用。所使用的皮质类固醇可以选自甲基***龙、氢化可的松、强的松、布***、美沙拉敏和***中的任何一种。适当的选择将取决于配制品和递送偏好。
在一些实施例中,将抗体细胞因子移植蛋白与免疫调节剂共同配制。在特定的实施例中,免疫调节剂选自6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、环孢菌素A、他克莫司和氨甲蝶呤中的任何一种。在特定的实施例中,免疫调节剂选自抗TNF剂(例如,英夫利昔单抗、阿达木单抗、西妥珠单抗、戈利木单抗)、那他珠单抗和维多珠单抗。
在一些实施例中,将抗体细胞因子移植蛋白与氨基水杨酸酯试剂共同配制。在特定的实施例中,氨基水杨酸酯选自柳氮磺胺吡啶、美沙拉敏、巴拉萨德、奥沙拉嗪或5-氨基水杨酸的其他衍生物。
在一些实施例中,将抗体细胞因子移植蛋白与抗细菌剂共同配制。示例性的抗细菌剂包括但不限于磺酰胺(例如,磺胺、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、磺乙酰胺)、甲氧苄啶、喹诺酮(例如,萘啶酸、西沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、司帕沙星、氟西沙星、培洛沙星、左氧氟沙星、加仑沙星和吉非沙星)、二甲胺、呋喃妥因、青霉素(例如,青霉素G、青霉素V、美西林、奥沙西林、氯沙西林、双氯西林、萘菲林、氨苄青霉素、阿莫西林、卡宾西林、替卡西林、美洛西林和哌拉西林)、头孢菌素(例如,头孢唑林、头孢氨苄、头孢曲氨酯、头孢西丁、头孢克洛、头孢丙嗪、头孢呋辛、头孢呋辛乙酰胺、氯苯甲酸酯、头孢替坦、头孢呋喃、头孢噻肟、头孢泊肟酯、头孢布丁、头孢丁烯、头孢地肟、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢噻肟、头孢地肟)、碳青霉烯(例如,亚胺培南、氨曲南)、和氨基糖苷(例如,新霉素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、和阿米卡星)。
实例
实例1:ACE蛋白构建体的产生
通过将细胞因子序列工程化到各种免疫球蛋白支架的CDR区中,生成ACE蛋白,然后使用免疫球蛋白链的重链和轻链生成最终的ACE蛋白。ACE蛋白赋予细胞因子优选的治疗特性;并具有另外的有益效果,例如延长的半衰期和易制性。
为了产生ACE蛋白,将成熟形式的细胞因子序列***免疫球蛋白链支架的CDR环中。表1列出了为ACE蛋白选择的细胞因子,并添加了IL2ACE分子。使用多种已知的免疫球蛋白序列制备ACE蛋白,所述免疫球蛋白序列以及种系抗体序列已用于临床环境。表2中描述了称为GFTX3b和GFTX的示例性支架中的细胞因子的序列。基于可用的结构或同源性模型数据,将***点选择为CDR环的中点。使用标准分子生物学方法、利用编码相关序列的重组DNA产生ACE蛋白。
选择哪些CDR用于细胞因子移植的选择基于以下参数:所需的生物学,生物物理特性和良好的发展概况。建模软件在预测哪个CDR和CDR中的哪个位置将提供所期望参数方面仅部分有用,因此要制造所有六种可能的抗体细胞因子移植物,并且然后在生物学分析中进行评估。如果实现了所需的生物学活性,则ACE分子与各自的细胞因子受体相互作用的性质得以解决。
对于ACE蛋白,最初解决了考虑用于细胞因子移植的抗体候选物的结构。由于移植技术,每种ACE蛋白都受到不同长度、序列和结构环境的CDR环的约束。这样,将每个细胞因子移植到所有六种CDR中,这六种CDR对应于HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3。
为了选择***点,选择了CDR环的结构中心,因为这将在两侧提供最大的空间(在相邻的一侧线性大小残基数),并且不受任何理论的约束,这通过使细胞因子更容易独立折叠,从而提供了稳定的分子。由于已知移植支架GFTX3b和GFTX的结构,因每个CDR的结构中心也是已知的。这通常与使用乔西亚编号格式定义的CDR环序列的中心重合。
总之,每个CDR的***点都是在结构基础上选择的,并且哪种CDR移植最适合细胞因子是基于所需的生物学和生物物理特性。细胞因子受体的性质、细胞因子/受体相互作用和信号传导机制也发挥了作用,并且这是通过比较每种单个抗体细胞因子分子各自的特性来研究的。
表1.
表2.
实例2:小鼠脾细胞中ACE蛋白的体外活性
从小鼠脾脏中分离细胞,并且将单细胞悬液添加到每个孔中。将每种IL7 ACE蛋白、重组人IL7或IL7-Fc分子添加至孔中,并在37℃下孵育30分钟。20分钟后,将细胞用Cytofix缓冲液(BD号554655)固定,洗涤并且用表面标记物染色。在室温下30分钟后,将样品洗涤,并且将重悬的细胞沉淀物用-20℃Perm缓冲液III(BD号558050)渗透,洗涤并且用pSTAT5 Ab(BD号612567)染色。在LSR Fortessa上获得细胞,并且用软件分析数据。将数据用软件绘图。
评估IL7 ACE蛋白对小鼠脾细胞在IL7Ra上的刺激。当与等摩尔量的重组人IL7(rec hIL7)以及结合至Fc部分的人IL-7相比时,所有IL7 ACE蛋白在CD8(图3A)和CD4(图3B)T细胞上均显示出IL7Ra途径的激活增加。因此,IL7的移植增加了细胞因子的效力。
实例3:IL7ACE蛋白在人PBMC中的体外活性
将PBMC细胞置于无血清测试培养基中,并将IL7 ACE蛋白或重组人IL7加入细胞中,并在37℃下孵育20分钟。20分钟后,将细胞用1.6%甲醛固定,洗涤并且用表面标记物染色。在室温下30分钟后,将样品洗涤,并且将重悬的细胞沉淀物用-20℃甲醇渗透,洗涤并且用pSTAT5 Ab(BD号612567)和DNA嵌入剂染色。在Cytof上运行细胞,并且用软件分析数据。
当与野生型支架或未刺激的细胞相比时,所有测试的分子,无论其形式如何,均可诱导在CD8和CD4 T细胞而非B细胞或NK细胞上激活IL7Ra途径(图4A)。此外,CD8(图4B)和CD4(图4C)T细胞均被重组hIL7或IL7 ACE蛋白IgG.IL7.H3和IgG.IL7.H2强烈激活,并且与所用浓度无关。因此,hIL7 ACE蛋白强烈刺激CD8和CD4人T细胞,而不刺激B细胞或NK细胞。
实例4:hIL7 ACE蛋白在C57Bl6小鼠中的体内活性
每天一次以不同的浓度向B6雌性小鼠施用hIL7、hIL7-Fc和IL7ACE蛋白,持续4天。上次治疗后一天(第5天),处理脾脏以获得单细胞悬液,并且在RPMI(10%FBS)中洗涤。用红细胞裂解缓冲液(西格玛公司(Sigma)号R7757)裂解红细胞,并且针对细胞数和活力对细胞计数。使用FACS缓冲液(1xPBS+0.5%BSA+0.05%叠氮化钠)在标准方案下进行FACS染色。将细胞用以下表面抗体染色:大鼠抗小鼠CD8-BUV737(BD生物科学公司(BD Biosciences)号564297)、大鼠抗小鼠CD19-PeCF594/TR(BD生物科学公司(BD Biosciences)号562291)、大鼠抗小鼠CD3-PerCP(博奇公司(Biolegend)号100218)、大鼠抗小鼠CD127-e450(ebioscience公司号48-1273-82)、大鼠抗小鼠CD4-BV510(BD生物科学公司(BDBiosciences)号563106)、大鼠抗小鼠CD44-BV711(BD生物科学公司(BD Biosciences)号563971)、大鼠抗小鼠CD62L-APC-Cy7(BD生物科学公司(BD Biosciences)号560514)、并且随后针对大鼠抗小鼠Ki-67-e660(ebioscience公司号50-5698-82)和根据抗小鼠/大鼠FoxP3 FITC染色套件的FoxP3(ebioscience公司号71-5775-40)进行固定/透化和染色。在BD LSR Fortessa或BD FACS LSR II上分析细胞,并且用软件分析数据。将数据用Prism软件绘图。
从测试的六种不同的IL7 ACE蛋白中,IgG.IL7.H3和IgG.IL7.H2持续增加CD8Ki67+ T细胞(图5A-B),以及每天IP施用持续连续4天后,效应记忆(CD44高 CD62L低)T细胞的频率(图5C-D)。IgG.IL7.H3和IgG.IL7.H2也持续增加CD4+ T细胞(数据未显示)。值得注意的是,IL7 ACE蛋白的摩尔量比用于实现相同的CD8+和CD4+ T细胞相对扩增的Fc融合IL7所使用的量低5倍。小鼠对所有的IL7 ACE蛋白都有很好的耐受性,并且未见不良反应。
实例5:IL7ACE蛋白在CT26同系小鼠肿瘤模型中的体内活性
CT26(ATCC)细胞是一种侵略性、未分化的人类结肠直肠癌细胞系,并且经常用于测试同系小鼠模型中分子的抗癌活性。使CT26细胞在具有5%CO2的37℃培育箱中在无菌条件下生长。在补充有10%FBS的RPMI 1640培养基中培养细胞。每3-4天使细胞进行传代。在注射日,在第11代收获细胞并且以2.5x106个/ml浓度重悬浮于HBSS中。对细胞进行针对支原菌及鼠类病毒的Radil测试。对于各小鼠,通过皮下注射使用28g针(100μl注射体积)将0.25x106个细胞植入右侧腹中。植入后,一旦肿瘤明显,每周3次对动物进行测径并称重。使用(LxWxW)/2计算卡尺测量值。根据实验动物的护理和使用指南和机构动物护理和使用委员会的规定,用正常饮食喂养小鼠并且圈养在SPF动物设施中。
当肿瘤达到约100mm3时,每周两次腹腔注射20-100μg的IL7-flag、IL7-Fc-融合物或IL7 ACE蛋白IgG.IL7.H3和IgG.IL7.H2,总共4剂。一周两次测量肿瘤。使用Prism 5(GraphPad)软件绘制平均肿瘤体积。当肿瘤大小达到1000mm3的体积时,达到了功效研究的终点。注射后,还密切监测小鼠的临床恶化迹象。监测小鼠的任何发病迹象,包括呼吸窘迫、驼背的姿势、活力下降、后腿麻痹、作为胸腔积液的迹象的呼吸急促、体重减轻接近20%或15%以及其他迹象,或者如果它们进行正常活动(进食,移动)。
最后一次治疗后1天(第13天),收集了脾脏和肿瘤。处理脾脏以获得单细胞悬液,并且在RPMI(10%FBS)中洗涤。用红细胞裂解缓冲液(西格玛公司(Sigma)号R7757)裂解红细胞,并且针对细胞数和活力对细胞计数。使用FACS缓冲液(1xPBS+0.5%BSA+0.05%叠氮化钠)在标准方案下进行FACS染色。将细胞用以下表面抗体染色:大鼠抗小鼠CD8-BUV737(BD生物科学公司(BD Biosciences)号564297)、大鼠抗小鼠CD19-PeCF594/TR(BD生物科学公司(BD Biosciences)号562291)、大鼠抗小鼠CD3-PerCP(博奇公司(Biolegend)号100218)、大鼠抗小鼠CD127-e450(ebioscience公司号48-1273-82)、大鼠抗小鼠CD4-BV510(BD生物科学公司(BD Biosciences)号563106)、大鼠抗小鼠CD44-BV711(BD生物科学公司(BD Biosciences)号563971)、大鼠抗小鼠CD62L-APC-Cy7(BD生物科学公司(BDBiosciences)号560514)、并且随后针对大鼠抗小鼠Ki-67-e660(ebioscience公司号50-5698-82)和根据抗小鼠/大鼠FoxP3 FITC染色套件的FoxP3(ebioscience公司号71-5775-40)进行固定/透化和染色。在BD LSR或BD FACS LSR II上分析细胞,并且用软件分析数据。将肿瘤固定在***中,并包埋石蜡,以针对小鼠CD8(eBioscience公司号14-0808-82)和小鼠CD4(艾博抗公司(Abcam)号ab183685)进行免疫组织化学染色。使用Matlab软件(MathWorks)定量阳性细胞的数量,用Prism软件绘制数据图。
在体内测试了ACE蛋白IgG.IL7.H3和IgG.IL7.H2针对CT26肿瘤的功效。当与等摩尔剂量的IL7标志蛋白或IL7-Fc融合物相比时,IgG.IL7.H2或IgG.IL7.H2的施用显著降低了肿瘤的生长(图6A)。在较低剂量下观察到相同的趋势(图6B)。此外,当与对照组相比时,4剂中最后一剂后一天,在用IgG.IL7.H3和IgG.IL7.H2治疗的小鼠中,效应记忆(CD44高/CD62L低)CD8+ T细胞的频率显著增加(图6C)。此外,当与对照组相比时,高剂量的IgG.IL7.H3和IgG.IL7.H2下,CD8和CD4+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的频率均增加(分别为图6D和6E)。因此,当与重组IL7相比时,ACE蛋白IgG.IL7.H3和IgG.IL7.H2显示增强的IL7活性,减小的肿瘤体积(作为单一药物)和增加的TIL数量。
实例6:离体衰竭模型中IL7 ACE蛋白的活性
对B6雌性小鼠静脉内(iv)感染2x106PFU淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)克隆13。感染后三周,收集脾脏并进行处理以获得单细胞悬液。使用EasySepTM StemCell B细胞去除试剂盒(Stemcell公司,剑桥,马萨诸塞州)去除B细胞后,在有(培养基+抗PD-L1)或在没有(培养基)的抗PD-L1抗体的情况下,将细胞与3种MHC-I和1种MHC-II LCMV特异性肽的混合物一起添加到RPMI(10%FBS)的孔中。24小时后通过ELISA测量INFγ,并且用Prism软件对数据作图。
ACE蛋白IgG.IL7.H3与抗PD-L1抗体协同增加了IFN-γ的产生。尽管相对于抗PD-L1治疗(DMSO),添加重组人IL7不会导致IFN-γ的产生进一步增加,但添加IgG.IL7.H3会导致IFN-γ的显著增加(图7)。因此,IL7 ACE蛋白能够在离体模型中恢复CD8+ T细胞的衰竭表型。
实例7:IgG.IL7.H3和IgG.IL7.H2的结构解析
图8是分别***Fab片段中的IgG.IL7.H2和IgG.IL7.H3的结构图。对于IgG.IL7.H3,图8证明通过将IL7移植到HCDR2或HCDR3中,IL7分子被暴露并可用于与IL7Ra结合,并且IgG序列不干扰。
实例8:抗体细胞因子移植蛋白的结合
将IL7序列***免疫球蛋白链支架的CDR环中。使用多种已知的免疫球蛋白序列制备抗体细胞因子移植蛋白,所述免疫球蛋白序列以及种系抗体序列已用于临床环境。使用的抗体之一具有RSV作为其靶抗原。为了确定将IL7移植到该抗体的CDR中是否减少了与RSV的结合,对PBS或碳酸盐缓冲液中的RSV蛋白进行了ELISA测定。如图9所示,这似乎受选择哪个CDR用于IL7移植的影响。例如,移植到重链CDR1(CDR-H1)的IL7具有与未移植(未经修饰)原始抗体相似的RSV结合。相反,将IL7移植到CDR2(CDR-H2)重链中和CDR-H3中会降低与RSV的结合。移植到轻链CDR3(CDR-L3)中的IL7几乎没有RSV结合。如所期望的,被移植到GFTX抗体中的靶向IgE的IL2不产生结合。这证明抗体细胞因子移植蛋白可以保持与抗体支架原始靶的结合,或者可以减少这种结合。
实例9:IL7抗体细胞因子移植蛋白在CD1小鼠中的体内药代动力学
向CD1雌性小鼠施用单剂量等摩尔量的IL7、IL7-Fc和IL7细胞因子移植蛋白,并通过Gyros测定在不同时间点在血清样品中测量IL7蛋白(图10)。将数据用Prism软件分析并绘图。
当与其他格式相比时,从测试的六种不同的IL7蛋白,IgG.IL7.H2显示出最佳的暴露(图10)。值得注意的是,重组人IL7的量仅在6小时后就低于定量限(LOQ),而Fc融合IL7在24小时后也是如此。所有的IL7抗体细胞因子移植蛋白均可测量到长达72小时。
实例10:体内T细胞衰竭模型中IgG.IL7.H2细胞因子移植蛋白的活性
对B6雌性小鼠静脉内(iv)感染2x106 PFU淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)克隆13。感染后三周,给小鼠施用单独的200μg的同型对照抗体,单独的100μg的IgG.IL7.H2,单独的200μg的抗PD-L1,或共同给药100μg的IgG.IL7.H2加200μg的抗PD-L1每周两次抗PD-L1,持续2周。最后一次给药后三天(第35天),分析了血液、脾细胞和肝脏。
处理脾脏以及血液以获得单细胞悬液,并且在RPMI(10%FBS)中洗涤。用红细胞裂解缓冲液(西格玛公司(Sigma)号R7757)裂解红细胞,并且针对细胞数和活力对细胞计数。使用FACS缓冲液(1xPBS+0.5%BSA+0.05%叠氮化钠)在标准方案下进行FACS染色。将细胞用以下表面抗体和四聚体分子染色:大鼠抗小鼠CD8-PerCP(BD生物科学公司(BDBiosciences)号553036)、大鼠抗小鼠CD19-APC-Cy7(BD生物科学公司(BD Biosciences)号560143)、大鼠抗小鼠KLRG1-BV421(BD生物科学公司(BD Biosciences)号560733)、大鼠抗小鼠CD127-PE-Cy7(BD生物科学公司(BD Biosciences)号560733)、大鼠抗小鼠CD4-BUV395(BD生物科学公司(BD Biosciences)号563790)、大鼠抗小鼠CD44-BUV737(BD生物科学公司(BD Biosciences)号564392)、大鼠抗小鼠CD62L-FITC(Tonbo号35-0621-U100)、大鼠抗小鼠CD366-APC(博奇公司(Biolegend)号119706)、大鼠抗小鼠CD279-BV605(博奇公司(Biolegend)号135219)、T-Select H-2Db LCMV gp33(C9M)四聚体-PE(MBL号TS-M512-1)和T-Select H-2Db LCMV gp276-286四聚体-BV421(MBL号TB-5009-4)。在BD LSR或BD FACS LSR II上分析细胞,并且用软件分析数据。将数据用软件绘图。
在给药IgG.IL7.H2抗体细胞因子移植蛋白时,在血液中观察到病毒特异性CD8+ T细胞的增加,而与抗PD-L1抗体的存在无关(图11)。在给药IgG.IL7.H2细胞因子移植蛋白时,在血液中初始、中枢记忆和效应记忆CD8+ T细胞总数也增加了,但单独的抗PD-L1时却没有(图13)。脾细胞的分析还显示了,IgG.IL7.H2抗体细胞因子移植蛋白单独或与抗PD-L1组合均可诱导另一个检查点分子Tim-3的减少(图12)。此外,给药IgG.IL7.H2细胞因子移植蛋白也可诱导CD8+PD-1+细胞增加,已知这是对PD-1阻断疗法的最佳反应(图14)。
IgG.IL7.H2细胞因子移植蛋白与抗PD-L1的结合的添加导致IFN-γ的显著增加(图16)。总之,这些数据表明,在体内模型中,IgG.IL7.H2抗体细胞因子移植蛋白还原了CD8+ T细胞的衰竭表型。肝脏中病毒RNA的分析表明,施用IgG.IL7.H2作为单一试剂能够降低病毒载量(图15)。抗PD-L1抗体以及IgG.IL7.H2和抗PD-L1抗体的组合可进一步降低病毒载量(图15)。
实例11:抗体细胞因子移植蛋白对Treg细胞显示更高的活性并且延长了半衰期
选择IgG.IL2D49A.H1和IgG.IL2.L3是因为它们比具有所期望的生物学作用(图17总结了相对变化)。这些影响包括:对Treg与Tcon和NK细胞上的IL-2R的选择性,小鼠中Treg与Tcon和NK细胞的半衰期延长。
在评估高亲和力IL-2受体刺激时,和IgG.IL2D49A.H1移植物在Treg细胞上均显示出相当的信号效力,但不像IgG.IL2D49A.H1对CD8 T效应细胞和NK细胞均显示降低至无活性。移植到CDRL3中的IL2(IgG.IL2.L3)在Treg上显示出比低的信号效力,但对NK细胞无活性。人外周血单核细胞(hPBMC)购自HemaCare公司,并且用IgG.IL2D49A.H1或IgG.IL2.L3进行体外测试,以评估对IL-2高亲和力受体的选择活性。将细胞置于无血清的测试培养基中,并且添加到每个孔中。将抗体细胞因子移植蛋白或天然人IL-2添加到孔中,并且于37℃孵育20分钟。20分钟后,按照制造商的说明书,将细胞固定,用表面标记物染色,透化并且用STAT5抗体(BD生物科学公司(BDBiosciences))染色。
仅1个剂量后,血浆中IgG.IL2D49A.H1或IgG.IL2.L3的药代动力学显示了超过的延长的半衰期。一次用或移植物治疗后8天,评估前期糖尿病NOD小鼠脾脏中的细胞扩增。在前期糖尿病小鼠中,IgG.IL2D49A.H1实现了超过T效应细胞和NK细胞的优异的Treg扩增,并且在前期糖尿病小鼠中耐受性优于图18显示了STAT5刺激,IgG.IL2D49A.H1和IgG.IL2.L3的PK/PD的总结。这表明抗体细胞因子移植蛋白不仅比具有更长的半衰期,而且可以刺激目标Treg细胞,而不会对T效应子和NK细胞产生不想要的刺激。
实例12:抗体细胞因子移植蛋白对Treg细胞显示出更高的活性
向前期糖尿病NOD小鼠施用等摩尔(每周3次)和不同的抗体细胞因子移植蛋白(每周1次)。第一治疗后八天,处理脾脏以获得单细胞悬液,并且在RPMI(10%FBS)中洗涤。用红细胞裂解缓冲液(西格玛公司(Sigma)号R7757)裂解红细胞,并且针对细胞数和活力对细胞计数。使用FACS缓冲液(1xPBS+0.5%BSA+0.05%叠氮化钠)在标准方案下进行FACS染色。将细胞用以下表面抗体染色:大鼠抗小鼠CD3-BV605(BD Pharmingen公司号563004)、大鼠抗小鼠CD4-Pacific蓝(BD Pharmingen公司号558107)、大鼠抗小鼠CD8-PerCp(BD Pharmingen公司号553036)、CD44 FITC(Pharmingen公司号553133)大鼠抗小鼠CD25-APC(Ebioscience公司号17-0251),并且然后根据抗小鼠/大鼠FoxP3染色套装PE(Ebioscience公司号72-5775)进行FoxP3固定/透化和染色。在BD LSR或BDFACS LSR上分析细胞,并且用软件分析数据。图19显示了作为绝对值的从每个脾脏算出的倍数和比例,将IgG.IL2D49A.H1和IgG.IL2D113A.H1与进行了比较。顶行显示了Treg细胞的扩增增加,而具有IgG.IL2D49A.H1的CD 8 T效应细胞或NK细胞却没有扩增。这与低剂量和较高剂量的相反,其导致所有细胞类型的扩增。
实例13:在体外,CD4 Tcon和CD8 Teff中IL-2R信号传导效力降低,但Treg中却没有降低
和IgG.IL2D49A.H1两者均在人和食蟹猴PBMC上进行了IL-2R的信号强度的体外测试。等摩尔IL2浓度的IgG.IL2D49A.H1和在表达高亲和力IL-2R的Treg细胞上显示相似的信号效力,但只有IgG.IL2D49A.H1对表达低亲和力IL-2受体的常规CD4和CD8 T效应细胞显示出降低的效力。在人和食蟹猴PBMC中均观察到了这些结果。为了进行测定,将PBMC细胞置于无血清的测试培养基中,并且添加到每个孔中。将IgG.IL2D49A.H1或添加到孔中,并且在37℃下孵育20分钟。20分钟后,按照制造商的说明书,将细胞固定,用表面标记物染色,透化并且用STAT5抗体(BD生物科学公司(BD Biosciences))染色。在BD LSR上分析细胞,并且用软件分析数据。
如图20所示的结果特别明显。在人和食蟹猴PBMC中,在Treg上发现通过IgG.IL2D49A.H1的pSTAT5激活,而在CD8 T效应子上却很少。
实例14:IgG.IL2D49A.H1在体外扩增功能的及稳定的Treg
针对Treg的改善的选择性伴随有功能作用。用IgG.IL2D49A.H1扩展的Treg是比扩展Treg等效的或更好的T效应子抑制剂。对于该测定,通过在Ficoll-Hypaque梯度(通用电气医疗集团(GE HealthCare)目录号17-1440-03)上离心从全血中纯化人PBMC。将PBMC用RBC裂解(Amimed公司目录号3-13F00-H)。使用EasySep CD4+ T细胞富集试剂盒(干细胞技术公司(StemCell Technologies)目录号19052)富集CD4+ T细胞。将富集的CD4+用V500抗CD4(克隆RPAT4)、PerCP-Cy5.5抗CD127(和APC抗CD25)染色,并且进行分选以分离CD4+CD127-CD25+自然调节性T细胞(nTreg)和CD4+CD127+CD25-T反应者(Tresp)。将分选的Treg重复铺板(1x105/100μl/孔)在装有培养基的96孔圆底微孔板中,并且在存在等摩尔IL2浓度的1或0.3nM 或IgG.IL2D49A.H1的情况下,以3:1微珠与细胞的比例用微珠刺激。在37℃下孵育24小时后,将孔重新充满100μl含有相同IL2浓度的培养基。在第3天,将培养物悬浮,分成两半,并且重新充满100μl含有相同IL2浓度的培养基。在第6天,与第3天一样处理培养物。在第8天,收获细胞,将其合并在试管中,并且将试管放在多级磁体上1-2分钟以除去珠子。收集含有细胞的上清液,并且在室温下以200g离心5分钟。然后对细胞计数,并且以约5x105/ml再次铺板在装有含有1/5原始IL2浓度的培养基的48孔平底微孔板中。休息2天后,收获细胞,计数并且分析或用于抑制测定。如在照制造商的说明书中所描述的,分别用0.8μM CT紫(生命科技公司(Life Technologies)目录号C34557)和1μM CFSE(生命科技公司(Life Technologies)目录号C34554)标记扩增的Treg和新鲜解冻的CD4+CD127+CD25-T反应者(Tresp)细胞。为了评估扩增的Treg的抑制特性,将3x104 CFSE标记的Tresp一式三份单独地或与CT紫标记的Treg(不同的Tresp:Treg比例)一起铺板,并且用Dynabead以1:8的珠与细胞比例(终体积为200μl/孔)刺激。4-5天后,收集细胞并且通过流式细胞术评估反应细胞的增殖。
与Tresp细胞相比,评估了新鲜Treg和扩增Treg中的甲基化状态。使用来自凯杰公司(Qiagen)(目录号80204)的DNA/RNA Mini从>5.00E+05细胞中分离基因组DNA(gDNA)。然后,使用来自西格玛公司(Sigma)的DNA修饰试剂盒(目录号MOD50)处理200ng的gDNA,以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶(而甲基化的胞嘧啶保持不变)。然后使用以下使用基于序列特异性探针的实时PCR对8ng亚硫酸氢盐转化的gDNA进行定量甲基化评估:EpiTectPCR+ROX(凯杰公司(Qiagen)目录号59496)、Epitect对照DNA(凯杰公司(Qiagen)目录号59695)、标准甲基化的(生命科技公司(LifeTechnologies),目录号12AAZ7FP)和未甲基化的(生命科技公司(Life Technologies),目录号12AAZ7FP)质粒、Treg特异性去甲基化区(TSDR)甲基化和未甲基化的正向和反向引物、以及探针(MicroSynth)。如EpiTectPCR手册中所述计算甲基化%。
图21以图形方式显示了用和IgG.IL2D49A.H1扩增的Treg稳定去甲基化Foxp3基因座。通过Foxp3表达和去甲基化,在体外用IgG.IL2D49A.H1扩增的人Treg是稳定的,这导致稳定的Treg细胞。实例15:用IgG.IL2D49.H1在体外人NK中降低的对IL-2R信号传导的效力
与等摩尔浓度下的相比,IgG.IL2D49A.H1在NK细胞中显示出降低的信号传导效力。将PBMC细胞置于无血清的测试培养基中,并且添加到每个孔中。将IgG.IL2D49A.H1或添加到孔中,并且在37℃下孵育20分钟。20分钟后,将细胞用1.6%甲醛固定,洗涤并且用表面标记物染色。在室温下30分钟后,将样品洗涤,并且将重悬的细胞沉淀物用-20℃甲醇渗透,洗涤并且用STAT5和DNA嵌入剂染色。在Cytof上运行细胞,并且用软件分析数据。结果显示在图22中,其中IgG.IL2D49A.H1对NK细胞几乎没有影响。相反,治疗增加了NK细胞的pSTAT5的活性,作为治疗的不期望的副作用。
实例16:评估IgG.IL2D49A.H1的药代动力学(PK)、药效学(PD)和毒理作用
食蟹猴中的IgG.IL2D49A.H1显示出超过T效应细胞的扩展的药代动力学、优异的Treg扩展,以及比低剂量更小的毒性。这项非临床实验室研究是根据诺华动物保护和使用委员会批准的通用方案编号TX 4039,用此方案和设施的标准操作程序(SOP)进行的。
在研究的第一天,向动物皮下施用IgG.IL2D49A.H1或在研究时以每个剂量水平从所有动物收集血液。在给药前第1天,给药后1小时、6小时和12小时,以及然后在第2、3、4、5、6、7、8、10、12天。将用于药代动力学和药效学的所有血液样品离心,并且获得血浆样品。将所得血浆样品转移到单个聚丙烯管中,并且冷冻在大约-70℃或更低的温度下。分析所有样品,并且使用免疫测定测量血浆中IgG.IL2D49A.H1和的浓度。计算药代动力学参数例如半衰期,并且通过FACS对细胞进行免疫表型分析以了解药效学。IL-2/IL-2 Gyros测定方案如下。每个样品一式两份运行,其中每个重复的分析都需要5μL的以1∶20稀释的样品。捕获抗体是山羊抗人IL-2生物素化抗体(R&D***公司(R&DSystems)BAF202),并且用Alexa 647抗人IL-2、克隆MQ1-17H12(生物传奇公司(Biolegend)500315)LOQ检测:0.08ng/ml,所有免疫测定均使用具有Gyros的Gyrolab进行。
图23显示了IgG.IL2D49A.H1和之间的对比。IgG.IL2D49A.H1的半衰期为12小时,而的半衰期为3小时。随着IgG.IL2D49A.H1的半衰期延长,Treg活性增加,嗜酸性粒细胞毒性大大降低。
单次施用后,与4小时的半衰期相比,IgG.IL2D49A.H1显示了约12小时的半衰期。初始CD-1动物经静脉或皮下给药,并且在给药前,给药后1小时、3、7、24、31、48、55和72小时从所有动物收集血液。将血液样品离心,并且获得血浆样品。将所得血浆样品转移到单个聚丙烯管中,并且冷冻在-80℃下。分析所有样品,并且使用免疫测定测量血浆中IgG.IL2D49A.H1的浓度。IL-2/IL-2 Gyros测定方案如下。每个样品一式两份运行,其中每个重复的分析都需要5μL的以1∶20稀释的样品。捕获抗体是山羊抗人IL-2生物素化抗体(R&D***公司(R&D Systems)BAF202),并且用Alexa 647抗人IL-2、克隆MQ1-17H12(生物传奇公司(Biolegend)500315)LOQ检测:0.08ng/ml,所有免疫测定均使用具有Gyros的Gyrolab进行。该测定扩展了实例16的半衰期确定。该测定的结果显示在图24中,其中IgG.IL2D49A.H1的半衰期确定为12-14小时,而与半衰期为4小时的相反。
实例18:在患有异种GvHD的小鼠中,人Treg扩增,但T效应子或NK细胞却没有
在异种GvHD模型中,IgG.IL2D49A.H1选择性地使Treg扩增超过T效应子或NK细胞,而则没有。通过腹膜内注射(HemaCare Corp公司),将来自健康供体的hPBMC注射到NOD-scid IL2Rγ无效小鼠(NSG)。注射后24小时,每周向动物给药IgG.IL2D49A.H11次/周或5次/周,持续研究期间。每周两次监测体重,持续研究期间。第一次给药后28天,每组收获四只小鼠,并且处理脾脏以获得单细胞悬液,并且在RPMI(10%FBS)中洗涤。用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞,并且针对细胞数和活力对细胞计数。使用FACS缓冲液(1xPBS+0.5%BSA+0.05%叠氮化钠)在标准方案下进行FACS染色。将细胞用表面抗体染色,并且然后根据抗小鼠/大鼠FoxP3染色套装PE(Ebioscience公司号72-5775)进行固定/通透和FoxP3染色。在BD LSR 上分析细胞,并且用软件分析数据。倍数和比例基于从每个脾脏绝对数计算出的相对数。图25显示,在该小鼠模型中,IgG.IL2D49A.H1比更好地扩增Treg细胞,并且还减少了Tcon和NK细胞的不期望的扩增。
当异种GvHD小鼠用IgG.IL2D49.H1治疗并且注射人PBMC(外来细胞)时,他们在治疗过程中保持正常体重。相反,用治疗的小鼠体重严重减轻。每周两次监测体重,持续研究期间,并且考虑登记时动物的初始体重来计算体重百分比。这种改善与该模型中IgG.IL2D49A.H1对Treg增强的影响有关,并且数据以图形方式示于图26中。该数据表明IgG.IL2D49A.H1和其他抗体细胞因子移植蛋白具有更大的治疗指数和安全范围。
实例19:IgG.IL2D49A.H1预防糖尿病的NOD小鼠模型中1型糖尿病的发展
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠自发发展为1型糖尿病,并且通常被用作人1型糖尿病的动物模型。将前期糖尿病NOD雌性动物通过腹膜内注射施用等摩尔(每周3次)和IgG.IL2D49A.H1(每周1次)。在研究期间(首次给药后4个月),每周两次监测小鼠的血糖和体重。图27显示经IgG.IL2D49A.H1治疗的小鼠维持低血糖值。这样,用IgG.IL2D49A.H1治疗的小鼠并未进展为明显的1型糖尿病(T1D)。相反,经治疗的小鼠开始具有低血糖值,但随着时间而升高,并且导致1型糖尿病症状。
与NOD小鼠模型中的3个剂量相比,在一剂的情况下,IgG.IL2D49A.H1显示优异的Treg扩增,更好的耐受性且无不良事件。将前期糖尿病NOD雌性动物通过腹膜内注射施用低剂量等摩尔(每周3次)和IgG.IL2D49A.H1(每周1次)。第一次给药后4天,每组取四只小鼠,并且处理脾脏以获得单细胞悬液,并且在RPMI(10%FBS)中洗涤。用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞,并且针对细胞数和活力对细胞计数。使用FACS缓冲液(1xPBS+0.5%BSA+0.05%叠氮化钠)在标准方案下进行FACS染色。将细胞用以下表面抗体染色:大鼠抗小鼠CD3-BV605(BD Pharmingen公司号563004)、大鼠抗小鼠CD4-Pacific蓝(BD Pharmingen公司号558107)、大鼠抗小鼠CD8-PerCp(BD Pharmingen公司号553036)、CD44 FITC(Pharmingen公司号553133)大鼠抗小鼠CD25-APC(Ebioscience公司号17-0251),并且然后根据抗小鼠/大鼠FoxP3染色套装PE(Ebioscience公司号72-5775)进行FoxP3固定/透化和染色。在BD LSR或BD FACS LSR上分析细胞,并且用软件分析数据。倍数和比例基于从每个脾脏绝对数计算出的相对数。在NOD小鼠模型中,单剂量IgG.IL2D49A.H1的施用显示比重复施用更大的Treg扩增,如图28所示。
实例21:有效剂量的IgG.IL2D49A.H1在NOD小鼠模型中的药代动力学
在1个剂量后长达48小时,血浆中测定了1.3mg/kg和0.43mg/kg的IgG.IL2D49A.H1的药代动力学。将前期糖尿病10周大的NOD小鼠腹膜内给药两种不同浓度的IgG.IL2D49A.H1,并且在给药后1小时,3、7、24和48小时从所有动物收集血液。将血液样品离心,并且获得血浆样品。将所得血浆样品转移到单个聚丙烯管中,并且冷冻在-80℃下。使用适用于Gyros平台的三种不同方法对每个样品进行分析以检测IgG.IL2D49A.H1血浆浓度:1)基于IL2的捕获和检测,2)基于IL2的捕获和基于hFc的检测,以及3)基于hFc的捕获和检测。
每个样品一式两份运行,其中每个重复的分析都需要5μL的以1∶20稀释的样品。Gyros IL-2/IL-2测定使用捕获山羊抗人IL-2生物素化抗体(R&D***公司(R&D Systems)BAF202),并且用Alexa 647抗人IL-2,克隆MQ1-17H12(生物传奇公司(Biolegend)500315)检测。对于IL-2/Fc检测,使用捕获山羊抗人IL-2生物素化抗体(R&D***公司(R&DSystems)BAF202),并且对于检测,使用Alexa 647山羊抗人IgG Fc特异性(杰克森免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)109-605-098)抗体。对于人Fc/Fc测定,使用捕获生物素化山羊抗人IgG,Fc特异性(杰克森免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)号109-065-098)。检测步骤使用了Fcγ特异性的Alexa 647山羊抗人IgG,Fcγ特异性(杰克森免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)号109-605-098)。所有免疫测定均使用具有Gyros CD-200s的Gyrolab 进行。如图29所示,此小鼠模型中的定量限(LOQ)为48小时。将其与和图30中的IL2-Fc融合蛋白进行比较。该图表明,抗体细胞因子移植蛋白(例如IgG.IL2D49.H1)的LOQ较高。
实例22:前期糖尿病NOD小鼠的剂量范围发现
当与在相同等摩尔浓度下的相比,IgG.IL2D49A.H1显示了超过CD4Tcon和CD8 T效应子的优异的Treg扩增。在最高的组中发现了不良事件例如死亡,并且在用任何剂量的IgG.IL2D49.H1治疗的小鼠中均未看到死亡率。
将前期糖尿病NOD雌性动物通过腹膜内注射施用低剂量等摩尔IL-2(每周3次)和IgG.IL2D49A.H1(每周1次)。在第一次给药后第8天,每组三只小鼠被安乐死并且收获脾脏。处理脾脏以获得单细胞悬液,并且在RPMI(10%FBS)中洗涤。收集血液,用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞,并且针对细胞数和活力对细胞计数。使用FACS缓冲液(1xPBS+0.5%BSA+0.05%叠氮化钠)在标准方案下进行FACS染色。将细胞用表面抗体染色,并且然后根据抗小鼠/大鼠FoxP3染色套装PE(Ebioscience公司号72-5775)进行固定/通透和FoxP3染色。在BDLSR 上分析细胞,并且用软件分析数据。比率基于从每个脾脏计算出的相对细胞数。此数据提供于图31中。该表提供了抗体细胞因子移植蛋白的剂量范围格式。这也证明了IgG.IL2D49A.H1具有比更高的治疗指数,因为在更大范围内给药均可良好耐受。相反,以较高剂量施用在小鼠中产生发病和死亡。
实例23:在人PBMC上的STAT5信号传导
在健康供体人PBMC以及来自自身免疫供体的PBMC中,IgG.IL2D49A.H1对Treg激活的选择超过Tcon和NK。在体用IgG.IL2D49.H1治疗后,Tcon中的STAT5信号传导的效力降低,但Treg却没有降低。将来自健康和自身免疫患者的人PBMC(Hemacare Corp公司)细胞置于无血清的测试培养基中,并且添加到每个孔中。将IgG.IL2D49A.H1添加到孔中,并且在37℃下孵育20分钟。20分钟后,按照制造商的说明书,将细胞固定,用表面标记物染色,透化并且用STAT5抗体(BD生物科学公司(BD Biosciences))染色。在BD LSR 上分析细胞,并且用软件分析数据。图32中的数据表明,对取自患有白癜风患者的PBMC进行IgG.IL2D49A.H1治疗,几乎没有NK、CD4 T con或CD8 T效应细胞的激活,同时保持Treg活性。在患有SLE和桥本氏病的患者的PBMC中也观察到了这一结果(数据未显示)。图33显示,取自患有1型糖尿病(T1D)的人患者的并且用IgG.IL2D49A.H1和治疗的PBMC具有对NK细胞、CD8 T效应细胞或CD4 Tcon细胞的大大降低的pSTAT5活性。由于IgG.IL2D49A.H1治疗在正常PBMC中有效,并且在取自T1D患者的PBMC中具有良好耐受,因此这表明即使患者正在接受胰岛素疗法,抗体细胞因子蛋白也可用于T1D的治疗。这表明在患有这些免疫相关障碍的患者中,IgG.IL2D49A.H1良好耐受,并且可以有效应对这些免疫相关障碍。
实例24:抗体细胞因子移植蛋白的结合
使用多种已知的免疫球蛋白序列制备抗体细胞因子移植蛋白,所述免疫球蛋白序列以及种系抗体序列已用于临床环境。使用的抗体之一具有RSV作为其抗原。为了确定将IL2移植到该抗体的CDR中是否减少或取消了与RSV的结合,对PBS或碳酸盐缓冲液中的RSV蛋白进行了ELISA分析。如图34所示,这似乎受哪个CDR选择用于IL2移植的影响。例如,IgG.IL2D49A.H1具有与未移植(未经修饰)原始抗体相似的RSV结合。相反,将IL2移植到CDR3(CDR-L3)轻链或CDR-H3中会降低结合。如所期望的,被移植到GFTX抗体中的靶向IgE的IL2不产生结合。这证明抗体细胞因子移植蛋白可以保持与抗体支架原始靶的结合,或者可以减少这种结合。
实例25:非人灵长类动物中Treg扩增
以两个单次上升皮下剂量向食蟹猴施用IgG.IL2D49A.H1,假设2个剂量组(3M/组)之间有4周的无给药间隔。这随后是两组的2周多剂量阶段(3M/组),这两组接受6次皮下剂量(隔两天一次,持续两周)的缓冲液或5mg/kg IgG.IL2D49A.H1。图35显示了从“单剂量阶段”(两次给药间隔29天)通过流式细胞术(免疫分型)评估的淋巴细胞群体的变化。在125和375μg/kg剂量下,观察到Treg绝对数量的3-4倍以及最多增加5.5倍增加,而对Tcon或NK细胞没有任何明显作用。在第4天看到最大Treg扩增,并且到第10天,Treg值恢复到接近基线。IgG.IL2D49A.H1安全且良好耐受,并且没有死亡,临床体征或体重、食物消耗、细胞因子水平或临床病理变化。此外,在高达2.4mg/kg的单次剂量或每隔一天以5mg/kg的多次给药持续两周后,在研究中未观察到心血管效应(ECG或血压)没有迹象表明血管渗漏或其他CV有关的发现。
实例26:IgG.IL2R67A.H1活性和延长的半衰期
含有R67A或F71A突变蛋白的IL2被移植到所有六个CDR中,这六种CDR对应于LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3和HCDR-1、HCDR-2和HCDR-3。图36的表中可以明显看出,抗体的细胞因子移植蛋白的活性不同,包括移植到CDR2的轻链中的IL2(GFTX3b-IL2-L2)不表达。还观察到,当将IL2移植到具有改变的Fc功能(例如,Fc沉默)的HCDR1中时,在扩增CD8+ T效应子上具有更好的生物学结果。
为了确定半衰期,初始CD-1小鼠腹膜内给药,并且在给药前,给药后1小时、3、7、24、31、48、55和72小时从所有动物收集血液。将血液样品离心,并且获得血浆样品。将所得血浆样品转移到单个聚丙烯管中,并且冷冻在-80℃下。分析所有样品,并且使用免疫测定测量血浆中IgG.IL2R67A.H1的浓度。计算药代动力学参数,例如半衰期。每个样品一式两份运行,其中每个重复的分析都需要5μL的以1∶20稀释的样品。捕获:山羊抗人IL-2生物素化抗体(R&D***公司(R&D Systems)BAF202)检测:Alexa 647抗人IL-2,克隆MQ1-17H12(生物传奇公司(Biolegend)500315)所有免疫测定均使用具有Gyros CD-200的Bioaffy200进行。如图37中的图所示,IgG.IL2R67A.H1的半衰期约为12小时,并且然后在接下来的48小时内减少。半衰期无法在此图上显示,因为其半衰期约为4小时。
IgG.IL2R67A.H1增强CD8 T效应子超过Treg,不会引起在施用的情况下所看到的不良事件。在第1天给小鼠给药后,在第4天,第8天和第11天监测CD8 T效应子的扩增。在每个时间点,CD8 T效应细胞群体都被大大扩增,而没有Treg扩增。这与和IL-2Fc融合物形成对比,其中在等摩尔剂量的IL-2下观察到死亡和发病。
在等摩尔浓度下,向B6雌鼠施用(5x每周)、IL-2 Fc和IgG.IL2R67A.H1(1x/每周)第一治疗后八天,处理脾脏以获得单细胞悬液,并且在RPMI(10%FBS)中洗涤。用红细胞裂解缓冲液(西格玛公司(Sigma)号R7757)裂解红细胞,并且针对细胞数和活力对细胞计数。使用FACS缓冲液(1xPBS+0.5%BSA+0.05%叠氮化钠)在标准方案下进行FACS染色。将细胞用以下表面抗体染色:大鼠抗-小鼠CD3-efluor 450(Ebioscience公司号48-0032)、大鼠抗-小鼠CD4-Pacific Blue(BD Pharmingen公司号558107)、大鼠抗-小鼠CD8-PerCp(BD Pharmingen公司号553036)、大鼠抗-小鼠CD44 FITC(Pharmingen公司号553133)、大鼠抗-小鼠CD25-APC(Ebioscience公司号17-0251)、大鼠抗-小鼠Nk1.1(Ebioscience公司号95-5941)和随后根据抗小鼠/大鼠FoxP3染色套装PE对FoxP3进行固定/透化和染色(Ebioscience公司号72-5775)。在贝迪公司(Becton-Dickinson)LSR或贝迪公司(Becton-Dickinson)FACS LSR分析细胞,并且用软件分析数据。
图38A-38C显示了在等摩尔浓度(IgG.IL2R67A.H1/IL2-Fc 100μg~1nmol IL2当量)下,施用(5x每周)、IL2-Fc和IgG.IL2R67A.H1(1x/每周)后,B6雌性小鼠中CD8 T效应细胞的优先扩增。图中的数据证明CD8 T效应细胞增殖而没有类似的Treg增殖。将该数据与进行对比,后者可以扩增CD8 T效应子和Treg。请注意,IgG.IL2R67A.H1在CD8 T效应细胞扩增的绝对数和在CD8 T效应细胞:Treg的比例均优于IL2-Fc融合构建体,证明存在IgG.IL2R67A.H1构建体的结构和功能基础。图38D-38F显示了在更高剂量下,IgG.IL2R67A.H1的有益作用更加明显。当向B6小鼠施用500μg(5nmol IL2当量)的IgG.IL2R67A.H1时,相对于与较低剂量相似的Treg细胞,可以看到CD8 T效应细胞的优先扩增。然而,在IL2-Fc治疗组中,在较高剂量下仅单次给药后发现小鼠死亡(数据未显示)。这表明IgG.IL2R67A.H1具有比IL2-Fc融合构建体更大的治疗指数,并且可以在更宽的剂量范围内安全施用。
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠自发发展为1型糖尿病,并且通常被用作人1型糖尿病的动物模型。使用实例27中所述的B6小鼠的相同方案,在等摩尔当量下,向NOD小鼠施用IgG.IL2R67A.H1、IL2-Fc和再次,以该剂量施用IgG.IL2R67A.H1优先扩增CD8 T效应细胞超过Treg,如图39A中的图所示。此外,施用IgG.IL2R67A.H1在NOD小鼠中未显示不良事件,然而治疗组具有5只垂死的小鼠和2例死亡。图39B是报告来自NOD小鼠模型的剂量、细胞倍数变化和细胞类型的图。
实例29:IgG.IL2R67A.H1显示了在CT26结肠肿瘤小鼠模型中的单次试剂功效
在研究IgG.IL2R67A.H1的安全性之后,在CT26小鼠模型中测试其单次试剂功效。鼠类CT26细胞系是快速生长的IV级结肠癌细胞系,已在500多个已发表的研究中使用,并且是药物开发中常用的模型之一。
使CT26(ATCC CRL-2638)细胞在具有5%CO2的37℃培育箱中在无菌条件下生长。在补充有10%FBS的RPMI 1640培养基中培养细胞。每3-4天使细胞进行传代。在注射日,将细胞收割(第11代)并且以2.5x106/ml浓度重悬浮于HBSS中。对细胞进行针对支原菌及鼠类病毒的Radil测试。使用Balbc小鼠。对于各小鼠,通过皮下注射使用28g针(100μl注射体积)将0.25x106个细胞植入右侧腹中。植入后,一旦肿瘤明显,每周3次对动物进行测径并称重。使用(LxWxW)/2计算卡尺测量值。根据实验动物的护理和使用指南和机构动物护理和使用委员会的规定,用正常饮食喂养小鼠并且圈养在SPF动物设施中。
当肿瘤达到约100mm3时,通过腹膜内途径施用小鼠12.5-100μg的IgG.IL2R67A.H1。一周两次测量肿瘤。使用Prism 5软件绘制平均肿瘤体积。当肿瘤大小达到1000mm3的体积时,达到了功效研究的终点。注射后,还密切监测小鼠的临床恶化迹象。如果出于任何原因,小鼠显示出任何发病迹象,包括呼吸窘迫、驼背的姿势、活力下降、后腿麻痹、作为胸腔积液的迹象的呼吸急促、体重减轻接近20%或15%以及其他迹象,或者如果它们进行正常活动(进食,移动)受损,则对小鼠实施安乐死。
在范围为12.5μg至100μg的剂量下,IgG.IL2R67A.H1在CT26小鼠模型中是有效的,其中在20天的研究中,在17天内4次施用IgG.IL2R67A.H1。图40中显示的肿瘤体积曲线表明IgG.IL2R67A.H1在这项研究中的功效,因为肿瘤体积会保持在200mm下持续15天,并且然后在400mm下持续其余5天。
实例30:IgG.IL2R67A.H1和另外的癌症疗法显示了在B16小鼠模型中的功效
为了评估IgG.IL2R67A.H1与其他癌症治疗剂组合的功效,使用了B16F10黑色素瘤小鼠模型。使B16F10细胞(ATCC CRL-6475)在具有5%CO2的37℃培育箱中在无菌条件下生长两周。将B16F10细胞在DMEM+10%FBS中培养。收获细胞,并且以1x106/100μl的浓度重悬浮于无FBS的培养基DMEM中。对B16F10细胞进行针对支原菌及鼠类病毒的Radil测试。使用28号针头(100μl注射体积)将细胞植入B6小鼠的右侧腹。植入后,一旦肿瘤明显,每周2次对小鼠进行测径并称重。使用(L x W x W)/2计算卡尺测量值。
在这项研究中,IgG.IL2R67A.H1被作为单一试剂或与TA99抗体、抗Trp1抗体组合使用,其中Trp1在B16F10细胞上高水平表达。IL2-Fc融合物作为单一试剂或与TA99抗体组合施用。作为对照,将TA99抗体作为单一试剂施用。
令人惊讶地的是,在该模型中以500μg剂量作为单一试剂施用时,IgG.IL2R67A.H1是最有效的治疗(图41)次好的治疗方法是IgG.IL2R67A.H1(100μg)和TA99的组合。这种组合比作为单一试剂的100μg下的IgG.IL2F71A.H1、与500μg下的IgG.IL2F71A.H1组合的TA99和作为单一试剂的IL2-Fc或IL2-Fc/TA99组合更有效。当TA99作为单一试剂施用时,没有作用,并且平均肿瘤体积与未治疗的对照组相似。该数据证明,IgG.IL2R67A.H1在黑色素瘤小鼠肿瘤模型中作为单一药剂是有效的,但是当与另一种抗癌剂配合时也是有效的。
实例31:IgG.IL2R67A.H1和IgG.IL2F71A.H1在人细胞中的活性
为了测试IgG.IL2R67A.H1对人CD8 T效应子的活性,测定了人外周血单核细胞(PBMC)的pSTAT5活性。将PBMC细胞置于无血清的测试培养基中,并且铺板。IgG.IL2R67A.H1、IgG.IL2F71A.H1或添加到PBMC,并且在37℃下孵育20分钟。20分钟后,将细胞用1.6%甲醛固定,洗涤并且用表面标志物染色。在室温下30分钟后,将样品洗涤,并且将重悬浮的细胞沉淀物用-20℃甲醇渗透,洗涤并且用pSTAT5和DNA嵌入剂染色。在上运行细胞,并且用FlowJoTM软件分析数据以定量pSTAT5活性水平。图42中的表格证明了IgG.IL2R67A.H1对人CD8 T效应细胞具有优先激活作用,并且使Treg细胞的激活最小化。
实例32:抗体细胞因子移植蛋白的结合
使用多种已知的免疫球蛋白序列制备抗体细胞因子移植蛋白,所述免疫球蛋白序列以及种系抗体序列已用于临床环境。使用的抗体之一具有RSV作为其抗原。为了确定将IL2移植到该抗体的CDR中是否减少或取消了与RSV的结合,对PBS或碳酸盐缓冲液中的RSV蛋白进行了ELISA分析。如图43所示,这似乎受哪个CDR选择用于IL2移植的影响。例如,IgG.IL2R67A.H1具有与未移植(未经修饰)原始抗体相似的RSV结合。相反,将IL2移植到CDR3(CDR-L3)轻链或CDR-H3中会降低结合。如所期望的,被移植到GFTX抗体中的靶向IgE的IL2不产生结合。这证明抗体细胞因子移植蛋白可以保持与抗体支架原始靶的结合,或者可以减少这种结合。
实例33:IL-6抗体细胞因子移植蛋白在人PBMC中的体外活性
CyTOF,基于FACS的方法,结合了大量细胞计数法,将流式细胞仪技术与飞行时间电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)结合在一起。它允许同时检测和定量来自单个细胞中的40多个参数。它利用针对特定细胞表面或细胞内分子的稀土金属缀合单克隆抗体。使用CyTOF,在通过pSTAT1、pSTAT3、pSTAT4和pSTAT5检测所评估的人PBMC中,对IL-6抗体细胞因子移植蛋白进行了体外信号传导研究。
以IL-6的摩尔当量,用同种型对照、IL-6移植物(IgG.IL-6.L2、IgG.IL-6.L3、IgG.IL-6.H2和IgG.IL-6.H3)或天然IL-6处理人PBMC持续30分钟。将细胞用1.6%PFA固定以保留信号传导分子上的磷酸化状态。然后将细胞用特定谱系的细胞表面受体和JAK/Stat途径的细胞内信号传导分子的组合染色。然后获得样品并在CyTOF上进行分析。结果表明,IL-6移植物具有与天然IL-6相似的生物活性(图44)。它们还通过相同的JAK/Stat途径在相似的细胞群(CD8和CD4 T细胞)上发出信号。
实例34:IL-6抗体细胞因子移植蛋白在C57Bl6 DIO小鼠中的体内活性
还对小鼠中的免疫细胞进行了CyTOF分析。对于小鼠体内研究,向C57/B16 DIO小鼠皮下给药一次5mg/kg的IgG.IL-6.L3、IgG.IL-6.H2和IgG.IL-6.H3,并与初始小鼠进行比较。在给药后第2次收集全血,并用1.6%PFA固定以保留信号传导分子上的磷酸化状态。然后将细胞用特定谱系的细胞表面受体和JAK/Stat途径的细胞内信号传导分子的组合染色。然后获得样品并在CyTOF上进行分析。
如图45中的图所示,如通过pSTAT1和pSTAT3水平所测量的,IL-6抗体细胞因子移植蛋白刺激了CD8和CD4 T细胞。如通过pSTAT3水平所测量的,还观察到单核细胞的刺激。
实例35:IL-6抗体细胞因子移植蛋白的药代动力学和药效学评估
在C57Bl/6 DIO小鼠中评估了抗体细胞因子移植蛋白的半衰期。皮下以0.5、2、5和10mg/kg(10ml/kg剂量体积)在0.9%盐水中注射抗体细胞因子移植蛋白,并在注射后2小时和注射后240小时开始取样血液。在每个时间点将全血收集到肝素处理过的试管中,并在4℃下以12,500rpm离心10分钟。收集血浆上清液并保存在-80℃直至收集所有时间点。使用三种不同的免疫测定方法测量血浆中抗体细胞因子移植蛋白的水平,以能够检测抗体细胞因子移植蛋白的IL-6和抗体结构域。第一项测定由内部生物素标记的山羊抗人IL-6捕获(R&D***公司(R&D Systems)AF-206-NA)和alexafluor 647山羊抗人IgG,Fcγ特异性检测(杰克森免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)号109-605-098)组成。第二项测定由生物素化的山羊抗人IgG,Fcγ特异性检测(杰克森免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)号109-065-098)和alexafluor647山羊抗人IgG,Fcγ特异性检测(杰克森免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)号109-605-098)组成。第三项测定由内部生物素标记的山羊抗人IL-6捕获(R&D***公司(R&D Systems)AF-206-NA)和内部alexafluor 647标记的抗人IL-6检测(R&D Duoset DY206-05部件号840113)。所有三项测定均在xP工作站(Gyros AB公司,乌普萨拉,瑞典)上运行。使用Gyros批准的向导方法在200nL CD(Gyros号P0004180)上运行该测定。所用的缓冲液是用于标准和样品稀释的(Gyros号P0004820)和用于检测制备的(Gyros号P0004825)。使用数据分析软件对结果进行分析。如图46A-B所示,IgG.IL-6.H2和IgG.IL-6.H3的半衰期为12-14小时,均比天然IL-6长。
与延长的半衰期一致,抗体细胞因子移植蛋白也证明了改善的药效学。皮下给药后,在靶组织(肌肉和脂肪)中监测磷酸STAT3(pSTAT3),IL-6激活的标志物。以0.1(10ml/kg剂量体积)在0.9%盐水中皮下注射抗体细胞因子移植蛋白IgG.IL-6.H2。注射后4小时收获末梢股四头肌和性腺脂肪(各1cm)。将肌肉和脂肪组织收集在含有500μl MSD裂解缓冲液(MSD公司(Meso Scale Discovery),号K150SVD-2,批号Z0055522)和钢珠(Qiagen,号69989)的试管中。通过组织裂解器在室温下以30rps将组织匀浆5分钟。将裂解的组织在4℃下以14,000xg离心10分钟。收集上清液,并保存在冰上直至磷酸STAT3测定。
在收集和处理组织的同一天运行磷酸Stat3测定板(Meso pSTAT3(Tyr705)测定)。使用Bradford测定(Pierce)进行组织上清蛋白检测。然后将蛋白以50μl/孔铺在STAT3磷酸测定板上。将板在室温孵育2小时,洗涤,并用磷酸STAT3或总STAT3抗体(MSD公司(Meso Scale Discovery))处理。在MSD Sector Imager 2400(MSD公司(Meso ScaleDiscovery))上分析板的相对荧光单位(RFU)。将蛋白质磷酸STAT3 RFU标准化为加载的蛋白浓度。给药后4小时在脂肪组织中检测到增强的pSTAT3信号,但在肌肉中未检测到(图47)。
实例36:IL-6抗体细胞因子移植蛋白在C57Bl6 DIO小鼠中的体内活性
对两个移植物进行了功效的剂量反应。在实验中,每天给C57/Bl6DIO小鼠皮下注射媒介物,5、10或20mg/kg的H2和H3型抗体IL-6移植蛋白。在给药后第1天和第13天的第2、6和24小时收集全血。在每个时间点将全血收集到肝素处理过的试管中,并在4℃下以12,500rpm离心10分钟。收集血浆上清液并保存在-80℃直至收集所有时间点。如上提交样品进行PK分析。每隔一天测量体重以监测体重减轻。每周进行一次NMR分析,以评估与初始正常饮食对照小鼠相比的体重组成。在第20天,给小鼠给药,然后禁食过夜。次日早晨,接受葡萄糖激发(20%葡萄糖1g/kg推注)。给药葡萄糖后20、40、60和120分钟使小鼠放血,并在血糖仪上测量血糖水平。
在移植物和所有剂量水平下均注意到体重和脂肪量的快速损失(图48A和48B)。对瘦肉部分的影响不太明显,可能会有给药反应(图48C)。随着时间,对瘦肉质量的影响似乎降低,而对脂肪减少的影响持续存在。
实例37:IL-6抗体细胞因子移植蛋白对C57Bl6 DIO小鼠的呼吸交换率(RER)的体内活性
设计了一项研究,以测试抗体细胞因子移植蛋白IgG.IL-6.H3对呼吸交换率的影响。每天给C57/Bl6 DIO小鼠皮下注射媒介物或5mg/kg的H3型抗体IL-6移植蛋白。在实验的第1-3天和第5-7天进行给药,而在Oxymax间接量热法笼中以第-1-1天,第3-5天和第7-9天的48小时增量来评估O2消耗和CO2产生,在此期间,小鼠保持不受干扰。每隔一天测量体重以监测体重减轻。呼吸交换率(RER)由所测量的O2消耗和CO2产生计算得出。
在实验组之间,给药前的RER相当(图49A)。相比之下,在第3-5天,相对于媒介物对照,在H3移植物给药的动物中,注意到RER明显减少,表明朝着脂肪利用的方向发展(图49B)。该差异由7-9标准化(图49C)。
实例38:在成对喂食的C57Bl6 DIO小鼠中IL-6抗体细胞因子移植蛋白对食物摄入的体内活性
设计了一项研究,以测试成对喂养模型中抗体细胞因子移植蛋白IgG.IL-6.H3对食物摄入的影响。每天给C57/Bl6 DIO小鼠皮下注射媒介物或5mg/kg的H3型抗体IL-6移植蛋白。在研究开始时称重食物,此后每天两次,以评估食物摄入量。成对喂食组从给药第二天开始,每天早晨和下午接受与给药组所消耗的一样多的食物。在给药的第1、3、5和7天进行NMR分析以评估体重组成。
给药H3抗体移植物的动物证明体重迅速减轻,到治疗第6天达到约15%的体重减轻(图50A)。这种作用伴随着食物摄入的显著减少,在给药的第3天达到最低点,随后逐渐增加到食物消耗的基线水平(图50B)。成对喂食的动物证明体重减轻程度与给药H3移植物的动物相似,表明通过移植的抗体治疗诱导的体重减轻很大程度上反映了食物摄入的减少(图50A)。在第7天,给药H3抗体移植物的动物和成对喂食的动物的体重的减轻伴随着总脂肪量的约30%-40%降低(图50C);相比之下,成对饲喂的但未给药H3抗体的动物中的瘦肉质量显著降低(图50D)。在给药H3抗体的动物或成对喂养的动物中,分离的胫骨前肌的重量均未显著降低(图50E)。
实例39:IL10抗体细胞因子移植蛋白的产生
通过将单体IL10序列工程化到各种免疫球蛋白支架的CDR区中,生成IL10 ACE蛋白,然后产生免疫球蛋白链的重链和轻链生成最终的蛋白构建体。IL10 ACE蛋白赋予IL10优选的治疗性抗炎特性;然而,如与rhIL10相比,IgGIL10M移植构建体具有降低比例的促炎活性。
为了产生抗体细胞因子移植蛋白,将包含全长IL10的残基19-178的残基在残基134和135之间具有六个氨基酸接头的单体IL10(IL10M)***免疫球蛋白链支架的各种CDR环中。使用多种已知的免疫球蛋白序列制备移植的构建体,所述免疫球蛋白序列以及种系抗体序列已用于临床环境。在两个示例性支架(称为GFTX和GFTX3b)中的IL10M序列,其中表2列出了GFTX ACE蛋白,表3列出了GFTX3b蛋白。基于可用的结构或同源性模型数据,将***点选择为CDR环的中点。使用标准分子生物学方法、利用编码相关序列的重组DNA产生抗体细胞因子移植蛋白。
例如,合成了***到六个CDR之一中的含有IL10M的每种抗体的可变区。经由PCR扩增编码可变区的DNA,并且将所得的片段亚克隆到含有轻链恒定区或重链恒定区和Fc区的载体中。以这种方式,对应于将IL10M***6个CDR(L1、L2、L3、H1、H2、H3)的每一个中,制备了IL10M抗体细胞因子移植蛋白。所得的构建体示于表2或表3中。重链和轻链载体的适当组合的转染导致带有两个移植的IL10M分子(每个Fab臂中一个IL10单体)的重组抗体表达。
选择哪些CDR用于细胞因子移植的选择取决于以下参数:所需的生物学、生物物理特性和良好的发展概况。此时,建模软件在预测哪个CDR和CDR中的哪个位置将提供所期望参数方面仅部分有用,因此要制造所有六种可能的抗体细胞因子移植物,并且然后在生物学分析中进行评估。如果实现了所需的生物学活性,则解决了抗体细胞因子移植分子的生物物理特性,例如结构分辨率。
通过将IL10移植到CDR中,抗体细胞因子移植蛋白的抗体部分呈现具有独特结构的IL10单体,该独特结构影响与IL10受体的结合,如下所述。由于抗体部分,没有脱靶效应。此外,抗体细胞因子移植蛋白的Fc部分已被修改为对ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)保持完全沉默。
总之,每个CDR的***点都是在结构基础上选择的,假设移植到CDR中会为IL10受体的单个亚基提供一定水平的空间位阻。哪种CDR移植物最适合特定的细胞因子的最后选择是基于所期望的生物学和生物物理特性。细胞因子受体的性质、细胞因子/受体相互作用和信号传导机制也发挥了作用,并且这是通过比较每种单个抗体细胞因子移植分子各自的特性来解决。例如,将IL10移植到轻链CDR1(CDRL1)中可产生所需的激活单核细胞的生物活性,但不会激活其他细胞(例如NK细胞)。在示例性抗体细胞因子移植蛋白IgGIL10M7和IgGIL10M13中可见到这一点。
表3.
实例39:抗体细胞因子移植蛋白具有抗炎活性
使用为支持临床中的rhIL10促炎活性而开发的测定(Lauw等人,J Immunol.[免疫学杂志]2000;165(5):2783-9),评估了人全血中IgGIL10M13的促炎活性。为了评估促炎活性,分析了抗体细胞因子移植蛋白在激活的原代人CD8 T细胞中诱导干扰素γ(IFNγ)或颗粒酶B的能力。发现如通过IFNγ产生所测量的,抗体细胞因子移植蛋白(例如IgGIL10M13)证明比重组人IL10(rhIL10)显著低的促炎活性。此数据示于图51A中。在测量颗粒酶B的测定(数据未显示)以及其他示例性抗体细胞因子移植蛋白(IgGIL10M7)中也发现了相似的结果。如与rhIL10相比,通过IgGIL10M13所证明的促炎活性明显降低,这表明它在治疗免疫相关障碍方面优于rhIL10,因为IgGIL10M13可以在更宽的剂量范围内施用。
为了检查抗炎活性,测试了抗体细胞因子移植蛋白和rhIL10在人全血中抑制LPS诱导的TNFα的能力。该数据示于图51B中,其中rhIL10或IgGIL10M13浓度的增加降低了TNFα的产生。请注意,rhIL10和IgGIL10M13曲线相似,表明这两种分子均具有有效的抗炎活性。
总之,这些结果显示出,抗体细胞因子移植蛋白具有与IL10类似的抗炎特性,但没有剂量限制和不想要的促炎特性。
实例40:IL10依赖性信号传导
在人PBMC和全血中进行的体外信号传导研究表明,当与rhIL10相比时,抗体细胞因子移植蛋白(例如IgGIL10M13)具有更特异性的信号传导谱。使用CyTOF(利用质谱的基于FACS的方法),通过pSTAT3检测评估了全血中多个不同细胞群体中抗体细胞因子移植蛋白信号传导(图52)。抗体细胞因子移植蛋白(例如IgGIL10M13)仅在高于μM浓度(高达1.8μM)的单核细胞、巨噬细胞和浆细胞样树突状细胞上诱导pSTAT3信号。已知所有这些细胞类型均具有增加的IL10受体表达。rhIL10在单核细胞上也可在另外的细胞类型(例如T细胞,B细胞和NK细胞)上诱导pSTAT3信号。即使在低nM的rhIL10浓度下也可以看到这一点。在以100nM浓度的rhIL10处理的全血中,在单核细胞和髓样树突状细胞上观察到最强的pSTAT3信号,另外具有中等程度的T、NK、B细胞和粒细胞激活。pSTAT3信号传导的功能后果导致从CD8 T细胞和NK细胞产生IFNγ和颗粒酶B的增加。响应于rhIL10信号传导,B细胞也有增殖。rhIL10在人全血中的这种促炎活性在暴露于高于抗炎IC90的小于5倍时观察到。抗体细胞因子移植蛋白(例如IgGIL10M13)的更具选择性的细胞谱导致促炎活性降低,从而导致更好的抗炎功效。
实例41:各种物种中的抗体细胞因子移植蛋白信号传导
rhIL10有效在人单核细胞,PBMC和全血中抑制LPS诱导的促炎性细胞因子产生。抗体细胞因子移植蛋白IgGIL10M13在靶细胞上表现出pM效力,尽管效力比rhIL10低10倍。表4是人全血以及选定毒性物种的全血中IL10或IgGIL10M13活性的效力比较。
效能计算基于来自小鼠、食蟹猴或人类的离体全血测定。对于每种测试的物种,滴定IgGIL10M13或rhIL10并评估其抑制LPS诱导的TNFα产生的能力。将IC50计算为引起总TNFα信号50%抑制的分子水平。考虑到每种测定的希尔斜率值,用以下公式计算IC90和IC30:logEC50=logECF-(1/HillSlope)*lob(F/100-F)),其中ECF是给出总TNFα信号的F%的响应的浓度。
表4.
实例42:抗体细胞因子移植蛋白药代动力学的评估
rhIL10半衰期短,限制了其靶组织的暴露,并要求患者进行多次给药。在C57Bl/6小鼠中评估了抗体细胞因子移植蛋白的半衰期。皮下以0.2mg/kg注射抗体细胞因子移植蛋白(例如IgGIL10M13),并从注射后5分钟直至注射后144小时开始取样血液。与具有约1小时半衰期的rhIL10(图53A)相比,IgGIL10M13具有显著的约4.4天的半衰期延长(图53B)。
实例43:抗体细胞因子移植蛋白药效学的评估
与延长的半衰期一致,抗体细胞因子移植蛋白也证明了改善的药效学。皮下给药IgGIL10M13后,在小鼠结肠中监测磷酸STAT3(pSTAT3),IL10受体激活和信号传导的标志物。在给药后至少72小时,在结肠中检测到增强的pSTAT3信号,而在给药后144小时不存在。参见图53C。与rhIL10相比,该特性有了显著改善,给药后24小时没有其信号。图53D描绘了如与rhIL10相比,如通过在抗体细胞因子移植蛋白给药后响应LPS激发抑制血液中的TNFa所测量的IgGIL10M13的体内反应的改善的持续时间。
实例44:抗体细胞因子移植蛋白在小鼠模型中的功效
直接比较了LPS激发后TNFα抑制的功效。给C57/BL6小鼠皮下给药媒介物或等摩尔水平的IL10(每只小鼠110nmol),针对重组IL10和IgGIL10M13进行计算。然后用腹膜内递送的LPS激发小鼠,以评估IL10依赖性TNFα水平的抑制。IgGIL10M13在0.5小时的初始评估期间显示出与rhIL10相当的功效,然而,在给药后长达至少48小时,如通过TNFα产生所测量的,IgGIL10M13维持优于rhIL10的功效。此数据示于图54中。
实例45:抗体细胞因子移植蛋白具有改善的暴露
在C57Bl/6小鼠中评估了抗体细胞因子移植蛋白的峰值血清浓度(Cmax)。皮下以0.2mg/kg(10ml/kg剂量体积)在0.9%盐水中注射抗体细胞因子移植蛋白,并在注射后1小时和注射后144小时开始取样血液。在每个时间点将全血收集到肝素处理过的试管中,并在4℃下以12,500rpm离心10分钟。收集血浆上清液并保存在-80℃直至收集所有时间点。使用两种不同的免疫测定方法测量血浆中抗体细胞因子移植蛋白的水平,以能够检测抗体细胞因子移植蛋白的IL10和抗体结构域。如图55所示,抗体细胞因子移植蛋白(例如IgGIL10M13)在100小时后保持大于60%Cmax。相反,rhIL10水平在3.5小时内降至20%Cmax以下。
实例46:抗体细胞因子移植蛋白仅作用于人类患者的某些细胞类型
如先前所述,CyTOF是在来自人类健康供体和患有克罗恩病的患者的免疫细胞上运行的。如图56中的图所示,IgGIL10M13仅刺激单核细胞,并且如通过pSTAT3水平所测量的刺激与rhIL10相当。单核细胞是炎症相关障碍(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)的靶细胞,并表达很高水平的IL10受体。然而,图56还显示了rhIL10的不想要的促炎作用,例如,对CD4T细胞、CD8 T细胞和NK细胞上的pSTAT3信号传导增加。值得注意的是,IgGIL10M13不会对正常人细胞或克罗恩病患者的细胞显示出这种不想要的促炎作用。这证明IgGIL10M13具有更大、更安全的治疗指数,因为施用抗体细胞因子移植蛋白质只会作用于所希望的细胞类型,而不会作用于其他细胞类型(例如CD8 T细胞),这只会加剧免疫相关障碍(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)。
实例47:与rhIL10相比,IgGIL10M13在PHA刺激的人全血中具有降低的促炎活性
尽管存在将遗传性IL10缺乏症与IBD易感性相关联的大量临床数据,但rhIL10在IBD临床试验中仅显示了轻度的功效(Herfarth等人,Gut[肠道]2002:50(2):146-147)。对试验数据的回顾性分析表明,rhIL10的功效受到其固有的促炎活性(例如增强的IFNγ产生)的限制。如前所述,在基于人功能细胞的测定中,rhIL10信号传导导致从T细胞和NK细胞产生IFNγ和颗粒酶B。
从患有克罗恩病的患者中抽取全血,并且在单独用rhIL10、IgGIL10M13和PHA刺激后测量IFNγ的水平。此数据示于图57-61中。rhIL10剂量的增加会导致IFNγ产生的急剧增加,然后达到稳定。相反,在用IgGIL10M13处理这些细胞时,几乎没有见到IFNγ的产生,这表明IgGIL10M13没有诱导或仅诱导从T细胞或NK细胞非常低水平的IFNγ产生。
用这些患者供体样品进行了另一个滴定实验。在该实验中,测量了来自供体患者血清中的IL10水平,并且发现其范围为1.5至5飞摩尔(fM),尽管科学文献已报道患者IL10水平可能高达20fM(Szkaradkiewicz等人,Arch.Immunol.Ther Exp[免疫档案与实验治疗]2009:57(4):291-294)。将rhIL10以固定浓度2飞摩尔(fM)、2pM、2nM和200nM的浓度施用于供体患者细胞。对于这些固定浓度的rhIL10,施用浓度增加的抗体细胞因子移植蛋白IgGIL10M13,并分析IFNγ的产生。此数据示于图62中。在2fM和2pM的固定浓度下,IgGIL10M13与rhIL10竞争,并将IFNγ的产生降低至基线水平。在2nM的固定浓度下,纳摩尔浓度的IgGIL10M13降低了IFNγ产生。最后,在200nM rhIL10的固定过量浓度下,仅见到极少的通过IgGIL10M13的IFNγ产生的减少。这表明在IL10的生理水平上,IgGIL10M13竞争优于IL10,从而降低了IFNγ的产生以及不想要的促炎作用。
实例48:抗体细胞因子移植蛋白的聚合特性
在IBD的临床试验中,观察到rhIL10的半衰期非常短;然而,鉴于这种分子的聚合特性,并未寻求与IL10二聚体简单的Fc融合以延长半衰期。图63显示了与Fc连接的IL10野生型和与Fc连接的IL10单体的聚合。然而,如图64所示,抗体细胞因子移植蛋白的抗体结构阻止了IL10聚合,从而促进了施用的容易性。此外,减少聚合具有减少针对治疗剂的免疫反应以及产生抗药物抗体的益处。
实例49:抗体细胞因子移植蛋白的保留结合
帕利珠单抗是抗RSV抗体,并且被选作细胞因子移植的抗体结构。该抗体具有已知结构的优点,并且因为其靶是RSV、非人靶。选择非人类靶是为了确保没有与脱靶人抗原结合的抗体细胞因子移植蛋白相关的毒性。尚不确定将IL10M移植到帕利珠单抗后,最终的IL10抗体细胞因子移植蛋白是否仍会结合RSV靶蛋白。如通过ELISA所测定的,尽管存在IL10M,但IL10抗体细胞因子移植蛋白仍与RSV靶蛋白结合。此数据示于图65中。
实例50:抗体细胞因子移植蛋白的结构构象导致跨细胞类型的差异活性
抗体细胞因子移植蛋白(例如IgGIL10M13)将单体IL10掺入抗体的轻链CDR 1中。在IL10的螺旋D和E之间***6个氨基酸的甘氨酸-丝氨酸接头使得正常异二聚体分子不能进行结构域交换二聚化。这样,将IL10M移植到抗体中导致具有2个单体IL10分子的抗体细胞因子移植蛋白。然而,由于抗体Fab臂的灵活性,IL10单体之间的角度和距离不固定,就像在野生型IL10二聚体中一样,因此影响了它与IL10R1/R2受体复合物的相互作用。这以图形方式示于图66中。具体而言,由于抗体移植,移植的IL10二聚体的角度更大且可变,从而如在促炎细胞类型如CD4和CD8 T细胞、B细胞和NK细胞上发现的,在IL10R1和R2的表达水平较低的情况下,使信号转导在细胞上效率较低。相反,抗体细胞因子移植蛋白在具有高IL-10R1和R2表达的细胞(如单核细胞)上更有效地发出信号。IgGIL10M13的类平均负染色EM研究强调了单体之间的额外灵活性和更宽的角度,证实了与rhIL10相比,几何形状发生了变化。IgGIL10M13中IL10二聚体的限制性较小的几何结构会改变其与IL10R复合物的相互作用。结果,IgGIL10M13抗体细胞因子移植蛋白的结构导致仅对具有高水平IL10R1和R2表达的细胞类型产生生产信号的生物学作用。
实例51:IgGIL10M13的晶体结构
IgGIL10M13 Fab在20mM HEPES pH 8.0、150mM NaCl中浓缩至16.2mg/ml,并且直接用于悬滴气相扩散结晶试验。通过将0.2μl蛋白质溶液与0.2μl储库溶液混合并针对50μl相同储库溶液进行平衡来设置结晶筛选。在20℃下3-4周后,从20%PEG3350、200mM乙酸镁(pH 7.9)的储液中出现了用于数据收集的晶体。在收集数据之前,将晶体浸泡在补充有20%乙二醇的储液中,并在液氮中快速冷却。
用ADSC Quantum 315R检测器在ALS光束线5.0.3处收集衍射数据。使用HKL2000软件包对数据进行索引和缩放(Otwinowski和Minor.(1997)Methods in Enzymology[酶学方法],276卷:Macromolecular Crystallography[大分子晶体学],部分A,第307-326页)。在空间组P21中将IgGIL10M13 Fab的数据处理为其中细胞维度 α=90°,β=115.3°,γ=90°。通过使用PHASER进行分子置换来解决结构(McCoy等人,(2007)J.Appl.Cryst.[应用结晶学杂志]40:658-674),其中帕利珠单抗Fab结构(PDB代码:2HWZ)和单体IL10结构(PDB代码:1LK3链A)作为搜索模型。顶部分子替换溶液在不对称单元中含有2个分子的IgGIL10M13 Fab。最终模型在COOT中构建(Emsley&Cowtan(2004)Acta Cryst.[晶体学报]D60:2126-2132),并用PHENIX进行了完善(Adams等人,(2010)Acta Cryst.[晶体学报]D66,213-221)。Rwork和Rfree值分别为18.8%和23.9%,其中与理想键长和键角的均方根(r.m.s)偏差值分别为和0.882°。
整体结构
用不对称单元中的2个分子结晶的IgGIL10M13 Fab都具有相似的构象。两个分子的电子密度图相似。总体结构(图67A)显示Fab和移植的单体IL10(IL10M)可以采用共线排列(白色的Fab轻链,黑色的Fab重链,深灰色的IL10M)。图67B显示了CDR-L1中的移植点的近视图。用深灰色棒显示了三个侧翼的CDR残基。虚线表示由于缺少电子密度,大概是由于这些区域中的结构灵活性而无法适合模型的结构部分。这两个区域在移植点之后在IL10M的N末端包括6个残基,以及在IL10M的螺旋4和5之间的8个残基,所述IL10M涵盖了***的6个残基接头。移植的IL10M分子和Fab重链部分之间还存在3对氢键相互作用(图67C)。这些包括R138和N104(侧链),R135和D56(侧链)以及N38和K58(主链/侧链)。
实例52:使用可替代的支架的ACE蛋白
最初使用GFTX3b,抗RSV抗体作为支架构建ACE蛋白。然而,ACE蛋白也可以使用GFTX和抗IgE抗体作为另外的支架构建。作为同型二聚体的天然IL10信号,在同一抗体“臂”中使用IL10构建了IL10 ACE蛋白。例如,将IL10移植到GFTX支架的可变重链(CDRH3)的第三CDR中,从而得到在抗体的两个CDRH3“臂”中具有IL10分子的ACE分子。此外,用可变轻链(CDRL1)的第一CDR中的IL10分子和CDRH3中的IL10分子构成ACE蛋白。这产生了具有移植到GFTX支架内的两个分开的且不同的位置的IL10细胞因子的ACE蛋白。将两种类型的GFTXACE蛋白与天然IL10细胞因子和IL10Fc融合蛋白进行了比较。
人全血是从斯克里普斯研究所正常献血者服务处获得的。全血捐献者是匿名的,但要求其不含抗炎药。采集后,准备测定时,分离前将全血在37℃下保持1小时。使用Lymphoprep密度梯度(STEMCELL公司,目录号07851,批号12ISf11)将15ml全血以10ml梯度分层,然后在室温下以800xG离心20分钟,不制动,将全血处理成PBMC。从密度梯度界面收集PBMC,并在培养基中洗涤两次。将其针对每个供体50ml血液重复。以2.2e6细胞/ml(在384孔板中以45ul体积中的100,000个细胞/孔)制备PBMC。
将GFTX构建体和rhIL-10(博奇公司(Biolegend))解冻并稀释至淋巴细胞培养基(RPMI 1640、10%FBS、50μM BME、10mM Hepes、0.1mM NEAA、1mM丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺、1X人胰岛素转铁蛋白硒、60mg/ml Pen/100mg/mlStrep)中的1000ng/mL[最终测定为100ng/mL]工作溶液。使用工作溶液作为起始浓度并针对培养基中的每个后续浓度进行1∶3稀释,准备了11点剂量滴定。制备LPS(100μg/ml储备液)并解冻,并在测定前置于冰上。
制备了滴定曲线。对于“无LPS”对照孔,将45μl/孔的PBMC分配到384孔板的各个孔中,并用培养基补足至50μl。对于LPS刺激,将LPS添加到50ml含有人PBMC的锥形杯中,至工作浓度为1.1ng/m1[在测定中最终为1ng/mL]。将PBMC和LPS充分混合,并且然后将45μl/孔分配到板上的指定孔中,然后分配5μl/孔的指定IL-10配制品。将测定板充分混合,并在37℃,5%CO2的培养箱中孵育20小时。
第二天,将测定板在室温以1400rpm混合离心5分钟。从每个孔中取出上清液(约10μl),并转移到384孔代理板上。对于HTRF分析,将针对TNFa的抗体在HTRF试剂盒(Cisbio公司,贝德福德,马萨诸塞州)中提供的重建缓冲液中以1∶40重构。然后将HTRF混合物添加到代用(proxy)孔(10μl/孔)中,并将代用板在黑暗中于室温孵育3小时。然后分析样品在665nm波长处的FRET。使用供体最低滴定结果作为基线,将每个供体的数据标准化。使用“无LPS”孔为每个供体计算LPS诱导。使用非线性回归分析数据以计算每个供体的IC50。
如图68所示,具有移植到同一CDR中的IL10的IL10抗体细胞因子蛋白(例如,CDRH1)显示出与重组人IL10(rhIL10)和IL-10Fc融合物(Fc野生型融合物或含有Fc沉默突变的融合物(LALA或DAPA))相似的IC50效力。相反,如图69所示,其中IL10移植到同一ACE蛋白中的不同CDR(例如CDRL1和CDRH1)中,与IL-10M Fc融合物(野生型Fc或DAPA Fc)相比,见到较低的IC50效力。
还构建了针对IL2的可替代的支架。与IL10相比,IL2可以充当单体,因此将IL2移植到相同的CDR(例如CDRL3)中,而则没有制造ACE蛋白,其中将IL2移植到同一抗体的不同CDR(例如CDRL3和CDRH1)中。
施用前期糖尿病NOD雌性动物低剂量的等摩尔IL2(每周5次)或IL2 ACE蛋白,其中通过腹膜内注射将IL2移植到CDRL3中(每周1次)。第一次给药后7天,每组取五只小鼠,处理脾脏以获得单细胞悬液,并且在RPMI(10%FBS)中洗涤。用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞,并且针对细胞数和活力对细胞计数。使用FACS缓冲液(1xPBS+0.5%BSA+0.05%叠氮化钠)在标准方案下进行FACS染色。将细胞用以下表面抗体染色:大鼠抗小鼠CD3-BV605(BDPharmingen公司号563004)、大鼠抗小鼠CD4-Pacific蓝(BD Pharmingen公司号558107)、大鼠抗小鼠CD8-PerCp(BD Pharmingen公司号553036)、CD44 FITC(Pharmingen公司号553133)大鼠抗小鼠CD25-APC(Ebioscience公司号17-0251),并且然后根据抗小鼠/大鼠FoxP3染色套装PE(Ebioscience公司号72-5775)进行FoxP3固定/透化和染色。在BD LSR或BD FACS LSR II上分析细胞,并且用软件分析数据。
如图70A所示,IL2 ACE蛋白(GFTXIL3_IL-2)比重组人IL2(hIL-2)更有效地扩增CD8+ T效应子。具有Fc沉默修饰的IL2 ACE蛋白(GFTXL3LALA_IL2)也比重组人IL2更有效地扩展CD8+ T效应子。图70B证明,IL2 ACE蛋白(GFTXIL3_IL-2)比重组人IL2(hIL-2)更有效地扩增CD4+ Treg细胞。对NK细胞的作用显示在图70C中,其中重组人IL2比具有或不具有Fc沉默突变的IL2 ACE蛋白更有效地扩增NK细胞。总之,该数据表明,使用不同的抗体支架,IL2 ACE蛋白可以是有效的。
实例53:ACE蛋白的细胞数据
CyTOF,基于FACS的方法,结合了大量细胞计数法,将流式细胞仪技术与飞行时间电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)结合在一起。它允许同时检测和定量来自单个细胞中的40多个参数。它利用针对特定细胞表面或细胞内分子的稀土金属缀合单克隆抗体。使用CyTOF,在通过pSTAT1、pSTAT3、pSTAT4和pSTAT5检测所评估的人PBMC中,对ACE蛋白进行了体外信号传导研究。
用用于ACE蛋白或相应ACE蛋白支架的野生型抗体处理人PBMC。如果可用,还包括天然细胞因子(例如,IL3)作为对照。将细胞用1.6%PFA固定以保留信号传导分子上的磷酸化状态。然后将细胞用特定谱系的细胞表面受体和JAK/Stat途径的细胞内信号传导分子的组合染色。然后获得样品并在CyTOF上进行分析。每种ACE蛋白的结果示于图71-100中。
实例54:诱导DC分化的Flt3L移植物
通过用完全RPMI培养基(10%FBS,Pen/Step,非必需氨基酸,丙酮酸钠,HEPES和β巯基乙醇)冲洗股骨和胫骨,分离来自C57/BL6小鼠的小鼠骨髓。通过离心沉淀骨髓,并且通过添加ACK裂解缓冲液(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)号A1049201)裂解红细胞。将细胞以2x106/mL在完全RPMI中用重组人Flt3L(派普泰克公司(Peprotech)号300-19-50UG)以10.53nM或摩尔当量剂量的H1、H3或L3人Flt3L移植物铺板,并在37℃下培养5天。通过移液收集细胞用于流式细胞检测分析,并用针对CD103(博奇公司(Biolegend)号121422)、CD11b(博奇公司(Biolegend)号101257)、CD11c(Biolegend号117306)、MHCII(博奇公司(Biolegend)号107628)、CD370(博奇公司(Biolegend)号143504)和B220(BD号552772)的抗体染色。使用FACS缓冲液(1xPBS+2%FBS+0.5mM EDTA)在标准方案下进行FACS染色。图101显示了,与用重组人Flt3L观察到的结果相比,H1、H3和L3 Flt3L移植物能够诱导B220+CD11c+浆细胞样DC分化(上图)和CD370+DC1分化(下图)。
实例55:诱导DC分化的GM-CSF移植物
使用阳性选择从白细胞分离术中分离人CD14+单核细胞(干细胞技术公司(Stemcell Technologies)号17858)。为了诱导单核细胞树突状细胞(DC)分化,在完整的RPMI(10%FBS、Pen/Step、非必需氨基酸、丙酮酸钠、HEPES和β巯基乙醇)中,在20ng/mL重组人IL-4(派普泰克公司(Peprotech)号200-04-100UG)和不同浓度的重组人GM-CSF(派普泰克公司(Peprotech)号300-03-100UG)或GM-CSF移植物存在下,一式两份培养细胞。将未移植的帕利珠单抗用作对照(移植支架对照)。
在37℃下培养6天后,收获细胞并染色以针对以下进行流式细胞检测分析:CD16(博奇公司(Biolegend)号302032)、HLA-DR(博奇公司(Biolegend)号307644)、CD86(博奇公司(Biolegend)号305414)、DC-SIGN(博奇公司(Biolegend)号330106)、CD24(博奇公司(Biolegend)号311134)、CD80(博奇公司(Biolegend)号305218)、CD40(博奇公司(Biolegend)号313008)、CD11c(eBioscience公司号56-0116-42)和CD14(BD号557831)。使用FACS缓冲液(1xPBS+2%FBS+0.5mM EDTA)在标准方案下进行FACS染色。
对于R848刺激,如上所述将细胞培养6天(3.9nM GM-CSF用于重组人GM-CSF和GM-CSF移植物)。洗去GM-CSF和IL-4培养基,并且将细胞与不同浓度的R848(内部产生的)在完全RMPI中孵育过夜。第二天早晨,如上所述将细胞染色以进行流式细胞检测分析。图102显示了GM-CSF细胞因子移植物能够诱导单核细胞DC分化,如通过细胞上DC-SIGN的上调和CD14的下调所证明的。图103显示了用GM-CSF移植物生成的单核细胞DC能够响应TLR7/8激活。
应理解,本文描述的实例和实施例用于举例说明目的,并且其各种修饰或改变对于本领域技术人员将是明了的,并且包括在本申请的精神和范围内和所附权利要求书的范围内。本文引用的所有公开物、序列登录号、专利和专利申请都出于所有目的以其全部内容而特此并入。
Claims (65)
1.一种ACE蛋白,其包含:
(a)重链可变区(VH),所述重链可变区包含互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2、HCDR3;和
(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3;和
(c)移植到所述VH或所述VL的CDR中的细胞因子分子,
其中将所述细胞因子分子直接移植到所述CDR中,并且其中所述细胞因子分子不是白细胞介素-10(IL-10)。
2.如权利要求1所述的ACE蛋白,其中所述细胞因子分子被移植到重链CDR中。
3.如权利要求2所述的ACE蛋白,其中所述重链CDR选自互补决定区1(HCDR1)、互补决定区2(HCDR2)和互补决定区3(HCDR3)。
4.如权利要求1所述的ACE蛋白,其中所述细胞因子分子被移植到轻链CDR中。
5.如权利要求4所述的ACE蛋白,其中所述轻链CDR选自互补决定区1(LCDR1)、互补决定区2(LCDR2)和互补决定区3(LCDR3)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的ACE蛋白,其中将所述细胞因子分子直接移植到没有肽接头的CDR中。
7.如权利要求1-6中任一项所述的ACE蛋白,其中所述细胞因子分子是选自表1的分子。
8.如权利要求1-7中任一项所述的ACE蛋白,所述ACE蛋白进一步包含IgG类抗体重链。
9.如权利要求8所述的ACE蛋白,其中所述IgG类重链选自IgG1、IgG2和IgG4。
10.如权利要求1-9中任一项所述的ACE蛋白,其中所述CDR与靶蛋白的结合特异性通过所移植的细胞因子分子降低。
11.如权利要求10所述的ACE蛋白,其中所述结合其中所述CDR与靶蛋白的结合特异性,通过所移植的细胞因子分子,降低了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。
12.如权利要求1-11中任一项所述的ACE蛋白,其中所述CDR与靶蛋白的结合特异性,在存在所移植的细胞因子分子的情况下得以保留。
13.如权利要求12所述的ACE蛋白,其中所述CDR与靶蛋白的结合特异性,在存在所移植的细胞因子分子的情况下,保留了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。
14.如权利要求1-13中任一项所述的ACE蛋白,其中所述CDR的结合特异性不同于所述细胞因子分子的结合特异性。
15.如权利要求14所述的ACE蛋白,其中所述CDR的结合特异性是针对非人抗原的。
16.如权利要求15所述的ACE蛋白,其中所述非人抗原是病毒。
17.如权利要求16所述的ACE蛋白,其中所述病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)。
18.如权利要求17所述的ACE蛋白,其中所述RSV选自RSV亚组A或RSV亚组B。
19.如权利要求1-18中任一项所述的ACE蛋白,其中所述ACE蛋白的抗体支架部分是人源化的或人的。
20.如权利要求1-19中任一项所述的ACE蛋白,其中与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子与受体的结合亲和力增加。
21.如权利要求1-20中任一项所述的ACE蛋白,其中与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子与受体的结合亲和力降低。
22.如权利要求1-21中任一项所述的ACE蛋白,其中与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子与受体的结合亲合力增加。
23.如权利要求1-22中任一项所述的ACE蛋白,其中与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子与受体的结合亲合力降低。
24.如权利要求1-23中任一项所述的ACE蛋白,其中与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子与两个或更多个受体的不同的结合亲和力(affinity)或亲合力(avidity)发生了变化。
25.如权利要求1-24中任一项所述的ACE蛋白,其中与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子的活性增加。
26.如权利要求1-25中任一项所述的ACE蛋白,其中与游离细胞因子分子相比,所移植的细胞因子分子的活性降低。
27.如权利要求1-26中任一项所述的ACE蛋白,其中所移植的细胞因子分子是表1中的分子。
28.一种ACE蛋白,其包含:
重链可变区,所述重链可变区包含:(a)HCDR1、(b)HCDR2和(c)HCDR3,其中所述HCDR序列中的每个在表2中列出,以及
轻链可变区,所述轻链可变区包含:(d)LCDR1、(e)LCDR2和(f)LCDR3,其中所述LCDR序列中的每个在表2中列出,
其中细胞因子分子被移植到CDR中。
29.一种ACE蛋白,其包含:
重链可变区(VH),所述重链可变区包含表2中列出的VH,以及
轻链可变区(VL),所述轻链可变区包含表2中列出的VL,
其中细胞因子分子被移植到VH或VL中。
30.如权利要求1-29中任一项所述的ACE蛋白,所述ACE蛋白进一步包含对应于降低的效应子功能的经修饰的Fc区。
31.如权利要求30所述的ACE蛋白,其中所述经修饰的Fc区包含选自D265A、P329A、P329G、N297A、L234A和L235A中的一个或多个的突变。
32.如权利要求31所述的ACE蛋白,其中所述经修饰的Fc区包含选自D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的一个或多个的突变的组合。
33.如权利要求32所述的ACE蛋白,其中所述Fc区突变为D265A/P329A。
34.一种分离的编码ACE蛋白的核酸,所述ACE蛋白包含:
表2中列出的重链可变区,以及
表2中列出的轻链可变区,
其中细胞因子分子被移植到所述重链可变区或所述轻链可变区。
35.一种适合于产生ACE蛋白的重组宿主细胞,所述重组宿主细胞包含如权利要求34所述的分离的核酸,以及任选地,分泌信号。
36.如权利要求35所述的重组宿主细胞,其是哺乳动物细胞系。
37.如权利要求36所述的重组宿主细胞,其中所述哺乳动物细胞系是CHO细胞系。
38.一种药物组合物,所述药物组合物包含如权利要求1-33中任一项所述的ACE蛋白,以及药学上可接受的载体。
39.一种在有需要的个体中治疗疾病的方法,所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的如权利要求38所述的药物组合物。
40.如权利要求39所述的方法,其中所述疾病是癌症。
41.如权利要求40所述的方法,其中所述癌症选自下组,所述组由以下组成:黑色素瘤、肺癌、大肠癌、***癌、乳腺癌和淋巴瘤。
42.如权利要求39-41中任一项所述的方法,其中所述药物组合物与另一种治疗剂组合施用。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述治疗剂是免疫检查点抑制剂。
44.如权利要求43所述的方法,其中所述免疫检查点选自下组,所述组由以下组成:PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM3、CTLA-4、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFR。
45.如权利要求44所述的方法,其中所述免疫检查点抑制剂是抗PD-L1抗体。
46.如权利要求44所述的方法,其中所述免疫检查点抑制剂是抗TIM3抗体。
47.如权利要求39所述的方法,其中所述疾病是免疫相关障碍。
48.如权利要求47所述的方法,其中所述免疫相关障碍选自下组,所述组由以下组成:炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病、急性胰腺炎、葡萄膜炎、斯耶格伦氏病、白塞病、结节病、移植物抗宿主病(GVHD)、***性红斑狼疮、白癜风、慢性预防性急性移植物抗宿主病(pGvHD)、HIV诱导的血管炎、斑秃、全身性硬化症和原发性抗磷脂综合征。
49.如权利要求39、47-48中任一项所述的方法,其中所述药物组合物与另一种治疗剂组合施用。
50.如权利要求49所述的方法,其中所述治疗剂是选自下组的抗TNF剂,所述组由以下组成:英夫利昔单抗、阿达木单抗、西妥珠单抗、戈利木单抗、那他珠单抗和维多珠单抗。
51.如权利要求49所述的方法,其中所述治疗剂是选自下组的氨基水杨酸酯试剂,所述组由以下组成:柳氮磺胺吡啶、美沙拉敏、巴拉萨德、奥沙拉嗪和5-氨基水杨酸的其他衍生物。
52.如权利要求49所述的方法,其中所述治疗剂是选自下组的皮质类固醇,所述组由以下组成:甲基***龙、氢化可的松、强的松、布***、美沙拉敏和***。
53.如权利要求49所述的方法,其中所述治疗剂是抗细菌剂。
54.ACE蛋白在治疗疾病中的用途,所述ACE蛋白包含:
重链可变区,所述重链可变区包含:(a)HCDR1、(b)HCDR2和(c)HCDR3,其中所述HCDR序列中的每个在表2中列出,以及
轻链可变区,所述轻链可变区包含:(d)LCDR1、(e)LCDR2和(f)LCDR3,其中所述LCDR序列中的每个在表2中列出,
其中细胞因子分子被移植到CDR中。
55.如权利要求54所述的用途,其中所述ACE蛋白与另一种治疗剂组合施用。
56.如权利要求54或55所述的用途,其中所述疾病是癌症。
57.如权利要求56所述的用途,其中所述治疗剂是免疫检查点抑制剂。
58.如权利要求57所述的用途,其中所述免疫检查点选自下组,所述组由以下组成:PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM3、CTLA-4、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFR。
59.如权利要求58所述的用途,其中所述免疫检查点抑制剂是抗PD-L1抗体。
60.如权利要求58所述的用途,其中所述免疫检查点抑制剂是抗TIM3抗体。
61.如权利要求54或55所述的用途,其中所述疾病是免疫相关障碍。
62.如权利要求61所述的用途,其中所述治疗剂是选自下组的抗TNF剂,所述组由以下组成:英夫利昔单抗、阿达木单抗、西妥珠单抗、戈利木单抗、那他珠单抗和维多珠单抗。
63.如权利要求61所述的用途,其中所述治疗剂是选自下组的氨基水杨酸酯试剂,所述组由以下组成:柳氮磺胺吡啶、美沙拉敏、巴拉萨德、奥沙拉嗪和5-氨基水杨酸的其他衍生物。
64.如权利要求61所述的用途,其中所述治疗剂是选自下组的皮质类固醇,所述组由以下组成:甲基***龙、氢化可的松、强的松、布***、美沙拉敏和***。
65.如权利要求61所述的用途,其中所述治疗剂是抗细菌剂。
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