JP2015508749A

JP2015508749A - アポトーシスシグナル調節キナーゼ阻害剤

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Publication number: JP2015508749A
Application number: JP2014554828A
Authority: JP
Inventors: グレゴリーノット，
Original assignee: ギリアードサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 2012-01-27
Filing date: 2013-01-24
Publication date: 2015-03-23
Anticipated expiration: 2033-01-24
Also published as: CA3026700A1; RS54492B1; EP2807151A1; PE20141822A1; IL233598A0; WO2013112741A1; US9333197B2; US20180099950A1; BR112014018355B1; MX365954B; US20140228411A1; KR20140117609A; KR20190000898A; AR089818A1; HUE028641T2; CN104080771B; IL233598A; TWI634890B; IL257965A; US9254284B2

Abstract

本発明は、式（Ｉ）の化合物に関する：該化合物は、アポトーシスシグナル調節キナーゼ（「ＡＳＫ１」）抑制活性を有し、したがって、腎疾患、糖尿病性腎症および腎線維症などの疾患の処置において有用である。別の実施形態では、本発明は、糖尿病性腎症、または糖尿病の合併症を処置する方法であって、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む方法である。別の実施形態では、本発明は、腎疾患、または糖尿病性腎疾患を処置する方法であって、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。

Description

発明の分野
本発明は、ＡＳＫ１媒介性疾患の処置における使用のための新規化合物に関する。本発明はまた、その調製のための中間体および上記新規化合物を含有する医薬組成物にも関する。

背景
アポトーシスシグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）は、ｃ−ＪｕｎＮ−末端タンパク質キナーゼ（「ＪＮＫ」）およびｐ３８ＭＡＰキナーゼを活性化する、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ（「ＭＡＰ３Ｋ」）ファミリーのメンバーである（Ｉｃｈｉｊｏ、Ｈ．、Ｎｉｓｈｉｄａ、Ｅ．、Ｉｒｉｅ、Ｋ．、Ｄｉｊｋｅ、Ｐ．Ｔ．、Ｓａｉｔｏｈ、Ｍ．、Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ、Ｔ．、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｋ．、Ｍｉｙａｚｏｎｏ、Ｋ．、およびＧｏｔｏｈ、Ｙ．（１９９７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５巻、９０〜９４頁）。ＡＳＫ１は、酸化ストレス、反応性酸素種（ＲＯＳ）、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、ＦａｓＬ、ＥＲストレス、および細胞内カルシウム濃度の増加を含めた様々な刺激により活性化される（Ｈａｔｔｏｒｉ、Ｋ．、Ｎａｇｕｒｏ、Ｉ．、Ｒｕｎｃｈｅｌ、Ｃ．、およびＩｃｈｉｊｏ、Ｈ．（２００９年）ＣｅｌｌＣｏｍｍ．Ｓｉｇｎａｌ．７巻：１〜１０頁；Ｔａｋｅｄａ、Ｋ．、Ｎｏｇｕｃｈｉ、Ｔ．、Ｎａｇｕｒｏ、Ｉ．、およびＩｃｈｉｊｏ、Ｈ．（２００７年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４８巻：１〜８．２７頁；Ｎａｇａｉ、Ｈ．、Ｎｏｇｕｃｈｉ、Ｔ．、Ｔａｋｅｄａ、Ｋ．、およびＩｃｈｉｊｏ、Ｉ．（２００７年）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０巻：１〜６頁）。

ＡＳＫ１タンパク質のリン酸化は、細胞型に応じて、アポトーシスまたは他の細胞応答を引き起こし得る。ＡＳＫ１活性化およびシグナル伝達は、神経変性障害、心血管障害、炎症性障害、自己免疫性障害、および代謝性障害を含めた広範囲の疾患において重要な役割を果たすことが報告されている。加えて、ＡＳＫ１は、心臓、脳、および腎臓の虚血および再灌流に続いて生じる器官損傷の媒介に関係している（Ｗａｔａｎａｂｅら、（２００５年）ＢＢＲＣ３３３巻、５６２〜５６７頁；Ｚｈａｎｇら、（２００３年）ＬｉｆｅＳｃｉ７４巻、３７〜４３頁；Ｔｅｒａｄａら、（２００７年）ＢＢＲＣ３６４巻：１０４３〜４９頁）。

ＲＯＳは、腎臓における炎症性サイトカインの産生、線維症、アポトーシス、およびネクローシスの増加に関連していることが報告されている。（ＳｉｎｇｈＤＫ、ＷｉｎｏｃｏｕｒＰ、ＦａｒｒｉｎｇｔｏｎＫ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｎｅａｒｌｙｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ：ｆｕｅｌｉｎｇｔｈｅｆｉｒｅ．ＮａｔＲｅｖＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ２０１１年３月；７巻（３号）：１７６〜１８４頁；ＢｒｏｗｎｌｅｅＭ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ、２００１年１２月１３日；４１４巻（６８６５号）：８１３〜８２０頁；ＭｉｍｕｒａＩ、ＮａｎｇａｋｕＭ．Ｔｈｅｓｕｆｆｏｃａｔｉｎｇｋｉｄｎｅｙ：ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｈｙｐｏｘｉａｉｎｅｎｄ−ｓｔａｇｅｒｅｎａｌｄｉｓｅａｓｅ．ＮａｔＲｅｖＮｅｐｈｒｏｌ、２０１０年１１月；６巻（１１号）：６６７〜６７８頁）。

さらに、酸化ストレスは、さらなる腎臓損傷およびＲＯＳの産生を引き起こす高度なグリケーション最終産物（ＡＧＥ）の形成を促進する。（ＨｕｎｇＫＹら、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎｐｒｅｖｅｎｔｓｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｃｏｌｌａｇｅｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｒａｔｍｅｓａｎｇｉａｌｃｅｌｌｓ．ＡｍＪＮｅｐｈｒｏｌ、２００９年；２９巻（３号）：１９２〜２０２頁）。

腎臓における尿細管間質性線維症は、慢性腎疾患を有する患者における、腎不全への進行の強い予測判断材料である（ＳｃｈａｉｎｕｃｋＬＩら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｉｎｒｅｎａｌｄｉｓｅａｓｅ．ＰａｒｔＩＩ：Ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ．ＨｕｍＰａｔｈｏｌ、１９７０年；１巻：６３１〜６４１頁）。ラットにおける片側尿管閉塞（ＵＵＯ）は、広く使用されている尿細管間質性線維症のモデルである。ＵＵＯは、尿細管間質性（ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔａｌ）炎症、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の発現の増加、および筋線維芽細胞の蓄積を引き起こし、これによって、マトリクスタンパク質、例えば、コラーゲンおよびフィブロネクチンを分泌する。ＵＵＯモデルを使用して、腎線維症を阻害することによって、慢性腎疾患を処置するための薬物の潜在能力を試験することができる（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、Ｕｒｅｔｅｒａｌｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｓａｍｏｄｅｌｏｆｒｅｎａｌｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓａｎｄｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、（２００９年）７５巻、１１４５〜１１５２頁）。

したがって、ＡＳＫ１シグナル伝達の阻害剤として機能する治療剤は、神経変性障害、心血管障害、炎症性障害、自己免疫性障害、および代謝性障害などの疾患または状態に対する処置を必要とする患者の生活を救済または改善する潜在能力を有する。特に、ＡＳＫ１阻害剤は、腎疾患、糖尿病性腎疾患、慢性腎疾患を含む心臓−腎疾患、線維性疾患（肺線維症および腎線維症を含む）、呼吸器疾患（慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および急性肺損傷を含む）、急性および慢性肝疾患を処置する潜在能力を有する。

米国公開第２００７／０２７６０５０号は、心血管疾患を予防および／または処置するのに有用なＡＳＫ１阻害剤を同定するための方法ならびに動物における心血管疾患を予防および／または処置するための方法について記載している。
ＷＯ２００９０２７２８３は、トリアゾロピリジン化合物、その調製のための方法ならびに自己免疫性障害、炎症性疾患、心血管疾患および神経変性疾患を処置するための方法を開示している。

２０１１年１月１３日に公開された、米国特許公開第２００１／０００９５４１０Ａ１号は、ＡＳＫ−１阻害剤として有用な化合物を開示している。米国特許公開第２００１／０００９５４１０Ａ１号は、式（Ｉ）の化合物に関する：
（式中、
Ｒ^１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、これらのすべては、ハロ、オキソ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アリールオキシ、−ＮＯ_２、Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^６、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^６ −Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−ＯＣ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−Ｓ−Ｒ^６、−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ^６、−Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ^６、−Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｏ−Ｒ^６、−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−Ｎ（Ｒ^６）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^７、−Ｎ（Ｒ^６）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ^７、−Ｎ（Ｒ^６）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−Ｎ（Ｒ^６）−Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｒ^６、−ＣＮ、および−Ｏ−Ｒ^６、から選択される１、２、または３つの置換基で必要に応じて置換されており、ここで、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、フェニル、およびフェノキシは、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、およびハロから選択される１、２、または３つの置換基で必要に応じて置換されており、
Ｒ^６およびＲ^７は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_１５アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から独立して選択され、これらのすべては、ハロ、アルキル、モノ−もしくはジアルキルアミノ、アルキルもしくはアリールもしくはヘテロアリールアミド、−ＣＮ、低級アルコキシ、−ＣＦ_３、アリール、およびヘテロアリールから選択される１〜３つの置換基で必要に応じて置換されているか、または
Ｒ^６およびＲ^７は、これらが付加している窒素と一緒になった場合、ヘテロ環を形成し、
Ｒ^２は、水素、ハロ、シアノ、アルコキシ、またはアルキル（ハロで必要に応じて置換されている）であり、
Ｒ^３は、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、これらのすべては、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ハロ、オキソ、−ＮＯ_２、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−ＣＮ、−Ｏ−Ｒ^６、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^６、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−Ｓ−Ｒ^６、−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ^６、−Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ^６、−Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｏ−Ｒ^６、−Ｎ（Ｒ^６）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^７、−Ｎ（Ｒ^６）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ^７、−Ｎ（Ｒ^６）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、および−Ｎ（Ｒ^６）−Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｒ^７、から選択される１つまたは複数の置換基で必要に応じて置換されており、
ここで、上記アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、ハロ、オキソ、−ＮＯ_２、アルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−ＣＮ、−Ｏ−Ｒ^６、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリル；から選択される１つまたは複数の置換基でさらに必要に応じて置換されており、
ただし、上記ヘテロアリールまたはヘテロシクリル部分は、少なくとも１個の環窒素原子を含むことを条件とし、
Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５、Ｘ^６、Ｘ^７およびＸ^８は、独立して、Ｃ（Ｒ^４）またはＮであり、ここで、各Ｒ^４は、独立して、水素、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ハロ、−ＮＯ_２、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−ＣＮ、−Ｏ−Ｒ^６、−Ｓ−Ｒ^６、−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ^６、−Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ^６、−Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｏ−Ｒ^６、−Ｎ（Ｒ^６）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^７、−Ｎ（Ｒ^６）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ^７、−Ｎ（Ｒ^６）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、または−Ｎ（Ｒ^６）−Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｒ^７、であり、ここで、上記アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、ハロ、オキソ、−ＮＯ_２、−ＣＦ_３、−Ｏ−ＣＦ_３、−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ^７、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ^６）（Ｒ^７）、−ＣＮ、−Ｏ−Ｒ^６から選択される１つまたは複数の置換基でさらに必要に応じて置換されており、または
Ｘ^５およびＸ^６もしくはＸ^６およびＸ^７は、一緒になることによって、必要に応じて置換されている縮合アリールもしくは必要に応じて置換されている縮合ヘテロアリールを提供し、
ただし、Ｘ^２、Ｘ^３、およびＸ^４のうちの少なくとも１つはＣ（Ｒ^４）であり、
Ｘ^５、Ｘ^６、Ｘ^７、およびＸ^８のうちの少なくとも２つはＣ（Ｒ^４）であり、
Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５、Ｘ^６、Ｘ^７およびＸ^８のうちの少なくとも１つはＮであることを条件とする）。

米国特許出願公開第２００７／０２７６０５０号国際公開第２００９０２７２８３号米国特許出願公開第２００１／０００９５４１０号

上記開示にもかかわらず、ＡＳＫ１活性化に関する疾患の処置のための、強力であり、改善された薬物動態学的および／または薬力学的プロファイルを示す化合物に対する必要性が存在する。

驚くことに、出願人らは、米国特許公開第２０１１／０００９４１０Ａ号の範囲内で、その中に開示されている化合物と比較した場合、概して良好な効力、改善された薬物動態学的および／または薬力学的プロファイルを示す、新規化合物を発見した。

発明の要旨
本発明は、式：
の化合物または薬学的に許容されるその塩に関する。

一実施形態では、本発明は、ＡＳＫ１阻害剤での処置を必要とする患者の疾患の処置における式（Ｉ）の化合物の使用に関する。

別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩と、１つまたは複数の薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物に関する。

別の実施形態では、本発明は、糖尿病性腎症、または糖尿病の合併症を処置する方法であって、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む方法である。

別の実施形態では、本発明は、腎疾患、または糖尿病性腎疾患を処置する方法であって、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、腎線維症、肺線維症、または特発性肺線維症（ＩＰＦ）を処置する方法であって、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、糖尿病性腎疾患、糖尿病性腎症、腎線維症、肝線維症、または肺線維症を処置する方法であって、式（ｆｏｒｕｍｉａ）（Ｉ）の化合物または塩の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物を合成するために有用な中間体に関する。

別の実施形態では、本発明は、慢性腎疾患の処置のための式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の使用に関する。

別の実施形態では、本発明は、糖尿病性腎疾患の処置のための式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の使用に関する。

別の実施形態では、本発明は、慢性腎疾患の処置のための医薬品の製造における、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の使用に関する。

さらに別の実施形態では、本発明は、治療における使用のための式（Ｉ）の化合物に関する。

図１は、７日間の片側尿管閉塞を被った、１日当たり１、３、１０、または３０ｍｇ／ｋｇのｂ．ｉ．ｄ．により、ビヒクルまたは式（Ｉ）の化合物のいずれかで処置したラットの腎臓皮質中のコラーゲンＩＶレベルを示す棒グラフである。

図２は、７日間の片側尿管閉塞を被った、１日当たり１、３、１０、または３０ｍｇ／ｋｇのｂ．ｉ．ｄ．により、ビヒクルまたは式（Ｉ）の化合物のいずれかで処置したラットからの、アルファ−平滑筋アクチン（活性化した筋線維芽細胞のマーカー）で染色した腎臓皮質切片の代表的な画像を示している。

定義および一般的パラメーター
本明細書で使用される場合、以下の単語および句は、これらが使用されている文脈が他を示す場合を除いて、以下に記述された意味を有することを意図する。いかなる指示や定義も与えられていない場合には、関連する辞書においてまたは当業者に公知の一般的用法において見出されるような単語または句の通常の意味が含まれる。

「慢性腎疾患」という用語は、本明細書で使用される場合、通常数カ月または数年の経時的な腎機能の進行性消失を指す。慢性腎疾患（ＣＫＤ）は、当業者に公知の適当な情報、試験またはマーカーを使用して、適格な介護者により診断される。慢性腎疾患は、暗示的に腎疾患を含む。

「糖尿病性腎疾患」という用語は、本明細書で使用される場合、糖尿病が原因となって引き起こされる、糖尿病により増悪する、または糖尿病と共存する腎疾患を指す。糖尿病性腎疾患は、糖尿病患者のほぼ３０％に生じる慢性腎疾患の形態である。糖尿病性腎疾患は、タンパク尿の存在および／または損なわれた腎機能（すなわち糸球体濾過速度の低減）を有する糖尿病として定義されている（ｄｅＢ、Ｉら、ＴｅｍｐｏｒａｌｔｒｅｎｄｓｉｎｔｈｅｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｋｉｄｎｅｙｄｉｓｅａｓｅｉｎｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ．ＪＡＭＡ、２０１１年６月２２日；３０５巻（２４号）：２５３２〜２５３９頁を参照されたい）。

「薬学的に許容される塩」という用語は、生物学的有効性および基礎となる化合物の特性を保持し、生物学的にまたは他の点で不適切ではない薬学的化合物、例えば式（Ｉ）の化合物の塩を指す。酸付加塩および塩基付加塩が存在する。薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸から調製することができる。

薬学的に許容される塩（それぞれ酸付加塩または塩基付加塩）を形成するための、基礎となる化合物との反応のために有用な酸および塩基は当業者には公知である。同様に、基礎となる化合物（開示による）から薬学的に許容される塩を調製する方法は当業者には公知であり、例えば、Ｂｅｒｇｅら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ、１９７７年１月、６６巻、１号、および他の出典において開示されている。無機酸から誘導される塩として、これらに限定されないが塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。有機酸から誘導される塩として、これらに限定されないがマレイン酸、フマル酸、酒石酸、ｐ−トルエン−スルホン酸などが挙げられる。塩基付加塩を形成するのに有用な塩基は当業者には公知である。式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩の例は、式（Ｉ）の化合物の塩酸塩である。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容されるキャリア」として、本発明の化合物またはその使用に対して有害ではない、賦形剤または作用物質、例えば、溶媒、希釈剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的活性物質の組成物を調製するためのこのようなキャリアおよび作用物質の使用は当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＭａｃｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版（１９８５年）；およびＭｏｄｅｒｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．第３版（Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ＆Ｃ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編）を参照されたい。）

「心臓−腎疾患」という用語は、本明細書で使用される場合、心血管の問題、例えば、高い血圧または高血圧症などにより引き起こされるまたは増悪する腎臓の機能に関する疾患を指す。高血圧症は腎疾患の主要な原因因子と考えられている。

「呼吸器疾患」という用語は、本明細書で使用される場合、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および特発性肺線維症（ＩＰＦ）を含む疾患を指す。

「治療有効量」という用語は、１回または複数回の用量で、このような処置を必要とする患者（特にヒト）に投与された場合、以下に定義されるような処置を実行するのに十分な式（Ｉ）の化合物の量を指す。治療有効量は、資格のある処方者もしくは介護者により決定されるとおり、患者、処置している疾患、患者の体重および／もしくは年齢、疾患の重症度、または投与方式に応じて異なる。

「処置」または「処置する」という用語は、以下の目的のために、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容される塩を投与することを意味する：
（ｉ）疾患の発現を遅らせる、すなわち、疾患の臨床症状を発症しないようにさせる、もしくはその発症を遅らせること；
（ｉｉ）疾患を阻害する、すなわち、臨床症状の発症を止めること；および／または
（ｉｉｉ）疾患を緩和する、すなわち、臨床症状もしくはその重症度の後退を引き起こすこと。

好ましい実施形態では、本発明は、慢性腎疾患の処置における式（Ｉ）の化合物の使用であって、それを必要とする患者に治療有効量を投与することを含む、使用に関する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、糖尿病性腎疾患の処置における式（Ｉ）の化合物の使用であって、それを必要とする患者に治療有効量を投与することを含む、使用に関する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、肺線維症または腎線維症の処置における式（Ｉ）の化合物の使用であって、それを必要とする患者に治療有効量を投与することを含む、使用に関する。

治療剤の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）とは、標的酵素に対する最大阻害の５０％を生じさせるのに必要な治療剤の濃度である。治療剤、例えば、低いＩＣ_５０でアポトーシスシグナル調節キナーゼ（ＡＳＫ１）を阻害する化合物を発見することが、望ましい目標である。このように、望ましくない副作用は、ＡＳＫ１酵素を阻害するのにより低い用量の治療剤を使用することができることによって最小限に抑えられる。

同様に、低い解離定数（Ｋ_ｄ）を有する治療剤を発見することが望ましい目標である。Ｋ_ｄを使用して、リガンド（例えば、治療剤）と、対応するキナーゼまたは受容体との間の親和性を記載する；すなわち、Ｋ_ｄは_、治療剤がある特定のキナーゼ、例えばアポトーシスシグナル調節キナーゼＡＳＫ１にどれだけしっかりと結合するかの尺度である。したがって、より低いＫ_ｄは一般的に薬物開発において好ましい。

同様に、低いＥＣ_５０を有する化合物を発見することが望ましい目標である。ＥＣ_５０は、細胞において最大効果の５０％を達成する薬物の濃度である。ＥＣ_５０値は、言い換えると、最大効果の５０％を達成するのに必要なアッセイ媒体中の化合物の濃度である。したがって、より低いＥＣ_５０は薬物開発のために一般的に好ましい。

ＥＣ_５０に関連する有用な測定単位は、タンパク質結合で調整したＥＣ_５０（本明細書で使用される場合ＰＢ_ａｄｊ．ＥＣ_５０）である。この値は、最大効果の５０％を提供する、タンパク質に未結合の薬物の画分と相関する薬物の量、例えば式（Ｉ）の化合物の量を測定する。この値は、標的作用部位で利用可能な薬物の量に対して補正された、またはこれと相関する薬物の効能を測定する。

別の望ましい特性は、ＣＡＣＯ細胞透過性実験で決定した細胞膜流出比が低い化合物を有することである。流出比（（Ｂ／Ａ）／（Ａ／Ｂ））３．０未満が好ましい。３を超える比を有する化合物は、細胞から活発で急速な流出が生じることが予想され、最大効果を達成するために十分な継続時間を細胞内で有することができない。

別の望ましい目標は、目的外の（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）阻害が最小である薬物を発見することである。すなわち、Ｃｙｐ４５０（チトクロムＰ４５０）酵素を最小限に阻害する薬物である。より具体的には、Ｐ４５０酵素の中で最も重要であるｃｙｐ３Ａ４の弱い阻害剤である薬物が所望される。弱い阻害剤は、プラズマＡＵＣ値において少なくとも１．２５倍、ただし２倍未満の増加、またはクリアランスにおいて２０〜５０％の低下を引き起こす化合物である（ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ｃｙｐ３Ａ４、１１／１２／１１にアクセス）。一般的に、１０ｕＭを超えるＣｙｐ３Ａ４のＩＣ_５０を示す化合物は弱い阻害剤とみなされる。

候補薬物の中でｃｙｐ３Ａ４阻害を比較するのに有用な尺度は、Ｃｙｐ３Ａ４阻害とタンパク質結合で調整したＥＣ_５０との比である。この値から、各薬物に特異的であるタンパク質結合で調整したＥＣ_５０に対して補正されたｃｙｐ阻害に対する相対的潜在能力の指標が得られる。この尺度においてより高い比が好ましいが、これはｃｙｐ３Ａ４阻害に対するより低い潜在能力を示すからである。

予想外におよび有利なことには、出願人らは、米国特許公開第２００１／０００９５４１０Ａ１号に開示されている構造的に近い化合物（本明細書中で化合物ＡおよびＢと指定されている）と比較して利点を提供する米国特許公開第２００１／０００９５４１０Ａ１号の一般的範囲内の化合物（本明細書中の式（Ｉ））を発見した

したがって、本発明の目的は、これらに限定されないが、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩、および腎疾患、慢性腎疾患、糖尿病性腎疾患、糖尿病性腎症、腎線維症または肺線維症の処置のための式（Ｉ）の化合物を使用する方法の提供を含む。

併用療法
心臓−腎疾患、例えば、慢性腎疾患に対する処置を受けている患者は、併用薬物処置から恩恵を受けることができる。例えば、本発明の化合物は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、例えば、エナラプリル、カプトプリル、ラミプリル、リシノプリル、およびキナプリル；またはアンジオテンシン（ａｎｇｉｏｎｔｅｓｉｎ）ＩＩ受容体遮断剤（ＡＲＢ）、例えば、ロサルタン、オルメサルタン、およびイルベサルタン；または抗高血圧剤、例えば、アムロジピン、ニフェジピン、およびフェロジピンのうちの１種または複数と組み合わせることができる。組合せの利点は、成分に対する効能の増加および／または副作用の減少となり得る。これは、式（Ｉ）の化合物および／または他の活性のある成分（複数可）の効能により増大したその効能の恩恵を受けながら、その成分の用量を、副作用を減少させるよう下方調節することができるからである。

ＡＳＫＩ阻害剤、例えば、式（Ｉ）の化合物で処置可能な慢性腎疾患を呈示する患者はまた、式（Ｉ）の化合物と組み合わせて、抗生剤、鎮痛剤、抗うつ剤および／または抗不安剤である１種または複数種の治療剤を共投与すること（資格のある介護者により導かれる通りに）から恩恵を受ける状態を示し得る。組合せ処置は、資格のある介護者により導かれる通りに、同時にもしくは互いに間隔をあけて投与するか、または２種以上の活性薬剤の固定用量（すべての活性成分（ａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｔｅｎｔ）を単一剤形、例えば錠剤へと組み合わせる）の提示によって投与することができる。

医薬組成物および投与
本発明の化合物は、医薬組成物の形態で投与することができる。したがって、本発明は、活性成分として、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩、ならびに１つもしくは複数の薬学的に許容される賦形剤および／またはキャリア（不活性固体希釈剤および充填剤を含む）、希釈剤（滅菌水溶液および様々な有機溶媒を含む）、浸透促進剤、可溶化剤ならびにアジュバントを含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与することができる。組成物は、固体錠剤、カプセル剤、カプレット、軟膏剤、皮膚パッチ、持続性放出、高速分解する錠剤、吸入製剤など、送達用として調製され得る。典型的な医薬組成物は、薬学技術において周知の方法および／またはプロセスを使用して調製および／または投与される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＭａｃｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版（１９８５年）；およびＭｏｄｅｒｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、第３版（Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ＆Ｃ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ，編）を参照されたい）。

式（Ｉ）の化合物を含む組合せ処置のための配合物は、当業者に公知の手順を使用した、固定用量の配合物、例えば錠剤、エリキシル剤、液剤、軟膏剤、吸入剤、ゲル剤などとして存在してもよい。

式（Ｉ）の化合物の医薬組成物は、単回または複数回の用量のいずれかで、例えば、直腸、口腔、鼻腔内および経皮的経路を含めた経路で、動脈内注射で、静脈内、腹腔内、非経口的に、筋肉内、皮下、経口的、局所的に、吸入剤として、または含浸させたもしくはコーティングしたデバイス、例えば、ステント、もしくは例えば、動脈挿入された円柱状ポリマーを介して投与することができる。投与の最も好ましい経路として、経口投与、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与および静脈内投与が挙げられる。

式（Ｉ）の化合物は、薬学的有効量で投与することができる。経口投与に対して、各投与単位は、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇの式（Ｉ）の化合物を含有する。より好ましい用量は１ｍｇ〜２５０ｍｇの式（Ｉ）の化合物である。特に好ましいのは、１日２回およそ２０ｍｇ〜１日２回およそ５０ｍｇの範囲である式（Ｉ）の化合物の用量である。しかし、実際に投与される化合物の量は普通、処置する状態、選ばれた投与経路、適用可能な場合、共投与の化合物、個々の患者の年齢、体重、応答性、患者の症状の重症度などを含めた関連する状況を考慮して医師により決定されることを理解されたい。

命名法
ＣｈｅｍＢｉｏＤｒａｗＵｌｔｒａ１１を使用して生成された、本発明の化合物の名称は、

５−（４−シクロプロピル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（６−（４−イソプロピル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）ピリジン−２−イル）−２−フルオロ−４−メチルベンズアミドであり、これはまた、５−（（４−シクロプロピル−１Ｈ−イミダゾール（ｉｍｄａｚｏｌ）−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−（６−（４−イソプロピル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）ピリジン−２−イル）−４−メチルベンズアミドとしても公知である。

式（Ｉ）の化合物の合成
本発明の化合物は、本明細書中に開示されている方法またはその変化形（本明細書中の開示を考えると明らかである）を使用して調製することができる。本発明の化合物の合成は、以下の実施例に記載されているように遂行することができる。利用可能な場合、試薬は、例えば、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈまたは他の化学物質の供給元から商業的に購入することができる。代わりに、試薬は、当業者に公知の反応スキームおよび方法を使用して調製することができる。

合成反応パラメーター
「溶媒」、「不活性有機溶媒」または「不活性溶媒」という用語は、反応と併せて記載されている反応条件下で不活性な溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、クロロホルム、塩化メチレン（またはジクロロメタン）、ジエチルエーテル、石油エーテル（ＰＥ）、メタノール、ピリジン、酢酸エチル（ＥＡ）などを含む）を指す。反対の意味であることが特定されていない限り、本発明の反応に使用される溶媒は、不活性な有機溶媒であり、反応は、不活性ガス下、好ましくは窒素下で行われる。

式（Ｉ）の化合物を調製する一つの方法が、以下の反応スキーム１および２において示されている。
スキーム１

化合物Ａの調製
メチル６−アミノピコリネート（４３２ｇ、２．８４モル）のＭｅＯＨ（５Ｌ）中溶液に、ＮＨ_２ＮＨ_２．Ｈ_２Ｏ（２８４ｇ、５．６８モル、２．０当量）を加えた。反応混合物を３時間加熱還流し、次いで室温に冷却した。混合物中に形成された沈殿物を濾過で収集し、ＥＡで洗浄し（２Ｌ×２）、次いで真空中で乾燥させることによって、化合物Ａを白色の固体として得た（４０５ｇ、９４％収率）。

化合物Ｂの調製
化合物Ａ（４０５ｇ、２．６６モル）のジメチルホルムアミド−ジメチルアセタール（ＤＭＦ−ＤＭＡ）（３．５４Ｌ）中混合物を１８時間加熱還流し、室温に冷却し、次いで減圧下で濃縮した。残渣をＥＡ（７００ｍＬ）に溶解し、５０℃で２０分間加熱した。室温に冷却した後、固体を濾過で収集し、真空中で乾燥させることによって、白色の固体として、化合物Ｂを得た（５７２ｇ、８２％収率）。

Ｃの調製
化合物Ｂ（５７２ｇ、２．１８モル）のＣＨ_３ＣＮ−ＡｃＯＨ（３．６Ｌ、４：１）混合物中溶液に、プロパン−２−アミン（６４６ｇ、５．０当量）を加えた。生成した混合物を２４時間加熱還流し、次いで室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を水（２．８Ｌ）中に溶解し、１Ｎの水性ＮａＯＨを８．０ＨのｐＨまで加えた。沈殿物を濾過で収集し、濾液をＥＡ（５００ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、次いで１５０ｍＬの体積まで濃縮した。この混合物に０℃でＰＥ（４００ｍＬ）をゆっくりと加え、生成した懸濁液を濾過した。合わせた固体をＥＡ−ＰＥから再結晶化することによって、オフホワイト色の固体として化合物Ｃを得た（２５３ｇ、５７％収率）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）： δ ８．２４（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｍ，２Ｈ），６．５１（ｄｄ，Ｊ＝１．６，７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．５５（ｍ，１Ｈ），４．４６（ｂｓ，２Ｈ），１．４５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：２０４（Ｍ＋１）^＋。

化合物Ｃは、式（Ｉ）の化合物の合成のための主要な中間体である。したがって、本発明の目的はまた、式（Ｉ）の化合物の調製のための、中間体化合物Ｃ、
その塩またはその保護された形態の提供である。化合物Ｃの塩の例はＨＣｌ付加塩である。化合物Ｃの保護された形態の例は、カルバメート化合物、例えば、Ｃｂｚ−Ｃｌで得られるものである。保護基、これらの調製および使用は、ＰｅｔｅｒＧ．Ｍ．ＷｕｔｓａｎｄＴｈｅｏｄｏｒａＷ．Ｇｒｅｅｎｅ、ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、１９９１年、ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにおいて教示されている。

スキーム２
式（Ｉ）の化合物の調製は連続した：
化合物６は、式（Ｉ）の化合物の合成のための主要な中間体である。したがって、本発明の目的はまた、式（Ｉ）の化合物の調製のための、中間体化合物６、

その塩または保護された形態の提供である。化合物６の塩の例はＨＣｌ付加塩である。化合物６の保護された形態の例はエステル（例えばメチル、エチルまたはベンジルエステル）またはカルバメート化合物、例えば、Ｃｂｚ−Ｃｌで得られるものである。保護基、これらの調製および使用は、ＰｅｔｅｒＧ．Ｍ．ＷｕｔｓａｎｄＴｈｅｏｄｏｒａＷ．Ｇｒｅｅｎｅ、ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、１９９１年、ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにおいて教示されている。

ステップ１ − ５−アミノ−２−フルオロ−４−メチルベンゾニトリルの調製−化合物（２）
出発の５−ブロモ−４−フルオロ−２−メチルアニリン（１）（２０ｇ、９８ｍｍｏｌ）を無水１−メチルピロリジノン（１００ｍＬ）中に溶解し、シアン化銅（Ｉ）（１７．６ｇ、１９６ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を１８０℃に３時間加熱し、室温に冷却し、水（３００ｍＬ）および濃水酸化アンモニウム（３００ｍＬ）を加えた。混合物を３０分間撹拌し、ＥＡ（３×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。油性残渣をヘキサン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、固体をジクロロメタン中に溶解し、シリカゲルカラム上に載せた。ヘキサン中０〜２５％ＥＡの勾配で溶出させることで５−アミノ−２−フルオロ−４−メチルベンゾニトリルを得た（１０．０６ｇ、６７．１ｍｍｏｌ）。ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ：１５１Ｍ^＋１）。

ステップ２ − ５−（２−シクロプロピル−２−オキソエチルアミノ）−２−フルオロ−４−メチルベンゾニトリルの調製−化合物（３）
５−アミノ−２−フルオロ−４−メチルベンゾニトリル（１２ｇ、８０ｍｍｏｌ）を、窒素下で無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１６０ｍＬ）中に溶解し、撹拌しながら、炭酸カリウム（１３．２７ｇ、９６ｍｍｏｌ）およびヨウ化カリウム（１４．６１ｇ、８８ｍｍｏｌ）を固体として加えた。反応物を室温で５分間撹拌し、次いでブロモメチルシクロプロピルケトン（２０．２４ｍＬ、１８０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を６０℃に３時間加熱し、次いで減圧下で溶媒を除去した。残渣をＥＡ（４００ｍＬ）中に溶解し、４００ｍＬの水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。残渣を最小量のＥＡ中に再溶解し、ヘキサンを加えることによって、溶液を、体積に関して３：１のヘキサン：ＥＡにした。溶液から沈殿した生成物を濾過で収集することによって、５−（２−シクロプロピル−２−オキソエチルアミノ）−２−フルオロ−４−メチルベンゾニトリルを得た（１４．１９ｇ、６１．２ｍｍｏｌ）。ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ：２３３、Ｍ^＋１）。

ステップ３ − ５−（４−シクロプロピル−２−メルカプト−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−フルオロ−４−メチルベンゾニトリルの調製−化合物（４）
５−（２−シクロプロピル−２−オキソエチルアミノ）−２−フルオロ−４−メチルベンゾニトリル（１４．１９ｇ、６１．２ｍｍｏｌ）を氷酢酸（３００ｍＬ）中に溶解した。撹拌しながら、チオシアン酸カリウム（１１．９ｇ、１２２．４ｍｍｏｌ）を固体として加えた。反応混合物を１１０℃に４時間加熱し、この時点で溶媒を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解し、２００ｍＬの水で洗浄した。水性抽出物を追加のジクロロメタンで抽出し（２×２００ｍＬ）、有機抽出物を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、油性残渣をＥＡ（５０ｍＬ）中に再溶解し、１５０ｍＬのヘキサンを加えた。形成された暗色の層および撹拌棒をフラスコに加えた。激しい撹拌が、生成物をモモ色の固体として沈殿させた。生成物を濾過で収集することによって、５−（４−シクロプロピル−２−メルカプト−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−フルオロ−４−メチルベンゾニトリル、（１４．２６ｇ、５２．２３ｍｍｏｌ）を生成した。分析用ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ：２７４、Ｍ^＋１）。

ステップ４ − ５−（４−シクロプロピル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−フルオロ−４−メチルベンゾニトリルの調製−化合物（５）
５００ｍＬ三口丸底フラスコ内に、酢酸（９６ｍＬ）、水（１９ｍＬ）および過酸化水素（３０％、７．４７ｍＬ、６５．８８ｍｍｏｌ）を入れた。内部温度をモニターしながら、混合物を、窒素下で４５℃に加熱撹拌した。次いで、内部温度を５５℃未満に維持しながら、５−（４−シクロプロピル−２−メルカプト−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−フルオロ−４−メチルベンゾニトリル（６．００ｇ、２１．９６ｍｍｏｌ）を、固体として、少量ずつ３０分間にわたり加えた。チオイミダゾールの添加が完了したら、反応物を４５℃の温度で３０分間撹拌し、次いで室温に冷却し、２０％ｗｔ／ｗｔの亜硫酸ナトリウムの水（６ｍＬ）中溶液をゆっくりと加えた。混合物を３０分間撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を２５０ｍＬの水中に懸濁させ、４Ｎの水性水酸化アンモニウムを加えて、ｐＨを約１０にした。混合物をジクロロメタン（３×２００ｍｌ）で抽出し、有機物を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。残渣を２０ｍＬのＥＡ中に溶解し、撹拌しながら８０ｍＬのヘキサンを加えた。溶媒をデカントすると、油性の残渣が後に残った。このプロセスを繰り返し、生成物、５−（４−シクロプロピル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−フルオロ−４−メチルベンゾニトリルを粘性の油として得た（５．１４ｇ、２１．３３ｍｍｏｌ）。分析用ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ：２４２、Ｍ^＋１）。

ステップ５ − ５−（４−シクロプロピル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−フルオロ−４−メチル安息香酸塩酸塩（６）の調製
５−（４−シクロプロピル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−フルオロ−４−メチルベンゾニトリル（１１．２１ｇ、４６．５０ｍｍｏｌ）を、還流冷却器を取り付けた丸底フラスコ内に入れ、３８％塩酸（２００ｍＬ）中に懸濁させた。混合物を１００℃に４．５時間加熱し、次いで室温に冷却した。溶媒を減圧下で除去することによって、ピンク色の固体を得た。これに、１００ｍｌのＥＡを加えた。固体生成物を濾過で収集し、３×１００ｍＬのＥＡで洗浄した。固体生成物に、ジクロロメタン中の１０％メタノール、１００ｍＬを加え、混合物を撹拌し、濾液を収集した。ジクロロメタン中１０％メタノール、１００ｍｌをさらに２回分用いて、これを繰り返した。濾液を合わせ、溶媒を減圧下で除去することによって、粗製の５−（４−シクロプロピル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−フルオロ−４−メチル安息香酸塩酸塩を得た。さらなる精製は行わなかった（１１．１３ｇ、３７．５４ｍｍｏｌ）。分析用ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ：２６１、Ｍ^＋１）。

ステップ６ − ５−（４−シクロプロピル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−（６−（４−イソプロピル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）ピリジン−２−イル）−４−メチルベンズアミドの調製−式（Ｉ）
５−（４−シクロプロピル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−フルオロ−４−メチル安息香酸塩酸塩（１．５ｇ、５．０７ｍｍｏｌ）を室温で無水１，２−ジクロロメタン（２５ｍＬ）中に懸濁させた。撹拌しながら窒素下で塩化オキサリル（０．５７５ｍｌ、６．５９ｍｍｏｌ）を加え、続いてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．０４４ｍｌ、０．５０７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去した。残渣を２５ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解した。撹拌しながら、窒素下で６−（４−イソプロピル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）ピリジン−２−アミン（１．１３ｇ、５．５８ｍｍｏｌ）（化合物Ｃ）および４−ジメチルアミノピリジン（０．６２ｇ、５．０７ｍｍｏｌ）を素早く加えた。反応物を室温で２時間撹拌し、水性の飽和ＮａＨＣＯ_３（１５ｍＬ）を加えた。混合物を１０分間撹拌し、層を分離し、水層を１×２０ｍＬのジクロロメタンで洗浄した。合わせた有機物を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。残渣を最小量のＣＨ_３ＣＮ中に溶解し、固体が混合物から沈殿するまで水をゆっくりと加えた。固体を濾過で収集し、乾燥させることによって、５−（４−シクロプロピル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−（６−（４−イソプロピル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）ピリジン−２−イル）−４−メチルベンズアミドを約９６％の純度で得た（１．２８ｇ、２．８８ｍｍｏｌ）。分析用ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ：４４６、Ｍ^＋１）。この物質をＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣ）でさらに精製することによって、分析で純粋な試料をＨＣｌ塩として得た。
Ｃ_２４Ｈ_２４ＦＮ_７Ｏ−ＨＣｌ。４４６．２（Ｍ＋１）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）： δ １１．１２（ｓ，１Ｈ），９．４１（ｓ，１Ｈ），９．３２（ｓ，１Ｈ），８．２０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０７（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），５．７２（七重線，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ），２．００−２．０５（ｍ，１Ｈ），１．４４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ），１．０１−１．０６（ｍ，２Ｈ），０．８５−０．８９（ｍ，２Ｈ）。

生物学的アッセイ
ＡＳＫ１（アポトーシスシグナル調節キナーゼ１）ＴＲ−ＦＲＥＴキナーゼアッセイ（生化学的ＩＣ_５０）
タンパク質基質としてビオチン化したミエリン塩基性タンパク質［ビオチン−ＭＢＰ］を利用して、ＡＳＫ１キナーゼ活性を阻害する化合物の能力を、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動［ＴＲ−ＦＲＥＴ］アッセイを使用して決定した。ＢｅｃｋｍａｎＢｉｏｍｅｋＦＸ液体取扱いロボットを利用して、２．４４％の水性ＤＭＳＯ中の２μＬ／ウェルの化合物を、低体積の３８４−ウェルポリプロピレンプレート［Ｎｕｎｃ、＃２６７４６０］にスポットし、キナーゼアッセイにおいて１００μＭ〜０．５ｎＭの間の最終濃度の化合物を得た。ＤｅｅｒａｃＦｌｕｉｄｉｃｓＥｑｕａｔｏｒを使用して、０．６６７ｎｇ／μＬの３μＬ／ウェル［ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１４−６０６、または組織内で調製した同等のタンパク質］および緩衝液（８５ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、８．５ｍＭ酢酸マグネシウム、５％グリセロール、０．０８５％ＮＰ−４０、１．７ｍＭＤＴＴおよび１．７ｍｇ／ｍＬＢＳＡ）中の０．１６６５ｎｇ／ｍＬのビオチン−ＭＢＰ［ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１３−１１１］を、スポットした化合物を含有するプレートに分配した。

ＤｅｅｒａｃＦｌｕｉｄｉｃｓＥｑｕａｔｏｒを使用して、緩衝液（５０ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．０．５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭＤＴＴ、５％ＤＭＳＯ）中５μＬ／ウェルの３００μＭＡＴＰの添加によりキナーゼ反応を開始する前に、酵素を化合物と共に２０分間プレインキュベートさせておいた。キナーゼ反応は、周辺温度で２０分間進行させておき、続いてＤｅｅｒａｃＦｌｕｉｄｉｃｓＥｑｕａｔｏｒを使用して、５μＬ／ウェルの２５ｍＭＥＤＴＡを添加することによりこれを停止させた。次いで、ＢｉｏｍｅｋＦＸを使用して、１μＬ／ウェルの各完了したキナーゼ反応物を、５μＬ／ウェルの検出試薬（１．１１ｎＭＥｕ−Ｗ１０２４）で標識した抗ホスホトレオニン抗体［ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃ＡＤ００９４］および１×ＬＡＮＣＥ検出緩衝液［ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃ＣＲ９７−１００］）中の５５．５６ｎＭストレプトアビジンアロフィコシアニン［ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃ＣＲ１３０−１００］を含有した、ＯｐｔｉＰｌａｔｅ−１５３６白色ポリスチレンプレート［ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００４２９９］のウェルに移した。次いで、プレートを周辺温度で２時間インキュベートした後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー上でＴＲ−ＦＲＥＴ信号を読んだ。

上記に記載されているＥＤＴＡおよびＡＴＰ溶液の添加の順序を切り替えることによって１００％阻害ポジティブコントロールウェルを生成した。これらのウェルおよびアッセイ開始時に２．４４％ＤＭＳＯのスポットを含有する０％阻害ウェルを、試験化合物に対する％阻害の計算に使用した。

結果
式（Ｉ）の化合物は、３．０ｎＭのＩＣ_５０でＡＳＫ１を阻害した。このデータは、式（Ｉ）の化合物が、競合リガンドＡＴＰの存在下でＡＳＫ１の強力な阻害剤であることを示唆している。

上記アッセイの最新バージョンでは、ＡＳＫ１に対する本発明の化合物の抑制活性をＴＲ−ＦＲＥＴＡＳＫ１アッセイを使用して試験し、ＡＴＰからペプチド基質へ移ったホスフェートの量を決定した。

材料および方法
試薬
脱リン酸化した組換えヒトＡＳＫ１キナーゼは、ＧｉｌｅａｄＳｃｉｅｎｃｅｓ製のものであった。小分子キナーゼ阻害剤スタウロスポリン（カタログ＃Ｓ６９４２）およびジチオトレイトール（ＤＴＴ、カタログ＃４３８１５−５Ｇ）を、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から調達した。ＡＴＰ（カタログ＃７７２４）は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（ＳａｎｔａＣｌａｒａ、ＣＡ）製のものであり、式（Ｉ）の化合物はＧｉｌｅａｄＳｃｉｅｎｃｅｓ製のものであった。ＨＴＲＦＫｉｎＥＡＳＥ（商標）−ＳＴＫＳ３キットは、Ｃｉｓｂｉｏ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ）から調達した。すべて他の試薬は、最高の等級の市販品であった。

アッセイ
アッセイは、ＨＴＲＦ検出を使用して、ＡＳＫ１キナーゼによりビオチン化したペプチド基質のリン酸化レベルを測定する（６．１）。これは、Ｃｉｓｂｉｏ製ＨＴＲＦ（登録商標）ＫｉｎＥＡＳＥ（商標）−ＳＴＫマニュアルに基づく、競合的な、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）イムノアッセイである（６．１）。試験化合物、１μＭＳＴＫ３ペプチド基質、４ｎＭのＡＳＫ１キナーゼを、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２５％ＮＰ−４０、１ｍＭＤＴＴ、０．０５％ＢＳＡおよび１．５％グリセロールを含有する１０ｍＭＭＯＰ緩衝液、ｐＨ．７．０とともに３０分間インキュベートし、次いで１００μＭＡＴＰを加えることによって、キナーゼ反応を開始し、３時間インキュベートする。１０ｍＭＥＤＴＡおよび１２５ｎＭストレプトアビジンＸＬ６６５を含有する１ＸＥｕ^３＋クリプテート緩衝液で標識したペプチド抗体を加えて反応を停止させ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製のＥｎｖｉｓｉｏｎ２１０３Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌｅｄリーダーを使用してリン酸化したペプチド基質を検出する。蛍光を６１５ｎｍ（クリプテート）および６６５ｎｍ（ＸＬ６６５）で測定し、６６５ｎｍ／６１５ｎｍの比を各ウェルについて計算する。結果として得たＴＲ−ＦＲＥＴレベル（６６５ｎｍ／６１５ｎｍの比）は、リン酸化レベルと比例する。これらのアッセイ条件下で、ペプチド基質のリン酸化の度合は、時間および酵素に対する濃度に直線的である。このアッセイ系は、酵素についてのＫ_ｍおよび特定の活性に関して矛盾のない結果を生じた。阻害実験（ＩＣ_５０値）に対して、活性は、一定濃度のＡＴＰ、ペプチドおよびいくつかの固定された濃度の阻害剤を用いて実施した。スタウロスポリン、非選択的キナーゼ阻害剤をポジティブコントロールとして使用した。すべての酵素活性データは、４通りの測定の平均として報告される。

データ解析
ＩＣ_５０値は以下の方程式で計算した：
ｙ＝値域（ｒａｎｇｅ）／｛１＋（ｘ／ＩＣ_５０）^ｓ｝＋バックグラウンド
（式中、ｘおよびｙは、それぞれ阻害剤および酵素活性の濃度を表す）。酵素活性は、ＡＴＰから基質ペプチドへ組み込まれたホスフェートの量として表現される。値域は最大ｙ値域（阻害剤なし、ＤＭＳＯ対照）であり、ｓはスロープ係数である（６．２）。

結果
式（Ｉ）の化合物は、この試験条件下で３．２ｎＭのＩＣ５０を示した。

データは、式（Ｉ）の化合物は、ＡＳＫ−１１受容体の強力な阻害剤であることを実証している。

ＡＳＫ１（アポトーシスシグナル調節キナーゼ１）２９３細胞ベースのアッセイ（細胞のＥＣ_５０）
化合物についての細胞の効能を、ＡＰ−１：ルシフェラーゼリポーター構築物（２９３／ＡＰ１−Ｌｕｃ細胞−ＰａｎｏｍｉｃｓＩｎｃ．、６５１９ＤｕｍｂａｒｔｏｎＣｉｒｃｌｅ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を安定して発現する細胞でアッセイした。細胞をキナーゼ活性のあるＡＳＫ１（ラットＡＳＫ１ｃＤＮＡの６３１−１３８１）を発現するアデノウイルスに感染させた。これによって、ＡＰ−１転写因子が活性化し、ルシフェラーゼの発現を増加させる。ＡＳＫ１の阻害剤は、ＡＳＫ１の酵素活性を低下させ、したがって、ＡＰ−１転写因子の活性およびルシフェラーゼの発現を低下させる。

１．本プロトコルに必要な材料

２．参考資料
Ｐａｎｏｍｉｃｓ２９３／ＡＰ１−Ｌｕｃｓｔａｂｌｅｃｅｌｌｌｉｎｅ製品の挿入物。
ＰｒｏｍｅｇａＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系製品の挿入物。

３．必要な媒体
完全増殖培地、「ＣＧＭ」
ＤＭＥＭ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）
１０％ＦＢＳ
１％ＰＳＧ
１００ｕｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ
アッセイ媒体、「ＡＭ」
ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２５ｍＭＨＥＰＥＳ
１ｍＭピルビン酸ナトリウム
１％ＰＳＧ

４．方法
維持：
供給業者の指示に従い２９３／ＡＰ１−Ｌｕｃが２９３／Ａｃｅｌｌを維持する；Ｔ１５０フラスコ内、約８０％コンフルエンスにおいて、細胞を以下の通り収穫する：
媒体を吸引し、約１２ｍＬの滅菌Ｄ−ＰＢＳで穏やかに洗浄し、吸引する。
５ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡを加え、静かに傾けて、フラスコをコーティングし、約５分間３７℃でインキュベートする。
フラスコの口を開かない；５ｍＬのＣＧＭを加え、細胞懸濁液でフラスコを４回洗浄し、５０ｍＬのコニカルバイアルに移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
細胞ペレットから媒体を吸引し、２０〜３０ｍＬのＣＧＭを加え、ピペッティング（６回）でペレットを再懸濁させ、セルストレーナーを通して、凝集塊を分散させ（必要に応じて）、血球計算板で細胞をカウントする。

アッセイ第１日目：
細胞ペレットを再懸濁させる以外は、上記の通り細胞を収穫する。

細胞をカウントし、１ｍＬ当たり１．５×１０^５細胞に希釈し、細胞１個当たり５感染形成ユニット（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）が存在するようにアデノウイルスを加える。
注入し（２０〜３０ｍＬ）、ＢｉｏＴｅｋｕＦｉｌｌを使用して（１ウェル当たり８０ｕＬ）、Ｇｒｅｉｎｅｒポリ−Ｄ−リシンコーティングした３８４−ウェルプレート中に、細胞を、１ウェル当たり１．２×１０^４細胞をまく。
直ちに、０．４ｕＬの化合物の用量シリーズ（１００％ＤＭＳＯ中）をプレートに加え、加湿したインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で２４時間インキュベートする。

アッセイ第２日目：
プレートを（製造者の指示通り）以下の通り処理する：
層流フード内にプレートをセットし、３０分間室温に曝露することによって冷却する。
６０ｕＬのＡＭをアッセイウェルから取り出す。
１ウェル当たり２０ｕＬのＳｔｅａｄｙ−ＧｌｏＦｉｒｅｆｌｙ基質を加え、室温で１０〜２０分間置く。
アッセイプレートの底面を白色バッキングテープで覆う。
蛍光プレートリーダーでデータを取得する
残基７０９においてリシンのアルギニン（ａｒｇｉｎｅ）への変異を有する、触媒として不活性なＡＳＫ１変異体を発現するアデノウイルスに細胞を感染させることによって、１００％阻害ポジティブコントロールウェルを生成した。

結果
式（Ｉ）の化合物は、２．０ｎＭのＥＣ_５０を示す。

Ｋｄの決定
キナーゼアッセイ
ＢＬ２１株から誘導された大腸菌宿主内に、キナーゼタグを付けたＴ７ファージ株を調製した。大腸菌を対数期まで成長させ、Ｔ７ファージに感染させ、振盪しながら溶解するまで３２℃でインキュベートした。溶解物を遠心分離し、濾過して細胞デブリを除去した。残りのキナーゼをＨＥＫ−２９３細胞中に生成し、続いてｑＰＣＲ検出用にＤＮＡでタグを付けた。ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを、室温で３０分間、ビオチン化した小分子リガンドで処理することによって、キナーゼアッセイのための親和性レジンを生成した。

リガンド結合させたビーズを過剰のビオチンでブロックし、ブロッキング緩衝液（ＳｅａＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）、１％（ウシ血清アルブミン）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭＤＴＴ（ジチオトレイトール））で洗浄して、未結合のリガンドを除去し、非特異的結合を減少させた。キナーゼ、リガンド結合させた親和性ビーズ、および試験化合物を１×結合緩衝液（２０％ＳｅａＢｌｏｃｋ、０．１７×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、６ｍＭＤＴＴ）中で組み合わせることにより、結合反応を組み立てた。すべての反応は、最終体積０．１３５ｍＬで、ポリスチレン９６−ウェルプレート内で実施した。１時間振盪させながら、アッセイプレートを室温でインキュベートし、親和性ビーズを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。次いで、溶出緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５μＭ非ビオチン化親和性リガンド）中にビーズを再懸濁させ、３０分間振盪させながら、室温でインキュベートした。溶出液中のキナーゼ濃度をｑＰＣＲで測定した。

Ｈｉｌｌ方程式を使用して、標準用量反応曲線で結合定数（Ｋｄ）を計算した。

結果
式（Ｉ）の化合物は０．２４ｎＭのＫ_ｄを示した。このデータは、式（Ｉ）の化合物がＡＴＰの不在下でＡＳＫ１受容体に強力に結合することを示唆している。

血漿に結合した化合物のパーセントの決定
実験デザイン：
ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ、ＵＳＡ）製の１ｍＬのテフロン（登録商標）透析セルをこれらの実験に使用した。試験の前に、透析膜は、０．１３３Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中にほぼ１時間浸漬させた。設定濃度２μＭの化合物を１ｍＬの血漿または１ｍＬの細胞培養媒体にスパイクした。細胞の各側面の液体総体積は１ｍＬであった。３７℃の水槽内で３時間平衡状態にした後、１ｍＬのヒト血漿（細胞培養媒体）、または緩衝液のいずれかを含有する適当なバイアル中に細胞の各側面からの試料を等分して入れた。試料バイアルを秤量し、記録した。１００μＬのアリコートを取り出し、４００μＬのクエンチ溶液（５０％メタノール、２５％アセトニトリル、２５％水および内部標準）に加えた。試料をボルテックスし、１２０００Ｇで１５分間遠心分離した。２００μＬの上清を取り出し、新しい９６ウェルプレートに入れた。追加の２００μＬの１：１ＡＣＮ：水を加えた。次いでプレートをボルテックスし、ＬＣ−ＭＳ分析に供した。
以下の方程式を使用して、血漿中の分析物に対して未結合のパーセントを計算した
％未結合＝１００（Ｃ_ｆ／Ｃ_ｔ）
（式中、Ｃ_ｆおよびＣ_ｔは、それぞれ透析後緩衝液および血漿中濃度である）。

結果
式（Ｉ）の化合物について、ヒト血漿中で測定した未結合のパーセントは１１．９４％であった。

ＣＡＣＯ−２流出比の決定
実験：
３７℃、湿度９０％およびＣＯ_２５％に設定したインキュベーター内で、ピルビン酸ナトリウム、Ｇｌｕｔｍａｘ（１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％ＮＥＡＡおよび１０％ウシ胎仔血清を補充）を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＣａｃｏ−２細胞を維持した。

継代６２と７２との間のＣａｃｏ−２細胞を、２１００細胞／ウェルで播種し、２４ウェルＰＥＴ（ポリエチレン−テレフタラート）プレート（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で少なくとも２１日間にわたりコンフルエンスまで成長させた。レシーバーウェルは、ｐＨをｐＨ７．４に調節した１％ＢＳＡを補充したＨＢＳＳ緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５ｍＭグルコース、ｐＨをｐＨ６．５に調節）を含有した。トランスポート緩衝液での最初の平衡化後、ＴＥＥＲ値を読んで膜完全性を試験した。試験化合物を含有する緩衝液を加え、１００μｌの溶液を１時間および２時間の時点でレシーバーコンパートメントから取った。取り出した緩衝液を新鮮な緩衝液で置き換え、取り出した物質について、補正をすべての計算に適用した。実験を反復して行った。すべての試料を直ちに４００μｌの１００％アセトニトリル酸（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅａｃｉｄ）中に収集することによって、タンパク質を沈殿させ、試験化合物を安定化させた。前方透過性（ＡからＢ）および逆方透過性（ＢからＡ）を決定するために、細胞には、先端側または基底側へ加えた。細胞を含まないｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌを介した透過性もまた、膜および非特異的結合を介した細胞透過性の尺度として決定する。非特異的結合および化合物の不安定さを試験するためにリカバリーパーセントを決定する。試料をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。
見かけの透過性、Ｐ_ａｐｐ、および％リカバリーを以下の通り計算した：
Ｐ_ａｐｐ＝（ｄＲ／ｄｔ）×Ｖ_ｒ／（Ａ×Ｄ_０）
％リカバリー＝１００×（（Ｖ_ｒ×Ｒ_１２０）＋（Ｖ_ｄ×Ｄ_１２０））／（Ｖ_ｄ×Ｄ_０）
（式中、
ｄＲ／ｄｔは、６０および１２０分の時点で測定したレシーバー濃度に基づく、レシーバーコンパートメントにおける累積濃度対時間（単位：μＭ／秒）の傾きである）。
Ｖ_ｒおよびＶ_ｄは、それぞれ、レシーバーコンパートメントおよびドナーコンパートメントにおける体積（単位：ｃｍ^３）である。
Ａは、セル単層の面積である（０．３３ｃｍ^２）。
Ｄ_０およびＤ_１２０は、それぞれ、実験の開始および終了時に測定されたドナー濃度である。
Ｒ_１２０は、実験終了時のレシーバー濃度である（１２０分間））。

吸収および流出の分類：

結果

式（Ｉ）の化合物は、ＣＡＣＯＡ→Ｂ値が２７であり、ＣＡＣＯＢ→Ａ値が３５であることが観察され、結果として流出比（Ｂ→Ａ）／（Ａ→Ｂ）が１．３であった。
肝臓ミクロソーム画分における代謝安定性の決定：
実験：

酸化的代謝（ＮＡＤＰＨ）およびコンジュゲーション（ＵＤＰグルクロン酸（ＵＤＰＧＡ））の両方についてコファクターを使用して、代謝安定性を評価した。式（Ｉ）の化合物の、二重に作製するアリコート（３μＬの０．５ｍＭＤＭＳＯストック）または代謝安定性標準品（ブスピロン）を、タンパク質濃度１．０ｍｇ／ｍＬを得るためにリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４で希釈し、透過剤としてアラメチシンを含有するミクロソームストックに加えた。ＮＡＤＰＨ再生系およびＵＤＰＧＡコファクターの添加により代謝反応が開始した。各反応混合物の最終の組成は以下の通りであった：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中の、３μＭ試験化合物、１ｍｇのミクロソームタンパク質／ｍＬ、５ｍＭＵＤＰＧＡ、２３．４μｇ／ｍＬのアラメチシン、１．２５ｍＭＮＡＤＰ、３．３ｍＭグルコース−６−ホスフェート、０．４Ｕ／ｍＬグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび３．３ｍＭＭｇＣｌ_２。０、２、５、１０、１５、３０、４５、および６０分の時点で、２５μＬアリコートの反応混合物を、２５０μｌのＩＳ／Ｑ（内部標準を含有するクエンチ溶液）を含有するプレートに移した。クエンチ後、プレートを３０００×ｇで３０分間遠心分離し、ＬＣ／ＭＳを使用して１０μＬアリコートの上清を分析することによって、分析物／内部標準ピーク面積比を得た。

ミクロソーム画分中の代謝安定性を、式（Ｉ）の化合物の消失速度を測定することによって決定した。データ（残りの親化合物の％）を片対数目盛上にプロットし指数近似（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｆｉｔ）を使用して適合させた：
式中、
Ｃ_ｔは、時間＝ｔにおいて残っている親化合物の％
Ｃ_０は、時間＝０において残っている親化合物の％
ｔは時間（ｈｒ）
Ｋは一次***速度定数（ｈｒ^−１）
Ｔ１／２はインビトロの半減期（ｈｒ）
予測される肝臓クリアランスを以下の通り計算した｛参照１｝：
式中、
ＣＬ_ｈは予測される肝臓クリアランス（Ｌ／ｈｒ／ｋｇ体重）
ＣＬ_ｉｎｔは内因性肝臓クリアランス（Ｌ／ｈｒ／ｋｇ体重）
Ｖはインキュベーション体積（Ｌ）
Ｙ_Ｐはミクロソームタンパク質の収量（ｍｇタンパク質／ｋｇ体重）
Ｙ_Ｈは肝実質細胞の収量（数百万の細胞／ｋｇ体重）
Ｐはインキュベーションにおけるタンパク質の質量（ｍｇ）
Ｈはインキュベーションにおける肝実質細胞の数（百万）
Ｑ_ｈは肝臓の血流（Ｌ／ｈｒ／ｋｇ体重）。

次いで、予測される肝臓クリアランスと肝臓の血流との比較により予測される肝臓での抽出を計算した。インキュベーション期間にわたる基質濃度の減少が１０％未満である場合（ミクロソーム画分における外挿された半減期３９５分超および肝実質細胞における外挿された半減期３９．５時間超に相当）、化合物は安定しているとみなされた。
予測される肝臓クリアランスの計算のために使用される値は、以下の表に示されている：

表１．ミクロソーム安定性から、予測される肝臓のクリアランスの計算のために使用される値

結果：
ミクロソーム画分のインビトロ実験から決定した、ヒトにおいて予測される肝臓のクリアランスは０．１Ｌ／ｈ／ｋｇである。

試験化合物についてのラットＣＬおよびＶｓｓの決定
ラットにおける１ｍｇ／ｋｇのＩＶ注入および５．０ｍｇ／ｋｇのＰＯ投薬後の、試験化合物の薬物動態
試験品目および配合物
ＩＶ投与のため、０．５ｍｇ／ｍＬで、１当量のＨＣｌを有して、６０：４０のＰＥＧ４００：水に試験化合物を配合した。配合物は溶液であった。

ＰＯ（経口の）投与のため、２．５ｍｇ／ｍＬで、５／７５／１０／１０のエタノール／ＰＧ／ソルトール／水に試験化合物を配合した。配合物は溶液であった。

使用した動物
ＩＶおよびＰＯ投薬群はそれぞれ３匹のオスのＳＤラットからなった。投薬時に、動物は概して０．３１７〜０．３５５ｋｇの間の体重だった。用量の投与前の一晩、および投薬後４時間まで動物を絶食させた。

投薬
ＩＶ注入群に対して、試験化合物を静脈内注入によって３０分間にわたり投与した。注入速度は、２ｍＬ／ｋｇで１ｍｇ／ｋｇの用量を送達するよう、各動物の体重に従い調節した。経口投薬群に対して、試験品目は、２ｍＬ／ｋｇで５．０ｍｇ／ｋｇの用量を強制経口投与により投与した。
試料の収集

ひと続きの静脈血液試料（それぞれほぼ０．４ｍＬ）を、投薬後の特定された時間点で各動物から採取した。抗凝固剤としてＥＤＴＡを含有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）管（Ｂｅｃｔｏｎ−ＤｉｓｃｋｉｎｓｏｎＣｏｒｐ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）に血液試料を収集し、血漿採取のための遠心分離を行うまで、直ちに湿った氷上に置いた。

血漿中の式（Ｉ）の化合物濃度の決定
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法を使用して、血漿中の試験化合物濃度を測定した。

計算
非コンパートメントの薬物動態学的分析を血漿中濃度−時間データについて実施した。

結果
式（Ｉ）の化合物は、ラットにおいて、０．０９Ｌ／ｈｒ／ｋｇのＣＬ；７５％の経口バイオアベイラビリティー；５．０７時間のｔ_１／２および０．５５Ｌ／ｋｇのＶｓｓを示した。

Ｃｙｐ阻害アッセイ
目的
主要なチトクロムＰ４５０アイソフォームである、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ３Ａ４（２つの基質）を阻害する試験化合物の潜在能力を評価すること。

チトクロムＰ４５０阻害のＩＣ_５０決定（８つのアイソフォーム、９つの基質）
プロトコルの概要
チトクロムＰ４５０アイソフォームに特異的なプローブ基質の存在下で、試験化合物（０．１μＭ〜２５μＭ）をヒト肝ミクロソームおよびＮＡＤＰＨと共にインキュベートする。ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ３Ａ４に特異的な反応に対して、代謝物を質量分析法でモニターする。ＣＹＰ１Ａ活性を、蛍光性代謝物の形成を測定することによってモニターする。ビヒクル対照と比較した、代謝物の形成の低減を使用して、ＩＣ５０値を計算する（５０％阻害をもたらす試験化合物濃度）。

アッセイに必要なもの
ＤＭＳＯ中の、５００μＬの１０ｍＭ試験化合物溶液。
実験手順
ＣＹＰ１Ａ阻害
６つの試験化合物濃度（ＤＭＳＯ中０．１、０．２５、１、２．５、１０、２５μＭ；最終ＤＭＳＯ濃度＝０．３％）を、プローブ基質エトキシレゾルフィン（０．５μＭ）の存在下、３７℃で５分間、ヒト肝ミクロソーム（０．２５ｍｇ／ｍＬ）およびＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）と共にインキュベートする。選択的ＣＹＰ１Ａ阻害剤、アルファ−ナフトフラボンを、ポジティブコントロールとして試験化合物と一緒にスクリーニングする。

ＣＹＰ２Ｂ６阻害
６つの試験化合物濃度（ＤＭＳＯ中０．１、０．２５、１、２．５、１０、２５μＭ；最終のＤＭＳＯ濃度＝０．３％）を、プローブ基質ブプロピオン（１１０μＭ）の存在下、３７℃で５分間、ヒト肝ミクロソーム（０．１ｍｇ／ｍＬ）およびＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）と共にインキュベートする。選択的ＣＹＰ２Ｂ６阻害剤、チクロピジンを、ポジティブコントロールとして試験化合物と一緒にスクリーニングする。

ＣＹＰ２Ｃ８阻害
６つの試験化合物濃度（ＤＭＳＯ中０．１、０．２５、１、２．５、１０、２５μＭ；最終のＤＭＳＯ濃度＝０．３％）を、プローブ基質パクリタキセル（７．５μＭ）の存在下、３７℃で３０分間、ヒト肝ミクロソーム（０．２５ｍｇ／ｍＬ）およびＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）と共にインキュベートする。選択的ＣＹＰ２Ｃ８阻害剤、モンテルカストを、ポジティブコントロールとして試験化合物と一緒にスクリーニングする。

ＣＹＰ２Ｃ９阻害
６つの試験化合物濃度（ＤＭＳＯ中０．１、０．２５、１、２．５、１０、２５μＭ；最終のＤＭＳＯ濃度＝０．２５％）を、プローブ基質トルブタミド（１２０μＭ）の存在下、３７℃で６０分間、ヒト肝ミクロソーム（１ｍｇ／ｍＬ）およびＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）と共にインキュベートする。選択的ＣＹＰ２Ｃ９阻害剤、スルファフェナゾールを、ポジティブコントロールとして試験化合物と一緒にスクリーニングする。

ＣＹＰ２Ｃ１９阻害
６つの試験化合物濃度（ＤＭＳＯ中０．１、０．２５、１、２．５、１０、２５μＭ；最終ＤＭＳＯ濃度＝０．２５％）を、プローブ基質メフェニトイン（２５μＭ）の存在下、３７℃で６０分間、ヒト肝ミクロソーム（０．５ｍｇ／ｍＬ）およびＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）と共にインキュベートする。選択的ＣＹＰ２Ｃ１９阻害剤、トラニルシプロミンを、ポジティブコントロールとして試験化合物と一緒にスクリーニングする。

ＣＹＰ２Ｄ６阻害
６つの試験化合物濃度（ＤＭＳＯ中０．１、０．２５、１、２．５、１０、２５μＭ；最終ＤＭＳＯ濃度＝０．２５％）を、プローブ基質デキストロメトルファン（５μＭ）の存在下、３７℃で５分間、ヒト肝ミクロソーム（０．５ｍｇ／ｍＬ）およびＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）と共にインキュベートする。選択的ＣＹＰ２Ｄ６阻害剤、キニジンを、ポジティブコントロールとして試験化合物と一緒にスクリーニングする。

ＣＹＰ３Ａ４阻害（ミダゾラム）
６つの試験化合物濃度（ＤＭＳＯ中０．１、０．２５、１、２．５、１０、２５μＭ；最終ＤＭＳＯ濃度＝０．２６％）を、プローブ基質ミダゾラム（２．５μＭ）の存在下、３７℃で５分間、ヒト肝ミクロソーム（０．１ｍｇ／ｍＬ）およびＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）と共にインキュベートする。選択的ＣＹＰ３Ａ４阻害剤、ケトコナゾールを、ポジティブコントロールとして試験化合物と一緒にスクリーニングする。

ＣＹＰ３Ａ４阻害（テストステロン）
６つの試験化合物濃度（ＤＭＳＯ中０．１、０．２５、１、２．５、１０、２５μＭ；最終ＤＭＳＯ濃度＝０．２７５％）を、プローブ基質テストステロン（５０μＭ）の存在下、３７℃で５分間、ヒト肝ミクロソーム（０．５ｍｇ／ｍＬ）およびＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）と共にインキュベートする。選択的ＣＹＰ３Ａ４阻害剤、ケトコナゾールをポジティブコントロールとして試験化合物と一緒にスクリーニングする。

ＣＹＰ１Ａインキュベーションについては、反応をメタノールで停止し、代謝物、レゾルフィンの形成を蛍光（励起波長＝５３５ｎｍ、発光波長＝５９５ｎｍ）でモニターする。ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、およびＣＹＰ３Ａ４インキュベーションについては、反応をメタノールで停止する。次いで試料を遠心分離し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる４−ヒドロキシトルブタミド、４−ヒドロキシメフェニトイン、デキストロルファン、および１−ヒドロキシミダゾラムの同時分析用に上清を合わせる。ヒドロキシブプロピオン、６α−ヒドロキシパクリタキセルおよび６β−ヒドロキシテストステロンをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで別々に分析する。内部標準を含有する脱イオン水中ギ酸（最終濃度＝０．１％）を、分析前に最終試料に加える。ビヒクル対照と比較した、代謝物の形成の低減を使用して、ＩＣ５０値を計算する（５０％阻害をもたらす試験化合物濃度）。
結果

腎線維症のラットの片側尿管閉塞（ＵＵＯ）モデルについての一般的実験デザイン
オスのスプラーグドーリーラットには、普通の固形飼料を与え、標準的条件下で飼育し、手術前に少なくとも７日間順応させた。実験開始時に、ラットは、体重を一致させた群内に入れ、強制経口投与を介して、ビヒクル、化合物の４つの用量レベルのうちの１つ（１、３、１０、または３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した（２ｍｌ／ｋｇｐ．ｏ．ｂｉｄ）。ラットは、ノーズコーン上でイソフルラン麻酔し、開腹術を実施した。ラットには、加熱滅菌装置および無菌の外科的技法を使用して、右の尿管（ＵＵＯ）の完全な閉塞を施した。ラットには、術後直ちに５０μｌのペニシリンＧ（ｉ．ｍ．）を投与した。ラットは、清浄な、温めたケージ内で回復させてから、普通の動物施設条件に戻した。ラットには、化合物を、上記に記載されている用量で毎日２回（１２時間間隔で）続けて７日間の間投与した。手術後７日目に、ラットをイソフルランで麻酔にかけ、血清、血漿、および尿を収集した。次いで、動物を安楽死させ、腎臓を取り出し、腎臓皮質の生検を、形態学的、組織学的、および生化学的分析のために収集した。生化学的分析用のすべての組織は、液体窒素内でフラッシュ凍結し、−８０℃で保存し、組織学的分析用組織は１０％の中性緩衝化ホルマリン中で固定した。

ＥＬＩＳＡ法で腎臓のコラーゲンＩＶの量を測定することにより、および免疫組織化学法で腎臓のアルファ平滑筋アクチン陽性筋線維芽細胞の蓄積を検査することにより、腎線維症を評価した。前者に対して、凍結した腎臓皮質の小片を移送し、ＲＩＰＡ緩衝液中でホモジナイズし（ｈｏｍｅｎｇｅｎｉｚｅｄ）、次いで、４℃で１０分間、１４０００×ｇで遠心分離した。上清を予め冷やした管に収集し、タンパク質濃度を決定した。製造者の指示に従い、全タンパク質の相当量（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔａｍｏｕｎｔ）をＣｏｌＩＶＥＬＩＳＡアッセイ（Ｅｘｏｃｅｌｌ）に供した。

ホルマリン固定してパラフィン包埋した腎臓組織を、以前に記載されている通りアルファ−平滑筋アクチンで染色した（Ｓｔａｍｂｅら、ＴｈｅＲｏｌｅｏｆｐ３８Ｍｉｔｏｇｅｎ−ＡｃｔｉｖａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎＲｅｎａｌＦｉｂｒｏｓｉｓＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ、第１５巻：３７０〜３７９頁、２００４年）。

結果：
式（Ｉ）の化合物は、３〜３０ｍｇ／ｋｇの用量で、腎臓コラーゲンＩＶの誘発（図１）およびアルファ−平滑筋陽性筋線維芽細胞の蓄積（図２）を有意に減少させることが判明した。

式（Ｉ）の化合物および対照化合物に対する比較データ
以下の表は、式（Ｉ）の化合物と、２０１１年１月１３日に公開された米国特許公開第２００１／０００９５４１０Ａ１号に開示されている対照化合物ＡおよびＢとに対する比較結果を提供している。出願人は、以下で結果が比較されている実験は、同様の条件で実施されたが、必ずしも一緒に実施されたものではないことを述べておく。
表
丸括弧（）内の値は、式（Ｉ）の化合物が、示されたパラメーターについて、示された化合物より改善を示す倍数を表す。

上記比較データから以下を推定することができる：

式（Ｉ）の化合物は、化合物ＡのＥＣ_５０に匹敵するＥＣ_５０を有する。

式（Ｉ）の化合物は、化合物ＡおよびＢについてのＩＣ_５０ｓに匹敵する機能的ＩＣ_５０を有する。

式（Ｉ）の化合物は、化合物ＡのＥＣ_５０よりも４倍低く、化合物ＢのＥＣ_５０よりも３３倍低い、タンパク質結合で調整したＥＣ_５０を有する。

式（Ｉ）の化合物は、化合物ＡおよびＢと比較して、弱いＣｙｐ３Ａ４阻害剤である。

式（Ｉ）の化合物は、式Ａの化合物についてのＣＹＰ３Ａ４ＩＣ_５０／ＰＢＡｄｊ．ＥＣ_５０値よりも４３倍高く、式Ｂの化合物についてのＣＹＰ３Ａ４ＩＣ_５０／ＰＢＡｄｊ．ＥＣ_５０値よりも９２倍高い、ＣＹＰ３Ａ４ＩＣ_５０／ＰＢＡｄｊ．ＥＣ_５０値を有する。

式（Ｉ）の化合物は、式Ａの化合物についてのラットＣＬ値よりも２．７倍低く、式Ｂの化合物についてのラットＣＬ値よりも３．６倍低い、ラットＣＬ値を有する。

式（Ｉ）の化合物は、ラットにおいて、化合物Ａよりも６．８倍高く、化合物Ｂよりも１．５倍高い、バイオアベイラビリティー百分率を有する。

式（Ｉ）の化合物は、ラットにおいて、化合物Ａの半減期よりも８．６倍長く、化合物Ｂの半減期よりも３．９倍長い、半減期を有する。

上記データは、式（Ｉ）の化合物が、式ＡおよびＢの化合物と比較して、予期しないおよび有利な特性を有し、式（Ｉ）の化合物は恐らく、慢性腎疾患、肺線維症および／もしくは腎線維症、ならびに／または心臓−腎疾患の処置に対するさらなる開発のためのより良好な候補であることを正当に示唆している。

Claims

５−（４−シクロプロピル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（６−（４−イソプロピル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）ピリジン−２−イル）−２−フルオロ−４−メチルベンズアミドである、式（Ｉ）
の化合物または薬学的に許容されるその塩。
５−（（４−シクロプロピル−１Ｈ−イミダゾール（ｉｍｄａｚｏｌ）−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−（６−（４−イソプロピル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）ピリジン−２−イル）−４−メチルベンズアミドである、式（Ｉ）
の化合物。
請求項１に記載の化合物または塩の治療有効量と、薬学的に許容されるキャリアとを含む、医薬組成物。
請求項２に記載の化合物の治療有効量と、薬学的に許容されるキャリアとを含む、医薬組成物。
慢性腎疾患を処置する方法であって、請求項２に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
糖尿病性腎症を処置する方法であって、請求項２に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
腎線維症、肝線維症、または肺線維症を処置する方法であって、請求項１に記載の化合物または塩の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
糖尿病性腎疾患を処置する方法であって、請求項１に記載の化合物または塩の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
慢性腎疾患の処置のための医薬品の製造における、請求項１に記載の化合物または塩の使用。
治療における請求項１に記載の化合物または塩の使用。
２−アミノ，５−（４−イソプロピル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）ピリジンである、式：
の中間体またはその塩もしくは保護された形態。
５−（４−シクロプロピル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−フルオロ−４−メチル安息香酸である、式：
の中間体、その塩または保護された形態。