CN104080771A - 细胞凋亡信号调节激酶抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种如通式(I)所示的化合物；该化合物具有细胞凋亡信号调节激酶(“ASK1”)抑制活性，因此可用于对肾病、糖尿病性肾病和肾脏纤维化等疾病的治疗。

Description

细胞凋亡信号调节激酶抑制剂
技术领域
本发明涉及一种用于治疗ASK1-介导的疾病的新型化合物。本发明还涉及制备该化合物的中间体和含有所述新型化合物的药物组合物。
背景技术
细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)是促***原活化蛋白激酶激酶激酶(“MAP3K”)家族的成员，该MAP3K家族激活c-Jun氨基末端蛋白激酶(“JNK”)和p38MAP激酶(Ichijo，H.，Nishida，E.，e，K.，Dijke，P.T.，Saitoh，M.，Moriguchi，T.，Matsumoto，K.，Miyazono，K.，and Gotoh，Y.(1997)Science，275，90-94)。
ASK1可以被各种刺激激活，包括氧化压力、活性氧类(ROS)、LPS、TNF-a、FasL、ER压力和细胞内钙浓度升高(Hattori，K.，Naguro，I.，Runchel，C，and Ichijo，H.(2009)CellComm.Signal.7:1-10；Takeda，K.，Noguchi，T.，Naguro，I.，and Ichijo，H.(2007)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.48:1-8.27；Nagai，H.，Noguchi，T.，Takeda，K.，and Ichijo，I.(2007)J.Biochem.Mol.Biol.40:1-6)。
ASK1蛋白的磷酸化可以导致细胞凋亡或其他细胞反应，取决于细胞类型。据报告，ASK1的激活和信号传递在许多疾病中都扮演了重要角色，包括神经变性疾病、心血管疾病、炎症、自体免疫性疾病和新陈代谢紊乱。此外，ASK1还涉及到介导心脏、大脑和肾脏局部缺血和再灌注后的器官损伤(Watanabe et al.(2005)BBRC333，562-567；Zhang et al，(2003)Life Sci 74-37-43；Terada et al.(2007)BBRC364:1043-49)。
据报告，ROS与肾脏内炎性细胞因子的生成增加、纤维化、细胞凋亡和细胞坏死有关(SinghDK，Winocour P，Farrington K.Oxidative stress in early diabetic nephropathy:fueling the fire.NatRev Endocrinol2011Mar；7(3):176-184；Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biologyof diabetic complications.Nature2001Dec13；414(6865):813-820；Mimura I，Nangaku M.The suffocating kidney:tubulointerstitial hypoxia in end-stage renal disease.Nat Rev Nephrol2010Nov；6(11):667-678)。
此外，氧化压力促进糖基化终产物(AGEs)的形成，AGEs导致进一步肾损伤和ROS生成(HungKY，et al.N-acetylcysteine-mediated antioxidation prevents hyperglycemia-induced apoptosis andcollagen synthesis in rat mesangial cells.Am J Nephrol2009；29(3):192-202)。
肾脏的肾小管间质纤维化是慢性肾病患者肾衰竭发展的重要预测因子(Schainuck LI，et al.Structural-functional correlations in renal disease.Part II:The correlations.Hum Pathol1970；1:631-641.)。
大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)是广泛应用的肾小管间质纤维化模型。UUO导致肾小管发炎、转化生长因子(TGF-β)表达增加以及成纤维细胞积累；成纤维细胞分泌基质蛋白，例如胶原蛋白和纤连蛋白。该UUO模型可用于测试一种药物通过抑制肾纤维化来治疗慢性疾病的潜力(Chevalier et al.，Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructivenephropathy，Kidney International(2009)75，1145-1152)。
因此，有可能将具有ASK1信号传递抑制剂作用的治疗剂用于治疗患有例如神经变性疾病、心血管疾病、炎症、自体免疫性疾病和新陈代谢紊乱等疾病或症状的患者或改善其生活。特别地，ASK1抑制剂有潜力治疗心肾疾病，包括肾病、糖尿病性肾病、慢性肾病、纤维化疾病(包括肺和肾纤维化)、呼吸道疾病(包括慢性阻塞性肺病(COPD)和急性肺部损伤)、急性和慢性肝病。
美国公开号2007/0276050的专利描述了鉴别可用于预防和/或治疗心血管疾病的ASK1抑制剂的方法，以及可用于预防和/或治疗动物心血管疾病的方法。
WO2009027283公开了***并吡啶化合物、用于制备该化合物的方法以及用于治疗自体免疫紊乱、验证、心血管疾病和神经变性疾病的方法。
2011年1月13日公布的美国专利公开号2001/00095410A1公开了可用作ASK-1抑制剂的化合物。美国专利公开号2001/00095410A1涉及如通式(I)所示的化合物：
其中：
R1选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基，所有这些基团不被取代，或可选地，被1、2或3个选自下列基团的取代基取代：卤素、氧代基、烷基、环烷基、杂环基、芳基、芳氧基、-NO2、R6、-C(O)-R6、-OC(O)-R6-C(O)-O-R6、-C(O)-N(R6)(R7)、-OC(O)-N(R6)(R7)、-S-R6、-S(＝O)-R6、-S(＝O)2R6、-S(＝O)2-N(R6)(R7)、-S(＝O)2-O-R6、-N(R6)(R7)、-N(R6)-C(O)-R7、-N(R6)-C(O)-O-R7、-N(R6)-C(O)-N(R6)(R7)、-N(R6)-S(＝O)2-R6、-CN和-O-R6。
其中，所述烷基、环烷基、杂环基、苯基、苯氧基不被取代或可选地被1、2或3个选自下列基团的取代基取代：烷基、环烷基、烷氧基、羟基和卤素；其中，R6和R7独立地选自以下基团：氢、C1-C15烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，且这些基团不被取代或可选地被1-3个选自下列基团的取代基取代：卤素、烷基、单烷基氨基或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺基、-CN、低级烷氧基、-CF3、芳基和杂芳基；或
当R6andR7通过N连接在一起时，形成杂环；
R2选自氢、卤素、氰基、烷氧基或烷基，其中烷基不被取代或可选地被卤素取代；R3选自芳基、杂芳基或杂环基，这些基团不被取代或可选地被一个或多个选自以下基团的取代基取代：烷基、烷氧基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基、杂环基烷基、卤素、氧代基、-NO2、卤代烷基、卤代烷氧基、-CN、-O-R6、-O-C(O)-R6、-O-C(O)-N(R6)(R7)、-S-R6、-S(＝O)-R6、-S(＝O)2R6、-S(＝O)2-N(R6)(R7)、-S(＝O)2-O-R6、-N(R6)-C(O)-R7、-N(R6)-C(O)-O-R7、-N(R6)-C(O)-N(R6)(R7)、-C(O)-R6、-C(O)-O-R6、-C(O)-N(R6)(R7)和-N(R6)-S(＝O)2-R7，其中所述烷基、烷氧基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基不被取代或可选地被一个或多个选自下列基团的取代基取代：卤素、氧代基、-NO2、烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、-N(R6)(R7)、-C(O)-R6、-C(O)-O-R6、-C(O)-N(R6)(R7)、-CN、-O-R6、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基；
其必要限定条件是：杂芳基或杂环基部分包括至少1个成环氮原子；
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7和X8是独立的C(R4)或N，其中，每个R4均独立选自氢、烷基、烷氧基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、卤素、-NO2、卤代烷基、卤代烷氧基、-CN、-O-R6、-S-R6、-N(R6)(R7)、-S(＝O)-R6、-S(＝O)2R6、-S(＝O)2-N(R6)(R7)、-S(＝O)2-O-R6、-N(R6)-C(O)-R7、-N(R6)-C(O)-O-R7、-N(R6)-C(O)-N(R6)(R7)、-C(O)-R6、-C(O)-O-R6、-C(O)-N(R6)(R7)或-N(R6)-S(＝O)2-R7其中烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基不被取代或进一步可选地被一个或多个选自以下基团的取代基所取代：卤素、氧代基、-NO2、-CF3、-O-CF3、-N(R6)(R7)、-C(O)-R6、-C(O)-O-R7、-C(O)-N(R6)(R7)、-CN、-O-R6；或者
X5和X6、或X6和X7，连接在一起提供作为可选取代基的稠合芳基或作为可选取代基的稠合杂芳基；以及
其必要限定条件为：X2、X3和X4中的至少1个是C(R4)；
X5、X6、X7和X8中的至少2个是C(R4)；以及
X2、X3、X4、X5、X6、X7和X8中的至少1个是N。
即使已存在上述公开，仍存在对在ASK1激活相关疾病的治疗中具有提高的药代动力学和/或药效动力学表现的有效化合物的需要。
令人吃惊的是，申请人在美国专利公开号US2011/0009410A的范围中发现了一种新型化合物；与该公开中的化合物相比，该新型化合物总体上表现出良好的有效性、提高的药代动力学和/或药效动力学表现。
发明内容
本发明涉及一种如下通式所示的化合物：
，或其药学上可接受的盐。
在其中一个实施例中，本发明涉及通式(I)所示化合物在治疗需要ASK1抑制剂治疗的患者中的用途。
在另一个实施例中，本发明涉及一种药物组合物，包括治疗有效量的通式(I)化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。
在另一个实施例中，本发明涉及一种治疗糖尿病性肾病或糖尿病并发症的方法，包括：向需要治疗所述疾病的患者给予治疗有效量的通式(I)化合物或其药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，本发明涉及一种治疗肾病或糖尿病性肾病的方法，包括：向需要治疗所述疾病的患者给予治疗有效量的通式(I)化合物或其药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，本发明涉及一种治疗肾脏纤维化、肝脏纤维化、肺纤维化或特发性肺间质纤维化(IPF)的方法，包括：向需要治疗所述疾病的患者给予治疗有效量的通式(I)化合物或其药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，本发明涉及一种治疗糖尿病性肾病、糖尿病肾病、肾脏纤维化、肝脏纤维化或肺纤维化的方法，包括：向需要治疗所述疾病的患者给予治疗有效量的通式(I)化合物或其盐。
在另一个实施例中，本发明涉及可用于合成通式(I)化合物的中间体。
在另一个实施例中，本发明涉及通式(I)化合物或其药学上可接受的盐在治疗慢性肾病中的用途。
在另一个实施例中，本发明涉及通式(I)化合物或其药学上可接受的盐在治疗糖尿病性肾病中的用途。
在另一个实施例中，本发明涉及通式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗慢性肾病的药剂中的用途。
在又一个实施例中，本发明涉及通式(I)化合物在治疗中的用途。
附图说明
图1是单侧输尿管梗阻的大鼠在7日内每日两次地接受1、3、10或30mg/kg的载体或通式(I)化合物后的胶原蛋白IV水平。
图2是单侧输尿管梗阻的大鼠在7日内每日两次地接受1、3、10或30mg/kg的载体或通式(I)化合物后，以α-平滑肌肌动蛋白(活化肌成纤维细胞的标记物)染色的肾皮质切片的典型图像。
具体实施方式
定义和常规参数
本文中所用的下列词语和短语，除另有说明外，其定义如下所述。若未给出说明或定义，则应采用该词语或短语在相关词典或本领域技术人员所知的常规用法中的普通定义。
本文中所称术语“慢性肾病”，指的是随时间逐渐丧失肾脏功能，典型为发生在数月甚至数年间。慢性肾病(CKD)由合格的护理人员采用本领域技术人员所知的恰当信息、测试或标记物来诊断。不言而喻，慢性肾病包括肾病。
本文中所称术语“糖尿病性肾病”，指的是由糖尿病所引起、加重或作为糖尿病并发症的肾病。这是慢性肾病的一种类型，出现在约30％的糖尿病患者中，定义为：存在蛋白尿和/或肾功能受损的糖尿病(即，肾小球滤过率降低(参见de B，I，et al.Temporal trends in the prevalenceof diabetic kidney disease in the United States.JAMA2011Jun22；305(24):2532-2539))。
本文中所称术语“药学上可接受的盐”，指的是潜在药学化合物(例如，通式(I)化合物)的能够保持其生物效力和性能且在生物学及其他方面无害的盐，可以是酸加成盐或碱加成盐。药学上可接受的酸加成盐可以用无机酸和有机酸来制备。
可用于与潜在化合物反应并生成药学上可接受盐的酸或碱(分别生成酸加成盐或碱加成盐)是本领域技术人员所熟知的。类似地，从潜在化合物(根据公开内容)制备药学上可接受盐的方法也是本领域技术人员所熟知的，并在例如Berge，at al.Journal of Pharmaceutical Science，Jan.1977vol.66，No.1及其他来源中均有公开。无机酸衍生的盐包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的盐。有机酸衍生的盐包括但不限于马来酸、富马酸、酒石酸、对甲苯磺酸等的盐。可用于生成碱加成盐的碱为本领域技术人员所熟知。如通式(I)所示的化合物的药学上可接受盐的一个例子为，通式(I)化合物的盐酸盐。
本文中所称术语“药学上可接受的载体”，指的是如溶剂、稀释剂、分散介质、包覆层、抗细菌和抗真菌的药剂、等渗和吸收延迟药剂等不损害本发明的化合物或其用途的赋形剂或药剂。所述载体和药剂在制备药学活性物质中的应用为本领域技术人员所熟知(例如参见Remington's Pharmaceutical Sciences，Mace Publishing Co.，Philadelphia，PA17th Ed.(1985)；and Modern Pharmaceutics，Marcel Dekker，Inc.3rd Ed.(G.S.Banker&C.T.Rhodes，Eds.)。
本文中所称术语“心肾疾病”，指的是由如高血压引起的心血管问题所导致或加重的肾功能相关疾病。高血压被认为是肾病的主要起因。
本文中所称术语“呼吸道疾病”，指的是包括慢性阻塞性肺病(COPD)和特发性肺纤维化(IPF)在内的疾病。
本文中所称术语“治疗有效量”，指的是向需要此类治疗的患者(尤其是人类)给药一剂或多剂后，足以对治疗产生如下文所述作用的通式(I)化合物剂量。该治疗有效量根据患者、疾病、患者体重和/或年龄、疾病严重程度或由具备资格的开药者或护理者所决定的给药方式而变化。
本文中所称术语“治疗”，指的是为了以下目的给予通式(I)化合物或其医学上可接受的盐：
(i)延缓疾病发生，即，使得该疾病的临床症状的发展停滞或延缓；
(ii)抑制疾病，即，组织临床症状的发展；和/或
(iii)减轻疾病，即，使得临床症状或其严重程度发生退化。
在一个优选实施例中，本发明涉及通式(I)化合物在治疗慢性肾病中的用途，包括：向需要治疗所述疾病的患者给予治疗有效量。
在又一个优选实施例中，本发明涉及通式(I)化合物在治疗糖尿病性肾病中的用途，包括：向需要治疗所述疾病的患者给予治疗有效量。
在又一个优选实施例中，本发明涉及通式(I)化合物在治疗肺纤维化或肾纤维化中的用途，包括：向需要治疗所述疾病的患者给予治疗有效量。
治疗药剂的半抑制浓度(IC50)，是该治疗药剂对目标酶产生50％最大抑制性的必要浓度。预期目的在于找到一种治疗药剂，例如一种低IC50的细胞凋亡信号调节激酶(ASK1)抑制剂。如此一来，能够通过使用较低剂量的ASK1酶抑制剂作为治疗药剂，将有害副作用降到最低。
类似地，预期目的还在于发现一种具有低解离常数(Kd)的治疗药剂。Kd用于描述配体(例如治疗药剂)和对应激酶或受体之间的亲和力，即，Kd是一种治疗药剂与特定激酶(例如，细胞凋亡信号调节激酶ASK1)结合紧密度的量度。因此，药物研发中一般更倾向于较低的Kd。
类似地，预期目的还在于，发现一种具有低EC50的化合物。EC50是药物在细胞中达到50％最大效力所需浓度。EC50值对应于测试介质中达到50％最大效力的药物浓度。因此，药物研发中一般更倾向于较低的EC50。
EC50相关的一个有用量度是蛋白结合校正EC50(本文称为PBadj-EC50)。该数值测量的是药物(例如通式(I)化合物)达到50％最大效力时，未与蛋白质结合的药物部分的相关数量。该数值测量以目标反应点处可用药物量来校正后的药物效力或与其具有相关性的药物效力。
另一预期目的在于，获得一种化合物，该化合物在以CACO细胞渗透性研究中的方法进行测定时，具有低细胞膜外排比率。优选为低于3.0的外排比率((B/A)/(A/B))。若化合物的该比率超过3，则会从细胞中活跃而迅速地外排，可能无法在细胞中充分停留来达到最大效力。
另一预期目的在于，找到一种呈现最小脱靶抑制效应的药物，即对Cyp450(细胞色素p450)酶抑制作用最小的药物。更为具体地说，需要一种对P450酶中最重要的cyp3A4抑制性弱的药物。弱抑制剂指的是，提高血浆AUC值至少1.25倍但少于2倍，或降低20-50％的血浆清除率的化合物(wikipedia.org/wiki/cyp3A4，访问于11/12/11)。总的来说，一种化合物对Cyp3A4呈现的IC50若超过10uM，则认为其是一种弱抑制剂。
一种可用于对比待选药物的Cyp3A4抑制效应的量度，是Cyp3A4抑制效应和蛋白结合校正EC50的比值。该数值表示以每种药物专有的蛋白结合校正EC50校正后的cyp抑制相对潜力。该量度优选为较高比值，因为较高比值暗示着低cyp3A4抑制潜力。
出乎意料且有利地，申请人在美国专利公开号No.2001/00095410A1的一般范围内发现了一种化合物(如本文通式(I)所示)，其与美国专利公开号No.2001/00095410A1中所公开的结构相近的化合物相比(本文中称为化合物A和B)更有优势。
因此，本发明的目的包括但不限于，提供一种如通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，以及使用通式(I)化合物治疗肾病、慢性肾病、糖尿病性肾病、糖尿病肾病、肾纤维化或肺纤维化的方法。
联合疗法
接受心肾疾病(如慢性肾病)治疗的患者，可能从联合药物疗法中受益。例如，本发明的药物可以与以下药物联合使用：一种或多种血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，例如依那普利、卡托普利、雷米普利、赖诺普利和喹那普利；或血管紧张素II受体阻断剂(ARB)，例如氯沙坦、奥美沙坦和厄贝沙坦；或抗高血压剂，如氨氯地平、硝苯地平和非洛地平。联合用药的好处在于，可以提高一种成分的效力和/或降低其副作用，因为可以通过降低该成分的剂量来降低其副作用，同时因通式(I)化合物和/或其他活性成分的效力令药效提高而受益。
患有可用ASK1抑制剂(如通式(I)化合物)治疗的慢性肾病的患者，其症状也可能受益于治疗药剂或抗生素、止痛剂、抗抑郁剂和/或抗焦虑药剂与通式(I)化合物的联合给药(根据合格护理者的指示)。
根据合格护理者的指示，联合治疗可以是同时给药或间隔轮流给药，或是两种或以上活性药剂的固定剂量(所有活性成分合并在单一剂型例如药片中)。
药物组合物和给药
本发明的化合物可以药物组合物的形式给药。因此，本发明提供一种含有通式(I)化合物或其药学可接受盐作为活性成分的药物组合物，该药物组合物还含有一种或多种药学可接受的赋形剂和/或载体，包括惰性固体稀释剂和填充剂、稀释剂(包括无菌水溶液和各种有机溶剂)、渗透促进剂、增溶剂和佐剂。
该药物组合物可以单独给药，或与其他治疗药剂联合给药。组合物的递送方式可以制备为固体片剂、胶囊、锭剂、软膏剂、皮肤贴剂、缓释剂、快速崩解片剂、吸入制剂等。典型的药物组合物制备和/或给药方法和/或步骤为药学领域所熟知(例如参见Remington'sPharmaceutical Sciences，Mace Publishing Co.，Philadelphia，PA17th Ed.(1985)；以及ModernPharmaceutics，Marcel Dekker，Inc.3rd Ed.(G.S.Banker&C.T.Rhodes，Eds.)。
包含通式(I)化合物的联合治疗的剂型可以是以本领域技术人员所知的步骤制成的固定剂量制型，例如片剂、酏剂、液体制剂、软膏剂、吸入剂、凝胶剂等。
通式(I)化合物的药物组合物可以通过以下方式单剂或多剂给药：通过包括例如直肠、口腔、鼻内和透皮途径在内的途径；通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌内、皮下、口服、局部敷用，作为吸入剂，或者通过浸渍或涂布装置诸如支架，或***动脉的圆柱形聚合物。最优选的给药途径包括口服，肠胃外和静脉给药。
通式(I)化合物可以以药学有效剂量给药。对于口服给药，每剂量单位优选为含有1-500mg通式(I)化合物，更优选的剂量为1-250mg，尤为优选的剂量为约20-50mg，每天给药两次。但可知晓，实际给药的化合物剂量将由知晓相关情况的医生决定，所述相关情况包括待治疗症状、选定给药途径、联合给药的化合物(若适用)、患者的年龄、体重、反应、患者症状严重程度等。
命名法
本发明的化合物名称是使用ChemBioDraw Ultra11软件生成的。
为5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1，2，4-***-3-基)吡啶-2-基)-2-氟-4-甲基苯甲酰胺，亦称为5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1，2，4-***-3-基)吡啶-2-基)-4-甲基苯甲酰胺。
通式(I)化合物的合成
本发明的化合物可以用本文所公开的方法或根据本公开而显而易见的改进方法进行制备。本发明化合物的合成可以如下列实施例中所述般进行。适用药剂可以从Sigma Aldrich或其他化学品供应商处购得。可选地，可以采用本领域技术人员所知的反应流程和方法来制备试剂。
合成反应参数
术语“溶剂”、“惰性有机溶剂”或“惰性溶剂”指的是一种在此述的实验条件下为惰性的溶剂，例如，苯、甲苯、乙腈、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、氯仿、亚甲基氯(或称二氯甲烷)、***、石油醚(PE)、甲醇、吡啶、乙酸乙酯(EA)等。除非另有说明，本发明的反应中所用的溶剂均为惰性有机溶剂，且这些反应是在惰性气体(优选为氮气)环境下进行的。
通式(I)化合物的一种制备方法如下反应流程1和2所示。
流程1
制备化合物A
取含有甲基6-氨基吡啶(432g，2.84mol)的MeOH溶液(5L)，加入NH2NH2.H2O(284g，5.68mol，2.0eq.)。将此反应混合物回流加热3小时，然后冷却至室温。过滤收集该混合物中形成的沉淀物，以EA(2LX2)洗涤，然后真空干燥以获得白色固体状的化合物A(405g，94％产率)。
制备化合物B
取含化合物A(405g，2.66mol)的二甲基甲酰胺-二甲基乙缩醛(DMF-DMA)混合物(3.54L)，回流加热18小时，冷却至室温，然后减压浓缩。用EA(700ml)吸收残留物并以50℃加热20分钟，冷却到室温后，过滤收集固体并真空干燥以获得白色固体状的化合物A(572g，82％产率)。
制备化合物B
取含化合物B(572g，2.18mol)的CH3CN-AcOH混合物(3.6L，4:1)，加入丙-2-胺(646g，5.0eq.)，将所得混合物回流加热24小时，冷却至室温，然后减压去除溶剂。用水(2.8L)溶解残留物，并加入1N NaOH水溶液直到pH为8.0H。过滤收集沉淀，并用EA(500mLx3)提取滤液。用无水Na2SO4干燥合并的有机相，然后浓缩至150mL体积。在0℃下，缓慢地向该混合物加入PE(400mL)，并过滤所得悬液。然后令合并固相从EA-PE重结晶，得到白色固体状的化合物C(253g，57％产率)。
1H-NMR(400MHz，CDC13):δ8.24(s，1H)，7.52(m，2H)，6.51(dd，J＝1.6，7.2Hz，1H)，5.55(m，1H)，4.46(bs，2H)，1.45(d，J＝6.8Hz，6H).MS(ESI+)m/z:204(M+1)+.
化合物C是合成通式(I)化合物的关键中间体。因此，本发明的目的之一还在于提供用于制备通式(I)化合物的该中间体化合物C，
其盐或其保护形式。化合物C的盐的一个例子是HCl加成盐。化合物C的保护形式的一个例子是用例如Cbz-Cl制得的氨基甲酸酯化合物。保护基及其制备和应用的教导可见Peter G.M.Wuts and Theodora W.Greene，Protective Groups in Organic Chemistry，2nd edition，1991，Wileyand Sons，Publishers。
流程2
继续制备通式(I)化合物：
化合物6是合成通式(I)化合物的关键中间体。因此，本发明的目的之一还在于提供用于制备通式(I)化合物的中间体化合物6，
其盐或其保护形式。化合物6的盐的一个例子是HCl加成盐。化合物6的保护形式的一个例子是用例如Cbz-Cl制得的酯(例如，甲基、乙基或苯甲基酯)或氨基甲酸酯化合物。保护基及其制备和应用的教导可见Peter G.M.Wuts and Theodora W.Greene，Protective Groups inOrganic Chemistry，2nd edition，1991，Wiley and Sons，Publishers。
步骤1-制备5-氨基-2-氟-4-对甲苯腈——化合物(2)
从5-溴-4-氟-2-对甲苯腈(1)开始，将其(20g，98mmol)溶解在无水1-甲基吡咯烷酮(100mL)中，并加入铜(I)氰化物(17.6g，196mmol)。在180℃下加热反应3小时，冷却至室温，加入水(300mL)和浓氢氧化铵(300mL)。将混合物搅拌30分钟，并用EA(3x200mL)萃取。用硫酸镁干燥所得的合并萃取物，然后减压去除溶剂。用己烷(2x100mL)洗涤油状残留物，用二氯甲烷溶解该固体并装载到硅胶柱上。用0至25％EA的己烷梯度溶液洗脱，得到5-氨基-2-氟-4–甲基苯甲腈(10.06g，67.1mmol)。LC/MS(m/z:151M+1)。
步骤2-制备5-(2-环丙基-2-氧代乙基氨基)-2-氟-4-甲基苯甲腈——化合物(3)
取5-氨基-2-氟-4-甲基苯甲腈(12g，80mmol)，在氮气环境下溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(160mL)中，然后加入固体碳酸钾(13.27g，96mmol)和碘化钾(14.61g，88mmol)同时搅拌。在室温下搅拌反应5分钟，然后加入溴甲基环丙基酮(20.24mL，180mmol)。将反应混合物加热至60℃保持3小时，然后减压除去溶剂。将残余物溶解于EA(400mL)中，并用400mL水洗涤。将有机层用硫酸镁干燥，并在减压下除去溶剂。将残余物重新溶解于最小量的EA中，并以己烷：EA＝3:1的体积比加入己烷。产物从溶液中析出，并通过过滤收集，得到5-(2-环丙基-2-氧代乙基氨基)-2-氟-4-甲基苯甲腈(14.19g，61.2mmol)。LC/MS(m/z：233，M+1)。
步骤3-制备5-(4-环丙基-2-巯基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲腈——化合物(4)
取5-(2-环丙基-2-氧代乙基氨基)-2-氟-4-甲基苯甲腈(14.19g，61.2mmol)溶于冰醋酸(300mL)。加入固体硫氰酸钾(11.9g，122.4mmol)，同时搅拌。将反应混合物加热至110℃并保持4小时，然后减压除去溶剂。将残余物溶于二氯甲烷(200mL)中，用200mL水洗涤。用额外的二氯甲烷(2×200mL)萃取水性萃取液，合并有机萃取液并用硫酸镁干燥。减压除去溶剂，将油状残余物再溶解于EA(50mL)和150mL己烷中。形成深色层后，向烧瓶中加入搅拌棒。剧烈搅拌下，产品沉淀为桃红色固体。过滤收集产物，得到5-(4-环丙基-2-巯基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲腈(14.26g，52.23mmol)。Anal.LC/MS(m/z：274，M+1)。
步骤4-制备5-(4-环丙基-1H-咪唑-2-基)-2-氟-4-甲基苯甲腈——化合物(5)
在一个500mL的三颈圆底烧瓶中加入乙酸(96mL)、水(19mL)及过氧化氢(30％，7.47mL，65.88mmol)。在氮气环境下将混合物搅拌加热至45℃，同时监测内部温度。然后，在30分钟内分小份加入固体5-(4-环丙基-2-巯基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲腈(6.00g，21.96mmol)，同时保持内部温度低于55℃。当完成硫代咪唑的加入后，在45℃下搅拌反应30分钟，然后冷却至室温，并缓缓加入20％wt/wt的亚硫酸钠(6mL)水溶液。将混合物搅拌30分钟后，减压除去溶剂。将残余物悬浮在250mL水中，并加入4N氢氧化铵水溶液直至pH约为10。用二氯甲烷(3×200ml)萃取混合物，合并有机相，并用硫酸镁干燥，然后在减压下除去溶剂。将残余物溶解在20ml的EA中，边搅拌边加入80mL己烷。将溶剂滗析掉，余下油状残余物。重复该过程，获得粘稠油状的产物5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲腈(5.14g，21.33mmol)。Anal.LC/MS(M/Z：242，M+1)。
步骤5-制备5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲酸盐酸盐(6)
取5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲腈(11.21g，46.50mmol)置于装配有回流冷凝器的圆底烧瓶中，并将其悬浮在38％的盐酸(200mL)中。将混合物加热至100℃并保持4.5小时，然后冷却至室温。减压除去溶剂，得到粉红色固体，向其中加入100mLEA。过滤收集固体产物，并用3×100mL的EA洗涤。向所得固体产物中加入100mL含10％甲醇的二氯甲烷溶液，搅拌混合物，并过滤收集滤液。用100mL含10％甲醇的二氯甲烷溶液重复该步骤2次。合并滤液，并在减压下除去溶剂，得到粗5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲酸盐酸盐。未进行进一步纯化(11.13g，37.54mmol)。Anal.LC/MS(m/z：261，M+1)。
步骤6-制备5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1，2，4-***-3-基)吡 啶-2-基)-4-甲基苯甲酰胺——通式(I)
取5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲酸盐酸盐(1.5g，5.07mmol)，在室温下悬浮在无水1,2-二氯乙烷(25mL)中。在氮气下搅拌并加入草酰氯(0.575mL，6.59mmol)，然后加入N，N-二甲基甲酰胺(0.044mL，0.507mmol)。在室温下搅拌混合物4小时，然后减压除去溶剂。将残余物溶解在25mL无水二氯甲烷中。在氮气环境下搅拌并迅速加入6-(4-异丙基-4H-1，2，4-***-3-基)吡啶-2-胺(1.13g，5.58mmol)(化合物C)和4-二甲氨基吡啶(0.62g，5.07mmol)。在室温下搅拌反应混合物2小时，并加入水饱和的NaHCO3(15mL)。搅拌混合物10分钟，分离各层，并用1×20mL二氯甲烷洗涤水性层。将合并的有机层干燥(MgSO4)、过滤并浓缩。将残余物溶解在最小量的CH3CN中，并缓缓加入水，直至混合物中析出固体颗粒。过滤收集固体并干燥，得到96％纯度的5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1，2，4-***-3-基)吡啶-2-基)-4-甲基苯甲酰胺(1.28g，2.88mmol)。Anal.LC/MS(m/z：446，M+1)。该材料用RP-HPLC(反相HPLC)进一步纯化，得到分析纯的盐酸盐样品。
C24H24FN7O-HCI.446.2(M+1).1H-NMR(DMSO):δ11.12(s，1H)，9.41(s，1H)，9.32(s，1H)，8.20(d，J＝8.4Hz，1H)，8.07(t，J＝8.4Hz，1H)，7.95(d，J＝6.4Hz，1H)，7.92(d，J＝7.6Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.59(d，J＝10.4Hz，1H)，5.72(sept，J＝6.8Hz，1H)，2.29(s，3H)，2.00-2.05(m，1H)，1.44(d，J＝6.8Hz，6H)，1.01-1.06(m，2H)，0.85-0.89(m，2H).
生物学分析
ASKI(细胞凋亡信号调节激酶1)TR-FRET激酶鉴定(生化IC50)
为了测定化合物抑制ASKl激酶活性的能力，采用时间分辨荧光能量共振转移[TR-FRET]测定法，利用生物素化的髓鞘碱性蛋白[生物素-MBP]作为蛋白质底物。使用Beckman Biomek FX液体处理机器人来将含化合物的2.44％DMSO水溶液以2μL/每孔加入低容量384孔聚丙烯板[Nunc公司，#267460]，使得激酶测定中的化合物终浓度在0.5nM-100μM之间。使用DeeracFluidics Equator以3μL/每孔的浓度将含0.667ng/μL[Upstate Biotechnologies公司，#14-606，或等同的实验室自制蛋白质]和0.1665ng/mL生物素-MBP[Upstate Biotechnologies公司，#13-111]的缓冲液(85mM MOPS，pH7.0，8.5mm乙酸镁，5％甘油，0.085％NP-40，1.7mmDTT和1.7mg/mLBSA)分配至含有化合物的平板中。
将该酶与化合物一起预培养20分钟，然后使用Deerac Fluidics Equator以5μL/每孔加入额外的300μΜATP缓冲液(50mM MOPS，pH值7.0，5mM乙酸镁，1mM DTT，5％DMSO)，以开始激酶反应。在室温下进行20分钟的激酶反应，随后使用Deerac300μΜ以5μL/每孔加入25mM EDTA，令反应停止。使用Biomek FX取1μL/孔每种完成的激酶反应物，移入含有5μL/孔检测试剂(含1.1nM Eu-W1024标记的抗磷酸苏氨酸抗体[PerkinElmer公司，#AD0094]和55.56nM链霉亲和别藻蓝蛋白[PerkinElmer公司，CR130-100]的LANCE检测缓冲液[PerkinElmer公司，#CR97-100])的OptiPlate-1536白色聚苯乙烯板[PerkinElmer公司，#6004299]。在室温下培养所述平板2小时后，以Perkin Elmer Envision平板分析仪读取所述平板上的TR-FRET信号。
通过交换上述EDTA和ATP溶液的添加顺序，生成100％抑制性的阳性对照孔。这些孔和含2.44％DMSO斑点的0％抑制孔，在测定开始时用于计算测试化合物的抑制百分比。
实验结果
通式(I)化合物抑制ASK1的IC50为3.0nM。该数据暗示，通式(I)化合物能够在竞争配体ATP的存在下有效抑制ASK1。
在上述检测的更新版本中，采用TR-FRET ASK1检测来测试本发明化合物对ASK1的抑制活性，TR-FRET ASK1检测能测定从ATP转移至多肽底物的磷酸数量。
材料与方法
反应试剂
去磷酸化重组人ASK1激酶来自Gilead Sciences公司。小分子激酶抑制剂星孢菌素(货号#S6942)和二硫苏糖醇(DTT公司，货号#43815-5G)来自Sigma Chemicals公司(圣路易斯，密苏里州)。ATP(货号#7724)来自Affymetrix公司(圣g拉拉，加利福尼亚州)，通式(I)化合物来自Gilead Sciences公司。HTRF KinEASETM-STK S3试剂盒来自Cisbio公司(贝德福德，马萨诸塞州)。所有其他试剂均是市面上有售的最高等级试剂。
分析
该分析通过使用HTRF(6.1)检测来测量ASK1激酶对生物素化多肽底物的磷酸化水平。这是一项基于Cisbio(6.1)的KinEASETM-STK手册的竞争性时间分辨荧光能量共振转移(TR-FRET)免疫测定法。取测试化合物、1μΜSTK3多肽底物、4nM ASK1激酶，与含有10mM乙酸镁、0.025％NP-40、1mM DTT、0.05％BSA和1.5％甘油的10mM MOP缓冲液培养30分钟，然后加入100DM ATP来开始激酶反应，并培养3小时。加入以含有10mM EDTA和125nM链霉亲和素XL665的1X Eu3+穴状化合物缓冲液标记的多肽抗体，以终止反应，并用PerkinElmer公司的Envision2103多标记分析仪检测磷酸化多肽底物。在615nm(穴状化合物)和665nm(XL665)处测量荧光，并对每孔计算615nm/665nm比率。所得TR-FRET水平(615nm/665nm比率)与磷酸化水平成比例。在所述分析条件下，多肽底物的磷酸化程度与时间和酶浓度呈线性关系。该分析体系产生稳定一致的Km结果和酶比活性。对于抑制性实验(IC50值)，以恒定浓度的ATP、多肽和若干固定浓度的抑制剂来测定酶活性。使用星孢菌素(非选择性激酶抑制剂)作为阳性对照。所有酶活性数据均报告为4个样本测定值的平均值。
数据分析
按以下公式计算IC50值：
y＝酶活性范围/{1+(x/IC50)S}+背景值
其中x和y分别代表抑制剂浓度和酶活性。酶活性表达为从ATP结合到底物多肽中的磷酸量。范围是y最大范围(无抑制剂，DMSO对照)且s是斜率因子(6.2)。
实验结果
在此实验条件下，通式(I)化合物所呈现出的IC50值为3.2nM。该数据显示，通式(I)化合物是ASK-11受体的一种有效抑制剂。
ASK1(细胞凋亡信号调节激酶1)293细胞水平测定(细胞EC50)
对于稳定表达AP-1：荧光素酶报告基因构建体的细胞(293/APl–Luc细胞，Panomics公司，邓巴顿环街6519号，福利蒙特市，加利福利亚州)，测定化合物在其细胞中的效能。以表达活跃激酶ASK1(大鼠ASK1cDNA631-1381)的腺病毒来感染细胞，这将激活AP-1转录因子，增加荧光素酶的表达。ASK-1抑制剂将降低ASK1的酶活性，由此降低AP-1转录因子活性和荧光素酶的表达。
1.实验方案材料要求
2.参考材料
Panomics293/AP1–Luc稳定细胞系产品插页。
Promega Steady-Glo荧光素酶检测体系产品插页。
3.培养基要求
完全生长培养基，"CGM"
DMEM(MediaTech)
10％FBS
1％PSG
100μg/mL潮霉素B
分析培养基，"AM"
DMEM(Invitrogen)
25mM HEPES
1mM丙酮酸钠
1％PSG
4.METHODS
4.方法
维护：
293/AP1-Luc：按照厂商说明书维护293/AP1-Luc cells；细胞在T150烧瓶中达到～80％融合度时，按照如下步骤收获细胞：
抽提培养基，以～12mL无菌D-PBS轻轻洗涤，抽提。
加入5mL胰岛素-EDTA，轻轻倾斜以涂布烧瓶，并在37℃下培养～5分钟。
不要敲烧瓶；加入5mL CGM，以细胞悬浮液洗涤烧瓶4次，转移至50mL锥形试管中，以1200rpm离心5分钟。
从细胞团快中抽提培养基，加入20-30mL CGM，用移液枪抽吸6次以重悬细胞团快，过细胞筛以令团块分散(根据需要)，用血细胞计数器进行细胞计数。
实验第1天：
如上所述收获细胞，但不要重悬细胞团块。
对细胞进行计数，并稀释至1.5x105细胞/mL；加入腺病毒，以达到5感染形成单位/细胞。
取20-30mL用BioTek uFill以1.2x104细胞/孔在Greiner多聚D-赖氨酸涂层384孔板上涂布细胞。
立即向平板加入一系列剂量的0.4μL化合物(100％DMSO中)，在加湿培养箱(37℃，5％CO2)中培养24小时。
实验第2天：
按照下列步骤处理平板(根据厂商说明书)：
将平板置于层流净化罩中，揭去盖子室温冷却30分钟。
从实验孔中移除60μL。
向每孔加入20μL Steady-Glo Firefly底物，室温静置10-20分钟。
用白色胶带遮盖测定平板底部。
用荧光平板分析仪读取数据。
100％抑制性的阳性对照孔，是通过用表达无催化作用的ASK1突变体的腺病毒来感染细胞产生的，该突变体在残基709处有从赖氨酸到精氨酸的突变。
实验结果
通式(I)化合物的EC50为2.0nM。
Kd测定
激酶分析
以E.coli为宿主细胞、从BL21系制备激酶标记的T7噬菌体系。E.coli生长至对数期后，感染T7噬菌体，并在32℃下振荡培养直至溶菌。对溶菌产物进行离心和过滤以除去细胞碎片。余下的激酶在HEK-293细胞中生产，然后以用于qPCR检测的DNA进行标记。取链霉亲和素涂层的磁珠，用生物素化的小分子配体室温处理30分钟，以产生用于激酶分析的亲和树脂。已配位的亲和珠用过量生物素封闭后，用封闭液(SeaBlock(Pierce)公司，1％(牛血清白蛋白)、0.05％吐温20、1mM DTT(二硫苏糖醇))洗涤以除去未结合的配体和减少非特异性结合。结合反应是通过令激酶、已配位的亲和珠与测试化合物在1x结合缓冲液(20％SeaBlock、0.17x PBS、0.05％吐温20、61mM DTT)中组装完成的。所有反应均在聚苯乙烯96孔板中进行，最终体积为0.135mL。将测定板在室温下振荡培养1小时，并用洗液(1x PBS、0.05％吐温20)洗涤亲和珠。将珠粒重悬在洗脱缓冲液(1x PBS、0.05％吐温20、0.5μΜ非生物素化亲和配体)中，并在室温下振荡培养30分钟。用qPCR测量洗脱液中的激酶浓度。用希尔方程建立标准剂量反应曲线来计算结合常数(Kd)。
实验结果
通式(I)化合物的Kd为0.24nM，该数据暗示，通式(I)化合物能够在缺少ATP的情况下有效地结合ASK1受体。
测定与血浆结合的化合物百分比
实验设计：
所述实验中使用了购自Harvard Apparatus(霍利斯顿，马萨诸塞州，美国)的1mL Teflon(聚四氟乙烯)透析槽。在此研究之前，将透析膜在pH7.4的0.133M磷酸缓冲液中浸泡约一小时。取标称浓度为2μΜ的化合物，加入至1mL血浆培养基或1mL细胞培养基。透析槽每侧的总液体体积为1mL。在37℃的水浴中达到平衡3小时后，将透析槽每侧的少量样品移入含有1mL人血浆(细胞培养基)或缓冲液的适当试管中。样本试管称重并记录。取100μL试样并加入到400μL淬灭溶液(50％甲醇、25％乙腈、25％水和内标)中。将样本以12000G涡旋离心15分钟。然后，取200μL上清液放入一个新的96孔板中。再加入200μL1:1ACN：水溶液，然后将板涡旋振荡并进行LC-MS分析。
血浆中未结合的分析物百分比按照下列公式进行计算：
％未结合分析物＝100(Cf/Ct)
其中Cf和Ct分别是透后缓冲液和血浆浓度。
实验结果
通式(I)化合物在人血浆中的未结合分析物百分比为11.94％。
测定CACO-2排出比率
实验过程
将Caco-2细胞养在含丙酮酸钠和补充有1％青霉素/链霉素、1％NEAA、10％胎牛血清的Glutmax的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)中，培养箱设定在37℃、90％湿度和5％CO2。在24孔PET(聚对苯二甲酸乙二酯)板(BD Biosciences)上，以2100个细胞/孔将Caco-2细胞铺在通道62和72之间，并在至少21天内生长至融合，所述接收孔室中含有HBSS缓冲液(10mM HEPES、15mM pH6.5的葡萄糖)，所述缓冲液含pH7.4的1％BSA。与转移缓冲液达到初始平衡后，读取TEER值来测试膜的完整性。加入含有测试化合物的缓冲液，并于1小时和2小时后从接收室中取出100μL溶液。已移除的缓冲液替换为新鲜缓冲液后，在所有计算中对所移除的物质进行校正。该实验包含重复样本。所有样品立即收集到400μL100％乙腈酸中，以沉淀蛋白质并稳定试验化合物。对细胞顶端或基底侧给药，以测定正向(A到B)和反向(B到A)渗透性。还测定了通过无细胞的侵袭小室(trans-well)的渗透性，作为一种细胞膜透性和非特异性结合的度量。为了测试非特异性结合和化合物不稳定性，还测定了回收率百分比。样品通过LC/MS/MS进行分析。
表观渗透率(Papp)和回收率百分比的计算如下：
Papp＝(dR/dt)x Vr/(A x D0)
％回收率＝100 x((Vr x R120)+(Vd x D120))/(Vd x D0)
其中，
dR/dt是基于第60和120分钟测定的接收室浓度的接收室累积浓度-时间斜率(μΜ/s)。
Vr和Vd分别是接收室和供应室的体积cm3。
A是单层细胞的面积(0.33cm2)。
D0和D120分别是在实验开始和结束时测定的供应室浓度。
R120是实验结束时(120分钟)的接收室浓度。
吸收和排出等级
Papp(A到B)≥1.0x10-6cm/s 高
1.0x10-6cm/s≥Papp(A到B)≥0.5x10-6cm/s 中
Papp(A到B)<0.5x10-6cm/s 低
Papp(B到A)/Papp(A到B)≥3 显著排出
％回收率<20％ 可能影响测得的渗透性
无细胞Papp<15 可能影响测得的渗透性
实验结果
据观察，通式(I)化合物的CACO A→B值为27；CACO B→A值为35，因此外排比率(B→A)/(A→B)为1.3。
测定肝微粒体部分的代谢稳定性：
实验过程：
利用有氧代谢辅因子(NADPH)和接合辅因子(UDP葡糖醛酸(UDPGA))来评估代谢稳定性。以pH7.4的磷酸钾缓冲液稀释微粒体储液后，加入通式(I)化合物的重复等份试样(3Ε0.5mM DMSO储液)或代谢稳定性标样(Buspirone)，得到的蛋白质浓度为1.0mg/mL，且含有作为渗透剂的丙甲菌素。加入NADPH再生体系和UDPGA辅因子，以开始代谢反应。每种反应混合物的最终组成为：pH7.4的50mM磷酸钾缓冲液，内含3μΜ测试化合物、1mg微粒体蛋白/mL、5mM UDPGA、23.4μg/mL丙甲菌素、1.25mM NADP、3.3mM葡糖-6-磷酸、0.4U/mL葡糖-6-磷酸磷酸脱氢酶和3.3mM MgCl2。在第0、2、5、10、15、30、45、60分钟时，取25μL的反应混合物，移入含有250μL IS/Q(含内标的淬灭溶液)的平板。淬灭后，将平板在3000x g下离心30分钟，并取10μL上清液试样进行LC/MS分析，以获得分析物/内标峰值面积比率。
微粒体部分的代谢稳定性是通过测量通式(I)化合物的消失速率来计算的。数据(残余母体药物百分比)绘制在半对数刻度上并进行指数拟合。
Ct＝C0·e-K·t和T1/2＝ln2/K，其中
Ct：时间＝t时的残余母体药物百分比
Co：时间＝0时的残余母体药物百分比
t：时间(hr)
K：一阶消除速率常数(hr-1)
T1/2：体外半排出期(hr)
肝清除率预测值的计算如下{参考文献1}：
CLint＝K·V·YP/P或CLint＝K·V·YH/H
CLh＝(CLint.Qh)/(CLint+Qh)，其中
CLh：肝清除率预测值(L/hr/kg体重)
CLint：肝内在清除率(L/hr/kg体重)
V：培养体积(L)
YP：微粒体蛋白质产量＝(mg蛋白质/kg体重)
YH：肝细胞产量(百万细胞/kg体重)
P：培养期间蛋白质质量(mg)
H：培养期间肝细胞数量(百万)
Qh：肝血流量(L/hr/kg体重)
此时，通过对比肝清除率和肝血流量的预测值，计算肝提取预测值。若培养期间中底物浓度减少<10％，则认为化合物稳定(对应的推测微粒体部分半排出期>395min，干细胞半排出期>39.5hr)。
用于从微粒体稳定性计算肝脏清除率预测值的数值如下表格所示：
表1：用于从微粒体稳定性计算肝脏清除率预测值的数值
实验结果
由微粒体部分体外实验测定的人肝脏清除率预测值为0.1L/h/kg。
测定测试化合物在大鼠中的CL和V ss 值
测试化合物以1mg/kg静脉滴注和5.0mg/kg口腔服用后在大鼠中的药代动力学
实验样品和剂型
对于静脉注射给药，测试化合物以0.5mg/mL浓度同1当量的HCl溶于PEG400：水＝60：40中。该剂型为溶液。
对于口服给药，测试化合物以2.5mg/mL浓度溶于乙醇/PG/Solutol增容剂/水＝5/75/10/10中。该剂型为溶液。
实验动物
每个静脉或口腔给药组由3只雄性SD大鼠组成。给药时，每只动物大致体重在0.317-0.355kg之间。这些动物在给药前夜和给药后4小时内禁食。
配量给药
对于静脉滴注组，测试化合物以30分钟以上的静脉滴注给药。滴注速度根据每只动物的体重调整，以2mL/kg递送1mg/kg的剂量。对于口服给药组，受试药物通过口腔灌注给药，以2mL/kg递送5.0mg/kg的剂量。
样本采集
配量给药后，在特定时间点从每只动物收集连续静脉血样本(每样本约0.4mL)。血液样本收集在含有抗凝血作用的EDTA的VacutainerTM试管(Becton-Disekinson公司，新泽西州，美国)中，并立即置于湿冰上，以待进行血浆离心。
测定通式(I)化合物的血药浓度
采用LC/MS/MS方法测量测试化合物的血药浓度。
计算
对该血药浓度-时间数据进行非房室模型药代动力学分析。
实验结果
通式(I)化合物在大鼠中表现的CL值为0.09L/hr/kg，口服生物利用率为75％；t1/2值为5.07小时，Vss为0.55L/kg。
Cyp抑制性检测
实验目的
检测测试化合物对细胞色素P450主要亚型(CYPIA、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6andCYP3A4(2种底物))的抑制潜力。
细胞色素P450抑制性IC50测定(8种亚型，9种底物)
简要实验方案
在细胞色素P450亚型特异性探针底物的存在下，将测试化合物(0.1μΜ-25μΜ)与人类肝微粒体和NADPH共培养。以质谱仪检测CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4特异反应的代谢物。CYPIA活性是通过荧光代谢物的形成来测量的。代谢物形成量与载体对照相比的减少量用于计算IC50值(产生50％抑制性时的测试化合物浓度)。
测试要求
500μΙ含10mM测试化合物的DMSO溶液。
实验步骤
CYP1A抑制
将测试化合物以6个浓度(0.1、0.25、1、2.5、10、25μΜ的DMSO溶液；最终DMSO浓度＝0.3％)与人肝微粒体(0.1mg/mL)和NADPH(1mM)在探针底物乙氧基试卤灵(0.5μΜ)的存在下37℃共同培育5分钟。选择性CYP1A抑制剂α-萘黄酮作为阳性对照与测试化合物一同进行实验。
CYP2B6抑制
将测试化合物以6个浓度(0.1、0.25、1、2.5、10、25μΜ的DMSO溶液；最终DMSO浓度＝0.3％)与人肝微粒体(0.1mg/mL)和NADPH(1mM)在探针底物睾酮(110μΜ)的存在下37℃共同培育5分钟。选择性CYP2B6抑制剂噻氯匹定作为阳性对照与测试化合物一同进行实验。
CYP2C8抑制
将测试化合物以6个浓度(0.1、0.25、1、2.5、10、25μΜ的DMSO溶液；最终DMSO浓度＝0.3％)与人肝微粒体(0.1mg/mL)和NADPH(1mM)在探针底物紫杉醇(7.5μΜ)的存在下37℃共同培育30分钟。选择性CYP2C8抑制剂孟鲁斯特作为阳性对照与测试化合物一同进行实验。
CYP2C9抑制
将测试化合物以6个浓度(0.1、0.25、1、2.5、10、25μΜ的DMSO溶液；最终DMSO浓度＝0.25％)与人肝微粒体(1mg/mL)和NADPH(1mM)在探针底物甲苯磺丁脲(120μΜ)的存在下37℃共同培育60分钟。选择性CYP2C9抑制剂酮康唑作为阳性对照与测试化合物一同进行实验。
CYP2C19抑制
将测试化合物以6个浓度(0.1、0.25、1、2.5、10、25μΜ的DMSO溶液；最终DMSO浓度＝0.25％)与人肝微粒体(0.5mg/mL)和NADPH(1mM)在探针底物美芬妥英(25μΜ)的存在下37℃共同培育60分钟。选择性CYP2C19抑制剂反苯环丙胺作为阳性对照与测试化合物一同进行实验。
CYP2D6抑制
将测试化合物以6个浓度(0.1、0.25、1、2.5、10、25μΜ的DMSO溶液；最终DMSO浓度＝0.25％)与人肝微粒体(0.5mg/mL)和NADPH(1mM)在探针底物右美沙芬(5μΜ)的存在下37℃共同培育5分钟。选择性CYP2D6抑制剂奎尼丁作为阳性对照与测试化合物一同进行实验。
CYP3A4抑制(咪达***)
将测试化合物以6个浓度(0.1、0.25、1、2.5、10、25μΜ的DMSO溶液；最终DMSO浓度＝0.26％)与人肝微粒体(0.1mg/mL)和NADPH(1mM)在探针底物咪达***(2.5μΜ)的存在下37℃共同培育5分钟。选择性CYP3A4抑制剂酮康唑作为阳性对照与测试化合物一同进行实验。
CYP3A4抑制(睾酮)
将测试化合物以6个浓度(0.1、0.25、1、2.5、10、25μΜ的DMSO溶液；最终DMSO浓度＝0.275％)与人肝微粒体(0.5mg/mL)和NADPH(1mM)在探针底物睾酮(50μΜ)的存在下37℃共同培育5分钟。选择性CYP3A4抑制剂酮康唑作为阳性对照与测试化合物一同进行实验。
对于CYP1A的培养，以甲醇终止该反应，并用荧光(激发波长＝535nm，发射波长＝595nm)监测代谢物试卤灵的生成。对于CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的培养，以甲醇终止反应，然后将样品离心，合并上清液，并用LC-MS/MS同时对4-羟基甲苯磺丁脲、4-羟基美芬妥英、右啡烷和1-羟基咪达***进行分析。羟基安非他酮、6α-羟基紫杉醇和6B-羟基睾酮分别通过LC-MS/MS进行分析。最终样品在分析前加入含有含内标甲酸的去离子水(最终浓度＝0.1％)。用该代谢物的形成量与载体对照相比的减少量，来计算IC50值(产生50％抑制性的测试化合物浓度)。
实验结果
单侧输尿管梗阻(DUO)肾纤维化大鼠模型的一般研究设计
用正常饲料饲喂标准安置条件下的雄性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley)大鼠，并在手术前至少7天使其适应。在研究开始时，将大鼠按重量分组，并以4个化合物剂量水平(1、3、10或30mg/kg)通过口灌工具给药(2mL/kg p.o.bid)。大鼠通过鼻锥吸入异氟烷麻醉，并进行剖腹手术。使用高温消毒器械和无菌手术技术对大鼠进行右输尿管(UUO)完全性肠梗阻。大鼠术后立即给药50μL青霉素G(i.m.)。令大鼠干净、加热的笼中恢复，然后回到正常动物饲养条件。后续7天中，以如上所述的化合物剂量每日两次(间隔12小时)对大鼠给药。手术后第7天，用异氟醚将大鼠麻醉后，收集其血清、血浆和尿。然后，将动物安乐死，收获肾脏，并收集肾皮质活性组织切片，以供形态学、组织学和生化分析。所有用于生化分析的组织均以液氮快速冷冻，并以-80℃保存；用于组织学分析的组织以10％中性缓冲***固定。
肾纤维化的评估，是通过以ELISA方法测量肾脏中的胶原蛋白IV数量，以及用免疫组织化学方法检查肾脏中积累的α-平滑肌肌动蛋白阳性肌成纤维细胞来进行的。对于前者，将一小块冷冻肾皮质用RIPA缓冲液制成匀浆，然后以4℃、14000×g离心10分钟。将上清液收集到预冷的试管中，并测定蛋白浓度。按照厂商说明进行Col IV ELISA法(Exocell)，以测定总蛋白的等量。
用前述的α-平滑肌肌动蛋白对***固定和石蜡包埋的肾组织进行染色(Stambe et al.，TheRole of p38Mitogen-Activated Protein Kinase Activation in Renal Fibrosis J Am Soc Nephrol15:370-379，2004)。
实验结果：
3-30mg/kg剂量水平的通式(I)化合物显著降低了肾胶原蛋白IV水平(图1)和α-平滑肌阳性纤维细胞(图2)。
通式(I)化合物和参照化合物的数据比较
以下表格提供了通式(I)化合物和参照化合物A和B(2011年1月13日公布的美国专利公开号2001/00095410A1中公开)的结果对比。申请人在此指出，下列比较结果的实验是在相似的条件下进行的，但并不一定是同时进行的。
表格
()括号中的数值代表通式(I)化合物在指定参数上相对于指定化合物的改进程度。
上述数据比较可推出以下结果：
通式(I)化合物的EC50与化合物A相当。
通式(I)化合物的功能性IC50与化合物A、化合物B相当。
通式(I)化合物的蛋白结合调整EC50比化合物A低4倍，比化合物B低33倍。
通式(I)化合物的Cyp3抑制性比化合物A、化合物B弱。
通式(I)化合物的CYP3A4IC50/PBAdj.EC50值比分子式A的化合物高43倍，比分子式B的化合物高92倍。
通式(I)化合物在大鼠中的CL值化合物A低2.7倍，比化合物B低3.6倍。
通式(I)化合物在大鼠中的生物利用率百分比化合物A高6.8倍，比化合物B高1.5倍。
通式(I)化合物在大鼠中的半排出期比化合物A长8.6倍，比化合物B长3.9倍。
以上数据较好地说明了，与通式A和B的化合物相比，通式(I)化合物具有出乎意料的有益性质；以及，通式(I)化合物可能用于进一步开发慢性肾病、肺和/或肾纤维化，和/或心肾疾病疗法的更好选择。

Claims (12)

1.如通式(I)所示的化合物：
即：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1，2，4-***-3-基)吡啶-2-基)-2-氟-4-甲基苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
2.如通式(I)所示的化合物：
即：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1，2，4-***-3-基)吡啶-2-基)-4-甲基苯甲酰胺。
3.一种药物组合物，包括治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物或其盐，以及药学上可接受的载体。
4.一种药物组合物，包括治疗有效量的根据权利要求2所述的化合物，以及药学上可接受的载体。
5.一种治疗慢性肾病的方法，包括：向需要治疗所述疾病的患者给予治疗有效量的根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐。
6.一种治疗糖尿病性肾病的方法，包括：向需要治疗所述疾病的患者给予治疗有效量的根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐。
7.一种治疗肾脏纤维化、肝脏纤维化或肺纤维化的方法，包括：向需要治疗所述疾病的患者给予治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐。
8.一种治疗糖尿病性肾病的方法，包括：向需要治疗所述疾病的患者给予治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物或其盐。
9.根据权利要求1所述的化合物或其盐在制备用于治疗慢性肾病的药物中的用途。
10.根据权利要求1所述的化合物或其盐在治疗中的用途。
11.如下通式所示的中间体：
即：2-氨基-5-(4-异丙基-4H-1，2，4-***-3-基)吡啶，或其盐，或其保护形式。
12.如下通式所示的中间体：
即：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲酸，或其盐，或其保护形式。
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