JP2009235352A - Polyamide resin composition - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a polyamide resin composition improved in heat aging resistance, while using a biomass-derived starting material. <P>SOLUTION: The polyamide resin composition comprises a polyamide resin obtained by a polycondensation reaction using pentamethylenediamine and a dicarboxylic acid as principal monomer components and a cuprous halide, wherein a total sulfur content of the monomer components is ≤1.2 wt. ppm. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、ポリアミド樹脂組成物に関し、より詳しくは、バイオマス由来の原料を使用したポリアミド樹脂組成物に関する。   The present invention relates to a polyamide resin composition, and more particularly to a polyamide resin composition using a biomass-derived raw material.

近年、バイオマス由来の原料を使用したポリアミド樹脂（５６ナイロン）が製造されている。５６ナイロンは、６６ナイロン等とほぼ同等の機械物性を有する。バイオマス由来の原料を使用したポリアミド樹脂を用いた例として、特許文献１に、ジカルボン酸単位と、ペンタメチレンジアミン単位を含むジアミン単位とを構成成分とするポリアミド樹脂を含有するポリアミドフィルムが記載されている。   In recent years, polyamide resins (56 nylon) using raw materials derived from biomass have been manufactured. 56 nylon has almost the same mechanical properties as 66 nylon and the like. As an example using a polyamide resin using a biomass-derived raw material, Patent Document 1 describes a polyamide film containing a polyamide resin having a dicarboxylic acid unit and a diamine unit containing a pentamethylenediamine unit as constituent components. Yes.

特開２００７−１３８０４７号公報JP 2007-138047 A

ところで、一般にポリアミド樹脂は、その特性を利用して、耐熱老化性が要求される部品等の用途に広く使用されている。
しかし、バイオマス由来の原料を使用したポリアミド樹脂は、例えば、石化原料から合成される６６ナイロン等と比べ、ハロゲン化銅等の熱安定剤を配合した場合であっても、耐熱老化性が不十分であることが判明している。 By the way, in general, polyamide resins are widely used for applications such as parts that require heat aging resistance by utilizing their characteristics.
However, polyamide resins using biomass-derived raw materials, for example, have insufficient heat aging resistance even when heat stabilizers such as copper halides are blended as compared to 66 nylon synthesized from petrochemical raw materials. It has been found that

本発明は、上述した課題を解決するためになされたものである。即ち、本発明の目的は、バイオマス由来の原料を使用し、且つ耐熱老化性が改良されたポリアミド樹脂組成物を提供することにある。   The present invention has been made to solve the above-described problems. That is, an object of the present invention is to provide a polyamide resin composition using a biomass-derived raw material and having improved heat aging resistance.

そこで本発明者は鋭意検討の結果、バイオマス由来の原料を使用したポリアミド樹脂に含まれる硫黄がポリアミド樹脂の耐熱老化性に影響を与えることを見出し、かかる知見に基づき本発明を完成した。
かくして本発明によれば、ペンタメチレンジアミンとジカルボン酸とを主な単量体成分として用いる重縮合反応により得られるポリアミド樹脂とハロゲン化第一銅とを含み、単量体成分中の硫黄の合計含有量が１．２重量ｐｐｍ以下であることを特徴とするポリアミド樹脂組成物が提供される。 As a result of intensive studies, the present inventor has found that sulfur contained in a polyamide resin using a biomass-derived raw material affects the heat aging resistance of the polyamide resin, and has completed the present invention based on such knowledge.
Thus, according to the present invention, a polyamide resin obtained by a polycondensation reaction using pentamethylenediamine and dicarboxylic acid as main monomer components and cuprous halide are included, and the sum of sulfur in the monomer components A polyamide resin composition having a content of 1.2 ppm by weight or less is provided.

ここで、本発明のポリアミド樹脂組成物は、重縮合反応に用いられる単量体成分中のアミノ酸の合計含有量が１００重量ｐｐｍ以下であることが好ましい。
また、重縮合反応に用いられる単量体成分中のメチオニンの合計含有量が５重量ｐｐｍ以下であることが好ましい。
さらに、重縮合反応に用いられる単量体成分の一つであるジカルボン酸が、アジピン酸であることが好ましい。 Here, in the polyamide resin composition of the present invention, the total content of amino acids in the monomer component used for the polycondensation reaction is preferably 100 ppm by weight or less.
Further, the total content of methionine in the monomer component used for the polycondensation reaction is preferably 5 ppm by weight or less.
Furthermore, it is preferable that the dicarboxylic acid which is one of the monomer components used in the polycondensation reaction is adipic acid.

次に、重縮合反応に用いられる単量体成分の一つであるペンタメチレンジアミンは、リジン脱炭酸酵素、リジン脱炭酸酵素活性の向上した組み換え微生物又はリジン脱炭酸酵素を産生する細胞または細胞の処理物を使用し、リジンから産出されたものであることが好ましい。
また、ペンタメチレンジアミンを産出する際に用いるリジンは、グルコースを発酵させて得られたものであることが好ましい。
尚、ペンタメチレンジアミンは、グルコースを発酵させ、直接得てもよい。 Next, pentamethylenediamine, which is one of the monomer components used in the polycondensation reaction, is a lysine decarboxylase, a recombinant microorganism with improved lysine decarboxylase activity, or a cell that produces lysine decarboxylase It is preferable that the processed product is used and produced from lysine.
Moreover, it is preferable that the lysine used when producing pentamethylenediamine is obtained by fermenting glucose.
Pentamethylenediamine may be obtained directly by fermenting glucose.

また、本発明のポリアミド樹脂組成物は、ハロゲン化第一銅に由来する銅の含有量が５重量ｐｐｍ〜５００重量ｐｐｍであることが好ましい。
また、ハロゲン化第一銅に由来する銅の含有量と重縮合反応に用いられる単量体成分中の硫黄の含有量との比（銅含有量／硫黄含有量）が３０を超えることが好ましい。
また、ポリアミド樹脂を得る重縮合反応の重縮合触媒として燐含有化合物を用い、且つ重縮合触媒として用いられた燐含有化合物に由来する燐の含有量が１重量ｐｐｍ〜９０重量ｐｐｍであることが好ましい。 In the polyamide resin composition of the present invention, the content of copper derived from cuprous halide is preferably 5 ppm to 500 ppm by weight.
Moreover, it is preferable that the ratio (copper content / sulfur content) of copper content derived from cuprous halide and sulfur content in the monomer component used for the polycondensation reaction exceeds 30. .
In addition, the phosphorus-containing compound is used as a polycondensation catalyst for the polycondensation reaction to obtain a polyamide resin, and the phosphorus content derived from the phosphorus-containing compound used as the polycondensation catalyst is 1 to 90 ppm by weight. preferable.

さらに、本発明のポリアミド樹脂組成物は、ポリアミド樹脂１００重量部に対し、強化材５重量部〜１５０重量部をさらに含むことが好ましい。
この場合、強化材が、ガラス繊維であることが好ましい。 Furthermore, it is preferable that the polyamide resin composition of the present invention further includes 5 to 150 parts by weight of a reinforcing material with respect to 100 parts by weight of the polyamide resin.
In this case, the reinforcing material is preferably glass fiber.

本発明によれば、バイオマス由来の原料を使用し、且つ耐熱老化性が改良されたポリアミド樹脂等が得られる。   According to the present invention, a polyamide resin or the like using a biomass-derived raw material and having improved heat aging resistance can be obtained.

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。尚、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。   Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. In addition, this invention is not limited to the following embodiment, It can implement by changing variously within the range of the summary.

（ポリアミド樹脂）
本実施の形態で使用するポリアミド樹脂は、ペンタメチレンジアミンに由来する構造単位を少なくとも含む構造を有する。
さらに、本実施の形態において、ポリアミド樹脂は、ペンタメチレンジアミンを含む脂肪族ジアミンとジカルボン酸とを単量体成分とし、これらを用いた重縮合反応により得られたものであることが好ましい。 (Polyamide resin)
The polyamide resin used in the present embodiment has a structure including at least a structural unit derived from pentamethylenediamine.
Further, in the present embodiment, the polyamide resin is preferably obtained by a polycondensation reaction using aliphatic diamine containing pentamethylenediamine and dicarboxylic acid as monomer components.

（ペンタメチレンジアミン）
本実施の形態において、単量体成分である脂肪族ジアミン中のペンタメチレンジアミンの濃度は、通常、９０重量％以上、好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは１００重量％である。
ここで、ペンタメチレンジアミン（１，５−ジアミノペンタン）以外の他の脂肪族ジアミンとしては、例えば、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナン、１，１０−ジアミノデカン、１，１１−ジアミノウンデカン、１，１２−ジアミノドデカン、１，１３−ジアミノトリデカン、１，１４−ジアミノテトラデカン、１，１５−ジアミノペンタデカン、１，１６−ジアミノヘキサデカン、１，１７−ジアミノヘプタデカン、１，１８−ジアミノオクタデカン、１，１９−ジアミノノナデカン、１，２０−ジアミノエイコサン、２−メチル−１，５−ジアミノペンタン等が挙げられる。 (Pentamethylenediamine)
In the present embodiment, the concentration of pentamethylenediamine in the aliphatic diamine as the monomer component is usually 90% by weight or more, preferably 95% by weight or more, and more preferably 100% by weight.
Here, as other aliphatic diamines other than pentamethylenediamine (1,5-diaminopentane), for example, ethylenediamine, 1,3-diaminopropane, 1,4-diaminobutane, 1,6-diaminohexane, 1 , 7-diaminoheptane, 1,8-diaminooctane, 1,9-diaminononane, 1,10-diaminodecane, 1,11-diaminoundecane, 1,12-diaminododecane, 1,13-diaminotridecane, 1, 14-diaminotetradecane, 1,15-diaminopentadecane, 1,16-diaminohexadecane, 1,17-diaminoheptadecane, 1,18-diaminooctadecane, 1,19-diaminononadecane, 1,20-diaminoeicosane, Examples include 2-methyl-1,5-diaminopentane.

本実施の形態において、ペンタメチレンジアミンは、リジン脱炭酸酵素、リジン脱炭酸酵素活性の向上した組み換え微生物又はリジン脱炭酸酵素を産生する細胞または当該細胞の処理物を使用してリジンから産出される方法が挙げられる。
ポリアミド樹脂の単量体成分として、このようなペンタメチレンジアミンを用いることにより、ポリアミド樹脂の単量体成分に占めるバイオマス由来原料の割合（バイオマス比率）を高くすることができる。
本実施の形態では、ポリアミドにおけるバイオマス比率が２．５１％以上であることが好ましい。バイオマス比率が２．５１％以上の場合、地球温暖化の原因となる二酸化炭素の発生を抑制する効果が得られる。 In the present embodiment, pentamethylenediamine is produced from lysine using lysine decarboxylase, a recombinant microorganism having improved lysine decarboxylase activity, a cell producing lysine decarboxylase, or a treated product of the cell. A method is mentioned.
By using such pentamethylenediamine as the monomer component of the polyamide resin, the ratio (biomass ratio) of the biomass-derived raw material in the monomer component of the polyamide resin can be increased.
In the present embodiment, the biomass ratio in the polyamide is preferably 2.51% or more. When the biomass ratio is 2.51% or more, an effect of suppressing the generation of carbon dioxide causing global warming can be obtained.

上記のペンタメチレンジアミンは、例えば、以下の方法によって製造される。即ち、リジンの酵素的脱炭酸反応は、リジン溶液に酸を加えることにより行われる。この場合、リジン溶液のｐＨが酵素的脱炭酸反応に適した範囲に維持されるように、リジン溶液に酸が加えられる。ここで、リジン溶液に加えられる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸；酢酸等の有機酸が挙げられる。次に、酵素的脱炭酸反応により得られた反応生成液を通常の分離精製方法により処理することにより、遊離ペンタメチレンジアミンが採取される。   Said pentamethylenediamine is manufactured by the following methods, for example. That is, the enzymatic decarboxylation reaction of lysine is performed by adding an acid to the lysine solution. In this case, an acid is added to the lysine solution so that the pH of the lysine solution is maintained in a range suitable for the enzymatic decarboxylation reaction. Here, examples of the acid added to the lysine solution include inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, and phosphoric acid; and organic acids such as acetic acid. Next, free pentamethylenediamine is collected by treating the reaction product obtained by the enzymatic decarboxylation reaction by a conventional separation and purification method.

（ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩）
本実施の形態では、リジンの酵素的脱炭酸反応において、アジピン酸等のジカルボン酸を使用することにより、ポリアミドの単量体成分としてペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩を直接採取することができる。以下、酸としてアジピン酸を用いて、リジンの酵素的脱炭酸反応により、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を製造する方法について説明する。
原料として用いるリジンは、通常、遊離塩基（リジンベース）であることが好ましい。さらに、リジンはグルコースを発酵させて得られたものであることが好ましい。また、リジンのアジピン酸塩を原料として用いてもよい。酵素的脱炭酸反応によりペンタメチレンジアミンを生成するリジンとして、Ｌ−リジン、Ｄ−リジンが挙げられる。中でも、Ｌ−リジンが好ましい。また、リジンの形態としては、精製されたリジン、グルコースを含む合成培地を用いて生成したリジンを含む発酵液が挙げられる。但し、発酵液の場合は、酵素的脱炭酸反応により生成するペンタメチレンジアミンがアジピン酸と塩を形成することが可能であることが必要である。リジン溶液を調製する溶媒としては、好適には水が用いられる。 (Pentamethylenediamine dicarboxylate)
In the present embodiment, pentamethylenediamine dicarboxylate can be directly collected as a monomer component of polyamide by using a dicarboxylic acid such as adipic acid in the enzymatic decarboxylation reaction of lysine. Hereinafter, a method for producing pentamethylenediamine adipate by enzymatic decarboxylation of lysine using adipic acid as an acid will be described.
The lysine used as a raw material is usually preferably a free base (lysine base). Furthermore, lysine is preferably obtained by fermenting glucose. Alternatively, lysine adipate may be used as a raw material. Examples of lysine that generates pentamethylenediamine by enzymatic decarboxylation include L-lysine and D-lysine. Of these, L-lysine is preferable. Moreover, as a form of lysine, the fermentation liquid containing the lysine produced | generated using the synthetic culture medium containing refined lysine and glucose is mentioned. However, in the case of a fermentation broth, it is necessary that pentamethylenediamine produced by the enzymatic decarboxylation reaction can form a salt with adipic acid. As a solvent for preparing the lysine solution, water is preferably used.

反応液のｐＨは、アジピン酸によって調整するため、一般に他のｐＨ調整剤や緩衝剤を用いる必要はない。但し、前記溶媒として緩衝液を用いてもよい。このような緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。但し、ペンタメチレンジアミンとアジピン酸との塩を形成させるという点からは、緩衝剤等は用いないことが好ましく、たとえ用いる場合であっても低濃度に抑えることが好ましい。   Since the pH of the reaction solution is adjusted with adipic acid, it is generally unnecessary to use other pH adjusting agents or buffers. However, a buffer may be used as the solvent. Examples of such a buffer include sodium acetate buffer. However, from the viewpoint of forming a salt of pentamethylenediamine and adipic acid, it is preferable not to use a buffering agent or the like, and even if it is used, it is preferable to suppress it to a low concentration.

リジンとして遊離リジンを用いる場合は、リジン溶液にアジピン酸を加えて酵素的脱炭酸反応に適したｐＨとなるように調整する。具体的には、ｐＨとしては、通常４以上、好ましくは５以上、より好ましくは５．５以上で、通常８以下、好ましくは７以下、より好ましくは６．５以下が挙げられる。なお、リジンとして、リジンのアジピン酸塩を用いる場合は、反応液調製時にアジピン酸を加える必要はない。以下、このように、反応液のｐＨを酵素的脱炭酸反応に適したｐＨに調整することを「中和」と称す場合がある。   When free lysine is used as lysine, adipic acid is added to the lysine solution to adjust to a pH suitable for enzymatic decarboxylation. Specifically, the pH is usually 4 or more, preferably 5 or more, more preferably 5.5 or more, and usually 8 or less, preferably 7 or less, more preferably 6.5 or less. When lysine adipate is used as lysine, it is not necessary to add adipic acid when preparing the reaction solution. Hereinafter, adjusting the pH of the reaction solution to a pH suitable for the enzymatic decarboxylation reaction may be referred to as “neutralization”.

リジンの酵素的脱炭酸反応は、例えば、上記のようにして中和されたリジン溶液にリジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）を添加することによって行うことができる。ＬＤＣとしては、リジンに作用してペンタメチレンジアミンを生成させるものであれば特に制限はない。ＬＤＣとしては、精製酵素を用いてもよく、ＬＤＣを産生する微生物、植物細胞又は動物細胞等の細胞を用いてもよい。ＬＤＣ又はそれを産生する細胞は、１種でもよく、２種以上の混合物であってもよい。また、細胞をそのまま用いてもよく、ＬＤＣを含む細胞処理物を用いてもよい。細胞処理物としては、細胞破砕液、及びその分画物が挙げられる。   The enzymatic decarboxylation reaction of lysine can be performed, for example, by adding lysine decarboxylase (LDC) to the lysine solution neutralized as described above. The LDC is not particularly limited as long as it acts on lysine to produce pentamethylenediamine. As the LDC, a purified enzyme may be used, or a cell such as a microorganism, a plant cell, or an animal cell that produces LDC may be used. One type of LDC or a cell that produces it may be used, or a mixture of two or more types may be used. Further, the cells may be used as they are, or a cell treatment product containing LDC may be used. Examples of the cell treatment product include a cell disruption solution and a fraction thereof.

前記微生物としては、Ｅ．ｃｏｌｉ等のエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）等のコリネ型細菌、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属細菌、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）等のセラチア属細菌等の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核細胞が挙げられる。これらの中では細菌、特にＥ．ｃｏｌｉが好ましい。   Examples of the microorganism include E. coli. Escherichia bacteria such as E. coli, coryneform bacteria such as Brevibacterium lactofermentum, Bacillus subtilis such as Bacillus subtilis, Serratia marcescens such as Serratia marcescens And eukaryotic cells such as Saccharomyces cerevisiae. Among these, bacteria, in particular E. coli. E. coli is preferred.

前記微生物は、ＬＤＣを産生する限り、野生株でもよく、変異株であってもよい。また、ＬＤＣ活性が上昇するように改変された組換え株であってもよい。植物細胞又は動物細胞も、ＬＤＣ活性が上昇するように改変された組換え細胞を用いることができる。
リジン溶液にＬＤＣを添加して反応を開始した後は、反応の進行に伴い、リジンから遊離される炭酸ガスが反応液から放出され、ｐＨが上昇する。従って、反応液のｐＨが前記範囲となるように、アジピン酸を反応液に添加する。アジピン酸は連続的に添加してもよく、ｐＨが前記範囲に維持される限り、分割して添加してもよい。反応条件は、ＬＤＣがリジンに作用してペンタメチレンジアミンを生成させる条件であれば特に制限されず、濃度は、通常２０℃以上、好ましくは３０℃以上、通常６０℃以下、好ましくは４０℃以下で行う。 The microorganism may be a wild strain or a mutant strain as long as it produces LDC. Moreover, the recombinant strain modified so that LDC activity may increase may be sufficient. Plant cells or animal cells can also be recombinant cells that have been modified to increase LDC activity.
After starting the reaction by adding LDC to the lysine solution, as the reaction proceeds, carbon dioxide released from the lysine is released from the reaction solution, and the pH rises. Therefore, adipic acid is added to the reaction solution so that the pH of the reaction solution is in the above range. Adipic acid may be added continuously, or may be added in portions as long as the pH is maintained in the above range. The reaction conditions are not particularly limited as long as LDC acts on lysine to produce pentamethylenediamine, and the concentration is usually 20 ° C or higher, preferably 30 ° C or higher, usually 60 ° C or lower, preferably 40 ° C or lower. To do.

原料のリジン又はリジン・アジピン酸塩は、反応開始時に反応液に全量添加してもよく、ＬＤＣ反応の進行に応じて、分割して添加してもよい。
酵素反応は、バッチ式によって行うと、アジピン酸の添加を容易に行うことができる。また、ＬＤＣ、ＬＤＣを産生する細胞又はその処理物を固定化した担体を用いた移動床カラムクロマトグラフィーによって、反応を行うこともできる。その場合は、反応系のｐＨが所定の範囲に維持されたまま反応が進行するように、リジン及びアジピン酸をカラムの適当な部位に注入すればよい。 The raw material lysine or lysine adipate may be added to the reaction solution in its entirety at the start of the reaction, or may be added in portions as the LDC reaction proceeds.
When the enzyme reaction is carried out batchwise, adipic acid can be easily added. The reaction can also be carried out by moving bed column chromatography using a carrier on which LDC, LDC-producing cells or treatments thereof are immobilized. In that case, lysine and adipic acid may be injected into an appropriate part of the column so that the reaction proceeds while the pH of the reaction system is maintained within a predetermined range.

上記のようにして、リジンの酵素的脱炭酸反応によるペンタメチレンジアミン生成に伴って上昇するｐＨを、アジピン酸を用いて逐次中和することにより、酵素反応が良好に進行する。このようにして生成するペンタメチレンジアミンは、アジピン酸塩として反応液中に蓄積する。   As described above, the enzymatic reaction proceeds favorably by sequentially neutralizing the pH, which increases with the formation of pentamethylenediamine by enzymatic decarboxylation of lysine, using adipic acid. The pentamethylenediamine thus generated accumulates in the reaction solution as an adipate.

ＬＤＣ反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩は、反応液から公知の方法を組み合わせることによって単離、精製することができる。例えば、反応液をオートクレーブ等により殺菌した後、遠心分離により上清を回収し、活性炭等を用いて上清を脱色し、適宜濃縮する。ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩は、使用態様に応じて、溶液のままであってもよく、結晶であってもよい。ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の結晶は、例えば、濃縮した反応液を冷却することによりペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を析出させることによって、形成させることができる。上記のようにして得られる結晶は、ペンタメチレンジアミンとアジピン酸を等モルで含んでいるため、ポリアミド製造の原料として好適であり、必要に応じて乾燥して使用することができる。   The pentamethylenediamine adipate obtained by the LDC reaction can be isolated and purified from the reaction solution by combining known methods. For example, after the reaction solution is sterilized by an autoclave or the like, the supernatant is collected by centrifugation, and the supernatant is decolored using activated carbon or the like and concentrated as appropriate. The pentamethylenediamine adipate may be in a solution or a crystal depending on the use mode. The crystals of pentamethylenediamine adipate can be formed, for example, by precipitating pentamethylenediamine adipate by cooling the concentrated reaction solution. Since the crystal obtained as described above contains pentamethylenediamine and adipic acid in equimolar amounts, it is suitable as a raw material for producing polyamide, and can be used after drying as necessary.

本実施の形態において、ＬＤＣ反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩は、晶析又は蒸留により、反応液から単離・精製することが好ましい。リジンの酵素的脱炭酸反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を、晶析又は蒸留により反応液から単離・精製することによって、不純物として混入しているアミノ酸等の濃度を低減させることができる。また、アミノ酸のなかでも、メチオニン、システイン、シスチン等の含硫アミノ酸の濃度を低減させ、これらの含硫アミノ酸に由来する硫黄含有量を低減させることができる。   In the present embodiment, the pentamethylenediamine adipate obtained by the LDC reaction is preferably isolated and purified from the reaction solution by crystallization or distillation. To reduce the concentration of amino acids mixed in as impurities by isolating and purifying pentamethylenediamine adipate obtained by enzymatic decarboxylation of lysine from the reaction solution by crystallization or distillation. Can do. In addition, among amino acids, the concentration of sulfur-containing amino acids such as methionine, cysteine, cystine and the like can be reduced, and the sulfur content derived from these sulfur-containing amino acids can be reduced.

ここで、本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂組成物において、重縮合反応に用いられる単量体成分中のアミノ酸の、ポリアミド樹脂組成物に含まれる含有量が１００重量ｐｐｍ以下、好ましくは、５０重量ｐｐｍ以下、さらに好ましくは、１０重量ｐｐｍ以下に低減させることが好ましい。重縮合反応に用いられる単量体成分中のアミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン等のモノアミノジカルボン酸；リジン、オルニチン、ヒドロキシリジン、アルギニン、ヒスチジン等のジアミノモノカルボン酸等が挙げられる。   Here, in the polyamide resin composition to which the present embodiment is applied, the content of the amino acid in the monomer component used for the polycondensation reaction is 100 wt ppm or less, preferably, It is preferably reduced to 50 ppm by weight or less, more preferably 10 ppm by weight or less. Examples of amino acids in the monomer component used in the polycondensation reaction include monoaminodicarboxylic acids such as aspartic acid, glutamic acid, asparagine, and glutamine; diaminomonocarboxylic acids such as lysine, ornithine, hydroxylysine, arginine, and histidine. Is mentioned.

さらに、重縮合反応に用いられる単量体成分中のアミノ酸の中でも、メチオニン、システイン、シスチン等の含硫アミノ酸のポリアミド樹脂組成物に含まれる含有量を低減させることが好ましい。この場合、ポリアミド樹脂を得るための単量体成分であるペンタメチレンジアミンにおいて、特に、重縮合反応に用いられる単量体成分中のメチオニンの含有量を５重量ｐｐｍ以下、好ましくは、３重量ｐｐｍ以下、さらに好ましくは、１重量ｐｐｍ以下に低減させることが好ましい。かかるメチオニンの含有量が低減されたペンタメチレンジアミンとジカルボン酸とを単量体成分とした重縮合反応により、発酵法において混入した不純物が低減されたポリアミド樹脂が得られる。   Furthermore, among the amino acids in the monomer component used for the polycondensation reaction, it is preferable to reduce the content contained in the polyamide resin composition of sulfur-containing amino acids such as methionine, cysteine, and cystine. In this case, in pentamethylenediamine, which is a monomer component for obtaining a polyamide resin, the content of methionine in the monomer component used for the polycondensation reaction is 5 ppm by weight or less, preferably 3 ppm by weight. Hereinafter, it is more preferable to reduce the content to 1 ppm by weight or less. By the polycondensation reaction using pentamethylenediamine and dicarboxylic acid having a reduced methionine content as monomer components, a polyamide resin in which impurities mixed in the fermentation method are reduced is obtained.

また、本実施の形態において、重縮合反応に用いられる単量体成分中のメチオニン、システイン、シスチン等の含硫アミノ酸が低減されることにより、これらの含硫アミノ酸に由来する硫黄の、ポリアミド樹脂組成物中の含有量を、１．２重量ｐｐｍ以下、好ましくは、１．１重量ｐｐｍ以下、さらに好ましくは、１．０重量ｐｐｍ以下に低減させることができる。
含硫アミノ酸に由来する硫黄の、ポリアミド樹脂組成物中の含有量を低減させることにより、硫黄の含有量が過度に多い場合と比較して、ポリアミド樹脂組成物の耐熱老化性を向上させることができる。 In the present embodiment, the sulfur-containing polyamide resin derived from these sulfur-containing amino acids is reduced by reducing sulfur-containing amino acids such as methionine, cysteine, and cystine in the monomer component used in the polycondensation reaction. The content in the composition can be reduced to 1.2 ppm by weight or less, preferably 1.1 ppm by weight or less, more preferably 1.0 ppm by weight or less.
By reducing the content of sulfur derived from sulfur-containing amino acids in the polyamide resin composition, the heat aging resistance of the polyamide resin composition can be improved as compared with the case where the sulfur content is excessively large. it can.

（晶析法）
以下に、リジンの酵素的脱炭酸反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を、晶析により反応液から単離・精製する一例について説明する。
通常、リジンの酵素的脱炭酸反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液は着色しているため、晶析前に脱色することが好ましい。脱色剤としては活性炭、合成吸着剤、活性白土、シリカ、ゼオライト等が挙げられ、中でも活性炭が好ましい。
脱色後のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液は、窒素バブリングにより溶存酸素を追い出した後、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩濃度が５０重量％〜６９重量％、好ましくは６０重量％〜６７重量％まで濃縮する。ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩濃度が過度に小さいと、晶析後の収率が低下し、過度に大きいと、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に混入するアミノ酸等の不純物濃度が高くなる傾向がある。 (Crystallization method)
An example of isolating and purifying pentamethylenediamine adipate obtained by enzymatic decarboxylation of lysine from the reaction solution by crystallization will be described below.
Usually, since the aqueous solution of pentamethylenediamine / adipate obtained by enzymatic decarboxylation of lysine is colored, it is preferably decolorized before crystallization. Examples of the decolorizing agent include activated carbon, synthetic adsorbent, activated clay, silica, zeolite, and the like. Among them, activated carbon is preferable.
The aqueous solution of pentamethylenediamine / adipate after decolorization expels dissolved oxygen by nitrogen bubbling, and then the concentration of pentamethylenediamine / adipate is 50% to 69% by weight, preferably 60% to 67% by weight. Concentrate. If the concentration of pentamethylenediamine / adipate is too small, the yield after crystallization will decrease, and if it is too large, the concentration of impurities such as amino acids mixed in pentamethylenediamine / adipate will tend to increase. .

濃縮は、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液の温度５０℃〜７０℃、減圧度１５０Ｔｏｒｒ以下で行うのが好ましい。温度が過度に低いと、濃縮時間が長くなり、温度が過度に高いと、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩が分解するので好ましくない。また、減圧度が１５０Ｔｏｒｒを超えると濃縮時間が長くなるので好ましくない。   Concentration is preferably carried out at a temperature of 50 ° C. to 70 ° C. and a reduced pressure of 150 Torr or less of an aqueous solution of pentamethylenediamine / adipate. If the temperature is excessively low, the concentration time becomes long. If the temperature is excessively high, pentamethylenediamine adipate is decomposed, which is not preferable. In addition, if the degree of vacuum exceeds 150 Torr, the concentration time becomes longer, which is not preferable.

晶析は、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を冷却してペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を析出させて行われる。種晶の添加は、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を冷却する降温途中で行うことが好ましい。種晶は、析出するペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩が好ましい。但し、種晶としての効果が得られればそれに限定されない。   Crystallization is performed by cooling an aqueous solution of pentamethylenediamine / adipate to precipitate pentamethylenediamine / adipate. It is preferable to add the seed crystal during the temperature lowering to cool the pentamethylenediamine / adipate aqueous solution. The seed crystal is preferably precipitated pentamethylenediamine / adipate. However, it is not limited to this as long as the effect as a seed crystal can be obtained.

冷却時の降温速度は、通常１℃／ｈｒ以上、好ましくは２℃／ｈｒ以上、さらに好ましくは３℃／ｈｒ以上、又通常３０℃／ｈｒ以下、好ましくは２０℃／ｈｒ以下、さらに好ましくは１０℃／ｈｒ以下である。降温速度が過度に遅いと、晶析に長時間を要する。降温速度が過度に早いと、結晶サイズが小さくなる傾向にあり、精製度合いが低下する方向であり好ましくない。   The cooling rate during cooling is usually 1 ° C./hr or more, preferably 2 ° C./hr or more, more preferably 3 ° C./hr or more, and usually 30 ° C./hr or less, preferably 20 ° C./hr or less, more preferably 10 ° C./hr or less. If the cooling rate is too slow, it takes a long time for crystallization. If the temperature lowering rate is excessively high, the crystal size tends to be small, and the degree of purification decreases, which is not preferable.

晶析終了温度は、通常１℃以上、好ましくは５℃以上、さらに好ましくは１０℃以上、又通常３０℃以下、好ましくは２５℃以下、さらに好ましくは２０℃以下である。晶析終了温度が過度に高いと、収率が低下する傾向がある。晶析終了温度が過度に低いと、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩スラリーを移送時に配管が閉塞しやすくなるので好ましくない。   The crystallization end temperature is usually 1 ° C. or higher, preferably 5 ° C. or higher, more preferably 10 ° C. or higher, and usually 30 ° C. or lower, preferably 25 ° C. or lower, more preferably 20 ° C. or lower. When the crystallization end temperature is excessively high, the yield tends to decrease. An excessively low crystallization end temperature is not preferable because the piping tends to be clogged during the transfer of the pentamethylenediamine / adipate slurry.

晶析率は、濃縮液のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩濃度と晶析終了温度により適宜決定される。通常、晶析率は１重量％以上、好ましくは５重量％以上、さらに好ましくは１０重量％以上、又通常４６重量％以下、好ましくは３９重量％以下、さらに好ましくは３５重量％以下に制御することが好ましい。晶析率が過度に低いと、収率が低下する傾向がある。晶析率が過度に高いと、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に混入する不純物濃度が高くなる傾向がある。   The crystallization rate is appropriately determined by the concentration of pentamethylenediamine / adipate in the concentrate and the crystallization end temperature. Usually, the crystallization rate is controlled to 1% by weight or more, preferably 5% by weight or more, more preferably 10% by weight or more, and usually 46% by weight or less, preferably 39% by weight or less, more preferably 35% by weight or less. It is preferable. If the crystallization rate is excessively low, the yield tends to decrease. If the crystallization rate is excessively high, the concentration of impurities mixed in pentamethylenediamine / adipate tends to increase.

晶析後のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩スラリーは、常法に従い、固液分離して結晶として得られる。例えば、遠心濾過を行う場合は、母液を振り切った後に、遠心濾過器が回転している状態で少量の脱塩水をシャワー状にふりかけ、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に付着している母液をさらに洗い流すと精製度が上がり好ましい。
脱塩水量は、ｗｅｔケーキ（若干の水を含んだペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩）に対して、通常１重量％以上、好ましくは５重量％以上、又通常４０重量％以下、好ましくは３０重量％以下である。脱塩水量が過度に少ないと、洗浄効果が小さくなる傾向がある。脱塩水量が過度に多いと、収率が低下する傾向がある。このようにして得られた結晶を１番晶と称する。 The pentamethylenediamine / adipate slurry after crystallization is obtained as crystals by solid-liquid separation according to a conventional method. For example, when carrying out centrifugal filtration, after shaking off the mother liquor, a small amount of demineralized water is sprinkled in a shower while the centrifugal filter is rotating to further remove the mother liquor adhering to pentamethylenediamine / adipate. Washing away is preferable because it increases the degree of purification.
The amount of demineralized water is usually 1% by weight or more, preferably 5% by weight or more, and usually 40% by weight or less, preferably 30% by weight with respect to the wet cake (pentamethylenediamine / adipate containing some water). % Or less. If the amount of demineralized water is too small, the cleaning effect tends to be small. If the amount of demineralized water is excessively large, the yield tends to decrease. The crystal thus obtained is referred to as the first crystal.

固液分離後の母液や洗浄液は回収して、再度、濃縮、晶析、固液分離を行い、２番晶を得る。同様にして、３番晶、４番晶等を得ることができる。
前述した１番晶を１回晶析品とすると、これを再度脱塩水に溶解し、濃縮、晶析、ふりかけ洗浄及び固液分離を行うことにより、より精製度の高い２回晶析品を得ることができる。同様にして、さらに精製度の高い３回晶析品、４回晶析品も得ることができる。 The mother liquor and the washing liquid after the solid-liquid separation are collected, and again concentrated, crystallized, and solid-liquid separated to obtain the second crystal. Similarly, the third crystal, the fourth crystal and the like can be obtained.
When the above-mentioned first crystal is made into a once-crystallized product, it is dissolved again in demineralized water, and concentrated, crystallized, sprinkled and washed, and solid-liquid separation is performed to obtain a twice-crystallized product with a higher degree of purification. Obtainable. Similarly, a three-crystallized product and a four-crystallized product with a higher degree of purification can be obtained.

（蒸留）
次に、リジンの酵素的脱炭酸反応により得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を、蒸留により反応液から単離・精製する一例について説明する。
本実施の形態では、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液にアルカリを添加・混合してペンタメチレンジアミンを遊離させ、その後、（１）溶媒で抽出した上で蒸留する方法、（２）そのまま蒸留する方法、が挙げられる。
（１）の方法の具体例としては、例えば、特開２００４−０００１１４号公報に記載された方法が挙げられる。また、（２）の方法を用いる場合は、蒸留に先立って脱水蒸留を行い、アジピン酸のアルカリ塩を析出・分離しておくことが好ましい。 (distillation)
Next, an example of isolating and purifying the aqueous solution of pentamethylenediamine / adipate obtained by enzymatic decarboxylation of lysine from the reaction solution by distillation will be described.
In this embodiment, an alkali is added to and mixed with an aqueous solution of pentamethylenediamine / adipate to liberate pentamethylenediamine, then (1) a method of distillation after extraction with a solvent, and (2) distillation as it is. Method.
As a specific example of the method (1), for example, the method described in JP-A-2004-000114 can be mentioned. When the method (2) is used, it is preferable to perform dehydration distillation prior to distillation to precipitate and separate the alkali salt of adipic acid.

（ジカルボン酸）
次に、本実施の形態において、ポリアミド樹脂を得るために使用する単量体成分としてのジカルボン酸の具体例は、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸、ブラシリン酸、テトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、オクタデカン二酸等の脂肪族ジカルボン酸；シクロヘキサンジカルボン酸等の脂環式ジカルボン酸；フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸等の芳香族ジカルボン酸が挙げられる。これらの中でも、アジピン酸が好ましい。また、ジカルボン酸としてアジピン酸を用いる場合、ジカルボン酸中のアジピン酸の濃度は、通常、９０重量％以上、好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは１００重量％である。 (Dicarboxylic acid)
Next, in the present embodiment, specific examples of dicarboxylic acid as a monomer component used to obtain a polyamide resin include, for example, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, Suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, undecanedioic acid, dodecanedioic acid, brassic acid, tetradecanedioic acid, pentadecanedioic acid, octadecanedioic acid and other aliphatic dicarboxylic acids; cyclohexanedicarboxylic acid and other alicyclic dicarboxylic acids; phthalate Examples thereof include aromatic dicarboxylic acids such as acid, isophthalic acid, terephthalic acid, and naphthalenedicarboxylic acid. Among these, adipic acid is preferable. When adipic acid is used as the dicarboxylic acid, the concentration of adipic acid in the dicarboxylic acid is usually 90% by weight or more, preferably 95% by weight or more, and more preferably 100% by weight.

さらに、本発明により得られる効果を損なわない程度において、他の単量体成分を用いることができる。このような他の単量体成分としては、例えば、６−アミノカプロン酸、１１−アミノウンデカン酸、１２−アミノドデカン酸、パラアミノメチル安息香酸等のアミノ酸；ε−カプロラクタム、ω−ラウロラクタム等のラクタム；シクロヘキサンジアミン、ビス−（４−アミノヘキシル）メタン等の脂環式ジアミン；キシリレンジアミン等の芳香族ジアミンが挙げられる。   Furthermore, other monomer components can be used as long as the effects obtained by the present invention are not impaired. Examples of such other monomer components include amino acids such as 6-aminocaproic acid, 11-aminoundecanoic acid, 12-aminododecanoic acid and paraaminomethylbenzoic acid; and lactams such as ε-caprolactam and ω-laurolactam. An alicyclic diamine such as cyclohexanediamine and bis- (4-aminohexyl) methane; and an aromatic diamine such as xylylenediamine.

（重縮合方法）
本実施の形態において、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸の重縮合方法は特に限定されず、従来公知の方法から適宜選択することが出来る。重縮合方法の一例としては、例えば、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸を含む水溶液を高温高圧下で、脱水反応を進行させる加熱重縮合法；脂肪族ジアミン及びジカルボン酸を加圧加熱下で重縮合して得られた低次縮合物（オリゴマー）を高分子量化する方法；脂肪族ジアミンを溶解した水溶液と、ジカルボン酸塩を水性溶媒又は有機溶媒に溶解させた溶液とを接触させ、これらの界面で重縮合反応させる界面重縮合法等が挙げられる。 (Polycondensation method)
In this Embodiment, the polycondensation method of aliphatic diamine and dicarboxylic acid is not specifically limited, It can select suitably from a conventionally well-known method. As an example of the polycondensation method, for example, a heat polycondensation method in which an aqueous solution containing an aliphatic diamine and a dicarboxylic acid is allowed to proceed with a dehydration reaction under high temperature and high pressure; A method of increasing the molecular weight of the low-order condensate (oligomer) obtained by bringing an aqueous solution in which an aliphatic diamine is dissolved into contact with a solution in which a dicarboxylate is dissolved in an aqueous solvent or an organic solvent. Examples include an interfacial polycondensation method in which a polycondensation reaction is performed.

本実施の形態では、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸の重縮合方法としては、化学工業的な観点から加熱重縮合法が好ましい。加熱重縮合法により脂肪族ジアミン及びジカルボン酸を重縮合する場合、脂肪族ジアミンとジカルボン酸とを反応させたジカルボン酸塩を調製し、脱塩水の存在下でこのジカルボン酸塩を加熱し、脱水反応を進行させる方法が好ましい。この方法で得られたポリアミドは、加熱重縮合後、さらに固相重縮合することによって、分子量を上昇させることが可能である。固相重縮合は、例えば、１００℃〜当該樹脂の融点の温度範囲で、真空中又は不活性ガス中で加熱することにより行われる。   In the present embodiment, the polycondensation method of the aliphatic diamine and the dicarboxylic acid is preferably a heating polycondensation method from a chemical industrial viewpoint. In the case of polycondensation of aliphatic diamine and dicarboxylic acid by the heating polycondensation method, a dicarboxylic acid salt obtained by reacting an aliphatic diamine and dicarboxylic acid is prepared, and this dicarboxylic acid salt is heated in the presence of demineralized water for dehydration. A method of allowing the reaction to proceed is preferred. The polyamide obtained by this method can be increased in molecular weight by further solid-phase polycondensation after heat polycondensation. The solid phase polycondensation is performed, for example, by heating in a vacuum or in an inert gas within a temperature range from 100 ° C. to the melting point of the resin.

（重縮合触媒）
本実施の形態において、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸の重縮合反応は、重縮合触媒として下記式（１）で表される燐含有化合物と脱塩水とを用いて行われることが好ましい。
Ｍ_ｘＨ_ｙＰＯ_ｚ 式（１）
（但し、式（１）中、Ｍは、アルカリ金属又はアルカリ土類金属である。Ｘ及びＹは、式（１）の化合物が全体として電気的に中性となり、かつ、Ｘ＋Ｙ＝３を満たす０〜３の整数である。Ｚは２〜４の整数である。） (Polycondensation catalyst)
In the present embodiment, the polycondensation reaction of aliphatic diamine and dicarboxylic acid is preferably performed using a phosphorus-containing compound represented by the following formula (1) and demineralized water as a polycondensation catalyst.
M _x H _y PO _z formula (1)
(However, in Formula (1), M is an alkali metal or an alkaline earth metal. X and Y are electrically neutral as a whole of the compound of Formula (1) and satisfy X + Y = 3. (It is an integer of 0 to 3. Z is an integer of 2 to 4.)

式（１）で表される燐含有化合物としては、燐酸水素塩類が好ましい。また、燐含有化合物として、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩；カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩が含まれる。
また、燐酸種としては、正燐酸、亜燐酸または次亜燐酸が挙げられる。 As the phosphorus-containing compound represented by the formula (1), hydrogen phosphates are preferable. Examples of the phosphorus-containing compound include alkali metal salts such as lithium salts, sodium salts, and potassium salts; magnesium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts.
Examples of the phosphoric acid species include orthophosphoric acid, phosphorous acid, and hypophosphorous acid.

本実施の形態において、式（１）で表される燐含有化合物の中でも、ナトリウム塩が最も好ましい。具体例としては、例えば、亜燐酸１水素２ナトリウム塩５水和物（Ｎａ_２ＨＰＯ_３）、亜燐酸２水素１ナトリウム塩２．５水和物（ＮａＨ_２ＰＯ_３）等が挙げられる。
さらに、ナトリウム塩の場合、（Ｎａ原子数）／（Ｐ原子数）が０．１以上が好ましく、１以上がより好ましく、２以上が特に好ましい。具体的には、Ｘ＝１又は２、Ｙ＝２又は１、Ｚ＝２又は３若しくは４であるナトリウム塩が好ましく、中でもＸ＝２、Ｙ＝１、Ｚ＝２又は３若しくは４であるナトリウム塩がより好ましく、特に、Ｎａ_２ＨＰＯ_３が最も好ましい。 In the present embodiment, among the phosphorus-containing compounds represented by the formula (1), a sodium salt is most preferable. Specific examples include, for example, dihydrogen phosphite disodium salt pentahydrate (Na ₂ HPO ₃ ), dihydrogen phosphite monosodium salt 2.5 hydrate (NaH ₂ PO ₃ ), and the like.
Further, in the case of a sodium salt, (number of Na atoms) / (number of P atoms) is preferably 0.1 or more, more preferably 1 or more, and particularly preferably 2 or more. Specifically, a sodium salt in which X = 1 or 2, Y = 2 or 1, Z = 2, 3 or 4 is preferable, and among them, sodium in which X = 2, Y = 1, Z = 2 or 3 or 4 Salts are more preferred, especially Na ₂ HPO ₃ is most preferred.

重縮合触媒として使用される式（１）で表される燐含有化合物の使用量は、単量体成分の総重量に対し、燐原子換算で１重量ｐｐｍ〜９０重量ｐｐｍ、好ましくは５重量ｐｐｍ〜５０重量ｐｐｍ（以下、ｗｔ−ｐｐｍと記すことがある。）である。燐含有化合物の使用量が過度に少ないと、重縮合反応が促進しない傾向がある。燐含有化合物の使用量が過度に多いと、得られるポリアミド樹脂の強度や透明性が損なわれる傾向がある。
また、式（１）で表される燐含有化合物と併せて使用する脱塩水の使用量は、通常、単量体成分に対し、１重量％〜２００重量％、好ましくは５０重量％〜１５０重量％の割合である。脱塩水の使用量が過度に少ない場合、及び過度に多い場合、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸の重縮合反応における反応速度が低下することがある。 The amount of the phosphorus-containing compound represented by the formula (1) used as the polycondensation catalyst is 1 ppm by weight to 90 ppm by weight in terms of phosphorus atoms, preferably 5 ppm by weight, based on the total weight of the monomer components. -50 ppm by weight (hereinafter sometimes referred to as wt-ppm). If the amount of the phosphorus-containing compound used is excessively small, the polycondensation reaction tends not to accelerate. If the amount of the phosphorus-containing compound used is excessively large, the strength and transparency of the resulting polyamide resin tend to be impaired.
Moreover, the usage-amount of the desalinated water used together with the phosphorus containing compound represented by Formula (1) is 1 to 200 weight% normally with respect to a monomer component, Preferably it is 50 to 150 weight%. %. When the amount of demineralized water used is excessively small and excessively large, the reaction rate in the polycondensation reaction of the aliphatic diamine and dicarboxylic acid may decrease.

本実施の形態において、式（１）で表される燐含有化合物を含む重縮合触媒を使用して脂肪族ジアミン及びジカルボン酸を重縮合することにより、得られたポリアミド樹脂中に、式（１）で表される燐含有化合物に由来する燐化合物が含まれる。
かかるポリアミド樹脂における、式（１）で表される燐含有化合物に由来する燐化合物の含有量は、燐原子換算で１重量ｐｐｍ〜９０重量ｐｐｍ、好ましくは、３重量ｐｐｍ〜５０重量ｐｐｍの範囲である。
このように、式（１）で表される燐含有化合物を含む重縮合触媒を使用して脂肪族ジアミン及びジカルボン酸を重縮合することにより、得られたポリアミド樹脂の耐衝撃性を向上させることができる。 In the present embodiment, the polycondensation of aliphatic diamine and dicarboxylic acid using a polycondensation catalyst containing a phosphorus-containing compound represented by the formula (1), the resulting polyamide resin has the formula (1 The phosphorus compound derived from the phosphorus containing compound represented by this is included.
The content of the phosphorus compound derived from the phosphorus-containing compound represented by the formula (1) in the polyamide resin is in the range of 1 to 90 ppm by weight, preferably 3 to 50 ppm by weight in terms of phosphorus atoms. It is.
Thus, the impact resistance of the obtained polyamide resin is improved by polycondensation of aliphatic diamine and dicarboxylic acid using the polycondensation catalyst containing the phosphorus-containing compound represented by the formula (1). Can do.

本実施の形態において、脂肪族ジアミン及びジカルボン酸の重縮合により得られるポリアミドの分子量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択される。実用性の観点から、通常、ポリアミドの２５℃における９８％硫酸溶液（ポリアミド濃度：０．０１ｇ／ｍｌ）の相対粘度の下限が、通常１．５以上、好ましくは１．８以上、特に好ましくは２．２以上であり、上限は、通常８．０以下、好ましくは５．０以下、特に好ましくは３．５以下である。相対粘度が過度に小さいと実用的強度が得られない傾向がある。相対粘度が過度に大きいと、ポリアミドの流動性が低下し、成形加工性が損なわれる傾向がある。   In the present embodiment, the molecular weight of the polyamide obtained by polycondensation of aliphatic diamine and dicarboxylic acid is not particularly limited, and is appropriately selected according to the purpose. From the viewpoint of practicality, the lower limit of the relative viscosity of a 98% sulfuric acid solution of polyamide at 25 ° C. (polyamide concentration: 0.01 g / ml) is usually 1.5 or more, preferably 1.8 or more, particularly preferably. The upper limit is usually 8.0 or less, preferably 5.0 or less, particularly preferably 3.5 or less. When the relative viscosity is too small, there is a tendency that practical strength cannot be obtained. When the relative viscosity is excessively large, the fluidity of the polyamide is lowered and the molding processability tends to be impaired.

（ポリアミド樹脂組成物）
本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂組成物には、熱安定剤としてハロゲン化第一銅が含まれる。
ここで、ハロゲン化第一銅としては、例えば、ヨウ化第一銅、臭化第一銅、塩化第一銅等が挙げられる。これらの中でも、ポリアミド樹脂の熱安定性の点で、ヨウ化第一銅、塩化第一銅が好ましい。ハロゲン化第一銅は、それぞれ単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
ポリアミド樹脂組成物に配合されるハロゲン化第一銅の配合量は、銅原子に換算した含有量として、通常５重量ｐｐｍ以上、好ましくは２０重量ｐｐｍ以上、特に好ましくは８０重量ｐｐｍ以上であり、上限は、通常５００重量ｐｐｍ以下、好ましくは３００重量ｐｐｍ以下、特に好ましくは１５０重量ｐｐｍ以下である。 (Polyamide resin composition)
The polyamide resin composition to which the present embodiment is applied contains cuprous halide as a heat stabilizer.
Here, examples of the cuprous halide include cuprous iodide, cuprous bromide, and cuprous chloride. Among these, cuprous iodide and cuprous chloride are preferable from the viewpoint of the thermal stability of the polyamide resin. The cuprous halides can be used alone or in combination of two or more.
The blending amount of the cuprous halide blended in the polyamide resin composition is usually 5 ppm by weight or more, preferably 20 ppm by weight or more, particularly preferably 80 ppm by weight or more, as the content converted to copper atoms. The upper limit is usually 500 ppm by weight or less, preferably 300 ppm by weight or less, particularly preferably 150 ppm by weight or less.

ここで、ポリアミド樹脂組成物に配合されるハロゲン化第一銅の配合量は、ハロゲン化第一銅に由来する銅の含有量と重縮合反応に用いられる単量体成分中の硫黄の含有量との比（銅含有量／硫黄含有量）が３０を超えるように、好ましくは、４０以上、さらに好ましくは５０以上となるようにポリアミド樹脂組成物に配合されることが好ましい。
銅含有量が過度に少ないと、耐熱老化性が低下する傾向がある。 Here, the compounding quantity of the cuprous halide mix | blended with a polyamide resin composition is the content of the sulfur in the monomer component used for the content of the copper originating in the cuprous halide, and a polycondensation reaction. And the ratio (copper content / sulfur content) in excess of 30, preferably 40 or more, more preferably 50 or more.
When the copper content is excessively small, the heat aging resistance tends to decrease.

また、本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂組成物は、上記ハロゲン化第一銅に加え、ハロゲン化アルカリ金属塩を含むことにより、耐熱老化性がさらに向上する。
ハロゲン化アルカリ金属塩としては、例えば、ヨウ化カリウム、臭化カリウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。これらの中でも、ヨウ化カリウムの使用が好ましい。ハロゲン化アルカリ金属塩はそれぞれ単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
ハロゲン化アルカリ金属塩の配合量は、下限が、通常０．０１重量％以上、好ましくは０．０５重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上であり、上限は、通常、１重量％以下、好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．２重量以下である。 In addition, the polyamide resin composition to which the present embodiment is applied contains a halogenated alkali metal salt in addition to the cuprous halide, whereby the heat aging resistance is further improved.
Examples of the alkali metal halide include potassium iodide, potassium bromide, potassium chloride, sodium iodide, sodium bromide, sodium chloride and the like. Among these, use of potassium iodide is preferable. The alkali metal halides can be used alone or in combination of two or more.
The lower limit of the compounding amount of the alkali metal halide is usually 0.01% by weight or more, preferably 0.05% by weight or more, particularly preferably 0.1% by weight or more, and the upper limit is usually 1% by weight. Hereinafter, it is preferably 0.6% by weight or less, particularly preferably 0.2% by weight or less.

（強化材）
本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂組成物に強化材を配合することにより、ポリアミド樹脂組成物の実用的強度をさらに向上させることができる。
強化材の配合量は、ポリアミド樹脂１００重量部に対し、下限は、通常５重量部以上、好ましくは２０重量部以上、特に好ましくは４０重量部以上であり、上限は、通常１５０重量部以下、好ましくは１２０重量部以下、特に好ましくは１００重量部以下である。強化材の配合量が過度に多いと、ポリアミド樹脂組成物の流動性が低下する傾向がある。 (Reinforcing material)
By adding a reinforcing material to the polyamide resin composition to which this embodiment is applied, the practical strength of the polyamide resin composition can be further improved.
The compounding amount of the reinforcing material is usually 5 parts by weight or more, preferably 20 parts by weight or more, particularly preferably 40 parts by weight or more, and the upper limit is usually 150 parts by weight or less with respect to 100 parts by weight of the polyamide resin. The amount is preferably 120 parts by weight or less, particularly preferably 100 parts by weight or less. When the amount of the reinforcing material is excessively large, the fluidity of the polyamide resin composition tends to decrease.

このような強化材としては、例えば、ガラス繊維、ガラスフレーク、炭素繊維、窒化硼素、チタン酸カリウム、硼酸アルミニウム、が挙げられる。これらの中でも、補強効果が高いガラス繊維が好ましい。   Examples of such a reinforcing material include glass fiber, glass flake, carbon fiber, boron nitride, potassium titanate, and aluminum borate. Among these, glass fiber having a high reinforcing effect is preferable.

ガラス繊維としては、通常、熱可塑性樹脂に配合される公知のガラス繊維が使用でき、なかでも、Ｅガラス（無アルカリガラス）から製造されるチョップドストランドが好ましい。ガラス繊維の繊維径は、通常、１μｍ〜２０μｍ、好ましくは、５μｍ〜１５μｍである。また、ガラス繊維は、ポリアミド樹脂との接着性を向上させるために、シランカップリング剤等により表面処理されていることが好ましい。   As a glass fiber, the well-known glass fiber normally mix | blended with a thermoplastic resin can be used, Especially, the chopped strand manufactured from E glass (non-alkali glass) is preferable. The fiber diameter of the glass fiber is usually 1 μm to 20 μm, preferably 5 μm to 15 μm. The glass fiber is preferably surface-treated with a silane coupling agent or the like in order to improve the adhesion with the polyamide resin.

（添加剤）
本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂には、必要に応じて、各種の添加剤が配合される。添加剤としては、例えば、酸化防止剤、耐候剤、離型剤、滑剤、顔料、染料、結晶核剤、可塑剤、帯電防止剤、難燃剤、充填剤、他の重縮合体等が挙げられる。 (Additive)
Various additives are blended in the polyamide resin to which the present embodiment is applied, if necessary. Examples of additives include antioxidants, weathering agents, release agents, lubricants, pigments, dyes, crystal nucleating agents, plasticizers, antistatic agents, flame retardants, fillers, and other polycondensates. .

具体的には、酸化防止剤又は熱安定剤としては、ヒンダードフェノール系化合物、ヒドロキノン系化合物、ホスファイト系化合物及びこれらの置換体等が挙げられる。耐候剤としては、レゾルシノール系化合物、サリシレート系化合物、ベンゾトリアゾール系化合物、ベンゾフェノン系化合物、ヒンダードアミン系化合物等が挙げられる。離型剤又は滑剤としては、脂肪族アルコール、脂肪族アミド、脂肪族ビスアミド、ビス尿素、ポリエチレンワックス等が挙げられる。顔料としては、硫化カドミウム、フタロシアニン、カーボンブラック等が挙げられる。染料としては、ニグロシン、アニリンブラック等が挙げられる。結晶核剤としては、タルク、シリカ、カオリン、クレー等が挙げられる。可塑剤としては、ｐ−オキシ安息香酸オクチル、Ｎ−ブチルベンゼンスルホンアミド等が挙げられる。   Specifically, examples of the antioxidant or the heat stabilizer include hindered phenol compounds, hydroquinone compounds, phosphite compounds, and substituted products thereof. Examples of weathering agents include resorcinol compounds, salicylate compounds, benzotriazole compounds, benzophenone compounds, hindered amine compounds, and the like. Examples of the release agent or lubricant include aliphatic alcohols, aliphatic amides, aliphatic bisamides, bisureas, and polyethylene waxes. Examples of the pigment include cadmium sulfide, phthalocyanine, carbon black and the like. Examples of the dye include nigrosine and aniline black. Examples of the crystal nucleating agent include talc, silica, kaolin, clay and the like. Examples of the plasticizer include octyl p-oxybenzoate and N-butylbenzenesulfonamide.

帯電防止剤としては、アルキルサルフェート型アニオン系帯電防止剤、４級アンモニウム塩型カチオン系帯電防止剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等の非イオン系帯電防止剤、ベタイン系両性帯電防止剤等が挙げられる。難燃剤としては、メラミンシアヌレート、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム等の水酸化物、ポリリン酸アンモニウム、臭素化ポリスチレン、臭素化ポリフェニレンオキシド、臭素化ポリカーボネート、臭素化エポキシ樹脂あるいはこれらの臭素系難燃剤と三酸化アンチモンとの組み合わせ等が挙げられる。充填剤としては、グラファイト、硫酸バリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化アンチモン、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化亜鉛、酸化鉄、硫化亜鉛、亜鉛、鉛、ニッケル、アルミニウム、銅、鉄、ステンレス、ベントナイト、モンモリロナイト、合成雲母等の粒子状、針状、板状充填材が挙げられる。他の重合体としては、他のポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンスルフィド、液晶ポリマー、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ＡＢＳ樹脂、ＳＡＮ樹脂、ポリスチレン等が挙げられる。これらは、ポリアミド樹脂を製造する工程において、添加量、添加工程等が適宜選択され、添加すればよい。   Examples of antistatic agents include alkyl sulfate type anionic antistatic agents, quaternary ammonium salt type cationic antistatic agents, nonionic antistatic agents such as polyoxyethylene sorbitan monostearate, and betaine amphoteric antistatic agents. Can be mentioned. Flame retardants include hydroxides such as melamine cyanurate, magnesium hydroxide, aluminum hydroxide, ammonium polyphosphate, brominated polystyrene, brominated polyphenylene oxide, brominated polycarbonate, brominated epoxy resins or brominated flame retardants thereof. And a combination of antimony trioxide and the like. Fillers include graphite, barium sulfate, magnesium sulfate, calcium carbonate, magnesium carbonate, antimony oxide, titanium oxide, aluminum oxide, zinc oxide, iron oxide, zinc sulfide, zinc, lead, nickel, aluminum, copper, iron, stainless steel , Bentonite, montmorillonite, synthetic mica, and other particulate, needle-like and plate-like fillers. Other polymers include other polyamides, polyethylene, polypropylene, polyester, polycarbonate, polyphenylene ether, polyphenylene sulfide, liquid crystal polymer, polysulfone, polyethersulfone, ABS resin, SAN resin, polystyrene, and the like. These may be added by appropriately selecting the addition amount, the addition step and the like in the step of producing the polyamide resin.

本実施の形態において、ポリアミド樹脂の重縮合から成形までの任意の段階で、ポリアミド樹脂組成物に添加剤、強化材を配合することができる。中でも、ポリアミド樹脂と添加剤、強化材とを押出機中に投入し、これらを溶融混練することにより、ポリアミド樹脂組成物を調製することが好ましい。   In this Embodiment, an additive and a reinforcement can be mix | blended with a polyamide resin composition in the arbitrary steps from the polycondensation of a polyamide resin to shaping | molding. Among them, it is preferable to prepare a polyamide resin composition by charging a polyamide resin, an additive, and a reinforcing material into an extruder and melt-kneading them.

また、本実施の形態のポリアミド樹脂は、射出成形、フィルム成形、溶融紡糸、ブロー成形、真空成形等の任意の成形方法により、所望の形状に成形することができる。成形品としては、例えば、射出成形品、フィルム、シート、フィラメント、テーパードフィラメント、繊維等が挙げられる。また、ポリアミド樹脂は、接着剤、塗料等にも使用することができる。   Further, the polyamide resin of the present embodiment can be molded into a desired shape by any molding method such as injection molding, film molding, melt spinning, blow molding, vacuum molding and the like. Examples of the molded product include injection molded products, films, sheets, filaments, tapered filaments, fibers, and the like. Polyamide resins can also be used for adhesives, paints, and the like.

さらに、本実施の形態のポリアミド樹脂の具体的な用途例としては、自動車・車両関連部品として、例えば、インテークマニホールド、ヒンジ付きクリップ（ヒンジ付き成形品）、結束バンド、レゾネーター、エアークリーナー、エンジンカバー、ロッカーカバー、シリンダーヘッドカバー、タイミングベルトカバー、ガソリンタンク、ガソリンサブタンク、ラジエータータンク、インタークーラータンク、オイルリザーバータンク、オイルパン、電動パワステギヤ、オイルストレーナー、キャニスター、エンジンマウント、ジャンクションブロック、リレーブロック、コネクター、コルゲートチューブ、プロテクター等の自動車用アンダーフード部品；ドアハンドル、フェンダー、フードバルジ、ルーフレールレグ、ドアミラーステー、バンパー、スポイラー、ホイールカバー等の自動車用外装部品；カップホルダー、コンソールボックス、アクセルペダル、クラッチペダル、シフトレバー台座、シフトレバーノブ等の自動車用内装部品が挙げられる。   Furthermore, specific applications of the polyamide resin of the present embodiment include, for example, an intake manifold, a clip with a hinge (molded product with a hinge), a binding band, a resonator, an air cleaner, and an engine cover as automobile / vehicle-related parts. , Rocker cover, cylinder head cover, timing belt cover, gasoline tank, gasoline sub tank, radiator tank, intercooler tank, oil reservoir tank, oil pan, electric power steering gear, oil strainer, canister, engine mount, junction block, relay block, connector, corrugated Automotive under hood parts such as tubes and protectors; door handles, fenders, hood bulges, roof rail legs, door mirror stays, bars Par, spoilers, automobile exterior parts such as wheel covers, cup holders, console boxes, accelerator pedals, clutch pedals, shift lever pedestals, automobile interior parts such as a shift lever knob and the like.

また、本実施の形態のポリアミド樹脂は、釣り糸、漁網等の漁業関連資材、スイッチ類、超小型スライドスイッチ、ＤＩＰスイッチ、スイッチのハウジング、ランプソケット、結束バンド、コネクタ、コネクタのハウジング、コネクタのシェル、ＩＣソケット類、コイルボビン、ボビンカバー、リレー、リレーボックス、コンデンサーケース、モーターの内部部品、小型モーターケース、ギヤ・カム、ダンシングプーリー、スペーサー、インシュレーター、キャスター、端子台、電動工具のハウジング、スターターの絶縁部分、ヒューズボックス、ターミナルのハウジング、ベアリングリテーナー、スピーカー振動板、耐熱容器、電子レンジ部品、炊飯器部品、プリンタリボンガイド等に代表される電気・電子関連部品、家庭・事務電気製品部品、コンピューター関連部品、ファクシミリ・複写機関連部品、機械関連部品等各種用途に使用することができる。   In addition, the polyamide resin of this embodiment includes fishing line, fishing net and other fishery related materials, switches, ultra-small slide switches, DIP switches, switch housings, lamp sockets, cable ties, connectors, connector housings, connector shells , IC sockets, coil bobbins, bobbin covers, relays, relay boxes, condenser cases, motor internal parts, small motor cases, gears / cams, dancing pulleys, spacers, insulators, casters, terminal blocks, power tool housings, starter Insulating parts, fuse boxes, terminal housings, bearing retainers, speaker diaphragms, heat-resistant containers, microwave oven parts, rice cooker parts, printer ribbon guides, etc. Goods, computer-related parts, facsimile-copier-related parts, can be used in the machine-related parts such as various applications.

以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
実施例および比較例において使用したポリアミド樹脂とその単量体成分、ポリアミド樹脂組成物の評価方法は以下の通りである。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples unless it exceeds the gist.
The evaluation methods of the polyamide resin, its monomer component, and the polyamide resin composition used in the examples and comparative examples are as follows.

（１）ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩中の硫黄含有量、アミノ酸含有量、メチオニン含有量
重縮合反応に使用する単量体成分であるペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩中の硫黄含有量、アミノ酸含有量、メチオニン含有量は、アミノ酸分析計（株式会社日立製作所製Ｌ−８９００）を用いて測定した。
先ず、試料を水に溶かし所定の濃度の水溶液とし分析試料とした。分析条件は、生体アミノ酸分離条件、分析法はニンヒドリン発色法（５７０ｎｍ、４４０ｎｍ）とした。標準品には、アミノ酸混合液（和光純薬工業株式会社製ＡＮＩＩ型及びＢ型）を希釈したものを用い、試料注入量は１０μＬとした。定量計算として、Ｐｒｏは４４０ｎｍ、他のアミノ酸は５７０ｎｍのピーク面積から一点外部標準法にてアミノ酸の含有量を算出した（単位：重量ｐｐｍ）。
ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩中の硫黄の含有量は、得られた含硫アミノ酸の測定値に基づき算出した（単位：重量ｐｐｍ）。 (1) Sulfur content, amino acid content, methionine content in pentamethylenediamine / adipate Sulfur content, amino acid content in pentamethylenediamine / adipate, which is a monomer component used in the polycondensation reaction The amount and methionine content were measured using an amino acid analyzer (L-8900 manufactured by Hitachi, Ltd.).
First, the sample was dissolved in water to obtain an aqueous solution having a predetermined concentration, which was used as an analysis sample. The analysis conditions were biological amino acid separation conditions, and the analysis method was ninhydrin coloring method (570 nm, 440 nm). As a standard product, a diluted amino acid mixture (ANII type and B type manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used, and the sample injection amount was 10 μL. As quantitative calculation, the content of amino acids was calculated by a one-point external standard method from the peak area of 440 nm for Pro and 570 nm for other amino acids (unit: ppm by weight).
The sulfur content in pentamethylenediamine adipate was calculated based on the measured value of the obtained sulfur-containing amino acid (unit: weight ppm).

（２）相対粘度（η_ｒ）
ポリアミド樹脂の相対粘度（η_ｒ）は、ポリアミド樹脂の９８％硫酸溶液（濃度：０．０１ｇ／ｍｌ）を調製し、２５℃で、オストワルド式粘度計を使用して測定した（単位：ｄｌ／ｇ）。 (2) Relative viscosity (η _r )
The relative viscosity (η _r ) of the polyamide resin was measured by preparing a 98% sulfuric acid solution (concentration: 0.01 g / ml) of the polyamide resin and using an Ostwald viscometer at 25 ° C. (unit: dl / g).

（３）燐化合物の含有量の分析
ポリアミド樹脂に含まれる燐化合物の含有量は、ポリアミド樹脂を、硫酸−硝酸で湿式分解し、その後、ＩＣＰ質量分析法により測定した燐原子量として求めた（単位：重量ｐｐｍ）。 (3) Analysis of content of phosphorus compound The content of the phosphorus compound contained in the polyamide resin was determined as the amount of phosphorus atom measured by ICP mass spectrometry after wet decomposition of the polyamide resin with sulfuric acid-nitric acid (unit). : Ppm by weight).

（４）ポリアミド樹脂組成物の調製
燐含有化合物を含む重縮合触媒を用いたペンタメチレンジアミン及びアジピン酸の重縮合により調製したポリアミド樹脂に、後述する表１に示す組成で、塩化第１銅（関東化学株式会社製）、ガラス繊維（日本電気硝子株式会社製Ｔ２４９Ｈ）を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
ポリアミド樹脂組成物の調製には、二軸混練機（東芝機械株式会社製：ＴＥＭ−３５Ｂ型二軸混練機）を用いた。設定温度は、実施例１、実施例３及び比較例１は２７０℃であり、実施例２、実施例４及び比較例２は２８０℃である。尚、ガラス繊維は折損抑制のためサイドフィードした。 (4) Preparation of Polyamide Resin Composition A polyamide resin prepared by polycondensation of pentamethylenediamine and adipic acid using a polycondensation catalyst containing a phosphorus-containing compound was added to a cuprous chloride ( Kanto Chemical Co., Ltd.) and glass fiber (T249H manufactured by Nippon Electric Glass Co., Ltd.) were blended to prepare a polyamide resin composition.
A biaxial kneader (manufactured by Toshiba Machine Co., Ltd .: TEM-35B type biaxial kneader) was used for the preparation of the polyamide resin composition. The set temperature is 270 ° C. for Example 1, Example 3 and Comparative Example 1, and 280 ° C. for Example 2, Example 4 and Comparative Example 2. The glass fiber was side fed to suppress breakage.

（５）耐熱老化試験
後述する表１に示す配合組成のポリアミド樹脂組成物を使用し、それぞれＩＳＯ規格に準じ、射出成形機（日本製鋼所株式会社社製：Ｊ７５ＥＩＩ型射出成形機）を使用してＩＳＯ試験片を成形した。
ガラス繊維を配合した実施例２、実施例４及び比較例２の場合、射出成形機の樹脂温度は２７０℃、金型温度は８０℃である。ガラス繊維を配合しない実施例１、実施例３及び比較例１の場合は、射出成形機の樹脂温度は２６５℃、金型温度は８０℃である。
得られたＩＳＯ試験片を使用し、それぞれＩＳＯ規格に準じ、１２０℃×１，０００時間放置後の試験片の引張り強さの、放置前の試験片の引張り強さに対する割合を求めた。数値が大きいほど、耐熱老化性が良好である（単位：％）。 (5) Heat aging test A polyamide resin composition having the composition shown in Table 1 described later is used, and an injection molding machine (manufactured by Nippon Steel Works Co., Ltd .: J75EII type injection molding machine) is used in accordance with ISO standards. Thus, an ISO test piece was formed.
In the case of Example 2, Example 4 and Comparative Example 2 containing glass fiber, the resin temperature of the injection molding machine is 270 ° C., and the mold temperature is 80 ° C. In the case of Example 1, Example 3 and Comparative Example 1 in which no glass fiber is blended, the resin temperature of the injection molding machine is 265 ° C., and the mold temperature is 80 ° C.
The obtained ISO test piece was used, and the ratio of the tensile strength of the test piece after standing at 120 ° C. for 1,000 hours to the tensile strength of the test piece before standing was determined according to the ISO standard. The larger the value, the better the heat aging resistance (unit:%).

（アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼへの変異導入株ＡＬ２作製）
＜遺伝子破壊用ベクターの構築＞
（Ａ）枯草菌ゲノムＤＮＡの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを蒸留水１ｌに溶解］１０ｍｌに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度のリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍｌに懸濁した。 (Generation of mutant AL2 introduced into aspartokinase and homoserine dehydrogenase)
<Construction of vector for gene disruption>
(A) Extraction of Bacillus subtilis genomic DNA In 10 ml of LB medium [composition: tryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 5 g dissolved in distilled water 1 l], Bacillus subtilis ISW1214 is cultured until the late logarithmic growth phase, The cells were collected. The obtained cells were suspended in 0.15 ml of a 10 mM NaCl / 20 mM Tris buffer solution (pH 8.0) / 1 mM EDTA · 2Na solution containing lysozyme at a concentration of 10 mg / ml.

次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。   Next, proteinase K was added to the suspension so that the final concentration was 100 μg / ml, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, sodium dodecyl sulfate was added to a final concentration of 0.5%, and the mixture was incubated at 50 ° C. for 6 hours for lysis. To this lysate, add an equal amount of phenol / chloroform solution, shake gently at room temperature for 10 minutes, and then centrifuge (5,000 × g, 20 minutes, 10-12 ° C.) to obtain a supernatant. The fraction was collected and sodium acetate was added to a concentration of 0.3 M, and then twice as much ethanol was added and mixed. The precipitate collected by centrifugation (15,000 × g, 2 minutes) was washed with 70% ethanol and then air-dried. To the obtained DNA, 5 ml of 10 mM Tris buffer solution (pH 7.5) / 1 mM EDTA · 2Na solution was added and left overnight at 4 ° C., and used as template DNA for subsequent PCR.

（Ｂ）ＰＣＲによるＳａｃＢ遺伝子の増幅およびクローニング
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。 (B) Amplification and cloning of SacB gene by PCR Acquisition of the Bacillus subtilis SacB gene using the DNA prepared in (A) as a template and the already reported base sequence of the gene (GenBank Database Accession No. X02730). This was performed by PCR using the synthetic DNA (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) designed based on the group.

（反応液組成）
鋳型ＤＮＡ１μｌ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン株式会社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．２５μＭ ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。 (Reaction solution composition)
Template DNA 1 μl, PfxDNA polymerase (manufactured by Invitrogen) 0.2 μL, 1 × concentration attached buffer, 0.3 μM each primer, 1 mM MgSO ₄ , 0.25 μM dNTPs were mixed to make a total volume of 20 μl.

（反応温度条件）
ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ株式会社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。 (Reaction temperature conditions)
Using a DNA thermal cycler PTC-200 (manufactured by MJ Research), a cycle consisting of 94 ° C. for 20 seconds and 68 ° C. for 2 minutes was repeated 35 times. However, the heat retention at 94 ° C. in the first cycle was 1 minute 20 seconds, and the heat retention at 68 ° C. in the final cycle was 5 minutes.

増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ株式会社）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。   Confirmation of the amplification product was carried out by separation by 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: FMCBioProducts) gel electrophoresis and visualization by ethidium bromide staining, and a fragment of about 2 kb was detected. The DNA fragment of interest was recovered from the gel using a QIAQuick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).

回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造株式会社製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ：ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ製）のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。   The recovered DNA fragment was phosphorylated at the 5 'end with T4 polynucleotide kinase (T4 Polynucleotide Kinase: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and then ligated kit ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was used to bind to the EcoRV site of the E. coli vector (pBluescript II: manufactured by STRATEGENE), and E. coli (DH5α strain) was transformed with the resulting plasmid DNA. The recombinant Escherichia coli thus obtained was smeared in an LB agar medium [10 g tryptone, 5 g yeast extract, 5 g NaCl, and 15 g agar dissolved in 1 l distilled water] containing 50 μg / ml ampicillin and 50 μg / ml X-Gal. did.

この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃で２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ＳａｃＢ遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断することにより、約２ｋｂの挿入断片が認められ、該プラスミドをｐＢＳ／ＳａｃＢと命名した。   Clones that formed white colonies on this medium were then transferred to LB agar medium containing 50 μg / mL ampicillin and 10% sucrose and cultured at 37 ° C. for 24 hours. Among these clones, those that could not grow on a medium containing sucrose were subjected to liquid culture by a conventional method, and then plasmid DNA was purified. Strains in which the SacB gene is functionally expressed in E. coli should be unable to grow on sucrose-containing media. The obtained plasmid DNA was cleaved with restriction enzymes SalI and PstI, whereby an inserted fragment of about 2 kb was observed, and the plasmid was named pBS / SacB.

（Ｃ）クロラムフェニコール耐性ＳａｃＢベクターの構築
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造株式会社：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢＩ１０ｕｎｉｔｓを３７℃で一時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造株式会社製）により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いてＭｌｕＩリンカー（宝酒造株式会社製）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕＩの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。 (C) Construction of chloramphenicol resistant SacB vector 500 ng of E. coli plasmid vector pHSG396 (Takara Shuzo Co., Ltd .: chloramphenicol resistant marker) was reacted with the restriction enzyme PshBI10units at 37 ° C. for 1 hour, followed by phenol / chloroform extraction and ethanol Collected by precipitation. After smoothing both ends with Klenow fragment (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), ligation kit ver. MluI linker (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was ligated and circularized using 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) to transform Escherichia coli (DH5α strain). The recombinant Escherichia coli thus obtained was smeared on an LB agar medium containing 34 μg / ml chloramphenicol. Plasmid DNA was prepared from the obtained clones by a conventional method, and a clone having a restriction enzyme MluI cleavage site was selected and named pHSG396Mlu.

一方、上記（Ｂ）にて構築したｐＢＳ／ＳａｃＢを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断した後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化した。これにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いてＭｌｕＩリンカーを連結したのち、０．７５％アガロースゲル電気泳動によりＳａｃＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＳａｃＢ遺伝子断片を、制限酵素ＭｌｕＩ切断後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造株式会社製）にて末端を脱リン酸化したｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いて連結させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。こうして得られたコロニーを、次に３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃で２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕＩ切断により解析した結果、約２．０ｋｂの挿入断片を持つことが確認され、これをｐＣＭＢ１と命名した。   On the other hand, pBS / SacB constructed in (B) above was cleaved with restriction enzymes SalI and PstI, and the ends were blunted with Klenow fragment. Ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) was used to link MluI linkers, and then a DNA fragment of about 2.0 kb containing the SacB gene was separated and recovered by 0.75% agarose gel electrophoresis. This SacB gene fragment was cleaved with the restriction enzyme MluI, then pHSG396Mlu fragment dehydrated with alkaline phosphatase (Alkaline Phosphatase Calf intestine: Takara Shuzo Co., Ltd.) and ligation kit ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and transformed into E. coli (DH5α strain). The recombinant Escherichia coli thus obtained was smeared on an LB agar medium containing 34 μg / ml chloramphenicol. The colonies thus obtained were then transferred to an LB agar medium containing 34 μg / ml chloramphenicol and 10% sucrose and cultured at 37 ° C. for 24 hours. Among these clones, plasmid DNA was purified by a conventional method for those that could not grow on a medium containing sucrose. As a result of analyzing the plasmid DNA thus obtained by MluI digestion, it was confirmed that it had an inserted fragment of about 2.0 kb, and this was named pCMB1.

（Ｄ）カナマイシン耐性遺伝子の取得
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造株式会社：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）０．１μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭ ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。 (D) Acquisition of kanamycin resistance gene Acquisition of the kanamycin resistance gene was performed using the DNA of E. coli plasmid vector pHSG299 (Takara Shuzo Co., Ltd .: Kanamycin resistance marker) as a template and the synthetic DNAs shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 as primers. The PCR method was used. Reaction solution composition: Template DNA 1 ng, Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) 0.1 μl, 1-fold concentration buffer, 0.5 μM each primer, 0.25 μM dNTPs were mixed to make a total volume of 20 μl.

（反応温度条件）
ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ株式会社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。 (Reaction temperature conditions)
Using a DNA thermal cycler PTC-200 (manufactured by MJ Research), a cycle consisting of 94 ° C. for 20 seconds, 62 ° C. for 15 seconds, and 72 ° C. for 1 minute 20 seconds was repeated 20 times. However, the heat retention at 94 ° C. in the first cycle was 1 minute 20 seconds, and the heat retention at 72 ° C. in the final cycle was 5 minutes.

増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ株式会社製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．１ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造株式会社製）により５’末端をリン酸化した。   Confirmation of the amplification product was performed by separating by 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMCBioProducts) gel electrophoresis and then visualized by staining with ethidium bromide to detect a fragment of about 1.1 kb. The DNA fragment of interest was recovered from the gel using a QIAQuick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN). The recovered DNA fragment was phosphorylated at the 5 'end with T4 polynucleotide kinase (T4 Polynucleotide Kinase: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.).

（Ｅ）カナマイシン耐性ＳａｃＢベクターの構築
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。 (E) Construction of kanamycin-resistant SacB vector The approximately 3.5 kb DNA fragment obtained by cleaving pCMB1 constructed in (C) above with restriction enzymes Van91I and ScaI was separated and recovered by 0.75% agarose gel electrophoresis. did. This was mixed with the kanamycin resistance gene prepared in (D) above, and ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) and Escherichia coli (DH5α strain) was transformed with the obtained plasmid DNA. The recombinant Escherichia coli thus obtained was smeared on an LB agar medium containing 50 μg / ml kanamycin.

このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能であることが確認された。また、同株から調製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ消化により３５４、４７３、１８０７、１９９７ｂｐの断片を生じたことから、構造に間違いないと判断し、当該プラスミドをｐＫＭＢ１と命名した。構築したｐＫＭＢ１を制限酵素ＳａｌＩで切断して得られた約４．６ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造株式会社製）により両末端を平滑化した後、ＥｃｏＲＶ制限酵素サイトを含むリンカー（配列番号５）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＶで切断し、再び上記方法により連結し、このプラスミドをｐＫＭＢ３と命名した。   It was confirmed that the strain grown on this kanamycin-containing medium was unable to grow on the sucrose-containing medium. Moreover, the plasmid DNA prepared from the same strain produced fragments of 354, 473, 1807, and 1997 bp by digestion with the restriction enzyme HindIII. Therefore, it was judged that the structure was correct, and the plasmid was designated as pKMB1. A DNA fragment of about 4.6 kb obtained by cleaving the constructed pKMB1 with the restriction enzyme SalI was separated and recovered by 0.75% agarose gel electrophoresis. After blunting both ends with Klenow fragment (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), this was mixed with a linker (SEQ ID NO: 5) containing an EcoRV restriction enzyme site, and ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.). The obtained plasmid was cleaved with EcoRV and ligated again by the above method, and this plasmid was designated as pKMB3.

（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のアスパルトキナーゼ遺伝子変異株の作製）
＜コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株アスパルトキナーゼ遺伝子のクローニング＞
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（以下ＡＴＣＣ１３０３２）株のアスパルトキナーゼ遺伝子（以下ｌｙｓＣ）の取得は、対象とする菌をＡＴＣＣ１３０３２とすること以外上記（Ａ）と同様の操作により調製したＡＴＣＣ１３０３２のＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号６および配列番号７）を用いたＰＣＲによって行った。 (Preparation of Aspartokinase Gene Mutant of Corynebacterium glutamicum ATCC13032)
<Cloning of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain aspartokinase gene>
Aspartokinase gene (hereinafter referred to as lysC) of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (hereinafter referred to as ATCC13032) strain is obtained by using the template of ATCC13032 prepared by the same procedure as in (A) above except that the target strain is ATCC13032. The PCR was performed using synthetic DNA (SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7) designed based on the gene sequence (GenBank Database Accession No. AP005276) of the ATCC13032 strain for which the entire genome sequence was reported.

なお、反応液は、鋳型ＤＮＡ１μｌおよびＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン株式会社製）０．２μｌに、各プライマーが０．３μＭ、ＭｇＳＯ_４が１ｍＭ、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）が０．２５μＭとなるように、１倍濃度Ｐｆｘ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン株式会社製）を加えて全量を２０μｌとすることにより調整した。また、反応温度条件としては、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ株式会社製ＰＴＣ−２００）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、６８℃で１分からなるサイクルを３５回繰り返した。ただし、１サイクル目は９４℃で１分２０秒の保温を行った。 The reaction solution was 1 μl of template DNA and 0.2 μl of Platinum (registered trademark) Pfx DNA polymerase (manufactured by Invitrogen), each primer was 0.3 μM, MgSO ₄ was 1 mM, and deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) were 0. The total amount was adjusted to 20 μl by adding 1 × concentration Pfx Amplification Buffer (manufactured by Invitrogen Corporation) so as to be 25 μM. As a reaction temperature condition, a DNA thermal cycler (PTC-200 manufactured by MJ Research Co., Ltd.) was used, and a cycle consisting of 94 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 20 seconds, and 68 ° C. for 1 minute was repeated 35 times. However, in the first cycle, the temperature was kept at 94 ° C. for 1 minute 20 seconds.

得られたｌｙｓＣ遺伝子のＤＮＡ断片はフェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿による精製を行い、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を検出し、ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡績株式会社製）を用いてゲルから回収した。   The obtained lysC gene DNA fragment was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, separated by 1.0% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMC BioProducts) gel electrophoresis, and visualized by ethidium bromide staining. A DNA fragment of about 1.3 kb was detected and recovered from the gel using a DNA Fragmentation Kit MagExtractor (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).

このＤＮＡ断片を、大腸菌ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（宝酒造株式会社製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌ アンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを用いてオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１５および配列番号１６）によるコロニーＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡは、コロニーを５０μｌの滅菌水に研濁した後、５分間煮沸処理した上清とした。   This DNA fragment was mixed with an E. coli vector pT7Blue vector (Takara Shuzo Co., Ltd.), and ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Escherichia coli (DH5α strain) was transformed with the obtained plasmid DNA and smeared on an LB agar medium containing 50 μg / ml ampicillin and 50 μg / ml X-Gal. Colony PCR using oligonucleotide primers (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16) was performed using clones that formed white colonies on this medium. The template DNA was a supernatant obtained by boiling the colony in 50 μl of sterilized water and boiling for 5 minutes.

（反応液組成）
鋳型ＤＮＡ１μｌ、Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ 各々プライマー、０．２μＭ ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。 (Reaction solution composition)
Template DNA 1 μl, Ex-Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) 0.2 μL, 1 × concentration attached buffer, 0.2 μM each primer, 0.2 μM dNTPs were mixed to make a total volume of 20 μl.

（反応温度条件）
ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ株式会社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は４分とした。 (Reaction temperature conditions)
Using DNA thermal cycler PTC-200 (manufactured by MJ Research), a cycle consisting of 94 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 20 seconds and 72 ° C. for 1 minute was repeated 30 times. However, the heat retention at 94 ° C. in the first cycle was 4 minutes.

これにより１２８６ｂｐのＰＣＲ増幅産物を得る株を選抜し、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ｌｙｓＣ挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデルＡＢＩ３１３０ｘｌ）およびビックダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ．３を用いて確認した。   Thus, a strain from which a 1286 bp PCR amplification product was obtained was selected and subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified. The base sequence of the lysC insert fragment was determined by applying a base sequence decoding device (Model ABI3130xl) manufactured by Applied Biosystems and Bic Die Terminator cycle sequence kit ver. 3 was confirmed.

＜ＡＴＣＣ１３０３２株アスパルトキナーゼ遺伝子変異導入用プラスミドの構築＞
次に、上記シークエンス解析に基づき、クローニングしたｌｙｓＣ遺伝子の９３１番目から９３３番目のＡＣＣ（Ｔｈｒ）をＡＴＣ（Ｉｌｅ）に変異させるためにクロスオーバーＰＣＲを行った。遺伝子前半部分を増幅させるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号８および配列番号９）および後半部分を増幅させるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１０および配列番号１１）を合成し、増幅断片を鋳型としてＰＣＲを行った。 <Construction of ATCC13032 Strain Aspartokinase Gene Mutation Plasmid>
Next, based on the above sequence analysis, crossover PCR was performed to mutate the 931st to 933rd ACC (Thr) of the cloned lysC gene to ATC (Ile). Oligonucleotide primers (SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9) for amplifying the first half of the gene and oligonucleotide primers (SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11) for amplifying the second half were synthesized, and PCR was performed using the amplified fragment as a template.

得られた断片をエタノール沈殿によって精製し、これを鋳型としてオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号８および配列番号１１）によって増幅させた。この断片を１．０％アガロース電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色を用いて可視化することによりｌｙｓＣ遺伝子を含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を検出し、ゲルから切り出してキットにより精製した。回収した断片はリン酸化を行い、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿による精製の後、プラスミドベクターｐＫＭＢ１に制限酵素ＳａｃＩ、ＳｐｈＩで切断したＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結した。   The obtained fragment was purified by ethanol precipitation, and amplified with oligonucleotide primers (SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 11) using this as a template. This fragment was separated by 1.0% agarose electrophoresis and visualized using ethidium bromide staining to detect a DNA fragment of about 1.3 kb containing the lysC gene, cut out from the gel, and purified with a kit. The recovered fragment was phosphorylated, extracted with phenol / chloroform, purified by ethanol precipitation, mixed with the DNA fragment cleaved with the restriction enzymes SacI and SphI in the plasmid vector pKMB1, and ligated kit ver. 2 (manufactured by Takara Bio Inc.).

このようにして得られた変異導入用プラスミドを用いて大腸菌（ＤＨ５α）を塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した。この組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドをシークエンス解析により、１２８６ｋｂの挿入断片が認められることを確認した。このプラスミドをｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１Ｉと命名した。
大腸菌ＪＭ１１０にｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１Ｉを、電気パルス法により導入した。この組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。培地上にコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。 Escherichia coli (DH5α) was transformed by the calcium chloride method (Journal of Molecular Biology, 53, 159, 1970) using the plasmid for mutagenesis thus obtained. This recombinant Escherichia coli was cultured on an LB agar medium containing 50 μg / ml kanamycin and 50 μg / mL X-Gal.
Clones that formed white colonies on this medium were subjected to liquid culture by a conventional method, and then plasmid DNA was purified. The obtained plasmid was confirmed to have a 1286 kb insert fragment by sequence analysis. This plasmid was designated as pKMB1-lysCT311I.
PKMB1-lysCT311I was introduced into E. coli JM110 by the electric pulse method. This recombinant Escherichia coli was cultured on an LB agar medium containing 50 μg / ml kanamycin. Clones that formed colonies on the medium were subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified.

＜アスパルトキナーゼ遺伝子変異株の作製＞
ＡＴＣＣ１３０３２株にｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１Ｉを、電気パルス法により導入し、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。 <Production of aspartokinase gene mutant>
PKMB1-lysCT311I was introduced into the ATCC13032 strain by an electric pulse method, and the obtained transformant was added to an LBG agar medium containing 50 μg / ml kanamycin [tryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 5 g, glucose 20 g, and agar 15 g. Dissolved in 1 liter of distilled water].

この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１ＩがＡＴＣＣ１３０３２株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｌｙｓＣ遺伝子とＡＴＣＣ１３０３２株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。   The strain grown on this medium is the result of homologous recombination between the lysC gene of the plasmid and the same gene on the genome of ATCC13032 because pKMB1-lysCT311I is a plasmid that cannot replicate in the ATCC13032 strain. The kanamycin resistance gene and SacB gene derived from the plasmid should be inserted on the same genome.

次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。その結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を約３０個得た。
この様にして得られた株の中には、そのｌｙｓＣ遺伝子がｐＫＭＢ１−ｌｙｓＣＴ３１１Ｉに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ｌｙｓＣ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Ｌ−リジンとＬ−スレオニンによる協奏的フィードバック阻害が解除されたことによるＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を指標に選択し、得られた変異株をＡＬ１と命名した。 Next, the homologous recombination strain was liquid cultured in an LBG medium containing kanamycin 50 μg / ml. A portion equivalent to about 1 million cells of this culture was smeared on a 10% sucrose-containing LBG medium. As a result, about 30 strains that were considered to be sucrose-insensitive due to the loss of the SacB gene by the second homologous recombination were obtained.
Among the strains thus obtained, those in which the lysC gene has been replaced with a mutant derived from pKMB1-lysCT311I and those in which the lysC gene has returned to the wild type are included. Confirmation of whether the lysC gene is a mutant type or a wild type is an indicator of resistance to S- (2-aminoethyl) -L-cysteine due to the release of concerted feedback inhibition by L-lysine and L-threonine The mutant obtained was named AL1.

（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＬ１のｈｏｍ遺伝子変異株の作製）
＜ホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下ｈｏｍ）遺伝子のクローニング＞
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（以下ＡＴＣＣ１３０３２）ＡＴＣＣ１３０３２株のホモセリン脱水素酵素（以下ｈｏｍ）遺伝子の取得は、対象とする菌をＡＴＣＣ１３０３２とすること以外上記（Ａ）と同様の操作により調製したＡＴＣＣ１３０３２のＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１２および配列番号１３）を用いたＰＣＲによって行った。 (Preparation of hom gene mutant of Corynebacterium glutamicum AL1)
<Cloning of homoserine dehydrogenase (hom) gene>
The homoserine dehydrogenase (hereinafter referred to as hom) gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (hereinafter referred to as ATCC13032) strain ATCC13032 was obtained by the DNA of ATCC13032 prepared by the same procedure as in (A) above except that the target bacterium was ATCC13032. Synthetic DNA (SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13) designed based on the gene sequence (GenBank Database Accession No. AP005276) of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain, which has been reported as a whole genome sequence By PCR.

なお、反応液は、鋳型ＤＮＡ１μｌおよびＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μｌに、各プライマーが０．３μＭ、ＭｇＳＯ_４が１ｍＭ、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）が０．２５μＭとなるように、１倍濃度Ｐｆｘ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン社製）を加えて全量を２０μｌとすることにより調整した。また、反応温度条件としては、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製ＰＴＣ−２００）を用い、９８℃で５秒、６８℃で２０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の前に９４℃で１分、最終サイクルの後に７２℃で３分の保温を行った。 The reaction solution was prepared by adding 1 μl of template DNA and 0.2 μl of Platinum (registered trademark) Pfx DNA polymerase (manufactured by Invitrogen), 0.3 μM of each primer, 1 mM of MgSO ₄ , and 0. deoxynucleotide triphosphate (dNTPs). A 1-fold concentration Pfx Amplification Buffer (manufactured by Invitrogen) was added to adjust the total volume to 20 μl so as to be 25 μM. As a reaction temperature condition, a DNA thermal cycler (PTC-200 manufactured by MJ Research) was used, and a cycle consisting of 98 ° C. for 5 seconds and 68 ° C. for 20 seconds was repeated 30 times. However, heat retention was performed at 94 ° C. for 1 minute before the first cycle, and at 72 ° C. for 3 minutes after the final cycle.

＜ｈｏｍ遺伝子変異導入用プラスミドの構築＞
次に、上記シークエンス解析に基づき、クローニングしたｈｏｍ遺伝子配列の１７５番目から１７７番目の配列をＧＴＴ（Ｖａｌ）からＧＣＴ（Ａｌａ）に変異させるためにクロスオーバーＰＣＲを行った。 <Construction of plasmid for introducing hom gene mutation>
Next, based on the above sequence analysis, crossover PCR was performed to mutate the 175th to 177th sequences of the cloned hom gene sequence from GTT (Val) to GCT (Ala).

遺伝子前半部分を増幅させるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１２および配列番号１４）および後半部分を増幅させるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１５および配列番号１３）を合成し、増幅断片を鋳型としてＰＣＲを行った。得られた断片をエタノール沈殿によって精製し、これを鋳型としてオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１２および配列番号１５）によって増幅させた。   Oligonucleotide primers (SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 14) for amplifying the first half of the gene and oligonucleotide primers (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 13) for amplifying the second half were synthesized, and PCR was performed using the amplified fragment as a template. The obtained fragment was purified by ethanol precipitation, and amplified with oligonucleotide primers (SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 15) using this as a template.

この断片を１．０％アガロース電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色を用いて可視化することによりｈｏｍ遺伝子を含む約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を検出し、ゲルから切り出してキットにより精製した。回収した断片はリン酸化を行い、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿による精製の後、プラスミドベクターｐＫＭＢ３に制限酵素ＥｃｏＲＶで切断したＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結した。   This fragment was separated by 1.0% agarose electrophoresis and visualized using ethidium bromide staining to detect a DNA fragment of about 1.0 kb containing the hom gene, cut out from the gel, and purified with a kit. The recovered fragment was phosphorylated, purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, mixed with a DNA fragment cleaved with the restriction enzyme EcoRV into the plasmid vector pKMB3, and ligated with a ligation kit ver. 2 (manufactured by Takara Bio Inc.).

このようにして得られた変異導入用プラスミドを用いて大腸菌（ＤＨ５α）を塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した。この組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび５０μｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養した。   Escherichia coli (DH5α) was transformed by the calcium chloride method (Journal of Molecular Biology, 53, 159, 1970) using the plasmid for mutagenesis thus obtained. The recombinant E. coli was cultured on an LB agar medium containing 50 μg / ml kanamycin and 50 μg / ml X-Gal.

この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドをシークエンス解析により、約１．０ｋｂの挿入断片が認められることを確認した。このプラスミドをｐＫＭＢ３ＡＬｈｏｍ５９と命名した。
大腸菌ＪＭ１１０にｐＫＭＢ３ＡＬｈｏｍ５９を、電気パルス法により導入した。この組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。培地上にコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。 Clones that formed white colonies on this medium were subjected to liquid culture by a conventional method, and then plasmid DNA was purified. It was confirmed by sequence analysis that the obtained plasmid had an inserted fragment of about 1.0 kb. This plasmid was named pKMB3ALhom59.
PKMB3ALhom59 was introduced into E. coli JM110 by the electric pulse method. This recombinant Escherichia coli was cultured on an LB agar medium containing 50 μg / ml kanamycin. Clones that formed colonies on the medium were subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified.

＜ｈｏｍ遺伝子変異株の作製＞
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＬ１株にｐＫＭＢ３ＡＬｈｏｍ５９を電気パルス法により導入し、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。 <Preparation of hom gene mutant>
PKMB3ALhom59 was introduced into Corynebacterium glutamicum strain AL1 by the electric pulse method, and the obtained transformant was LBG agar medium containing 50 μg / ml kanamycin [tryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 5 g, glucose 20 g, and agar. 15 g was dissolved in 1 l of distilled water].

この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ３ＡＬｈｏｍ５９がＡＴＣＣ１３０３２株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｈｏｍ遺伝子とＡＴＣＣ１３０３２株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。   Since the strain grown on this medium is a plasmid in which pKMB3ALhom59 cannot replicate in the ATCC13032 bacterial cell, homologous recombination was caused between the hom gene of the plasmid and the same gene on the genome of the ATCC13032 strain. The kanamycin resistance gene and SacB gene derived from the plasmid should be inserted on the genome.

次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を約３個得た。
この様にして得られた株の中には、そのｈｏｍ遺伝子がｐＫＭＢ３ＡＬｈｏｍ５９に由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ｈｏｍ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、変異導入箇所増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー（配列１６および配列１７）およびＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅを用いた融解曲線分析（ロシュ・ダイアグノスティック株式会社製ライトサイクラー１．５）による変異検出によって行った。この結果Ｖ５９Ａ変異が導入されたｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ組換え体であることが確認された。こうして得られた変異株をＡＬ２と命名した。 Next, the homologous recombination strain was liquid cultured in an LBG medium containing kanamycin 50 μg / ml. A portion equivalent to about 1 million cells of this culture was smeared on a 10% sucrose-containing LBG medium. As a result, about 3 strains that were considered to be sucrose-insensitive due to the loss of the SacB gene by the second homologous recombination were obtained.
Among the strains thus obtained, those in which the hom gene is replaced with a mutant type derived from pKMB3ALhom59 and those in which the hom gene has returned to the wild type are included. Whether the hom gene is a mutant type or a wild type is confirmed by melting curve analysis (Roche Diagnostics, Inc.) using oligonucleotide primers (sequence 16 and sequence 17) for amplification of mutation-introduced sites and hybridization probe. The detection was performed by mutation detection using a light cycler 1.5). As a result, it was confirmed that it was a double crossover recombinant into which the V59A mutation was introduced. The mutant strain thus obtained was named AL2.

［リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）増強株の作製］
次いで、後述するカダベリン塩酸塩水溶液の調製に用いるリジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）増幅株の作製手順について説明する。 [Preparation of lysine decarboxylase gene (cadA) -enhanced strain]
Subsequently, the preparation procedure of the lysine decarboxylase gene (cadA) amplification strain used for preparation of the cadaverine hydrochloride aqueous solution mentioned later is demonstrated.

＜大腸菌ＤＮＡ抽出＞
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍｌに、大腸菌ＪＭ１０９株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）水溶液０．１５ｍｌに懸濁した。 <Escherichia coli DNA extraction>
In 10 ml of LB medium [composition: tryptone 10 g, yeast extract 5 g, sodium chloride (NaCl) 5 g dissolved in 1 L of distilled water] Escherichia coli JM109 strain was cultured until the late logarithmic growth phase. It was suspended in 0.15 ml of a 10 mM NaCl / 20 mM Tris buffer (pH 8.0) / 1 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA · 2Na) aqueous solution containing ml of lysozyme.

次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で１時間保温した。更に、ドデシル硫酸ナトリウムを、最終濃度が０．５％になるように加え、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を加え、室温で１０分間緩やかに振盪した後、全量を遠心分離（５０００×ｇ、２０分間、１０℃〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように加えた後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、後述のＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用した。   Next, proteinase K was added to the above suspension so that the final concentration was 100 μg / ml, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, sodium dodecyl sulfate was added to a final concentration of 0.5%, and the mixture was incubated at 50 ° C. for 6 hours for lysis. To this lysate, add an equal amount of phenol / chloroform solution, gently shake at room temperature for 10 minutes, then centrifuge the whole volume (5000 × g, 20 minutes, 10 ° C. to 12 ° C.), and remove the supernatant fraction. After separating and adding sodium acetate to 0.3 M, 2 volumes of ethanol was added and mixed. The precipitate collected by centrifugation (15000 × g, 2 minutes) was washed with 70% ethanol and then air-dried. To the obtained DNA, 5 ml of 10 mM Tris buffer solution (pH 7.5) / 1 mM EDTA · 2Na solution was added and left overnight at 4 ° C., and used as template DNA for PCR described later.

＜ｃａｄＡのクローニング＞
大腸菌ｃａｄＡの取得は、上記手順で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ（下記の配列番号１８及び配列番号１９で表わされる配列からなるＤＮＡ）をプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行なった。 <Cloning of cadA>
E. coli cadA is obtained by using the DNA prepared in the above procedure as a template, and a synthetic DNA designed based on the sequence of the gene of E. coli K12-MG1655 strain (GenBank Database Accession No. U00096) for which the entire genome sequence has been reported (GenBank Database Accession No. U00096). DNA comprising the sequences represented by the following SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19) was performed by polymerase chain reaction (PCR) using as a primer.

なお、反応液は、鋳型ＤＮＡ１μｌ及びＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン株式会社製）０．２μｌに、各プライマーが０．３μＭ、ＭｇＳＯ_４が１ｍＭ、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）が０．２５μＭとなるように、１倍濃度Ｐｆｘ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン社製）を加えて全量を２０μｌとすることにより調製した。 The reaction solution was 1 μl of template DNA and 0.2 μl of Platinum (registered trademark) Pfx DNA polymerase (manufactured by Invitrogen), each primer was 0.3 μM, MgSO ₄ was 1 mM, and deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) were 0. It was prepared by adding a 1-fold concentration Pfx Amplification Buffer (manufactured by Invitrogen) to a total volume of 20 μl so as to be 25 μM.

また、反応温度条件としては、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製ＰＴＣ−２００）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２．５分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は１０分とした。   As a reaction temperature condition, a DNA thermal cycler (PTC-200 manufactured by MJ Research) was used, and a cycle consisting of 94 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 2.5 minutes was repeated 35 times. However, the heat retention at 94 ° C. in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 72 ° C. in the final cycle was 10 minutes.

ＰＣＲの終了後、増幅産物をエタノール沈殿により精製し、制限酵素ＫｐｎＩ及び制限酵素ＳｐｈＩで切断した。得られたＤＮＡ標品を、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離した後、臭化エチジウム染色を用いて可視化することにより、ｃａｄＡを含む約２．６ｋｂの断片を検出し、ＱＩＡ Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて目的ＤＮＡ断片の回収を行なった。   After completion of PCR, the amplified product was purified by ethanol precipitation and cleaved with restriction enzyme KpnI and restriction enzyme SphI. The obtained DNA preparation was separated by 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMCBioProducts) gel electrophoresis and then visualized using ethidium bromide staining, whereby a fragment of about 2.6 kb containing cadA. The target DNA fragment was recovered using QIA Quick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).

回収したＤＮＡ断片を、大腸菌プラスミドベクターｐＵＣ１８（タカラバイオ株式会社製）を制限酵素ＫｐｎＩ及び制限酵素ＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）及び５０μｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ及び制限酵素ＳｐｈＩで切断することにより、約２．５ｋｂの挿入断片が認められることを確認した。このプラスミドをｐＣＡＤ１と命名し、ｐＣＡＤ１を含む大腸菌株をＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１と命名した。 The recovered DNA fragment was mixed with a DNA fragment prepared by cleaving E. coli plasmid vector pUC18 (Takara Bio Inc.) with restriction enzymes KpnI and restriction enzyme SphI, and ligation kit ver. 2 (manufactured by Takara Bio Inc.) and then Escherichia coli (JM109 strain) was transformed with the obtained plasmid DNA. The recombinant Escherichia coli thus obtained was smeared on an LB agar medium containing 50 μg / ml ampicillin, 0.2 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) and 50 μg / ml X-Gal.
Clones that formed white colonies on this medium were subjected to liquid culture by a conventional method, and then plasmid DNA was purified. The obtained plasmid DNA was cleaved with restriction enzyme KpnI and restriction enzyme SphI, and it was confirmed that an inserted fragment of about 2.5 kb was observed. This plasmid was named pCAD1 and the E. coli strain containing pCAD1 was named JM109 / pCAD1.

＜ｃａｄＡ増幅株の培養＞
上記手順により得られた大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１をＬＢ培地入り５００ｍｌ容フラスコ１本で前培養した後、１０ｍｌの培養液を２００ｍｌの２倍濃度ＬＢ培地が入った１ｌ容フラスコに接種し、温度３５℃、通気なし（０ｖｖｍ）、振とう回転数１６０ｒｐｍの条件下で培養を行なった。培養４時間目に、滅菌したＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度で０．５ｍＭになるように加え、その後１４時間培養を継続した。
次に、６０００ｒｐｍ、１０分の条件で遠心分離を行い培養液からの菌体回収を行なった。この湿菌体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液に懸濁して保存、または、後述のリジン脱炭酸反応に使用した。 <Culture of cadA amplified strain>
E. coli strain JM109 / pCAD1 obtained by the above procedure was pre-cultured in one 500 ml flask containing LB medium, and 10 ml of the culture solution was inoculated into a 1 l flask containing 200 ml of double concentration LB medium, and the temperature was 35. Cultivation was performed under the conditions of 0 ° C., no aeration (0 vvm), and a shaking rotation speed of 160 rpm. At 4 hours of culture, sterilized IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 0.5 mM, and then the culture was continued for 14 hours.
Next, centrifugation was performed at 6000 rpm for 10 minutes to recover the cells from the culture. This wet cell was suspended in 10 mM sodium acetate solution and stored, or used for lysine decarboxylation described below.

（ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液の作成）
＜コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＬ２株によるリジンの発酵生産＞
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＬ２株を、滅菌ＬＢ培地を２００ｍｌ含む１Ｌ容フラスコ５本に１白金耳ずつ植菌し、３０℃で２４時間振とうし、前々培養液（計１Ｌ）を得た。この前々培養液の全量を、９９ＬのＬＰＧ１培地（表１参照）を入れた全容２００Ｌの培養タンクに植菌し、３０℃、ｐＨ７．２、滅菌した空気を１ｖｖｍで通気、撹拌回転数はＤＯが３ｐｐｍ以上になるように可変させて６時間培養した。この全量を、２．５ｍ^３のＬＰＧ培地を含む全容５ｍ^３の発酵槽に無菌的に移送し、滅菌空気を１ｖｖｍで通気、３０℃で培養を開始した。 (Preparation of pentamethylenediamine / adipate aqueous solution)
<Fermental production of lysine by Corynebacterium glutamicum AL2 strain>
One platinum loop of the Corynebacterium glutamicum AL2 strain was inoculated into five 1 L flasks containing 200 ml of sterilized LB medium, and shaken at 30 ° C. for 24 hours to obtain a culture solution (1 L in total). The entire amount of the culture medium was inoculated into a 200 L culture tank containing 99 L of LPG1 medium (see Table 1), aerated at 30 ° C., pH 7.2, sterilized air at 1 vvm, and the stirring speed was The culture was performed for 6 hours while changing the DO to 3 ppm or more. The total amount, aseptically transferred to the fermentation tank of the total volume 5 m ³ including LPG medium 2.5 m ^3, venting sterile air at 1 vvm, culture was started at 30 ° C..

ｐＨは、アンモニアガスを供給することにより７．２に制御した。撹拌回転数はＤＯが３ｐｐｍ以下にならないように段階的に変更した。培地中のグルコースが枯渇した時点から、滅菌したフィード溶液［５０％（ｗ／ｖ）グルコース、４．５％（ｗ／ｖ）ＮＨ４Ｃｌ、０．５ｍｇ／Ｌ Ｄ−ビオチン］を定速で連続的に供給し、５０時間まで培養を継続した。培養終了後の全容積は約３．５ｍ^３であった。培養後のリジン濃度の測定は、ＢＬ５リジンセンサ（王子計測機器株式会社製）により行い、培養終了後のリジン濃度は、約９０ｇ／Ｌであった。
尚、表１にＬＰＧ１培地を示す。 The pH was controlled at 7.2 by supplying ammonia gas. The stirring rotation speed was changed stepwise so that DO would not be 3 ppm or less. From the time when glucose in the medium is depleted, a sterilized feed solution [50% (w / v) glucose, 4.5% (w / v) NH 4 Cl, 0.5 mg / L D-biotin] is continuously added at a constant speed. The culture was continued up to 50 hours. The total volume after completion of the culture was about 3.5 m ³ . The lysine concentration after the culture was measured with a BL5 lysine sensor (manufactured by Oji Scientific Instruments), and the lysine concentration after the culture was about 90 g / L.
Table 1 shows the LPG1 medium.

＜ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液の作成＞
上述した操作により作成したリジンを含む発酵溶液に、ピリドキサルリン酸を０．１ｍＭの濃度となるように加え、更に、大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１の菌体を、ＯＤ６６０が０．５になるように加えてリジン脱炭酸反応を開始した。
反応時の条件は、温度３７℃、通気量なし（０ｖｖｍ）、撹拌回転数７０ｒｐｍとした。反応中の溶液のｐＨは、２５０ｋｇのアジピン酸をイオン交換水４００Ｌに懸濁したスラリーを加え、ｐＨ６．５になるように制御し、合計２２時間反応させた。
反応終了時には、リジン残存濃度が０．０３ｇ／Ｌ以下であり、ほぼ１００％のリジンがペンタメチレンジアミンに変換されていた。反応後の溶液（約４ｍ^３）は、菌体の不活化処理（８０℃、３０分）を実施した後、分子量１３，０００カットのＵＦ膜モジュール（旭化成工業株式会社製ＡＣＰ−３０５３）を通して高分子量の不純物除去を行なった。 <Preparation of pentamethylenediamine / adipate aqueous solution>
To the fermentation solution containing lysine prepared by the above-described operation, pyridoxal phosphate is added to a concentration of 0.1 mM, and further, cells of E. coli strain JM109 / pCAD1 are added so that OD660 is 0.5. Lysine decarboxylation was initiated.
The reaction conditions were a temperature of 37 ° C., no air flow (0 vvm), and a stirring speed of 70 rpm. The pH of the solution during the reaction was controlled by adding a slurry in which 250 kg of adipic acid was suspended in 400 L of ion-exchanged water and adjusted to pH 6.5 and reacted for a total of 22 hours.
At the end of the reaction, the residual concentration of lysine was 0.03 g / L or less, and almost 100% of lysine was converted to pentamethylenediamine. The solution after the reaction (about 4 m ³ ) was subjected to inactivation treatment of cells (80 ° C., 30 minutes), and then passed through a UF membrane module (ACP-3053 manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.) having a molecular weight of 13,000 cut. Molecular weight impurities were removed.

尚、配列番号と配列番号に対応した塩基配列は以下の通りである。
（配列番号）
１ ＣＣＴＴＴＴＴＡＡＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＡＴＡＣＣＴＧＣＣＧＴＴＣＡＣ
２ ＡＡＡＧＧＴＴＡＧＧＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＧＣＣＡＴＴＴＧＣＣＴＧ
３ ＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧ
４ ＣＴＣＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡ
５ ＧＧＡＴＡＴＣＣ
６ ＧＴＧＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＡＣＴＣＧＡＴＧ
７ ＧＣＣＴＧＡＧＴＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＡＣＣＴＣＧＡ
８ ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧ
９ ＡＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＴ
１０ ＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣＧＣＴ
１１ ＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
１２ ＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＡＡ
１３ ＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴ
１４ ＧＡＧＡＴＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＡＴＧＣＣＡ
１５ ＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＣ
１６ ＣＧＡＧＴＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＧ
１７ ＣＴＴＣＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＧＡＡＣＴＡＣ
１８ ＧＴＴＧＣＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＧＣＴＧＡＴＧ
１９ ＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡＡＧ In addition, the nucleotide sequence corresponding to the sequence number and the sequence number is as follows.
(Sequence number)
1 CCTTTTTACACCCATCACATATACCTGCCGTTCAC
2 AAAGGGTTAGGAATACGGTTAGCCATTTGCCCTG
3 GAGGTCTGCCTCTCGTGAAGAAG
4 CTCATTAGAAAAACTCATCGAGCATCA
5 GGA ATCC
6 GTGTGCGTGAAGCACTCGGATG
7 GCCTGAGTAATGTTCTCTACTCTCGA
8 GTTTTCCCAGTCACGACGTTG
9 AGCGAGGGCAGGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCCGT
10 ACGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGCT
11 ACACAGGAAACAGCTATGACCATG
12 CACCCATCTCAATGGGTCATGGTGAA
13 GATGGATGCCAAAATGTCAGCCTT
14 GAGATACATCAGAAGCAGCAATGCCA
15 TGGCATTGCTGCCTCTGATATCTC
16 CGAGTACGGTGATGAACTTG
17 CTTCAGAGCTGCGAGAACTAC
18 GTTGCGGTGTCTGCCTCATCGCGCTGATG
19 ACCAAGCTGATGGGGTGAGATAGGAGAATGAGTAAG

［ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の精製・単離］
（１）活性炭による脱色
直径７００ｍｍの活性炭塔に活性炭（三菱化学カルゴン株式会社製ＭＭ−１１）１０５ｋｇ（約４４０Ｌ）を仕込み、２日間脱塩水を通水した。次に、前記ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液（約４ｍ^３）を１．３２ｍ^３／ｈの速度で通液し、最後に５００Ｌの脱塩水を通水した。初期４６０Ｌをパージした後、活性炭処理したペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を採取した。 [Purification and isolation of pentamethylenediamine adipate]
(1) Decolorization with activated carbon 105 kg (about 440 L) of activated carbon (MM-11 manufactured by Mitsubishi Chemical Calgon Co., Ltd.) was charged into an activated carbon tower having a diameter of 700 mm, and demineralized water was passed through for 2 days. Next, the pentamethylenediamine / adipate aqueous solution (about 4 m ³ ) was passed at a rate of 1.32 m ³ / h, and finally 500 L of demineralized water was passed. After initially purging 460 L, an activated carbon-treated pentamethylenediamine / adipate aqueous solution was collected.

（２）濃縮
ＰＰプリーツカートリッジフィルターＴＣＰ−ＪＸを通して、前記活性炭処理後のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を２ｍ^３撹拌槽に仕込み、ジャケット温度１１０℃、内温５７℃、真空度１４０Ｔｏｒｒ〜１５０Ｔｏｒｒにて濃縮を開始し、適宜、活性炭処理後のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を仕込みながら濃縮を行った。
ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩濃度は６３．５重量％であった。 (2) Concentration Through a PP pleated cartridge filter TCP-JX, the aqueous solution of pentamethylenediamine / adipate after the activated carbon treatment is charged into a 2 m ³ stirring tank, and the jacket temperature is 110 ° C., the internal temperature is 57 ° C., and the vacuum is 140 Torr to 150 Torr. Concentration was started, and the concentration was carried out while appropriately charging the activated carbon-treated pentamethylenediamine / adipate solution.
The concentration of pentamethylenediamine adipate was 63.5% by weight.

尚、上記濃縮液等のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液中のペンタメチレンジアミン濃度は、１Ｎ−ＨＣｌ水溶液にて滴定して、ｐＨの変曲点までの滴定量から算出した。同様に上記濃縮液等のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液中のアジピン酸濃度は、１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液にて滴定して、ｐＨの変曲点までの滴定量から算出した。滴定には、自動滴定装置（三菱化学株式会社製ＧＴ−０６型）を使用した。   The concentration of pentamethylenediamine in the aqueous solution of pentamethylenediamine / adipate such as the concentrated solution was titrated with a 1N-HCl aqueous solution and calculated from the titration amount up to the inflection point of pH. Similarly, the concentration of adipic acid in the pentamethylenediamine / adipate aqueous solution such as the concentrated solution was titrated with a 1N-NaOH aqueous solution and calculated from the titration amount up to the inflection point of pH. For titration, an automatic titration apparatus (GT-06 model manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) was used.

（３）晶析
次に、同一の２ｍ^３撹拌槽にて晶析を行った。撹拌翼は３枚後退翼、撹拌速度は４０ｒｐｍ、降温速度は８℃／ｈである。
内温３７．４℃のときに、予め作成したペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を種晶として１ｋｇ添加して結晶を析出させ、内温１０．５℃で晶析終了として、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩スラリーを得た。尚、種晶としてのペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩は、本実施例に準じてラボスケールにて準備した。 (3) Crystallization Next, crystallization was performed in the same 2 m ³ stirring tank. The stirring blades are three retreating blades, the stirring speed is 40 rpm, and the cooling rate is 8 ° C./h.
When the internal temperature is 37.4 ° C., 1 kg of pentamethylenediamine / adipate prepared in advance is added as a seed crystal to precipitate crystals, and the crystallization is completed at an internal temperature of 10.5 ° C. An acid salt slurry was obtained. Incidentally, pentamethylenediamine adipate as a seed crystal was prepared on a lab scale according to this example.

（４）遠心濾過
直径１．２２ｍの遠心濾過器を用い、前記ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩スラリーを３回に分けて遠心濾過した。回転数は９８０ｒｐｍ、母液振り切り時間は１５分、母液振り切り後に１０℃の脱塩水約１２ｋｇをシャワー状に振りかけて洗浄し、その脱塩水の振り切り時間は１５分間とした。 (4) Centrifugal Filtration Using a centrifugal filter having a diameter of 1.22 m, the pentamethylenediamine / adipate slurry was centrifugally filtered in three portions. The number of revolutions was 980 rpm, the mother liquor shake-off time was 15 minutes, and after washing the mother liquor, about 12 kg of demineralized water at 10 ° C. was sprinkled in a shower to wash the demineralized water for 15 minutes.

１番晶（１回晶析品）として得られたｗｅｔケーキは約１９０ｋｇ（ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩として約１６０ｋｇ）であった。
尚、上記ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩重量は、ｗｅｔケーキの水分量を水分計（三菱化学株式会社製：電量滴定式水分測定装置ＣＡ−０６型）と、水分気化装置（三菱化学株式会社製：ＶＡ−０６型）とを使用して測定し、測定値から算出した。 The wet cake obtained as the first crystal (one crystallized product) was about 190 kg (about 160 kg as pentamethylenediamine adipate).
The weight of the pentamethylenediamine / adipate is determined based on the moisture content of the wet cake (Mitsubishi Chemical Co., Ltd .: Coulometric Titration Moisture Analyzer CA-06) and the moisture vaporizer (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.). : VA-06 type) and calculated from the measured value.

（５）２回晶析品
１回晶析品の一部を脱塩水に溶解し５０重量％のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液とし、これに１回晶析品を得たのと同様の操作を加えて、より精製度の高い２回晶析品（ｗｅｔケーキ約４０ｋｇ）を得た。 (5) Double-crystallized product A part of the single-crystallized product was dissolved in demineralized water to obtain a 50% by weight pentamethylenediamine / adipate aqueous solution. Operation was added to obtain a twice-crystallized product (wet cake of about 40 kg) having a higher degree of purification.

［ペンタメチレンジアミンの精製・単離］
前述した［ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の精製・単離］の（４）遠心濾過において、遠心濾過後の濾液であるペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を回収した。次に、回収したペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液中のペンタメチレンジアミン濃度を測定し、水溶液中のペンタメチレンジアミンのモル数を算出した。続いて、この水溶液に、算出したペンタメチレンジアミンのモル数の２倍のモル数に相当する水酸化ナトリウム（濃度４８重量％水溶液）を添加し、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液からペンタメチレンジアミンを遊離させた。同時に、アジピン酸ナトリウムが析出した。
次に、遊離したペンタメチレンジアミンを含むスラリーを６０℃、５０Ｔｏｒｒにて脱水蒸留を行った。さらに、析出したアジピン酸ナトリウムを遠心濾過にて固液分離した。
次に、得られた濾液を８０℃、３０Ｔｏｒｒにて単蒸留してペンタメチレンジアミンを得た。得られたペンタメチレンジアミンの数量は約９０ｋｇであった。 [Puramethylenediamine purification and isolation]
In (4) centrifugal filtration of [Pentamethylenediamine / adipate purification / isolation] described above, an aqueous solution of pentamethylenediamine / adipate, which was the filtrate after centrifugal filtration, was recovered. Next, the concentration of pentamethylenediamine in the recovered pentamethylenediamine / adipate aqueous solution was measured, and the number of moles of pentamethylenediamine in the aqueous solution was calculated. Subsequently, sodium hydroxide (48% by weight aqueous solution) corresponding to twice the number of moles of pentamethylenediamine calculated was added to this aqueous solution, and pentamethylenediamine was added from the pentamethylenediamine / adipate aqueous solution. Was released. At the same time, sodium adipate precipitated.
Next, the slurry containing the released pentamethylenediamine was subjected to dehydration distillation at 60 ° C. and 50 Torr. Furthermore, the precipitated sodium adipate was subjected to solid-liquid separation by centrifugal filtration.
Next, the obtained filtrate was simply distilled at 80 ° C. and 30 Torr to obtain pentamethylenediamine. The quantity of pentamethylenediamine obtained was about 90 kg.

（実施例１）
＜ポリアミド樹脂の製造＞
上記ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の精製・単離にて調製したペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の２回晶析品２５ｋｇに脱塩水２５ｋｇを添加した後、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に対して燐原子換算で３０重量ｐｐｍの亜燐酸水素２ナトリウム・５水和物を添加し、窒素雰囲気下で混合物を溶解させ、原料水溶液を得た。
プランジャーポンプにて予め窒素置換したオートクレーブに、上記の原料水溶液を移送した。ジャケット温度を２８０℃に、オートクレーブの圧力を１．４７ＭＰａにそれぞれ調節し、内容物を２７０℃に昇温した。 Example 1
<Manufacture of polyamide resin>
After adding 25 kg of demineralized water to 25 kg of the double crystallized product of pentamethylenediamine and adipate prepared by purification and isolation of the above pentamethylenediamine and adipate, 30 wt ppm of disodium hydrogen phosphite pentahydrate in terms of phosphorus atom was added, and the mixture was dissolved in a nitrogen atmosphere to obtain a raw material aqueous solution.
The raw material aqueous solution was transferred to an autoclave which had been previously purged with nitrogen by a plunger pump. The jacket temperature was adjusted to 280 ° C., the autoclave pressure was adjusted to 1.47 MPa, and the contents were heated to 270 ° C.

次に、オートクレーブ内の圧力を除々に放圧した後、更に減圧して所定の撹拌動力に到達した時点で反応終了とした。反応終了後に窒素にて復圧し、内容物をストランド状に冷却水槽へ導入した後、回転式カッターでペレット化した。得られたペレットは、１２０℃、１ｔｏｒｒ（０．１３ｋＰａ）の条件で、水分量が０．１％以下となる迄乾燥し、ポリアミド樹脂（ＰＡ５６）を得た。相対粘度（η_ｒ）は２．８であった。
続いて、このポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表１に示すように銅含有量３０重量ｐｐｍで塩化第一銅を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。 Next, after gradually releasing the pressure in the autoclave, the pressure was further reduced and the reaction was terminated when a predetermined stirring power was reached. After completion of the reaction, the pressure was restored with nitrogen, and the contents were introduced into a cooling water tank in the form of a strand and then pelletized with a rotary cutter. The obtained pellets were dried at 120 ° C. and 1 torr (0.13 kPa) until the water content became 0.1% or less to obtain a polyamide resin (PA56). The relative viscosity (η _r ) was 2.8.
Subsequently, as shown in Table 1, cuprous chloride was blended with the polyamide resin (PA56) at a copper content of 30 ppm by weight to prepare a polyamide resin composition.

（実施例２）
実施例１で得られたポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、さらに、後述する表２に示すように、銅含有量１００重量ｐｐｍとなるような塩化第一銅とガラス繊維４３重量部を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。 (Example 2)
Further, as shown in Table 2 described later, cuprous chloride and 43 parts by weight of glass fiber with a copper content of 100 ppm by weight were blended with the polyamide resin (PA56) obtained in Example 1 to obtain a polyamide. A resin composition was prepared.

（実施例３）
蒸留により単離したペンタメチレンジアミン、アジピン酸（旭化成ケミカルズ株式会社製）及び脱塩水を用い、濃度約５０重量％のペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩水溶液を調製し、ｐＨ８．０〜ｐＨ８．１に調整した。このペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に対して燐原子換算で３０重量ｐｐｍの亜リン酸水素２ナトリウム・５水和物を添加し、実施例１と同様な条件で重縮合を行い、ポリアミド樹脂（ＰＡ５６）を得た。相対粘度（η_ｒ）は２．８であった。
続いて、このポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表２に示すように銅含有量３０重量ｐｐｍで塩化第一銅を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。 (Example 3)
Using pentamethylenediamine, adipic acid (manufactured by Asahi Kasei Chemicals Co., Ltd.) and demineralized water isolated by distillation, an aqueous solution of pentamethylenediamine and adipate having a concentration of about 50% by weight is prepared to pH 8.0 to pH 8.1. It was adjusted. To this pentamethylenediamine adipate, 30 weight ppm of disodium hydrogen phosphite · pentahydrate in terms of phosphorus atom was added, polycondensation was carried out under the same conditions as in Example 1, and a polyamide resin ( PA56) was obtained. The relative viscosity (η _r ) was 2.8.
Subsequently, as shown in Table 2, cuprous chloride was blended with this polyamide resin (PA56) at a copper content of 30 ppm by weight to prepare a polyamide resin composition.

（実施例４）
実施例３で使用したポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表２に示すように、銅含有量が１００重量ｐｐｍとなるような塩化第一銅とガラス繊維４３重量部を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。 Example 4
As shown in Table 2, the polyamide resin (PA56) used in Example 3 was blended with cuprous chloride and 43 parts by weight of glass fiber so that the copper content was 100 ppm by weight. Prepared.

（比較例１）
実施例１において、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩の２回晶析品に代えて、１番晶（１回晶析品）を使用した以外は、実施例１と同様な条件で重縮合を行い、ポリアミド樹脂（ＰＡ５６）を得た。相対粘度（η_ｒ）は２．８であった。
続いて、このポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表２に示すように銅含有量３０重量ｐｐｍで塩化第一銅を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。 (Comparative Example 1)
In Example 1, polycondensation was performed under the same conditions as in Example 1 except that the first crystal (the first crystallized product) was used instead of the double crystallized product of pentamethylenediamine / adipate. A polyamide resin (PA56) was obtained. The relative viscosity (η _r ) was 2.8.
Subsequently, as shown in Table 2, cuprous chloride was blended with this polyamide resin (PA56) at a copper content of 30 ppm by weight to prepare a polyamide resin composition.

（比較例２）
比較例１で用いたポリアミド樹脂（ＰＡ５６）に、表２に示すように、銅含有量が１００重量ｐｐｍとなるような塩化第一銅とガラス繊維４３重量部を配合し、ポリアミド樹脂組成物を調製した。
実施例１〜実施例４、比較例１、比較例２において得られたペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩に含まれる硫黄含有量、アミノ酸含有量、メチオニン含有量を測定した。
またこれらのポリアミド樹脂組成物について耐熱老化性の評価を行った。結果を表２に示す。 (Comparative Example 2)
As shown in Table 2, the polyamide resin (PA56) used in Comparative Example 1 was blended with cuprous chloride and 43 parts by weight of glass fiber so that the copper content was 100 ppm by weight. Prepared.
The sulfur content, amino acid content, and methionine content contained in the pentamethylenediamine / adipate obtained in Examples 1 to 4, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 were measured.
These polyamide resin compositions were evaluated for heat aging resistance. The results are shown in Table 2.

表２に示す結果から、硫黄の含有量が１．２重量ｐｐｍ未満であるペンタメチレンジアミンとアジピン酸との重縮合反応により得られたポリアミド樹脂と、ハロゲン化第一銅とを含むポリアミド樹脂組成物（実施例１〜実施例４）は、１２０℃×１，０００時間放置後の試験片の引張り強さが低下せず、耐熱老化性が良好であることが分かる。
一方、硫黄の含有量が１．２重量ｐｐｍ以上であるペンタメチレンジアミンとアジピン酸との重縮合反応により得られたポリアミド樹脂を含むポリアミド樹脂組成物（比較例１，２）は、１２０℃×１，０００時間放置後の試験片の引張り強さが大幅に低下し、耐熱老化性が改善されないことが分かる。 From the results shown in Table 2, a polyamide resin composition comprising a polyamide resin obtained by polycondensation reaction of pentamethylenediamine having a sulfur content of less than 1.2 ppm by weight and adipic acid, and cuprous halide. It can be seen that the products (Examples 1 to 4) have good heat aging resistance without lowering the tensile strength of the test piece after standing at 120 ° C. for 1,000 hours.
On the other hand, a polyamide resin composition (Comparative Examples 1 and 2) containing a polyamide resin obtained by polycondensation reaction of pentamethylenediamine having a sulfur content of 1.2 ppm by weight or more and adipic acid is 120 ° C. × It can be seen that the tensile strength of the test piece after leaving for 1,000 hours is greatly reduced, and the heat aging resistance is not improved.

Claims (11)

ペンタメチレンジアミンとジカルボン酸とを主な単量体成分として用いる重縮合反応により得られるポリアミド樹脂とハロゲン化第一銅とを含み、当該単量体成分中の硫黄の合計含有量が１．２重量ｐｐｍ以下であることを特徴とするポリアミド樹脂組成物。   A polyamide resin obtained by a polycondensation reaction using pentamethylenediamine and dicarboxylic acid as main monomer components and cuprous halide are included, and the total content of sulfur in the monomer components is 1.2. A polyamide resin composition having a weight ppm or less. 重縮合反応に用いられる単量体成分中のアミノ酸の合計含有量が１００重量ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載のポリアミド樹脂組成物。   2. The polyamide resin composition according to claim 1, wherein the total content of amino acids in the monomer components used in the polycondensation reaction is 100 ppm by weight or less. 重縮合反応に用いられる単量体成分中のメチオニンの合計含有量が５重量ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載のポリアミド樹脂組成物。   The polyamide resin composition according to claim 1 or 2, wherein the total content of methionine in the monomer component used in the polycondensation reaction is 5 ppm by weight or less. 重縮合反応に用いられる単量体成分の一つであるジカルボン酸が、アジピン酸であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のポリアミド樹脂組成物。   The polyamide resin composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the dicarboxylic acid, which is one of the monomer components used in the polycondensation reaction, is adipic acid. 重縮合反応に用いられる単量体成分の一つであるペンタメチレンジアミンは、リジン脱炭酸酵素、リジン脱炭酸酵素活性の向上した組み換え微生物又はリジン脱炭酸酵素を産生する細胞または当該細胞の処理物を使用し、リジンから産出されたものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のポリアミド樹脂組成物。   Pentamethylenediamine, one of the monomer components used in the polycondensation reaction, is a lysine decarboxylase, a recombinant microorganism with improved lysine decarboxylase activity, a cell producing lysine decarboxylase, or a treated product of the cell The polyamide resin composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the polyamide resin composition is produced from lysine. ペンタメチレンジアミンを産出する際に用いるリジンは、グルコースを発酵させて得られたものであることを特徴とする請求項５に記載のポリアミド樹脂組成物。   6. The polyamide resin composition according to claim 5, wherein the lysine used for producing pentamethylenediamine is obtained by fermenting glucose. ハロゲン化第一銅に由来する銅の含有量が５重量ｐｐｍ〜５００重量ｐｐｍであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のポリアミド樹脂組成物。   7. The polyamide resin composition according to claim 1, wherein the content of copper derived from cuprous halide is 5 ppm by weight to 500 ppm by weight. ハロゲン化第一銅に由来する銅の含有量と重縮合反応に用いられる単量体成分中の硫黄の含有量との比（銅含有量／硫黄含有量）が３０を超えることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載のポリアミド樹脂組成物。   The ratio (copper content / sulfur content) between the copper content derived from cuprous halide and the sulfur content in the monomer component used for the polycondensation reaction is more than 30 The polyamide resin composition according to any one of claims 1 to 7. ポリアミド樹脂を得る重縮合反応の重縮合触媒として燐含有化合物を用い、且つ当該重縮合触媒として用いられた燐含有化合物に由来する燐の含有量が１重量ｐｐｍ〜９０重量ｐｐｍであることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載のポリアミド樹脂組成物。   A phosphorus-containing compound is used as a polycondensation catalyst for the polycondensation reaction to obtain a polyamide resin, and the phosphorus content derived from the phosphorus-containing compound used as the polycondensation catalyst is 1 to 90 ppm by weight. The polyamide resin composition according to any one of claims 1 to 8. 請求項１乃至９のいずれか１項に記載のポリアミド樹脂組成物において当該ポリアミド樹脂組成物のポリアミド樹脂１００重量部に対し、強化材５重量部〜１５０重量部をさらに含むことを特徴とするポリアミド樹脂組成物。   The polyamide resin composition according to any one of claims 1 to 9, further comprising 5 to 150 parts by weight of a reinforcing material with respect to 100 parts by weight of the polyamide resin of the polyamide resin composition. Resin composition. 前記強化材が、ガラス繊維であることを特徴とする請求項１０に記載のポリアミド樹脂組成物。   The polyamide resin composition according to claim 10, wherein the reinforcing material is glass fiber.