JP2008220239A - Method for producing cadaverine salt, polyamide and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、カダベリン塩を製造する方法、並びに、その製造されたカダベリン塩を用いたポリアミドの製造方法、及び、それにより製造されたポリアミドに関する。 The present invention relates to a method for producing a cadaverine salt, a method for producing a polyamide using the produced cadaverine salt, and a polyamide produced thereby.
カダベリン及び酸からなる塩（カダベリン塩）は、ナイロン等のポリアミドの原料等として期待され、需要が高まりつつある。 Salts of cadaverine and acids (cadaverine salts) are expected as raw materials for polyamides such as nylon, and the demand is increasing.
従来、カダベリン塩の製造技術として、触媒を用いる方法（非特許文献１，２、特許文献１）や酵素を用いる方法（特許文献２〜５）等が検討され、開発されつつある。これらの方法においては、カダベリン塩は溶液として得られることになる。
Conventionally, as a technique for producing a cadaverine salt, a method using a catalyst (Non-patent
しかしながら、実際に工業レベルでカダベリン塩を製造した後、それを用いた重縮合反応を行ない、ポリアミドを製造する場合、カダベリン塩の製造後に精製及び重縮合反応を短時間で行なうことは不可能である。よって、より安定な状態のカダベリン塩の溶液を製造することが重要である。 However, when a cadaverine salt is actually produced at an industrial level and then a polycondensation reaction is carried out using the cadaverine salt to produce a polyamide, it is impossible to carry out the purification and polycondensation reaction in a short time after the production of the cadaverine salt. is there. Therefore, it is important to produce a more stable cadaverine salt solution.
これまでに、カダベリン塩の溶液中に存在する不純物がその後の重縮合反応に影響を与えるという観点に基づき、その製法を改善する手法が提案されている。例としては、カダベリンをカルボン酸塩として製造する方法（特許文献６、７）や、精製工程においてｐＨを制御し、極性有機溶剤で抽出する工程を含む製造方法（特許文献８）等が挙げられる。 So far, based on the viewpoint that impurities present in the solution of the cadaverine salt affect the subsequent polycondensation reaction, a method for improving the production method has been proposed. Examples include a method for producing cadaverine as a carboxylate (Patent Documents 6 and 7), a production method including a process for controlling pH in a purification step and extraction with a polar organic solvent (Patent Document 8). .
しかしながら、上述の各文献等の従来の技術によれば、比較的純度の高いカダベリン塩の溶液を製造した場合でも、そのまま数日放置しておくと不純物が生成したり、着色を生じたりする場合があった。このため、不純物を取り除いて脱色するために、複雑な精製工程を行なわねばならず、手順が煩雑となるとともに、カダベリン塩の収量が低下する等の課題が生じていた。 However, according to the conventional techniques such as the above-mentioned documents, even when a cadaverine salt solution having a relatively high purity is produced, if it is left as it is for several days, impurities are generated or coloring occurs. was there. For this reason, in order to remove impurities and decolorize, a complicated purification process must be performed, and the procedure becomes complicated, and problems such as a decrease in the yield of cadaverine salt have occurred.
以上の背景から、着色が少なく安定したカダベリン塩の溶液を得る方法であって、生産効率に優れ、経済的にも有効な方法が望まれている。
本発明は上述の課題に鑑みてなされたもので、その目的は、溶液の状態において、着色が少なく安定したカダベリン塩を、効率よく製造することが可能な方法を提供することである。
In view of the above background, there is a demand for a method for obtaining a stable solution of cadaverine salt with little coloration, which is excellent in production efficiency and economically effective.
This invention is made | formed in view of the above-mentioned subject, The objective is to provide the method which can manufacture efficiently the cadaverine salt with little coloring and stable in the state of a solution.
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、リジン及び酸の共存する溶液にリジン脱炭酸酵素を作用させ、脱炭酸反応によりカダベリン塩を製造する方法において、反応終了時における反応液をカダベリン過剰な状態とすることで、溶液の状態において、着色が少なく安定したカダベリン塩を、効率よく製造できることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor made a lysine decarboxylase act on a solution in which lysine and an acid coexist to produce a cadaverine salt by a decarboxylation reaction. As a result, the inventors have found that a stable cadaverine salt with little coloration can be efficiently produced in a solution state by making cadaverine excessive, and the present invention has been completed.
即ち、本発明の要旨は、リジン及び酸の共存する溶液にリジン脱炭酸酵素を作用させ、脱炭酸反応によりカダベリン塩を製造する方法であって、反応終了時における反応液を、カダベリン過剰な状態とすることを特徴とする、カダベリン塩の製造方法に存する（請求項１）。 That is, the gist of the present invention is a method for producing a cadaverine salt by a decarboxylation reaction by causing lysine decarboxylase to act on a solution in which lysine and an acid coexist, and the reaction solution at the end of the reaction is in an cadaverine excess state. The present invention resides in a method for producing a cadaverine salt (claim 1).
このとき、反応終了時までに使用したリジンの酸に対する規定比を１よりも大きい値とすることが好ましい（請求項２）。 At this time, it is preferable that the specified ratio of lysine used up to the end of the reaction with respect to the acid is larger than 1. (Claim 2)
また、反応終了時における反応液のｐＨを、カダベリンと酸との中和点におけるｐＨよりも高い値とすることが好ましい（請求項３）。 Moreover, it is preferable to make pH of the reaction liquid at the time of completion | finish of reaction into a value higher than the pH in the neutralization point of cadaverine and an acid (Claim 3).
さらに、リジンと共存させる酸が、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸、カルボン酸、リン酸、及びスルホン酸からなる群より選択される一種以上の酸であることが好ましい（請求項４）。 Furthermore, the acid that coexists with lysine is preferably one or more acids selected from the group consisting of hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, carbonic acid, carboxylic acid, phosphoric acid, and sulfonic acid.
本発明の別の要旨は、上述のカダベリン塩の製造方法によって得られたカダベリン塩を、重縮合させることを特徴とする、ポリアミドの製造方法に存する（請求項５）。 Another gist of the present invention resides in a method for producing polyamide, wherein the cadaverine salt obtained by the above-described method for producing cadaverine salt is polycondensed (claim 5).
本発明のさらに別の要旨は、上述のポリアミドの製造方法によって得られたことを特徴とする、ポリアミドに存する（請求項６）。 Still another subject matter of the present invention lies in a polyamide obtained by the above-described method for producing a polyamide (claim 6).
本発明によれば、溶液の状態において、着色が少なく安定したカダベリン塩を、効率よく製造することができる。さらに、得られたカダベリン塩を用いて、高品質なポリアミドを得ることが出来る。 According to the present invention, a stable cadaverine salt with little coloration in the state of a solution can be efficiently produced. Furthermore, high quality polyamide can be obtained using the obtained cadaverine salt.
以下、本発明について実施の形態を挙げて詳細に説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において種々に変更して実施することができる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to embodiments. However, the present invention is not limited to the following description, and various modifications can be made without departing from the scope of the present invention.
本発明のカダベリン塩の製造方法（以下、適宜「本発明の製造方法」ということがある）は、リジン及び酸の共存する溶液にリジン脱炭酸酵素（以下「ＬＤＣ」（Lysine decarboxylase）ということがある）を作用させ、脱炭酸反応によりカダベリン塩を製造する方法であって、反応終了時における反応液をカダベリン過剰な状態とすることに特徴を有する。 The cadaverine salt production method of the present invention (hereinafter sometimes referred to as “the production method of the present invention” as appropriate) is referred to as lysine decarboxylase (hereinafter referred to as “LDC”) in a solution in which lysine and an acid coexist. The cadaverine salt is produced by decarboxylation reaction, and is characterized in that the reaction solution at the end of the reaction is in an excess state of cadaverine.
以下の記載では、まず、本発明の製造方法によって得られるカダベリン塩（以下、適宜「本発明に係るカダベリン塩」ということがある）について説明し、続いて、本発明の製造方法について説明する。 In the following description, first, a cadaverine salt obtained by the production method of the present invention (hereinafter sometimes referred to as “cadaverine salt according to the present invention” as appropriate) will be described, and subsequently, the production method of the present invention will be described.
［１．カダベリン塩］
＜１−１．カダベリン＞
本発明において「カダベリン」とは、１，５−ペンタンジアミン（Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）5ＮＨ2）をいう。カダベリンは、ポリマー原料や医薬中間体の合成原料として有用な化合物である。
[1. Cadaverine salt]
<1-1. Cadaverine>
In the present invention, “cadaverine” refers to 1,5-pentanediamine (H 2 N (CH 2 ) 5 NH 2 ). Cadaverine is a compound useful as a raw material for the synthesis of polymer raw materials and pharmaceutical intermediates.
＜１−２．カダベリン塩＞
本発明において「カダベリン塩」とは、カダベリン及び後述する酸から形成される塩のことをいう。
<1-2. Cadaverine salt>
In the present invention, “cadaverine salt” refers to a salt formed from cadaverine and an acid described later.
なお、後述する反応液中では、カダベリン塩はその大部分が溶解し、イオン（カダベリンイオンとその共役塩基）として解離した状態で存在するが、本発明に係るカダベリン塩は、このように解離した状態で得られたものをも含むものとする。 In the reaction solution described later, most of the cadaverine salt is dissolved and exists in a dissociated state as ions (cadaverine ion and its conjugate base), but the cadaverine salt according to the present invention is dissociated in this way. Including those obtained in the state.
＜１−２−１．酸＞
本発明に係るカダベリン塩を構成する酸の種類に制限はないが、本発明の製造方法において、カダベリンは反応液に含有されている酸と塩を形成するため、具体的には後述の＜２−１−２．酸＞で説明する酸と同様である。これらの酸は何れか一種を単独で用いてもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。
<1-2-1. Acid>
Although there is no restriction | limiting in the kind of acid which comprises the cadaverine salt which concerns on this invention, In the manufacturing method of this invention, since cadaverine forms the acid and salt which are contained in the reaction liquid, it is specifically mentioned below <2 -1-2. It is the same as the acid described in <Acid>. Any of these acids may be used alone, or two or more of these acids may be used in any combination and ratio.
＜１−２−２．カダベリン塩の組成＞
本発明に係るカダベリン塩１分子を構成するカダベリン及び酸の分子数も任意に選択し得る。カダベリン塩１分子あたり、カダベリン及び酸が共に１分子であってもよく、カダベリン及び酸の一方又は双方が２分子以上であってもよい。例えば、二価の塩基であるカダベリンと二価の酸とから構成される塩の場合、一般的にはカダベリン１分子と二価の酸（例えばアジピン酸）１分子とからカダベリン塩１分子が構成されるが、他の形態を排除するものではなく、２分子以上のカダベリン及び／又は２分子以上の二価の酸から構成されたカダベリン塩が含まれていてもよい。
<1-2-2. Composition of cadaverine salt>
The number of cadaverine and acid molecules constituting one molecule of the cadaverine salt according to the present invention may be arbitrarily selected. One cadaverine and acid may be one molecule per one cadaverine salt, and one or both of cadaverine and acid may be two or more molecules. For example, in the case of a salt composed of cadaverine which is a divalent base and a divalent acid, one cadaverine salt is generally composed of one molecule of cadaverine and one molecule of divalent acid (for example, adipic acid). However, other forms are not excluded, and a cadaverine salt composed of two or more molecules of cadaverine and / or two or more molecules of a divalent acid may be included.
［２．カダベリン塩の製造方法］
本発明の製造方法は、リジン及び酸の共存する溶液にＬＤＣを作用させて脱炭酸反応することにより、カダベリン塩を製造するものである。従って、本発明に係るカダベリン塩は、その大部分が反応液に溶解した状態で、即ち溶液（カダベリン塩溶液）の状態で得られることになる。
[2. Method for producing cadaverine salt]
In the production method of the present invention, cadaverine salt is produced by allowing LDC to act on a solution in which lysine and an acid coexist to cause a decarboxylation reaction. Therefore, the cadaverine salt according to the present invention is obtained in a state where most of the cadaverine salt is dissolved in the reaction solution, that is, in a solution (cadaverine salt solution) state.
本発明の製造方法における手順や条件は、上記の反応終了時における反応液がカダベリン過剰な状態となれば、本発明の効果を著しく損なわない限り制限はない。
以下、まずは本発明の製造方法に使用される成分（リジン、酸、溶媒、ＬＤＣ等）について説明し、その後で、本発明の製造方法の手順について説明する。
The procedure and conditions in the production method of the present invention are not limited as long as the reaction solution at the end of the above reaction is in an excess of cadaverine unless the effects of the present invention are significantly impaired.
Hereinafter, components (lysine, acid, solvent, LDC, etc.) used in the production method of the present invention will be described first, and then the procedure of the production method of the present invention will be described.
なお、以下の記載で「反応液」とは、上述の「リジン及び酸の共存する溶液」に制限されるものではなく、リジン、酸及びＬＤＣのうち少なくとも何れかが溶媒に溶解した溶液であって、リジン脱炭酸反応に関与する溶液を、リジン脱炭酸反応の開始や終了の前後に拠らず指すものとする。 In the following description, the “reaction solution” is not limited to the above-mentioned “solution in which lysine and acid coexist”, but is a solution in which at least one of lysine, acid and LDC is dissolved in a solvent. Thus, the solution involved in the lysine decarboxylation reaction is referred to regardless of the start or end of the lysine decarboxylation reaction.
＜２−１．成分＞
本発明の製造方法では、カダベリン塩の原料となるリジン及び酸と、溶媒と、ＬＤＣとを少なくとも使用する。以下、これらの成分について説明する。なお、ＬＤＣについては章を改めて、後出の＜２−２．ＬＤＣ＞において説明する。
<2-1. Ingredients>
In the production method of the present invention, at least lysine and acid, which are raw materials for the cadaverine salt, a solvent and LDC are used. Hereinafter, these components will be described. For LDC, the chapter has been revised, and <2-2. LDC> will be described.
＜２−１−１．リジン＞
本発明において「リジン」とは、リジン分子又はリジンイオンをいう。リジンイオンは遊離していてもよく、他のイオンと結合して塩を形成していてもよい。すなわち、反応液中において、リジンは全てリジン分子として存在していてもよく、全てリジンイオンとして存在していてもよく、リジン分子とリジンイオンとが任意の組み合わせ及び割合で存在していてもよい。また、リジンイオンは、反応液中で全て遊離している必要はなく、他のイオンと塩（以下、適宜「リジン塩」ということがある）を形成している状態で存在してもよい。
<2-1-1. Lysine>
In the present invention, “lysine” refers to a lysine molecule or lysine ion. The lysine ion may be free or may be combined with other ions to form a salt. That is, in the reaction solution, all lysine may be present as lysine molecules, all may be present as lysine ions, or lysine molecules and lysine ions may be present in any combination and proportion. . The lysine ions do not have to be completely liberated in the reaction solution, and may exist in a state of forming a salt with other ions (hereinafter sometimes referred to as “lysine salt” as appropriate).
リジン塩１分子を構成するリジンイオン及び他のイオンの数も任意に選択し得る。リジン塩１分子あたり、リジンイオン及び他のイオンが共に１分子であってもよく、リジンイオン及び他のイオンの一方又は双方が２分子以上であってもよい。一般的には、一価の塩基の状態であるリジンイオンと、一価の他のイオンとから塩が構成される。しかし、他の形態を排除するものではなく、例えば、一価の塩基の状態であるリジンイオンと、二価の他のイオンとから塩を構成する場合、リジンイオン２分子と二価の他のイオン１分子とからリジン塩１分子が構成されていてもよい。 The number of lysine ions and other ions constituting one molecule of lysine salt can be arbitrarily selected. One molecule of lysine ions and other ions may be one molecule per molecule of lysine, and one or both of lysine ions and other ions may be two or more molecules. In general, a salt is composed of a lysine ion that is in a monovalent base state and another monovalent ion. However, other forms are not excluded. For example, when a salt is composed of a lysine ion in the form of a monovalent base and another divalent ion, two molecules of lysine ion and other divalent ions are used. One lysine salt molecule may be composed of one ion molecule.
リジンイオンと共に塩を形成するイオンとしては、酸のイオンが挙げられる。但し、本発明の製造方法においては、＜２−１−２．酸＞の欄で後述する酸のイオンが好ましい。 Examples of ions that form salts with lysine ions include acid ions. However, in the production method of the present invention, <2-1-2. The acid ion described below in the column of <acid> is preferred.
なお、リジンは、酵素的脱炭酸反応によりカダベリンを生成するものであれば、Ｌ−リジン、Ｄ−リジンの何れであってもよく、これらが任意の比率で混合されたものであってもよいが、通常はＬ−リジンが好ましい。 The lysine may be either L-lysine or D-lysine as long as it produces cadaverine by enzymatic decarboxylation, and these may be mixed at an arbitrary ratio. However, L-lysine is usually preferred.
＜２−１−２．酸＞
本発明の製造方法に使用される酸の種類に制限はない。無機酸でも有機酸でもよく、また、一価の酸でも二価以上の酸でもよい。酸の例としては、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸、カルボン酸、リン酸、スルホン酸等が挙げられる。カルボン酸の具体例としては、ギ酸、マロン酸、酢酸、アジピン酸、グルタル酸、コハク酸、スベリン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸等が挙げられる。ただし、本発明の製造方法で得られるカダベリン塩の純度の低下を防止するため、カダベリンと塩を形成したときに、所望のカダベリン塩となる酸を用いることが好ましい。係る観点から、得られるカダベリン塩をナイロン等のポリアミドの製造用途に使用する場合には、カルボン酸が好ましく、特にアジピン酸が好ましい。これらの酸は何れか一種を単独で用いてもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。
<2-1-2. Acid>
There is no restriction | limiting in the kind of acid used for the manufacturing method of this invention. It may be an inorganic acid or an organic acid, and may be a monovalent acid or a divalent or higher acid. Examples of the acid include hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, carbonic acid, carboxylic acid, phosphoric acid, sulfonic acid and the like. Specific examples of the carboxylic acid include formic acid, malonic acid, acetic acid, adipic acid, glutaric acid, succinic acid, suberic acid, sebacic acid, phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid and the like. However, in order to prevent a decrease in the purity of the cadaverine salt obtained by the production method of the present invention, it is preferable to use an acid that becomes a desired cadaverine salt when the salt is formed with cadaverine. From such a viewpoint, when the obtained cadaverine salt is used for producing polyamide such as nylon, carboxylic acid is preferable, and adipic acid is particularly preferable. Any of these acids may be used alone, or two or more of these acids may be used in any combination and ratio.
＜２−１−３．溶媒＞
溶媒としては、上述のリジン及び酸を溶解させることが可能であれば、その種類は任意である。但し、本発明の製造方法では酵素（ＬＤＣ）の作用により反応を行なうため、酵素反応を進行させる観点から、通常、水又は水を主成分とする混合溶媒が用いられる。ここで「主成分」とは、混合溶媒の通常５０重量％以上、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上を占める成分をいう。
<2-1-3. Solvent>
The type of the solvent is arbitrary as long as it can dissolve the above-mentioned lysine and acid. However, since the reaction is carried out by the action of the enzyme (LDC) in the production method of the present invention, water or a mixed solvent containing water as a main component is usually used from the viewpoint of advancing the enzyme reaction. Here, the “main component” refers to a component that usually accounts for 50% by weight or more, preferably 80% by weight or more, more preferably 90% by weight or more of the mixed solvent.
該混合溶媒の水以外の成分としては、通常、水と混和性を有する親水性溶媒が用いられる。具体的には、アルコール、カルボン酸、エステル等が挙げられる。アルコール類の例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ペンタノール、イソペンタノール、ヘキサノール、エチレングリコール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセリン等が挙げられる。カルボン酸の例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、ヘキサン酸等が挙げられる。エステル類の例としては、酢酸メチル、酢酸エチル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル等が挙げられる。 As the component other than water in the mixed solvent, a hydrophilic solvent that is miscible with water is usually used. Specifically, alcohol, carboxylic acid, ester, etc. are mentioned. Examples of alcohols include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, t-butanol, pentanol, isopentanol, hexanol, ethylene glycol, 1,2-propanediol, 1,3-propanediol, Examples include 1,2-butanediol, 1,3-butanediol, 1,4-butanediol, glycerin and the like. Examples of carboxylic acids include formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid, isovaleric acid, hexanoic acid and the like. Examples of esters include methyl acetate, ethyl acetate, methyl propionate, ethyl propionate and the like.
なお、これらの水以外の成分は、何れか一種の溶媒を水に混合してもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で混合した溶媒を水に混合してもよい。なお、溶媒は、目的とするカタベリン塩溶液の種類や濃度、又は使用する酸を考慮して、適宜選択することが好ましい。 In addition, these components other than water may mix any one kind of solvent with water, and may mix the solvent which mixed 2 or more types by arbitrary combinations and ratios with water. The solvent is preferably selected as appropriate in consideration of the type and concentration of the target cataverine salt solution or the acid to be used.
＜２−１−４．その他＞
本発明の製造方法では、上述のリジン、酸及び溶媒、並びに後述するＬＤＣに加えて、その他の一種又は二種以上の成分を反応液に含有させてもよい。その他の成分の種類や含有量は本発明の効果を著しく損なわない限り任意であり、通常はカダベリン塩の製法や用途に応じて選択される。
<2-1-4. Other>
In the production method of the present invention, in addition to the above-mentioned lysine, acid and solvent, and LDC described later, one or more other components may be contained in the reaction solution. The type and content of the other components are arbitrary as long as the effects of the present invention are not significantly impaired, and are usually selected according to the production method and use of the cadaverine salt.
例えば、反応液のｐＨは、通常、上述の酸によって調整されるため、他のｐＨ調整剤を用いる必要はない。但し、本発明の製造方法では酵素（ＬＤＣ）の作用により反応を行なうため、反応に至適なｐＨを保つために、反応液中に緩衝液を含有させてもよい。緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。但し、カダベリンと酸との塩を形成させるという点からは、緩衝液等は用いないか、用いる場合であっても低濃度に抑えることが好ましい。 For example, since the pH of the reaction solution is usually adjusted by the above-described acid, it is not necessary to use another pH adjuster. However, in the production method of the present invention, the reaction is performed by the action of an enzyme (LDC), and therefore a buffer solution may be included in the reaction solution in order to maintain an optimum pH for the reaction. Examples of the buffer include sodium acetate buffer. However, from the viewpoint of forming a salt of cadaverine and acid, it is preferable not to use a buffer solution or the like, or to keep the concentration low even if it is used.
＜２−２．ＬＤＣ＞
本発明の製造方法に用いられるＬＤＣは、リジンに作用して脱炭酸反応を行ないカダベリンに変換することが出来る酵素であれば、その種類に制限はない。従って、どの生物種由来のＬＤＣを用いてもよい。
<2-2. LDC>
The type of LDC used in the production method of the present invention is not limited as long as it is an enzyme capable of acting on lysine and decarboxylation to convert it into cadaverine. Therefore, any biological species-derived LDC may be used.
中でも、本発明の製造方法では、副反応を抑えるために、立体特異性等の基質特異性や、反応選択性が高いＬＤＣを用いることが好ましい。ただし、反応生成物であるカダベリンによるアロステリック効果を受けないものが好ましい。収率が低下する傾向を抑えるためである。 Especially, in the manufacturing method of this invention, in order to suppress a side reaction, it is preferable to use LDC with high substrate selectivity, such as stereospecificity, and reaction selectivity. However, those which do not receive the allosteric effect of cadaverine which is a reaction product are preferable. It is for suppressing the tendency for a yield to fall.
また、本発明の製造方法では、工業的に取り扱いが簡便となるよう、反応の至適温度、至適ｐＨ、至適な塩濃度のレンジが広いＬＤＣを用いることが好ましい。 Further, in the production method of the present invention, it is preferable to use LDC having a wide range of optimum temperature, optimum pH, and optimum salt concentration for easy handling industrially.
また、本発明の製造方法では、ＬＤＣは、１種類を用いてもよく、２種以上を任意の割合及び比率で併用してもよい。
さらに、アイソザイムが存在するＬＤＣについては、１種類のアイソザイムのみを用いてもよく、２種以上のアイソザイムを任意の割合及び比率で併用していてもよい。
Moreover, in the manufacturing method of this invention, LDC may use 1 type and may use 2 or more types together by arbitrary ratios and ratios.
Furthermore, for LDCs in which isozymes are present, only one type of isozyme may be used, or two or more types of isozymes may be used in combination at an arbitrary ratio and ratio.
本発明で使用されるＬＤＣの例としては、例えば、前述した非特許文献１，２及び特許文献１〜５に記載された酵素等が挙げられる。以下、本発明におけるＬＤＣの産生方法を説明する。
Examples of the LDC used in the present invention include, for example, the enzymes described in
ＬＤＣを産生する細胞の例としては、微生物（以下、適宜「菌体」という場合がある）、植物細胞、動物細胞等が挙げられるが、微生物が好ましい。微生物としては、細菌、真核生物等が挙げられる。細菌としては、大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス（Bacillus subtills）等のバチルス属細菌、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）等のセラチア属細菌等が挙げられる。真核生物としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等が挙げられる。中でも、菌体としては細菌が好ましく、エシェリヒア属細菌がより好ましく、大腸菌が特に好ましい。菌体は、ＬＤＣを産生する限り、野生株でもよく、変異株であってもよい。また、ＬＤＣ活性が上昇するように改変された組換え株であってもよい。なお、組換え株の詳細については後述する。 Examples of cells that produce LDC include microorganisms (hereinafter sometimes referred to as “bacteria” as appropriate), plant cells, animal cells, and the like, with microorganisms being preferred. Examples of microorganisms include bacteria and eukaryotes. The bacteria include Escherichia bacteria such as Escherichia coli, coryneform bacteria such as Brevibacterium lactofermentum, Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis, Serratia marcescens (Serratia). marcescens) and the like. Examples of eukaryotes include Saccharomyces cerevisiae. Among them, bacteria are preferable as the bacterial cells, Escherichia bacteria are more preferable, and Escherichia coli is particularly preferable. As long as LDC is produced, the bacterial cell may be a wild strain or a mutant strain. Moreover, the recombinant strain modified so that LDC activity may increase may be sufficient. Details of the recombinant strain will be described later.
菌体等の細胞を用いてＬＤＣを産生した後、細胞をそのまま反応液に混合してもよく、ＬＤＣを含む細胞培養液又は細胞処理物を反応液に混合してもよく、細胞培養液又は細胞処理物からＬＤＣを精製してから反応液に混合してもよい。細胞処理物としては、細胞の破砕液及びその分画物が挙げられる。 After producing LDC using cells such as cells, the cells may be directly mixed with the reaction solution, or a cell culture solution or a cell treatment product containing LDC may be mixed with the reaction solution. LDC may be purified from the cell-treated product and then mixed with the reaction solution. Examples of the cell-treated product include a cell lysate and a fraction thereof.
なお、以下の記載では、反応液に混合される、ＬＤＣを産生する細胞、ＬＤＣを含む細胞培養液及び細胞処理物、並びに精製されたＬＤＣを総称して「ＬＤＣ源」という場合がある。ＬＤＣ源は、何れか一種を単独で使用してもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。 In the following description, LDC-producing cells, cell culture solutions and cell processed products containing LDC, and purified LDC that are mixed in the reaction solution may be collectively referred to as “LDC source”. Any one type of LDC source may be used alone, or two or more types may be used in any combination and ratio.
また、ＬＤＣの活性中心の活性化のため、補酵素などの補助因子を併用することも好ましい。
例えば、生産速度及び反応収率向上のため、補酵素としてビタミンＢ６を用いることが好ましい。ビタミンＢ６の例としては、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサル、ピリドキサルリン酸等が挙げられる。これらは一種を単独で用いてもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。中でも、ピリドキサルリン酸が好ましい。
It is also preferable to use a cofactor such as a coenzyme for the activation of the active center of LDC.
For example, it is preferable to use vitamin B6 as a coenzyme for improving the production rate and reaction yield. Examples of vitamin B6 include pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal, pyridoxal phosphate, and the like. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together by arbitrary combinations and a ratio. Of these, pyridoxal phosphate is preferable.
ビタミンＢ６の使用量は特に制限されないが、通常、反応液とＬＤＣとを混合した反応液に対して、０．０１ｍＭ以上、０．５ｍＭ以下の範囲が好ましい。ビタミンＢ６の使用量が少な過ぎると反応速度が遅くなる場合があり、多過ぎると反応液の色が黄色くなる場合がある。 The amount of vitamin B6 used is not particularly limited, but is usually preferably in the range of 0.01 mM or more and 0.5 mM or less with respect to the reaction solution obtained by mixing the reaction solution and LDC. If the amount of vitamin B6 used is too small, the reaction rate may be slow, and if it is too much, the color of the reaction solution may become yellow.
ビタミンＢ６を反応液に含有させる時期や手法に制限はない。反応前に含有させてもよく、反応中に含有させてもよい。また、一度に反応液に含有させてもよく、二度以上に分割して、異なる時期に反応液に含有させてもよい。 There is no restriction on the timing and method of containing vitamin B6 in the reaction solution. You may make it contain before reaction and may make it contain during reaction. Moreover, you may make it contain in a reaction liquid at once, and it may divide | segment twice or more and may make it contain in a reaction liquid at a different time.
＜２−３．リジンの脱炭酸反応＞
本発明の製造方法では、リジン及び酸の共存する溶液にＬＤＣを作用させて脱炭酸反応を生じさせることができれば、その具体的な手順は制限されないが、通常は上述のリジン、酸、溶媒、ＬＤＣ源等の各成分を混合することにより、脱炭酸反応を行なう。
リジン、酸、溶媒、ＬＤＣ源等の各成分の混合順は制限されず、任意である。また、各成分は何れも、全量を一度に混合してもよく、全量を分割して複数回に分割して混合してもよく、時間を掛けて連続的又は断続的に混合してもよい。
<2-3. Decarboxylation of lysine>
In the production method of the present invention, the specific procedure is not limited as long as LDC can be caused to act on a solution in which lysine and an acid coexist to cause a decarboxylation reaction, but usually the above-described lysine, acid, solvent, A decarboxylation reaction is performed by mixing each component such as an LDC source.
The mixing order of each component such as lysine, acid, solvent, and LDC source is not limited and is arbitrary. In addition, all the components may be mixed in the whole amount at once, divided into a plurality of times by dividing the whole amount, or may be mixed continuously or intermittently over time. .
但し、通常は、溶媒に適量のリジン及び酸を溶解させて、後述する至適範囲内のｐＨを有する反応液を調製した上で、この反応液にＬＤＣ源を加えて反応を開始させ、その後はリジン及び／又は酸を反応液に補充することにより、反応液のｐＨを調整しながら反応を進行させることが好ましい。以下、主にこの手順で反応を行なう場合について説明を行なうが、本発明の製造方法における具体的な手順は以下の説明に制限されるものではない。 However, usually, an appropriate amount of lysine and acid are dissolved in a solvent to prepare a reaction solution having a pH within the optimum range described below, and then an LDC source is added to the reaction solution to start the reaction, and then It is preferable to advance the reaction while adjusting the pH of the reaction solution by supplementing the reaction solution with lysine and / or acid. Hereinafter, although the case where it reacts mainly by this procedure is demonstrated, the specific procedure in the manufacturing method of this invention is not restrict | limited to the following description.
具体的に、本発明の製造方法において、反応液におけるリジン濃度は、後述の脱炭酸反応が進行すれば任意であるが、通常１０ｇ／Ｌ以上、好ましくは２０ｇ／Ｌ以上、また、通常７００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下の範囲とすることが望ましい。 Specifically, in the production method of the present invention, the lysine concentration in the reaction solution is arbitrary as long as the decarboxylation reaction described later proceeds, but is usually 10 g / L or more, preferably 20 g / L or more, and usually 700 g / L. L or less, preferably 500 g / L or less.
但し、本発明の製造方法では、酵素による反応を行なっているため、酵素量に対して基質（リジン）濃度が高くなりすぎると、反応効率が低下する傾向がある。従って、反応液中のリジン濃度は、反応期間の大部分に亘って上述の範囲とすることが好ましい。そのため、ＬＤＣの量に対して、最適なリジン濃度で反応させ、反応の進行とともに反応液から減少したリジンを順次補うように加えてもよい。 However, in the production method of the present invention, since the reaction is performed with an enzyme, if the substrate (lysine) concentration becomes too high with respect to the amount of enzyme, the reaction efficiency tends to decrease. Therefore, the lysine concentration in the reaction solution is preferably within the above-mentioned range over most of the reaction period. Therefore, the reaction may be performed at an optimum lysine concentration with respect to the amount of LDC, and lysine that has decreased from the reaction solution as the reaction proceeds may be added in order.
なお、反応液中のリジン濃度は、種々の分析機器で測定することが可能である。分析手法は限定されないが、リジンセンサー、イオンクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー等を用いて測定するのが一般的である。これらのリジンセンサーやクロマトグラフィーによって測定を行なう場合、測定対象となる溶液をそのまま、或いは必要に応じて所定の濃度範囲となるように希釈して測定に供する。また、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーの場合は、溶液中の成分が有する特定の官能基（主にリジンのアミノ基）を誘導体化してから測定に供することが好ましい。 The lysine concentration in the reaction solution can be measured with various analytical instruments. The analysis method is not limited, but the measurement is generally performed using a lysine sensor, ion chromatography, gas chromatography, liquid chromatography or the like. When measurement is performed by using these lysine sensors or chromatography, the solution to be measured is used as it is or diluted so as to be in a predetermined concentration range as necessary. In the case of gas chromatography or liquid chromatography, it is preferable to derivatize specific functional groups (mainly amino groups of lysine) possessed by the components in the solution before use in the measurement.
また、反応液のｐＨは任意であるが、通常は反応液中のリジンと酸との比率を調整することにより、反応液のｐＨが酵素的脱炭酸反応に適したｐＨとなるように調整することが好ましい。具体的には、反応液のｐＨを、通常４．０以上、好ましくは５．０以上、より好ましくは５．５以上、また、通常８．０以下、好ましくは７．５以下、より好ましくは７．０以下の範囲とすることが望ましい。反応液のｐＨが低過ぎても高過ぎても、充分な反応速度が得られない場合がある。 In addition, the pH of the reaction solution is arbitrary, but it is usually adjusted by adjusting the ratio of lysine and acid in the reaction solution so that the pH of the reaction solution is suitable for the enzymatic decarboxylation reaction. It is preferable. Specifically, the pH of the reaction solution is usually 4.0 or higher, preferably 5.0 or higher, more preferably 5.5 or higher, and usually 8.0 or lower, preferably 7.5 or lower, more preferably It is desirable that the range is 7.0 or less. If the pH of the reaction solution is too low or too high, a sufficient reaction rate may not be obtained.
上述したように、通常は、適量のリジン及び酸を溶媒に溶解させて、上述の至適範囲内のｐＨを有する反応液を調製し、この反応液にＬＤＣ源を混合して反応を開始させる。反応の開始後は、脱炭酸反応の進行に伴い、リジンから遊離される二酸化炭素が炭酸ガスとなって反応液から放出され、反応液のｐＨが上昇する。従って、反応中も反応液のｐＨが前記範囲内に保たれるように、反応液に酸を加えてｐＨを調整することが好ましい（後述する反応終了前の一定期間を除く）。酸は反応液に連続的に加えてもよく、ｐＨが前記範囲に維持される限り、分割して断続的に加えてもよい。 As described above, usually, an appropriate amount of lysine and acid are dissolved in a solvent to prepare a reaction solution having a pH within the above-described optimum range, and an LDC source is mixed with this reaction solution to start the reaction. . After the start of the reaction, with the progress of the decarboxylation reaction, carbon dioxide liberated from lysine is released as carbon dioxide gas from the reaction solution, and the pH of the reaction solution rises. Therefore, it is preferable to adjust the pH by adding an acid to the reaction solution so that the pH of the reaction solution is maintained within the above range even during the reaction (except for a certain period before the completion of the reaction described later). The acid may be added continuously to the reaction solution, or may be added intermittently in divided portions as long as the pH is maintained in the above range.
リジン脱炭酸反応時におけるその他の条件は、ＬＤＣがリジンに作用してカダベリンを生成させる条件であれば特に制限はないが、一般的には以下の通りである。 Other conditions during the lysine decarboxylation reaction are not particularly limited as long as LDC acts on lysine to produce cadaverine, but are generally as follows.
反応方式は、連続式でもバッチ式でもよい。反応中に反応液に酸を容易に混合する観点からは、バッチ式で反応を行なうことが好ましい。また、一種又は二種以上のＬＤＣ源を固定化した担体を用いた移動床カラムクロマトグラフィーによって反応を行なうこともできる。その場合は、反応系のｐＨが所定の範囲に維持されたまま反応が進行するように、リジン及び／又は酸をカラムの適当な部位に注入すればよい。 The reaction method may be a continuous method or a batch method. From the viewpoint of easily mixing the acid into the reaction solution during the reaction, it is preferable to carry out the reaction in a batch system. The reaction can also be carried out by moving bed column chromatography using a carrier on which one or more LDC sources are immobilized. In that case, lysine and / or acid may be injected into an appropriate part of the column so that the reaction proceeds while the pH of the reaction system is maintained within a predetermined range.
反応時の反応液の温度は、通常２０℃以上、好ましくは３０℃以上、また、通常６０℃以下、好ましくは４０℃以下の範囲とすることが望ましい。反応液の温度が低過ぎると反応が進行しない場合があり、高過ぎると酵素が失活する場合がある。 The temperature of the reaction solution during the reaction is usually 20 ° C or higher, preferably 30 ° C or higher, and usually 60 ° C or lower, preferably 40 ° C or lower. If the temperature of the reaction solution is too low, the reaction may not proceed, and if it is too high, the enzyme may be deactivated.
反応時の雰囲気は任意であるが、通常は空気、炭酸ガス又は窒素ガス雰囲気下が好ましい。
反応時の圧力も任意であるが、通常は常圧或いはそれに近い圧力下で行なう。
また、反応液に攪拌を加えてもよい。
The atmosphere at the time of reaction is arbitrary, but usually an atmosphere of air, carbon dioxide gas or nitrogen gas is preferable.
Although the pressure during the reaction is also arbitrary, it is usually carried out under normal pressure or a pressure close thereto.
Moreover, you may add stirring to a reaction liquid.
＜２−４．カダベリン過剰な状態＞
本発明の製造方法は、反応終了時にける反応液をカダベリン過剰な状態とすることに特徴を有する。ここで、本発明において「カダベリン過剰な状態」とは、反応液中のカダベリンの物質量が、酸の物質量に比べて多いことをいう。
<2-4. Excessive cadaverine>
The production method of the present invention is characterized in that the reaction solution at the end of the reaction is in an excess state of cadaverine. Here, the “cadaverine-excess state” in the present invention means that the amount of cadaverine in the reaction solution is larger than the amount of acid.
上述したように、本発明の製造方法では通常、反応時にリジン及び／又は酸を反応液に補充しながら反応を進行させる。そこで、反応終了前の一定期間において、リジン及び／又は酸の反応液への供給量を調整する（通常は、酸の供給量を減少させる）ことにより、反応終了時にける反応液をカダベリン過剰な状態とすることが可能である。その際、反応液中のカダベリン及び酸の物質量を測定し、それを基準にしてリジン及び／又は酸の反応液への供給量を調整することが好ましい。この酸供給量の調整は、ＬＣＤの種類や、反応温度、ｐＨ、反応容量等の条件によって異なるが、通常、２時間以下、好ましくは１時間以下、さらに好ましくは０．５時間以下で行なうことが好ましい。
なお、酸供給量の調節後、通常２時間以上、好ましくは４時間以上、さらに好ましくは６時間以上、反応を継続させてから終了することが好ましい。酸供給量の調整後、一定時間経過することで、反応が完全に終了し、溶液の状態が安定するためである。
As described above, in the production method of the present invention, the reaction is usually allowed to proceed while supplementing lysine and / or acid to the reaction solution during the reaction. Therefore, by adjusting the amount of lysine and / or acid supplied to the reaction solution for a certain period before the reaction is completed (usually, the amount of acid supplied is reduced), the reaction solution at the end of the reaction is allowed to contain excess cadaverine. It is possible to be in a state. At that time, it is preferable to measure the amount of cadaverine and acid in the reaction solution and adjust the amount of lysine and / or acid supplied to the reaction solution based on the measured amount. The adjustment of the acid supply amount varies depending on the type of LCD, the reaction temperature, pH, reaction volume, and the like, but is usually 2 hours or less, preferably 1 hour or less, more preferably 0.5 hours or less. Is preferred.
After the adjustment of the acid supply amount, the reaction is preferably continued for 2 hours or longer, preferably 4 hours or longer, more preferably 6 hours or longer and then terminated. This is because the reaction is completely completed and the state of the solution is stabilized after a certain time has elapsed after the adjustment of the acid supply amount.
反応液中のカダベリン及び酸の物質量は、種々の分析機器で測定することが可能である。分析手法は限定されないが、通常、イオンクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー等を用いて測定される。これらのクロマトグラフィーによって測定を行なう場合、測定対象となる反応液をそのまま、或いは必要に応じて所定の濃度範囲となるように希釈して測定に供する。また、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーの場合は、反応液中の成分が有する特定の官能基（主にカダベリンのアミノ基）を誘導体化してから測定に供することが好ましい。中でも、本発明においては、液体クロマトグラフィーで測定を行なうことが好ましい。なお、これらのクロマトグラフィーを用いた測定法を、以下「直接法」という場合がある。 The amount of cadaverine and acid in the reaction solution can be measured with various analytical instruments. The analytical technique is not limited, but is usually measured using ion chromatography, gas chromatography, liquid chromatography or the like. When measuring by these chromatography, the reaction liquid used as a measuring object is used as it is or diluted so that it may become a predetermined concentration range as needed. In the case of gas chromatography or liquid chromatography, it is preferable to derivatize a specific functional group (mainly the cadaverine amino group) of the component in the reaction solution before use in the measurement. Among these, in the present invention, it is preferable to perform measurement by liquid chromatography. In addition, the measurement method using these chromatographies may be hereinafter referred to as “direct method”.
また、直接的にカダベリンや酸の物質量を測定しなくても、反応液のｐＨを測定することで、間接的にカダベリン塩溶液におけるカダベリンと酸との物質量の比を予測することが出来る。即ち、カダベリン及び酸を含有する溶液（例えば反応液。これを以下「共存溶液」という場合がある。）中のカダベリンに対する酸の物質量の比と、当該共存溶液のｐＨとの間には相関がある。よって、本発明の製造方法に用いる酸を含有する共存溶液を用いて、この相関を予め測定し、把握しておけば、反応液のｐＨを測定することによって、酸の物質量に対するカダベリンの物質量の比を間接的に予測することが可能となる。この方法は、副生成物の少ない系においては、非常に有効であり、正確に物質量比を予測することができる。本発明の反応系は、これに当てはまる。なお、このｐＨを用いた予測法を、以下「間接法」という場合がある。 Further, even if the amount of cadaverine or acid is not directly measured, the ratio of the amount of cadaverine to acid in the cadaverine salt solution can be estimated indirectly by measuring the pH of the reaction solution. . That is, there is a correlation between the ratio of the amount of acid to cadaverine in a solution containing cadaverine and an acid (for example, a reaction solution, which may be hereinafter referred to as “coexisting solution”), and the pH of the coexisting solution. There is. Therefore, if this correlation is measured in advance using the coexisting solution containing the acid used in the production method of the present invention, and the pH of the reaction solution is measured, the cadaverine substance relative to the acid substance amount It is possible to indirectly estimate the ratio of quantities. This method is very effective in a system with a small amount of by-products, and the mass ratio can be accurately predicted. The reaction system of the present invention applies to this. In addition, the prediction method using this pH may be hereinafter referred to as “indirect method”.
上述の、クロマトグラフィーを用いた直接法と、ｐＨを用いた間接法の何れの方法でも、反応液中の酸の物質量に対するカダベリンの物質量の比を求めることが出来る。ただし、ｐＨを用いた間接法は、液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを用いた直接法に比べて、簡便であるという利点がある。 The ratio of the cadaverine substance amount to the acid substance amount in the reaction solution can be determined by any of the above-described direct method using chromatography and the indirect method using pH. However, the indirect method using pH has an advantage that it is simpler than the direct method using chromatography such as liquid chromatography.
なお、反応量論から、酸の規定数に対するリジンの規定数の比（規定比）が１であるとき、カタベリンと酸との物質量が等しくなる。従って、上述のようなカダベリン過剰な状態は、反応終了時までに使用した酸に対するリジンの規定比を１よりも大きな値にすることにより得られる。中でも、溶液の状態における着色が防止された安定なカダベリン塩を製造するためには、該規定比を１以上にするのが好ましく、１．００５以上にするのが更に好ましい。 From the reaction stoichiometry, when the ratio of the specified number of lysine to the specified number of acids (specified ratio) is 1, the substance amounts of cataverine and acid are equal. Therefore, the cadaverine excess state as described above can be obtained by setting the specified ratio of lysine to the acid used up to the end of the reaction to a value larger than 1. Among these, in order to produce a stable cadaverine salt in which coloring in a solution state is prevented, the specified ratio is preferably 1 or more, and more preferably 1.005 or more.
また、酸と塩基との中和の理論から、反応液のｐＨが、カダベリンと酸との中和点におけるｐＨのときに、カダベリンと酸との物質量が等しくなる。従って、上述のようなカダベリン過剰な状態は、反応終了時における反応液のｐＨを、カダベリンと酸との中和点におけるｐＨよりも高い値にすることにより得られる。
具体的には、上記の酸が、塩酸、硫酸、硝酸等の強酸の場合には、ｐＨが４．５以上になると、強酸に比べてカダベリンの物質量が過剰な状態となる。また、炭酸、カルボン酸、リン酸等の弱酸の場合には、ｐＨが７．２以上になると、弱酸に比べてカダベリンの物質量が過剰な状態となる。
従って、例えば、カダベリンとアジピン酸との場合は、反応液のｐＨが７．２以上のときに、カダベリン過剰な状態となる。中でも、溶液の着色が防止され安定なカダベリン類の溶液を製造するためには、該ｐＨを７．２０以上にするのが好ましく、７．４０以上にするのが更に好ましい。
Further, from the theory of neutralization of acid and base, when the pH of the reaction solution is the pH at the neutralization point between cadaverine and acid, the amount of cadaverine and acid is equal. Therefore, the cadaverine excess state as described above can be obtained by setting the pH of the reaction solution at the end of the reaction to a value higher than the pH at the neutralization point of cadaverine and acid.
Specifically, when the acid is a strong acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, or nitric acid, the amount of cadaverine is excessive as compared with the strong acid when the pH is 4.5 or more. Further, in the case of weak acids such as carbonic acid, carboxylic acid, and phosphoric acid, when the pH is 7.2 or more, the amount of cadaverine is excessive compared to the weak acid.
Therefore, for example, in the case of cadaverine and adipic acid, cadaverine becomes excessive when the pH of the reaction solution is 7.2 or higher. Among these, in order to produce a stable cadaverine solution in which coloring of the solution is prevented, the pH is preferably 7.20 or more, and more preferably 7.40 or more.
本発明の製造方法では、反応終了時における反応液をカダベリン過剰な状態とすることにより、得られるカダベリン塩の溶液が着色の少なく安定したものになる、という効果が得られる。 In the production method of the present invention, the cadaverine salt solution obtained at the end of the reaction is brought into a cadaverine-excess state, whereby the resulting cadaverine salt solution is stable with little coloration.
更に、本発明の製造方法により得られたカダベリン塩を、ポリアミドの製造原料の用途に用いる場合には、コストや効率の面でも利点がある。
即ち、従来のカダベリン塩の製造方法では、ＬＤＣの至適ｐＨのまま反応を終了させていたので、反応終了後の反応液は酸が過剰に存在する状態となっていた。このため、得られた反応液をポリアミドの製造原料の用途に用いる場合には、カダベリンを追加してカダベリン（イオン）と酸（共役塩基）との物質量比を概ね等量に調整していたが、カダベリンは高価であったため、コストや効率の面で不利であった。
これに対し、本発明の製造方法では、反応終了後の反応液がカダベリン過剰な状態となっているため、反応液に酸を補充することによりカダベリン（イオン）と酸（共役塩基）とを概ね等量に調整することができ、コストや効率の面で有利である。
Furthermore, when the cadaverine salt obtained by the production method of the present invention is used as a raw material for producing polyamide, there are advantages in terms of cost and efficiency.
That is, in the conventional method for producing a cadaverine salt, the reaction was terminated with the optimum pH of LDC, so that the reaction solution after the reaction was in an excess of acid. For this reason, when using the obtained reaction liquid for the use of the manufacturing raw material of polyamide, cadaverine was added and the substance amount ratio of cadaverine (ion) and an acid (conjugated base) was adjusted to about equal amount. However, cadaverine was expensive and disadvantageous in terms of cost and efficiency.
On the other hand, in the production method of the present invention, the reaction solution after completion of the reaction is in an excess state of cadaverine. Therefore, cadaverine (ion) and acid (conjugate base) are generally added by supplementing the reaction solution with acid. It can be adjusted to the same amount, which is advantageous in terms of cost and efficiency.
＜２−５．その他＞
以上の手順により、リジンの酵素的脱炭酸反応によってカダベリンが生成する。これにより、得られた反応液中には、生成したカダベリンと、酸とが共存することになる。なお、これらのカダベリン及び酸は通常、その大部分がイオンとなって反応液中に溶解した状態で存在する。こうして、本発明の製造方法により、カダベリン塩が反応液中で解離した状態で（即ち、カダベリン塩の溶液として）得られることになる。
<2-5. Other>
Through the above procedure, cadaverine is produced by enzymatic decarboxylation of lysine. Thereby, the produced cadaverine and the acid coexist in the obtained reaction solution. In addition, these cadaverine and acid usually exist in a state where most of them are ionized and dissolved in the reaction solution. Thus, according to the production method of the present invention, the cadaverine salt is obtained in a dissociated state in the reaction solution (that is, as a solution of cadaverine salt).
なお、上述したように、反応終了時の反応液はカダベリン過剰な状態であるため、カ ダベリンイオンの物質量がその共役塩基の物質量よりも多い状態となっているが、本発 明ではこのような場合も含め、カダベリンイオンとその共役塩基とを含有する溶液を包 括して「カダベリン塩溶液」というものとする。 As described above, since the reaction solution at the end of the reaction is in an excessive state of cadaverine, the amount of cadaverine ions is larger than the amount of its conjugate base. The solution containing cadaverine ion and its conjugate base is collectively referred to as “cadaverine salt solution”.
［３．カダベリン塩の用途及び保存］
本発明の製造方法により得られたカダベリン塩（本発明に係るカダベリン塩）は、任意の用途に使用することが可能であるが、例としては５６ナイロン等のポリアミドの製造原料としての用途が挙げられる。
[3. Use and storage of cadaverine salt]
The cadaverine salt obtained by the production method of the present invention (the cadaverine salt according to the present invention) can be used for any application, but examples include the use as a raw material for producing polyamide such as 56 nylon. It is done.
本発明に係るカダベリン塩は、その用途によって、上述の反応終了後に得られた反応液の状態のままで用いてもよいが、何らかの処理を加えてから用いてもよい。処理の内容は任意であるが、例としては、カダベリン及び／又は酸の追加、反応液の滅菌・濾過、溶媒の除去・追加によるカダベリン塩の濃度調整等の処理が挙げられる。 The cadaverine salt according to the present invention may be used in the state of the reaction solution obtained after completion of the above-mentioned reaction depending on its use, but may be used after some treatment. The contents of the treatment are arbitrary, but examples include treatment such as addition of cadaverine and / or acid, sterilization / filtration of the reaction solution, and concentration adjustment of cadaverine salt by removal / addition of solvent.
また、以上の反応により得られた反応液から、カダベリン塩を精製・単離してもよい。精製・単離の手法は任意であり、公知の手法を適宜選択して用いればよい。例としては、晶析、蒸留等が挙げられる。精製・単離されたカダベリン塩を含む固体成分を任意の溶媒に溶解させることにより、本発明に係るカダベリン塩を含有する溶液を新たに調製することも可能である。
但し、本発明に係るカダベリン塩をポリアミドの製造原料としての用途に使用する場合には、複雑な精製や単離を行なうことなく、上述のように反応終了後の反応液に酸を追加して、カダベリン（イオン）と酸（共役塩基）との物質量を等量に調整することができ、コストや効率の面で好ましい。
Moreover, you may refine | purify and isolate a cadaverine salt from the reaction liquid obtained by the above reaction. The method of purification / isolation is arbitrary, and a known method may be appropriately selected and used. Examples include crystallization, distillation and the like. It is also possible to newly prepare a solution containing the cadaverine salt according to the present invention by dissolving the solid component containing the purified and isolated cadaverine salt in an arbitrary solvent.
However, when the cadaverine salt according to the present invention is used as a raw material for producing polyamide, an acid is added to the reaction solution after completion of the reaction as described above without performing complicated purification and isolation. The amount of cadaverine (ion) and acid (conjugated base) can be adjusted to the same amount, which is preferable in terms of cost and efficiency.
なお、本明細書では、本発明の製造方法における反応終了後の反応液か、その反応液に各種の処理を加えて得られた溶液かを問わず、本発明に係るカダベリン塩を含有する溶液を「本発明に係るカダベリン塩溶液」と総称するものとする。 In the present specification, a solution containing the cadaverine salt according to the present invention, whether it is a reaction solution after completion of the reaction in the production method of the present invention or a solution obtained by adding various treatments to the reaction solution. Are collectively referred to as “cadaverine salt solution according to the present invention”.
本発明に係るカダベリン塩溶液は、調製後にすぐ使用に供してもよいが、使用までに時間がある場合には、以下に説明する方法で保存することが好ましい（この保存方法を以下「本発明に係る保存方法」という場合がある。）。 The cadaverine salt solution according to the present invention may be used immediately after preparation, but when there is time until use, it is preferably stored by the method described below (this storage method is hereinafter referred to as “the present invention”). May be referred to as a “storage method”.).
本発明に係る保存方法では、上述した本発明に係るカダベリン塩溶液のｐＨを、酸性或いは塩基性に調整して保存する。 In the storage method according to the present invention, the pH of the cadaverine salt solution according to the present invention described above is adjusted to be acidic or basic and stored.
具体的に、カダベリン塩溶液のｐＨを酸性に調整する場合、そのｐＨは、通常６．４以下、好ましくは６．０以下、更に好ましくは５．５以下である。
一方、カダベリン塩溶液のｐＨをアルカリ性に調整する場合、そのｐＨは、通常７．５以上、好ましくは８．０以上、更に好ましくは８．５以上である。
上述のように、カダベリン塩溶液のｐＨを酸性或いは塩基性に調整して保存することにより、カダベリン塩溶液を着色の少ない状態で安定に保存することができる。
Specifically, when the pH of the cadaverine salt solution is adjusted to be acidic, the pH is usually 6.4 or less, preferably 6.0 or less, and more preferably 5.5 or less.
On the other hand, when the pH of the cadaverine salt solution is adjusted to be alkaline, the pH is usually 7.5 or higher, preferably 8.0 or higher, more preferably 8.5 or higher.
As described above, by adjusting the pH of the cadaverine salt solution to be acidic or basic and storing it, the cadaverine salt solution can be stably stored with little coloration.
カダベリン塩溶液のｐＨを上記範囲内となるように調整する手法は制限されないが、例としては、以下に挙げる二種の手法が挙げられる。 The method for adjusting the pH of the cadaverine salt solution to be within the above range is not limited, but examples include the following two methods.
まず、第一の手法として、カダベリン塩溶液の製造時にその条件を調整することにより、得られるカダベリン塩溶液のｐＨを上記範囲内にするという手法が挙げられる。具体例として、上述のＬＤＣを用いたリジンの酵素的脱炭酸反応によってカダベリン塩溶液を製造する場合、反応時に反応液に加える酸の量を調整したり、或いはカダベリンやカダベリン塩を加えることにより、反応終了時における反応液、即ちカダベリン塩溶液のｐＨが上記範囲内となるように調整することができる。 First, as a first technique, there is a technique in which the pH of the cadaverine salt solution obtained is adjusted within the above range by adjusting the conditions during the production of the cadaverine salt solution. As a specific example, when producing a cadaverine salt solution by enzymatic decarboxylation of lysine using the above-mentioned LDC, by adjusting the amount of acid added to the reaction solution during the reaction, or by adding cadaverine or cadaverine salt, The reaction solution at the end of the reaction, that is, the cadaverine salt solution can be adjusted so that the pH is within the above range.
また、第二の手法として、カダベリン塩溶液を製造した後に、ｐＨ調整剤を用いてそのｐＨを上記範囲内に調整するという手法が挙げられる。
ｐＨ調整剤の種類は制限されない。保存するカダベリン塩溶液の成分や用途等に応じて適宜選択することができる。
In addition, as a second technique, after the cadaverine salt solution is manufactured, a technique of adjusting the pH within the above range using a pH adjuster can be mentioned.
The kind of pH adjuster is not limited. The cadaverine salt solution to be stored can be appropriately selected depending on the components and applications.
ｐＨ調整剤は主に、酸と塩基とに分けられる。
酸の種類は任意であるが、例としては、上述のカダベリン塩を構成する酸として例示したものが挙げられる。
塩基としては、無機塩基でも有機塩基でもよく、また、一価の塩基でも二価以上の塩基でもよい。塩基の例としては、カダベリン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、アンモニア等が挙げられる。中でも、カダベリン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。これらの塩基は何れか一種を単独で用いてもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。
The pH adjusting agent is mainly divided into an acid and a base.
Although the kind of acid is arbitrary, what was illustrated as an acid which comprises the above-mentioned cadaverine salt as an example is mentioned.
The base may be an inorganic base or an organic base, and may be a monovalent base or a divalent or higher base. Examples of the base include cadaverine, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, lithium hydroxide, magnesium hydroxide, barium hydroxide, ammonia and the like. Of these, cadaverine, sodium hydroxide, and potassium hydroxide are preferred. Any one of these bases may be used alone, or two or more thereof may be used in any combination and ratio.
なお、ｐＨ調整剤とともに、緩衝剤を用いてもよい。緩衝剤の種類は任意であるが、例としては、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等が挙げられる。これらの緩衝剤は何れか一種を単独で用いてもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。 A buffer may be used together with the pH adjuster. Although the kind of buffer is arbitrary, as an example, sodium acetate buffer, potassium phosphate buffer, etc. are mentioned. Any one of these buffering agents may be used alone, or two or more thereof may be used in any combination and ratio.
但し、本発明の製造方法により得られた反応液が、上述のｐＨの範囲を満たしている場合（例えば、ｐＨ７．５以上の場合）には、更なるｐＨの調整を行なうことなく、そのまま保存に供してもよい。 However, when the reaction solution obtained by the production method of the present invention satisfies the above pH range (for example, pH 7.5 or more), it is stored as it is without further pH adjustment. You may use for.
本発明に係るカダベリン塩溶液の保存時におけるその他の条件は任意であるが、通常は以下の通りである。
即ち、保存時の温度は特に制限されないが、通常は常温以下とすることが望ましい。具体的には、通常３０℃以下、好ましくは２５℃以下が望ましい。また、例えば通常１０℃以下、好ましくは５℃以下の低温に冷却して保存を行なってもよい。保存時の温度が高過ぎると、変色が進んだり、不純物が発生したりする場合がある。
保存時の雰囲気は任意であるが、通常は空気又は窒素ガス等の不活性ガス雰囲気下が好ましい。
保存時の圧力も任意であるが、通常は常圧或いはそれに近い圧力とする。
本発明に係るカダベリン塩溶液の保存時における状態も制限されないが、通常は静置状態で保存する。
Other conditions at the time of storage of the cadaverine salt solution according to the present invention are arbitrary, but are usually as follows.
That is, the temperature at the time of storage is not particularly limited, but it is usually desirable to keep it at room temperature or lower. Specifically, it is usually 30 ° C. or lower, preferably 25 ° C. or lower. Further, for example, it may be stored by cooling to a low temperature of usually 10 ° C. or lower, preferably 5 ° C. or lower. If the temperature during storage is too high, discoloration may progress or impurities may be generated.
The atmosphere at the time of storage is arbitrary, but usually an inert gas atmosphere such as air or nitrogen gas is preferable.
Although the pressure at the time of storage is also arbitrary, it is usually a normal pressure or a pressure close thereto.
The state of the cadaverine salt solution according to the present invention during storage is not limited, but is usually stored in a stationary state.
本発明に係る保存方法によれば、本発明に係るカダベリン塩溶液を、着色の少ない状態で安定に保存することができる。具体的には、本発明に係る保存方法によりカダベリン塩溶液を７日間保存した場合、下記式［１］により規定される、波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化が、通常０．１３以下、好ましくは０．１２５以下、更に好ましくは０．１２以下である。この値が低いほど、可視光領域における吸光度の変化が少なく、ひいては着色が少ないといえる。 According to the storage method according to the present invention, the cadaverine salt solution according to the present invention can be stably stored with little coloration. Specifically, when the cadaverine salt solution is stored for 7 days by the storage method according to the present invention, the change in average molar absorbance at a wavelength of 400 to 500 nm, defined by the following formula [1], is usually 0.13 or less, Preferably it is 0.125 or less, More preferably, it is 0.12 or less. It can be said that the lower this value, the less the change in absorbance in the visible light region, and the less the coloring.
（波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化）
＝ （保存前後の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度の変化）
／（カダベリン塩溶液中のカダベリンのモル濃度） ［１］
(Change in average molar absorbance at wavelengths of 400 to 500 nm)
= (Change in average absorbance at a wavelength of 400 to 500 nm before and after storage)
/ (Molar concentration of cadaverine in cadaverine salt solution) [1]
上記式［１］中、「保存前後の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度の変化」は、下記式［２］により求められる値である。 In the above formula [1], “change in average absorbance at wavelengths of 400 to 500 nm before and after storage” is a value determined by the following formula [2].
（保存前後の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度の変化）
＝ （保存７日目の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度）
− （保存０日目の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度） ［２］
(Change in average absorbance at a wavelength of 400 to 500 nm before and after storage)
= (Average absorbance at a wavelength of 400 to 500 nm on the seventh day of storage)
-(Average absorbance at
なお、カダベリン塩溶液の波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化は、２５℃の室内環境下でカダベリン塩溶液を７日間保存するとともに、その前後における吸
光スペクトルを分光光度計（例えば日立製作所製Ｕ−３５００）で測定し、得られた吸光スペクトルから求めることが可能である。
The change in the average molar absorbance of the cadaverine salt solution at a wavelength of 400 to 500 nm was determined by storing the cadaverine salt solution for 7 days in an indoor environment at 25 ° C., and measuring the absorption spectrum before and after that for a spectrophotometer (for example, U -3500) and can be obtained from the obtained absorption spectrum.
［４．ＬＤＣ遺伝子の発現の増強］
次に、微生物をＬＤＣ活性が上昇するように改質する方法について例示する。なお、他の細胞についても、それに適するように下記の方法を適宜改変することによって、同様にＬＤＣ活性を上昇させることができる。
[4. Enhancement of LDC gene expression]
Next, a method for modifying microorganisms so that LDC activity is increased will be exemplified. For other cells, LDC activity can be similarly increased by appropriately modifying the following method so as to be suitable for the other cells.
ＬＤＣ活性は、例えば、ＬＤＣをコードする遺伝子（ＬＤＣ遺伝子）の発現を増強することによって上昇する。ＬＤＣ遺伝子の発現の増強は、ＬＤＣ遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、ＬＤＣ遺伝子断片を、微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換すればよい。 The LDC activity is increased by, for example, enhancing the expression of a gene encoding LDC (LDC gene). Enhanced expression of the LDC gene is achieved by increasing the copy number of the LDC gene. For example, an LDC gene fragment may be ligated with a vector that functions in a microorganism, preferably a multicopy vector, to produce a recombinant DNA, which is introduced into an appropriate host and transformed.
ＬＤＣ遺伝子のコピー数の増大は、ＬＤＣ遺伝子を微生物の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体ＤＮＡ上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行なう。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。 Increasing the copy number of the LDC gene can also be achieved by having multiple copies of the LDC gene on the chromosomal DNA of the microorganism. In order to introduce a gene in multiple copies on the chromosomal DNA of a microorganism, homologous recombination is performed using a sequence present on the chromosomal DNA as a target. As a sequence present in multiple copies on chromosomal DNA, repetitive DNA and inverted repeat present at the end of a transposable element can be used. Alternatively, as disclosed in JP-A-2-109985, a target gene can be mounted on a transposon and transferred to introduce multiple copies onto chromosomal DNA.
ＬＤＣ活性の上昇は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上のＬＤＣ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開第００／１８９３５号パンフレットに開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換又は改変によりＬＤＣ遺伝子の発現が強化され、ＬＤＣ活性が上昇する。これら発現調節配列の改変は、遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。 In addition to the gene amplification described above, the increase in LDC activity can also be achieved by replacing an expression regulatory sequence such as a promoter of LDC gene on chromosomal DNA or plasmid with a strong one. For example, lac promoter, trp promoter, trc promoter and the like are known as strong promoters. Further, as disclosed in International Publication No. 00/18935 pamphlet, it is possible to introduce a base substitution of several bases into the promoter region of a gene and modify it to be more powerful. These promoter substitutions or modifications enhance LDC gene expression and increase LDC activity. Modification of these expression regulatory sequences may be combined with increasing the copy number of the gene.
発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。大腸菌の温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えば国際公開第９９／０３９８８号パンフレットに記載のプラスミドｐＭＡＮ９９７等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した方法（Datsenko, K. A., PNAS (2000) 97(12), 6640-6645）によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。 The replacement of the expression regulatory sequence can be performed, for example, in the same manner as the gene replacement using a temperature sensitive plasmid. Examples of the vector having a temperature-sensitive replication origin of E. coli include plasmid pMAN997 described in International Publication No. 99/03988 pamphlet. The expression regulatory sequence can also be replaced by a method using red recombinase of λ phage (Datsenko, KA, PNAS (2000) 97 (12), 6640-6645).
ＬＤＣ遺伝子としては、コードされるＬＤＣが、リジンの脱炭酸反応に有効利用できるものであれば特に制限されないが、例えば、バクテリウム カダベリス、大腸菌等の細菌や、カラス豆等の植物、更には、特開２００２−２２３７７０号公報に記載の微生物のＬＤＣ遺伝子が挙げられる。 The LDC gene is not particularly limited as long as the encoded LDC can be effectively used for lysine decarboxylation. For example, bacteria such as bacteria cadaveris and E. coli, plants such as crow beans, and more Examples thereof include the LDC gene of microorganisms described in Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-223770.
宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、大腸菌由来のＬＤＣ遺伝子が好ましい。
大腸菌のＬＤＣ遺伝子としては、ｃａｄＡ遺伝子及びｌｄｃ遺伝子（米国特許第５８２７６９８号明細書）が知られているが、これらの中ではｃａｄＡ遺伝子が好ましい。大腸菌のｃａｄＡ遺伝子は配列が知られており（N. Watson et al., Journal of Bacteriology (1992) vo.174, p.530-540; S. Y. Meng et al. Journal of Bacteriology (1992) vo.174, p.2659-2668; GenBank accession No.M76411）、その配列に基づいて作成したプライマーを用いたＰＣＲにより、大腸菌染色体ＤＮＡから単離することができる。このようなプライマーとしては、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
When E. coli is used as the host microorganism, the LDC gene derived from E. coli is preferred.
As the LDC gene of Escherichia coli, the cadA gene and the ldc gene (US Pat. No. 5,827,698) are known, and among these, the cadA gene is preferable. The sequence of the cadA gene of E. coli is known (N. Watson et al., Journal of Bacteriology (1992) vo.174, p.530-540; SY Meng et al. Journal of Bacteriology (1992) vo.174, p.2659-2668; GenBank accession No. M76411), and can be isolated from Escherichia coli chromosomal DNA by PCR using primers prepared based on the sequence. Examples of such primers include primers having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2.
取得されたＬＤＣ遺伝子とベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、ＬＤＣ遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて前記遺伝子とベクターを連結すればよい。大腸菌用のベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＳＴＶ２９、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＷ２１９等が挙げられる。 In order to prepare a recombinant DNA by ligating the obtained LDC gene and the vector, the vector is cleaved with a restriction enzyme suitable for the end of the LDC gene, and the gene and the vector are used using a ligase such as T4 DNA ligase. What is necessary is just to connect. Examples of vectors for E. coli include pUC18, pUC19, pSTV29, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, and pMW219.
ＬＤＣ遺伝子は、野生型であってもよいし、変異型であってもよい。例えばｃａｄＡ遺伝子は、コードされるＬＤＣの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むＬＤＣをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２個以上、また、通常５０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下である。 The LDC gene may be a wild type or a mutant type. For example, a cadA gene encodes an LDC that includes a substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids at one or more positions, as long as the activity of the encoded LDC is not impaired. Also good. Here, “several” differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically 2 or more, usually 50 or less, preferably 30 or less, more preferably Is 10 or less.
上記のようなＬＤＣと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むようにｃａｄＡ遺伝子の塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線、又は、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）若しくはエチルメタンスル
ホン酸（ＥＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
DNA encoding a protein substantially identical to LDC as described above may be substituted, deleted, inserted, added, or inverted by substitution of a specific site by, for example, site-directed mutagenesis. It is obtained by modifying the base sequence of the cadA gene. The modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment. As the mutation treatment, a method of treating DNA before mutation treatment with hydroxylamine or the like in vitro, and a microorganism that retains the DNA before mutation treatment, such as an Escherichia bacterium, with ultraviolet light or N-methyl-N′-nitro- A method of treating with a mutagen that is usually used for mutagenesis treatment such as N-nitrosoguanidine (NTG) or ethylmethanesulfonic acid (EMS) can be mentioned.
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることにより、ＬＤＣと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するＬＤＣをコードするＤＮＡ又はこれを保持する細胞から、例えばｃａｄＡ遺伝子（GenBank accession No.M76411）のコード領域の配列、又は同配列の一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ＬＤＣと同等の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それにより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、或いは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である、温度約６０℃で、通常は１倍濃度ＳＳＣ又は０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、好ましくは０．１倍濃度ＳＳＣ又は０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。 By expressing the DNA having the mutation as described above in an appropriate cell and examining the activity of the expression product, DNA encoding a protein substantially identical to LDC can be obtained. Further, from a DNA encoding a mutated LDC or a cell carrying the same, for example, under a stringent condition with a probe having the sequence of the coding region of the cadA gene (GenBank accession No. M76411) or a part of the sequence. A DNA encoding a protein that hybridizes and has an activity equivalent to that of LDC is obtained. The “stringent conditions” referred to herein are conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to quantify this condition clearly, for example, highly homologous DNAs, for example, usually have a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more. The conditions are such that DNAs hybridize so that DNAs with low homology do not hybridize, or normal Southern hybridization washing conditions, at a temperature of about 60 ° C., usually 1 × concentration SSC or 0. The conditions include hybridization at a salt concentration corresponding to 1% SDS, preferably 0.1-fold concentration SSC or a salt concentration corresponding to 0.1% SDS.
プローブとしてｃａｄＡ遺伝子の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、公知のｃａｄＡ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ｃａｄＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、例えば温度約５０℃、２倍濃度ＳＳＣ又は０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度という条件が挙げられる。 A partial sequence of the cadA gene can also be used as a probe. Such a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared based on a known cadA gene base sequence as a primer and a DNA fragment containing the cadA gene as a template. When a DNA fragment having a length of about 300 bp is used as a probe, the washing conditions for hybridization include, for example, a temperature of about 50 ° C., a 2-fold concentration SSC, or a salt concentration corresponding to 0.1% SDS. Can be mentioned.
ＬＤＣと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして、具体的には、公知のｃａｄＡ遺伝子がコードするアミノ酸配列と、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有し、且つ、ＬＤＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。 Specifically, the DNA encoding a protein substantially the same as LDC is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more of the amino acid sequence encoded by a known cadA gene. Examples thereof include DNA encoding a protein having homology and having LDC activity.
組換えＤＮＡの微生物への導入は、これまでに報告されている形質転換法に従って行なえばよい。例えば、大腸菌Ｋ１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・サブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Ducan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E., Gene, 1, 153 (1997)）がある。或いは、バチルス・サブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラスト又はスフェロプラストの状態にして、組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)）も応用できる。更には、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報）によっても、微生物の形質転換を行なうことができる。 The introduction of the recombinant DNA into the microorganism may be performed according to the transformation methods reported so far. For example, as reported for E. coli K12, recipient cells are treated with calcium chloride to increase DNA permeability (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159). (1970)), and a method of introducing competent cells from proliferating cells and introducing DNA as reported for Bacillus subtilis (Ducan, CH, Wilson, GA and Young, FE, Gene, 1, 153 (1997)). Alternatively, DNA-receptive cells, such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, can be placed in a protoplast or spheroplast state that readily incorporates recombinant DNA, and the recombinant DNA becomes a DNA-receptor. Introduction method (Chang, S. and Choen, SN, Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, MJ, Ward, JM and Hopwood, OA, Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, JB and Fink, GR Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)). Furthermore, transformation of microorganisms can also be performed by an electric pulse method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791).
ＬＤＣを産生する微生物又は細胞を得るための培養は、用いる微生物又は細胞に応じて、ＬＤＣの産生に適した方法によって行なえばよい。 Culture for obtaining microorganisms or cells producing LDC may be performed by a method suitable for production of LDC depending on the microorganism or cells used.
例えば、培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いればよい。 For example, as the medium, a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic components as necessary may be used.
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、澱粉の加水分解物等の糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。 Examples of carbon sources include glucose, lactose, galactose, fructose, arabinose, maltose, xylose, trehalose, ribose, alcohols such as starch hydrolysates, alcohols such as glycerol, mannitol and sorbitol, gluconic acid, fumaric acid, citric acid And organic acids such as succinic acid can be used.
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。 As the nitrogen source, inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia and the like can be used.
有機微量栄養素としては、ビタミンＢ１等のビタミン類、アデニンやＲＮＡ等の核酸類などの要求物質又は酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。 As organic micronutrients, it is desirable to contain appropriate amounts of required substances such as vitamins such as vitamin B1, nucleic acids such as adenine and RNA, yeast extract, and the like.
これらの他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を少量使用してもよい。 In addition to these, a small amount of calcium phosphate, magnesium sulfate, iron ion, manganese ion or the like may be used as necessary.
培養条件としては、大腸菌の場合、好気的条件下で１６〜７２時間程度実施するのがよく、培養温度は３０〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御するのがよい。なお、ｐＨ調整には、無機又は有機の酸性又はアルカリ性物質、アンモニアガス等を使用することができる。
なお、ＬＤＣ遺伝子の発現が、誘導可能なプロモーターによって調節されている場合には、誘導剤を培地に含有させてもよい。
As the culture conditions, in the case of Escherichia coli, the culture is preferably carried out under aerobic conditions for about 16 to 72 hours, the culture temperature is preferably 30 to 45 ° C., and the pH during the culture is preferably controlled to 5 to 8. For pH adjustment, an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas, or the like can be used.
In addition, when the expression of the LDC gene is regulated by an inducible promoter, an inducing agent may be included in the medium.
培養後、細胞を遠心分離機や膜により集めることにより、培養液から回収することができる。
回収された細胞は、そのまま用いてもよいが、ＬＤＣを含むそれらの処理物を用いる場合は、細胞を超音波、フレンチプレス、又は酵素的処理により破砕して酵素を抽出し、無細胞抽出液とする。更に、そこからＬＤＣを精製する場合には、常法に従い、硫安塩折、各種クロマトグラフィーを使用することによって精製することができる。
After culturing, the cells can be collected from the culture solution by collecting them with a centrifuge or a membrane.
The recovered cells may be used as they are. However, when those treated products containing LDC are used, the cells are disrupted by ultrasonic, French press, or enzymatic treatment to extract the enzyme, and a cell-free extract is obtained. And Further, when LDC is purified therefrom, it can be purified by using ammonium sulfate or various chromatographies according to a conventional method.
［５．ポリアミド］
本発明のポリアミドは、本発明の製造方法によって得られたカダベリン塩を、重縮合させる工程を経て製造される。本発明のポリアミドの製造方法は、上記特徴を有していればよいが、本発明の効果を著しく損なわない限り、その他の任意の工程を有することが出来る。
本発明のポリアミドの製造方法の具体例としては、［２．カダベリン塩の製造方法］で得られたカダベリン塩を重縮合する方法が考えられる。以下、この方法を中心に説明する。
なお、本明細書では、ポリアミドの構成単位を、その由来となる重合成分又は共重合成分に「単位」を付して表わす場合がある。例えば、「ジカルボン酸単位」とは、ジカルボン酸に由来する構成単位である。
[5. polyamide]
The polyamide of the present invention is produced through a step of polycondensing the cadaverine salt obtained by the production method of the present invention. Although the manufacturing method of the polyamide of this invention should just have the said characteristic, unless the effect of this invention is impaired remarkably, it can have other arbitrary processes.
Specific examples of the method for producing the polyamide of the present invention include [2. A method of polycondensing the cadaverine salt obtained in [Method for producing cadaverine salt] is conceivable. Hereinafter, this method will be mainly described.
In the present specification, the structural unit of polyamide may be represented by adding “unit” to the polymerization component or copolymerization component from which it is derived. For example, a “dicarboxylic acid unit” is a structural unit derived from a dicarboxylic acid.
＜５−１．ポリアミドの構成単位＞
本発明のポリアミドは、その分子構造の構成成分として、カダベリン単位、及び、ジカルボン酸単位とを有してなる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、それ以外の共重合成分の構成単位を有していてもよい。
<5-1. Polyamide structural unit>
The polyamide of the present invention comprises cadaverine units and dicarboxylic acid units as constituent components of its molecular structure. Moreover, in the range which does not impair the effect of this invention, you may have the structural unit of the other copolymerization component.
（ジカルボン酸単位）
本発明のポリアミドが有するジカルボン酸単位としては、脂肪族ジカルボン酸、芳香族ジカルボン酸等に由来するジカルボン酸単位が挙げられる。
(Dicarboxylic acid unit)
Examples of the dicarboxylic acid unit possessed by the polyamide of the present invention include dicarboxylic acid units derived from aliphatic dicarboxylic acids, aromatic dicarboxylic acids and the like.
脂肪族ジカルボン酸の具体例としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸、ブラシリン酸、テトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、オクタデカン二酸、アジピン酸、等の脂肪族飽和ジカルボン酸；マレイン酸、フマル酸等の脂肪族不飽和ジカルボン酸；シクロヘキサンジカルボン酸等の脂環式ジカルボン酸；等が挙げられる。 Specific examples of the aliphatic dicarboxylic acid include oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, undecanedioic acid, dodecanedioic acid, brassic acid, tetradecanedioic acid, pentadecane Aliphatic saturated dicarboxylic acids such as diacid, octadecanedioic acid, and adipic acid; aliphatic unsaturated dicarboxylic acids such as maleic acid and fumaric acid; alicyclic dicarboxylic acids such as cyclohexanedicarboxylic acid; and the like.
芳香族ジカルボン酸の具体例としては、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、等が挙げられる。 Specific examples of the aromatic dicarboxylic acid include phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, naphthalenedicarboxylic acid, and the like.
これらのジカルボン酸単位の種類によって、用途に応じた様々なポリアミドを製造することができる。例えば、アジピン酸を用いた場合には５６−ナイロン、スベリン酸を用いた場合は５８−ナイロン、セバシン酸を用いた場合は５１０−ナイロン、テレフタル酸を用いた場合は５Ｔ−ナイロン、イソフタル酸を用いた場合は５Ｉ−ナイロンを得ることができる。 Depending on the type of these dicarboxylic acid units, various polyamides can be produced according to the application. For example, 56-nylon when adipic acid is used, 58-nylon when suberic acid is used, 510-nylon when sebacic acid is used, 5T-nylon and isophthalic acid when terephthalic acid is used. When used, 5I-nylon can be obtained.
（共重合成分）
また、共重合成分を用いる場合、その具体例としては、６−アミノカプロン酸、１１−アミノウンデカン酸、１２−アミノドデカン酸、パラアミノメチル安息香酸、等のアミノ酸；ε−カプロラクタム、ω−ラウロラクタム、等のラクタム；エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナン、１，１０−ジアミノデカン、１，１１−ジアミノウンデカン、１，１２−ジアミノドデカン、１，１３−ジアミノトリデカン、１，１４−ジアミノテトラデカン、１，１５−ジアミノペンタデカン、１，１６−ジアミノヘキサデカン、１，１７−ジアミノヘプタデカン、１，１８−ジアミノオクタデカン、１，１９−ジアミノノナデカン、１，２０−ジアミノエイコサン、２−メチル−１，５−ジアミノペンタン、等の脂肪族ジアミン；シクロヘキサンジアミン、ビス−（４−アミノヘキシル）メタン、等の脂環式ジアミン；キシリレンジアミン、等の芳香族ジアミン；等が挙げられる。
(Copolymerization component)
When a copolymer component is used, specific examples thereof include amino acids such as 6-aminocaproic acid, 11-aminoundecanoic acid, 12-aminododecanoic acid and paraaminomethylbenzoic acid; ε-caprolactam, ω-laurolactam, Lactams such as ethylenediamine, 1,3-diaminopropane, 1,4-diaminobutane, 1,6-diaminohexane, 1,7-diaminoheptane, 1,8-diaminooctane, 1,9-diaminononane, 1,10 -Diaminodecane, 1,11-diaminoundecane, 1,12-diaminododecane, 1,13-diaminotridecane, 1,14-diaminotetradecane, 1,15-diaminopentadecane, 1,16-diaminohexadecane, 1,17 -Diaminoheptadecane, 1,18-diaminooctadecane, 1,19 -Aliphatic diamines such as diaminononadecane, 1,20-diaminoeicosane, 2-methyl-1,5-diaminopentane; and cycloaliphatic diamines such as cyclohexanediamine and bis- (4-aminohexyl) methane; And aromatic diamines such as xylylenediamine and the like.
これらの共重合成分は１種を単独で用いてもよく、２種以上を任意の割合、及び比率で併用してもよい。 These copolymerization components may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together by arbitrary ratios and ratios.
＜５−２．ポリアミドの製造方法＞
本発明のポリアミドの製造方法としては、公知の方法が使用できる。具体例としては「ポリアミド樹脂ハンドブック」（日刊工業社出版：福本修編）等に開示されている。
<5-2. Manufacturing method of polyamide>
A known method can be used as a method for producing the polyamide of the present invention. Specific examples are disclosed in “Polyamide resin handbook” (published by Nikkan Kogyosha: edited by Osamu Fukumoto).
（加熱重縮合反応）
例えば、ポリアミド５６を製造する場合、本発明の製造方法で得られるアジピン酸とのカダベリン塩（以下、適宜「カダベリン・アジピン酸塩」という。）を、水の存在下で加熱して、脱水反応（加熱重縮合反応）を進行させることができる。
(Heating polycondensation reaction)
For example, when the polyamide 56 is produced, a cadaverine salt with adipic acid obtained by the production method of the present invention (hereinafter, referred to as “cadaverine adipate” as appropriate) is heated in the presence of water to perform a dehydration reaction. (Heating polycondensation reaction) can proceed.
加熱重縮合反応における、反応物の最高到達温度としては、通常２００℃以上、好ましくは２５０℃以上、さらに好ましくは２６０℃以上、また、通常３２０℃以下、好ましくは３００℃以下、さらに好ましくは２９０℃以下である。この範囲を上回ると、重合反応時の熱安定性が低下する可能性がある。 In the heat polycondensation reaction, the maximum reached temperature of the reactant is usually 200 ° C. or higher, preferably 250 ° C. or higher, more preferably 260 ° C. or higher, and usually 320 ° C. or lower, preferably 300 ° C. or lower, more preferably 290. It is below ℃. If it exceeds this range, the thermal stability during the polymerization reaction may be reduced.
また、加熱重縮合反応の反応方式にも制限は無く、バッチ式、回分式、連続方式を用いることができる。 Moreover, there is no restriction | limiting in the reaction system of a heating polycondensation reaction, A batch type, a batch type, and a continuous system can be used.
上記の方法で製造されたポリアミドは、加熱重縮合後に更に固相重合することができる。これにより、ポリアミドの分子量を高くすることができる。固相重合は、通常１００℃以上、好ましくは１２０℃以上、更に好ましくは１５０℃以上、また、通常ポリアミドの融点以下の温度で、真空中、あるいは不活性ガス中で加熱することにより行うことができる。 The polyamide produced by the above method can be further subjected to solid phase polymerization after heat polycondensation. Thereby, the molecular weight of polyamide can be increased. The solid phase polymerization is usually carried out by heating in a vacuum or in an inert gas at a temperature of usually 100 ° C. or higher, preferably 120 ° C. or higher, more preferably 150 ° C. or higher, and usually not higher than the melting point of polyamide. it can.
（ポリアミドの物性）
本発明のポリアミドの重合度には制限はないが、硫酸溶液（０．０１ｇ／ｍｌ、２５℃）に対する相対粘度が、好ましくは１．５以上、さらに好ましくは２．０以上、また、好ましくは８．０以下、さらに好ましくは５．５以下になるように重合度を調整することが好ましい。相対粘度が上記範囲を下回ると、実用的強度が不足する可能性がある。一方、上回ると、流動性が低下し、成形加工性が損なわれる可能性がある。
また、成形性の観点から、フィルム、繊維、モノフィラメント等を押出成形をする場合、上記相対粘度が３．０以上、５．５以下が特に好ましく、射出成形する場合、上記相対粘度が２．０以上、３．５以下が特に好ましい。
(Physical properties of polyamide)
The degree of polymerization of the polyamide of the present invention is not limited, but the relative viscosity with respect to a sulfuric acid solution (0.01 g / ml, 25 ° C.) is preferably 1.5 or more, more preferably 2.0 or more, and preferably It is preferable to adjust the degree of polymerization so that it is 8.0 or less, more preferably 5.5 or less. When the relative viscosity is below the above range, the practical strength may be insufficient. On the other hand, when it exceeds, fluidity | liquidity falls and molding processability may be impaired.
Also, from the viewpoint of moldability, when extruding films, fibers, monofilaments, etc., the relative viscosity is particularly preferably 3.0 or more and 5.5 or less, and when injection molding, the relative viscosity is 2.0. As mentioned above, 3.5 or less is especially preferable.
本発明のポリアミドの数平均重合度は、通常９５以上、好ましくは９８以上、更に好ましくは１００以上である。この範囲を下回ると、ポリアミドを用いた製品の強度が低下する可能性がある。 The number average degree of polymerization of the polyamide of the present invention is usually 95 or higher, preferably 98 or higher, more preferably 100 or higher. Below this range, the strength of the product using polyamide may be reduced.
（添加剤）
本発明のポリアミドには、本発明の効果を著しく損なわない範囲で、その他の成分を混合してもよい。
例えば、酸化防止剤や熱安定剤（ヒンダードフェノール系、ヒドロキノン系、ホスファイト系およびこれらの置換体、ハロゲン化銅、ヨウ素化合物等）、耐候剤（レゾルシノール系、サリシレート系、ベンゾトリアゾール系、ベンゾフェノン系、ヒンダードアミン系等）、離型剤及び滑剤（脂肪族アルコール、脂肪族アミド、脂肪族ビスアミド、ビス尿素及びポリエチレンワックス等）、顔料（硫化カドミウム、フタロシアニン、カーボンブラック等）、染料（ニグロシン、アニリンブラック等）、可塑剤（ｐ−オキシ安息香酸オクチル、Ｎ−ブチルベンゼンスルホンアミド等）、帯電防止剤（アルキルサルフェート型アニオン系帯電防止剤、４級アンモニウム塩型カチオン系帯電防止剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレートのような非イオン系帯電防止剤、ベタイン系両性帯電防止剤等）、難燃剤（メラミンシアヌレート、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム等の水酸化物、ポリリン酸アンモニウム、臭素化ポリスチレン、臭素化ポリフェニレンオキシド、臭素化ポリカーボネート、臭素化エポキシ樹脂あるいはこれらの臭素系難燃剤と三酸化アンチモンとの組み合わせ等）、他の重合体（他のポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンスルフィド、液晶ポリマー、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ＡＢＳ樹脂、ＳＡＮ樹脂、ポリスチレン等）、等を混合することができる。
(Additive)
The polyamide of the present invention may be mixed with other components as long as the effects of the present invention are not significantly impaired.
For example, antioxidants and heat stabilizers (hindered phenols, hydroquinones, phosphites and their substitutes, copper halides, iodine compounds, etc.), weathering agents (resorcinols, salicylates, benzotriazoles, benzophenones) , Hindered amines, etc.), mold release agents and lubricants (aliphatic alcohols, aliphatic amides, aliphatic bisamides, bisureas, polyethylene waxes, etc.), pigments (cadmium sulfide, phthalocyanine, carbon black, etc.), dyes (nigrosine, aniline) Black, etc.), plasticizers (octyl p-oxybenzoate, N-butylbenzenesulfonamide, etc.), antistatic agents (alkyl sulfate type anionic antistatic agents, quaternary ammonium salt type cationic antistatic agents, polyoxyethylene Of sorbitan monostearate Non-ionic antistatic agents, betaine amphoteric antistatic agents, etc.), flame retardants (hydramines such as melamine cyanurate, magnesium hydroxide, aluminum hydroxide, ammonium polyphosphate, brominated polystyrene, brominated polyphenylene oxide, Brominated polycarbonate, brominated epoxy resin or combinations of these brominated flame retardants and antimony trioxide), other polymers (other polyamides, polyethylene, polypropylene, polyester, polycarbonate, polyphenylene ether, polyphenylene sulfide, liquid crystal polymer) , Polysulfone, polyethersulfone, ABS resin, SAN resin, polystyrene, etc.) can be mixed.
添加剤は、樹脂の重合から成形までの任意の段階で混合することができるが、ドライブレンド、あるいは押出機を用いて溶融混練するのが好ましい。 The additive can be mixed at any stage from polymerization of the resin to molding, but is preferably melt blended using dry blending or an extruder.
また、本発明のポリアミドをフィルム用途に用いる場合には、滑り性向上のため、タルク、カオリン、焼成カオリン、シリカ、ゼオライトなどの無機フィラー、特に微粒子状の無機フィラーの配合が好ましい。更に好ましくは無機フィラーと離型剤および／または滑剤とを併用する態様が挙げられる。無機フィラーの配合量としては、本発明のポリアミド１００重量部当り０．００５重量部以上、０．１重量部以下が好ましく用いられる。また、離型剤および／または滑剤の配合量としては、本発明のポリアミド１００重量部当たり０．０１重量部以上、０．５重量部以下が好ましく用いられる。 In addition, when the polyamide of the present invention is used for a film, an inorganic filler such as talc, kaolin, calcined kaolin, silica, zeolite, etc., particularly a fine inorganic filler is preferably used for improving slipperiness. More preferably, the aspect which uses together an inorganic filler, a mold release agent, and / or a lubricant is mentioned. The blending amount of the inorganic filler is preferably 0.005 part by weight or more and 0.1 part by weight or less per 100 parts by weight of the polyamide of the present invention. Moreover, as a compounding quantity of a mold release agent and / or a lubricant, 0.01 weight part or more and 0.5 weight part or less are preferably used per 100 weight part of polyamides of this invention.
（ポリアミドの形成）
本発明のポリアミドは、射出成形、フィルム成形、溶融紡糸、ブロー成形、真空成形などの任意の成形方法により、所望の形状に成形することができる。例えば、射出成形品、フィルム、シート、フィラメント、テーパードフィラメント、繊維、等にすることができる。また、本発明のポリアミドは接着剤、塗料などにも使用することができる。
(Formation of polyamide)
The polyamide of the present invention can be molded into a desired shape by any molding method such as injection molding, film molding, melt spinning, blow molding or vacuum molding. For example, it can be an injection molded product, a film, a sheet, a filament, a tapered filament, a fiber, or the like. The polyamide of the present invention can also be used for adhesives, paints and the like.
本発明のポリアミドのフィルムは公知の方法で成形することができる。たとえば、ポリアミドに離型剤や滑剤等をドライブレンドしたポリアミド組成物の溶融体を連続的にＴ−ダイより押出し、キャスティングロールにて冷却しながらフィルム状に成形するＴ−ダイ法、環状のダイスより連続的に押出し、水を接触させて冷却する水冷インフレーション法、同じく環状のダイスより押出し、空気によって冷却する空冷インフレーション法などが用いられる。また、これらの成形法で他の材料を同時に押し出す共押出法で多層のフィルムを得ることもできる。 The polyamide film of the present invention can be formed by a known method. For example, a T-die method in which a melt of a polyamide composition obtained by dry blending a release agent, a lubricant, or the like with polyamide is continuously extruded from a T-die and formed into a film while being cooled by a casting roll, an annular die For example, a water-cooled inflation method in which water is extruded continuously and cooled by contact with water, or an air-cooled inflation method in which the material is extruded from an annular die and cooled by air is used. Moreover, a multilayer film can also be obtained by a coextrusion method in which other materials are simultaneously extruded by these molding methods.
また、必要に応じて一軸または二軸延伸フィルムとして使用することも可能である。延伸方法についても公知の方法が応用でき、例えば、Ｔ−ダイ法にて成形したフィルムについては縦延伸（一軸延伸）はロール方式を用い、さらに横方向に延伸する際にはテンター方式を使用した逐次二延伸法、環状ダイより成形したチューブ状フィルムについては上記の逐次二軸法以外に縦横同時に延伸できるチューブラー延伸法が用いられる。共押出しフィルムについても同様の方法で各層を同時に延伸（共延伸）することができる。尚、延伸倍率は縦方向、横方向とも通常２以上、また、通常４倍以下、好ましくは３．５倍以下である。 Moreover, it is also possible to use as a uniaxial or biaxially stretched film as needed. As a stretching method, a known method can be applied. For example, a film formed by a T-die method uses a roll method for longitudinal stretching (uniaxial stretching), and a tenter method for further stretching in the transverse direction. For the tubular film formed from the successive bi-stretching method and the annular die, a tubular stretching method capable of simultaneously stretching in the vertical and horizontal directions is used in addition to the above-described sequential biaxial method. Each layer can be stretched (co-stretched) at the same time by the same method for the coextruded film. The stretching ratio is usually 2 or more in both the longitudinal direction and the transverse direction, and usually 4 times or less, preferably 3.5 times or less.
このときのポリアミドのフィルムの厚みは、好ましくは１μｍ以上、また、好ましくは７０μｍ以下である。１μｍを下回ると強度が不充分になる傾向があり、７０μｍを上回ると繰り返し屈曲疲労性が低下する傾向がある。また、ポリアミドのフィルムがポリアミド単層フィルムである場合、上記フィルムの厚みは、５μｍ以上がより好ましく、１０μｍ以上が更に好ましく、また、５０μｍ以下がより好ましく、３０μｍ以下が更に好ましい。一方、ポリアミドのフィルムが多層フィルムである場合、ポリアミド層としての厚みは、２μｍ以上がより好ましく、５μｍ以上が更に好ましく、また、５０μｍ以下がより好ましく、３０μｍ以下が更に好ましい。 The thickness of the polyamide film at this time is preferably 1 μm or more, and preferably 70 μm or less. When the thickness is less than 1 μm, the strength tends to be insufficient, and when the thickness is more than 70 μm, the bending fatigue resistance tends to decrease. When the polyamide film is a polyamide single layer film, the thickness of the film is more preferably 5 μm or more, further preferably 10 μm or more, more preferably 50 μm or less, and further preferably 30 μm or less. On the other hand, when the polyamide film is a multilayer film, the thickness of the polyamide layer is more preferably 2 μm or more, further preferably 5 μm or more, more preferably 50 μm or less, and further preferably 30 μm or less.
本発明のポリアミドのフィルムは、印刷性の改良や、ラミネート性（接着性）の改良のために片面、または両面にコロナ処理した後使用することもできる。 The polyamide film of the present invention can also be used after corona treatment on one side or both sides in order to improve printability and laminate properties (adhesiveness).
本発明のポリアミドを用いた射出成形品は、射出成形方法により所望の形状に成形を行うことによって得られる。 An injection molded product using the polyamide of the present invention is obtained by molding into a desired shape by an injection molding method.
＜５−３．ポリアミドの用途＞
本発明のポリアミドの具体的な用途例としては、自動車・車両関連部品として、インテークマニホールド、ヒンジ付きクリップ（ヒンジ付き成形品）、結束バンド、レゾネーター、エアークリーナー、エンジンカバー、ロッカーカバー、シリンダーヘッドカバー、タイミングベルトカバー、ガソリンタンク、ガソリンサブタンク、ラジエータータンク、インタークーラータンク、オイルリザーバータンク、オイルパン、電動パワステギヤ、オイルストレーナー、キャニスター、エンジンマウント、ジャンクションブロック、リレーブロック、コネクター、コルゲートチューブ、プロテクター等の自動車用アンダーフード部品、ドアハンドル、フェンダー、フードバルジ、ルーフレールレグ、ドアミラーステー、バンパー、スポイラー、ホイールカバー等の自動車用外装部品、カップホルダー、コンソールボックス、アクセルペダル、クラッチペダル、シフトレバー台座、シフトレバーノブ等の自動車用内装部品が挙げられる。
<5-3. Uses of polyamide>
Specific examples of applications of the polyamide of the present invention include automobile manifolds, vehicle-related parts, intake manifolds, hinged clips (molded products with hinges), binding bands, resonators, air cleaners, engine covers, rocker covers, cylinder head covers, Timing belt covers, gasoline tanks, gasoline sub tanks, radiator tanks, intercooler tanks, oil reservoir tanks, oil pans, electric power steering gears, oil strainers, canisters, engine mounts, junction blocks, relay blocks, connectors, corrugated tubes, protectors, etc. Underhood parts, door handles, fenders, hood bulges, roof rail legs, door mirror stays, bumpers, spoilers, wheels Automobile exterior parts such as a cover, cup holders, console boxes, accelerator pedals, clutch pedals, shift lever pedestals, automobile interior parts such as a shift lever knob and the like.
さらに、本発明のポリアミドは、釣り糸、漁網などの漁業関連資材、スイッチ類、超小型スライドスイッチ、ＤＩＰスイッチ、スイッチのハウジング、ランプソケット、結束バンド、コネクタ、コネクタのハウジング、コネクタのシェル、ＩＣソケット類、コイルボビン、ボビンカバー、リレー、リレーボックス、コンデンサーケース、モーターの内部部品、小型モーターケース、ギヤ・カム、ダンシングプーリー、スペーサー、インシュレーター、キャスター、端子台、電動工具のハウジング、スターターの絶縁部分、ヒューズボックス、ターミナルのハウジング、ベアリングリテーナー、スピーカー振動板、耐熱容器、電子レンジ部品、炊飯器部品、プリンタリボンガイド等に代表される電気・電子関連部品、家庭・事務電気製品部品、コンピューター関連部品、ファクシミリ・複写機関連部品、機械関連部品など各種用途に使用することができる。 Further, the polyamide of the present invention includes fishing line, fishing net and other fishery-related materials, switches, ultra-small slide switches, DIP switches, switch housings, lamp sockets, cable ties, connectors, connector housings, connector shells, IC sockets. Type, coil bobbin, bobbin cover, relay, relay box, condenser case, motor internal parts, small motor case, gear cam, dancing pulley, spacer, insulator, caster, terminal block, electric tool housing, starter insulation, Fuse box, terminal housing, bearing retainer, speaker diaphragm, heat-resistant container, microwave oven parts, rice cooker parts, electrical / electronic related parts such as printer ribbon guides, home / office electrical product parts, Computer over related parts, facsimile-copier-related parts, can be used in various applications such as mechanical related parts.
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に限定されるものではではない。 EXAMPLES The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these descriptions.
実施例及び比較例で使用したカダベリン・アジピン酸水溶液（カダベリン塩溶液）は、リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）増幅株を用い、リジン・アジピン酸塩を原料として調製した。リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）増幅株の作製手順と、それを用いたカダベリン・アジピン酸水溶液の調製手順について、以下に詳述する。 The cadaverine / adipic acid aqueous solution (cadaverine salt solution) used in Examples and Comparative Examples was prepared using a lysine decarboxylase gene (cadA) amplification strain and lysine / adipate as a raw material. A procedure for preparing a lysine decarboxylase gene (cadA) amplified strain and a procedure for preparing a cadaverine-adipic acid aqueous solution using the same will be described in detail below.
［実施例１］
（１）リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）増強株の作製：
図１は、リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）を組み込んだプラスミドｐＣＡＤ１の構築手順の概要を示す図である。具体的には、以下に説明する手順により行なった。
[Example 1]
(1) Production of lysine decarboxylase gene (cadA) -enhanced strain:
FIG. 1 is a diagram showing an outline of a procedure for constructing a plasmid pCAD1 incorporating a lysine decarboxylase gene (cadA). Specifically, the procedure described below was performed.
（Ａ）大腸菌ＤＮＡ抽出：
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を、１０ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）水溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
(A) E. coli DNA extraction:
LB medium [Composition: Tryptone 10 g, yeast extract 5 g, sodium chloride (NaCl) 5 g dissolved in 1 L of distilled water] 10 mL of Escherichia coli JM109 strain was cultured until the late logarithmic growth phase, and the resulting cells Was suspended in 0.15 mL of a 10 mM NaCl / 20 mM Tris buffer (pH 8.0) / 1 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA · 2Na) aqueous solution containing 10 mg / mL lysozyme.
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。更にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。 Next, proteinase K was added to the suspension so that the final concentration was 100 μg / mL, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, sodium dodecyl sulfate was added to a final concentration of 0.5%, and the mixture was incubated at 50 ° C. for 6 hours for lysis. To this lysate, add an equal volume of phenol / chloroform solution, shake gently for 10 minutes at room temperature, and then centrifuge the whole volume (5000 × g, 20 minutes, 10-12 ° C.) to obtain the supernatant fraction. After separating and adding sodium acetate to 0.3M, 2 volumes of ethanol was added and mixed. The precipitate collected by centrifugation (15000 × g, 2 minutes) was washed with 70% ethanol and then air-dried. To the obtained DNA, 5 mL of 10 mM Tris buffer (pH 7.5) -1 mM EDTA · 2Na solution was added and left overnight at 4 ° C., and used as template DNA for subsequent PCR.
（Ｂ）ｃａｄＡのクローニング：
大腸菌ｃａｄＡの取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（GenBank Database Accession No.U00096）を基に設計した合成ＤＮＡ（下記の配列番号１及び配列番号２で表わされる配列からなるＤＮＡ）をプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行なった。
(B) Cloning of cadA:
E. coli cadA is obtained by using the DNA prepared in (A) above as a template, and a synthesis designed based on the gene sequence of the E. coli K12-MG1655 strain (GenBank Database Accession No. U00096) for which the entire genome sequence has been reported. This was performed by polymerase chain reaction (PCR) using DNA (DNA consisting of the sequences represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 below) as a primer.
・配列番号１：
ＧＴＴＧＣＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＧＣＴＧＡＴＧ
・配列番号２：
ＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡＡＧ
-SEQ ID NO: 1:
GTTGCGGTGTCTGCCTTCCATCGCGCTGATG
-SEQ ID NO: 2:
ACCAAGCTGATGGGGTGAGATAGGAGAGATGAGAG
なお、反応液は、鋳型ＤＮＡ１μＬ及びＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬに、各プライマーが０．３μＭ、ＭｇＳＯ4が１ｍＭ、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）が０．２５μＭとなるように、１倍濃度Ｐｆｘ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン社製）を加えて全量を２０μＬとすることにより調製した。 The reaction solution was 1 μL of template DNA and 0.2 μL of Platinum (registered trademark) Pfx DNA polymerase (manufactured by Invitrogen), each primer was 0.3 μM, MgSO 4 was 1 mM, and deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) was 0. It was prepared by adding a 1-fold concentration Pfx Amplification Buffer (manufactured by Invitrogen) to a total volume of 20 μL so as to be 25 μM.
また、反応温度条件としては、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製ＰＴＣ−２００）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２．５分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は１０分とした。 As a reaction temperature condition, a DNA thermal cycler (PTC-200 manufactured by MJ Research) was used, and a cycle consisting of 94 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 2.5 minutes was repeated 35 times. However, the heat retention at 94 ° C. in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 72 ° C. in the final cycle was 10 minutes.
ＰＣＲの終了後、増幅産物をエタノール沈殿により精製し、制限酵素ＫｐｎＩ及び制限酵素ＳｐｈＩで切断した。得られたＤＮＡ標品を、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離した後、臭化エチジウム染色を用いて可視化することにより、ｃａｄＡを含む約２．６ｋｂの断片を検出し、ＱＩＡ Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて目的ＤＮＡ断片の回収を行なった。 After completion of PCR, the amplified product was purified by ethanol precipitation and cleaved with restriction enzyme KpnI and restriction enzyme SphI. The obtained DNA preparation was separated by 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMCBioProducts) gel electrophoresis and then visualized using ethidium bromide staining, whereby a fragment of about 2.6 kb containing cadA. The target DNA fragment was recovered using QIA Quick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
回収したＤＮＡ断片を、大腸菌プラスミドベクターｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）を制限酵素ＫｐｎＩ及び制限酵素ＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリン、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）及び５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。 The recovered DNA fragment was mixed with a DNA fragment prepared by cleaving E. coli plasmid vector pUC18 (Takara Bio) with restriction enzymes KpnI and restriction enzyme SphI, and ligation kit ver. After ligation using 2 (manufactured by Takara Bio Inc.), Escherichia coli (JM109 strain) was transformed with the obtained plasmid DNA. The recombinant Escherichia coli thus obtained was smeared on an LB agar medium containing 50 μg / mL ampicillin, 0.2 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) and 50 μg / mL X-Gal.
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ及び制限酵素ＳｐｈＩで切断することにより、約２．５ｋｂの挿入断片が認められることを確認した。このプラスミドをｐＣＡＤ１と命名し、ｐＣＡＤ１を含む大腸菌株をＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１と命名した。 Clones that formed white colonies on this medium were subjected to liquid culture by a conventional method, and then plasmid DNA was purified. The obtained plasmid DNA was cleaved with restriction enzyme KpnI and restriction enzyme SphI, and it was confirmed that an inserted fragment of about 2.5 kb was observed. This plasmid was named pCAD1 and the E. coli strain containing pCAD1 was named JM109 / pCAD1.
（２）ｃａｄＡ増幅株の培養：
大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１をＬＢ培地で前培養した後、１０００ｍＬの培養液を９９Ｌの培地（ミーストＰ１Ｇ １０ｇ／Ｌ、ポリペプトンＮ ２０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、アンピシリンＮａ ５０ｍｇ／Ｌ）が入った２００Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、通気量２５０ｍｌ／分、３５℃、７００ｒｐｍで通気攪拌培養を行なった。１５時間培養後、培養液全量を３ｍ3の培地（ミーストＰ１Ｇ １０ｇ／Ｌ、ポリペプトンＮ２０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、アンピシリンＮａ ５０ｍｇ／Ｌ）が入った５ｍ3容タンクに接種して更に培養を行なった。５ｍ3ジャーでの培養条件は、通気量０．５ｖｖｍ、３５℃、Ａｇｉｔ：１００ｒｐｍであった。培養４時間目に、３００ｇのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を５Ｌの水に溶解した後、フィルターを通して加えた。その後２１時間培養を続けた。
(2) Culture of cadA amplified strain:
E. coli strain JM109 / pCAD1 was precultured in LB medium, and then 1000 mL of the culture solution was added to 99 L of medium (Mist P1G 10 g / L, Polypeptone N 20 g / L, NaCl 10 g / L, Ampicillin Na 50 mg / L). A jar fermenter was inoculated and aerated and agitated and cultured at an aeration rate of 250 ml / min at 35 ° C. and 700 rpm. After 15 h incubation, the medium of culture total amount 3m 3 (Meast P1G 10 g / L, polypeptone N20g / L, NaCl 10g / L , ampicillin Na 50 mg / L) Inoculated further cultured 5 m 3 capacity tank containing the I did it. The culture conditions in a 5 m 3 jar were an aeration rate of 0.5 vvm, 35 ° C., and Agit: 100 rpm. At 4 hours of culture, 300 g of IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) was dissolved in 5 L of water and then added through a filter. Thereafter, the culture was continued for 21 hours.
（３）菌体の分離：
６４００ｒｐｍ、フィード速度７５０Ｌ／ｈｒの条件下で、アルファラバル分離機により培養液からの菌体回収を行った。回収された菌体の湿重量は３６．９Ｋｇであった。この湿菌体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液１６０Ｌに懸濁したのち、１５０００ｒｐｍ、フィード速度１．０Ｌ／ｍｉｎの条件下でシャープレス遠心機により再度菌体回収を行ない、１８．７ｋｇの湿菌体を取得した。
(3) Separation of bacterial cells:
Under the conditions of 6400 rpm and a feed rate of 750 L / hr, the cells were collected from the culture solution using an Alfa Laval separator. The wet weight of the collected cells was 36.9 kg. After suspending the wet cells in 160 L of 10 mM sodium acetate solution, the cells were collected again with a sharp press centrifuge at 15000 rpm and a feed rate of 1.0 L / min, and 18.7 kg of wet cells were obtained. I got it.
（４）カダベリン・アジピン酸塩の製造：
５０重量体積％のリジン水溶液にｐＨが６．５となるようにアジピン酸スラリーを加え、リジン・アジピン酸塩溶液を調製し、基質溶液とした（リジン換算濃度１２５．０ｇ／Ｌ）。ピリドキサルリン酸を０．１ｍＭとなるように加えて反応液を調製し、これに大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１の菌体液（仕込み湿菌体濃度０．２８ｇ／Ｌ）を添加し、反応を開始した。反応は、５Ｌジャーファーメンターに３Ｌの反応液を仕込んで行なった。また、反応中に適宜、アジピン酸スラリーを反応液に添加することにより、反応液のｐＨを６．５となるように制御した。リジンセンサーでリジンの量をモニタリングし、反応の進行程度に従ってアジピン酸スラリーの添加量を徐々に少なくした。リジンの量が、リジンセンサーの検出限界以下になった後、さらに１６時間反応を続け、リジンのほぼ１００％がカダベリンに変換された（総消費リジン量３７０．８ｇ）。得られた反応液のｐＨは７．４５であった。得られた反応液を「実施例１のカダベリン・アジピン酸塩溶液」という。
(4) Production of cadaverine adipate:
An adipic acid slurry was added to a 50% by weight lysine aqueous solution so as to have a pH of 6.5 to prepare a lysine / adipate solution, which was used as a substrate solution (lysine conversion concentration 125.0 g / L). A reaction solution was prepared by adding pyridoxal phosphate to 0.1 mM, and a cell solution of E. coli strain JM109 / pCAD1 (prepared wet cell concentration 0.28 g / L) was added thereto to initiate the reaction. The reaction was performed by charging 3 L of the reaction solution into a 5 L jar fermenter. Moreover, the pH of the reaction solution was controlled to 6.5 by adding adipic acid slurry to the reaction solution as appropriate during the reaction. The amount of lysine was monitored with a lysine sensor, and the amount of adipic acid slurry added was gradually reduced according to the progress of the reaction. After the amount of lysine fell below the detection limit of the lysine sensor, the reaction was continued for another 16 hours, and almost 100% of the lysine was converted to cadaverine (total amount of lysine consumed: 370.8 g). The pH of the obtained reaction liquid was 7.45. The obtained reaction solution is referred to as “cadaverine adipate solution of Example 1”.
（５）カダベリン濃度のＨＰＬＣによる測定：
実施例１のカダベリン・アジピン酸塩溶液中のガダベリン濃度を、ＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography）によって測定した。このとき、カラムとしてはＬ−ｃｏｌｕｍｎ（化学物質評価機構、４．６×２５０ｍｍ）を４０℃で用いた。また、移動相としては１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとを７２：２８（容量比）で混合したものを用いて、流速１．０ｍＬ／分で展開した。検出は２４５ｎｍのＵＶで行なった。
(5) Measurement of cadaverine concentration by HPLC:
The gadaverine concentration in the cadaverine adipate solution of Example 1 was measured by HPLC (High performance liquid chromatography). At this time, L-column (Chemical Substance Evaluation Mechanism, 4.6 × 250 mm) was used at 40 ° C. as the column. Moreover, as a mobile phase, what mixed 10 mM ammonium acetate aqueous solution and acetonitrile by 72:28 (volume ratio) was developed at the flow rate of 1.0 mL / min. Detection was performed with UV at 245 nm.
測定をするにあたり、実施例１のカダベリン・アジピン酸塩溶液（測定サンプル）に、前処理を行なった。前処理は、キットとしてＡｃｃＱ・Ｆｌｕｏｒ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ウオーターズ、Ｐ／Ｎ：ＷＡＴＯ５２８８０）を用いて行なった。０．２ｍｇ／ｍＬ以下になるようにカダベリンの濃度を調整した測定サンプルの希釈水溶液１０μＬに、該キットのアクタグ１液７０μＬ、２Ａ液２０μＬを順次加え、５５℃で１０分加熱した。前処理した測定サンプルを、そのままＨＰＬＣに１０μＬ注入して測定を行なった。
In the measurement, the cadaverine adipate solution (measurement sample) of Example 1 was pretreated. The pretreatment was performed using AccQ Fluor Reagent Kit (Waters, P / N: WATO52880) as a kit. 70 μL of the
（６）アジピン酸濃度のＨＰＬＣによる測定：
実施例１のカダベリン・アジピン酸塩溶液中のアジピン酸濃度を、ＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography）によって測定した。測定には、カラムとしてＵＬＴＲＯＮ ＰＳ−８０Ｈ（信和化学工業社製、８．０×３００ｍｍ）を６０℃で用いた。また、移動相としては１０ｍＭ過塩素酸水溶液を用いて、流速１．０ｍＬ／分で展開した。検出はＲＩで行った。測定は、実施例１のカダベリン・アジピン酸塩溶液のサンプルを、１００倍希釈してＨＰＬＣに１０μＬ注入して行った。
(6) Determination of adipic acid concentration by HPLC:
The adipic acid concentration in the cadaverine adipate solution of Example 1 was measured by HPLC (High performance liquid chromatography). For the measurement, ULTRON PS-80H (manufactured by Shinwa Chemical Industry Co., Ltd., 8.0 × 300 mm) was used as a column at 60 ° C. Moreover, 10 mM perchloric acid aqueous solution was used as a mobile phase, and it developed at a flow rate of 1.0 mL / min. Detection was performed by RI. The measurement was carried out by diluting the sample of the cadaverine / adipate solution of Example 1 100 times and injecting 10 μL of the sample into HPLC.
（７）保存試験：
実施例１のカダベリン・アジピン酸塩溶液１０ｍＬを、５０ｍｌコニカルチューブ（Becton Dickinson製）に入れ、２５℃の室内環境下で保存した。保存０日目（保存開始日）及び保存７日目に、分光光度計（日立製作所製Ｕ−３５００）を用いて、その吸光スペクトルを測定した。
(7) Storage test:
10 mL of the cadaverine adipate solution of Example 1 was placed in a 50 ml conical tube (manufactured by Becton Dickinson) and stored in an indoor environment at 25 ° C. The absorption spectrum was measured using a spectrophotometer (U-3500, manufactured by Hitachi, Ltd.) on the storage day 0 (storage start date) and storage day 7.
また、得られた吸光スペクトルから、下記式［１］により、波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化を求めた。
（波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化）
＝ （保存前後の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度の変化）
／（カダベリン・アジピン酸塩溶液中のカダベリンのモル濃度） ［１］
Moreover, the change of the average molar absorbance in wavelength 400-500 nm was calculated | required from the obtained absorption spectrum by following formula [1].
(Change in average molar absorbance at wavelengths of 400 to 500 nm)
= (Change in average absorbance at a wavelength of 400 to 500 nm before and after storage)
/ (Molar concentration of cadaverine in cadaverine adipate solution) [1]
なお、上記式［１］中、「保存前後の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度の変化」は、下記式［２］により求められる値である。
（保存前後の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度の変化）
＝ （保存７日目の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度）
− （保存０日目の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度） ［２］
In the above formula [1], “change in average absorbance at wavelengths of 400 to 500 nm before and after storage” is a value determined by the following formula [2].
(Change in average absorbance at a wavelength of 400 to 500 nm before and after storage)
= (Average absorbance at a wavelength of 400 to 500 nm on the seventh day of storage)
-(Average absorbance at
実施例１のカダベリン・アジピン酸塩溶液の波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化を、後述の表１に示す。また、実施例１のカダベリン・アジピン酸塩溶液の保存０日目及び保存７日目の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを図２に示す。 The change in average molar absorbance of the cadaverine / adipate solution of Example 1 at a wavelength of 400 to 500 nm is shown in Table 1 described later. Moreover, the absorption spectrum in the wavelength of 400-500 nm of the preservation | save 0th day and the preservation | save day 7 of the cadaverine adipate solution of Example 1 is shown in FIG.
［実施例２］
実施例１において、反応終了時における反応液のｐＨを７．６６にした以外は、実施例１と同様の手順により、カダベリン・アジピン酸塩溶液の製造、測定、保存試験等を行なった。得られたカダベリン・アジピン酸塩溶液（これを「実施例２のカダベリン・アジピン酸塩溶液」という。）のカダベリン濃度、アジピン酸濃度、平均モル吸光度の変化の結果を表１に示す。また、実施例２のカダベリン・アジピン酸塩溶液の保存０日目及び保存７日目の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを図３に示す。
[Example 2]
In Example 1, except that the pH of the reaction solution at the end of the reaction was 7.66, the production, measurement, storage test and the like of the cadaverine / adipate solution were performed by the same procedure as in Example 1. Table 1 shows the results of changes in the cadaverine concentration, adipic acid concentration, and average molar absorbance of the obtained cadaverine adipate solution (this is referred to as “cadaverine adipate solution of Example 2”). Moreover, the absorption spectrum in the wavelength of 400-500 nm of the preservation | save 0th day and the preservation | save 7th day of the cadaverine adipate solution of Example 2 is shown in FIG.
［実施例３］
実施例１において、反応開始時のリジン仕込み濃度を８８ｇ／Ｌ（リジン換算濃度）にして反応を行い、反応終了時における反応液のｐＨを８．０３にした以外は、実施例１と同様の手順により、カダベリン・アジピン酸塩溶液の製造、測定、保存試験等を行なった。得られたカダベリン・アジピン酸塩溶液（これを「実施例３のカダベリン・アジピン酸塩溶液」という。）のカダベリン濃度、アジピン酸濃度、平均モル吸光度の変化の結果を表１に示す。また、実施例３のカダベリン・アジピン酸塩溶液の保存０日目及び保存７日目の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを図４に示す。
[Example 3]
In Example 1, the reaction was carried out at a lysine charge concentration of 88 g / L (lysine conversion concentration) at the start of the reaction, and the pH of the reaction solution at the end of the reaction was adjusted to 8.03. According to the procedure, cadaverine / adipate solution was produced, measured, stored, and tested. Table 1 shows the results of changes in the cadaverine concentration, adipic acid concentration and average molar absorbance of the obtained cadaverine adipate solution (this is referred to as “cadaverine adipate solution of Example 3”). Moreover, the absorption spectrum in the wavelength of 400-500 nm of the preservation | save
［実施例４］
実施例１において、反応終了時における反応液のｐＨを８．３６にした以外は、実施例１と同様の手順により、カダベリン・アジピン酸塩溶液の製造、測定、保存試験等を行なった。得られたカダベリン・アジピン酸塩溶液（これを「実施例４のカダベリン・アジピン酸塩溶液」という。）のカダベリン濃度、アジピン酸濃度、平均モル吸光度の変化の結果を表１に示す。また、実施例４のカダベリン・アジピン酸塩溶液の保存０日目及び保存７日目の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを図５に示す。
[Example 4]
In Example 1, except that the pH of the reaction solution at the end of the reaction was 8.36, the production, measurement, storage test and the like of the cadaverine / adipate solution were performed by the same procedure as in Example 1. Table 1 shows the results of changes in cadaverine concentration, adipic acid concentration, and average molar absorbance of the obtained cadaverine adipate solution (this is referred to as “cadaverine adipate solution of Example 4”). Moreover, the absorption spectrum in wavelength 400-500nm of the preservation | save
［比較例１］
実施例１において、反応終了時における反応液のｐＨを７．１７にした以外は、実施例１と同様の手順により、カダベリン・アジピン酸塩溶液の製造、測定、保存試験等を行なった。得られたカダベリン・アジピン酸塩溶液（これを「比較例１のカダベリン・アジピン酸塩溶液」という。）のカダベリン濃度、アジピン酸濃度、平均モル吸光度の変化の結果を表１に示す。また、比較例１のカダベリン・アジピン酸塩溶液の保存０日目及び保存７日目の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを図６に示す。
[Comparative Example 1]
In Example 1, except that the pH of the reaction solution at the end of the reaction was 7.17, the production, measurement, storage test and the like of the cadaverine / adipate solution were performed by the same procedure as in Example 1. Table 1 shows the results of changes in the cadaverine concentration, adipic acid concentration, and average molar absorbance of the obtained cadaverine-adipate solution (this is referred to as “cadaverine-adipate solution of Comparative Example 1”). Moreover, the absorption spectrum in the wavelength of 400-500 nm of the preservation | save
［比較例２］
実施例１において、反応終了時における反応液のｐＨを６．９２にした以外は、実施例１と同様の手順により、カダベリン・アジピン酸塩溶液の製造、測定、保存試験等を行なった。得られたカダベリン・アジピン酸塩溶液（これを「比較例２のカダベリン・アジピン酸塩溶液」という。）のカダベリン濃度、アジピン酸濃度、平均モル吸光度の変化の結果を表１に示す。また、比較例２のカダベリン・アジピン酸塩溶液の保存０日目及び保存７日目の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを図７に示す。
[Comparative Example 2]
In Example 1, except that the pH of the reaction solution at the end of the reaction was 6.92, the production, measurement, storage test and the like of the cadaverine / adipate solution were performed by the same procedure as in Example 1. Table 1 shows the results of changes in the cadaverine concentration, adipic acid concentration, and average molar absorbance of the obtained cadaverine adipate solution (this is referred to as “cadaverine adipate solution of Comparative Example 2”). Moreover, the absorption spectrum in wavelength 400-500nm of the preservation | save
［比較例３］
実施例１において、反応開始時のリジン仕込み濃度を８８ｇ／Ｌ（リジン換算濃度）にして反応を行い、反応終了時における反応液のｐＨを６．５０にした以外は、実施例１と同様の手順により、カダベリン・アジピン酸塩溶液の製造、測定、保存試験等を行なった。得られたカダベリン・アジピン酸塩溶液（これを「比較例３のカダベリン・アジピン酸塩溶液」という。）のカダベリン濃度、アジピン酸濃度、平均モル吸光度の変化の結果を表１に示す。また、比較例３のカダベリン・アジピン酸塩溶液の保存０日目及び保存７日目の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを図８に示す。
[Comparative Example 3]
In Example 1, the reaction was carried out at a lysine charge concentration of 88 g / L (lysine conversion concentration) at the start of the reaction, and the pH of the reaction solution at the end of the reaction was changed to 6.50. According to the procedure, cadaverine / adipate solution was produced, measured, stored, and tested. Table 1 shows the results of changes in the cadaverine concentration, adipic acid concentration, and average molar absorbance of the obtained cadaverine-adipate solution (this is referred to as “cadaverine-adipate solution of Comparative Example 3”). Moreover, the absorption spectrum in wavelength 400-500nm of the preservation | save 0th day and the preservation | save day 7 of the cadaverine adipate solution of the comparative example 3 is shown in FIG.
［参考例］
ガダベリンとアジピン酸とを表２に記載の重量ずつ、水に溶解させて得られた水溶液のｐＨを、それぞれ測定した。結果を表２に示す。なお、表２中、物質量の値は、添加した重量から算出した値である。なお、そのときのグラフを図９及び図１０に示す。
[Reference example]
The pH of an aqueous solution obtained by dissolving gadaverine and adipic acid in water in the weights shown in Table 2 was measured. The results are shown in Table 2. In Table 2, the value of the substance amount is a value calculated from the added weight. In addition, the graph at that time is shown in FIG.9 and FIG.10.
［結果］
表１及び図２〜８の結果から、反応終了時の反応液をカダベリン過剰な状態とした実施例１〜４の方が、比較例１〜３と比べて、得られたカダベリン・アジピン酸塩溶液の保存時における着色が少なく、安定に保存できていることが分かる。
また、上記結果に加え、さらに表２及び図９〜１０の結果から、反応液のｐＨを測定することで、間接的にカダベリン塩溶液におけるカダベリンと酸との物質量の比を測定することが出来ることが分かる。
From the results of Table 1 and FIGS. 2 to 8, the cadaverine adipate obtained in Examples 1 to 4 in which the reaction solution at the end of the reaction was in an excess state of cadaverine was compared to Comparative Examples 1 to 3. It turns out that there is little coloring at the time of storage of a solution, and it can be stored stably.
In addition to the above results, from the results of Table 2 and FIGS. 9 to 10, the ratio of the substance amount of cadaverine and acid in the cadaverine salt solution can be indirectly measured by measuring the pH of the reaction solution. I understand that I can do it.
本発明を利用可能な分野は制限されず、カダベリン塩が用いられる任意の分野に利用することが可能であるが、特にナイロン等のポリアミドの製造分野において好適に用いられる。 The field in which the present invention can be used is not limited, and can be used in any field where cadaverine salts are used, but is particularly preferably used in the field of producing polyamides such as nylon.
Claims (6)
反応終了時における反応液を、カダベリン過剰な状態とする
ことを特徴とする、カダベリン塩の製造方法。 A method for producing a cadaverine salt by a decarboxylation reaction by allowing lysine decarboxylase to act on a solution in which lysine and an acid coexist,
A method for producing a cadaverine salt, characterized in that the reaction solution at the end of the reaction is in an excess state of cadaverine.
ことを特徴とする、請求項１記載のカダベリン塩の製造方法。 The method for producing a cadaverine salt according to claim 1, wherein the specified ratio of lysine to acid used by the end of the reaction is set to a value larger than 1.
ことを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載のカダベリン塩の製造方法。 The method for producing a cadaverine salt according to claim 1 or 2, wherein the pH of the reaction solution at the end of the reaction is higher than the pH at the neutralization point between cadaverine and acid.
ことを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載のカダベリン塩の製造方法。 The acid coexisting with lysine is one or more acids selected from the group consisting of hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, carbonic acid, carboxylic acid, phosphoric acid, and sulfonic acid. A method for producing a cadaverine salt according to claim 1.
ことを特徴とする、ポリアミドの製造方法。 A method for producing a polyamide, comprising a step of polycondensing the cadaverine salt obtained by the production method according to claim 1.
ことを特徴とする、ポリアミド。 A polyamide obtained by the production method according to claim 5.
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| JP2010031266A (en) * | 2008-06-30 | 2010-02-12 | Toray Ind Inc | Polyamide resin, polyamide resin composition and molded article of those |
| KR101873541B1 (en) * | 2016-01-28 | 2018-07-04 | 건국대학교 산학협력단 | A Method for continuedly production of large volume cadaverine using immobilized carrier and lysine decarboxylase―overexpressing recombinant E.coli |
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