JP2008017853A - 分析物の検出、定量及び増幅のための新規な組成物および方法 - Google Patents

分析物の検出、定量及び増幅のための新規な組成物および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】分析物の検出、定量及び増幅用の新規の組成物および方法を得る。
【解決手段】分析物の核酸アレイおよびライブラリーをこのような組成物および方法に有用に組入れる。ユニバーサルディテクションエレメントおよびシグナル伝達体などを使用して分析物を検出し、必要であるか所望する場合、更に定量する。ターゲット分析物の増幅もまた、本発明の組成物および方法によってもたらされる。
【選択図】図１

Description

発明の利用分野
本発明は、分析物の検出、定量および増幅の分野に関し、これらを目的とする組成物および方法に関する。
本出願で引用または同定した全ての特許、特許出願、特許公報、科学文献などは、本発明が属する技術状況をより完全に説明するためにその全体が本明細書中で参考文献として加えられる。
発明の背景
ＲＮＡの発現を定量化することで、細胞の代謝、機能、成長、および相互作用の分析に対する大きな洞察が得られる。個々のＲＮＡ種は歴史的にこれらの研究の主題となってきたにもかかわらず、既知の機能および未知の機能双方を有するの多数のＲＮＡ種の同時発現パターンの分析に、より多くの関心が示されている。このアプローチにより、異なる細胞集団間の発現パターンに関する比較研究が可能となり、これにより、これらの集団内で生じる生化学的活性の差異の指標としての役目を果たす。例えば、細胞の１つのグループを２つまたはそれ以上の群に分け、１つの群はコントロールとしての役目を果たし、他の部分を薬物、代謝生成物、または異なる物理的条件に曝す。この方法では、種々のｍＲＮＡ種の大多数では、発現レベルにほとんど或いは全く差がなく、ある特定のｍＲＮＡ種は、未処理または正規のコントロールと比較して発現レベルが劇的に増加するか減少する。
例として、ホルボールエステル（ＰＭＡ）の適用により、インビトロで増殖する哺乳動物細胞の多数の特徴が変化することが長い間知られている。ロックハート（Ｌｏｃｋｈａｒｔ）等が（１９９６、ネイチャーバイオテクノロジー、１４、１６７５〜１６８０で）報告したの実験では、培養物中で成長した細胞を、ＰＭＡに曝し、種々の期間後にｍＲＮＡを抽出し、これを使用してラベルしたプローブのライブラリーを作製した。次いで、この物質を様々なｍＲＮＡ配列に相補的な核酸アレイとハイブリダイズした。種々の細胞サイトカインの誘導のタイミングおよび誘導の量の双方において有意な変化が認められた。一方、いわゆる「ハウスキーピング」遺伝子（アクチンおよびＧＡＰＤＨなど）は、この処理により本質的に影響を受けなかった。この例は、種々のｍＲＮＡを個別にモニターして、特定の遺伝子が処理の影響を受け得るかを同定することができることを実証している。
細胞集団間の自然な差異もまた検証することができる。例えば、細胞のサイクルを介して細胞が進行する際、種々の遺伝子の発現レベルの差異を観察することができる（チョー（Ｃｈｏ）等、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２、６５〜７３およびスピールマン（Ｓｐｅｌｌｍａｎ）、１９９８、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、９５、１４８６３〜１４８６８）。これらの研究によって作成された遺伝子発現プロフィールにより、細胞周期関連蛋白質をエンコードするように既に特徴づけされている遺伝子で発現の有意な差異が認められた場合に、このアプローチが実証された。加えて、これらの研究で使用したアレイは、研究中の酵母の全遺伝子に相補的である核酸の配列から構成されるものであった。このように、これらの研究の１つの結果は、細胞周期に依存する発現を示す以前は未知であった機能を有する多数の遺伝子を観測したことである。他の更なる従来の方法により、これら特定遺伝子を再実験することにより、これらの遺伝子は細胞周期の進行に関連することが実証された。したがって、この方法は、異なる発現として既に公知の遺伝子を認識すると供に、新規の遺伝子を同定する能力のあることが実証された。
正常な細胞と形質転換された細胞との間の差異もまた、長い間興味がもたれている主題である。正常な細胞と比較して過剰に発現されるか或いは過小に発現されるかのいずれかである特定遺伝子の性質は、癌細胞の発生、進行、または治療についての情報を提供するかもしれない。アレイ分析は、正常な細胞由来の発現と比較して腫瘍由来細胞から得たＲＮＡを使用することで行われてきた。ぺロウ（Ｐｅｒｏｕ）等（１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、９２１２〜９２１７）による１つの研究において、ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）を、原発性乳癌由来の検体と比較した。この研究に含まれるものは、種々の細胞因子に対する反応ならびにコントロール培養物中での融合または老化の結果であった。これらの全ては、癌状態への細胞の形質転換に関連するか、或いは影響され得る因子である。このタイプの研究で得たデータの量は、その複雑さの点で圧倒されるほどのものであった。しかし、検体に関連する因子と相関する識別できる発現パターンまたはクラスターが観測され得る。他の腫瘍型およびこれらの非形質転換均等物の発現からデータを収集する場合、更なる理解が得られる。
アレイを使用する発現の研究の全てにおいて２つの識別できるエレメントが存在する。第１のエレメントは、分析中のｍＲＮＡ由来のラベルされた物質に結合するか捕獲するために使用するプローブバンクの調製に関する。これらアレイの目的は、個々の多数のプローブを提供することにあり、ここで各プローブは空間的に定められた分離した或いは孤立した位置に配置されている。サンプルのハイブリダイゼーションを行った後、各部位でサンプルの個々の量を測定して、その部位に位置する個々のプローブに対し相同性を示す物質がサンプル中にどの程度存在するかを相対的に測定する。最も一般的に使用されている２つのアレイ構築法は、２つの非常に異なるスケールを操作してアレイを合成する。
最も簡単なレベルの構築では、インクジェットプリンターで使用される方法と非常に類似した方法で、ガラススライドまたはナイロンメンブランのような固体マトリックスに、はっきり分離して核酸を固定する（例えば、オカモト等、２０００、ネイチャーバイオテクノロジー、１８、４３８〜４４１を参照のこと）。マトリックスに堆積したプローブの実体は、小さな合成オリゴヌクレオチドからクローン由来の大きな核酸セグメントに至る範囲であり得る。アレイアッセンブリのこの形態で使用されるクローン化セグメントの調製物は、溶解してマトリックスに直接固定されている各クローンを含むイー.コリのコロニーから、ＰＣＲ増幅された物質の調製用のテンプレートとしての個々のプラスミドを使用するより精巧なものであってもよい。核酸生成物の純度が高いので、後者の方法が好ましい。アッセンブリに使用する特定のプローブの選択は、機能および配列が知られているという見地で決定してもよい。人工的に合成すべきであるので、オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、このことは勿論常に正しい。一方、プローブがＤＮＡの大きなクローン化セグメントに由来する場合、配列または機能の知識とは関係なく使用することができる。例えば、先に引用した研究では、細胞周期進行中の異なる発現に際し酵母の全ゲノムを示すプローブバンクを使用していた。ヒト配列については、ヒト配列決定計画の急速な発展により配列情報が増加し、この情報は一定の割合で拡大中である。したがって、ヒト転写生成物の検出に使用することができるプローブのポピュラーな供給源は、エクスプレスドシーケンスタグ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ）（ＥＳＴｓ）であった。（アダムス（Ａｄａｍｓ）等、１９９１、サイエンス、２５２、１６５１〜１６５６）。未知の機能を有する配列の使用は、比較研究おける反応に関する任意の先験的推測が欠如している点が有利であり、事実、それ自体の研究を機能性の同定に役立てることができる。現在、種々のヒト組織、発育段階、および病状に基づく発現の分析のためのフィルターおよびガラスアレイは多数の供給元から市販されている。一方、カスタムアレイの作製法が文献およびインターネットによって普及している。
複雑さの秤の他端にあるのもは、マイクロ回路のエッチングで使用されるものと類似の「マスキング」技術を使用して固体マトリックス上で直接オリゴヌクレオチドの本来の合成を行う方法である（ピルング（Ｐｉｒｒｕｎｇ）等、米国特許第５，１４３，８５４号（本明細書中で参考文献として加える））。非常に小さなマイクロスケールでこの方法を行うので、非常に多数の異なるプローブを高密度アレイとしての１つの「バイオチップ」上に貼り付けることができる。しかし、この方法は部位固有の合成に依存するため、オリゴヌクレオチドのみを使用し、必然的にプローブのサイズが限られる。また、直接の配列の合成を使用するので、配列情報は各プローブにとって利用可能でなければならない。このシステムの利点は、ある１つの固有の遺伝子生成物に対し１つのプローブを使用する代わりに、異なるセグメントからの多数のプローブを合成してアレイの設計に組込むことができる点である。これにより情報が冗長するので、特定の転写レベルの変化が、１つまたはそれ以上の類似の配列を有する転写生成物によるよりもむしろ、意図するターゲットにおけるゆらぎが原因であることが証明される。これらの「バイオチップ」ならびにこれの読み出しに必要なハードウェアおよびソフトウェアは市販されている。
核酸の固定には一般にプラスチックおよびガラスなどの固体支持体が使用されているが、多孔質物質もまた使用されている。例えば、オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミド中のアルデヒド基に結合し（イェルショフ（Ｙｅｒｓｈｏｖ）等、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、４９１３〜４９１８）およびアガロースに結合（アファンアシブ（Ａｆａｎａｓｓｉｅｖ）等、２０００、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８、ｅ６６）して、ハイブリダイゼーションアッセイで使用するアレイを合成していた。
アレイ分析に関連する第２のエレメントは、アレイの種々のプローブに結合するラベルされた核酸の存在および量を検出する手段である。シグナルを発生することができる３つの使用レベルのターゲットｍＲＮＡが存在する。第１のアプローチでは、天然のＲＮＡ自体をラベルすることができる。これは、断片化ＲＮＡのリン酸化およびその後のＴ４ ＲＮＡリガーゼ媒介しての５´末端へのビオチン化オリゴマーの付加によって酵素を使用して行われていた（ロックハート（Ｌｏｃｋｈａｒｔ）等、１９９６）。この方法は、ラベルのＲＮＡへの適切な結合を確認するために一晩インキュベーションを行う必要があるという制約がある。ＲＮＡの化学的標識（ラベル）付けのために、フラグメントをビオチンに連結されたソラレンでラベルする（標識付けする）ことができる（ロックハート（Ｌｏｃｋｈａｒｔ）等、１９９６）。この方法は、ＲＮＡにラベルを結合する架橋結合により、ターゲットの分子のストランド内架橋結合を行うことで、ハイブリダイズすることが可能な物質の量が減少するとういう欠点がある。
第２のアプローチでは、転写生成物自体のラベル付けよりもむしろ、ＲＮＡをテンプレートとして使用してランダムプライマーまたはオリゴｄＴプライマーのいずれかの使用によってｃＤＮＡコピーを合成する。逆転写酵素によるプライマーの伸長を、修飾されたヌクレオチドの存在下で行うことにより、全ての未完成ｃＤＮＡコピーをラベルすることができる。修飾されたヌクレオチドは、自身で信号を発生する付着した部分を有してもよく、或いは信号を発生することができる他の部分の結合に適切な部分を有してもよい。直接的信号発生に使用されている基の例は、放射性化合物および蛍光化合物（フルオレセイン、テキサスレッド、Ｃｙ３、およびＣｙ５等）である。直接的信号発生は単純であるという利点を有するが、多くの場合、ポリメラーゼによるラベルされたヌクレオチドの組込み効率が減少するという制約がある。アレイ中の直接的信号発生に使用されている基の例は、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）リガンドまたはビオチンリガンドである。これらの存在は、後に、これらリガンドに親和性を示すラベルされた分子を使用して検出する。アビジンまたはストレプアビジンはビオチン部分に特異的に結合し、ＤＮＰまたはビオチンに特異的な抗体を使用することができる。これらの蛋白質自体をラベルするか、あるいは、ラベルされた化合物との二次的結合のためのターゲット（標的）として使用することができる。これに代えて、ラベルされたヌクレオチドがアリルアミン修飾などの化学的に活性な置換基を含む場合、適切にラベルしたエステルを化学的に付加することで、合成後に修飾を行ってもよい。
ｍＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡコピーの合成により、ラベルされた生成物と出発物質との比が基本的には１：１のモル比になる。ある場合には、分析されるｍＲＮＡの量が制限され、これらの場合、サンプル中の核酸配列が幾らか増幅されることが望ましい。これが第３のアプローチの使用につながり、オリジナルのｍＲＮＡテンプレート由来のｃＤＮＡコピー自体をさらなる合成用のテンプレートとして使用する。ある１つのターゲット固有のオリゴヌクレオチドを使用してｃＤＮＡコピーを作製し、第２のターゲット固有のオリゴヌクレオチドを使用してシングルストランドＤＮＡをダブルストランド形態に変換する「転写増幅システム」（ＴＡＳ）と呼ばれるシステムが記載された（クオーＤ．Ｙ．（Ｋｗｏｈ， Ｄ．Ｙ．）及び ジンジャーズＴ．Ｒ.（Ｇｉｎｇｅｒａｓ，Ｔ．Ｒ．）、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８６、１１７３〜１１７７）。第１のオリゴヌクレオチド中にＴ７プロモーター配列が含まれることで、ダブルストランド分子を使用して、意図したオリジナルｍＲＮＡに相補的な多数の転写生成物を生成することができる。このシステムの目的は、種々のＲＮＡ種プールに基づくある１つの孤立した配列の増幅である。この研究には、汎用増幅を目的とする孤立していないプライマー配列を使用するこのような系の示唆またはその価値の認識は述べられていない。
オリジナルのＲＮＡ集団に対する相同性を有する多数のＲＮＡ転写コピーが、バンゲルダー（ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒ）等の米国特許第５，８９１，６３６号に開示されている。ここで、このようなシステムを利用するのに、この特定の参照文献が与えられ、孤立した配列に加えて種々の遺伝子生成物のライブラリーを作成する。それぞれのｍＲＮＡ分子は究極的には多数の相補的転写物の供給源である可能性を有するので、このシステムは、オリジナルのｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡコピーの直接的なラベル付けと比較して必要な出発材料の量が少なくてすむ線形増幅の利点を有する。
しかし、米国特許第５，８９１，６３６号に記載の研究は、特に、外因性プライマーを加えることで第２のストランドの合成を行うこととは教示していない。その代わりに、オリゴヌクレオチドプライマーを使用してｃＤＮＡの第１のストランドのみを生成することが開示されている。第２のストランドの合成に関しては、２つの可能な方法が開示されていた。第１の方法では、オリジナルのｍＲＮＡテンプレートでのＲＮＡ分解酵素Ｈのニッキング活性を使用して、ｃＤＮＡをテンプレートとして使用し得るプライマーを生成した。第２の方法では、ＤＮＡポリメラーゼを添加して第１のｃＤＮＡストランドの末端に自己プライミングを行うことができるヘアピンを形成した。第１の方法は、ＲＮＡ分解酵素ＨをｃＤＮＡ合成反応の完了後に添加して、ＲＮＡ分解酵素Ｈの活性のバランスを、潜在的なＲＮＡプライマーを全て分解することなく十分なニッキングを提供するものとして同定しなければならないという制約がある。第２の方法は、逆転写酵素に加えて異なるポリメラーゼのさらなるインキュベーション工程が必要であり、また、Ｓ１ヌクレアーゼを添加して、ヘアピン構造中のループを除去しなければならない。さらに、フォールドバックによる形成および伸長はあまり理解されていないシステムであり、このシステムは高い効率で作用せず、ｃＤＮＡコピーの配列および量がランダム因子として作用し得る。
ＲＮＡ転写の使用による増幅に加えて、ＰＣＲをいくつかのプロトコルに含めることで、個々の配列の各末端で共通のプライマー結合部位を使用することによってライブラリーの合成を行っている（エンデッジ（Ｅｎｄｅｇｅ）等 、１９９９、バイオテクニークス、２６、５４２〜５５０、イェン（Ｙｉｎｇ）等、１９９９、バイオテクニークス、２７、４１０〜４１４）。これらの方法は共通して熱サイクリング専用の装置が必要である。
ライブラリー由来の結合分析物に加えて、アレイ上の核酸は、プライマー伸長反応用のテンプレートとして分析物を使用することができる。例えば、互いに配列変異を示すアレイ上の異なる部位で１組のプライマーを使用することによって、単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ´ｓ）の同定が行われている（パスチネン（Ｐａｓｔｉｎｅｎ）等、２０００、ゲノムリサーチ、１０、１０３１〜１０４２）。プライマーの各組によるプライマー伸長に使用されるテンプレートの能力または不能は、分析物内の特定の配列変異の指標である。米国特許第５，６４１，６５８号およびウェスリン（Ｗｅｓｌｉｎ）等、２０００、ネイチャーバイオテクノロジー、１８、１９９〜２０４に記載のように、局所的増幅用のプラットフォームとしてのアレイの使用によってより複雑な一連の反応も行われている。アレイテクノロジーのこれらの特定の適用では、アレイの各遺伝子座での各核酸ターゲットの固有のプライマー組の獲得によってＰＣＲおよびＳＤＡを行った。アレイの各遺伝子座での増幅の有無を、分析サンプル中の対応するターゲット配列の有無の指標として使用した。
近年、ＤＮＡマイクロアレイの合成および使用の急速な開発にもかかわらず蛋白質または他のリガンド開発の進行は非常に遅いが、このようなアレイは遺伝子発現ならびに抗体−抗原、受容体−リガンド、蛋白質−蛋白質相互作用、および他の適用を研究するための理想的な形式である。以前の技術では、遺伝子発現、抗体スクリーニング、および酵素アッセイに蛋白質アレイが使用されている（ルーキング（Ｌｕｅｋｉｎｇ）等、１９９９、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０、１０３〜１１１、デウィルド（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ）等、２０００、ネイチャーバイオテクノロジー、１８、９８９〜９９４、アレンコフ（Ａｒｅｎｋｏｖ）等、２０００、アナリティカルバイオケミストリー、２７８、１２３〜１３１）。高処理ＥＬＩＳＡアッセイ（メンドーザ（Ｍｅｎｄｏｚａ）等、１９９９、バイオテクニークス、２７、７７８〜７８８）および複合溶液中の各蛋白質の検出（ハーブ（Ｈａａｂ）等、２００１、ゲノムバイオロジー、２、１〜１３）にも蛋白質アレイが使用されている。しかし、今までは蛋白質に関連する固有の問題によってその使用が制限されている。ＤＮＡは、非常に丈夫で、固体マトリックスに固定され、活性または機能のいかなる損失も無く乾燥および再水和することができる。しかし、蛋白質は、アレイ形式での使用は非常に困難である。アレイ形式での蛋白質の使用上の主な問題の１つは、ペプチドまたは蛋白質が変性またはその他の変化を起こすことなく、蛋白質の接触可能で反応性を示す形態での固体マトリックスへの蛋白質の適用が困難であることである。また、多くの蛋白質は再水和することができずに常に溶液中で保持されるので、アレイでの使用はさらに困難である。
蛋白質アレイの調製に使用されているいくつかの方法には、グルタルアルデヒドまたは他の試薬での処理によって活性化されているガラススライド上のポリアクリルアミドゲルマトリックス上への蛋白質の貼り付けが含まれる（アレンコフ（Ａｒｅｎｋｏｖ）。別の方法は、アルデヒドで被覆したガラススライドへの蛋白質の添加および所望の蛋白質結合後のＢＳＡでの残存アルデヒド部位のブロッキングである。しかし、ＢＳＡは蛋白質を不明瞭にするので、この方法を小さな蛋白質には使用できない。スライドのＢＳＡでの被覆によってスライド上にペプチドおよび小さな蛋白質を貼り付け、その後Ｎ，Ｎ’−ジスクニミジルカーボネートでのＢＳＡで活性化する（タトン（Ｔａｔｏｎ）等、２０００、サイエンス、２７８９、１７６０〜１７６３）。次いで、ペプチドをスライド上にプリントし、残りの活性化スライドをグリシンでブロックした。ポリ−Ｌ−リジン被覆ガラススライド（ハーブ（Ｈａａｂ）等）およびアガロース被覆スライド（アファナシブ（Ａｆａｎａｓｓｉｅｖ）等、２０００、核酸リサーチ、２８、ｅ６６）上にも蛋白質アレイが調製されている。蛋白質を固体表面上に捕捉し、質量分析によって分析するための「蛋白質チップ」もまた、シファーゲン（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）（フレモント、ＣＡ）から市販されている。
「ホック」或いはとしてのオリゴヌクレオチドまたは非核酸分子同定物としての「タグ」の使用が文献に記載されている。例えば、各ペプチドが孤立した核酸部分に結合されたペプチドのライブラリーを作製し、ライブラリーのメンバーが特定の分析物への結合能力について試験されている。結合親和性を有するペプチドの単離後、ＰＣＲによって同定を行ってペプチド配列を「デコード」した（ブレナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）及びレナー（Ｌｅｒｎｅｒ）、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、５３８１〜５３８３、ニーデルス（Ｎｅｅｄｅｌｓ）等、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、１０，７００〜１０，７０４）。核酸配列をアレイ中のタグとして使用し、選択したオリゴヌクレオチド配列を、単一ヌクレオチド多型の遺伝子分類に使用されるプライマーに付加した。（ヒルショールン（Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ）等、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１２１６４〜１２１６９）。しかし、この場合「タグ」は、事実上プライマーデザインの一部であり、単一塩基の伸長アッセイを使用するＳＮＰ検出に特異的に使用される。ロセ（Ｌｏｈｓｅ）等（ＷＯ００／３２８２３）によって出願された特許出願は、蛋白質アレイ用のＤＮＡ−蛋白質融合の使用が開示されている。この方法では、蛋白質をＲＮＡ転写物から合成し、その後逆転写して対応する蛋白質に結合するＤＮＡ配列を得る。この技術は特に核酸およびペプチドまたは蛋白質を含むキメラ分子のみに関連するので、このシステムは自由度を欠く。さらに、蛋白質はＲＮＡ配列に直接的に関連するので、得られたＤＮＡ配列もまた蛋白質配列の影響を受ける。最後に、アレイ中で使用される全ての蛋白質は、細胞抽出物から作製した生体外での翻訳システムを使用する必要があり、費用がかかり且つ非効率的な、多数のプローブの大量合成用のシステムを使用する必要がある。キメラ組成物と供に使用するための電気化学的に処理されたチップの使用もまた、バジン（Ｂａｚｉｎ）及びリヴァーシェ（Ｌｉｖａｃｈｅ）、１９９９、「固相状態での合成および組換えライブラリーの革新および展望」、Ｒ．エプトン編（Ｒ．Ｅｐｔｏｎ）、メイフローワサイエンティフィックリミテッド、バーミンガム、ＵＫに記載されている。
従って、本発明の目的は、上記従来技術が抱えていた問題を克服するため、分析物の検出、定量、及び増幅のための新規な組成物および方法を提供することにある。
従って、本発明は、分析物のライブラリーからなる組成物であって、前記分析物は核酸のアレイにハイブリダイズし、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記分析物は内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ＵＤＴに付着したユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とからなり、前記ＵＤＥは前記分析物の存在もしくは量またはＵＤＥのＵＤＴへの付着を示すシグナルを発生する組成物を提供する。
本発明は、また、分析物のライブラリーからなる組成物であって、前記分析物は核酸のアレイにハイブリダイズされ、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記分析物は非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ＵＤＴにハイブリダイズされたユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とからなり、前記ＵＤＥは前記分析物の存在もしくは量を検出するシグナルを直接的もしくは間接的に発生する組成物を提供する。
本発明は、更に、分析物のライブラリーからなり、前記分析物は核酸のアレイにハイブリダイズされ、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記分析物と前記核酸との間の前記ハイブリダイズは複合体形成領域を発生すると共に、前記組成物はさらに前記領域に複合化されたシグナル発生体を含むことを特徴とする組成物を提供する。
本発明は、更に、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーであって、意図する前記核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含むライブラリーと、（ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｃ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する方法を提供する。
本発明により提供されるものは、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーであって、意図する前記核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含むライブラリーと、（ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと核酸分析物の前記アレイで接触させて、１またはそれ以上の複合体を形成し、（ｃ）核酸分析物の前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する方法である。
本発明により提供されるものは、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーであって、意図する前記核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含み、前記非内在性のＵＤＴは前記核酸分析物に付着するライブラリーと、（ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｃ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する方法である。
本発明により提供される他の態様は、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーであって、意図する前記核酸のそれぞれは少なくとも１種の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含み、前記非内在性のＵＤＴは前記核酸分析物に付着するライブラリーと、（ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと核酸分析物の前記ライブラリーで接触させて、１もしくはそれ以上の複合体を形成し、（ｃ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する方法である。
本発明により提供される他の態様は、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）１もしくはそれ以上のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、（ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ＵＤＴ（ｉｉｉ）を核酸分析物の前記ライブラリー（ｉｉ）に付着させ、（ｃ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、前記意図する核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｄ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｅ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する前記複数の核酸を検出もしくは定量する方法である。
更に他の特徴は、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）１もしくはそれ以上のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、（ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ＵＤＴ（ｉｉｉ）を核酸分析物の前記ライブラリー（ｉｉ）に付着させ、（ｃ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと核酸分析物の前記ライブラリーで接触して、１もしくはそれ以上の複合体を形成し、（ｄ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、前記意図する核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｅ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する前記複数の核酸を検出もしくは定量する方法である。
本発明は、加えて、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）複合体形成のための核酸ハイブリッドにより形成される領域に結合すると共にシグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズして、意図する前記核酸が存在する場合には複合体形成領域を提供するハイブリッドを形成し、（ｃ）前記ＵＤＥを前記ハイブリッドと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する方法を提供する。
また、ここに提供されるものは、核酸分析物コピーのライブラリーからなり、前記第１の核酸コピーは核酸のアレイにハイブリダイズされ、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記第１の核酸コピーは内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ＵＤＴに付着したユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とからなり、前記ＵＤＥは直接的もしくは間接的にシグナルを発生して前記分析物の存在もしくは量を検出する組成物である。
本発明の他の実施の形態は、第１の核酸コピーのライブラリーからなる組成物であって、前記第１の核酸コピーは核酸のアレイにハイブリダイズされ、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記第１の核酸コピーは１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ＵＤＴに付着した１もしくはそれ以上のユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とからなり、前記ＵＤＥは直接的もしくは間接的にシグナルを発生して前記分析物の存在もしくは量を検出し、前記ＵＤＴは（ｉ）前記第１の核酸コピーの５′末端に位置すると共にオリゴＴセグメントもしくは配列に隣接せず、または（ｉｉ）前記第１の核酸コピーの３′末端に位置し、または（ｉｉｉ）その（ｉ）と（ｉｉ）との両者のいずれかである組成物である。
本発明は、また、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一の固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含有しうる核酸分析物のライブラリーであって、前記意図する核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含むライブラリーと、（ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、（ｉｖ）分析物の前記核酸の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記核酸分析物の全部もしくは１部に相補的である１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成すると共に、前記ＵＤＴの全部もしくは１部に相補的である配列を合成して相補的ＵＤＴを形成し、（ｃ）前記第１の核酸コピーを前記核酸のアレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、前記意図する核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｄ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーの前記相補的ＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｅ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する前記複数の核酸を検出もしくは定量する方法に関する。
本発明により提供される他の実施の形態は、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一の固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含有しうる核酸分析物のライブラリーであって、前記意図する核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含むライブラリーと、（ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、（ｉｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、（ｃ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーにおける前記ＵＤＴと接触させて、１もしくはそれ以上の複合体を形成し、（ｄ）前記第１の核酸コピーを前記核酸のアレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて前記意図する核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｅ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する前記複数の核酸を検出もしくは定量する方法である。
本発明の更なる態様は、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一な固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、（ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、（ｖ）前記核酸分析物のコピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記非内在性のＵＤＴを前記核酸分析物の３′末端、前記第１核酸分析物の５′末端、または前記核酸分析物の前記３′末端および前記５′末端の両者に付着させ、（ｃ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、（ｄ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｅ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーのＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｆ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する方法である。
ここで提供されるものは、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一な固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、（ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、（ｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記非内在性のＵＤＴを前記核酸分析物の３′末端、前記第１核酸分析物の５′末端、または前記核酸分析物の前記３′末端および前記５′末端の両者に付着させ、（ｃ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、（ｄ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーのＵＤＴと接触させて、複合体を形成し、（ｅ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｆ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する方法である。
ここで提供される他の実施の形態は、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一な固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、（ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、（ｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、（ｃ）前記非内在性のＵＤＴを前記核酸コピーの３′末端、前記第１の核酸コピーの５′末端、または前記核酸コピーの前記３′末端および前記５′末端の両者に付着させ、（ｄ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｅ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーのＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｆ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する方法である。
本発明により提供させる他の方法は、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一な固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、（ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、（ｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、（ｃ）前記非内在性のＵＤＴを前記第１の核酸コピーの３′末端、前記第１の核酸コピーの５′末端、または前記第１の核酸コピーの前記３′末端および前記５′末端の両者に付着させ、（ｄ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーのＵＤＴと接触させて複合体を形成し、（ｅ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｆ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する方法である。
さらに提供されるものは、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的でありかつ固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）核酸ハイブリッドにより形成された複合体形成領域に結合し、直接或いは間接的に信号を発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥｓ）と、（ｉｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の核酸コピーを合成し、（ｃ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドでありかつ複合体形成領域を提供するハイブリッドを形成し、（ｄ）前記ＵＤＥｓを前記ハイブリッドに接触させて、前記アレイに結合する複合体を形成し、（e）前記アレイに結合したＵＤＥｓから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することで、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する方法である。
本発明により提供させる他の態様は、インビボ複製が実質的に不可能であると共に非内在性のホモ重合化された配列を持たないダブルストランド核酸のライブラリーからなり、前記核酸は試料から得られたライブラリーの内在性の配列に部分的もしくは全体的に相補的もしくは同一である配列を含み、前記ダブルストランド核酸は前記ダブルストランドの１端部に近位する少なくとも１つの内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ダブルストランドの他端部に近位する少なくとも１つの非内在性のプロダクションセンターとを含む組成物である。
本発明の他の態様は、インビボ複製が実質的に不可能であるダブルストランド核酸のライブラリーからなり、前記核酸が試料から得られたライブラリーの内在性の配列に対し部分的もしくは全体的に相補的もしくは同一である配列からなり、前記ダブルストランド核酸は前記ダブルストランドの１端部に近位する少なくとも４個（４）の非内在性のヌクレオチドと前記ダブルストランドの他端部に近位する非内在性のプロダクションセンターとを含む組成物に関する。
本発明の他の有用な態様は、固体支持体に固定されたダブルストランド核酸のライブラリーからなり、前記核酸が試料から得られるライブラリーの内在性の配列に部分的もしくは全体的に相補的もしくは同一である配列を含み、さらに前記核酸が前記ダブルストランドの１端部に近位する非内在性の核酸の少なくとも１つの第１配列セグメントと前記ダブルストランドの他端部に近位する少なくとも１つの第２配列セグメントとを含み、前記第２配列セグメントが少なくとも１つのプロダクションセンターを含む組成物に関する。
本発明の他の特徴は、固体支持体に付着したダブルストランド核酸のライブラリーからなり、前記核酸は部分的または全体的に試料から得られるライブラリーの内在性の配列に相補的または同一である配列を含み、前記ダブルストランド核酸は前記ダブルストランドの１端部に近位する少なくとも１つの内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ダブルストランドの他端部に近位する少なくとも１つの非内在性のプロダクションセンターを含む組成物である。
また、本発明は、ここにおいて、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）部分的または全体的に前記意図する核酸の配列に同一もしくは相補的である固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段であって、この重合化手段は第１セットのプライマーと第２セットのプライマーとを含み、前記第２セットのプライマーは少なくとも２つのセグメントを含み、３′末端における第１セグメントはランダム配列を含み、第２セグメントは少なくとも１つの形成センタを含む重合化手段と、（ｉｖ）核酸コピーを等温性もしくは平衡の条件下で合成する手段とを設け、（ｂ）核酸分析物の前記ライブラリーを前記第１セットのプライマーと接触させて複数の第１の結合体を形成させ、（ｃ）前記結合した第１セットのプライマーを前記核酸分析物により与えられたテンプレート配列により伸長されて前記分析物の第１のコピーを形成し、（ｄ）前記伸長した第１のコピーを前記第２セットのプライマーと接触させて複数の第２結合物質を形成し、（ｅ）前記結合した第２セットのプライマーを前記伸長した第１のコピーにより与えられたテンプレート配列により伸長させて伸長第１のコピーと伸長第２セットのプライマーとからなる複数の複合体を形成し、（ｆ）前記複合体における前記第２セットのプライマーのプロダクションセンターから等温性若しくは平衡条件下で１もしくはそれ以上の核酸コピーを合成し、（ｇ）工程（ｆ）で形成された前記核酸コピーを工程（ａ）（ｉ）で形成された前記核酸のアレイにハイブリダイズし、（ｈ）工程（ｇ）で得られた前記ハイブリダイズコピーを検出もしくは定量する方法を提供する。
また、本発明により提供されるものは、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）部分的もしくは全体的に前記意図する核酸の配列に同一もしくは相補的である固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、前記重合化手段は第１セットのプライマーと第２セットのプライマーとを含み、前記第１セットのプライマーは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む重合化手段と、（ｉｖ）等温性もしくは平衡の条件下で核酸コピーを合成する手段とを設け、（ｂ）前記核酸分析物のライブラリーを前記第１セットのプライマーと接触させて複数の第１の結合体を形成し、（ｃ）前記結合した第１セットのプライマーを前記核酸分析物により与えられたテンプレート配列により伸長させて前記分析物の第１のコピーを形成し、（ｄ）前記第１のコピーを少なくとも４種（４）もしくはそれ以上の非内在性のホモポリマーヌクレオチドにより伸長させ、（ｅ）前記伸長した第１のコピーを前記第２セットのプライマーと接触させて複数の第２結合物質を複合体を形成し、（ｆ）前記複合した前記第２セットのプライマーを前記伸長した第１のコピーにより与えられたテンプレート配列により伸長させて伸長第１のコピーと伸長第２セットのプライマーとからなる複数の複合体を形成し、（ｇ）前記複合体における前記第２セットのプライマーのプロダクションセンターから等温性もしくは平衡な条件下で１もしくはそれ以上の核酸コピーを合成し、（ｈ）工程（ｇ）で形成された前記核酸コピーを工程（ａ）（ｉ）で与えられた核酸の前記アレイにハイブリダイズし、（ｉ）工程（ｈ）で得られた前記ハイブリダイズされたコピーを検出もしくは定量する方法である。
本発明の他の特徴は、ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸の配列と、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、ここで該第１のセットが少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、（ｉｖ）プライマーの該第２のセットの少なくとも１つのセグメントまたは配列に相補的なポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットと、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（ｉｖ）の該セットを連結するための手段を提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して、該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セットａ）（ｉｖ）を工程ｃ）において形成した該第１のコピーの３´末端に連結して、複数の連結された生成物を生成し、ｅ）プライマーの該第２のセットと、該連結された生成物とを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｆ）工程ｄ）において形成された該連結された生成物によって提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、該連結された生成物およびプライマーの該伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法である。
更に本発明は、ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸の配列と、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、ここで該第２のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、（ｉｖ）プライマーの該第２のセットの少なくとも１つのセグメントまたは配列に相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットと、（ｖ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セット（ｉｖ）を連結するための手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セットａ）（ｉｖ）を工程ｃ）において形成された該第１のコピーの３´末端に連結して複数の連結された生成物を形成し、ｅ）プライマーの該第２のセットと、該連結された生成物とを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｆ）工程ｄ）において形成された該連結された生成物により提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、該連結された生成物およびプライマーの該伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法を提供する。
更に本発明により提供されるものは、ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸の配列と、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセット、プライマーの第２のセット、およびプラスミドの第３のセットを含み、ここでプライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、該第３のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、結合されたプライマーの第１のセットを形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１のコピーとを接触して、結合されたプライマーの第２のセットを形成し、ｅ）該伸長された第１のコピーによって提供されるテンプレート配列によって結合されたプライマーの該第２のセットを伸長して、該核酸分析物の第２のコピーを形成し、ｆ）プライマーの該第３のセットと、該第２のコピーとを接触して、第３の結合体を形成する、複数の結合されたプライマーの第３のセットを形成し、ｇ）プライマーの該伸長された第２のセットによって提供されるテンプレート配列によって結合されたプライマーの該第３のセットを伸長して、第３のコピーおよび少なくとも１つのプロダクションセンターを含むハイブリッドを形成し、ｈ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｉ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｉ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｊ）工程ｉ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法である。
また、本発明に固有に提供されるものは、ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸の配列と、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセット、プライマーの第２のセット、ここでプライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、該第２のセットは少なくとも２つのセグメントを含む、第１のセグメントは３´末端にてランダムな配列を含み、および第２のセグメントは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、ｉｖ）等温または平行な条件下で核酸コピーを合成するための手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１のコピーとを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｅ）該伸長された第１のコピーによって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第２のセットを伸長して、伸長された第１のコピーおよびプライマーの伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、ｆ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｇ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｆ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｈ）工程ｇ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法である。
本発明の他の有意な態様は、ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、ここでプライマーの該第１のセットは固体支持体に固定化または不動化され、プライマーの該第１のセットが少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、（ｉｖ）等温または平衡な条件下で核酸コピーを合成するための手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長し、ｄ）少なくとも４つ以上の非内在性の同種重合体ヌクレオチドによって該第１のコピーを伸長し、ｅ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１のコピーとを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｆ）該伸長された第１のコピーによって提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、伸長された第１のコピーおよびプライマーの伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法である。
本発明に従って提供されるものは、ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、ここでプライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、該第１のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、（ｉｖ）プライマーの該第２のセットの少なくとも１つのセグメントまたは配列に相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットと、（ｖ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セット（ｉｖ）をライゲートするための手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セットａ）（ｉｖ）を工程ｃ）において形成された該第１のコピーの３´末端にライゲートして複数のライゲートされた生成物を形成し、ｅ）プライマーの該第２のセットと、該ライゲートされた生成物とを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｆ）工程ｄ）において形成された該ライゲートされた生成物により提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、該ライゲートされた生成物およびプライマーの該伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法である。
本発明の他の特徴は、ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、プライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、およびここで該第２のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、（ｉｖ）プライマーの該第２のセットの少なくとも１つのセグメントまたは配列に相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットと、（ｖ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セット（ｉｖ）をライゲートするための手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セットａ）（ｉｖ）を工程ｃ）において形成された該第１のコピーの３´末端にライゲートして、複数のライゲートされた生成物を形成し、ｅ）プライマーの該第２のセットと、該ライゲートされた生成物とを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｆ）工程ｄ）において形成された該ライゲートされた生成物により提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、該ライゲートされた生成物およびプライマーの該伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法に関する。
本発明により提供される他の方法は、ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセット、プライマーの第２のセット、およびプラスミドの第３のセットを含み、プライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、およびここで該第３のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１のコピーとを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｅ）該伸長された第１のコピーによって提供されるテンプレート配列によって該結合されたプライマーの第２のセットを伸長して、プライマーの伸長された第２のセットを形成し、ｆ）工程ｅ）において得られたプライマーの該伸長された第２のセットを分離し、ｇ）プライマーの該第３のセットと、プライマーの該伸長された第２のセットとを接触して複数の第３の結合体を形成し、ｈ）プライマーの該伸長された第２のセットによって提供されるテンプレート配列によって該第３の結合体を伸長して、該伸長された第３の結合体およびプライマーの該伸長されたセットを含む複数の複合体を形成し、ｉ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｊ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｉ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｋ）工程ｊ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法である。
ここにおいて提供される他の有意な実施の形態は、ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一な固定化または不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットを含む、重合化手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの第１のセットの該結合されたセットを伸長して該分析物の第１の核酸コピーを形成し、ｄ）該分析物から該第１の核酸コピーを分離し、ｅ）所望の量の第１の核酸コピーが合成されるまで工程ｂ）、ｃ）、ｄ）を繰返し、ｆ）工程ｉ）において提供される核酸の該配列に、工程ｅ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｇ）工程ｆ）において得られた該ハイブリダイズされた第１の核酸コピーのいずれかを検出または定量する方法である。
ここにおいて記載される発明は、ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一な固定化または不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセット、プライマーの第２のセットを含む、重合化手段と、（ｉｖ）核酸の３´末端への配列の付加のための手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、該核酸分析物とを接触して、第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの第１のセットの該結合されたセットを伸長して該分析物の第１の核酸コピーを形成し、ｄ）該第１の核酸コピーの３´末端への非テンプレート由来の配列の付加によって該第１の核酸コピーを伸長し、ｅ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１の核酸コピーとを接触して第２の結合体を形成し、ｆ）該伸長された第１の核酸コピーによって提供されるテンプレート配列によってプライマーの第２のセットの該結合されたセットを伸長して、第２の核酸コピーを形成し、ｇ）伸長された第１の核酸コピーから該第２の核酸コピーを分離し、ｈ）所望の量の第２の核酸コピーが合成されるまで工程ｅ）、ｆ）、ｇ）を繰返し、ｉ）工程（ｉ）において提供される核酸の該配列に、工程ｈ）において形成された該第２の核酸コピーをハイブリダイズし、ｊ）工程ｉ）において得られた該ハイブリダイズされた第２の核酸コピーのいずれかを検出または定量する方法を提供する。
本発明により提供される他の有意な組成物は、分離した領域を含む固体表面のアレイを含む組成物であって、該分離した領域の少なくとも２つがそれぞれ、核酸プライマーの第１のセットと、核酸プライマーの第２のセットとを含み、核酸プライマーの該第１のセットにおけるヌクレオチド配列は、核酸プライマーの該第２のセットにおけるヌクレオチド配列と異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列は、少なくとも１つの塩基が互いに異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列は、実質的に同じであるかまたは同一である組成物である。
本発明の関連する組成物は、複数の分離した領域を含む固体表面のアレイを含む組成物であって、該分離した領域の少なくとも２つがそれぞれ、核酸プライマーの第１のセットと、核酸プライマーの第２のセットとを含み、核酸プライマーの該第１のセットにおけるヌクレオチド配列は、核酸プライマーの第２のセットにおけるヌクレオチド配列と異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列は実質的に互いに異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列は実質的に同じであるかまたは同一である組成物に関する。
直前に記載した組成物に関連する方法は、ライブラリー中の目的の核酸の２つ以上のコピーを生成するための方法であって、ａ）（ｉ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つがそれぞれ、（１）核酸プライマーの第１のセットと、（２）核酸プライマーの第２のセットとを含み、核酸プライマーの該第１のセットにおけるヌクレオチド配列は、核酸プライマーの該第２のセットにおけるヌクレオチド配列と異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列は少なくとも１つの塩基が実質的に互いに異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列は実質的に同じであるかまたは同一である固体表面のアレイと、（ｉｉ）目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該目的の核酸の核酸コピーを合成するための重合化手段とを提供し、ｂ）該目的の核酸における相補的な配列と、該第１のセットのプライマーとを接触し、ｃ）該目的の核酸をテンプレートとして使用して第１のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第１のプライマーを生成し、ｄ）該伸長された第１のプライマーにおける相補的な配列と、該第２のセットにおけるプライマーとを接触し、ｅ）該伸長された第１のプライマーを使用して第２のセットにおける該プライマーを伸長して、該伸長された第２のプライマーを生成し、ｆ）該伸長された第２のプライマーにおける相補的な配列と、第１のセットにおけるプライマーとを接触し、ｇ）該伸長された第２のプライマーをテンプレートとして使用して、第１のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第１のプライマーを生成し、ｈ）上述のｄ）からｇ）までの工程を１回以上反復する工程を含む方法である。
本発明の他の関連する方法は、ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量化するための方法であって、ａ）（ｉ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つがそれぞれ、（１）核酸プライマーの第１のセットと、（２）核酸プライマーの第２のセットとを含み、核酸プライマーの該第１のセットにおけるヌクレオチド配列は、核酸プライマーの該第２のセットにおけるヌクレオチド配列と異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列は少なくとも１つの塩基が互いに異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列は実質的に同じであるかまたは同一である固体表面のアレイと、（ｉｉ）目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該目的の核酸の核酸コピーを合成するための重合化手段と、（ｉｖ）核酸に付着され得るか、または核酸に取り込まれ得る非放射性のシグナル発生手段とを提供し、ｂ）該目的の核酸における相補的な配列と、該第１のセットのプライマーとを接触し、ｃ）該目的の核酸をテンプレートとして使用して第１のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第１のプライマーを生成し、ｄ）該伸長された第１のプライマーにおける相補的な配列と、該第２のセットにおけるプライマーとを接触し、ｅ）該伸長された第１のプライマーをテンプレートとして使用して第２のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第２のプライマーを生成し、ｆ）該伸長された第２のプライマーにおける相補的な配列と、第１のセットにおけるプライマーとを接触し、ｇ）該伸長された第２のプライマーをテンプレートとして使用して、第１のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第１のプライマーを生成し、ｈ）上述のｄ）からｇ）までの工程を１回以上反復し、ｉ）上述の工程ｃ）、ｅ）、ｇ）、およびｈ）における該伸長されたプライマーのいずれかに付着された或いはその中に取り込まれた該非放射性シグナル発生手段によって、検出または定量化する方法である。
本発明により提供される他の有用な組成物は、複数の分離した領域を含む固体表面のアレイを含む組成物であって、該分離した領域の少なくとも２つは、核酸部分と、非核酸部分とを含むキメラ組成物を含み、第１の分離した領域の該核酸部分は第２の分離した領域の核酸部分と同じ配列を有し、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有する組成物である。
本発明により更に提供されるものは、複数の分離した領域を含む固体表面のアレイを含む組成物であって、該分離した領域の少なくとも２つは、該分離した領域に固定化または不動化される核酸の相補的な配列にハイブリダイズされるキメラ組成物を含み、該キメラ組成物は、核酸部分と、非核酸部分とを含み、該核酸部分は少なくとも１つの配列を含み、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は、該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に対して同一または相補的配列のいずれも含まない組成物である。
本発明の１つの有意な態様として提供されるものは、目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、１）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは：核酸部分；および非核酸部分を含むキメラ組成物を含み；第１の分離した領域の該核酸部分は第２の分離した領域の核酸部分と同じ配列を有し、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有する、固体表面のアレイと、ｂ）該目的の分析物の１つ以上を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、ｃ）シグナル発生手段とを提供し、２）サンプルｂ）と配列ａ）とを、該非核酸部分への該分析物の結合を許容する条件下で、接触させ、３）該シグナル発生手段と該結合された分析物とを接触させ、４）該分析物の存在を検出または定量化する方法である。
本発明により提供される他の特徴は、目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、１）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは：核酸部分；および非核酸部分を含むキメラ組成物を含み；第１の分離した領域の該核酸部分は第２の分離した領域の核酸部分と同じ配列を有し、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有する固体表面のアレイと、ｂ）該目的の分析物の１つ以上を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、ｃ）シグナル発生手段とを提供し、２）該シグナル発生手段で該目的の分析物をラベルし、３）該ラベルされた分析物と配列ａ）とを、該非核酸部分への該ラベル化された分析物の結合を許容する条件下で接触させ、４）該分析物の存在を検出または定量化する方法である。
本発明により提供されるものは、目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、１）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは該分離した領域に固定化または不動化された核酸部分を含む、固体表面のアレイと、ｂ）ｉ）核酸部分と、ｉｉ）非核酸部分とを含むキメラ組成物であって、該核酸部分は、少なくとも１つの配列を有し、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は、該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に同一または相補的な配列のいずれも含まないキメラ組成物と、ｃ）該目的の分析物の１つ以上を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、ｄ）シグナル発生手段とを提供し、２）キメラ組成物と該配列とを接触して、該キメラ組成物の核酸部分を該配列に固定化または不動化された相補的な核酸にハイブリダイズし、３）サンプルと該配列とを、該非核酸部分への該分析物の結合を許容する条件下で接触させ、４）該シグナル発生手段と該結合された分析物とを接触させ、５）該分析物の存在を検出または定量化する方法である。
加えて、本発明は、目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、１）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは、該分離した領域に固定化または不動化された核酸部分を含む、固体表面のアレイと、ｂ）ｉ）核酸部分と、ｉｉ）非核酸部分とを含むキメラ組成物であって、該核酸部分は、少なくとも１つの配列を含み、ここで該非核酸部分は、目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は、該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に同一または相補的配列のいずれも含まないキメラ組成物と、ｃ）該目的の分析物を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、ｄ）シグナル発生手段とを提供し、２）該非核酸部分に該分析物を結合することを許容する条件下で、該サンプルｂ）と該キメラ組成物とを接触させ、３）該キメラ組成物と該配列とを接触して、該キメラ組成物の核酸部分を該配列に固定化または不動化された相補的な核酸にハイブリダイズし、４）該シグナル発生手段と該結合された分析物とを接触させ、５）該分析物の存在を検出または定量化する方法を提供する。
ここにおいて、発明が提供する他の有用なことは、目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、１）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは、該分離した領域に固定化または不動化された核酸部分を含む、固体表面のアレイと、ｂ）ｉ）核酸部分と、ｉｉ）非核酸部分とを含むキメラ組成物であって、該核酸部分は、少なくとも１つの配列を含み、ここで該非核酸部分は、目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に同一または相補的配列のいずれも含まないキメラ組成物と、ｃ）該目的の分析物の１つ以上を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、ｄ）シグナル発生手段とを提供し、２）該キメラ組成物と該配列とを接触して、該キメラ組成物の核酸部分を該配列に固定化または不動化された相補的な核酸部分にハイブリダイズし、３）該シグナル発生手段で該分析物をラベルし、４）ラベルされた分析物と該配列とを接触して、該分析物を該非核酸部分に結合し、５）該分析物の存在を検出または定量化する方法である。
本発明により更に提供されるものは、目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、１）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは、該分離した領域に固定化または不動化された核酸部分を含む、固体表面のアレイと、ｂ）ｉ）核酸部分と、ｉｉ）非核酸部分とを含むキメラ組成物であって、該核酸部分は、少なくとも１つの配列を含み、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に同一または相補的配列のいずれも含まないキメラ組成物と、ｃ）該目的の分析物を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、ｄ）シグナル発生手段とを提供し、２）該シグナル発生手段で該目的の分析物をラベルし、３）該ラベルされた分析物と該キメラ配列とを接触して、該分析物を該非核酸部分に結合し、４）該キメラ組成物と該配列とを接触して、該キメラ組成物の核酸部分を、該配列に固定化または不動化された相補的な核酸にハイブリダイズし、５）該分析物の存在を検出または定量化する方法である。
発明の実施の形態
本発明は、核酸のライブラリーを作成し、解析する際に使用し得る新規な方法、組成物及びキットを開示する。テストサンプルの核酸を直接使用して信号を発生してもよく、これら核酸をテンプレートとして使用して、オリジナル配列と同一或いは相補性を有する配列からなる１又はそれ以上の核酸のコピーを提供してもよい。
本発明において、以下の用語を使用し、以下のように定義する。
分析物は、生物高分子或いはリガンドで、合成手段或いは合成プロセス、又は酵素手段或いは酵素プロセスにより、器官、組織、細胞のような生物資源、或いは非生物資源から分離され或いはそれらから派生したものである。生物高分子の例は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴサッカライド（単糖類）、ポリサッカライド（多糖類）、リピッド（脂質）を含んでもよいが、これらに限定されない。リガンドの例は、非ペプチド抗原、ホルモン、酵素物質、ビタミン、ドラッグ、非ペプチド信号分子を含んでもよいが、これらに限定されない。
ライブラリーは、核酸の多様な集合体であり、a）分析物；ｂ）分析物から導出され分析物の配列に相補的な配列からなる核酸；ｃ）分析物から導出され分析物の配列に同一な配列からなる核酸；及びｄ）前記のあらゆる組み合わせとから構成される。
ラベルは、信号を直接的或いは間接的に発生する能力を有する部分である。
プロダクションセンター（生成源）は、このプロダクションセンターに機能的に結合した配列と同一或いは相補的な配列を有する複数のコピーを生成する能力のある核酸或いはその類似物のセグメントである。
ユニバーサルディテクションターゲット（汎用検出ターゲット）（ＵＤＴｓ）は、あるサンプル中の核酸の群に存在する様々な核酸の一般に知られた或いは変更されていないセグメントであり、対応する結合パートナーにより認識され得るものである。ＵＤＴｓは、内在性であってもよくまた、核酸中に人工的に組込まれてもよい。本質的なＵＤＴｓの例は、３´ポリＡセグメント、５´キャップ、２次的構造およびコンセンサス配列で構成し得るが、これらに限定されるものではない。本発明において使用し得る本質的なコンセンサス配列の例は、ポリＡ付随物、スプライシングエレメント、Ａｌｕ配列のようなマルチコピー反復に対する信号部位で構成し得るが、これらに限定されるものではない。ＵＤＴｓは、また、オリジナル分析物である核酸に加えるか或いはオリジナル分析物の配列と同一或いは相補的な配列からなる核酸の合成により、人工的に核酸中に組込むことが可能である。人工的に加えられたＵＤＴｓは、それら自身ラベルされるか或いは結合パートナーとして作用し得る。
ユニバーサルディテクションエレメント（汎用検出エレメント）（ＵＤＥｓ）は、２つのセグメントからなり、第１のセグメントはＵＤＴに対する結合パートナーとして作用する能力を有し、第２のセグメントはラベルされるかさもなくば検出可能な信号を発生する能力を有する。場合によっては、第１及び第２のセグメントは重複するかあるいは完全に同一セグメントであってもよい。ＵＤＥｓがラベルされる場合、これらは単一の信号部分で構成してもよく、或いは、複数の信号単位で構成してもよい。ＵＤＴｓ或いは信号発生に結合するのに関連するＵＤＥｓのセグメントは、核酸、核酸類似物、ポリペプチド、ポリサッカライド（多糖類）、合成ポリマーのような重合物質で構成してもよいが、これらには限定されない。
本発明は、アレイ解析を目的とするＵＤＴｓおよびＵＤＥｓの使用を開示する。本発明は、また、アレイ解析で使用し得る核酸ライブラリーへプロダクションセンター（生成源）を組込むための新規な方法を開示する。これらプロダクションセンターは、オリジナルの多様な核酸分析物中の配列と同一或いは相補的な配列の増幅を提供し得る。これらプロダクションセンター（生成源）から導出された生成物は、それら自身ラベルされてもよく、或いは検出目的でこれらにＵＤＴｓを組込んでもよい。本発明で使用される核酸は、ＤＮＡ或いはＲＮＡで構成してもよく、或いはＤＮＡ或いはＲＮＡから導出されたものであってもよい。核酸のオリジナルの集団は、ゲノミックＤＮＡ、アンスプライスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｓｎＲＮＡで構成してもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明は、分析物のライブラリーからなる組成物であって、前記分析物は核酸のアレイにハイブリダイズし、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記分析物は内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ＵＤＴに付着したユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とからなり、前記ＵＤＥは前記分析物の存在もしくは量またはＵＤＥのＵＤＴへの付着を示すシグナルを発生する組成物を提供する。前記分析物のライブラリーが器官、組織および細胞よりなる群から選択された生物資源から得られるものであってもよいし、また、前記定義付けしたセクションで述べたように非自然の資源から得られるものであってもよい。生物の分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択されてもよい。前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物例えばＰＮＡよりなる群から選択されてもよい。このような核酸もしくは類似物を糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれかにて改変してもよい。前記固体支持体は、多孔質もしくは非多孔質を含む多くの形態をとってもよい。前記多孔質固体支持体をポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択してもよい。非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックであってもよい。前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性であってもよい。
核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化してもよい。間接的固定の場合、前記核酸を、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化してもよい。
本開示の別の場所で説明したように、前記内在性のＵＤＴを３′ポリＡセグメント、５′キャップ、２次的構造、、コンセンサス配列および前記の任意の組合せよりなる群から選択してもよい。前記コンセンサス配列をポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択してもよい。本開示の別の場所で説明したように、前記ＵＤＥを核酸、核酸類似物、ポリペプチド、多糖類、合成ポリマーおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択してもよい。前述したように、前記類似物はＰＮＡの形態をとってもよい。前記ＵＤＥは直接的もしくは間接的にシグナルを発生する。前記直接的シグナル発生があらゆる形態をとり、蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択してもよい。間接的シグナル発生が好ましい場合も同様に、異なる形態をとってもよく、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択してもよい。間接的に検出され得る好適な酵素は、蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する酵素を含んでもよい。
本発明は更に、分析物のライブラリーからなる組成物であって、前記分析物は核酸のアレイにハイブリダイズされ、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記分析物は非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ＵＤＴにハイブリダイズされたユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とからなり、前記ＵＤＥは前記分析物の存在もしくは量を検出するシグナルを直接的もしくは間接的に発生する組成物を提供する。分析物の本質、核酸アレイ、改変、固体支持体は先のパラグラフで述べた通りである。前記非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）がヘテロ重合化された配列から構成されてもよい。前記ユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）が核酸、核酸類似物およびその改変形態物よりなる群から選択されてもよい。前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生し、このような直接或いは間接的信号発生は直前のパラグラフで述べた通りである。
本発明はさらに、分析物のライブラリーからなり、前記分析物は核酸のアレイにハイブリダイズされ、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記分析物と前記核酸との間の前記ハイブリダイズは複合体形成領域を発生すると共に、前記組成物はさらに前記領域に複合化されたシグナル発生体を含むことを特徴とする組成物を提供する。分析物のライブラリー、核酸アレイ、固体支持体、これへの固定化及び不動化、直接的或いは間接的信号発生は先に議論した通りであり、特に直前の幾つかのパラグラフで議論した通りである。特に、複合体形成領域がＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドおよびＲＮＡ−ＰＮＡハイブリッドよりなる群から選択され得る。前記領域に複合化された前記シグナル発生体が蛋白質および挿入物よりなる群から選択され得る。このような蛋白質は、ダブルストランド核酸に優先的に結合する核酸結合蛋白質で構成してもよく、例えば抗体で構成してもよい。これら抗体は、核酸ハイブリッドに対し特異性であり、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドおよびＲＮＡ−ＰＮＡハイブリッドよりなる群から選択され得る。本発明によれば、有用な挿入物は、臭化エチジウム、臭化ジエチジウム、アクリジンオレンジおよびＳＹＢＲグリーンよりなる群から選択され得る。本発明で利用される場合、前記蛋白質が直接的もしくは間接的にシグナルを発生する。直接的もしくは間接的信号発生のこのような形態及び手法は、本開示の別の場所で説明した通りであり、取分け前の幾つかのパラグラフで説明した通りである。
前述した組成物に関連する固有のそして有用なプロセスが存在する。本発明はしたがって、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーであって、意図する前記核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含むライブラリーと、（ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｃ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する方法を提供する。これらエレメントの多くは、本開示中で既に説明しており、いくらかの曖昧さの可能性があるので、ここで念入りに説明する。例えば、前記核酸アレイはＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択され得る。後者はＰＮＡからなる。これら核酸およびその類似物の改変を、糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで行ってもよい。前記固体支持体が多孔質、例えば、ポリアクリルアミドおよびアガロース、もしくは非多孔質、例えば、ガラスもしくはプラスチックであってもよい。前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性であってもよい。
前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される。前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される。別の場所で議論したように、前記分析物のライブラリーが器官、組織もしくは細胞よりなる群から選択された生物資源から得られるものであってもよいし、或いは非自然の或いは更に合成されたあるいは人により作られた資源から得られるものであってもよい。生物の分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される。
上記プロセスで使用される内在性のＵＤＴは、３′ポリＡセグメント、５′キャップ、２次的構造、コンセンサス配列および前記の任意の組合せよりなる群から選択され得る。このようなコンセンサス配列は、ポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択され得る。ＵＤＥは核酸、核酸類似物例えばＰＮＡ、ポリペプチド、多糖類、合成ポリマーおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択され得る。ＵＤＥは直接的もしくは間接的にシグナルを発生する。前記直接的シグナル発生は様々であり、蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択され得る。間接的シグナル発生もまた様々であり、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択され得る。プロセスで所望され利用される場合、このような酵素は、蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する。前述のプロセスが更に１またはそれ以上の洗浄工程を含んでもよいことは、当業者であれば容易に予想できるであろう。
本発明は、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーであって、意図する前記核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含むライブラリーと、（ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと核酸分析物の前記アレイで接触させて、１またはそれ以上の複合体を形成し、（ｃ）核酸分析物の前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する方法を提供する。更にこのプロセスは１またはそれ以上の従来の洗浄工程を含んでもよい。
ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する他の方法は、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーであって、意図する前記核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含み、前記非内在性のＵＤＴは前記核酸分析物に付着するライブラリーと、（ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｃ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する。本開示において様々に説明したように、核酸アレイの本質及び形式、核酸及び核酸類似物の改変、固体支持体、固体支持体への直接或いは間接的固定化及び不動化、分析物のライブラリー、直接及び間接的信号発生等は、本開示の別の場所で述べた通りである。特筆すべきことは、前記非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を、ホモ重合化された配列およびヘテロ重合化された配列から構成してもよい。また特筆すべきことは、ユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）が核酸、核酸類似物例えばＰＮＡ、ポリペプチドおよび前記その改変形態物よりなる群から選択され得る。１回もしくはそれ以上の洗浄工程をこの直前に説明したプロセスに含んでもよい。
ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する他の方法は、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーであって、意図する前記核酸のそれぞれは少なくとも１種の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含み、前記非内在性のＵＤＴは前記核酸分析物に付着するライブラリーと、（ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと核酸分析物の前記ライブラリーで接触させて、１もしくはそれ以上の複合体を形成し、（ｃ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する。核酸アレイ、改変、固体支持体、固体支持体への直接或いは間接的な固定或いは不動化、分析物のライブラリー、内在性でないユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴｓ）、ユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥｓ）、直接或いは間接的な信号発生、洗浄工程を含むこと、及びその他に関する説明は、本開示の別の場所で行い、かつこの直前に説明したプロセスへも等しく適用できる。
ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する他の方法は、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）１もしくはそれ以上のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、（ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ＵＤＴ（ｉｉｉ）を核酸分析物の前記ライブラリー（ｉｉ）に付着させ、（ｃ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、前記意図する核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｄ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｅ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する前記複数の核酸を検出もしくは定量する。これらエレメントの多くは既に述べた。これらは、核酸アレイ、核酸類似物、糖、リン酸、及び塩基の改変、固体支持体、固体支持体への直接或いは間接的な固定或いは不動化、分析物のライブラリー、ユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥｓ）、直接或いは間接的な信号発生、洗浄工程を含むこと、及びその他を含み、これらに関する説明は、本開示の先及び後別の場所で行い、かつこの直前に説明したプロセスへも等しく適用できる。特筆すべきことは、結合手段は、例えばポリＡポリメラーゼや末端転写酵素等の様々な酵素によりホモ重合配列を加えることである。他の結合手段を使用してホモ重合配列や或いはヘテロ重合配列を付加してもよく、ＤＮＡリガーゼやＲＮＡリガーゼから選択された酵素手段や酵素を含む。
ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する更に他の方法は、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）１もしくはそれ以上のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、（ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ＵＤＴ（ｉｉｉ）を核酸分析物の前記ライブラリー（ｉｉ）に付着させ、（ｃ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと核酸分析物の前記ライブラリーで接触して、１もしくはそれ以上の複合体を形成し、（ｄ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、前記意図する核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｅ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する前記複数の核酸を検出もしくは定量する。予想できるように、本プロセスで記述されるエレメントは、本開示の別の場所で説明されかつこの直前に説明したプロセスへも等しく適用できる。これら先に説明したエレメントは、核酸アレイ、改変、固体支持体、固体支持体への直接或いは間接的な固定或いは不動化、分析物のライブラリー、結合手段、ＵＤＥ、直接或いは間接的な信号発生、洗浄工程を含む。
ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する他の方法は、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）複合体形成のための核酸ハイブリッドにより形成される領域に結合すると共にシグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、（ｂ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズして、意図する前記核酸が存在する場合には複合体形成領域を提供するハイブリッドを形成し、（ｃ）前記ＵＤＥを前記ハイブリッドと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する。核酸アレイ、例えばＰＮＡのような核酸類似物、（糖、塩基、及びリン酸部分の）改変、固体支持体、固定或いは不動化、分析物のライブラリー、複合体形成領域、信号発生蛋白質からの直接或いは間接的な信号発生、洗浄工程等に関する説明は、既に行われたが、かつこの直前に説明したプロセスへも等しく適用できる。このプロセスは特筆すべきもので、信号発生体は領域と混成され複合体を形成し、このような信号発生体は蛋白質や挿入物から選択される。このような蛋白質は、例えば抗体のような２重螺旋核酸に好適に結合する核酸結合蛋白を含んでもよく、特にこの抗体は、核酸ハイブリッド、例えばＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッド、ＲＮＡ−ＰＮＡハイブリッドに固有のものである。挿入物は、本開示中において先に説明したが、これは臭化エチジウム、臭化ジエチジウム、アクリジンオレンジ及びＳＹＢＲグリーンから選択し得る。
他の組成物も本発明により提供される。１つのこのような組成物は、核酸分析物コピーのライブラリーからなり、前記第１の核酸コピーは核酸のアレイにハイブリダイズされ、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記第１の核酸コピーは内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ＵＤＴに付着したユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とからなり、前記ＵＤＥは直接的もしくは間接的にシグナルを発生して前記分析物の存在もしくは量を検出するものである。例えば生物資源等の分析物のライブラリー及びこのような分析物の例示、例えばゲノムＤＮＡ、エピソームＲＮＡ、スプライスされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および上述の任意の組み合わせについては前述した。同様に、例えばＤＮＡ，ＲＮＡ及びこれらに類似するものであるＰＮＡを含む核酸アレイは既に説明した。核酸及びこれらに類似するもの（糖、リン酸、塩基）の改変、固体支持体の特徴（多孔性/非多孔性、透明、半透明、不透明、または反射性）、この固体支持体への固定/不動化、内在性ＵＤＴ、ＵＤＥ、ＵＤＥｓからの直接的/間接的信号発生に関しては、前述した通りでありこの直前の組成物にも等しく適用できる。
他の組成物は第１の核酸コピーのライブラリーからなり、前記第１の核酸コピーは核酸のアレイにハイブリダイズされ、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記第１の核酸コピーは１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ＵＤＴに付着した１もしくはそれ以上のユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とからなり、前記ＵＤＥは直接的もしくは間接的にシグナルを発生して前記分析物の存在もしくは量を検出し、前記ＵＤＴは（ｉ）前記第１の核酸コピーの５′末端に位置すると共にオリゴＴセグメントもしくは配列に隣接せず、または（ｉｉ）前記第１の核酸コピーの３′末端に位置し、または（ｉｉｉ）その（ｉ）と（ｉｉ）との両者のいずれかである。分析物のライブラリー、核酸アレイ、核酸改変、固体支持体、この固体支持体への固定/不動化、ヘテロ重合化配列のような非内在性ＵＤＴ、ＵＤＥｓ（例えば核酸、核酸類似物、ポリペプチド、多糖類、合成ポリマー等）、ＵＤＥｓからの直接的/間接的信号発生に関しては、前述した通りでありこの直前の組成物にも等しく適用できる。
ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する他の方法は、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一の固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含有しうる核酸分析物のライブラリーであって、前記意図する核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含むライブラリーと、（ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、（ｉｖ）分析物の前記核酸の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記核酸分析物の全部もしくは１部に相補的である１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成すると共に、前記ＵＤＴの全部もしくは１部に相補的である配列を合成して相補的ＵＤＴを形成し、（ｃ）前記第１の核酸コピーを前記核酸のアレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、前記意図する核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｄ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーの前記相補的ＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｅ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する前記複数の核酸を検出もしくは定量する。核酸アレイ、改変、固体支持体、固定/不動化、分析物のライブラリー、一致した配列のような内在性ＵＤＴ、ＵＤＥｓ、ＵＤＥｓからの直接的/間接的信号発生に関しては、前述した通りでありこの直前の組成物にも等しく適用できる。特筆すべきことは、記述した重合化手段を、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトから選択し得る。
本発明により提供される他の実施の形態は、ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一の固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含有しうる核酸分析物のライブラリーであって、前記意図する核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含むライブラリーと、
（ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、（ｉｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、（ｃ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーにおける前記ＵＤＴと接触させて、１もしくはそれ以上の複合体を形成し、（ｄ）前記第１の核酸コピーを前記核酸のアレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて前記意図する核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｅ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する前記複数の核酸を検出もしくは定量する方法である。核酸アレイ、核酸改変、固体支持体、（直接的/間接的）固定/不動化、分析物のライブラリー、内在性ＵＤＴｓ、ＵＤＥｓ、ＵＤＥｓからの（直接的/間接的）信号発生、重合化手段に関しては、前述した通りでありこの直前のプロセスにも等しく適用できる。
ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する他の方法は、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一な固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、（ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、（ｖ）前記核酸分析物のコピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記非内在性のＵＤＴを前記核酸分析物の３′末端、前記第１核酸分析物の５′末端、または前記核酸分析物の前記３′末端および前記５′末端の両者に付着させ、（ｃ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、（ｄ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｅ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーのＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｆ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する。核酸アレイ、改変、固体支持体、固定/不動化、分析物のライブラリー、結合手段、ＵＤＥｓ、ＵＤＥｓからの直接的/間接的信号発生、重合化手段等に関する説明及び特徴は先のパラグラフを参照すべきである。
ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する更に別の方法は、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一な固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、（ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、（ｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記非内在性のＵＤＴを前記核酸分析物の３′末端、前記第１核酸分析物の５′末端、または前記核酸分析物の前記３′末端および前記５′末端の両者に付着させ、（ｃ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、（ｄ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーのＵＤＴと接触させて、複合体を形成し、（ｅ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｆ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する。核酸アレイ、改変、固体支持体、直接的/間接的固定/不動化、分析物のライブラリー、結合手段、ＵＤＥｓ、ＵＤＥｓからの信号発生、直接的/間接的信号発生、重合化手段等に関しては、前述した通りでありこの直前に説明したプロセスにも等しく適用できる。
ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する他の方法は、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一な固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、（ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、（ｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、（ｃ）前記非内在性のＵＤＴを前記核酸コピーの３′末端、前記第１の核酸コピーの５′末端、または前記核酸コピーの前記３′末端および前記５′末端の両者に付着させ、（ｄ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｅ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーのＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、（ｆ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する。前述したエレメントの説明は先の通りであり、この直前に説明したプロセスにも等しく適用できる。
ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する更に他の方法は、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一な固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、（ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、（ｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、（ｃ）前記非内在性のＵＤＴを前記核酸コピーの３′末端、前記第１の核酸コピーの５′末端、または前記核酸コピーの前記３′末端および前記５′末端の両者に付着させ、（ｄ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーのＵＤＴと接触させて複合体を形成し、（ｅ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、（ｆ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する。これらエレメントとサブエレメントとは、本開示の別の場所で説明した。この説明はこの直前に説明したプロセスにも適用できる。
ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量するさらに他の方法は、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的でありかつ固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）核酸ハイブリッドにより形成された複合体形成領域に結合し、直接或いは間接的に信号を発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥｓ）と、（ｉｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、（ｂ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の核酸コピーを合成し、（ｃ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドでありかつ複合体形成領域を提供するハイブリッドを形成し、（ｄ）前記ＵＤＥｓを前記ハイブリッドに接触させて、前記アレイに結合する複合体を形成し、（e）前記アレイに結合したＵＤＥｓから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することで、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する。前述のエレメントとサブエレメント並びにこれらの変更例は本開示の別の場所で説明するが、この直前に説明したプロセスにも等しく適用できる。
本発明の１つの態様は、エンドユーザーによるラベルされたヌクレオチドを酵素により組込む必要性をなくす方法を開示する。特筆する態様によれば、核酸分析物の様々な群に存在する一般に知られた或いは改変されていない機構を利用して分析物のハイブリダイゼーションの範囲を分析してターゲットとなるエレメントをアレイ形式で分離する。これら一般に知られた或いは改変されていない機構は、ユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴｓ）であり、ユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥｓ）の結合により信号を発生し得る。
様々な核酸分析物の群に潜在的に存在するＵＤＴｓは、３´ポリＡセグメント、５´キャップ、２次的構造およびコンセンサス配列で構成し得るが、これらに限定されるものではない。本発明で利用し得る一致する部位の例は、ポリＡ付随物、スプライシングエレメント、Ａｌｕ配列のようなマルチコピー反復で構成し得るが、これらに限定されるものではない。
ＵＤＥｓは、直接的或いは間接的にラベルされてもよい。直接的なラベルの例は、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群の如何なる構成要員で構成し得るが、これらに限定されるものではない。
間接的なラベルの例は、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群からの如何なる構成要員で構成し得るが、これらに限定されるものではない。この酵素は、が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する如何なる酵素でもよい。
ＲＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼは、重合化に際しラベルされたヌクレオチドを物質として受け入れることがしばしば難しい。従来技術においては、この欠点により、２乃至３の信号発生体を有する短いストランドからなるラベルされたライブラリーが生成される結果となり得る。このような非効率的な組込みによる限定は、反応混合物中のラベルされた前駆体の量を増加することで部分的には相殺される。しかし、この方法は、ある程度の改良を達成するに過ぎず、コストが高くなりさらにラベルされた反応物を無駄に消費する結果となる。これに対し、本発明の特筆すべき態様によれば、ライブラリー中の様々な核酸を、操作或いは修飾する必要無しに自然の形態でアレイ形式でハイブリダイズでき、アレイに結合したＵＤＴｓの存在により検出できる手段を開示する。
このプロセスの図示した例を図１に示す。あるサンプル中の様々な核酸の集合を作り出すｍＲＮＡには多数の固有の種が存在するが、これら核酸によりシェアーされる共通のエレメントを、ＵＤＴｓとして使用し得る。ｍＲＮＡのアレイへのハイブリダイゼーションは、個々の種が局在化するのを可能にし、アレイの場所を分離する。アレイの各位置に結合したサンプルの定量化は、適当なＵＤＥの結合により各位置に存在するＵＤＴの量を検出することで行う。従って図１において、位置１及び３はこれら位置の各々に結合するｍＲＮＡの量に比例する信号量を発生する能力を有する。一方で、位置２からの信号の発生は殆ど或いは全く無い。なぜならこの位置に結合するｍＲＮＡが殆ど或いは全く存在しないからである。殆どが或いは相補的にポリＴ或いはＵである単一のラベルされた種をＵＤＥとして使用し、図１の真核性のｍＲＮＡの様々な種のポリＡテイルの量を定量化してもよい。この方法によれば、ラベルされたものの単一ユニバーサル種を合成して、ＵＤＥとして使用し、定量化するＲＮＡ分子を間接的にラベルする安価で効率的な手段を提供する。
核酸ＵＤＥは化学的或いは酵素的に調製し得る。例えば、オリゴヌクレオチドを合成する装置は市販されており、ラベルされたポリＴ/Ｕ配列からなるＵＤＥを生成し、前述したポリＡＵＤＴの検出を行うことが可能である。ラベルされた部分の量と位置を厳密にこの方法により制御できる。また、これは、ホモ重合化生成物であるため、１又はそれ以上の塩基分だけ短いプローブでもまだ有効なはずであり、使用可能な生成物の実行収率は、区別された特定配列を必要とするものより高いはずである。一方、このような配列を酵素で合成する方法は当業者に周知である。一般的には、ｄＴのテトラマーをプライマー使用してポリＴ或いはポリＵを末端転写酵素により付加する。各塩基を変えて信号を発生できるようにするか、或いはラベルされた又はラベルされていない塩基の混合物を使用し得る。ポリＡＵＤＴを前記例で説明したが、異なる配列をＵＤＴｓとして使用する場合、対応するＵＤＥｓの合成を前述した同一の化学的及び酵素を使用した手法で行うことができる。ＤＮＡの類似物を使用しＵＤＥｓを合成し得ることが予想される。例えば、ＤＮＡの使用に代え、ラベルされたＲＮＡ或いはＰＮＡ（ペプチド核酸）を使用してもよい。
特定の座に結合されたＵＤＴｓの量の検出及び定量を、ＵＤＥとして作用する抗体を使用して行ってもよい。ＵＤＥｓとして使用し得る抗体の種の例は完全なｍＲＮＡの５´末端でキャップエレメントの認識或いはホモ重合化ポリＡ配列で構成してもよいが、これらに限定されるものではない。更に、核酸間のハイブリダイゼーションにより、抗体ＵＤＥｓで認識できるＵＤＴを生成し得る。例えば、アレイに結合した様々なＲＮＡ種のライブラリーが存在する場合、アレイ中のＲＮＡターゲットエレメント、ＤＮＡターゲットエレメント、ＰＮＡターゲットエレメントは、定量化される特定ＲＮＡ伴う相同性を有する各座で、ＲＮＡ/ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ/ＤＮＡハイブリッド、或いはＲＮＡ/ＰＮＡハイブリッドを生成するであろう。部位の各々は１つの分離された配列を有するにもかかわらず、汎用的な検出及び定量を、このようなハイブリダイゼーションにより生成された物理的構造の変化を認識する抗体により行うことが可能である。これに代えて、アレイのターゲットエレメントに結合した核酸のＵＤＥ及び相補的ＵＤＴ間のハイブリダイゼーションを、適当な抗体で検出してもよい。前述したＵＤＥｓに固有の抗体はそれら自身でラベルされてもよく或いは、二次的にラベルされた抗体を使用して信号を増強してもよい。
ｍＲＮＡの単一のライブラリーのみが解析される場合、ＲＮＡを検出プローブのアレイにハイブリダイズした後、或いはその前にＵＤＥをＵＤＴに結合してもよい。事象の起きる特定の順番は結合パートナーの本質及び安定性に依存する。二つのライブラリーからの分析物を同時に比較する場合、好適には各ＵＤＥの結合パートナーへの結合を行った後、ターゲットエレメントのアレイへのハイブリダイゼーションを行うことで、各ライブラリーを違いがわかるようにラベルする。典型的には比較は２つのライブラリー間で行うが、各ライブラリーが他のライブラリーと区別する信号を発生する能力がある限り、如何なる数の比較を同時に行ってもよい。一方、同時にハイブリダイゼーションおよび検出を行うよりむしろ、複数のアレイを並列或いは縦列で使用してもよい。この形式では、ハイブリダイゼーションおよび検出を各ライブラリー毎に分けて行い、解析結果を後で静的状態にある遺伝子の規格化された比較対象と比較する。
本発明の他の態様において、ＵＤＴｓ又はＵＤＥｓは、ライブラリーの様々な核酸中に人工的に組込む。ＲＮＡ分析物に特に使用されることが確認された酵素は、ＲＮＡの３´末端にアデニンリボヌクレオチドを特に加えるポリＡポリメラーゼ、並びにＲＮＡ分析物の５´末端或いは３´末端のいずれかにオリゴヌクレオチド或いはポリヌクレオチドを加えることが可能なＲＮＡリガーゼで構成してもよいが、これらに限定するものではない。この手段により、ホモ重合化された配列或いは内在性の配列のいずれかを加えてＵＤＴｓ或いはＵＤＥｓとして作用させてもよい。ＲＮＡ分析物に特に使用されることが確認された酵素は、３´末端に加えるための末端転写酵素及び３´末端或いは５´末端に加えるためのＲＮＡリガーゼで構成してもよいが、これらに限定するものではない。核酸分析物に組込む配列を、ＵＤＥの合成或いは付加中にラベルしてもよく、又逆に、ラベルしていないＵＤＴｓを合成或いは付加し、対応するラベルされたＵＤＥｓにより後に検出してもよい。スプライスしていないＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ又はｒＲＮＡを分析物として使用する場合、この視点は取分け有益である。なぜなら、これらはＵＤＴｓとして有用であると先に説明したｍＲＮＡ中に存在する潜在的なエレメントを欠いているかもしれないからである。本発明のこの視点は、原核ｍＲＮＡに使用されることが確認されるであろう。なぜなら、ｍＲＮＡの潜在的ＵＤＴｓとして先に述べたポリＡ付加、５´キャップ及びスプライスエレメントは、本質的には原核生物中には存在しないためである。
本発明のこの特筆すべき視点は、フラグメント化のプロセスに関連して使用してもよい。具体的には、真核生物から導出されたｍＲＮＡ分子は、プロセスの後でさえもとても大きい可能性がある。このサイズ要因は、ハイブリダイゼーションを阻害するか、或いはアレイ中のターゲットエレメントに結合するのに使用するセグメントと、信号発生に使用するＵＤＴとの間が分離するのを許容する。加えて、フラグメント化の工程は、ＲＮＡ中に存在する二次的な構造物の量を減少させる可能性がある。したがって、本発明のこの態様によれば、ＲＮＡを小さいサイズのフラグメントに物理的或いは酵素を使用してフラグメント化して、続いてＵＤＴｓ或いはＵＤＥｓとして作用し得る配列を加えてもよい。核酸のフラグメント化の物理的手段の例は、シェアリング処理又はアルカリ処理を含むが、これに限定するものではない。酵素を使用する手段の例は、ヌクレアーゼ（核酸分解酵素）或いはリボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）による部分的な分解を含むが、これに限定するものではない。
加えて、殆どの資源からのＤＮＡは、その自然のままの形態では極めて大きいことが予想される。ＤＮＡ分析物を、好適な物理的あるいは酵素による手段でフラグメント化してもよい。とりわけ有用な酵素による手段は、制限酵素の使用であり、制限酵素を認識する配列の本質は、フラグメントの平均サイズを決定する。また、殆どの制限酵素のテンプレートとしてダブルストランドＤＮＡを必要とし、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ及びＭｎｌｌのような幾つかの酵素は、シングルストランドＤＮＡを効率的にクリーブする（２０００−２００１カタログ、ニューイングランド、バイオラボ、べべリー、マサチューセッツ、２１４頁）。このフラグメント方により、単一の分析物の分子は、多数のサブフラグメントに変換され、それぞれが、人工的にＵＤＴ或いはＵＤＥを導入する。本発明のこの特筆すべき態様の例示は、図２に含まれる。
本発明の他の態様によれば、アレイによる分析に分析物を直接使用することに代えて、ライブラリー中の様々な核酸をテンプレートとして使用して相補的核酸コピーを合成する。分析物のテンプレートは、内在性のＵＤＴｓを有してもよく、また、先に述べた手段により人工的に組込まれたＵＤＴｓを有してもよい。一方、ＵＤＴｓは分析物のテンプレート中に存在する必要はなく、人工的ＵＤＴｓを核酸コピーの合成中或いは合成後に組込んでもよい。ＤＮＡテンプレートのコピーを作成するのに使用し得る酵素の例は、ＤＮＡコピーを合成するためのＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡコピーを合成するためのＲＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されるものではない。本発明において、ＤＮＡに基づくＤＮＡコピーの合成に使用し得るＤＮＡポリメラーゼの例は、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプト、およびこれらの様々な完成した形態或いは代替する形態を含むが、これらに限定されるものではない。本発明において、ＤＮＡテンプレートに基づくＲＮＡコピーの合成に使用し得るＲＮＡポリメラーゼの例は、バクテリオファージＴ３ＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、及びバクテリオファージＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されるものではない。本発明において、ＲＮＡテンプレートのＤＮＡコピーの作成に使用し得る酵素の例は、ＡＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプト、オムニスクリプト、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、およびこれらの様々な完成した形態或いは代替する形態を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明において、ＲＮＡテンプレートのＲＮＡコピーの作成に使用し得る酵素の例は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されるものではない（コーニン、１９９１年Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ.７２、２１９７−２２０６頁ここに参考文献として加える）。
分析物テンプレートの相補的コピーの効果的な合成は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる効果的な合成のためのプロモータの存在が必要であり、一方他の例示的に引用した酵素はプライマーを必要とする。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるべくＤＮＡ分析物へＵＤＴを組込むには、ＤＮＡリガーゼの作用によるＵＤＴ配列とプロモーター配列とのライゲーション（結合・合成）で行ってもよいが、これに限定されるものではない。このプロセスは、以下のように表わされる。
ＤＮＡ分析物＋ＵＤＴ--プロモータ＝ＤＮＡ分析物--ＵＤＴ--プロモータ
この構造の転写により、「３´分析物--ＵＤＴ５´」構造を有するＲＮＡの生成が可能となる。
本発明のこの特筆すべき１態様を実行する１つの手段は、制限酵素による様々なダブルストランドＤＮＡ分析物のライブラリーを分解し、その後続いて、ＲＮＡプロモーター配列からなるダブルストランドＤＮＡセグメントをライゲーション（結合・合成）することである。転写単位でのその後の転写により、ラベルされた或いはラベルされていない転写物を合成する。ラベルされていない転写物は内在するＵＤＴｓ或いは合成による付加されたＵＤＴｓのいずれかの存在下で検出することができる。
プライマーを使用し分析物テンプレートの相補的コピーを合成する場合、このプライマーは、ランダムな配列或いは分析物テンプレートに結合するため選択された配列から構成し得る。事象を開始するために使用されたランダムプライマーは、ヘキサマーからドデカマーの範囲である。プライマーとして有用である選択された配列は、内在する配列或いは分析物のテンプレート中に導入された非内在性の配列に相補的であってもよい。内在する配列の例は、コンセンサス配列又はホモ重合化された配列を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。コンセンサス配列は、研究されている集団の大部分中に保有されるエレメントから導出され得る。これらの例は、ポリＡ付加部位、スプライスエレメント、Ａｌｕ配列のようなマルチコピーの繰返しで構成してもよいが、これらに限定されるものではない。プライマー結合のため使用される内在するホモ重合化された配列の１例は、真核生物中の完全なｍＲＮＡに固有のポリＡテイルであってもよい。プライマー結合のため使用される非内在性ホモ重合化された配列或いは内在性の配列を、ポリＡポリメラーゼ或いはＲＮＡリガーゼを含んでもよいがこれらに限定されるものではない手段により、ＲＮＡテンプレート中に導入してもよい。プライマー結合のため使用される非内在性ホモ重合化された配列或いは内在性の配列を、末端転写酵素及びＤＮＡリガーゼを含んでもよいがこれらに限定されるものではない手段により、ＤＮＡテンプレート中に導入してもよい。人工的に結合する部位を、完全な核酸テンプレート中に導入してもよく、或いはフラグメント化プロセスを前述したように実行してもよい。
ホモ重合化された配列或いは変更されていない配列をプライマー結合部位として使用する場合、１又はそれ以上の付加的な分離された塩基を３´末端で合成したプライマーを使用してライブラリーを更に分割してもよい。例えば、式５´-ＴｎｄＣ-３´を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、ポリＡテイルでｍＲＮＡの集団全体をプライムするよりむしろ、ポリＡテイルの前の最後の塩基がＧであったｍＲＮＡを好適にプライムする。同様の原理が、５´-ＴｎｄＧ-３´プライマー或いは５´-ＴｎｄＡ-３´プライマーを使用する場合にも言える。このことにより、ポリＡテイルを有するＲＮＡ集団全体を全体として含むべきｍＲＮＡの原集団のコピーの３つの分離したサブ集団が提供される。この集団をさらに、プライマーの３´末端に第２の独立する塩基を含ますことで分割してもよい。この場合、オリゴヌクレオチドは、一番後ろの塩基として３´末端にｄＣ、ｄＧ或いはｄＡのいずれかを有し、後ろから２番目の位置にｄＣ、ｄＧ或いはｄＡのいずれかを有し、残りの部分はポリＴセグメントからなる。これにより、原集団に基づく１２の分離したプールができる可能性がある。更に、３´末端から３つ目のヌクレオチドの位置に独立塩基を設けたので所望により４８個の異なるサブ集団へと分離する。
サブ集団の使用はＲＮＡにより低い複雑さをもたらし、これによって分析がよりシンプルになる。加えて、３´末端に独立塩基を使用することで、ｃＤＮＡコピーの末端部でポリＴテイルのサイズが限定される。なぜなら、プライミング事象の意味のある量、ポリＡ付加部位の接合で単に実行されるためである。このことにより、過剰なポリＴトラック或いはポリＡトラックにより引き起こされるバックグランドハイブリダイゼーションが減少する可能性がある。また、長いホモ重合化トラックにより引き起こされるストール状態での終了或いは早熟状態での終了を減少させることによりラベルされた生成物の収率を増加させることが可能である。一方、オリゴＴプライマーと３´末端の独立塩基を混合状態で使用することは、分析物の元の配列の完全に合成する能力があり、一方でホモ重合化テイルのサイズを抑制する能力を同時に保有している点で相補的ホモ重合化オリゴＴプライマーに似ていることが多い。
本発明の特筆すべき態様によれば、ＲＮＡテンプレートのプールから合成されたｃＤＮＡ分子はＵＤＴｓ或いはＵＤＥｓから構成される。前述したように、これらＵＤＴｓは潜在的に内在していてもよく、或いはこれらはｃＤＮＡの合成中に人工的に組込まれた非内在性配列であってもよい。分析物が、ＵＤＴとして使用し得る核酸配列を有する場合、相補的コピーを合成することで、ＵＤＴとして使用し得る配列が生成される。例えば、真核生物のｍＲＮＡの３´末端のポリＡ配列は、潜在的なＵＤＴであるとして先に説明した。付加的な塩基を伴い或いは伴わずにポリＴプライマーの伸長により、このｍＲＮＡをテンプレートとして使用する場合、ｃＤＮＡコピーのポリＴセグメントはＵＤＴとして作用し得る。ｃＤＮＡによるＲＮＡテンプレートの分解或いは分離により、ｃＤＮＡの５´末端でポリＴが、ラベルされたポリＡ ＵＤＥの結合によりＵＤＴとして作用することが可能になる。また、ランダムプライマー、ホモ重合化プライマー或いは特定配列プライマーの５´テイルへ、プライマー結合に参加しない核酸セグメントを含ますことで、ｃＤＮＡコピーにＵＤＴｓ或いはＵＤＥｓを組込んでもよい。ＵＤＴｓとして使用する付加的な核酸セグメントの特定配列は、プライマー結合するのに必要としないため、任意の自然のものである。このように、これらＵＤＴｓのための配列の選択は、その複合性に関し、ホモ重合化された配列から特定の内在性配列の範囲とすることができる。これらの本質もまた任意で、プライマー或いはＵＤＴのいずれかがＰＮＡの同一物か或いは他の核酸の同一物で構成してもよい。加えて、ＵＤＥｓを認識する核酸の他の重合体であってもよい。
ＵＤＴ或いはＵＤＥの本質はユーザーが選択してもよいため、本発明によれば、比較されるライブラリー間の違いを出すだけでもよい。例えば、研究中の１つの集団をホモ重合化プライマー或いはランダムプライマーにより伸長し、Ｃｙ３によりラベルされたＵＤＥでハイブリダイズしてもよい。比較する第２の集団をホモ重合化プライマー或いはランダムプライマーにより伸長し、Ｃｙ５を組込んだＵＤＥでハイブリダイズしてもよい。ｃＤＮＡの他の末端をＵＤＥｓと供に使用し得る。例えば、逆転写酵素によるｃＤＮＡのコピーの合成後、末端転写酵素により非テンプレート目的でヌクレオチドを付加して３´末端を伸長してもよい。本発明のこの特筆すべき態様は、図３中に図示する。
様々な核酸のライブラリー中のＵＤＴｓあるいはＵＤＥｓの存在の検出は、ＵＤＴｓに関連して先に述べた手段のいずれかで行ってもよい。たった１つのライブラリーが分析される場合、５´或いは３´のＵＤＴあるいはＵＤＥへのプローブ即ち抗体の結合を、アレイの検出エレメントへの核酸のハイブリダイゼーションの前で行ってもよく或いは後でもよい。事象の特定順は結合パラメータの本質及び安定性に依存する。一方、各集団が異なるＵＤＴ或いはＵＤＥを含む場合、ラベルされたもののＵＤＴｓへの結合は、分析物のコピーのアレイへのハイブリダイゼーションの前でも後でもいずれでもよい。しかし、並列或いは縦列にハイブリダイゼーションを行う場合、前述したように同一のＵＤＴ或いはＵＤＥを各集団に対し使用してもよい。
また、本発明の様々な形態を、他の先に開示した方法に代えるのではなく、むしろ先の方法に加えて使用し得ることが予想される。例えば、ラベルされたヌクレオチドの存在下で伸長される原プライマーにより、信号をｃＤＮＡ中で発生させてもよい。このような方法で発生した信号は、ラベルしたヌクレオチドがストランドの伸長中に組込まれたとしても、原プライマーにより発生した信号の和である。したがって、これら手法を組み合わせることで各方法単独により達成される量より高い信号が生成されるはずである。予めラベルされたプライマーに加えて、本発明で開示する他の方法を様々な組み合わせで使用してもよい。
サンプル中の配列の増幅が有利となる場合がある。したがって、本発明の他の態様によれば、合成を沢山繰返し行い、様々な核酸配列のライブラリーの線形増加を引き起こしてもよい。本発明のこの特筆すべき態様の第１の工程によれば、核酸分析物の集団全体或いは集団のサブセットを使用し、第１のストランドの核酸コピーを合成する。本発明に限れば、最初の分析物はＤＮＡ或いはＲＮＡであり、分析物の核酸コピーであるため、この生成物をｃＮＡ（相補的核酸）とみなす。第１のストランドの核酸コピーの合成は前述したように、独立したプライマー、ランダムプライマー、ホモポリマー或いは３´末端に１又はそれ以上の分離した塩基を有するホモポリマーを使用して行ってもよい。本発明のこの特定の実施例によれば、３´末端で１又はそれ以上の独立塩基を有するホモポリマーでプライムすることで、増幅効率を増大させることができる。なぜなら、プライマーやサブストレートのような資源は、第１のｃＮＡ（相補的核酸）の合成反応に導出された分離したサブ集団の増加のみを目的とするためである。
線形増幅に関し、ある１つの核酸分析物のプライマー結合部位を、テンプレートからの第１のｃＮＡ（相補的核酸）の分離により多数回使用し、その後続けてある１つの新たな第１のｃＮＡ（相補的核酸）のコピーを再開する。反応物を高温に曝すことで分離を行ってもよい。核酸の合成のために使用する酵素がＴａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ或いは幾つかの他の熱的に安定したポリメラーゼである場合、多くの反応を他の如何なる反応も追加することなく、反応を熱的に繰返すことで行ってもよい。一方、変質させるような高温で、熱的に不安定な酵素、例えばＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ポリＩのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント或いはＭｕＬＶ逆転写酵素を使用する場合、酵素の付加逆性熱非活性化を行い、酵素を再度補充してさらなるｃＮＡ（相補的核酸）の合成を行うべきである。代替的には、フュラー（Ｆｕｌｌｅｒ）による米国特許第５、４３２、０６５及び、ラコバシビル（Ｌａｋｏｂａｓｈｖｉｌｌ）とラピドット（Ｌａｐｉｄｏｔ）による１９９９年（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７；１５６６−１５６８）に、核酸の低温による変質を可能にする反応およびＰＣＲを伴う使用につき開示されており、双方の方法は、参照文献としてここに加える。更に、ウィンホウベン（Ｗｉｎｈｏｖｅｎ）及びロサウ（Ｒｏｓｓａｕ）がＰＣＴ出願ＷＯ９８/４５４７４（参照文献としてここに加える）中で、２価のイオンレベルを電気的制御操作することで、温度操作をしなくてもよいことを開示している。したがってこれらの方法により、たとえ熱的に不安定な酵素であっても合成を多数回繰返し線形増幅を行うことが可能である。前述した特許文献及び前述した刊行物を参照文献としてここに加える。
増幅は本発明の意味のある顕著な態様であり、幾つかの組成物及びプロセスは増幅のためにだけ存在する。例えばここで提供するものは、インビボ複製が実質的に不可能であると共に非内在性のホモ重合化された配列を持たないダブルストランド核酸のライブラリーからなる組成物であって、前記核酸はサンプルから得られたライブラリーの内在する配列に部分的もしくは全体的に相補的もしくは同一である配列を含み、前記ダブルストランド核酸は前記ダブルストランドの１端部に近位する少なくとも１つの内在するユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と、前記ダブルストランドの他端部に近位する少なくとも１つの非内在性のプロダクションセンター（生成源）とを含む。ライブラリーの内在する配列を得るサンプルは、生物資源例えば、器官、組織および細胞であってもよい。他の場所で説明したように、核酸の前記ライブラリーがゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよびそれらの任意の組合せから導出してもよい。内在性のＵＤＴが３′ポリＡセグメント、コンセンサス配列またはその両者よりなる群から選択されてもよい。先に既に述べたように、コンセンサス配列を、ポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよびこれらの任意の組合せよりなる群から選択してもよい。特筆すべきことは、プロダクションセンター（生成源）を、プライマー結合部位、ＲＮＡプロモータまたは両者の組合せよりなる群から選択してもよい。このようなＲＮＡプロモータはファージプロモータ例えばＴ３、Ｔ７およびＳＰ６からなるものであってもよい。
増幅目的の他の組成物は、インビボ複製が実質的に不可能であるダブルストランド核酸のライブラリーからなり、このような核酸がサンプルから得られたライブラリーの内在する配列に対し部分的もしくは全体的に相補的もしくは同一である配列からなり、ダブルストランド核酸はこのダブルストランドの１端部に近位する少なくとも４個（４）の非内在性のヌクレオチドと前記ダブルストランドの他端部に近位する非内在性のプロダクションセンター（生成源）とを含んでもよい。このようなエレメント例えばサンプル、核酸のライブラリー、内在するＵＤＴｓ、非内在性のヌクレオチド、非内在性のプロダクションセンター（生成源）、例えばＲＮＡプロモータ、例えばファージプロモータ（Ｔ３、Ｔ７およびＳＰ６）の説明は本開示の別の場所で行われるが、この直前の組成物にも等しく適用できる。
増幅のための他の組成物は、固体支持体に固定されたダブルストランド核酸のライブラリーからなり、この核酸は、サンプルから得られるライブラリーの内在する配列に部分的もしくは全体的に相補的もしくは同一である配列を含み、さらに前記核酸が前記ダブルストランドの１端部に近位する非内在性の核酸の少なくとも１つの第１配列セグメントと前記ダブルストランドの他端部に近位する少なくとも１つの第２配列セグメントとを含み、前記第２配列セグメントが少なくとも１つのプロダクションセンター（生成源）を含む。特筆すべきは、ビーズ取分けビーズ及び磁性ビーズを固体支持体として使用することである。他のエレメント例えばサンプル、生物資源、核酸のライブラリー、内在するＵＤＴｓ、非内在性のプロダクションセンター（生成源）については既に説明した。
他の増幅型組成物は、固体支持体に付着したダブルストランド核酸のライブラリーからなり、前記核酸は部分的または全体的にサンプルから得られるライブラリーの内在する配列に相補的または同一である配列を含み、前記ダブルストランド核酸は前記ダブルストランドの１端部に近位する少なくとも１つの内在するユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ダブルストランドの他端部に近位する少なくとも１つの非内在性のプロダクションセンター（生成源）とを含む。エレメント及びサブエレメント（固体支持体、ビーズ、磁性ビーズ、サンプル、核酸ライブラリー、内在性ＵＤＴｓ、コンセンサス配列、プロダクションセンター、ＲＮＡプロモーター、ファージプロモーター例えばＴ３、Ｔ７，ＳＰ６は、前述した。
ライブラリーにおいて意図する複数の核酸を検出もしくは定量するに際し有用なプロセスは、（ａ）（ｉ）部分的または全体的に前記意図する核酸の配列に同一もしくは相補的である固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段であって、この重合化手段は第１セットのプライマーと第２セットのプライマーとを含み、前記第２セットのプライマーは少なくとも２つのセグメントを含み、３′末端における第１セグメントはランダム配列を含み、第２セグメントは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む重合化手段と、（ｉｖ）核酸コピーを等温性もしくは平衡の条件下で合成する手段とを設け、（ｂ）核酸分析物の前記ライブラリーを前記第１セットのプライマーと接触させて複数の第１の結合体を形成し、（ｃ）前記結合した第１セットのプライマーを前記核酸分析物により与えられたテンプレート配列により伸長されて前記分析物の第１のコピーを形成させ；
（ｄ）前記伸長した第１のコピーを前記第２セットのプライマーと接触させて複数の第２結合物質を形成し、（ｅ）前記結合した第２セットのプライマーを前記伸長した第１のコピーにより与えられたテンプレート配列により伸長させて伸長した第１のコピーと伸長した第２セットのプライマーとからなる複数の複合体を形成し、（ｆ）前記複合体における前記第２セットのプライマーのプロダクションセンターから等温若しくは平衡条件下で１もしくはそれ以上の核酸コピーを合成し、（ｇ）工程（ｆ）で形成した前記核酸コピーを工程（ａ）（ｉ）で形成した前記核酸のアレイにハイブリダイズさせ、（ｈ）工程（ｇ）で得られた前記ハイブリダイズコピーを検出もしくは定量する。このプロセスで参照したエレメント及びこれらのサブエレメントは、本開示で既に述べた。特筆すべきことは、内在性のＵＤＴｓに相補的なプライマーの第１のセットである。更に記載すべきことは、ハイブリダイズされた核酸がこれに付着或いは組込まれた１又はそれ以上の信号発生体から構成してもよいことである。先に多様に記載したように、信号の検出は、直接的でも間接的でもよい。プロセスは更に、工程（ｃ）から得られた第１のコピーをそのテンプレートから分離する工程をさらに含み、工程（ｂ）を繰返す工程を含んでもよい。また、工程（ｆ）から得られた伸長した第２のセットのプライマーをそのテンプレートから分離する工程をさらに含み、工程（ｅ）を繰返す工程を含んでもよい。工程（ｇ）を反復して行ってよい。本発明により提供される特徴及び直前に記載したプロセスがッ前述された。更に、等温性もしくは等恒常性の条件下で核酸コピーの合成が、ＲＮＡ転写、ストランドの置換・増幅および２次的構造増幅よりなる群から選択される１もしくはそれ以上の要因により行われる。このプロセスの使用は全て予測されることである。
ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する他の工程は、（ａ）（ｉ）部分的もしくは全体的に前記意図する核酸の配列に同一もしくは相補的である固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、前記重合化手段は第１セットのプライマーと第２セットのプライマーとを含み、前記第１セットのプライマーは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む重合化手段と、（ｉｖ）等温性もしくは平衡の条件下で核酸コピーを合成する手段とを設け、（ｂ）前記核酸分析物のライブラリーを前記第１セットのプライマーと接触させて複数の第１の結合体を形成し、（ｃ）前記結合した第１セットのプライマーを前記核酸分析物により与えられたテンプレート配列により伸長して前記分析物の第１のコピーを形成し、（ｄ）前記第１のコピーを少なくとも４種（４）もしくはそれ以上の非内在性のホモポリマーヌクレオチドにより伸長し、（ｅ）前記伸長した第１のコピーを前記第２セットのプライマーと接触させて複数の第２結合物質を複合体を形成し、（ｆ）前記複合した前記第２セットのプライマーを前記伸長した第１のコピーにより与えられたテンプレート配列により伸長させて伸長第１のコピーと伸長第２セットのプライマーとからなる複数の複合体を形成し、（ｇ）前記複合体における前記第２セットのプライマーのプロダクションセンターから等温性もしくは平衡な条件下で１もしくはそれ以上の核酸コピーを合成し、（ｈ）工程（ｇ）で形成された前記核酸コピーを工程（ａ）（ｉ）で与えられた核酸の前記アレイにハイブリダイズし、（ｉ）工程（ｈ）で得られた前記ハイブリダイズコピーを検出もしくは定量する。特筆すべきは、４つ又はそれ以上の非内在性ホモ重合化ヌクレオチドがそれら自身加えられる伸長工程ｄ）中に或いはその後で、熱転写酵素を使用或いは加えることである。本プロセスのエレメント及びサブエレメントは前述した。本発明の形態に尽き特筆する。例えば、等温性或いは等定常性条件下で核酸コピーの合成を、ＲＮＡ転写、ストランドの置換・増幅および２次的構造増幅よりなる群から選択される１もしくはそれ以上の要因により行ってもよい。更に、工程（ｃ）から得られた第１のコピーをそのテンプレートから分離する工程をさらに含み、工程（ｂ）を繰返す工程を含んでもよい。また、工程（ｆ）から得られた伸長した第２のセットのプライマーをそのテンプレートから分離する工程をさらに含み、工程（ｅ）を繰返す工程を含んでもよい。工程（ｇ）を必要に応じて反復して行ってよい。
ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法は、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸の配列と、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、ここで該第１のセットが少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、（ｉｖ）プライマーの該第２のセットの少なくとも１つのセグメントまたは配列に相補的なポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットと、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（ｉｖ）の該セットを連結するための手段を提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して、該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セットａ）（ｉｖ）を工程ｃ）において形成した該第１のコピーの３´末端に連結して、複数の連結された生成物を生成し、ｅ）プライマーの該第２のセットと、該連結された生成物とを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｆ）工程ｄ）において形成された該連結された生成物によって提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、該連結された生成物およびプライマーの該伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法である。本プロセスの態様は、核酸アレイ、修飾、固体支持体、固定化及び不動化、核酸分析物、ＵＤＴｓ、プロダクションセンター、信号発生、重合化手段、付加的な工程、繰返し工程、合成手段等を含むが、これらは先に記載され、この直前に記載したプロセスにも等しく適用する。特筆すべきは、前述のライゲートする手段が例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼであってもよい。
ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための他の方法は、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸の配列と、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、ここで該第２のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、（ｉｖ）プライマーの該第２のセットの少なくとも１つのセグメントまたは配列に相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットと、（ｖ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セット（ｉｖ）を連結するための手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セットａ）（ｉｖ）を工程ｃ）において形成された該第１のコピーの３´末端に連結して複数の連結された生成物を形成し、ｅ）プライマーの該第２のセットと、該連結された生成物とを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｆ）工程ｄ）において形成された該連結された生成物により提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、該連結された生成物およびプライマーの該伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法である。本プロセスに関し前述したエレメントの各々は、本開示の別の場所で説明した。この説明を本プロセスにも等しく適用する。プロセスに関し特筆すべきは、第１のセットのプライマーが、内在性のＵＤＴｓに相補的な１またはそれ以上の配列からなることである。ハイブリダイズした核酸コピーは、更に、これに付着するか或いはこれに組込まれた１またはそれ以上の信号発生体から構成してもよい。もしそうである場合、信号発生及び検出、例えば、直接的或いは間接的発生及び検出に関する前述の実施の形態は、本プロセスにも適用できる。他の同様のプロセスで既に述べたように、付加的なプロセスを行ってもよい。例えば、工程ｃ）から得られた第１のコピーをそれらのテンプレートから分離し、そして工程ｂ）を反復してもよい。工程ｆ）から得られたプライマーの伸長された第２のセットを分離し、そして工程ｅ）を反復する工程をさらに行ってもよい。また、工程ｇ）を反復して行ってもよい。
ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための他の方法は、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸の配列と、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセット、プライマーの第２のセット、およびプラスミドの第３のセットを含み、ここでプライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、該第３のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、結合されたプライマーの第１のセットを形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１のコピーとを接触して、結合されたプライマーの第２のセットを形成し、ｅ）該伸長された第１のコピーによって提供されるテンプレート配列によって結合されたプライマーの該第２のセットを伸長して、該核酸分析物の第２のコピーを形成し、ｆ）プライマーの該第３のセットと、該第２のコピーとを接触して、第３の結合体を形成する、複数の結合されたプライマーの第３のセットを形成し、ｇ）プライマーの該伸長された第２のセットによって提供されるテンプレート配列によって結合されたプライマーの該第３のセットを伸長して、第３のコピーおよび少なくとも１つのプロダクションセンターを含むハイブリッドを形成し、ｈ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｉ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｉ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｊ）工程ｉ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法である。本プロセスにおいて引用したエレメント、変更例及びサブエレメントは本開示の別の場所で説明した通りである。特筆すべきことは、第２のセットのプライマーとしてランダムなプライマーを使用することである。さらに、プライマーの前記第２のセットが該プライマー結合部位に相補的であってもよく、この場合プロセスが工程ｃ）を行った後にプライマー結合部位を含める工程ｃ´）をさらに含む。プライマー結合部位は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたは末端転移酵素の手段によって付加され得る。本プロセスの他の態様及び変更を行ってもよい。さらに、工程ｆ）から得られたプライマーの伸長された第２のセットを分離し、そして工程ｅ）を反復する工程を行ってもよい。工程ｇ）が反復して行ってもよい。くわえて、工程ｅ）において得られたプライマーの前記伸長された第２のセットを分離する工程ｆ´）をさらに行ってもよい。また、工程ｃ）から得られた第１のコピーをそれらのテンプレートから分離し、そして工程ｂ）を反復する工程をさらに行ってもよい。更に、工程ｆ）から得られたプライマーの伸長された第２のセットを分離し、そして工程ｅ）を反復する工程を行ってもよい。工程ｇ）が反復して行ってもよい。本プロセスの他の変更例として、プライマーの前記第２のセットが、プライマーの第３のセットにおける前記プロダクションセンターと核酸配列が異なる少なくとも１つのプロダクションセンターで構成されてもよい。
ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための他の方法は、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸の配列と、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセット、プライマーの第２のセット、ここでプライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、該第２のセットは少なくとも２つのセグメントを含む、第１のセグメントは３´末端にてランダムな配列を含み、および第２のセグメントは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、ｉｖ）等温または平行な条件下で核酸コピーを合成するための手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１のコピーとを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｅ）該伸長された第１のコピーによって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第２のセットを伸長して、伸長された第１のコピーおよびプライマーの伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、ｆ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｇ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｆ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｈ）工程ｇ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法である。本プロセスで先に引用したエレメント、変更例及びサブエレメントは、本開示の他の場所で説明する。これらの説明をこのプロセスにも適用する。
他の有意な方法の有用な説明は、ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するためのものである。この方法は、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、ここでプライマーの該第１のセットは固体支持体に固定化または不動化され、プライマーの該第１のセットが少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、（ｉｖ）等温または平衡な条件下で核酸コピーを合成するための手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長し、ｄ）少なくとも４つ以上の非内在性の同種重合体ヌクレオチドによって該第１のコピーを伸長し、ｅ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１のコピーとを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｆ）該伸長された第１のコピーによって提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、伸長された第１のコピーおよびプライマーの伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法である。本プロセスで先に引用したエレメント、変更例及びサブエレメントは、本開示の他の場所で説明する。これらの説明をこのプロセスにも適用する。
ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための他の方法は、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、ここでプライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、該第１のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、（ｉｖ）プライマーの該第２のセットの少なくとも１つのセグメントまたは配列に相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットと、（ｖ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セット（ｉｖ）をライゲートするための手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セットａ）（ｉｖ）を工程ｃ）において形成された該第１のコピーの３´末端にライゲートして複数のライゲートされた生成物を形成し、ｅ）プライマーの該第２のセットと、該ライゲートされた生成物とを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｆ）工程ｄ）において形成された該ライゲートされた生成物により提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、該ライゲートされた生成物およびプライマーの該伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法である。本プロセス中で引用したエレメントの説明を本開示の他の場所で行うため、繰返し説明せず、本プロセスにも説明を等しく適用する。
ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法は、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、プライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、およびここで該第２のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、（ｉｖ）プライマーの該第２のセットの少なくとも１つのセグメントまたは配列に相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットと、（ｖ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セット（ｉｖ）をライゲートするための手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セットａ）（ｉｖ）を工程ｃ）において形成された該第１のコピーの３´末端にライゲートして、複数のライゲートされた生成物を形成し、ｅ）プライマーの該第２のセットと、該ライゲートされた生成物とを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｆ）工程ｄ）において形成された該ライゲートされた生成物により提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、該ライゲートされた生成物およびプライマーの該伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法である。本プロセス中で引用したエレメントの説明については、前の幾つかのパラグラフのいずれかを参照のこと。
ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための他の方法は、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセット、プライマーの第２のセット、およびプラスミドの第３のセットを含み、プライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、およびここで該第３のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、ｄ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１のコピーとを接触して、複数の第２の結合体を形成し、ｅ）該伸長された第１のコピーによって提供されるテンプレート配列によって該結合されたプライマーの第２のセットを伸長して、プライマーの伸長された第２のセットを形成し、ｆ）工程ｅ）において得られたプライマーの該伸長された第２のセットを分離し、ｇ）プライマーの該第３のセットと、プライマーの該伸長された第２のセットとを接触して複数の第３の結合体を形成し、ｈ）プライマーの該伸長された第２のセットによって提供されるテンプレート配列によって該第３の結合体を伸長して、該伸長された第３の結合体およびプライマーの該伸長されたセットを含む複数の複合体を形成し、ｉ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、ｊ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｉ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｋ）工程ｊ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法。前記エレメントの説明に関しては本開示を参照のこと。
ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための他の方法は、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一な固定化または不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットを含む、重合化手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの第１のセットの該結合されたセットを伸長して該分析物の第１の核酸コピーを形成し、ｄ）該分析物から該第１の核酸コピーを分離し、ｅ）所望の量の第１の核酸コピーが合成されるまで工程ｂ）、ｃ）、ｄ）を繰返し、ｆ）工程ｉ）において提供される核酸の該配列に、工程ｅ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、ｇ）工程ｆ）において得られた該ハイブリダイズされた第１の核酸コピーのいずれかを検出または定量する方法である。これらエレメントは本開示の他の場所で説明する。
ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための他の方法は、ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一な固定化または不動化された核酸のアレイと、（ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセット、プライマーの第２のセットを含む、重合化手段と、（ｉｖ）核酸の３´末端への配列の付加のための手段とを提供し、ｂ）プライマーの該第１のセットと、該核酸分析物とを接触して、第１の結合体を形成し、ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの第１のセットの該結合されたセットを伸長して該分析物の第１の核酸コピーを形成し、ｄ）該第１の核酸コピーの３´末端への非テンプレート由来の配列の付加によって該第１の核酸コピーを伸長し、ｅ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１の核酸コピーとを接触して第２の結合体を形成し、ｆ）該伸長された第１の核酸コピーによって提供されるテンプレート配列によってプライマーの第２のセットの該結合されたセットを伸長して、第２の核酸コピーを形成し、ｇ）伸長された第１の核酸コピーから該第２の核酸コピーを分離し、ｈ）所望の量の第２の核酸コピーが合成されるまで工程ｅ）、ｆ）、ｇ）を繰返し、ｉ）工程（ｉ）において提供される核酸の該配列に、工程ｈ）において形成された該第２の核酸コピーをハイブリダイズし、ｊ）工程ｉ）において得られた該ハイブリダイズされた第２の核酸コピーのいずれかを検出または定量する方法である。前述のエレメントの説明は、本開示の別の場所で行う。
本発明のこの形態の図示した実施は、ポリＴプライマーをポリＡｍＲＮＡに結合し、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼによりそれが逆転写酵素として作用する条件の下で伸長することである。熱による変性に続けて伸長していないポリＴプライマーを結合することで、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼによる他のコピーの合成が可能となる。増幅量は、a）個々のテンプレート分子のプライマー結合部位の数と、ｂ）結合/伸長の効率と、ｃ）実行サイクル数とに比例する。したがって、ある１つのターゲットとなる分析物中に単一のプライマー結合部位が存在し、５０％の効率と１００サイクルの変性/再プライミングの場合、本発明の方法によれば、単一の分析物分子から第１のｃＮＡコピーを５０個生成することが可能である。
本発明の他の形態によれば、プライマーを使用して、原分析物中の配列と同一か或いは相補的な配列からなる多数の核酸コピーを合成する能力のあるプロダクションセンターを有する核酸ライブラリーを生成する。本発明のこの形態の第１の工程において、核酸分析物の集団全体或いは集団のサブセットを使用して、前述したように第１のストランドの核酸コピーを合成して、線形増幅を行う。本発明のこの形態の次の工程では、第１のｃＮＡストランドを利用して、テンプレートのストランドを除去するか或いは分解することで更なる結合/伸長を行う。これは、様々な物理的、化学的及び酵素的手段により行うことができる。このような方法の例は、変性処理、アルカリ処理或いはＲＮＡ分解酵素処理であってもよいが、これらに限定されるものではない。変性は、高熱に曝すことで、或いは前述した他の方法で実行することができ、線形増幅を多数回繰返し、これらを後の工程で利用する。次の工程では、プライマーを第１のｃＮＡストランドに対しアニールし、相補的ストランドを合成し、原分析物集団のダブルストランドｃＮＡコピーを生成する。第２のストランドの合成に使用するプライマーは、これらの５´末端がプロダクションセンターとして作用する能力のある配列からなるよう設計される。このようなプロダクションセンターの説明はラバニ（Ｒａｂｂａｎｉ）等の米国特許出願０８/５７４、４４３号、１９９５年１２月１５日出願（発明の名称：新規な性質を有効にする及び/又は新規な性質を示す組成物の治療及び診断への使用）に開示されており、この出願は放棄され、米国特許出願０８/９７８、６３２号、１９９７年１１月２５日出願として出願されており、ここに参考文献として加える。本発明で取分け有用なプロダクションセンターの例はＲＮＡプロモーターセグメントで構成される。
例えば、第２のストランド合成用のランダムヘキサマープライマーは、構造：５´プロモーター−Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６−３´を有する。好適な形態において、このプロモーターはファージプロモーターである。これら同質のポリメラーゼに固有の配列は、これらをプライミングに使用するオリゴヌクレオチドへ付加することで効果的に且つ安価に合成することが可能となるほどに十分短い。同時に、これらは、供に使用するゲノムＤＮＡに比べ十分長い。また、これらプロモーターを認識するファージＲＮＡポリメラーゼは、大抵、他のサブユニットやコファクターを必要としない単一の蛋白分子である。本発明の本形態で特に使用するものは、Ｔ３、Ｔ７およびＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼにより認識されるファージプロモーターの配列である。これら酵素は十分に性質が知られており多くのソースで市販されている。
効果的に機能化するために、前例で引用したプロモーターはダブルストランドの形態であるべきである。これは幾つかの異なる方法で実行できる。１つのこのような方法の事象の可能な順番はグラフィックとして図４に示す。伸長に使用するポリメラーゼがストランドを置換する能力を有する場合、第１のストランドの３´末端に最も近く結合するプライマー（図４のプライマーＡ）はテンプレートに結合したままであるが、他の伸長されたプライマー（プライマーＢ及びプライマーＣ）は、テンプレートから離れてシングルストランドの状態となる。したがって、ある与えられた個々のテンプレート分子は、複数の相補的コピーを多数回のプライミング/伸長により生成し、この生成物には２つのグループがあり、即ち、基本的にダブルストランド分子であって相補的なストランドに結合した第１のｃＮＡストランドからなるものと、置換したストランドから得られるシングルストランド分子である。
初期では、置換したストランドは、シングルストランドの形態であるが、第１或いは第２のいずれかのストランドの合成による他のプライマーが継続的に存在することでさらなる結合/伸長が可能となり置換されたシングルストランドがダブルストランド形態へと変化する。これに代えて、伸長したプライマーを伸長していないプライマーから分離するために行われる中間段階での精製工程が存在する。例えば、分離は、各末端でプロモーターにより分子が合成されるのを最小限にするか或いは避けるためには有用である可能性がある。このような２重末端構造は、アレイのターゲットとなるエレメントよりむしろ、御互いにハイブリダイズする核酸を効率的に転写しないかもしれないが、これら核酸を生成する可能性がある。したがって、第１のｃＮＡストランドの合成を開始するのに使用した同一のプライマーを、置換した第２のｃＮＡストランドとの混合物に加えてもよく、同様に、どんな場合でも、置換したシングルストランドＤＮＡ分子をダブルストランド生成物へ変換するするのに試薬が必要となるかもしれない。これに代えて、プロモーターのないランダムプライマーを使用して、置換した第２のｃＮＡストランドのプライミングを行ってもよい。置換したシングルストランドに対する相補的コピーの合成により、これら分子の５´末端中のプロモーターセグメントがダブルストランド形態へと変化する。
一方、オリジナルの第１のｃＮＡストランドテンプレート（図４のプライマーＡ）に結合しつづけている伸長されたプライマー中のプロモーターは、機能的に異なる形態を取るため異なるプロセスを必要とする。例えば、第１のｃＮＡストランドのシングルストランド３´末端を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３´から５´エクソヌクレアーゼによりダイジェスト即ち短くしてもよい。ダブルストランドの部分に届いたら、酵素の重合化作用を利用して、短くされた３´末端を、プライマーＡのプロモーターセグメントをテンプレートとして使用することで伸長し、これによりダブルストランドプロモーターを生成してもよい。他のアプローチとして、（図５a）のシングルストランドプロモーターの配列に相補的なオリゴヌクレオチドを設けてもよいし、或いは、第２のｃＮＡストランドの合成に使用するプライマーを、自己相補性で（図５ｂ）のダブルストランド機能性プロモーターを生成するステムループ構造を形成するよう設計してもよい。最後に、テンプレートに結合した第２のｃＮＡストランドを変性するとともに、置換した第２のｃＮＡストランドを変更するための前述した同様のプロセスを使用して、これらをダブルストランド形状に変換してもよい。
機能性転写ユニットをオリジナルの様々な核酸分析物から生成することで、各ｃＮＡテンプレートから多数の転写コピーを作成することによる増幅が可能となる。第１のｃＮＡストランドをテンプレートとして使用したプライマー中のＲＮＡプロモーターの配列を含むことで、結果として得られるすべての転写物が第１のｃＮＡストランドに相補的となる。しかしながら、ターゲットエレメントとして決定したオリゴヌクレオチド配列を使用する幾つかのターゲットとなるアレイは、相補性のものよりもむしろ、ｍＲＮＡのラベルされた第１のｃＤＮＡコピーを検出する目的で設計された。このような場合、前述の一連の反応による転写生成物をテンプレートとして使用して、ラベルされた第１のｃＤＮＡコピーに均等な配列を逆転写酵素により合成してもよい。前述したように、ランダム或いは選択されたプライマーをこの目的のために使用してもよいことが確認できるかもしれない。この変換工程は、他の利点ももたらす。なぜなら、ＤＮＡはＲＮＡより更に安定していることが知られており、ＤＮＡはＲＮＡに比較して比較的より少ない２次的な構造を有するためである。
ＲＮＡ転写物或いは前述の方法で生成したＲＮＡ転写物のｃＤＮＡコピーは、ラベルされたものでも或いはラベルされていないものでもよい。ポリヌクレオチドがラベルされない場合、これらは信号発生のためＵＤＴｓを使用してもよい。前述したように、オリジナルの分析物は、この機能を提供することが可能な内在性のＵＤＴ配列を有する可能性があり、或いは、分析物は非内在性のＵＤＴ配列を組込むことで改変してもよい。一方、先の１連の反応で行われる合成の工程により、適当にデザインされたプライマーにより、第１のストランド或いは第２のストランドのいずれかの合成中に非内在性のＵＤＴｓを組込む機会が与えられる。例えば、第２のストランドの合成用に設計されたプライマーは、以下の構造を有する可能性がある。
５´プロモーター−ＵＤＴ−ヘキサマー−３´
前記プライマーを第１のｃＮＡストランドに結合した後、続けて伸長し、その後生成される転写物は、構造：
５´ＵＤＴ−ヘキサマー−ＲＮＡ配列−３´
を有する。
先に示した転写物はその５´末端にＵＤＴを有するが、他の設計は、転写物がその３´末端のＵＤＴｓで合成されるのを可能にする。例えば、これは、ＵＤＴとして作用する能力のある第１のストランドの初期の合成に使用するプライマー結合部位の配列か、或いは、ＵＤＴを第１のストランドの合成に使用するためのプライマー中に組込むことで実行される。双方の方法の１つの例として、構造：５´ＵＤＴオリゴＴ−３´を有するオリゴヌクレオチドプライマーにより第１のｃＮＡストランドをプライミングし、そして、構造：５´プロモーター−ヘキサマー−３´を有するオリゴヌクレオチドプライマーにより第２のｃＮＡストランドをプライミングすることで、ポリＡ ＲＮＡに基づき転写ユニットを合成してもよい。
第１のｃＮＡストランドの合成反応及び第２のｃＮＡストランドの合成反応によるダブルストランド生成物は、以下の構造を有する。
５´プロモーター-ヘキサマー--第２のストランドの配列--ポリＡ--ＵＤＴ３´
この構造物からの転写物は、以下の構造を有するＲＮＡ分子を生成する。
５´ヘキサマー--第２のストランドの配列--ポリＡ--ＵＤＴ３´
前記生成物は、内在性のＵＤＴ（ポリＡ配列）或いは人工的に組込まれたＵＤＴのいずれかによりＵＤＥに結合し得る。加えて、信号生成のためのＵＤＴｓの組込みは、所望によりラベルされたヌクレオチドの組込みと合わせてもよいことを認識すべきである。これにより、直接ラベルするか或いはＵＤＴｓが存在することで、本発明のこの態様により、あるライブラリーの様々な核酸分析物の初期のレベルを反映する検出可能なライブラリーが合成される。
ＲＮＡの合成を利用した増幅を使用することは、クノウ（Ｋｗｏｈ）及びジンジャース（Ｇｉｎｇｅｒａｓ）により（１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６；１１７３-１１７７；ここに文献として加える）で既に説明したが、実施の目的は本発明とは相対するものであった。クノウ（Ｋｗｏｈ）及びジンジャース（Ｇｉｎｇｅｒａｓ）によれば、固有の配列を有するプライマーを使用して第２のｃＤＮＡストランドを合成し、意図した単一の限定した独立配列を増幅した。したがって、様々な核酸の様々な集団を増幅することが有益である可能性を示唆することもなく、またそのような認識もない。
クノウ（Ｋｗｏｈ）及びジンジャース（Ｇｉｎｇｅｒａｓ）により同年に出願され公開された特許出願によれば、バンゲルダー（ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒ）等により（米国特許第５、７１６、７８５；ここに参考文献として加える）説明された方法は、第１のｃＤＮＡストランドに使用したプライマーにファージプロモーターを含ますことでＲＮＡターゲットの一般的集団の線形増幅である。第２のストランドの合成は、ＲＮＡ分解酵素ＨによるＲＮＡテンプレートのニッキング（切断）により行われるか、或いは第１のｃＤＮＡストランドの末端にヘアピンを形成して自己プライミングを行うことで実行した。さらに、この特許のクレーム及び同一発明者による関連特許（米国特許第５、８９１、６３６；ここに参考文献として加える）は取分け「外因性のプライマーを使用せずに」という文言を含んでいる。したがって、これら特許では、まず第１に第１のストランドの合成に使用したプライマーにプロモーターの配列を含める必要がある。第２に、第２のストランドの合成を触媒するのに加えるプライマーを使用することの価値がない。事実、この後者の概念と大きくかけ離れた教示があるのみである。加えて、前述の方法の全てが元となる分析物の不完全なコピーを合成するのみである。なぜなら、ＲＮＡ分解酵素Ｈにより作られたコピーの完全性は、ｍＲＮＡの５´末端に最も近いニック（切れ目）の距離に依存し、少数のものだけがｍＲＮＡの５´末端に最も近い配列の表現を有する。加えて、末端それ自身は５´末端に最も近いＲＮＡフラグメント/プライマーを保ち続けるために使用するので、末端の表現はけっしてありえない。ヘアピン形成手段による合成では、潜在的に５´末端配列の不完全な表現となる。なぜなら、これら配列のヌクレアーゼによる分解がヘアピンの除去中に起きるからである。また、固有のシングルストランドであると考えられるヌクレアーゼでさえ、シングルストランドを好むようより正確に特徴付けされているため、ダブルストランド形状のセグメントによる幾つかの活性レベルがあることは周知であるため、他の損失がある。
本発明は、第２のストランドの合成にプライマーを使用しない前述の技術とは相対するものである。これら先行技術の方法は、ＲＮＡ分解酵素Ｈの存在に依存して第２のストランドを生成するか、さもなくばフォールドバック機構による自己プライミング及びそれに続くＳ１ヌクレアーゼ或いはそれに均等なものによる処理を必要とする。ヌクレアーゼによる処理を行わない場合、ヘアピン誘導構造から生成した転写物は、自己相補的であり、したがって、アレイへの評価できるようなハイブリダイゼーションを行う能力はない。この従来技術に対し、本発明は、外因性のプライマーを使用して、第２のストランドを合成する様々な方法を開示する。また、本発明の幾つかの態様では、第２のストランドを合成するのに使用する方法は、分析物の５´末端から得られる情報を選択的に保持する手段を含む。加えて、本発明は、単一の第１のストランドｃＮＡテンプレートから多くの転写ユニットを合成し、増幅の更なるレベルを提供することの可能性につき記載する。
本発明の他の態様によれば、第１のｃＮＡストランドが第１のｃＮＡストランドをフォールドバック機構により生成するのを、第１のｃＮＡストランドの伸長性をブロックすることで積極的に抑制してもよい。これを実行する１つの方法は、ジデオキシヌクレオチドを第１のｃＮＡコピーの３´末端に、末端転写酵素で加えることによるものである。この方法は、第１のｃＮＡストランドが自己プライミング反応に参加するのを防ぐにもかかわらず、ブロックされた第１のｃＮＡストランドがテンプレートとして使用される能力を保持する。本発明のこの態様によれば、第１のストランドｃＮＡ合成に使用するプライマー或いは第２のストランドｃＮＡ合成に使用するプライマーはＲＮＡプロモーターかあるいは他のレプリケーションセンター（複製源）から構成し得る。
本発明の他の態様は、人工的なプライマー結合部位を加えるか組込むことで前述の新規なプロセスを実行することを開示する。例えば、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの翻訳はしばしば、逆転写酵素により、少数の非テンプレート指向のヌクレオチドを第１のｃＮＡストランドの３´末端に加えることを含む。従来技術においては、これら付加された塩基はプライマー結合部位として使用されフルレングスｃＤＮＡ分子をクローニングする。３´末端にグアノシン（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）ヌクレオチドを有するプライマーの結合及び伸長するには、少数のシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）ヌクレオチドを分子の末端に加えることで十分である。（ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ技術に関するユーザーマニュアル、クローンテック ラボラトリーズインク、パロアルト、カリフォルニア）。このシステムにおいて、オリジナルｍＲＮＡ分子の不完全コピーである不完全な或いは途中で止まったｃＤＮＡ配列は、逆転写酵素による付加反応のためのサブストレートではない。このことにより、ｃＤＮＡクローンのライブラリー中のオリジナルｍＲＮＡの５´配列はより完全に表現する。
シトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）ヌクレオチドを第１のｃＤＮＡストランドに非テンプレート由来で加えることは、転写物のライブラリーを作成するプロセスで既に使用されている（ワン（Ｗａｎｇ）等、ネイチャーバイオテクノロジー、１８；４５７−４５９、ここに参考文献として加える）。しかしながら、このシステムは基本的にバンゲルダー（ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒ）等(op.cit.)により記載された方法に類似する。なぜなら、ファージプロモーターが第１のｃＤＮＡストランドの合成に使用するプライマーに含まれるからである。このように、この条件では限界があり、ｍＲＮＡテンプレートを完全にコピーした分子の選択性を失う。内部ポリＣ配列に結合し、伸長を開始するプライマーは、ｃＤＮＡの末端でポリＣのそれに結合するのと同様の能力を有し（マッツ（Ｍａｔｚ）等１９９９）、第２のｃＤＮＡストランドを合成し、これにより機能性ダブルストランドファージプロモーターを生成する。
バンゲルダー（ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒ）等およびワン（Ｗａｎｇ）等に対して、本発明のこの特定態様は、第２のストランドを合成するのに使用するプライマー中のプロモーターを提供する。したがって、先に開示した新規なプロセスは、第２のストランド合成に、３´末端でのオリゴｄＧ配列からなるプライマーを使用して第１のｃＮＡストランドの末端に結合することで実行され得る。本発明のこの態様によれば、末端結合及び末端伸長により得られるプライミングの結果、分子構造のダブルストランドプロモーターが生成される。図６の工程（Ｄ）に示すように、Ｔ７プロモーターを有するプライマーは、第１のｃＮＡストランドの末端に結合することが可能である。このプライマーの伸長は、ダブルストランド分子を生成することが可能であり、ここでは、プライマーの３´末端がｃＤＮＡをテンプレートとして使用することで伸長され、且つｃＮＡの３´末端がプライマーの配列をテンプレートとして使用することで伸長される。この伸長による実効的な生成物はダブルストランド転写ユニットである。一方、図６の工程（Ｅ）はＴ７プロモーターを有するプライマーをｃＮＡの内部セグメントに結合することを示している。この場合、プライマーの３´末端からの伸長により部分的にダブルストランド構造の分子を生成する可能性があり、ｃＮＡの３´末端はプライマーをテンプレートとして使用できず、したがってプロモーターは機能を発揮しないシングルストランド形状のままである可能性がある。
前述したシステムの１つの利点は、ヌクレオチドの非テンプレート付加は、反応混合物中に既に存在する酵素により実行できることである。一方、所望により、末端転写酵素を加えて、反応の制御性を高めると供に、効率を向上してもよい。ポリＡ配列、ポリＴ配列或いはポリＵ配列が、ＲＮＡコピー、ＤＮＡコピー或いはｃＮＡコピーのいずれかの中に既に存在する場合、末端転写酵素がｄＧＴＰ或いはｄＣＴＰを使用することが好ましい。第２のストランドの合成のためのプライマーを、その配列がプロモーターと、末端転写酵素による付加工程により付加された配列に相補的な３´セグメントとからなるよう設計してもよい。本プロセスの工程は図７に示す。ここで、ダブルストランドプロモーターを生成するためのその後の伸長は図６に関連して先に説明したように行ってもよい。また、ヌクレオチドの意図した付加を、ダブルストランド末端か或いは３´自由末端のいずれかが存在する場合のみ行ってもよいため、分析物テンプレートの末端まで相補的に伸長したｃＤＮＡ分子のみが末端付加のためのサブストレートとして好適である。
これら付加された部分は、逆転写酵素で非テンプレート付加により得られた部分より長いので、第２のストランドの合成のためのプライマーは、より長い対応のホモ重合化されたセグメントを有しており、これにより更に高温での結合と伸長とが可能となる。この高められた厳格性は、第１のｃＮＡテンプレートストランド中に内在する配列によるプライミングを繰返しを減少させ、さらにオリジナル分析物の５´末端からの配列の高い表現性をもたらす。したがって、末端転写酵素を使用して第２のストランドの合成のためのプライマー結合部位を生成する場合、プロモーターは、第１のストランド或いは第２のストランド中に存在してもよい。末端転写酵素による第１のｃＮＡへの付加工程を行うと同時に前述したようにそのテンプレートに結合したままでもよいし、或いはテンプレートを分解或いは第１のｃＮＡストランドからの分離の後にその付加工程を行ってもよい。この方法は連続して第２のストランドの合成を行うべきであり、この合成はプライマーを結合し第１のｃＮＡストランドの３´末端から伸長することで好適に行われる。前述したように、ＵＤＴｓ並びにラベルされた或いはラベルされていないヌクレオチドを本発明の本態様を実行する際に利用してもよい。また、ここに開示の様々なプロセスの１又はそれ以上の工程を繰返すことで最終生成物のより高い収率を達成し得ることが予想される。
第１のｃＮＡストランドの３´末端でのプライミングを好適に実施する他の手段を、本発明では使用してもよい。例えば、ＲＮＡテンプレートの完全なコピーであるｃＤＮＡは、ダブルストランドオリゴヌクレオチドを有するＴ４ＤＮＡリガーゼによる平滑末端ライゲーションのサブストレートである。第１のｃＮＡストランドの３´末端にライゲートされたオリゴヌクレオチドの配列は、ユーザーにより選択出来、第２のｃＮＡストランドを生成するためのプライマー結合部位として機能する。同様に、第１のｃＮＡストランドの３´シングルストランドテイルは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによるシングルストランドＤＮＡオリゴヌクレオチドのライゲーションのためのサブストレートとなる（エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）等、１９９１年核酸の研究１９、５２２７−５２３２；ここに参考文献として加える）。最後に、３´シングルストランドテイルを有するダブルストランドオリゴヌクレオチドを、第１のｃＮＡ及びオリゴヌクレオチドテイルが相補的である場合、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる「スティッキーエンド（突出末端）」ライゲーションで第１のストランドｃＮＡに接合してもよい。前述したように、これらｃＮＡテイルは、逆転写酵素或いは末端転写酵素により、非テンプレート付加部分から得ることが可能である。これらプロセスの図示した例を図８で与える。これらプロセスの全てが、第１のストランドｃＮＡ分子の３´末端にプライマーを好適に結合することに依存するため、プロモーターは第１或いは第２のいずれかのｃＤＮＡストランド中に存在してもよい。
本発明の他の実施の形態によれば、第１のｃＮＡストランドは、物理的手段、化学的手段或いは酵素による手段でフラグメント化される。酵素による手段の例は、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ及びＭｎｌｌのような制限酵素、ＤＮａｓｅＩのようなＤＮＡ分解酵素、Ｓ１Ｎｕｃｌｅａｓｅ及びＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅのようなヌクレアーゼを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。これらフラグメントをテンプレートとして使用して、前述した方法のいずれかにより、第２のストランドを合成してもよい。例えば、Ｔ７プロモーターを有するランダムプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を、図４及び５に示すのと類似するプロセス中で、テンプレートとしてのｃＮＡストランドのフラグメントとともに使用してもよい。或いは、好適な場合には、前述のホモ重合化付加工程及びライゲーション工程を行い、特定のプライマー結合部位を提供してもよい。図８は、ホモ重合化方法を使用したこのプロセスを示すものである。第１のストランドコピーをより小さなセグメントにブレイクダウンし、その後第２のストランド合成中にプライマーを組込むことで、より小さな転写ユニットを提供する。これは、信号生成のため改変したヌクレオチドを使用する場合に有益である可能性がある。例えば、ラベルされたヌクレオチドに相補的なテンプレートストランド中に長い伸長部が存在する場合、ヌクレオチドの改変により、下流方向への転写中に中断が生じるか、或いは工程の損失が生じる可能があり、結果として、これら配列の表現が不充分（Ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）となる可能性がある。本発明のこの特定態様によれば、分析物の配列のコピーをより小さなここの転写ユニットに分離することで、ユニットの各々が独立してＲＮＡの合成を指揮することが可能となり、これにより様々な核酸配列のライブラリーがより完全に表現される。
本発明の他の実施の形態によれば、開示されるライブラリーの合成の新規な方法を、キャプチャー方と組み合わせてより効率的な合成を提供し、並びに、多数の工程からなるプロセス中に塩、バッファー、酵素及びその他の構成要素を変更する自由度を提供する。本発明は、ビーズのような固体マトリックスに結合した第１のストランドプライマーの使用及びそれに続く前述のプロセスを開示する例えば、固体マトリックスに結合したオリゴＴ配列の３´末端を、ポリＡｍＲＮＡをテンプレートとして使用して伸長してもよい。本発明の方法によれば、この第１のストランドは、第２のストランドのテンプレートとして使用される。本発明のこの態様を実行する場合、ＲＮＡプロモーターのような複製源を、使用する特定方法に依存して第１或いは第２のストランドのいずれかに導入してもよい。例えば、５´末端にプロモーターを有するランダムプライマーを、伸長した第１のｃＤＮＡストランドに結合し、プロモーターが組込まれた第２のストランドを生成してもよい。このプロセスは図１０に示す。
第２のｃＤＮＡストランドの５´末端のシングルストランドプロモーターは、前述の方法のいずれかによりダブルストランド形状に変化する。例えば、図１０のビーズに結合されたままのプライマー/テンプレート複合体を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、プロモーターセグメントに相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしてもよいし、或いはプライマーをそれ自身相補的な領域を有するように設計してもよい。後の２つの方法は、既に図５を参照して説明した。図１０の置換した第２のｃＤＮＡストランドに関し、マトリックス物質上に伸長していないオリゴ-Ｔテイルが存在することで、更なる結合/伸長を可能にする。なぜなら、置換したストランドは３´末端のポリＡ配列を運ぶためである。しかしながら、好適であるなら、さらなるオリゴ-Ｔを、ビーズと関連させ或いは溶液中に自由で加えてもよい。オリゴ-Ｔの伸長の結果、究極には、置換した第２のｃＤＮＡストランドのシングルストランドプロモーターが機能を発揮できるダブルストランド形状に変化する。
本発明で使用し得る他の方法は、本発明で説明した１又はそれ以上の工程を繰返すことである。例えば、分析物のライブラリーを使用してマトリックスに付着する第１のｃＮＡコピーを生成した後に、分析物を第１のｃＮＡコピーから分離して使用し、第１のｃＮＡコピーの別のプールを生成してもよい。同様に、第２のｃＮＡの合成後に、第２のｃＮＡストランドのライブラリーを、マトリックスに固定された第１のｃＮＡストランドから分離してもよい。第１のｃＮＡストランドの５´末端をコピーした第２のｃＮＡストランドの全ては、ビーズにリンクされたプライマーに結合するのに初期の段階で使用された部位を再製したであろう。所望により、第２のストランドを再度同じビーズに結合してもよい。第１のｃＮＡ合成に使用したテンプレートの数に比較してビーズ上のポリＴプライマーの数が途方も無く大きい傾向にあるため、マトリックス上のプライマーの大部分は伸長されないままであり、新たなプライミングのために使用してもよい。したがって、これら再結合した第２のｃＮＡストランドを完全にコピーすることで、「トリミング」するためＴ４を使用する必要なく、これら分子の末端にダブルストランドプロモーターを生成することが可能となるはずである。所望により、マトリックスに付着する第１のｃＮＡストランドを使用して、第２のｃＮＡストランドの別のプールを生成してもよい。第２のｃＮＡストランドのプールを、３´末端に相補的なプライマーを有する新しいビーズに付加してもよい。再び、マトリックスに付着するプライマーの伸長により、第２のｃＮＡストランドの全てが５´末端でのプロモーター配列を含むダブルストランド形状に変化する。転写反応を行った後で、反応生成物を除去し、マトリックス上の核酸を使用して更なる転写反応を行って、さらなる転写による生成物を蓄積してもよい。
前述の例は、マトリックスに付着したオリゴＴプライマーによるポリＡセグメントを有する分析物のプライミングにつき記述したが、３´末端に１又はそれ以上の独立した塩基を有するプライマーを調製してもよい。前述したように、これらプライマーを、可能な変更全てを表わすグループとして使用してもよいし、或いは、一般的な増幅或いはサブクラスへの分離が所望されているか否かによって、個々にこれらを使用してもよい。先に使用したポリＡ配列は、単に図示した一つの例に過ぎないと理解する。前述したように、第１のストランドプライマーの結合に使用した分析物の配列を内在する配列から得てもよく、あるいは、これらは、前述したいずれかの手段で人工的に分析物中に導入した非内在性の配列であってもよい。本発明のこの特定の実施の形態によれば、マトリックスに結合するプライマーの配列を適当に設計することによりこれらプライマー結合部位のいずれかを利用してもよい。
本発明においては、第１のストランドの合成のためのプライマーの配列は、マトリックスに直接或いは間接的に付着させることができる。マトリックスへオリゴヌクレオチドを直接付着させる方法は技術的に周知である。加えて、共有付着し伸長可能なポリＴセグメントを有するビーズは、多くのソースで市販されている。間接的に付着させる方法もまた技術的に周知である。例えば、図１１はサンドイッチする方法を示しているが、ここで、プライマーは２つのセグメントを有し、その１つは、マトリックスに付着したキャプチャーセグメントに相補的であり、他方は、ターゲットのＲＮＡのポリＡセグメントに相補的である。プライマーの２つのセグメントは、１つの連続したヌクレオチドの配列を形成してもよいし、或いは、２つのセグメント間で分離した状態でもよい。マトリックス上で且つ分析物の結合部位での、プライマーの２つのセグメントと相補的配列とのハイブリダイゼーションは同時に行ってもよく、或いは段階的に行ってもよい。例えば、ターゲットとなるＲＮＡのキャプチャーエレメントへのハイブリダイゼーションは、溶液中で行ってもよくその後続いてマトリックスへ捕獲される。マトリックスに結合したセグメントは、伸長する能力が無くなることが好ましい。この阻害を行う１つの方法は、図１１に示すようにマトリックへの付着点として３´末端を使用することである。結合及び伸長は図１０に関連して先に説明したように実行して、オリジナルのポリＡｍＲＮＡの第１及び第２のｃＤＮＡコピーを合成してもよい。プロモーターの配列のダブルストランド形状への変換は、前述したように実行してもよい。転写ユニットがマトリックスに付着した状態で転写を行ってもよく、或いは、所望により、転写に続く次の工程でマトリックスから分離してもよい。
第１のストランドの合成中にＲＮＡプロモーターを組込むことで、オリジナル分析物中の配列に相補的な配列からなる転写物が得られる。第２のストランドの合成中にＲＮＡプロモーターを組込むことで、オリジナル分析物中の配列と同一の配列からなる転写物が生成される。前述したように、所望により、これらをｃＤＮＡコピーへ容易に変換できる。
本発明のさらなる主題によれば、第１のｃＮＡストランド（エバーワイン（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）等によって説明されている）或いは第２のｃＮＡストランド（本発明の先の実施の形態で説明した）のいずれかのストランド中に、プロモーターの配列を組込むこと無く、転写ユニットを合成してもよい。図１２の工程Ｄに示すように、伸長した第１のｃＮＡストランドをテンプレートとして使用し第２のｃＮＡストランドを合成する場合、オリジナルのプライマー結合配列の重複部分を合成する。したがって、図１２aでは、置換された第２のｃＮＡストランド及びビーズに結合したままの第２のｃＮＡストランドの双方とも、５´末端にポリＡセグメントが生成される。これら第２のｃＮＡストランドを除去した後、ＲＮＡプロモーター配列とオリゴ-Ｔ配列とからなるオリゴヌクレオチドプライマーを、第２のｃＮＡストランドとハイブリダイズしてもよい。プライマーをマトリックスに付着させてもよく、或いは溶液中で自由にさせてもよい。ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド及び適当なコファクターを規定することで、プロモーターの３´末端およびプライマーの３´末端の双方の伸長並びにｃＤＮＡコピーの３´末端の伸長が可能となる可能性があり、これにより図１２の工程Ｆに示したような機能を発揮できる転写ユニットが生成される。これらＤＮＡ分子からの転写の結果、オリジナルの分析物中の配列に相補的な配列からなる生成物が得られる。
従来技術において、セルロースやビーズのようなマトリックスに付着したオリゴ-Ｔの最も一般的に周知な使用は、ポリＡｍＲＮＡの選択的な隔離及びそれに続く分離工程さらにその後のライブラリーの合成を目的としたものであった。一例として、Ｔ７プロモーターに結合した特定オリゴＴプライマーを、ＲＮＡをテンプレートとして使用することで伸長し、ライブラリーを生成した（エバーワイン（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ））。しかしながらこの方式は、プロモーターをキャプチャービーズの近くに配置するため、潜在的にダブルストランド形状に変換される能力が減少すると供に、或いはプロモーターとして機能する能力が減少する。また、ランダムプライミングによる第２のストランドの合成は、ヘアピン形状の自己プライミングを防止しない。ヌクレアーゼ工程が無い場合、転写ユニットが、ターゲットのアレイにハイブリダイズする能力の無いはずのヘアピン形状のテンプレート配列に基づく自己相補性ＲＮＡｓの合成を指揮する。この非生産性合成のためのテンプレートの使用により、効果的にラベルされた転写物が結果として無効となる可能性がある。
本発明に従い第２のｃＮＡの合成のために使用したプライマー中のプロモーターを使用することの特筆する利点は、自己プライミングの可能性を有する条件下、例えば、フォールドバック機構による第２のｃＤＮＡのストランドを生成する条件の下で、第１のｃＮＡストランドが合成されるにもかかわらず、第１のｃＤＮＡストランド中にプロモーターが存在しないことで、これら構造体が転写の活性を示さないことである。したがって、プロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドによるプライミングにより得られる第２のｃＤＮＡストランドのみが、転写に際し機能を発揮できる。このことはエバーワイン（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）による先に説明したシステムと対照的である。これとは正反対に、本発明において記載した方法は、第１のｃＮＡストランドの伸長を避けるか、或いは第１のストランドテンプレートの末端でのプライミングによる第２のストランドの合成を促進することで、第１のストランド中のプロモーターの使用を可能にする。
本発明の他の目的は、ラベルされるべき単一のＲＮＡ集団のみを必要とする比較解析方法を提供する。この特定態様には、ラベルされていないＲＮＡの集団による競合性結合の利点がある。この物質の合成は、前述した手段のいずれで実施してもよい。特定の配列は、アレイに存在する配列に対し相同であってもよく、或いはラベルされた物質中に存在する配列に対し相同であってもよい。競合相手の存在下或いは不存在下でのラベルされた物質のハイブリダイゼーションを比較することで、増加或いは減少したｍＲＮＡ合成の相対レベルを、競合相手に関連して確立してもよい。使用されるラベルしていない物質の相対量の調整を行ってもよく、あるいは、コントロールとして存在するハウスキーピング遺伝子で正規化値としてもよい。この方法は、多くの縦列的或いは並列的ハイブリダイゼーションを行って、ＲＮＡの単一の共通なラベルされたコントロール集団と比較してもよいという利点をもたらす。
必要に応じて様々な試薬を添加し、インキュベートすることで、本発明の様々な工程を順番に実行してもよい。一方、反応成分を取り除くか或いは不活性化して、一連の工程を分離してもよく、或いは所望する生成物を反応混合物から分離してもよい。前者の例は、逆転写酵素の熱による不活性化であってもよい。後者の例は、選択性マトリックスによるＲＮＡ/ＤＮＡハイブリッドの隔離であってもよい。これら付加的な工程を実施して、その後の工程の効率を向上し、或いは好ましくない副反応を防止してもよい。
先の例は本発明の様々な態様を実行する際ファージプロモーターの利用を開示するものであったが、プロダクションセンター（生成源）は、他の手段によっても操作できる。例えば、プライマー結合部位として作用するＵＤＴｓ
を導入する様々な手段は、第２のコピーストランドの合成およびこれに続くＲＮＡ転写の範囲では前述した。これらプライマー結合部位は、それら自身で、プロダクションセンター（生成源）として作用し、等温条件下で様々な核酸の多重コピーを生成する。
例えば、ラバーニ（Ｒａｂｂａｎｉ）等の米国特許出願番号０９/１０４、０６７、１９９８年６月２４日出願「核酸配列化のためのポスト-ターミネーションラベル方法および減少されたサーモダイナミック安定性を有する核酸の生成」に、ターゲット依存性ステムループ構造体を生成するように設計されたプライマーの使用が、選択された配列の特定等温増幅に関して開示されている。前述の番号０９/１０４、０６７の内容をここに参考文献として加える。本発明において、ＵＤＴｓをライブラリーの様々な核酸に加えて、先に引用しここに参考文献として加えたラバーニ（Ｒａｂｂａｎｉ）等の米国特許出願番号０９/１０４、０６７に開示の増幅を行ってもよい。図１３は実行するために使用されるべく一連の反応を示すものである。例えばＵＤＴをポリＡｍＲＮＡのライブラリーにライゲートしてもよく、ここでＵＤＴは２つのセグメントから構成してもよい（本図中Ｘ及びＹで表わす）。次の工程で、２つのセグメントからなるプライマー（プライマー１）、３´末端でのポリＴ配列及び５´末端でのＺで表わしたセグメントを、ｍＲＮＡの３´末端のポリＡ配列にハイブリダイズし、そして逆転写酵素で伸長して、３´末端でのセグメントＸ´及びセグメントＹ´を含む第１のｃＮＡコピーを生成する（図１３の工程Ｃ及びＤ）。オリジナルテンプレートを除去することで、第１のｃＮＡコピーの３´末端でのセグメントＸ´がハイブリダイゼーションに利用できるようになる。２つのセグメント即ち３´末端でのセグメントＸ及び５´末端でのセグメントＹを有する第２のプライマー（プライマー２）を、アニールし、伸長して第２のコピーを生成する（図１２の工程Ｄ及びＥ）。プライマー２が存在することで第１のｃＮＡコピーの更なる伸長が可能となり、ダブルストランドセグメントが形成され、ＹセグメントおよびＹ´セグメントは自己ハイブリダイズする能力を有し、これにより先に引用しここに参考文献として加えたラバーニ（Ｒａｂｂａｎｉ）等の米国特許出願番号０９/１０４、０６７に記述するように、ループ部分にＸセグメントおよびＸ´セグメントを有するステム−ループ構造体を生成する。２つのセグメント即ち３´末端でのセグメントＺ及び５´末端でのポリＡセグメントを有する第３のプライマー（プライマー３）を、第２のｃＮＡコピーをテンプレートとして使用することでアニールして、他の末端にステムループを形成してもよい。（これにより先に引用しここに参考文献として加えたラバーニ（Ｒａｂｂａｎｉ）等の米国特許出願番号０９/１０４、０６７に記述するように）他の末端でプライマー２による多重プライミングあるいは第１及び第２のストランドを互いに変質することよる多重プライミングにより、第２のｃＮＡコピーをテンプレートとして利用することが可能となる。プライマー３の伸長により、ステムを形成するポリＴセグメント及びポリＡセグメントと、ループを形成するＺセグメント及びＺ´セグメントとを有する構造体を生成する。更に等温条件下で結合反応及び伸長反応を前述したように行い固有のターゲットを得てもよい。留意すべきことは、Ｘ、Ｙ、Ｚに対し使用する特定配列は任意であって、ユーザーが選択してもよい。例えば、図１３の工程Ｃ中で使用するプライマー１のＺセグメントが、５´末端にＸセグメント及びＹセグメントを有するように設計された場合、単位長さのアンプリコン（増幅単位）は、各ストランドの３´末端にＸセグメント及びＹセグメントを有するはずである。このように増幅はプライマー２のみを使用して行うことが可能である。
等温増幅のためにプライマー結合部位として使用される非内在性のＵＤＴｓを使用した他の例は、図１４に示すように、ここに参考文献として加えるウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）等の米国特許第５、２７０、１８４号に記述のストランド置換増幅を伴って使用するものである。この特定例において、二つの異なる方法によりセグメントＸを組込む。図１４の工程Ｂで、ライゲーションによりセグメントＸをライブラリーの分析物に導入する。工程Ｃでは、セグメントＸをポリＴプライマーに付着させてストランドの伸長により組込む。アンプリコン（増幅単位）ユニットの各５´末端にＸセグメントが存在することで、シングルストランド置換プライマーによりプライマー結合が可能となる。５´末端に適当な配列を有するプライマーを設計する方法は、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）等により説明されている。ＳＤＡシステムの１部として使用する特定酵素に関し、プライマー結合部位間のある１との特定制限部位により、ライブラリーの一般的増幅のために設計された反応において増幅される幾つかの配列の能力が制限される可能性がある。これは、比較的珍しい配列を選択するか、或いは異なる酵素による並列反応を行うことで解決できる可能性がある。
指摘すべきことは、図１３及び１４に示した例において、各末端にプライマー結合部位が存在することで、指数関数的な増幅が可能となる。しかしながら、アンプリコン（増幅単位）がアンプリコンのたった１つの末端で等温増幅するよう結合部位を有するように設計することで、これらプロセスを線形増幅に変えることができる。
実施例中にプロモーターを使用た前述の工程のいずれかにより、多数のコピーを等温で生成するために使用し得るプライマー結合部位を組込んでもよい。例えば、図１３及び１４は、等温結合部位を分析物に直接加えることを示すと供に、第１のコピーの合成中に等温結合部位を組込むことを示す。図１５は、同様の状態を示すが、但しこの例では、セグメントＸは第１のｃＮＡ合成中に組込まれ、セグメントＱは第１のストランドの合成後に付加され、セグメントＺは、第２のｃＮＡストランド合成中に付加される。前述したように、１又はそれ以上のこれらセグメントは、等温での合成のためのプライマー結合部位で構成されてもよい。また、指摘すべきことは、図１３及び１５では、内在性及び非内在性のＵＤＴｓを１例として使用したことである。
本発明の他の態様によれば、ＵＤＴｓをプライマー結合部位として使用してアレイ上の増幅を行う。この特定の態様では、アレイ上の各座が、プライマーの２つの組からなる。１つの座の第１のセットは、特定の分析物に固有の選択性プライマーエレメント（ＳＰＥ´ｓ）からなる。１つの座の第２のセットは、ＵＤＴエレメント中の配列と同一或いは相補的なユニバーサルプライマーエレメント（ＵＰＥ´ｓ）からなる。前述したように、ＵＤＴｓは、自然に発生する配列から得られるものであってもよく、或いは人工的に組込まれたものであってもよい。ある座でのＳＰＥ”ｓはライブラリーの核酸中の相補的配列に結合する能力があるはずであり、これにより核酸の個々の独立した種をアレイの特定の座に結合する。適当な条件、試薬及び酵素を使用することで、結合した核酸をテンプレートとして使用することでＳＰＥを伸長することが可能である。
本発明のこの態様の１つの例として、図１６は、座Ｐ、座Ｑおよび座Ｒで表わした３つの異なる座を有するアレイを示す。各座では、Ｐ、Ｑ、Ｒでそれぞれ表わしたポリＡｍＲＮＡの３つの種の１つから生成したｃＤＮＡ中の特定配列に相補的である、アレイに結合したＳＰＥ´ｓの１つの組が存在する。加えて、図１６中のアレイの各座は、ポリＴ配列からなるＵＰＥ´ｓを１つの組を有する。これらポリＡテイルのポリＴプライミングによるｍＲＮＡテンプレートの各々のｃＤＮＡコピーの合成により、ｃＤＮＡ Ｐ、ｃＤＮＡ Ｑ及びｃＤＮＡ Ｒをそれぞれ生成する。分析物の第１のｃＤＮＡストランドのＳＰＥへの結合は、ある特定の座で各種に対し選択的であるべきである。一方、図１６のアレイのＵＰＥ´ｓ中の汎用ポリＴ配列に対するｃＤＮＡコピーの結合は殆どないか或いは全く無いべきてある。伸長のために酵素及び試薬を添加することで、結合したｃＤＮＡをテンプレートとして使用するＳＰＥ´ｓの伸長により、アレイのＬＰ部位、ＬＱ部位、及びＬＲ部位で、Ｐ、Ｑ及びＲの第２のｃＤＮＡコピーがが生成される。これら第２のｃＤＮＡコピーの各々は、第１のｃＤＮＡストランドテンプレートに相補的な固有の配列からなる。しかし、これら固有の配列に加えて、第２のストランドコピーは、これら３´末端にある１つの共通のポリＡ配列を含むはずである。この段階では、ハイブリダイズされた分析物を除去するとともに、第２のストランド合成の際に使用したテンプレートを除去することが好ましい場合がある。これは、熱による変質とそれに続く洗浄工程により最も容易に実行できる。この段階での生成物は、各座に伸長したＳＰＥと伸長していないＳＰＥとを有するアレイであり、伸長したＳＰＥの数はオリジナルの対応する分析物の量に比例する。伸長していないポリＴ ＵＰＥが十分近い場合、伸長したＳＰＥはテンプレートとして作用する。固相状態での増幅のための対をなす固有プライマーの設計及び配置については、ここに参照文献として加える米国特許第５、６４１、６５８号に詳細に記載されている。各座での２つの異なる配列を有するアレイの合成方法は、また、ここに参照文献として加える（核酸研究２７；１４８５−１４９１）中にジェンタレン（Ｇｅｎｔａｌｅｎ）とチー（Ｃｈｅｅ）により説明された。同じプライマーの設計ルールを、非固有のプライマーを使用する本発明に適用してもよい。テンプレートとしての近接する伸長したＳＰＥを有するＵＰＥの伸長することで、近接する伸長していないＳＰＥのためテンプレートとして順に使用し得る新たなテンプレートが生成される。ＳＰＥ´ｓとＵＰＥ´ｓとを交互に使用する１連の結合工程及び伸長工程を介してこのプロセスを行って、ＳＰＥ中の配列に相同するターゲットの核酸から得た核酸を各座に蓄積してもよい。これら工程を図１６乃至１９に示す。
固相での増幅のためにアレイを設計および合成する方法は、米国特許第５、６４１、６５８号及びウィスリン（Ｗｅｓｌｉｎ）等の２０００年ネイチャーバイオテクノロジー１８；１９９-２０４（双方ともここに参照文献として加える）に、全体的に固有のプライマーを利用することに関し記載されている。合成の程度を評価する方法がこれら参照文献に記載されている。ラベルされた前駆体を反応中にふくめることでラベルされた増幅生成物を合成してもよい。代わりに、正規の前駆体を、増幅生成物に結合した染料を挿入することで得られた信号発生とともに使用してもよい。
本発明は、固相での増幅のための固有の組成物およびプロセスを提供する。組成物は、分離した領域を含む固体表面のアレイを含む組成物であって、該分離した領域の少なくとも２つがそれぞれ、核酸プライマーの第１のセットと、核酸プライマーの第２のセットとを含み、核酸プライマーの該第１のセットにおけるヌクレオチド配列は、核酸プライマーの該第２のセットにおけるヌクレオチド配列と異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列は、少なくとも１つの塩基が互いに異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列は、実質的に同じであるかまたは同一である組成物である。先に記載したエレメントのいづれかが、本会時の別の場所で既に説明されているので、このプロセスに関するこれら説明は避けることにする。
本発明の関連する組成物は、複数の分離した領域を含む固体表面のアレイを含む組成物であって、該分離した領域の少なくとも２つがそれぞれ、核酸プライマーの第１のセットと、核酸プライマーの第２のセットとを含み、核酸プライマーの該第１のセットにおけるヌクレオチド配列は、核酸プライマーの第２のセットにおけるヌクレオチド配列と異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列は実質的に互いに異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列は実質的に同じであるかまたは同一である組成物であるこのプロセスのエレメントのいずれかの説明に関してはこの開示の前後を参照のこと。
直前に記載した組成物に関連するプロセスは、ライブラリー中の目的の核酸の２つ以上のコピーを生成するためのプロセスであって、ａ）（ｉ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つがそれぞれ、（１）核酸プライマーの第１のセットと、（２）核酸プライマーの第２のセットとを含み、核酸プライマーの該第１のセットにおけるヌクレオチド配列は、核酸プライマーの該第２のセットにおけるヌクレオチド配列と異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列は少なくとも１つの塩基が実質的に互いに異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列は実質的に同じであるかまたは同一である固体表面のアレイと、（ｉｉ）目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該目的の核酸の核酸コピーを合成するための重合化手段とを提供し、ｂ）該目的の核酸における相補的な配列と、該第１のセットのプライマーとを接触し、ｃ）該目的の核酸をテンプレートとして使用して第１のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第１のプライマーを生成し、ｄ）該伸長された第１のプライマーにおける相補的な配列と、該第２のセットにおけるプライマーとを接触し、ｅ）該伸長された第１のプライマーを使用して第２のセットにおける該プライマーを伸長して、該伸長された第２のプライマーを生成し、ｆ）該伸長された第２のプライマーにおける相補的な配列と、第１のセットにおけるプライマーとを接触し、ｇ）該伸長された第２のプライマーをテンプレートとして使用して、第１のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第１のプライマーを生成し、ｈ）上述のｄ）からｇ）までの工程を１回以上反復することを含む方法である。前述のエレメントは別の場所で説明する。
ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量化するための他の関連する方法は、ａ）（ｉ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つがそれぞれ、（１）核酸プライマーの第１のセットと、（２）核酸プライマーの第２のセットとを含み、核酸プライマーの該第１のセットにおけるヌクレオチド配列は、核酸プライマーの該第２のセットにおけるヌクレオチド配列と異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列は少なくとも１つの塩基が互いに異なり、第１の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列は実質的に同じであるかまたは同一である固体表面のアレイと、（ｉｉ）目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、（ｉｉｉ）該目的の核酸の核酸コピーを合成するための重合化手段と、（ｉｖ）核酸に付着され得るか、または核酸に取り込まれ得る非放射性のシグナル発生手段とを提供し、ｂ）該目的の核酸における相補的な配列と、該第１のセットのプライマーとを接触し、ｃ）該目的の核酸をテンプレートとして使用して第１のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第１のプライマーを生成し、ｄ）該伸長された第１のプライマーにおける相補的な配列と、該第２のセットにおけるプライマーとを接触し、ｅ）該伸長された第１のプライマーをテンプレートとして使用して第２のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第２のプライマーを生成し、ｆ）該伸長された第２のプライマーにおける相補的な配列と、第１のセットにおけるプライマーとを接触しｇ）該伸長された第２のプライマーをテンプレートとして使用して、第１のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第１のプライマーを生成し、ｈ）上述のｄ）からｇ）までの工程を１回以上反復し、ｉ）上述の工程ｃ）、ｅ）、ｇ）、およびｈ）における該伸長されたプライマーのいずれかに付着された或いはその中に取り込まれた該非放射性シグナル発生手段によって検出または定量化する方法である。前述のエレメントは別の場所で説明する。
多くの使用では、相補的ＳＰＥ´ｓへの分析物のハイブリダイゼーション中にＵＰＥ´ｓはアレイ上に存在するはずである。しかしながら、この工程でＵＰＥ´ｓの存在が害となる場合がある。たとえば、ライブラリーの様々な核酸の結合はアレイ上のＳＰＥ´ｓの作用のみで好適に行うべきである。前述の例に対し、ライブラリーの本質或いはＵＰＥ配列の選択のいずれかの理由で、ライブラリーとアレイのＵＰＥとの間でハイブリダイゼーションを行うことが可能となる原因が存在するかもしれない。この結果、ターゲットの核酸をアレイの適当な領域に結合することで反応効率が損失する。例えば、特定座のＳＰＥ´ｓは、相補的核酸ターゲットがＵＰＥ´ｓの結合を介して不適当に他の物理的位置に結合されるばあい、これら相補的核酸ターゲットをテンプレートとして使用することは出来ない。更に、ＵＰＥ´ｓが伸長され、との特定座のＳＰＥ´ｓに対する相補性を欠く核酸コピーを合成することで、ＵＰＥ´ｓが機能を発揮できなくなる。
したがって、本発明の１つの主題は、アレイ中のＳＰＥ´ｓへのライブラリーの初期のハイブリダイゼーションのあいだ、ＵＰＥ´ｓが機能を発揮できないか或いは存在しないことである。これを実行する一つの方法によれば、ＵＰＥ´ｓの変わらない普遍の本質或いは性質に利点がある。ＳＰＥの各特定種は、アレイの特定領域に移動するにもかかわらず、ＵＰＥ´ｓはアレイの多くの領域に存在することを目的とする。このように、各座がＳＰＥ´ｓの１つの組と、ＵＰＥ´ｓの反応基と共存できる化学的に活性化した部位の１つの組とからなるアレイを合成してもよい。核酸ターゲットの適当なＳＰＥ´ｓへの初期のハイブリダイゼーションの後、アレイの活性部位全てに同時に付着させることで、適当な基を有するＵＰＥ´ｓをアレイに全体的に付着してもよい。本発明のこの態様で使用することが可能な適合した変更の１例は、アレイが各座にマレインイミド基を有するアレイと、５´末端に付着したアミン基を有するＵＰＥ´ｓであってもよい。
代わりのアプローチは、一時的に機能を発揮できないように改変したＵＰＥ´ｓを有するアレイを合成することである。例えば、３´ＰＯ４基でＵＰＥ´ｓを合成して、起こり得る伸長反応を抑制する。アレイの様々なＳＰＥ´ｓへの核酸のハイブリダイゼーション及びそれに続くＳＰＥ´ｓの伸長の後、テンプレートとして使用した核酸を反応から除去する。この工程の後、３´ＰＯ４基を除去し、バクテリオファージポリヌクレオチドキナーゼ或いはアルカリフォスファターゼのような試薬による処理で、ＵＰＥ´ｓの３´末端を機能化する。その後、続く反応を前述したように行う。
代替のアプローチは、核酸のハイブリダイゼーションの利用である。例えば、核酸間のハイブリダイゼーションのＴｍはこれらの長さと塩基組成物の機能である。したがって、十分異なるＴｍ´ｓでＳＰＥ´ｓ及びＵＰＥ´ｓを設計して、塩の条件又は温度条件を使用し、サンプル中の核酸のＳＰＥ´ｓへのハイブリダイゼーションを選択的に可能にしてもよい。塩及び温度の条件は後で変更して、アレイのＵＰＥ´ｓへのハイブリダイゼーションを可能にし、適当な１連の反応を行ってもよい。
他の例は競合性ハイブリダイゼーションの利用である。核酸或いはこれらの類似物であってＵＰＥ´ｓに相同するものを加えてもよい。プレハイブリダイゼーション或いはこのような競合体の高い過剰分を含むことのいずれかにより、ＵＰＥ´ｓは全て、競合する核酸により占有されることで、ライブラリーの核酸のＳＰＥ´ｓのみへの結合が可能となる。更に、競合するものがＵＰＥ´ｓに結合するにもかかわらず、競合するものがＵＰＥ´ｓの伸長の際テンプレートとして作用出来ないような手法で、競合するものを合成してもよい。この目的のために使用し得る手段の例として、ペプチド核酸及び多くの１塩基部位を有するオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されるものではない。ＳＰＥ´ｓの伸長の後、ＳＰＥ´ｓの伸長に使用したテンプレートと、ＵＰＥ´ｓに結合した競合するオリゴヌクレオチドとの双方を同時に除去して、伸長したＳＰＥ´ｓおよびＵＰＥ´ｓの双方を互いに結合できるようにしてもよい。
図１６−１９に示す例においてポリＡ ＲＮＡは真核性のｍＲＮＡ中に内在するＵＤＥを利用する。前述したように、ＵＤＥｓを重合化或いはライゲーションのいずれかにより人工的に加えてもよい。例えば、選択された任意の配列を、Ｔ４ＲＮＡリガーゼの作用によりＲＮＡ分析物のライブラリーの５´末端に加えてもよい。したがって、固有のＲＮＡ配列用のＳＰＥ´ｓと、ライゲートされたセグメントと同一の配列を有するＵＰＥ´ｓとを有するアレイを使用してもよい。様々なＲＮＡの種をアレイの適当な位置へ局所化した後で、逆転写に適当な酵素を加えると供に、適当なバッファーおよび試薬を加えてＳＰＥ´ｓを伸長し、これによりアレイに結合する第１のストランドｃＤＮＡコピーを合成してもよい。ＲＮＡテンプレートを除去することで、ｃＤＮＡ中のＵＰＥの相補性がアレイ上の近くに位置するＵＰＥに結合するのを可能にし、その後続けて前述した１組の反応を起すことが可能となる。人工的に加えたＵＰＥ´ｓのために配列を選ぶことは、本質的には任意のことであるため、本発明のこの態様は、各ライブラリーに異なった独立したＵＰＥを加えることで分析物の異なるプールを同時に解析する場合にも適用してもよい。これに対し、先の従来技術は、同一配列を有する異なるソースからの分析物の集団を区別するための規定を設けない。この目的のため使用し得るアレイを図２０に示す。ここで２つのライブラリーが比較される。１つのライブラリーは、ＵＰＥ１の配列を核酸に加えることで作成し、第２のライブラリーは、核酸に結合したＵＰＥ２の配列を有するよう作成する。留意すべきことは、図２０において、アレイの座１は、座９と同一のＳＰＥ´ｓを有するが、ＵＰＥの同一性に関しては異なる。ここでＵＰＥ１は座１に存在し、ＵＰＥ２は座９に存在する。座１０に比較して座２に関して、このことは当然そうあるべきものである。したがって、同一の配列を座１或いは座９のいずれかの場所で結合してもよいが、各座で行われる増幅の程度は適当なＵＰＥ配列を含む結合した物質の量に依存するはずである。
加えて、本発明のこの態様に関し、前記例はＲＮＡコピー或いはｃＤＮＡコピーをライブラリーとして使用したが、先に開示したことはＤＮＡは初期の分析物であってもよいことである。本発明の本態様の１例として、ＤＮＡを制限酵素により短くして、フラグメントのライブラリーを生成してもよい。その後、ダブルストランドＵＤＥを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりこれらフラグメントにライゲートしてもよい。ライゲートした生成物を変性してＳＰＥ´ｓのアレイにハイブリダイズする。例えば、ある１つのターゲットとなる核酸の部位“Ｘ”に潜在的に存在するＳＰＥ´ｓを検討するため、ＳＰＥ´ｓの組をこれら３´末端で１つのヌクレオチドのみが異なるよう設計してもよい。その後の伸長の効率は、ＳＰＥの３´基に対しターゲットテンプレートの部位“Ｘ”でのヌクレオチドが如何にうまく整合したかによる。内部コントロールとして、１組のＳＰＥ´ｓを部位“Ｘ”で各ストランドを利用するよう設計し、情報を複写してもよい。このプロセスは図２１に示されている。この特定例においては、ライゲートしたフラグメントがＵＰＥ´ｓに相補的な配列を有するために、アレイ上での核酸とＵＰＥとの結合を避けることが好ましい。これを実行するために使用し得る手段の例は先に説明した。ここでＳＰＥ´ｓへの核酸のハイブリダイゼーションの間、ＵＰＥ´ｓは存在しないか或いは機能を発揮しない。一方、解析中の核酸を処理して、ＵＰＥ´ｓに相補的な配列を除去してもよい。例えば、前述したライゲーションの工程の後、核酸を３´から５´のダブルストランドのオキソヌクレアーゼで処理してもよい。これにより、ＵＰＥ´ｓに相補的な配列を選択的に除去する一方で、ＵＰＥ´ｓ中の配列に同一の配列を保持する。ＵＰＥに相補的な配列の再生は、ＳＰＥを伸長した後でのみ行うべきである。また、前述したように、ＵＰＥの配列を人工的に加えることで、各プール毎に異なるＵＰＥの配列を選択的に選ぶことによって、異なるプールを同時に分析できるようになる。
本発明の更なる目的は、従来の配列情報から得られた特定の配列を選択するよりむしろ、一般解析を行って、全ての可能な配列の完全な表現を提供するものである。例えば、４つの塩基と４つのバリアブル塩基の全ての前突然変異とを有するライブラリーのＳＰＥ´ｓは、４×４×４×４の区別できる配列例えばトータルで２５６の前突然変異からなる。４つのバリアブル塩基と全て先天性のオクタマー（８量体）オリゴヌクレオチドとの複合性に関し、トータルで２５６の前突然変異に対しては、トータルで２５６×２５６ある。従来技術においては、可能な増幅された生成物全てをカバーするアレイは、各個別の増幅のため２つの固有のプライマーを必要とする。したがって、アレイ上の固有のオクタマー（８量体）プライマーのペアに対しトータルで４．３×１０９の前突然変異に対しては、トータルで６５、５３６×６５、５３６ある。このような大きい数は、実際に応用するにはあまりにも過剰であり、あまりにも複雑すぎる。一方、本発明は、ＵＰＥ´ｓを使用するためこの限界を克服する。したがって、ＳＰＥ´ｓのみが、潜在するオクタマー配列全てを網羅する必要があり、この結果トータルで６５、５３６の異なる配列が必要となり、この数は現在のテクノロジーの能力の範囲ないである。各座で増幅される異なる核酸の数はテンプレートとして利用される核酸のライブラリーの複合性に依存すると供に、増幅を行う際の条件にも依存する。アレイの複合度は、ＳＰＥ´ｓからなるヌクレオチドの数を増加したり減少したりすることで変化し得る。逆を言えば、先に指摘したように、差別化の程度はＵＰＥに１又はそれ以上の独立した塩基を加えることで達成できる。例えば、ポリＴ ＵＰＥの末端で単一のバリアブルヌクレオチドを使用することで、増幅され得るライブラリー中の分析物の複合性が減少する。なぜなら、平均でＳＰＥ´ｓに結合した様々な異なる３つの核酸の内のたった１つがストランドの伸長を行う能力がある。一方、オクタマーＳＰＥ´ｓの完全な表現に加えて、３つの潜在する塩基の１つをそれぞれ運搬するＵＰＥ´ｓの３つの組全てを含むことで、アレイの複合性が６５、５３６配列からトータルで１．９７×１０５（３×６５、５３６）の前突然変異へと増加する。ＳＰＥオクタマーを有するアレイのＵＰＥの３´末端で最後の２つのヌクレオチドに対しバリアブルヌクレオチドを使用することで、複合性は８．０×１０５（１２×６５、５３６）の前突然変異である。また理解すべきことは、アレイの複合性が潜在するＳＰＥの配列全てを完全に表現することが可能であることである。例えば、ランダムな集団の平均的なＴｍよりずっと高いか或いはずっと低いＴｍ´ｓを有するオクトマーが存在することは望ましくないかもしれない。また、自己相補性３´及び５´末端を有するオクタマーの発揮する結合能力は低いかもしれない。ＵＰＥの複数種を使用している場合には、この態様は各ＵＰＥにより同時に行われる増幅により実施してもよい。より好適には、反応の各組に対しアレイ上に与えられたＵＰＥを使用して複数の反応を並列に行ってもよい。
本発明の他の態様によれば、混合相での増幅を行ってもよく、ここでアレイ上の固定された位置のＳＰＥ´ｓを、第１のストランドの合成のために使用する。しかし、第２のストランドの合成のために使用したプライマーはアレイのマトリックスに付着されない。本発明のこの態様において、溶液中の第２のストランド用のプライマーのプールは正規の核酸の運動を利用してアレイ上の区別できる座に固定した第１のストランドテンプレートを第２のストランドをプライミングするのにあてがってもよい。
図２２乃至２５は、アレイに固定したＳＰＥ´ｓのみを使用して１連の結合反応及び伸長反応の１つの例を示す。この例では、ＳＰＥ−Ｐ１は、座Ｐに固定され且つターゲットＰの（+）ストランドに相補的であるプライマーであり、ＳＰＥ−Ｐ２は、溶液中で固定されず自由で且つターゲットＰの（-）ストランドに相補的であるプライマーである。ＳＰＥ−Ｑ１は、座Ｑに固定され且つターゲットＱの（+）ストランドに相補的であるプライマーであり、ＳＰＥ−Ｑ２は、溶液中で固定されず自由で且つターゲットＱの（-）ストランドに相補的であるプライマーである。
図２２乃至２５で判ることは、反応の特性および特定座への増幅の固定は、全体的にこの第１のストランドをコピーする反応で指揮される。このように溶液中で固定されず自由なプライマーの同一性は、これらがアレイのＳＰＥ´ｓに特定的に結合され得る核酸を合成する能力を有する限り、重要ではない。したがって、第２のストランドのプライミング反応及び伸長反応を示すため固有の特定配列を図２２乃至２５では使用したが、混合相での増幅が行われる本発明のこの態様では、第２のストランドの合成のためのプライミングを、ＵＰＥ´ｓの混合物により行ってもよいし、またプライマーは全て一様にランダムプライマー或いはンダムプライマーのプールで構成してもよい。本発明のこの特定の態様は、配列のバリエーションの度合いを表わした一般的なアレイと供に使用する。例えば添付資料で説明したように本来の場所で合成して生成するアレイを、１つのオクタマーアレイの６５、５３６の前突然変異の幾つかあるいは全部で合成し、その後溶液中でＵＰＥ´ｓとともに使用してもよい。
本発明の他の態様は、アレイ上の結合サブストレートの露出を増加し、自己のマトリックスへの不特定結合を減少するよう作用する蛋白質とリガンドとのアレイを生成し使用するための新規な方法、組成物及びキットを開示する。１実施れいにおいて、２つのセグメント、即ち核酸部及び非核酸部から構成されるキメラ組成物を開示する。核酸部を使用して、非核酸部を固体支持体に付着させるための現実的且つより利用する機会の多い方法を達成する。１つの使用方法によれば、核酸部を直接アレイの表面に直接結合して、アレイの表面とキメラ組成物の非核酸部とのリンカーとして核酸部を作用させる。加えて、核酸のリン酸が変化するため、ある１つの座での各キメラ組成物は、キメラ組成物間の相互作用を最小にするための斥力を発揮する。
その配列の同一性よりむしろその物理的性質を利用しているので、如何なる特定配列も様々なキメラ組成物全てに概ね使用し得る。非核酸部の同一性に関する情報は核酸部からは得られず、むしろアレイ上のキメラ組成物が固定或いは不動化されている空間位置から得られる。これは、核酸部の特定配列の多様性を本質的に必要とし、更にその後の核酸部のデコーディングを必要とする従来技術とは相対するものである。本発明の他の実施の形態によれば、キメラ組成物の核酸部は、孤立した複数の配列からなり、支持体上で不動化された相補性配列へのハイブリダイゼーションを介してキメラ組成物がアレイに結合するのを可能にする。
キメラ組成物の核酸部は、デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、変性ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）のような核酸類似物或いはこれらのあらゆる組み合わせで構成してもよい。核酸部の配列は、完全に任意性のものであり、ユーザーによって選択され得る。本発明の１つの態様において、非核酸部をアレイに使用する固体表面に付着するための核酸ハイブリダイゼーションの本質的な性質に利点がある。したがって、本発明は、高い特異性、タイトな結合および良好な運動を可能にし、これら性質を享受しない非核酸部へ伝達されるべき核酸の相互作用の特徴である。
本発明のキメラ組成物の非核酸部は、ペプチド、蛋白質、リガンド或いは対応する結合パートナーと結合する能力を有するか或いはこの結合パートナーと相互作用する能力を有する他の化合物で構成してもよい。ペプチドおよび蛋白質は、その長さが小さなペプチドから大きなペプチドの範囲のアミノ酸配列で構成してもよい。このペプチドおよび蛋白質は、また、変質したアミノ酸或いはアミノ酸の類似物で構成してもよい。アミノ酸或いはアミノ酸の類似物は、如何なる所望の配列で構成してもよい。例えば、アミノ酸配列は、酵素、抗体、抗原、抗原のエピトープ（抗原決定基）受容体、及び糖蛋白質に由来するものであってもよい。ペプチド或いは蛋白質をキメラ組成物の非核酸部として使用する場合、核酸部の配列は任意性を有し、ペプチド或いは蛋白質のアミノ酸配列に対応しない。ペプチドおよび蛋白質付近の他の分子が、本発明において使用してもよい。非核酸部に使用し得る他の構成要素の例は、２０００以下のＭＷのリガンド、ホルモン、ドラッグ及び可能な蛋白質結合体で構成してもよいが、これらに限定されない。
前述したように、核酸の特定配列は、ユーザーによって決定される。本発明を使用する１つの方法において、非核酸部として使用される各個別の種を、固有の核酸配列に共有結合する。キメラ組成物の核酸部の、アレイ上での特定座で相補性配列へのハイブリダイゼーションにより、この座に今結合される非核酸部の特定種の同一性が決定される。例えば、各々が固有のペプチド及び固有の核酸の配列からなる１００個の異なるキメラ組成物を合成してもよい。各座が固有の核酸配列の１つに相補的である核酸を有する、１００個の異なる座を有するアレイでハイブリダイゼーションをその後行なってもよい。ハイブリダイゼーションの結果、各固有のペプチドはアレイの１つの特定座に局在し、核酸アレイがペプチドアレイに形質転換する。核酸部に対し使用し得る配列を選択するのに有用な方法は、ここに参照文献として加えるヒルショーン（Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ）等により説明されている。また、非核酸部と核酸部との間の関連性が必要とされないため、非核酸部に使用する異なる種を有するが、核酸部に対し１００個の配列の同じ組を使用するよう１つの異なる組の１００個のキメラ組成物を設計してもよい。この場合、一般的な核酸アレイを使用してキメラ組成物のアイデンティティーを変えることで異なるペプチドのアレイを生成してもよい。
これに代えて、非核酸部を結合する物質を、全てが同一の配列からなるオリゴヌクレオチドに付着させてもよい。例えば、様々な非核酸部を有するキメラ組成物を合成し、各キメラ組成物の核酸部を共通のポリＴ配列で構成してもよい。マトリックスを生成し、各部位のオリゴヌクレオチドを相補性ポリＡ配列で構成してもよい。キメラ組成物を、ヘラー（Ｈｅｌｌｅｒ）らの米国特許第５、６０５、６６２号（ここに参照文献として加える）に記載されたアドレス付け可能なアレイシステムを使用したマトリックスに適用してもよい。これらの手段によって、各特定のキメラ組成物を、電気的に制御されたシステムを使用したマトリックスに個々に適用し、ハイブリダイゼーションを介して適当な部位に不動化してもよい。
アレイの特定の座のキメラ組成物は、本質的には完全に均一である必要はなく、例えば、あるオリゴヌクレオチド配列を非核酸部の幾つかの異なる種に付着させてもよい。例えば、１連の１００個のペプチドを、プール１をオリゴヌクレオチド１に結合する２５個のペプチドで作成し、プール２をオリゴヌクレオチド２に結合する２５個のペプチドで作成し、プール３をオリゴヌクレオチド３に結合する２５個のペプチドで作成し、プール４をオリゴヌクレオチド４に結合する２５個のペプチドで作成することで、アレイのたった４つの異なる部位に配置してもよい。各部位で異なるオリゴヌクレオチドに相補的な固有の配列からなるオリゴヌクレオチド１、２、３及び４を有することで、各座にキメラ組成物の様々なプールを付着させてもよく、或いは前述するように、アドレス付け可能なアレイシステムを使用して、同一配列を有する核酸部を使用して各プールを局所化してもよい。核酸部及び非核酸部からなるキメラ組成物を、当業者に知られた方法を使用して合成してもよい。本発明で使用し得る方法は、タン（Ｔｕｎｇ）Ｃ-Ｈ（２０００バイオコンジュゲートケミストリー１１、５、６０５-６１８）およびエンゲルハード（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ）らの１９９３年に発行した米国特許第５、２４１、０６０号及び１９８３年５月５日出願の米国特許出願第０６/４９１９２９号に基づき優先権を主張したペルゴリージ（Ｐｅｒｇｏｌｉｚｚｉ）等の１９９５年６月７日出願の米国特許出願第０８/４７９９９５「ポリヌクレオチド配列を利用した分析物の検出、組成物キット」によりレビューとして記載される。ここで前記全ての文献をここに参照文献として加える。１つのアプローチとして、ペプチドとオリゴヌクレオチドとを、標準化し自動化した手法を使用し、その後互いに共役結合することで分離して合成する。例えば、チオール基をオリゴヌクレオチドの５´末端に加えるか、或いはキメラ組成物の核酸部の内部に加えてもよい。マレインイミド基をペプチドのＮ−末端或いはその内部に加えることで、オリゴヌクレオチドのチオール基を伴う反応により、核酸及びペプチドから構成されるキメラ組成物を形成することが可能となる（エリタジャ（Ｅｒｉｔｊａ）等１９９１年、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、４７；４１１３-４１２０、アラー（Ａｒａｒ）等１９９３年テトラヘドロン レター３４；８０８７-８０９０、エデ（Ｅｄｅ）等１９９４年バイオコンジュゲートケミストリー５；３７３-３７８、ステツェンコ（Ｓｔｅｔｓｅｎｋｏ）及びガイト（Ｇａｉｔ）２０００年Ｊ．Ｏｒｇ.Ｃｈｅｍ.６５；４９００-４９０８）。これに代えて、同一の固体支持体上にアミノ酸及びヌクレオチドを段階的に加えていくことで、キメラ組成物を生成してもよい（デラトルー（ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅ）等１９９４年テトラヘドロン レター３５；２７３３-２７３６、バーグマン（Ｂｅｒｇｍａｎｎ）及びバンワルス（Ｂａｎｎｗａｒｔｈ）１９９５年テトラヘドロン レター３６；１８３９-１８４２、ロブレス（Ｒｏｂｌｅｓ）等１９９９年テトラヘドロン レター５５；１３２５１-１３２６４、アントポルスキー（Ａｎｔｏｐｏｌｓｋｙ）等１９９９年Ｈｅｌｖ.Ｃｈｅｍ Ａｃｔａ８２、２１３０-２１４０）。これら文献を参照文献としてここに加えるが、これら文献において、最初にペプチドを合成し、その後続けて、塩基を加えてオリゴヌクレオチド部分を合成する。標準的なペプチドの合成では、アミノ酸のＮ-末端及び側鎖を、Ｆｍｏｃ基及びタートブチル基によりそれぞれ保護してもよい。Ｆｍｏｃ基の各サイクルは、２０％-ピペリジンにより除去し、側鎖を９０％-トリフルオロ酢酸で保護解除する。しかしながら、オリゴヌクレオチドとペプチドとの双方を単一の組成物の１部として合成した場合、異なる化学的性質を利用すべきであった。例えば、塩基易動性Ｆｍｏｃ基及び塩基易動性９-フルオレンメチル基をアミノ酸側鎖保護基として使用し、ＤＮＡが強い酸に曝されるのを避けた（デラトルー（ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅ）の先に引用した文献、デラトルー（ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅ）等１９９９バイオコンジュゲートケミストリー１０；１００５-１０１２、ロブレス（Ｒｏｂｌｅｓ）等の先に引用した文献、これら全ての文献を参照文献としてここに加える）。核酸類似物であるＰＮＡに融合したペプチドのキメラ組成物を生成する方法は、ここに参照文献として加える米国特許第６、２０４、３２６中にクック（Ｃｏｏｋ）等により説明されている。更に、核酸とペプチドから構成されるキメラ組成物を固体支持体上で直接合成し、ここに参照文献として加える米国特許第５、９１９、５２３中にサンドバーグ（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ）等により説明されている方法を使用してアレイを形成してもよい。
固体支持体は、アレイ用に使用するあらゆる物質であってよく、ナイロン、セルロース膜、ガラス、合成物、プラスチック及び金属を含むが、これらに限定されるものではない。この材料は、遮光性、反射性、透過性、半透過性であってもよい。これらは、多孔性でも非多孔性でもよい。キメラ組成物の１部或いはキメラ組成物に相補的であるべき核酸は、ＤＮＡアレイを調製するのに使用するものとして既に知られた方法で固体支持体に固定してもよい。
混合相形態或いは液状形態のいずれかで分析物を適当な結合パートナーに結合してもよい。例えば、本発明は、合成アームリンカー及びキメラ組成物を使用して、結合サブストレートをアレイに直接固定することを開示した。アレイ上の結合サブストレート（固相状態）を、意図する分析物を含んだ溶液（液相状態）に曝してもよい。アレイ上の結合サブストレートと溶液中の分析物との相互作用を後で定量化してもよい。本発明で使用するかもしれない相互作用の例は、ペプチド-蛋白質、抗原-抗体、リガンド-受容体、或いは酵素-サブストレートを含むが、これに限定されるものではない。例えば、アレイを１連のペプチドで作成し、特定の抗体に結合する能力を定量してもよい。アレイを抗体を含む溶液中でインキュベートし、その後続けて結合しなかった物質を洗い流してもよい。アレイ上の様々な成分に結合した抗体の検出を、多くの従来技術のいずれかで行ってもよい。例えば、本例では、アレイに塗布される抗体をビオチンでラベルして、直接的に検出するか或いは、蛍光性化合物でラベルして、間接的に検出してもよい。これに代えて、抗体分析物をラベルせず、蛍光性ラベルを有する２次的な抗体を利用して、直接的に検出するか或いは、ビオチンのような間接的ラベルを有する２次的な抗体を利用して間接的検出してもよい。従って、本例においては、抗体-抗原相互作用は固体マトリックスに抗原を結合することで現れる。
本発明は、また、アレイに結合或いは不動化した相補性核酸にキメラ組成物の核酸部をハイブリダイズすることでアレイに間接的に結合したキメラ組成物の使用方法を開示した。これらは、キメラ組成物をアレイにハイブリダイズしその後続けて分析物を結合することで、前述したのと同一の混合形態で使用してもよい。しかしながら、ハイブリダイゼーションを使用してキメラ組成物をアレイの特定座に不動化することで、分析物をキメラ組成物に結合する際に完全な液相形態での使用を可能にする。この方法では、キメラ組成物を最適な条件の下で溶液中のターゲットとなる分子と結合させて、分析物とキメラ組成物の非核酸部との間の相互作用を引き起こしてもよい。この結果得られる溶液は、この溶液中で自由なキメラ組成物を含有すると供に、分析物を有する複合体に結合したキメラ組成物を含有するものであり、この溶液をマトリックスに塗布して、核酸部をアレイ上で相補的配列にハイブリダイズすることで、様々なキメラ組成物をアレイ上の様々な位置に局所化してもよい。このプロセスを図２８に示す。
ハイブリダイゼーションは、リガンド-受容体複合体或いは蛋白質-蛋白質複合体と相互干渉しないような緩やかな条件で行ってもよい。蛋白質-蛋白質間の相互作用は、概して、大きさが１０−５から１０−９のオーダーの低いＫｍ´ｓにより特徴づけされる。本発明のこの態様では、蛋白質の相互作用は、固体表面上でよりもむしろ液体中で現れ、優れた結合動作が可能となると供に、広い条件で蛋白質の結合が可能となり、混合形態で得ることが可能となる。また、キメラ組成物と分析物とが供に溶液中に存在することで、マトリックスとの直接の相互作用或いは相互干渉を避けて、バックグランドを減少させる。従って、先に引用した例を使用して抗体ターゲットを含む溶液を、キメラ組成物を含む溶液と組み合わせる。従って、本発明の方法を使用することで、蛋白質は、プロセス中ずっと溶液中に存在し、固体マトリックスに結合した蛋白質を脱水することに関連した問題を防止する。
本発明の方法を使用して化合物間の相互作用を含めた多くのシステムを研究してもよい。これらは、抗原-抗体関係、蛋白質-蛋白質相互作用、酵素-サブストレート相互作用、受容体-リガンド相互作用、リガンド-受容体相互作用、ホルモン-受容体相互作用、炭水化物-レクチン相互作用、ドラッグスクリーニング、及び細胞中或いは組織中での蛋白質の発現パターンを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の他の使用方法は、個々の非核酸部毎に固有の核酸部を使用することに代えて、１つの特定結合サブストレートを様々な核酸供給資源と組み合わせることで、共通の非核酸部と固有の核酸部とを有するキメラ組成物を１集団を形成してもよい。各特定キメラ組成物を異なる資源から得た分析物と組み合わせ、アレイ上で核酸部をこれらと相補的な配列にハイブリダイズすることで、アレイに付着させてもよい。アレイに結合した蛋白質を標準的な手続きに従って検出してもよい。これら手段により、各資源から得たターゲットの量であって、キメラ組成物中の結合サブストレートと相互作用する可能性のある量を同時に検出してもよい。
例えば、１組２０個の異なる組成物を合成して、前記組の各組成物が異なる核酸部と同一のペプチドを有するよう合成してもよい。２０個の他の核酸部にリンクする１つの異なるペプチドを有するような他の組を生成してもよい。更なる組を同一塩基で作成してもよい。蛋白質の抽出物を２０の異なる組織から得て、各抽出物をキメラ組成物の組の異なる組成物と組み合わせてもよい。従って、核酸部は、ペプチドだけでなく資源として使用した特定組織に対してもマーカーとして作用する。例えば異なる受容体との親和性を有するペプチドを有する１群のセットを作成してもよい。キメラ組成物による混合物のインキュベーションの後、混合物をアレイに塗布し、検出してもよい。この方法において、研究している各特定の受容体を、様々な組織間で同時に定量して検出してもよい。これに代えて、前述したアドレス可能なシステムを使用し、個々の反応による混合物を加えた後に各座へのハイブリダイゼーションを行うことで、同一の核酸の配列を各資源に共通に使用してもよい。
同一の方法を、同一の資源に基づき異なる処理を行う組織培養及び細胞培養に応用してもよい。例えば、ドラッグ発見プログラム中において、９個の異なるドラッグを個々の細胞培養に加えて、特定蛋白質に対する効果を定量してもよい。モニターされるべき各蛋白質と反応することが知られているペプチドを有するキメラ組成物を設計し、合成してもよい。前述の例におけるように、ある１つの特定の核酸配列を、各ペプチド及び各特定処理に対しマーカーとして作用させてもよい。１０の細胞培養（９つの処理されたドラッグ及び１つの未処理コントロール）の各々から蛋白質を抽出し、キメラ組成物でインキュベートする。混合物をアレイに付着させ、アレイの各座で対応するペプチドに結合した分析物の量を様々なドラッグ条件に関して測定する。所望により、本発明を分析物の分離に使用してもよい。分析物とキメラ組成物の非核酸部との間の相互作用を中断しするか或いは、アレイに固定或いは不動化した相補的配列から核酸部を変質するかのいずれかにより、これを行ってもよい。また、アレイからキメラ組成物を除去することで他の試験でアレイを再利用してもよいことが予想される。
更に詳細には、本発明は新規なキメラ組成物及びこのキメラ組成物を使用したプロセスを提供する。１つのこのような組成物は、複数の分離した領域を含む固体表面のアレイからなり、該分離した領域の少なくとも２つは、核酸部分と非核酸部分とからなるキメラ組成物からなり、第１の分離した領域の該核酸部分は第２の分離した領域の核酸部分と同じ配列を有し、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有するものである。
他の組成物は、複数の分離した領域を含む固体表面のアレイを含む組成物であって、該分離した領域の少なくとも２つは、該分離した領域に固定化または不動化される核酸の相補的な配列にハイブリダイズされたキメラ組成物を含み、該キメラ組成物は、核酸部分と非核酸部分とを含み、該核酸部分は少なくとも１つの配列を含み、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は、該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に対して同一または相補的配列のいずれも含まない。
記載すべき方法は、目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、１）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは：核酸部分と非核酸部分とを含むキメラ組成物を含み、第１の分離した領域の該核酸部分は第２の分離した領域の核酸部分と同じ配列を有し、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有する固体表面のアレイと、ｂ）該目的の分析物の１つ以上を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、ｃ）シグナル発生手段とを提供し、２）サンプルｂ）と配列ａ）とを、該非核酸部分への該分析物の結合を許容する条件下で接触させ、３）該シグナル発生手段と該結合された分析物とを接触させ、４）該分析物の存在を検出または定量化する方法である。
目的の分析物を検出または定量化するための他の方法であって、１）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは、核酸部分と非核酸部分を含むキメラ組成物とを含み、第１の分離した領域の該核酸部分は第２の分離した領域の核酸部分と同じ配列を有し、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有する固体表面のアレイと、ｂ）該目的の分析物の１つ以上を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、ｃ）シグナル発生手段とを提供し、２）該シグナル発生手段で該目的の分析物をラベルし、３）該ラベルされた分析物と配列ａ）とを、該非核酸部分への該ラベル化された分析物の結合を許容する条件下で接触させ、４）該分析物の存在を検出または定量化する方法である。
目的の分析物を検出または定量化するための他の方法であって、１）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは該分離した領域に固定化または不動化された核酸部分を含む固体表面のアレイと、ｂ）ｉ）核酸部分と、ｉｉ）非核酸部分とを含むキメラ組成物であって、該核酸部分は、少なくとも１つの配列を有し、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は、該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に同一または相補的な配列のいずれも含まないキメラ組成物と、ｃ）該目的の分析物の１つ以上を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、ｄ）シグナル発生手段とを提供し、２）キメラ組成物と該配列とを接触して、該キメラ組成物の核酸部分を該配列に固定化または不動化された相補的な核酸にハイブリダイズし、３）サンプルと該配列とを、該非核酸部分への該分析物の結合を許容する条件下で接触させ、４）該シグナル発生手段と該結合された分析物とを接触させ、５）該分析物の存在を検出または定量化する方法である。
目的の分析物を検出または定量化するための他の方法であって、１）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは、該分離した領域に固定化または不動化された核酸部分を含む固体表面のアレイと、ｂ）ｉ）核酸部分と、ｉｉ）非核酸部分とを含むキメラ組成物であって、該核酸部分は、少なくとも１つの配列を含み、該非核酸部分は、目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は、該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に同一または相補的配列のいずれも含まないキメラ組成物と、ｃ）該目的の分析物を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、ｄ）シグナル発生手段とを提供し、２）該非核酸部分に該分析物を結合することを許容する条件下で、該サンプルｂ）と該キメラ組成物とを接触させ、３）該キメラ組成物と該配列とを接触して、該キメラ組成物の核酸部分を該配列に固定化または不動化された相補的な核酸にハイブリダイズし、４）該シグナル発生手段と該結合された分析物とを接触させ、５）該分析物の存在を検出または定量化する方法である。
他の有用な方法は、目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、１）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは、該分離した領域に固定化または不動化された核酸部分を含む、固体表面のアレイと、ｂ）ｉ）核酸部分と、ｉｉ）非核酸部分とを含むキメラ組成物であって、該核酸部分は、少なくとも１つの配列を含み、ここで該非核酸部分は、目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に同一または相補的配列のいずれも含まないキメラ組成物と、ｃ）該目的の分析物の１つ以上を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、ｄ）シグナル発生手段とを提供し、２）該キメラ組成物と該配列とを接触して、該キメラ組成物の核酸部分を該配列に固定化または不動化された相補的な核酸部分にハイブリダイズし、３）該シグナル発生手段で該分析物をラベルし、４）ラベルされた分析物と該配列とを接触して、該分析物を該非核酸部分に結合し、５）該分析物の存在を検出または定量化する方法である。
目的の分析物を検出または定量化するための他の方法は、１）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは、該分離した領域に固定化または不動化された核酸部分を含む、固体表面のアレイと、ｂ）ｉ）核酸部分と、ｉｉ）非核酸部分とを含むキメラ組成物であって、該核酸部分は、少なくとも１つの配列を含み、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に同一または相補的配列のいずれも含まないキメラ組成物と、ｃ）該目的の分析物を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、ｄ）シグナル発生手段とを提供し、２）該シグナル発生手段で該目的の分析物をラベルし、３）該ラベルされた分析物と該キメラ配列とを接触して、該分析物を該非核酸部分に結合し、４）該キメラ組成物と該配列とを接触して、該キメラ組成物の核酸部分を、該配列に固定化または不動化された相補的な核酸にハイブリダイズし、５）該分析物の存在を検出または定量化する方法である。
直前の幾つかのキメラ組成物で引用したエレメントとこのキメラ組成物を使用するプロセスは、本開示の別の場所で説明した。
以下、実施例を説明し、本発明の様々な態様を図示するが、如何なる場合もその後に続く請求の範囲に記載し定めた範囲を限定するものではない。
実施例１：Ｔ７プロモーター配列を有するランダムプライマーによって行われる第２のストランドの合成をによるＲＮＡターゲットのライブラリーの増幅：
１）第１のストランドの合成：
２５０ｎｇのウサギグロブリンｍＲＮＡ（ライフ テクノロジー、 ロックビル、ＭＤ）と２００ｎｇのオリゴ（ｄＴ）２４（社内所有または購入）との２つの混合物を５μｌを、７０℃で１０分間加熱後、氷上で２分間インキュベートした。次いで、この材料を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、６００μＭのｄＮＴＰ、および１２０単位のスーパースクリプトＩＩ ＲＮＡ分解酵素Ｈ、逆転写酵素（ライフ テクノロジー、 ロックビル、ＭＤ）を含む１０μｌの反応物中で使用し、４２℃で６０分間インキュベートした。
２）第２のストランドの合成：
ＫＯＨを反応物に添加して最終濃度を２００ｍＭとした。３７℃で３０分間インキュベーションを行った後、等モル量の氷酢酸で中和した。以下の配列を有するプライマーを使用して、第２のストランドの合成を行った：
５´−ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＮ１−９−３´。
上記の配列を有するプライマー（ＴＰＲプライマー）は、５´末端のＴ７プロモーター配列と、３´末端のランダム配列を含む９ヌクレオチドとからなる。４００ｐｍｏｌのＴＰＲプライマーおよび他の適切な試薬を添加して、８６．６ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、３２ｍＭのＫＣｌ、２００ｍＭのＫＯＡｃ、１５．６ｍＭのＭｇＣｌ２、３．３ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１５ｍＭのＮＡＤ、２００μｇ／ｍｌのヌクレアーゼを含んでいないＢＳＡ（バイエル、カンカケイ、アイエル）を含む最終反応混合物を３０μｌ得た。アニーリングを混合物を６５℃に加熱することで行い、室温までゆっくり冷却し、その後氷上で５分間インキュベートした。１．２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、４単位のイー・コリ ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）および１２単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）または６単位のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ-フラグメント エキソ（−）バージョン（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）のいずれかを添加してプライマー伸長を行った。インキュベートを１５℃で５分間、その後３７℃で１２０分間行った。フェーズロックゲル（エッペンドルフ、ウェストベリー、ＮＹ）を用いたフェノール／クロロホルムでの抽出およびエタノール沈殿によって反応物を精製した。
３）転写：
製造者の使用説明書に従い、「バイオアレイハイイールドトランスクリプションキット」（Ｔ７）（エンゾー ダイアグナスティックス、ファーミングデール、ＮＹ）を使用して転写を行って、最終体積を４０μｌした。反応混合物は、また、比活性４５Ｃｉ／ｍＭｏｌの１０μＣｉの３Ｈ−ＡＴＰ（アマーシャム ファーマシア、ピスケートウェイ、ＮＪ）を含んでいた。１ｍｌの１０％ＴＣＡ、５０μｇ／ｍｌ ポリＡ、５ｍＭのＥＤＴＡへの５μｌの転写反応物の添加およびその後の氷上での３０分間のインキュベーションによって組み込み処理を行った。沈殿物を２５ｍｍのグラスファイバーフィルター（ワットマン、リフトン、ＮＪ）上に回収し、その後５％ＴＣＡで３回洗浄し、エタノールで３回洗浄した。
４）結果と結論：
サンプル１ ＤＮＡポリメラーゼＩを有する ４，２４３ｃｐｍ
サンプル２ エキソ（−）クレノーを有する １９，６６２ｃｐｍ
本実施例により、上記の工程および使用した条件の下で、ＲＮＡ転写物が核酸ライブラリーから得られ、クレノーのエキソ（−）バージョンが、ＤＮＡポリメラーゼＩを使用した場合と比較してより多くの生成されたことが実証された。
実施例２：オリゴＴ磁性ビーズを使用した第１のストランドの合成およびＴ７プロモーター配列を有するランダムプライマーによる第２のストランドの合成によるＲＮＡターゲットライブラリーの増幅：
１）ビーズの調製：
５０μｌのダイナルオリゴ（ｄＴ）２５磁性ビーズ（ダイナル社、レイク サクセス、ＮＹ）を、１００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１．０ＭのＬｉＣｌ及び２ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄し、その後５０μｌの結合緩衝液に再懸濁した。
２）ＲＮＡのビーズへの結合：
１μｇのマウスポリＡ ＲＮＡ（シグマ ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）または１μｇのコムギ胚芽ｔＲＮＡ（シグマ ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）を、ＲＮＡ分解酵素を含んでいないＨ２Ｏ（アムバイオン、オースチン、ＴＸ）中に希釈し、最終濃度を５０μｌとし、そして、ＲＮＡ溶液を６５℃で５分間加熱して、ＲＮＡターゲットを調製した。ＲＮＡ溶液を工程１で調製したビーズと合わせ、ダイナルサンプルミキサー（ダイナル社、レイク サクセス、ＮＹ）を用いて室温で１５分間混合した。結合していない物質を、ダイナル磁気粒子濃縮器（ダイナル社、レイク サクセス、ＮＹ）を使用した磁気分離によって除去し、その後２００μｌの洗浄緩衝液Ｂ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１５０ｍＭのＬｉＣｌ及び１ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄し、２５０μｌの第１のストランド用の緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ及び３ｍＭのＭｇＣｌ２）で３回洗浄した。
３）第１のストランドの合成：
工程２由来のビーズを、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、５００μＭのｄＮＴＰ、および４００単位のスーパースクリプトＩＩ ＲＮＡ分解酵素Ｈ、逆転写酵素（ライフ テクノロジー、 ロックビル、ＭＤ）中に再懸濁し、４２℃で９０分間インキュベートした。
４）第２のストランドの合成：
工程３での第１のストランドの合成反応混合物を９０℃で５分間加熱して、ＲＮＡテンプレートを除去し、続いて磁気分離後に上清を除去した。ビーズを、１００μｌの緩衝液Ｃ（７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、９０ｍＭのＫＣｌ、１４．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＥ、１０ｍＭの（ＮＨ４）ＳＯ４、および２００μｇ／ｍｌのヌクレアーゼを含んでいないＢＳＡ）で２回洗浄し、３６０ｐｍｏｌのＴＰＲプライマーを含む５０μｌのランダムプライミングミックスＡ（８６．７ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１１３．３ｍＭのＫＣｌ、１７ｍＭのＭｇＣｌ２、１１．３ｍＭのＤＴＴ、１１．３ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２２７μｇ／ｍｌのヌクレアーゼを含んでいないＢＳＡ）に再懸濁した。プライマーを氷上で１５分間アニーリングした。結合していないプライマーを、磁気分離によって除去した。ビーズを、１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩクレノーフラグメント（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）および４００ｍＭのｄＮＴＰを含む５０μｌのランダムプライミングミックスＡ（ＴＰＲプライマーを含まない）に再懸濁した。４℃で５分間、１５℃で３０分間、３７℃で３０分間インキュベーションを行った。いくつかのサンプルについては、さらに工程１に記載のように調製した２５μｌのオリゴＴ磁性ビーズを緩衝液Ｃで調製し、反応混合物に添加した。また、いくつかのサンプルについては、３単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）およびｄＮＴＰの１０ｍＭストックを２μｌ反応混合物に添加した。これらのさらなる工程を使用したサンプルを、３７℃で３０分間インキュベートした。種々の反応の終わりに、ビーズを試薬から磁気によって分離し、このビーズを使用して転写分析を行った。
５）転写合成：
製造者の使用説明書を使用し、バイオアレイハイイールドトランスクリプションキット（Ｔ７）（エンゾー ダイアグナスティックス、ファーミングデール、ＮＹ）による試薬へのビーズの再懸濁によって転写反応を行って、最終体積を４０μｌとした。反応混合物はまた、比活性４５Ｃｉ／ｍＭｏｌを有する１０μＣｉの３Ｈ−ＡＴＰ（アマーシャム ファーマシア、ピスケートウェイ、ＮＪ）を含んでいた。前述したように転写の程度をＴＣＡ沈殿を使用して測定した。
６）結果：
サンプル ターゲット 過剰ビーズ Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ 組込ｃｐｍ
１． ポリＡ ― ― ８，５３５
２． ポリＡ ― ＋ １５，４８３
３． ポリＡ ＋ ― １６，０４８
４． ポリＡ ＋ ＋ １８，８７５
５． ｔＲＮＡ ＋ ＋ ２，５４８。
７）結論：
本実施例により、前述の工程によって核酸ライブラリーから転写物が得られたことが実証された。過剰にビーズを添加することにより、合成量を増加させることができる。Ｔ４ ＤＮＡ重合工程を用いずにこの反応を行うことができるが、このような試薬の添加によって合成量を増加させることもできる。
実施例３：オリゴＴ磁性ビーズと、Ｔ７プロモーター配列を有するランダムプライマーとを使用したＲＮＡターゲットライブラリーの増幅における逆転写酵素への依存性：
１）ビーズの調製：
各反応のビーズの量を１００μｌに増加させる以外は、実施例２の工程１に記載のように本工程を行った。
２）ＲＮＡのビーズへの結合：
１μｇのマウスポリＡ ｍＲＮＡ（シグマ ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）を、ヌクレアーゼを含んでいないＨ２Ｏ（アンビオン社、オースチン ＴＸ）に希釈して最終濃度を５０μｌとし、更にＲＮＡ溶液を６５℃で１５分間加熱することによって、ＲＮＡターゲットを調製した。ＲＮＡ溶液を工程１で調製したビーズと合わせ、ダイナルサンプルミキサー（ダイナル社、レイク サクセス、ＮＹ）を用いて室温で１５分間混合した。結合しなかった物質を磁気分離によって除去し、その後続けて、２００μｌの洗浄緩衝液Ｂで２回洗浄し、更に１００μｌの第１のストランド用の緩衝液で２回洗浄した。
３）第１のストランドの合成：
一組の複製サンプルの逆転写酵素を省略する以外は、実施例２の工程３に記載のように本工程を行った。
４）第２のストランドの合成：
工程３の第１のストランドの合成反応混合物を９０℃で４分間加熱することによって、ＲＮＡテンプレートを除去し、その後続けて、磁気分離後に上清を除去した。ビーズを、１００μｌの洗浄緩衝液Ｂで２回洗浄し、３６０ｐｍｏｌのＴＰＲプライマーを含む５０μｌのランダムプライミングミックスＡに再懸濁した。プライマーを氷上で１５分間アニーリングした。非結合プライマーを、磁気分離によって除去し、ビーズを、１００μｌの低温緩衝液Ｄ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、９０ｍＭのＫＣｌ、４．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４）で２回洗浄した。１ｍＭのｄＮＴＰおよび１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）を含む４０μｌの緩衝液Ｃに再懸濁した。４℃で５分間、１５℃で３０分間、３７℃で３０分間インキュベーションを行った。２μｌ（６単位）のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）およびｄＮＴＰの１０ｍＭストック２μｌを添加することにより、更なる反応を行い、その後３７℃で３０分間インキュベートした。
５）転写合成：
ビーズを、１００μｌの洗浄緩衝液Ｂで２回洗浄し、１００μｌの１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１回洗浄した。ビーズを１０μｌの１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、製造者の使用説明者を使用して、バイオアレイハイイールドトランスクリプションキット（Ｔ７）（エンゾー ダイアグナスティックス、ファーミングデール、ＮＹ）により試薬と混合した。反応物の体積は３０μｌであり、３７℃で２時間インキュベーションを行った。
６）結果と結論：
０．５×ＴＢＥ緩衝液中に１％アガロースを使用することで、１０μｌの転写反応物をゲル電気泳動させ反応物の分析を行った。本実験結果は図２７中に複製サンプルについて示されており、この結果は、上記の工程によって核酸ライブラリーから転写物が得られ、この合成は逆転写酵素活性の存在に依存することを実証するものである。
実施例４：Ｔ７プロモーターを有するランダムプライマーによる第２のストランドの多数過程による合成：
ビーズの調製、ｍＲＮＡの結合、および第１のストランドの合成の工程１、２、および３を、実施例３の工程１乃至３に記載のように行った。
４）第２のストランドの合成：
第１のストランドの合成後、液相を磁気分離によって除去し、ビーズを１００μｌのディタージェントウォッシュ Ｎｏ．１（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％ＳＤＳ）に再懸濁し、９０℃で５分間加熱した。上清を磁気分離によって除去し、ビーズを１００μｌのディタージェントウォッシュ Ｎｏ．２（４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％ツィーン ２０、０．０１％ノニデット Ｐ４０）で洗浄した。ビーズを１００μｌの洗浄緩衝液Ｂで２回洗浄し、３６０ｐｍｏｌのＴＰＲプライマーを含む５０μｌのランダムプライミングミックスＡに再懸濁した。プライマーを氷上で１５分間アニーリングした。結合しなかったプライマーを磁気分離によって除去し、ビーズを１００μｌの低温緩衝液Ｄ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、９０ｍＭのＫＣｌ、４．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４）で２回洗浄した。次いで、ビーズを１ｍＭのｄＮＴＰおよび１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）を含む４０μｌの緩衝液Ｃに懸濁した。４℃で５分間、１５℃で３０分間、３７℃で３０分間インキュベーションを行った。２μｌ（６単位）のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）およびｄＮＴＰの１０ｍＭストックを２μｌ添加し、その後続けて、３７℃で３０分間インキュベートすることで、更なる反応を行った。ビーズを１００μｌの洗浄緩衝液Ｂで２回洗浄し、５０μｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、５分間加熱した。上清を磁気分離後に除去し、上清番号１として保存した。次いで、ビーズを１００μｌのディタージェントウォッシュ Ｎｏ．２でもう一度洗浄し、１００μｌの洗浄緩衝液Ｂで２回洗浄し、３６０ｐｍｏｌのＴＰＲプライマーを含む５０μｌのランダムプライミングミックスＡに再懸濁した。プライマーのアニーリングおよび伸長を上記のように行った。次いで、ビーズを１００μｌの洗浄緩衝液Ｂで２回洗浄し、５０μｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、９０℃で５分間加熱した。上清を磁気分離後に除去し、上清２として保存した。一連の洗浄工程、アニーリング工程、および伸長工程を、上記の工程を使用して再度行った。ついで、ビーズを１００μｌの洗浄緩衝液Ｂで２回洗浄し、５０μｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、９０℃で５分間加熱した。上清を磁気分離後に除去し、上清３として保存した。
５）第２のストランドに相補するものの合成：
上清番号１、上清番号２、および上清番号３を合わせることによってプールを作製した。このプールは、５´末端のＴ７プロモーターおよび３´末端のポリＡセグメントを有する、溶液中で自由な第２のストランドのライブラリーからなる。ポリＴテールを有する新しい磁性ビーズを調製し、実施例２の工程１および２に記載のものと同一の方法によって第２のストランドのプールに対しアニールを行った。次いで、１ｍＭのｄＮＴＰおよび１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）を含む５０μｌの緩衝液Ｃへの再懸濁によって伸長した。３７℃で９０分間インキュベーションを行った。次いで、反応体積を２０μｌに減少させる以外は実施例３の工程５に記載のように転写を行った。
６）結果と結論：
この実験の結果は図２８中に示し、上記の工程によってポリＡ ｍＲＮＡのライブラリーから転写物が得られたことが実証された。この実施例により、第２のストランドのライブラリーは第２のストランドの多数の合成過程の後に得られ、溶液中で自由な状態に分離され、その後これを使用して機能的に活性なプロダクションセンター（生成源）が作製されたことが実証された。
実施例５：転写構成物からのさらなるＲＮＡの合成：
実施例４に記載の転写構成物のライブラリーを使用して、第２過程の転写を行った。実施例４の分析のための転写生成物の除去後、ビーズを１００μｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、４℃で一晩放置した。翌日、ビーズを１００μｌのディタージェントウォッシュ Ｎｏ．２で洗浄し、１００μｌのディタージェントウォッシュ Ｎｏ．１に再懸濁し、４２℃で５分間加熱し、その後１００μｌの洗剤緩衝液Ｎｏ．２で２回洗浄し、更に１００μｌの洗浄緩衝液Ｂで２回洗浄し、更に１００μｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。転写反応物を２０μｌの体積作成した。
結果と結論：
転写反応の結果を図２９に示すが、これは、実施例４で合成した核酸は安定であり、これをさらなる転写合成に使用することができることを示す。
実施例６：ポリＧテールを第１のストランドへ末端転写酵素により添加してＴ７プロモーターを有するプライマーの結合：
１）ビーズの調製：
１５０μｌのダイナルオリゴ（ｄＴ）２５磁性ビーズ（ダイナル社、レイク サクセス、ＮＹ）を、１５０μｌの結合緩衝液で２回洗浄し、７５μｌの結合緩衝液に再懸濁した。
２）ＲＮＡのビーズへの結合：
３μｌの０．５μｇ／μｌマウスポリＡ ＲＮＡ（シグマ ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）を３２μｌのＲＮＡ分解酵素を含んでいない水（アムバイオン、オースチン、ＴＸ）および４０μｌの結合緩衝液で希釈し、６５℃で５分間のＲＮＡ溶液を加熱することで、ＲＮＡターゲットを調製した。ＲＮＡ溶液を工程１で調製したビーズと合わせ、室温で３０分間混合した。
３）第１のストランドの合成：
結合しなかった物質を磁気分離によって除去し、その後続けて、２００μｌの洗浄緩衝液Ｂで２回洗浄し、更に１００μｌの第１のストランド用の緩衝液で１回洗浄した。ビーズを、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、５００μＭのｄＮＴＰ、および４００単位のスーパースクリプトＩＩ ＲＮＡ分解酵素Ｈ、逆転写酵素（ライフ テクノロジー、 ロックビル、ＭＤ）の５０μｌの混合物中に再懸濁し、４２℃で９０分間インキュベートした。第１のストランドの合成反応の最後に、液相を磁気分離によって除去し、ビーズを１００μｌのディタージェントウォッシュ Ｎｏ．１に再懸濁し、９０℃で５分間加熱した。上清を磁気分離によって除去し、１００μｌのディタージェントウォッシュ Ｎｏ．２および１００μｌの洗浄緩衝液Ｂで２回で洗浄し、３００μｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
４）第２のストランドの合成：
２つの方法を使用して第２のストランドの合成を行った。第１の方法は上記実施例に記載の方法であり、すなわち、５´末端にＴ７プロモーターを有し、３´末端にランダム配列を有するＴＰＲプライマーを使用した。第２の方法は、５´末端にＴ７プロモーターを有し、３´末端にポリＣセグメントを有するＴ７−Ｃ９プライマーの使用であった。Ｔ７−Ｃ９プライマーの配列は以下の通りである：
５´ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣ-３´。
工程３の生成物を２つの部分に分けた。第１の部分（サンプル番号１）は、１００μｌであり、ランダムプライミングに使用するため別にしておいた。第２の部分（残り２００μｌ）を、ビーズから緩衝液を磁気的分離することよってさらに処理し、ビーズを１００μｌに再懸濁し、さらに１００μｌのポリＡミックス（１．６μｇ／μｌのポリＡ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ＭのＬｉＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）を添加した。ポリＡはアマーシャム ファーマシア、ピスケートウェイ、ＮＪ）から購入したもので、平均３５０ヌクレオチド長を有するものであった。ビーズおよびポリＡを、ダイナルサンプルミキサー（ダイナル社、レイク サクセス、ＮＹ）を用いて室温で１５分間混合した。ビーズを洗浄緩衝液Ｂで２回洗浄し、２００μｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁した。これを１００μｌの２つの部分（サンプル番号２およびサンプル番号３）に分けた。ビーズから緩衝液の磁気的分離することよって、サンプル３をさらに処理し、３´オリゴヌクレオチドテーリングシステム（エンゾー バイオケム、ファーミングデール、ＮＹ １１５６１）から得た試薬およびダイレクションを０．５ｍＭのｄＧＴＰの存在下で使用することで、８０μｌの反応混合物にビーズを再懸濁した。サンプル番号３を３７℃で１時間インキュベートし、その後磁気分離によって試薬を除去した。ついで、ビーズを１００μｌの洗浄緩衝液Ｎｏ．１に再懸濁し、９０℃で３分間加熱した。次いで、１００μｌのディタージェントウォッシュ Ｎｏ．２で一度洗浄し、その後１００μｌの洗浄緩衝液Ｂで２回洗浄した。サンプル番号３を、１００μｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁した。これら全てのサンプル（サンプル番号１、サンプル番号２、およびサンプル番号３）を、１００μｌの洗浄緩衝液Ｅ（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、３００ｍＭの（ＮＨ４）ＳＯ４）で１回洗浄し、５０μｌの緩衝液Ｅに再懸濁した。第２のストランドの合成用プライマーを各サンプルに添加した。ここで、サンプル１には４μｌの１００ｐＭｏｌｅ／μｌのＴＰＲプライマーを添加し、サンプル２および３には４μｌの１０ｐＭｏｌｅ／μｌｎＴ７−Ｃ９プライマーを添加した。次いで、サンプルを氷上で１５分間インキュベートし、その後１００μｌの氷冷緩衝液Ｅで洗浄し、氷冷緩衝液Ｄで１回洗浄した。各サンプルを、１ｍＭのｄＮＴＰおよび２００単位のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）を含む４０μｌの緩衝液Ｄに再懸濁した。１５℃で３０分間、その後３７℃で３０分間インキュベーションを行った。
３つのサンプル全てを、２μｌ（３単位）のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ソースロケーション）および２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰを添加し、その後、３７℃で３０分間のインキュベーションによってさらに処理した。サンプルを、１００μｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。転写反応物を上記のように体積で２０μｌ生成した。
５）結果と考察：
１％アガロースを含む０．５×ＴＢＥ緩衝液中に使用して、２μｌおよび１０μｌの転写反応のサンプルによるゲル電気泳動によって反応物の分析を行った。この実験の結果を図３０に示すが、非内在性のＵＤＴが上記の方法によってライブラリーの第１のストランドのコピーの末端に付加されたことを実証している。非内在性のＵＤＴは、３´末端にポリＣを有するプライマーに対するプライマー結合部位として作用し、第２のストランドのライブラリーの合成を行った。サンプル番号２と番号３との間のＲＮＡ転写量の差異は、使用した条件下では内部の部位ではプライミングは比較的ほとんど起こらないというさらなる指標として役立つ。
実施例７：第１のストランドへポリＧテールを末端転写酵素により添加し、Ｔ７プロモーターを有するプライマーの結合（組込みアッセイ）：
実施例６の転写生成物を、図３０に示すようにゲル電気泳動によって分析した。この実施例に記載の方法の数値による評価を得るために、サンプル番号１、番号２、および番号３中のビーズに結合したライブラリーを、３Ｈの組込みを使用した別の転写反応で使用した。実施例３に記載のように転写を行った。
結果は以下のようであった：
ランダムプライミング
サンプル番号１ ６，６６０ｃｐｍ
Ｔ７−Ｃ９プライマー、ＴｄＴ付加工程無し、
サンプル番号２ １，１４４ｃｐｍ
Ｔ７−Ｃ９プライマー、ＴｄＴ付加工程無し、
サンプル番号３ ２１，２４８ｃｐｍ。
この第２のアッセイは、実施例６の結論と一致する。すなわち、Ｔ７−Ｃ９プライマーを本発明の方法で使用することができ、内部配列と比較して末端付加ポリＧ配列を用いてより多くがプライミングを行った。
実施例８：第２のストランドの合成後のプロモーターの組込み：
１）ビーズの調製：
実施例３の工程１に記載のように各サンプル用のビーズを調製した。
２）ＲＮＡのビーズへの結合：
各サンプル中で、１２０単位のプライムＲＮＡ分解酵素阻害剤（エッペンドルフ、ウェストベリー、ＮＹ）を添加することで、実施例３の工程２に記載のように、１μｇのポリｍＲＮＡをビーズに結合させた。
３）第１のストランドの合成：
反応に１２０単位のプライムＲＮＡ分解酵素阻害剤を補充する以外は、実施例３の工程３に記載のように第１のストランドの合成を行なった。
４）第２のストランドの合成：
実施例６のサンプル３について記載したように、ポリｄＧを添加した。１００μｌの反応物に８０ｐＭｏｌｅのプライマーを使用したこと以外は、実施例６に記載のように第２のストランドの合成を行った。サンプル番号１および２については、第２のストランドのプライマーは、前記のＴ７−Ｃ９プライマーであった。サンプル３および４については、第２のストランドのプライマーは配列：５´−ＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３´を有するＣ９プライマーであった。反応の最後に、全てのサンプルを１００μｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。
５）第３のストランドの合成：
サンプル番号２、３、および４を、２６μｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）へのビーズの再懸濁および９０℃で３分間の加熱によってさらに処理した。この方法で開放された第２のストランドを、磁気分離によってビーズから分離し、４０ｐＭｏｌｅの第３のストランドのプライマーと混合して、最終体積を３０μｌとした。サンプル３について、第３のストランドのプライマーは、配列：５´ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣ（Ｔ）２５−３´を有するＴ７−Ｔ２５プライマーであった。サンプル２および４について、第３のストランドのプライマーは、配列：５´ＣＴＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＡＴＴＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴ（Ｔ）２５−３´有するＴ３−Ｔ２５プライマーであった。
混合後、サンプル番号２、３、および４を氷上で１５分間維持した。次いで、伸長反応を、１×Ｍ−ＭｕＬＶ緩衝液（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）中で、１０単位のＭ−ＭｕＬＶ逆転移酵素（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）および１ｍＭの各ｄＮＴＰを使用し、最終体積４０μｌで行った。３７℃で１時間インキュベートした。６単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）をサンプル番号１、２、３、４に添加し、３７℃でさらに１５分間インキュベートした。ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を添加して最終濃度を１０ｍＭとし、反応を停止させた。次いで、サンプル番号２、３、および４から得たＤＮＡを、適量の１０ｍＭのトリス−ＨＣｌを添加して体積を１５０μｌに調整することによって精製した。反応物に同体積のフェノール：クロロホルム：イソアミールアルコール（２５：２４：１）を添加し、２ｍｌのフェーズロックゲルヘビーチューブ（エッペンドルフ、ウェストベリー、ＮＹ）に移した。チューブを１〜２分間ボルテックスし、微量遠心管中、１６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、水相を別のチューブに移し、ＤＮＡをエタノールおよび酢酸アンモニウムで沈殿させた。
６）転写：
ビーズ（サンプル番号１）および沈殿物（サンプル番号２、３、および４）を、バイオアレイハイイールドトランスクリプションキット（Ｔ７）（エンゾー ダイアグナスティックス、ＮＹ）の構成部品で再懸濁し、製造者の使用説明書に従い、２０μｌの体積で５μＣｉ３Ｈ−ＣＴＰ（２０Ｃｉ／ｍＭｏｌ）（アマーシャム ファーマシア、ピスケートウェイ、ＮＪ）を添加して転写を行った。さらに、バイオアレイハイイールドトランスクリプションキット（Ｔ７）（エンゾー ダイアグナスティックス、ＮＹ）のＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを省略して上記のいくつかの反応を行った。反応は、３７℃で１２０分間行った。
７）結果：
サンプル 第２ストランド 第３ストランドプライマー ＣＰＭ
番号 プライマー （ＲＮＡポリマー）
１． Ｔ７−Ｃ９ ---------- Ｔ７ １２，３９２
２． Ｔ７−Ｃ９ Ｔ３−Ｔ２５ Ｔ７ ２９，１６０
２． Ｔ７−Ｃ９ Ｔ３−Ｔ２５ Ｔ３ １４，７８４
３． Ｃ９ Ｔ７−Ｔ２５ Ｔ７ ２２，６２２
４． Ｃ９ Ｔ３−Ｔ２５ Ｔ３ １２，２２１。
８）結論：
本実施例により、第３のストランドの合成中にプロモーターを導入し、機能性プロダクションセンター（生成源）を生成し得ることが実証された。この実施例により、Ｔ７プロモーターに加えて、Ｔ３プロモーターもまた本方法で機能的であることも実証された。本実施例により、異なるプロダクションセンター（生成源）を構成体（サンプル番号２）の各末端に導入することができ、プロダクションセンター（生成源）双方とも機能的であることも実証された。
実施例９：熱安定性ポリメラーゼによる複数過程による第２のストランドの合成：
１）ビーズの調製：
ビーズへのＲＮＡの結合および第１のストランドの合成を、実施例８に記載のように行った。
２）第２のストランドの合成およびリサイクル：
実施例６のサンプル番号３について記載したようにポリｄＧを添加し、テールされた３´末端を有するビーズを様々な条件下で使用して、第２のストランドの合成を行った。５０μｌの反応混合物を、以下のように用意した。サンプル番号１は、１×Ｔａｑ ＰＣＲ緩衝液（エピセント、マディソン、ＷＩ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲエンハンサー（エピセント、マディソン、ＷＩ）、０．４ｍＭのｄＮＴＰ、４０ｐＭｏｌｅのＣ９プライマー、および５単位のマスター ＡｍｐＴＭ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（エピセント、マディソン、ＷＩ）からなり、サンプル番号２は１００ｐＭｏｌｅのＣ９プライマー以外はサンプル番号１と同一であり、サンプル番号３は、１×Ｔａｑ ＰＣＲ緩衝液（エピセント、マディソン、ＷＩ）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲエンハンサー（エピセント、マディソン、ＷＩ）、０．４ｍＭのｄＮＴＰ、４０ｐＭｏｌｅのＣ９プライマー、および５単位のマスター ＡｍｐＴＭ Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（エピセント、マディソン、ＷＩ）からなり、サンプル番号４は、１００ｐＭｏｌｅのＣ９プライマーを使用した以外はサンプル番号３と同一である。サンプル番号１および３は１回の結合／伸長サイクルを行い、サンプル２および４は、５回のこのようなサイクルを行った。各結合伸長／伸長サイクルを、以下の条件下のサーモサイクラーで行った：
９０℃で２分間、
４℃で５分間、
３７℃で５分間、
５０℃で５分間、
７２℃で１５分間。
各サイクルの終わりに、サンプル番号２および４を軽く振ってビーズを再懸濁した。１サイクルまたは５サイクルの完了後、混合物を９０℃で３分間加熱し、水性部分を磁気分離の後回収した。サンプル番号３および４について実施例８の工程５に記載のように、各サンプルをフェノール抽出し、エタノール沈殿を行った。
３）第３のストランドの合成：
ペレットを、２６μｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、Ｔ７−Ｔ２５プライマーを添加した。サンプル番号１および３には４０ｐＭｏｌｅのＴ７−Ｔ２５を添加し、サンプル番号２および４には４００ｐＭｏｌｅのＴ７−Ｔ２５を添加した。次いで、実施例８の工程５に記載のように、ＭｕＬＶ、ＭｕＬＶ緩衝液、およびｄＮＴＰＳの添加によって第３のストランドの合成を行った。
４）転写：
放射性前駆体を添加しないで、上記のように転写を行った。上記のようにゲル電気泳動によって各サンプルから得た反応物の分析を行った。これを図３１に示す。
５）結論：
本実施例により、熱安定性ポリメラーゼを使用して、上記の方法で第２のストランドの合成を行うことができたことが実証された。本実施例により、プライマー量およびサイクル数の増加により元の核酸ライブラリー由来のＲＮＡコピーの量が増加することも実証された。
実施例１０：連続過程による第２のストランドの合成による転写のレベル：
１）ビーズの調製：
ビーズへのＲＮＡの結合および第１のストランドの合成を、各反応の分析物および試薬を２倍に増加させる以外は実施例８に記載するように行った。実施例６のサンプル３に関し記載したように第２のストランドの合成のために第１のストランドを調製した。
２）第２のストランドの合成：
実施例８のサンプル番号３に記載のように第２のストランドを合成した。サンプル番号１は別にして、実施例８に記載のように第２のストランドの生成物の分離および単離を行った。次いで、新たな試薬をビーズに添加し、別過程の第２のストランドの合成を行った。この第２の反応生成物を、ビーズから分離し、サンプル番号２とした。次いで、ビーズをもう一度使用して、第３過程の合成を行った。この反応生成物を、サンプル番号３として区別した。
３）第３のストランドの合成：
サンプル番号１、２、および３をテンプレートとして使用して、実施例８に記載の試薬および条件を用いた各反応において第３のストランドの合成を行った。上記のように、本実施例の出発材料は実施例８での使用量の２倍であるので、この反応用の全試薬の量も２倍であった。例えば、８０ｐＭｏｌｅのＴ７−Ｔ２５プライマーを使用した。実施例８に記載のように、各反応由来の生成物を精製を行った。
４）転写：
バイオアレイハイイールドトランスクリプションキット（Ｔ７）（エンゾー ダイアグナスティックス、ＮＹ）を使用して転写反応を行った。ＤＮＡを最終反応体積２０μｌで使用し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、ゲル分析を使用して、上記の第２のストランドの各合成過程の結果である合成量を評価した。対比目的で、種々の量の転写反応物（４μおよび１０μｌ）を分析し、さらに、転写反応で使用されなかった等量のＤＮＡテンプレートも含めた。この結果を図３２に示す。
５）結論：
本実施例により、第２のストランドの各合成過程で生成された第２のストランドは、機能的プロダクションセンター（生成源）を有するライブラリーの合成するのに使用され得る能力が実質的に均等であることが実証された。図３２はまた、本合成に使用した転写物量とオリジナルのＤＮＡテンプレートとの間の対比を示すことで、各テンプレートからの高レベルでの合成を実証している。
実施例１１：種々の供給源由来の逆転写酵素の使用：
ビーズの調製：
種々の供給源由来の逆転写酵素を使用して第１のストランドの合成反応行った以外は実施例６に記載のようにＲＮＡのビーズへの結合および第１のストランドの合成を行った。サンプル番号２について実施例６に記載のように第２のストランドの合成を行った。具体的には、末端転写酵素の添加後、続けて、Ｔ７−Ｃ９プライマーの結合および伸長を行った。種々の逆転写酵素およびその供給源のリストを以下に示す。
１）スーパースクリプトＩＩ（ＲＮＡ分解酵素Ｈ（−）ＭｕＬＶ） （ライフ テクノロジー、ロックビル、ＭＤ）
２）ＲＮＡ分解酵素Ｈ（＋）ＭｕＬＶ（ライフ テクノロジー、 ロックビル、ＭＤ）
３）ＲＮＡ分解酵素Ｈ（＋）ＭｕＬＶ（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）
４）エンハンスドＡＭＶ （シグマ、セントルイス、ＭＯ）
５）ＡＭＶ （ライフ テクノロジー、 ロックビル、ＭＤ）
６）ＡＭＶ （シグマ、セントルイス、ＭＯ）
７）オムニスクリプト （キアジェン）
８）ディスプレイサーモ−ＲＴ（ディスプレイシステムズバイオテック）
９）パワースクリプト（ＲＮＡ分解酵素Ｈ（−）ＭｕＬＶ） （クローンテックラボラトリーズ）。
ニューイングランドバイオラボのＲＮＡ分解酵素Ｈ（＋）ＭｕＬＶをライフ テクノロジーが提供しているＲＮＡ分解酵素Ｈ（＋）ＭｕＬＶ用の緩衝液中で使用する以外は、各逆転写酵素の製造者が提供する緩衝液中で第２のストランドの各合成を行った。実施例６に記載のようにさらに処理および転写反応を行った。本実施例の結果を、図３３に示す。
結論：
種々の異なる逆転写酵素を本発明の方法に関連して使用することができる。
本発明の上記詳細な説明および実施例に鑑み、多くの自明な変更例が明白に当業者に対し示唆されるであろう。全てのこのような変更例は、特許請求の範囲でより詳細に定義される本発明の範囲および精神に十分含まれる。
ＵＤＴを有する分析物のライブラリーから得たｍＲＮＡを有するアレイを示す。 分析物の断片化およびこれに続く分析物への非内在性ＵＤＴの付加をを示す。 プライマーによる第１のｃＮＡコピーへの非内在性のＵＤＴの組み込みを示す。 プロダクションセンターを有するランダムプライマーを使用して第２のストランドを合成することを示す。 図４と同様のプロセスに関し、プロダクションセンターがダブルストランドである。 末端部位及び内部部位における第２のｃＮＡストランドのプライミングを示す。 ホモ重合化配列の末端転写酵素付加の後の、第２のｃＮＡストランドのプライミングを示す。 ライゲーションによりプライマー結合部位を付加することを示す。 プライマー結合部位を多数付加することを示す。 ビーズに結合したオリゴｄＴプライマーの伸長による第１のストランドの合成およびこれに続くプロダクションセンターを有するランダムプライマーによる第２のｃＮＡのストランドの合成を示す。 ビーズに間接的に結合したポリＴプライマーによる第１のストランドの合成およびこれに続く、プロダクションセンターを有するランダムプライマーによる第２のストランドの合成を示している。 第３のストランド合成中におけるプロモータの組み込みを示す。 アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を合成して、分析物のライブラリーの等温増幅を行うことを示す。 アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を合成して、ＳＤＡ増幅を行うことを示している。 プライマー結合部位をライゲートして等温増幅を行うことをしめす。 ＳＰＥ及びＵＰＥを有するアレイに分析物を結合して、固相状態での増幅を行うことを示す。 固相状態での増幅中におけるアレイ上でのＳＰＥの伸長を示す。 伸長したＳＰＥへのＵＰＥの結合及びその後の、固相状態での増幅中におけるＵＰＥの伸長を示す。 伸長していないＳＰＥ及び伸長していないＵＰＥへの伸長したＳＰＥ及び伸長したＵＰＥの結合が起きる、固相状態での増幅を示す。 比較分析のための増幅アレイを示す。 ＳＰＥｓ及びＵＰＥｓを有するアレイを使用してＳＮＰ分析を行うことを示す。 アレイ上でのＳＰＥｓへの分析物の結合に関する。 アレイ上での伸長したＳＰＥｓへのプライマーの結合を示す。 アレイ上でのＳＰＥｓへのプライマー及び伸長したプライマーの結合を示す。 本発明に開示の増幅に従ってアレイ上のプライマー及びＳＰＥｓの伸長を示す。 アレイ上での相補的配列へのキメラ組成物の核酸部の結合を示す。 ゲル分析であって、本発明及び上記実施例３に係るライブラリーの増幅のための逆転写酵素への依存性を示す。 ゲル分析であって、上記実施例４で説明したように、第２のストランド合成の多数の過程の後の転写を示す。 ゲル分析であって、実施例５で説明したように、ライブラリーからのＲＮＡ転写の第二の過程を示す。 ゲル分析であって、本発明及び実施例６に係るポリｄＧテーリングの後作成されたライブラリーからの転写を示す。 ゲル分析であって、一連の反応の後のＲＮＡ転写を示し、一連の反応の内の１つが、実施例９で説明したように、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによる第２のストランド合成である。 ゲル分析であって、実施例１０で更に説明したように、第２のストランドの順次の合成から作成されたライブラリーからの転写を示す。 ゲル分析であって、種々の逆転写酵素を使用した分析物のライブラリーの増幅より第１ストランド合成を行うことを示す。

Claims (952)

  1. 分析物のライブラリーからなる組成物であって、前記分析物は核酸のアレイにハイブリダイズし、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記分析物は内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ＵＤＴに付着したユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とからなり、前記ＵＤＥは前記分析物の存在もしくは量またはＵＤＥのＵＤＴへの付着を示すシグナルを発生する組成物。
  2. 前記分析物のライブラリーが器官、組織および細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項１に記載の組成物。
  3. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
  4. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
  5. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項４に記載の組成物。
  6. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれかにて改変される請求項４または５に記載の組成物。
  7. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項１に記載の組成物。
  8. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項７に記載の組成物。
  9. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項７に記載の組成物。
  10. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項１に記載の組成物。
  11. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項１に記載の組成物。
  12. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記内在性のＵＤＴが３′ポリＡセグメント、５′キャップ、２次的構造、、コンセンサス配列および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
  14. 前記コンセンサス配列がポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物、ポリペプチド、多糖類、合成ポリマーおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
  16. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項４に記載の組成物。
  17. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項１に記載の組成物。
  18. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１７に記載の組成物。
  20. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項１９に記載の組成物。
  21. 分析物のライブラリーからなる組成物であって、前記分析物は核酸のアレイにハイブリダイズされ、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記分析物は非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ＵＤＴにハイブリダイズされたユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とからなり、前記ＵＤＥは前記分析物の存在もしくは量を検出するシグナルを直接的もしくは間接的に発生する組成物。
  22. 前記分析物のライブラリーが器官、組織および細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２１に記載の組成物。
  24. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項２１に記載の組成物。
  25. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれかで改変される請求項２４または２５に記載の組成物。
  27. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項２１に記載の組成物。
  28. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項２７に記載の組成物。
  29. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項２７に記載の組成物。
  30. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項２１に記載の組成物。
  31. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項２１に記載の組成物。
  32. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）がホモ重合化された配列からなる請求項２１に記載の組成物。
  34. 前記非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）がヘテロ重合化された配列からなる請求項２１に記載の組成物。
  35. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物およびその改変形態物よりなる群から選択される請求項２１に記載の組成物。
  36. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項２１に記載の組成物。
  38. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３７に記載の組成物。
  39. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３７に記載の組成物。
  40. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項３９に記載の組成物。
  41. 分析物のライブラリーからなり、前記分析物は核酸のアレイにハイブリダイズされ、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記分析物と前記核酸との間の前記ハイブリダイズは複合体形成領域を発生すると共に、前記組成物はさらに前記領域に複合化されたシグナル発生体を含むことを特徴とする組成物。
  42. 前記分析物のライブラリーが器官、組織および細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項４１に記載の組成物。
  44. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項４１に記載の組成物。
  45. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項４４または４５に記載の組成物。
  47. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項４１に記載の組成物。
  48. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項４７に記載の組成物。
  50. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項４１に記載の組成物。
  51. 前記核酸が、前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項４１に記載の組成物。
  52. 前記核酸が化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項４１に記載の組成物。
  53. 複合体形成のための前記領域がＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドおよびＲＮＡ−ＰＮＡハイブリッドよりなる群から選択される請求項４１に記載の組成物。
  54. 前記領域に複合化された前記シグナル発生体が蛋白質および挿入物よりなる群から選択される請求項４１に記載の組成物。
  55. 前記蛋白質が、ダブルストランド核酸に優先的に結合する核酸結合蛋白質からなる請求項５４に記載の組成物。
  56. 前記核酸結合蛋白質が抗体からなる請求項５５に記載の組成物。
  57. 前記抗体は、核酸ハイブリッドに対し特異性であり、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドおよびＲＮＡ−ＰＮＡハイブリッドよりなる群から選択される請求項５６に記載の組成物。
  58. 前記挿入物が臭化エチジウム、臭化ジエチジウム、アクリジンオレンジおよびＳＹＢＲグリーンよりなる群から選択される請求項５４に記載の組成物。
  59. 前記蛋白質が直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項４１に記載の組成物。
  60. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項５９に記載の組成物。
  61. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項５９に記載の組成物。
  62. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項６１に記載の組成物。
  63. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーであって、意図する前記核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含むライブラリーと、
    （ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、
    （ｂ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、
    （ｃ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、
    （ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する方法。
  64. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項６３に記載の方法。
  65. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項６４に記載の方法。
  66. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項６４または６５に記載の方法。
  67. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項６３に記載の方法。
  68. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項６７に記載の方法。
  69. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項６７に記載の方法。
  70. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項６３に記載の方法。
  71. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項６３に記載の方法。
  72. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項７１に記載の方法。
  73. 前記分析物のライブラリーが器官、組織もしくは細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項６３に記載の方法。
  74. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項６３に記載の方法。
  75. 前記内在性のＵＤＴが３′ポリＡセグメント、５′キャップ、２次的構造、、コンセンサス配列および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項６３に記載の方法。
  76. 前記コンセンサス配列がポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項７５に記載の方法。
  77. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物、ポリペプチド、多糖類、合成ポリマーおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項６３に記載の方法。
  78. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項６４に記載の方法。
  79. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項６３に記載の方法。
  80. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項７９に記載の方法。
  81. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項７９に記載の方法。
  82. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項８１に記載の方法。
  83. １回もしくはそれ以上の洗浄工程を含む請求項６３に記載の方法。
  84. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーであって、意図する前記核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含むライブラリーと、
    （ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、
    （ｂ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと核酸分析物の前記アレイで接触させて、１またはそれ以上の複合体を形成し、
    （ｃ）核酸分析物の前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、
    （ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する方法。
  85. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項８４に記載の方法。
  86. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項８５に記載の方法。
  87. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項８５または８６に記載の方法。
  88. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項８４に記載の方法。
  89. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項８８に記載の方法。
  90. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項８８に記載の方法。
  91. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項８４に記載の方法。
  92. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項８４に記載の方法。
  93. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項９２に記載の方法。
  94. 前記分析物のライブラリーが器官、組織もしくは細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項８４に記載の方法。
  95. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項８４に記載の方法。
  96. 前記内在性のＵＤＴが３′ポリＡセグメント、５′キャップ、２次的構造、コンセンサス配列および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項８４に記載の方法。
  97. 前記コンセンサス配列がポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項９６に記載の方法。
  98. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物、ポリペプチド、多糖類、合成ポリマーおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項８４に記載の方法。
  99. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項９８に記載の方法。
  100. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項８４に記載の方法。
  101. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１００に記載の方法。
  102. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１００に記載の方法。
  103. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項１０２に記載の方法。
  104. １回もしくはそれ以上の洗浄工程を含む請求項８４に記載の方法。
  105. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーであって、意図する前記核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含み、前記非内在性のＵＤＴは前記核酸分析物に付着するライブラリーと、
    （ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、
    （ｂ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、
    （ｃ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、
    （ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する方法。
  106. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項１０６または１０７に記載の方法。
  109. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項１０５に記載の方法。
  110. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項１０９に記載の方法。
  112. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項１０５に記載の方法。
  113. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項１０５に記載の方法。
  114. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記分析物のライブラリーが器官、組織もしくは細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項１０５に記載の方法。
  116. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１０５に記載の方法。
  117. 前記非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）がホモ重合化された配列からなる群から選択される請求項１０５に記載の方法。
  118. 前記非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）がヘテロ重合化された配列からなる群から選択される請求項１０５に記載の方法。
  119. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物、ポリペプチドおよび前記その改変形態物よりなる群から選択される請求項１０５に記載の方法。
  120. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項１０５に記載の方法。
  122. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１２１に記載の方法。
  124. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項１２３に記載の方法。
  125. １回もしくはそれ以上の洗浄工程を含む請求項１０５に記載の方法。
  126. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーであって、意図する前記核酸のそれぞれは少なくとも１種の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含み、前記非内在性のＵＤＴは前記核酸分析物に付着するライブラリーと、
    （ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、
    （ｂ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと核酸分析物の前記ライブラリーで接触させて、１もしくはそれ以上の複合体を形成し、
    （ｃ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、
    （ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する方法。
  127. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項１２７または１２８に記載の方法。
  130. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項１２６に記載の方法。
  131. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項１３０に記載の方法。
  133. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項１２６に記載の方法。
  134. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項１２６に記載の方法。
  135. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項１３４に記載の方法。
  136. 前記分析物のライブラリーが器官、組織もしくは細胞よりなる群から選択される生物資源から得られる請求項１２６に記載の方法。
  137. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１２６に記載の方法。
  138. 前記非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）がホモ重合化された配列からなる請求項１２６に記載の方法。
  139. 前記非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）がヘテロ重合化された配列からなる請求項１２６に記載の方法。
  140. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物、ポリペプチド、多糖類およびその改変形態物よりなる群から選択される請求項１２６に記載の方法。
  141. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項１４０に記載の方法。
  142. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項１２６に記載の方法。
  143. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１４２に記載の方法。
  145. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項１４４に記載の方法。
  146. １回もしくはそれ以上の洗浄工程を含む請求項１２６に記載の方法。
  147. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）１もしくはそれ以上のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、
    （ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、
    （ｂ）前記ＵＤＴ（ｉｉｉ）を核酸分析物の前記ライブラリー（ｉｉ）に付着させ、
    （ｃ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、前記意図する核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、
    （ｄ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、
    （ｅ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する前記複数の核酸を検出もしくは定量する方法。
  148. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項１４７に記載の方法。
  149. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項１４８に記載の方法。
  150. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項１４８または１４９に記載の方法。
  151. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項１４７に記載の方法。
  152. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項１５１に記載の方法。
  153. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項１５１に記載の方法。
  154. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項１４７に記載の方法。
  155. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項１４７に記載の方法。
  156. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項１５５に記載の方法。
  157. 前記分析物のライブラリーが器官、組織もしくは細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項１４７に記載の方法。
  158. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１４７に記載の方法。
  159. 前記付着手段が、ポリＡ−ポリメラーゼおよび末端転写酵素よりなる群から選択される酵素を介しホモ重合化された配列を付加する請求項１４７に記載の方法。
  160. 前記付着手段が、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼよりなる群から選択される酵素を介しホモ重合化もしくはヘテロ重合化された配列を付加する請求項１４７に記載の方法。
  161. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物およびその改変形態物よりなる群から選択される請求項１４７に記載の方法。
  162. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項１６１に記載の方法。
  163. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項１４７に記載の方法。
  164. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１６３に記載の方法。
  165. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１６３に記載の方法。
  166. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項１６５に記載の方法。
  167. １回もしくはそれ以上の洗浄工程を含む請求項１４７に記載の方法。
  168. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）１もしくはそれ以上のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、
    （ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、
    （ｂ）前記ＵＤＴ（ｉｉｉ）を核酸分析物の前記ライブラリー（ｉｉ）に付着させ、
    （ｃ）前記ＵＤＥを前記ＵＤＴと核酸分析物の前記ライブラリーで接触して、１もしくはそれ以上の複合体を形成し、
    （ｄ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、前記意図する核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、
    （ｅ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する前記複数の核酸を検出もしくは定量する方法。
  169. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項１６８に記載の方法。
  170. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項１６９に記載の方法。
  171. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項１６９または１７０に記載の方法。
  172. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項１６８に記載の方法。
  173. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項１７２に記載の方法。
  174. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項１７２に記載の方法。
  175. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項１６８に記載の方法。
  176. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項１６８に記載の方法。
  177. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項１７６に記載の方法。
  178. 前記分析物のライブラリーが器官、組織もしくは細胞よりなる群から選択される生物資源から得られる請求項１６８に記載の方法。
  179. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１６８に記載の方法。
  180. 前記付着手段が、ポリＡ−ポリメラーゼおよび末端転写酵素よりなる群から選択される酵素を介しホモ重合化された配列を付加する請求項１６８に記載の方法。
  181. 前記付着手段が、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼよりなる群から選択される酵素を介しホモ重合化もしくはヘテロ重合化された配列を付加する請求項１６８に記載の方法。
  182. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物およびその改変形態物よりなる群から選択される請求項１６８に記載の方法。
  183. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項１８２に記載の方法。
  184. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項１６８に記載の方法。
  185. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１８４に記載の方法。
  186. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１８４に記載の方法。
  187. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項１８６に記載の方法。
  188. １回もしくはそれ以上の洗浄工程を含む請求項１６８に記載の方法。
  189. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的な固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）複合体形成のための核酸ハイブリッドにより形成される領域に結合すると共にシグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とを提供し、
    （ｂ）前記ライブラリー（ｉｉ）を核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズして、意図する前記核酸が存在する場合には複合体形成領域を提供するハイブリッドを形成し、
    （ｃ）前記ＵＤＥを前記ハイブリッドと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、
    （ｄ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、前記複数の意図する核酸を検出もしくは定量する方法。
  190. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項１８９に記載の方法。
  191. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項１９０に記載の方法。
  192. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項１９０または１９１に記載の方法。
  193. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項１８９に記載の方法。
  194. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項１９３に記載の方法。
  195. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項１９３に記載の方法。
  196. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項１８９に記載の方法。
  197. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項１８９に記載の方法。
  198. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項１９７に記載の方法。
  199. 前記分析物のライブラリーが器官、組織および細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項１８９に記載の方法。
  200. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項１８９に記載の方法。
  201. 複合体形成のための前記領域がＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドおよびＲＮＡ−ＰＮＡハイブリッドよりなる群から選択される請求項１８９に記載の方法。
  202. 前記領域に複合化された前記シグナル形成物質が蛋白質および挿入物よりなる群から選択される請求項１８９に記載の方法。
  203. 前記蛋白質がダブルストランド核酸に優先的に結合する核酸結合蛋白質からなる請求項２０２に記載の方法。
  204. 前記核酸結合蛋白質が抗体からなる請求項２０３に記載の方法。
  205. 前記抗体は、核酸ハイブリッドに対し特異性であり、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドおよびＲＮＡ−ＰＮＡハイブリッドよりなる群から選択される請求項２０４に記載の方法。
  206. 前記挿入物が臭化エチジウム、臭化ジエチジウム、アクリジンオレンジおよびＳＹＢＲグリーンよりなる群から選択される請求項２０２に記載の方法。
  207. 前記蛋白質が直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項１８９に記載の方法。
  208. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２０７に記載の方法。
  209. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２０７に記載の方法。
  210. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項２０９に記載の方法。
  211. １回もしくはそれ以上の洗浄工程を含む請求項１８９に記載の方法。
  212. 核酸分析物コピーのライブラリーからなり、前記第１の核酸コピーは核酸のアレイにハイブリダイズされ、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記第１の核酸コピーは内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ＵＤＴに付着したユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とからなり、前記ＵＤＥは直接的もしくは間接的にシグナルを発生して前記分析物の存在もしくは量を検出する組成物。
  213. 前記分析物のライブラリーが器官、組織および細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項２１２に記載の組成物。
  214. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２１２に記載の組成物。
  215. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項２１２に記載の組成物。
  216. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項２１５に記載の組成物。
  217. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つにて改変される請求項２１５または２１６に記載の組成物。
  218. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項２１２に記載の組成物。
  219. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項２１８に記載の組成物。
  220. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項２１８に記載の組成物。
  221. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項２１２に記載の組成物。
  222. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項２１２に記載の組成物。
  223. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項２２２に記載の組成物。
  224. 前記内在性のＵＤＴがポリＴセグメント、２次的構造、コンセンサス配列および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２１２に記載の組成物。
  225. 前記コンセンサス配列がポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２２４に記載の組成物。
  226. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物、ポリペプチド、多糖類、合成ポリマーおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２１２に記載の組成物。
  227. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項２２６に記載の組成物。
  228. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項２１２に記載の組成物。
  229. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２２８に記載の組成物。
  230. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２２８に記載の組成物。
  231. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項２３０に記載の組成物。
  232. 第１の核酸コピーのライブラリーからなる組成物であって、前記第１の核酸コピーは核酸のアレイにハイブリダイズされ、前記核酸は固体支持体に固定化もしくは不動化され、前記第１の核酸コピーは１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ＵＤＴに付着した１もしくはそれ以上のユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）とからなり、前記ＵＤＥは直接的もしくは間接的にシグナルを発生して前記分析物の存在もしくは量を検出し、前記ＵＤＴは（ｉ）前記第１の核酸コピーの５′末端に位置すると共にオリゴＴセグメントもしくは配列に隣接せず、または（ｉｉ）前記第１の核酸コピーの３′末端に位置し、または（ｉｉｉ）その（ｉ）と（ｉｉ）との両者のいずれかである組成物。
  233. 前記分析物のライブラリーが器官、組織および細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項２３２に記載の組成物。
  234. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２３２に記載の組成物。
  235. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項２３２に記載の組成物。
  236. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項２３５に記載の組成物。
  237. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項２３５または２３６に記載の組成物。
  238. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項２３２に記載の組成物。
  239. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項２３８に記載の組成物。
  240. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項２３８に記載の組成物。
  241. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項２３２に記載の組成物。
  242. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項２３２に記載の組成物。
  243. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項２４２に記載の組成物。
  244. 前記非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）がホモ重合化された配列からなる請求項２３２に記載の組成物。
  245. 前記非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）がヘテロ重合化された配列からなる請求項２３２に記載の組成物。
  246. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物、ポリペプチド、多糖類、合成ポリマーおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２３２に記載の組成物。
  247. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項２４６に記載の組成物。
  248. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項２３２に記載の組成物。
  249. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２４８に記載の組成物。
  250. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２４８に記載の組成物。
  251. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項２５０に記載の組成物。
  252. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一の固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含有しうる核酸分析物のライブラリーであって、前記意図する核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含むライブラリーと、
    （ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、
    （ｉｖ）分析物の前記核酸の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、
    （ｂ）前記核酸分析物の全部もしくは１部に相補的である１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成すると共に、前記ＵＤＴの全部もしくは１部に相補的である配列を合成して相補的ＵＤＴを形成し、
    （ｃ）前記第１の核酸コピーを前記核酸のアレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、前記意図する核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、
    （ｄ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーの前記相補的ＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、
    （ｅ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する前記複数の核酸を検出もしくは定量する方法。
  253. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項２５２に記載の方法。
  254. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項２５３に記載の方法。
  255. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項２５３または２５４に記載の方法。
  256. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項２５２に記載の方法。
  257. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項２５６に記載の方法。
  258. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項２５６に記載の方法。
  259. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項２５２に記載の方法。
  260. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項２５２に記載の方法。
  261. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項２６０に記載の方法。
  262. 前記分析物のライブラリーが器官、組織もしくは細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項２５２に記載の方法。
  263. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２５２に記載の方法。
  264. 前記内在性のＵＤＴがポリＴセグメント、２次的構造、コンセンサス配列および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２５２に記載の方法。
  265. 前記コンセンサス配列がポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２６４に記載の方法。
  266. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物、ポリペプチド、多糖類、合成ポリマーおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２５２に記載の方法。
  267. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項２６６に記載の方法。
  268. 前記ＵＤＥがシグナルを直接的もしくは間接的に発生する請求項２５２に記載の方法。
  269. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２６８に記載の方法。
  270. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２６８に記載の方法。
  271. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項２７０に記載の方法。
  272. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項２５２に記載の方法。
  273. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一の固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量化しようとする意図する核酸を含有しうる核酸分析物のライブラリーであって、前記意図する核酸のそれぞれは少なくとも１種の内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を含むライブラリーと、
    （ｉｉｉ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、
    （ｉｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、
    （ｂ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、
    （ｃ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーにおける前記ＵＤＴと接触させて、１もしくはそれ以上の複合体を形成し、
    （ｄ）前記第１の核酸コピーを前記核酸のアレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて前記意図する核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、
    （ｅ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する前記複数の核酸を検出もしくは定量する方法。
  274. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項２７３に記載の方法。
  275. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項２７４に記載の方法。
  276. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項２７４または２７５に記載の方法。
  277. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項２７３に記載の方法。
  278. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項２７７に記載の方法。
  279. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項２７７に記載の方法。
  280. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項２７３に記載の方法。
  281. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項２７３に記載の方法。
  282. 前記核酸が化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項２８１に記載の方法。
  283. 前記分析物のライブラリーが器官、組織もしくは細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項２７３に記載の方法。
  284. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２７３に記載の方法。
  285. 前記内在性のＵＤＴがポリＴセグメント、２次的構造、コンセンサス配列および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２７３に記載の方法。
  286. 前記コンセンサス配列がポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２８５に記載の方法。
  287. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物、ポリペプチド、多糖類、合成ポリマーおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２７３に記載の方法。
  288. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項２８７に記載の方法。
  289. 前記ＵＤＥがシグナルを直接的もしくは間接的に発生する請求項２７３に記載の方法。
  290. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２８９に記載の方法。
  291. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２８９に記載の方法。
  292. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項２９１に記載の方法。
  293. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項２８２に記載の方法。
  294. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一な固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、
    （ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、
    （ｖ）前記核酸分析物のコピーを合成する重合化手段とを設け、
    （ｂ）前記非内在性のＵＤＴを前記核酸分析物の３′末端、前記第１核酸分析物の５′末端、または前記核酸分析物の前記３′末端および前記５′末端の両者に付着させ、
    （ｃ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、
    （ｄ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、
    （ｅ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーのＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、
    （ｆ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する方法。
  295. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項２９４に記載の方法。
  296. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項２９５に記載の方法。
  297. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項２９５または２９６に記載の方法。
  298. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項２９４に記載の方法。
  299. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項２９８に記載の方法。
  300. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項２９８に記載の方法。
  301. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項２９４に記載の方法。
  302. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項２９４に記載の方法。
  303. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項３０２に記載の方法。
  304. 前記分析物のライブラリーが器官、組織もしくは細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項２９４に記載の方法。
  305. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項２９４に記載の方法。
  306. 前記付着手段が、ポリＡポリメラーゼおよび末端転写酵素よりなる群から選択される酵素を介しホモ重合化された配列を付加する請求項２９４に記載の方法。
  307. 前記付着手段が、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼよりなる群から選択される酵素を介しホモ重合化もしくはヘテロ重合化された配列を付加する請求項２９４に記載の方法。
  308. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物および改変形態物よりなる群から選択される請求項２９４に記載の方法。
  309. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項３０８に記載の方法。
  310. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項２９４に記載の方法。
  311. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３１０に記載の方法。
  312. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３１０に記載の方法。
  313. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項３１２に記載の方法。
  314. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項２９４に記載の方法。
  315. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一な固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、
    （ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、
    （ｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、
    （ｂ）前記非内在性のＵＤＴを前記核酸分析物の３′末端、前記第１核酸分析物の５′末端、または前記核酸分析物の前記３′末端および前記５′末端の両者に付着させ、
    （ｃ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、
    （ｄ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーのＵＤＴと接触させて、複合体を形成し、
    （ｅ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、
    （ｆ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する方法。
  316. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項３１５に記載の方法。
  317. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項３１６に記載の方法。
  318. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項３１６または３１７に記載の方法。
  319. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項３１５に記載の方法。
  320. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項３１９に記載の方法。
  321. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項３１９に記載の方法。
  322. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項３１５に記載の方法。
  323. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項３１５に記載の方法。
  324. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項３２３に記載の方法。
  325. 前記分析物のライブラリーが器官、組織および細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項３１５に記載の方法。
  326. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３１５に記載の方法。
  327. 前記付着手段が、ポリＡポリメラーゼおよび末端転写酵素よりなる群から選択される酵素を介しホモ重合化された配列を付加する請求項３１５に記載の方法。
  328. 前記付着手段が、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼよりなる群から選択される酵素を介しホモ重合化もしくはヘテロ重合化された配列を付加する請求項３１５に記載の方法。
  329. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物およびその改変形態物よりなる群から選択される請求項３１５に記載の方法。
  330. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項３２９に記載の方法。
  331. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項３１５に記載の方法。
  332. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３３１に記載の方法。
  333. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３３１に記載の方法。
  334. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項３３３に記載の方法。
  335. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項３１５に記載の方法。
  336. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、（ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一な固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、
    （ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、
    （ｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、
    （ｂ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、
    （ｃ）前記非内在性のＵＤＴを前記核酸コピーの３′末端、前記第１の核酸コピーの５′末端、または前記核酸コピーの前記３′末端および前記５′末端の両者に付着させ、
    （ｄ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、
    （ｅ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーのＵＤＴと接触させて、前記アレイに結合した複合体を形成し、
    （ｆ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する方法。
  337. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項３３６に記載の方法。
  338. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項３３７に記載の方法。
  339. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項３３７または３３８に記載の方法。
  340. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項３３６に記載の方法。
  341. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項３４０に記載の方法。
  342. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項３４０に記載の方法。
  343. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項３３６に記載の方法。
  344. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項３３６に記載の方法。
  345. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項３４４に記載の方法。
  346. 前記分析物のライブラリーが器官、組織および細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項３３６に記載の方法。
  347. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３３６に記載の方法。
  348. 前記付着手段が、末端転写酵素を介しホモ重合化された配列を付加する請求項３３６に記載の方法。
  349. 前記付着手段が、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼよりなる群から選択される酵素を介しホモ重合化もしくはヘテロ重合化された配列を付加する請求項３３６に記載の方法。
  350. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物およびその改変形態物よりなる群から選択される請求項３３６に記載の方法。
  351. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項３５０に記載の方法。
  352. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項３３６に記載の方法。
  353. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３５２に記載の方法。
  354. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３５２に記載の方法。
  355. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項３５４に記載の方法。
  356. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項３３６に記載の方法。
  357. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）意図する前記核酸と部分的もしくは全体的に同一な固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）１もしくはそれ以上の非内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）を核酸に付着させる手段と、
    （ｉｖ）シグナルを直接的もしくは間接的に発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥ）と、
    （ｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、
    （ｂ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の第１の核酸コピーを合成し、
    （ｃ）前記非内在性のＵＤＴを前記第１の核酸コピーの３′末端、前記第１の核酸コピーの５′末端、または前記第１の核酸コピーの前記３′末端および前記５′末端の両者に付着させ、
    （ｄ）前記ＵＤＥを前記第１の核酸コピーのＵＤＴと接触させて複合体を形成し、
    （ｅ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドを形成し、
    （ｆ）前記アレイに結合したＵＤＥから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することにより、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する方法。
  358. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項３５７に記載の方法。
  359. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項３５８に記載の方法。
  360. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項３５８または３５９に記載の方法。
  361. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項３５７に記載の方法。
  362. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項３６１に記載の方法。
  363. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項３６１に記載の方法。
  364. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項３５７に記載の方法。
  365. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項３５７に記載の方法。
  366. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項３６５に記載の方法。
  367. 前記分析物のライブラリーが器官、組織および細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項３５７に記載の方法。
  368. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３５７に記載の方法。
  369. 前記付着手段が、末端転写酵素介しホモ重合化された配列を付加する請求項３５７に記載の方法。
  370. 前記付着手段が、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼよりなる群から選択される酵素を介しホモ重合化もしくはヘテロ重合化された配列を付加する請求項３５７に記載の方法。
  371. 前記ＵＤＥが核酸、核酸類似物およびその改変形態物よりなる群から選択される請求項３５７に記載の方法。
  372. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項３７１に記載の方法。
  373. 前記ＵＤＥが直接的もしくは間接的にシグナルを発生する請求項３５７に記載の方法。
  374. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３７３に記載の方法。
  375. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３７３に記載の方法。
  376. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項３７５に記載の方法。
  377. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項３５７に記載の方法。
  378. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）意図する前記核酸に相補的でありかつ固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）核酸ハイブリッドにより形成された複合体形成領域に結合し、直接或いは間接的に信号を発生するユニバーサルディテクションエレメント（ＵＤＥｓ）と、
    （ｉｖ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段とを設け、
    （ｂ）前記核酸分析物の１もしくはそれ以上の核酸コピーを合成し、
    （ｃ）前記第１の核酸コピーを核酸の前記アレイ（ｉ）とハイブリダイズさせて、意図する前記核酸が存在する場合にはハイブリッドでありかつ複合体形成領域を提供するハイブリッドを形成し、
    （ｄ）前記ＵＤＥｓを前記ハイブリッドに接触させて、前記アレイに結合する複合体を形成し、
    （e）前記アレイに結合したＵＤＥｓから発生するシグナルの量を検出もしくは測定することで、意図する複数の前記核酸を検出もしくは定量する方法。
  379. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される請求項３７８に記載の方法。
  380. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項３７９に記載の方法。
  381. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項３７９または３８０に記載の方法。
  382. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項３７８に記載の方法。
  383. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項３８２に記載の方法。
  384. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項３８２に記載の方法。
  385. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項３７８に記載の方法。
  386. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化される請求項３７８に記載の方法。
  387. 前記核酸が化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項３８６に記載の方法。
  388. 前記分析物のライブラリーが器官、組織もしくは細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項３７８に記載の方法。
  389. 前記分析物がゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３７８に記載の方法。
  390. 複合体形成のための前記領域がＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドおよびＲＮＡ−ＰＮＡハイブリッドよりなる群から選択される請求項３７８に記載の方法。
  391. 前記領域に複合化される前記シグナル形成物質が蛋白質および挿入物よりなる群から選択される請求項３７８に記載の方法。
  392. 前記蛋白質が優先的にダブルストランド核酸に結合する核酸結合蛋白質からなる請求項３９１に記載の方法。
  393. 前記核酸結合蛋白質が抗体からなる請求項３９２に記載の方法。
  394. 前記抗体がＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドおよびＲＮＡ−ＰＮＡハイブリッドよりなる群から選択される核酸ハイブリッドに特異性である請求項３９３に記載の方法。
  395. 前記挿入物が臭化エチジウム、臭化ジエチジウム、アクリジンオレンジおよびＳＹＢＲグリーンよりなる群から選択される請求項３９１に記載の方法。
  396. 前記蛋白質がシグナルを直接的もしくは間接的に発生する請求項３９１に記載の方法。
  397. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３９６に記載の方法。
  398. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項３９６に記載の方法。
  399. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項３９８に記載の方法。
  400. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項３７８に記載の方法。
  401. インビボ複製が実質的に不可能であると共に非内在性のホモ重合化された配列を持たないダブルストランド核酸のライブラリーからなり、前記核酸は試料から得られたライブラリーの内在性の配列に部分的もしくは全体的に相補的もしくは同一である配列を含み、前記ダブルストランド核酸は前記ダブルストランドの１端部に近位する少なくとも１つの内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ダブルストランドの他端部に近位する少なくとも１つの非内在性のプロダクションセンターとを含む組成物。
  402. 前記試料が器官、組織および細胞よりなる群から選択される生物資源からなる請求項４０１に記載の組成物。
  403. 核酸の前記ライブラリーがゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から得られる請求項４０１に記載の組成物。
  404. 前記内在性のＵＤＴが３′ポリＡセグメント、コンセンサス配列またはその両者よりなる群から選択される請求項４０１に記載の組成物。
  405. 前記コンセンサス配列がポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項４０１に記載の組成物。
  406. 前記プロダクションセンターがプライマー結合部位、ＲＮＡプロモータまたは両者の組合せよりなる群から選択される請求項４０１に記載の組成物。
  407. 前記ＲＮＡプロモータがファージプロモータからなる請求項４０６に記載の組成物。
  408. 前記ファージプロモータがＴ３、Ｔ７およびＳＰ６よりなる群から選択される請求項４０７に記載の組成物。
  409. インビボ複製が実質的に不可能であるダブルストランド核酸のライブラリーからなり、前記核酸が試料から得られたライブラリーの内在性の配列に対し部分的もしくは全体的に相補的もしくは同一である配列からなり、前記ダブルストランド核酸は前記ダブルストランドの１端部に近位する少なくとも４個（４）の非内在性のヌクレオチドと前記ダブルストランドの他端部に近位する非内在性のプロダクションセンターとを含む組成物。
  410. 前記試料が器官、組織および細胞よりなる群から選択される生物資源からなる請求項４０９に記載の組成物。
  411. 核酸の前記ライブラリーがゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、アンスプライストＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から得られる請求項４０９に記載の組成物。
  412. ３′ポリＡセグメント、コンセンサス配列またはその両者よりなる群から選択される１もしくはそれ以上の内在性のＵＤＴをさらに含む請求項４０９に記載の組成物。
  413. 前記コンセンサス配列がポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項４１２に記載の組成物。
  414. 前記少なくとも４種（４）の非内在性のヌクレオチドがホモポリマーである請求項４０９に記載の組成物。
  415. 前記非内在性のプロダクションセンターがプライマー結合部位、ＲＮＡプロモータまたはその両者の組合せよりなる群から選択される請求項４０９に記載の組成物。
  416. 前記ＲＮＡプロモータがファージプロモータからなる請求項４１５に記載の組成物。
  417. 前記ファージプロモータがＴ３、Ｔ７およびＳＰ６よりなる群から選択される請求項４１６に記載の組成物。
  418. 固体支持体に固定されたダブルストランド核酸のライブラリーからなり、前記核酸が試料から得られるライブラリーの内在性の配列に部分的もしくは全体的に相補的もしくは同一である配列を含み、さらに前記核酸が前記ダブルストランドの１端部に近位する非内在性の核酸の少なくとも１つの第１配列セグメントと前記ダブルストランドの他端部に近位する少なくとも１つの第２配列セグメントとを含み、前記第２配列セグメントが少なくとも１つのプロダクションセンターを含む組成物。
  419. 前記固体支持体がビーズからなる請求項４１８に記載の組成物。
  420. 前記ビーズが磁性である請求項４１９に記載の組成物。
  421. 前記試料が器官、組織および細胞よりなる群から選択される生物資源からなる請求項４１８に記載の組成物。
  422. 核酸の前記ライブラリーがゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、アンスプライストＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から得られる請求項４１８に記載の組成物。
  423. ３′ポリＡセグメント、コンセンサス配列またはその両者よりなる群から選択される１もしくはそれ以上の内在性のＵＤＴをさらに含む請求項４１８に記載の組成物。
  424. 前記コンセンサス配列がポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項４２３に記載の組成物。
  425. 前記非内在性のプロダクションセンターがプライマー結合部位、ＲＮＡプロモータまたはその両者の組合せよりなる群から選択される請求項４１８に記載の組成物。
  426. 前記ＲＮＡプロモータがファージプロモータからなる請求項４２５に記載の組成物。
  427. 前記ファージプロモータがＴ３、Ｔ７およびＳＰ６よりなる群から選択される請求項４２６に記載の組成物。
  428. 固体支持体に付着したダブルストランド核酸のライブラリーからなり、前記核酸は部分的または全体的に試料から得られるライブラリーの内在性の配列に相補的または同一である配列を含み、前記ダブルストランド核酸は前記ダブルストランドの１端部に近位する少なくとも１つの内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）と前記ダブルストランドの他端部に近位する少なくとも１つの非内在性のプロダクションセンターを含む組成物。
  429. 前記固体支持体がビーズからなる請求項４２８に記載の組成物。
  430. 前記ビーズが磁性である請求項４２９に記載の組成物。
  431. 前記試料が器官、組織および細胞よりなる群から選択される生物資源からなる請求項４２８に記載の組成物。
  432. 核酸の前記ライブラリーがゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、アンスプライストＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から得られる請求項４２８に記載の組成物。
  433. ３′ポリＡセグメント、コンセンサス配列またはその両者よりなる群から選択される１もしくはそれ以上の内在性のＵＤＴをさらに含む請求項４２８に記載の組成物。
  434. 前記コンセンサス配列がポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項４３３に記載の組成物。
  435. 前記非内在性のプロダクションセンターがプライマー結合部位、ＲＮＡプロモータまたはその両者の組合せよりなる群から選択される請求項４２８に記載の組成物。
  436. 前記ＲＮＡプロモータがファージプロモータからなる請求項４３５に記載の組成物。
  437. 前記ファージプロモータがＴ３、Ｔ７およびＳＰ６よりなる群から選択される請求項４３６に記載の組成物。
  438. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）部分的または全体的に前記意図する核酸の配列に同一もしくは相補的である固定化もしくは不動化した核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成する重合化手段であって、この重合化手段は第１セットのプライマーと第２セットのプライマーとを含み、前記第２セットのプライマーは少なくとも２つのセグメントを含み、３′末端における第１セグメントはランダム配列を含み、第２セグメントは少なくとも１つの形成センタを含む重合化手段と、
    （ｉｖ）核酸コピーを等温性もしくは平衡の条件下で合成する手段とを設け、
    （ｂ）核酸分析物の前記ライブラリーを前記第１セットのプライマーと接触させて複数の第１の結合体を形成させ、
    （ｃ）前記結合した第１セットのプライマーを前記核酸分析物により与えられたテンプレート配列により伸長されて前記分析物の第１のコピーを形成し、
    （ｄ）前記伸長した第１のコピーを前記第２セットのプライマーと接触させて複数の第２結合物質を形成し、
    （ｅ）前記結合した第２セットのプライマーを前記伸長した第１のコピーにより与えられたテンプレート配列により伸長させて伸長第１のコピーと伸長第２セットのプライマーとからなる複数の複合体を形成し、
    （ｆ）前記複合体における前記第２セットのプライマーのプロダクションセンターから等温性若しくは平衡条件下で１もしくはそれ以上の核酸コピーを合成し、
    （ｇ）工程（ｆ）で形成された前記核酸コピーを工程（ａ）（ｉ）で形成された前記核酸のアレイにハイブリダイズし、
    （ｈ）工程（ｇ）で得られた前記ハイブリダイズコピーを検出もしくは定量する方法。
  439. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される要因よりなる請求項４３８に記載の方法。
  440. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項４３９に記載の方法。
  441. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項４３９または４４０に記載の方法。
  442. 前記核酸アレイを固体支持体に固定化もしくは不動化させる請求項４３８に記載の方法。
  443. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項４４２に記載の方法。
  444. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項４４３に記載の方法。
  445. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項４４３に記載の方法。
  446. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項４４２に記載の方法。
  447. 前記核酸を前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化させる請求項４４２に記載の方法。
  448. 前記核酸を化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化させる請求項４４７に記載の方法。
  449. 核酸分析物の前記ライブラリーが器官、組織もしくは細胞よりなる群から選択された生物資源から得られる請求項４３８に記載の方法。
  450. 核酸分析物の前記ライブラリーがゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、スプライスしていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から得られる請求項４３８に記載の方法。
  451. 前記第１セットのプライマーが内在性のＵＤＴに相補的である請求項４３８に記載の方法。
  452. 前記内在性のＵＤＴが３′ポリＡセグメント、コンセンサス配列およびその両者の組合せよりなる群から選択される請求項４３８に記載の方法。
  453. 前記コンセンサス配列がポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピーの繰返しおよび前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項４５２に記載の方法。
  454. 前記プロダクションセンターがプライマー結合部位、ＲＮＡプロモータまたはその両者の組合せよりなる群から選択される請求項４３８に記載の方法。
  455. 前記ＲＮＡプロモータがファージプロモータからなる請求項４５４に記載の方法。
  456. 前記ファージプロモータがＴ３、Ｔ７およびＳＰ６よりなる群から選択される請求項４５５に記載の方法。
  457. 前記ハイブリダイズ核酸コピーがこれに付着もしくは一体化された１もしくはそれ以上のシグナル形成物質をさらに含む請求項４３８に記載の方法。
  458. 前記シグナル形成物質がシグナルを直接的もしくは間接的に発生する請求項４５７に記載の方法。
  459. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項４５８に記載の方法。
  460. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項４５８に記載の方法。
  461. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項４６０に記載の方法。
  462. 工程（ｃ）から得られた第１のコピーをそのテンプレートから分離する工程をさらに含み、工程（ｂ）を反復する請求項４３８に記載の方法。
  463. 工程（ｆ）から得られた伸長した第２セットのプライマーをそのテンプレートから分離する工程をさらに含み、工程（ｅ）を反復する請求項４３８に記載の方法。
  464. 工程（ｇ）を反復して行う請求項４３８に記載の方法。
  465. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項４３８に記載の方法。
  466. 等温性もしくは平衡の条件下で核酸コピーを合成する前記手段がＲＮＡ転写、ストランド・置換・増幅および２次的構造増幅よりなる群から選択される１もしくはそれ以上により行われる請求項４３８に記載の方法。
  467. ライブラリーにおける意図する複数の核酸を検出もしくは定量する方法であって、
    （ａ）（ｉ）部分的もしくは全体的に前記意図する核酸の配列に同一もしくは相補的である固定化もしくは不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出もしくは定量しようとする意図する核酸を含む可能性のある核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）前記核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、前記重合化手段は第１セットのプライマーと第２セットのプライマーとを含み、前記第１セットのプライマーは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む重合化手段と、
    （ｉｖ）等温性もしくは平衡の条件下で核酸コピーを合成する手段とを設け、
    （ｂ）前記核酸分析物のライブラリーを前記第１セットのプライマーと接触させて複数の第１の結合体を形成し、
    （ｃ）前記結合した第１セットのプライマーを前記核酸分析物により与えられたテンプレート配列により伸長させて前記分析物の第１のコピーを形成し、
    （ｄ）前記第１のコピーを少なくとも４種（４）もしくはそれ以上の非内在性のホモポリマーヌクレオチドにより伸長させ、
    （ｅ）前記伸長した第１のコピーを前記第２セットのプライマーと接触させて複数の第２結合物質を複合体を形成し、
    （ｆ）前記複合した前記第２セットのプライマーを前記伸長した第１のコピーにより与えられたテンプレート配列により伸長させて伸長第１のコピーと伸長第２セットのプライマーとからなる複数の複合体を形成し、
    （ｇ）前記複合体における前記第２セットのプライマーのプロダクションセンターから等温性もしくは平衡な条件下で１もしくはそれ以上の核酸コピーを合成し、
    （ｈ）工程（ｇ）で形成された前記核酸コピーを工程（ａ）（ｉ）で与えられた核酸の前記アレイにハイブリダイズし、
    （ｉ）工程（ｈ）で得られた前記ハイブリダイズされたコピーを検出もしくは定量する方法。
  468. 前記核酸アレイがＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似物よりなる群から選択される要因よりなる請求項４６７に記載の方法。
  469. 前記類似物がＰＮＡからなる請求項４６８に記載の方法。
  470. 前記核酸もしくは類似物が糖部分、燐酸塩部分もしくは塩基部分のいずれか１つで改変される請求項４６８または４６９に記載の方法。
  471. 前記核酸アレイを固体支持体に固定化もしくは不動化させる請求項４６７に記載の方法。
  472. 前記固体支持体が多孔質もしくは非多孔質である請求項４７１に記載の方法。
  473. 前記多孔質固体支持体がポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項４７２に記載の方法。
  474. 前記非多孔質固体支持体がガラスもしくはプラスチックからなる請求項４７２に記載の方法。
  475. 前記固体支持体が透過性、半透過性、遮光性又は反射性である請求項４７１に記載の方法。
  476. 前記核酸が前記固体支持体に直接的もしくは間接的に固定化もしくは不動化させる請求項４７１に記載の方法。
  477. 前記核酸が、化学リンカーもしくは結合アームにより前記固体支持体に間接的に固定化もしくは不動化される請求項４７１に記載の方法。
  478. 核酸分析物の前記ライブラリーが器官、組織および細胞よりなる群から選択される生物学的供給源から得られる請求項４６７に記載の方法。
  479. 核酸分析物の前記ライブラリーがゲノムＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、アンスプライスドＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび前記の任意の組合せよりなる群から得られる請求項４６７に記載の方法。
  480. 前記第１セットのプライマーが、内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）に相補的な１つもしくはそれ以上の配列をさらに含む請求項４６７に記載の方法。
  481. 前記内在性のＵＤＴが３′ポリＡセグメント、コンセンサス配列およびその両者の組合せよりなる群から選択される請求項４６７に記載の方法。
  482. 前記コンセンサス配列がポリＡ付加のためのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピー反復物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項４８１に記載の方法。
  483. 前記プロダクションセンターがプライマー結合部位、ＲＮＡプロモータまたはその両者の組合せよりなる群から選択される請求項４６７に記載の方法。
  484. 前記ＲＮＡプロモータがファージプロモータからなる請求項４８３に記載の方法。
  485. 前記ファージプロモータがＴ３、Ｔ７およびＳＰ６よりなる群から選択される請求項４８４に記載の方法。
  486. 前記伸長工程（ｄ）にて４種もしくはそれ以上の非内在性のホモ重合化ヌクレオチドを末端転写酵素により付加する請求項４６７に記載の方法。
  487. 前記ハイブリダイズした核酸コピーが、これに付着もしくは組込まれた１種もしくはそれ以上のシグナル発生体をさらに含む請求項４６７に記載の方法。
  488. 前記シグナル発生体がシグナルを直接的もしくは間接的に発生する請求項４８７に記載の方法。
  489. 前記直接的シグナル発生が蛍光性化合物、燐光性化合物、化学蛍光性化合物、キレート性化合物、電子高密度化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項４８８に記載の方法。
  490. 前記間接的シグナル発生が抗体、抗原、ハプテン、リセプタ、ホルモン、リガンド、酵素および前記の任意の組合せよりなる群から選択される請求項４８９に記載の方法。
  491. 前記酵素が蛍光反応、発色性反応および化学蛍光性反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項４９０に記載の方法。
  492. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項４６７に記載の方法。
  493. 等温もしくは平衡の条件下で核酸コピーを合成する前記手段がＲＮＡ転写、ストランド・置換・増幅および第２構造増幅よりなる群から選択される１つもしくはそれ以上の要員により行われる請求項４６７に記載の方法。
  494. 工程（ｃ）から得られた第１のコピーをそのテンプレートから分離すると共に工程（ｂ）を繰返す工程をさらに含む請求項４６７に記載の方法。
  495. 工程（ｆ）から得られた伸長した第２セットのプライマーをそのテンプレートから分離すると共に工程（ｅ）を繰返す工程をさらに含む請求項４６７に記載の方法。
  496. 工程（ｇ）を繰返して行う請求項４６７に記載の方法。
  497. ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、
    ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸の配列と、
    （ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、ここで該第１のセットが少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、
    （ｉｖ）プライマーの該第２のセットの少なくとも１つのセグメントまたは配列に相補的なポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットと、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（ｉｖ）の該セットを連結するための手段を提供し、
    ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、
    ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して、該分析物の第１のコピーを形成し、
    ｄ）該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セットａ）（ｉｖ）を工程ｃ）において形成した該第１のコピーの３´末端に連結して、複数の連結された生成物を生成し、
    ｅ）プライマーの該第２のセットと、該連結された生成物とを接触して、複数の第２の結合体を形成し、
    ｆ）工程ｄ）において形成された該連結された生成物によって提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、該連結された生成物およびプライマーの該伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、
    ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、
    ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、
    ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法。
  498. 前記核酸配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される構成要員を含む請求項４９７に記載の方法。
  499. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項４９８に記載の方法。
  500. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項４９８または４９９に記載の方法。
  501. 前記核酸配列が固体支持体に固定化もしくは不動化される請求項４９７に記載の方法。
  502. 前記固体支持体が多孔性であるか、または非多孔性である請求項５０１に記載の方法。
  503. 前記多孔性固体支持体が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項５０２に記載の方法。
  504. 前記非多孔性の固体支持体が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項５０２に記載の方法。
  505. 前記固体支持体が、透明性、半透明性、不透明性、または反射性である請求項５０１に記載の方法。
  506. 前記核酸が直接的または間接的に、前記固体支持体に固定化または不動化される請求項５０１に記載の方法。
  507. 前記核酸は化学リンカーまたは結合アームによって前記固体支持体に対して間接的に固定化または不動化される請求項５０６に記載の方法。
  508. 核酸分析物の前記ライブラリーが、器官、組織、および細胞よりなる群から選択される、生物資源に由来する請求項４９７に記載の方法。
  509. 核酸分析物の前記ライブラリーが、ゲノムＤＮＡ、エピソームＲＮＡ、スプライスされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項４９７に記載の方法。
  510. 前記プライマーの第１のセットがさらに、内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）に相補的な１つ以上の配列を含む請求項４９７に記載の方法。
  511. 前記内在性のＵＤＴが、３´ポリＡセグメント、コンセンサス配列、および両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項４９７に記載の方法。
  512. 前記コンセンサス配列が、ポリＡ付加についてのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピー反復、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項５１１に記載の方法。
  513. 前記プロダクションセンターが、プライマー結合部位、ＲＮＡプロモーター、または両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項４９７に記載の方法。
  514. 前記ＲＮＡプロモーターがファージプロモーターを含む請求項５１３に記載の方法。
  515. 前記ファージプロモーターが、Ｔ３、Ｔ７、およびＳＰ６よりなる群から選択される請求項５１４に記載の方法。
  516. 前記ハイブリダイズされた核酸コピーがさらにそれに付着されるかまたは取り込まれる１つ以上のシグナル伝達体を含む請求項４９７に記載の方法。
  517. 前記シグナル伝達体がシグナルを直接的にまたは間接的に発生する請求項５１６に記載の方法。
  518. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項５１７に記載の方法。
  519. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項５１７に記載の方法。
  520. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項５１９に記載の方法。
  521. 前記重合化手段が、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡ ＰｏｌＩ、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡ ＰｏｌＩのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプト（Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ）、およびオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）よりなる群から選択される請求項４９７に記載の方法。
  522. 前記連結する手段がＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む請求項４９７に記載の方法。
  523. 工程ｃ）から得られた第１のコピーをそれらのテンプレートから分離し、そして工程ｂ）を反復する工程をさらに包含する請求項４９７に記載の方法。
  524. 工程ｆ）から得られたプライマーの伸長された第２のセットを分離し、そして工程ｅ）を反復する工程をさらに包含する請求項４９７に記載の方法。
  525. 工程ｇ）が反復して行われる請求項４９７に記載の方法。
  526. 等温または平衡な条件下で核酸の核酸コピーを合成するための前記手段が、ＲＮＡ転写、ストランド置換増幅、および２次構造増幅よりなる群から選択される１つ以上によって行われる請求項４９７に記載の方法。
  527. ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、
    ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸の配列と、
    （ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、ここで該第２のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、
    （ｉｖ）プライマーの該第２のセットの少なくとも１つのセグメントまたは配列に相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットと、
    （ｖ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セット（ｉｖ）を連結するための手段とを提供し、
    ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、
    ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、
    ｄ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セットａ）（ｉｖ）を工程ｃ）において形成された該第１のコピーの３´末端に連結して複数の連結された生成物を形成し、
    ｅ）プライマーの該第２のセットと、該連結された生成物とを接触して、複数の第２の結合体を形成し、
    ｆ）工程ｄ）において形成された該連結された生成物により提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、該連結された生成物およびプライマーの該伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、
    ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、
    ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、
    ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法。
  528. 前記核酸配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される構成要員を含む請求項５２７に記載の方法。
  529. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項５２８に記載の方法。
  530. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項５２８または５２９に記載の方法。
  531. 前記核酸配列が固体支持体に固定化もしくは不動化される請求項５２７に記載の方法。
  532. 前記固体支持体が多孔性であるか、または非多孔性である請求項５３１に記載の方法。
  533. 前記多孔性固体支持体が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項５３２に記載の方法。
  534. 前記非多孔性の固体支持体が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項５３２に記載の方法。
  535. 前記固体支持体が、透明性、半透明性、不透明性、または反射性である請求項５３１に記載の方法。
  536. 前記核酸が直接的または間接的に、前記固体支持体に固定化または不動化される請求項５３１に記載の方法。
  537. 前記核酸は化学リンカーまたは結合アームによって前記固体支持体に対して間接的に固定化または不動化される請求項５３６に記載の方法。
  538. 核酸分析物の前記ライブラリーが、器官、組織、および細胞よりなる群から選択される、生物資源に由来する請求項５２７に記載の方法。
  539. 核酸分析物の前記ライブラリーが、ゲノムＤＮＡ、エピソームＲＮＡ、スプライスされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項５２７に記載の方法。
  540. 前記プライマーの第１のセットが、内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）に相補的な１つ以上の配列を含む請求項５２７に記載の方法。
  541. 前記内在性のＵＤＴが、３´ポリＡセグメント、コンセンサス配列、および両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項５２７に記載の方法。
  542. 前記コンセンサス配列が、ポリＡ付加についてのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピー反復、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項５４１に記載の方法。
  543. 前記プロダクションセンターが、プライマー結合部位、ＲＮＡプロモーター、または両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項５２７に記載の方法。
  544. 前記ＲＮＡプロモーターがファージプロモーターを含む請求項５４３に記載の方法。
  545. 前記ファージプロモーターが、Ｔ３、Ｔ７、およびＳＰ６よりなる群から選択される請求項５４４に記載の方法。
  546. 前記ハイブリダイズされた核酸コピーがさらにそれに付着されるかまたは結合される１つ以上のシグナル伝達体を含む請求項５２７に記載の方法。
  547. 前記シグナル伝達体がシグナルを直接的にまたは間接的に発生する請求項５４６に記載の方法。
  548. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項５４７に記載の方法。
  549. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項５４７に記載の方法。
  550. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項５４９に記載の方法。
  551. 前記重合化手段が、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡ ＰｏｌＩ、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡ ＰｏｌＩのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプト（Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ）、およびオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）よりなる群から選択される請求項５２７に記載の方法。
  552. 前記連結手段がＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む請求項５２７に記載の方法。
  553. 等温または平衡な条件下で核酸コピーを合成するための前記手段が、ＲＮＡ転写、ストランド置換増幅、および２次構造増幅よりなる群から選択される１つ以上によって行われる請求項５２７に記載の方法。
  554. 工程ｃ）から得られた第１のコピーをそれらのテンプレートから分離し、そして工程ｂ）を反復する工程をさらに包含する請求項５２７に記載の方法。
  555. 工程ｆ）から得られたプライマーの伸長された第２のセットを分離し、そして工程ｅ）を反復する工程をさらに包含する請求項５２７に記載の方法。
  556. 工程ｇ）が反復して行われる請求項５２７に記載の方法。
  557. 等温または平衡な条件下で核酸コピーを合成するための前記手段が、ＲＮＡ転写、ストランド置換増幅、および２次構造増幅よりなる群から選択される１つ以上によって行われる請求項５２７に記載の方法。
  558. ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、
    ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸の配列と、
    （ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセット、プライマーの第２のセット、およびプラスミドの第３のセットを含み、ここでプライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、該第３のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段とを提供し、
    ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、結合されたプライマーの第１のセットを形成し、
    ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、
    ｄ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１のコピーとを接触して、結合されたプライマーの第２のセットを形成し、
    ｅ）該伸長された第１のコピーによって提供されるテンプレート配列によって結合されたプライマーの該第２のセットを伸長して、該核酸分析物の第２のコピーを形成し、
    ｆ）プライマーの該第３のセットと、該第２のコピーとを接触して、第３の結合体を形成する、複数の結合されたプライマーの第３のセットを形成し、
    ｇ）プライマーの該伸長された第２のセットによって提供されるテンプレート配列によって結合されたプライマーの該第３のセットを伸長して、第３のコピーおよび少なくとも１つのプロダクションセンターを含むハイブリッドを形成し、
    ｈ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、
    ｉ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｉ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、
    ｊ）工程ｉ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法。
  559. 前記核酸配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される構成要員を含む請求項５５８に記載の方法。
  560. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項５５９に記載の方法。
  561. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項５５９または５６０に記載の方法。
  562. 前記核酸配列が固体支持体に固定化もしくは不動化される請求項５５８に記載の方法。
  563. 前記固体支持体が多孔性であるか、または非多孔性である請求項５６２に記載の方法。
  564. 前記多孔性固体支持体が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項５６３に記載の方法。
  565. 前記非多孔性の固体支持体が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項５６３に記載の方法。
  566. 前記固体支持体が、透明性、半透明性、不透明性、または反射性である請求項５６２に記載の方法。
  567. 前記核酸が直接的または間接的に、前記固体支持体に固定化または不動化される請求項５６２に記載の方法。
  568. 前記核酸は化学リンカーまたは結合アームによって前記固体支持体に対して間接的に固定化または不動化される請求項５６２に記載の方法。
  569. 核酸分析物の前記ライブラリーが、器官、組織、および細胞よりなる群から選択される、生物資源に由来する請求項５５８に記載の方法。
  570. 核酸分析物の前記ライブラリーが、ゲノムＤＮＡ、エピソームＲＮＡ、スプライスされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項５５８に記載の方法。
  571. 前記プライマーの第１のセットが、内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）に相補的な１つ以上の配列を含む請求項５５８に記載の方法。
  572. 前記内在性のＵＤＴが、３´ポリＡセグメント、コンセンサス配列、および両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項５５８に記載の方法。
  573. 前記コンセンサス配列が、ポリＡ付加についてのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピー反復、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項５７２に記載の方法。
  574. ここで前記第２のセットのプライマーがランダムなプライマーである請求項５５８に記載の方法。
  575. 工程ｃ）の後にプライマー結合部位を添加する工程ｃ´）をさらに包含する請求項５５８に記載の方法。
  576. プライマーの前記第２のセットが該プライマー結合部位に相補的である請求項５７５に記載の方法。
  577. 前記プライマー結合部位がＴ４ ＤＮＡリガーゼまたは末端転移酵素の手段によって付加される請求項５７５に記載の方法。
  578. 前記プロダクションセンターが、プライマー結合部位、ＲＮＡプロモーター、または両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項５５８に記載の方法。
  579. 前記ＲＮＡプロモーターがファージプロモーターを含む請求項５７８に記載の方法。
  580. 前記ファージプロモーターが、Ｔ３、Ｔ７、およびＳＰ６よりなる群から選択される請求項５７９に記載の方法。
  581. 前記ハイブリダイズされた核酸コピーがさらにそれに付着されるかまたは結合される１つ以上のシグナル伝達体を含む請求項５５８に記載の方法。
  582. 前記シグナル伝達体がシグナルを直接的にまたは間接的に発生する請求項５８１に記載の方法。
  583. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項５８２に記載の方法。
  584. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項５８２に記載の方法。
  585. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項５８４に記載の方法。
  586. 前記重合化手段が、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡ ＰｏｌＩ、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡ ＰｏｌＩのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプト（Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ）、およびオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）よりなる群から選択される請求項５５８に記載の方法。
  587. 工程ｃ）から得られた第１のコピーをそれらのテンプレートから分離し、そして工程ｂ）を反復する工程をさらに包含する請求項５５８に記載の方法。
  588. 工程ｆ）から得られたプライマーの伸長された第２のセットを分離し、そして工程ｅ）を反復する工程をさらに包含する請求項５５８に記載の方法。
  589. 工程ｇ）が反復して行われる請求項５５８に記載の方法。
  590. 工程ｅ）において得られたプライマーの前記伸長された第２のセットを分離する工程ｆ´）をさらに包含する、請求項５５８に記載の方法。
  591. 工程ｃ）から得られた第１のコピーをそれらのテンプレートから分離し、そして工程ｂ）を反復する工程をさらに包含する請求項５５８に記載の方法。
  592. 工程ｆ）から得られたプライマーの伸長された第２のセットを分離し、そして工程ｅ）を反復する工程をさらに包含する請求項５５８に記載の方法。
  593. 工程ｇ）が反復して行われる請求項５５８に記載の方法。
  594. 等温または平衡な条件下で核酸コピーを合成するための前記手段が、ＲＮＡ転写、ストランド置換増幅、および２次構造増幅よりなる群から選択される１つ以上によって行われる請求項５５８に記載の方法。
  595. プライマーの前記第２のセットが、プライマーの第３のセットにおける前記プロダクションセンターと核酸配列が異なる少なくとも１つのプロダクションセンターを含む請求項５９４に記載の方法。
  596. ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、
    ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸の配列と、
    （ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセット、プライマーの第２のセット、ここでプライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、該第２のセットは少なくとも２つのセグメントを含む、第１のセグメントは３´末端にてランダムな配列を含み、および第２のセグメントは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、
    ｉｖ）等温または平行な条件下で核酸コピーを合成するための手段とを提供し、
    ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、
    ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、
    ｄ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１のコピーとを接触して、複数の第２の結合体を形成し、
    ｅ）該伸長された第１のコピーによって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第２のセットを伸長して、伸長された第１のコピーおよびプライマーの伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、
    ｆ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、
    ｇ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｆ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、
    ｈ）工程ｇ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法。
  597. 前記固体支持体がビーズを含む請求項５９６に記載の方法。
  598. 前記ビーズが磁性である請求項５９７に記載の方法。
  599. 前記核酸配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される構成要員を含む請求項５９６に記載の方法。
  600. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項５９９に記載の方法。
  601. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項５９９または６００に記載の方法。
  602. 前記核酸配列が固体支持体に固定化もしくは不動化される請求項５９６に記載の方法。
  603. 前記固体支持体が多孔性であるか、または非多孔性である請求項６０２に記載の方法。
  604. 前記多孔性固体支持体が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項６０３に記載の方法。
  605. 前記非多孔性の固体支持体が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項６０３に記載の方法。
  606. 前記固体支持体が、透明性、半透明性、不透明性、または反射性である請求項６０２に記載の方法。
  607. 前記核酸が直接的または間接的に、前記固体支持体に固定化または不動化される請求項６０２に記載の方法。
  608. 前記核酸は化学リンカーまたは結合アームによって前記固体支持体に対して間接的に固定化または不動化される請求項６０７に記載の方法。
  609. 核酸分析物の前記ライブラリーが、器官、組織、および細胞よりなる群から選択される、生物資源に由来する請求項５９６に記載の方法。
  610. 核酸分析物の前記ライブラリーが、ゲノムＤＮＡ、エピソームＲＮＡ、スプライスされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項５９６に記載の方法。
  611. 前記プライマーの第１のセットが、内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）に相補的な１つ以上の配列を含む請求項５９６に記載の方法。
  612. 前記内在性のＵＤＴが、３´ポリＡセグメント、コンセンサス配列、および両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項５９６に記載の方法。
  613. 前記コンセンサス配列が、ポリＡ付加についてのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピー反復、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項６１２に記載の方法。
  614. 前記プロダクションセンターが、プライマー結合部位、ＲＮＡプロモーター、または両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項５９６に記載の方法。
  615. 前記ＲＮＡプロモーターがファージプロモーターを含む請求項６１４に記載の方法。
  616. 前記ファージプロモーターが、Ｔ３、Ｔ７、およびＳＰ６よりなる群から選択される請求項６１５に記載の方法。
  617. 前記ハイブリダイズされた核酸コピーがさらにそれに付着されるかまたは取り込まれる１つ以上のシグナル伝達体を含む請求項５９６に記載の方法。
  618. 前記シグナル伝達体がシグナルを直接的にまたは間接的に発生する請求項６１７に記載の方法。
  619. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項６１８に記載の方法。
  620. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項６１８に記載の方法。
  621. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項６２０に記載の方法。
  622. 前記重合化手段が、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡ ＰｏｌＩ、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡ ＰｏｌＩのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプト（Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ）、およびオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）よりなる群から選択される請求項５９６に記載の方法。
  623. 工程ｃ）から得られた第１のコピーをそれらのテンプレートから分離し、そして工程ｂ）を反復する工程をさらに包含する請求項５９６に記載の方法。
  624. 工程ｆ）から得られたプライマーの伸長された第２のセットを分離し、そして工程ｅ）を反復する工程をさらに包含する請求項５９６に記載の方法。
  625. 工程ｇ）が反復して行われる請求項５９６に記載の方法。
  626. 等温または平衡な条件下で核酸コピーを合成するための前記手段が、ＲＮＡ転写、ストランド置換増幅、および２次構造増幅よりなる群から選択される１つ以上によって行われる請求項５９６に記載の方法。
  627. ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、
    ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、ここでプライマーの該第１のセットは固体支持体に固定化または不動化され、プライマーの該第１のセットが少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、
    （ｉｖ）等温または平衡な条件下で核酸コピーを合成するための手段とを提供し、
    ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、
    ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長し、
    ｄ）少なくとも４つ以上の非内在性の同種重合体ヌクレオチドによって該第１のコピーを伸長し、
    ｅ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１のコピーとを接触して、複数の第２の結合体を形成し、
    ｆ）該伸長された第１のコピーによって提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、伸長された第１のコピーおよびプライマーの伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、
    ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、
    ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、
    ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法。
  628. 前記固体支持体がビーズを含む請求項６２７に記載の方法。
  629. 前記ビーズが磁性である請求項６２８に記載の方法。
  630. 前記核酸配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択されるメンバーを含む請求項６２７に記載の方法。
  631. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項６３０に記載の方法。
  632. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項６３０または６３１に記載の方法。
  633. 前記核酸配列が固体支持体に固定化もしくは不動化される請求項６２７に記載の方法。
  634. 前記固体支持体が多孔性であるか、または非多孔性である請求項６３３に記載の方法。
  635. 前記多孔性固体支持体が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項６３４に記載の方法。
  636. 前記非多孔性の固体支持体が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項６３４に記載の方法。
  637. 前記固体支持体が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項６３３に記載の方法。
  638. 前記核酸が直接的または間接的に、前記固体支持体に固定化または不動化される請求項６３３に記載の方法。
  639. 前記核酸は化学リンカーまたは結合アームによって前記固体支持体に対して間接的に固定化または不動化される請求項６３８に記載の方法。
  640. 核酸分析物の前記ライブラリーが、器官、組織、および細胞よりなる群から選択される、生物資源に由来する請求項６２７に記載の方法。
  641. 核酸分析物の前記ライブラリーが、ゲノムＤＮＡ、エピソームＲＮＡ、スプライスされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項６２７に記載の方法。
  642. 前記プライマーの第１のセットがさらに、内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）に相補的な１つ以上の配列を含む請求項６２７に記載の方法。
  643. 前記内在性のＵＤＴが、３´ポリＡセグメント、コンセンサス配列、および両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項６２７に記載の方法。
  644. 前記コンセンサス配列が、ポリＡ付加についてのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピー反復、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項６４３に記載の方法。
  645. 前記プロダクションセンターが、プライマー結合部位、ＲＮＡプロモーター、または両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項６２７に記載の方法。
  646. 前記ＲＮＡプロモーターがファージプロモーターを含む請求項６４５に記載の方法。
  647. 前記ファージプロモーターが、Ｔ３、Ｔ７、およびＳＰ６よりなる群から選択される請求項６４６に記載の方法。
  648. 前記伸長する工程ｄ）において、４つ以上の非内在性の同種重合体ヌクレオチドが末端転写酵素によって付加される請求項６２７に記載の方法。
  649. 前記ハイブリダイズされた核酸コピーがさらにそれに付着されるかまたは取り込まれる１つ以上のシグナル伝達体を含む請求項６２７に記載の方法。
  650. 前記シグナル伝達体がシグナルを直接的にまたは間接的に発生する請求項６４９に記載の方法。
  651. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項６５０に記載の方法。
  652. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項６５０に記載の方法。
  653. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項６５２に記載の方法。
  654. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項６２７に記載の方法。
  655. 工程ｃ）から得られた第１のコピーをそれらのテンプレートから分離し、そして工程ｂ）を反復する工程をさらに包含する請求項６２７に記載の方法。
  656. 工程ｆ）から得られたプライマーの伸長された第２のセットを分離し、そして工程ｅ）を反復する工程をさらに包含する請求項６２７に記載の方法。
  657. 工程ｇ）が反復して行われる請求項６２７に記載の方法。
  658. 等温または平衡な条件下で核酸の核酸コピーを合成するための前記手段が、ＲＮＡ転写、ストランド置換増幅、および２次的構造増幅よりなる群から選択される１つ以上のメンバーによって行われる請求項６２７に記載の方法。
  659. ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、
    ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、ここでプライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、該第１のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、
    （ｉｖ）プライマーの該第２のセットの少なくとも１つのセグメントまたは配列に相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットと、
    （ｖ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セット（ｉｖ）をライゲートするための手段とを提供し、
    ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、
    ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、
    ｄ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セットａ）（ｉｖ）を工程ｃ）において形成された該第１のコピーの３´末端にライゲートして複数のライゲートされた生成物を形成し、
    ｅ）プライマーの該第２のセットと、該ライゲートされた生成物とを接触して、複数の第２の結合体を形成し、
    ｆ）工程ｄ）において形成された該ライゲートされた生成物により提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、該ライゲートされた生成物およびプライマーの該伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、
    ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、
    ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、
    ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法。
  660. 前記固体支持体がビーズを含む請求項６５９に記載の方法。
  661. 前記ビーズが磁性である請求項６６０に記載の方法。
  662. 前記核酸配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択されるメンバーを含む請求項６５９に記載の方法。
  663. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項６６２に記載の方法。
  664. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項６６２または６６３に記載の方法。
  665. 前記核酸配列が固体支持体に固定化もしくは不動化される請求項６５９に記載の方法。
  666. 前記固体支持体が多孔性であるか、または非多孔性である請求項６６５に記載の方法。
  667. 前記多孔性固体支持体が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項６６６に記載の方法。
  668. 前記非多孔性の固体支持体が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項６６６に記載の方法。
  669. 前記固体支持体が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項６６５に記載の方法。
  670. 前記核酸が直接的または間接的に、前記固体支持体に固定化または不動化される請求項６６５に記載の方法。
  671. 前記核酸は化学リンカーまたは結合アームによって前記固体支持体に対して間接的に固定化または不動化される請求項６６５に記載の方法。
  672. 核酸分析物の前記ライブラリーが、器官、組織、および細胞よりなる群から選択される、生物資源に由来する請求項６５９に記載の方法。
  673. 核酸分析物の前記ライブラリーが、ゲノムＤＮＡ、エピソームＲＮＡ、スプライスされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項６５９に記載の方法。
  674. 前記プライマーの第１のセットが、内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）に相補的な１つ以上の配列を含む請求項６５９に記載の方法。
  675. 前記内在性のＵＤＴが、３´ポリＡセグメント、コンセンサス配列、および両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項６５９に記載の方法。
  676. 前記コンセンサス配列が、ポリＡ付加についてのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピー反復、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項６７５に記載の方法。
  677. 前記プロダクションセンターが、プライマー結合部位、ＲＮＡプロモーター、または両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項６５９に記載の方法。
  678. 前記ＲＮＡプロモーターがファージプロモーターを含む請求項６７７に記載の方法。
  679. 前記ファージプロモーターが、Ｔ３、Ｔ７、およびＳＰ６よりなる群から選択される請求項６７８に記載の方法。
  680. 前記ハイブリダイズされた核酸コピーがさらにそれに付着されるかまたは結合される１つ以上のシグナル伝達体を含む請求項６５９に記載の方法。
  681. 前記シグナル伝達体がシグナルを直接的にまたは間接的に発生する請求項６８０に記載の方法。
  682. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項６８１に記載の方法。
  683. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項６８２に記載の方法。
  684. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項６８３に記載の方法。
  685. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項６５９に記載の方法。
  686. 前記ライゲートする手段がＴ４ＤＮＡリガーゼを含む請求項６５９に記載の方法。
  687. 工程ｃ）から得られた第１のコピーをそれらのテンプレートから分離し、そして工程ｂ）を反復する工程をさらに包含する請求項６５９に記載の方法。
  688. 工程ｆ）から得られたプライマーの伸長された第２のセットを分離し、そして工程ｅ）を反復する工程をさらに包含する請求項６５９に記載の方法。
  689. 工程ｇ）が反復して行われる請求項６５９に記載の方法。
  690. 等温または平衡な条件下で核酸コピーを合成するための前記手段が、ＲＮＡ転写、ストランド置換増幅、および２次的構造増幅よりなる群から選択される１つ以上のメンバーによって行われる請求項６５９に記載の方法。
  691. ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、
    ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットおよびプライマーの第２のセットを含み、プライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、およびここで該第２のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段と、
    （ｉｖ）プライマーの該第２のセットの少なくとも１つのセグメントまたは配列に相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットと、
    （ｖ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セット（ｉｖ）をライゲートするための手段とを提供し、
    ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、
    ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、
    ｄ）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの該セットａ）（ｉｖ）を工程ｃ）において形成された該第１のコピーの３´末端にライゲートして、複数のライゲートされた生成物を形成し、
    ｅ）プライマーの該第２のセットと、該ライゲートされた生成物とを接触して、複数の第２の結合体を形成し、
    ｆ）工程ｄ）において形成された該ライゲートされた生成物により提供されるテンプレート配列によって、プライマーの該結合された第２のセットを伸長して、該ライゲートされた生成物およびプライマーの該伸長された第２のセットを含む複数の複合体を形成し、
    ｇ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、
    ｈ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｇ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、
    ｉ）工程ｈ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法。
  692. 工程ｃ）から得られた第１のコピーをそれらのテンプレートから分離し、そして工程ｂ）を反復する工程をさらに包含する請求項６９１に記載の方法。
  693. 工程ｆ）から得られたプライマーの伸長された第２のセットを分離し、そして工程ｅ）を反復する工程をさらに包含する請求項６９１に記載の方法。
  694. 工程ｇ）が反復して行われる請求項６９１に記載の方法。
  695. 等温または平衡な条件下で核酸コピーを合成するための前記手段が、ＲＮＡ転写、ストランド置換増幅、および２次的構造増幅よりなる群から選択される１つ以上のメンバーによって行われる請求項６９１に記載の方法。
  696. ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、
    ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一または相補的な固定化または不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセット、プライマーの第２のセット、およびプラスミドの第３のセットを含み、プライマーの該第１のセットは、固体支持体に固定化または不動化され、およびここで該第３のセットは少なくとも１つのプロダクションセンターを含む、重合化手段とを提供し、
    ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、複数の第１の結合体を形成し、
    ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの該結合された第１のセットを伸長して該分析物の第１のコピーを形成し、
    ｄ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１のコピーとを接触して、複数の第２の結合体を形成し、
    ｅ）該伸長された第１のコピーによって提供されるテンプレート配列によって該結合されたプライマーの第２のセットを伸長して、プライマーの伸長された第２のセットを形成し、
    ｆ）工程ｅ）において得られたプライマーの該伸長された第２のセットを分離し、
    ｇ）プライマーの該第３のセットと、プライマーの該伸長された第２のセットとを接触して複数の第３の結合体を形成し、
    ｈ）プライマーの該伸長された第２のセットによって提供されるテンプレート配列によって該第３の結合体を伸長して、該伸長された第３の結合体およびプライマーの該伸長されたセットを含む複数の複合体を形成し、
    ｉ）等温または平衡な条件下で、該複合体中のプライマーの該第２のセットにおけるプロダクションセンターから、１つ以上の核酸コピーを合成し、
    ｊ）工程ａ）（ｉ）において提供される該核酸の配列に、工程ｉ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、
    ｋ）工程ｊ）において得られた該ハイブリダイズされたコピーのいずれかを検出または定量する方法。
  697. 前記固体支持体がビーズを含む請求項６９６に記載の方法。
  698. 前記ビーズが磁性である請求項６６０に記載の方法。
  699. 前記核酸配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択されるメンバーを含む請求項６９６に記載の方法。
  700. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項６９９に記載の方法。
  701. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項６９９または７００に記載の方法。
  702. 前記核酸配列が固体支持体に固定化もしくは不動化される請求項６９６に記載の方法。
  703. 前記固体支持体が多孔性であるか、または非多孔性である請求項７０２に記載の方法。
  704. 前記多孔性固体支持体が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項７０３に記載の方法。
  705. 前記非多孔性の固体支持体が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項７０３に記載の方法。
  706. 前記固体支持体が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項７０３に記載の方法。
  707. 前記核酸が直接的または間接的に、前記固体支持体に固定化または不動化される請求項７０３に記載の方法。
  708. 前記核酸は化学リンカーまたは結合アームによって前記固体支持体に対して間接的に固定化または不動化される請求項７０７に記載の方法。
  709. 核酸分析物の前記ライブラリーが、器官、組織、および細胞よりなる群から選択される、且つ生物資源に由来するものである請求項６９６に記載の方法。
  710. 核酸分析物の前記ライブラリーが、ゲノムＤＮＡ、エピソームＲＮＡ、スプライスされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項６９６に記載の方法。
  711. 前記プライマーの第１のセットが、内在性のユニバーサルディテクションターゲット（ＵＤＴ）に相補的な１つ以上の配列を含む請求項６９６に記載の方法。
  712. 前記内在性のＵＤＴが、３´ポリＡセグメント、コンセンサス配列、および両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項６９６に記載の方法。
  713. 前記コンセンサス配列が、ポリＡ付加についてのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピー反復、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項７１２に記載の方法。
  714. 前記プライマーの第２のセットがランダムなプライマーである請求項６９６に記載の方法。
  715. 工程ｃ）の後にプライマー結合部位を付加する工程ｃ´）をさらに包含する請求項６９６に記載の方法。
  716. プライマーの前記第２のセットが前記プライマー結合部位に相補的である請求項７１５に記載の方法。
  717. 前記プライマー結合部位がＴ４ＤＮＡリガーゼまたは末端転写酵素によって付加される請求項７１５に記載の方法。
  718. 前記プロダクションセンターが、プライマー結合部位、ＲＮＡプロモーター、または両方の組み合わせよりなる群から選択される請求項６９６に記載の方法。
  719. 前記ＲＮＡプロモーターがファージプロモーターを含む請求項７１８に記載の方法。
  720. 前記ファージプロモーターが、Ｔ３、Ｔ７、およびＳＰ６よりなる群から選択される請求項７１９に記載の方法。
  721. 前記ハイブリダイズされた核酸コピーがさらにそれに付着されるかまたは取り込まれる１つ以上のシグナル伝達体を含む請求項６９６に記載の方法。
  722. 前記シグナル伝達体がシグナルを直接的にまたは間接的に発生する請求項７２１に記載の方法。
  723. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項７２２に記載の方法。
  724. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項７２２に記載の方法。
  725. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項７２４に記載の方法。
  726. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項７２６に記載の方法。
  727. 工程ｃ）から得られた第１のコピーをそれらのテンプレートから分離し、そして工程ｂ）を反復する工程をさらに包含する請求項６９６に記載の方法。
  728. 工程ｆ）から得られたプライマーの伸長された第２のセットを分離し、そして工程ｅ）を反復する工程をさらに包含する請求項６９６に記載の方法。
  729. 工程ｇ）が反復して行われる請求項６９６に記載の方法。
  730. 等温または平衡な条件下で核酸コピーを合成するための前記手段が、ＲＮＡ転写、ストランド置換増幅、および２次的構造増幅よりなる群から選択される１つ以上のメンバーによって行われる請求項６９６に記載の方法。
  731. 前記プライマーの第２のセットが、プライマーの第３のセットにおける前記プロダクションセンターとヌクレオチド配列が異なる少なくとも１つのプロダクションセンターを含む６９６に記載の方法。
  732. ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、
    ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一な固定化または不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセットを含む、重合化手段とを提供し、
    ｂ）プライマーの該第１のセットと、核酸分析物の該ライブラリーとを接触して、第１の結合体を形成し、
    ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの第１のセットの該結合されたセットを伸長して該分析物の第１の核酸コピーを形成し、
    ｄ）該分析物から該第１の核酸コピーを分離し、
    ｅ）所望の量の第１の核酸コピーが合成されるまで工程ｂ）、ｃ）、ｄ）を繰返し、
    ｆ）工程ｉ）において提供される核酸の該配列に、工程ｅ）において形成された該核酸コピーをハイブリダイズし、
    ｇ）工程ｆ）において得られた該ハイブリダイズされた第１の核酸コピーのいずれかを検出または定量する方法。
  733. 前記核酸配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項７３２に記載の方法。
  734. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項４に記載の方法。
  735. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項７３３または７３４に記載の方法。
  736. 前記核酸配列が固体支持体に固定化もしくは不動化される請求項７３２に記載の方法。
  737. 前記固体支持体が多孔性であるか、または非多孔性である請求項７３６に記載の方法。
  738. 前記多孔性固体支持体が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項７３７に記載の方法。
  739. 前記非多孔性の固体支持体が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項７３６に記載の方法。
  740. 前記固体支持体が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項７３６に記載の方法。
  741. 前記核酸が直接的または間接的に、前記固体支持体に固定化または不動化される請求項７３６に記載の方法。
  742. 前記核酸は化学リンカーまたは結合アームによって前記固体支持体に対して間接的に固定化または不動化される請求項７４１に記載の方法。
  743. 核酸分析物の前記ライブラリーが、器官、組織、および細胞よりなる群から選択され、且つ生物資源に由来するものである請求項７３２に記載の方法。
  744. 前記核酸分析物が、ゲノムＤＮＡ、エピソームＲＮＡ、スプライスされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項７３２に記載の方法。
  745. 前記核酸分析物が、ポリＴセグメント、２次的構造、コンセンサス配列、および上述の組み合わせよりなる群から選択される内在性のＵＤＴを含む、請求項７３２に記載の方法。
  746. 前記コンセンサス配列が、ポリＡ付加についてのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピー反復、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項７４５に記載の方法。
  747. ポリＡポリメラーゼ、末端転写酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される酵素手段によって、前記核酸分析物または前記第１のコピーに１つ以上の非内在性のＵＤＴを付加する工程をさらに包含する請求項７３２に記載の方法。
  748. 前記提供するまたは接触する工程において、プライマーの第１のセットが１つ以上のＵＤＴを含む請求項７３２に記載の方法。
  749. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項７３２に記載の方法。
  750. さらなる量の酵素が工程ｄ）の後にまたは反復する工程ｄ）の後に添加される請求項７４９に記載の方法。
  751. 前記ハイブリダイズされた核酸コピーがさらにそれに付着されるかまたは結合される１つ以上のシグナル伝達体を含む請求項７３２に記載の方法。
  752. 前記ＵＤＥがシグナルを直接的にまたは間接的に発生する請求項７４８に記載の方法。
  753. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項７５２に記載の方法。
  754. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項７５２に記載の方法。
  755. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項７５４に記載の方法。
  756. ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量するための方法であって、
    ａ）（ｉ）該目的の核酸の配列に、部分または全体が同一な固定化または不動化された核酸のアレイと、
    （ｉｉ）検出または定量されることを求められる目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）該核酸分析物の核酸コピーを合成するための重合化手段であって、該重合化手段は、プライマーの第１のセット、プライマーの第２のセットを含む、重合化手段と、
    （ｉｖ）核酸の３´末端への配列の付加のための手段とを提供し、
    ｂ）プライマーの該第１のセットと、該核酸分析物とを接触して、第１の結合体を形成し、
    ｃ）該核酸分析物によって提供されるテンプレート配列によってプライマーの第１のセットの該結合されたセットを伸長して該分析物の第１の核酸コピーを形成し、
    ｄ）該第１の核酸コピーの３´末端への非テンプレート由来の配列の付加によって該第１の核酸コピーを伸長し、
    ｅ）プライマーの該第２のセットと、該伸長された第１の核酸コピーとを接触して第２の結合体を形成し、
    ｆ）該伸長された第１の核酸コピーによって提供されるテンプレート配列によってプライマーの第２のセットの該結合されたセットを伸長して、第２の核酸コピーを形成し、
    ｇ）伸長された第１の核酸コピーから該第２の核酸コピーを分離し、
    ｈ）所望の量の第２の核酸コピーが合成されるまで工程ｅ）、ｆ）、ｇ）を繰返し、
    ｉ）工程（ｉ）において提供される核酸の該配列に、工程ｈ）において形成された該第２の核酸コピーをハイブリダイズし、
    ｊ）工程ｉ）において得られた該ハイブリダイズされた第２の核酸コピーのいずれかを検出または定量する方法。
  757. 前記核酸配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択されるメンバーを含む請求項７５６に記載の方法。
  758. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項７５７に記載の方法。
  759. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項７５７または７５８に記載の方法。
  760. 前記固体支持体が多孔性であるか、または非多孔性である請求項７５６に記載の方法。
  761. 前記多孔性固体支持体が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項７６０に記載の方法。
  762. 前記非多孔性の固体支持体が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項７６０に記載の方法。
  763. 前記固体支持体が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項７５８に記載の方法。
  764. 前記核酸が直接的または間接的に、前記固体支持体に固定化または不動化される請求項７５６に記載の方法。
  765. 前記核酸は化学リンカーまたは結合アームによって前記固体支持体に対して間接的に固定化または不動化される請求項７６４に記載の方法。
  766. 核酸分析物の前記ライブラリーが、器官、組織、および細胞よりなる群から選択され、かつ生物資源に由来するものである請求項７５８に記載の方法。
  767. 前記核酸分析物が、ゲノムＤＮＡ、エピソームＲＮＡ、スプライスされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項７５８に記載の方法。
  768. 前記核酸分析物が、ポリＴセグメント、２次的構造、コンセンサス配列、および上述の組み合わせよりなる群から選択される内在性のＵＤＴを含む、請求項７５８に記載の方法。
  769. 前記コンセンサス配列が、ポリＡ付加についてのシグナル配列、スプライスエレメント、マルチコピー反復、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項７６８に記載の方法。
  770. ポリＡポリメラーゼ、末端転写酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、および上述の任意の組み合わせから選択される酵素手段によって、前記核酸分析物、前記第１のコピー、または前記第２のコピーに１つ以上の非内在性のＵＤＴを付加する工程をさらに包含する請求項７５８に記載の方法。
  771. 前記提供するまたは接触する工程において、プライマーの第１のセットまたはプライマーの第２のセットまたは両方が、１つ以上のＵＤＴを含む請求項７５８に記載の方法。
  772. 前記伸長工程ｄ）が、末端転写酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、および上述の任意の組み合わせから選択される酵素手段によって行われる請求項７５８に記載の方法。
  773. 前記重合化手段がイー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項７５８に記載の方法。
  774. さらなる量の酵素が添加される請求項７７３に記載の方法。
  775. 前記ハイブリダイズされた核酸コピーがさらにそれに付着されるかまたは取り込まれる１つ以上のシグナル伝達体を含む請求項７５８に記載の方法。
  776. 前記シグナル体が、シグナルを直接的にまたは間接的に発生する請求項７７５に記載の方法。
  777. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項７７６に記載の方法。
  778. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項７７６に記載の方法。
  779. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項７７８に記載の方法。
  780. ｉ）請求項１７５０の工程ｃ）において生成される核酸コピーを前記分析物から分離する工程、およびｍ）所望の量の伸長された第１の核酸コピーが合成されるまで工程ｂ）、ｃ）、およびｋ）を反復する工程を包含する請求項７５６に記載の方法。
  781. ｉ）請求項７５０の工程ｄ）において生成される伸長された第１の核酸コピーを前記分析物から分離する工程、およびｍ）所望の量の伸長された第１の核酸コピーが合成されるまで工程ｂ）、ｃ）、ｄ）、およびｌ）を反復する工程を包含する請求項７５６に記載の方法。
  782. 前記プライマーの第１のセットが固体支持体に付着される請求項７５６に記載の方法。
  783. 前記固体支持体がビーズを含む請求項７８２に記載の方法。
  784. 前記ビーズが磁性である請求項７８３に記載の方法。
  785. 分離した領域を含む固体表面のアレイを含む組成物であって、該分離した領域の少なくとも２つがそれぞれ、
    核酸プライマーの第１のセットと、
    核酸プライマーの第２のセットとを含み、
    核酸プライマーの該第１のセットにおけるヌクレオチド配列は、核酸プライマーの該第２のセットにおけるヌクレオチド配列と異なり、
    第１の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列は、少なくとも１つの塩基が互いに異なり、
    第１の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列は、実質的に同じであるかまたは同一である組成物。
  786. 固体表面の前記配列は、Ｄ１がＤ２よりも少ないように設計／合成され、該Ｄ１は、領域の第１のセットの部分である核酸プライマーと、同じ領域の第２のセットの部分である核酸プライマーとの間の該配置上の物理的な距離であり、Ｄ２は第１のセットの核酸プライマーについてのサンプル中の該核酸におけるプライマー結合部位の配列と、第２のセットにおける核酸プライマーについてのサンプル中の該核酸におけるプライマー結合部位の相補物との間のサンプル中核酸上の物理的な距離である請求項７８５に記載の組成物。
  787. 該核酸プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項７８５に記載の組成物。
  788. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項７８７に記載の組成物。
  789. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項７８７または７８８に記載の組成物。
  790. 前記固体表面が多孔性であるか、または非多孔性である請求項７８５に記載の組成物。
  791. 前記多孔性固体表面が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項７８９に記載の組成物。
  792. 前記非多孔性の固体表面が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項７９０に記載の組成物。
  793. 前記固体表面が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項７８５に記載の組成物。
  794. 核酸プライマーが直接的または間接的に、前記固体表面に固定化または不動化される請求項７８５に記載の組成物。
  795. 前記核酸プライマーは化学リンカーまたは結合アーム連結アームによって、当該固体表面に間接的に固定化または不動化される請求項７９４に記載の組成物。
  796. 複数の分離した領域を含む固体表面のアレイを含む組成物であって、該分離した領域の少なくとも２つがそれぞれ、
    核酸プライマーの第１のセットと、
    核酸プライマーの第２のセットとを含み、
    核酸プライマーの該第１のセットにおけるヌクレオチド配列は、核酸プライマーの第２のセットにおけるヌクレオチド配列と異なり、
    第１の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列は実質的に互いに異なり、
    第１の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列は実質的に同じであるかまたは同一である組成物。
  797. 固体表面の前記配列は、Ｄ１がＤ２よりも少ないように設計／合成され、該Ｄ１は、領域の第１のセットの部分である核酸プライマーと、同じ領域の第２のセットの部分である核酸プライマーとの間の該配列上の物理的な距離であり、Ｄ２は第１のセットの核酸プライマーについてのサンプル中の該核酸におけるプライマー結合部位の配列と、第２のセットにおける核酸プライマーについてのサンプル中の該核酸におけるプライマー結合部位の相補物との間のサンプル中核酸上の物理的な距離である請求項７９５に記載の組成物。
  798. 該核酸プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項７８６記載の組成物。
  799. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項７９８に記載の組成物。
  800. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項７９８または７９９に記載の組成物。
  801. 前記固体表面が多孔性であるか、または非多孔性である請求項７９６に記載の組成物。
  802. 前記多孔性固体表面が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項８０１に記載の組成物。
  803. 前記非多孔性の固体表面が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項７９６に記載の組成物。
  804. 前記固体表面が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項７９６に記載の組成物。
  805. 核酸プライマーが直接的または間接的に、前記固体表面に固定化または不動化される請求項７９６に記載の組成物。
  806. 前記核酸プライマーは化学リンカーまたは結合アームによって、当該固体表面に間接的に固定化または不動化される請求項８０５に記載の組成物。
  807. ライブラリー中の目的の核酸の２つ以上のコピーを生成するための方法であって、
    ａ）（ｉ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つがそれぞれ、
    （１）核酸プライマーの第１のセットと、
    （２）核酸プライマーの第２のセットとを含み、
    核酸プライマーの該第１のセットにおけるヌクレオチド配列は、核酸プライマーの該第２のセットにおけるヌクレオチド配列と異なり、
    第１の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列は少なくとも１つの塩基が実質的に互いに異なり、
    第１の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列は実質的に同じであるかまたは同一である固体表面のアレイと、
    （ｉｉ）目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）該目的の核酸の核酸コピーを合成するための重合化手段とを提供し、
    ｂ）該目的の核酸における相補的な配列と、該第１のセットのプライマーとを接触し、
    ｃ）該目的の核酸をテンプレートとして使用して第１のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第１のプライマーを生成し、
    ｄ）該伸長された第１のプライマーにおける相補的な配列と、該第２のセットにおけるプライマーとを接触し、
    ｅ）該伸長された第１のプライマーを使用して第２のセットにおける該プライマーを伸長して、該伸長された第２のプライマーを生成し、
    ｆ）該伸長された第２のプライマーにおける相補的な配列と、第１のセットにおけるプライマーとを接触し、
    ｇ）該伸長された第２のプライマーをテンプレートとして使用して、第１のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第１のプライマーを生成し、
    ｈ）上述のｄ）からｇ）までの工程を１回以上反復する工程を含む方法。
  808. 該核酸プライマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項８０７に記載の方法。
  809. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項８０８に記載の方法。
  810. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項８０８または８０９に記載の方法。
  811. 前記固体支持体が多孔性であるか、または非多孔性である請求項８０７に記載の方法。
  812. 前記多孔性固体支持体が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項８１１に記載の方法。
  813. 前記非多孔性の固体支持体が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項８１１に記載の方法。
  814. 前記固体支持体が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項８０７に記載の方法。
  815. 核酸プライマーが直接的または間接的に、前記固体支持体に固定化または不動化される請求項８０７に記載の方法。
  816. 前記核酸プライマーは化学リンカーまたは結合アームによって前記固体支持体に対して間接的に固定化または不動化される請求項８１５に記載の方法。
  817. 分析物の前記ライブラリーが、器官、組織、および細胞よりなる群から選択される、生物資源に由来する請求項８０７に記載の方法。
  818. 前記分析物が、ゲノムＤＮＡ、エピソームＲＮＡ、接合されていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８０７に記載の方法。
  819. 前記重合化手段が、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項６００に記載の方法。
  820. ライブラリー中の複数の目的の核酸を検出または定量化するための方法であって、
    ａ）（ｉ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つがそれぞれ、
    （１）核酸プライマーの第１のセットと、
    （２）核酸プライマーの第２のセットとを含み、
    核酸プライマーの該第１のセットにおけるヌクレオチド配列は、核酸プライマーの該第２のセットにおけるヌクレオチド配列と異なり、
    第１の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第１のセットのヌクレオチド配列は少なくとも１つの塩基が互いに異なり、
    第１の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列および第２の分離した領域の核酸プライマーの第２のセットのヌクレオチド配列は実質的に同じであるかまたは同一である固体表面のアレイと、
    （ｉｉ）目的の核酸を含み得る核酸分析物のライブラリーと、
    （ｉｉｉ）該目的の核酸の核酸コピーを合成するための重合化手段と、
    （ｉｖ）核酸に付着され得るか、または核酸に取り込まれ得る非放射性のシグナル発生手段とを提供し、
    ｂ）該目的の核酸における相補的な配列と、該第１のセットのプライマーとを接触し、
    ｃ）該目的の核酸をテンプレートとして使用して第１のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第１のプライマーを生成し、
    ｄ）該伸長された第１のプライマーにおける相補的な配列と、該第２のセットにおけるプライマーとを接触し、
    ｅ）該伸長された第１のプライマーをテンプレートとして使用して第２のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第２のプライマーを生成し、
    ｆ）該伸長された第２のプライマーにおける相補的な配列と、第１のセットにおけるプライマーとを接触し、
    ｇ）該伸長された第２のプライマーをテンプレートとして使用して、第１のセットにおける該プライマーを伸長して、伸長された第１のプライマーを生成し、
    ｈ）上述のｄ）からｇ）までの工程を１回以上反復し、
    ｉ）上述の工程ｃ）、ｅ）、ｇ）、およびｈ）における該伸長されたプライマーのいずれかに付着された或いはその中に取り込まれた該非放射性シグナル発生手段によって、検出または定量化する方法。
  821. 前記核酸プライマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項８２０に記載の方法。
  822. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項８２１に記載の方法。
  823. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項８２１または８２２に記載の方法。
  824. 前記固体支持体が多孔性であるか、または非多孔性である請求項８２０に記載の方法。
  825. 前記多孔性固体支持体が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項８２４に記載の方法。
  826. 前記非多孔性の固体支持体が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項８２４に記載の方法。
  827. 前記固体支持体が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項８２０に記載の方法。
  828. 核酸プライマーが直接的または間接的に、前記固体支持体に固定化または不動化される請求項８２０に記載の方法。
  829. 前記核酸プライマーは化学リンカーまたは結合アームによって前記固体支持体に対して間接的に固定化または不動化される請求項８２８に記載の方法。
  830. 分析物の前記ライブラリーが、器官、組織、および細胞よりなる群から選択される、生物資源に由来する請求項８２０に記載の方法。
  831. 前記分析物が、ゲノムＤＮＡ、エピソームＲＮＡ、接合されていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＳｎＲＮＡ、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８２０に記載の方法。
  832. 前記重合化手段が、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉ、イー・コリＤＮＡＰｏｌ Ｉのクレノーフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＶ逆転写酵素、ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、センシスクリプトおよびオムニスクリプトよりなる群から選択される請求項８２０に記載の方法。
  833. 前記非放射性シグナル発生手段が、ラベル化ヌクレオチド、挿入色素、普遍的な検出エレメント、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８２０に記載の方法。
  834. 前記伸長されたプライマーがさらに、それに付着された或いはその中に取り込まれた１又はそれ以上のシグナル発生体を含む請求項８２０に記載の方法。
  835. 前記シグナル発生体が、直接的にまたは間接的にシグナルを作製する請求項８３４に記載の方法。
  836. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８３５に記載の方法。
  837. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８３５に記載の方法。
  838. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項８３７に記載の方法。
  839. 複数の分離した領域を含む固体表面のアレイを含む組成物であって、該分離した領域の少なくとも２つは、
    核酸部分と、
    非核酸部分とを含むキメラ組成物を含み、
    第１の分離した領域の該核酸部分は第２の分離した領域の核酸部分と同じ配列を有し、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有する組成物。
  840. 前記核酸部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項８３９に記載の組成物。
  841. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項８４０に記載の組成物。
  842. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項８４０または８４１に記載の組成物。
  843. 前記固体表面が多孔性であるか、または非多孔性である請求項８３９に記載の組成物。
  844. 前記多孔性固体表面が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項８４３に記載の組成物。
  845. 前記非多孔性の固体表面が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項８４３に記載の組成物。
  846. 前記固体表面が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項８３９に記載の組成物。
  847. 核酸部分が直接的または間接的に、前記固体表面に固定化または不動化される請求項８３９に記載の組成物。
  848. 前記非核酸部分は、ペプチド、蛋白質、リガンド、酵素、基質、ホルモン、受容体、薬物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８３９に記載の組成物。
  849. 複数の分離した領域を含む固体表面のアレイを含む組成物であって、該分離した領域の少なくとも２つは、
    該分離した領域に固定化または不動化される核酸の相補的な配列にハイブリダイズされるキメラ組成物を含み、該キメラ組成物は、
    核酸部分と、
    非核酸部分とを含み、
    該核酸部分は少なくとも１つの配列を含み、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は、該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に対して同一または相補的配列のいずれも含まない組成物。
  850. 前記固体表面が多孔性であるか、または非多孔性である請求項８４９に記載の組成物。
  851. 前記多孔性固体表面が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項８５０に記載の組成物。
  852. 前記非多孔性の固体表面が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項８５０に記載の組成物。
  853. 前記固体表面が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項８４９に記載の組成物。
  854. 前記固定化または不動化された核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項８４９に記載の組成物。
  855. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項８５４に記載の組成物。
  856. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項８５４または８５５に記載の組成物。
  857. 前記核酸部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項８４９に記載の組成物。
  858. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項８５７に記載の組成物。
  859. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項８５７または８５８に記載の組成物。
  860. 前記非核酸部分は、ペプチド、蛋白質、リガンド、酵素、基質、ホルモン、受容体、薬物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８４９に記載の組成物。
  861. 目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、
    １）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは：核酸部分；および非核酸部分を含むキメラ組成物を含み；第１の分離した領域の該核酸部分は第２の分離した領域の核酸部分と同じ配列を有し、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有する、固体表面のアレイと、
    ｂ）該目的の分析物の１つ以上を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、
    ｃ）シグナル発生手段とを提供し、
    ２）サンプルｂ）と配列ａ）とを、該非核酸部分への該分析物の結合を許容する条件下で、接触させ、
    ３）該シグナル発生手段と該結合された分析物とを接触させ、
    ４）該分析物の存在を検出または定量化する方法。
  862. 前記固体表面が多孔性であるか、または非多孔性である請求項８６１に記載の方法。
  863. 前記多孔性固体表面が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項８６２に記載の方法。
  864. 前記非多孔性の固体表面が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項８６２に記載の方法。
  865. 前記固体表面が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項８６１に記載の方法。
  866. 前記核酸部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項８６１に記載の方法。
  867. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項８６６に記載の方法。
  868. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項８６６または８６７に記載の方法。
  869. 前記核酸部分は、前記固体表面に直接的または間接的に固定化または不動化される請求項８６１に記載の方法。
  870. 前記非核酸部分は、ペプチド、蛋白質、リガンド、酵素、基質、ホルモン、受容体、薬物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８６１に記載の方法。
  871. 前記シグナル発生手段が、直接的なシグナル発生手段および間接的なシグナル発生手段を含む請求項８６１に記載の方法。
  872. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８７１に記載の方法。
  873. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８７１に記載の方法。
  874. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項８７３に記載の方法。
  875. 目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、
    １）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは：核酸部分；および非核酸部分を含むキメラ組成物を含み；第１の分離した領域の該核酸部分は第２の分離した領域の核酸部分と同じ配列を有し、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有する固体表面のアレイと、
    ｂ）該目的の分析物の１つ以上を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、
    ｃ）シグナル発生手段とを提供し、
    ２）該シグナル発生手段で該目的の分析物をラベルし、
    ３）該ラベルされた分析物と配列ａ）とを、該非核酸部分への該ラベル化された分析物の結合を許容する条件下で接触させ、
    ４）該分析物の存在を検出または定量化する方法。
  876. 前記固体表面が多孔性であるか、または非多孔性である請求項８７５に記載の方法。
  877. 前記多孔性固体表面が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項８７６に記載の方法。
  878. 前記非多孔性の固体表面が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項８７６に記載の方法。
  879. 前記固体表面が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項８７６に記載の方法。
  880. 前記核酸部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項８７５に記載の方法。
  881. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項８８０に記載の方法。
  882. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項８８０または８８１に記載の方法。
  883. 前記核酸部分は、前記固体表面に直接的または間接的に固定化または不動化される請求項８７５に記載の方法。
  884. 前記非核酸部分は、ペプチド、蛋白質、リガンド、酵素、基質、ホルモン、受容体、薬物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８７５に記載の方法。
  885. 前記シグナル発生手段が、直接的なシグナル発生手段および間接的なシグナル発生手段を含む請求項８７５に記載の方法。
  886. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８８５に記載の方法。
  887. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８８５に記載の方法。
  888. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項８８７に記載の方法。
  889. 目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、
    １）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは該分離した領域に固定化または不動化された核酸部分を含む、固体表面のアレイと、
    ｂ）ｉ）核酸部分と、
    ｉｉ）非核酸部分とを含むキメラ組成物であって、
    該核酸部分は、少なくとも１つの配列を有し、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は、該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に同一または相補的な配列のいずれも含まないキメラ組成物と、
    ｃ）該目的の分析物の１つ以上を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、
    ｄ）シグナル発生手段とを提供し、
    ２）キメラ組成物と該配列とを接触して、該キメラ組成物の核酸部分を該配列に固定化または不動化された相補的な核酸にハイブリダイズし、
    ３）サンプルと該配列とを、該非核酸部分への該分析物の結合を許容する条件下で接触させ、
    ４）該シグナル発生手段と該結合された分析物とを接触させ、
    ５）該分析物の存在を検出または定量化する方法。
  890. 前記固体表面が多孔性であるか、または非多孔性である請求項８８９に記載の方法。
  891. 前記多孔性固体表面が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項８９０に記載の方法。
  892. 前記非多孔性の固体表面が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項８９０に記載の方法。
  893. 前記固体表面が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項８８９に記載の方法。
  894. 前記固定化または不動化された核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項８８９に記載の方法。
  895. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項８９４に記載の方法。
  896. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項８９４または８９５に記載の方法。
  897. 前記核酸部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項８８９に記載の方法。
  898. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項８９７に記載の方法。
  899. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項８９７または８９８に記載の方法。
  900. 前記非核酸部分は、ペプチド、蛋白質、リガンド、酵素、基質、ホルモン、受容体、薬物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項８８９に記載の方法。
  901. 前記シグナル発生手段は、直接的なシグナル発生手段および間接的なシグナル発生手段を含む請求項８８９に記載の方法。
  902. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項９０１に記載の方法。
  903. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項９０１に記載の方法。
  904. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項９０３に記載の方法。
  905. 目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、
    １）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは、該分離した領域に固定化または不動化された核酸部分を含む、固体表面のアレイと、
    ｂ）ｉ）核酸部分と、
    ｉｉ）非核酸部分とを含むキメラ組成物であって、
    該核酸部分は、少なくとも１つの配列を含み、ここで該非核酸部分は、目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は、該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に同一または相補的配列のいずれも含まないキメラ組成物と、
    ｃ）該目的の分析物を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、
    ｄ）シグナル発生手段とを提供し、
    ２）該非核酸部分に該分析物を結合することを許容する条件下で、該サンプルｂ）と該キメラ組成物とを接触させ、
    ３）該キメラ組成物と該配列とを接触して、該キメラ組成物の核酸部分を該配列に固定化または不動化された相補的な核酸にハイブリダイズし、
    ４）該シグナル発生手段と該結合された分析物とを接触させ、
    ５）該分析物の存在を検出または定量化する方法。
  906. 前記固体表面が多孔性であるか、または非多孔性である請求項９０５に記載の方法。
  907. 前記多孔性固体表面が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項９０６に記載の方法。
  908. 前記非多孔性の固体表面が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項９０６に記載の方法。
  909. 前記固体表面が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項９０５に記載の方法。
  910. 前記固定化または不動化された核酸部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項９０５に記載の方法。
  911. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項９１０に記載の方法。
  912. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項９１０または９１１に記載の方法。
  913. 前記核酸部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項９０５に記載の方法。
  914. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項９１３に記載の方法。
  915. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項９１３または９１４に記載の方法。
  916. 前記非核酸部分は、ペプチド、蛋白質、リガンド、酵素、基質、ホルモン、受容体、薬物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項９０５に記載の方法。
  917. 前記シグナル発生手段は、直接的なシグナル発生手段および間接的なシグナル発生手段を含む請求項９０５に記載の方法。
  918. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項９１７に記載の方法。
  919. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項９１７に記載の方法。
  920. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項９１９に記載の方法。
  921. 目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、
    １）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは、該分離した領域に固定化または不動化された核酸部分を含む、固体表面のアレイと、
    ｂ）ｉ）核酸部分と、
    ｉｉ）非核酸部分とを含むキメラ組成物であって、
    該核酸部分は、少なくとも１つの配列を含み、ここで該非核酸部分は、目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に同一または相補的配列のいずれも含まないキメラ組成物と、
    ｃ）該目的の分析物の１つ以上を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、
    ｄ）シグナル発生手段とを提供し、
    ２）該キメラ組成物と該配列とを接触して、該キメラ組成物の核酸部分を該配列に固定化または不動化された相補的な核酸部分にハイブリダイズし、
    ３）該シグナル発生手段で該分析物をラベルし、
    ４）ラベルされた分析物と該配列とを接触して、該分析物を該非核酸部分に結合し、
    ５）該分析物の存在を検出または定量化する方法。
  922. 前記固体表面が多孔性であるか、または非多孔性である請求項９２１に記載の方法。
  923. 前記多孔性固体表面が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項９２２に記載の方法。
  924. 前記非多孔性の固体表面が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項９２２に記載の方法。
  925. 前記固体表面が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項９２１に記載の方法。
  926. 前記固定化または不動化された核酸部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項９２１に記載の方法。
  927. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項９２６に記載の方法。
  928. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項９２６または９２７に記載の方法。
  929. 前記核酸部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項９２１に記載の方法。
  930. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項９２９に記載の方法。
  931. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項９２９または９３０に記載の方法。
  932. 前記非核酸部分は、ペプチド、蛋白質、リガンド、酵素、基質、ホルモン、受容体、薬物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項９２１に記載の方法。
  933. 前記シグナル発生手段は、直接的なシグナル発生手段および間接的なシグナル発生手段を含む請求項９２１に記載の方法。
  934. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項９３３に記載の方法。
  935. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項９３３に記載の方法。
  936. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項９３５に記載の方法。
  937. 目的の分析物を検出または定量化するための方法であって、
    １）ａ）複数の分離した領域を含む固体表面のアレイであって、該分離した領域の少なくとも２つは、該分離した領域に固定化または不動化された核酸部分を含む、固体表面のアレイと、
    ｂ）ｉ）核酸部分と、
    ｉｉ）非核酸部分とを含むキメラ組成物であって、
    該核酸部分は、少なくとも１つの配列を含み、該非核酸部分は目的の分析物に対する結合親和性を有し、該非核酸部分がペプチドまたは蛋白質である場合、該核酸部分は該ペプチドまたは蛋白質をコードする配列に同一または相補的配列のいずれも含まないキメラ組成物と、
    ｃ）該目的の分析物を含むか、または含むことが予測されるサンプルと、
    ｄ）シグナル発生手段とを提供し、
    ２）該シグナル発生手段で該目的の分析物をラベルし、
    ３）該ラベルされた分析物と該キメラ配列とを接触して、該分析物を該非核酸部分に結合し、
    ４）該キメラ組成物と該配列とを接触して、該キメラ組成物の核酸部分を、該配列に固定化または不動化された相補的な核酸にハイブリダイズし、
    ５）該分析物の存在を検出または定量化する方法。
  938. 前記固体表面が多孔性であるか、または非多孔性である請求項９３７に記載の方法。
  939. 前記多孔性固体表面が、ポリアクリルアミドおよびアガロースよりなる群から選択される請求項９３８に記載の方法。
  940. 前記非多孔性の固体表面が、ガラスまたはプラスチックを含む請求項９３８に記載の方法。
  941. 前記固体表面が、透明、半透明、不透明、または反射性である請求項９３７に記載の方法。
  942. 前記固定化または不動化された核酸部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項９３７に記載の方法。
  943. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項９４２に記載の方法。
  944. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項９４２または９４３に記載の方法。
  945. 前記核酸部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似物よりなる群から選択される請求項９３７に記載の方法。
  946. 前記類似物がＰＮＡを含む請求項９４５に記載の方法。
  947. 前記核酸または類似物が、糖部、リン酸部、または塩基部のいずれか１つで修飾される請求項９４５または９４６に記載の方法。
  948. 前記非核酸部分は、ペプチド、蛋白質、リガンド、酵素、基質、ホルモン、受容体、薬物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項９３７に記載の方法。
  949. 前記シグナル発生手段は、直接的なシグナル発生手段および間接的なシグナル発生手段を含む請求項９３７に記載の方法。
  950. 前記直接的なシグナル発生が、蛍光化合物、リン光化合物、化学発光化合物、キレート化化合物、電子高密度な化合物、磁性化合物、挿入化合物、エネルギー伝達化合物、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項９４９に記載の方法。
  951. 前記間接的なシグナル発生が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、ホルモン、リガンド、酵素、および上述の任意の組み合わせよりなる群から選択される請求項９４９に記載の方法。
  952. 前記酵素が、蛍光発生反応、色素生成反応、および化学発光反応よりなる群から選択される反応を触媒する請求項９５１に記載の方法。
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