JP2002514441A - 遺伝子の同定方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
合図に誘導される遺伝子発現により、RNAレベルで制御される遺伝子を同定する方法。本発明は、特異的な細胞区画から得られるmRNAを分析し、試験生物的試料に合図を適用した結果としてのこれらの区画中のmRNAの相対量の変化を比較することによる、示差的に発現される遺伝子または発生的に制御される遺伝子の迅速な単離に関する。細胞区画は、ポリソームと非ポリソーム画分、核画分、細胞質画分、およびスプライソソーム画分を含む。任意の1つまたはそれ以上のレベルでの制御により示差的に発現される遺伝子が性状解析される。制御レベルは、翻訳制御、転写制御、mRNA安定性制御、およびmRNA輸送制御を含む。内部リボゾーム侵入部位をコードする遺伝子配列の同定方法も提供され、これは、細胞中の5’キャップ依存性mRNA翻訳を阻害し、細胞からmRNAのプールを回収し、そしてmRNAのプールを示差的に分析して内部リボゾーム侵入部位をコードする配列を有する遺伝子を同定する、ことを含む。
Description
【0001】 関連出願への相互参照 本出願は、1998年5月11日出願の米国仮特許出願第60/084,94
4号の転換出願であり、これに優先権を主張する。
4号の転換出願であり、これに優先権を主張する。
【0002】 (発明の背景) (技術分野) 本発明は、RNAレベルで制御される遺伝子を同定する方法に関する。さらに
詳しくは本発明は、特異的な細胞区画から得られるmRNAの分析により、示差
的に発現される遺伝子または発生的に制御される遺伝子の迅速な単離に関する。
試験生物学的試料への合図または刺激の適用の結果として存在する、これらの区
画に見い出されるmRNAの相対量の変化を比較することにより、示差的に発現
される遺伝子を性状解析することができる。
詳しくは本発明は、特異的な細胞区画から得られるmRNAの分析により、示差
的に発現される遺伝子または発生的に制御される遺伝子の迅速な単離に関する。
試験生物学的試料への合図または刺激の適用の結果として存在する、これらの区
画に見い出されるmRNAの相対量の変化を比較することにより、示差的に発現
される遺伝子を性状解析することができる。
【0003】 (背景技術) その発現が、2つのタイプの細胞または組織の間、またはストレス状態、化合
物もしくは病原体に暴露された細胞または組織の間で異なる、遺伝子の同定およ
び/または単離は、種々の生理学的状態、障害、または疾患の根底にある機作の
理解に決定的に重要である。遺伝子発現の制御は、胚発生、加齢、組織修復、お
よび悪性形質転換を含む多くの生物学的プロセスにおいて、重要な役割を果たす
ことが証明されている。遺伝子発現の制御は、転写制御、翻訳制御、mRNA安
定性の制御、mRNA輸送の制御、天然のアンチセンスmRNAによる制御およ
び代替スプライシングによる制御を含む、多くのレベルで存在しうる。しかしこ
うして制御される遺伝子が文献に報告されているが、現在までにたどった遺伝子
発見のアプローチは、全細胞内RNAの分析による細胞内mRNAの「定常状態
」レベルでの変化を検討しただけであった。
物もしくは病原体に暴露された細胞または組織の間で異なる、遺伝子の同定およ
び/または単離は、種々の生理学的状態、障害、または疾患の根底にある機作の
理解に決定的に重要である。遺伝子発現の制御は、胚発生、加齢、組織修復、お
よび悪性形質転換を含む多くの生物学的プロセスにおいて、重要な役割を果たす
ことが証明されている。遺伝子発現の制御は、転写制御、翻訳制御、mRNA安
定性の制御、mRNA輸送の制御、天然のアンチセンスmRNAによる制御およ
び代替スプライシングによる制御を含む、多くのレベルで存在しうる。しかしこ
うして制御される遺伝子が文献に報告されているが、現在までにたどった遺伝子
発見のアプローチは、全細胞内RNAの分析による細胞内mRNAの「定常状態
」レベルでの変化を検討しただけであった。
【0004】 発生的、生理学的、薬理学的、または他の合図された事象に応答して活性化ま
たは抑制される遺伝子の検出と単離のために、多くの方法が開発されている。1
つの具体的な方法は、ゼン(Zeng)の米国特許第5,525,471号に記載さ
れているサブトラクティブハイブリダイゼーション(subtractive hybridizatio
n)である。サブトラクティブハイブリダイゼーションは、1つのDNAまたは
RNA集団に存在するが、別の集団には存在しない配列を選択的にクローン化す
るための特に有用な方法であるが、より微妙な差には感受性が低い。選択的クロ
ーン化は、対照細胞/組織(ドライバーcDNA)と、研究される具体的な変化
または応答の間または後の細胞/組織(テスターcDNA)との両方から、1本
鎖相補的DNAライブラリーを生成させることにより達成される。2つのcDN
Aライブラリーを、変性し相互にハイブリダイズさせると、ドライバーcDNA
とテスターcDNA鎖の間で2本鎖が形成される。この方法では、共通配列は除
去されて、残りのハイブリダイズしなかった1本鎖DNAは、研究される具体的
な変化または事象に関係した実験細胞/組織に存在する配列が濃縮される。(デ
イビス(Davis)ら、1987年)。
たは抑制される遺伝子の検出と単離のために、多くの方法が開発されている。1
つの具体的な方法は、ゼン(Zeng)の米国特許第5,525,471号に記載さ
れているサブトラクティブハイブリダイゼーション(subtractive hybridizatio
n)である。サブトラクティブハイブリダイゼーションは、1つのDNAまたは
RNA集団に存在するが、別の集団には存在しない配列を選択的にクローン化す
るための特に有用な方法であるが、より微妙な差には感受性が低い。選択的クロ
ーン化は、対照細胞/組織(ドライバーcDNA)と、研究される具体的な変化
または応答の間または後の細胞/組織(テスターcDNA)との両方から、1本
鎖相補的DNAライブラリーを生成させることにより達成される。2つのcDN
Aライブラリーを、変性し相互にハイブリダイズさせると、ドライバーcDNA
とテスターcDNA鎖の間で2本鎖が形成される。この方法では、共通配列は除
去されて、残りのハイブリダイズしなかった1本鎖DNAは、研究される具体的
な変化または事象に関係した実験細胞/組織に存在する配列が濃縮される。(デ
イビス(Davis)ら、1987年)。
【0005】 合図または刺激により誘導/減少されるタンパク質をコードするmRNAを同
定するために現在使用されている方法は、示差的に発現されるmRNAのスクリ
ーニングを介する定常状態のmRNAレベルの変化に依存している。示差的に発
現されるmRNAの同定のためのこのような方法の1つは、サトクリフ(Sutcli
ffe)らの米国特許第5,459,037号に開示されている。この方法により
、あるmRNA集団が単離され、12個のアンカープライマーの混合物を使用し
て2本鎖cDNAがmRNA集団から調製され、cDNAが2つの制限エンドヌ
クレアーゼで切断され、次いでベクター内のT3プロモーターに対してアンチセ
ンスであるような配向でベクター中に挿入される。大腸菌(E. coli)を、ベク
ターを含有するcDNAで形質転換して、第1および第2の制限エンドヌクレア
ーゼとは異なる少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼで消化してクローン化
した挿入配列から、線状化断片を作成し、そしてT3 RNAポリメラーゼと共
に線状化断片をインキュベートすることにより、アンチセンスcDNA転写体の
cDNA調製物を作成する。cDNA集団をサブプールに分割して、各サブプー
ルからの第1鎖cDNAを、熱安定性逆転写酵素および16個のプライマーの1
つを使用して転写する。16個の反応プールのそれぞれの転写産物を、3’−プ
ライマーおよび5’−プライマーを用いるポリメラーゼチェイン反応(PCR)
のための鋳型として使用し、試料中に存在するmRNAの3’末端を表すバンド
を表示するために、ポリメラーゼチェイン反応で増幅した断片を電気泳動により
分離する。この方法は、示差的に発現されるmRNAの同定およびこれらの相対
濃度の測定のために有用である。しかしこのタイプの方法は、そのレベルが一定
に残存するがその翻訳性が可変であるかまたは変化するmRNA、あるいは核か
ら細胞質へのmRNA輸送の変化により生じる差を同定することができない。
定するために現在使用されている方法は、示差的に発現されるmRNAのスクリ
ーニングを介する定常状態のmRNAレベルの変化に依存している。示差的に発
現されるmRNAの同定のためのこのような方法の1つは、サトクリフ(Sutcli
ffe)らの米国特許第5,459,037号に開示されている。この方法により
、あるmRNA集団が単離され、12個のアンカープライマーの混合物を使用し
て2本鎖cDNAがmRNA集団から調製され、cDNAが2つの制限エンドヌ
クレアーゼで切断され、次いでベクター内のT3プロモーターに対してアンチセ
ンスであるような配向でベクター中に挿入される。大腸菌(E. coli)を、ベク
ターを含有するcDNAで形質転換して、第1および第2の制限エンドヌクレア
ーゼとは異なる少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼで消化してクローン化
した挿入配列から、線状化断片を作成し、そしてT3 RNAポリメラーゼと共
に線状化断片をインキュベートすることにより、アンチセンスcDNA転写体の
cDNA調製物を作成する。cDNA集団をサブプールに分割して、各サブプー
ルからの第1鎖cDNAを、熱安定性逆転写酵素および16個のプライマーの1
つを使用して転写する。16個の反応プールのそれぞれの転写産物を、3’−プ
ライマーおよび5’−プライマーを用いるポリメラーゼチェイン反応(PCR)
のための鋳型として使用し、試料中に存在するmRNAの3’末端を表すバンド
を表示するために、ポリメラーゼチェイン反応で増幅した断片を電気泳動により
分離する。この方法は、示差的に発現されるmRNAの同定およびこれらの相対
濃度の測定のために有用である。しかしこのタイプの方法は、そのレベルが一定
に残存するがその翻訳性が可変であるかまたは変化するmRNA、あるいは核か
ら細胞質へのmRNA輸送の変化により生じる差を同定することができない。
【0006】 スケーナ(Schena)らは、マイクロアレイを利用する並行して多くの遺伝子の
発現を追跡するための高能力システムを開発した。マイクロアレイは、ガラスへ
のcDNAの高速ロボット印刷により調製して、対応する遺伝子の定量的発現測
定を可能にする(スケーナ(Schena)ら、1995年)。遺伝子の示差的発現測
定は、同時2色蛍光ハイブリダイゼーションにより行われる。しかしこの方法単
独では、感度が限定され、翻訳的に制御される遺伝子およびmRNA輸送制御を
含む、数種のタイプの制御レベルの同定には不充分である。著者らは、転写活性
の直接評価を可能にする特別なmRNAプールの使用は検討しなかった。
発現を追跡するための高能力システムを開発した。マイクロアレイは、ガラスへ
のcDNAの高速ロボット印刷により調製して、対応する遺伝子の定量的発現測
定を可能にする(スケーナ(Schena)ら、1995年)。遺伝子の示差的発現測
定は、同時2色蛍光ハイブリダイゼーションにより行われる。しかしこの方法単
独では、感度が限定され、翻訳的に制御される遺伝子およびmRNA輸送制御を
含む、数種のタイプの制御レベルの同定には不充分である。著者らは、転写活性
の直接評価を可能にする特別なmRNAプールの使用は検討しなかった。
【0007】 ハイプシン形成の既知インヒビターであるミモシンを使用して、そのポリソー
ムmRNA集団対非ポリソームmRNA集団を示差的に表示しながら、細胞中の
ハイプシン形成性デオキシハイプシルヒドロキシラーゼを可逆的に抑制した。(
ハナウスケ−アベル(Hanauske-Abel)ら、1995年)。この方法を利用して
、ハイプシン形成の阻害および脱阻害に関連してポリソームで、それぞれ消失お
よび再出現し、そして翻訳的に制御される酵素をコードすると考えられる、数種
類のmRNAが発見された。この方法は、翻訳的に制御される遺伝子を同定する
ために、既知の刺激要素(すなわち、誘導物質またはリプレッサー)の使用を教
示するだけである。(この方法は、刺激要素が未知である場合、翻訳的に制御さ
れる遺伝子の検出および/または同定のための機作を提供しない)。遺伝子発見
のための示差的表示法の使用は、処理能力と感度が非常に限定され、多く技巧の
影響を受ける。本出願の主題は、DNAチップ分析用のプローブの供給源として
ポリソームmRNAプールの使用を包含しない。これは実際、大量の高品質のポ
リソームmRNAを入手するために、方法の特別な改良を必要とする。
ムmRNA集団対非ポリソームmRNA集団を示差的に表示しながら、細胞中の
ハイプシン形成性デオキシハイプシルヒドロキシラーゼを可逆的に抑制した。(
ハナウスケ−アベル(Hanauske-Abel)ら、1995年)。この方法を利用して
、ハイプシン形成の阻害および脱阻害に関連してポリソームで、それぞれ消失お
よび再出現し、そして翻訳的に制御される酵素をコードすると考えられる、数種
類のmRNAが発見された。この方法は、翻訳的に制御される遺伝子を同定する
ために、既知の刺激要素(すなわち、誘導物質またはリプレッサー)の使用を教
示するだけである。(この方法は、刺激要素が未知である場合、翻訳的に制御さ
れる遺伝子の検出および/または同定のための機作を提供しない)。遺伝子発見
のための示差的表示法の使用は、処理能力と感度が非常に限定され、多く技巧の
影響を受ける。本出願の主題は、DNAチップ分析用のプローブの供給源として
ポリソームmRNAプールの使用を包含しない。これは実際、大量の高品質のポ
リソームmRNAを入手するために、方法の特別な改良を必要とする。
【0008】 一般に、真核生物mRNAの翻訳は、5’キャップ介在性リボソーム結合に依
存する。翻訳の前に、リボソームの小サブユニット(40S)は、転写体上の5
’キャップ構造に結合し、次に翻訳開始部位までmRNA分子に沿って走査しつ
つ前進して、そこで大サブユニット(60S)が、完全なリボソーム開始部位を
形成する。多くの例において、翻訳開始部位は、第1のAUGコドンである。翻
訳開始のこの「走査モデル」は、ほとんどの真核生物mRNAに適応する。「走
査モデル」に対する少数の顕著な例外は、ピコルナウイルスファミリーにより提
供される。これらのウイルスは、多数の非翻訳開始AUGコドンを含有する長い
(600〜1200ヌクレオチド)5’非翻訳領域(UTR)を有する非キャッ
プ付与転写体を産生する。キャップ構造が存在しないため、これらのRNAの翻
訳効率は、内部リボゾーム侵入部位(IRES)として知られている非翻訳領域
(UTR)内の特異的配列の存在に依存する。
存する。翻訳の前に、リボソームの小サブユニット(40S)は、転写体上の5
’キャップ構造に結合し、次に翻訳開始部位までmRNA分子に沿って走査しつ
つ前進して、そこで大サブユニット(60S)が、完全なリボソーム開始部位を
形成する。多くの例において、翻訳開始部位は、第1のAUGコドンである。翻
訳開始のこの「走査モデル」は、ほとんどの真核生物mRNAに適応する。「走
査モデル」に対する少数の顕著な例外は、ピコルナウイルスファミリーにより提
供される。これらのウイルスは、多数の非翻訳開始AUGコドンを含有する長い
(600〜1200ヌクレオチド)5’非翻訳領域(UTR)を有する非キャッ
プ付与転写体を産生する。キャップ構造が存在しないため、これらのRNAの翻
訳効率は、内部リボゾーム侵入部位(IRES)として知られている非翻訳領域
(UTR)内の特異的配列の存在に依存する。
【0009】 さらに最近になって、mRNA転写体を含有するIRESが、免疫グロブリン
重鎖結合タンパク質をコードするmRNA、ドロソフィラ(Drosophila)のアン
テナペディア(antenapedia)遺伝子、およびマウスFgl−2遺伝子のような
、非ウイルス系で発見されている。これらの発見により、正常プローブおよび異
常プローブの両方の間の遺伝子発現の発生的制御におけるキャップ非依存性翻訳
の役割に関する考察が促進された。
重鎖結合タンパク質をコードするmRNA、ドロソフィラ(Drosophila)のアン
テナペディア(antenapedia)遺伝子、およびマウスFgl−2遺伝子のような
、非ウイルス系で発見されている。これらの発見により、正常プローブおよび異
常プローブの両方の間の遺伝子発現の発生的制御におけるキャップ非依存性翻訳
の役割に関する考察が促進された。
【0010】 mRNAを含有する上記非ウイルスIRESの発見は、真核生物IRES配列
が、以前に実現されていたよりもさらに広がっていることを暗示している。真核
生物IRES配列を同定する上での困難さは、これらが典型的には配列相同性に
より同定することができないという事実にある。[オー(Oh)ら、1993年;
マウントフォード(Mountford)ら、1995年;マセジャック(Macejak)ら、
1991年;ペレティア(Pelletier)ら、1988年;ヴァグナー(Vagner)
ら、1995年]従って、正常および異常プロセスの両方とのこれらの結合を確
認および評価するために、5’キャップ非依存性翻訳を介して機能する翻訳的に
制御される遺伝子を同定するために、mRNAを含有するIRESを同定するた
めの方法を持つことは有利であろう。
が、以前に実現されていたよりもさらに広がっていることを暗示している。真核
生物IRES配列を同定する上での困難さは、これらが典型的には配列相同性に
より同定することができないという事実にある。[オー(Oh)ら、1993年;
マウントフォード(Mountford)ら、1995年;マセジャック(Macejak)ら、
1991年;ペレティア(Pelletier)ら、1988年;ヴァグナー(Vagner)
ら、1995年]従って、正常および異常プロセスの両方とのこれらの結合を確
認および評価するために、5’キャップ非依存性翻訳を介して機能する翻訳的に
制御される遺伝子を同定するために、mRNAを含有するIRESを同定するた
めの方法を持つことは有利であろう。
【0011】 先行技術の方法は、遺伝子発現制御の非常に狭い側面に注目しており、従って
多くの本質的な限界を有する方法を使用してきた。従って、遺伝子発現制御レベ
ルの整理された情報の拡大を可能にし、従って生物学的に重要な遺伝子の単離を
可能にする方法を持つことが望ましいであろう。
多くの本質的な限界を有する方法を使用してきた。従って、遺伝子発現制御レベ
ルの整理された情報の拡大を可能にし、従って生物学的に重要な遺伝子の単離を
可能にする方法を持つことが望ましいであろう。
【0012】 (発明の要約) 本発明により、多くの可能な制御レベルで制御される遺伝子の同定方法が提供
される。このような方法は、細胞または組織を、機械的、化学的、毒性の、薬剤
学的または他のストレス、ホルモン、生理学的障害または疾患のような、合図ま
たは刺激に暴露する工程;細胞を、ポリソーム、核、細胞質およびスプラソソー
ムのような区画に分画する工程;これらの画分からmRNAを抽出し、そしてこ
れらのmRNAを、遺伝子発現アレイ(GEM)のような許容されている方法を
使用して示差的分析に付す工程を含む。
される。このような方法は、細胞または組織を、機械的、化学的、毒性の、薬剤
学的または他のストレス、ホルモン、生理学的障害または疾患のような、合図ま
たは刺激に暴露する工程;細胞を、ポリソーム、核、細胞質およびスプラソソー
ムのような区画に分画する工程;これらの画分からmRNAを抽出し、そしてこ
れらのmRNAを、遺伝子発現アレイ(GEM)のような許容されている方法を
使用して示差的分析に付す工程を含む。
【0013】 定常状態レベルがわずかな変化しか示さないが、核RNAプローブにより検出
すると非常に示差的な発現を示す遺伝子を単離するための、核からのRNAの単
離の利用する例が提供される。多くのこのような遺伝子は、転写レベルで制御さ
れる。そのmRNAの定常状態レベルは変化しないが、ストレス合図の適用後ポ
リソーム内で非常に増加する遺伝子を同定するための、細胞/組織から単離され
るポリソームを利用する1つのタイプの制御の別の例が提供される。このような
遺伝子は、翻訳レベルで厳密に制御される。
すると非常に示差的な発現を示す遺伝子を単離するための、核からのRNAの単
離の利用する例が提供される。多くのこのような遺伝子は、転写レベルで制御さ
れる。そのmRNAの定常状態レベルは変化しないが、ストレス合図の適用後ポ
リソーム内で非常に増加する遺伝子を同定するための、細胞/組織から単離され
るポリソームを利用する1つのタイプの制御の別の例が提供される。このような
遺伝子は、翻訳レベルで厳密に制御される。
【0014】 翻訳レベルで制御される遺伝子のサブグループは、内部リボゾーム侵入部位の
存在を伴う。細胞内の5’キャップ依存性mRNA翻訳を阻害すること、細胞か
らmRNAのプールを回収すること、およびmRNAのプールを示差的分析して
内部リボゾーム侵入部位をコードする配列を含む遺伝子を同定することを含む、
このような遺伝子の同定のための方法が提供される。
存在を伴う。細胞内の5’キャップ依存性mRNA翻訳を阻害すること、細胞か
らmRNAのプールを回収すること、およびmRNAのプールを示差的分析して
内部リボゾーム侵入部位をコードする配列を含む遺伝子を同定することを含む、
このような遺伝子の同定のための方法が提供される。
【0015】 (発明の詳細な説明) ストレス誘導性要素で未知の標的mRNA(より大きな試料の一部である)を
選択的に刺激することにより、発現が少なくとも部分的にmRNAレベルで制御
される遺伝子を同定する方法。生物は、適切なmRNAを提供する任意の生物で
あってよい。mRNA試料は、ストレス誘導性要素により翻訳的に制御される遺
伝子を同定するために示差的分析される、発現制御およびタンパク質局在に基づ
く細胞内区画に由来する。本方法は、特異的な合図に応答性の遺伝子を同定およ
びクローン化するために設計される。すなわち本方法は、特異的な病態、ストレ
ス、生理学状態など、および一般に細胞または生物にその遺伝子発現を改変させ
る影響を及ぼしうる任意の因子に応答して、アップレギュレートまたはダウンレ
ギュレートされる遺伝子を同定およびクローン化するために設計される。
選択的に刺激することにより、発現が少なくとも部分的にmRNAレベルで制御
される遺伝子を同定する方法。生物は、適切なmRNAを提供する任意の生物で
あってよい。mRNA試料は、ストレス誘導性要素により翻訳的に制御される遺
伝子を同定するために示差的分析される、発現制御およびタンパク質局在に基づ
く細胞内区画に由来する。本方法は、特異的な合図に応答性の遺伝子を同定およ
びクローン化するために設計される。すなわち本方法は、特異的な病態、ストレ
ス、生理学状態など、および一般に細胞または生物にその遺伝子発現を改変させ
る影響を及ぼしうる任意の因子に応答して、アップレギュレートまたはダウンレ
ギュレートされる遺伝子を同定およびクローン化するために設計される。
【0016】 本発明の方法は、基本的な細胞機能に関与し、生物内の任意のレベルで制御さ
れる、遺伝子の同定およびクローン化への新規なアプローチを提供する。本方法
の基礎となる理論は、遺伝子発現の制御が、異なるレベル(様式)で制御するこ
とができるという知識、および異なる各制御レベルが、細胞内の特異的mRNA
の分布におけるいくらかの差により表されるという知見に基づいている。翻訳に
より制御される遺伝子ではmRNAは、不活性化型の細胞に貯蔵され、ポリソー
ムには見い出されない。適切な外部からの合図により、mRNAはポリソーム中
に組み込まれ、翻訳され、そしてコードされるタンパク質が急速に出現する。所
定の時点で「活性な」または「非活性な」mRNAを比較することにより、「シ
フト機作」と呼ばれる機作により制御される遺伝子を同定することができる。
れる、遺伝子の同定およびクローン化への新規なアプローチを提供する。本方法
の基礎となる理論は、遺伝子発現の制御が、異なるレベル(様式)で制御するこ
とができるという知識、および異なる各制御レベルが、細胞内の特異的mRNA
の分布におけるいくらかの差により表されるという知見に基づいている。翻訳に
より制御される遺伝子ではmRNAは、不活性化型の細胞に貯蔵され、ポリソー
ムには見い出されない。適切な外部からの合図により、mRNAはポリソーム中
に組み込まれ、翻訳され、そしてコードされるタンパク質が急速に出現する。所
定の時点で「活性な」または「非活性な」mRNAを比較することにより、「シ
フト機作」と呼ばれる機作により制御される遺伝子を同定することができる。
【0017】 主要な制御レベルが核から細胞質へのmRNAの能動輸送である遺伝子は、核
に貯蔵され、そして適切な合図でmRNAは細胞質に輸送される。合図の前後に
核および細胞質から単離されるmRNAの比較により、このように制御される遺
伝子が発見される。核に由来するmRNAの比較によっても、多くの遺伝子の転
写活性の直接分析が可能になる。転写で活性化される多くの遺伝子では、その基
礎転写活性が低いときでさえ、基礎レベルのmRNAが細胞内に存在する。従っ
て、増大した転写(5倍まで)は、全細胞内RNAが、遺伝子発現の示差的分析
に使用されるときにはしばしば不明確になる。核RNAを使用すると、基礎mR
NAが細胞質中に見い出されるため、多くの遺伝子の転写活性を直接測定するこ
とができる。その結果、示差的発現の検出のための感度が大きく増大する。
に貯蔵され、そして適切な合図でmRNAは細胞質に輸送される。合図の前後に
核および細胞質から単離されるmRNAの比較により、このように制御される遺
伝子が発見される。核に由来するmRNAの比較によっても、多くの遺伝子の転
写活性の直接分析が可能になる。転写で活性化される多くの遺伝子では、その基
礎転写活性が低いときでさえ、基礎レベルのmRNAが細胞内に存在する。従っ
て、増大した転写(5倍まで)は、全細胞内RNAが、遺伝子発現の示差的分析
に使用されるときにはしばしば不明確になる。核RNAを使用すると、基礎mR
NAが細胞質中に見い出されるため、多くの遺伝子の転写活性を直接測定するこ
とができる。その結果、示差的発現の検出のための感度が大きく増大する。
【0018】 mRNA安定性の制御の場合には、このようなmRNAは、合図を与える前後
に同様に転写され、その結果核mRNAプールの同様な量となることが予測され
る。しかし、合図後にmRNAが安定化されるならば、細胞質におけるその量は
より多くなる。mRNA輸送の制御の場合には、このようなmRNAは合図の前
には核内には高レベルで、そして細胞質には低レベルで存在することが予測され
るが、この状況は、合図を与えた後には逆転する。従ってこの2つの制御様式を
区別することは容易である。
に同様に転写され、その結果核mRNAプールの同様な量となることが予測され
る。しかし、合図後にmRNAが安定化されるならば、細胞質におけるその量は
より多くなる。mRNA輸送の制御の場合には、このようなmRNAは合図の前
には核内には高レベルで、そして細胞質には低レベルで存在することが予測され
るが、この状況は、合図を与えた後には逆転する。従ってこの2つの制御様式を
区別することは容易である。
【0019】 本発明の方法は、翻訳レベルで同定される遺伝子;転写レベルで制御される遺
伝子;RNA安定性により制御される遺伝子;核と細胞質との間のmRNA輸送
速度により制御される遺伝子;および示差スプライシングにより制御される遺伝
子の同定を含む。すなわち、その発現が少なくとも一部はmRNAレベルで調節
または制御される遺伝子を同定することができる。
伝子;RNA安定性により制御される遺伝子;核と細胞質との間のmRNA輸送
速度により制御される遺伝子;および示差スプライシングにより制御される遺伝
子の同定を含む。すなわち、その発現が少なくとも一部はmRNAレベルで調節
または制御される遺伝子を同定することができる。
【0020】 本方法は、分泌タンパク質および膜タンパク質をコードする遺伝子;核タンパ
ク質をコードする遺伝子;ミトコンドリアタンパク質をコードする遺伝子;およ
び細胞骨格タンパク質をコードする遺伝子を同定するであろう。さらに、その発
現がmRNAレベルで調節できる他の任意の遺伝子を、この方法により同定する
ことができる。
ク質をコードする遺伝子;ミトコンドリアタンパク質をコードする遺伝子;およ
び細胞骨格タンパク質をコードする遺伝子を同定するであろう。さらに、その発
現がmRNAレベルで調節できる他の任意の遺伝子を、この方法により同定する
ことができる。
【0021】 本明細書において使用されるとき、RNAとは、細胞培養物、培養組織、また
は刺激され、識別され、区別され、化合物に暴露された生物、病原体で感染され
たかもしくは刺激された生物から単離される細胞または組織から単離される、R
NAを意味する。本明細書において使用されるとき、翻訳とは、mRNA鋳型上
のタンパク質の合成として定義される。
は刺激され、識別され、区別され、化合物に暴露された生物、病原体で感染され
たかもしくは刺激された生物から単離される細胞または組織から単離される、R
NAを意味する。本明細書において使用されるとき、翻訳とは、mRNA鋳型上
のタンパク質の合成として定義される。
【0022】 本明細書において使用されるとき、未知の標的mRNAまたは刺激要素の翻訳
、転写、安定性または輸送の刺激は、病態および/またはストレス状態下の未変
性組織および/または細胞から誘導しうる遺伝子からのmRNA集団を、化学的
に、病理的に、物理的に、またはその他で、誘導または抑制することを含む。す
なわち、ストレス誘導性要素または「ストレッサー」による遺伝子のmRNAの
発現の刺激は、試料の細胞内に非翻訳mRNAとして貯蔵されるmRNAの翻訳
を刺激するかまたは開始する、外部合図または刺激の適用を含むことができる。
ストレッサーは、ある種のmRNAの安定性の増大を引き起こしうるか、または
核から細胞質への特異的mRNAの輸送を誘導しうる。ストレッサーはまた、遺
伝子転写を誘導してもよい。未変性細胞/組織内の遺伝子からのmRNAの翻訳
を刺激すること以外に、刺激は、病態および/またはストレス条件下の遺伝子の
誘導および/または抑制を含んでよい。本方法は、ストレス誘導性要素またはス
トレッサーにより種々の可能なレベルで制御される未知の標的遺伝子を同定する
ために、刺激またはストレッサーを利用する。
、転写、安定性または輸送の刺激は、病態および/またはストレス状態下の未変
性組織および/または細胞から誘導しうる遺伝子からのmRNA集団を、化学的
に、病理的に、物理的に、またはその他で、誘導または抑制することを含む。す
なわち、ストレス誘導性要素または「ストレッサー」による遺伝子のmRNAの
発現の刺激は、試料の細胞内に非翻訳mRNAとして貯蔵されるmRNAの翻訳
を刺激するかまたは開始する、外部合図または刺激の適用を含むことができる。
ストレッサーは、ある種のmRNAの安定性の増大を引き起こしうるか、または
核から細胞質への特異的mRNAの輸送を誘導しうる。ストレッサーはまた、遺
伝子転写を誘導してもよい。未変性細胞/組織内の遺伝子からのmRNAの翻訳
を刺激すること以外に、刺激は、病態および/またはストレス条件下の遺伝子の
誘導および/または抑制を含んでよい。本方法は、ストレス誘導性要素またはス
トレッサーにより種々の可能なレベルで制御される未知の標的遺伝子を同定する
ために、刺激またはストレッサーを利用する。
【0023】 本発明の方法は、本来別々に使用されていた以前から知られている2つのタイ
プの方法を相乗的に統合している。第1の方法は、ポリソーム、核、細胞質また
はスプライソソームから誘導されるmRNAの別々のプールへの、細胞内mRN
Aの分割である。第2の方法は、示差的表示法、レプレゼンテーショナル示差的
分析(RDA)、遺伝子発現マイクロアレイ法(GEM)、抑制サブトラクショ
ンハイブリダイゼーション法(SSH)(ディアチェンコ(Diatchenko)ら、1
996年)、およびオリゴヌクレオチドチップ法(例えば、アフィマックス・テ
クノロジーズ社(Affymax Technologies N.V.)に譲渡されたラバ(Rava)らの
米国特許第5,545,531号に例証されたチップ法およびハイセク社(Hyse
q, Inc.)のWO96/17957号特許出願に例示された直接配列決定法)の
ような示差的分析の方法による、別々のプールに見い出されるmRNA種の相対
量の同時比較を伴う。
プの方法を相乗的に統合している。第1の方法は、ポリソーム、核、細胞質また
はスプライソソームから誘導されるmRNAの別々のプールへの、細胞内mRN
Aの分割である。第2の方法は、示差的表示法、レプレゼンテーショナル示差的
分析(RDA)、遺伝子発現マイクロアレイ法(GEM)、抑制サブトラクショ
ンハイブリダイゼーション法(SSH)(ディアチェンコ(Diatchenko)ら、1
996年)、およびオリゴヌクレオチドチップ法(例えば、アフィマックス・テ
クノロジーズ社(Affymax Technologies N.V.)に譲渡されたラバ(Rava)らの
米国特許第5,545,531号に例証されたチップ法およびハイセク社(Hyse
q, Inc.)のWO96/17957号特許出願に例示された直接配列決定法)の
ような示差的分析の方法による、別々のプールに見い出されるmRNA種の相対
量の同時比較を伴う。
【0024】 簡単に述べると、サブトラクティブハイブリダイゼーションは、溶液中のハイ
ブリッド形成によるmRNAの引き算(subtraction)として定義される。2つ
のプールに共通のRNAは除去できる二本鎖を形成して、1つのプールに独特で
あるかまたはより豊富にあるRNAが濃縮される。示差的表示法は、cDNAへ
のmRNAの逆転写および変性プライマーによるPCR増幅として定義される。
2つのプールからの増幅産物の量の比較(電気泳動による)により、転写の量が
示される。RDA、GEM、SSH、SAGEは、本明細書に上記されている。
ブリッド形成によるmRNAの引き算(subtraction)として定義される。2つ
のプールに共通のRNAは除去できる二本鎖を形成して、1つのプールに独特で
あるかまたはより豊富にあるRNAが濃縮される。示差的表示法は、cDNAへ
のmRNAの逆転写および変性プライマーによるPCR増幅として定義される。
2つのプールからの増幅産物の量の比較(電気泳動による)により、転写の量が
示される。RDA、GEM、SSH、SAGEは、本明細書に上記されている。
【0025】 翻訳的に制御される遺伝子を同定するために分析すべき特定の細胞/組織は、
任意の適切な細胞および/または組織を含んでよい。樹立された細胞株または培
養物であろうと、または暴露された生物から直接単離されたものであろうと、任
意のタイプの細胞または組織を使用することができる。
任意の適切な細胞および/または組織を含んでよい。樹立された細胞株または培
養物であろうと、または暴露された生物から直接単離されたものであろうと、任
意のタイプの細胞または組織を使用することができる。
【0026】 本方法で分析される細胞/組織は、試料組織内のmRNAの翻訳を刺激するた
め、およびその発現が少なくとも一部はmRNAレベルで制御される遺伝子を同
定するために、生理学的、化学的、環境的および/または病的ストレス誘導性要
素またはストレッサーを使用して、選択的に刺激または「ストレス」をかけられ
る。刺激は、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを引き起こ
しうる。刺激後、RNAは細胞/組織から単離または抽出する。RNAの単離は
、当業者には周知の方法を利用して行うことができ、そしてこれらは、例えば、
「分子クローニング;実験室マニュアル(Molecular Cloning; A Laboratory Ma
nual)」(コールド・スプリングス・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold S
prings Harbor Laboratory Press)、コールドスプリングハーバー、ニューヨー
ク、1989年)に記載されている。細胞/組織からのRNAの単離および抽出
のための他の方法を使用することができ、これらは当業者には知るところとなろ
う。(マッハ(Mach)ら、1986年、ジェフェリーズ(Jefferies)ら、19
94年)。しかしこれらの方法の変法も公表されている。本明細書に記載される
方法は、多くの試験後に注意深く選択した。
め、およびその発現が少なくとも一部はmRNAレベルで制御される遺伝子を同
定するために、生理学的、化学的、環境的および/または病的ストレス誘導性要
素またはストレッサーを使用して、選択的に刺激または「ストレス」をかけられ
る。刺激は、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを引き起こ
しうる。刺激後、RNAは細胞/組織から単離または抽出する。RNAの単離は
、当業者には周知の方法を利用して行うことができ、そしてこれらは、例えば、
「分子クローニング;実験室マニュアル(Molecular Cloning; A Laboratory Ma
nual)」(コールド・スプリングス・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold S
prings Harbor Laboratory Press)、コールドスプリングハーバー、ニューヨー
ク、1989年)に記載されている。細胞/組織からのRNAの単離および抽出
のための他の方法を使用することができ、これらは当業者には知るところとなろ
う。(マッハ(Mach)ら、1986年、ジェフェリーズ(Jefferies)ら、19
94年)。しかしこれらの方法の変法も公表されている。本明細書に記載される
方法は、多くの試験後に注意深く選択した。
【0027】 翻訳に活発に取り込まれるmRNAおよび非翻訳のまま残るmRNAは、ショ
糖密度勾配、高性能ゲル濾過クロマトグラフィー、またはポリアクリルアミドゲ
ルマトリックス分離(オギシマ(Ogishima)ら、1984年、メナカー(Menake
r)ら、1974年、ヒラマ(Hirama)ら、1986年、メクラー(Mechler)、
1987年、およびバルーチャ(Bharucha)とマーシー(Murthy)、1992年
)上の分画のような方法を利用して分離することができ、これは、翻訳されるm
RNAはリボソームを負荷されこのため密度勾配上で、リボソームを負荷されな
い非翻訳のmRNAとは移動が異なるためである。所定の時点で翻訳において活
性なまたは非活性なmRNA集団を比較することにより、「シフト機作」により
制御される遺伝子を同定することができる。
糖密度勾配、高性能ゲル濾過クロマトグラフィー、またはポリアクリルアミドゲ
ルマトリックス分離(オギシマ(Ogishima)ら、1984年、メナカー(Menake
r)ら、1974年、ヒラマ(Hirama)ら、1986年、メクラー(Mechler)、
1987年、およびバルーチャ(Bharucha)とマーシー(Murthy)、1992年
)上の分画のような方法を利用して分離することができ、これは、翻訳されるm
RNAはリボソームを負荷されこのため密度勾配上で、リボソームを負荷されな
い非翻訳のmRNAとは移動が異なるためである。所定の時点で翻訳において活
性なまたは非活性なmRNA集団を比較することにより、「シフト機作」により
制御される遺伝子を同定することができる。
【0028】 ポリソームの分画および特異的分析は、転写または翻訳を特異的に阻害または
制御する薬物により標的細胞/組織を処理することにより促進することができる
。このような薬物の例は、それぞれアクチノマイシンDおよびシクロヘキサミド
である。
制御する薬物により標的細胞/組織を処理することにより促進することができる
。このような薬物の例は、それぞれアクチノマイシンDおよびシクロヘキサミド
である。
【0029】 分画は、ポリソームのサブ分割物を作って完了することができる。このサブ分
割物は、当該分野において既知の方法(メクラー(Mechler)、1987年)に
より、全ポリリボソームまたは膜結合リボソームを区別するために作成すること
ができる。さらに、mRNA試料は、以下のサブセグメントまたは画分の1つま
たはそれ以上(細胞質、核、ポリリボソーム、サブポリリボソーム、ミクロソー
ムまたは粗面小胞体、ミトコンドリアおよびスプライソソームに結合したmRN
A)に、当該分野で公知の方法により追加的に分画することができる(表1も参
照のこと)。
割物は、当該分野において既知の方法(メクラー(Mechler)、1987年)に
より、全ポリリボソームまたは膜結合リボソームを区別するために作成すること
ができる。さらに、mRNA試料は、以下のサブセグメントまたは画分の1つま
たはそれ以上(細胞質、核、ポリリボソーム、サブポリリボソーム、ミクロソー
ムまたは粗面小胞体、ミトコンドリアおよびスプライソソームに結合したmRN
A)に、当該分野で公知の方法により追加的に分画することができる(表1も参
照のこと)。
【0030】 さらに詳しくは、核画分は、実験セクションに記載されるように「豊富な核内
リボ核タンパク質型のCAD RNA(Abundant Nuclear Ribonucleoprotein F
orm of CAD RNA)」と題した論文(スパーリング(Sperling)、1984年)に
記載の方法を使用して入手することができ、このためストレス状態に制御される
かまたは応答性である遺伝子を同定する方法のために、核RNAを利用すること
ができる。さらに、特異的病態またはストレス状態に応答性である遺伝子を同定
する方法として、アンチセンスRNAを利用することができる。アンチセンスR
NAは、ディミトリジェビック(Dimitrijevic)に記載の方法(この要約は、試
料からアンチセンスRNAを入手および単離するために使用される方法を詳述し
ている)を使用して単離することができる。さらに、ミクロソーム画分は、ウォ
ルター(Walter)とブローベル(Blobel)により1983年に開示された方法の
変法である実験セクションに記載された本発明の方法を使用して入手することが
できる。
リボ核タンパク質型のCAD RNA(Abundant Nuclear Ribonucleoprotein F
orm of CAD RNA)」と題した論文(スパーリング(Sperling)、1984年)に
記載の方法を使用して入手することができ、このためストレス状態に制御される
かまたは応答性である遺伝子を同定する方法のために、核RNAを利用すること
ができる。さらに、特異的病態またはストレス状態に応答性である遺伝子を同定
する方法として、アンチセンスRNAを利用することができる。アンチセンスR
NAは、ディミトリジェビック(Dimitrijevic)に記載の方法(この要約は、試
料からアンチセンスRNAを入手および単離するために使用される方法を詳述し
ている)を使用して単離することができる。さらに、ミクロソーム画分は、ウォ
ルター(Walter)とブローベル(Blobel)により1983年に開示された方法の
変法である実験セクションに記載された本発明の方法を使用して入手することが
できる。
【0031】 全mRNA集団を別々のmRNAの発現制御およびタンパク質局在プールへ単
離および分割後、これらのプールに存在する多くのmRNA種の相対量は、示差
的表示法、オリゴヌクレオチドチップ法、レプレゼンテーショナル示差的分析(
RDA)、GEM−遺伝子発現マイクロアレイ法(スケーナ(Schena)ら、19
95年、アイエロ(Aiello)ら、1994年、シェン(Shen)ら、1995年、
バウアー(Bauer)ら、1993年、リャン(Liang)とパーディー(Pardee)、
1992年、リャン(Liang)とパーディー(Pardee)、1995年、リャン(L
iang)ら、1993年、ブラウン(Braun)ら、1995年、ヒューバンク(Hub
ank)とシャッツ(Schatz)、1994年)および抑制サブトラクションハイブ
リダイゼーション法(SSH)のような、示差的分析法を使用して同時に比較さ
れる。画分から単離されるRNAは、ポリA選択により、さらにリボソームRN
Aを含まないmRNAまで精製することができる。この方法を利用すると複数の
プールを分析することができることに注目されたい。すなわち、異なるストレッ
サーに付される異なる細胞アリコートは、相互に、さらには参照試料と比較する
ことができる。
離および分割後、これらのプールに存在する多くのmRNA種の相対量は、示差
的表示法、オリゴヌクレオチドチップ法、レプレゼンテーショナル示差的分析(
RDA)、GEM−遺伝子発現マイクロアレイ法(スケーナ(Schena)ら、19
95年、アイエロ(Aiello)ら、1994年、シェン(Shen)ら、1995年、
バウアー(Bauer)ら、1993年、リャン(Liang)とパーディー(Pardee)、
1992年、リャン(Liang)とパーディー(Pardee)、1995年、リャン(L
iang)ら、1993年、ブラウン(Braun)ら、1995年、ヒューバンク(Hub
ank)とシャッツ(Schatz)、1994年)および抑制サブトラクションハイブ
リダイゼーション法(SSH)のような、示差的分析法を使用して同時に比較さ
れる。画分から単離されるRNAは、ポリA選択により、さらにリボソームRN
Aを含まないmRNAまで精製することができる。この方法を利用すると複数の
プールを分析することができることに注目されたい。すなわち、異なるストレッ
サーに付される異なる細胞アリコートは、相互に、さらには参照試料と比較する
ことができる。
【0032】 ポリソーム、非ポリソーム、mRNP、核、細胞質、またはスプライソソーム
画分から得られるRNAから作成される標識核酸プローブ(cDNA、PCR産
物またはcDNAから転写されたrRNA中)は、(GEM)のような固相マト
リックス様マイクロアレイ上(ラバ(Rava)らの米国特許第5,545,531
号およびハイセク社(Hyseq, Inc.)のWO96/17957号に記載)、およ
びクローンが電気泳動後ブロットされるかまたは直接膜上に載せられる(ドット
ブロット)任意の種類の膜上に固定される、cDNA、ゲノムクローン、および
mRNA種のクローンを同定するために、プローブとして使用することができる
。標識は、放射活性、蛍光、またはジゴキシゲニンおよびビオチンのような修飾
塩基の組み込みであってよい。
画分から得られるRNAから作成される標識核酸プローブ(cDNA、PCR産
物またはcDNAから転写されたrRNA中)は、(GEM)のような固相マト
リックス様マイクロアレイ上(ラバ(Rava)らの米国特許第5,545,531
号およびハイセク社(Hyseq, Inc.)のWO96/17957号に記載)、およ
びクローンが電気泳動後ブロットされるかまたは直接膜上に載せられる(ドット
ブロット)任意の種類の膜上に固定される、cDNA、ゲノムクローン、および
mRNA種のクローンを同定するために、プローブとして使用することができる
。標識は、放射活性、蛍光、またはジゴキシゲニンおよびビオチンのような修飾
塩基の組み込みであってよい。
【0033】 ポリソームまたはポリリボソーム画分から得られる画分または他の画分と、全
未分画物質との比較は、翻訳それ自体の調節に由来するものから転写制御の結果
である発現レベルにおける差を区別することに必須である。ポリソーム画分また
は画分群は、膜結合ポリソーム、緩いまたは堅いポリソーム、または遊離の未結
合ポリソーム群を含んでよい。
未分画物質との比較は、翻訳それ自体の調節に由来するものから転写制御の結果
である発現レベルにおける差を区別することに必須である。ポリソーム画分また
は画分群は、膜結合ポリソーム、緩いまたは堅いポリソーム、または遊離の未結
合ポリソーム群を含んでよい。
【0034】 (翻訳的に)示差的に発現される遺伝子を同定するためにポリソームのサブ集
団を利用することの重要性は、例1に示されるが、ここで多くの遺伝子は、全m
RNAを検出プローブとして使用したときには熱ショック誘導下で翻訳的に発現
されるものとして検出されなかったが、しかしポリソームmRNAをプローブと
して使用したときには、多くの遺伝子は、示差的に発現されるものとして同定さ
れた。例1に示すように、全mRNA由来プローブによる熱ショック誘導下の多
くの遺伝子は、ポリソームmRNA画分でプローブ探索すると検出された。虚血
性疾患のような急性疾患のモデルである熱ショックは、ポリソームプローブの重
要性を明らかにする。細胞は、急性の状況で決定的に重要なmRNAを迅速にポ
リソームに載せて(転写によるこれらの産生を待つ必要なく)、翻訳して細胞が
ストレス下で生き抜くために必要とするタンパク質が産生されるように、これら
の決定的に重要なmRNAを不活性化型で貯蔵している。
団を利用することの重要性は、例1に示されるが、ここで多くの遺伝子は、全m
RNAを検出プローブとして使用したときには熱ショック誘導下で翻訳的に発現
されるものとして検出されなかったが、しかしポリソームmRNAをプローブと
して使用したときには、多くの遺伝子は、示差的に発現されるものとして同定さ
れた。例1に示すように、全mRNA由来プローブによる熱ショック誘導下の多
くの遺伝子は、ポリソームmRNA画分でプローブ探索すると検出された。虚血
性疾患のような急性疾患のモデルである熱ショックは、ポリソームプローブの重
要性を明らかにする。細胞は、急性の状況で決定的に重要なmRNAを迅速にポ
リソームに載せて(転写によるこれらの産生を待つ必要なく)、翻訳して細胞が
ストレス下で生き抜くために必要とするタンパク質が産生されるように、これら
の決定的に重要なmRNAを不活性化型で貯蔵している。
【0035】 翻訳的に制御される遺伝子を同定するための本方法は、mRNAプールの起源
によって限定されない。従って、本方法は、「シフト機作」により制御される、
病的および/またはストレス状態下の未変性細胞/組織からの遺伝子、さらには
病的および/またはストレス状態下で誘導/抑制される遺伝子をクローン化する
ために利用することができる。病態とは、病原体および外傷により引き起こされ
る疾患を含めた疾患状態を含んでよい。ストレス状態はまた、疾患状態、物理的
および心理学的外傷、および環境的ストレスを含んでよい。示差的分析の選択さ
れる方法による分析後、翻訳により制御されるものとして同定された遺伝子は、
当業者に公知の任意の適切なクローニング法によりクローン化することができる
。(リシツィン(Lisitsyn)とウィグラー(Wigler)、1993年)。
によって限定されない。従って、本方法は、「シフト機作」により制御される、
病的および/またはストレス状態下の未変性細胞/組織からの遺伝子、さらには
病的および/またはストレス状態下で誘導/抑制される遺伝子をクローン化する
ために利用することができる。病態とは、病原体および外傷により引き起こされ
る疾患を含めた疾患状態を含んでよい。ストレス状態はまた、疾患状態、物理的
および心理学的外傷、および環境的ストレスを含んでよい。示差的分析の選択さ
れる方法による分析後、翻訳により制御されるものとして同定された遺伝子は、
当業者に公知の任意の適切なクローニング法によりクローン化することができる
。(リシツィン(Lisitsyn)とウィグラー(Wigler)、1993年)。
【0036】 示差的比較は、ポリソーム対非ポリソームRNAの全ての可能な組合せについ
て、行うことができ、ここで画分の型の定義は、例えば、254nmでの吸光度プ
ロフィール、図1Aに示すようなショ糖勾配の密度(または高圧液体クロマトグ
ラフィーもしくはゲルシステムが使用されるならば、別のサイズ標準)および図
1Bに示すような、アガロースゲル上の画分の電気泳動後に臭化エチジウムで染
色されるRNAの型により行われる。図1Aでは、ポリソーム画分は、2個を超
えるリボソームが載ったmRNAを有する画分である。この比較のための材料と
方法は、以下の実験セクションに記載する。
て、行うことができ、ここで画分の型の定義は、例えば、254nmでの吸光度プ
ロフィール、図1Aに示すようなショ糖勾配の密度(または高圧液体クロマトグ
ラフィーもしくはゲルシステムが使用されるならば、別のサイズ標準)および図
1Bに示すような、アガロースゲル上の画分の電気泳動後に臭化エチジウムで染
色されるRNAの型により行われる。図1Aでは、ポリソーム画分は、2個を超
えるリボソームが載ったmRNAを有する画分である。この比較のための材料と
方法は、以下の実験セクションに記載する。
【0037】 示差的比較はまた、各状態でのポリソーム対非ポリソーム画分を含んでよい。
「状態」とは、異なる処理を受けるか、または異なる特徴を有するようにもしく
は異なるセットの遺伝子を発現するように修飾されている、細胞株、初代細胞、
または組織のような同じ起源の細胞を意味する。例えば、これは、分化、形質転
換、酸素欠乏、化学的処理、または放射線の適用により達成することができる。
組合せは、例えば、 1.個々の状態(同じ密度で移動する)の間の、または1つのプール中のポリ
ソーム画分; 2.個々の状態(同じ密度で移動する)の間の、または1つのプール中の非ポ
リソーム画分; 3.状態間および各状態内(同じ密度で移動する)の、または1つのプール中
の非ポリソーム画分;および 4.未分画の全RNAに比較することができる個々にポリソームおよび非ポリ
ソームである画分のそれぞれ(同じ密度で移動する)、または1つのプール中の
画分、を含んでよい。
「状態」とは、異なる処理を受けるか、または異なる特徴を有するようにもしく
は異なるセットの遺伝子を発現するように修飾されている、細胞株、初代細胞、
または組織のような同じ起源の細胞を意味する。例えば、これは、分化、形質転
換、酸素欠乏、化学的処理、または放射線の適用により達成することができる。
組合せは、例えば、 1.個々の状態(同じ密度で移動する)の間の、または1つのプール中のポリ
ソーム画分; 2.個々の状態(同じ密度で移動する)の間の、または1つのプール中の非ポ
リソーム画分; 3.状態間および各状態内(同じ密度で移動する)の、または1つのプール中
の非ポリソーム画分;および 4.未分画の全RNAに比較することができる個々にポリソームおよび非ポリ
ソームである画分のそれぞれ(同じ密度で移動する)、または1つのプール中の
画分、を含んでよい。
【0038】 翻訳レベルで制御される遺伝子の同定のための上記の方法には、多くの応用が
ある。この方法の具体的な応用としては、生理学的または病的変化に関連した細
胞/組織内のmRNA発現パターンの変化を検出するためのその使用がある。翻
訳mRNAと非翻訳mRNAを比較することにより、細胞/組織内のmRNA発
現パターンの変化に及ぼす生理学的または病的合図またはストレスの影響を、観
察および/または検出することができる。この方法を使用して、多くの合図、刺
激、またはストレッサーの作用を研究して、細胞/組織の種々の生理学的および
病的活動に対する影響または寄与を確認することができる。特に、本方法は、薬
物または化合物の投与の前後の組織のmRNAパターンを比較することにより、
個体への薬剤(薬物)または他の化合物の投与の結果を分析するために使用する
ことができる。この分析によって、翻訳制御のレベルで細胞/組織に影響を及ぼ
す薬物、化合物、または他の刺激の同定が可能になる。この方法を利用して、特
定のmRNA種が、特定の生理学的または疾患状態に関係しているかどうかを確
認すること、および特に外部刺激すなわち薬物が、翻訳レベルで制御される遺伝
子に影響を及ぼす特異的細胞/組織を確認することが可能である。
ある。この方法の具体的な応用としては、生理学的または病的変化に関連した細
胞/組織内のmRNA発現パターンの変化を検出するためのその使用がある。翻
訳mRNAと非翻訳mRNAを比較することにより、細胞/組織内のmRNA発
現パターンの変化に及ぼす生理学的または病的合図またはストレスの影響を、観
察および/または検出することができる。この方法を使用して、多くの合図、刺
激、またはストレッサーの作用を研究して、細胞/組織の種々の生理学的および
病的活動に対する影響または寄与を確認することができる。特に、本方法は、薬
物または化合物の投与の前後の組織のmRNAパターンを比較することにより、
個体への薬剤(薬物)または他の化合物の投与の結果を分析するために使用する
ことができる。この分析によって、翻訳制御のレベルで細胞/組織に影響を及ぼ
す薬物、化合物、または他の刺激の同定が可能になる。この方法を利用して、特
定のmRNA種が、特定の生理学的または疾患状態に関係しているかどうかを確
認すること、および特に外部刺激すなわち薬物が、翻訳レベルで制御される遺伝
子に影響を及ぼす特異的細胞/組織を確認することが可能である。
【0039】 翻訳レベルで制御される遺伝子のサブグループの同定は、細胞内の5’キャッ
プ依存性mRNA翻訳を阻害する一般的工程、細胞からmRNAのプールを回収
する一般的工程、および内部リボゾーム侵入部位をコードする配列を含む遺伝子
を同定するためにmRNAのプールを示差的分析する一般的工程を含む、内部リ
ボゾーム侵入部位(IRES)をコードする遺伝子配列を同定するための方法を
伴う。
プ依存性mRNA翻訳を阻害する一般的工程、細胞からmRNAのプールを回収
する一般的工程、および内部リボゾーム侵入部位をコードする配列を含む遺伝子
を同定するためにmRNAのプールを示差的分析する一般的工程を含む、内部リ
ボゾーム侵入部位(IRES)をコードする遺伝子配列を同定するための方法を
伴う。
【0040】 上記のように、標準的5’キャップ依存性翻訳開始の例外が存在することが知
られている。内部リボゾーム侵入部位(IRES)として知られている特異的配
列の存在を含有することができる配列が、RNAの非翻訳領域(UTR)内に存
在する(エーレンフェルド(Ehrenfeld)、1996年)。これらの内部リボゾ
ーム侵入部位は、上記のように少数の原核生物および真核生物システムのための
翻訳開始を支持することが証明されている。しかし5’キャップ非依存性翻訳機
作およびこれらの正常および異常プロセスの両方への結合を介して、翻訳的に制
御される遺伝子を同定するためには、5’キャップ非依存性mRNA翻訳を選択
することができるように、5’キャップ開始翻訳を阻害することが必要である。
IRES配列は、配列相同性により同定することが不可能ではないが困難なため
、この阻害は必要である。
られている。内部リボゾーム侵入部位(IRES)として知られている特異的配
列の存在を含有することができる配列が、RNAの非翻訳領域(UTR)内に存
在する(エーレンフェルド(Ehrenfeld)、1996年)。これらの内部リボゾ
ーム侵入部位は、上記のように少数の原核生物および真核生物システムのための
翻訳開始を支持することが証明されている。しかし5’キャップ非依存性翻訳機
作およびこれらの正常および異常プロセスの両方への結合を介して、翻訳的に制
御される遺伝子を同定するためには、5’キャップ非依存性mRNA翻訳を選択
することができるように、5’キャップ開始翻訳を阻害することが必要である。
IRES配列は、配列相同性により同定することが不可能ではないが困難なため
、この阻害は必要である。
【0041】 5’キャップ依存性翻訳を阻害するために、従って5’キャップ非依存性翻訳
の存在を選択するために、内部リボゾーム侵入部位の存在に関して分析すべき細
胞または組織は、5’キャップ構造翻訳開始機作を防止または邪魔するためのい
くつかの方法で処理する必要がある。本質的に翻訳平衡をIRES開始翻訳にシ
フトさせるために、標準的な走査型翻訳開始の機作は、完全ではなくても実質的
に止めるかまたは閉じるべきである。すなわち、5’キャップ構造の認識は、5
’キャップ介在性開始の正常な機作を破壊させることにより阻害される。5’キ
ャップ翻訳を阻害する機作は、5’キャップ介在性の翻訳開始を防止するための
任意の既知の手段または機作を含んでよい。5’キャップ介在性翻訳を阻害する
ためのこのような機作の1つは、IRES配列の存在に関して分析すべき細胞、
細胞系、または組織へのポリオウイルス2Aプロテアーゼの発現である。ポリオ
ウイルス2Aプロテアーゼの使用は、細胞内5’キャップ依存性翻訳機構を不活
性化することにより、5’キャップ依存性mRNA翻訳を阻害する。これによっ
て、遺伝子の活性化の前に、翻訳的に制御されかつ熱ショック、低酸素、または
上記の他のストレス誘導要素のようなストレス誘導要素/ストレッサーの適用後
の、細胞の即時的応答において決定的に重要な役割を果たす遺伝子を含有する細
胞内IRESの同定が可能になる。ポリオウイルス2Aプロテアーゼは、mRN
A 5’キャップの認識に関与する真核生物翻訳開始因子4(eIF−4)の大
サブユニットのeIF−4γ(p220)を切断することにより、5’キャップ
介在性翻訳を妨害する。
の存在を選択するために、内部リボゾーム侵入部位の存在に関して分析すべき細
胞または組織は、5’キャップ構造翻訳開始機作を防止または邪魔するためのい
くつかの方法で処理する必要がある。本質的に翻訳平衡をIRES開始翻訳にシ
フトさせるために、標準的な走査型翻訳開始の機作は、完全ではなくても実質的
に止めるかまたは閉じるべきである。すなわち、5’キャップ構造の認識は、5
’キャップ介在性開始の正常な機作を破壊させることにより阻害される。5’キ
ャップ翻訳を阻害する機作は、5’キャップ介在性の翻訳開始を防止するための
任意の既知の手段または機作を含んでよい。5’キャップ介在性翻訳を阻害する
ためのこのような機作の1つは、IRES配列の存在に関して分析すべき細胞、
細胞系、または組織へのポリオウイルス2Aプロテアーゼの発現である。ポリオ
ウイルス2Aプロテアーゼの使用は、細胞内5’キャップ依存性翻訳機構を不活
性化することにより、5’キャップ依存性mRNA翻訳を阻害する。これによっ
て、遺伝子の活性化の前に、翻訳的に制御されかつ熱ショック、低酸素、または
上記の他のストレス誘導要素のようなストレス誘導要素/ストレッサーの適用後
の、細胞の即時的応答において決定的に重要な役割を果たす遺伝子を含有する細
胞内IRESの同定が可能になる。ポリオウイルス2Aプロテアーゼは、mRN
A 5’キャップの認識に関与する真核生物翻訳開始因子4(eIF−4)の大
サブユニットのeIF−4γ(p220)を切断することにより、5’キャップ
介在性翻訳を妨害する。
【0042】 5’キャップ介在性の翻訳を阻害するために、ポリオウイルス2Aプロテアー
ゼは、内部リボゾーム侵入部位をコードする遺伝子配列の存在についておよび/
または翻訳的に制御される遺伝子を同定について分析される細胞に、組み込む必
要がある。細胞中にポリオウイルス2Aプロテアーゼを組み込むためのこのよう
な1つの方法は、ポリオウイルス2Aプロテアーゼをコードする遺伝子を含有す
る発現ベクターにより、標的細胞の形質転換を行う。ポリオウイルス2Aプロテ
アーゼは、それが構成性に発現されるとき生きた細胞にとって有害であるため、
ポリオウイルス2Aプロテアーゼ遺伝子を含有する発現ベクターは、LacIリ
プレッサーがCMVプロモーターの下で構成性に発現される細菌のLacI誘導
性システムと結合させる。ポリオウイルス2Aプロテアーゼは、その3’末端が
LacIリプレッサー結合部位に結合したRSV、TK、またはミニTKプロモ
ーターを含む多くの適切なプロモーターの下で発現しうる。LacIリプレッサ
ーを含有する発現ベクターおよびポリオウイルス2A発現ベクターで標的細胞を
形質転換することにより、ポリオウイルス2Aプロテアーゼの発現は、イソプロ
ピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)により細胞を処理すること
で誘導しうる。IPTGによる標的細胞の処理は、リプレッサー結合部位で結合
したLacIリプレッサー分子の結合を解消して、そのためポリオウイルス2A
プロテアーゼの転写を可能にする。ポリオウイルス2Aプロテアーゼの発現を、
LacIシステムのような誘導性システムに結合させることによって、この機作
は、ポリオウイルス2Aプロテアーゼをコードする遺伝子の発現制御の確立を可
能にする。
ゼは、内部リボゾーム侵入部位をコードする遺伝子配列の存在についておよび/
または翻訳的に制御される遺伝子を同定について分析される細胞に、組み込む必
要がある。細胞中にポリオウイルス2Aプロテアーゼを組み込むためのこのよう
な1つの方法は、ポリオウイルス2Aプロテアーゼをコードする遺伝子を含有す
る発現ベクターにより、標的細胞の形質転換を行う。ポリオウイルス2Aプロテ
アーゼは、それが構成性に発現されるとき生きた細胞にとって有害であるため、
ポリオウイルス2Aプロテアーゼ遺伝子を含有する発現ベクターは、LacIリ
プレッサーがCMVプロモーターの下で構成性に発現される細菌のLacI誘導
性システムと結合させる。ポリオウイルス2Aプロテアーゼは、その3’末端が
LacIリプレッサー結合部位に結合したRSV、TK、またはミニTKプロモ
ーターを含む多くの適切なプロモーターの下で発現しうる。LacIリプレッサ
ーを含有する発現ベクターおよびポリオウイルス2A発現ベクターで標的細胞を
形質転換することにより、ポリオウイルス2Aプロテアーゼの発現は、イソプロ
ピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)により細胞を処理すること
で誘導しうる。IPTGによる標的細胞の処理は、リプレッサー結合部位で結合
したLacIリプレッサー分子の結合を解消して、そのためポリオウイルス2A
プロテアーゼの転写を可能にする。ポリオウイルス2Aプロテアーゼの発現を、
LacIシステムのような誘導性システムに結合させることによって、この機作
は、ポリオウイルス2Aプロテアーゼをコードする遺伝子の発現制御の確立を可
能にする。
【0043】 標的細胞中でポリオウイルス2Aプロテアーゼの発現を誘導後、おそらく内部
リボゾーム侵入部位を含有するRNAは回収して、上記の方法を利用して分析し
て、その翻訳がポリオウイルス2Aプロテアーゼの作用によりアップレギュレー
トされる遺伝子を同定することができる。
リボゾーム侵入部位を含有するRNAは回収して、上記の方法を利用して分析し
て、その翻訳がポリオウイルス2Aプロテアーゼの作用によりアップレギュレー
トされる遺伝子を同定することができる。
【0044】 (実験)示差的翻訳 材料と方法 一般的スキーム a.もとの組織または細胞からの全てのRNAの全mRNA有機抽出。(ポリA
+mRNAについての追加の選択を含めてもよい)。 b.核RNA − 低張性緩衝液中のホモジナイズによる(組織または細胞株か
らの)細胞の溶解。遠心分離による核の回収およびRNAの有機抽出。 c.細胞質RNA − 上記bの上清からのRNAの有機抽出。 d.ポリリボソーム/サブポリリボソーム分画。低張性緩衝液中のホモジナイズ
による細胞の溶解、核の除去および線形ショ糖勾配でのポリリボソームの分画お
よび勾配の各画分からのRNAの有機抽出。 e.分泌された、膜をコードする転写物。 1.(細胞のホモジナイズ後)パーコール(Percol)勾配上のRERの単離。 2.RERを含有するミクロソームの調製 3.洗浄剤を用いる細胞の連続処理による膜結合ポリリボソームの単離。 f.核タンパク質。異なる洗浄剤で細胞溶解物を処理することによる細胞骨格結
合ポリリボソームの単離。 g.ミトコンドリア遺伝子。パーコール(Percoll)勾配上のミトコンドリアの
単離。 h.代替スプライシング。核の分離および線形ショ糖勾配上のスプライソソーム
(タンパク質とRNAの複合体)の単離。
+mRNAについての追加の選択を含めてもよい)。 b.核RNA − 低張性緩衝液中のホモジナイズによる(組織または細胞株か
らの)細胞の溶解。遠心分離による核の回収およびRNAの有機抽出。 c.細胞質RNA − 上記bの上清からのRNAの有機抽出。 d.ポリリボソーム/サブポリリボソーム分画。低張性緩衝液中のホモジナイズ
による細胞の溶解、核の除去および線形ショ糖勾配でのポリリボソームの分画お
よび勾配の各画分からのRNAの有機抽出。 e.分泌された、膜をコードする転写物。 1.(細胞のホモジナイズ後)パーコール(Percol)勾配上のRERの単離。 2.RERを含有するミクロソームの調製 3.洗浄剤を用いる細胞の連続処理による膜結合ポリリボソームの単離。 f.核タンパク質。異なる洗浄剤で細胞溶解物を処理することによる細胞骨格結
合ポリリボソームの単離。 g.ミトコンドリア遺伝子。パーコール(Percoll)勾配上のミトコンドリアの
単離。 h.代替スプライシング。核の分離および線形ショ糖勾配上のスプライソソーム
(タンパク質とRNAの複合体)の単離。
【0045】細胞抽出物の調製 細胞を遠心分離した。ペレットは、PBSで洗浄して再遠心分離した。細胞を
、低張性溶解緩衝液(HLB:20mMトリスHCl pH=7.4;10mM N
aCl;3mM MgCl2)で4×1充填赤血球量(PCV)に再懸濁した。細
胞を氷上で5分間インキュベートした。1.2%トリトンX−100および0.
2Mショ糖を含有する1×PCVのHLBを加えた。細胞は、ダンス型(Dounce
)ホモジェナイザー(B乳棒で5ストローク)でホモジナイズした。細胞溶解物
は、2300gで4℃で10分間遠心分離した。上清は、新しいチューブに移し
た。10mg/mlヘパリンを含有するHLBを、1mg/mlヘパリンの最終濃度まで加
えた。NaClを0.15Mの最終濃度まで加えた。上清を、液体N2中で急速
に凍結後、−70℃で凍結させるかまたは即座に使用した。
、低張性溶解緩衝液(HLB:20mMトリスHCl pH=7.4;10mM N
aCl;3mM MgCl2)で4×1充填赤血球量(PCV)に再懸濁した。細
胞を氷上で5分間インキュベートした。1.2%トリトンX−100および0.
2Mショ糖を含有する1×PCVのHLBを加えた。細胞は、ダンス型(Dounce
)ホモジェナイザー(B乳棒で5ストローク)でホモジナイズした。細胞溶解物
は、2300gで4℃で10分間遠心分離した。上清は、新しいチューブに移し
た。10mg/mlヘパリンを含有するHLBを、1mg/mlヘパリンの最終濃度まで加
えた。NaClを0.15Mの最終濃度まで加えた。上清を、液体N2中で急速
に凍結後、−70℃で凍結させるかまたは即座に使用した。
【0046】ショ糖勾配分画 HLB中の0.5M〜1.5Mショ糖の線形ショ糖勾配を調製した。ポリアロ
マーチューブ(14×89mm)を使用した。0.5〜1.0mlの細胞抽出物を勾
配に載せた。細胞は、36,000RPMで4℃で110分間遠心分離した。IS
CO密度分画機(ISCO Density Fractionator)を使用して画分を回収し、吸光
度プロフィールを記録した。
マーチューブ(14×89mm)を使用した。0.5〜1.0mlの細胞抽出物を勾
配に載せた。細胞は、36,000RPMで4℃で110分間遠心分離した。IS
CO密度分画機(ISCO Density Fractionator)を使用して画分を回収し、吸光
度プロフィールを記録した。
【0047】RNA精製 SDSは0.5%まで、そしてプロテイナーゼKは0.1mg/mlまで加え、3
7℃で30分間インキュベートした。等容量のフェノール+クロロホルム(1:
1)で抽出する。水相は、1容量のクロロホルムで抽出して、酢酸ナトリウムを
0.3Mまでそして2.5容量のエタノールを加え、−20℃で一晩インキュベ
ートしてRNAを沈殿させた。10分間遠心分離して、上清を吸引して、RNA
ペレットを無菌ピロ炭酸ジエチル(本明細書で以降「DEPC」と呼ぶ)DEP
C処理水に溶解した。
7℃で30分間インキュベートした。等容量のフェノール+クロロホルム(1:
1)で抽出する。水相は、1容量のクロロホルムで抽出して、酢酸ナトリウムを
0.3Mまでそして2.5容量のエタノールを加え、−20℃で一晩インキュベ
ートしてRNAを沈殿させた。10分間遠心分離して、上清を吸引して、RNA
ペレットを無菌ピロ炭酸ジエチル(本明細書で以降「DEPC」と呼ぶ)DEP
C処理水に溶解した。
【0048】ミクロソームの調製 可能であれば、凍結することなく新鮮な組織および細胞を使用する。組織を液
体窒素中で乳鉢と乳棒で粉砕して、次に4mlの緩衝液A/1g組織(緩衝液Aは
、250mMショ糖、50mM TEA、50mM KOAc pH7.5、6mM M
g(Oac)2、1mM EDTA、1mM DTT、0.5mM PMSFである。
PMSFは、緩衝液を作成する前にエタノール中で作成し、撹拌しながら緩衝液
に滴下して加えた。これを15分間撹拌して次にDTTを加えた)を使用してホ
モジナイズした。新鮮な臓器を緩衝液Aで数回洗浄し、次に小片に切ってホモジ
ナイズした。約5ml緩衝液A/5×108細胞を加えてホモジナイズした。次に
これを氷上で5〜10回、または必要に応じて個々の組織と共にホモジナイズし
た。混合物を50mlチューブに移し、次にスインギングバケットローターマシー
ン(swinging bucket rotor machine)中で4℃で10分間遠心分離した。次に
上清を、できるだけペレットを避けてソーバル(Sorvall)チューブに移して、
ペレットを再度1ml緩衝液で洗浄して前回同様遠心分離した。2つのペレットを
合わせ、核画分を確立した。この組合せたものを溶解して、ペレットをトリ試薬
(Tri-reagent)(試料が細胞由来であるとき通常2mlのトリ試薬)で処理して
核RNAを抽出した。合わせた第1および第2の上清を10000gで4℃で1
0分間遠心分離した。再度、上清をチューブに移して氷上で保持した。ペレット
を再度1ml緩衝液で洗浄し、10000gで10分間遠心分離して、2つのペレ
ットを前回同様合わせて、ミトコンドリアペレットを確立した。再度、ペレット
をトリ試薬(細胞では通常1ml)で処理して、ミトコンドリアRNAを抽出した
。次に、緩衝液A+1.3Mショ糖から作られたショ糖クッションを含有する冷
超遠心チューブを調製した。クッションの容量は、上清の約1/3とした。上清
をクッション上に1:3のクッション対上清比で載せた。1対のチューブを、T
i60.2ローター(45,000rpm)により140,000g、4℃で2.
5時間遠心分離した。上清の2相が見えたとき、赤色相だけを(可能であれば)
、細胞質画分としてソーバル(sorvall)チューブに移した。清澄な上清を吸引
した。分離することができないか、または相の相違が目に見えないときには、全
ての上清を細胞質画分としてとって、ショ糖をTE(10mMトリス−HCl p
H8.0、1mM EDTA)で希釈した。ペレットには、目に見えかつ清澄であ
るかまたは帯黄色であるミクロソームが入っていた。RNA抽出のために、細胞
質画分を1% SDS、0.1mg/mlプロテイナーゼKで37℃で30分間処理
した。この後、−80℃での凍結が可能であった。RNAは、フェノール:クロ
ロホルムの組合せで抽出して、0.3M Naアセテート、1μlグリコーゲン
、および等容量のイソプロパノールで沈殿させた。O’N沈殿が可能であり、氷
上で30分で達成できる。抽出物を10000gで20分間遠心分離し、次にR
NAペレットを70%エタノールで洗浄した。ペレットを乾燥し、次にH2Oに
溶解した。次にこのミクロソームを0.1M NaCl/1% SDS溶液(小
さいペレットには1mlで通常充分である)で溶解して、フェノール:クロロホル
ムの組合せ(プロテイナーゼK処理をしない)で抽出した。次にRNAの沈殿は
、塩を加える必要がない他は、細胞質画分の場合と同様に行った。
体窒素中で乳鉢と乳棒で粉砕して、次に4mlの緩衝液A/1g組織(緩衝液Aは
、250mMショ糖、50mM TEA、50mM KOAc pH7.5、6mM M
g(Oac)2、1mM EDTA、1mM DTT、0.5mM PMSFである。
PMSFは、緩衝液を作成する前にエタノール中で作成し、撹拌しながら緩衝液
に滴下して加えた。これを15分間撹拌して次にDTTを加えた)を使用してホ
モジナイズした。新鮮な臓器を緩衝液Aで数回洗浄し、次に小片に切ってホモジ
ナイズした。約5ml緩衝液A/5×108細胞を加えてホモジナイズした。次に
これを氷上で5〜10回、または必要に応じて個々の組織と共にホモジナイズし
た。混合物を50mlチューブに移し、次にスインギングバケットローターマシー
ン(swinging bucket rotor machine)中で4℃で10分間遠心分離した。次に
上清を、できるだけペレットを避けてソーバル(Sorvall)チューブに移して、
ペレットを再度1ml緩衝液で洗浄して前回同様遠心分離した。2つのペレットを
合わせ、核画分を確立した。この組合せたものを溶解して、ペレットをトリ試薬
(Tri-reagent)(試料が細胞由来であるとき通常2mlのトリ試薬)で処理して
核RNAを抽出した。合わせた第1および第2の上清を10000gで4℃で1
0分間遠心分離した。再度、上清をチューブに移して氷上で保持した。ペレット
を再度1ml緩衝液で洗浄し、10000gで10分間遠心分離して、2つのペレ
ットを前回同様合わせて、ミトコンドリアペレットを確立した。再度、ペレット
をトリ試薬(細胞では通常1ml)で処理して、ミトコンドリアRNAを抽出した
。次に、緩衝液A+1.3Mショ糖から作られたショ糖クッションを含有する冷
超遠心チューブを調製した。クッションの容量は、上清の約1/3とした。上清
をクッション上に1:3のクッション対上清比で載せた。1対のチューブを、T
i60.2ローター(45,000rpm)により140,000g、4℃で2.
5時間遠心分離した。上清の2相が見えたとき、赤色相だけを(可能であれば)
、細胞質画分としてソーバル(sorvall)チューブに移した。清澄な上清を吸引
した。分離することができないか、または相の相違が目に見えないときには、全
ての上清を細胞質画分としてとって、ショ糖をTE(10mMトリス−HCl p
H8.0、1mM EDTA)で希釈した。ペレットには、目に見えかつ清澄であ
るかまたは帯黄色であるミクロソームが入っていた。RNA抽出のために、細胞
質画分を1% SDS、0.1mg/mlプロテイナーゼKで37℃で30分間処理
した。この後、−80℃での凍結が可能であった。RNAは、フェノール:クロ
ロホルムの組合せで抽出して、0.3M Naアセテート、1μlグリコーゲン
、および等容量のイソプロパノールで沈殿させた。O’N沈殿が可能であり、氷
上で30分で達成できる。抽出物を10000gで20分間遠心分離し、次にR
NAペレットを70%エタノールで洗浄した。ペレットを乾燥し、次にH2Oに
溶解した。次にこのミクロソームを0.1M NaCl/1% SDS溶液(小
さいペレットには1mlで通常充分である)で溶解して、フェノール:クロロホル
ムの組合せ(プロテイナーゼK処理をしない)で抽出した。次にRNAの沈殿は
、塩を加える必要がない他は、細胞質画分の場合と同様に行った。
【0049】核および細胞質RNAの調製 サブコンフルエントなプレートを125mM KCl−30mMトリス−塩酸塩(
pH7.5)−5mM酢酸マグネシウム−1mM 2−メルカプトエタノール−2mM
リボヌクレオシドバナジル複合体(2)−0.15mMスペルミン−0.05mMス
ペルミジンで4℃で洗浄して、細胞をプレートから削り落として同じ緩衝液で2
回洗浄した。約108細胞を2.5mlの膨潤緩衝液(KCl濃度が10mMである
ことを除いて洗浄緩衝液と同じ)中で10分間膨潤させて、20ストロークのダ
ンス型(Dounce)ホモジェナイザー(B乳棒)で溶解して、25%グリセロール
を含有する等容量の膨潤緩衝液の上に重層し、400×gで4℃で5分間遠心分
離した。上清の上層は、溶解により放出されたCAD配列の90%を含有してい
たが、これを細胞質画分と呼んだ。核ペレットは、2mlの膨潤緩衝液−25%グ
リセロール−0.5%トリトンX−100で1回、そして2mlの膨潤緩衝液で1
回洗浄した。
pH7.5)−5mM酢酸マグネシウム−1mM 2−メルカプトエタノール−2mM
リボヌクレオシドバナジル複合体(2)−0.15mMスペルミン−0.05mMス
ペルミジンで4℃で洗浄して、細胞をプレートから削り落として同じ緩衝液で2
回洗浄した。約108細胞を2.5mlの膨潤緩衝液(KCl濃度が10mMである
ことを除いて洗浄緩衝液と同じ)中で10分間膨潤させて、20ストロークのダ
ンス型(Dounce)ホモジェナイザー(B乳棒)で溶解して、25%グリセロール
を含有する等容量の膨潤緩衝液の上に重層し、400×gで4℃で5分間遠心分
離した。上清の上層は、溶解により放出されたCAD配列の90%を含有してい
たが、これを細胞質画分と呼んだ。核ペレットは、2mlの膨潤緩衝液−25%グ
リセロール−0.5%トリトンX−100で1回、そして2mlの膨潤緩衝液で1
回洗浄した。
【0050】 核RNP。上記のように調製した108細胞からの核は、1mlの10mMトリス
−塩酸塩(pH8.0)−100mM NaCl−2mM MgCl2−1mM 2−
メルカプトエタノール−0.15mMスペルミン−0.05mMスペルミジン−10
mMリボヌクレオシドバナジル複合体(2)−1ml当たり100Uの胎盤RNアー
ゼインヒビター(アマーシャム社(Amersham Corp.))に懸濁して、コンレス(
Konres)マイクロ超音波細胞破砕機の最大出力設定で4℃で20gで超音波処理
した。細菌性tRNA(2mg)を加え、塩基性タンパク質(9)を吸着し、そし
て混合物を1分間遠心分離した(エッペンドルフ(Eppendorf)マイクロ遠心機
)。上清を、1mMトリス−塩酸塩−100mM NaCl−2mM MgCl2−−
2mMリボヌクレオシドバナジル複合体中15〜45%ショ糖勾配に適用して、ベ
ックマン(Beckman)SW41ローターで40,000rpmおよび4℃で90分間
遠心分離した。ドデシル硫酸ナトリウムを0.5%まで加え、プロテイナーゼK
(200μg/ml)で37℃で2時間処理し、フェノールで抽出し、エタノールで
沈殿させることにより、RNAを勾配画分から回収した。
−塩酸塩(pH8.0)−100mM NaCl−2mM MgCl2−1mM 2−
メルカプトエタノール−0.15mMスペルミン−0.05mMスペルミジン−10
mMリボヌクレオシドバナジル複合体(2)−1ml当たり100Uの胎盤RNアー
ゼインヒビター(アマーシャム社(Amersham Corp.))に懸濁して、コンレス(
Konres)マイクロ超音波細胞破砕機の最大出力設定で4℃で20gで超音波処理
した。細菌性tRNA(2mg)を加え、塩基性タンパク質(9)を吸着し、そし
て混合物を1分間遠心分離した(エッペンドルフ(Eppendorf)マイクロ遠心機
)。上清を、1mMトリス−塩酸塩−100mM NaCl−2mM MgCl2−−
2mMリボヌクレオシドバナジル複合体中15〜45%ショ糖勾配に適用して、ベ
ックマン(Beckman)SW41ローターで40,000rpmおよび4℃で90分間
遠心分離した。ドデシル硫酸ナトリウムを0.5%まで加え、プロテイナーゼK
(200μg/ml)で37℃で2時間処理し、フェノールで抽出し、エタノールで
沈殿させることにより、RNAを勾配画分から回収した。
【0051】アンチセンスRNAの調製 細胞性RNAを抽出した。RNAプールの一部を膜上に固定化し、別の一部を
オリゴデオキシヌクレオチドを3’末端に結合させてcDNAに変換した。cD
NA合成のためのビオチン化した相補的なオリゴを使用すると、「マイナス」鎖
をストレプトアビジン被覆磁性ビーズに固定化することが可能になる。第2のセ
ットのオリゴを、RNAの以前の5’末端でcDNAに結合させた。結合した鎖
からプラス鎖を溶出し、膜結合RNAにハイブリダイズさせる。使用したcDN
A鎖はRNAと同じ極性を有するため、相補的なRNAに結合することができる
cDNA配列のみが保持される。PCR増幅とPCR断片の以後のクローニング
後に、配列分析を行う。クローン化した配列が正しく同定されるかどうかを試験
するために、センスおよびアンチセンス方向でプローブを作成する。陽性クロー
ンを、構造的および機能的に性状解析する。この方法を実施するために我々は、
アンチセンスRNAによりそのコピー数を制御するプラスミドR1を含有する細
菌株(大腸菌(Escherichia coli))を使用し始めた。以前の研究で、細胞内で
R1のアンチセンス(CopA)と標的RNA(CopT)の両方が同定された
。この方法が実施できるなら、他の生物中のアンチセンスRNA系をスクリーニ
ングするのに使用されるであろう。
オリゴデオキシヌクレオチドを3’末端に結合させてcDNAに変換した。cD
NA合成のためのビオチン化した相補的なオリゴを使用すると、「マイナス」鎖
をストレプトアビジン被覆磁性ビーズに固定化することが可能になる。第2のセ
ットのオリゴを、RNAの以前の5’末端でcDNAに結合させた。結合した鎖
からプラス鎖を溶出し、膜結合RNAにハイブリダイズさせる。使用したcDN
A鎖はRNAと同じ極性を有するため、相補的なRNAに結合することができる
cDNA配列のみが保持される。PCR増幅とPCR断片の以後のクローニング
後に、配列分析を行う。クローン化した配列が正しく同定されるかどうかを試験
するために、センスおよびアンチセンス方向でプローブを作成する。陽性クロー
ンを、構造的および機能的に性状解析する。この方法を実施するために我々は、
アンチセンスRNAによりそのコピー数を制御するプラスミドR1を含有する細
菌株(大腸菌(Escherichia coli))を使用し始めた。以前の研究で、細胞内で
R1のアンチセンス(CopA)と標的RNA(CopT)の両方が同定された
。この方法が実施できるなら、他の生物中のアンチセンスRNA系をスクリーニ
ングするのに使用されるであろう。
【0052】示差的分析 示差的表示 : 逆転写:2μgのRNAを6.5μlの容量中の1pmolのオリゴdTプライマー(
dT)18と、70℃で5分間加熱し、氷上で冷却してアニーリングする。2μl
の反応緩衝液(x5)、1μlの10mM dNTPミックス、および0.5μlの
スーパースクリプトII(SuperScriptII)逆転写酵素(ギブコビーアールエル(
GibcoBRL))を加えた。42℃で1時間反応を行なった。70μlのT
E(10mMトリス pH=8;、0.1mM EDTA)を加えて、反応を停止さ
せた。示差的表示に使用したオリゴヌクレオチド:オリゴヌクレオチドは基本的
に、デルタRNAフィンガープリンティングキット(Delta RNA Fingerprinting
kit)(クロンテクラボズ・インク(Clontech Labs. Inc.))に記載されてい
るものである。構造:5’CATTATGCTGAGTGATATCTTTTT
TTTTXY3’(配列番号1)の9つの「T」オリゴヌクレオチドがあった。
10個の「P」オリゴヌクレオチドは、構造:3’ATTAACCCTCACT
AAA”TGCTGGGGA”3’(配列番号11)であり、カッコ内の9また
は10ヌクレオチドは任意の配列であり、10個の異なる配列(配列番号12〜
21)があり、各「P」オリゴについて1つである。
dT)18と、70℃で5分間加熱し、氷上で冷却してアニーリングする。2μl
の反応緩衝液(x5)、1μlの10mM dNTPミックス、および0.5μlの
スーパースクリプトII(SuperScriptII)逆転写酵素(ギブコビーアールエル(
GibcoBRL))を加えた。42℃で1時間反応を行なった。70μlのT
E(10mMトリス pH=8;、0.1mM EDTA)を加えて、反応を停止さ
せた。示差的表示に使用したオリゴヌクレオチド:オリゴヌクレオチドは基本的
に、デルタRNAフィンガープリンティングキット(Delta RNA Fingerprinting
kit)(クロンテクラボズ・インク(Clontech Labs. Inc.))に記載されてい
るものである。構造:5’CATTATGCTGAGTGATATCTTTTT
TTTTXY3’(配列番号1)の9つの「T」オリゴヌクレオチドがあった。
10個の「P」オリゴヌクレオチドは、構造:3’ATTAACCCTCACT
AAA”TGCTGGGGA”3’(配列番号11)であり、カッコ内の9また
は10ヌクレオチドは任意の配列であり、10個の異なる配列(配列番号12〜
21)があり、各「P」オリゴについて1つである。
【0053】増幅反応 :各反応は20μl中で行い、50μM dNTPミックス、各プライ
マーから1μM、1×ポリメラーゼ緩衝液、1単位拡張ポリメラーゼ(ベーリン
ガーマンハイム(Boehringer-Mannheim))、2μCi[α−32P]dATP、お
よび1μl cDNA鋳型を含有する。サイクル条件:95℃で3分、次に94
℃で2分、40℃で5分、68℃で5分を3サイクル。次に、94℃で1分、6
0℃で2分、68℃で2分を27サイクルを行う。68℃で7分インキュベート
し、20μlの配列決定停止溶液(95%ホルムアミド、10mM NaOH、0
.025%ブロモフェノールブルー、0.025%キシレンシアノール)を加え
て反応を停止させた。
マーから1μM、1×ポリメラーゼ緩衝液、1単位拡張ポリメラーゼ(ベーリン
ガーマンハイム(Boehringer-Mannheim))、2μCi[α−32P]dATP、お
よび1μl cDNA鋳型を含有する。サイクル条件:95℃で3分、次に94
℃で2分、40℃で5分、68℃で5分を3サイクル。次に、94℃で1分、6
0℃で2分、68℃で2分を27サイクルを行う。68℃で7分インキュベート
し、20μlの配列決定停止溶液(95%ホルムアミド、10mM NaOH、0
.025%ブロモフェノールブルー、0.025%キシレンシアノール)を加え
て反応を停止させた。
【0054】ゲル分析 :5%配列決定ポリアクリルアミドゲルに3〜4μlをのせ、スロー色
素(キシレンシアノール)が底から約2cmになるまで、2000ボルト/40ミ
リアンペアで電気泳動した。ゲルをろ紙に移し、真空下で乾燥し、X線フィルム
に露出した。
素(キシレンシアノール)が底から約2cmになるまで、2000ボルト/40ミ
リアンペアで電気泳動した。ゲルをろ紙に移し、真空下で乾燥し、X線フィルム
に露出した。
【0055】示差的バンドの回収 :種々のプールの間で差を示すバンドを、乾燥ゲルから切り
出し、マイクロ遠心分離チューブに入れた。50μlの無菌水を加え、試験管を
5分間100℃で加熱した。示差的表示に使用したものと同じプライマーを使用
して1μlを49μlのPCR反応物に加え、試料を、30サイクルの94℃で1
分、60℃で1分、68℃で1分により増幅した。10μlをアガロースゲルで
分析して視覚化して、増幅がうまくいったことを確認する。
出し、マイクロ遠心分離チューブに入れた。50μlの無菌水を加え、試験管を
5分間100℃で加熱した。示差的表示に使用したものと同じプライマーを使用
して1μlを49μlのPCR反応物に加え、試料を、30サイクルの94℃で1
分、60℃で1分、68℃で1分により増幅した。10μlをアガロースゲルで
分析して視覚化して、増幅がうまくいったことを確認する。
【0056】リプリゼンテーショナル示差的分析 逆転写 :2μgのポリA+選択mRNAを使用した以外は上記のように行なった
。2本鎖cDNAの調製:前工程からのcDNAをアルカリで処理してmRNA
を除去し、沈殿させ、20μlのH2Oに溶解した。5μlの緩衝液、2μlの10
mM dATP、48μlになるようにH2O、および2μlの末端デオキシヌクレ
オチドトランスラーゼ(TdT)を加えた。反応物を37℃で2〜4時間インキ
ュベートした。5μlのオリゴdT(1μg/μl)を加え、60℃で5分間インキ
ュベートした。5μlの200mM DTT、10μlの10×セクション緩衝液(
100mM MgCl2、900mMヘペス、pH6.6)、16μlのdNTP(1
mM)、および16Uのクレノウを加え、混合物を室温で一晩インキュベートして
ds cDNAを作成した。100μlのTEを加え、フェノール/クロロホル
ムで抽出した。DNAを沈殿させ、50μlのH2Oに溶解した。
。2本鎖cDNAの調製:前工程からのcDNAをアルカリで処理してmRNA
を除去し、沈殿させ、20μlのH2Oに溶解した。5μlの緩衝液、2μlの10
mM dATP、48μlになるようにH2O、および2μlの末端デオキシヌクレ
オチドトランスラーゼ(TdT)を加えた。反応物を37℃で2〜4時間インキ
ュベートした。5μlのオリゴdT(1μg/μl)を加え、60℃で5分間インキ
ュベートした。5μlの200mM DTT、10μlの10×セクション緩衝液(
100mM MgCl2、900mMヘペス、pH6.6)、16μlのdNTP(1
mM)、および16Uのクレノウを加え、混合物を室温で一晩インキュベートして
ds cDNAを作成した。100μlのTEを加え、フェノール/クロロホル
ムで抽出した。DNAを沈殿させ、50μlのH2Oに溶解した。
【0057】リプリゼンテーションの作成 :DpnIIを有するcDNAを、3μlのDpnI
I反応緩衝液20VとDpnIIを25μlのcDNAに加え、37℃で5時間イ
ンキュベートして消化した。50μlのTEを加え、フェノール/クロロホルム
で抽出した。cDNAを沈殿させ、10ng/μlの濃度に溶解した。 この方法では以下のオリゴヌクレオチドを使用する: R−Bgl−12 5’GATCTGCGGTGA3’(配列番号22) R−Bgl−24 5’AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA3
’(配列番号23) J−Bgl−12 5’GATCTGTTCATG3’(配列番号24) J−Bgl−24 5’ACCGACGTCGACTATCCATGAACA3
’(配列番号25) N−Bgl−12 5’GATCTTCCCTCG3’(配列番号26) N−Bgl−24 5’AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAA3
’(配列番号27)
I反応緩衝液20VとDpnIIを25μlのcDNAに加え、37℃で5時間イ
ンキュベートして消化した。50μlのTEを加え、フェノール/クロロホルム
で抽出した。cDNAを沈殿させ、10ng/μlの濃度に溶解した。 この方法では以下のオリゴヌクレオチドを使用する: R−Bgl−12 5’GATCTGCGGTGA3’(配列番号22) R−Bgl−24 5’AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA3
’(配列番号23) J−Bgl−12 5’GATCTGTTCATG3’(配列番号24) J−Bgl−24 5’ACCGACGTCGACTATCCATGAACA3
’(配列番号25) N−Bgl−12 5’GATCTTCCCTCG3’(配列番号26) N−Bgl−24 5’AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAA3
’(配列番号27)
【0058】 R−Bgl−12とR−Bgl−24オリゴをテスター(Tester)とドライバ
ー(Driver)に結合した:1.2μgのDpnII消化cDNA。各オリゴから4
μlと5μlの結合緩衝液×10を60℃で10分間アニーリングした。2μlの
リガーゼを加え、16℃で一晩インキュベートした。140μlのTEを加えて
結合混合物を希釈した。R−Bgl−24プライマーと2μlの結合産物を使用
して200μlの容量中で増幅を行い、各試料について20本のチューブで繰り
返した。TaqDNAポリメラーゼを加える前に、チューブを72℃で3分間加
熱した。PCR条件:72℃で5分、次に95℃で1分と72℃で3分を20サ
イクル、次に72℃で10分。各4つの反応物を一緒にし、フェノール/クロロ
ホルムで抽出し、沈殿させた。増幅したDNAを0.5μg/μlの濃度に溶解し
、すべて試料をプールした。
ー(Driver)に結合した:1.2μgのDpnII消化cDNA。各オリゴから4
μlと5μlの結合緩衝液×10を60℃で10分間アニーリングした。2μlの
リガーゼを加え、16℃で一晩インキュベートした。140μlのTEを加えて
結合混合物を希釈した。R−Bgl−24プライマーと2μlの結合産物を使用
して200μlの容量中で増幅を行い、各試料について20本のチューブで繰り
返した。TaqDNAポリメラーゼを加える前に、チューブを72℃で3分間加
熱した。PCR条件:72℃で5分、次に95℃で1分と72℃で3分を20サ
イクル、次に72℃で10分。各4つの反応物を一緒にし、フェノール/クロロ
ホルムで抽出し、沈殿させた。増幅したDNAを0.5μg/μlの濃度に溶解し
、すべて試料をプールした。
【0059】サブトラクション :テスターDNA(20μg)を上記のようにDpnIIで消化
し、1.2%アガロースゲルで分離した。ゲルからDNAを抽出し、R−オリゴ
について上記したように、2μgをJ−Bgl−12とJ−Bgl24オリゴに
結合させた。結合したテスターDNAをTEで10ng/μlに希釈した。ドライバ
ーDNAをDpnIIで消化し、再精製して最終濃度0.5μg/μlにした。40
μgのドライバーDNAを0.4μgのテスターDNAと混合する。フェノール/
クロロホルムで抽出し、70%エタノールで2回洗浄して沈殿させ、DNAを4
μlの30mM EPPS(pH8.0)、3mM EDTAに再懸濁し、35μlの
ミネラル油を重層する。98℃で5分変性させ、67℃に冷却し、DNAに1μ
lの5M NaClを加えた。67℃で20時間インキュベートした。400μl
のTEを加えてDNAを希釈した。
し、1.2%アガロースゲルで分離した。ゲルからDNAを抽出し、R−オリゴ
について上記したように、2μgをJ−Bgl−12とJ−Bgl24オリゴに
結合させた。結合したテスターDNAをTEで10ng/μlに希釈した。ドライバ
ーDNAをDpnIIで消化し、再精製して最終濃度0.5μg/μlにした。40
μgのドライバーDNAを0.4μgのテスターDNAと混合する。フェノール/
クロロホルムで抽出し、70%エタノールで2回洗浄して沈殿させ、DNAを4
μlの30mM EPPS(pH8.0)、3mM EDTAに再懸濁し、35μlの
ミネラル油を重層する。98℃で5分変性させ、67℃に冷却し、DNAに1μ
lの5M NaClを加えた。67℃で20時間インキュベートした。400μl
のTEを加えてDNAを希釈した。
【0060】増幅 :最終容量200μl中のサブトラクトしたDNAの増幅:緩衝液、ヌクレ
オチドおよび20μlの希釈DNAを加え、72℃で加熱し、TaqDNAポリ
メラーゼを加えた。72℃で5分インキュベートし、J−Bgl−24オリゴを
加えた。95℃で1分、70℃で3分を10サイクル行なった。72℃で10分
インキュベートした。4つの異なるチューブで増幅を繰り返した。増幅したDN
Aをフェノール/クロロホルムで抽出し、沈殿させ、すべての4つのチューブを
40μlの0.2×TEで一緒にし、ムング・ビーン・ヌクレアーゼ(Mung Bean
Nuclease)で以下のように消化した:20μlのDNAに、4μlの緩衝液、1
4μlのH2O、および2μlのムング・ビーン・ヌクレアーゼ(Mung Bean Nucle
ase)(10単位/μl)を加えた。30℃で35分インキュベート+第1の示差
的産物(DPI)でインキュベートした。
オチドおよび20μlの希釈DNAを加え、72℃で加熱し、TaqDNAポリ
メラーゼを加えた。72℃で5分インキュベートし、J−Bgl−24オリゴを
加えた。95℃で1分、70℃で3分を10サイクル行なった。72℃で10分
インキュベートした。4つの異なるチューブで増幅を繰り返した。増幅したDN
Aをフェノール/クロロホルムで抽出し、沈殿させ、すべての4つのチューブを
40μlの0.2×TEで一緒にし、ムング・ビーン・ヌクレアーゼ(Mung Bean
Nuclease)で以下のように消化した:20μlのDNAに、4μlの緩衝液、1
4μlのH2O、および2μlのムング・ビーン・ヌクレアーゼ(Mung Bean Nucle
ase)(10単位/μl)を加えた。30℃で35分インキュベート+第1の示差
的産物(DPI)でインキュベートした。
【0061】繰り返しサブトラクションハイブリダイゼーションとドライバーでのPCR増幅 :N−BglオリゴヌクレオチドとJ−Bglオリゴヌクレオチドを使用して、
それぞれ1:400(DPII)と1:40,000(DPIII)のディファレン
シャル比。個々のクローンの分析のために、BamHI部位で示差的産物を、ブ
ルースクリプト(Bluescript)ベクターにクローン化した。
それぞれ1:400(DPII)と1:40,000(DPIII)のディファレン
シャル比。個々のクローンの分析のために、BamHI部位で示差的産物を、ブ
ルースクリプト(Bluescript)ベクターにクローン化した。
【0062】
【0063】例1 レプレゼンタティブ熱ショックGEM示差的発現系の翻訳レベルで制御される遺 伝子の分析 材料と方法 通常の温度(37℃)と熱ショック温度(43℃)で実験細胞を4時間増殖さ
せた。次に細胞を採取し、細胞質抽出物を得て、ポリソームを分画して、そこか
らRNAを抽出した。細胞の平行培養物から、全細胞RNAを抽出した。次に抽
出したRNAを、前記GEM法を使用して分析した。
せた。次に細胞を採取し、細胞質抽出物を得て、ポリソームを分画して、そこか
らRNAを抽出した。細胞の平行培養物から、全細胞RNAを抽出した。次に抽
出したRNAを、前記GEM法を使用して分析した。
【0064】 図2と表2および3は、示差的発現分析で全mRNAプローブに対してポリソ
ームプローブを使用して、熱ショックのような刺激に応答して示差的に発現され
る遺伝子を同定することの有用性を証明している。これらの表は、フィブロネク
チン、ピルビン酸キナーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ポリ(AD
Pリボース)ポリメラーゼ、サイモポエチン、90Kd熱ショックタンパク質、
アシルアミノ酸放出酵素、β−スペクトリン、およびピルビン酸キナーゼをすべ
て、ポリソームプローブを使用して示差的に発現されるものとして同定したが、
ただしフィブロネクチンの場合を除いて、全mRNAプローブを使用した時他の
タンパク質は示差的に発現されるものとして同定されなかった。この例は、スト
レス誘導性成分により制御される翻訳的または示差的に制御される遺伝子を同定
するための本発明の有用性を証明する。さらに表2において、ポリソームプロー
ブと全mRNAプローブの両方を用いた熱ショック示差的遺伝子発現分析の結果
を提供する。表2は、ポリソームプローブを使用して多くの示差的に発現される
遺伝子が同定されたことを示すが、全mRNAプローブを使用した時、これらの
遺伝子は必ずしも示差的に発現されるものとして同定されないことを示す。表3
は、全mRNAまたはポリソームmRNAをプローブとして使用して同定された
、示差的に発現される遺伝子の数を統計的に例示する。表3は、ポリソームmR
NAプローブは、全mRNAプローブに対して示差的に発現される遺伝子の数が
、2〜10倍以上増加したことを明瞭に示す。
ームプローブを使用して、熱ショックのような刺激に応答して示差的に発現され
る遺伝子を同定することの有用性を証明している。これらの表は、フィブロネク
チン、ピルビン酸キナーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ポリ(AD
Pリボース)ポリメラーゼ、サイモポエチン、90Kd熱ショックタンパク質、
アシルアミノ酸放出酵素、β−スペクトリン、およびピルビン酸キナーゼをすべ
て、ポリソームプローブを使用して示差的に発現されるものとして同定したが、
ただしフィブロネクチンの場合を除いて、全mRNAプローブを使用した時他の
タンパク質は示差的に発現されるものとして同定されなかった。この例は、スト
レス誘導性成分により制御される翻訳的または示差的に制御される遺伝子を同定
するための本発明の有用性を証明する。さらに表2において、ポリソームプロー
ブと全mRNAプローブの両方を用いた熱ショック示差的遺伝子発現分析の結果
を提供する。表2は、ポリソームプローブを使用して多くの示差的に発現される
遺伝子が同定されたことを示すが、全mRNAプローブを使用した時、これらの
遺伝子は必ずしも示差的に発現されるものとして同定されないことを示す。表3
は、全mRNAまたはポリソームmRNAをプローブとして使用して同定された
、示差的に発現される遺伝子の数を統計的に例示する。表3は、ポリソームmR
NAプローブは、全mRNAプローブに対して示差的に発現される遺伝子の数が
、2〜10倍以上増加したことを明瞭に示す。
【0065】例2 核mRNAプローブを使用する転写レベルの遺伝子の分析 実験細胞を通常の条件で、低酸素(<1%酸素)下で4時間と低酸素下で16
時間、交互に増殖させた。細胞を採取し、細胞から調製された核(核RNA)か
ら、または未分画細胞の抽出物(全細胞RNA)から、RNAを調製した。
時間、交互に増殖させた。細胞を採取し、細胞から調製された核(核RNA)か
ら、または未分画細胞の抽出物(全細胞RNA)から、RNAを調製した。
【0066】 図3は、核RNAから調製されたプローブ(STP)が、全細胞RNAプロー
ブ(Tot)より高い示差的発現を与えることを示す。VEGF(血管内皮増殖
因子)、Glut1(グルコーストランスポーター1)およびグリコーゲンシン
ターゼをコードする対照遺伝子は、低酸素ストレスにより誘導されることが知ら
れている。核プローブで観察される誘導レベルは、全プローブで見られるものよ
りはるかに高く、実際の誘導レベルにより近い。3つの新しい遺伝子RTP24
1、RTP262およびRTP779は、低酸素により顕著な誘導を示す。核プ
ローブでみられる誘導レベルはこの場合も、RTP779について見られるよう
にはるかに(最大5倍高い)高い。これらの遺伝子の誘導をノーザンブロット法
で分析すると、核プローブは実際の状況にはるかに近く、全プローブは顕著な過
小評価を与えることがわかった。
ブ(Tot)より高い示差的発現を与えることを示す。VEGF(血管内皮増殖
因子)、Glut1(グルコーストランスポーター1)およびグリコーゲンシン
ターゼをコードする対照遺伝子は、低酸素ストレスにより誘導されることが知ら
れている。核プローブで観察される誘導レベルは、全プローブで見られるものよ
りはるかに高く、実際の誘導レベルにより近い。3つの新しい遺伝子RTP24
1、RTP262およびRTP779は、低酸素により顕著な誘導を示す。核プ
ローブでみられる誘導レベルはこの場合も、RTP779について見られるよう
にはるかに(最大5倍高い)高い。これらの遺伝子の誘導をノーザンブロット法
で分析すると、核プローブは実際の状況にはるかに近く、全プローブは顕著な過
小評価を与えることがわかった。
【0067】 遺伝子RTPi−66とRPT2I−72は、全プローブでは示差的に現れな
い示差的に発現される遺伝子を、核プローブが検出する能力を示す。
い示差的に発現される遺伝子を、核プローブが検出する能力を示す。
【0068】 ヌクレオリン(Nucleolin)とトロンボスポンジン(Thrombospondin)の遺伝
子は、ダウンレギュレーションされたmRNAについても、核プローブははるか
に高感度であり、はるかに高いレベルの示差的発現値を与えることを示している
。
子は、ダウンレギュレーションされたmRNAについても、核プローブははるか
に高感度であり、はるかに高いレベルの示差的発現値を与えることを示している
。
【0069】 最後に、リボゾームタンパク質L17と細胞質ガンマアクチンの遺伝子は、低
酸素ストレスに応答しない遺伝子として知られている。核プローブと全プローブ
の両方とも、誘導が起きないことを示す。
酸素ストレスに応答しない遺伝子として知られている。核プローブと全プローブ
の両方とも、誘導が起きないことを示す。
【0070】例3 IRES含有遺伝子の同定 2Aプロテアーゼを発現する哺乳動物細胞の樹立 予備的実験では、2AプロテアーゼはHEK−293ヒト(ATCC CRL
−1573)細胞株でIRES含有遺伝子の発現を増強することを示したため、
この細胞株を、ポリオウイルス2Aプロテアーゼ誘導発現のモデル系として使用
した。図4A〜Cに示すようにそれぞれポリオウイルス2Aプロテアーゼベクタ
ーPTK−OP3−WT2A、ミニTK−WT2A、またはPCIbb−Lac
I−Hyg(ストラタジーン(Stratagene)からのベクターに基づき本出願人が
作製した)のいずれか1つと組合せて、HEK−293細胞をCMV−LacI
−(当業者に公知の方法を使用して作製した)と同時トランスフェクトした。L
acI発現ベクターはヒグロマイシン選択マーカーを含有し、ポリオウイルス2
Aプロテアーゼ発現ベクターはネオマイシン選択マーカーを含有し、これは、お
そらくLacIリプレッサーとポリオウイルス2Aタンパク質の両方を発現する
、両方のマーカーに耐性のクローンの単離を可能にした。
−1573)細胞株でIRES含有遺伝子の発現を増強することを示したため、
この細胞株を、ポリオウイルス2Aプロテアーゼ誘導発現のモデル系として使用
した。図4A〜Cに示すようにそれぞれポリオウイルス2Aプロテアーゼベクタ
ーPTK−OP3−WT2A、ミニTK−WT2A、またはPCIbb−Lac
I−Hyg(ストラタジーン(Stratagene)からのベクターに基づき本出願人が
作製した)のいずれか1つと組合せて、HEK−293細胞をCMV−LacI
−(当業者に公知の方法を使用して作製した)と同時トランスフェクトした。L
acI発現ベクターはヒグロマイシン選択マーカーを含有し、ポリオウイルス2
Aプロテアーゼ発現ベクターはネオマイシン選択マーカーを含有し、これは、お
そらくLacIリプレッサーとポリオウイルス2Aタンパク質の両方を発現する
、両方のマーカーに耐性のクローンの単離を可能にした。
【0071】ポリオウイルス2Aプロテアーゼ発現の分析 死滅測定法 :ヒグロマイシン(50μg/ml)とネオマイシン(500μg/ml)で
選択後に増殖した耐性クローンを、IPTG(5mMで48時間+5mMでさらに4
8時間)で処理した。次に細胞を生存活性について追跡し、ポリオウイルス2A
プロテアーゼ誘導で完全な死滅を示したクローン(おそらくポリオウイルス2A
プロテアーゼの有害作用を発現する)を、さらなる分析のために選択した。その
ようなクローン2つ、TKプロモーターの制御下でポリオウイルス2Aプロテア
ーゼを発現するHEK−293細胞(クローン#14)とミニTKプロモーター
の制御下でポリオウイルス2Aプロテアーゼを発現するHEK−293細胞(ク
ローン#1)を、図5に示すように単離した。
選択後に増殖した耐性クローンを、IPTG(5mMで48時間+5mMでさらに4
8時間)で処理した。次に細胞を生存活性について追跡し、ポリオウイルス2A
プロテアーゼ誘導で完全な死滅を示したクローン(おそらくポリオウイルス2A
プロテアーゼの有害作用を発現する)を、さらなる分析のために選択した。その
ようなクローン2つ、TKプロモーターの制御下でポリオウイルス2Aプロテア
ーゼを発現するHEK−293細胞(クローン#14)とミニTKプロモーター
の制御下でポリオウイルス2Aプロテアーゼを発現するHEK−293細胞(ク
ローン#1)を、図5に示すように単離した。
【0072】2Aプロテアーゼ発現の分析 :IPTG誘導後のHEK−293ミニTK#1ク
ローンとHEK−293TK#14クローン中のポリオウイルス2Aプロテアー
ゼ発現の直接分析は、タンパク質に対する抗体が欠如していたため行なわなかっ
た。現在利用できるいくつかの方法(ノーザンブロット解析、RNase保護測
定法、in situ ハイブリダイゼーション、および逆転写ポリメラーゼチェ
イン反応(RT−PCR)を含む)を使用して、遺伝子発現の変化を測定するこ
とができる。RT−PCR法は非常に高感度な方法であり、IPTG処理後のH
EK−293ミニTK#1クローン中のポリオウイルス2Aプロテアーゼをコー
ドするmRNAの誘導を追跡するのに使用した。mRNAは、異なる時点でのI
PTGで処理後のHEK−293親細胞とHEK−293ミニTK−2Aクロー
ンから調製した。RNAを以下のポリオウイルス2Aプロテアーゼ特異的オリゴ
ヌクレオチドを使用してRT−PCR反応に付した: 5’GCAACTACCATTTGGCCACTCAGGAAG3’(配列番号
28)と 5’GCAACCAACCCTTCTCCACCAGCAG3’(配列番号29
)。
ローンとHEK−293TK#14クローン中のポリオウイルス2Aプロテアー
ゼ発現の直接分析は、タンパク質に対する抗体が欠如していたため行なわなかっ
た。現在利用できるいくつかの方法(ノーザンブロット解析、RNase保護測
定法、in situ ハイブリダイゼーション、および逆転写ポリメラーゼチェ
イン反応(RT−PCR)を含む)を使用して、遺伝子発現の変化を測定するこ
とができる。RT−PCR法は非常に高感度な方法であり、IPTG処理後のH
EK−293ミニTK#1クローン中のポリオウイルス2Aプロテアーゼをコー
ドするmRNAの誘導を追跡するのに使用した。mRNAは、異なる時点でのI
PTGで処理後のHEK−293親細胞とHEK−293ミニTK−2Aクロー
ンから調製した。RNAを以下のポリオウイルス2Aプロテアーゼ特異的オリゴ
ヌクレオチドを使用してRT−PCR反応に付した: 5’GCAACTACCATTTGGCCACTCAGGAAG3’(配列番号
28)と 5’GCAACCAACCCTTCTCCACCAGCAG3’(配列番号29
)。
【0073】 ポリオウイルス2AプロテアーゼmRNAはHEK−293親細胞中で検出さ
れなかったが、IPTG処理後に誘導され、図6に示すようにIPTG処理の4
8時間後に最高レベルに達した。
れなかったが、IPTG処理後に誘導され、図6に示すようにIPTG処理の4
8時間後に最高レベルに達した。
【0074】2Aプロテアーゼ活性の分析 p220切断 :ポリオウイルス2Aプロテアーゼの充分性状解析された機能は、
40Sリボゾームサブユニットの成分であるp220タンパク質(4Fγ翻訳因
子)の切断である。p220の切断は、翻訳後修飾により100〜120KDa分
子量の3つのN末端切断産物を与える。図6に示すようにN末端領域p220に
対して特異的に作成したポリクローナル抗p220抗体を使用して、p220と
その切断産物を7%SDS PAGEとウェスタンブロッティング解析により同
定した。図6はそのような分析を示し、HEK−293ミニTK2A#1クロー
ンとHEK−293TK2A#14クローンをポリオウイルス2Aプロテアーゼ
発現について誘導してp220の切断生成物を作成した。対照として、HEK−
293細胞溶解物を、in vitro翻訳により産生したポリオウイルス2Aプロテア
ーゼで処理し、7%SDS PAGEでHEK−2932Aクローンと同じ移動
度の同じ切断産物を生成することがわかった。
40Sリボゾームサブユニットの成分であるp220タンパク質(4Fγ翻訳因
子)の切断である。p220の切断は、翻訳後修飾により100〜120KDa分
子量の3つのN末端切断産物を与える。図6に示すようにN末端領域p220に
対して特異的に作成したポリクローナル抗p220抗体を使用して、p220と
その切断産物を7%SDS PAGEとウェスタンブロッティング解析により同
定した。図6はそのような分析を示し、HEK−293ミニTK2A#1クロー
ンとHEK−293TK2A#14クローンをポリオウイルス2Aプロテアーゼ
発現について誘導してp220の切断生成物を作成した。対照として、HEK−
293細胞溶解物を、in vitro翻訳により産生したポリオウイルス2Aプロテア
ーゼで処理し、7%SDS PAGEでHEK−2932Aクローンと同じ移動
度の同じ切断産物を生成することがわかった。
【0075】 この系を、ポリソーム分画のためのmRNAの供給源として使用した。上記の
プロトコールを使用してRDA分析を行い、その翻訳がポリオウイルス2Aプロ
テアーゼの作用によりアップレギュレーションされる遺伝子を同定した。表4は
、上記方法に従って行なった分析とそれにより単離された遺伝子の結果を要約す
る。
プロトコールを使用してRDA分析を行い、その翻訳がポリオウイルス2Aプロ
テアーゼの作用によりアップレギュレーションされる遺伝子を同定した。表4は
、上記方法に従って行なった分析とそれにより単離された遺伝子の結果を要約す
る。
【0076】 本出願を通して、種々の文献は引用により参照され特許は番号で参照される。
文献の完全な引用を以下に示す。本発明に関する技術の現状を詳細に説明するた
めに、これらの文献の完全な開示は参照することにより本明細書の一部とする。
文献の完全な引用を以下に示す。本発明に関する技術の現状を詳細に説明するた
めに、これらの文献の完全な開示は参照することにより本明細書の一部とする。
【0077】 本発明は、例示的に記載し、使用される用語は説明が目的であって限定が目的
ではないことを理解されたい。
ではないことを理解されたい。
【0078】 上記教示を考慮すると、明らかに本発明の多くの修飾および変法が可能である
。従って添付の請求の範囲内で本発明は具体的に記載したもの以外に実施しうる
ことを理解されたい。
。従って添付の請求の範囲内で本発明は具体的に記載したもの以外に実施しうる
ことを理解されたい。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【0079】 引用文献 Aielloら、「mRNA示差的表示を使用するグルコースの上昇レベルへの暴露に
より変化したウシ網膜血管周囲細胞中の複数の遺伝子の同定」、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA Vol.91, pp.6231-6235 (1994) Bauerら、「改良されたディスプレイ技術(DDRT−PCR)による示差的に
発現したmRNA種の同定」、Nucleic Acids Research, Vol.21, No.18 (1993)
BharuchaとVen Murthy,「ショ糖密度勾配遠心分離とその後のポリアクリルアミ
ドゲルマトリックス中の固定化によるポリソームとポリソームmRNAの性状解
析」、Methods in Enzymology, Vol. 216, pp. 168-179 (1992) Braunら、「レプレゼンテーショナル示差的分析によるEwing肉腫EWS/FLI
融合タンパク質の標的遺伝子の同定」、Molecular and Cellular Biology, Vol.
15, No. 8, pp. 4623-4630 (1995) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
Davisら、「単一のトランスフェクトしたcDNAの発現は繊維芽細胞を筋原細
胞に変換する」、Cell 51:987-1000, 1987 Diatchenkoら、「抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション:示差的に制御
されたまたは組織特異的cDNAプローブとライブラリーの作成方法」、Proc.
Natl. Acad. Sci., Vol. 93, pp. 6025-6030 (1996) Ehrenfeld, 「ピコルナウイルスRNAによる翻訳の開始」、Translational Con
trol, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 549-573, 1996 Hadmanら、「示差的表示法の修飾はバックグランドを低減させ感度を上昇させる
」、Analytical Biochemistry 226:383-386 (1995) Hanauske-Abelら、「G1−S境界でヒプシン(hypusine)生成の調節に関連す
るポリソームmRNAのサブセットの検出。DNA複製の開始におけるEIF−
5Aの役割の提唱」、FEBS Letters 386 pp. 92-98 (1995) Hiramaら、「単離したポリソーム画分からのポリアデニル化RNAの直接精製」
、Analytical Biochemistry, 155, pp. 385-390 (1986) HubangとSchatz、「cDNAのリプリゼンテーショナル示差的分析によるmRN
A発現の差の同定」、Nucleic Acids Research, Vol. 22, No. 25, p. 5640-564
8 (1994) Jerreriesら、「伸長因子−1α mRNAは有糸***促進物質による刺激によ
り選択的に翻訳される」、The Journal of Biological Chemistry, Vol. 269, N
o. 6, pp. 4367-4372 (1994) LiangとPardee、「ポリメラーゼチェイン反応による真核生物メッセンジャーR
NAの示差的表示」、Science, Vol. 257, pp. 967-971 (1992) Liangら、「示差的表示による真核生物mRNAの分布とクローニング:改良と
最適化」、Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 14, pp. 3269-3275 (1993)
LiangとPardee、「示差的表示の最近の進歩」、Current Opinion in Immunology
, 7:274-280 (1995) Linskensら、「増強示差的表示を使用する若い細胞と老化細胞における改変遺伝
子発現の分類」、Nuc. Ac. Res. 23:3244-3251 (1995) LisitsynとWigler、「2つの複合ゲノムの差をクローニング」、Science, Vol.
259, pp. 946-951 (1993) Machら、「S−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼをコードするcDNA
クローンの単離」、The Annual of Biological Chemistry, Vol. 261, No. 25,
pp. 11697-11703 (1986) Macejakら、「細胞性mRNAの5’リーダーに介在される翻訳の内部開始」、N
ature, Vol. 353, pp. 990-994 (1991) Mechler、「膜結合ポリソームからのメッセンジャーRNAの単離」、Methods i
n Enzymology, Vol. 152, pp. 241-253 (1987) Menakerら、「線形ショ糖密度勾配によるラット顎下唾液腺ポリソームの単離方
法」、Analytical Biochemistry 57, pp. 325-335 (1974) Meyuhasら、「真核生物におけるリボゾームタンパク質mRNAの翻訳調節」、T
ranslational control, pp. 363-388 (1996) Mountfordら、「哺乳動物トランス遺伝子中の内部リボゾーム侵入部位とディシ
スロトニック(dicistronic)RNA」、TIG, Vol. 11, No. 5, pp. 179-184 (1
995) Ogishimaら、「高性能ゲルろ過クロマトグラフィーによる哺乳動物組織mRNA
の分画」、Analytical Biochemistry, 138, pp. 309-313 (1984) Ohら、「遺伝子制御:内部リボゾーム結合による翻訳開始」、Current Opinion
in Genetics and develpment, pp. 295-300 (1993) Pelletierら、「ポリオウイルスRNAから得られる配列に指令される真核生物
mRNAの翻訳の内部開始」、Nature, Vol. 334, pp. 320-325 (1988) Schenaら、「相補的なDNAマイクロアレイを有する遺伝子発現パターンの定量
的モニタリング」、Science, Vol. 270, pp. 467-470 (1995) Schenら、「迅速な発現クローニングと示差的RNAディスプレイによるヒト前
立腺癌癌遺伝子の同定」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, pp. 6778-67
82 (1995) Vagnerら、「リボゾームの内部侵入によるヒト繊維芽細胞増殖因子2 mRNA
の代替翻訳」、Molecular and Cellular Biology, Vol. 15, No.1, pp. 35-44 (
1995) Welshら、「RNAの任意のプライムPCRフィンガープリンティング」、Nuc.
Ac. Res. 20:4965-4970 (1992) Zhaoら、「新しいプライマー方策は示差的表示の正確度を改善する」、Biotechn
iques 18:842-850 (1995)
より変化したウシ網膜血管周囲細胞中の複数の遺伝子の同定」、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA Vol.91, pp.6231-6235 (1994) Bauerら、「改良されたディスプレイ技術(DDRT−PCR)による示差的に
発現したmRNA種の同定」、Nucleic Acids Research, Vol.21, No.18 (1993)
BharuchaとVen Murthy,「ショ糖密度勾配遠心分離とその後のポリアクリルアミ
ドゲルマトリックス中の固定化によるポリソームとポリソームmRNAの性状解
析」、Methods in Enzymology, Vol. 216, pp. 168-179 (1992) Braunら、「レプレゼンテーショナル示差的分析によるEwing肉腫EWS/FLI
融合タンパク質の標的遺伝子の同定」、Molecular and Cellular Biology, Vol.
15, No. 8, pp. 4623-4630 (1995) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
Davisら、「単一のトランスフェクトしたcDNAの発現は繊維芽細胞を筋原細
胞に変換する」、Cell 51:987-1000, 1987 Diatchenkoら、「抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション:示差的に制御
されたまたは組織特異的cDNAプローブとライブラリーの作成方法」、Proc.
Natl. Acad. Sci., Vol. 93, pp. 6025-6030 (1996) Ehrenfeld, 「ピコルナウイルスRNAによる翻訳の開始」、Translational Con
trol, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 549-573, 1996 Hadmanら、「示差的表示法の修飾はバックグランドを低減させ感度を上昇させる
」、Analytical Biochemistry 226:383-386 (1995) Hanauske-Abelら、「G1−S境界でヒプシン(hypusine)生成の調節に関連す
るポリソームmRNAのサブセットの検出。DNA複製の開始におけるEIF−
5Aの役割の提唱」、FEBS Letters 386 pp. 92-98 (1995) Hiramaら、「単離したポリソーム画分からのポリアデニル化RNAの直接精製」
、Analytical Biochemistry, 155, pp. 385-390 (1986) HubangとSchatz、「cDNAのリプリゼンテーショナル示差的分析によるmRN
A発現の差の同定」、Nucleic Acids Research, Vol. 22, No. 25, p. 5640-564
8 (1994) Jerreriesら、「伸長因子−1α mRNAは有糸***促進物質による刺激によ
り選択的に翻訳される」、The Journal of Biological Chemistry, Vol. 269, N
o. 6, pp. 4367-4372 (1994) LiangとPardee、「ポリメラーゼチェイン反応による真核生物メッセンジャーR
NAの示差的表示」、Science, Vol. 257, pp. 967-971 (1992) Liangら、「示差的表示による真核生物mRNAの分布とクローニング:改良と
最適化」、Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 14, pp. 3269-3275 (1993)
LiangとPardee、「示差的表示の最近の進歩」、Current Opinion in Immunology
, 7:274-280 (1995) Linskensら、「増強示差的表示を使用する若い細胞と老化細胞における改変遺伝
子発現の分類」、Nuc. Ac. Res. 23:3244-3251 (1995) LisitsynとWigler、「2つの複合ゲノムの差をクローニング」、Science, Vol.
259, pp. 946-951 (1993) Machら、「S−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼをコードするcDNA
クローンの単離」、The Annual of Biological Chemistry, Vol. 261, No. 25,
pp. 11697-11703 (1986) Macejakら、「細胞性mRNAの5’リーダーに介在される翻訳の内部開始」、N
ature, Vol. 353, pp. 990-994 (1991) Mechler、「膜結合ポリソームからのメッセンジャーRNAの単離」、Methods i
n Enzymology, Vol. 152, pp. 241-253 (1987) Menakerら、「線形ショ糖密度勾配によるラット顎下唾液腺ポリソームの単離方
法」、Analytical Biochemistry 57, pp. 325-335 (1974) Meyuhasら、「真核生物におけるリボゾームタンパク質mRNAの翻訳調節」、T
ranslational control, pp. 363-388 (1996) Mountfordら、「哺乳動物トランス遺伝子中の内部リボゾーム侵入部位とディシ
スロトニック(dicistronic)RNA」、TIG, Vol. 11, No. 5, pp. 179-184 (1
995) Ogishimaら、「高性能ゲルろ過クロマトグラフィーによる哺乳動物組織mRNA
の分画」、Analytical Biochemistry, 138, pp. 309-313 (1984) Ohら、「遺伝子制御:内部リボゾーム結合による翻訳開始」、Current Opinion
in Genetics and develpment, pp. 295-300 (1993) Pelletierら、「ポリオウイルスRNAから得られる配列に指令される真核生物
mRNAの翻訳の内部開始」、Nature, Vol. 334, pp. 320-325 (1988) Schenaら、「相補的なDNAマイクロアレイを有する遺伝子発現パターンの定量
的モニタリング」、Science, Vol. 270, pp. 467-470 (1995) Schenら、「迅速な発現クローニングと示差的RNAディスプレイによるヒト前
立腺癌癌遺伝子の同定」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, pp. 6778-67
82 (1995) Vagnerら、「リボゾームの内部侵入によるヒト繊維芽細胞増殖因子2 mRNA
の代替翻訳」、Molecular and Cellular Biology, Vol. 15, No.1, pp. 35-44 (
1995) Welshら、「RNAの任意のプライムPCRフィンガープリンティング」、Nuc.
Ac. Res. 20:4965-4970 (1992) Zhaoら、「新しいプライマー方策は示差的表示の正確度を改善する」、Biotechn
iques 18:842-850 (1995)
【配列表】
本発明の他の利点は、添付の図面とともに詳細な説明を参照して容易に理解さ
れるであろう。
れるであろう。
【図1A】 図1Aは、ショ糖密度勾配上の細胞質RNAの分画の吸光度プロフィールであ
り、吸光度(254nm)は細胞質RNAの沈降速度に対してプロットしてある。
り、吸光度(254nm)は細胞質RNAの沈降速度に対してプロットしてある。
【図1B】 図1Bは、アガロースゲルで電気泳動し臭化エチジウムで染色した精製RNA
の写真であり、RNAの分画を示す。
の写真であり、RNAの分画を示す。
【図2】 図2は、全RNAのプローブをポリソームRNA由来のプローブ(翻訳プロー
ブ)と比較したDNAチップハイブリダイゼーション結果のカラー表示である。
ブ)と比較したDNAチップハイブリダイゼーション結果のカラー表示である。
【図3】 図3は、全RNAのプローブ(Tot)を核RNA由来のプローブ(STP)
と比較したDNAチップハイブリダイゼーション結果のカラー表示である。
と比較したDNAチップハイブリダイゼーション結果のカラー表示である。
【図4】 図4A〜Cは、(A)プラスミドpTK−OP3−WT2A中、(B)プラス
ミドミニTK−WT2A中、および(C)ヒグロマイシン選択マーカーを含有す
るプラスミド中、のポリオウイルス2A遺伝子を含有するプラスミドの模式図で
ある。
ミドミニTK−WT2A中、および(C)ヒグロマイシン選択マーカーを含有す
るプラスミド中、のポリオウイルス2A遺伝子を含有するプラスミドの模式図で
ある。
【図5】 図5は、2Aプロテアーゼの誘導後に細胞の死に至るポリオウイルス2Aプロ
テアーゼの誘導を例示するグラフである。
テアーゼの誘導を例示するグラフである。
【図6】 図6は、IPTGによる誘導後の形質転換HEK−293細胞(293−2A
)中のポリオウイルス2Aプロテアーゼ発現の存在と、IPTGによる処理後の
HEK−293(293)親細胞中のポリオウイルス2Aプロテアーゼの欠如を
示すゲルの写真である、および
)中のポリオウイルス2Aプロテアーゼ発現の存在と、IPTGによる処理後の
HEK−293(293)親細胞中のポリオウイルス2Aプロテアーゼの欠如を
示すゲルの写真である、および
【図7】 図7は、40Sリボゾームサブユニットのp220タンパク質成分の切断にお
けるポリオウイルス2Aプロテアーゼの活性を示すウェスタンブロットの写真で
あり、ポリオウイルス2Aプロテアーゼについて誘導したクローンがp220タ
ンパク質の切断産物を生成したことを示している。
けるポリオウイルス2Aプロテアーゼの活性を示すウェスタンブロットの写真で
あり、ポリオウイルス2Aプロテアーゼについて誘導したクローンがp220タ
ンパク質の切断産物を生成したことを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU, CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,G E,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS ,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK, LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,M N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU ,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM, TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,Z A,ZW (72)発明者 モル、オルナ イスラエル国 キルヤット オノ、ガネイ イラン、エメク アイアロン 12 (72)発明者 ルリア、シルビア イスラエル国 ネス ー ジオナ、ハバニ ム 113/17 (72)発明者 ハリス、ニコラス イスラエル国 レホボト、ナハシ ハリス ホン 14/17 (72)発明者 グロスマン、ゼハバ イスラエル国 レホボト、タラン ストリ ート 20 Fターム(参考) 4B024 AA11 BA80 CA12 DA02 4B063 QA01 QQ36 QQ53 QQ59 QR32 QR55 4B064 AF27 CA10 CA19 CC24 DA13
Claims (28)
- 【請求項1】 その発現が、特異的な合図(cue or cues)に応答性である
遺伝子を同定するための方法またはプロセスであって、 (a)生物または組織または細胞に合図を適用する工程、 (b)合図を受けた組織または細胞から特異的細胞画分を単離する工程、 (c)細胞画分からmRNAを抽出する工程;および (d)mRNA試料を合図を受けなかった対照試料と比較して示差的分析して
、合図に応答した遺伝子を同定する工程、 を含む、上記方法またはプロセス。 - 【請求項2】 合図は、毒素または化学物質、または薬剤、または機械的ス
トレス、または電流、または病原体または病態、またはホルモン、または特異的
タンパク質である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 合図は、細胞の化学的処理、または細胞の放射線照射、また
は細胞の酸素欠乏としてさらに定義される、請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 合図は、遺伝子翻訳との関係が未知であるストレス誘導性要
素としてさらに定義される、請求項2に記載の方法。 - 【請求項5】 遺伝子は、翻訳レベルで同定され;遺伝子は、転写レベルで
制御され;遺伝子は、RNA安定性により制御され;遺伝子は、核と細胞質との
間のmRNA輸送速度により制御され;遺伝子は、示差スプライシングにより制
御され;そして遺伝子は、アンチセンスRNAにより制御される、請求項1に記
載の方法。 - 【請求項6】 mRNA試料は、さらにmRNAサブ画分に分画され、そし
てこれらは、本明細書に定義されるように、発現制御の全てのレベルで合図に応
答する遺伝子を同定するために、および応答の量および方向を測定するために、
示差的分析に付される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 mRNA試料は、本質的に細胞質、核、ポリリボソーム、サ
ブポリリボソーム、ミクロソームまたは粗面小胞体、ミトコンドリアおよびスプ
ライスソーム(splicesome)結合mRNAよりなる群からの1つまたはそれ以上
のサブ画分に分画される、請求項6に記載の方法。 - 【請求項8】 示差的分析工程は、示差的表示法(differential display)
、レプレゼンテーショナル示差的分析(representational differential analys
is)(RDA)、抑制サブトラクションハイブリダイゼーション(suppressive
subtraction hybridization)(SSH)、遺伝子発現の連続分析(serial anal
ysis of gene expression)(SAGE)、遺伝子発現マイクロアレイ法(gene
expression microarray)(GEM)、核酸チップ法(nucleic acid chip techn
ology)、オリゴヌクレオチドチップ法(oligonucleotide chip technology);
DNA膜アレイ法(DNA membrane arrays);直接配列決定法、およびこれらの
方法の変法および組合せよりなる群から選択される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項9】 示差的分析工程は、翻訳レベルで制御される遺伝子を同定お
よび測定することとしてさらに定義される、請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 示差的分析工程は、転写レベルで制御される遺伝子を同定
および測定することとしてさらに定義される、請求項8に記載の方法。 - 【請求項11】 示差的分析工程は、RNA安定性により制御される遺伝子
を同定および測定することとしてさらに定義される、請求項8に記載の方法。 - 【請求項12】 示差的分析工程は、核と細胞質との間のmRNA輸送速度
により制御される遺伝子を同定および測定することとしてさらに定義される、請
求項8に記載の方法。 - 【請求項13】 示差的分析工程は、示差スプライシングにより制御される
遺伝子を同定および測定することとしてさらに定義される、請求項8に記載の方
法。 - 【請求項14】 示差的分析工程は、分泌タンパク質および膜タンパク質を
コードする遺伝子を同定および測定することとしてさらに定義される、請求項8
に記載の方法。 - 【請求項15】 示差的分析工程は、核タンパク質をコードする遺伝子を同
定および測定することとしてさらに定義される、請求項8に記載の方法。 - 【請求項16】 内部リボゾーム侵入部位をコードする遺伝子配列を同定す
る方法であって、 細胞内の5’キャップ依存性mRNA翻訳を阻害する工程; 細胞からmRNAのプールを回収する工程;および 内部リボゾーム侵入部位をコードする配列を含む遺伝子を同定するためにmR
NAのプールを示差的分析する工程、 を含んでなる、上記方法。 - 【請求項17】 阻害工程は、非5’キャップ依存性mRNA翻訳を選択す
ることとしてさらに定義される、請求項16に記載の方法。 - 【請求項18】 阻害工程は、ポリオウイルス2Aプロテアーゼをコードす
る遺伝子を細胞中に組み込む工程をさらに含む、請求項16に記載の方法。 - 【請求項19】 組み込み工程は、ポリオウイルス2Aプロテアーゼをコー
ドする遺伝子を含有するベクターで細胞を形質転換することとしてさらに定義さ
れる、請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】 ポリオウイルス2Aプロテアーゼをコードする遺伝子の発
現を制御する工程を含む、請求項18に記載の方法。 - 【請求項21】 分析工程は、示差的表示分析としてさらに定義される、請
求項16に記載の方法。 - 【請求項22】 分析工程は、レプレゼンテーショナル示差的分析としてさ
らに定義される、請求項16に記載の方法。 - 【請求項23】 分析工程は、遺伝子発現マイクロアレイ分析の実施として
さらに定義される、請求項16に記載の方法。 - 【請求項24】 翻訳的に制御されるものとして同定される遺伝子をクロー
ン化するさらなる工程を含む、請求項16に記載の方法。 - 【請求項25】 分析工程は、個々にまたはプールとして、同じ密度で移動
するポリソーム画分を識別する、請求項16に記載の方法。 - 【請求項26】 分析工程は、個々にまたはプールとして、非ポリソーム画
分を区別する、請求項16に記載の方法。 - 【請求項27】 分析工程は、個々にまたはプールとして、刺激ポリソーム
および非ポリソーム画分を区別する、請求項16に記載の方法。 - 【請求項28】 分析工程は、非分画全RNAプールに比較して、個々に、
またはプールとして、ポリソームおよび非ポリソーム画分のそれぞれを区別する
、請求項16に記載の方法。
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