JP2002514441A

JP2002514441A - 遺伝子の同定方法

Info

Publication number: JP2002514441A
Application number: JP2000548509A
Authority: JP
Inventors: エイナット、パズ; スカリター、ラミ; モル、オルナ; ルリア、シルビア; ハリス、ニコラス; グロスマン、ゼハバ
Original assignee: クアークバイオテクインコーポレイテッド
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2002-05-21
Also published as: EP1002135A1; WO1999058718A1; AU3981799A; US20020037511A1; IL133673A0

Abstract

(57)【要約】合図に誘導される遺伝子発現により、ＲＮＡレベルで制御される遺伝子を同定する方法。本発明は、特異的な細胞区画から得られるｍＲＮＡを分析し、試験生物的試料に合図を適用した結果としてのこれらの区画中のｍＲＮＡの相対量の変化を比較することによる、示差的に発現される遺伝子または発生的に制御される遺伝子の迅速な単離に関する。細胞区画は、ポリソームと非ポリソーム画分、核画分、細胞質画分、およびスプライソソーム画分を含む。任意の１つまたはそれ以上のレベルでの制御により示差的に発現される遺伝子が性状解析される。制御レベルは、翻訳制御、転写制御、ｍＲＮＡ安定性制御、およびｍＲＮＡ輸送制御を含む。内部リボゾーム侵入部位をコードする遺伝子配列の同定方法も提供され、これは、細胞中の５’キャップ依存性ｍＲＮＡ翻訳を阻害し、細胞からｍＲＮＡのプールを回収し、そしてｍＲＮＡのプールを示差的に分析して内部リボゾーム侵入部位をコードする配列を有する遺伝子を同定する、ことを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願への相互参照本出願は、１９９８年５月１１日出願の米国仮特許出願第６０／０８４，９４
４号の転換出願であり、これに優先権を主張する。

【０００２】（発明の背景）（技術分野）本発明は、ＲＮＡレベルで制御される遺伝子を同定する方法に関する。さらに
詳しくは本発明は、特異的な細胞区画から得られるｍＲＮＡの分析により、示差
的に発現される遺伝子または発生的に制御される遺伝子の迅速な単離に関する。
試験生物学的試料への合図または刺激の適用の結果として存在する、これらの区
画に見い出されるｍＲＮＡの相対量の変化を比較することにより、示差的に発現
される遺伝子を性状解析することができる。

【０００３】（背景技術）その発現が、２つのタイプの細胞または組織の間、またはストレス状態、化合
物もしくは病原体に暴露された細胞または組織の間で異なる、遺伝子の同定およ
び／または単離は、種々の生理学的状態、障害、または疾患の根底にある機作の
理解に決定的に重要である。遺伝子発現の制御は、胚発生、加齢、組織修復、お
よび悪性形質転換を含む多くの生物学的プロセスにおいて、重要な役割を果たす
ことが証明されている。遺伝子発現の制御は、転写制御、翻訳制御、ｍＲＮＡ安
定性の制御、ｍＲＮＡ輸送の制御、天然のアンチセンスｍＲＮＡによる制御およ
び代替スプライシングによる制御を含む、多くのレベルで存在しうる。しかしこ
うして制御される遺伝子が文献に報告されているが、現在までにたどった遺伝子
発見のアプローチは、全細胞内ＲＮＡの分析による細胞内ｍＲＮＡの「定常状態
」レベルでの変化を検討しただけであった。

【０００４】発生的、生理学的、薬理学的、または他の合図された事象に応答して活性化ま
たは抑制される遺伝子の検出と単離のために、多くの方法が開発されている。１
つの具体的な方法は、ゼン（Zeng）の米国特許第５，５２５，４７１号に記載さ
れているサブトラクティブハイブリダイゼーション（subtractive hybridizatio
n）である。サブトラクティブハイブリダイゼーションは、１つのＤＮＡまたは
ＲＮＡ集団に存在するが、別の集団には存在しない配列を選択的にクローン化す
るための特に有用な方法であるが、より微妙な差には感受性が低い。選択的クロ
ーン化は、対照細胞／組織（ドライバーｃＤＮＡ）と、研究される具体的な変化
または応答の間または後の細胞／組織（テスターｃＤＮＡ）との両方から、１本
鎖相補的ＤＮＡライブラリーを生成させることにより達成される。２つのｃＤＮ
Ａライブラリーを、変性し相互にハイブリダイズさせると、ドライバーｃＤＮＡ
とテスターｃＤＮＡ鎖の間で２本鎖が形成される。この方法では、共通配列は除
去されて、残りのハイブリダイズしなかった１本鎖ＤＮＡは、研究される具体的
な変化または事象に関係した実験細胞／組織に存在する配列が濃縮される。（デ
イビス（Davis）ら、１９８７年）。

【０００５】合図または刺激により誘導／減少されるタンパク質をコードするｍＲＮＡを同
定するために現在使用されている方法は、示差的に発現されるｍＲＮＡのスクリ
ーニングを介する定常状態のｍＲＮＡレベルの変化に依存している。示差的に発
現されるｍＲＮＡの同定のためのこのような方法の１つは、サトクリフ（Sutcli
ffe）らの米国特許第５，４５９，０３７号に開示されている。この方法により
、あるｍＲＮＡ集団が単離され、１２個のアンカープライマーの混合物を使用し
て２本鎖ｃＤＮＡがｍＲＮＡ集団から調製され、ｃＤＮＡが２つの制限エンドヌ
クレアーゼで切断され、次いでベクター内のＴ３プロモーターに対してアンチセ
ンスであるような配向でベクター中に挿入される。大腸菌（E. coli）を、ベク
ターを含有するｃＤＮＡで形質転換して、第１および第２の制限エンドヌクレア
ーゼとは異なる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで消化してクローン化
した挿入配列から、線状化断片を作成し、そしてＴ３ＲＮＡポリメラーゼと共
に線状化断片をインキュベートすることにより、アンチセンスｃＤＮＡ転写体の
ｃＤＮＡ調製物を作成する。ｃＤＮＡ集団をサブプールに分割して、各サブプー
ルからの第１鎖ｃＤＮＡを、熱安定性逆転写酵素および１６個のプライマーの１
つを使用して転写する。１６個の反応プールのそれぞれの転写産物を、３’−プ
ライマーおよび５’−プライマーを用いるポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）
のための鋳型として使用し、試料中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表すバンド
を表示するために、ポリメラーゼチェイン反応で増幅した断片を電気泳動により
分離する。この方法は、示差的に発現されるｍＲＮＡの同定およびこれらの相対
濃度の測定のために有用である。しかしこのタイプの方法は、そのレベルが一定
に残存するがその翻訳性が可変であるかまたは変化するｍＲＮＡ、あるいは核か
ら細胞質へのｍＲＮＡ輸送の変化により生じる差を同定することができない。

【０００６】スケーナ（Schena）らは、マイクロアレイを利用する並行して多くの遺伝子の
発現を追跡するための高能力システムを開発した。マイクロアレイは、ガラスへ
のｃＤＮＡの高速ロボット印刷により調製して、対応する遺伝子の定量的発現測
定を可能にする（スケーナ（Schena）ら、１９９５年）。遺伝子の示差的発現測
定は、同時２色蛍光ハイブリダイゼーションにより行われる。しかしこの方法単
独では、感度が限定され、翻訳的に制御される遺伝子およびｍＲＮＡ輸送制御を
含む、数種のタイプの制御レベルの同定には不充分である。著者らは、転写活性
の直接評価を可能にする特別なｍＲＮＡプールの使用は検討しなかった。

【０００７】ハイプシン形成の既知インヒビターであるミモシンを使用して、そのポリソー
ムｍＲＮＡ集団対非ポリソームｍＲＮＡ集団を示差的に表示しながら、細胞中の
ハイプシン形成性デオキシハイプシルヒドロキシラーゼを可逆的に抑制した。（
ハナウスケ−アベル（Hanauske-Abel）ら、１９９５年）。この方法を利用して
、ハイプシン形成の阻害および脱阻害に関連してポリソームで、それぞれ消失お
よび再出現し、そして翻訳的に制御される酵素をコードすると考えられる、数種
類のｍＲＮＡが発見された。この方法は、翻訳的に制御される遺伝子を同定する
ために、既知の刺激要素（すなわち、誘導物質またはリプレッサー）の使用を教
示するだけである。（この方法は、刺激要素が未知である場合、翻訳的に制御さ
れる遺伝子の検出および／または同定のための機作を提供しない）。遺伝子発見
のための示差的表示法の使用は、処理能力と感度が非常に限定され、多く技巧の
影響を受ける。本出願の主題は、ＤＮＡチップ分析用のプローブの供給源として
ポリソームｍＲＮＡプールの使用を包含しない。これは実際、大量の高品質のポ
リソームｍＲＮＡを入手するために、方法の特別な改良を必要とする。

【０００８】一般に、真核生物ｍＲＮＡの翻訳は、５’キャップ介在性リボソーム結合に依
存する。翻訳の前に、リボソームの小サブユニット（４０Ｓ）は、転写体上の５
’キャップ構造に結合し、次に翻訳開始部位までｍＲＮＡ分子に沿って走査しつ
つ前進して、そこで大サブユニット（６０Ｓ）が、完全なリボソーム開始部位を
形成する。多くの例において、翻訳開始部位は、第１のＡＵＧコドンである。翻
訳開始のこの「走査モデル」は、ほとんどの真核生物ｍＲＮＡに適応する。「走
査モデル」に対する少数の顕著な例外は、ピコルナウイルスファミリーにより提
供される。これらのウイルスは、多数の非翻訳開始ＡＵＧコドンを含有する長い
（６００〜１２００ヌクレオチド）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を有する非キャッ
プ付与転写体を産生する。キャップ構造が存在しないため、これらのＲＮＡの翻
訳効率は、内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）として知られている非翻訳領域
（ＵＴＲ）内の特異的配列の存在に依存する。

【０００９】さらに最近になって、ｍＲＮＡ転写体を含有するＩＲＥＳが、免疫グロブリン
重鎖結合タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ドロソフィラ（Drosophila）のアン
テナペディア（antenapedia）遺伝子、およびマウスＦｇｌ−２遺伝子のような
、非ウイルス系で発見されている。これらの発見により、正常プローブおよび異
常プローブの両方の間の遺伝子発現の発生的制御におけるキャップ非依存性翻訳
の役割に関する考察が促進された。

【００１０】ｍＲＮＡを含有する上記非ウイルスＩＲＥＳの発見は、真核生物ＩＲＥＳ配列
が、以前に実現されていたよりもさらに広がっていることを暗示している。真核
生物ＩＲＥＳ配列を同定する上での困難さは、これらが典型的には配列相同性に
より同定することができないという事実にある。［オー（Oh）ら、１９９３年；
マウントフォード（Mountford）ら、１９９５年；マセジャック（Macejak）ら、
１９９１年；ペレティア（Pelletier）ら、１９８８年；ヴァグナー（Vagner）
ら、１９９５年］従って、正常および異常プロセスの両方とのこれらの結合を確
認および評価するために、５’キャップ非依存性翻訳を介して機能する翻訳的に
制御される遺伝子を同定するために、ｍＲＮＡを含有するＩＲＥＳを同定するた
めの方法を持つことは有利であろう。

【００１１】先行技術の方法は、遺伝子発現制御の非常に狭い側面に注目しており、従って
多くの本質的な限界を有する方法を使用してきた。従って、遺伝子発現制御レベ
ルの整理された情報の拡大を可能にし、従って生物学的に重要な遺伝子の単離を
可能にする方法を持つことが望ましいであろう。

【００１２】（発明の要約）本発明により、多くの可能な制御レベルで制御される遺伝子の同定方法が提供
される。このような方法は、細胞または組織を、機械的、化学的、毒性の、薬剤
学的または他のストレス、ホルモン、生理学的障害または疾患のような、合図ま
たは刺激に暴露する工程；細胞を、ポリソーム、核、細胞質およびスプラソソー
ムのような区画に分画する工程；これらの画分からｍＲＮＡを抽出し、そしてこ
れらのｍＲＮＡを、遺伝子発現アレイ（ＧＥＭ）のような許容されている方法を
使用して示差的分析に付す工程を含む。

【００１３】定常状態レベルがわずかな変化しか示さないが、核ＲＮＡプローブにより検出
すると非常に示差的な発現を示す遺伝子を単離するための、核からのＲＮＡの単
離の利用する例が提供される。多くのこのような遺伝子は、転写レベルで制御さ
れる。そのｍＲＮＡの定常状態レベルは変化しないが、ストレス合図の適用後ポ
リソーム内で非常に増加する遺伝子を同定するための、細胞／組織から単離され
るポリソームを利用する１つのタイプの制御の別の例が提供される。このような
遺伝子は、翻訳レベルで厳密に制御される。

【００１４】翻訳レベルで制御される遺伝子のサブグループは、内部リボゾーム侵入部位の
存在を伴う。細胞内の５’キャップ依存性ｍＲＮＡ翻訳を阻害すること、細胞か
らｍＲＮＡのプールを回収すること、およびｍＲＮＡのプールを示差的分析して
内部リボゾーム侵入部位をコードする配列を含む遺伝子を同定することを含む、
このような遺伝子の同定のための方法が提供される。

【００１５】（発明の詳細な説明）ストレス誘導性要素で未知の標的ｍＲＮＡ（より大きな試料の一部である）を
選択的に刺激することにより、発現が少なくとも部分的にｍＲＮＡレベルで制御
される遺伝子を同定する方法。生物は、適切なｍＲＮＡを提供する任意の生物で
あってよい。ｍＲＮＡ試料は、ストレス誘導性要素により翻訳的に制御される遺
伝子を同定するために示差的分析される、発現制御およびタンパク質局在に基づ
く細胞内区画に由来する。本方法は、特異的な合図に応答性の遺伝子を同定およ
びクローン化するために設計される。すなわち本方法は、特異的な病態、ストレ
ス、生理学状態など、および一般に細胞または生物にその遺伝子発現を改変させ
る影響を及ぼしうる任意の因子に応答して、アップレギュレートまたはダウンレ
ギュレートされる遺伝子を同定およびクローン化するために設計される。

【００１６】本発明の方法は、基本的な細胞機能に関与し、生物内の任意のレベルで制御さ
れる、遺伝子の同定およびクローン化への新規なアプローチを提供する。本方法
の基礎となる理論は、遺伝子発現の制御が、異なるレベル（様式）で制御するこ
とができるという知識、および異なる各制御レベルが、細胞内の特異的ｍＲＮＡ
の分布におけるいくらかの差により表されるという知見に基づいている。翻訳に
より制御される遺伝子ではｍＲＮＡは、不活性化型の細胞に貯蔵され、ポリソー
ムには見い出されない。適切な外部からの合図により、ｍＲＮＡはポリソーム中
に組み込まれ、翻訳され、そしてコードされるタンパク質が急速に出現する。所
定の時点で「活性な」または「非活性な」ｍＲＮＡを比較することにより、「シ
フト機作」と呼ばれる機作により制御される遺伝子を同定することができる。

【００１７】主要な制御レベルが核から細胞質へのｍＲＮＡの能動輸送である遺伝子は、核
に貯蔵され、そして適切な合図でｍＲＮＡは細胞質に輸送される。合図の前後に
核および細胞質から単離されるｍＲＮＡの比較により、このように制御される遺
伝子が発見される。核に由来するｍＲＮＡの比較によっても、多くの遺伝子の転
写活性の直接分析が可能になる。転写で活性化される多くの遺伝子では、その基
礎転写活性が低いときでさえ、基礎レベルのｍＲＮＡが細胞内に存在する。従っ
て、増大した転写（５倍まで）は、全細胞内ＲＮＡが、遺伝子発現の示差的分析
に使用されるときにはしばしば不明確になる。核ＲＮＡを使用すると、基礎ｍＲ
ＮＡが細胞質中に見い出されるため、多くの遺伝子の転写活性を直接測定するこ
とができる。その結果、示差的発現の検出のための感度が大きく増大する。

【００１８】ｍＲＮＡ安定性の制御の場合には、このようなｍＲＮＡは、合図を与える前後
に同様に転写され、その結果核ｍＲＮＡプールの同様な量となることが予測され
る。しかし、合図後にｍＲＮＡが安定化されるならば、細胞質におけるその量は
より多くなる。ｍＲＮＡ輸送の制御の場合には、このようなｍＲＮＡは合図の前
には核内には高レベルで、そして細胞質には低レベルで存在することが予測され
るが、この状況は、合図を与えた後には逆転する。従ってこの２つの制御様式を
区別することは容易である。

【００１９】本発明の方法は、翻訳レベルで同定される遺伝子；転写レベルで制御される遺
伝子；ＲＮＡ安定性により制御される遺伝子；核と細胞質との間のｍＲＮＡ輸送
速度により制御される遺伝子；および示差スプライシングにより制御される遺伝
子の同定を含む。すなわち、その発現が少なくとも一部はｍＲＮＡレベルで調節
または制御される遺伝子を同定することができる。

【００２０】本方法は、分泌タンパク質および膜タンパク質をコードする遺伝子；核タンパ
ク質をコードする遺伝子；ミトコンドリアタンパク質をコードする遺伝子；およ
び細胞骨格タンパク質をコードする遺伝子を同定するであろう。さらに、その発
現がｍＲＮＡレベルで調節できる他の任意の遺伝子を、この方法により同定する
ことができる。

【００２１】本明細書において使用されるとき、ＲＮＡとは、細胞培養物、培養組織、また
は刺激され、識別され、区別され、化合物に暴露された生物、病原体で感染され
たかもしくは刺激された生物から単離される細胞または組織から単離される、Ｒ
ＮＡを意味する。本明細書において使用されるとき、翻訳とは、ｍＲＮＡ鋳型上
のタンパク質の合成として定義される。

【００２２】本明細書において使用されるとき、未知の標的ｍＲＮＡまたは刺激要素の翻訳
、転写、安定性または輸送の刺激は、病態および／またはストレス状態下の未変
性組織および／または細胞から誘導しうる遺伝子からのｍＲＮＡ集団を、化学的
に、病理的に、物理的に、またはその他で、誘導または抑制することを含む。す
なわち、ストレス誘導性要素または「ストレッサー」による遺伝子のｍＲＮＡの
発現の刺激は、試料の細胞内に非翻訳ｍＲＮＡとして貯蔵されるｍＲＮＡの翻訳
を刺激するかまたは開始する、外部合図または刺激の適用を含むことができる。
ストレッサーは、ある種のｍＲＮＡの安定性の増大を引き起こしうるか、または
核から細胞質への特異的ｍＲＮＡの輸送を誘導しうる。ストレッサーはまた、遺
伝子転写を誘導してもよい。未変性細胞／組織内の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳
を刺激すること以外に、刺激は、病態および／またはストレス条件下の遺伝子の
誘導および／または抑制を含んでよい。本方法は、ストレス誘導性要素またはス
トレッサーにより種々の可能なレベルで制御される未知の標的遺伝子を同定する
ために、刺激またはストレッサーを利用する。

【００２３】本発明の方法は、本来別々に使用されていた以前から知られている２つのタイ
プの方法を相乗的に統合している。第１の方法は、ポリソーム、核、細胞質また
はスプライソソームから誘導されるｍＲＮＡの別々のプールへの、細胞内ｍＲＮ
Ａの分割である。第２の方法は、示差的表示法、レプレゼンテーショナル示差的
分析（ＲＤＡ）、遺伝子発現マイクロアレイ法（ＧＥＭ）、抑制サブトラクショ
ンハイブリダイゼーション法（ＳＳＨ）（ディアチェンコ（Diatchenko）ら、１
９９６年）、およびオリゴヌクレオチドチップ法（例えば、アフィマックス・テ
クノロジーズ社（Affymax Technologies N.V.）に譲渡されたラバ（Rava）らの
米国特許第５，５４５，５３１号に例証されたチップ法およびハイセク社（Hyse
q, Inc.）のＷＯ９６／１７９５７号特許出願に例示された直接配列決定法）の
ような示差的分析の方法による、別々のプールに見い出されるｍＲＮＡ種の相対
量の同時比較を伴う。

【００２４】簡単に述べると、サブトラクティブハイブリダイゼーションは、溶液中のハイ
ブリッド形成によるｍＲＮＡの引き算（subtraction）として定義される。２つ
のプールに共通のＲＮＡは除去できる二本鎖を形成して、１つのプールに独特で
あるかまたはより豊富にあるＲＮＡが濃縮される。示差的表示法は、ｃＤＮＡへ
のｍＲＮＡの逆転写および変性プライマーによるＰＣＲ増幅として定義される。
２つのプールからの増幅産物の量の比較（電気泳動による）により、転写の量が
示される。ＲＤＡ、ＧＥＭ、ＳＳＨ、ＳＡＧＥは、本明細書に上記されている。

【００２５】翻訳的に制御される遺伝子を同定するために分析すべき特定の細胞／組織は、
任意の適切な細胞および／または組織を含んでよい。樹立された細胞株または培
養物であろうと、または暴露された生物から直接単離されたものであろうと、任
意のタイプの細胞または組織を使用することができる。

【００２６】本方法で分析される細胞／組織は、試料組織内のｍＲＮＡの翻訳を刺激するた
め、およびその発現が少なくとも一部はｍＲＮＡレベルで制御される遺伝子を同
定するために、生理学的、化学的、環境的および／または病的ストレス誘導性要
素またはストレッサーを使用して、選択的に刺激または「ストレス」をかけられ
る。刺激は、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを引き起こ
しうる。刺激後、ＲＮＡは細胞／組織から単離または抽出する。ＲＮＡの単離は
、当業者には周知の方法を利用して行うことができ、そしてこれらは、例えば、
「分子クローニング；実験室マニュアル（Molecular Cloning; A Laboratory Ma
nual）」（コールド・スプリングス・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold S
prings Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー、ニューヨー
ク、１９８９年）に記載されている。細胞／組織からのＲＮＡの単離および抽出
のための他の方法を使用することができ、これらは当業者には知るところとなろ
う。（マッハ（Mach）ら、１９８６年、ジェフェリーズ（Jefferies）ら、１９
９４年）。しかしこれらの方法の変法も公表されている。本明細書に記載される
方法は、多くの試験後に注意深く選択した。

【００２７】翻訳に活発に取り込まれるｍＲＮＡおよび非翻訳のまま残るｍＲＮＡは、ショ
糖密度勾配、高性能ゲル濾過クロマトグラフィー、またはポリアクリルアミドゲ
ルマトリックス分離（オギシマ（Ogishima）ら、１９８４年、メナカー（Menake
r）ら、１９７４年、ヒラマ（Hirama）ら、１９８６年、メクラー（Mechler）、
１９８７年、およびバルーチャ（Bharucha）とマーシー（Murthy）、１９９２年
）上の分画のような方法を利用して分離することができ、これは、翻訳されるｍ
ＲＮＡはリボソームを負荷されこのため密度勾配上で、リボソームを負荷されな
い非翻訳のｍＲＮＡとは移動が異なるためである。所定の時点で翻訳において活
性なまたは非活性なｍＲＮＡ集団を比較することにより、「シフト機作」により
制御される遺伝子を同定することができる。

【００２８】ポリソームの分画および特異的分析は、転写または翻訳を特異的に阻害または
制御する薬物により標的細胞／組織を処理することにより促進することができる
。このような薬物の例は、それぞれアクチノマイシンＤおよびシクロヘキサミド
である。

【００２９】分画は、ポリソームのサブ分割物を作って完了することができる。このサブ分
割物は、当該分野において既知の方法（メクラー（Mechler）、１９８７年）に
より、全ポリリボソームまたは膜結合リボソームを区別するために作成すること
ができる。さらに、ｍＲＮＡ試料は、以下のサブセグメントまたは画分の１つま
たはそれ以上（細胞質、核、ポリリボソーム、サブポリリボソーム、ミクロソー
ムまたは粗面小胞体、ミトコンドリアおよびスプライソソームに結合したｍＲＮ
Ａ）に、当該分野で公知の方法により追加的に分画することができる（表１も参
照のこと）。

【００３０】さらに詳しくは、核画分は、実験セクションに記載されるように「豊富な核内
リボ核タンパク質型のＣＡＤＲＮＡ（Abundant Nuclear Ribonucleoprotein F
orm of CAD RNA）」と題した論文（スパーリング（Sperling）、１９８４年）に
記載の方法を使用して入手することができ、このためストレス状態に制御される
かまたは応答性である遺伝子を同定する方法のために、核ＲＮＡを利用すること
ができる。さらに、特異的病態またはストレス状態に応答性である遺伝子を同定
する方法として、アンチセンスＲＮＡを利用することができる。アンチセンスＲ
ＮＡは、ディミトリジェビック（Dimitrijevic）に記載の方法（この要約は、試
料からアンチセンスＲＮＡを入手および単離するために使用される方法を詳述し
ている）を使用して単離することができる。さらに、ミクロソーム画分は、ウォ
ルター（Walter）とブローベル（Blobel）により１９８３年に開示された方法の
変法である実験セクションに記載された本発明の方法を使用して入手することが
できる。

【００３１】全ｍＲＮＡ集団を別々のｍＲＮＡの発現制御およびタンパク質局在プールへ単
離および分割後、これらのプールに存在する多くのｍＲＮＡ種の相対量は、示差
的表示法、オリゴヌクレオチドチップ法、レプレゼンテーショナル示差的分析（
ＲＤＡ）、ＧＥＭ−遺伝子発現マイクロアレイ法（スケーナ（Schena）ら、１９
９５年、アイエロ（Aiello）ら、１９９４年、シェン（Shen）ら、１９９５年、
バウアー（Bauer）ら、１９９３年、リャン（Liang）とパーディー（Pardee）、
１９９２年、リャン（Liang）とパーディー（Pardee）、１９９５年、リャン（L
iang）ら、１９９３年、ブラウン（Braun）ら、１９９５年、ヒューバンク（Hub
ank）とシャッツ（Schatz）、１９９４年）および抑制サブトラクションハイブ
リダイゼーション法（ＳＳＨ）のような、示差的分析法を使用して同時に比較さ
れる。画分から単離されるＲＮＡは、ポリＡ選択により、さらにリボソームＲＮ
Ａを含まないｍＲＮＡまで精製することができる。この方法を利用すると複数の
プールを分析することができることに注目されたい。すなわち、異なるストレッ
サーに付される異なる細胞アリコートは、相互に、さらには参照試料と比較する
ことができる。

【００３２】ポリソーム、非ポリソーム、ｍＲＮＰ、核、細胞質、またはスプライソソーム
画分から得られるＲＮＡから作成される標識核酸プローブ（ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産
物またはｃＤＮＡから転写されたｒＲＮＡ中）は、（ＧＥＭ）のような固相マト
リックス様マイクロアレイ上（ラバ（Rava）らの米国特許第５，５４５，５３１
号およびハイセク社（Hyseq, Inc.）のＷＯ９６／１７９５７号に記載）、およ
びクローンが電気泳動後ブロットされるかまたは直接膜上に載せられる（ドット
ブロット）任意の種類の膜上に固定される、ｃＤＮＡ、ゲノムクローン、および
ｍＲＮＡ種のクローンを同定するために、プローブとして使用することができる
。標識は、放射活性、蛍光、またはジゴキシゲニンおよびビオチンのような修飾
塩基の組み込みであってよい。

【００３３】ポリソームまたはポリリボソーム画分から得られる画分または他の画分と、全
未分画物質との比較は、翻訳それ自体の調節に由来するものから転写制御の結果
である発現レベルにおける差を区別することに必須である。ポリソーム画分また
は画分群は、膜結合ポリソーム、緩いまたは堅いポリソーム、または遊離の未結
合ポリソーム群を含んでよい。

【００３４】（翻訳的に）示差的に発現される遺伝子を同定するためにポリソームのサブ集
団を利用することの重要性は、例１に示されるが、ここで多くの遺伝子は、全ｍ
ＲＮＡを検出プローブとして使用したときには熱ショック誘導下で翻訳的に発現
されるものとして検出されなかったが、しかしポリソームｍＲＮＡをプローブと
して使用したときには、多くの遺伝子は、示差的に発現されるものとして同定さ
れた。例１に示すように、全ｍＲＮＡ由来プローブによる熱ショック誘導下の多
くの遺伝子は、ポリソームｍＲＮＡ画分でプローブ探索すると検出された。虚血
性疾患のような急性疾患のモデルである熱ショックは、ポリソームプローブの重
要性を明らかにする。細胞は、急性の状況で決定的に重要なｍＲＮＡを迅速にポ
リソームに載せて（転写によるこれらの産生を待つ必要なく）、翻訳して細胞が
ストレス下で生き抜くために必要とするタンパク質が産生されるように、これら
の決定的に重要なｍＲＮＡを不活性化型で貯蔵している。

【００３５】翻訳的に制御される遺伝子を同定するための本方法は、ｍＲＮＡプールの起源
によって限定されない。従って、本方法は、「シフト機作」により制御される、
病的および／またはストレス状態下の未変性細胞／組織からの遺伝子、さらには
病的および／またはストレス状態下で誘導／抑制される遺伝子をクローン化する
ために利用することができる。病態とは、病原体および外傷により引き起こされ
る疾患を含めた疾患状態を含んでよい。ストレス状態はまた、疾患状態、物理的
および心理学的外傷、および環境的ストレスを含んでよい。示差的分析の選択さ
れる方法による分析後、翻訳により制御されるものとして同定された遺伝子は、
当業者に公知の任意の適切なクローニング法によりクローン化することができる
。（リシツィン（Lisitsyn）とウィグラー（Wigler）、１９９３年）。

【００３６】示差的比較は、ポリソーム対非ポリソームＲＮＡの全ての可能な組合せについ
て、行うことができ、ここで画分の型の定義は、例えば、２５４nmでの吸光度プ
ロフィール、図１Ａに示すようなショ糖勾配の密度（または高圧液体クロマトグ
ラフィーもしくはゲルシステムが使用されるならば、別のサイズ標準）および図
１Ｂに示すような、アガロースゲル上の画分の電気泳動後に臭化エチジウムで染
色されるＲＮＡの型により行われる。図１Ａでは、ポリソーム画分は、２個を超
えるリボソームが載ったｍＲＮＡを有する画分である。この比較のための材料と
方法は、以下の実験セクションに記載する。

【００３７】示差的比較はまた、各状態でのポリソーム対非ポリソーム画分を含んでよい。
「状態」とは、異なる処理を受けるか、または異なる特徴を有するようにもしく
は異なるセットの遺伝子を発現するように修飾されている、細胞株、初代細胞、
または組織のような同じ起源の細胞を意味する。例えば、これは、分化、形質転
換、酸素欠乏、化学的処理、または放射線の適用により達成することができる。
組合せは、例えば、１．個々の状態（同じ密度で移動する）の間の、または１つのプール中のポリ
ソーム画分；２．個々の状態（同じ密度で移動する）の間の、または１つのプール中の非ポ
リソーム画分；３．状態間および各状態内（同じ密度で移動する）の、または１つのプール中
の非ポリソーム画分；および４．未分画の全ＲＮＡに比較することができる個々にポリソームおよび非ポリ
ソームである画分のそれぞれ（同じ密度で移動する）、または１つのプール中の
画分、を含んでよい。

【００３８】翻訳レベルで制御される遺伝子の同定のための上記の方法には、多くの応用が
ある。この方法の具体的な応用としては、生理学的または病的変化に関連した細
胞／組織内のｍＲＮＡ発現パターンの変化を検出するためのその使用がある。翻
訳ｍＲＮＡと非翻訳ｍＲＮＡを比較することにより、細胞／組織内のｍＲＮＡ発
現パターンの変化に及ぼす生理学的または病的合図またはストレスの影響を、観
察および／または検出することができる。この方法を使用して、多くの合図、刺
激、またはストレッサーの作用を研究して、細胞／組織の種々の生理学的および
病的活動に対する影響または寄与を確認することができる。特に、本方法は、薬
物または化合物の投与の前後の組織のｍＲＮＡパターンを比較することにより、
個体への薬剤（薬物）または他の化合物の投与の結果を分析するために使用する
ことができる。この分析によって、翻訳制御のレベルで細胞／組織に影響を及ぼ
す薬物、化合物、または他の刺激の同定が可能になる。この方法を利用して、特
定のｍＲＮＡ種が、特定の生理学的または疾患状態に関係しているかどうかを確
認すること、および特に外部刺激すなわち薬物が、翻訳レベルで制御される遺伝
子に影響を及ぼす特異的細胞／組織を確認することが可能である。

【００３９】翻訳レベルで制御される遺伝子のサブグループの同定は、細胞内の５’キャッ
プ依存性ｍＲＮＡ翻訳を阻害する一般的工程、細胞からｍＲＮＡのプールを回収
する一般的工程、および内部リボゾーム侵入部位をコードする配列を含む遺伝子
を同定するためにｍＲＮＡのプールを示差的分析する一般的工程を含む、内部リ
ボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする遺伝子配列を同定するための方法を
伴う。

【００４０】上記のように、標準的５’キャップ依存性翻訳開始の例外が存在することが知
られている。内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）として知られている特異的配
列の存在を含有することができる配列が、ＲＮＡの非翻訳領域（ＵＴＲ）内に存
在する（エーレンフェルド（Ehrenfeld）、１９９６年）。これらの内部リボゾ
ーム侵入部位は、上記のように少数の原核生物および真核生物システムのための
翻訳開始を支持することが証明されている。しかし５’キャップ非依存性翻訳機
作およびこれらの正常および異常プロセスの両方への結合を介して、翻訳的に制
御される遺伝子を同定するためには、５’キャップ非依存性ｍＲＮＡ翻訳を選択
することができるように、５’キャップ開始翻訳を阻害することが必要である。
ＩＲＥＳ配列は、配列相同性により同定することが不可能ではないが困難なため
、この阻害は必要である。

【００４１】５’キャップ依存性翻訳を阻害するために、従って５’キャップ非依存性翻訳
の存在を選択するために、内部リボゾーム侵入部位の存在に関して分析すべき細
胞または組織は、５’キャップ構造翻訳開始機作を防止または邪魔するためのい
くつかの方法で処理する必要がある。本質的に翻訳平衡をＩＲＥＳ開始翻訳にシ
フトさせるために、標準的な走査型翻訳開始の機作は、完全ではなくても実質的
に止めるかまたは閉じるべきである。すなわち、５’キャップ構造の認識は、５
’キャップ介在性開始の正常な機作を破壊させることにより阻害される。５’キ
ャップ翻訳を阻害する機作は、５’キャップ介在性の翻訳開始を防止するための
任意の既知の手段または機作を含んでよい。５’キャップ介在性翻訳を阻害する
ためのこのような機作の１つは、ＩＲＥＳ配列の存在に関して分析すべき細胞、
細胞系、または組織へのポリオウイルス２Ａプロテアーゼの発現である。ポリオ
ウイルス２Ａプロテアーゼの使用は、細胞内５’キャップ依存性翻訳機構を不活
性化することにより、５’キャップ依存性ｍＲＮＡ翻訳を阻害する。これによっ
て、遺伝子の活性化の前に、翻訳的に制御されかつ熱ショック、低酸素、または
上記の他のストレス誘導要素のようなストレス誘導要素／ストレッサーの適用後
の、細胞の即時的応答において決定的に重要な役割を果たす遺伝子を含有する細
胞内ＩＲＥＳの同定が可能になる。ポリオウイルス２Ａプロテアーゼは、ｍＲＮ
Ａ５’キャップの認識に関与する真核生物翻訳開始因子４（ｅＩＦ−４）の大
サブユニットのｅＩＦ−４γ（ｐ２２０）を切断することにより、５’キャップ
介在性翻訳を妨害する。

【００４２】５’キャップ介在性の翻訳を阻害するために、ポリオウイルス２Ａプロテアー
ゼは、内部リボゾーム侵入部位をコードする遺伝子配列の存在についておよび／
または翻訳的に制御される遺伝子を同定について分析される細胞に、組み込む必
要がある。細胞中にポリオウイルス２Ａプロテアーゼを組み込むためのこのよう
な１つの方法は、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼをコードする遺伝子を含有す
る発現ベクターにより、標的細胞の形質転換を行う。ポリオウイルス２Ａプロテ
アーゼは、それが構成性に発現されるとき生きた細胞にとって有害であるため、
ポリオウイルス２Ａプロテアーゼ遺伝子を含有する発現ベクターは、ＬａｃＩリ
プレッサーがＣＭＶプロモーターの下で構成性に発現される細菌のＬａｃＩ誘導
性システムと結合させる。ポリオウイルス２Ａプロテアーゼは、その３’末端が
ＬａｃＩリプレッサー結合部位に結合したＲＳＶ、ＴＫ、またはミニＴＫプロモ
ーターを含む多くの適切なプロモーターの下で発現しうる。ＬａｃＩリプレッサ
ーを含有する発現ベクターおよびポリオウイルス２Ａ発現ベクターで標的細胞を
形質転換することにより、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼの発現は、イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により細胞を処理すること
で誘導しうる。ＩＰＴＧによる標的細胞の処理は、リプレッサー結合部位で結合
したＬａｃＩリプレッサー分子の結合を解消して、そのためポリオウイルス２Ａ
プロテアーゼの転写を可能にする。ポリオウイルス２Ａプロテアーゼの発現を、
ＬａｃＩシステムのような誘導性システムに結合させることによって、この機作
は、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼをコードする遺伝子の発現制御の確立を可
能にする。

【００４３】標的細胞中でポリオウイルス２Ａプロテアーゼの発現を誘導後、おそらく内部
リボゾーム侵入部位を含有するＲＮＡは回収して、上記の方法を利用して分析し
て、その翻訳がポリオウイルス２Ａプロテアーゼの作用によりアップレギュレー
トされる遺伝子を同定することができる。

【００４４】（実験）示差的翻訳材料と方法一般的スキームａ．もとの組織または細胞からの全てのＲＮＡの全ｍＲＮＡ有機抽出。（ポリＡ
＋ｍＲＮＡについての追加の選択を含めてもよい）。ｂ．核ＲＮＡ − 低張性緩衝液中のホモジナイズによる（組織または細胞株か
らの）細胞の溶解。遠心分離による核の回収およびＲＮＡの有機抽出。ｃ．細胞質ＲＮＡ − 上記ｂの上清からのＲＮＡの有機抽出。ｄ．ポリリボソーム／サブポリリボソーム分画。低張性緩衝液中のホモジナイズ
による細胞の溶解、核の除去および線形ショ糖勾配でのポリリボソームの分画お
よび勾配の各画分からのＲＮＡの有機抽出。ｅ．分泌された、膜をコードする転写物。１．（細胞のホモジナイズ後）パーコール（Percol）勾配上のＲＥＲの単離。２．ＲＥＲを含有するミクロソームの調製３．洗浄剤を用いる細胞の連続処理による膜結合ポリリボソームの単離。ｆ．核タンパク質。異なる洗浄剤で細胞溶解物を処理することによる細胞骨格結
合ポリリボソームの単離。ｇ．ミトコンドリア遺伝子。パーコール（Percoll）勾配上のミトコンドリアの
単離。ｈ．代替スプライシング。核の分離および線形ショ糖勾配上のスプライソソーム
（タンパク質とＲＮＡの複合体）の単離。

【００４５】細胞抽出物の調製細胞を遠心分離した。ペレットは、ＰＢＳで洗浄して再遠心分離した。細胞を
、低張性溶解緩衝液（ＨＬＢ：２０mMトリスＨＣｌｐＨ＝７．４；１０mM Ｎ
ａＣｌ；３mM ＭｇＣｌ₂）で４×１充填赤血球量（ＰＣＶ）に再懸濁した。細
胞を氷上で５分間インキュベートした。１．２％トリトンＸ−１００および０．
２Ｍショ糖を含有する１×ＰＣＶのＨＬＢを加えた。細胞は、ダンス型（Dounce
）ホモジェナイザー（Ｂ乳棒で５ストローク）でホモジナイズした。細胞溶解物
は、２３００ｇで４℃で１０分間遠心分離した。上清は、新しいチューブに移し
た。１０mg/mlヘパリンを含有するＨＬＢを、１mg/mlヘパリンの最終濃度まで加
えた。ＮａＣｌを０．１５Ｍの最終濃度まで加えた。上清を、液体Ｎ₂中で急速
に凍結後、−７０℃で凍結させるかまたは即座に使用した。

【００４６】ショ糖勾配分画ＨＬＢ中の０．５Ｍ〜１．５Ｍショ糖の線形ショ糖勾配を調製した。ポリアロ
マーチューブ（１４×８９mm）を使用した。０．５〜１．０mlの細胞抽出物を勾
配に載せた。細胞は、３６，０００RPMで４℃で１１０分間遠心分離した。ＩＳ
ＣＯ密度分画機（ISCO Density Fractionator）を使用して画分を回収し、吸光
度プロフィールを記録した。

【００４７】ＲＮＡ精製ＳＤＳは０．５％まで、そしてプロテイナーゼＫは０．１mg/mlまで加え、３
７℃で３０分間インキュベートした。等容量のフェノール＋クロロホルム（１：
１）で抽出する。水相は、１容量のクロロホルムで抽出して、酢酸ナトリウムを
０．３Ｍまでそして２．５容量のエタノールを加え、−２０℃で一晩インキュベ
ートしてＲＮＡを沈殿させた。１０分間遠心分離して、上清を吸引して、ＲＮＡ
ペレットを無菌ピロ炭酸ジエチル（本明細書で以降「ＤＥＰＣ」と呼ぶ）ＤＥＰ
Ｃ処理水に溶解した。

【００４８】ミクロソームの調製可能であれば、凍結することなく新鮮な組織および細胞を使用する。組織を液
体窒素中で乳鉢と乳棒で粉砕して、次に４mlの緩衝液Ａ／１ｇ組織（緩衝液Ａは
、２５０mMショ糖、５０mM ＴＥＡ、５０mM ＫＯＡｃｐＨ７．５、６mM Ｍ
ｇ（Ｏａｃ）₂、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、０．５mM ＰＭＳＦである。
ＰＭＳＦは、緩衝液を作成する前にエタノール中で作成し、撹拌しながら緩衝液
に滴下して加えた。これを１５分間撹拌して次にＤＴＴを加えた）を使用してホ
モジナイズした。新鮮な臓器を緩衝液Ａで数回洗浄し、次に小片に切ってホモジ
ナイズした。約５ml緩衝液Ａ／５×１０⁸細胞を加えてホモジナイズした。次に
これを氷上で５〜１０回、または必要に応じて個々の組織と共にホモジナイズし
た。混合物を５０mlチューブに移し、次にスインギングバケットローターマシー
ン（swinging bucket rotor machine）中で４℃で１０分間遠心分離した。次に
上清を、できるだけペレットを避けてソーバル（Sorvall）チューブに移して、
ペレットを再度１ml緩衝液で洗浄して前回同様遠心分離した。２つのペレットを
合わせ、核画分を確立した。この組合せたものを溶解して、ペレットをトリ試薬
（Tri-reagent）（試料が細胞由来であるとき通常２mlのトリ試薬）で処理して
核ＲＮＡを抽出した。合わせた第１および第２の上清を１００００ｇで４℃で１
０分間遠心分離した。再度、上清をチューブに移して氷上で保持した。ペレット
を再度１ml緩衝液で洗浄し、１００００ｇで１０分間遠心分離して、２つのペレ
ットを前回同様合わせて、ミトコンドリアペレットを確立した。再度、ペレット
をトリ試薬（細胞では通常１ml）で処理して、ミトコンドリアＲＮＡを抽出した
。次に、緩衝液Ａ＋１．３Ｍショ糖から作られたショ糖クッションを含有する冷
超遠心チューブを調製した。クッションの容量は、上清の約１／３とした。上清
をクッション上に１：３のクッション対上清比で載せた。１対のチューブを、Ｔ
ｉ６０．２ローター（４５，０００rpm）により１４０，０００ｇ、４℃で２．
５時間遠心分離した。上清の２相が見えたとき、赤色相だけを（可能であれば）
、細胞質画分としてソーバル（sorvall）チューブに移した。清澄な上清を吸引
した。分離することができないか、または相の相違が目に見えないときには、全
ての上清を細胞質画分としてとって、ショ糖をＴＥ（１０mMトリス−ＨＣｌｐ
Ｈ８．０、１mM ＥＤＴＡ）で希釈した。ペレットには、目に見えかつ清澄であ
るかまたは帯黄色であるミクロソームが入っていた。ＲＮＡ抽出のために、細胞
質画分を１％ＳＤＳ、０．１mg/mlプロテイナーゼＫで３７℃で３０分間処理
した。この後、−８０℃での凍結が可能であった。ＲＮＡは、フェノール：クロ
ロホルムの組合せで抽出して、０．３ＭＮａアセテート、１μlグリコーゲン
、および等容量のイソプロパノールで沈殿させた。Ｏ’Ｎ沈殿が可能であり、氷
上で３０分で達成できる。抽出物を１００００ｇで２０分間遠心分離し、次にＲ
ＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄した。ペレットを乾燥し、次にＨ₂Ｏに
溶解した。次にこのミクロソームを０．１ＭＮａＣｌ／１％ＳＤＳ溶液（小
さいペレットには１mlで通常充分である）で溶解して、フェノール：クロロホル
ムの組合せ（プロテイナーゼＫ処理をしない）で抽出した。次にＲＮＡの沈殿は
、塩を加える必要がない他は、細胞質画分の場合と同様に行った。

【００４９】核および細胞質ＲＮＡの調製サブコンフルエントなプレートを１２５mM ＫＣｌ−３０mMトリス−塩酸塩（
ｐＨ７．５）−５mM酢酸マグネシウム−１mM ２−メルカプトエタノール−２mM
リボヌクレオシドバナジル複合体（２）−０．１５mMスペルミン−０．０５mMス
ペルミジンで４℃で洗浄して、細胞をプレートから削り落として同じ緩衝液で２
回洗浄した。約１０⁸細胞を２．５mlの膨潤緩衝液（ＫＣｌ濃度が１０mMである
ことを除いて洗浄緩衝液と同じ）中で１０分間膨潤させて、２０ストロークのダ
ンス型（Dounce）ホモジェナイザー（Ｂ乳棒）で溶解して、２５％グリセロール
を含有する等容量の膨潤緩衝液の上に重層し、４００×ｇで４℃で５分間遠心分
離した。上清の上層は、溶解により放出されたＣＡＤ配列の９０％を含有してい
たが、これを細胞質画分と呼んだ。核ペレットは、２mlの膨潤緩衝液−２５％グ
リセロール−０．５％トリトンＸ−１００で１回、そして２mlの膨潤緩衝液で１
回洗浄した。

【００５０】核ＲＮＰ。上記のように調製した１０⁸細胞からの核は、１mlの１０mMトリス
−塩酸塩（ｐＨ８．０）−１００mM ＮａＣｌ−２mM ＭｇＣｌ₂−１mM ２−
メルカプトエタノール−０．１５mMスペルミン−０．０５mMスペルミジン−１０
mMリボヌクレオシドバナジル複合体（２）−１ml当たり１００Ｕの胎盤ＲＮアー
ゼインヒビター（アマーシャム社（Amersham Corp.））に懸濁して、コンレス（
Konres）マイクロ超音波細胞破砕機の最大出力設定で４℃で２０ｇで超音波処理
した。細菌性ｔＲＮＡ（２mg）を加え、塩基性タンパク質（９）を吸着し、そし
て混合物を１分間遠心分離した（エッペンドルフ（Eppendorf）マイクロ遠心機
）。上清を、１mMトリス−塩酸塩−１００mM ＮａＣｌ−２mM ＭｇＣｌ₂−−
２mMリボヌクレオシドバナジル複合体中１５〜４５％ショ糖勾配に適用して、ベ
ックマン（Beckman）ＳＷ４１ローターで４０，０００rpmおよび４℃で９０分間
遠心分離した。ドデシル硫酸ナトリウムを０．５％まで加え、プロテイナーゼＫ
（２００μg/ml）で３７℃で２時間処理し、フェノールで抽出し、エタノールで
沈殿させることにより、ＲＮＡを勾配画分から回収した。

【００５１】アンチセンスＲＮＡの調製細胞性ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡプールの一部を膜上に固定化し、別の一部を
オリゴデオキシヌクレオチドを３’末端に結合させてｃＤＮＡに変換した。ｃＤ
ＮＡ合成のためのビオチン化した相補的なオリゴを使用すると、「マイナス」鎖
をストレプトアビジン被覆磁性ビーズに固定化することが可能になる。第２のセ
ットのオリゴを、ＲＮＡの以前の５’末端でｃＤＮＡに結合させた。結合した鎖
からプラス鎖を溶出し、膜結合ＲＮＡにハイブリダイズさせる。使用したｃＤＮ
Ａ鎖はＲＮＡと同じ極性を有するため、相補的なＲＮＡに結合することができる
ｃＤＮＡ配列のみが保持される。ＰＣＲ増幅とＰＣＲ断片の以後のクローニング
後に、配列分析を行う。クローン化した配列が正しく同定されるかどうかを試験
するために、センスおよびアンチセンス方向でプローブを作成する。陽性クロー
ンを、構造的および機能的に性状解析する。この方法を実施するために我々は、
アンチセンスＲＮＡによりそのコピー数を制御するプラスミドＲ１を含有する細
菌株（大腸菌（Escherichia coli））を使用し始めた。以前の研究で、細胞内で
Ｒ１のアンチセンス（ＣｏｐＡ）と標的ＲＮＡ（ＣｏｐＴ）の両方が同定された
。この方法が実施できるなら、他の生物中のアンチセンスＲＮＡ系をスクリーニ
ングするのに使用されるであろう。

【００５２】示差的分析示差的表示：逆転写：２μgのＲＮＡを６．５μlの容量中の１pmolのオリゴｄＴプライマー（
ｄＴ）₁₈と、７０℃で５分間加熱し、氷上で冷却してアニーリングする。２μl
の反応緩衝液（ｘ５）、１μlの１０mM ｄＮＴＰミックス、および０．５μlの
スーパースクリプトII（SuperScriptII）逆転写酵素（ギブコビーアールエル（
ＧｉｂｃｏＢＲＬ））を加えた。４２℃で１時間反応を行なった。７０μlのＴ
Ｅ（１０mMトリスｐＨ＝８；、０．１mM ＥＤＴＡ）を加えて、反応を停止さ
せた。示差的表示に使用したオリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドは基本的
に、デルタＲＮＡフィンガープリンティングキット（Delta RNA Fingerprinting
kit）（クロンテクラボズ・インク（Clontech Labs. Inc.））に記載されてい
るものである。構造：５’ＣＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＸＹ３’（配列番号１）の９つの「Ｔ」オリゴヌクレオチドがあった。
１０個の「Ｐ」オリゴヌクレオチドは、構造：３’ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴ
ＡＡＡ”ＴＧＣＴＧＧＧＧＡ”３’（配列番号１１）であり、カッコ内の９また
は１０ヌクレオチドは任意の配列であり、１０個の異なる配列（配列番号１２〜
２１）があり、各「Ｐ」オリゴについて１つである。

【００５３】増幅反応：各反応は２０μl中で行い、５０μＭｄＮＴＰミックス、各プライ
マーから１μＭ、１×ポリメラーゼ緩衝液、１単位拡張ポリメラーゼ（ベーリン
ガーマンハイム（Boehringer-Mannheim））、２μCi［α−³²Ｐ］ｄＡＴＰ、お
よび１μl ｃＤＮＡ鋳型を含有する。サイクル条件：９５℃で３分、次に９４
℃で２分、４０℃で５分、６８℃で５分を３サイクル。次に、９４℃で１分、６
０℃で２分、６８℃で２分を２７サイクルを行う。６８℃で７分インキュベート
し、２０μlの配列決定停止溶液（９５％ホルムアミド、１０mM ＮａＯＨ、０
．０２５％ブロモフェノールブルー、０．０２５％キシレンシアノール）を加え
て反応を停止させた。

【００５４】ゲル分析：５％配列決定ポリアクリルアミドゲルに３〜４μlをのせ、スロー色
素（キシレンシアノール）が底から約２cmになるまで、２０００ボルト／４０ミ
リアンペアで電気泳動した。ゲルをろ紙に移し、真空下で乾燥し、Ｘ線フィルム
に露出した。

【００５５】示差的バンドの回収：種々のプールの間で差を示すバンドを、乾燥ゲルから切り
出し、マイクロ遠心分離チューブに入れた。５０μlの無菌水を加え、試験管を
５分間１００℃で加熱した。示差的表示に使用したものと同じプライマーを使用
して１μlを４９μlのＰＣＲ反応物に加え、試料を、３０サイクルの９４℃で１
分、６０℃で１分、６８℃で１分により増幅した。１０μlをアガロースゲルで
分析して視覚化して、増幅がうまくいったことを確認する。

【００５６】リプリゼンテーショナル示差的分析逆転写：２μgのポリＡ＋選択ｍＲＮＡを使用した以外は上記のように行なった
。２本鎖ｃＤＮＡの調製：前工程からのｃＤＮＡをアルカリで処理してｍＲＮＡ
を除去し、沈殿させ、２０μlのＨ₂Ｏに溶解した。５μlの緩衝液、２μlの１０
mM ｄＡＴＰ、４８μlになるようにＨ₂Ｏ、および２μlの末端デオキシヌクレ
オチドトランスラーゼ（ＴｄＴ）を加えた。反応物を３７℃で２〜４時間インキ
ュベートした。５μlのオリゴｄＴ（１μg/μl）を加え、６０℃で５分間インキ
ュベートした。５μlの２００mM ＤＴＴ、１０μlの１０×セクション緩衝液（
１００mM ＭｇＣｌ₂、９００mMヘペス、ｐＨ６．６）、１６μlのｄＮＴＰ（１
mM）、および１６Ｕのクレノウを加え、混合物を室温で一晩インキュベートして
ｄｓｃＤＮＡを作成した。１００μlのＴＥを加え、フェノール／クロロホル
ムで抽出した。ＤＮＡを沈殿させ、５０μlのＨ₂Ｏに溶解した。

【００５７】リプリゼンテーションの作成：ＤｐｎIIを有するｃＤＮＡを、３μlのＤｐｎＩ
Ｉ反応緩衝液２０ＶとＤｐｎIIを２５μlのｃＤＮＡに加え、３７℃で５時間イ
ンキュベートして消化した。５０μlのＴＥを加え、フェノール／クロロホルム
で抽出した。ｃＤＮＡを沈殿させ、１０ng/μlの濃度に溶解した。この方法では以下のオリゴヌクレオチドを使用する：Ｒ−Ｂｇｌ−１２５’ＧＡＴＣＴＧＣＧＧＴＧＡ３’（配列番号２２）Ｒ−Ｂｇｌ−２４５’ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＣＡ３
’（配列番号２３）Ｊ−Ｂｇｌ−１２５’ＧＡＴＣＴＧＴＴＣＡＴＧ３’（配列番号２４）Ｊ−Ｂｇｌ−２４５’ＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡ３
’（配列番号２５）Ｎ−Ｂｇｌ−１２５’ＧＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＧ３’（配列番号２６）Ｎ−Ｂｇｌ−２４５’ＡＧＧＣＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＴＣＣＧＡＧＧＧＡＡ３
’（配列番号２７）

【００５８】Ｒ−Ｂｇｌ−１２とＲ−Ｂｇｌ−２４オリゴをテスター（Tester）とドライバ
ー（Driver）に結合した：１．２μgのＤｐｎII消化ｃＤＮＡ。各オリゴから４
μlと５μlの結合緩衝液×１０を６０℃で１０分間アニーリングした。２μlの
リガーゼを加え、１６℃で一晩インキュベートした。１４０μlのＴＥを加えて
結合混合物を希釈した。Ｒ−Ｂｇｌ−２４プライマーと２μlの結合産物を使用
して２００μlの容量中で増幅を行い、各試料について２０本のチューブで繰り
返した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加える前に、チューブを７２℃で３分間加
熱した。ＰＣＲ条件：７２℃で５分、次に９５℃で１分と７２℃で３分を２０サ
イクル、次に７２℃で１０分。各４つの反応物を一緒にし、フェノール／クロロ
ホルムで抽出し、沈殿させた。増幅したＤＮＡを０．５μg/μlの濃度に溶解し
、すべて試料をプールした。

【００５９】サブトラクション：テスターＤＮＡ（２０μg）を上記のようにＤｐｎIIで消化
し、１．２％アガロースゲルで分離した。ゲルからＤＮＡを抽出し、Ｒ−オリゴ
について上記したように、２μgをＪ−Ｂｇｌ−１２とＪ−Ｂｇｌ２４オリゴに
結合させた。結合したテスターＤＮＡをＴＥで１０ng/μlに希釈した。ドライバ
ーＤＮＡをＤｐｎIIで消化し、再精製して最終濃度０．５μg/μlにした。４０
μgのドライバーＤＮＡを０．４μgのテスターＤＮＡと混合する。フェノール／
クロロホルムで抽出し、７０％エタノールで２回洗浄して沈殿させ、ＤＮＡを４
μlの３０mM ＥＰＰＳ（ｐＨ８．０）、３mM ＥＤＴＡに再懸濁し、３５μlの
ミネラル油を重層する。９８℃で５分変性させ、６７℃に冷却し、ＤＮＡに１μ
lの５ＭＮａＣｌを加えた。６７℃で２０時間インキュベートした。４００μl
のＴＥを加えてＤＮＡを希釈した。

【００６０】増幅：最終容量２００μl中のサブトラクトしたＤＮＡの増幅：緩衝液、ヌクレ
オチドおよび２０μlの希釈ＤＮＡを加え、７２℃で加熱し、ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼを加えた。７２℃で５分インキュベートし、Ｊ−Ｂｇｌ−２４オリゴを
加えた。９５℃で１分、７０℃で３分を１０サイクル行なった。７２℃で１０分
インキュベートした。４つの異なるチューブで増幅を繰り返した。増幅したＤＮ
Ａをフェノール／クロロホルムで抽出し、沈殿させ、すべての４つのチューブを
４０μlの０．２×ＴＥで一緒にし、ムング・ビーン・ヌクレアーゼ（Mung Bean
Nuclease）で以下のように消化した：２０μlのＤＮＡに、４μlの緩衝液、１
４μlのＨ₂Ｏ、および２μlのムング・ビーン・ヌクレアーゼ（Mung Bean Nucle
ase）（１０単位/μl）を加えた。３０℃で３５分インキュベート＋第１の示差
的産物（ＤＰＩ）でインキュベートした。

【００６１】繰り返しサブトラクションハイブリダイゼーションとドライバーでのＰＣＲ増幅：Ｎ−ＢｇｌオリゴヌクレオチドとＪ−Ｂｇｌオリゴヌクレオチドを使用して、
それぞれ１：４００（ＤＰII）と１：４０，０００（ＤＰIII）のディファレン
シャル比。個々のクローンの分析のために、ＢａｍＨＩ部位で示差的産物を、ブ
ルースクリプト（Bluescript）ベクターにクローン化した。

【００６２】

【実施例】

【００６３】例１レプレゼンタティブ熱ショックＧＥＭ示差的発現系の翻訳レベルで制御される遺伝子の分析材料と方法通常の温度（３７℃）と熱ショック温度（４３℃）で実験細胞を４時間増殖さ
せた。次に細胞を採取し、細胞質抽出物を得て、ポリソームを分画して、そこか
らＲＮＡを抽出した。細胞の平行培養物から、全細胞ＲＮＡを抽出した。次に抽
出したＲＮＡを、前記ＧＥＭ法を使用して分析した。

【００６４】図２と表２および３は、示差的発現分析で全ｍＲＮＡプローブに対してポリソ
ームプローブを使用して、熱ショックのような刺激に応答して示差的に発現され
る遺伝子を同定することの有用性を証明している。これらの表は、フィブロネク
チン、ピルビン酸キナーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ポリ（ＡＤ
Ｐリボース）ポリメラーゼ、サイモポエチン、９０Ｋｄ熱ショックタンパク質、
アシルアミノ酸放出酵素、β−スペクトリン、およびピルビン酸キナーゼをすべ
て、ポリソームプローブを使用して示差的に発現されるものとして同定したが、
ただしフィブロネクチンの場合を除いて、全ｍＲＮＡプローブを使用した時他の
タンパク質は示差的に発現されるものとして同定されなかった。この例は、スト
レス誘導性成分により制御される翻訳的または示差的に制御される遺伝子を同定
するための本発明の有用性を証明する。さらに表２において、ポリソームプロー
ブと全ｍＲＮＡプローブの両方を用いた熱ショック示差的遺伝子発現分析の結果
を提供する。表２は、ポリソームプローブを使用して多くの示差的に発現される
遺伝子が同定されたことを示すが、全ｍＲＮＡプローブを使用した時、これらの
遺伝子は必ずしも示差的に発現されるものとして同定されないことを示す。表３
は、全ｍＲＮＡまたはポリソームｍＲＮＡをプローブとして使用して同定された
、示差的に発現される遺伝子の数を統計的に例示する。表３は、ポリソームｍＲ
ＮＡプローブは、全ｍＲＮＡプローブに対して示差的に発現される遺伝子の数が
、２〜１０倍以上増加したことを明瞭に示す。

【００６５】例２核ｍＲＮＡプローブを使用する転写レベルの遺伝子の分析実験細胞を通常の条件で、低酸素（＜１％酸素）下で４時間と低酸素下で１６
時間、交互に増殖させた。細胞を採取し、細胞から調製された核（核ＲＮＡ）か
ら、または未分画細胞の抽出物（全細胞ＲＮＡ）から、ＲＮＡを調製した。

【００６６】図３は、核ＲＮＡから調製されたプローブ（ＳＴＰ）が、全細胞ＲＮＡプロー
ブ（Ｔｏｔ）より高い示差的発現を与えることを示す。ＶＥＧＦ（血管内皮増殖
因子）、Ｇｌｕｔ１（グルコーストランスポーター１）およびグリコーゲンシン
ターゼをコードする対照遺伝子は、低酸素ストレスにより誘導されることが知ら
れている。核プローブで観察される誘導レベルは、全プローブで見られるものよ
りはるかに高く、実際の誘導レベルにより近い。３つの新しい遺伝子ＲＴＰ２４
１、ＲＴＰ２６２およびＲＴＰ７７９は、低酸素により顕著な誘導を示す。核プ
ローブでみられる誘導レベルはこの場合も、ＲＴＰ７７９について見られるよう
にはるかに（最大５倍高い）高い。これらの遺伝子の誘導をノーザンブロット法
で分析すると、核プローブは実際の状況にはるかに近く、全プローブは顕著な過
小評価を与えることがわかった。

【００６７】遺伝子ＲＴＰｉ−６６とＲＰＴ２Ｉ−７２は、全プローブでは示差的に現れな
い示差的に発現される遺伝子を、核プローブが検出する能力を示す。

【００６８】ヌクレオリン（Nucleolin）とトロンボスポンジン（Thrombospondin）の遺伝
子は、ダウンレギュレーションされたｍＲＮＡについても、核プローブははるか
に高感度であり、はるかに高いレベルの示差的発現値を与えることを示している
。

【００６９】最後に、リボゾームタンパク質Ｌ１７と細胞質ガンマアクチンの遺伝子は、低
酸素ストレスに応答しない遺伝子として知られている。核プローブと全プローブ
の両方とも、誘導が起きないことを示す。

【００７０】例３ＩＲＥＳ含有遺伝子の同定２Ａプロテアーゼを発現する哺乳動物細胞の樹立予備的実験では、２ＡプロテアーゼはＨＥＫ−２９３ヒト（ＡＴＣＣＣＲＬ
−１５７３）細胞株でＩＲＥＳ含有遺伝子の発現を増強することを示したため、
この細胞株を、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼ誘導発現のモデル系として使用
した。図４Ａ〜Ｃに示すようにそれぞれポリオウイルス２Ａプロテアーゼベクタ
ーＰＴＫ−ＯＰ３−ＷＴ２Ａ、ミニＴＫ−ＷＴ２Ａ、またはＰＣＩｂｂ−Ｌａｃ
Ｉ−Ｈｙｇ（ストラタジーン（Stratagene）からのベクターに基づき本出願人が
作製した）のいずれか１つと組合せて、ＨＥＫ−２９３細胞をＣＭＶ−ＬａｃＩ
−（当業者に公知の方法を使用して作製した）と同時トランスフェクトした。Ｌ
ａｃＩ発現ベクターはヒグロマイシン選択マーカーを含有し、ポリオウイルス２
Ａプロテアーゼ発現ベクターはネオマイシン選択マーカーを含有し、これは、お
そらくＬａｃＩリプレッサーとポリオウイルス２Ａタンパク質の両方を発現する
、両方のマーカーに耐性のクローンの単離を可能にした。

【００７１】ポリオウイルス２Ａプロテアーゼ発現の分析死滅測定法：ヒグロマイシン（５０μg/ml）とネオマイシン（５００μg/ml）で
選択後に増殖した耐性クローンを、ＩＰＴＧ（５mMで４８時間＋５mMでさらに４
８時間）で処理した。次に細胞を生存活性について追跡し、ポリオウイルス２Ａ
プロテアーゼ誘導で完全な死滅を示したクローン（おそらくポリオウイルス２Ａ
プロテアーゼの有害作用を発現する）を、さらなる分析のために選択した。その
ようなクローン２つ、ＴＫプロモーターの制御下でポリオウイルス２Ａプロテア
ーゼを発現するＨＥＫ−２９３細胞（クローン＃１４）とミニＴＫプロモーター
の制御下でポリオウイルス２Ａプロテアーゼを発現するＨＥＫ−２９３細胞（ク
ローン＃１）を、図５に示すように単離した。

【００７２】２Ａプロテアーゼ発現の分析：ＩＰＴＧ誘導後のＨＥＫ−２９３ミニＴＫ＃１ク
ローンとＨＥＫ−２９３ＴＫ＃１４クローン中のポリオウイルス２Ａプロテアー
ゼ発現の直接分析は、タンパク質に対する抗体が欠如していたため行なわなかっ
た。現在利用できるいくつかの方法（ノーザンブロット解析、ＲＮａｓｅ保護測
定法、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および逆転写ポリメラーゼチェ
イン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む）を使用して、遺伝子発現の変化を測定するこ
とができる。ＲＴ−ＰＣＲ法は非常に高感度な方法であり、ＩＰＴＧ処理後のＨ
ＥＫ−２９３ミニＴＫ＃１クローン中のポリオウイルス２Ａプロテアーゼをコー
ドするｍＲＮＡの誘導を追跡するのに使用した。ｍＲＮＡは、異なる時点でのＩ
ＰＴＧで処理後のＨＥＫ−２９３親細胞とＨＥＫ−２９３ミニＴＫ−２Ａクロー
ンから調製した。ＲＮＡを以下のポリオウイルス２Ａプロテアーゼ特異的オリゴ
ヌクレオチドを使用してＲＴ−ＰＣＲ反応に付した：５’ＧＣＡＡＣＴＡＣＣＡＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧ３’（配列番号
２８）と５’ＧＣＡＡＣＣＡＡＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧ３’（配列番号２９
）。

【００７３】ポリオウイルス２ＡプロテアーゼｍＲＮＡはＨＥＫ−２９３親細胞中で検出さ
れなかったが、ＩＰＴＧ処理後に誘導され、図６に示すようにＩＰＴＧ処理の４
８時間後に最高レベルに達した。

【００７４】２Ａプロテアーゼ活性の分析ｐ２２０切断：ポリオウイルス２Ａプロテアーゼの充分性状解析された機能は、
４０Ｓリボゾームサブユニットの成分であるｐ２２０タンパク質（４Ｆγ翻訳因
子）の切断である。ｐ２２０の切断は、翻訳後修飾により１００〜１２０KDa分
子量の３つのＮ末端切断産物を与える。図６に示すようにＮ末端領域ｐ２２０に
対して特異的に作成したポリクローナル抗ｐ２２０抗体を使用して、ｐ２２０と
その切断産物を７％ＳＤＳＰＡＧＥとウェスタンブロッティング解析により同
定した。図６はそのような分析を示し、ＨＥＫ−２９３ミニＴＫ２Ａ＃１クロー
ンとＨＥＫ−２９３ＴＫ２Ａ＃１４クローンをポリオウイルス２Ａプロテアーゼ
発現について誘導してｐ２２０の切断生成物を作成した。対照として、ＨＥＫ−
２９３細胞溶解物を、in vitro翻訳により産生したポリオウイルス２Ａプロテア
ーゼで処理し、７％ＳＤＳＰＡＧＥでＨＥＫ−２９３２Ａクローンと同じ移動
度の同じ切断産物を生成することがわかった。

【００７５】この系を、ポリソーム分画のためのｍＲＮＡの供給源として使用した。上記の
プロトコールを使用してＲＤＡ分析を行い、その翻訳がポリオウイルス２Ａプロ
テアーゼの作用によりアップレギュレーションされる遺伝子を同定した。表４は
、上記方法に従って行なった分析とそれにより単離された遺伝子の結果を要約す
る。

【００７６】本出願を通して、種々の文献は引用により参照され特許は番号で参照される。
文献の完全な引用を以下に示す。本発明に関する技術の現状を詳細に説明するた
めに、これらの文献の完全な開示は参照することにより本明細書の一部とする。

【００７７】本発明は、例示的に記載し、使用される用語は説明が目的であって限定が目的
ではないことを理解されたい。

【００７８】上記教示を考慮すると、明らかに本発明の多くの修飾および変法が可能である
。従って添付の請求の範囲内で本発明は具体的に記載したもの以外に実施しうる
ことを理解されたい。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【００７９】引用文献 Aielloら、「ｍＲＮＡ示差的表示を使用するグルコースの上昇レベルへの暴露に
より変化したウシ網膜血管周囲細胞中の複数の遺伝子の同定」、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA Vol.91, pp.6231-6235 (1994) Bauerら、「改良されたディスプレイ技術（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）による示差的に
発現したｍＲＮＡ種の同定」、Nucleic Acids Research, Vol.21, No.18 (1993)
BharuchaとVen Murthy,「ショ糖密度勾配遠心分離とその後のポリアクリルアミ
ドゲルマトリックス中の固定化によるポリソームとポリソームｍＲＮＡの性状解
析」、Methods in Enzymology, Vol. 216, pp. 168-179 (1992) Braunら、「レプレゼンテーショナル示差的分析によるEwing肉腫ＥＷＳ／ＦＬＩ
融合タンパク質の標的遺伝子の同定」、Molecular and Cellular Biology, Vol.
15, No. 8, pp. 4623-4630 (1995) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
Davisら、「単一のトランスフェクトしたｃＤＮＡの発現は繊維芽細胞を筋原細
胞に変換する」、Cell 51:987-1000, 1987 Diatchenkoら、「抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション：示差的に制御
されたまたは組織特異的ｃＤＮＡプローブとライブラリーの作成方法」、Proc.
Natl. Acad. Sci., Vol. 93, pp. 6025-6030 (1996) Ehrenfeld, 「ピコルナウイルスＲＮＡによる翻訳の開始」、Translational Con
trol, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 549-573, 1996 Hadmanら、「示差的表示法の修飾はバックグランドを低減させ感度を上昇させる
」、Analytical Biochemistry 226:383-386 (1995) Hanauske-Abelら、「Ｇ１−Ｓ境界でヒプシン（hypusine）生成の調節に関連す
るポリソームｍＲＮＡのサブセットの検出。ＤＮＡ複製の開始におけるＥＩＦ−
５Ａの役割の提唱」、FEBS Letters 386 pp. 92-98 (1995) Hiramaら、「単離したポリソーム画分からのポリアデニル化ＲＮＡの直接精製」
、Analytical Biochemistry, 155, pp. 385-390 (1986) HubangとSchatz、「ｃＤＮＡのリプリゼンテーショナル示差的分析によるｍＲＮ
Ａ発現の差の同定」、Nucleic Acids Research, Vol. 22, No. 25, p. 5640-564
8 (1994) Jerreriesら、「伸長因子−１α ｍＲＮＡは有糸***促進物質による刺激によ
り選択的に翻訳される」、The Journal of Biological Chemistry, Vol. 269, N
o. 6, pp. 4367-4372 (1994) LiangとPardee、「ポリメラーゼチェイン反応による真核生物メッセンジャーＲ
ＮＡの示差的表示」、Science, Vol. 257, pp. 967-971 (1992) Liangら、「示差的表示による真核生物ｍＲＮＡの分布とクローニング：改良と
最適化」、Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 14, pp. 3269-3275 (1993)
LiangとPardee、「示差的表示の最近の進歩」、Current Opinion in Immunology
, 7:274-280 (1995) Linskensら、「増強示差的表示を使用する若い細胞と老化細胞における改変遺伝
子発現の分類」、Nuc. Ac. Res. 23:3244-3251 (1995) LisitsynとWigler、「２つの複合ゲノムの差をクローニング」、Science, Vol.
259, pp. 946-951 (1993) Machら、「Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼをコードするｃＤＮＡ
クローンの単離」、The Annual of Biological Chemistry, Vol. 261, No. 25,
pp. 11697-11703 (1986) Macejakら、「細胞性ｍＲＮＡの５’リーダーに介在される翻訳の内部開始」、N
ature, Vol. 353, pp. 990-994 (1991) Mechler、「膜結合ポリソームからのメッセンジャーＲＮＡの単離」、Methods i
n Enzymology, Vol. 152, pp. 241-253 (1987) Menakerら、「線形ショ糖密度勾配によるラット顎下唾液腺ポリソームの単離方
法」、Analytical Biochemistry 57, pp. 325-335 (1974) Meyuhasら、「真核生物におけるリボゾームタンパク質ｍＲＮＡの翻訳調節」、T
ranslational control, pp. 363-388 (1996) Mountfordら、「哺乳動物トランス遺伝子中の内部リボゾーム侵入部位とディシ
スロトニック（dicistronic）ＲＮＡ」、TIG, Vol. 11, No. 5, pp. 179-184 (1
995) Ogishimaら、「高性能ゲルろ過クロマトグラフィーによる哺乳動物組織ｍＲＮＡ
の分画」、Analytical Biochemistry, 138, pp. 309-313 (1984) Ohら、「遺伝子制御：内部リボゾーム結合による翻訳開始」、Current Opinion
in Genetics and develpment, pp. 295-300 (1993) Pelletierら、「ポリオウイルスＲＮＡから得られる配列に指令される真核生物
ｍＲＮＡの翻訳の内部開始」、Nature, Vol. 334, pp. 320-325 (1988) Schenaら、「相補的なＤＮＡマイクロアレイを有する遺伝子発現パターンの定量
的モニタリング」、Science, Vol. 270, pp. 467-470 (1995) Schenら、「迅速な発現クローニングと示差的ＲＮＡディスプレイによるヒト前
立腺癌癌遺伝子の同定」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, pp. 6778-67
82 (1995) Vagnerら、「リボゾームの内部侵入によるヒト繊維芽細胞増殖因子２ｍＲＮＡ
の代替翻訳」、Molecular and Cellular Biology, Vol. 15, No.1, pp. 35-44 (
1995) Welshら、「ＲＮＡの任意のプライムＰＣＲフィンガープリンティング」、Nuc.
Ac. Res. 20:4965-4970 (1992) Zhaoら、「新しいプライマー方策は示差的表示の正確度を改善する」、Biotechn
iques 18:842-850 (1995)

【配列表】

【図面の簡単な説明】

本発明の他の利点は、添付の図面とともに詳細な説明を参照して容易に理解さ
れるであろう。

【図１Ａ】図１Ａは、ショ糖密度勾配上の細胞質ＲＮＡの分画の吸光度プロフィールであ
り、吸光度（２５４nm）は細胞質ＲＮＡの沈降速度に対してプロットしてある。

【図１Ｂ】図１Ｂは、アガロースゲルで電気泳動し臭化エチジウムで染色した精製ＲＮＡ
の写真であり、ＲＮＡの分画を示す。

【図２】図２は、全ＲＮＡのプローブをポリソームＲＮＡ由来のプローブ（翻訳プロー
ブ）と比較したＤＮＡチップハイブリダイゼーション結果のカラー表示である。

【図３】図３は、全ＲＮＡのプローブ（Ｔｏｔ）を核ＲＮＡ由来のプローブ（ＳＴＰ）
と比較したＤＮＡチップハイブリダイゼーション結果のカラー表示である。

【図４】図４Ａ〜Ｃは、（Ａ）プラスミドｐＴＫ−ＯＰ３−ＷＴ２Ａ中、（Ｂ）プラス
ミドミニＴＫ−ＷＴ２Ａ中、および（Ｃ）ヒグロマイシン選択マーカーを含有す
るプラスミド中、のポリオウイルス２Ａ遺伝子を含有するプラスミドの模式図で
ある。

【図５】図５は、２Ａプロテアーゼの誘導後に細胞の死に至るポリオウイルス２Ａプロ
テアーゼの誘導を例示するグラフである。

【図６】図６は、ＩＰＴＧによる誘導後の形質転換ＨＥＫ−２９３細胞（２９３−２Ａ
）中のポリオウイルス２Ａプロテアーゼ発現の存在と、ＩＰＴＧによる処理後の
ＨＥＫ−２９３（２９３）親細胞中のポリオウイルス２Ａプロテアーゼの欠如を
示すゲルの写真である、および

【図７】図７は、４０Ｓリボゾームサブユニットのｐ２２０タンパク質成分の切断にお
けるポリオウイルス２Ａプロテアーゼの活性を示すウェスタンブロットの写真で
あり、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼについて誘導したクローンがｐ２２０タ
ンパク質の切断産物を生成したことを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者モル、オルナイスラエル国キルヤットオノ、ガネイイラン、エメクアイアロン 12 (72)発明者ルリア、シルビアイスラエル国ネスージオナ、ハバニム 113／17 (72)発明者ハリス、ニコラスイスラエル国レホボト、ナハシハリスホン 14／17 (72)発明者グロスマン、ゼハバイスラエル国レホボト、タランストリート 20 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA12 DA02 4B063 QA01 QQ36 QQ53 QQ59 QR32 QR55 4B064 AF27 CA10 CA19 CC24 DA13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】その発現が、特異的な合図（cue or cues）に応答性である
遺伝子を同定するための方法またはプロセスであって、（ａ）生物または組織または細胞に合図を適用する工程、（ｂ）合図を受けた組織または細胞から特異的細胞画分を単離する工程、（ｃ）細胞画分からｍＲＮＡを抽出する工程；および（ｄ）ｍＲＮＡ試料を合図を受けなかった対照試料と比較して示差的分析して
、合図に応答した遺伝子を同定する工程、を含む、上記方法またはプロセス。
【請求項２】合図は、毒素または化学物質、または薬剤、または機械的ス
トレス、または電流、または病原体または病態、またはホルモン、または特異的
タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】合図は、細胞の化学的処理、または細胞の放射線照射、また
は細胞の酸素欠乏としてさらに定義される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】合図は、遺伝子翻訳との関係が未知であるストレス誘導性要
素としてさらに定義される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】遺伝子は、翻訳レベルで同定され；遺伝子は、転写レベルで
制御され；遺伝子は、ＲＮＡ安定性により制御され；遺伝子は、核と細胞質との
間のｍＲＮＡ輸送速度により制御され；遺伝子は、示差スプライシングにより制
御され；そして遺伝子は、アンチセンスＲＮＡにより制御される、請求項１に記
載の方法。
【請求項６】ｍＲＮＡ試料は、さらにｍＲＮＡサブ画分に分画され、そし
てこれらは、本明細書に定義されるように、発現制御の全てのレベルで合図に応
答する遺伝子を同定するために、および応答の量および方向を測定するために、
示差的分析に付される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】ｍＲＮＡ試料は、本質的に細胞質、核、ポリリボソーム、サ
ブポリリボソーム、ミクロソームまたは粗面小胞体、ミトコンドリアおよびスプ
ライスソーム（splicesome）結合ｍＲＮＡよりなる群からの１つまたはそれ以上
のサブ画分に分画される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】示差的分析工程は、示差的表示法（differential display）
、レプレゼンテーショナル示差的分析（representational differential analys
is）（ＲＤＡ）、抑制サブトラクションハイブリダイゼーション（suppressive
subtraction hybridization）（ＳＳＨ）、遺伝子発現の連続分析（serial anal
ysis of gene expression）（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現マイクロアレイ法（gene
expression microarray）（ＧＥＭ）、核酸チップ法（nucleic acid chip techn
ology）、オリゴヌクレオチドチップ法（oligonucleotide chip technology）；
ＤＮＡ膜アレイ法（DNA membrane arrays）；直接配列決定法、およびこれらの
方法の変法および組合せよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】示差的分析工程は、翻訳レベルで制御される遺伝子を同定お
よび測定することとしてさらに定義される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】示差的分析工程は、転写レベルで制御される遺伝子を同定
および測定することとしてさらに定義される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】示差的分析工程は、ＲＮＡ安定性により制御される遺伝子
を同定および測定することとしてさらに定義される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】示差的分析工程は、核と細胞質との間のｍＲＮＡ輸送速度
により制御される遺伝子を同定および測定することとしてさらに定義される、請
求項８に記載の方法。
【請求項１３】示差的分析工程は、示差スプライシングにより制御される
遺伝子を同定および測定することとしてさらに定義される、請求項８に記載の方
法。
【請求項１４】示差的分析工程は、分泌タンパク質および膜タンパク質を
コードする遺伝子を同定および測定することとしてさらに定義される、請求項８
に記載の方法。
【請求項１５】示差的分析工程は、核タンパク質をコードする遺伝子を同
定および測定することとしてさらに定義される、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】内部リボゾーム侵入部位をコードする遺伝子配列を同定す
る方法であって、細胞内の５’キャップ依存性ｍＲＮＡ翻訳を阻害する工程；細胞からｍＲＮＡのプールを回収する工程；および内部リボゾーム侵入部位をコードする配列を含む遺伝子を同定するためにｍＲ
ＮＡのプールを示差的分析する工程、を含んでなる、上記方法。
【請求項１７】阻害工程は、非５’キャップ依存性ｍＲＮＡ翻訳を選択す
ることとしてさらに定義される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】阻害工程は、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼをコードす
る遺伝子を細胞中に組み込む工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】組み込み工程は、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼをコー
ドする遺伝子を含有するベクターで細胞を形質転換することとしてさらに定義さ
れる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】ポリオウイルス２Ａプロテアーゼをコードする遺伝子の発
現を制御する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】分析工程は、示差的表示分析としてさらに定義される、請
求項１６に記載の方法。
【請求項２２】分析工程は、レプレゼンテーショナル示差的分析としてさ
らに定義される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】分析工程は、遺伝子発現マイクロアレイ分析の実施として
さらに定義される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】翻訳的に制御されるものとして同定される遺伝子をクロー
ン化するさらなる工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】分析工程は、個々にまたはプールとして、同じ密度で移動
するポリソーム画分を識別する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】分析工程は、個々にまたはプールとして、非ポリソーム画
分を区別する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】分析工程は、個々にまたはプールとして、刺激ポリソーム
および非ポリソーム画分を区別する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】分析工程は、非分画全ＲＮＡプールに比較して、個々に、
またはプールとして、ポリソームおよび非ポリソーム画分のそれぞれを区別する
、請求項１６に記載の方法。