JP7085999B2 - 分子プログラミングツール - Google Patents
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Description
本願は、2016年2月17日に出願された米国仮特許出願第62/296,310号、2016年2月24日に出願された米国仮特許出願第62/299,206号、2016年12月2日に出願された米国仮特許出願第62/429,149号、及び2016年12月9日に出願された米国仮特許出願第62/432,017号の、35U.S.C§119(e)に対する優先権を主張するものであり、これらの特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所により賦与されたEB018659;国立科学財団により賦与された1317291、2014188、1540214、及び1334109;並びに米国国防省、海軍研究局により賦与されたN00014-14-1-0610、N00014-13-1-0593、及びN00014-16-1-2410の下で政府の支援を得て実施された。政府は、本発明に一部の権利を有する。
デオキシリボ核酸(DNA)の特性をコードする情報と、ワトソン・クリック(Watson-Crick)型塩基対相補性を比較的容易にプログラムできることによって、この20年の間に多様な用途で基質として使用されるDNAが得られた1~9。さらに、DNAは、規定された2D及び3D形状のナノ構造に自己組織化するようにプログラムされて10~18、生体分子の正確な空間パターン形成19~26、さらには、無機分子の造形27も可能にする。これらの合成系は、生体分子の核磁気共鳴(NMR)構造決定のためのDNAナノ構造28、細胞経路の条件付き調節22、29、30、並びに薬物送達のためのビヒクルとしてのDNAナノ構造31、32の適用に関して進行中の研究により、合成生物学、材料科学、及び生物学的画像の分野で、それらの価値を既に示している。
一部の態様では、分子地形の記録及び再構築を可能にする核酸ベースの分子ツールが本明細書に提供される。DNAは、ゲノム中の多様な分子機能についての情報をコードすることによって、生命をパターン形成する。DNAはまた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Randall K Saiki, et al. Science, 239(4839):487-491, 1988)、ローリングサークル増幅(RCA)(Paul M Lizardi, et al. Nature genetics, 19(3):225-232, 1998)、及び鎖置換回路(Lulu Qian and Erik Winfree. Science, 332(6034):1196-1201, 201; David Yu Zhang and Georg Seelig. Nature chemistry, 3(2):103-113, 2011)などの多数の合成反応ネットワークのためのテンプレート基質としても役立つ。本開示は、中でも、プライマー交換反応(PER)の概念を導入するが、これは、段階的に、一本鎖DNA(ssDNA)の等温合成をパターン形成するために、一部の実施形態では、触媒活性DNAヘアピン種を用いる。本明細書に提供されるデータは、プライマー交換反応カスケードを用いて、規定の経路に従ってDNAの新生鎖を成長させることができ、さらに、これを用いて、例えば、特定のプライマーシグナルを線上に増幅する合成テロメラーゼを構築することができることを示している。本明細書に提供される別のデータは、溶液中のRNAシグナルをプロセシングし、これに応答するいくつかの機能性システム、例えば、無標識バイオセンサー、タイムレコーダ、論理回路、及び標的シグナルの検出を、独立のRNA配列について動作する機能性DNAザイムに変換するナノデバイスなどの実現を明らかにしている。本開示の方法を用いて、等温インサイチュ環境で、任意のssDNAを合成すると共に、例えば、分子デバイスの新たな作製のための基礎を提供することができる。
本明細書に記載するツールは、分子構造及び可溶性シグナルの記録並びに分子構造のプログラムされた組織化を可能にする。例えば、本開示は、(a)インサイチュで、又は治療薬/診断薬としてインビボで、トリガーされた複雑な構造の組織化を操作するために用いることができる一本鎖DNAの等温及び自律的合成のための組成物及び方法、(b)経過した時間を計測するための分子時計及び時間遅延後のシグナルを制御するためのタイマー、並びに(c)環境シグナルに応じて差別化し、これらのシグナルを経時的に記録する環境応答性ナノマシンを提供する。本開示は、例えば、Cryo-EMイメージングのためのマーカのインサイチュ成長、汚染物質の長期環境監視、条件付き遺伝子調節、及びトリガーされたインサイチュでの毒素被包などの変革的適用のための基礎を提供する。
本開示のこの態様の基本は、図1A~1Bに描くプライマー交換反応(PER)である。短いプライマー配列から核酸を合成するためのこの酵素による方法は、等温、例えば、典型的には37℃で操作し、燃料としてdNTPしか必要としない。反応物を合わせて、長い核酸配列を成長させるPERカスケードを形成することができ、これらの合成反応物は、存在する多重化環境シグナルに応じて作製することができる。これによって、リアルタイムで合成される転写物への、具体的なmRNA種の存在などのシグナル情報の空間・時間的記録が可能になる。さらに、一部の実施形態では、合成された転写物は、任意の配列を有し得るため、合成された鎖自体が、特定の条件に応答して細胞内でプログラムされた機能的挙動を果たす。
触媒核酸分子(「触媒分子」)は、一般に、不対(一本鎖)3’トーホールドドメインと、3’トーホールドドメイン(一部の実施形態では、これに直接隣接して)から5’側の対(二本鎖)ドメインを含む。「触媒ヘアピン分子」は、ループドメインも含む。プライマー交換反応の動態学は、例えば、触媒分子(例えば、触媒分子の1つ若しくは複数のドメイン)の長さ、組成及び濃度を変更することによって、制御することができる。
胚発生中に、環境シグナルと組み合わせた速度論的経路によって、器官及び脚などの複雑な機能性構造の組織化が起こる。速度論、シグナル伝達及び構造、並びに生物系における驚くべきレベルのプログラム可能性及び複雑性の間のこの密接な関係に、本開示は、少なくとも一部が基づくものである。今日まで、アニーリングプロトコルにより形成することができる構造の複雑さに一層近い環境シグナルに応じて形状を動的に形成することはほとんど不可能であった。本明細書に記載するプライマー交換技術は、この隔たりを克服する。PERをツールとして使用することができるいくつかの用途の例を図6、7、11及び18に描くと共に、以下に説明する。
一部の実施形態では、プライマー交換反応(PER)を用いて、長い固定長さ核酸鎖を合成する(図7A)。核酸鎖の長さは、反応物中の触媒分子の長さ及び数をはじめとするいくつかの要因に応じて変動する。触媒反応(プライマー結合、プライマーの鎖置換伸長及び分岐移動など;図1を参照)の各々が、成長する核酸鎖にドメインを付加する。全てのプライマー及び触媒分子成分は比較的小さいことから、完全に合成された核酸スカフォールドの直接送達が実現不可能となり得る固定細胞におけるものなど、密集環境において鎖合成を実施することができる。
本開示のプライマー交換反応システムはまた、例えば、任意の分子事象(例えば、物理的又は化学的シグナルに対する曝露)間の時間を計測し、インサイチュでそれらをDNA中でコードする(「分子時計」として機能する)ことができる合成システムを作製するために使用することもできる。PERは、シグナルのネイティブ環境において、また、一部の実施形態では、複数のシグナルを同時に検出するための速度論、さらにはその可能性を妨害し得る蛍光タグ付け又はバーコード化を一切用いずに、シグナルを直接測定することができる。一部の実施形態では、PERシステムを用いて、感知された事象と事象の間の時間に、鎖の末端に塩基を絶えず付加することにより、時間を記録することができる。これらの鎖の長さの分布を、2つの分子シグナル間の時間量の指針として用いることができ、この分布は、例えば、変性ゲル上で直接読み取ることができる。反応速度は、ヘアピン濃度により制御することができるため、多くの異なる時間尺度(例えば、分から時間、又はそれより多くの尺度)にわたって時間を計測することが可能である。
生物は、単細胞から発生し、専用の発達経路の横断を指令する分子シグナルによって、ゲノムプログラムから自己組織化する。これらの驚くほど効率的且つ頑健な発達経路に触発されて、合成発達性自己組織化が、本開示のプライマー交換反応システムにより達成され、これによって、様々な構造が、シグナル濃度の時間的及び空間的変化という結果として形成される。前述した構造合成フレームワーク及びシグナル検出及び作動能力を用いて、一部の実施形態では、発達性自己組織化がプログラムされ、これにより、構造は、それらが経時的に遭遇する様々な環境シグナルに応答して、成長すると共に、形状を変化させる。これらの構造は、規定の動態学的経路に従いながら、分子事象を動的に記録すると共に、イメージング、システム生物学、及び生物学的シグナル処理における適用のための特定の構造に組織化する。これらの反応は、等温で実施され、システムの所望の動作温度、速度、及びイオン濃度と適合するように、反応速度論を修正することができる。このアプローチを首尾よく実施すれば、様々な環境条件への適合能力と、ヒトの介入をほとんど、又は全く必要としない長期にわたる実行能力の両方によって、合成自己組織化の分野に多大なパラダイムシフトが導入される。本明細書に記載するように、プライマー交換反応システムを用いて、イメージング用のマーカとして構造の成長をパターン形成及び指令し、生体分子のパターン形成のためのスカフォールドを構築することができ、あるいはさらに、例えば、特定の標的分子の周囲に形成されて、それを捕捉する構造を合成することもできる。
トリガーされたcryo-EMマーカのインサイチュ合成.タンパク質に対して、トリガーされた大型の構造的に健全なDNAナノ構造成長を、cryo-EMを用いた構造決定のためのマーカとして使用することができる。既知形状の非対称マーカを用いれば、タンパク質構造のクラス平均化及び3D再構築のプロセスが、より容易になるはずである。このアプローチは、例えば、そうでなければイメージングが困難なタンパク質の構造をマッピングする上で特に有用である。
一部の実施形態では、PERカスケードをインビボでインプリメントすることによって、細胞内での核酸のプログラム可能な動的合成が可能になる。これらのシステムは、単細胞レベルで応答性となって、特定の細胞環境に従って合成される転写物の集団を形成し得る。これらの転写物は、時間とともに検出されるシグナルの記録であってもよいし、又は機能性RNA転写物であってもよく、これにより、細胞は、特定の細胞条件に対してプログラムされた応答を有する。
また、分子レベルで分子環境を検査する分子モータシステムも本明細書に記載される。そのために、単位操作がローカルスケールで起こるべきであり、それに続く操作が、隣接する部位に沿って連続的に起こるべきである。単位相互作用は、明確な距離依存的挙動を有するべきである。単位ステップの反応速度は、クローラ及びテンプレートの様々な部分の長さ、並びに部位同士の距離に依存する。「分子クローラ」は、ヘビ様(snake-like)分子種であり、これは、第1走路部位から最終走路部位まで成長する際、全軌道にわたって走路の周りを動き回る(例えば、図31Aを参照)。クローラが部位間を移動する際、これは、部位からの情報をコピーし、情報をその成長する本体(核酸)に記録する。「分子ウォーカ」は、部位の間を移動し、各ステップの後に前の部位を去る(例えば、図32Aを参照)。走路に沿って移動する間、ウォーカは、その本体を成長させ、走路部位からの情報をコピーし、これを保持する。
生物学的研究は、分子相互作用について量的、感受性及びシステムレベルの情報を報告することができるツールを必要とする。これらのツールは、1分子のレベルで、長期にわたり相互作用を報告する能力を有すると同時に、膨大且つ多様な相互作用を処理しなければならない。本明細書には、「分子定規」と呼ばれる分子記録システムも提供され、これは、DNA分子内の距離情報を記録することによって標的分子間のナノスケール距離を記録する(図31A~31B)。生成されたDNA記録の長さは、測定される距離に直接対応する。加えて、各DNA記録は、その配列の一部として、標的分子のアイデンティティをコードする。1ラウンドの記録生成は以下のように進行する(図34Bを参照):(a)標的にDNA記録の前駆体を接種する。(b)前駆体は、それらがパートナー核酸と遭遇するまで、鎖置換ポリメラーゼ及び触媒分子(例えば、触媒ヘアピン)の助けによって成長する。パートナー同士がハイブリダイズし、延長して記録を生成し、各々が他方をテンプレートとして用いる。(c)記録が放出され、標的はリセットされて、更なる記録ラウンドを可能にする。複数の記録ラウンドによって、複数の隣接物との距離、さらには距離の変化/相違を報告する記録が得られる。
1.(a)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)結合ドメインを含む初期触媒ヘアピン分子;
(b)3’トーホールドドメインと相補的で、これと結合する初期プライマー;並びに
(c)鎖置換活性を有するポリメラーゼ
を含むプライマー交換反応(PER)システム。
2.結合ドメインが、ループドメインである、パラグラフ1に記載のPERシステム。
3.(d)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)第2ヘアピン分子の3’サブドメインと第2ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む第2触媒ヘアピン分子をさらに含み、ここで、第2ヘアピン分子の3’トーホールドドメインが、初期ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である、パラグラフ1又は2に記載のPERシステム。
4.第2ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメイン内に位置するヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含む第2プライマーをさらに含む、パラグラフ3に記載のPERシステム。
5.(e)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)第3ヘアピン分子の3’サブドメインと第3ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む第3触媒ヘアピン分子をさらに含み、ここで、第3ヘアピン分子の3’トーホールドドメインが、第2ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である、パラグラフ1~4のいずれか1つに記載のPERシステム。
6.第3ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的な第3プライマーをさらに含む、パラグラフ5に記載のPERシステム。
7.複数の触媒ヘアピン分子をさらに含み、各ヘアピン分子は、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)複数のうち1ヘアピン分子の3’サブドメインと、複数のうち1ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含み、ここで、各ヘアピン分子の3’トーホールドドメインが、複数のうち1つの他のヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である、パラグラフ5又は6に記載のPERシステム。
8.複数のプライマーをさらに含み、各プライマーは、複数のうち1つのヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的である、パラグラフ7に記載のPERシステム。
9.プライマーが、検出可能な分子と連結される、パラグラフ1~8のいずれか1つに記載のPERシステム。
10.プライマーが、生体分子と連結される、パラグラフ1~9のいずれか1つに記載のPERシステム。
11.生体分子が、タンパク質である、パラグラフ10に記載のPERシステム。
12.ポリメラーゼが、phi29 DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ又はBsu DNAポリメラーゼである、パラグラフ1~11のいずれか1つに記載のPERシステム。
13.デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)をさらに含む、パラグラフ1~12のいずれか1つに記載のPERシステム。
14.(a)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)分子の5’サブドメインと分子の3’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む初期触媒ヘアピン分子;
(b)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)第2ヘアピン分子の3’サブドメインと第2ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)結合ドメインを含む第2触媒ヘアピン分子(ここで、第2ヘアピン分子の3’トーホールドドメインは、初期ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である);並びに
(c)初期ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー
を含むプライマー交換反応(PER)システム。
15.結合ドメインが、ループドメインである、パラグラフ14に記載のPERシステム。
16.第2ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的な第2プライマーをさらに含む、パラグラフ14又は15に記載のPERシステム。
17.鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含む、パラグラフ14又は16に記載のPERシステム。
18.デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)をさらに含む、パラグラフ14~17のいずれか1つに記載のPERシステム。
19.(a)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)結合ドメインを含む初期触媒ヘアピン分子、
(b)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)第2触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと第2触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む第2触媒ヘアピン分子(ここで、第2触媒分子の3’トーホールドドメインは、初期触媒分子の5’サブドメインと相補的である)、
(c)初期ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的なプライマー、
(d)鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
(e)デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)
を反応バッファー中で合わせることより、反応混合物を形成した後;
一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングをもたらす条件下で反応混合物をインキュベートすること
を含むプライマー交換反応(PER)方法。
20.結合ドメインがループドメインである、パラグラフ19に記載のプライマー交換反応。
21.(a)鎖置換活性を有するポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)の存在下で、インプットプライマーを触媒分子と接触させるが、ここで、触媒分子は、(i)不対3’トーホールドドメイン及び(ii)置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから5’側に位置する対ドメインを含み、インプットプライマーは、触媒分子の3’トーホールドドメインと相補的であり;
(b)触媒分子の対ドメインを介してプライマーを延長することにより、置換鎖を置換して、延長アウトプットプライマーを形成し;
(c)置換鎖とテンプレート鎖同士の分子内ヌクレオチド塩基対によって、ヘアピン分子から延長アウトプットプライマーを置換し;
(d)鎖置換活性を有するポリメラーゼ及びdNTPの存在下で、(c)の置換された延長アウトプットプライマーを第2触媒分子と接触させることを含み、ここで、第2触媒分子は、(i)不対3’トーホールドドメイン及び(ii)置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから5’側に位置する対ドメインを含み、延長アウトプットプライマーは、第2初期触媒分子の3’トーホールドドメインと相同的である、プライマー交換反応。
22.一本鎖核酸を生成する方法であって、
(a)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子間ヌクレオチド塩基対により形成される、対ステムドメイン、及び(iii)ヘアピンループドメインを含む初期ヘアピン分子、
(b)各ヘアピン分子が、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)複数のうち1ヘアピン分子の3’サブドメインと複数のうち1ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む、複数の異なるヘアピン分子(ここで、各ヘアピン分子の3’トーホールドドメインは、複数のうち1つの他のヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である)、
(c)初期ヘアピン分子の3’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー、
(d)鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
(e)デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)
を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成した後;
初期プライマーよりも長い一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングをもたらす条件下で反応混合物をインキュベートすることを含む方法。
23.(e)で生成された一本鎖核酸が、複数のうちのヘアピン分子のステムドメインと相補的であるヌクレオチドドメインのコンカテマーを含む、パラグラフ22に記載の方法。
24.(e)で生成された一本鎖核酸が、自己相補性のドメインを含む、パラグラフ22又は23に記載の方法。
25.自己相補性のドメインの同士の分子内ヌクレオチド塩基対によって(e)で生成された一本鎖核酸の折り畳みが達成される条件下で、反応混合物をインキュベートすることをさらに含む、パラグラフ24に記載の方法。
26.核酸ステープル鎖の存在下で、一本鎖核酸及び核酸ステープル鎖のドメイン同士のヌクレオチド塩基対によって(e)で生成された一本鎖核酸の折り畳みが達成される条件下で、反応混合物をインキュベートすることをさらに含む、パラグラフ22~25のいずれか1つに記載の方法。
27.パラグラフ1~13のいずれか1つに記載のPERシステムを含む細胞。
28.細胞が、原核細胞又は真核細胞である、パラグラフ27に記載の細胞。
29.細胞が、哺乳動物細胞である、パラグラフ28に記載の細胞。
30.少なくとも2つの核酸を含み、これらの各々が、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと、同じ触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む触媒ヘアピン分子をコードする、ベクター。
31.少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つの核酸をコードし、これらの各々が、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと、同じ触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む触媒ヘアピン分子をコードする、パラグラフ30に記載のベクター。
32.パラグラフ30又は31に記載のベクターを含む、細胞。
33.触媒分子の3’トーホールドドメインと相補的で、且つ、これと結合する初期プライマーをさらに含む、パラグラフ32に記載の細胞。
34.鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含む、パラグラフ32又は33に記載の細胞。
35.(a)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)結合ドメインを含む触媒ヘアピン分子(ここで、(a)(i)及び(a)(ii)のドメインは、タンデム反復配列を形成する)、
(b)(i)3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)結合ドメインを含む少なくとも1つの他の触媒ヘアピン分子(ここで、(b)(i)及び(b)(ii)のドメインは、シグナル配列により分断されるタンデム反復配列を形成し、(b)(i)の3’トーホールドドメインは、プロテクター鎖と不可逆的に結合している)、並びに
(c)(a)の触媒ヘアピン分子の3’トーホールドドメインと相補的で、且つ(b)の触媒ヘアピン分子の3’トーホールドドメインと相補的であるドメインを含む核酸プライマー
を含む組成物。
36.(a)(iii)及び/又は(b)(iii)の結合ドメインが、ループドメインである、パラグラフ35に記載の組成物。
37.(a)(iii)及び/又は(b)(iii)の結合ドメインが、少なくとも1つの共有結合架橋したヌクレオチドを含む、パラグラフ35に記載の組成物。
38.結合ドメインが、少なくとも10ヌクレオチド長の安定した対ドメインである、パラグラフ35に記載の組成物。
39.シグナル配列が、2~20ヌクレオチドを有する、パラグラフ35~38のいずれか1つに記載の組成物。
40.シグナル配列が、標識分子に特異的にバーコード化される、パラグラフ35~39のいずれか1つに記載の組成物。
41.プライマーが、実験特異的バーコードを含む、パラグラフ35~40のいずれか1つに記載の組成物。
42.プロテクター鎖が、任意選択で、ループドメインを介して、(b)の少なくとも1つの他の触媒ヘアピン分子の3’トーホールドドメインと連結している、パラグラフ35~41のいずれか1つに記載の組成物。
43.標的分子をさらに含む、パラグラフ35~42のいずれか1つに記載の組成物。
44.標的分子が、核酸である、パラグラフ43に記載の組成物。
45.核酸が、一本鎖核酸又は二本鎖核酸である、パラグラフ44に記載の組成物。
46.標的分子が、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、脂肪、及び分子量900ダルトン未満の小分子から選択される生体分子である、パラグラフ43に記載の組成物。
47.プロテクター鎖が、標的分子と結合することができる、パラグラフ43~46のいずれか1つに記載の組成物。
48.標的分子が、プロテクター鎖と相補的なヌクレオチド配列を含むか、又はヌクレオチド配列と連結している、パラグラフ47に記載の組成物。
49.鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含む、パラグラフ35~48のいずれか1つに記載の組成物。
50.標的分子を検出する方法であって、
標的分子、鎖置換ポリメラーゼ、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)を含有する反応バッファー中で、
(a)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)結合ドメインを含む触媒ヘアピン分子(ここで、(a)(i)及び(a)(ii)のドメインは、タンデム反復配列を形成する);
(b)(i)3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)結合ドメインを含む少なくとも1つの他の触媒ヘアピン分子(ここで、(b)(i)及び(b)(ii)のドメインは、シグナル配列により分断されるタンデム反復配列を形成し、(b)(i)の3’トーホールドドメインは、標的分子と結合することができるプロテクター鎖と不可逆的に結合している)、並びに
(c)(a)の触媒ヘアピン分子の3’トーホールドドメインと相補的で、且つ(b)の触媒ヘアピン分子の3’トーホールドドメインと相補的であるドメインを含む核酸プライマー
を合わせ、
初期プライマーよりも長く、且つシグナル配列の少なくとも1つを含む一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で、反応混合物をインキュベートすることを含む方法。
51.分子事象間の時間を計測する方法であって、
(a)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ヘアピンループドメインを含む初期触媒ヘアピン分子、
(b)各ヘアピン分子が、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)ヘアピン分子の3’サブドメインとヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む複数の異なる触媒ヘアピン分子(ここで、各ヘアピン分子の3’トーホールドドメインは、複数のうち1つの他のヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である)、
(c)初期ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー、
(d)鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
(e)デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成し;
第1分子事象に反応混合物を曝露し;
一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で反応混合物をインキュベートした後;
第2分子事象に反応混合物を曝露することを含む方法。
52.第1分子事象が、DNA重合を開始する、パラグラフ51に記載の方法。
53.第2分子事象が、DNA重合を終結させる、パラグラフ51又は52に記載の方法。
54.生成される一本鎖核酸の長さに基づいて、第1分子事象と第2分子事象との間の時間間隔を決定することをさらに含む、パラグラフ51~53に記載の方法。
55.(a)不対3’トーホールドドメイン、及びトーホールドドメインから5’側に位置し、且つ置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、対ドメインを含む初期触媒分子;
(b)不対3’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー;並びに
(c)鎖置換活性を有するポリメラーゼ
を含む、プライマー交換反応(PER)システム。
56.不対3’トーホールドドメイン、及びトーホールドドメインから5’側に位置し、且つ置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、対ドメインを含む第2触媒分子をさらに含み、ここで、第2触媒分子の3’トーホールドドメインは、初期触媒分子の対ドメインの置換鎖と相補的である、パラグラフ55に記載のPERシステム。
57.(a)(i)不対3’トーホールドドメイン及び(ii)置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから5’側に位置する対ドメインを含む初期核酸分子;
(b)(i)不対3’トーホールドドメイン及び(ii)置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから5’側に位置する対ドメインを含む第2核酸分子(ここで、第2核酸分子の不対3’トーホールドドメインは、初期核酸分子の置換鎖と相補的である);
(c)初期核酸分子の不対3’トーホールドドメイン内に位置するヌクレオチドと相補的なプライマー
を含む分子モータシステム。
58.鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含む、パラグラフ57に記載の分子モータシステム。
59.初期核酸分子の対ドメインが、重合を終結させる分子を含む、パラグラフ57又は58に記載の分子モータシステム。
60.第2核酸分子の対ドメインが、重合を終結させる分子を含む、パラグラフ57~59のいずれか1つに記載の分子モータシステム。
61.第2核酸分子の3’トーホールドドメインが、重合を停止する3’分子を含む、パラグラフ57~59のいずれか1つに記載の分子モータシステム。
62.複数の核酸分子をさらに含み、各分子が、(i)不対3’トーホールドドメイン及び(ii)置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから5’側に位置する対ドメインを含み、ここで、複数のうちの1分子の不対3’トーホールドドメインは、複数のうち1つの他の核酸分子の置換鎖と相補的である、パラグラフ57~61のいずれか1つに記載の分子モータシステム。
63.核酸分子の少なくとも1つが、標的生体分子と結合している、パラグラフ57~62のいずれか1つに記載の分子モータシステム。
64.核酸分子の各々が、異なる標的生体分子と結合している、パラグラフ63に記載の分子モータシステム。
65.標的分子間の距離を記録する方法であって、
(a)(i)不対3’トーホールドドメイン、及び(ii)置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから5’側に位置する対ドメインを含む初期核酸分子(ここで、初期核酸分子は、標的生体分子と連結している)、
(b)(i)不対3’トーホールドドメイン、及び(ii)置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから5’側に位置する対ドメインを含む第2核酸分子(ここで、第2核酸分子の不対3’トーホールドドメインは、初期核酸分子の置換鎖と相補的であり、また、第2核酸分子は、標的生体分子と連結している)、
(c)初期核酸分子の不対3’トーホールドドメインと相補的なプライマー、
(d)鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
(e)デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成し;
一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で反応混合物をインキュベートすることを含む方法。
66.反応混合物が、複数の核酸分子をさらに含み、各分子が、(i)不対3’トーホールドドメイン及び(ii)置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから5’側に位置する対ドメインを含み、ここで、複数のうち1核酸分子の不対3’トーホールドドメインは、複数のうち1つの他の核酸分子の置換鎖と相補的であり、複数の核酸分子の各々が、標的生体分子と連結している、パラグラフ65に記載の方法。
67.(a)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む初期ヘアピン分子(ここで、初期ヘアピン分子は、標的生体分子と連結している);
(b)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む第2ヘアピン分子(ここで、第2ヘアピン分子は、標的生体分子と連結しており、初期ヘアピン分子の5’サブドメインは、第2ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である);
(c)一方が、初期ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的であり、他方が、第2ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的である、2つのプライマー;
(d)各分子が、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む、複数の触媒ヘアピン分子(ここで、複数のヘアピン分子各々の5’サブドメインは、複数のうち1つの他のヘアピン分子の5’サブドメインと相補的であり、複数のヘアピン分子の1つの3’トーホールドドメインは、初期ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的であり、複数のうちの別のヘアピン分子の3’トーホールドドメインは、第2ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である);並びに
(e)鎖置換活性を有するポリメラーゼ
を含む分子記録システム。
68.標的生体分子間の距離を記録する方法であって、
(a)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む初期ヘアピン分子(初期ヘアピン分子は、標的生体分子と連結している);
(b)(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む第2ヘアピン分子(第2ヘアピン分子は、標的生体分子と連結しており、初期ヘアピン分子の5’サブドメインは、第2ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である);
(c)一方が、初期ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的であり、他方が、第2ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的である、2つのプライマー;
(d)各分子が、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)分子の3’サブドメインと分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む、複数のヘアピン分子(ここで、複数のヘアピン分子各々の5’サブドメインは、複数のうち1つの他のヘアピン分子の5’サブドメインと相補的であり、複数のヘアピン分子の1つの3’トーホールドドメインは、初期ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的であり、複数のうち別のヘアピン分子の3’トーホールドドメインは、第2ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である);並びに
(e)鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びにデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成した後;
二本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で反応混合物をインキュベートすることを含む方法。
以下の実施例では、中でも、PER分子プリミティブを使用するいくつかのシステムの設計及び実施を説明し、PER分子プリミティブは、インサイチュで任意のssDNA配列を等温で合成するための一般的なフレームワークを提供する。データは、どのようにして、プライマー交換反応(PER)を互いに連鎖させて、固定長さのオリゴを合成する反応カスケードを形成することができるかを示す。後述するように、発癌性miRNAマーカの感知に応答して機能性DNAザイムを合成したナノデバイス、合成テロメラーゼを用いて、miRNA標的を検出して、そのシグナル検出を増幅することができる無標識バイオセンサー、オルトゴナルRNAインプットを検出することができる論理回路、及び2つのインプットシグナルの順序を記憶した分子レコーダは、全てインプリメントに成功した。多くのケースで、同じ分子インプット及びヘアピンを異なる経路中に再構成することによって、システムの論理を実行することができる。
この実施例は、プライマー交換反応を用いて、規定の経路に従って核酸鎖を伸長することができることを実証する。濃度100nMのCy5標識プライマーと濃度10nMのヘアピンを用いて、第1の反応物を37℃で2時間インキュベートした(図3A)。Cy5標識プライマーを導入する前に1時間インキュベートしたFAM標識プライマーを用いて、第2の反応物を37℃で4時間インキュベートした。プライマーを100nMの濃度で使用し、ヘアピンを10nMの濃度で使用した。80℃で20分間のインキュベーションによるポリメラーゼの熱変性によって反応を停止した。また、反応は、ポリメラーゼの熱不活性化又はキレート剤(例えば、EDTA)の導入によって停止してもよい。
プライマー交換反応を互いに連鎖させて、規定の反応経路に従い固定長さの鎖を成長させるPERカスケードを形成することができる。本発明者らがインプリメントした第1のPER経路は、dNTP、ポリメラーゼ、マグネシウム、及びプライマーを含む溶液中の1組の触媒ヘアピン種により媒介される5つの伸長ステップのカスケードであった(図2A(i))。溶液中に存在する全5つのヘアピン及びプライマーを用いて、経路は、5つの伸長ステップを通して進行する(図2A(ii))。ヘアピンAは、ドメインbと一緒にプライマードメインaの延長を触媒する。次に、ヘアピンBが、ドメインcと一緒にドメインbの延長を触媒する。続いて、ヘアピンC~Eが、dと一緒にc、eと一緒にd、fと一緒にeの延長をそれぞれ触媒する。
一実験では、ヘアピン配列を、5ステップのプライマー交換反応につき10塩基をコピーするように設計し(図5)、さらに合計50塩基が付加された。配列付加毎に1つのヘアピンを使用し、プライマー交換反応を用いて、5つの連続的伸長反応の各々における10ヌクレオチドにより、9ヌクレオチドプライマー配列を延長した。反応物を37℃で4時間インキュベートした。この伸長は、2つの相補的アプローチを用いて、増大することができる(図8A~8B)。最初に、反応グラフにおけるステップの数を増加するために、オルトゴナルプライマー配列(例えば、少なくとも30プライマー配列)を設計することができる。また、コピーされる各ヘアピンに対する塩基の数を増加することもできる。各ヘアピンは、次のプライマー配列の前に、任意の配列がコピーされるようにプログラムすることができ、一部の事例では、ポリメラーゼ酵素の処理能力、及び戻し鎖置換プロセスのために増加する時間は、この領域の長さにいくらかの実用的制約を課す。
この実施例では、任意の2D及び3D形状を折り畳むために、長い固定長さの鎖をスカフォールドとして用いる。伝統的なDNA折り紙アプローチの場合、長い鎖をスカフォールドとして用いて、特定の形状に折り畳む。スカフォールド鎖で構造領域を前後に突き通す、ラスター化戦略を使用する(図9A)。この戦略を用いて、スカフォールド鎖は、2D又は3D形状を通過した後、スカフォールド上で局在化しているはずのドメインと相補的なステープル鎖と互いにテザリングする。顕微鏡法で視覚化する上で十分に大きな特徴を有する構造を組織化するために、実施例3で生成した900bpスカフォールドを使用する。約20のステープル鎖(各々42~45塩基対を有する)が使用される。
この実施例では、プライマー交換反応を用いて、分岐構造を組織化する。新たなプライマーの伸長は、それらが構造と結合したときに初めて起こるべきであるため、ヘアピンは、この同時局在化を認識して、コピーを促進すべきである。これは、2つの配列からなるプライミング配列を用いることによって達成することができる(図10A)。2つの個別のプライマー領域(図10Aのa1及びa2)は、それ自体では、ヘアピンと極めて弱く結合するために、プライミング反応を開始する上で十分長く結合することができないようにすべきである。しかし、同時局在化すると、これらのプライマーは、プライマー交換反応で以前使用した8~9塩基対プライマーと同様の動態学を有し、それによって、ヘアピンから自発的に解離するのに十分短く、且つ鎖置換プライミングを好適に開始するには十分長くなるようにすべきである。8~9塩基対は、通常のプライマー交換反応におけるプライマー長さについては十分であったことから、4~6塩基対のa1及びa2プライマー領域を使用した。
プライマー交換反応適用の多用途性の証明として、本発明者らは、発癌性miR-19aシグナルを検出した後、独立したRNA転写物を切断するようにプログラムされた機能性DNAザイムを合成するナノデバイスをインプリメントした(図26A)。標的検出のために、本発明者らは、発癌性microRNAであるmiR-19a及びmiR-19bの共有3’領域に結合するヘアピンを設計した。検出に応答して、PER経路は、Twist遺伝子の完全長mRNAを切断して、DNAザイム(DZ-TWT)を合成するが、これは、アポトーシスをインビボで促進することが判明している。
ナノデバイスを用いて、本発明者らは、任意のインプット配列に応答して、任意の生物学的に関連するDNA配列を合成することができる。1つの配列を別の配列に変換するPER経路のプログラム可能性は、環境応答性の合成システム用の強力なモジュラーフレームワークを提供するが、本発明者らは、いくつかの追加適用を用いて、これをさらに詳しく調べた。本発明者らは、反復配列ドメインの長い鎖を合成する単一ヘアピンシステム(合成テロメラーゼと呼ぶ)をインプリメントすることにより開始し、次に、この構築物を、無標識バイオセンサーのためのシグナル増幅の1形態として使用し、これは、特定のmiRNAインプットを検出すると、蛍光コンカテマーを成長させる(図27C)。
論理式評価による標的配列のシグナル処理は、複雑な動的分子行動をプログラムするための有益なフレームワークとして生まれた。以下に、本発明者らは、単純に、標的鎖の存在の有無に基づいてどのプライマー配列が付加されるかをプログラムすることにより、任意の配列についてAND、OR、及びNOT論理をインプリメントするために、どのようにしてPERを用いることができるかを示す。基本的な戦略は、RNA標的をゲーテッドヘアピンと平衡させて、プライマーを導入し、インキュベーション後のゲル上の長さによる結果を読み出すことである(図28A)。
前述のシステムを用いて、本発明者らは、アウトプット配列は、インプット配列から完全に独立となり得るため、PERが、いかにして、環境応答性動作をインプリメントするためのモジュールフレームワークを提供するかを示した。PERのプログラム可能性、及び分子シグナル処理でのその適用をさらに明らかにするために、本発明者らは、2つのRNA標的が、動的に合成された転写物の証拠となる、順序をコードすることができる時間的記録システムを作出した(図29A)。
PERは、独立の核酸配列の読み取り及び書き込みを組み合わせる新規の方法を提供することから、これをインビボでインプリメントすれば、細胞内で高度にプログラム可能な遺伝子調節及び記録プラットホームが可能になる。PERカスケードは、標準的な細胞インキュベーション温度である37℃で動作するように既に設計されているが、異なる温度でPERが動作することができるように、プライマー長さを調節することもできる。反応は、生体サンプルと適合性である2mM~22mMまでの広範なマグネシウム濃度で確認されている。
PER多重化能力を最大にするために、大きなセットの作動性シグナル検出モジュールを、DNA及びmRNAなどの多様な一本鎖核酸、二本鎖DNA、及び小分子及びタンパク質について編集する(図12A~12F)。例えば、ヘアピンのプライマー結合領域は、同族シグナル(例えば、カルシウムイオン濃度)が、プロテクター鎖又は架橋剤のいずれかと一緒に、溶液中に存在するときだけ露出される。各ヘアピンが、プライマー鎖の状態間の遷移を決定することから、必要なシグナルが存在しないとき、ヘアピンを阻害すれば、プライマーは、その現状態で有効に停止される。一本鎖DNA及びRNAを検出するために、修飾されたトーホールド交換反応58,59を使用するが、その場合、プロテクター鎖(例えば、図12Aでは、配列×2’×1’)は、漏出の可能性を低減するために、ヘアピン濃度に対して過剰濃度で存在する。二本鎖DNAの検出は、非対称PCR法を用いて、同族トーホールド対をデュプレックスの末端に結合させることにより実施する。この方法はさらに拡大され、アプタマー配列を用いて、シグナルが存在しないときだけ、ヘアピンのプライマー結合領域を塞ぐことにより、タンパク質及び小分子を検出する。最後に、UV照射は、CNVK架橋剤の使用によって検出する57。これらのシグナル検出メカニズムは全て、可逆的であり、これは、シグナルが動作しているだろう溶液からシグナルが無期限に隔離されないことと、シグナル濃度の変化が、ヘアピン結合部位露出の変化により表されることとの両方を意味する。
この実施例で説明する遅延回路は、特定の時間にわたって起こるようにプログラムされる、シグナル検出事象と駆動の間の連続的伸長ステップのセットを含む(図14A~14C)。作動の前に、プライマーにいくつかの反応状態を通過させることによって、時間遅延を生成し、反応の数又はヘアピンの濃度のいずれか、従って反応の速度を変化させることにより調整する。このモジュール性は、広範な時間遅延後に駆動を可能にする(例えば、分から日までの時間尺度で駆動する)。
プライマー交換反応は、例えば、2つの分子の1つが感知された場合(OR論理)のみ、又は両方が感知された場合(AND論理)にのみ、アウトプットを放出することによって、様々なセットのシグナルに応答して駆動させるモジュールフレームワークを提供する(図16A~16I)。これらはまた、一部の事例では、プログラムされた遅延後に、インプットが検出されていない場合、シグナルが存在しないか(NOT論理)否かを検出するようにもプログラムされている。これらのゲートは、互いに連結されて、大きなセットの環境シグナル上で論理を実施し、前述した方法で駆動する(図17A~17C)。これらのデジタル論理回路は、様々な時点で検出される異なるセットのシグナルに応答性であり、転写及び翻訳ネットワークと相互作用する精巧なシグナル処理システムの基礎を提供する。
実施例6~8で作製したシグナル検出モジュールと、実施例3~5で作製したトリガーされる構造合成とを組み合わせることにより、環境シグナルに基づく形状形成の差別化を操作することが可能である(図19A~19C)。各シグナル検出器モジュールは、そのプライマー結合領域が、同族シグナルの存在下でしか露出されない単一ヘアピンを必要とする。差別化樹形図の終端状態は、構造形成のトリガーとして役立つ。
PERカスケードの動的合成反応を用いて、分子シグナル情報を経時的に記録することができる。この1つの有力な例は、分子ティッカーテープシステムであり、これは、シグナル依存的合成を連続的PERテロメア化反応と組み合わせることにより、特定のシグナルが溶液中に存在する場合についての情報を記録する(図20A~20D)。まず、1シグナル追跡システムをインプリメントし、これを用いて、2時間にわたる単一シグナルの速度論を解明することができる。実験及びその結果の説明を以下に記載する。
記録.3つの記録実験を実施した。実験Aでは、2時間のインキュベーション時間を通してシグナルを導入しなかった。これは、適正なクロック反応が起こったことを確認するための対照実験の役割を果たす。実験Bは、2時間のインキュベーションを通して、500pMの一定シグナルヘアピン濃度を用いた。クロック速度に対する相対シグナルを用いて、濃度曲線を較正することができたため、上記の反応を最後の実験の当てはめのための基準として用いた。実験Cは、シグナルなしで1時間実施した後、200pMのシグナルを途中で導入し、濃度曲線aステップ関数を作成した。
構文解析した2進配列を用いて、濃度曲線を当てはめたが、この最適化の結果は、図23A~23Bで見ることができる。
クローラの基本的作動を試験するための1D走路は、構造的に明確な硬質DNAナノ構造上に構築される。単純なDNA折り紙長方形、又はDNAレンガシステムを使用する52,53。下記のパラメータを変更する:(1)インキュベーション時間、(2)プライマー、ポリメラーゼ、及びヌクレオチドモノマーの濃度、(3)様々なドメイン(プライマー、情報コード部位など)の結合強度、(4)走路上で隣接する部位同士の空間的間隔、並びに(5)放出条件。反応のほぼ完了を可能にする1~2時間の時間尺度を使用する。反応の速度論をより良く理解するために、秒から分を含むインキュベーション時間の様々な変化も試験する。100nMのプライマー濃度及び10~100nMのdNTP濃度を試験する。ドメインの長さ及びGC含量を変化させることにより、並びに必要であれば、反応平衡を偏らせるためのバルジなどの追加的補助成分を導入することによって、様々なドメインの結合強さを変更する。異なる空間的間隔を有する走路は、走路アンカーポイント間の様々な距離を有するナノ構造を組織化することによって作製する。初めに、単純な2部位走路を試験して、基本的な距離依存的性能を特性決定する。また、例えば、インキュベーションの終了時に「リバースプライマー」を手動で付加する、最終走路部位の横に放出シグナル部位を埋め込む、又は熱媒介性解離など、前述したような様々な放出戦略も試験する。
この実施例は、次の特性を実証する:(1)2D空間におけるクローラの運動の周角、(2)クローラが動き回って、従うべき経路を「選択」する能力、(3)クローラが、2D走路に関する情報を集団で収集する能力。
分子モータは、所与の走路を動き回り、走路部位からの情報をコピーして、「記録」することができる。この能力について一般的に、各部位が、余剰のプライマーで標識された(全ての部位が同じプライマーを有する)未知の走路が想定される。生成された記録の長さから、分子によって採用される走路サイズ及びステップの数に関する量的情報が得られる。
分子モータは、走路からの情報をコピーして、記録するため、走路部位がユニークなDNA配列などのユニークな情報を含有していたら、クローラにより生成された記録は、各部位のアイデンティティ情報を含有するであろう。従って、量的情報以外に、ユニークなアイデンティティ情報も取得することができる(図33D)。
分子モータの特性:(1)所与の分子標的のアイデンティティ情報の記録及び(2)複数種の経路を介し、同じ標的に沿った反復記録によって、モータは、標的の地形を調べ、記録することが可能になる。複数のクローラの作用により収集された集合的情報を用いて、標的部位の幾何学的配置を分析し、及び分子地形を再構築する。
この実施例に記載する分子記録実験では、4つの異なる長さ(ロッド38、ロッド49、ロッド59、ロッド70のDNAロッド(10nM)と負の対照とを使用した。実験の結果を図38Aに示す。数(例えば、ロッド38)は、塩基対内の二本鎖領域の長さを示す。DNAロッドは、独立に、1×ThermoPolバッファー(3mM Mg2+)中の前駆体(100nM)、触媒ヘアピン(1μM)、dATP(10μM)、dTTP(10μM)及びBst、ラージフラグメントDNAポリメラーゼ(0.26U/μL)と一緒に37℃で4時間インキュベートした。反応の産物を65℃の15%PAGEゲル(0.5×TBE、8M尿素)上に泳動させ、Typhoonゲルスキャナーで視覚化した。結果は、生成された記録が、測定された距離と一致することを示している。一部のゲルバンドは、それらの対応するDNA記録で標識する。
DNAナノ構造を用いて、既知の固定距離で、DNA標的を正確に配置し(図35A)、実験により、分子定規がこれらの距離を記録することができることを明らかにする。
DNAナノ構造上の正八角形の頂点に8つのバーコード化DNA標的を正確に配置することによって、核孔複合体(NPC)の構造模倣物を生成する(図35B)。次に、分子定規を用いて、距離を記録する。次世代シーケンス技術を用いて、距離と、対応する符号化バーコードとを読み出す。次に、分子定規を用いて、典型的な生物学的実験のインサイチュ条件と一致させるためのNPC模倣物の低いコピー数(104~106)を記録する。
固定U2OS細胞(ヒト骨の骨肉腫細胞)中のヌクレオポリンNup98をカスタムDNA共役モノクローナル抗体(#2598、Cell Signaling)で標識する。超解像試験によって、この標識が、八角形構成中に8つのクラスターをもたらし、隣接するクラスター同士の距離は約30nmであることが判明した。分子定規を用い、4nm未満の解像度で、クラスター同士の距離を記録する。ゲル電気泳動読み出しデータは、予測した4つの異なる斜距離及びそれらの分散を明らかにする。NGS読み出しデータは、NPCの不均質性の研究を可能にする単一分子距離を明らかにする。
DNA合成及び精製.オリゴは全て、未精製又はHPLC精製のいずれもIDTに注文した。精製RNA分子は、無RNaseHPLCで精製したものを注文した。一部の未精製オリゴは、キットの指示に従って、Qiagen MinElute PCR精製カラムに100μLの100μM未精製オリゴを通過させることにより実験室内で精製した後、洗浄した。カラムに結合したオリゴを15μLまで溶離し、濃度をNanodrop及びそれらのオリゴアナライザー(www.idtdna.com/site/order/oligoentry)消散係数を用いて測定した。オリゴは、1×TEバッファー中に予め懸濁したものを100μM注文し、これらの濃度は、MinElute精製オリゴを除き、全ての希釈物について想定した。全てのオリゴは、1×TEで10μMの使用濃度まで希釈し、DNAのストック及び使用溶液は、-20℃で、RNAは、-80℃で保存した。
分子モータシステムの1つ、クローラについての一連の試験を実施して、基本的な操作を確認した(図43A~43C)。DNAナノ構造プラットホーム上の三角形アラインメントに沿った3点走路を設計した。図43Aの上のパネルは、この設計の概略図を示し、図43Aの下のパネルは、3つの標的部位にわたりクローリングした後のクローラの分子詳細を示す。クローリングプロセスの完了後、クローラは、長さ118ntの完全な記録となる。PCRにより増幅され、変性ゲル上を泳動するとき、最終記録は、予測された長さ範囲で出現した(図43B)。さらに、原子間力顕微鏡法(AFM)を用いて、クローラを視覚化した。図43Cの左側パネルは、クローリング反応を開始するプライマーが添加される前の標的プローブを示し、ここで、プローブは点として現れる。約1時間の記録反応後に、クローラは、図43Cの右側パネルに示すように、3つの走路部位を一緒に連結し、従って、これに応じてAFMイメージに出現する。これらの試験の結果は、各ステップ:(1)プライマー結合、(2)ポリメラーゼによるプライマー延長、(3)テンプレートによる鎖置換、(4)隣接する部位との相互作用、(5)ポリメラーゼによるさらなる延長、(6)記録の自律的放出についてクローラシステムの基本的操作を明らかにする。
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Claims (24)
- プライマー交換反応方法であって、
(a)第1触媒ヘアピン分子であって、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記第1触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記第1触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)結合ドメインを含む第1触媒ヘアピン分子、
(b)第2触媒ヘアピン分子であって、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記第2触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記第2触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含み、前記第2触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインが、前記第1触媒ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である、第2触媒ヘアピン分子、
(c)前記第1触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的なプライマー、
(d)鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
(e)デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)
を反応バッファー中で合わせることより、反応混合物を形成した後;
一本鎖核酸を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングをもたらす条件下で前記反応混合物をインキュベートすること
を含む、方法。 - 第1触媒ヘアピン分子の結合ドメインがループドメイン又は安定した対ドメインである、請求項1に記載の方法。
- 安定した対ドメインが少なくとも10ヌクレオチドの長さを有する、請求項2に記載の方法。
- 前記第2触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメイン内に位置するヌクレオチドと相補的である第2プライマーを更に含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- (f)第3触媒ヘアピン分子であって、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記第3触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記第3触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含み、前記第3触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインが、前記第2触媒ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である、第3触媒ヘアピン分子を更に含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第3触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメイン内に位置するヌクレオチドとヌクレオチドを含む第3プライマーを更に含む、請求項5に記載の方法。
- 複数の触媒ヘアピン分子をさらに含み、前記複数のうちの各触媒ヘアピン分子が、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記複数のうち1つの触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと、前記複数のうち1つの触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含み、ここで、前記複数のうちの各触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインが、前記複数のうち1つの他の触媒ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である、請求項5又は6に記載の方法。
- 複数のプライマーをさらに含み、各プライマーは、前記複数のうち1つの触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的である、請求項7に記載の方法。
- 一本鎖核酸を生成する方法であって、
(a)第1触媒ヘアピン分子であって、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記第1触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記第1触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子間ヌクレオチド塩基対により形成される、対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む第1触媒ヘアピン分子、
(b)複数の異なる触媒ヘアピン分子であって、前記複数のうちの各触媒ヘアピン分子が、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記複数のうち1つの触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記複数のうち1つの触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含み、前記複数のうちの各触媒ヘアピン分子の前記不対3’トーホールドドメインが、前記複数のうち1つの他の触媒ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である、複数の異なる触媒ヘアピン分子、
(c)前記第1触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的な第1プライマー、
(d)鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
(e)デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)
を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成した後;
前記第1プライマーよりも長い一本鎖核酸を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングをもたらす条件下で前記反応混合物をインキュベートすることを含む方法。 - ポリメラーゼが、phi29 DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ又はBsu DNAポリメラーゼである、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 生成された一本鎖核酸が、自己相補性のドメインを含み、そして前記方法が、核酸ステープル鎖の存在下で、一本鎖核酸及び核酸ステープル鎖のドメイン同士のヌクレオチド塩基対によって、一本鎖核酸の折り畳みが達成される条件下で、前記反応混合物をインキュベートすることをさらに含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、核酸ステープル鎖の存在下で、前記一本鎖核酸及び前記核酸ステープル鎖のドメイン同士のヌクレオチド塩基対によって前記一本鎖核酸の折り畳みが達成される条件下で、前記反応混合物をインキュベートすることをさらに含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 鎖置換反応により一本鎖核酸を生成するためのキットであって、
(a)第1触媒ヘアピン分子であって、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記第1触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記第1触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)結合ドメインを含む第1触媒ヘアピン分子;
(b)第2触媒ヘアピン分子であって、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記第2触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記第2触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含み、前記第2触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインが、前記第1触媒ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である、第2触媒ヘアピン分子;
(c)第1触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的であるプライマー;
(d)鎖置換活性を有するポリメラーゼ;並びに
(e)デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)、
を含む、キット。 - (a)の前記結合ドメインが、ループドメインである、請求項13に記載のキット。
- 前記第2触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメイン内に位置するヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含む第2プライマーをさらに含む、請求項13又は14に記載のキット。
- (e)第3触媒ヘアピン分子であって、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記第3触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記第3触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインをさらに含み、前記第3触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインは、前記第2触媒ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である、請求項15に記載のキット。
- 前記第3触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的な第3プライマーをさらに含む、請求項16に記載のキット。
- 複数の触媒ヘアピン分子をさらに含み、前記複数のうちの各触媒ヘアピン分子は、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記複数のうち1つの触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと、前記複数のうち1つの触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含み、ここで、前記複数のうちの各触媒ヘアピン分子の前記不対3’トーホールドドメインが、前記複数のうち1つの他の触媒ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である、請求項16に記載のキット。
- 複数のプライマーをさらに含み、各プライマーは、前記複数のうち1つの触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的である、請求項18に記載のキット。
- 前記プライマーが、検出可能な分子と連結される、請求項13~19のいずれか一項に記載のキット。
- 請求項13~20のいずれか一項に記載のキットを含む細胞。
- 標的分子を検出する方法であって、
標的分子、鎖置換ポリメラーゼ、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)を含有する反応バッファー中で、
(a)触媒ヘアピン分子であって、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)結合ドメインを含み、(a)(i)及び(a)(ii)の前記ドメインが、タンデム反復配列を形成する、触媒ヘアピン分子;
(b)少なくとも1つの他の触媒ヘアピン分子であって、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記少なくとも1つの他の触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記少なくとも1つの他の触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)結合ドメインを含み、(b)(i)及び(b)(ii)の前記ドメインは、シグナル配列により分断されるタンデム反復配列を形成し、(b)(i)の前記不対3’トーホールドドメインは、前記標的分子と結合することができるプロテクター鎖と可逆的に結合している、少なくとも1つの他の触媒ヘアピン分子、並びに
(c)(a)の前記触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的で、且つ(b)の前記少なくとも1つの他の触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的であるドメインを含む核酸プライマー
を合わせることにより、反応混合物を形成し;
前記核酸プライマーよりも長く、且つ前記シグナル配列の少なくとも1つを含む一本鎖核酸を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で、前記反応混合物をインキュベートすることを含む方法。 - 分子事象間の時間を計測する方法であって、
(a)第1触媒ヘアピン分子であって、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記第1触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記第1触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含む第1触媒ヘアピン分子、
(b)複数の異なる触媒ヘアピン分子であって、前記複数のうちの各触媒ヘアピン分子が、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記複数のうちの触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含み、各触媒ヘアピン分子の前記不対3’トーホールドドメインが、前記複数のうち1つの他の触媒ヘアピン分子の前記5’サブドメインと相補的である、複数の異なる触媒ヘアピン分子、
(c)前記第1触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的な第1プライマー、
(d)鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
(e)デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成し;
第1分子事象に前記反応混合物を曝露し;
一本鎖核酸を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で前記反応混合物をインキュベートした後;
第2分子事象に前記反応混合物を曝露し、
生成される前記一本鎖核酸の長さに基づいて、前記第1分子事象と前記第2分子事象との間の時間間隔を決定することを含む方法。 - 標的生体分子間の距離を記録する方法であって、
(a)第1触媒ヘアピン分子であって、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記第1触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記第1触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含み、前記第1触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインは、第1の標的生体分子と連結している、第1触媒ヘアピン分子;
(b)第2触媒ヘアピン分子であって、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記第2触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記第2触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含み、前記第2触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインが、第2の標的生体分子と連結しており、前記第1触媒ヘアピン分子の5’サブドメインが、前記第2触媒ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である、第2触媒ヘアピン分子;
(c)一方が、前記第1触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的であり、他方が、前記第2触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインと相補的である、2つのプライマー;
(d)複数の触媒ヘアピン分子であって、前記複数のうちの各触媒ヘアピン分子が、(i)不対3’トーホールドドメイン、(ii)前記触媒ヘアピン分子の3’サブドメインと前記触媒ヘアピン分子の5’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメインであって、重合を終結させる分子又は修飾を含む対ステムドメイン、及び(iii)ループドメインを含み、前記複数の触媒ヘアピン分子各々の5’サブドメインが、前記複数のうち1つの他の触媒ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的であり、前記複数の触媒ヘアピン分子の1つの不対3’トーホールドドメインが、前記第1触媒ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的であり、前記複数のうち別の触媒ヘアピン分子の不対3’トーホールドドメインは、前記第2触媒ヘアピン分子の5’サブドメインと相補的である、複数の触媒ヘアピン分子;
(e)鎖置換活性を有するポリメラーゼ;並びに
(f)デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)、
を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成した後;
二本鎖核酸を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で前記反応混合物をインキュベートすることを含む方法。
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