ES2254306T3 - Amplificacion usando cebadores modificados. - Google Patents

Amplificacion usando cebadores modificados.

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ES2254306T3 ES01125022T ES01125022T ES2254306T3 ES 2254306 T3 ES2254306 T3 ES 2254306T3 ES 01125022 T ES01125022 T ES 01125022T ES 01125022 T ES01125022 T ES 01125022T ES 2254306 T3 ES2254306 T3 ES 2254306T3
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Abstract

Un equipo para llevar a cabo la reacción de amplificación de ácidos nucleicos, en el que dicho equipo comprende un par de cebadores, en el que al menos un cebadores de dicho par, contiene un nucleótido modificado dentro de las 3 posiciones de nucleótidos terminales 3¿; en el que dicho nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en 2¿-O-Metil-nucleótidos, 2¿-fluoro- nucleótidos, 2¿-amino-nucleótidos y nucleótidos de arabinosa.

Description

Amplificación usando cebadores modificados.
Antecedentes de la invención Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de la biología molecular y la química de los ácidos nucleicos. En particular se refiere a métodos y reactivos para mejorar las reacciones de amplificación de los ácidos nucleicos. La invención, no obstante, tiene aplicaciones en cualquier campo donde la amplificación de los ácidos nucleicos sea utilizada.
Descripción de la invención
La invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) hace posible la amplificación in vitro de las secuencias de ácidos nucleicos. La PCR se ha descrito en las Patentes Estadounidenses Números 4,683,195; 4,683,202; y 4,965,188; Saiki et al., 1985, Science 230:1350-1354; Mullis et al., 1986, Cold Springs Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273; y Mullis y Faloona, 1987 Methods Enzymol. 155:355-350. Se ha descrito extensivamente en la bibliografía el desarrollo y la aplicación de la PCR. Por ejemplo, una gama de temas relacionados con PCR son discutidos en Tecnología de PCR-principios y aplicaciones para la amplificación del DNA, 1989, (ED H.A.Erlich) Stockton Press, New York; Protocolos de PCR: Una guía de métodos y aplicaciones, 1990, (ed. M. A. Innis et al.) Academic Press, San Diego; y Estrategias de PCR, 1995,(ed.M.A. Innis et al.) Academic Press, San Diego. Los proveedores comerciales como Applied Biosystems (Foster City, CA), suministran reactivos de PCR y publica protocolos de PCR.
Desde la publicación original de la amplificación de los ácidos nucleicos, se han descrito varios métodos de amplificación de éstos, basados en cebadores, incluyendo, pero no limitándose, al ensayo de desplazamiento de cadenas (Walter et al.,1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, Walter et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20:1961-1696, y Patente Estadounidense Número 5,455,166) y los sistemas de amplificación basados en la transcripción, incluyendo los métodos descritos en las Patentes Estadounidenses Números 5,437,990; 5,409,818; y 5,399,491; el sistema de amplificación por transcripción (TAS) (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177); y la secuencia de replicación auto-sostenida (3SR) (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87; 1874-1878 y WO 92/08800). En Abramson y Myers, 1993, Current opinion in Biotechnology 4:41-47, se proporciona un sondeo acerca de los sistemas de amplificación.
La especificidad de las reacciones de amplificación basadas en cebadores dependen, en gran parte, de la especificidad de la hibridación y extensión del cebador. Bajo el uso de temperaturas elevadas utilizadas en las amplificaciones típicas, los cebadores hibridan solamente a la secuencia diana. Sin embargo, las mezclas de reacciones de amplificación se unen a temperatura ambiente, ya que por debajo de dicha temperatura, se necesita asegurar la especificidad de la hibridación del cebador. Bajo tales condiciones menos estrictas, los cebadores se unen de forma no específica, a otras secuencias de ácidos nucleicos o a otros cebadores que son sólo parcialmente complementarios, iniciando la síntesis de productos de extensión no deseados, los cuales pueden ser amplificados a través de la secuencia diana. La amplificación no específica de productos de extensión a los cebadores, puede competir con la amplificación de la secuencia deseada; pudiendo disminuir la eficiencia de la amplificación de dicha secuencia.
Frecuentemente, se observa un tipo de amplificación no específica, que es un artefacto independiente de la muestra de reacciones de amplificación denominadas "dímero de cebadores". Un dímero de cebador es un fragmento de doble cadena cuya longitud típica se acerca a la suma de longitudes de los dos cebadores y aparece cuando el cebador se extiende encima del otro cebador. El producto de extensión resultante forma una plantilla no deseada, la cual, debido a su corta longitud, se amplifica eficientemente.
La amplificación no específica se puede disminuir, reduciendo la formación de productos de extensión del cebador, antes del inicio de la reacción. En un método, referido como protocolo "hot Start", uno o más reactivos críticos se mantienen fuera de la mezcla de reacción hasta que la temperatura se aumenta lo suficiente como para proporcionar la especificidad necesaria de la hibridación. Los métodos manuales hot-start, en los cuales los tubos de reacción están abiertos después del paso de incubación a altas temperaturas y los reactivos que faltan son adicionados, son trabajos duros y aumentan el riesgo de contaminación de la mezcla de reacción. Alternativamente, se puede utilizar un material sensible al calor como la cera, para separar o secuestrar los componentes de la reacción como se describe en la Patente Estadounidense Número 5,411,876, y Chou et al., 1992, Nucl. Acids. Res. 20(7):1717-1723. En estos métodos, la incubación con altas temperaturas funde el material sensible al calor, permitiendo así, la mezcla de los reactivos.
Otro método de reducción de la formación de productos de extensión de cebadores anteriores al comienzo de la reacción depende de la inactivación reversible de la polimerasa de DNA. Las Patentes Estadounidenses Números. 5,773,258 y 5,677,152 describen la reversibilidad de la polimerasa de DNA modificada por el acoplamiento covalente de un grupo modificador. La incubación de la polimerasa de DNA inactiva a altas temperaturas resulta en la escisión del enlace modificador-enzima, reactivando así el enzima.
La inhibición reversible no covalente de la polimerasa de DNA por anticuerpos específicos, contra la polimerasa de DNA, se ha descrito en la Patente Estadounidense Núm. 5,338,671.
Usando los métodos que se describen en la Patente Estadounidense Núm. 5,148,149, la amplificación no específica también puede reducirse por la degradación enzimática de los productos de extensión formados antes del inicio de la reacción. La degradación de los productos de extensión recién sintetizados se logra incorporando en la mezcla de reacción dUTP y UNG, e incubando la mezcla de reacción a 45-60ºC antes de llevar a cabo la reacción de amplificación. La extensión de los cebadores resulta en la formación de DNA que contiene uracilo, el cual se degrada con UNG bajo las condiciones de pre-amplificación. Una desventaja de este método es que la degradación de los productos de extensión compite con la formación de productos de extensión y la eliminación de productos de extensión no específicos puede ser menos completo. Por otra parte, una ventaja de este método es que el DNA que contiene uracilo, introducido en la mezcla de reacción como un contaminador de una reacción previa, es también degradado, y de esta manera, se reduce el problema de contaminación de una PCR mediante la amplificación de los ácidos nucleicos que provienen de reacciones anteriores.
Otro método de reducción de la formación de productos de extensión, antes del inicio de la reacción, se basa en el uso de cebadores modificados, cercanos o en la misma posición 3', formados por la adición de una amina exocíclica. Dicho método se describe en la Patente Estadounidense Núm. 6,001,611.
En la bibliografía se han descrito ampliamente las técnicas convencionales de la biología molecular y la química de los ácidos nucleicos que son conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor,.New York; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins. eds.,1984); PCR Technology-principles and applications for DNA amplification, 1989,(ed. H.A. Erlich) Stockton Press, New York; PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, (ed. M.A. Innis et al.) Academic Press, San Diego; y PCR Strategies, 1995, (ed. A. Innis et al.) Academic Press, San Diego.
Los oligonucleótidos que contienen 2'-O-metil nucleótidos, 2'-fluoro nucleótidos, 2'-amino nucleótidos y nucleótidos de arabinosa, son conocidos en la materia. En WO 98/02582 se ha descrito el uso de 2'-metil nucleótidos en oligonucleótidos para aumentar la estabilidad de la unión de estos oligonucleótidos cuando se hibridan a la secuencia diana. Cummins et al (Nucleic Acids Research 23:2019-2024), Aurup et al (Nucleic Acids Research 22: 20-24) y Wilds et al (Nucleic Acids Research 28: 3625-3635) describen oligonucleótidos que contienen 2'-fluoro-nucleótidos, 2-amino-nucleótidos y nucleótidos de arabinosa que aumentan la estabilidad de la hibridación y la estabilidad de la nucleasa de las sondas de hibridación antisentido.
Resumen de la invención
La presente invención aporta métodos y reactivos para la amplificación in vitro de una secuencia de ácidos nucleicos, utilizando cebadores que proporcionan una solución simple y económica a la problemática de la amplificación no específica. Los métodos incluyen el uso de cebadores oligonucleótidos que contienen modificaciones particulares cerca o en el extremo 3', del azúcar-fosfato.
En una realización, los métodos implican el uso de un cebador modificad, que consiste básicamente, en que un nucleótido de los tres nucleótidos del extremo 3' es un nucleótido modificado seleccionado del grupo que consiste en 2'-fluoro-nucleótidos, 2-amino-nucleótidos y 2'-O-metil-nucleótidos.
En otra realización, los métodos incluyen en el uso de cebadores modificados que consisten, básicamente, en un nucleótido modificado que contiene arabinosa.
Un aspecto de la invención se refiere a unos equipos utilizados para la amplificación in vitro de una secuencia de ácidos nucleicos usando una reacción de amplificación basada en cebadores. Estos equipos comprenden al menos un cebador modificado, preferiblemente dos, para cada diana. Un equipo normalmente comprenderá uno o más reactivos de amplificación, por ejemplo una polimerasa de ácido nucleico, nucleósidos trifosfato o tampones adecuados. Opcionalmente, un equipo puede comprender componentes de adición, como los utilizados para detectar los productos amplificados.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para la amplificación de ácidos nucleicos que comprende llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos basada en cebadores, usando al menos un cebador modificado. De este modo, la presente invención proporciona un método para la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos que comprende:
(a) proporcionar una mezcla de reacción de amplificación que contiene una secuencia de ácidos nucleicos y un par de cebadores, donde uno o ambos cebadores, son cebadores modificados; y
(b) el tratamiento de la mezcla de reacción del paso (a) bajo condiciones adecuadas para llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos.
Un una realización preferida de la invención, la reacción de amplificación es una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la que, finalmente, uno, o preferiblemente, todos los cebadores están modificados.
\newpage
Otro aspecto de la invención describe las mezclas de la reacción de amplificación, que contienen al menos un cebador modificado. En una realización preferida, la mezcla de reacción de amplificación, contiene un par de cebadores de oligonucleótidos modificados que permiten llevar a cabo una PCR.
Descripción detallada de la invención
Para una correcta comprensión de la invención se definen una serie de términos a continuación.
Los términos referentes a "ácido nucleico" y "oligonucleótido" definen desde polidesoxiribonucleótidos (contienen 2-desoxi-D-ribosa) a poliribonucleótidos (contienen D-ribosa), y a cualquier tipo de polinucleótido que sea un N glicósido de una base purínica o pirimidínica. No se pretende diferenciar por su longitud con los términos de "ácido nucleico" y "oligonucleótido"; por lo tanto se utilizaran indistintamente. Estos términos únicamente se refieren a la estructura primaria de la molécula. Así pues, estos términos incluyen una cadena doble o simple de DNA y RNA. Para la presente invención la utilización del término oligonucleótido comprende también análogos de nucleótidos no-pirimidínicos y no-purínicos.
Los oligonucleótidos pueden prepararse a través de cualquier método adecuado, incluyendo la síntesis química directa mediante el método fosfotriéster de Narang et al, 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99; el método fosfodiéster de Brown et al, 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151; el método de la dietilfosforamidita descrito por Baucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 y el método de soporte sólido de la Patente Estadounidense Núm. 4,458,066. En Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1 (3): 165-187, se detalla una revisión de los conjugados de oligonucleótidos y nucleótidos modificados.
El término "cebador" se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de DNA bajo condiciones, en que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador, complementario a una cadena de ácidos nucleicos; por ejemplo, en presencia de cualquiera de los 4 trifosfatos diferentes y un agente para la extensión (por ejemplo, una polimerasa de DNA o una transcriptasa reversa) en unas condiciones de temperatura y con un cebador adecuados. Un cebador es, preferiblemente, una cadena sencilla de DNA. La longitud apropiada de un cebador depende del uso que se le quiera dar a dicho cebador, pero normalmente los rangos van de 10 a 50 nucleótidos, aunque preferiblemente de 15 a 35. Las moléculas de cebador cortas, generalmente requieren temperaturas inferiores para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no necesita reflejar exactamente la secuencia del ácido nucleico molde, pero tiene que ser lo suficientemente complementaria como para hibridar con el molde. El diseño apropiado de cebadores para la amplificación de una secuencia diana determinada es conocida y descrita en la bibliografía, como por ejemplo, la citada anteriormente.
Los cebadores pueden incorporar características adicionales que permiten la detección o la inmovilización del cebador pero sin alterar sus propiedades básicas, como la actuación de punto de partida en la síntesis de DNA. Por ejemplo, los cebadores pueden contener una secuencia adicional de ácidos nucleicos en la posición terminal 5', en la que no hibridan los ácidos nucleicos, pero que facilita la clonación del producto amplificado. La región del cebador que es suficientemente complementaria para la hibridación es conocida en esta invención como región hibri-
dante.
En esta invención el término "cebador modificado" se refiere a un cebador que incluye al menos un nucleótido que contiene un azúcar diferente de la 2'-desoxi-D-ribosa o D-ribosa convencional hallada en los DNA y RNA naturales. De modo similar, tal como se usa aquí, un "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que contiene un azúcar diferente de la 2'-desoxi-D-ribosa o D-ribosa convencional hallada en los DNA y RNA naturales, y abarca otros nucleótidos en que el azúcar está modificado por una adición o sustitución del grupo lateral, o en que el azúcar es un estereoisómero de la 2'-desoxi-D-ribosa o D-ribosa convencional hallada en los DNA o RNA naturales, o ambos. Los términos no se utilizan para indicar que un cebador o nucleótido modificado es el producto de un proceso de modificación, sino que sirven para indicar la presencia de diferencias en la secuencia de oligonucleótidos relacionada con los DNA o RNA naturales. En particular, los cebadores de la presente invención son sintetizados preferiblemente para que contengan un nucleótido modificado, a pesar de que la modificación química de un cebador que inicialmente contenía nucleótidos convencionales puede proporcionar una síntesis alternativa.
Los términos "diana", "secuencia diana", "región diana", y "ácido nucleico diana" se refieren a una región o subsecuencia de un ácido nucleico que va a ser amplificado.
El término de "hibridación" se refiere a la formación de una estructura doble o doblete formada por dos cadenas de ácidos nucleicos sencillas debido al emparejamiento de bases complementarias. La hibridación puede ocurrir entre cadenas de ácidos nucleicos totalmente complementarias o entre cadenas de ácidos nucleicos "sustancialmente complementarias" que contengan pequeñas regiones desemparejadas. Las condiciones bajo las que sólo las cadenas de ácidos nucleicos totalmente complementarias hibridarán son conocidas como "condiciones de hibridación astringentes" o como "condiciones de hibridación específicas de secuencia". Los dobletes de secuencias sustancialmente complementarias estables pueden darse bajo condiciones menos estrictas; el grado de desemparejamiento tolerado puede controlarse ajustando adecuadamente las condiciones de hibridación. Los entendidos en el campo de los ácidos nucleicos pueden determinar la estabilidad de los dobletes de forma empírica, considerando un número de variables incluyendo, por ejemplo, la longitud y la concentración de pares de bases de oligonucleótidos, fuerza iónica, cationes metálicos y la incidencia de pares de bases desemparejadas, siguiendo la guía proporcionada en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; y Wetmur, 1991, Critical Review in Biochem. And Mol. Biol. 26(3/4):227-259.
Como viene siendo utilizado en esta invención, un cebador es "específico" para una secuencia diana si, cuando se utiliza en una reacción de amplificación bajo condiciones suficientemente astringentes, el cebador puede extenderse sólo si ha hibridado con el ácido nucleico diana. Normalmente, un cebador es específico para una secuencia diana si la estabilidad del doblete diana-cebador, en particular en la región terminal 3' del cebador, es mayor que la estabilidad de un doblete formado entre el cebador y cualquier otra secuencia encontrada en la muestra. Un experto en la materia reconocerá que varios factores, como la composición de las bases del cebador y la localización de los desemparejamientos, afectarán a la especificidad del cebador, y que en la mayoría de casos, se requieren confirmaciones experimentales rutinarias de la especificidad del cebador. Las condiciones de hibridación bajo las que un cebador específico de diana será extensible sólo si es hibridante con la secuencia diana, pueden determinarse de manera empírica de forma rutinaria. Así, la utilización de cebadores específicos de diana bajo condiciones de amplificación adecuadamente astringentes permite la amplificación específica de aquellas secuencias diana que contienen los sitios de unión de las diana del cebador. La utilización de condiciones de amplificación específicos de secuencia permite la amplificación específica de aquellas secuencias diana que contienen los sitios de unión exactamente complementarios al
cebador.
El término "amplificación no-específica" se refiere a la amplificación de las secuencias de ácidos nucleicos diferentes de la secuencia diana que resulta de la hibridación de cebadores a secuencias diferentes de la secuencia diana y que sirven como sustrato para la extensión de los cebadores. La hibridación de un cebador a una secuencia no diana es referida como "hibridación no específica" y puede darse en las condiciones de preamplificación de temperatura inferior y astringencia reducida. Un experto en la materia entenderá que se formarán aún de forma esporádica, dobletes altamente inestables, aunque estén altamente desfavorecidos en el estado de equilibrio.
El término "dímero de cebador" se utiliza aquí de forma genérica para definir los productos de amplificación no específicos independientes del molde. Se cree que un dímero de cebador es el resultado de las extensiones de un cebador donde otro cebador sirve como molde, aunque la génesis de un dímero de cebador no es muy conocida. El producto de la amplificación resultante normalmente parece corresponder a un concatémero de los dos cebadores, es decir, un dímero, aunque pueden darse concatémeros de más de dos cebadores.
El término "mezcla de reacción" se refiere a una solución que contiene reactivos que son necesarios para llevar a cabo una reacción determinada. Una "mezcla de reacción de amplificación", que se refiere a una solución que contiene reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación, normalmente contiene cebadores de oligonucleótidos y una polimerasa de ácidos nucleicos en un tampón adecuado. Una "mezcla de reacción de PCR" contiene normalmente cebadores oligonucleótidos, una polimerasa de DNA (normalmente una polimerasa de DNA termoestable), dNTP y un catión metálico divalente en un tampón adecuado. Se considera una mezcla de reacción completa si contiene todos los reactivos necesarios para que pueda producirse la reacción, e incompleta si tan solo contiene un pequeño conjunto de los reactivos necesarios. Un experto en la materia entenderá que los componentes de reacción son soluciones que se almacenan de forma separada de forma rutinaria, que cada una de ellas contiene un subconjunto de los componentes, que por razones de conveniencia, estabilidad, o para permitir el ajuste de las concentraciones de los componentes dependiendo del uso que se le va a dar, se combinan para formar una mezcla de reacción antes del inicio de la reacción, para crear una mezcla de reacción completa. Además, un experto en la materia entenderá que los componentes de reacción son comercializados individualmente y que existen unos equipos comerciales muy útiles que contienen los reactivos y que incluyen los cebadores modificados de la invención.
Cebadores modificados
Los cebadores de amplificación modificados de la presente invención, contienen modificaciones concretas en la posición terminal en la estructura del azúcar-fosfato en la en posición 3' o cercana a ella.
En una realización, los cebadores modificados están formados, esencialmente, por un oligonucleótido, en el que al menos uno de sus 3 nucleótidos terminales en posición 3' es un nucleótido modificado seleccionado del grupo formado por 2'-O-metil-nucleótidos, 2-amino-nucleótidos y 2'-fluoro-nucleótidos. En una realización preferida, los cebadores modificados están formados, esencialmente, por un oligonucleótido que al menos uno de sus 3 nucleótidos terminales en la posición 3', es un nucleótido modificado seleccionado del grupo formado por 2'-O-metil-ribonucleótidos, 2-desoxi-2'amino-nucleótidos y 2-desoxi-2'fluoro-nucleótidos. Estas modificaciones representan la adición de una porción en 2'OH o la sustitución de 2'OH por una porción alternativa.
En otra realización, los cebadores modificados están formados, esencialmente, por un oligonucleótido, en el que al menos uno de sus tres nucleótidos terminales en posición 3' es un nucleótido modificado que contiene arabinosa. La arabinosa es un estereoisómero de ribosa que en lo único en que se diferencia de ésta es en la configuración del C-2. Se espera que en las realizaciones, en las cuales la posición 2' de la arabinosa se modifica mediante la adición de una porción al 2'OH o la sustitución del grupo 2'OH con una porción alternativa, sea de utilidad en los métodos de la presente invención. En una realización preferible, los cebadores modificados estarán formados, esencialmente, por un oligonucleótido en el que al menos uno de sus tres nucleótidos terminales en posición 3' es un nucleótido modificado que contiene una arabinosa no modificada.
El diseño y la utilización de los cebadores de amplificación, en general, es bien conocida en el campo. Los cebadores de la presente invención, se distinguen por la inclusión en la secuencia de cebador de nucleótidos modificados especificados. Otros aspectos del cebador, como la longitud y secuencia total, son seleccionados siguiendo la práctica estándar del diseño del cebador.
Un cebador está formado, normalmente, por una única cadena de desoxiribonucleótidos (DNA) y contiene las bases convencionales: dos bases purínicas, adenina y guanina, y dos bases pirimidínicas, citosina y timina. Sin embargo, la presente invención, no se limita a cebadores formados sólo de bases convencionales. Se pueden utilizar bases análogas, por ejemplo, para alterar la estabilidad de hibridación de del doblete diana-cebador. Cualquier base análoga, que se pueda utilizar en un cebador de amplificación no modificado, puede utilizarse en los cebadores de la presente invención. Algunos ejemplos de análogos de base, también llamadas bases no convencionales, incluyen: 3-metiladenina, 7-metilguanina,3-metilguanina 5-metilcitosina y 5-hidroximetil citosina.
Teoría de funcionamiento
Una amplificación basada en un cebador, implica extensiones repetidas de cebador, en las que los cebadores hibridan primero a los ácidos nucleicos diana y posteriormente se prolongan de manera enzimática. La especificidad de la amplificación depende de la especificidad de la hibridación del cebador. Una hipótesis es que la amplificación no específica se da cuando se forma el doblete de hibridación inestable y temporal entre un cebador y una molécula de no diana, posiblemente otro cebador, en el que la terminación 3' del cebador se empareja momentáneamente con una base complementaria en la otra molécula. La extensión de cebador inicial da como resultado la formación de la secuencia complementaria, que estabiliza el doblete y permite extensiones adicionales.
Mientras la teoría no lo obligue, se cree que los cebadores modificados de la presente invención reducen la amplificación no específica mediante el incremento del tiempo que se requiere para que se de la extensión inicial del cebador. Las modificaciones de las estructuras probablemente retrasan la extensión inicial dejando el doblete diana-cebador, un molde menos preferido para la extensión. El retraso en la extensión inicial reduce la probabilidad de que el doblete de hibridación estable y temporal, como entre cebadores bajo condiciones de pre-reacción, exista durante un tiempo suficiente para permitir la extensión del cebador.
En comparación, los dobletes de hibridación cebador-diana son suficientemente estables bajo la condición de la hibridación del cebador utilizada en una amplificación, de tal modo que el tiempo adicional requerido no impide la extensión. De esta manera, bajo este modelo, la modificación no inhibe significativamente la extensión del cebador bajo las condiciones de amplificación, pero disminuye la probabilidad de extensión de los cebadores involucrados en dobletes inestables y temporales formados con las secuencias no dianas bajo condiciones de preamplifica-
ción.
Los 2'-O-metil-ribonucleótidos,2-desoxi-2'amino-nucleótidos y 2'-desoxi-2'fluoro-nucleótidos, relativos a los cebadores oligodeoxinucleótidos habituales, están formados por grupos laterales voluminosos unidos al C-2 del azúcar. Es probable que la parte lateral del grupo interfiriera estéricamente con la unión del enzima al doblete diana-cebador, pero no lo suficiente como para excluir la extensión. Esto sugiere que los grupos laterales adicionales de dimensiones similares tendrán un efecto similar y también se podrían utilizar en los métodos de la invención.
Los nucléotidos que contienen arabinosa, cambiando la orientación de los grupos laterales H y OH unidos al C-2 del azúcar, alteran la interacción con el enzima. Es probable que otros estereoisómeros pudieran inhibir, pero no eliminar, la extensión y estos componentes pudieran útiles en los métodos de la invención.
Síntesis de los cebadores modificados
La síntesis de los cebadores modificados se lleva a cabo utilizando una química estándar bien conocida en el campo, por ejemplo, el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862; y el método del soporte sólido de la Patente Estadounidense núm. 4.458.066.
La reacción de síntesis se lleva a cabo, preferentemente, en un sintetizador automático de DNA disponible a nivel comercial (p. ej.: sintetizador de DNA ABI 374 de Applied Biosystems, Foster City, CA.) utilizando fosforamiditas de nucleótidos disponibles a nivel comercial (p. ej. De Applied Biosystems, Foster City, CA). Las fosforamiditas de nucleótidos y los soportes adecuados para sintetizar los oligonucleótidos están formados por nucleótidos modificados como los utilizados aquí, disponibles a nivel comercial, por ejemplo en Glen Research (Sterling, VA).
La síntesis estándar de oligonucleótidos se realiza mediante el paso de la adición de monómeros de nucleósidos en una cadena creciente. Cada adición implica el acoplamiento de un grupo fosforoso 3' reactivo de un monómero de nucleósido con el 5'hidroxilo de otro nucleósido unido a un soporte sólido. Después de la adición del nucleósido final, el oligonucleótido se separa del soporte, los grupos protectores se eliminan de las bases y se purifica el oligonucleótido para ser utilizado.
Usando métodos de síntesis estándar, el nucleótido en posición terminal 3' del oligonucleótido final, se obtiene del nucleósido que se une inicialmente al soporte sólido. Por eso, la síntesis de oligonucleótidos que formados por un nucleótido modificado en posición terminal 3', se lleva a cabo empezando con un soporte sólido que contiene el nucleósido modificado. La síntesis de los oligonucleótidos que están formados por un nucleótido interno modificado, se realiza usando los monómeros de nucleósidos fosforamiditas apropiados.
Los 2'-O-metilribonucleósidos y las fosforamiditas están disponibles comercialmente y están preunidos a un soporte de la síntesis. Otro nucleósidos modificados están comercializados sólo como fosforamiditas. Los soportes alternativos de síntesis están disponibles, y permiten la síntesis de los oligonucleótidos con un nucleótido modificado en la posición terminal 3', utilizando las fosforamiditas de los monómeros de nucleósidos modificados. Por ejemplo, soportes universales, como los comercializados por Glen Research (Sterling, VA) bajo la licencia de Avecia LTD., permite la escisión de los otros nucleótidos sintetizados en el soporte sólido, entre el primer y segundo monómero 3'. Un nucleósido modificado destinado a convertirse en el nucleósido 3' se añade en la primera adición de monómero y, por eso, se convierte en el segundo monómero de la cadena creciente. Siguiendo la adición final, el nucleósido en posición terminal 3', originalmente unido al soporte, se elimina durante el paso final de escisión, dejando el nucleótido terminal modificado deseado.
Amplificaciones usando cebadores modificados
Los métodos de la presente invención, comprenden llevar a cabo una amplificación basada en un cebador, en la que al menos uno de los cebadores es un cebador modificado de la presente invención. En general, los cebadores modificados pueden ser sustituidos por cebadores no modificados, conteniendo la misma secuencia de nucleótidos en una amplificación basada en un cebador sólo con modificaciones rutinarias en las condiciones de reacción de la amplificación siguiendo los pasos descritos aquí.
En una realización preferida, los cebadores modificados de la presente invención son utilizados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), descrita en las Patente Estadounidenses Números. 4,683,195; 4,683,202: y 4,965,188; Saiki et al., 1985, Science 230: 1350-1354; Mullis et al., 1986, Cold Springs Harbor Symp. Quant.Biol 51:263-273: y Mullis y Faloona, 1987, Methods Enzymol. 155: 335-350. No obstante, la invención no se limita a ningún sistema de amplificación particular. Se espera que sea útil el uso de cebadores modificados en otros métodos de amplificación basados en cebadores, en los cuales, el dímero de cebador o los productos no específicos de la amplificación que se forman. Ejemplos de los métodos de amplificación basados en cebadores modificados incluyen el ensayo de desplazamiento de cadena (Walter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, Walter et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20: 1691-1696, y la Patente Estadounidense Número 5.455.166) y los métodos de amplificación basados en la transcripción, incluyen los métodos descritos en las Patentes Estadounidenses. números. 5.437.990: 5.409.818; y 5.399.491; el sistema de la amplificación de la transcripción (TAS) (Kwoh et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177); y la replicación de secuencia autosostenida(3SR) (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878 y WO 92/08800). En Abramson y Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47 se proporciona un resumen de los sistemas de amplificación.
Las enzimas que se utilizan en los métodos de amplificación de los ácidos nucleicos descritos anteriormente son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, la polimerasa de DNA y los mutantes de las mismas, son útiles para varias aplicaciones de la PCR, y se describen en la Patente Estadounidense Número 4.889.818; La Patente Estadounidense número 5.079.352; La Patente Estadounidense número 5.352.600; la Patente Estadounidense número 5.374.553; la Patente Estadounidense Núm. 5.405.774; la Patente Estadounidense Núm. 5.420.029; la Patente Estadounidense número 5.455.170; la Patente Estadounidense número 5.466.591; la Patente Estadounidense número 5.491.086; la Patente Estadounidense Núm. 5.624.833; la patente Estadounidenses núm. 5.674.738; la Patente Estadounidense número: 5.677.152; la Patente Estadounidense Núm.: 5.773.258; la Patente Estadounidense Núm.: 5.789.224; la Patente Estadounidense Núm.: 5.795.762: la Patente Estadounidense Núm.: 5.939.292; la Patente Estadounidense Número: 5.968.799; la publicación de la Patente Europea Núm.: 892.058; la publicación de la Patente Europea Núm.: 823.479; la publicación de la Patente Europea Núm.: 0902.035; y la Solicitud Estadounidense copendiente Núm.: 09/146,631. Los enzimas adicionales que se usan en otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos también son conocidos en la materia y se describen, por ejemplo, en las referencias citadas anteriormente, que describen los métodos de amplificación.
Un experto en la materia entiende que la magnitud del efecto de los cebadores modificados dependerá de la reacción de amplificación particular y de las condiciones de reacción seleccionadas. La magnitud del efecto se puede determinar empíricamente, siguiendo la explicación de los ejemplos.
Para la actividad catalítica de la polimerasa de DNA, se requiere la presencia de un catión divalente. Para las reacciones de extensión que usan una DNA polimerasa termoestable o termoactiva y una plantilla de DNA, el catión divalente preferido es el Mg^{2+}, aunque otros cationes como Mn^{2+} o Co^{2+}, pueden activar la polimerasa de DNA. En la Patente Estadounidense Número 5,130,652; la Patente Estadounidense Número 5,322,770; la Patente Estadounidense Número 5,407,800; la Patente Estadounidense número 5,561,058; la Patente Estadounidense Número 5,641,864; y la Patente Estadounidense Número 5,693,571; se describe el uso de Mn^{2+} para aumentar la eficiencia de las reacciones de extensión utilizando un molde de RNA, por ejemplo la transcripción reversa. El uso de Mn^{2+}, también disminuye la fidelidad de las amplificaciones ya sea usando un molde de RNA o de DNA. En general, el uso de Mn^{2+} disminuye el retraso de la amplificación del molde que resulta del uso de los cebadores modificados si lo comparamos con la amplificación que se lleva a cabo usando el Mg^{2+}.
En la presente invención puede ser útil la utilización de determinadas polimerasas de DNA mutantes. La Solicitud Estadounidense copendiente Núm. 60/198,336, describe el uso de estas determinadas polimerasas de DNA mutantes, las cuales, son descritas en la Publicación de la Patente europea Núm. 0,902,035 y la Solicitud Estadounidense copendiente Núm. 09/146,631, con el fin de conseguir reacciones de amplificación de RNA y una reacción de transcripción reversa a alta temperatura más eficientes, en particular, en las reacciones activadas con Mg^{2+}. Tal y como se describe en los ejemplos, esta mutación particular tiende a disminuir el efecto retrasante de los cebadores modificados en las dianas de amplificación, cuando son utilizados en los métodos de la presente invención. Las polimerasas de DNA derivan de la Thermatoga maritima, descrita en las patentes citadas anteriormente, pueden aportar ventajas similares cuando se utilizan en los presentes métodos.
La selección de cebadores modificados apropiados, enzimas, cationes y otros agentes de reacción y condiciones dependerán de su aplicación. En algunas aplicaciones, la minimización de dímeros de cebador puede ser más importante que la eficiencia de la diana de amplificación. En otras aplicaciones, es deseable mantener la eficiencia de la diana de amplificación lo máximo posible mientras se disminuye el dímero de cebador. Un experto, entenderá las condiciones de reacción apropiadas en general, y los enzimas y cationes en particular, pueden ser seleccionados empíricamente para cualquier aplicación usando métodos experimentales rutinarios, siguiendo esta guía y los ejemplos.
La presente invención es compatible con otros métodos de reducción de amplificación no específica, como los detallados anteriormente. Por ejemplo, la presente invención se puede utilizar en una amplificación que se lleva a cabo mediante un enzima inactivado de forma reversible, como se describe en las Patentes Estadounidenses Núm. 5.677.152 y 5.773.258. El uso de un enzima inactivado de forma reversible, el cual puede reactivarse bajo las condiciones de reacción a altas temperaturas, reduce la amplificación no específica inhibiendo la extensión del cebador de cualquier cebador modificado antes del comienzo de la reacción. Una polimerasa de DNA termoestable inactiva de forma reversible ha sido desarrollada y fabricada por Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ), comercializada por Applied Biosystems (Foster City, CA) y descrita en Birch et al., 1996, Nature 381 (6581):445-446.
La presente invención, también puede ser utilizada conjuntamente con los cebadores modificados descritos en la Patente Estadounidense Núm. 6.001.611. Tal y como se describe aquí, los cebadores pueden ser modificados por la unión covalente de un grupo modificador con una amina exocíclica de un nucleótido en la posición terminal 3' o cercana a ésta. La unión de un grupo con la amina exocíclica no interfiere en el uso de los nucleótidos modificados en la posición terminal 3' o la posición cercana a ésta, tal y como se especifica aquí. Se pueden seleccionar posibles combinaciones de modificaciones de cebadores para ser utilizados con una diana particular, y condiciones de reacción específicas, mediante la experimentación rutinaria tal y como se describe en los ejemplos siguientes. Los ejemplos de los métodos de preparación adecuados para las reacciones de amplificación son ampliamente conocidas en la literatura y se describen en la bibliografía aquí citada. El método utilizado en particular no es una parte clave de esta invención. Un experto en la materia puede optimizar las condiciones de reacción para el uso con los métodos conocidos de preparación de muestras.
Los métodos de análisis de los ácidos nucleicos amplificados son ampliamente conocidos y están completamente descritos en la bibliografía citada aquí. El método en particular utilizado no constituye una pauta clave de la presente invención. Un experto en la materia puede seleccionar un método de análisis apropiado dependiendo de su aplica-
ción.
Un método preferente para analizar una reacción de amplificación es monitorizando el aumento de la cantidad total del DNA de doble cadena en la mezcla de reacción, como se describe en Higuchi et al., 1992, Bio/Technology 10:413-417; Higuchi et al., 1993, Bio/Technology 11:1026-1030, Higuchi and Watson, 1999, en PCR Applications (Innis et al.,eds.) Capítulo 16, Academic Press, San Diego; la Patente Estadounidense Núm. 5.994.056; y las Publicaciones de las Patentes Europeas Núms. 487.218 y 512.334. En este método, citado aquí como "PCR cinética" la detección del DNA de doble cadena se basa en el aumento de fluorescencia que el bromuro de etidio (EtBr) y otros marcajes de unión a DNA muestran cuando se unen al DNA de doble cadena. La amplificación se lleva a cabo en presencia del marcaje .El aumento de DNA de doble cadena, resultante de la síntesis de las secuencias diana, da lugar a un aumento de la cantidad de marcaje unido al DNA de doble cadena y a un aumento concomitante detectable de la fluorescencia, el cual es monitorizado durante la amplificación. Por esto, los métodos facilitan la monitorización del progreso de una reacción de amplificación.
En una PCR cinética, la fluorescencia medida, depende de la cantidad total de DNA de doble cadena presente, ya sea resultante de la amplificación no específica o de la amplificación de la secuencia diana. La monitorización de la fluorescencia permite medir el aumento de la cantidad total de DNA de doble cadena, pero el aumento debido a la amplificación de la secuencia diana no se mide al margen del aumento debido al producto de la amplificación no-específico. Los cebadores modificados de la presente invención son particularmente útiles en la PCR cinética, porque no sólo reducen la cantidad de dímeros de cebador formados, sino que también retrasan la formación de cantidades detectables de los mismos. Un retraso en la formación de dímeros de cebador hasta después de que tenga lugar un aumento significativo de la secuencia diana permite, la monitorización independiente de la amplificación de secuencias diana y minimiza la interferencia producida por los dímeros de cebador.
Equipos
La presente invención está relacionada con equipos, unidades que son normalmente multi-contenedores que comprenden componentes útiles para la práctica del método presente. Un equipo que sea útil contiene cebadores, uno de los cuales al menos es modificado como se describe aquí para la amplificación de ácidos nucleicos. Otros componentes opcionales del equipo incluyen, por ejemplo, un agente catalizador de la síntesis de los productos de extensión del cebador, el sustrato de nucleósidos trifosfatos, tampones de reacción apropiados, e instrucciones para llevar a cabo el presente método.
Los ejemplos de la presente invención explicados a continuación son provistos sólo con propósito ilustrativo y no para limitar el alcance de la invención. Numerosas realizaciones de la invención dentro del alcance de las reivindicaciones que siguen a los ejemplos serán evidentes para los expertos en la materia tras leer el texto precedente y los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 Protocolos utilizados para evaluar los cebadores modificados
Los efectos de varios cebadores modificados sobre la formación de dímeros de cebador fueron analizados mediante la comparación de amplificaciones llevadas a cabo utilizando cebadores modificados o no modificados.
Las comparaciones se llevaron a cabo usando un protocolo esencialmente de la manera descrita a continuación. Allí donde el protocolo fue modificado, se indican los cambios en la descripción del experimento.
Ácidos nucleicos diana
Los plásmidos que contienen un segmento de DNA de HIV-1 subtipo O del gen gag fueron utilizados como diana.
Cebadores
Las amplificaciones se llevaron a cabo utilizando cebadores modificados y no modificados. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores se muestran a continuación, orientadas en la dirección de 5' a 3'. Estos cebadores amplían una porción del gen gag de una secuencia de HIV-1.
Los tres cebadores directos son variantes del mismo cebador; cada uno de ellos totalmente complementario a la secuencia diana, pero difiriendo en los nucleótidos terminales (A,T o G).Esto permite comparaciones de los efectos de la modificación de los nucleótidos terminales a la vez que minimiza los efectos de las diferencias de la secuencia de cebador.
Amplificación de las Secuencias de Cebador Directos
SK145-T (ID. DE SEC. NÚM.: 1)
AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA
SK145 (ID. DE SEC. NÚM.: 2)
AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT
SK145-G (ID. DE SEC. NÚM.: 3)
AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATG
Inverso
GAG152 (ID. DE SEC. NÚM.: 4)
GGTACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCC
Los cebadores modificados consisten en las mismas secuencias de nucleótidos pero siendo uno o más nucleótidos de la posición terminal 3' nucleótidos modificados. Las siguientes abreviaciones son utilizadas para identificar los nucleótidos.
\newpage
Nucleótido Abreviación
Nucleótidos no modificados dA, dT, dG, dC
2'-O-metil-ribonucleótidos 2'omeA, 2'omeU, 2'omeG, 2'omeC,
2'-desoxi-2'-amino-nucleótidos 2'NH_{2}A, 2'NH_{2}U, 2'NH_{2}G, 2'NH_{2}C
2'-desoxi-2'-fluoro-nucleótidos 2'FA, 2'FU, 2'FG, 2'FC
Nucleótidos que contienen arabinosa AraA, AraU, AraG, AraC
Como cada uno de los dímeros de cebador anteriores difiere en el nucleótido en posición terminal 3', los cebadores se identifican por el nucleótido terminal en los ejemplos detallados más abajo. Para los cebadores que contienen nucleótidos adicionales en dirección 5', se muestran los dos o tres nucleótidos terminales según sea necesario. Por eso, por ejemplo, un cebador directo identificado como 2'omeG se refiere a un cebador que tiene la secuencia SK145+G (ID. DE SEC. NÚM.: 3), donde el nucléotido en posición terminal 3' es una 2'-O-metil-guanosina. Análogamente, un cebador directo identificado como 2'omeA-dA se refiere a un cebador que tiene la secuencia SK145-T (ID. DE SEC. NÚM.: 1), donde el penúltimo nucléotido en posición terminal 3' es una 2'-O-metil-adenosina y el último nucleótido en la posición terminal 3' es una adenosina no modificada.
Los cebadores fueron sintetizados en un sintetizador de DNA ABI 394 (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City,CA). Las fosforamiditas del nucleósido modificado se obtuvieron por ejemplo de Glen Research (Sterling, VA). Se utilizaron condiciones de síntesis convencionales, básicamente, como las recomendadas por los fabricantes.
Los cebadores brutos se purificaron mediante DMT On/Off HPLC estándar usando una columna Rainin Pure-DNA en un sistema de Rainin HPLC (Rainin Instrument Co. Woburn, MA). Los oligonucleótidos fueron analizados utilizando el sistema de electroforesis capilar ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA) o mediante una cromatografía HPLC de intercambio aniónico desnaturalizante en una columna Dionex Nucleopak (Dionex Corp, Sunnyvale, CA).
Polimerasas de DNA
Las amplificaciones se llevaron a cabo utilizando la polimerasa de DNA termoestable de la especie Thermus ZO5 descrita en la Patente Estadounidense Núm. 5.455.170 y la Patente Estadounidense Núm. 5.674.738. Las amplificaciones también se llevaron a cabo utilizando 2 formas mutantes de una polimerasa de DNA provenientes de la especie Thermus Thermophilus (Tth). Tth se describe en la Patente Estadounidense Núm. 5.618.711.
Una de las polimerasas de DNA Tth mutantes, designada aquí como CE31, contiene las mutaciones puntuales Q682K y E683K, donde el número indica la posición de la mutación del aminoácido, la letra prefijo es el código de letra única estándar para el aminoácido del enzima originario, y la letra sufijo es el código de letra única estándar para el aminoácido del enzima mutante. La mutación E683K aumenta la capacidad de la polimerasa de DNA para incorporar nucleótidos, incluyendo desoxinucleótidos (dNTP) y análogos de nucleótidos como didesoxinucleótidos (ddNTP), marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína y de la cianina, como se describen en la Publicación de la Patente Europea Núm. 0.902.035 y Solicitud de Patente Estadounidense co-pendiente Núm. 09/146.631. La Solicitud de Patente Estadounidense co-pendiente Núm. 60/198,336, describe el uso de estas polimerasas de DNA mutantes para proporcionar una mayor efectividad a altas temperaturas en las reacciones de amplificación de RNA y transcripción inversa; en particular en las reacciones activadas por Mg^{+2}.
La otra polimerasa de DNA Tth mutante, designada aquí como CE18, contiene las mutaciones puntuales Q682K, E683K, G46E. La mutación G46E esencialmente elimina la actividad exonucleasa de 5'a 3', como se describe en la Patente Estadounidense Núm. 5.466.591. CE18 difiere de CE31 sólo por la presencia de la mutación G46E. Es de esperar que la presencia o ausencia de esta mutación puntual en el dominio 5' a 3' de la exonucleasa de la enzima no afecta a la capacidad de la enzima para extender un cebador modificado.
Condiciones de Amplificación
Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo mediante volúmenes de reacción de 100 \mul que contenían los siguientes reactivos, excepto donde se indica otra cantidad:
\medcirc las no-dianas (controles negativos) o entre 10^{4} a 10^{6} copias del molde de DNA de HIV
0,5 \muM de cada cebador (50 pmol)
5-50 unidades de polimerasa de DNA
50 mM Tricina (pH 8,3)
120 mM HOAC
300 \muM cada dATP, dCTP y dGTP
600 \muM dUTP
3 mM MnOAc
8,5% Glicerol
10 unidades de UNG*
1,0 \mug/ml de bromuro de etidio
El ciclado térmico de cada reacción se llevó a cabo en el termociclador GeneAmp® PCR system 9600 (Applied biosystems, Foster City, CA) modificado para facilitar la monitorización de la fluorescencia del bromuro de etidio durante la reacción, como se describe en Higuchi y Watson, 1999, en PCR Applications (Innis et al.,eds.) Capítulo 16, Academic Press, San Diego, incorporado aquí mediante su referencia. Alternativamente, las reacciones se pueden realizar en un ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) el cual permite la selección de longitudes de onda de detección para el uso con diferentes colorantes, o en un GeneAmp® 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA), el cual está diseñado con una longitud de onda de detección pre-programada para utilizarlo con SYBR® Green I (Molecular Probes, Eugene, OR). El ciclado térmico se llevó a cabo según el siguiente perfil de temperaturas:
Incubación de pre-reacción 48ºC durante 12 minutos
Incubación a altas temperaturas 96ºC durante 10 segundos
hasta 60 ciclos. Desnaturalizar a 91ºC durante 10 segundos, empareja-
miento/extensión a 65ºC durante 40 segundos.
La incubación de pre-reacción permite que la UNG, facilite la degradación de cualquier producto de extensión del cebador que contenga dU formados durante la etapa de reacción de baja temperatura, tal y como se describe en la Patente Estadounidense Núm. 5.418.149.
El ciclado de temperatura se llevó a cabo en la mayoría de reacciones durante 60 ciclos, aunque en algunas reacciones se paró en ciclos anteriores.
Detección de los productos de Amplificación
La acumulación de productos de amplificación se midió en cada ciclo durante la reacción utilizando los métodos de PCR cinética antes descritos. La fluorescencia del bromuro de etidio en la mezcla de reacción, con fluorescencias más fuertes cuando se intercala entre el DNA de doble cadena, se monitorizó para medir el aumento del DNA de doble cadena durante la amplificación. Las reacciones fueron monitorizadas mediante la medición de la fluorescencia de la mezcla de reacción en cada ciclo.
Las mediciones de fluorescencia se normalizaron dividiendo la medida de la fluorescencia inicial obtenida durante un ciclo temprano de la reacción mientras las medidas de fluorescencia entre ciclos eran relativamente constantes, es decir, antes de detectar el aumento del producto de reacción. El número de ciclo elegido para la medida de la fluorescencia inicial fue el mismo para todas las reacciones comparadas de modo que todas las medidas representan un aumento relacionado con el mismo ciclo de la reacción.
El aumento en el producto de reacción durante la reacción fue medido como el número de ciclos de amplificación desarrollados hasta que la fluorescencia normalizada excedía un nivel arbitrario de fluorescencia (AFL). El AFL escogido está cerca de los niveles basales de fluorescencia, pero por encima del rango de fluctuaciones aleatorias de la fluorescencia medida, de manera que la cinética de la reacción fue medida durante la fase de crecimiento geométrico de la amplificación. En ciclos posteriores, la acumulación de producto amplificado inhibe la reacción y, eventualmente, lleva a un plateau de reacción.
Para todas las reacciones se ha escogido el AFL de 1,2. Debido a que la reacción de amplificación de la PCR consiste en ciclos discretos y las mediciones de fluorescencia se realiza una en cada ciclo, la fluorescencia medida aumenta de forma característica desde por debajo de AFL hasta por encima de AFL en un solo ciclo. Para mejorar la precisión de las medidas, se calculó, mediante interpolación de fluorescencias medidas entre ciclos, un número "exacto" de ciclos para alcanzar el umbral de AFL, referido aquí como valor C_{T.}
Debido a que los métodos de cinética de PCR sólo miden un aumento de la cantidad total de DNA de doble cadena, los productos de amplificación no específica no son medidos al margen de los productos de amplificación buscados. Para medir la producción de los productos de amplificación independientes de molde no específica (dímero de cebador) se llevaron a cabo reacciones separadas sin el molde de ácidos nucleicos en la mezcla de reacción. En estas reacciones libres de molde, cualquier aumento de DNA de doble cadena se puede atribuir a la formación independiente del molde de los productos de amplificación no específico, es decir "dímero de cebador".
En la mayoría de reacciones, si se llevan a cabo suficientes ciclos de amplificación, los dímeros de cebador se forman eventualmente y, una vez creados, se amplifican eficientemente debido a su pequeño tamaño. No obstante, la generación del dímero de cebador no afecta al valor C_{T.} observado en la amplificación de diana siempre y cuando el dímero de cebador no sea detectable hasta mucho después del valor C_{T} de la amplificación de la diana. Preferentemente la formación de dímero de cebador se retrasa, para que no se forma dentro de los ciclos utilizados en la reacción.
Incluso un retraso menor en la formación del dímero de cebador respecto a la amplificación de la diana, puede aportar beneficios significativos a la reacción. Debido a la rápida acumulación de los productos de amplificación durante la fase de crecimiento geométrico de una reacción de PCR (cada ciclo da lugar a casi el doble de la cantidad de producto amplificado), cada ciclo de retraso en la formación del dímero de cebador respecto a la amplificación de la diana, equivale casi a la mitad de la cantidad de dímero de cebador presente, relativo a la cantidad de diana. Esta reducción en la cantidad relativa de dímero de cebador ayuda a minimizar cualquiera de los efectos de la formación de dímero de cebador en el valor C_{T.} la diana.
Los cebadores modificados, suelen tener un efecto, a menudo un retraso, sobre la formación de los productos de amplificación deseados. Preferentemente, este retraso se minimiza mientras se maximiza el retraso de la formación del dímero de cebador. Debido a que el valor absoluto de C_{T} obtenido de la amplificación de dianas depende de la concentración inicial de las dianas, se analizaron los resultados de las reacciones que contienen el molde diana comparando la diferencia de los valores obtenidos de C_{T}, designados \DeltaC_{T}, entre reacciones donde se utilizan los cebadores modificados y reacciones comparables donde se usan cebadores no modificados. Por eso, los cebadores modificados preferibles, son aquellos que proporcionan un cambio mínimo en el valor C_{T} de la amplificación de la diana, y un incremento máximo en el valor C_{T} de las amplificaciones de las no-dianas.
Ejemplo 2 Resultados utilizando cebadores no modificados
Las amplificaciones se llevaron a cabo sin molde diana, utilizando versiones de cebadores no modificados tales como SK145 (ID. DE SEC. NÚM.: 2) y GAG152 (ID. DE SEC. NÚM.: 4), con el fin de proporcionar una medida de la formación del dímero de cebador que puede utilizarse para evaluar las mejores obtenidas utilizando cebadores modificados. Las reacciones se llevaron a cabo con un rango de concentraciones de polimerasa de DNA.
A continuación, en la siguiente tabla, se muestran los valores de C_{T} representativos observados de las reacciones libres de molde:
Reacciones libres de molde
Enzima C_{T}
10 U Z05 38,0
20 U Z05 37,0
1.25 U CE31 37,1
2.5 U CE31 35,9
5 U CE31 35,5
10 U CE31 33,9
20 U CE31 31,4
Para ambas polimerasas de DNA, el dímero de cebador tiende a formarse antes a concentraciones de enzima mayores. En general, las reacciones que usan polimerasa de DNA CE31, dieron como resultado dímeros de cebadores antes (valor menor de C_{T}) que las que usan polimerasa de DNA ZO5.
Las amplificaciones se llevaron a cabo (no se muestran los datos) comparando la formación de dímeros de cebador en reacciones utilizando formas no modificadas de los tres cebadores directos. En los tres casos se obtuvieron resultados casi idénticos, por esta razón, en las comparaciones de los cebadores modificados y no modificados descritas debajo, los tres posibles pares de cebadores no modificados se utilizan indistintamente.
Se ha de destacar que los valores de C_{T} de las reacciones libres de molde tienden a ser más variables que los valores de C_{T} de la amplificación de los moldes. Esto, probablemente, refleja la aleatoriedad en el tiempo de formación del molde inicial del dímero de cebador, que a veces no ocurre en algunas reacciones. Una vez formado, el dímero cebador se amplifica eficientemente debido a su pequeño tamaño. Tal y como se muestra debajo, aunque el dímero de cebador normalmente fue detectable en las réplicas de reacción en el mismo número de ciclo, aproximadamente en algunas reacciones, el dímero de cebador se retrasó significativamente o no se formó finalmente en una de las
réplicas.
Ejemplo 3 Resultados utilizando cebadores modificados con 2'-O-metilo
Los resultados de amplificación utilizando una variedad de combinaciones de cebadores modificados se muestran en las siguientes tablas. Las modificaciones del cebador, el enzima y la concentración del enzima utilizadas en cada reacción se indican en la tabla.
Los resultados de la amplificación del molde diana, que proporciona el producto de amplificación deseado ("amplicon") son descritos como la diferencia en C_{T} (\DeltaC_{T}) entre las reacciones llevadas a cabo con los cebadores modificados indicados y las reacciones que utilizan cebadores no modificados. Las amplificaciones, normalmente, se realizan por duplicado y las cifras de los resultados obtenidos se muestran en la tabla siguiente.
Los resultados de las amplificaciones utilizando reacciones libres de moldes, que producen solamente dímero de cebadores, si lo hubiera, se describen como la C_{T.} En la mayoría de los casos, los resultados descritos son las cifras de las reacciones duplicadas. En las reacciones duplicadas, en las que los dímeros de cebador son detectables en diferentes números de ciclos, por ejemplo, en los que los valores de C_{T} son bastante diferentes (por ejemplo, en el que el dímero de cebador no se forma en una de las réplicas), ambos valores son descritos por separado. En reacciones, en las que el dímero de cebador no se detectó en el ciclo final, en el que se realizaron las mediciones de fluorescencia, se describe el número de ciclo final de la reacción y el resultado se marca con un asterisco.
I. Cebador modificado con 2'-O-Me en la posición terminal 3'
Los resultados de las amplificaciones que se llevan a cabo utilizando cebadores que contienen un nucleótido modificado en posición terminal 3' se muestran en las siguientes tablas:
\vskip1.000000\baselineskip
Amplificaciones utilizando la polimerasa de DNA ZO5
Cebadores Amplicon Dímero de cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
50 U Z05 0,9 45
2'omeG Dc 25 U Z05 1 42
12,5 U Z05 1 42,5
50 U Z05 1 49,3-59*
2'omeG 2'omeC 25 U Z05 1 45,4-59*
12,5 U Z05 1,1 59*
50 U Z05 1,2 43,2
2'omeU dC 25 U Z05 0,5 41,6
12,5 U Z05 1 43
(Continuación)
Cebadores Amplicon Dímero de cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
50 U Z05 1,8 46
2'omeU 2'omeC 25 U Z05 1,4 45
12,5 U Z05 1,5 46,6-53*
50 U Z05 5 44,4
2'omeA dC 25 U Z05 4,5 46,4
12,5 U Z05 4,5 47-*50 
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores obtenidos de C_{T} del dímero de cebador, se pueden comparar con aquellos obtenidos en las reacciones donde se usaban cebadores no modificados, en los que se observaron valores de G_{T} de 37-39. Los datos demuestran que, en general, el uso al menos de un cebador que incorpora en la posición terminal 3' un nucleótido 2'-O-Me retrasa la formación del dímero de cebador en una reacción libre de molde. En particular, en la mayoría de reacciones, se obtiene un valor de C_{T} mayor de 40, normalmente significativamente mayor.
El efecto observado del ribonucleótido 2'-O-Me en el extremo 3' sobre la amplificación de la diana dependió de la base concreta del nucleótido modificado. El uso de un 2'-O-Me-C o U o G en posición terminal 3', resultó en un retraso mínimo en la amplificación de la diana, variando entre 0,5 ciclos de retraso utilizando un solo cebador modificado y 1,8 ciclos de retraso utilizando dos cebadores modificados. Por contra, en reacciones donde se utiliza polimerasa de DNA ZO5, el uso de 2'-O-Me-A en la posición terminal 3'resulta en un retraso de 4-5 ciclos.
\vskip1.000000\baselineskip
Amplificaciones utilizando la polimerasa de DNA CE31
Cebadores Amplicon Dímero de cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
20 U CE31 0,9 41,2
2'omeG 2'omeC 10 U CE31 0,8 43
5 U CE31 1 43,2
20 U CE31 0,7 37
2'omeG dC 10 U CE31 0,8 38,4
5 U CE31 0,7 39
20 U CE31 0,7 39
2'omeU 2'omeC 10 U CE31 0,7 41,2
5 U CE31 1 41,9
20 U CE31 0,3 36,3
2'omeU dC 10 U CE31 0,1 37,2
5 U CE31 0,6 36,2
(Continuación)
Cebadores Amplicon Dímero de cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
20 U CE31 1 41,1
2'omeA 2'omeC 10 U CE31 1 42,6
5 U CE31 1,2 43,9
20 U CE31 1,3 37
2'omeA dC 10 U CE31 1,3 38,9
5 U CE31 1,9 40,6 
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha indicado anteriormente, las reacciones que utilizan cebadores no modificados con CE31 tienden a producir el dímero de cebador en un ciclo temprano, a diferencia de las reacciones que utilizan la polimerasa de DNA Z05. Los resultados obtenidos utilizando cebadores modificados en la posición terminal 3' muestran mejoras similares a las que se observan en las reacciones que utilizan la polimerasa de DNA ZO5. En general, las amplificaciones de los moldes utilizando CE31 tienden a verse menos afectadas con el uso de cebadores modificados en la posición terminal 3'. En particular, el uso de CE31 minimiza el retraso en las amplificaciones de las dianas llevadas a cabo con un cebador con 2'-O-Me en la posición terminal 3'.
Los resultados demuestran que los cebadores modificados que contienen un nucleótido modificado en la posición terminal 3' del nucleótido son útiles en los presentes métodos.
II. Modificaciones del nucleótido en la posición penúltima 3'
Los resultados de las amplificaciones que se llevan a cabo utilizando cebadores que contienen un nucleótido modificado en la penúltima posición 3' se muestran en las siguientes tablas:
\vskip1.000000\baselineskip
Amplificaciones utilizando polimerasa de DNA ZO5
Cebadores Amplicon Dímero de cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
50 U ZO5 3,4 46,5-59*
2'omeA-dA 2'omeC 25 U ZO5 2,6 48,3-59*
12,5 U ZO5 3,2 49
50 U ZO5 2,8 51-59*
2'omeA-dA 2'omeC-dC 25 U ZO5 2,2 51,7
12,5 U ZO5 2,5 47-59*
Amplificaciones utilizando polimerasa de DNA CE31
Cebadores Amplicon Dímero de cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
20 U CE31 1 40,9
2'omeA-dA 2'omeC 10 U CE31 0,9 43,5
5 U CE31 1 44,5
20 U CE31 1 37
2'omeA 2'omeC-dC 10 U CE31 1,5 38,9
5 U CE31 1,8 53,5
Los resultados demuestran que los cebadores modificados que contienen un nucleótido modificado en la posición penúltima 3' son útiles en los presentes métodos.
III. Modificaciones de dos nucleótidos en la posición terminal 3'
Los resultados de las amplificaciones llevadas a cabo utilizando cebadores que contienen dos nucleótidos modificados, uno en la posición terminal 3' y otro en la posición penúltima 3', se muestran en las siguientes tablas:
Amplificaciones utilizando polimerasa de DNA ZO5
Cebadores Amplicon Dímero de cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
2'omeC- 50 U ZO5 1,6 59*
2'omeG 2'omeC 25 U ZO5 1,9 59*
12,5 U ZO5 1,8 59*
2'omeC- 50 U ZO5 1,1 45-57*
2'omeU 2'omeC 25 U ZO5 1,2 45,8-47*
12,5U ZO5 1,1 49,8-57*
Amplificaciones utilizando polimerasa de DNA CE31
Cebadores Amplicon Dímero de cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
2'omeC- 20 U CE31 1,1 45-59*
2'omeG 2'omeC 10 U CE31 1 57-59*
5 U CE31 1 59*
2'omeC- 20 U CE31 0,8 40
2'omeU 2'omeC 10 U CE31 0,8 42,3-48,5
5 U CE31 1,1 43,5
2'omeC- 20 U CE31 1,4 50
2'omeA 2'omeC 10 U CE31 1,3 59*
5 U CE31 1,5 59*
Los resultados demuestran que los cebadores modificados que contienen nucleótidos modificados en las 2 posiciones terminales 3' son útiles en los presentes métodos.
Las amplificaciones adicionales (datos no mostrados) indicaron que ambos cebadores pueden ser modificados en la parte final de las 2 posiciones terminales 3'. Esta combinación es menos preferida porque, a pesar de que el dímero de cebador sea retrasado de un modo efectivo, el retraso en la amplificación de la diana también fue mayor (aproximadamente 3 ciclos). No obstante, bajo algunas condiciones de reacción, particularmente donde el retraso máximo de la formación del dímero de cebador es el más importante, el uso de un par de cebadores, cada uno de los cuales contiene nucleótidos modificados en las 2 posiciones terminales 3', serían de utilidad.
Ejemplo 4 Cebadores modificados con Fluoro, Amino y Arabinosa
Los resultados de la amplificación utilizando cebadores modificados con los grupos 2'-fluoro o 2'-amino o que contengan un nucleótido de arabinosa se muestran en las tablas a continuación. Las amplificaciones se llevan a cabo, esencialmente, tal y como se describen en el Ejemplo 1, pero utilizando las siguientes temperaturas de reacción descritas.
Incubación de pre-reacción 48ºC durante 12 minutos
Incubación de alta temperatura 93ºC durante 2 minutos
hasta 60 ciclos Desnaturalización a 93ºC durante 10 segundos, empareja-
miento/extensión a 60ºC durante 40 segundos
En las amplificaciones de moldes libres utilizando cebadores no modificados y polimerasas de DNA 40 U ZO5, se observa la formación de un C_{T} de 34.1 de la formación del dímero de cebador. En general, el uso de una emparejamiento/extensión de temperatura baja (60ºC) en la temperatura del ciclo descrita, tiende a aumentar la formación del dímero de cebador. Por esta razón, los valores de C_{T} presentados a continuación, no son directamente comparable con los descritos en el ejemplo anterior.
Los resultados se muestran en la siguiente tabla:
Amplificaciones utilizando otros cebadores modificados
Cebadores Amplicon Dímero de cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
dT dC 40 U ZO5 0 34,1
2'NH_{2}U-dG dC 40 U ZO5 0 36,9
2'FU-dG dC 40 U ZO5 0 32,1
dT 2'NH_{2}C-dG 40 U ZO5 0 36,6
dT 2'araC-dC 40 U ZO5 0 37,0
2'FU-dG 2'NH_{2}C-dG 40 U ZO5 1,1 41,5
2'NH_{2}U-dG 2'NH_{2}C-dG 40 U ZO5 0,8 45
2'NH_{2}U-dG 2'araC-dC 40 U ZO5 1,7 43.1
Los resultados demuestran que los 2'-fluoro o 2'-amino nucleótidos y los nucleótidos de arabinosa, también proporcionan resultados mejorados cuando se utilizan en cebadores modificados en los métodos presentes.
Los resultados obtenidos utilizando un cebador que contiene un 2'-fluoro nucleótido cuando se une con otro cebador modificado demostraron mejoras significativas, aunque sean atribuibles al segundo cebador modificado. No obstante, los resultados obtenidos utilizando el cebador que contiene un 2'-fluoro nucleótido unido a un cebador no modificado, mostraron, si lo hubiera, un efecto negativo menor. No es obvia la razón de este resultado anómalo.
Ejemplo 5 Comparación de cebadores: reacciones activadas mediante Mg^{2+}
Se llevaron a cabo reacciones adicionales, esencialmente, tal y como se describen en el Ejemplo 1 anterior, pero utilizando concentraciones de Mg^{2+} 3,0 mM en la mezcla de reacción, en vez de Mn^{2+}, 40 unidades de polimerasas de DNA ZO5 o CE18 y el siguiente perfil de temperatura:
Incubación de pre-reacción 48ºC durante 12 minutos
Incubación de alta temperatura 94ºC durante 10 segundos
hasta 60 ciclos Desnaturalización a 91ºC durante 10 segundos, empareja-
miento/extensión a 60ºC durante 40 segundos
En las amplificaciones libres de moldes, utilizando cebadores no modificados y 40U de polimerasa de DNA ZO5, se observa un C_{T} de 35,1 para la formación de dímero de cebador. Tal y como se describe arriba, el uso de una temperatura baja de emparejamiento/extensión (60ºC) en el perfil de ciclo de temperatura, tiende a aumentar la formación de dímeros de cebadores. Por esta razón, los valores de C_{T} presentados a continuación, no son directamente comparables con aquellos mostrados en el ejemplo anterior.
Los resultados se muestran en las siguientes tablas. Un "neg" en los resultados de las columnas indica que no se ha dado producto de amplificación.
Amplificaciones utilizando polimerasa de DNA ZO5
Cebadores Amplicon Dímero de cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
2'omeA dC 40 U ZO5 25,3 55
2'omeA 2'omeC 40 U ZO5 Neg Neg
2'omeA-dA dC 40 U ZO5 4,9 47
2'omeG dC 40 U ZO5 18,9 49
2'omeU dC 40 U ZO5 1,7 49,5
dA 2'omeC 40 U ZO5 0,55 49 
\vskip1.000000\baselineskip
Amplificaciones utilizando polimerasa de DNA CE18
Cebadores Amplicon Dímero de cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
2'omeA dC 40 U CE18 2,1 38
2'omeA 2'omeC 40 U CE18 21 53*
2'omeG dC 40 U CE18 3 42
2'omeG 2'omeC 40 U CE18 3 53*
2'omeU dC 40 U CE18 2,1 37,2
2'omeU 2'omeC 40 U CE18 1,8 53*
dA 2'omeC 40 U CE18 0,5 38,6
Los resultados demuestran que los cebadores que contienen nucleótidos modificados en la posición terminal 3' pueden ser de utilidad en los presentes métodos incluso en las amplificaciones activadas por Mg^{2+}, aunque el nucleótido modificado posea en mayor impacto en la diana de amplificación con un tampón con Mg^{2+} que con uno con Mn^{2+}. En particular, el grupo 2'-O-metil-A en la posición terminal 3' del cebador, retrasa significativamente la diana de amplificación bajo estas condiciones de reacción.
Ejemplo 6 Cebadores modificados múltiples
Las amplificaciones que se llevan a cabo utilizando el cebador directo SK145 (ID. DE SEC. NÚM.: 2) modificado por la inclusión de un ribonucleótido 2'-O-Me en cada quinta posición empezando por el nucleótido terminal 3' del. Estos cebadores son designados en las tablas como "1/5ome" Las amplificaciones transcurren esencialmente como las descritas en el ejemplo 1. Los resultados se presentan en las siguientes tablas:
Amplificaciones utilizando polimerasa de DNA ZO5
Cebadores Amplicon Dímero de cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
50 U Z05 4,5 59
1/5ome dC 25 U Z05 4,9 58*
12,5 U Z05 6,3 58*
20 U Z05 5,9 51*
1/5ome 2'omeC 10 U Z05 6,9 51*
50 U Z05 4,8 59*
1/5ome 2'omeC-dC 25 U Z05 5,2 59*
12,5 U Z05 6,6 59* 
\vskip1.000000\baselineskip
Amplificaciones utilizando polimerasa de DNA CE31
Cebadores Amplicon Dímero de cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
25 U CE31 1,9 47
1/5ome dC 12,5 U CE31 2 46
6,25 U CE31 2 46
50 U CE31 1,5 52*
1/5ome 2'omeC 25 U CE31 1,5 42*
20U CE31 1,8 57*
20 U CE31 1.6 51
5U CE31 2,9 57
2,5 U CE31 3,9 45
20 U CE31 2 54
1/5ome 2'omeC-dC 10 U CE31 2,5 59*
5 U CE31 3 59*
Los resultados demuestran que los cebadores que contienen un nucleótido modificado en cada quinta posición empezando por el nucleótido de la posición terminal 3', son útiles en los presentes métodos. Se espera que el patrón de modificación utilizado aquí no sea crítico y que la adición de cebadores modificados múltiples sea de utilidad en en los presentes métodos. Ciertamente, los cebadores que contienen un nucleótido modificado en cada quinta posición empezando por el penúltimo nucleótido de la posición terminal 3', también serán útiles para los presentes métodos.
Ejemplo 7 Cebador modificado en los 3 nucleótidos terminales 3'
Este ejemplo describe el uso de un cebador que contiene 2'-O-Me ribonucleótidos en las 3 posiciones terminales 3'. Estas reacciones particulares, se llevan a cabo con cebadores modificados que amplifican una secuencia del genoma del parvovirus (B19) humano.
Las reacciones se llevan a cabo indistintamente usando un par de cebadores no modificados o modificados en los cuales el cebador directo, en el cual su forma no modificada termina en A-G-T en la posición terminal 3', acabada en 2'omeA-2'omeG-2'omeU. El cebador inverso no se modifica. Las condiciones de reacción (reacciones activadas con Mn^{2+} utilizando polimerasa de DNA ZO5) son similares a las descritas anteriormente para la amplificación de una secuencia HIV-1, pero con la diferencia que se utilizan 20pmol de cada cebador de parvovirus y un molde diana que contiene ácidos nucleicos purificados de parvovirus. El ciclo térmico se llevó a cabo utilizando el siguiente perfil de temperatura.
Incubación de pre-reacción 48ºC durante 12 minutos
Incubación de alta temperatura 94ºC durante 10 segundos
hasta 60 ciclos Desnaturalización a 92ºC durante 10 segundos, empareja-
miento/extensión a 62ºC durante 60 segundos
Los resultados de las amplificaciones se muestran en la tabla siguiente. Debido a que la propensión de formar el dímero cebador, se sabe que es dependiente del sistema, los presentes resultados no son directamente comparables con los que se han presentado en los ejemplos anteriores. No obstante, a pesar de las diferencias en las reacciones, se observa un C_{T} en las amplificaciones libres de molde utilizando cebadores de parvovirus no modificados (37,0), son comparables con los observados cuando se ha utilizado los cebadores HIV no modificados en las reacciones descritas en el ejemplo 2.
Amplificaciones utilizando cebadores modificados triplemente
Cebadores Amplicon Dímero cebador
Directo Inverso Enzima \DeltaC_{T} C_{T}
dA dC 40 U ZO5 0,0 37
2'omeA-
2'omeG-
2'omeU dC 40 U ZO5 3,2 53*
Los resultados demuestran que los cebadores modificados que contienen nucleótidos modificados en las 3 posiciones terminales 3' son de utilidad para los presentes métodos.
<110> F.HOFFMANN-La Roche AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> AMPLIFICACIÓN UTILIZANDO CEBADORES MODIFICADOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 19272
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/243,182
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2000-10-25
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()...()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtgggggga catcaagcag ccatgcaa 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()...()>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtgggggga catcaagcag ccatgcaaat 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()...()>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtgggggga catcaagcag ccatgcaaat g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()...()>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtactagta gttcctgcta tgtcacttcc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (14)

1. Un equipo para llevar a cabo la reacción de amplificación de ácidos nucleicos, en el que dicho equipo comprende un par de cebadores, en el que al menos un cebadores de dicho par, contiene un nucleótido modificado dentro de las 3 posiciones de nucleótidos terminales 3'; en el que dicho nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en 2'-O-Metil-nucleótidos, 2'-fluoro-nucleótidos, 2'-amino-nucleótidos y nucleótidos de arabinosa.
2. Un equipo de la reivindicación 1, en el que dicho nucleótido modificado es un 2'-O-Metil nucleótido.
3. Un equipo de la reivindicación 1, en el que dicho nucleótido modificado es un 2'-fluoro nucleótido.
4. Un equipo de la reivindicación 1, en el que dicho nucleótido modificado es un 2'-amino nucleótido.
5. Un equipo de la reivindicación 1, en el que dicho nucleótido modificado es un nucleótido de arabinosa.
6. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 , en el que dicho nucleótido modificado se encuentra en la posición terminal 3'.
7. Un equipo de la reivindicación 1, en el que cada cebador de dicho par de cebadores, contiene de modo independiente un nucleótido modificado dentro de las 3 posiciones terminales 3'; en el que dicho nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en 2'-O-Metil-nucleótidos, 2'-fluoro-nucleótidos, 2'-amino-nucleótidos y nucleótidos de arabinosa.
8. Un método para amplificar una secuencia diana de ácidos nucleicos, en el que dicho método comprende llevar a cabo una reacción de amplificación basada en cebadores, en una mezcla de reacción que comprende un par de cebadores, en la que un cebador de dicho par de cebadores, contiene un nucleótido modificado dentro de las 3 posiciones terminales 3'; en el que dicho nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en 2'-O-Metil-nucleótidos, 2'-fluoro-nucleótidos, 2'-amino-nucleótidos y nucleótidos de arabinosa.
9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho nucleótido modificado es un 2'-O-Metil nucleótido.
10. El método de la reivindicación 8, en el que dicho nucleótido modificado es un 2'-fluoro nucleótido.
11. El método de la reivindicación 8, en el que dicho nucleótido modificado es un 2'-amino nucleótido.
12. El método de la reivindicación 8, en el que dicho nucleótido modificado es un nucleótido de arabinosa.
13. El método de las reivindicaciones 8 a 12, en el que dicho nucleótido modificado se encuentra en la posición terminal 3'.
14. Un método de la reivindicación 8, en el que cada cebador contiene independientemente un nucleótido modificado dentro de las 3 posiciones terminales 3'; en el que dicho nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en 2'-O-Metil-nucleótidos, 2'-fluoro-nucleótidos, 2'-amino-nucleótidos y nucleótidos de arabinosa.
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