JP2003530859A - 固定化酵素基材を使用した細菌およびバクテリオファージの検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 固定化酵素基材の使用を含む、バクテリオファージおよび細菌を検出する方法ならびに固定化酵素基材。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 細菌の検出は、食品および飲料産業をはじめとする種々の産業において重要で
ある。例えば病原性細菌について食品および水をスクリーニングする必要性は、
消費者安全性を確保する上で重要である。特定の系統の細菌のレベルの測定は、
食品の保存期限および微生物許容性、そしてそれらの製造に使用される加工装置
および原材料の衛生状態を推定するために一般に使用されるアプローチである。
微生物感染症の診断も原因生物（群）の検出に依存する。

【０００２】 多くの公知の細菌検出方法がある。例えば細菌に感染するウイルスであるバク
テリオファージを用いてもよい。バクテリオファージ、感染した細菌の存在また
はその不在が検出されてもよい。典型的に、標的細菌は、細菌に特異的なバクテ
リオファージ（ＢＰ）を細菌に感染させて、過剰なＢＰを不活性化し、次にＢＰ
感染した細菌を何らかの方法で操作して、サンプルが最初に標的細菌を含有した
かどうかの間接的指標としてＢＰの存在または不在を検出することによって検出
される。細菌「ヘルパー細胞」を使用してＢＰ感染した細菌数を増幅することに
より、例えば、より迅速にするなど、アッセイ方法を向上させることもできる。
かかるアッセイの最終段階における一般的な検出方法は、細菌ヘルパー細胞をＢ
Ｐ感染した細菌と共に培養して、溶液中の濁度の変化を観察する、あるいは代案
としては適切な増殖培地上のＢＰプラーク形成を観察することである。

【０００３】 例えば、米国特許出願第０９／４３４，５８６号（Ｗｉｃｋｓら）は、サンプ
ル中の細菌を検出するための装置および方法について述べている。簡単に述べる
と、疑わしい（標的）細菌を含有するサンプルに疑わしい細菌に特異的なＢＰを
感染させ、過剰ＢＰを抗ウイルス剤で不活性化し、ＢＰ感染した細菌を細菌ヘル
パー細胞に添加してＢＰを増幅し、視覚的にまたは機器によって検出できる信号
を生じさせる。例えば、ＢＰは、ヘルパー細胞を寒天上で培養して形成されたＢ
Ｐプラークを数えることによって検出できる。

【０００４】 かかるアッセイ方法において、ＢＰの存在（そしてひいては間接的に標的細菌
の存在または不在）を検出するための指標として酵素基質（ＥＳ）を用いること
は、非常に有用であろう。ＥＳ指標の使用は、溶液濁度変化を観察しようと試み
るまたはプラーク形成を数えるよりも顕著な利点をもたらす。ＥＳ指標の使用は
、より簡便でより迅速な、そしてより安価なアッセイ方法をもたらすことができ
る。しかし、かかるアッセイ方法では、伝統的な可溶性ＥＳ指標の使用は一般に
可能でない。可溶性ＥＳは、非標的細菌、および使用する場合には細菌ヘルパー
細胞の両方の無傷の細菌細胞内の酵素と望ましくなく反応することにより、許容
できないレベルのバックグラウンド信号を生じる。

【０００５】 従って、本発明は、不溶性固体担体に結合（すなわち、固定化）された酵素基
質を指標として利用することによって、先行技術の問題を解決する。固定化酵素
基質の使用は、酵素基質が細菌細胞壁を越えて無傷の細菌細胞内の酵素と反応す
ることを防止する。その結果、酵素基質は溶解した細菌細胞から放出された酵素
のみと反応できる。

【０００６】 従って、本発明は、標的バクテリオファージを検出（同定および／または定量
）する方法を提供する。この方法は、細菌を当該サンプルと組み合わせて反応混
合物を形成する工程と、当該サンプル中に存在する任意の標的バクテリオファー
ジが細菌を溶解して酵素を放出させるのに効果的な条件下で反応混合物を培養す
る工程と、固定化酵素基質を反応混合物に添加する工程と、固定化酵素基質と任
意の存在する放出された酵素との相互作用から生じる検出可能な信号について反
応混合物をモニターする工程と、を含む。反応混合物への固定化酵素基質の添加
は、反応混合物の培養の前または後に行うことができる。この方法は、サンプル
中のバクテリオファージの定性的または定量的測定を伴うことができる。定量的
測定のためには、反応混合物を適切な増殖培地上で平板培養し、検出可能な信号
を発する領域を数える。

【０００７】 代案として、標的細菌を検出（同定および／または定量）する方法もある。こ
の方法は、バクテリオファージを当該サンプルと組み合わせて反応混合物を形成
する工程と、バクテリオファージが当該サンプル中に存在する任意の標的細菌を
溶解して酵素を放出させるのに効果的な条件下で反応混合物を培養する工程と、
固定化酵素基質を反応混合物に添加する工程と、固定化酵素基質と任意の存在す
る放出された酵素との相互作用から生じる検出可能な信号について反応混合物を
モニターする工程と、を含む。反応混合物への固定化酵素基質の添加は、反応混
合物の培養の前または後に行うことができる。この方法は、サンプル中の細菌の
定性的または定量的測定を伴うことができる。

【０００８】 好ましい実施態様では、本発明は、バクテリオファージを当該サンプルと組み
合わせて反応混合物を形成する工程と、バクテリオファージを当該サンプル中に
存在する任意の標的細菌に感染させる工程と、抗ウイルス剤を添加して任意の細
胞外バクテリオファージを不活性化する工程と、細菌ヘルパー細胞を反応混合物
に添加する工程と、固定化酵素基質を反応混合物に添加する工程と、バクテリオ
ファージが存在する任意の標的細菌と、細菌ヘルパー細胞とを溶解して酵素を放
出させるのに効果的な条件下で反応混合物を培養する工程と、固定化酵素基質と
存在する任意の放出された酵素との相互作用から生じる検出可能な信号について
反応混合物をモニターする工程と、を含む標的細菌を検出する方法を提供する。
この方法は、定性的測定を伴うこともできるが、好ましくはサンプル中の細菌の
定量的測定のために使用される。

【０００９】 本発明は、多孔性固体担体およびそれに共有結合した酵素基質を含む、固定化
酵素基材も提供する。

【００１０】 本発明は、固定化酵素基質（すなわち、酵素反応体）を使用して、バクテリオ
ファージまたは細菌の存在または不在を検出する方法を提供する。従って、本発
明は、細菌検出のための間接的方法を提供するバクテリオファージの検出のため
に、あるいは直接的な細菌検出のために、酵素活性を使用する方法を提供する。

【００１１】 酵素基質は、好ましくは、試験サンプル中に存在する酵素に接触すると、例え
ば、酵素基質のスペクトル特性、またはその酵素反応から得られた反応生成物に
変化を生じる、検出可能な標識を含む。この変化は、酵素活性、およびそれゆえ
にバクテリオファージの存在または不在、およびそれゆえに細菌の存在または不
在、あるいは直接細菌の存在または不在を判定するのに使用される。好ましくは
、この変化は、例えば吸収または励起の変化などのその他のスペクトル変化も使
用できるが、酵素基質の蛍光スペクトルの変化である。

【００１２】 酵素基質は種々の固体担体上に固定化できる。好ましくは、それは、米国特許
第５，２３８，８０９号（Ｗｏｌｆｂｅｉｓ）に開示されるように、光ファイバ
ーなどのその他の担体も使用できるが、多孔性担体である。この後者の実施態様
で、酵素基質は光ファイバー終端に付着され、引き続く信号評価のための光検出
器が提供され、その光検知器は酵素との反応時に酵素基質またはその反応生成物
によって発せられる、例えば蛍光である信号を測定するであろう。適切な光検出
器は、光電子増倍管、フォトトランジスタおよび光ダイオードである。好ましく
は、光ファイバーは単一ファイバーであるが、複数ファイバー束として構成され
てもよい。

【００１３】 固体担体 本発明で使用するのに許容可能な担体は、大きく異なることができる。担体は
多孔性または非多孔性でありうるが、好ましくは多孔性である。それは連続性ま
たは不連続性、可撓性または非可撓性でありうる。担体は、セラミック材料、ガ
ラス質材料、金属材料、有機ポリマー材料、またはそれらの組み合わせからでき
た担体をはじめとする種々の材料から製造できる。かかる担体は磁性であること
ができ、それによって信号の集中および強化が可能になる。

【００１４】 好ましい担体としては、粒子性担体またはビーズ担体、織布ウェブおよび不織
布ウェブ（繊維性ウェブなど）、微孔性ファイバー、微孔性メンブラン、中空フ
ァイバーまたは中空チューブなどの有機ポリマー担体が挙げられる。織布ウェブ
および不織布ウェブは、規則的なまたは不規則な物理的立体配置の表面を有して
もよい。

【００１５】 多孔性材料は、大きな表面積を提供するので、特に望ましい。多孔性担体は合
成または天然、有機または無機であることができる。多孔性構造の適切な固形物
は、少なくとも約１．０ｎｍの孔径と少なくとも約０．１ｃｍ^３／ｇの孔隙量を
有する。より大きな孔は拡散に対する制限がより少ないので、好ましくは、孔直
径は少なくとも約３０ｎｍである。孔周囲のより大きな表面積によるより大きな
潜在的容量のために、好ましくは、孔隙量は少なくとも約０．５ｃｍ^３／ｇであ
る。好ましい多孔性担体としては、粒子性担体またはビーズ担体が挙げられる。

【００１６】 顕著な利点のために、担体は好ましくは親水性であり、高分子量（好ましくは
約５０００を越える、より好ましくは約４０，０００を越える）を有する。好ま
しくは、親水性ポリマーは水膨潤性で、酵素のより深い浸潤を可能にする。かか
る担体の例としては、セルロース、改質セルロース、アガロース、ポリビニルア
ルコール（ＰＶＡ）、デキストラン、アミノ変性デキストラン、ポリアクリルア
ミド、変性ガーゴム、ガーゴム、キサンタンガム、およびローカストビーンガム
が挙げられる。

【００１７】 本発明の目的に有用であるためには、担体は、好ましくはスペーサー基によっ
て酵素基質との結合に使用できる反応性官能基を含む。好ましくは、反応性官能
基は、所望のスペーサー基と迅速にかつ直接共有結合して、誘導体化された担体
を形成できる。好ましくは、担体は、任意にスペーサー基によって酵素基質に化
学結合する、ヒドロキシル、カルボキシル、スルフヒドリル、またはアミノ基な
どの少なくとも１つの反応性官能基を含む。その他の適切な官能基としては、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルエステル、ヨードアセチル基
、アルデヒド、イミダゾリルカルバメート、および臭化シアン活性化担体が挙げ
られる。かかる官能基は、種々の公知の技術によって担体に提供できる。例えば
、ガラス表面は、公知の方法でアミノプロピルトリエトキシシランによって誘導
体化できる。

【００１８】 担体への酵素基質の結合において、カップリング剤が好ましくは使用される。
例えば、カップリング剤ＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エ
チルカルボジイミド塩酸塩）およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾ
ール水和物）は、酵素基質のカルボキシル基をアミノ変性担体のアミノ基に共有
結合させるのを助けることができる。かかるカップリング剤の使用については「
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」ＪｅｒｒｙＭａｒｃ
ｈ著、Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ、第四版、１９９２年、４２０〜
４２１ページに述べられている。

【００１９】 酵素基質を担体に結合するためにスペーサー基も使用できる。適切なスペーサ
ー基は、ヘキサメチレンジアミンなどの長鎖ジアミンを含む。

【００２０】 担体への酵素基質の固定化は、共有結合が好ましいが、静電気的に（すなわち
、イオン的に）起こりうる。例えば、固定化は、酵素基質（例えば１−ヒドロキ
シピレン−３，６，８−トリスルホネートで誘導体化したもの）の負に帯電した
スルホネート基と、固体担体として使用される陰イオン交換体の正に帯電した表
面アンモニウム基との間の相互作用によって起こりうる。

【００２１】 本発明で有用な特に好ましい反応性担体は、かかる担体の内側および／または
外側表面にアズラクトン官能基を有する担体である。かかる反応性基は、式、

【化１】 （式中、Ｒ_１およびＲ_２は独立して、（Ｃ１〜Ｃ１４）アルキル基、（Ｃ３〜Ｃ
１４）シクロアルキル基、（Ｃ５〜Ｃ１２）アリール基、３個までのＳ、Ｎ、お
よび非過酸化物Ｏヘテロ原子を任意に有する（Ｃ６〜Ｃ２６）アレニル基であり
、またはＲ_１およびＲ_２はそれらが結合した炭素と一緒になって４〜１２個の環
原子を含有する環状炭素を形成でき、ｎ＝０または１である。）のアズラクトン
官能基を有する。

【００２２】 アズラクトン官能性反応性担体が、一般に安定であるので、特に好ましい。そ
れらはまた、反応性官能基を有するその他の担体よりもより良好に、より少ない
副反応（例えば加水分解）で、急速にかつ直接酵素基質を任意にスペーサー基と
共役結合する。さらに、それらは求核剤との高い共有結合能を有する。アズラク
トン官能性反応性担体は、米国特許第５，５６１，０９７号（Ｇｌｅａｓｏｎら
）に開示されるような多数の方法によって製造することができる。

【００２３】 酵素基質 多種多様な酵素基質（ＥＳ）が使用できる。好ましくは、酵素基質は、反応が
担体へのＥＳの結合をもたらすように、例えば、固体担体のヒドロキシル、アミ
ノ、またはスルフヒドリル部分と相互作用できる、あるいはより好ましくは反応
できる基を含む。好ましくは、担体への結合機構は、ＥＳに作用する酵素の能力
を妨害しない、あるいは酵素の作用時に信号を生じるＥＳの能力を破壊しない。

【００２４】 酵素基質としては、酵素と反応して検出可能な信号を与えるものが挙げられる
。例としては、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、β−グルクロニダーゼ、
アルコール脱水素酵素またはその他のＮＡＤ酸化還元酵素、転移酵素、アルカリ
ホスファターゼまたはその他の加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、酸化酵素
、ジャイレース、核酸分解酵素（ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素）、およ
び制限酵素のための酵素基質が挙げられるが、これに限定されるものではない。
かかる酵素は細菌によって生産される。酵素基質は、典型的にポリペプチド、炭
水化物（例えば多糖類）、または脂肪酸誘導体でありうる。

【００２５】 適切な酵素基質は、好ましくは検出可能な標識を含む。かかる標識の例として
は、蛍光、ルミネッセンス、および色素産生標識が挙げられる。好ましい標識は
蛍光である。蛍光標識の例としては、クマリン、フルオレセイン、およびフルオ
レセイン誘導体が挙げられる。ルミネッセンス標識の例としては、アダマンチル
オキシラン誘導体が挙げられる。色素産生標識の例としては、サルフォフタレイ
ン、サルフォフタレイン誘導体、およびインドキシル化合物とそれらの誘導体が
挙げられる。

【００２６】 酵素基質の具体例としては、クマリン−４−酢酸７−Ｏ−カプリレート、クマ
リン−４−酢酸７−Ｏ−β−Ｄ−グルクロニド、およびマリン−４−酢酸７−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが挙げられる。

【００２７】 アズラクトン官能性付与固体担体によるクマリン−４−酢酸７−Ｏ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドの固定化は、次の構造、

【化２】 （式中、「Ｂ−Ｄ−」は「β−Ｄ−」を指す。）を有する。

【００２８】 このプロセスから得られる固定化染料は、脱アルキル酵素（ガラクトシダーゼ
など）のための合成反応体である。かかる酵素はエーテル基を開裂させ、それに
よって、固定化蛍光染料７−ヒドロキシ−クマリン−４−酢酸（すなわち、酢酸
官能性染料の誘導体）から信号を生じさせる。

【００２９】 合成酵素基質だけでなく、染料で標識された天然酵素基質も固体担体上に固定
化できる。例えば卵アルブミンリゾチームを固体担体上に固定化して、次に、蛍
光染料、例えばイソチオシアン酸フルオレセインで標識できる。酵素トリプシン
と接触すると、この酵素基質は分解して、フルオレセインおよびフルオレセイン
標識されたリゾチーム断片を放出するであろう。

【００３０】 細菌およびバクテリオファージ 本発明の方法および固定化酵素基質を使用して検出できる細菌タイプは、限定
されない。バクテリオファージの宿主になることができ、本発明に従って検出可
能な適切な標的細菌としては、エシェリヒア、エンテロバクター、サルモネラ、
ブドウ球菌、赤痢菌、リステリア、アエロバクター、クレブシエラ、プロテウス
、シュードモナス、連鎖球菌、クラミジア、ミコプラズマ、肺炎球菌、ナイセリ
ア、クロストリジウム、バシラス、コリネバクテリウム、ミコバクテリウム、カ
ンピロバクター、ビブリ（Ｖｉｂｒｉｏ）、セラチア、プロビデンシア、クロモ
バクテリウム、ブルセラ、エルシニア、ヘモフィルス、ビブリオ（Ｂｉｖｒｉｏ
）、およびボルデテラ属のものが挙げられるが、これに限定されるものではない
。かかる細菌は、本発明の方法において試薬としても使用できる。

【００３１】 本発明の方法および固定化酵素基質を使用して検出されるバクテリオファージ
タイプは、限定されない。宿主細菌と反応でき、本発明に従って検出可能適切な
標的バクテリオファージは、エシェリヒアファージ、エンテロバクターファージ
、サルモネラファージ、ブドウ球菌ファージ、赤痢菌ファージ、リステリアファ
ージ、好気菌ファージ、クレブシエラファージ、プロテウスファージ、シュード
モナスファージ、連鎖球菌ファージ、クラミジアファージ、ミコプラズマファー
ジ、肺炎球菌ファージ、ナイセリアファージ、クロストリジウムファージ、バシ
ラスファージ、コリネバクテリウムファージ、ミコバクテリウムファージ、カン
ピロバクターファージ、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）ファージ、セラチアファージ
、プロビデンシアファージ、クロモバクテリウムファージ、ブルセラファージ、
エルシニアファージ、ヘモフィルスファージ、ビブリオ（Ｂｉｖｒｉｏ）ファー
ジ、およびボルデテラファージが挙げられるが、これに限定されるものではない
。かかるファージは、本発明の方法で試薬としても使用できる。これらは典型的
にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴ
ＣＣ）から入手でき、あるいは自然界から単離でき、例えば、凍結乾燥ペレット
の形態で使用できる。

【００３２】 バクテリオファージを使用する細菌細胞の溶解時には、多種多様の酵素が生じ
る。放出された酵素は固定化酵素基質と反応して検出可能な信号を与える。例と
しては、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、β−グルクロニダーゼ、アルコ
ール脱水素酵素、またはその他のＮＡＤ酸化還元酵素、転移酵素、アルカリホス
ファターゼ、またはその他の加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、酸化酵素、
ジャイレース、核酸分解酵素（ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素）、および
制限酵素が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【００３３】 かかる溶解が起こるのに効果的な条件は、一般に当業者に周知である。かかる
条件は、Ｅ．Ｌ．Ｅｌｌｉｓら「Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｐｈａｇｅ」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２２、３６５（１９３９）に開
示されており、典型的に細菌の生育に適切な条件下での約３７℃の温度における
十分な時間を含む。

【００３４】 アッセイのタイプ 本発明の方法および固定化酵素基質は、種々のアッセイで使用できる。固定化
酵素基質は、標的細菌を検出するために、当該サンプルにバクテリオファージと
共に添加できる。選択されたバクテリオファージは、当該細菌に感染し、引き続
いてそれを溶解するものである。代案として固定化酵素基質は、標的バクテリオ
ファージを検出するために、当該サンプルに細菌と共に添加できる。選択された
細菌は、当該バクテリオファージに感受性の（すなわち、感染して溶解されうる
）ものである。

【００３５】 １つの実施態様では、標的バクテリオファージを検出する方法は、細菌を当該
サンプルと組み合わせて反応混合物を形成する工程と、当該サンプル中に存在す
る任意の標的バクテリオファージが細菌を溶解して酵素を放出させるのに効果的
な条件下で反応混合物を培養する工程と、固定化酵素基質を反応混合物に添加す
る工程と、固定化酵素基材と任意の存在する放出された酵素との相互作用から生
じる検出可能な信号について反応混合物をモニターする工程と、を含む。反応混
合物への固定化酵素基質の添加は、反応混合物の培養の前または後に行うことが
できる。

【００３６】 その他の実施態様では、標的細菌を検出する方法は、バクテリオファージを当
該サンプルと組み合わせて反応混合物を形成する工程と、バクテリオファージが
当該サンプル中に存在する任意の標的細菌を溶解して酵素を放出させるのに効果
的な条件下で反応混合物を培養する工程と、固定化酵素基質を反応混合物に添加
する工程と、固定化酵素基質と任意の存在する放出された酵素との相互作用から
生じる検出可能な信号について反応混合物をモニターする工程と、を含む。反応
混合物への固定化酵素基質の添加は、反応混合物の培養の前または後に行うこと
ができる。

【００３７】 これらの方法は、定性的または定量的測定を伴うことができる。バクテリオフ
ァージの定量的測定のためには、例えば反応混合物を適切な増殖培地上で平板培
養し、検出可能な信号を発する領域を数えることができる。かかる領域は、典型
的に十分な時間経過と共にプラーク（すなわち、細菌「ヘルパー細胞」植生の空
き地領域またはバクテリオファージ由来の不連続点）になる。プラーク検出のた
めの標準試験法は、「Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃ
ｏｌｉｐｈａｇｅｓ ｉｎ Ｗａｔｅｒ」ＡＳＴＭ名称Ｄ４２０１−８２（再認
可１９８９）に述べられている。

【００３８】 好ましくは、細菌の定量的アッセイはファージ増幅を伴い、プラークの形成を
観察することによって細菌を検出する。一般に、この方法は、バクテリオファー
ジを当該サンプルと組み合わせて反応混合物を形成する工程と、バクテリオファ
ージを当該サンプル中に存在する任意の標的細菌に感染させる工程と、抗ウイル
ス剤を添加して任意の細胞外バクテリオファージを不活性化する工程と、細菌ヘ
ルパー細胞を反応混合物に添加する工程と、固定化酵素基質を反応混合物に添加
する工程と、バクテリオファージが存在する任意の標的細菌と、細菌ヘルパー細
胞とを溶解して酵素を放出させるのに効果的な条件下で反応混合物を培養する工
程と、固定化酵素基質と存在する任意の放出された酵素との相互作用から生じる
検出可能な信号について反応混合物をモニターする工程と、を含む。標的細菌が
存在しない場合、バクテリオファージは全て抗ウイルス剤によって不活性化され
、細菌ヘルパー細胞の溶解は起こらないであろう。この方法は、定性的測定を伴
うこともできるが、好ましくはサンプル中の細菌の定量的測定のために使用でき
る。

【００３９】 固定化されたＥＳは、標的細菌のバクテリオファージ感染および引き続く細胞
壁の破壊（溶解）によって放出された細菌酵素と反応するが、固定化されたＥＳ
は、細菌細胞壁を越えて無傷の細菌細胞内にとどまる酵素と反応することはない
。従って、細菌「ヘルパー細胞」または非標的細菌からの妨害がほとんどまたは
全くなしに、固定化されたＥＳをアッセイの最終段階で利用して、元のサンプル
中の標的細菌の存在を示す信号を生成することができる。

【００４０】 適切な細菌ヘルパー細胞は、標的細菌と同じでも異なってもよい。好ましくは
、選択されたバクテリオファージによって感染できるように、それらは標的細菌
の近縁種である。細菌ヘルパー細胞の例としては、標的細菌および試薬細菌につ
いて上で列挙したものが挙げられる。

【００４１】 ファージ増幅は、当業者には公知の多種多様の培地上で起こりうる。典型的に
、培地は、炭水化物などの炭素源、およびアミノ酸またはタンパク質加水分解産
物などの窒素源をはじめとする種々の栄養素を含む。代案として、増幅は、米国
特許第５，９５８，６７５号（Ｗｉｃｋｓら）に開示される「ＰＥＴＲＩＦＩＬ
Ｍ」装置などの固形物または半固形物培養装置上で起こりうる。

【００４２】 また、本方法および固定化酵素基質は、１９９９年１１月５日に出願された米
国特許出願第０９／４３４，５８６号（Ｗｉｃｋｓら）に開示される、シールを
活性化すると２つのチャンバーが連絡する活性化できるシール（すなわち、漏れ
を防止するように２つの区画を分割するバルブなどの構成部品）で分割された、
少なくとも２つのチャンバーを含む装置に組み込むことができる。好ましくは、
この装置は、その他の構造物（例えば、長方形または環状チューブ、平坦基板上
の溝、または微細複製構造）も想定されるが、種々の断面形状を有することがで
きるチューブ形態である。

【００４３】 好ましい実施態様では、バクテリオファージを試験サンプルに添加して試験サ
ンプル中の標的細菌に感染させる工程と、細胞外バクテリオファージを抗ウィル
ス剤（または細胞外バクテリオファージを殺すのに適した第一鉄塩、第一銅塩、
葉の抽出物、ザクロ果皮抽出物、および有機酸などの抗ウイルス剤の混合物）で
殺す工程と、抗ウイルス剤を（例えば緩衝液で）中和する工程と、固定化された
ＥＳを添加する工程と、得られた混合物を細菌ヘルパー細胞の植生存在下で培養
することによりバクテリオファージを増幅する工程と、を含む細菌（標的細菌）
の検出において、装置が使用される。終点としてプラーク形成を使用する（そし
てＥＳを使用しない）かかるファージ増幅アッセイは当業者に公知であり、米国
特許第５，４９８，５２５号（Ｒｅｅｓら）に開示されている。本発明の実施例
４に述べるような固定化されたＥＳ存在下における蛍光信号の出現は、試験サン
プルが標的細菌を含有したことの指標である。蛍光信号の形成をもたらすアッセ
イは、典型的に約４時間から約６時間内で迅速に判読でき、必要ならば２４時間
で確認できる。細菌を数える従来の方法は、通常約２４時間〜約４８時間の生育
を必要とする。

【００４４】 実施例１ 不溶性担体に結合した酵素基材 この実験の目的は、不溶性担体（アズラクトンビーズ）に共有結合した酵素基
質（クマリン−４−酢酸７−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を調製すること
にある。

【００４５】 アズラクトンビーズ（イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．）のサンプル（１０ｇ）を１，６−ヘキサンジアミンで（米国特
許第５，５６１，０９７号の実施例１１に述べられるように）誘導体化して、各
アズラクトン部位に遊離アミノ基を提供した。アズラクトンビーズ懸濁液１ｍｌ
あたりおよそ４１ミリモルのアミン当量を使用した。誘導体化したアズラクトン
ビーズサンプル（２００ｍｇ）を、蛍光原基質クマリン−４−酢酸７−Ｏ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド（１０ｍｇ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ）、
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（５．４ｍｇ、ウィスコンシン州ミ
ルウォーキーのＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、および１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（７ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
全てのＤＭＦ溶液に添加して、３ｍｌの総容積を得た。得られた混合物を室温で
５日間、試験管振盪機で絶え間なく振盪した。上澄み液を廃棄してビーズを大量
の水で洗浄し、水（１ｍｌ）に再懸濁した。得られた懸濁液は非常にわずかな蛍
光を示し、懸濁液を遠心分離した後は、蛍光の全てはビーズペレットに保持され
た。遠心分離からの上澄み液は、精製酵素β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）
を添加した際に、バックグラウンドに対して蛍光信号を与えなかった。しかし、
新鮮な緩衝液（バターフィールド緩衝液、ペンシルベニア州ピッツバーグのＦｉ
ｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁したビーズペレットにβ−ｇａｌを
添加した際には、非常に強い蛍光信号が観察された。

【００４６】 実施例２ 大腸菌細胞およびバクテリオファージ存在下で不溶性担体に結合した酵素基質 この実験の目的は、バクテリオファージの存在または不在下の両方において、
大腸菌細胞存在下で不溶性担体に付着した酵素基質から生じた蛍光信号を観察す
ることにあった。

【００４７】 （実施例１で述べたように）不溶性アズラクトンビーズ担体に共有結合した酵
素基質クマリン−４−酢酸７−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドのサンプル（５
０ｍｇのビーズ）を、初期濃度およそ１０^８細胞／ｍｌで大腸菌６２５細胞（イ
リノイ州シカゴハイツのＳｉｌｌｉｋｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有
するバターフィールド緩衝液（１ｍｌ、ｐＨ７、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ）に添加した。得られた混合物を、大腸菌細胞を溶解できるバクテリオフ
ァージＲＢ３３（１０^６個のファージ、Ｔ４ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ワシント
ン州オリンピアのＥｖｅｒｇｒｅｅｎ Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ）の存在ま
たは不在下の両方で、３７℃で６〜１０時間培養した。バターフィールド緩衝液
培地中の基質ビーズのみのサンプルも同様に培養したところ、蛍光信号をほとん
ど示さなかった。大腸菌細胞を含有するがバクテリオファージを含有しない培養
した培地は、低いバックグラウンドレベルの蛍光を示したにすぎなかった。大腸
菌細胞およびバクテリオファージを含有する培養した培地は、より高いレベルの
蛍光を示した。このより高いレベルの蛍光は、バクテリオファージによる大腸菌
細胞の溶解と、引き続く残留β−ｇａｌ酵素の放出に起因する。次に酵素はビー
ズ担持型酵素基質の加水分解を触媒して、強い蛍光信号を発する加水分解生成物
を生じることができる。

【００４８】 実施例３ 大腸菌細胞存在下における結合基質と非結合（遊離）基質との比較 この実験の目的は、不溶性担体（アズラクトンビーズ）に共有結合した酵素基
質（クマリン−４−酢酸７−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）が、溶液中の遊
離クマリン−４−酢酸７−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドと比べて、わずかな
または低レベルの蛍光信号しか生じないことを示すことにある。

【００４９】 （実施例１で述べたように）不溶性アズラクトンビーズ担体に共有結合した酵
素基質クマリン−４−酢酸７−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドのサンプル（約
２００ｍｇのビーズ）を５００μｌの滅菌水に懸濁し、次にこの懸濁液１００μ
ｌを９６ウェルプレート（Ｃｏ−Ｓｔａｒ、イリノイ州シカゴのＶ．Ｗ．Ｒ．）
の５個の各ウェルに添加した。酵素基質の加水分解が約４０００比蛍光単位（Ｒ
ＦＵ）の蛍光信号を与えるように、ビーズの量を選択した。その他のウェルには
、ビーズを含有しない遊離クマリン−４−酢酸７−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（５０μｇ／ｍｌ）を満たした。次に大腸菌６５０または大腸菌６５１細胞
（各細菌の終夜培養液１ｍｌを遠心分離し、バターフィールド緩衝液で２回洗浄
して、５００μｌの新鮮なＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブイヨンに再懸
濁して調製された）のどちらかの１００μｌアリコットをサンプルウェルに添加
した。次にウェルプレートを３７℃で６時間まで培養した。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｍｏｄｅｌ ７６２０蛍光マイクロプレートリーダ
ー（マサチューセッツ州ボストンのＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ）を使用して、各ウェルの蛍光の変化を測定した。酵素基質に共有結合したビ
ーズを含有するウェルは蛍光をほとんどまたは全く生じなかったのに対し、溶液
中に遊離酵素基質を含有したものは蛍光信号に顕著な増大を示した（表１参照）
。

【００５０】

【表１】

【００５１】 実施例４ 固定化酵素基質を使用した細菌の検出 米国特許出願第０９／４３４，５８６号（Ｗｉｃｋｓら）の実施例３に述べら
れるように、別個のチャンバーＡ、Ｂ、ＣおよびＤを有するファージ増幅装置（
ＰＡＤ）を構築する。中心のチャンバーＢおよびＣは、抗ウイルス剤構成成分を
含有する。構築に続いて凍結乾燥大腸菌ペレットＡＴＣＣ １３７０６細菌（お
よそ１×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ）をチャンバーＤに添加して、細菌「ヘルパー細胞
」とする。さらに、（実施例１で述べたように）不溶性アズラクトンビーズ担体
に共有結合した酵素基質クマリン−４−酢酸７−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドのサンプル（５０ｍｇのビーズ）をチャンバーＤに添加する。チャンバーＡは
試験サンプルを入れるために空のままにして、最初は全てのバルブを「閉位置」
にセットする。

【００５２】 ＰＡＤのチャンバーＡがおよそ０．１ｍｌの培養液を含有するように、１×１
０^８ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌ＡＴＣＣ １３７０６を含有する終夜培養液をＬａｍ
ｂｄａ緩衝液中で１０倍毎に段階希釈する（米国特許第５，４９８，５２５号（
Ｒｅｅｓら）の実施例４に述べられるように）。このサンプルに１×１０^１１ｐ
ｆｕ／ｍｌを含有するバクテリオファージ［Ｐｈｉ Ｘ １７４（ＡＴＣＣ １
３７０６−Ｂ１）］の栄養ブイヨン（製品番号４３１１４７９、メリーランド州
コッキースビルのＢＢＬ）懸濁液１０μｌを添加する。培養器内において３７℃
で１０分間、バクテリオファージを細菌細胞に吸着させる。次にバルブ１（チャ
ンバーＢおよびＣの間）を開けて、チャンバーＢおよびＣの抗ウイルス剤構成成
分を２３℃で２分間混合させる。次にバルブ２（チャンバーＡおよびＢの間）を
開けて、抗ウイルス剤溶液をチャンバーＡの内容物と２３℃で５分間混合して、
未吸着のバクテリオファージを不活性化する。次にバルブ３（チャンバーＣおよ
びＤの間）を開け、得られた溶液をチャンバーＤ内の細菌「ヘルパー細胞」ペレ
ットおよび固定化酵素基質と２３℃で５分間混合して、その溶液を中和する。次
にＰＡＤを６時間まで２３℃で培養し、蛍光の変化を測定する。蛍光信号は、元
の培養物中の大腸菌の指標である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クレイカレック，ゲイリー イー． アメリカ合衆国，ミネソタ 55133−3427， セント ポール，ピー．オー．ボックス 33427 (72)発明者 ウィックス，ジェイムズ エイチ． アメリカ合衆国，ミネソタ 55133−3427， セント ポール，ピー．オー．ボックス 33427 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ06 QQ10 QR41 QR51 QR57 QR66 QR75 QR79 QR82 QS24 QS36 QX02

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標的バクテリオファージを検出する方法であって、細菌を当
   該サンプルと組み合わせて反応混合物を形成する工程と、 当該サンプル中に存在する任意の標的バクテリオファージが細菌を溶解して酵
   素を放出させるのに効果的な条件下で反応混合物を培養する工程と、 固定化酵素基質を反応混合物に添加する工程と、 固定化酵素基質と任意の存在する放出された酵素との相互作用から生じる検出
   可能な信号について反応混合物をモニターする工程と、 を含む方法。
2. 【請求項２】 固定化酵素基質を反応混合物に添加する工程が、反応混合物
   を培養する前に起こる、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 反応混合物をモニターする工程が、サンプル中に存在する標
   的バクテリオファージの量を定量的に測定する工程を含む、請求項１に記載の方
   法。
4. 【請求項４】 サンプル中に存在するバクテリオファージの量を定量的に測
   定する工程が、細菌、固定化酵素基質および当該サンプルの反応混合物を増殖培
   地上で平板培養して、検出可能な信号を発する領域を数える工程を含む、請求項
   ３に記載の方法。
5. 【請求項５】 酵素基質が、クマリン−４−酢酸７−Ｏ−カプリレート、ク
   マリン−４−酢酸７−Ｏ−β−Ｄ−グルクロニドおよびクマリン−４−酢酸７−
   Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの群から選択される、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 細菌が、エシェリヒア、エンテロバクター、サルモネラ、ブ
   ドウ球菌、赤痢菌、リステリア、好気菌、クレブシエラ、プロテウス、シュード
   モナス、連鎖球菌、クラミジア、ミコプラズマ、肺炎球菌、ナイセリア、クロス
   トリジウム、バシラス、コリネバクテリウム、ミコバクテリウム、カンピロバク
   ター、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、セラチア、プロビデンシア、クロモバクテリ
   ウム、ブルセラ、エルシニア、ヘモフィルス、ビブリオ（Ｂｉｖｒｉｏ）および
   ボルデテラの群から選択される、請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 固定化酵素基質が固体担体およびそれと共有結合した酵素基
   質を含む、請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 固体担体がアズラクトン官能性固体担体を含む、請求項７に
   記載の方法。
9. 【請求項９】 検出可能な信号が、蛍光信号、ルミネッセンス信号、または
   色素産生信号である、請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 検出可能な信号が蛍光信号である、請求項９に記載の方法
    。
11. 【請求項１１】 標的細菌を検出する方法であって、バクテリオファージを
    当該サンプルと組み合わせて反応混合物を形成する工程と、 バクテリオファージが当該サンプル中に存在する任意の標的細菌を溶解して酵
    素を放出させるのに効果的な条件下で反応混合物を培養する工程と、 固定化酵素基質を反応混合物に添加する工程と、 固定化酵素基質と任意の存在する放出された酵素との相互作用から生じる検出
    可能な信号について反応混合物をモニターする工程と、 を含む方法。
12. 【請求項１２】 固定化酵素基質を反応混合物に添加する工程が、反応混合
    物を培養する前に起こる、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 反応混合物をモニターする工程が、サンプル中に存在する
    標的細菌の量を定量的に測定する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 酵素基質が、クマリン−４−酢酸７−Ｏ−カプリレート、
    クマリン−４−酢酸７−Ｏ−β−Ｄ−グルクロニドおよびクマリン−４−酢酸７
    −Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの群から選択される、請求項１１に記載の方
    法。
15. 【請求項１５】 バクテリオファージが、エシェリヒアファージ、エンテロ
    バクターファージ、サルモネラファージ、ブドウ球菌ファージ、赤痢菌ファージ
    、リステリアファージ、好気菌ファージ、クレブシエラファージ、プロテウスフ
    ァージ、シュードモナスファージ、連鎖球菌ファージ、クラミジアファージ、ミ
    コプラズマファージ、肺炎球菌ファージ、ナイセリアファージ、クロストリジウ
    ムファージ、バシラスファージ、コリネバクテリウムファージ、ミコバクテリウ
    ムファージ、カンピロバクターファージ、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）ファージ、
    セラチアファージ、プロビデンシアファージ、クロモバクテリウムファージ、ブ
    ルセラファージ、エルシニアファージ、ヘモフィルスファージ、ビブリオ（Ｂｉ
    ｖｒｉｏ）ファージおよびボルデテラファージの群から選択される、請求項１１
    に記載の方法。
16. 【請求項１６】 固定化酵素基質が固体担体およびそれと共有結合した酵素
    基質を含む、請求項１１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 固体担体がアズラクトン官能性固体担体を含む、請求項１
    ６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 検出可能な信号が、蛍光信号、ルミネッセンス信号、また
    は色素産生信号である、請求項１１に記載の方法。
19. 【請求項１９】 検出可能な信号が蛍光信号である、請求項１８に記載の方
    法。
20. 【請求項２０】 標的細菌を検出する方法であって、バクテリオファージを
    当該サンプルと組み合わせて反応混合物を形成する工程と、 バクテリオファージを当該サンプル中に存在する任意の標的細菌に感染させる
    工程と、 抗ウイルス剤を添加して任意の細胞外バクテリオファージを不活性化する工程
    と、 細菌ヘルパー細胞を反応混合物に添加する工程と、 固定化酵素基質を反応混合物に添加する工程と、 バクテリオファージが存在する任意の標的細菌と、細菌ヘルパー細胞とを溶解
    して酵素を放出させるのに効果的な条件下で反応混合物を培養する工程と、 固定化酵素基質と存在する任意の放出された酵素との相互作用から生じる検出
    可能な信号について反応混合物をモニターする工程と、 を含む方法。
21. 【請求項２１】 反応混合物をモニターする工程が、サンプル中に存在する
    標的細菌の量を定量的に測定する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 サンプル中に存在するバクテリオファージの量を定量的に
    測定する工程が、細菌ヘルパー細胞、固定化酵素基質および当該サンプルの反応
    混合物を増殖培地上で平板培養して、検出可能な信号を発する領域を数える工程
    を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 多孔性固体担体およびそれと共有結合した酵素基質を含む
    、固定化酵素基質。
24. 【請求項２４】 酵素基質が、クマリン−４−酢酸７−Ｏ−カプリレート、
    クマリン−４−酢酸７−Ｏ−β−Ｄ−グルクロニドおよびクマリン−４−酢酸７
    −Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの群から選択される、請求項２１に記載の固
    定化酵素基質。
25. 【請求項２５】 固体担体がアズラクトン官能性固体担体を含む、請求項２
    １に記載の固定化酵素基質。
26. 【請求項２６】 固体担体がアズラクトン官能性ビーズを含む、請求項２３
    に記載の固定化酵素基質。