DE19617338A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Identifikation von Mikroorganismen, Pilzen und Kleinstlebewesen mit Indikatorkugeln - Google Patents

Description

Die Vorrichtung der Indikatorkugel

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Kunststoffkugeln, den Oberflächen mit Indikatormolokülen zur Identifikation von Mikroorganismen bestückt sind.

Eine Vielzahl von lebensbedrohlichen Krankheiten werden von Bakterien verursacht. Daher ist die genaue mikrobielle Diagnostik die Grundlage für eine schnelle und erfolgversprechende Therapie.

Zur Identifikation pathogener Keime werden üblicherweise mit festen oder halbfesten Nährmedien gefüllte Kunststoffbehälter, sogenannte Agarplatten, eingesetzt. Die Probe wird auf die entsprechenden Platten manuell aufgetragen (Animpfung). Die Bakterien wachsen und geben dabei Stoffwechselprodukte an das Medium ab. Diese Metaboliten werden durch Indikatorsubstanzen nachgewiesen. In der Regel tritt ein Farbumschlag auf, der vom Labormediziner bewertet wird. Mit derselben Probe wird der Vorgang auf verschiedenen Indikatorplatten wiederholt (Bunte Reihe), bis aus der Kombination der Einzelergebnisse auf die Bakterienspezies geschlossen werden kann. Der Krankheitskeim ist charakterisiert.

Der entscheidende Nachteil dieses Verfahrens ist der hohe Aufwand an wertvoller Zeit und Material. Oft muß eine Vielzahl von Nährmedienbehältern angeimpft werden (8-15 pro Bunte Reihe). Das kostet Zeit. Viele Behälter sind teuer.

Das bisheriger Verfahren ist zeitintensiv. Führt ein Set von Messungen nicht zu einem ein­ deutigen Ergebnis, muß die Bunte Reihe entweder wiederholt oder neu kombiniert werden. Die Bakterien müssen erneut anwachsen und sich solange vermehren, bis ihre Metaboliten­ konzentration die Nachweisgrenze überschritten hat. Da bis zur Auswertung der ersten Meßreihe Stunden bis Tage vergehen, die folgende Meßreihe entsprechend länger dauert, geht bis zur optimalen Behandlung des Patienten oft wertvolle Zeit verloren.

Mit jeder Beimpfung steigt außerdem das Risiko für den Laboranten, sich trotz aller Vorkehrungen selbst zu infizieren.

Die bisherige Methode ist überdies platzintensiv, da eine Vielzahl von Nährmedienbehältern beimpft werden müssen. Die Behälter müssen von der Sterilbank in den Wärmeschrank und zurück transportiert werden, dabei steigt die Unfallgefahr (Unbeabsichtigtes öffnen einer kontaminierten Platte, Infektionsrisiko) an.

Die Vielzahl der durchzuführenden Tests verursacht zunehmenden klinischen Abfall.

Die bisher eingesetzte mikrobielle Diagnostik ist mit einem hohen manuellen Arbeitsaufwand verbunden. Der Beimpfungsprozeß sowie die Auswertung der Ergebnisse sind nicht automati­ sierbar, durch den manuellen Einsatz vergeht wertvolle Zeit bis zur Diagnose.

Ein weiterer Nachteil ist in der Auswertung selbst zu sehen. Es gibt kaum Kontrollinstrumente, die Auswertung ist nicht standardisierbar.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht darin, die für die Diagnostik von Krankheitskeimen notwendigen Untersuchungen zu vereinfachen, zu beschleu­ nigen und für das Laborpersonal sicherer zu gestalten. Ebenso sollte die Erfindung den Einsatz von Standardgeräten zur automatischen oder halbautomatischen Auswertung erlauben.

Diese Aufgabe wird mit der beschriebenen Indikatorkugel gelöst.

Der Kern der Lösung besteht mit anderen Worten darin, daß kleine Kugeln (1) (Durchmesser 5 nm bis 10 mm) an ihrer Oberfläche mit einer Schicht aus in der Regel genau einem Typ von Indikatormolekülen (3) an Bindungsstellen (2) verbunden sind (Abb. 4.1.1).

Die Indikatorkugeln werden in eine bebrütete Flüssigkultur von Mikroorganismen, Pilzen oder Kleinstlebewesen gegeben, die Indikatoren reagieren i.d.R sofort mit den bakterientypischen Metaboliten (4) und charakterisieren dadurch den Krankheitskeim.

Die Indikatormoleküle sind mit der Kugeloberfläche dauerhaft verbunden. Die Ausgestaltung der Erfindung sieht an speziellen Bindungsstellen eine kovalente Bindung, eine Ionenbindung oder ausreichende Adhäsionskräfte vor. Dadurch wird gewährleistet, daß durch mechanische Einflüsse (Schütteln der Kulturflasche, nachfolgende Wasch- oder Resuspensionsschritte) die Anzahl der aktiven und an die Kugeloberfläche gebundenen Indikatoren unverändert bleibt.

Die Erfindung sieht einen Bindungstyp vor, der die Reaktivität der Indikatormoleküle nach der Anbindung an die Kugel nicht beeinflußt. Auf diese Weise wird die Funktionalität der Indikatoren sichergestellt.

Die Erfindung sieht weiterhin vor, daß solche Indikatoren gewählt werde, die mit den bakteriell umgesetzten Edukten (Glukoseabbau), den freigesetzten Stoffwechselprodukten (Karbonsäuren, Alkoholen etc.) oder den freigesetzten Proteinen (Exoenzymen, Toxine, etc.) in Wechselwirkung treten können.

Sie erfahren dabei eine Änderung ihres Absorptions- oder des Emissionsverhaltens. Mit anderen Worten: Es tritt ein charakteristischer Farbumschlag oder eine Floureszensveränderung auf, der bzw. die meßbar ist.

Die Anordnung der Indikatormoleküle auf Kugeloberflächen erweist sich bei der hier beschriebenen Vorrichtung als besonders vorteilhaft, da die Signaldichte pro Oberfläche wesentlich höher als in einer Suspension mit der gleichen Anzahl von Indikatormolekülen ist. Pumpt man die zu untersuchende Suspension durch eine Meßkapillare, werden im ersten Fall wenige, aber sehr starke Signale gemessen, die in jedem Fall auswertbar sind.

Wird die Suspension mit nicht kumulierten Indikatoren in derselben Kapillare vermessen, so erhält man ein gleichbleibendes, aber sehr schwaches und damit kaum auswertbares Signal. Der Vorteil der Indikatorkugel besteht also in einer Verstärkung des Meßsignals bei gleich­ bleibender Indikatorkugel. Die Messung wird genauer.

Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, eine Kombination von verschiedenen Indikatorkugeln in einer Meßprobe zu verwenden. Dabei müssen Indikatoren gewählt werden, deren spektrale Kennlinien sich so weit unterscheiden, das eine sichere Zuordnung der Spektrallinien zu dem entsprechenden Indikator möglich ist.

Die Erfindung sieht weiterhin vor, das mit einem definierten Kugeldurchmesser in der Regel nur genau ein Indikatortyp verbunden ist. Dadurch ergeben sich folgende Vorteile:
Bei der optischen Messung einer Suspension von Kugeln in einer Flüssigkeit tritt an der Kugeloberfläche eine Lichtstreuung auf. Diese Lichtstreuung hängt in erster Linie von dem Kugeldurchmesser ab und beeinflußt das Spektrum geringfügig. Verwendet man mehrere Indikatoren einheitlichem Durchmesser in mit einer Probe, kann dieser Effekt vernachlässigt werden. Eine saubere Auswertung ist möglich, sofern sich die Indikatorkennlinien weit genug unterscheiden. Die Messung wird vereinfacht.

Unterscheiden sich zwei wichtige Indikatoren in ihren Kennlinien aber nur geringfügig, und ist ihre beider Anwesenheit zur Diagnose unbedingt erforderlich, so tritt der Faktor Kugeldurchmesser als wichtiges Differenzierungsmerkmal in den Vordergrund. Ist nun Indikator A mit einer kleinen Kugel verbunden und Indikator B mit einer großen Kugel, so kann bei einer doppelt positiven Reaktion keine sichere Differenzierung aufgrund der Kennlinien vorgenommen werden. Mißt man aber neben der Kennlinie auch das Streulicht (d. h. den Kugeldurchmesser) als zweiten Parameter, so ist wiederum eine eindeutige Zuordnung von positiv A auf kleiner Kugel und positiv B auf großer Kugel möglich. Dadurch erhöht sich das Maß an frei wählbaren Kombination genauso wie das Maß an dedektierbaren Bakterienarten. Die Erfindung ist sehr flexible einsetzbar.

Ein weitere Ausgestaltung sieht vor, daß sehr kleine Kugeln verwendet werden. Ihr Durchmesser liegt im Mikrometerbereich. Da eine Vielzahl kleiner Kugel eine größere reaktive Oberfläche als wenige große Kugeln hat, steigt die Wahrscheinlichkeit eines Kontaktes mit den Metaboliten. Der Vorteil ist eine schneller Reaktion und damit eine weit schnellere Diagnose, die dem Arzt erlaubt, ebenso schnell zu handeln.

Weiterhin ist vorgesehen, die Indikatorkugeln in eine Flüssigkeit zu suspendieren. Damit ergibt sich ein wesentlicher Vorteil der Erfindung gegenüber der herkömmlichen Diagnosetechnik auf festen Nährböden. Die Indikationssuspension kann pipettiert oder gepumpt werden. Damit ist diese Technik automatisierbar und wesentlich effizienter anzuwen­ den als die heute angewendete Methode. Ebenso verringert sich die Gefahr von manuellen Fehlern (z. B. Verwechslungen) im Routinebetrieb.

Der Vorteil der Erfindung liegt auch darin, daß die Kugeln in der Flüssigkeit hin- und her diffundieren bzw. bewegt werden können (Schütteln der Kulturflasche). Da auch die löslichen Metaboliten in einer Flüssigkeit diffundieren, treffen sich Reagenz und Indikator mit einer weit größeren Wahrscheinlichkeit als in den üblichen Nährmedienbehältern. Hier sind die Indikatoren fest im gallertartigen Nährmedium eingebettet, nur die Metaboliten sind mobil. Die Diffusion von Metaboliten zu Indikatoren ist einseitig und dauert länger. Der Vorteil des hier beschriebenen Erfindung liegt also auch in der schnelleren Auswertung.

Beispiel Lipase-Indikatorkugel

An käuflichen Kugeln (1) (Abb. 1) der Firma Dynax, Durchmesser 100 nm werden Flouresceindiacetat-Moleküle als Indikatoren (2) über eine Bindungsstelle (3) durch Ketogruppen an der gesamten Kugeloberfläche kovalent gebunden. Fluoresceindiacetat weist eine hydrolysierbare Esterbindung auf, die von Lipasen (4) erkannt wird. Lipasen sind typische Exoenzyme der Gattung Pseudomonas.

Die Indikatorkugeln fluoreszieren im inaktiven Zustand (3a) nicht. Nach der Zugabe zu einer Flüssigkultur von Pseudomonas treten die Indikatoren mit der Lipase des Bakteriums in Wechselwirkung. Das Enzym wird interfacial aktiviert. Durch die Spaltung einer charakteri­ stischen Esterbindung wird das Fluorogen Fluoresceindiacetat aktiviert (3b) und in einen Fluoreszenzfarbstoff umgewandelt. Bei einer Bestrahlung mit Licht der Wellenlänge 490 nm beginnt die Kugel grün zu leuchten (Emissionswellenlänge 520 nm). Die Spektralverschiebung ist in handelsüblichen Meßgeräten nachweisbar, das Bakterium kann identifiziert werden.

Verfahren zur Messung mit Indikatorkugeln

Bei dem erfindungsgemäßen werden die erfindungsgemaßen Verfahren wird durch den kenn­ zeichnenden Teil des Patentanspruches 2 beschrieben Indikatorkugeln in beliebiger Kombination zu einer Flüssigkulturflasche mit Mikroorganismen gegeben werden. Schon nach kurzer Reaktionszeit ist eine Identifikation der gesuchten Metaboliten durch die spektrale Veränderung der Indikatoren auf den Kugeln möglich. Damit können z. B. Bakterien schnell und sicher bestimmt werden.

Bisher wurden zur Charakterisierung eine Bakterienspezies etwa 8 Agarplatten angeimpft (Abb. 4.2.1). Nun erfüllt eine Flüssigkultur, in die 8 verschiedene Indikatorkugeln gegeben werden, denselben Zweck. Das spart Zeit und reduziert den klinischen Abfall. Die Reaktion zwischen Metaboliten und Indikatorkugeln erfolgt schnell. Die Messung der Farb- oder Fluoreszensänderung kann automatisch im Fluorimeter oder Photometer erfolgen. Die Ergebnisse sind wesentlich besser reproduzierbar als bei einer manuellen Auswertung. Die mikrobielle Diagnose wird sicherer.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sieht das Verfahren Kontrollmöglichkeiten vor (Abb. 4.2.2), die einfach und vollautomatisch durchführbar sind. Dazu müssen die Kulturflaschen nicht geöffnet werden. Bisher wurde auf Kontrollen aufgrund des hohen Arbeitsaufwandes weitgehend verzichtet. Das Verfahren bietet die Möglichkeit, einfach und schnell das ermittelte Ergebnis zu kontrollieren.

Dazu sind 3 Ansätze notwendig: Meßprobe mit Indikatorkugeln (runde Symbole) (1), bakteri­ elle Metaboliten (eckige Symbole) und Flüssignährmedium (grau), Blindprobe 1 mit Indikatorkugeln und Flüssignährmedium (2), Blindprobe 2 mit bakteriellen Metaboliten und Flüssignährmedium (3).

Zuerst wird die Probe mit bakteriellen Metaboliten, Flüssignährmedium und Indikatorkugeln spektral analysiert. Im Anschluß wird das reine Flüssigmedium mit Indikatorkugel vermessen und vom Meßprobenspektrum abgezogen.

Dadurch wird der Spektralanteil des Füssigmediums eliminiert. Dann wird das Spektrum der Bakterienkultur vom Meßergebnis abgezogen. Bakterien selbst können farbig oder fluoreszent sein und das Ergebnis verfälschen. Übrig bleibt ein sauberes Meßergebnis, daß den gesuchten Einfluß der Metabolite auf die Indikatorkugeln wiedergibt. Die Messung wird genauer. Durch einen Vergleich der Ergebnisse mit einer geeigneten Eichkurve kann eine qualitative und quantitative Bakterienbestimmung erfolgen, aus der sich zwei Aussagen ergeben: Welches Bakterium befindet sich in der Patientenprobe und wie hoch war seine Konzentration?! Der behandelnde Arzt gewinnt so Erkenntnisse über Kranheitsursache und augenblicklichen Stand der Infektion. Er kann gezielt handeln.

Eine besondere Ausgestaltung der Erfindung beschreibt eine Erhöhung der Meßgenauigkeit durch eine Konzentration der Indikatorkugeln in einem kleinere Volumen als dem Gesamtvolumen. Die Indikatorkugeln sind größer und schwerer als Bakterien (Abb. 4.2.3, bakterielle Metaboliten bzw. Bakterien als eckige Symbole, die Indikatorkugel als runde Symbole).

Wird die Probe geeignet zentrifugiert (1), befinden sich die Kugeln in Pellet (2), die Bakterien im Überstand. Sie werden verworfen (3). Nun wird die Probe mit einem kleinen Volumen resuspendiert und gemessen (4). Wird die Probe geeignet filtriert, befinden sich die Kugeln in Retentat und die Bakterien im Permeat. Sie werden ebenfalls verworfen. Die Kugeln werden in einem kleineren Volumen resuspendiert.

In beiden Fällen erhöht sich die Menge an Indikatorkugeln pro Volumen. Dadurch wird daß Meßsignal entsprechend verstärkt. Der Vorteil dieser Technik ist, daß a.) geringere Metaboliten- bzw. Bakterienkonzentrationen nachgewiesen werden können. Das Verfahren ist sensibler. Ein weiter, wichtiger Vorteil ist, daß b.) durch einen einzigen Zentrifugationsschritt die Gesamtanalysezeit erheblich verkürzt werden kann. Die effektive Nachweisgrenze wird durch Kugelkonzentration eher erreicht.

Eine besondere Ausgestaltung des Verfahrens sieht vor, daß bei einer nicht-eindeutigen Identifikation der Bakterienspezies weitere Indikatorkugeln mit anderen Oberflächenmarkern zu den schon bestehenden Testansätzen hinzugegeben werden können. Dies kann solange geschehen, bis die Spezies eindeutig identifiziert worden ist. Vorteil dieses neuen Verfahrens ist, daß dieselben Testansätze weiterverwendet werden können.

Bisher mußten bei uneindeutigen Tests die Animpfung und Inkubation auf anderen Indikatorkombinationen auf neuen Nährmedienbehältern wiederholt werden (2. Bunte Reihe). Bis das Bakterienwachstum und die damit verbundene nachweisbare Metabolitenkonzentration die Nachweisgrenze erneut erreicht hat, vergehen Stunden bis Tage. Die hier beschriebene Erfindung verzichtet auf eine erneute Animpfung, da die Zusatzmessung durch Zugabe beliebig vieler Indikatorkugeltypen direkt erfolgen kann. Das spart Zeit und kann Menschenleben retten.

Beispiel Verfahren zur Messung mit Lipase-Indikatorkugeln

Zur Identifikation der Gattung Pseudomonas, die schwere Lungenkrankheiten verursachen kann, werden drei Meßflaschen mit Flüssignährmedium befüllt. Flasche 1 und 2 bleiben unverändert. Sie dienen als Blindprobe. Flasche 3 wird mit den Bakterien angeimpft. Flasche 3 dient als Meßprobe. Die Flaschen werden 48 h bei 38°C inkubiert, die Bakterien wachsen und setzen Lipase frei. Die Bakterienkonzentration kann photometrisch bei 520 nm kontrolliert werden, ohne die Kultur zu öffnen.

Nun werden die zuvor beschriebenen Indikatorkugeln in Flasche 1 und 3 gegebenen. Alle Flaschen werden 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt.

In Flasche 1 zeigt sich keine Grünfluoreszenz bei 490 nm Anregungslicht, Flasche 2 weist schwache Fluoreszenz auf während Flasche 3 stark grün fluoresziert.

Zur Auswertung wird nun vom Fluoreszensspektrum der Flasche 3 das der Flaschen 1 und 2 abgezogen. Dadurch wird das mögliche Fluoreszenzspektrum des Flüssigmediums selbst berücksichtigt (Flasche 1) sowie der Einfluß des Flüssignährmediums auf die Indikatorkugeln ohne bakterielles Enzym. Unter Umständen findet eine leichte Autohydrolyse des Indikatormoleküls statt, was zu einer Überbewertung des Ergebnisses führen würde. Das Differenzspektrum aber gibt den ausschließlichen Einfluß der bakteriellen Lipase auf die Indikatorkugeln wieder.

Durch den Vergleich mit einer geeigneten Eichkurve kann die Messung qualitativ und quanti­ tativ ausgewertet werden. Es kann also der Bakterientyp und seine Anzahl nach 48 h bestimmt werden. So kann auf die Bakterienkonzentration in der Patientenprobe rückgeschlossen werden, was dem Arzt erlaubt, den Verlauf der Erkrankung einzuschätzen und gezielt zu handeln.

Claims (2)

1. Vorrichtung zur Identifikation von Mikroorganismen Pilzen und Kleinstlebewesen mit Indikatorkugeln dadurch gekennzeichnet, daß
die Oberflächen von chemisch und mechanisch stabilen Kugeln dauerhaft mit Indikator­ molekülen verbunden sind, die Mikroorganismen oder Pilze oder deren Stoffwechselprodukte oder derer Stoffwechselzwischenprodukte identifizieren können und daß
diese Moleküle nach Kontakt mit Mikroorganismen oder Pilzen oder deren Stoffwechselpro­ dukte oder derer Stoffwechselzwischenprodukte eine Farb- oder Floureszenzänderung, die als Identifikationsnachweis dient,
weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß vorteilhafterweise
die Bindung zwischen Indikator und Kugel dauerhaft ist, und/oder
daß die Bindung zwischen Indikator und Kugel eine kovalente Bindung, Ionenbindung oder durch Adhäsionskräfte hervorgerufen wird, und/oder
daß ein Kontakt der Indikatoren mit den oben genannten Stoffen durch eine Änderung ihrer spektralen Eigenschaft dieser Indikatormoleküle nachgewiesen werden kann, und/oder
daß die Kugeln selbst aus chemisch und mechanisch inertem Material besteht, und/oder
daß die Kugeln die Möglichkeit zu einer der oben genannte Bindungen bietet, und/oder
daß der Kugeldurchmesser zwischen 5 nm und 15 mm betragen kann, und/oder
daß eine Kugel ein oder mehrere Indikatormoleküle tragen kann, und oder
daß eine Kugeloberfläche dauerhaft (s. o.) mit Floureszeinverbindungen, insbesondere Fluores­ ceinsäuren wie z. B. Fluoresceindiacetatverbindungen sein kann, so daß insbesonder ein Nach­ weis bakterieller Lipasen durch eine Fluoreszenzänderung herbeigeführt werden kann.

2. Verfahren zur Identifikation von Mikroorganismen mit Indikatorkugeln, dadurch gekennzeichnet, daß
die Mikroorganismen oder Pilze oder Kleinstiebewesen oder deren Stoffwechselprodukte oder derer Stoffwechselzwischenprodukte und die Indikatorkugeln sich in der gleichen Flüssigkeit befinden,
weiterhin dadurch gekennzeichnet,
daß sich die Mikroorganismen oder Pilze oder deren Stoffwechselprodukte oder deren Stoffwechselzwischenprodukte mit mehreren verschiedenen Typen von Indikatorkugeln in derselben Flüssigkeit befinden können, und/oder
daß die Indikatorkugeln von der oben beschriebenen Suspension abgetrennt und zu Meßzwecken in eine weitere Flüssigkeit überführt werden können, und/oder
daß das Einbringen verschiedener Indikatorkugeln in oben beschriebene Suspension nicht zeitgleich sondern auch zeitversetzt erfolgen kann
daß Kontrollmessungen derart durchgeführt werden können, daß der Einfluß von der Flüssigkeit, in der sich die Indikatorkugeln befinden, auf die Indikatoren eliminiert werden kann und daß der Einfluß der Organismen selbst durch ihre natürlichen spektralen Eigenschaften auch eliminiert werden kann.