KR102065620B1 - 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출 키트 및 이를 이용한 검출방법 - Google Patents

박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출 키트 및 이를 이용한 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식중독 세균 검출 키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출 키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
상기 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출 키트는 (a) 시료 배양용 배지; (b) 시료에 존재하는 식중독 세균을 감염시키는 박테리오파지 칵테일(Bacteriophage cocktail); (c) 박테리오파지를 불활성화 시약; (d) 상기 박테리오파지 불활성화 시약 제거용 워싱 버퍼; 및 (e) 식중독 세균의 존재 유무를 확인하기 위한 센서 셀(sensor cell)을 포함한다.
본 발명에 따른 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출키트를 이용하면 전문가가 아닌 일반인도 식중독 세균을 간단하고, 정확하게 검출할 수 있다.

Description

박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출 키트 및 이를 이용한 검출방법 {Kit for Detecting Food Poisoning Bacteria Using Bacteriophage and Detecting Method Using the Same}
본 발명은 식중독 세균 검출 키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출 키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
식중독균은 급성위장염증상을 일으키는 세균을 말한다. 식품 안에서 증식할 때 독소를 생성하여 식중독을 야기하는 독소형 식중독세균인 황색포도당구균 그리고 보튤리누스(botulinus)균과 생균의 형태로 섭취되어 그 증식이 식중독을 야기하는 감염형 식중독세균인 비브리오, Salmonella, 그리고 설사 거인성대장균 등이 식중독 균으로 잘 알려져 있다.
식중독균은 주로 육류, 낙농제품, 식수 등 음식을 통하여 전파되므로, 음식과 같은 시료에서 식중독균의 존재 여부를 신속하고 경제적으로 확인할 수 있는 방법이 요구된다. 식중독균을 검출하기 위한 통상적 방법은 선택적 배지에서 시료를 배양하여, 식중독균로 추측되는 균을 분리한 후, 이를 생화학적 또는 면역학적 방법으로 확인하는 것이다. 그러나, 항체를 이용한 면역학적인 방법은 높은 정확도로 세균의 검출이 가능하지만, 많은 양의 시료가 필요하고, 각 진단에 필요한 항체를 생산하기 위해서는 해당 세균의 단백질 순화, 생산 또는 펩타이드 제작이 필수적이며, 높은 항체 생산 비용이 요구된다. 또한, 단백질의 특성상 보관과 이용상의 어려움이 많고, 한 번에 한 종류 또는 제한된 종류의 세균 검출만이 가능하며, 세균의 배양 및 실험 단계에 있어서 긴 시간이 소모된다. 이러한 단점을 개선하기 위하여, PCR 방법을 이용한 각종 세균 검출 키트들이 연구 개발되기 시작하였다. PCR 방법을 이용한 검출 키트들은 높은 정확성과 간편성, 신속성 때문에 각종 분야에서 날로 그 수요가 증가하고 있다.
한국등록특허 제10-1456646호는 식중독균 검출을 위한 특이 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 키트 및 이를 이용한 식중독균 검출 방법을 개시하였고, 한국등록특허 제10-1439158호는 RNA 앱타머를 포함하는 식중독균 검출 키트를 개시하였다.
하지만, PCR 등의 분자진단 방법은 생균이 아닌 사균까지도 검출이 되기에 실효성이 낮고, 고도로 숙련된 전문가만이 이용할 수 있기에 살아있는 식중독 균만을 간단하고, 손쉽게 검출할 수 있는 방법의 개발이 절실하다.
한편, 박테리오파지(bacteriophage)는 세균을 숙주세포로 하는 바이러스 일군을 총칭하는 것으로서, 세균바이러스 또는 단순히 파지라고도 한다. 대장균의 λ파지로 대표되는 용원성 파지는 숙주세균에 감염한 후 증식하여 자손파지를 방출하는 회로(용균 대응)를 취하거나 숙주염색체와 공존한 상태에서 세포는 생존하고 파지DNA는 복제하는(용원화 대응) 방법을 취할 수 있다.
용원화 상태에 있는 파지유전체를 프로파지라고 하는데, 프로파지는 숙주염색체 상의 특정 부위에 삽입되는 경우(λ파지 등), 숙주염색체의 불특정 부위에 삽입하는 경우(Mu-1 파지), 숙주염색체와는 독립된 플라스미드상태로서 존재하는 경우(P1파지 등) 등이 있다. 이에 대해 T짝수계 파지인 T4 등은 용균회로만을 취할 수 있는 파지이며, 독성파지라고도 한다.
미국공개특허 제2018-0216154호는 박테리오파지를 이용한 광음향 세포(photoacoustic cell) 또는 플로우메트리(flowmetry) 방식으로 박테리아를 검출하는 방법을 개시하였으나, 농식품이 아닌 환자의 샘플로부터 박테리아를 검출하는 것으로서, 농식품에 존재하는 식중독 세균 검출에는 적합하지 않은 문제점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 노력한 결과, 시료를 배지에 넣고 배양하는 단계; 박테리오파지로 시료에 존재하는 식중독 세균을 감염시키는 단계; 감염시키지 못한 박테리오파지를 불활성화시키는 단계; 불활성화 시약을 제거하는 단계; 및 반응액을 센서 셀(sensor cell)에 배양하는 단계를 수행할 경우, 식중독 세균을 전문적 스킬 없이도 간단하게 검출할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 농식품 등의 시료로부터 식중독 세균을 간단하면서도 정확하게 검출할 수 있는 식중독 세균 검출 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 농식품 등의 시료로부터 식중독 세균을 간단하면서도 정확하게 검출할 수 있는 식중독 세균 검출방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 시료를 배지에 넣고, 배양하는 단계; (b) 시료 배양액과 박테리오파지 칵테일(Bacteriophage cocktail)을 혼합하여, 시료에 존재하는 식중독 세균에 박테리오파지를 감염시키는 단계; (c) 박테리오파지가 혼합된 시료 배양액과 박테리오파지 불활성화 시약을 혼합반응시켜, 박테리오파지를 불활성화시키는 단계; (d) 반응액으로부터 박테리오파지 불활성화 시약을 제거하는 단계; (e) 박테리오파지 불활성화 시약이 제거된 반응액을 센서 셀(sensor cell)에 혼합하는 단계; 및 (f) 센서 셀(sensor cell) 혼합액을 확인하는 단계를 포함하는 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 시료 배양용 배지; (b) 시료에 존재하는 식중독 세균을 감염시키는 박테리오파지 칵테일(Bacteriophage cocktail); (c) 박테리오파지를 불활성화 시약; (d) 상기 박테리오파지 불활성화 시약 제거용 워싱 버퍼; 및 (e) 식중독 세균의 존재 유무를 확인하기 위한 센서 셀(sensor cell)을 포함하는 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 배지는 mTSB, mBPW-p, LB 및 EC 로 구성된 군으로부터 선택되는 배지인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 박테리오파지 불활성화 시약은 알루미늄 클로라이드(Aluminum chloride), 알루미늄 포타슘 설페이트(Aluminum potassium sulphate), 페릭 클로라이드(Ferric chloride), 페릭 시트레이트(Ferric citrate), 페릭 암모늄 설페이트(Ferric ammonium sulphate), 페릭 설페이트(Ferric sulphate), 페릭 니트레이트(Ferric nitrate), 페러스 암모늄 셀페이트(Ferrous ammonium sulphate), 페러스 클로라이드(Ferrous chloride) 및 페러스 설페이트(Ferrous sulphate)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 박테리오파지 불활성화 시약의 제거는 원심분리 또는 원심 여과기(centrifugal filter)를 이용하는 것을 특징 한다.
본 발명에 있어서, 원심분리 또는 원심 여과기(centrifugal filter) 수행 후 워싱 버퍼를 이용하여 추가적으로 박테리오파지 불활성화 시약을 제거하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 워싱 버퍼는 증류수 또는 PBS 버퍼인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 센서 셀(sensor cell)은 상기 박테리오파지 칵테일에 포함된 박테리오파지에 특이적으로 감염되는 균주인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 센서 셀(sensor cell) 혼합액의 확인은 (a) 센서 셀(sensor cell) 혼합액을 소프트 아가(Soft agar)에서 배양하여 육안으로 박테리오파지의 용균 활성을 확인하거나, (b) 레사주린(alamar blue), MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 또는 TTC(Triphenyl tetrazolium chloride)를 센서 셀(sensor cell) 혼합액에 넣고 색 변화를 확인하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출키트를 이용하면 전문가가 아닌 일반인도 식중독 세균을 간단하고, 정확하게 검출할 수 있다.
도 1은 레사주린의 환원 반응에 의한 색변화를 설명하는 그림이다.
도 2는 농산물에 따른 배지에서의 균 농도를 비교한 그래프이다(A; 로메인, B; 새싹, C; 양상추).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지의 용균활성을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 불활성화 시약의 박테리오파지 불활성화 효과를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 불활성화 시약의 제거방법을 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 불활성화 시약의 박테리오파지 불활성화 효과 및 불활성화 시약의 제거 효과를 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 소프트 아가를 이용한 식중독 세균의 검출 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 시약의 색변화를 이용한 식중독 세균의 검출 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 레사주린의 색변화를 이용한 식중독 세균의 검출 결과이다.
본 발명에서는 PCR 등의 분자진단 방법 대신에 박테리오파지의 용균활성 특성을 이용할 경우, 살아있는 식중독 균을 간단하고, 손쉽게 검출할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
본 발명에서는 시료를 배지에 넣고 배양하는 단계; 박테리오파지로 시료에 존재하는 식중독 세균을 감염시키는 단계; 감염시키지 못한 박테리오파지를 불활성화시키는 단계; 불활성화 시약을 제거하는 단계; 반응액을 센서 셀(sensor cell)에 배양하는 단계를 수행하였다. 그 결과 육안으로 식중독 세균의 존재 유무를 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 시료를 배지에 넣고, 배양하는 단계; (b) 시료 배양액과 박테리오파지 칵테일(Bacteriophage cocktail)을 혼합하여, 시료에 존재하는 식중독 세균에 박테리오파지를 감염시키는 단계; (c) 박테리오파지가 혼합된 시료 배양액과 박테리오파지 불활성화 시약을 혼합반응시켜, 박테리오파지를 불활성화시키는 단계; (d) 반응액으로부터 박테리오파지 불활성화 시약을 제거하는 단계; (e) 박테리오파지 불활성화 시약이 제거된 반응액을 센서 셀(sensor cell)에 혼합하는 단계; 및 (f) 센서 셀(sensor cell) 혼합액을 확인하는 단계를 포함하는 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 식중독 세균을 검출하기 위하여 먼저, 시료를 배지에 넣고, 배양하는 단계를 수행한다.
상기 시료는 식중독 세균이 존재할 것으로 의심되는 것으로서, 물, 농산물, 수산물, 사람이나 동물의 타액 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배지는 시료에 존재하는 식중독 세균의 증균을 위한 것으로서, 식중독 세균을 증식시킬 수 있는 것이라면 특별한 제한없이 이용할 수 있고, mTSB, mBPW-p, BCIG, LB 및 EC 등을 예시할 수 있으며, 염화칼슘(CaCl2)을 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다. 담즙산염(bile salts)이 제외된 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
배양조건은 특별히 제한되지 않으나 33~37℃에서 12~24시간 배양하는 것이 바람직하다.
시료에 존재하는 식중독 세균을 배양한 다음에는 시료 배양액과 박테리오파지 칵테일(Bacteriophage cocktail)을 혼합하여, 시료에 존재하는 식중독 세균에 박테리오파지를 감염시킨다.
박테리오파지는 특정 세균에만 감염하여 세균의 성장을 통제하는 세균특이적 바이러스로 세균 숙주 없이는 자가 증식이 불가능한 특성이 있다. 박테리오파지 칵테일(Bacteriophage cocktail)은 특이성이 상이한 박테리오파지들의 혼합물이다.
상기 박테리오파지는 식중독 세균에 대하여 강한 용균활성을 갖는 것이라면 특별한 제한없이 사용할 수 있다. 상기 식중독 세균으로는 살모넬라(Salmonella typhimurium), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli) 등을 예시할 수 있다.
식중독 세균이 존재할 경우, 박테리오파지가 감염시켜 그 내부에서 증식하게 되므로, 외부에 존재하는 박테리오파지를 제거하기 위하여, 박테리오파지가 혼합된 시료 배양액과 박테리오파지 불활성화 시약을 혼합반응시켜, 박테리오파지를 불활성화시키는 단계를 수행한다.
상기 박테리오파지 불활성화 시약은 식중독 세균에는 영향을 주지 않으면서 박테리오파지만 선택적으로 불활성화 시킬 수 있는 것이라면 특별한 제한없이 이용할 수 있으나, 알루미늄 클로라이드(Aluminum chloride), 알루미늄 포타슘 설페이트(Aluminum potassium sulphate), 페릭 클로라이드(Ferric chloride), 페릭 시트레이트(Ferric citrate), 페릭 암모늄 설페이트(Ferric ammonium sulphate), 페릭 설페이트(Ferric sulphate), 페릭 니트레이트(Ferric nitrate), 페러스 암모늄 셀페이트(Ferrous ammonium sulphate), 페러스 클로라이드(Ferrous chloride), 페러스 설페이트(Ferrous sulphate) 등을 예시할 수 있고, 페릭 암모늄 설페이트(Ferric ammonium sulphate)를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 혼합된 시료 배양액과 박테리오파지 불활성화 시약의 혼합 비율은 1: 0.8~1.2이며, 불활성화 시약의 농도는 5~25%인 것이 바람직하다. 불활성화 시약의 농도가 5% 미만인 경우에는 박테리오파지의 불활성화가 완벽히 이루어지지 않아 잔여 박테리오파지에 의해 식중독 세균 검출 결과의 신뢰도가 떨어지고, 25%를 초과할 경우에는 불활성화 시약의 제거 작업을 수차례 반복하여 잔존하는 불활성화 시약을 제거해야 소프트아가 및 발색시약을 통한 식중독 세균 검출 결과를 명확히 확인 할 수 있다.
본 발명에서는 불활성화 시약의 사용량을 줄이고, 배양액의 배지성분이 박테리오파지의 불활성화를 방해하는 것을 방지하기 위하여, 박테리오파지가 혼합된 시료 배양액을 원심분리시켜, 발생된 펠렛(pellet)에 불활성화 시약을 혼합하는 것을 특징으로 한다.
다음으로, 반응액에 박테리오파지 불활성화 시약이 잔존해 있으면, 배지의 색이 변하거나, 단백질 응고 반응에 의하여 플라크(plaque)의 구별이 어렵기 때문에, 반응액으로부터 박테리오파지 불활성화 시약을 제거하는 단계를 수행한다.
박테리오파지 불활성화 시약의 제거는 원심분리(centrifuge) 또는 원심 여과기(centrifugal filter)를 이용할 수 있으나, 경제적인 측면에서는 원심분리(centrifuge) 후 박테리오파지 불활성화 시약을 포함하는 상등액을 제거하는 것이 바람직하다.
박테리오파지 불활성화 시약을 완벽하게 제거하기 위하여 원심분리 또는 원심 여과기(centrifugal filter) 수행 후 워싱 버퍼를 이용하여 워싱을 1~4회 수행하는 것이 바람직하다. 워싱 버퍼로는 증류수, LBC broth, PBS 버퍼 등을 예시할 수 있으나, PBS 버퍼를 이용하는 것이 바람직하다.
다음으로 박테리오파지 불활성화 시약이 제거된 반응액을 센서 셀(sensor cell)에 혼합하는 단계를 수행한다.
상기 센서 셀(sensor cell)은 박테리오파지 칵테일(Bacteriophage cocktail)에 사용되는 모든 박테리오파지에 감염되는 multi-sensing 균주를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 센서 셀(sensor cell)로는 대장균(Escherichia coli E23) 등을 예시할 수 있다.
끝으로, 센서 셀(sensor cell) 혼합액을 확인하는 단계를 수행하여 식중독 세균을 검출할 수 있는데, 이는 크게 2가지 방법으로 구분된다.
첫 번째는 센서 셀(sensor cell) 혼합액을 소프트 아가(Soft agar)에서 배양하여 육안으로 박테리오파지의 용균 활성을 확인하는 방법이다.
시료에 식중독 세균이 존재할 경우에는 센서 셀 혼합액에 박테리오파지가 존재하므로, 소프트 아가에 플라크(plaque)가 형성되고, 식중독 세균이 존재하지 않을 경우에는 센서 셀 혼합액에 박테리오파지가 존재하지 않으므로, 소프트 아가에 플라크(plaque)가 형성되지 않게 된다.
두 번째는 레사주린 (alamar blue), MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 또는 TTC (Triphenyl tetrazolium chloride)를 센서 셀(sensor cell) 혼합액에 넣고 색 변화를 확인하는 방법이다.
시료에 식중독 세균이 존재할 경우에는 센서 셀 혼합액에 박테리오파지가 존재하므로, 센서 셀이 모두 감염되어 사멸하거나, 그 양이 적어서 대사가 적게 일어나고, 식중독 세균이 존재하지 않을 경우에는 박테리오파지는 존재하지 않고, 센서 셀만 존재하므로, 대사가 활발하게 일어나게 된다.
레사주린, MTT 또는 TTC는 세포 신진대사를 정량화하는데 사용되는 시약으로서 염료환원 원리를 이용할 수 있다. 예를 들어 도 1에 도시된 바와 같이, 레사주린(resazurin)은 산화상태에서 남색을 띄지만, 환원되면 분홍 또는 보라색으로 변하고 최종적으로 무색의 dihydroresorufin으로 환원되는 특성이 있다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 시료 배양용 배지; (b) 시료에 존재하는 식중독 세균을 감염시키는 박테리오파지 칵테일(Bacteriophage cocktail); (c) 박테리오파지를 불활성화 시약; (d) 상기 박테리오파지 불활성화 시약 제거용 워싱 버퍼; 및 (e) 식중독 세균의 존재 유무를 확인하기 위한 센서 셀(sensor cell)을 포함하는 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출 키트에 관한 것이다.
상기 식중독 세균 검출 키트는 색 변화를 통하여 식중독 세균의 존재 유무를 확인하기 위한 레사주린(alamar blue), MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 또는 TTC (Triphenyl tetrazolium chloride)를 추가로 포함할 수 있으며, 식중독 세균 검출 키트에 포함된 각각의 구성은 앞서 설명한 바와 동일하다.
상기 박테리오파지 칵테일(Bacteriophage cocktail); 박테리오파지를 불활성화 시약; 상기 박테리오파지 불활성화 시약 제거용 워싱 버퍼; 식중독 세균의 존재 유무를 확인하기 위한 센서 셀(sensor cell) 등은 작업의 편의성을 위하여 튜브에 포함되어 있는 것이 바람직하다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 증균 배지 탐색
1-1: 오염된 농산물의 배양
시중에 구입한 로메인, 새싹, 양상추를 감마처리 후 mTSB(Tryptone 17g, peptone 3g, sodium chloride 5g, dipotassium hydrogen phosphate 4g, glucose 2.5g, bile salt 1.5g, DW 1L) 225ml 배지에 넣고, E. coli O157:H7 (NCCP13930) 균주를 각각 <10 CFU/ml, <100 CFU/ml, <1,000 CFU/ml로 접종 후, 35℃에서 총 12시간 배양하면서 2시간 간격으로 증균수를 확인하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 도시된 바와 같이, 오염된 농산물에 존재하는 장출혈성대장균의 농도는 농산물 종류 및 초기접종농도에 따라 상이했지만, 12시간 배양 시 최소 3 log10 CFU/ml 이상으로 배양된 것을 확인할 수 있었다.
1-2: 최적 증균배지 결정
(a) 담즙산염(bile salts)이 제외된 mTSB 배지(Tryptone 17g, peptone 3g, sodium chloride 5g, dipotassium hydrogen phosphate 4g, glucose 2.5g, DW 1L), (b) 담즙산염(bile salts) 포함 mTSB 배지(Tryptone 17g, peptone 3g, sodium chloride 5g, dipotassium hydrogen phosphate 4g, glucose 2.5g, bile salt 1.5g, DW 1L), (c) mBPW-p 배지(Peptone 10g, NaCl 5g, Na2HPO4 3.6g, KH2PO4 1.5g, Casamino acids 5g, Yeast extract 6g, Lactose 10g, Sodium Pyruvate 1g) 각각에 E. coli O157:H7 (NCCP13930) 균 희석액 <102 cfu/ml을 접종하고 12시간 동안 35℃에서 정치배양 후 증균 수와 배지의 pH 변화를 확인하고, 그 결과를 표 1 및 표 2에 나타내었다.
배지 접종 균수 12시간 배양 후
mTSB w bile salts <102 cfu/ml 1.97*107 cfu/ml
mTSB w/o bile salts <102 cfu/ml 1.26*107 cfu/ml
mBPW-p <102 cfu/ml 4.9*107 cfu/ml
배지 접종 전 (pH) 12시간 배양 후 (pH)
mTSB w bile salts 7.63 6.72
mTSB w/o bile salts 7.86 6.9
mBPW-p 6.86 6.79
표 1 및 표 2로부터, 전반적으로 증균수는 약 107 cfu/ml 정도의 비슷한 수치로 나타났으나, plaque 수는 표 3과 같이 5배에서 최대 8배까지 차이를 보였다. 더불어, pH의 변화에 mBPW-P, mTSB w/o bile salts, mTSB w bile salts 순서로 안정적인 것을 확인할 수 있었다.

배지 		반응액의 희석 배수
10 0 10 1 10 2
m-TSB TNTC 15 10
mTSB w/o bile salts TNTC TNTC 55
m-BPW-p TNTC TNTC 81
실시예 2: 박테리오파지 감염
박테리오파지의 용균활성을 확인하기 위하여 박테리오파지 칵테일(Bacteriophage cocktail) (ECP26, ECP27, ECP32, ECP33, NOECP32, NOECP43 및 NOECP91; 가천대학교, 박종현 교수 연구실로부터 입수)을 10종의 장출혈성대장균(E. coli O157:H7 NCCP12079, E. coli O157 30.2CA, E. coli O26 NCCP13921, E. coli O157 932(beefed), E. coli O157 204P, E. coli O157 ATCC43888, E. coli O157 505B, E. coli O157 W2-2, E. coli O55 NCCP13899 및 E. coli O26 NCCP13919)에 감염시킨 다음, 35℃에서 30분간 반응시키고, 그 결과를 도 3 및 표 4에 나타내었다.
Phage E. coli Phage E. coli
ECP26 O157:H7 NCCP12079
O157 30.2CA
O26 NCCP13921
O157 932(beefed)
O55 NCCP13899		 NOECP32 O157:H7 NCCP12079
O157 30.2CA
O26 NCCP13921
NOECP43 O157:H7 NCCP12079
O157 30.2CA
O26 NCCP13921
O157 932(beefed)
O157 204P
O157 ATCC43888
O157 505B
O26 NCCP13919
ECP27 O157:H7 NCCP12079
O157 30.2CA
O26 NCCP13921
ECP32 O157:H7 NCCP12079
O157 30.2CA
O26 NCCP13921
ECP33 O157:H7 NCCP12079
O157 30.2CA
O26 NCCP13921		 NOECP91 O157:H7 NCCP12079
O157 30.2CA
O26 NCCP13921
도 3 및 표 4에 나타난 바와 같이, E. coli O157:H7 NCCP12079, E. coli O157 30.2CA 및 E. coli O26 NCCP13921에 대해서는 박테리오파지 모두 높은 수준의 용균 활성(Lytic activity)를 보여주었고, 나머지 7종의 장출혈성대장균 type에 대해서는 bacteriophage에 따라 상이한 용균 활성(Lytic activity)를 나타내었다.
특히, ECP26은 병원성 E. coli 5종에 대하여, ECP27, ECP32, ECP33, NOECP32 및 NOECP91은 각 3종에 대하여, NOECP43은 8종에 대하여 높은 용균활성을 보여주었다.
실시예 3: 박테리오파지 불활성화 및 불활성화 시약 제거
3-1: 박테리오파지 불활성화
실시예 2의 Bacteriophage NOECP91을 대상으로 하여 페러스 암모늄 셀페이트(Ferrous ammonium sulphate; FAS) 10%를 혼합하여 5~20분간 반응시킨 다음, 박테리오파지의 불활성화를 확인하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이때 negative control은 mTSB 225 ml로 하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, FAS에 의해 Bacteriophage NOECP91은 완벽하게 불활성화되었으나, 배지의 색이 황색으로 변하고 ammonium sulfate의 단백질과 응고 반응에 의해 plaque를 구별하기 어려운 단점이 있었다.
3-2: 박테리오파지 불활성화 시약 제거
FAS를 제거하기 위하여, 하기 표 5의 조건으로 원심분리 및 원심 여과기(centrifugal filter)를 각각 수행하고, 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
centrifuge(원심분리) centrifugal filter(원심 여과기)
사용기구 - 1.5ml microtube
- centrifuge		 - centrifugal filter(0.22um)
- centrifuge
원심분리
조건		 12,000rpm, 10min 12,000rpm, 10min
방법 1. 원심분리
2. pellet에 LB + 10mM CaCl2(LBC) 이용 1회 washing
3. LBC 이용 resuspend		 1. 원심분리
2. filter 위쪽에 존재하는 내용물에 PBS 버퍼 이용 1회 washing
2. PBS 버퍼 이용 resuspend
이때, LBS 솔루션 대신에 PBS 버퍼를 이용할 경우에는 pellet의 색이 청록색이 되는 특징점이 있기 때문에, negative control을 더욱 제어할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
도 5에 도시된 바와 같이, 원심분리 및 원심 여과기(centrifugal filter)를 모두 배지의 색과 plaque 수의 경향이 유사하게 나타났으며, 도 6에 도시된 바와 같이, 원심 여과기(centrifugal filter)로 FAS를 제거한 경우에는 배지의 색 변화 및 단백질 응고반응을 억제시킨 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 센서 셀(sensor cell) 혼합 및 검출
실시예 3에서 박테리오파지 불활성화 시약이 제거된 반응액을 센서 셀(E.coli NCCP 13937) 108 CFU/ml에 혼합하고, 이로부터 식중독 세균의 유무를 확인하였다.
4-1: 소프트 아가(Soft agar)에서 플라크 확인
센서 셀(sensor cell) 혼합액을 104~106 배로 희석한 다음 LBC soft agar(LB 25g, Agar 6g, Calcium chloride 10mM, DW 1L)에 접종하고, 35℃에서 15~24시간 동안 배양한 다음 그 결과를 도 7에 나타내었다.
만일 시료에 식중독 세균이 존재할 경우에는 센서 셀에 박테리오파지가 존재하므로, 소프트 아가에 플라크(plaque)가 형성되고, 식중독 세균이 존재하지 않을 경우에는 센서 셀에 박테리오파지가 존재하지 않으므로, 소프트 아가에 플라크(plaque)가 형성되지 않게 된다.
4-2: 색 변화 확인
센서 셀(sensor cell) 혼합액을 35℃에서 4시간 동안 배양한 다음, 0.01 % 레사주린(alamar blue), 0.5% MTT 및 0.002% TTC 각각을 첨가하고, 시간 흐름에 따른 색변화를 확인하고, 그 결과를 도 8 및 9에 나타내었다.
도 8 및 도 9에 도시된 바와 같이, 균이 존재할 경우, 레사주린은 파랑색에서 자주색으로, MTT는 노랑색에서 회색으로, TTC는 투명에서 분홍색으로 색 변화가 일어나는 것을 알 수 있었다. 그러나 즉각적이고 빠른 시간 내 색 변화가 일어나는 레사주린과 달리 MTT와 TTC의 경우 명확한 색 구분까지 많은 시간이 소요되었다. 그러므로 짧은 시간 내 명확한 구분을 위하여 레사주린을 사용하는 것이 바람직하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. (a) 시료를 배지에 넣고, 배양하는 단계;
    (b) 시료 배양액과 박테리오파지 칵테일(Bacteriophage cocktail)을 혼합하여, 시료에 존재하는 식중독 세균에 박테리오파지를 감염시키는 단계;
    (c) 박테리오파지가 혼합된 시료 배양액과 박테리오파지 불활성화 시약인 페릭 암모늄 설페이트(Ferric ammonium sulphate) 또는 페러스 암모늄 셀페이트(Ferrous ammonium sulphate)를 혼합반응시켜, 박테리오파지를 불활성화시키는 단계;
    (d) 반응액을 원심분리 또는 원심여과 수행 후, PBS 버퍼를 이용하여 박테리오파지 불활성화 시약을 제거하는 단계;
    (e) 박테리오파지 불활성화 시약이 제거된 반응액을 센서 셀(sensor cell)에 혼합하는 단계; 및
    (f) 레사주린(alamar blue)을 센서 셀(sensor cell) 혼합액에 넣고 색 변화를 확인하는 단계를 포함하는 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지는 mTSB, mBPW-p, BCIG, LB 및 EC 로 구성된 군으로부터 선택되는 배지인 것을 특징으로 하는 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 센서 셀(sensor cell)은 상기 박테리오파지 칵테일에 포함된 박테리오파지에 특이적으로 감염되는 균주인 것을 특징으로 하는 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출방법.
  8. 삭제
  9. (a) 시료 배양용 배지;
    (b) 시료에 존재하는 식중독 세균을 감염시키는 박테리오파지 칵테일(Bacteriophage cocktail);
    (c) 페릭 암모늄 설페이트(Ferric ammonium sulphate) 및 페러스 암모늄 셀페이트(Ferrous ammonium sulphate)로 구성된 군에서 선택되는 박테리오파지 불활성화 시약;
    (d) 박테리오파지 불활성화 시약 제거용 PBS 버퍼;
    (e) 상기 박테리오파지 칵테일에 포함된 박테리오파지에 특이적으로 감염되는 균주인 센서 셀(sensor cell); 및
    (f) 색 변화를 통하여 식중독 세균의 존재 유무를 확인하기 위한 레사주린(alamar blue)을 포함하는 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출 키트.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서, 상기 배지는 mTSB, mBPW-p, BCIG, LB 및 EC 로 구성된 군으로부터 선택되는 배지인 것을 특징으로 하는 박테리오파지를 이용한 식중독 세균 검출 키트.
  12. 삭제
  13. 삭제
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