CN101451159A - 含乙二胺四乙酸和聚乙烯亚胺的组合、能透化微生物细胞壁的新组合物 - Google Patents

含乙二胺四乙酸和聚乙烯亚胺的组合、能透化微生物细胞壁的新组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及能透化微生物细胞壁的组合物，其含聚乙烯亚胺(PEI)和乙二胺四乙酸(EDTA)的组合，以及利用上述组合物靶向计数和检测膜上微生物的方法。本发明也涉及含适于执行上述方法的探针的试剂盒。

Description

含乙二胺四乙酸和聚乙烯亚胺的组合、能透化微生物细胞壁的新组合物
本发明涉及能透化微生物细胞壁的新组合物，其包含乙二胺四乙酸(EDTA)和聚乙烯亚胺(PEI)的组合，本发明也涉及该组合物的应用，特别是在液体或气体介质中计数和/或鉴定靶微生物的方法中进行应用。
本发明更特别应用于，例如进入食品和药品生产线的液体和气体介质的微生物质量调控。
在该领域，待检测微生物量通常较少，因为它们被大量体积的水或气体所稀释。然而，它们的鉴定必须肯定地确定。事实上，微生物控制必须使得能在尽可能短的时间内检出作为所制造产品组合物的成分的流体的任何污染物，以便能在合适情况下停止该产品的制备或分装并采取必要去污步骤。
为使所述微生物培养时间最小化，已发展出多种微生物检测方法。
包含液体经膜过滤的微生物检测方法，已在例如专利申请WO01/59157中记载。根据该方法，含在液体样品中的微生物，在液体经膜后，会保留在滤膜表面。将微生物在膜表面与琼脂培养基接触培养，培养一段时间要求形成肉眼不可见微菌落。然后，将形成微菌落的细胞裂解，以释放三磷酸腺苷(ATP)和核酸内含物。用ATP-生物发光法，将所释放ATP作为鉴定及定量活细胞的标记物。ATP可作为化学发光反应的酶底物，其中，通过该反应可获得光信号然后用合适的视频界面进行检测(例如：LCD相机)。以图象形式提供的所获信号，能使可原位看见微生物生长的膜位点，这与在细菌培养皿琼脂培养基上进行的传统计数方式类似。在该实例中检测被认为是普遍通用的，因为ATP是在所有活微生物中都存在的标记。因此，该方法不能区分不同种属的微生物。
Millipore公司出售的
Figure A200810125896D00041
***，就是用上述记载原理进行的操作。该***被设计成在同一膜上进行过滤和检测步骤，其中，所述膜用塑料支持物进行支撑。对该支持物进行设计，以使其能嵌入各种装置用于过滤、微生物培养、和检测。
与传统细菌培养皿检测相比，该微型***能节省大量时间。此外，该方法也能存储数码介质所获的图象，所述图象在对分析产品进行追踪的情况下，是有利的。
然而，该***因为以下事实而具有某些局限性：在实践中，对膜表面微生物进行计数，是在细胞裂解之后进行的。进行该裂解是必需的，以从细胞提取发光试剂反应产物，例如ATP而产生待检测发光信号。然而，在对膜进行处理之后，就很难再利用该膜进行例如精确鉴定所检测微生物的其它分析。
可利用与微生物所含核酸(DNA或RNA)特异性杂交的探针鉴定微生物。最常用的这类探针，包含通常长度为10-40核苷酸的寡核苷酸片段，所述片段与微生物DNA或RNA所含序列可形成互补序列。
PNA(肽核酸)类探针，也认为在该类检测中有利，因为它们具有对微生物中所存在降解酶不太敏感的肽骨架，而且，该肽核酸也提供了一种不同标记手段。
专利申请WO2004/050902记载了一种膜检测***，所述***在不引起微生物任何裂解的情况下，可检测血样是否存在微生物污染。该***的特点在于，通过将标记试剂经细胞壁透化至微生物中而进行检测。所用标记试剂为小尺寸分子，特别是那些可嵌入核酸(DNA，RNA)的化合物，例如花青素衍生物，碘化丙啶，吖啶橙，或溴化乙啶。利用现有技术已知的透化剂，例如聚乙烯亚胺(PEI)，洋地黄皂苷，莫能菌素，六偏磷酸钠或氯化苄烷铵，上述小分子化合物可相对容易经膜透化至微生物中。首先，将含待测微生物液体试样在细胞透化剂存在情况下，稀释于含标记试剂的透化溶液，然后，将微生物经膜过滤由此检测。该方法可以良好分辨率来检测微生物。
然而，由于标记是通用标记，即该标记对微生物不具有特异性，所以，该***并不能精确确定所检测微生物的种类。
此外，该***的微生物操作(在透化液中温育)要在溶液中进行，而由此需要特定预案和复杂装备。应该注意，过滤前将活细胞在溶液中温育还有下列缺点——在膜固定前所述细胞能继续生长和分化，由此实际上可导致检测最终结果具有不确定性。
与该类分析相关的另一困难在于，必须用于透化溶液的透化剂用量。事实上，该用量应根据待测微生物类型而变化。例如，根据微生物(在细菌例子中)是革兰氏阳性还是革兰氏阴性类型，透化剂在同一浓度下会有不同效果，更坏的是，该效果将会导致所存在微生物裂解。
总之，革兰氏阳性菌具有由肽聚糖(肽和多糖链组成的聚合物)组成的厚外层单膜，由此其透化性较革兰氏阴性菌更加困难，其中，所述革兰氏阴性菌细胞壁由其中肽聚糖并不富余且更易分散的双层膜组成。
聚乙烯亚胺(PEI)为弱碱性、聚阳离子脂肪族聚合物，已经记载，其可使某些革兰氏阴性菌细胞壁可透过各种抗生素分子[Helander，I.M.et al.，Polyethyleneimine is an effective permeabilizer of gram-negative bacteria，Microbiology(1997)，143：3193-3199]。用于该目的以获得细菌例如大肠杆菌(E.coli)的PEI浓度在20-30μg/ml之间。
乙二胺四乙酸(EDTA，分子式C10H16N2O8)是公知的螯合剂，其通常在生物化学中用作稳定剂，特别是用作酶或抗氧化反应的抑制剂。为此目的，EDTA出现在特定组合物中。然而，已经显示，为获得核酸标记目的，特别是对革兰氏阳性菌而言，单独使用EDTA并不能获得满意的微生物细胞壁透化作用(WO04/050902)。
溶菌酶是在许多方案中用作透化革兰氏阳性菌细胞壁、以进行核酸细胞转染的一种产品。它特别是通过水解细菌细胞壁中的肽聚糖的某些N-乙酰糖胺和N-乙酰胞壁酸连接键而起作用。
本发明的目的是针对上述提到的现存检测***的限制，特别是被认为较难处理的革兰氏阳性菌。
令人惊奇地，本发明人注意到，EDTA与PEI的组合，与现有技术中记载的组合物相比，特别是那些仅含PEI或EDTA的组合物相比，能更有效透化微生物细胞壁。
因此，可以确信，至少组合PEI和EDTA的组合物，特别适用于微生物的透化，特别是革兰氏阳性菌。
根据本发明，这些组合物特别能用于用寡核苷酸探针标记所述微生物的方法中，其中，所述寡核苷酸探针可用于特异性检测所述微生物。上述方法包括将微生物，在标记大分子例如寡核苷酸探针或PNA类型探针存在情况下，与本发明包括PEI和EDTA联用的组合物接触，以致标记大分子能经细胞壁透化至微生物中而由此发生结合。
此外，这样处理的微生物似乎更能耐受高浓度的PEI，该浓度要比正常使用浓度大而不引起任何细胞的标志性裂解。
在本发明中，术语“微生物”是指在单细胞壁或多细胞壁所组成包膜中包含遗传物质、的任何(真核或原核)活细胞，单细胞生物体，配偶体，或病毒。
上述定义的组合物可允许大分子透化至微生物中，而同时仅限制性破坏其细胞壁。
大分子是指，大量简单分子结合所形成的分子，例如多肽、蛋白、糖蛋白、寡核苷酸、多糖、核酸(DNA，RNA)、抗体、或者它们的衍生物。本发明所适合的大分子，通常为分子量大于1000道尔顿(1kDa)，优选大于2000道尔顿(2kDa)，更优选大于5000道尔顿(5kDa)的分子。
聚乙烯亚胺(PEI)是以多种形式可获得的可溶产品。分子量约750kDa的聚合化单聚体形式，是本发明的优选形式(CAS No.9002-98-6)。PEI可在多种领域中应用，特别是在各种纯化步骤中，用作溶液中蛋白和核酸的絮凝剂。由于它具有可逆性破坏细胞壁磷脂的特性，所以它也可用作透化剂，由此导致所述细胞壁对通常不允许透化至细胞中的相关试剂变得可透化。
因此，本发明的第一目的是含PEI和EDTA组合的、能用于透化微生物细胞壁的组合物。
透化组合物中PEI的浓度，可以在100-1000μg/ml之间，优选在150-900μg/ml之间，更优选在200-800μg/ml之间。
根据本发明，EDTA通常出现在透化组合物中的终浓度为1-200mM，优选为5-100mM。优选地，EDTA终浓度大于50mM，更优选在50mM-100mM之间。
优选地，该组合物也包括溶菌酶，其浓度通常在0.5-5mg/ml，优选在1-4mg/ml。
本发明的另一目的涉及本发明组合物的应用，更特别地，涉及膜上检测微生物的方法，所述方法包括将标记性大分子透化至微生物中的步骤。
因某些详细不明原因，PEI与EDTA组合可有助于大分子例如核苷酸探针，透化至微生物中，同时，使用溶菌酶可有助于所述微生物细胞壁中所存在肽聚糖的片段化。
优选地，本发明组合物不含任何去垢剂，由此从下文详述微生物检测方法角度讲，提供了许多优点。不使用去垢剂，例如能防止破坏该方法实施所需的某些蛋白，如溶菌酶及参与信号产生以荧光检测的酶。不使用去垢剂也能更有效通过交联，将微生物固定于膜上。
参与微生物检测的特异性探针，优选是能与所述微生物核糖体RNAs杂交的那些寡核苷酸探针。这些探针优选包括下列序列之一：
SEQ ID NO.1：5’TCTACCGCGTCACTTACGTGACACC3’
SEQ ID NO.2：5’TTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCG3’
SEQ ID NO.3：5’GCTTCTCGTCCGTTCGCTCGAC3’
SEQ ID NO.4：5’ACTTTACTCCCTTCCTCCCCGCTG3’
SEQ ID NO.5：5’AAATCACTTCACCTACGTGTCAGCG3’
这些序列分别允许特异性检测绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，大肠杆菌(Escherichia coli)，和肠道沙门氏菌亚利桑那亚种(Salmonellaentericaarizonae)。
根据本发明，能用于微生物检测方法中的大分子并不限于寡核苷酸探针，例如，它能包括可直接针对微生物内部成分的抗原、抗体或核酸适体，这些物质也能用于检测本发明的微生物。
图1示意了本发明特异性检测微生物方法的各步骤，如实施例1所示。
图2对(A)ATP生物发光通用检测法所获结果与(B)利用含1mg/ml溶菌酶、100mMEDTA、374.5μg/mlPEI、和RNAse抑制剂(1x浓度)作为试剂的7号透化组合物、以根据本发明方法用相应于SEQ IDNO.2的杂交探针，特异性检测枯草芽孢杆菌(B.subtilis)所获结果，进行了比较。方法(A)和(B)在同一膜上进行，其中革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞沉积于所述膜上。左图在计算机生成图中显示了通过膜上的发光检测到的细菌小菌落的位置，右图显示的是同一膜，其在倾斜平面上突出显示了各个检测到的小菌落所发射的光信号强度。产生显著光信号的小菌落数量显示在计算机生成图象的右下角。在(A)和(B)中计数的小菌落数量基本相同，然而，(B)信号具有更高的分辨率。
图3显示了根据本发明使用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)特异性探针时所获的计算机生成图，所述图分别涉及细菌菌落(A)枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，(B)金黄色葡萄球菌(S.aureus)，(C)绿脓杆菌(P.aeruginosa)，(D)大肠杆菌(E.coli)，以及(E)肠道沙门氏菌亚利桑那亚种(S.enterica subsp arizonae)。该图显示，本发明方法能获得微生物的特异性检测。
图4-9显示了用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)作为靶微生物、按照实施例1所记载的方案获得的计算机生成图。各图分别对应于实施例1中指定的透化组合物的使用。在这些图中，(A)透化在室温下进行，(B)透化在37℃进行。左图在计算机生成图中显示了通过膜上的发光检测到细菌小菌落的位置，右图显示的是倾斜平面上的同一膜，其突出显示了各个检测到的小菌落所发射的光信号强度。
图4相应于使用含4mg/ml溶菌酶的透化组合物(组合物No.1)作为透化剂。
图5相应于使用含4mg/ml溶菌酶和5mMEDTA的组合物(2号组合物)作为透化剂。
图6相应于使用含4mg/ml溶菌酶和100mMEDTA的组合物(3号组合物)作为透化剂。
图7相应于使用含4mg/ml溶菌酶和374.5μg/mlPEI的组合物(4号组合物)作为透化剂。
图8相应于使用含4mg/ml溶菌酶，5mM EDTA和374.5μg/ml PEI的组合物(本发明的5号组合物)作为透化剂。
图9相应于使用含4mg/ml溶菌酶，100mM EDTA和374.5μg/ml PEI的组合物(本发明的6号组合物)作为透化剂。
图10显示了用含4mg/ml溶菌酶，100mM EDTA和374.5μg/ml PEI的透化组合物作为试剂，根据本发明方法特异性检测革兰氏阴性菌绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)时，获得的计算机生成图。左图在计算机生成图中显示了通过膜上的发光检测到的细菌小菌落的位置，右图显示的是倾斜平面上的同一膜，其突出显示了各个检测到的小菌落所发射的光信号强度。
本发明的目的更特别涉及将上述透化组合物应用于在膜上计数和/或鉴定原存在于液体或气体介质中的微生物的方法中。
根据本发明的具体实施方式，该方法特征在于，其包括下列步骤：
(a)将液体或气体介质经膜过滤，使该介质中所存在微生物滞留于膜上或膜内；
(b)将膜和微生物与上述含PEI，EDTA和溶菌酶的透化组合物接触；
(c)将细胞用交联剂固定于膜上；
(d)将微生物与一种或多种能透过微生物细胞壁的可选标记大分子接触；以及
(e)检测透化进入微生物的大分子。
本发明方法的目标微生物更特别选自，假单胞菌(Pseudomonas)，埃希氏菌(Escherichia)，军团菌(Legionella)，沙门氏菌(Salmonella)，李斯特菌(Listeria)，杆菌(Bacillus)，链球菌(Streptococcus)，弧菌(Vibrio)，耶森氏菌(Yersinia)，葡萄球菌(Staphylococcus)，分支杆菌(Mycobacterium)，志贺氏菌(Shigella)，梭菌(Clostridium)，弯曲杆菌(Campylobacter)，或气单胞菌(Aeromonas)属的革兰氏阳性或革兰氏阴性致病菌；贾第虫(Giardia)，内阿米巴(Entamoeba)，隐孢子虫(Cryptosporidium)，或环孢子虫(Cyclospora)属的原虫；支原体(Mycoplasma)或脲原体(Ureaplasma)属的支原体；曲霉属(Aspergillus)，假丝酵母属(Candida)或青霉属(Penicillium)的真菌；以及导致甲型肝炎至戊型肝炎的病毒，其中，所述微生物天然具有致病性并且通常会在环境中遇到。
该方法原则上也可用于检测诸如蓝细菌的单细胞藻类，诸如变形虫或线虫、吸虫或蛔虫卵的寄生生物体的单细胞形式，或者诸如花粉或精虫的其它植物或动物配偶子。
本方法的目的是，对液体介质例如水、或者气体介质例如空气中所存在微生物进行计数，同时尽可能地确定它们的种类(科、属、种、等等)。术语“液体或气体介质”是指，能通过应用压力差经膜过滤的任何流体，其中所述膜具有的孔平均直径通常在0.1-1.5微米，优选在0.15-0.8微米，更优选在0.2-0.6微米。这样的流体既可以包括涉及无菌产品制备过程中的单纯溶液，也可包括诸如饮用水、饮料、医学流体(血清、尿、羊水等)的复杂溶液。
本发明方法可在诊断领域中有多种应用，用以分析源自动物或患者的液体样品。
术语“膜”在本申请中是指，具有两面、其孔具有已知平均直径的合成支持物。
用在本发明中的膜，通常具有较高的表面/体积比，以及其固定厚度优选90-200微米。
这样的膜可以为单层或多层。通常，该膜由选自下列的一种或多种材料组成：聚四氟乙烯，聚偏二氟乙烯(PVDF)，聚碳酸脂，聚酰胺，聚酯，聚醚砜，醋酸纤维素，和硝酸纤维素。
材料优选那些能与所用溶剂相容的，特别是能与本方法各步骤中所使用的醇类和醛类相容。
微生物检测膜，优选主要由PVDF(聚偏二氟乙烯)或
Figure A200810125896D0011124212QIETU
(尼龙)组成。更优选地，所述膜为
Figure A200810125896D0011124219QIETU
公司以商标Milliflex和货号MXHVWP124或RMHVMFX24售卖的那种类型PVDF过滤膜。
本发明方法的步骤a)在于，将待分析液体或气体介质经上述膜过滤，以滞留介质中所含的微生物于膜表面。
在微生物过滤并滞留于膜上之后，在本方法步骤a)和步骤b)之间，可包括将微生物与合适培养基接触培养的可选步骤。所述培养基优选琼脂培养基，过滤后将滤膜放置于其上。该可选步骤使得可获得各初滤微生物的菌落，使检测更容易。
根据本发明，然后在步骤b)中，将微生物在本发明的透化组合物中温育。
该温育步骤在可在滤膜表面形成薄膜的少量溶液中进行。优选地，透化组合物可包含于将膜放置在其上的固相支持物(例如浸渍垫)中，由此，可限制膜表面任何可能的液体移动，而避免微生物混杂。该步骤在20℃-37℃进行5-20分钟。
本发明的方法更加有效，因为该方法包括用交联剂将细胞固定于膜上的步骤c)。
该步骤可将细胞固定于膜支持物上。本发明优选的交联剂，选自戊二醛、甲醛和多聚甲醛，其中多聚甲醛是指由至少六个单元甲醛组成的分子。优选地，固定组合物可包含于将膜放置在其上的固相支持物(例如浸渍垫)中，由此，可限制膜表面任何可能的液体移动，而避免微生物混杂。优选地，根据本发明，固定步骤在20℃-35℃进行5-20分钟。
该固定步骤也可用UV-射线，在膜上照射微生物进行。膜优选由组成。
将微生物与可经微生物细胞壁透化至所述微生物中的一种或多种可选标记大分子接触的步骤d)，优选在各温育和固定步骤b)和c)终末进行，因为这时是据观察微生物细胞壁对大分子的通透性最高的时机。
在本发明优选的实施方式中，将大分子标记并用作探针。
术语“探针”在本文是指，能识别、结合组成微生物的生物元件的大分子，由此，允许所述微生物被标记。
本发明优选的一方面，探针是能与微生物中所存在DNA或RNA序列杂交、并对所述核酸具有一定程度特异性的大分子。本发明可提供本领域技术人员已知的、能与核酸杂交的任意类型探针，例如简单寡核苷酸，2’-O-甲基-RNA型寡核苷酸，PNA型探针(嘌呤或嘧啶碱基取代多肽链所组成的探针)[NielsenP.E.et al.Science(1991)254：1497-1500]，或者专利EP 1 013 661中所记载的LNA型探针(含一个或多个2’-O-4’-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖单体的寡核苷酸)。
本发明人已经注意到，能杂交微生物核糖体RNA的探针，特别能用于本发明。
因此，本发明的一方面由下列探针组成，其中所述探针所包含的序列，与SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5相同，或者与上述序列显示出至少80％、优选90％、更优选95％的相同性。这样的探针特别适用进行本发明的计数和/或鉴定方法。本发明的另一方面，透化至微生物中、与上述探针特性相同的大分子，可以用作引物，用于对微生物所含核酸进行特异性扩增的额外步骤。如果这样的大分子用于本发明方法中，那么，该额外但可选步骤可在步骤c)和e)之间、优选在步骤d)和e)之间引入本发明方法。
这样的扩增步骤，通过增加可用于检测的核酸量，对于以最佳方式检测微生物有用。如果该扩增步骤具有高度特异性，其也能使鉴定微生物具有更高选择性，由此，可降低假阳性数量。这样的扩增优选TMA或NASBA型扩增[Compton，J.，Nature(1991)350：91-92]，或者LAMP型扩增[NotomiT.，NucleicAcids Research(2000)，28(12)：e63]。
上述探针或引物可以进行设计，以检测一种或几种类型的微生物。在此情况下，探针或引物可对微生物中所存在生物元件具有不同程度的特异性。例如，如果引物或探针是被选择用于与多种微生物保守核酸序列进行杂交的核酸，那么，该鉴定将会是相对非特异性的；另一方面，如果该序列被选择用于仅识别少数物种的特异性序列，那么，该鉴定的特异性将较强。
在本发明的又一具体实施方式中，优选地，核酸探针或引物与所述微生物核酸特异性杂交的步骤，在步骤d)之后和其后进行的检测步骤e)之前进行。
该核酸探针或引物杂交步骤，在本领域技术人员已知的标准杂交条件下进行。该步骤也可包括去除非特异性杂交核酸探针或引物的洗涤步骤。
为进行检测，本发明的核酸探针或引物，优选进行荧光标记，或者将其与能产生化学发光反应的酶进行偶联。
微生物检测步骤(e)，根据探针或引物标记情况用合适的界面，通过检测源自化学发光反应或所获荧光的发射的光信号来进行。
本发明的又一优选方面，核酸探针例如寡核苷酸，可与过氧化物酶偶联。将过氧化物酶置于发光氨(过氧化物酶底物)中时，所述过氧化物酶可发出光子(生物发光反应)。膜表面小菌落所发光子可经光纤维俘获，而传递至可将光子转化为电子的光电阴极。每个电子将产生电子团，当到达荧光屏时，该电子团又转化为光子。CCD相机整体上以每秒30次，记录发射光，然后，将图象传送至图象分析仪。
另一方面，本发明的上述透化组合物，可用于进行体外诊断实验。本发明组合物的特定性质，实际上可用于使核苷酸探针或其它任何分子复合物，透化至人或动物取样细胞或培养基所保存细胞，以进行原位检测。
本发明的透化组合物也可应用于医药领域的许多方面，例如用作药物佐剂，以增加通常不易自然透化入细胞的活性成分诸如抗生素或抗病毒剂的细胞壁通透性。
更特别地，本发明的组合物可用于使反义核酸，特别是反义RNAs(iRNAs)透化至需要抑制某其中基因表达的细胞，以特别用于治疗遗传疾病或某种癌症。
本发明也包括在液体或气体介质中检测并计数微生物的试剂盒，该试剂盒至少包括：
—液体或气体介质过滤膜；和
—本发明记载的透化组合物。
优选地，该试剂盒中所含的膜，主要由PVDF或
Figure A200810125896D0013124336QIETU
。
优选地，这样的试剂盒也包括含有选自下列交联剂的组合物：戊二醛、甲醛和多聚甲醛。该第二组合物可将微生物固定于膜上，从而进行本发明方法能获得更好的检测分辨率。
本发明的试剂盒，也可包括特异性检测所选微生物的探针，特别是如上所述含有序列与SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，或SEQ ID NO.5具有至少80％相同性的相关探针。
下列实施例的目的，是为了解释本发明而不是为了限制本发明。
实施例1
用Milliflex rapid法对菌株进行常规检测
将测试株保存于-80℃冷冻低温管(Dutscher，ref.028049)，所述测试株从ATCC，DSMZ及NCTC登记的冻干株制备而来。
为制备低温管，将100ml摇瓶TS肉汤(Biomérieux，ref.41146)在该管制备的当天，接种并35-37℃温育。生长期间，用光谱仪定期进行600nm OD检测(Eppendorf，Biophotometer ref.6131000.012)。当OD达到0.5时，终止生长。将600μl低温保护剂(Sigma，乙二醇冷冻细胞，ref.C6039)和600μl培养物，分装至各低温管。混合该管，然后置于-80℃。
计数通过10-5和10-6分置稀释，在肉汤和非冷冻低温管中进行。该稀释液制备于9ml蛋白胨水摇瓶(Biomérieux，ref.42111)。用分布器取出各稀释液100μl，涂覆于TSA琼脂(Biomérieux，ref.43011)，35℃温育24小时。该步骤重复三次。第二天，将低温管解冻并以相同方式计数。API软件包(Biomérieux)能鉴定并确认所制备低温管的纯度。
在所有测试中，将菌株都稀释于蛋白胨水试管(Biomérieux，ref.42111)。通过将1ml所用低温管菌株加至试管中的9ml蛋白胨水中，可连续稀释制备直至获得所期望稀释液。
用Milliflex+真空泵(Millipore，ref.MXPPLUS01)，在带0.45μm疏水网格型PVDF膜的Milliflex Rapid滤斗上(Millipore，ref.RM HVMFX24)进行过滤。将细菌加至50-100ml含0.9％NaCl的生理盐水中(B.Braun，ref0066570E)。
在32.5℃±2.5℃温育器中，将膜在Milliflex胰蛋白酶-大豆琼脂(Millipore，ref.MXSM CTS48)或R2A(Millipore，ref.MXSM CRA 48)固体培养基盒中温育。
温育之后(温育时间取决于所用细菌)，将裂解和生物发光试利(Millipore，ref.MXRP BLRST)用“Milliflex Rapid自动喷射仪”(Millipore，ref.MXRPSPRKT)施于膜，其中所述喷射仪可平均分布各试剂35μl于膜表面。然后，按制造商使用说明，用Milliflex Rapid***(Millipore，ref.MXRPKT230)读取膜值。
Milliflex Rapid***是用CCD相机检测、放大并记录，生物发光反应发光的综合***。它由CCD相机检测台，放大器，图象分析仪，以及用于收集、处理并记录数据的软件组成。
分析仪会减除发射信号的背景噪音，以产生计算机传送图象。然后，膜示意图会显示在屏幕上，该***会计数膜上所存在的菌落，以数字2-10表示。根据本发明方法用寡核苷酸探针特异性检测菌株
就Milliflex Rapid***方面而言，用Milliflex+真空泵在带0.45μmPVDF膜的滤斗上(Millipore，ref.MXHVWP 124)进行过滤。将待测菌株细胞，加至50-100ml含0.9％NaCl的生理盐水中。接着，将膜在32.5℃±2.5℃下、在MilliflexTSA培养基盒中(Millipore，ref.MXSM CTS48)温育足够微生物形成微菌落的一段时间。
将膜从琼脂培养基移出，然后在防渗漏支持物上(Millipore液体培养基盒吸收垫，ref.MXLM CO120)，将膜与2ml透化溶液在室温或37℃下接触5-20分钟(取决于所检测微生物种类)。对下列透化溶液进行检测：
透化溶液No.1
—溶菌酶                4mg/ml
透化溶液No.2
—溶菌酶                4mg/ml
—EDTA                  5mM
透化溶液No.3
—溶菌酶                4mg/ml
—EDTA                  100mM
透化溶液No.4
—溶菌酶                4mg/ml
—PEI                   374.5μg/ml
透化溶液No.5
(本发明)
—溶菌酶                4mg/ml
—EDTA                  5mM
—PEI                   374.5μg/ml
透化溶液No.6
(本发明)
—溶菌酶                4mg/ml
—EDTA                  100mM
—PEI                   374.5μg/ml
在膜用透化溶液处理后，将膜与含下列成分的2ml固定溶液室温接触10分钟：
—H2O2+尿素             0.01％
—甲醛                  1％
—乙醇                  80％
—H2O                   qs lL
然后，将膜转移至杂交盒，与含下列成分的1.5ml预杂交溶液接触：
—葡聚糖                 10％
—NaCl                   1.74％
—甲酰胺                 30％
—焦磷酸钠               0.1％
—PVP                    0.2％
—Ficoll                 0.2％
—EDTA                   0.186％
—TritonX-100            1％
—Tris-HCl               0.738％
—H2O                    qs1L
接着，将膜50℃轻微振荡(10rpm)温育15分钟。将预杂交溶液然后，用1.5ml含100mM探针的相同溶液替换，以在膜表面形成薄膜。
这样，在50℃轻微振荡下(10rpm)，将膜与杂交溶液温育60分钟。
然后，用含下列成分的20ml洗涤溶液(pH＝10)洗涤膜：
—CAPSO                 0.26％
—Tween 20              0.2％
—H2O                   qs 1L
将该洗涤溶液稀释于50℃预热的1L水中。振荡下(30rpm)将膜导入洗涤溶液，重复三次。
特异性杂交盒和特异性洗涤皿，可以 MXREXPEND货号和MXRPWASHR货号获得。
然后，将膜用包含作用于与寡核苷酸探针偶联的过氧化物酶分子的发光试剂喷射剂(发光氨和过氧化氢-Millipore，ref.WBKLS0050)的喷射仪(MilliflexRapid自动喷射仪)处理，然后，以常规检测的相同方式以Milliflex 
Figure A200810125896D00171
R-pseudo程序，进行图象分析。
透化实验中所测试的各化学产品，来自公司：溶菌酶(ref.L6876)，EDTA(ref.E5134)，聚乙烯亚胺(ref.P3143)，葡萄糖酸氯己定(ref.C9394)，精氨酸乙酯(ref.A2883)，蛋白酶K(ref.P4850)，RNase抑制剂(ref.R7397)。溶液于PBS(Gibco，ref.20012-019)制备，并用液体培养基盒应用于膜。
为特异性检测革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，将使用上述1-6的各种透化溶液所获结果示于图4-9。
为证实膜上所出现所有细菌被有效透化，计算本发明透化和杂交方案所检测菌落数量(使用SEQ ID NO.2序列寡核苷酸探针)与常规琼脂培养基计数所检测菌落数量的比率(覆盖率)。所获结果及相应的覆盖率，在下表1中给出。
表1：
 
组合物 ％覆盖率(透化性，室温) ％覆盖率(透化性，37℃)
溶菌酶(4mg/ml) 12.5％ 13.7％
溶菌酶(4mg/ml)+EDTA(5mM)    18.8％ 13.7％
溶菌酶(4mg/ml)+EDTA(100mM)  22.9％ 33.9％
溶菌酶(4mg/ml)+PEI(374.5μg/ml) 25％ 47.9％
溶菌酶(4mg/ml)+EDTA(5mM)+PEI(374.5μg/ml) 22.9％ 39.5％
溶菌酶(4mg/ml)+EDTA(100mM)+PEI(374.5μg/ml) 33.9％ 60％
从表1可以看出，最有效的透化溶液是含溶菌酶(4mg/ml)，EDTA(100mM)和PEI(374.5μg/ml)的6号组合物，特别是当其在37℃使用时。接着，针对该6号组合物进行，两种不同浓度溶菌酶(1和4mg/ml)，以确定是否能获得最佳覆盖率。对这两种浓度比较，按上述特异性检测方案、以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)作为检测靶，进行。覆盖结果示于表2。
表2
 
溶菌酶浓度 1mg/ml 4mg/ml
覆盖率 71.4％ 62.1％
该结果显示，1mg/ml溶菌酶浓度根据本发明，比4mg/ml该更高浓度，可获得更优结果。
对包含下列成分的“优化”透化组合物No.7：
—溶菌酶                    1mg/ml
—EDTA                      100mM
—PEI                       374.5μg/ml
—RNAse抑制剂               1X
按上述指定方案和常规检测方案(平行对照)，对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)进行测试。结果示于图2。按R-Pseudo图象分析仪所计数菌落数量而计算出的覆盖率，为100％。
用SEQ ID NO.3序列寡核苷酸探针，对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(表3)获得了相似结果。
表3：
 
温育6h后***计数的CFU数量            温育7h后***计数的CFU数量            温育8h后***计数的CFU数量           
778731 255201120 4832303021
覆盖率52.2％ 覆盖率73.9％ 覆盖率139％ 
目的在于验证按本发明所记载特异性检测方法是否能特异性检测枯草芽孢杆菌的(B.subtilis)实验，用下列5种微生物进行：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)，绿脓杆菌(P.aeruginosa)，大肠杆菌(E.coli)，和肠道沙门氏菌亚利桑那亚种(S.enterica subsp arizonae)。在TSA培养基25℃过夜温育之后，进行实验，以保证所有微生物都生长。使用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)特异性探针(SEQ ID NO.2)获得的结果示于图3。
根据本发明在37℃下在浸润垫上使用6号透化组合物(4mg/ml溶菌酶+100mM EDTA+374.5μg/ml PEI)20分钟，以与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)相同的方式特异性检测革兰氏阴性菌绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。为此目的，使用相应于SEQ ID NO.1序列的寡核苷酸探针作为杂交探针。该实验最终所获图象，经图象分析仪，示于图10。可以观察到，本发明方法允许较好地分辨所检测细菌的小菌落。
序列表
<110>米利波尔公司(MILLIPORE CORPORATION)
<120>含乙二胺四乙酸(EDTA)和聚乙烯亚胺(PEI)的组合、能渗透微生物细胞壁的新组合物
<130>BIF117190FR
<150>FR 0754623
<151>2007-04-20
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>artificial DNA
<220>
<221>misc_binding
<222>(1)..(25)
<223>hybridization probe for the specific detection of Pseudomonas aeruginosa RNA
<400>1
Figure A200810125896D00201
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>artificial DNA
<220>
<221>misc_binding
<222>(1)..(25)
<223>hybridization probe for the specific detection of Bacillus subtilis RNA
<400>2
Figure A200810125896D00202
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>artificial DNA
<220>
<221>misc_binding
<222>(1)..(22)
<223>hybridization probe for the specific detection of Staphylococcus aureus RNA
<400>3
Figure A200810125896D00211
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>artificial DNA
<220>
<221>misc_binding
<222>(1)..(24)
<223>hybridization probe for the specific detection of Escherichia coli RNA
<400>4
Figure A200810125896D00212
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>artificial DNA
<220>
<221>misc_binding
<222>(1)..(25)
<223>hybridization probe for the specific detection of Salmonella enterica RNA
<400>5
Figure A200810125896D00213

Claims (25)

1、用于透化微生物细胞壁的组合物，其特征在于其包括聚乙烯亚胺(PEI)和乙二胺四乙酸(EDTA)的组合，并且在所述组合物中，PEI终浓度大于100μg/ml，EDTA终浓度大于50mM。
2、权利要求1的组合物，其特征在于其进一步包括溶菌酶。
3、权利要求1和2任一项的组合物，其特征在于EDTA在终组合物中的浓度在50-150mM之间，优选在50-100mM之间。
4、权利要求1-3任一项的组合物，其特征在于所述组合物中PEI浓度在100-900μg/ml之间，优选在200-800μg/ml之间。
5、权利要求1-4任一项的组合物，其特征在于其不包含任何去垢剂。
6、在膜上计数和/或鉴定原存在于液体或气体介质中的微生物的方法，其特征在于其包括下列步骤：
(a)将液体或气体介质经膜过滤，以使该介质中所存在的微生物滞留于膜上或膜内；
(b)将所述膜和微生物与权利要求1-5的用于透化微生物细胞壁的组合物接触；
(c)用交联剂将细胞固定于膜上；
(d)将微生物与一种或多种能透过微生物细胞壁的任选地标记的大分子接触；
(e)检测穿透进微生物中的大分子。
7、权利要求6的方法，其特征在于其在步骤a)和步骤b)之间，包括培养该微生物的额外步骤。
8、权利要求6和7任一项的方法，其特征在于步骤c)中用作交联剂的试剂选自戊二醛、甲醛和多聚甲醛。
9、权利要求6-8任一项的方法，其特征在于在步骤d)中所用大分子为杂交探针，优选寡核苷酸或PNA-型杂交探针。
10、权利要求9的方法，其特征在于该杂交探针与所述微生物的RNA杂交。
11、权利要求10的方法，其特征在于该杂交探针与所述微生物的核糖体RNA杂交。
12、权利要求9-11任一项的方法，其特征在于步骤d)中所用杂交探针所包含的寡核苷酸序列与选自SEQ ID NO.1，2，3，4和5的序列具有至少80％相同性。
13、权利要求6-12任一项的方法，其特征在于在步骤d)中，所述大分子通过与允许发出光或荧光信号的酶偶联来标记。
14、权利要求13的方法，其特征在于步骤e)中微生物的检测是通过化学发光或荧光反应并用合适的界面识别发出的光信号而进行的。
15、权利要求6-14任一项的方法，其特征在于其在步骤d)和步骤e)之间，包括将探针或引物与所述微生物的核酸特异性杂交的额外步骤。
16、权利要求6-15任一项的方法，其特征在于其在步骤c)和步骤e)之间，包括将微生物中所存在的核酸进行特异性扩增的额外步骤。
17、权利要求6-16任一项的方法，其特征在于用于微生物检测的膜主要由PVDF或组成。
18、权利要求1-5任一项的透化组合物使大分子穿透进分离的细胞或微生物中的应用。
19、权利要求1-5任一项的透化组合物在计数和/或鉴定微生物的方法中的应用。
20、包含PEI和EDTA组合的透化组合物作为药物佐剂的应用。
21、检测并计数微生物的试剂盒，其特征在于其包括：
—至少一种标记的大分子；和
—权利要求1-5任一项的用于透化微生物细胞壁的组合物。
22、权利要求21的试剂盒，其特征在于其还包括含交联剂的组合物，所述交联剂选自戊二醛、甲醛和多聚甲醛。
23、权利要求21或22任一项的试剂盒，其特征在于所述标记的大分子由杂交探针组成。
24、权利要求23的试剂盒，其特征在于标记的大分子由含有下述序列的杂交探针组成，其中所述序列与SEQ ID NO.1-5的任一序列具有至少80％相同性。
25、权利要求21-24任一项的试剂盒，其特征在于其还包括滤膜，优选PVDF或
Figure A200810125896C00032
膜。
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