CN115725462A - 一株耐多粘菌素产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌EC382-2-2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐多粘菌素产超广谱β‑内酰胺酶大肠杆菌EC382‑2‑2及其应用。本发明的大肠杆菌EC382‑2‑2，于2022年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏号为GDMCC No：62929。所述大肠杆菌EC382‑2‑2同时携带eae毒力基因、质粒介导的耐多粘菌素基因mcr‑1、超广谱β‑内酰胺酶基因CTX‑M‑55，以及其他抗生素耐药基因。大肠杆菌EC382‑2‑2携带18种耐药基因并对多种抗生素产生高水平耐药，可作为筛选新型抗菌药物的模式菌株，具有良好的应用前景。

Description

一株耐多粘菌素产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌EC382-2-2及 其应用

技术领域：

本发明涉及耐药致病菌技术领域，尤其涉及一株耐多粘菌素产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌EC382-2-2及其应用。

背景技术：

大肠杆菌O157是一种重要的人畜共患病病原菌，可引起人和动物腹泻、出血性肠炎和溶血性尿毒综合症等疾病，给食品安全和人类健康造成严重威胁。E.coli O157包含多个H型，其中O157:H7是国内外研究最多的一类血清型，具有高致死率。除O157:H7外，近年来多种其他H型被报道与人类严重感染相关，例如O157:H45、O157:H26、O157:H2和O157:H16等。食用受E.coli O157污染的肉类蔬菜等是食物中毒的主要原因。目前，E.coli O157仍是世界各国重点追踪和监测的重要病原菌。

抗生素对于大肠杆菌(包括大肠杆菌O157)感染治疗具有一定辅助作用，但是随着抗生素在畜牧养殖和临床的广泛/过度使用，大肠杆菌及大肠杆菌O157耐药性逐年增加，多重耐药菌株在动物、食品和环境中不断扩散。泛耐药菌株可通过食品传播给人类，给临床和畜牧业细菌感染治疗带来新挑战。当前，耐药菌株的流行和蔓延已成为一个重要的公共卫生问题。文献资料显示，大肠杆菌对多数喹诺酮类药的耐药率高达50％，三代头孢的耐药率达到20％以上，且五重、六重、七重耐药情况占主导。多粘菌素(Colistin)被认为是治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后选择。然而自2015年我国首次报道质粒介导黏菌素耐药基因mcr-1以来，耐多粘菌素大肠杆菌在全球范围报道逐渐增多。Mcr-1基因通过可转移质粒在不同的细菌中水平传播，导致新的多重耐药和泛耐药菌开始出现。截止目前，质粒介导的mcr-1基因已经在大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌等多种肠杆菌科细菌中检出，部分菌株同时携带超广谱β-内酰胺酶类ESBL基因和mcr-1基因，导致对三代头孢和多粘菌素产生抗性，进一步限制了抗生素的选择，增加了疾病治疗的难度。

持续追踪监测新耐药菌的出现，及时更新报告耐药菌扩散情况，逐步完善数据共享服务平台，对于开发新型药物、保障人类健康具有重要意义。

发明内容：

为克服现有技术的不足，本发明提供一株同时携带多重耐药基因和毒力基因的大肠杆菌O157新菌株-大肠杆菌EC382-2-2及其应用，该菌株为国际上首次报道，可作为筛选新型抗菌药物的模式菌株，具有良好的应用前景。

本发明的第一个目的是提供一株致病大肠杆菌(atypical enteropathogenicEscherichia coli,aEPEC)EC382-2-2，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)EC382-2-2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏日期为2022年10月27日，保藏编号为GDMCC No：62929。

本发明提供的大肠杆菌EC382-2-2，属于血清型O157:H26，同时携带18种耐药基因和1种毒力基因，其所携带基因如下：

耐药基因：ant(2’)-Ia，aph(3’)-Ib，aph(3’)-IIa，aph(3’)-XV，aph(6’)-Id，floR，catB3，CTX-M-55，OXA-4，TEM-214，mcr-1，dfrA1，fosA3，mdf(A)，oqxA，oqxB，sul2，tet(A)；

毒力基因：携带编码LEE黏附位点的毒力基因(eae)；

染色体上喹诺酮类耐药突变位点：

gyrA基因编码产物的第83位的丝氨酸(S)突变为亮氨酸(L)；

gyrA基因编码产物的第87位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)；

parC基因编码产物的第80位的丝氨酸(S)突变为异亮氨酸(I)。

所述的致病大肠杆菌EC382-2-2，为革兰氏阴性、短杆菌，API 20E鉴定为大肠杆菌(5044552)，符合率为99.5％。其生化特征如下：ONPG试验(+)，精氨酸双水解酶(-)，赖氨酸脱羧酶(+)，鸟氨酸脱羧酶阳性(-)，柠檬酸盐(-)，产生硫化氢(-)，尿素酶(-)，苯丙氨酸脱氨酶(-)，吲哚试验(+)，VP试验(-)，不能液化明胶，发酵葡萄糖、甘露醇、山梨醇、鼠李糖、密二糖、***糖，不发酵肌醇、蔗糖和苦杏仁苷，具大肠杆菌典型生理生化特征。血清型分子鉴定为血清型O157:H26。

本发明的第二个目的是提供上述大肠杆菌EC382-2-2在作为筛选新型抗菌药物的模式菌株中的应用。

优选，是大肠杆菌EC382-2-2作为模式菌株在筛选抗大肠杆菌的功能微生物、药物、制剂或抗菌材料中的应用。

优选，所述的功能微生物、药物、制剂或抗菌材料是抑制耐氨苄西林、阿莫西林克拉维酸、头孢噻肟、多粘菌素E、庆大霉素、环丙沙星、复方新诺明、四环素和氟苯尼考的大肠杆菌的功能微生物、药物、制剂或抗菌材料。

优选，所述的大肠杆菌EC382-2-2可作为抗生素药物，例如多粘菌素或三代头孢测定的对照或模式菌株，用于辅助筛选食品微生物防控和临床治疗靶向药物。

优选，所述的大肠杆菌EC382-2-2作为检测耐药基因mcr-1/CTX-M-55和毒力基因eae的参照菌株。

本发明的第三个目的是能够特异性鉴别大肠杆菌EC382-2-2的核苷酸序列，如SEQID NO.1所示。

本发明的第四个目的是提供特异性鉴别大肠杆菌EC382-2-2的引物，包括：F:5’-TAGAAGGCTCTTTGGAAGCA-3’；R:5’-GACCGGACATCATCAGGAAG-3’。

本发明的第五个目的是提供特异性鉴别大肠杆菌EC382-2-2的方法，是采用上述引物对待测大肠杆菌进行PCR扩增或qPCR扩增，如果能够产生条带/信号，待测菌则为大肠杆菌EC382-2-2，如果不能产生条带/信号，待测菌不为大肠杆菌EC382-2-2。

优选，所述的PCR扩增，其扩增体系为25μL，包括12.5μL PCR mixture，10μmol/L上、下游引物各1.0μL，8.5μL ddH₂O，2.0μL DNA模板

优选，所述的PCR扩增，其扩增条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸60s，进行30个循环，最后72℃延伸10min。

本发明的有益效果：

本发明提供了一株耐多种抗生素的多重耐药致病大肠杆菌O157:H26新菌株EC382-2-2。该菌株同时携带eae毒力基因(致病大肠杆菌特有毒力基因)、质粒介导的耐多粘菌素基因mcr-1、超广谱β-内酰胺酶基因CTX-M-55，以及其他抗生素耐药基因。这是国际上首次发现18种耐药基因共存于同一株大肠杆菌非H7型O157中，属于新出现的高致病多重耐药菌。

本发明的大肠杆菌O157同时携带18种耐药基因[ant(2’)-Ia，aph(3’)-Ib，aph(3’)-IIa，aph(3’)-XV，aph(6’)-Id，floR，catB3，CTX-M-55，OXA-4，TEM-214，mcr-1，dfrA1，fosA3，mdf(A)，oqxA，oqxB，sul2，tet(A)]以及编码LEE黏附位点的毒力基因(eae)。这是国内外首次发现质粒介导的耐多粘菌素基因mcr-1,超广谱β－内酰胺酶ESBLs抗性基因CTX-M-55，TEM-214，OXA-4，喹诺酮类耐药基因(oqxAB)以及其他抗生素基因共存于同一株非H7型E.coli O157菌株中，该菌株在国际上未见报道。这一具有致病力的多重耐药菌株，可导致大肠杆菌O157菌株对三代头孢、多粘菌素、喹诺酮类药物等多种抗生素高度耐药，对治疗感染提出新的挑战。EC382-2-2对多种抗生素产生高水平耐药，包括氨苄西林(AMP)，阿莫西林克拉维酸(AMC)，头孢噻肟(CTX)，多粘菌素E，庆大霉素(GEN)，环丙沙星(CIP)，复方新诺明(SXT)，四环素(TE)和氟苯尼考(FFC)。这几种抗生素对大肠杆菌O157:H26 EC382-2-2菌株最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)分别为>128μg/mL，>128/64μg/mL，>8μg/mL，4μg/mL，>32μg/mL，>8μg/mL，>16/304μg/mL，>64μg/mL和>128μg/mL。本发明的大肠杆菌O157可作为筛选新型抗菌药物的模式菌株，具有良好的应用前景。

Escherichia coli EC382-2-2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏日期为2022年10月27日，保藏编号为GDMCC No：62929。

附图说明：

图1是大肠杆菌EC382-2-2菌落形态，EC382-2-2在大肠杆菌O157显色平板上呈现***菌落。

图2是大肠杆菌EC382-2-2革兰氏染色镜检(100×)。

图3是大肠杆菌EC382-2-2API 20E生化鉴定结果。

图4是大肠杆菌EC382-2-2血清型、耐药基因和毒力基因鉴定结果，血清型基因rfbE和filC_H26；

毒力基因eae；耐药基因CTX-M和mcr-1。

图5是大肠杆菌EC382-2-2及其他非目标菌株qPCR验证结果，从左到右为EC382-2-2、阪崎肠杆菌3414C1、单增李斯特菌CMCC54002、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、小肠结肠炎耶尔森氏菌256B1、单增李斯特菌CMCC54007、蜡样芽孢杆菌CMCC63301。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

实施例1：菌株分离

大肠杆菌O157:H26 EC382-2-2分离于中国内蒙古呼和浩特市鸡肉样品。检测方法参照《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》GB 4789.36-2016。以无菌操作取检样25g加入到含有225mL mEC+n肉汤的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质2min，36℃±1℃培养18-24h。用接种环取mEC+n增菌肉汤，划线接种于大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上，36℃±1℃培养18-24h，观察菌落形态。在大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上，典型菌落为圆形、光滑、边缘整齐、直径1-1.5mm***菌落(图1)。将菌落接种到LB肉汤中，37℃过夜培养，加入终浓度为50％甘油中，-40℃冰箱保存，同时行冻干管保存，获得大肠埃希氏菌O157 EC382-2-2，下称大肠杆菌(Escherichia coli)EC382-2-2。大肠杆菌(Escherichia coli)EC382-2-2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏日期为2022年10月27日，保藏编号为GDMCC No：62929。

实施例2：菌株EC382-2-2生化鉴定和血清型鉴定

将纯化后的菌株EC382-2-2进行形态特征、生理生化及血清型鉴定。

(1)革兰氏染色镜检

挑取1-2个单菌落于载玻片，进行革兰氏染色镜检观察形态。大肠杆菌EC382-2-2菌为革兰氏阴性、短杆状(图2)。

(2)API 20E鉴定

从NA平板上挑取单个菌落，用0.85％生理盐水制备成0.5麦氏浊度细菌悬浮液，按生物梅里埃API 20E试剂条说明书进行菌株鉴定(图3)。

(3)血清型鉴定

DNA提取试剂盒提取细菌DNA。参考文献中的引物序列进行O157抗原基因(rfbE)和H抗原基因(flicH26)鉴定，引物序列见下表(表1)。由华大基因合成，扩增体系为25μL，包括12.5μL PCR mixture，10μmol/L上、下游引物各1.0μL，8.5μL ddH₂O，2.0μL DNA模板。PCR扩增条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸60s，进行30个循环，最后72℃延伸10min。取6μL PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳分离(120V，25min)。

(4)大肠杆菌EC382-2-2菌株毒力因子鉴定

参考文献中方法对菌株毒力基因eae进行PCR鉴定，引物由华大基因科技有限公司合成(表1)。反应体系同上，取6μL的PCR产物上样于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离(120V，30min)(图4)。

(5)大肠杆菌EC382-2-2特异性分子靶标序列及qPCR验证

通过泛基因组分析，筛选E.coli EC382-2-2特异性分子靶标序列(SEQ ID NO.1)，设计特异性扩增引物(F:TAGAAGGCTCTTTGGAAGCA；R:GACCGGACATCATCAGGAAG)，进行传统PCR扩增及qPCR扩增。PCR扩增条件同上，qPCR扩增采用商业化试剂盒(SYB R qPCR SuperMixPlus)，反应体系20μL，包括2×SYBR qPCR Super Mix Plus 10μL，上、下游引物各1μL(终浓度1.0μM)，DNA模板2μL，RNase free water 6μL。扩增条件94℃ 3min，94℃ 15s，57℃ 30s，68℃ 40s，共40个循环，收集荧光信号，结果如图5所示，非目标菌未出现扩增或干扰，表明该靶标特异性良好。

结果表明，菌株EC382-2-2为革兰氏阴性、短杆菌，API 20E鉴定为大肠杆菌，生化代码5044552，符合率为99.5％。其生化特征如下：氧化酶阴性，ONPG试验(+)，精氨酸双水解酶(-)，赖氨酸脱羧酶(+)，鸟氨酸脱羧酶阳性(-)，柠檬酸盐(-)，产生硫化氢(-)，尿素酶(-)，苯丙氨酸脱氨酶(-)，吲哚试验(+)，VP试验(-)，不能液化明胶，发酵葡萄糖、甘露醇、山梨醇、鼠李糖、密二糖、***糖，不发酵肌醇、蔗糖和苦杏仁苷，具大肠杆菌典型生理生化特征(图3)。血清型PCR鉴定为O157:H26，见附图4。

根据形态、革兰氏染色、生化反应及血清鉴定可鉴定菌株为大肠埃希氏菌属大肠杆菌O157，命名为大肠杆菌(Escherichia coli)EC382-2-2。所述特异毒力基因eae的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

表1大肠杆菌EC382-2-2抗原基因及毒力基因引物序列及扩增片段

实施例3：菌株EC382-2-2耐药表型测定

按照美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standardsinstitute，CLSI)2018版的方法和结果判断标准，采用微量肉汤稀释法测定大肠杆菌EC382-2-2菌株对氨苄西林(AMP)、阿莫西林克拉维酸(AMC)、头孢噻肟(CTX)、多粘菌素E、庆大霉素(GEN)、环丙沙星(CIP)、复方新诺明(SXT)、四环素(TE)和氟苯尼考(FFC)的耐药水平。将EC382-2-2接种5mL LB肉汤，培养至对数期，调整至0.5麦氏浊度，稀释至1.0×10⁵cfu/mL。根据二倍梯度稀释，选择无菌96孔平底微量培养板，在每排第1孔中加入MH肉汤培养基50μL，然后在每排第1孔加入待测药物50μL，混合均匀，并取出50μL移至第2孔中，以此类推直至第12孔混匀后吸取50μL弃去。最后于各孔中加入稀释混匀后大肠杆菌EC382-2-2的菌悬液50μL。选择合适孔位加入100μL MH肉汤培养基作为阴性对照；加入50μL EC382-2-2菌液和50μL MH肉汤培养基作为阳性对照。将培养板置于37℃恒温箱中培养18-24h，用酶标仪读取OD值，测定MIC值。

经检测，氨苄西林(AMP)、阿莫西林克拉维酸(AMC)、头孢噻肟(CTX)、多粘菌素E、庆大霉素(GEN)、环丙沙星(CIP)、复方新诺明(SXT)、四环素(TE)和氟苯尼考(FFC)对大肠杆菌EC382-2-2菌株最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)分别为>128μg/mL，>128/64μg/mL，>8μg/mL，4μg/mL，>32μg/mL，>8μg/mL，>16/304μg/mL，>64μg/mL和>128μg/mL。大肠杆菌EC382-2-2菌株的药敏结果如表2所示。

表2大肠杆菌EC382-2-2菌株的药敏结果

实施例4：菌株EC382-2-2耐药基因的检测

由于致病大肠杆菌EC382-2-2对所选的β-酰胺类抗生素均产生耐药，为进一步确证其是否为ESBL菌株，采用PCR方法检测EC382-2-2是否携带CTX-M，该基因存在导致菌株对β-内酰胺类抗生素不敏感。同时检测mcr-1基因，该基因可导致菌株对多粘菌素E(colistin)耐药。将菌株接种于LB肉汤，37℃培养18-24h。根据Genomic DNA Mini Kit(Invitroge n,USA)试剂盒说明书方法提取基因组DNA。耐药基因采用单重PCR方法，参考文献中的引物序列(表3)。PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸50s，进行35个循环；最后72℃延伸8min。反应体系(25μL)包含：12.5μL 2×DreamTaqmaster mix，8.5μL超纯水，2μL模板DNA，10μmol/L上、下游引物各1.0μL。取5μL PCR扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离(120V，25min)(图4)

经鉴定，大肠杆菌EC382-2-2菌株同时携带这两种重要多重耐药基因，所述的mcr-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，CTX-M-55的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

表3耐药基因mcr-1和CTX-M基因引物序列及扩增片段

实施例5：大肠杆菌EC382-2-2全基因组测序

(1)基因组DNA提取

将大肠杆菌EC382-2-2在LB肉汤中37℃复苏18h，吸取1ml菌液，10000rpm离心10min收集菌体。利用细菌基因组提取试剂盒Genomic DNA MiniKit(Invitrogen,USA)提取细菌基因组DNA。所得基因组DNA经检测，OD280/OD260比值为1.86，DNA浓度为312ng/μL。

(2)Hiseq平台建库和文库质检

取100ng大肠杆菌EC382-2-2菌株的DNA，利用超声波破碎仪(Covaris S220)随机打断成小于400bp的片段，然后通过End Prep Enzyme Mix进行末端修复(包括5’末端磷酸化和3’末端加A)，两端加测序接头，再用磁珠纯化目的片段，然后通过P5和P7引物进行扩增，使用Agilent2100生物分析仪(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)检测文库质量，并且通过Qubit3.0检测文库浓度，用检验合格的文库进行cluster制备和测序。

(3)Pacbio平台建库和文库质检

取5-10ug高质量的基因组DNA，用Covarisg-TUBE随机打断成10Kb左右的片段(根据基因组大小选择20Kb文库)，随后用DNA Template Prep试剂盒构建SMRTbell文库、构建好的SMRTbell文库结合测序引物和聚合酶，以自由扩散的方式加入到PacBio Sequel平台的测序芯片中，准备测序。最后，对于质检台格的文库，进行上机测序。

(4)测序数据质控以及基因组组装

对于通过Hiseq平台获得的二代测序数据，使用cutadapt(v1.9.1)去除接头序列及低质量序列等，得到后续分析使用的二代测序clean data，使用Spades软件进行组装，获得二代测序的基因组草图。对于Pacbio平台获得的三代测序数据，使用HGAP4/Falcon(v0.3)进行组装，得到初步的组装结果。之后，将质量过滤后的二代测序数据比对到组装结果上，使用软件Pilon对组装结果进行进一步校正，得到最终的组装结果。

(5)基因组序列比对

采用本地程序Staramr(0.7.2)进行菌株基因组草图与Resfinder、Plasmidfinder和MLST数据库进行Blast比对。采用操作命令为“staramr search-o out/fna/382-2-2.fna”(输出文件夹为out)。最后在输出文件“result.xlsx”中查看结果。结果如表4所示。另外，发现了3个与喹诺酮类耐药相关的染色体突变位点：gyrA(S 83L)、gyrA(D 87N)和parC(S 80 I)。

表4 EC382-2-2菌株基因组测序及比对结果

实施例6：多重耐药菌株EC382-2-2的应用

EC382-2-2的具体应用主要体现在以下两个方面：

(1)可作为抗生素药物(多粘菌素和三代头孢)MIC测定的对照或模式菌株，用于辅助筛选新型食品微生物防控和临床治疗靶向药物。

抗菌药物的筛选方法如下：将待测药物用无菌超纯水溶解，配成初始浓度为2000μg/mL的溶液，二倍梯度稀释后用于测定最低抑菌浓度(minimum inhibitoryconcentration，MIC)。将本发明中大肠杆菌EC382-2-2在LB肉汤中37℃复苏18-24h，划线接种MH培养基，37℃复苏24h，挑取1-2个单菌落，用无菌生理盐水稀释，调整至0.5麦氏浊度，继续稀释至1.0×10⁵cfu/mL。根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI，2018)推荐的肉汤稀释法测定菌株对药物的MIC值，每组平行操作3次。利用96孔微量培养板，依据二倍梯度稀释法，在每排第1孔中加入MH肉汤100μL，然后在每排第1孔加入待测药物100μL，用移液器吹打混匀，取出100μL移至第2孔中，以此类推直至第12孔混匀后吸取100μL弃去。最后于各孔中加入混匀后的1×10⁵cfu/mL大肠杆菌EC382-2-2菌液100μL。以200μL MH肉汤为阴性对照，以100μL EC382-2-2菌液和100μL MH肉汤混合液为阳性对照。将培养板于37℃培养18-24h，用酶标仪读取OD值，测定其MIC值。

(2)作为检测耐药基因mcr-1/CTX-M-55和毒力基因eae的参照菌株

将待测菌株在合适复苏肉汤中培养18-24h，利用商业化试剂盒提取菌株DNA。利用本发明中mcr-1/CTX-M-55/eae的引物和扩增条件进行PCR扩增，电泳观察，判定菌株是否为mcr-1/CTX-M-55阳性的致病菌株。

具体如下：将待测菌株在合适复苏肉汤中培养18-24h，吸取1mL菌液，用商业化试剂盒提取菌株基因组DNA。采用单重PCR方法分别扩增mcr-1/CTX-M-55/eae基因，引物序列见表1和表3。PCR扩增体系25μL，包括12.5μL PCR mixture，10μmol/L上、下游引物各1.0μL，8.5μL ddH2O，2.0μL DNA模板。扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸60s，进行30个循环，最后72℃延伸10min。取6μLPCR扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离(120V，25min)。如果出现单一条带，表明该菌株mcr-1/CTX-M-55/eae阳性，说明为mcr-1/CTX-M-55阳性的致病菌株；若仅出现mcr-1/CTX-M-55目的条带，说明为耐药菌；若仅出现eae目的条带，说明为致病菌。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQ ID NO.1：382-2-2特异性靶标序列

ATGGATTTAAGTAAATTAGAAGGCTCTTTGGAAGCATCAGTAAAAAATTTTATATCAGTAATTGATGAAAAAACTGAAGATATTAAGAAAGCAACTATTGCCGAACTTATTCAAACAAGAGCCAGTACATTTGATCATCTTCCTGATGATGTCCGGTCAGCGGCAATTCACGTATATGTAACGGCAATAAGCAATATTGACCCCCCAATTGATGAAGAATCAAGAGATATTCAGAAAAAACGGTTTGAGATGTTAGCCAGCAACATTGTCGCTGGCTTTGCAAAGCTTACTTGTTGTTAG

SEQ ID NO.2：eae基因序列

ATGATTACTCATGGTTTTTATGCCCGGACCCGGCACAAGCATAAGCTAAAAAAAACATTTATTATGCTTAGTGCTGGTTTAGGATTGTTTTTTTATGTTAACCAGAATTCATTTGCAAATGGTGAAAATTATTTTAAATTGAGTTCAGATTCAAAACTGTTAACTCAAAATGCCGCTCAGGATCGCCTTTTTTATACGTTAAAAACAGGTGAAACTGTTGCCAATATTTCTAAATCACAGGGTATCAGTTTATCGGTAATTTGGTCACTGAATAAACATTTATACAGTTCCGAAAGCGAAATGATGAAGGCTGGACCTGGTCAGCAGATCATTTTGCCACTCAAAAAACTGTCTGTTGAATATAGTGCCTTACCTGTCTTAGGTTCGGCACCTGTTGTTGCTGCAGGTGGTGTCGCTGGTCATACGAATAAAATGACTAAAATGTCCCCGGACGCGACTAAAAGCAACACGACCGATGACAAGGCTCTAAATTATGCGGCACAACAGGCCGCGAGCCTTGGTAGCCAGCTCCAGTCGCGCTCACTGAACGGCGATTACGCGAAAGATACCGCTCTTGGTATGGCCAGCAGCCAGGCTTCGTCACAGTTGCAGGCCTGGTTACAACATTATGGAACGGCAGAGGTTAATCTGCAGAGTGGTAATAACTTTGACGGTAGTTCACTGGACTTCTTATTACCGTTCTATGATTCCGAAAACATGCTGGCATTTGGTCAGGTCGGTGCGCGTTACATTGACTCCCGCTTTACGGCAAATTTAGGTGCTGGCCAGCGTTTTTTCCTTCCTGAAAATATGTTGGGCTATAACGTCTTCATTGATCAGGATTTTTCTGGTGATAATACCCGTTTAGGTATTGGTGGCGAATACTGGCGAGACTATTTCAAAAGTAGCGTTAACGGCTATTTCCGCATGAGCGGCTGGCATGAGTCATACAATAAGAAAGACTATGATGAGCGCCCGGCAAATGGTTTTGATATCCGCTTTAATGGCTATTTACCATCATATCCGGCATTAGGCGCCAAACTGATGTACGAACAGTATTATGGTGATAATGTTGCTTTGTTTAATTCCGATAAGTTGCAGTCGAATCCTGGCGCGGCGACCGTTGGTGTAAACTACACTCCGATTCCTCTGGTGACGATGGGGATCGATTACCGTCATGGTACGGGTAATGAAAATGATCTCCTTTACTCAATGCAGTTCCGTTATCAGTTTGATAAACCGTGGTCTCAGCAAATCGAGCCACAGTATGTTAACGAGTTAAGAACATTATCGGGCAGCCGTTACGATCTGGTTCAGCGTAATAACAATATTATTCTGGAGTACAAAAAGCAGGATATTCTTTCTCTGAATATTCCGCATGATATTAATGGTACTGAACACAGTACGCAGAAGATTCAATTGATCGTTAAGAGCAAATACGGTCTGGATCGTATCGTCTGGGATGATAGCGCATTACGCAGTCAGGGCGGTCAGATTCAGCATGGCGGAAGCCAAAGCGCACAAGACTACCAGGCTATTTTGCCTGCTTATGTGCAAGGCGGCAGCAATATTTATAAAGTGACCGCTCGCGCCTATGACCGAAATGGTAATAGTTCTAATAATGTACAGCTCACTATTACCGTTTTACCGAATGGGCAGGTTGTGGACCAGGTTGGGGTAACGGACTTTACGGCTGATAAAACATCGGCTAAAGCGGATGGCATAGAAGCTATTACCTATACCGCGACGGTTAAAAAGAATGGTGTAGCTCAGGCTAATGTCCCTGTAACATTTAGTATTGTATCCGGGACTGCAACTCTTGGGGCAAATAGTGCCAGAACGGATGGTAACGGTAAGGCGACCGTAACGCTGAAGTCGGCTACGCCAGGACAGGTCGTCGTGTCTGCTAAAACCGCGGAGATGACTTCGCCACTTAATGCCAGCGCGGTTATATTTGTTGATCAAACCAAGGCCAGTATTACTGAGATTAAGGCTGATAAAACAACAGCGAAGGCAGATGGTTCTGATGCGATTACCTATACTGTCAGAGTGATGAAGGAGGGGGCACCCGTAGTAGATCAGAAAGTGACCTTTTCTAAGGATTTTGGGACCCTGAATAAGACTGAAGCAACAACCGATCAGAATGGTTATGCTACTGTAAAATTATCATCCAATACTCCTGGCAAGGCCATTGTTAGTGCAAAAGTGAGTGGAGTAGGTACAGAAGTTAAGGCTACTACCGTTGAGTTTTTTGCCCCGTTGAGTATTGATGGTGATAAAGTGACCGTAATTGGTACTGGTATCACGGGGGCTCTGCCAAAGAACTGGTTACAGTATGGTCAGGTTAAGCTACAGGCAACAGGGGGCAATGGAAAATACACATGGAAATCCAGTAATACTAAAATTGCTTCTGTTGATAACTCGGGAGTGATAACCTTAAATGAAAAAGGGAGTGCCACAATTACTGTAGTATCTGGTGATAATCAGAGTGCGACATACACAATTAATGCACCGGGTAGTATTGTAATTGCTGTGGATAAAAATACTCGAGTTACGTATTTTGATGCCGAAAACAAATGTAAGACAAATAGCGCAAATTTAGCACAGTCAAAAGAACTATTGGCCAATATCTATTCAACATGGGGTGCTGCAAATAAATATCCTTACTATTCTGGTTCTAAATCATTGACTGCTTGGATTAAACAATCCTCTTCTGAACAGTCATCAGGTGTATCAAGCACATATGATTTGGTTACGAAGAACCAGTTGAGCAATGTTGGAGTAAACAATAAGAATGCTTTTTCTGTTTGTGTAAAATAA

SEQ ID NO.3：mcr-1.1基因序列

ATGATGCAGCATACTTCTGTGTGGTACCGACGCTCGGTCAGTCCGTTTGTTCTTGTGGCGAGTGTTGCCGTTTTCTTGACCGCGACCGCCAATCTTACCTTTTTTGATAAAATCAGCCAAACCTATCCCATCGCGGACAATCTCGGCTTTGTGCTGACGATCGCTGTCGTGCTCTTTGGCGCGATGCTACTGATCACCACGCTGTTATCATCGTATCGCTATGTGCTAAAGCCTGTGTTGATTTTGCTATTAATCATGGGCGCGGTGACCAGTTATTTTACTGACACTTATGGCACGGTCTATGATACGACCATGCTCCAAAATGCCCTACAGACCGACCAAGCCGAGACCAAGGATCTATTAAACGCAGCGTTTATCATGCGTATCATTGGTTTGGGTGTGCTACCAAGTTTGCTTGTGGCTTTTGTTAAGGTGGATTATCCGACTTGGGGCAAGGGTTTGATGCGCCGATTGGGCTTGATCGTGGCAAGTCTTGCGCTGATTTTACTGCCTGTGGTGGCGTTCAGCAGTCATTATGCCAGTTTCTTTCGCGTGCATAAGCCGCTGCGTAGCTATGTCAATCCGATCATGCCAATCTACTCGGTGGGTAAGCTTGCCAGTATTGAGTATAAAAAAGCCAGTGCGCCAAAAGATACCATTTATCACGCCAAAGACGCGGTACAAGCAACCAAGCCTGATATGCGTAAGCCACGCCTAGTGGTGTTCGTCGTCGGTGAGACGGCACGCGCCGATCATGTCAGCTTCAATGGCTATGAGCGCGATACTTTCCCACAGCTTGCCAAGATCGATGGCGTGACCAATTTTAGCAATGTCACATCGTGCGGCACATCGACGGCGTATTCTGTGCCGTGTATGTTCAGCTATCTGGGCGCGGATGAGTATGATGTCGATACCGCCAAATACCAAGAAAATGTGCTGGATACGCTGGATCGCTTGGGCGTAAGTATCTTGTGGCGTGATAATAATTCGGACTCAAAAGGCGTGATGGATAAGCTGCCAAAAGCGCAATTTGCCGATTATAAATCCGCGACCAACAACGCCATCTGCAACACCAATCCTTATAACGAATGCCGCGATGTCGGTATGCTCGTTGGCTTAGATGACTTTGTCGCTGCCAATAACGGCAAAGATATGCTGATCATGCTGCACCAAATGGGCAATCACGGGCCTGCGTATTTTAAGCGATATGATGAAAAGTTTGCCAAATTCACGCCAGTGTGTGAAGGTAATGAGCTTGCCAAGTGCGAACATCAGTCCTTGATCAATGCTTATGACAATGCCTTGCTTGCCACCGATGATTTCATCGCTCAAAGTATCCAGTGGCTGCAGACGCACAGCAATGCCTATGATGTCTCAATGCTGTATGTCAGCGATCATGGCGAAAGTCTGGGTGAGAACGGTGTCTATCTACATGGTATGCCAAATGCCTTTGCACCAAAAGAACAGCGCAGTGTGCCTGCATTTTTCTGGACGGATAAGCAAACTGGCATCACGCCAATGGCAACCGATACCGTCCTGACCCATGACGCGATCACGCCGACATTATTAAAGCTGTTTGATGTCACCGCGGACAAAGTCAAAGACCGCACCGCATTCATCCGCTGA

SEQ ID NO.4：CTX-M-55序列

ATGGTTAAAAAATCACTGCGCCAGTTCACGCTGATGGCGACGGCAACCGTCACGCTGTTGTTAGGAAGTGTGCCGCTGTATGCGCAAACGGCGGACGTACAGCAAAAACTTGCCGAATTAGAGCGGCAGTCGGGAGGCAGACTGGGTGTGGCATTGATTAACACAGCAGATAATTCGCAAATACTTTATCGTGCTGATGAGCGCTTTGCGATGTGCAGCACCAGTAAAGTGATGGCCGTGGCCGCGGTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATCAGCGAGTTGAGATCAAAAAATCTGACCTTGTTAACTATAATCCGATTGCGGAAAAGCACGTCAATGGGACGATGTCACTGGCTGAGCTTAGCGCGGCCGCGCTACAGTACAGCGATAACGTGGCGATGAATAAGCTGATTGCTCACGTTGGCGGCCCGGCTAGCGTCACCGCGTTCGCCCGACAGCTGGGAGACGAAACGTTCCGTCTCGACCGTACCGAGCCGACGTTAAACACCGCCATTCCGGGCGATCCGCGTGATACCACTTCACCTCGGGCAATGGCGCAAACTCTGCGGAATCTGACGCTGGGTAAAGCATTGGGCGACAGCCAACGGGCGCAGCTGGTGACATGGATGAAAGGCAATACCACCGGTGCAGCGAGCATTCAGGCTGGACTGCCTGCTTCCTGGGTTGTGGGGGATAAAACCGGCAGCGGTGGCTATGGCACCACCAACGATATCGCGGTGATCTGGCCAAAAGATCGTGCGCCGCTGATTCTGGTCACTTACTTCACCCAGCCTCAACCTAAGGCAGAAAGCCGTCGCGATGTATTAGCGTCGGCGGCTAAAATCGTCACCGACGGTTTGTAA。

Claims (10)

1.大肠杆菌(Escherichia coli)EC382-2-2，保藏编号为GDMCC No：62929。

2.权利要求1所述的大肠杆菌EC382-2-2在作为筛选新型抗菌药物的模式菌株中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是大肠杆菌EC382-2-2作为模式菌株在筛选抗大肠杆菌的功能微生物、药物、制剂或抗菌材料中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的功能微生物、药物、制剂或抗菌材料是抑制耐氨苄西林、阿莫西林克拉维酸、头孢噻肟、多粘菌素E、庆大霉素、环丙沙星、复方新诺明、四环素和氟苯尼考的大肠杆菌的功能微生物、药物、制剂或抗菌材料。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的大肠杆菌EC382-2-2可作为筛选抗生素药物的对照或模式菌株，用于辅助筛选食品微生物防控和临床治疗靶向药物。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的大肠杆菌EC382-2-2作为检测耐药基因mcr-1/CTX-M-55和毒力基因eae的参照菌株。

7.一种能够特异性鉴别权利要求1所述的大肠杆菌EC382-2-2的核苷酸序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

8.一种特异性鉴别权利要求1所述的大肠杆菌EC382-2-2的引物，其特征在于，包括：F:5’-TAGAAGGCTCTTTGGAAGCA-3’和R:5’-GACCGGACATCATCAGGAAG-3’。

9.一种特异性鉴别权利要求1所述的大肠杆菌EC382-2-2的方法，其特征在于，是用权利要求8所述的引物对待测大肠杆菌进行PCR扩增或qPCR扩增，如果能够产生条带/信号，待测菌则为大肠杆菌EC382-2-2，如果不能产生条带/信号，待测菌不为大肠杆菌EC382-2-2。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其扩增体系为25μL，包括12.5μL PCR mixture，10μmol/L上、下游引物各1.0μL，8.5μL ddH₂O，2.0μLDNA模板；所述的PCR扩增，其扩增条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸60s，进行30个循环，最后72℃延伸10min。

Images