JP2002500892A - 抗生物質感受性試験 - Google Patents
抗生物質感受性試験Info
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Abstract
(57)【要約】
細菌細胞の増殖特性に及ぼす外部条件の効果についてのインビトロ試験におけるアデニル酸キナーゼの検定の使用。このような試験は、特に抗生物質又は生物静力学的薬剤に対する細菌の感受性についての試験、及び細菌の増殖段階及び健康状態を判定するための試験を包含する。これら試験を実行する方法及びそれらを達成するキットが記載されかつ請求されている。
Description
【０００１】 本発明は、細菌の増殖特性の試験方法に係り、詳細には、特定の抗生物質又は
生物静力学的薬剤（biostatic agent）に対する感受性試験、及びその方法で使 用するキットに関する。 抗生物質耐性を有する細菌は、ますます重大な問題になっている。１系統の細
菌の抗生物質耐性を決定する現在の方法は、非常に時間がかかる。それは、まず
純粋培養における生物体の単離を必要とする。そして、細菌の「芝生」（lawn）
を調製し、かつ１セットの抗生物質の存在下で増殖させる。特定の抗生物質の周
囲における増殖の阻害ゾーンは、該細菌が感受性であることを示す（そのゾーン
の大きさは感受性の程度を示す）。抗生物質の存在で増殖が阻害されないことは
、耐性を示している。このプロセスは完了までに少なくとも２日かかり、特に、
感染された個体の最適な治療法がこれら試験の結果により決定される臨床状況に
おいては、理想からはかけ離れている。 抗生物質耐性又は感受性をかなり速く、例えば数時間以内で判定できる試験が
要望されている。
生物静力学的薬剤（biostatic agent）に対する感受性試験、及びその方法で使 用するキットに関する。 抗生物質耐性を有する細菌は、ますます重大な問題になっている。１系統の細
菌の抗生物質耐性を決定する現在の方法は、非常に時間がかかる。それは、まず
純粋培養における生物体の単離を必要とする。そして、細菌の「芝生」（lawn）
を調製し、かつ１セットの抗生物質の存在下で増殖させる。特定の抗生物質の周
囲における増殖の阻害ゾーンは、該細菌が感受性であることを示す（そのゾーン
の大きさは感受性の程度を示す）。抗生物質の存在で増殖が阻害されないことは
、耐性を示している。このプロセスは完了までに少なくとも２日かかり、特に、
感染された個体の最適な治療法がこれら試験の結果により決定される臨床状況に
おいては、理想からはかけ離れている。 抗生物質耐性又は感受性をかなり速く、例えば数時間以内で判定できる試験が
要望されている。
【０００２】 アデニル酸キナーゼの測定による微生物検出のための検定法は、例えば国際特
許出願番号PCT/GB94/00118及びPCT/GB94/01513によって知られている。アデニル
酸キナーゼは、すべての生細胞で必須の酵素であり、以下に示されるように、Ａ
ＤＰの存在下、ＡＴＰの生成を触媒する。
許出願番号PCT/GB94/00118及びPCT/GB94/01513によって知られている。アデニル
酸キナーゼは、すべての生細胞で必須の酵素であり、以下に示されるように、Ａ
ＤＰの存在下、ＡＴＰの生成を触媒する。
【化１】 この検定法では、ＡＤＰは試薬として、好ましくはマグネシウムイオンの存在
下、試験する試料に加えられる。上記アデニル酸キナーゼ反応の結果として生成
されるＡＴＰは、例えばホタルの生物発光を用いて検出することができる。この
ため、ルシフェリン／ルシフェラーゼの組合せのような試薬を、通常、例えば約
５分のような短いインキュベーション時間後に混合物に加え、生じる発光シグナ
ルを観察する。 この検定法の感度はアデニル酸キナーゼの自然放射能レベル及び使用する試薬
の純度によってのみ制限される。例えば、モデル系として大腸菌を使用すると、
１００以下の細胞由来のアデニル酸キナーゼ活性が、後述する図１に示されるよ
うに、５分のインキュベーション検定で測定された。この図を作成するために使
用した試験では、試料体積は２００μlであった。
下、試験する試料に加えられる。上記アデニル酸キナーゼ反応の結果として生成
されるＡＴＰは、例えばホタルの生物発光を用いて検出することができる。この
ため、ルシフェリン／ルシフェラーゼの組合せのような試薬を、通常、例えば約
５分のような短いインキュベーション時間後に混合物に加え、生じる発光シグナ
ルを観察する。 この検定法の感度はアデニル酸キナーゼの自然放射能レベル及び使用する試薬
の純度によってのみ制限される。例えば、モデル系として大腸菌を使用すると、
１００以下の細胞由来のアデニル酸キナーゼ活性が、後述する図１に示されるよ
うに、５分のインキュベーション検定で測定された。この図を作成するために使
用した試験では、試料体積は２００μlであった。
【０００３】 出願人らは、アデニル酸キナーゼをバイオマスの感受性マーカーとして使用で
き、かつ上述の検定法が、細菌細胞の増殖特性に関するさらにずっと詳細な情報
を与える研究に利用できることを見出した。 従って、本発明は、細菌細胞の増殖特性に関する外部条件の効果に関するイン
ビトロ試験でのアデニル酸キナーゼの検定の使用を提供する。
き、かつ上述の検定法が、細菌細胞の増殖特性に関するさらにずっと詳細な情報
を与える研究に利用できることを見出した。 従って、本発明は、細菌細胞の増殖特性に関する外部条件の効果に関するイン
ビトロ試験でのアデニル酸キナーゼの検定の使用を提供する。
【０００４】 アデニル酸キナーゼの検定は、細菌の増殖及び阻害についての多くの観点を調
べる速くかつ高感度の手段を提供する。本発明を使用して調べるうる外部条件の
種類は様々である。例えば、アデニル酸キナーゼの検定は、特定細菌株又は混合
培養の特定の抗生物質又は生物静力学的薬剤に対する感受性を決定する方法に使
用してもよく、又は抗生物質又は生物静力学的特性のために試薬をスクリーニン
グするための用途に適合しうる方法に使用してもよい。また、細胞培養の細胞外
アデニル酸キナーゼ含量と、細胞内及び細胞外の総含量との比較は、細胞培養の
増殖状態及び健康状態の指標となるので、アデニル酸キナーゼの検定を使用して
、これらの特徴を判定できることがわかった。
べる速くかつ高感度の手段を提供する。本発明を使用して調べるうる外部条件の
種類は様々である。例えば、アデニル酸キナーゼの検定は、特定細菌株又は混合
培養の特定の抗生物質又は生物静力学的薬剤に対する感受性を決定する方法に使
用してもよく、又は抗生物質又は生物静力学的特性のために試薬をスクリーニン
グするための用途に適合しうる方法に使用してもよい。また、細胞培養の細胞外
アデニル酸キナーゼ含量と、細胞内及び細胞外の総含量との比較は、細胞培養の
増殖状態及び健康状態の指標となるので、アデニル酸キナーゼの検定を使用して
、これらの特徴を判定できることがわかった。
【０００５】 試験は、行われる調査の性質、入手できる細菌試料のタイプ、もしあれば試験
すべき試薬の性質、特にそれらが細胞に溶菌性又は非溶菌性効果を及ぼすかどう
かを考慮して構成される。これら試験の種々の形態については、さらに詳しく後
述する。 しかし、詳細には、本発明は、試験物質に対する細菌の感受性を決定する方法
であって、前記試薬含有の培養から細菌の溶解によって遊離されたアデニル酸キ
ナーゼを検定すること、及びかつその結果を、試薬の添加前の培養、及び／又は
異なった時点における同一培養からの溶解された細菌、及び／又は該試薬を含ま
ない同様の培養からの溶解された細菌のいずれかについての同様のアデニル酸キ
ナーゼの検定から得られた結果と比較することを含む方法を提供する。
すべき試薬の性質、特にそれらが細胞に溶菌性又は非溶菌性効果を及ぼすかどう
かを考慮して構成される。これら試験の種々の形態については、さらに詳しく後
述する。 しかし、詳細には、本発明は、試験物質に対する細菌の感受性を決定する方法
であって、前記試薬含有の培養から細菌の溶解によって遊離されたアデニル酸キ
ナーゼを検定すること、及びかつその結果を、試薬の添加前の培養、及び／又は
異なった時点における同一培養からの溶解された細菌、及び／又は該試薬を含ま
ない同様の培養からの溶解された細菌のいずれかについての同様のアデニル酸キ
ナーゼの検定から得られた結果と比較することを含む方法を提供する。
【０００６】 試験する試薬は、公知の抗生物質又は生物静力学的薬剤でもよく、又は従来は
抗生物質として知られていない新規の化合物若しくは試薬でもよく、その結果試
験がスクリーニングプログラムの一部をなすこともある。 いくつかの試薬、例えば、ペニシリン、例えばアンピシリン及びアモキシシリ
ンのようなβ-ラクタム抗生物質のような抗生物質は、培養中細菌を溶解するだ ろう。しかし、これが起こらない場合は、検定を行う前に細菌を溶解することが
必要であるかもしれない。これは、溶菌剤による処理及び細菌を磁場若しくは電
場、又は超音波に供するような物理的方法を含む、本分野で公知の種々の方法で
行うことができる。
抗生物質として知られていない新規の化合物若しくは試薬でもよく、その結果試
験がスクリーニングプログラムの一部をなすこともある。 いくつかの試薬、例えば、ペニシリン、例えばアンピシリン及びアモキシシリ
ンのようなβ-ラクタム抗生物質のような抗生物質は、培養中細菌を溶解するだ ろう。しかし、これが起こらない場合は、検定を行う前に細菌を溶解することが
必要であるかもしれない。これは、溶菌剤による処理及び細菌を磁場若しくは電
場、又は超音波に供するような物理的方法を含む、本分野で公知の種々の方法で
行うことができる。
【０００７】 細菌を溶解させる薬剤は、界面活性剤及び溶菌素のような酵素を含む。しかし
、これらは特異的でなく、試料中に存在するすべての生きている物質からＡＫを
遊離させるだろう。これは、試料が純粋な培養を含むときは適するであろう。し
かし、調査中の細菌が混合培養の一成分であるときは、他の戦略を採用してもよ
い。混合試料中の標的細胞由来の特異的な測定は、例えば：１）非特異的なアデ
ニル酸キナーゼの測定後に、問題の細胞を特異的に捕捉してそれらを混入してい
る生物体から分離すること；２）該標的細胞を溶解するだけの方法を使用して、
これらからアデニル酸キナーゼのみを測定すること；又は３）それらを併用する
ことによって達成することができる。
、これらは特異的でなく、試料中に存在するすべての生きている物質からＡＫを
遊離させるだろう。これは、試料が純粋な培養を含むときは適するであろう。し
かし、調査中の細菌が混合培養の一成分であるときは、他の戦略を採用してもよ
い。混合試料中の標的細胞由来の特異的な測定は、例えば：１）非特異的なアデ
ニル酸キナーゼの測定後に、問題の細胞を特異的に捕捉してそれらを混入してい
る生物体から分離すること；２）該標的細胞を溶解するだけの方法を使用して、
これらからアデニル酸キナーゼのみを測定すること；又は３）それらを併用する
ことによって達成することができる。
【０００８】 標的細菌細胞のみ（上記２）からのアデニル酸キナーゼは、調査している特定
の細菌に特異的である溶菌剤、例えば、標的細胞に特異的でありかつその細菌を
溶解させるバクテリオファージを用いて遊離されうる。これらのバクテリオファ
ージは、細菌に感染するウイルスであり、該細胞を溶解し、かつアデニル酸キナ
ーゼを含む細胞内成分を外部培地に遊離させる。この遊離は、感染後約３０〜６
０分起こる。４０分かかる検定にこの方法を使用して、５００より少ない細胞が
検出されることがわかった。
の細菌に特異的である溶菌剤、例えば、標的細胞に特異的でありかつその細菌を
溶解させるバクテリオファージを用いて遊離されうる。これらのバクテリオファ
ージは、細菌に感染するウイルスであり、該細胞を溶解し、かつアデニル酸キナ
ーゼを含む細胞内成分を外部培地に遊離させる。この遊離は、感染後約３０〜６
０分起こる。４０分かかる検定にこの方法を使用して、５００より少ない細胞が
検出されることがわかった。
【０００９】 ファージは、純粋培養又は混合培養で、同等によく標的細胞に感染しうる。試
料から化学的に抽出できるアデニル酸キナーゼの量と、ファージ感染による設定
時間後に遊離される量とを比較することによって、標的細胞が存在するかしない
か、及びその試験物質が標的細胞の増殖に及ぼす効果を決定できる。 バクテリオファージを再生し、それによって溶解を引き起こすためには、宿主
細胞は増殖の対数期になければならない。増殖が、例えば静菌剤又は抗生物質の
存在の結果として阻害されると、バクテリオファージは増殖又は細胞を溶解でき
ないだろう。このことは、以下に示されるように、本発明のさらなる実施形態の
基礎として使用できる。
料から化学的に抽出できるアデニル酸キナーゼの量と、ファージ感染による設定
時間後に遊離される量とを比較することによって、標的細胞が存在するかしない
か、及びその試験物質が標的細胞の増殖に及ぼす効果を決定できる。 バクテリオファージを再生し、それによって溶解を引き起こすためには、宿主
細胞は増殖の対数期になければならない。増殖が、例えば静菌剤又は抗生物質の
存在の結果として阻害されると、バクテリオファージは増殖又は細胞を溶解でき
ないだろう。このことは、以下に示されるように、本発明のさらなる実施形態の
基礎として使用できる。
【００１０】 代替的又は付加的に、混合培養を、標的細菌の細胞を培養中で濃厚にするか及
び／又はそれから分離する前処理工程に供してもよい。このような工程は、技術
的に周知である。例えば、分離は、特定の細菌に特異的な抗生物質又はその結合
断片を使用してそれらの細胞をビーズ、微量定量プレート、フィルター膜又はカ
ラムのような固体表面上に固定化する免疫捕捉法を使用して達成しうる。磁性ビ
ーズが、特に好ましい固体表面を与えてもよい。ビーズの分離は、磁気分離法を
用いることが適切であり、後述するように、標的細菌の実質的な単離を導く。典
型的には、磁性ビーズを固体支持体として使用すると、約３０分の総検定時間で
１０００以下の細胞の検出を達成できることがわかった。また、他の物質を固体
支持体として用いることもできる。
び／又はそれから分離する前処理工程に供してもよい。このような工程は、技術
的に周知である。例えば、分離は、特定の細菌に特異的な抗生物質又はその結合
断片を使用してそれらの細胞をビーズ、微量定量プレート、フィルター膜又はカ
ラムのような固体表面上に固定化する免疫捕捉法を使用して達成しうる。磁性ビ
ーズが、特に好ましい固体表面を与えてもよい。ビーズの分離は、磁気分離法を
用いることが適切であり、後述するように、標的細菌の実質的な単離を導く。典
型的には、磁性ビーズを固体支持体として使用すると、約３０分の総検定時間で
１０００以下の細胞の検出を達成できることがわかった。また、他の物質を固体
支持体として用いることもできる。
【００１１】 選択的な増殖培地の使用により、さらに特異性が得られてもよい。これを増菌
工程で使用して、免疫捕捉検定又はバクテリオファージによる感染の前に、健康
な増殖培養を確立できる。さらに、選択的培地をバクテリオファージ感染の過程
の間中使用しうる。 このような培地は、存在しうる標的でない生物体による過剰増殖、時には標的
細菌よりも非常に過剰となる場合を最小化するだろう。 上述したように、本発明は、特定の抗生物質又は静菌剤に対する細菌の感受性
試験での使用に適合しうる。
工程で使用して、免疫捕捉検定又はバクテリオファージによる感染の前に、健康
な増殖培養を確立できる。さらに、選択的培地をバクテリオファージ感染の過程
の間中使用しうる。 このような培地は、存在しうる標的でない生物体による過剰増殖、時には標的
細菌よりも非常に過剰となる場合を最小化するだろう。 上述したように、本発明は、特定の抗生物質又は静菌剤に対する細菌の感受性
試験での使用に適合しうる。
【００１２】 β-ラクタム、例えばペニシリンのような抗生物質は、細胞壁の合成を中断さ せ、それによって細胞の統合性を失わせ、かつ複製のときに溶解することによっ
て機能する。これは、細菌が活発に増殖していることを条件に、かなり速く、抗
生物質にさらした後約１０〜１５分で起こる。 クロラムフェニコールのような他の抗生物質は、細胞溶解は起こさないが、生
物静力学的薬剤が為すような他の方法で細胞増殖を阻害する。使用するいずれの
特定薬剤の作用機序形態も一般に理解されている。本発明は、これら薬剤のいず
れについても、細菌に対する感受性試験での使用に適合しうる。
て機能する。これは、細菌が活発に増殖していることを条件に、かなり速く、抗
生物質にさらした後約１０〜１５分で起こる。 クロラムフェニコールのような他の抗生物質は、細胞溶解は起こさないが、生
物静力学的薬剤が為すような他の方法で細胞増殖を阻害する。使用するいずれの
特定薬剤の作用機序形態も一般に理解されている。本発明は、これら薬剤のいず
れについても、細菌に対する感受性試験での使用に適合しうる。
【００１３】 本発明の特定の実施形態は、溶菌性抗生物質に対する細菌の感受性を決定する
方法であって、以下の工程：(i)前記細菌を、例えば免疫捕捉工程を用いて他の 菌種から分離する工程；(ii)前記細菌の培養の細胞外アデニル酸キナーゼ含量を
決定する工程；(iii)該培養に溶菌性抗生物質を添加し、それを、該抗生物質に その溶菌効果を及ぼすのに十分な時間インキュベートする工程；及び(iv)該培養
の細胞外アデニル酸キナーゼ含量を決定して、溶菌が起きたかどうかを判定する
工程；を含んでなる方法を包含する。
方法であって、以下の工程：(i)前記細菌を、例えば免疫捕捉工程を用いて他の 菌種から分離する工程；(ii)前記細菌の培養の細胞外アデニル酸キナーゼ含量を
決定する工程；(iii)該培養に溶菌性抗生物質を添加し、それを、該抗生物質に その溶菌効果を及ぼすのに十分な時間インキュベートする工程；及び(iv)該培養
の細胞外アデニル酸キナーゼ含量を決定して、溶菌が起きたかどうかを判定する
工程；を含んでなる方法を包含する。
【００１４】 この試験では、感受性細菌は、抗生物質の添加後すぐに、一般に約１５分以内
で抗生物質によって溶解されるだろう。従って、抗生物質の添加後、細菌細胞が
自由な細胞内アデニル酸キナーゼを壊して開くので、培養の遊離アデニル酸キナ
ーゼの含量は有意に増加するだろう。アデニル酸キナーゼレベルの最適な測定は
、抗生物質の添加直前に、それから再び抗生物質の添加後少なくとも１５分かか
るだろう。耐性細菌の培養の遊離アデニル酸キナーゼ含量は、大部分一定のまま
だろう。従って、普通に存在する低レベルの細胞外アデニル酸キナーゼのみの含
量は、上述のように測定され、これは、健康的に増殖する細胞についてはほぼ安
定している。この方法を用いて、約４０分の時間で抗生物質感受性の判定を行う
ことができる。 この方法で使用する細菌の培養は、上述の前記細菌に有利な選択的な増殖培地
を含んでもよく、これは、コンタミネーションの結果である誤った陽性結果を最
少化するだろう。
で抗生物質によって溶解されるだろう。従って、抗生物質の添加後、細菌細胞が
自由な細胞内アデニル酸キナーゼを壊して開くので、培養の遊離アデニル酸キナ
ーゼの含量は有意に増加するだろう。アデニル酸キナーゼレベルの最適な測定は
、抗生物質の添加直前に、それから再び抗生物質の添加後少なくとも１５分かか
るだろう。耐性細菌の培養の遊離アデニル酸キナーゼ含量は、大部分一定のまま
だろう。従って、普通に存在する低レベルの細胞外アデニル酸キナーゼのみの含
量は、上述のように測定され、これは、健康的に増殖する細胞についてはほぼ安
定している。この方法を用いて、約４０分の時間で抗生物質感受性の判定を行う
ことができる。 この方法で使用する細菌の培養は、上述の前記細菌に有利な選択的な増殖培地
を含んでもよく、これは、コンタミネーションの結果である誤った陽性結果を最
少化するだろう。
【００１５】 これとは別の本発明の実施形態は、細菌の非溶菌性抗生物質又は生物静力学的
薬剤に対する感受性を決定する方法であって、(i)前記細菌を、例えば免疫捕捉 法を用いて他の菌種から分離すること、(ii)前記非溶菌性抗生物質又は生物静力
学的薬剤及び任意に前記細菌に有利な選択的増殖培地の存在下、前記細菌の培養
をインキュベートすること、(iii)間欠的に試料を取り、これら試料中で細菌を 溶解し、かつ前記試料中のアデニル酸キナーゼを検定することによって、インキ
ュベーションの時間に渡って、該培養の全アデニル酸キナーゼ含量が増加したか
減少したかを決定すること；を含んでなる方法を提供する。
薬剤に対する感受性を決定する方法であって、(i)前記細菌を、例えば免疫捕捉 法を用いて他の菌種から分離すること、(ii)前記非溶菌性抗生物質又は生物静力
学的薬剤及び任意に前記細菌に有利な選択的増殖培地の存在下、前記細菌の培養
をインキュベートすること、(iii)間欠的に試料を取り、これら試料中で細菌を 溶解し、かつ前記試料中のアデニル酸キナーゼを検定することによって、インキ
ュベーションの時間に渡って、該培養の全アデニル酸キナーゼ含量が増加したか
減少したかを決定すること；を含んでなる方法を提供する。
【００１６】 この場合、ある時間、例えば約１時間に及ぶ化学的溶解後に得られるアデニル
酸キナーゼの量は、該細菌が該抗生物質に感受性であれば、ほぼ一定のままだろ
う。これは、細菌が該抗生物質の存在下では増殖できないからである。しかし、
耐性細菌の場合は、細菌は増殖し続け、そしてアデニル酸キナーゼのレベルは経
時的に着々と増加するだろう。 このように、溶菌性又は非溶菌性のいずれの特定の抗生物質に対する純粋培養
の感受性も、上記工程Ｉの方法論を用いて迅速に決定されうる。
酸キナーゼの量は、該細菌が該抗生物質に感受性であれば、ほぼ一定のままだろ
う。これは、細菌が該抗生物質の存在下では増殖できないからである。しかし、
耐性細菌の場合は、細菌は増殖し続け、そしてアデニル酸キナーゼのレベルは経
時的に着々と増加するだろう。 このように、溶菌性又は非溶菌性のいずれの特定の抗生物質に対する純粋培養
の感受性も、上記工程Ｉの方法論を用いて迅速に決定されうる。
【００１７】 本発明の他の実施形態は、細菌の単離又は純粋培養の使用を不要とする。詳細
には、本発明は、さらに、抗生物質又は生物静力学的薬剤に対する細菌の感受性
を決定する方法であって、 (a) 前記細菌の培養の第１試料、前記抗生物質の存在下の第２試料、前記標的 細菌を特異的に溶解するバクテリオファージの存在下の第３試料、及び前記バク
テリオファージ及び前記抗生物質の両方の存在下の第４試料をインキュベートす
ること、 (b) 培養後の第１〜第４試料のおのおのについてアデニル酸キナーゼ含量を決 定すること、及び (c) アデニル酸キナーゼの検定結果を基礎とし、かつ抗生物質又は生物静力学 的薬剤の作用形態に基づいて、該細菌の感受性又は耐性を決定すること を含んでなる方法を提供する。
には、本発明は、さらに、抗生物質又は生物静力学的薬剤に対する細菌の感受性
を決定する方法であって、 (a) 前記細菌の培養の第１試料、前記抗生物質の存在下の第２試料、前記標的 細菌を特異的に溶解するバクテリオファージの存在下の第３試料、及び前記バク
テリオファージ及び前記抗生物質の両方の存在下の第４試料をインキュベートす
ること、 (b) 培養後の第１〜第４試料のおのおのについてアデニル酸キナーゼ含量を決 定すること、及び (c) アデニル酸キナーゼの検定結果を基礎とし、かつ抗生物質又は生物静力学 的薬剤の作用形態に基づいて、該細菌の感受性又は耐性を決定すること を含んでなる方法を提供する。
【００１８】 細菌が抗生物質の効果に対して感受性であるためには、活発に増殖していなけ
ればならないので、最初の増菌工程に選択的な培地を使用できるだろう。増菌工
程は、約１時間のインキュベーションを含んでもよい。この時間後、該標的細胞
は、所望により免疫捕捉によって新鮮な選択的培地に増菌されてもよい。抗生物
質を標的細菌に添加する効果は、バクテリオファージ媒介の溶解と組み合わせた
アデニル酸キナーゼの測定によって決定できる。
ればならないので、最初の増菌工程に選択的な培地を使用できるだろう。増菌工
程は、約１時間のインキュベーションを含んでもよい。この時間後、該標的細胞
は、所望により免疫捕捉によって新鮮な選択的培地に増菌されてもよい。抗生物
質を標的細菌に添加する効果は、バクテリオファージ媒介の溶解と組み合わせた
アデニル酸キナーゼの測定によって決定できる。
【００１９】 バクテリオファージが再生するためには、宿主細胞は対数期の増殖になければ
ならない。例えば抗生物質の存在によって増殖が阻害されると、該ファージは複
製することができず、それゆえ宿主を溶解できないだろう。バクテリオファージ
とからめたアデニル酸キナーゼ検定を使用して、細菌の抗生物質感受性を３時間
以内で決定することができる。抗生物質にさらす前又はファージによる感染の前
に健康的に増殖する細胞を確立するには、さらなる時間が必要である。試験結果
の２つのタイプは、関係した抗生物質の作用形態に依存する可能性がある。
ならない。例えば抗生物質の存在によって増殖が阻害されると、該ファージは複
製することができず、それゆえ宿主を溶解できないだろう。バクテリオファージ
とからめたアデニル酸キナーゼ検定を使用して、細菌の抗生物質感受性を３時間
以内で決定することができる。抗生物質にさらす前又はファージによる感染の前
に健康的に増殖する細胞を確立するには、さらなる時間が必要である。試験結果
の２つのタイプは、関係した抗生物質の作用形態に依存する可能性がある。
【００２０】 得られた結果を図４にまとめた。図中、「−」は、細胞外アデニル酸キナーゼ
のみの検出と一致する結果を示し、「＋」は、増殖しない生存試料の細胞内及び
細胞外アデニル酸キナーゼの検出と一致する適度な陽性結果を示し、かつ「＋＋
」は、増殖培養の溶解と一致するアデニル酸キナーゼの上昇したレベルの検出を
示す。
のみの検出と一致する結果を示し、「＋」は、増殖しない生存試料の細胞内及び
細胞外アデニル酸キナーゼの検出と一致する適度な陽性結果を示し、かつ「＋＋
」は、増殖培養の溶解と一致するアデニル酸キナーゼの上昇したレベルの検出を
示す。
【００２１】 図４より明らかなように、この一連の試験を用いて得られた結果のパターンに
より、薬剤の作用形態（溶菌性又は非溶菌性）がわかれば、感受性細菌と耐性細
菌との区別を容易にできる。以下の実施例でさらに詳細に説明するように、種々
の試薬と細菌との相互作用の結果として様々な効果が引き起こされる。 細胞培養の細胞外アデニル酸キナーゼ含量と、細胞内及び細胞外の総含量との
比較により、細胞培養の増殖状態及び健康状態が示されることがわかった。
より、薬剤の作用形態（溶菌性又は非溶菌性）がわかれば、感受性細菌と耐性細
菌との区別を容易にできる。以下の実施例でさらに詳細に説明するように、種々
の試薬と細菌との相互作用の結果として様々な効果が引き起こされる。 細胞培養の細胞外アデニル酸キナーゼ含量と、細胞内及び細胞外の総含量との
比較により、細胞培養の増殖状態及び健康状態が示されることがわかった。
【００２２】 従って、本発明のさらに別の実施形態は、細菌培養の増殖期の決定方法であっ
て、 (a)前記細菌培養の第１試料を溶菌剤にさらして、その中で細菌細胞を溶解させ ること、 (b)前記第１試料中及び溶菌剤にさらされなかった前記培養の第２試料中のアデ ニル酸キナーゼを検定すること、及び (c)前記第１及び第２培養から得られた結果を比較し、かつ該培養の増殖期を判 定すること を含んでなる方法を提供する。
て、 (a)前記細菌培養の第１試料を溶菌剤にさらして、その中で細菌細胞を溶解させ ること、 (b)前記第１試料中及び溶菌剤にさらされなかった前記培養の第２試料中のアデ ニル酸キナーゼを検定すること、及び (c)前記第１及び第２培養から得られた結果を比較し、かつ該培養の増殖期を判 定すること を含んでなる方法を提供する。
【００２３】 健康な対数期培養は、相対的に低い（全アデニル酸キナーゼの約１％）細胞外
アデニル酸キナーゼレベルを有しており、細胞外アデニル酸キナーゼの比率は対
数期を通して相対的に一定のままであり、かつ培養が静止期に近づくにつれて増
加する。静止期の培養は、培養培地中の全アデニル酸キナーゼの３分の１程度を
有しうる。従って、アデニル酸キナーゼを用いて、細胞の健康状態、及びその数
を迅速に決定できる。
アデニル酸キナーゼレベルを有しており、細胞外アデニル酸キナーゼの比率は対
数期を通して相対的に一定のままであり、かつ培養が静止期に近づくにつれて増
加する。静止期の培養は、培養培地中の全アデニル酸キナーゼの３分の１程度を
有しうる。従って、アデニル酸キナーゼを用いて、細胞の健康状態、及びその数
を迅速に決定できる。
【００２４】 この方法を使用して、例えば最適な増殖が要求される、例えば発酵又は細胞生
成が要求される他のプロセスで、例えば特定の細胞培養がよく増殖することを確
認できる。これとは別に、試験において弱い又は静止期の培養が使用されたため
の誤った陽性結果を回避するために、抗生物質又は静菌化合物をスクリーニング
する際、細胞が非常に増殖することを確かめる必要があるかもしれない。さらに
、それを使用して、いかなる特定培養の増殖に関しても温度又は培養培地のよう
などんな効果的な環境因子を有するかを決定してもよい。 それぞれの場合に、アデニル酸キナーゼ含量は、培養の試料を取り、かつ例え
ば国際特許出願番号PCT/GB94/00118及びPCT/GB94/01513で記載されているような
アデニル酸キナーゼ検定法を行うことによって判定してもよい。
成が要求される他のプロセスで、例えば特定の細胞培養がよく増殖することを確
認できる。これとは別に、試験において弱い又は静止期の培養が使用されたため
の誤った陽性結果を回避するために、抗生物質又は静菌化合物をスクリーニング
する際、細胞が非常に増殖することを確かめる必要があるかもしれない。さらに
、それを使用して、いかなる特定培養の増殖に関しても温度又は培養培地のよう
などんな効果的な環境因子を有するかを決定してもよい。 それぞれの場合に、アデニル酸キナーゼ含量は、培養の試料を取り、かつ例え
ば国際特許出願番号PCT/GB94/00118及びPCT/GB94/01513で記載されているような
アデニル酸キナーゼ検定法を行うことによって判定してもよい。
【００２５】 また、本発明は、本発明の方法を達成する試験キットをも提供する。該試験キ
ットは、特定の検定法を実行できる適切な成分を含む。抗生物質感受性用試験キ
ットは、例えば凍結乾燥又は他の保存状態の一連の抗生物質を含んでもよい。そ
れは、界面活性剤又は他の化学的溶菌剤のような試料からアデニル酸キナーゼを
抽出するための試薬、及びルシフェリン／ルシフェラーゼ等のようなアデニル酸
キナーゼを検定するための試薬をも含んでもよい。また、混合細菌培養を試験す
べき場合での使用のためには、キットは適切なバクテリオファージを、凍結乾燥
バクテリオファージのような保存状態でも含みうる。さらに、該キットは、適切
な選択的増殖培地をも含んでよい。試薬は、マルチ−ウェルプレートのような適
切な反応容器に供給してもよい。
ットは、特定の検定法を実行できる適切な成分を含む。抗生物質感受性用試験キ
ットは、例えば凍結乾燥又は他の保存状態の一連の抗生物質を含んでもよい。そ
れは、界面活性剤又は他の化学的溶菌剤のような試料からアデニル酸キナーゼを
抽出するための試薬、及びルシフェリン／ルシフェラーゼ等のようなアデニル酸
キナーゼを検定するための試薬をも含んでもよい。また、混合細菌培養を試験す
べき場合での使用のためには、キットは適切なバクテリオファージを、凍結乾燥
バクテリオファージのような保存状態でも含みうる。さらに、該キットは、適切
な選択的増殖培地をも含んでよい。試薬は、マルチ−ウェルプレートのような適
切な反応容器に供給してもよい。
【００２６】 ここで、添付図面を参照して、実施例により本発明を詳細に説明する。 実施例１ 培養のアデニル酸キナーゼの細胞外含量と総含量との比較 例えば、一実施形態では、細菌細胞の試料を第１及び第２試料に分ける。細菌
細胞の第１試料を、マグネシウムイオンの存在下ＡＤＰ及び界面活性剤を含有す
る溶液と混ぜる。これは、試料中に存在するすべての細胞からアデニル酸キナー
ゼを抽出するので、ＡＴＰ生成反応を起こさせる。反応を必要な時間、例えば５
分間行わせ、その後生物発光試薬を添加し、その結果生じる光をルミノメーター
で測定する。このように行われる検定法により、試料中の細胞外又は細胞内のア
デニル酸キナーゼの総量を決定する。 第２試料を界面活性剤がないこと以外は同様の検定法に供して、細胞外アデニ
ル酸キナーゼのみを測定する。
細胞の第１試料を、マグネシウムイオンの存在下ＡＤＰ及び界面活性剤を含有す
る溶液と混ぜる。これは、試料中に存在するすべての細胞からアデニル酸キナー
ゼを抽出するので、ＡＴＰ生成反応を起こさせる。反応を必要な時間、例えば５
分間行わせ、その後生物発光試薬を添加し、その結果生じる光をルミノメーター
で測定する。このように行われる検定法により、試料中の細胞外又は細胞内のア
デニル酸キナーゼの総量を決定する。 第２試料を界面活性剤がないこと以外は同様の検定法に供して、細胞外アデニ
ル酸キナーゼのみを測定する。
【００２７】 実施例２ 混合懸濁液から標的細胞を分離するたの免疫捕捉の使用 純粋試料及び3.5×105バシラスサチリスバールニガー（Bacillus Subtilis va
r niger）（ＢＧ）増殖型細胞をも含有する試料によるサルモネラチフィムリウ ム（Salmonella typhimurium）についての免疫捕捉検定を行った。免疫捕捉検定
は、全体積３００μlで行った。S.チフィムリウム特異性抗体で被覆された磁性 マイクロビーズへの免疫捕捉工程は１０分かかった。その固定化されたビーズを
洗浄して非結合粒子を除去し、かつ非特異的溶解工程を行って、結合物質からア
デニル酸キナーゼを遊離させた。これは、５分間のアデニル酸キナーゼ検定によ
って検出した。 結果を図２に示した。グラフは、標的細胞の約７０％が懸濁液から選択的に除
去されること、かつこのことは、混入物質（ＢＧ細胞）の存在によってあまり影
響されないことを示している。
r niger）（ＢＧ）増殖型細胞をも含有する試料によるサルモネラチフィムリウ ム（Salmonella typhimurium）についての免疫捕捉検定を行った。免疫捕捉検定
は、全体積３００μlで行った。S.チフィムリウム特異性抗体で被覆された磁性 マイクロビーズへの免疫捕捉工程は１０分かかった。その固定化されたビーズを
洗浄して非結合粒子を除去し、かつ非特異的溶解工程を行って、結合物質からア
デニル酸キナーゼを遊離させた。これは、５分間のアデニル酸キナーゼ検定によ
って検出した。 結果を図２に示した。グラフは、標的細胞の約７０％が懸濁液から選択的に除
去されること、かつこのことは、混入物質（ＢＧ細胞）の存在によってあまり影
響されないことを示している。
【００２８】 実施例３ ファージ媒介溶解の使用 大腸菌特異性バクテリオファージで感染されたものもある大腸菌細胞の培養か
らのアデニル酸キナーゼ遊離の時間経過を調べた。１００μlの試料（それぞれ ちょうど３５０個の細胞を含有）を、大腸菌特異性バクテリオファージで感染さ
れた培養から間欠的に取り出し、４０分後に細胞外アデニル酸キナーゼ活性を検
定した。結果を図３に示し、ここで、○＝感染された培養、●＝感染されていな
い対照である。 これらの結果から、この方法により５００個以下の細胞が検出されることがわ
かった。
らのアデニル酸キナーゼ遊離の時間経過を調べた。１００μlの試料（それぞれ ちょうど３５０個の細胞を含有）を、大腸菌特異性バクテリオファージで感染さ
れた培養から間欠的に取り出し、４０分後に細胞外アデニル酸キナーゼ活性を検
定した。結果を図３に示し、ここで、○＝感染された培養、●＝感染されていな
い対照である。 これらの結果から、この方法により５００個以下の細胞が検出されることがわ
かった。
【００２９】 実施例４ 抗生物質感受性検定：−溶菌性抗生物質 試料細胞（混合培養でも純粋培養でもよい）を２つのフラクションに分割し、
１つをバクテリオファージで感染させた。これらフラクションをそれぞれさらに
２つのフラクションに分割し、１つは抗生物質にさらし、もう一方は処理しない
でおいた。所定時間で生成された細胞外アデニル酸キナーゼの相対レベルは、抗
生物質とバクテリオファージの標的細胞に及ぼす効果を示す。実際に得られた試
験結果を表１に示した。 結果は、細胞及び対照の両方の抗生物質耐性状態が、本試験が正確に機能した
ことを保証することを示している。
１つをバクテリオファージで感染させた。これらフラクションをそれぞれさらに
２つのフラクションに分割し、１つは抗生物質にさらし、もう一方は処理しない
でおいた。所定時間で生成された細胞外アデニル酸キナーゼの相対レベルは、抗
生物質とバクテリオファージの標的細胞に及ぼす効果を示す。実際に得られた試
験結果を表１に示した。 結果は、細胞及び対照の両方の抗生物質耐性状態が、本試験が正確に機能した
ことを保証することを示している。
【００３０】
【表１】
【００３１】 実施例５ 抗生物質感受性検定：−非溶菌性抗生物質又は生物静力学的薬剤 同様の方法によって、細胞を溶解しないが、他の方法で細胞増殖を阻害する抗
生物質（及び細菌細胞の増殖を阻害する生物静力学的薬剤のような他の化学薬品
）に対する細菌の感受性を迅速に決定することができる。 混合培養中の細胞の非溶菌性抗生物質に対する感受性試験は、溶解を起こす抗
生物質に対する感受性についての試験と同様な方法で実行できるだろう。しかし
、バクテリオファージ感染を許容するためには細菌は活発に増殖していなければ
ならないので、抗生物質に対する感受性は、処理された試料中のファージ媒介溶
解の欠如によって示されるだろう。 観察されるであろう結果を表２にまとめた。
生物質（及び細菌細胞の増殖を阻害する生物静力学的薬剤のような他の化学薬品
）に対する細菌の感受性を迅速に決定することができる。 混合培養中の細胞の非溶菌性抗生物質に対する感受性試験は、溶解を起こす抗
生物質に対する感受性についての試験と同様な方法で実行できるだろう。しかし
、バクテリオファージ感染を許容するためには細菌は活発に増殖していなければ
ならないので、抗生物質に対する感受性は、処理された試料中のファージ媒介溶
解の欠如によって示されるだろう。 観察されるであろう結果を表２にまとめた。
【００３２】
【表２】
【００３３】 実施例６ 抗生物質耐性試験用試験キット 好適な試験キットは、図５に示されるような多数のウェルが形成され、典型的
にはプラスチックプレートである試料容器を含む。各ウェルに保持できる液体の
総体積は、約0.5mlでよい。プレートは、好適には前調製して、特定のウェルが 、抗生物質及び／又はバクテリオファージの適切な凍結乾燥（又は他の保存状態
の）調製品、及び任意に選択的な増殖培地をも含む。 図５に示されるようなプレートでは、各列に４つのウェルが配置され、特定の
抗生物質に対する耐性を試験するのに使用されており、このプレートを用いて、
３つの抗生物質を同時に試験することができる。
にはプラスチックプレートである試料容器を含む。各ウェルに保持できる液体の
総体積は、約0.5mlでよい。プレートは、好適には前調製して、特定のウェルが 、抗生物質及び／又はバクテリオファージの適切な凍結乾燥（又は他の保存状態
の）調製品、及び任意に選択的な増殖培地をも含む。 図５に示されるようなプレートでは、各列に４つのウェルが配置され、特定の
抗生物質に対する耐性を試験するのに使用されており、このプレートを用いて、
３つの抗生物質を同時に試験することができる。
【００３４】 約0.2mlの体積の試験用試料が使用され、それは純粋培養、免疫捕捉により増 菌された調製品、選択的培地からの試料、又は適当なニートな試料でよく、各ウ
ェルに添加される。例えば、３７℃で１時間のインキュベーション後、アデニル
酸キナーゼ活性を測定するための試薬を添加してよい。これらは、アデニル酸キ
ナーゼの存在下、比色分析シグナルを生じる試薬でよく、さらに好ましくは生物
発光シグナルを生成する試薬である。 詳細には、ルシフェリン及びルシフェラーゼによる５分後、ＡＤＰ及びマグネ
シウムイオン源を添加する。１つのウェルを管へ移動して管ルミノメーター中で
測定することによって、光の放射を決定するか、又は好ましくはプレートをプレ
ートルミノメーター中で自動的に検定し、又はＣＣＤカメラシステムを使用して
全体として画像化する。
ェルに添加される。例えば、３７℃で１時間のインキュベーション後、アデニル
酸キナーゼ活性を測定するための試薬を添加してよい。これらは、アデニル酸キ
ナーゼの存在下、比色分析シグナルを生じる試薬でよく、さらに好ましくは生物
発光シグナルを生成する試薬である。 詳細には、ルシフェリン及びルシフェラーゼによる５分後、ＡＤＰ及びマグネ
シウムイオン源を添加する。１つのウェルを管へ移動して管ルミノメーター中で
測定することによって、光の放射を決定するか、又は好ましくはプレートをプレ
ートルミノメーター中で自動的に検定し、又はＣＣＤカメラシステムを使用して
全体として画像化する。
【００３５】 実施例７ 溶菌性抗生物質と非溶菌性抗生物質が培養増殖に及ぼす効果の比較 溶菌性抗生物質（アンピシリン）及び非溶菌性抗生物質（クロラムフェニコー
ル）の大腸菌培養増殖に及ぼす効果を調べた。 アンピシリン耐性をコードするプラスミド（ＰＵＣ１８）を大腸菌10243の純 粋培養中に導入して、ファージの宿主特異性を変えずに耐性にさせた。また、プ
ラスミドの輸送がその増殖率又はファージ10359による感染を変えないことを保 証するために耐性菌株を試験し、耐性菌株は増殖及び感染に関して感受性菌株と
同様であることがわかった。 大腸菌バクテリオファージ10359の存在下、感受性（輸送されない）細菌及び 耐性細菌から遊離されるアデニル酸キナーゼと、溶菌性抗生物質（アンピシリン
）又は非溶菌性抗生物質（クロラムフェニコール）のいずれかと比較した。
ル）の大腸菌培養増殖に及ぼす効果を調べた。 アンピシリン耐性をコードするプラスミド（ＰＵＣ１８）を大腸菌10243の純 粋培養中に導入して、ファージの宿主特異性を変えずに耐性にさせた。また、プ
ラスミドの輸送がその増殖率又はファージ10359による感染を変えないことを保 証するために耐性菌株を試験し、耐性菌株は増殖及び感染に関して感受性菌株と
同様であることがわかった。 大腸菌バクテリオファージ10359の存在下、感受性（輸送されない）細菌及び 耐性細菌から遊離されるアデニル酸キナーゼと、溶菌性抗生物質（アンピシリン
）又は非溶菌性抗生物質（クロラムフェニコール）のいずれかと比較した。
【００３６】 大腸菌10243の耐性菌株と感受性菌株の両方の対数期培養を、105ファージ1035
9によってＴ0で、また５０μl/mlのアンピシリンによってＴ5で感染させた。ア ンピシリンによる細胞溶解は、感受性菌株中Ｔ10で明白であり、Ｔ20で顕著であ
り、バクテリオファージによるいかなるタイティック(tytic)な効果をも遮蔽し ている。耐性菌株は、抗生物質によって感染されなかったが、２０分後のファー
ジ感染による溶解を示したが、これは有意でない単位Ｔ40であった。結果を図６
に示した。図６は、アンピシリン及びファージの存在下、４０分のみのインキュ
ベーション後、大腸菌10243の培養のアンピシリンに対する感受性を決定できる ことを示している。
9によってＴ0で、また５０μl/mlのアンピシリンによってＴ5で感染させた。ア ンピシリンによる細胞溶解は、感受性菌株中Ｔ10で明白であり、Ｔ20で顕著であ
り、バクテリオファージによるいかなるタイティック(tytic)な効果をも遮蔽し ている。耐性菌株は、抗生物質によって感染されなかったが、２０分後のファー
ジ感染による溶解を示したが、これは有意でない単位Ｔ40であった。結果を図６
に示した。図６は、アンピシリン及びファージの存在下、４０分のみのインキュ
ベーション後、大腸菌10243の培養のアンピシリンに対する感受性を決定できる ことを示している。
【００３７】 大腸菌10243の対数期培養を、ファージ10359及び／又はクロラムフェニコール
（３４μg/ml）の存在下、８０分間にわたってインキュベートし、前記と同様に
アデニル酸キナーゼを検定した。結果を図７に示した。 培養をバクテリオファージ及びクロラムフェニコールの両方と共にインキュベ
ートした場合、クロラムフェニコールのみの場合に比し、多くの細胞溶解が示さ
れた。クロラムフェニコールは溶菌性抗生物質ではないが、インキュベーション
の間中、おそらく細胞死によるであろう細胞の溶解を示した。ファージ媒介溶解
の度合は、抗生物質含有培養中でかなり少なかった。細菌が十分に増殖せず、フ
ァージが複製サイクルを達成するのを妨げたからである。
（３４μg/ml）の存在下、８０分間にわたってインキュベートし、前記と同様に
アデニル酸キナーゼを検定した。結果を図７に示した。 培養をバクテリオファージ及びクロラムフェニコールの両方と共にインキュベ
ートした場合、クロラムフェニコールのみの場合に比し、多くの細胞溶解が示さ
れた。クロラムフェニコールは溶菌性抗生物質ではないが、インキュベーション
の間中、おそらく細胞死によるであろう細胞の溶解を示した。ファージ媒介溶解
の度合は、抗生物質含有培養中でかなり少なかった。細菌が十分に増殖せず、フ
ァージが複製サイクルを達成するのを妨げたからである。
【００３８】 アンピシリン耐性変異体によって得られた結果によれば、クロラムフェニコー
ル耐性変異体は、抗生物質が存在してもしなくても同様にるふまうだろう。従っ
て、６０分のインキュベーション後、自然放射能の発光の増加度が、培養がクロ
ラムフェニコールに対して感受性であるか否かを示すだろう。
ル耐性変異体は、抗生物質が存在してもしなくても同様にるふまうだろう。従っ
て、６０分のインキュベーション後、自然放射能の発光の増加度が、培養がクロ
ラムフェニコールに対して感受性であるか否かを示すだろう。
【図１】 大腸菌細胞からのアデニル酸キナーゼ活性を測定するための実験結果を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図２】 純粋培養中、3.5×105バシラスサチリスバールニガー増殖型細胞の存在下、サ
ルモネラチフィムリウムについての磁性ビーズ免疫捕捉検定の結果を示し；ここ
で、■はビーズにより捕捉された細胞によるアデニル酸キナーゼ活性を示し；□
は試料中の残りの細胞によるアデニル酸キナーゼ活性を示す（すなわち、左側の
グラフは、捕捉されないサルモネラ細胞由来、右側のグラフはこれらプラス非特
異的細胞由来）。
ルモネラチフィムリウムについての磁性ビーズ免疫捕捉検定の結果を示し；ここ
で、■はビーズにより捕捉された細胞によるアデニル酸キナーゼ活性を示し；□
は試料中の残りの細胞によるアデニル酸キナーゼ活性を示す（すなわち、左側の
グラフは、捕捉されないサルモネラ細胞由来、右側のグラフはこれらプラス非特
異的細胞由来）。
【図３】 大腸菌細胞の培養からのアデニル酸キナーゼのファージ媒介遊離の時間経過を
調査するための実験結果を示すグラフである。。
調査するための実験結果を示すグラフである。。
【図４】 本発明の一実施形態によって得られた抗生物質試験結果の概要図である。
【図５】 抗生物質耐性について細菌を試験するための測定プレートを示す図である。
【図６】 大腸菌10243のアンピシリン感受性及び耐性培養についてのファージ10359及び
５０mg／リットルのアンピシリンの効果を示し、ここで、Ｏはアンピシリン及び
ファージ10359を有する感受性大腸菌10243の結果を表し、▽は溶菌剤なしの結果
を表し、かつ、□はアンピシリン及びファージを有する耐性大腸菌10243の結果 を表す。
５０mg／リットルのアンピシリンの効果を示し、ここで、Ｏはアンピシリン及び
ファージ10359を有する感受性大腸菌10243の結果を表し、▽は溶菌剤なしの結果
を表し、かつ、□はアンピシリン及びファージを有する耐性大腸菌10243の結果 を表す。
【図７】 大腸菌10243の培養に及ぼすクロラムフェニコール（３４mg／リットル）及び ファージ10359の効果を示し、ここで、○はファージのみを表し、▽はファージ1
0359及びクロラムフェニコールを表し、□はクロラムフェニコールのみを表し、
かつ◇はファージ又はクロラムフェニコールなしを表す。
0359及びクロラムフェニコールを表し、□はクロラムフェニコールのみを表し、
かつ◇はファージ又はクロラムフェニコールなしを表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 イギリス国 ＴＨＥ ＳＥＣＲＥＴＡＲＹ ＯＦ ＳＴ ＡＴＥ ＦＯＲ ＤＥＦＥＮＣＥ ＩＮ ＨＥＲ ＢＲＩＴＡＮＮＩＣ ＭＡＪＥＳ ＴＹ’Ｓ ＧＯＶＥＲＮＭＥＮＴ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＥＴＥＤ ＫＩＮＧＤＯＭ ＯＦ ＧＲＥＡＴ ＢＲＩＴＡＩＮ ＡＮ Ｄ ＮＯＲＴＨＥＲＮ ＩＲＥＬＡＮＤ イギリス国 ハンプシャー ジーユー14 ０エルエックス ファーンボロー アイヴ ェリー ロード（番地なし） ディフェン ス エヴァリュエイション アンド リサ ーチ エージェンシー (72)発明者 マーフィー メラニー ジェーン イギリス ウィルシャー エスピー４ ０ ジェイキュー ソールズバリー （番地な し） ディフェンス エヴァリュエイショ ン アンド リサーチ エージェンシー ディーイーアールエイ ポートン ダウン (72)発明者 プライス レイチェル ルイーズ イギリス ウィルシャー エスピー４ ０ ジェイキュー ソールズバリー （番地な し） ディフェンス エヴァリュエイショ ン アンド リサーチ エージェンシー ディーイーアールエイ ポートン ダウン (72)発明者 スクイーレル ディヴィッド ジェームズ イギリス ウィルシャー エスピー４ ０ ジェイキュー ソールズバリー （番地な し） ディフェンス エヴァリュエイショ ン アンド リサーチ エージェンシー ディーイーアールエイ ポートン ダウン Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA06 QQ06 QQ27 QQ63 QR02 QR41 QR42 QR50 QR52 QR68 QR69 QR79 QR84 QS12 QS24 QX02
Claims (37)
- 【請求項１】 細菌細胞の増殖特性に及ぼす外部条件の効果についてのイン
ビトロ試験におけるアデニル酸キナーゼの検定の使用。 - 【請求項２】 前記試験が、抗生物質又は生物静力学的薬剤に対する細菌の
感受性についてである請求項１に記載の使用。 - 【請求項３】 前記試験が、細菌の増殖段階を判定することである請求項１
に記載の使用。 - 【請求項４】 ある試薬に対する細菌の感受性を決定する方法であって、前
記試薬を含有する培養から、細菌の溶解によって遊離されたアデニル酸キナーゼ
を検定すること、及びその結果を、試薬の添加前の培養、及び／又は異なった時
点における同一培養からの溶解された細菌、及び／又は前記試薬を含まない同様
の培養からの溶解された細菌のいずれかについての同様のアデニル酸キナーゼの
検定から得られた結果と比較することを含む方法。 - 【請求項５】 細菌が、化学的溶菌剤を用いて溶解される請求項４に記載の
方法。 - 【請求項６】 前記溶菌剤が、特定の細菌に特異的である請求項４に記載の
方法。 - 【請求項７】 前記溶菌剤が、特異的な細菌属、種又は株に感染し、かつ溶
解するバクテリオファージである請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 細菌が、酵素によって溶解される請求項４に記載の方法。
- 【請求項９】 前記酵素が、溶菌素である請求項８に記載の方法。
- 【請求項１０】 前記細菌が、前記培養中のいずれの標的でない細菌をも実
質的に除去するために、まず分離工程に供される請求項３〜９のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項１１】 前記分離が、免疫捕捉法を用いて行われる請求項１０に記
載の方法。 - 【請求項１２】 前記細菌が、前記標的細菌に対して特異的である抗体又は
その結合断片が、その上に固定化されている固体表面に濃縮されている請求項１
１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記培養が、さらに選択的な前記細胞に有利な増殖培地を
含んでなる、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】 溶菌性抗生物質に対する細菌の感受性を決定する方法であ
って、(i)前記細菌を他の微生物種から分離する工程、(ii)前記細菌の培養の細 胞外アデニル酸キナーゼ含量を決定する工程、(iii)前記培養に前記溶菌性抗生 物質を添加し、それを、前記抗生物質がその溶菌効果を発揮できるのに十分な時
間インキュベートする工程、及び(iv)前記培養のアデニル酸キナーゼ含量を決定
して、溶解が起こったかどうかを判定する工程を含んでなる請求項４に記載の方
法。 - 【請求項１５】 工程(i)において、前記細菌が、免疫捕捉法によって分離 される請求項１４に記載の方法。
- 【請求項１６】 細菌の前記培養が、前記細菌に有利な選択的増殖培地を含
む請求項１４又は１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 非溶菌性抗生物質又は生物静力学的薬剤に対する細菌の感
受性を決定する方法であって、(i)前記細菌を他の微生物種から分離する工程、(
ii)前記細菌の培養を、前記非溶菌性抗生物質又は生物静力学的薬剤の存在下、 インキュベートする工程、(iii)そのインキュベーションの間に、間欠的に試料 を取り出し、これら試料中の細菌を溶解し、かつ前記試料中のアデニル酸キナー
ゼを検定することによって、前記培養のすべてのアデニル酸キナーゼ含量が増加
するか又は減少するかを決定する工程を含んでなる請求項４に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記細菌が、化学的溶菌剤を用いて溶解される請求項１７
に記載の方法。 - 【請求項１９】 工程(i)において、前記細菌が、免疫捕捉法によって分離 される請求項１７又は１８に記載の方法。
- 【請求項２０】 細菌の前記培養が、前記細菌に有利な選択的増殖培地を含
む請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２１】 抗生物質又は生物静力学的薬剤に対する細菌の感受性を決
定する方法であって、 (a) 前記細菌の第１試料、前記抗生物質の存在下の第２試料、前記標的細菌を 特異的に溶解するバクテリオファージの存在下の第３試料、及び前記バクテリオ
ファージ及び前記抗生物質の両方の存在下の第４試料をインキュベートする工程
； (b) 培養後の前記第１〜第４の各試料のアデニル酸キナーゼ含量を決定する工 程；及び (c) そのアデニル酸キナーゼの検定の結果を基礎とし、かつ前記抗生物質又は 生物静力学的薬剤の作用形態に基づき、前記細菌の感受性又は耐性を決定する工
程； を含んでなる方法。 - 【請求項２２】 工程(c)で得られた結果を、図４に示される結果と比較し て、前記細菌が前記抗生物質又は生物静力学的薬剤に対して感受性であるか、又
は耐性であるかを決定する請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 前記培養中の前記細菌の濃度が、工程(a)の前に、免疫捕 捉法によって高められる請求項２１又は２２に記載の方法。
- 【請求項２４】 前記試料が、さらに、他の菌種に優先して前記細菌の増殖
に有利な選択的増殖培地を含む請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２５】 細菌培養の増殖期を決定する方法であって、 (a) 前記細菌培養の第１試料を、溶菌剤に供して、その中で細菌細胞を溶解さ せる工程； (b) 前記第１試料中のアデニル酸キナーゼを検定する工程； (c) 前記溶菌剤にさらされなかった前記培養の第２試料中のアデニル酸キナー ゼを検定する工程； (c) 前記第１及び第２培養から得られた結果を比較し、かつ前記培養の増殖期 を判定する工程 を含んでなる方法。
- 【請求項２６】 工程(c)において、第１試料中で見出されるレベルの１％ のオーダーである第２試料中のアデニル酸キナーゼレベルが、健康な対数期の培
養及び１％の過剰レベルを指すことを示す結果が、静止期への進行を指し示して
いる請求項２５に記載の方法。 - 【請求項２７】 前記溶菌剤が、界面活性剤及び特定の標的細菌の細胞に特
異的に感染し、かつ溶解するバクテリオファージを含む請求項２５又は２６に記
載の方法。 - 【請求項２８】 抗生物質に対する細菌の感受性を試験するための試験キッ
トであって、１以上の抗生物質、及びアデニル酸キナーゼの検定に必要な１以上
の試薬を含んでなる試験キット。 - 【請求項２９】 アデニル酸キナーゼの検定に必要な前記試薬が、ＡＤＰ、
マグネシウムイオン源、ルシフェリン及びルシフェラーゼを含む請求項２８に記
載の試験キット。 - 【請求項３０】 前記抗生物質が、凍結乾燥されている請求項２８又は２９
に記載の試験キット。 - 【請求項３１】 さらに、溶菌剤を含んでなる請求項２８〜３０のいずれか
１項に記載の試験キット。 - 【請求項３２】 前記溶菌剤が、化学薬品を含んでなる請求項３１に記載の
試験キット。 - 【請求項３３】 前記溶菌剤が、特定の標的細菌の細胞に特異的なバクテリ
オファージを含んでなる請求項３１に記載の試験キット。 - 【請求項３４】 さらに、マルチ−ウェルプレートを含んでなる請求項２８
〜３３のいずれか１項に記載の試験キット。 - 【請求項３５】 実質的に、実施例を参照して上述したような請求項１に記
載の使用。 - 【請求項３６】 実質的に、実施例を参照して上述したような請求項４に記
載の方法。 - 【請求項３７】 実質的に、実施例６を参照して上述したような試験キット
。
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| GBGB9801126.5A GB9801126D0 (en) | 1998-01-21 | 1998-01-21 | Antibiotic sensitivity testing |
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| GB9816993.1 | 1998-08-06 | ||
| GBGB9816993.1A GB9816993D0 (en) | 1998-01-21 | 1998-08-06 | Antibiotic sensitivity testing |
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Cited By (8)
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