FI114482B - Erittyvien proteiinien lisääntynyt tuotanto eukaryoottisilla yhdistelmäsoluilla - Google Patents

Description

5 114482

Erittyvien proteiinien lisääntynyt tuotanto eukaryootti-silla yhdistelmäsoluilla - Förökad produktion av sekreto-riska proteiner vid eukaryotiska rekombinantceller

Keksintö koskee yhdistelmä-DNA-tekniikkaa. Erityisesti keksintö koskee SSO-geeneillä tai niiden homologeilla transformoituja uusia eukaryoottisia yhdistelmäsoluja. Useilla SSO-geenikopjoilla tai SSO:n kanssa homologisen 10 geenin kopioilla transformoidun eukaryoottisen solun kyky tuottaa erittyvää vierasta tai endogeenista proteiinia on lisääntynyt.

Mainitut uudet eukaryoottiset yhdistelmäsolut, erityises-15 ti hiivat ja rihmasienet, transformoituina sopivia hydro-lyyttisiä entsyymejä ilmentävillä geeneillä, voivat lisäksi hydrolysoida ja/tai käyttää hyväksi sopivia makro-molekulaarisia/polymeerisiä yhdisteitä tehokkaammin, mistä on seurauksena lisääntynyt solumassatuotanto ja/tai 20 monipuolisempi yhdisteiden hyväksikäyttö asiaan liittyvissä bioteknisissä käyttösovelluksissa.

Yhdistelmä-DNA-menetelmien kehitys on mahdollistanut pro- 4 I · i ’.· teiinien tuottamisen heterologisissa isäntäsysteemeissä.

: 25 Tämä mahdollisuus helpottaa huomattavasti esim. terapeut- ·; · tisesti tärkeiden proteiinien tuotantoa, joita tavalli- • ; sesti esiintyy luonnossa hyvin pieninä määrinä, tai joita » 1 i on muutoin vaikea eristää tai puhdistaa. Sellaisia proteiineja ovat kasvutekijät, hormonit ja muut biologisesti 30 aktiiviset proteiinit tai peptidit, joita on perinteisesti! ti eristetty ihmisten tai eläinten kudoksista tai kehon f nesteistä esim. veren seerumista tai virtsasta. Ihmisen •Jt patogeenisten virusten kuten HBV:n, HIV:n ja onkogeenis- : ; ten virusten tai muiden patogeenien läsnäoloon ihmisten » 4 ;.tt 35 tai eläinten kudoksissa tai kehonnesteissä liittyvä kas-\ \ vava vaara on tuntuvasti jouduttanut heterologisten tuo- ' ’ tantojärjestelmien etsintää näitä terapeuttisia aineita j 2 114482 I varten. Muita kliinisesti tärkeitä proteiineja ovat vi- j j rusten tai muiden mikrobien tai ihmisen loisten prote- j iinit, joita tarvitaan diagnostisiin aineisiin ja rokot- j teisiin, erityisesti sellaisista organismeista, joita on 5 vaikea kasvattaa in vitro tai kudosviljelmässä, tai jotka ovat ihmisen vaarallisia patogeenejä. Näitä ovat virukset kuten HBV, HIV, keltakuumevirus, vihurirokkovirus, FMDV, rabiesvirus ja ihmisen loiset kuten malaria-loiset.

10 Toinen proteiiniryhmä, jolle on kehitetty tai ollaan kehittämässä heterologisia tuotantosysteemejä, käsittää erittyvät entsyymit, erityisesti ne, jotka hydrolysoivat kasviainesta, ja joita tarvitaan elintarvike- tai rehu-tuotannossa samoin kuin muissa teollisissa prosesseissa, 15 mukaan lukien tekstiiliteollisuus ja paperi- ja massateollisuus. Mahdollisuus proteiinien tuottamiseksi hetero-logisissa systeemeissä tai endogeenisten proteiinien tuottamiseksi geneettisesti manipuloiduissa soluissa lisää niiden saantoja ja helpottaa huomattavasti niiden 20 puhdistusta, ja on jo tähän mennessä vaikuttanut suuresti tutkimuksiin koskien monen merkittävän entsyymin ja muiden proteiinien rakennetta ja toimintaa. Vieraiden hydro-: ** lyyttisten entsyymien tuotanto ja eritys esimerkiksi hii- : .· vassa johtaa parannuksiin prosesseissa, jotka pohjautuvat 25 teollisiin hiivakantoihin kuten polttimo-, panimo- tai leivinhiivoihin.

* * * *

Erilaisia tuotantojärjestelmiä on kehitetty ja kehitellään, esim. bakteerit, hiivat, rihmasienet, eläin- ja ,;t 30 kasvisoluviljelmät ja jopa monisoluiset organismit kuten [!!! siirtogeeniset eläimet ja kasvit. Kaikilla näistä erilai-

• I

sista järjestelmistä on etunsa, vaikka myös haittansa, ja ·.·.* kaikkia niitä tarvitaan.

* * # :v. 35 Hiiva Saccharomyces cerevisiae on tällä hetkellä parhai- [.*. ten tunnettu eukaryootti geneettisellä tasolla. Eukary- oottisena mikrobina sillä on eukaryoottisolun edut kuten 114482 useimmat ellei kaikki eukaryoottien post-translationaa-liset modifikaatiot, ja mikrobina sen ominaisuuksiin kuuluvat bakteerien tavoin helppo käsiteltävyys ja viljely. Suurimittaiset fermentointisysteemit ovat S. cerevisiaen i 5 osalta hyvin kehittyneet, jolla hiivalla on pitkä kehi tyskaari bioteknologian työjuhtana mukaan lukien elintarvikkeiden ja juomien, kuten oluen ja viinin tuotanto.

Hiivagenetiikan menetelmät ovat tähän mennessä parhaiten 10 kehittyneet eukaryooteilla perustuen klassisen genetiikan avulla kertyneeseen laajaan tietämykseen. Tämä teki helpoksi omaksua ja jatkokehittää hiivalle geenitekniikan menetelmät, jotka ensin kuvailtiin Escherichia colille. Laaja-alaisesti on mm. kehitetty menetelmiä sellaisten 15 hiivakantojen konstruoimiseksi, jotka tuottavat vieraita proteiineja (Romanos el: al_., 1992).

Proteiinien erittyminen kasvualustaan käsittää proteiinien siirtymisen erilaisten membraanin sulkemien osasto-20 jen kautta, jotka muodostavat eritysreitin. Proteiinit siirtyvät ensin endoplasmakalvoston, ER, onteloon. Siitä ,, , eteenpäin proteiinit kuljetetaan membraanirakkuloissa * · · • ·’ Golgin kompleksiin ja Golgin laitteesta solukalvolle.

• > * .* Eritysprosessi käsittää useita vaiheita, joissa eritty- 25 neitä proteiineja sisältävät rakkulat kuroutuvat irti "“·* luovuttajakalvolta, kohdistetaan vastaanottajakalvoon ja : : : sulautetaan siihen. Kaikissa näissä vaiheissa tarvitaan » « t · useiden eri proteiinien toimintoja.

30 Hiivan eritysreittiä ja useita siihen liittyviä geenejä on selvitetty eristämällä ehdollisia letaaleja mutantte- • · ja, jotka ovat vajavaisia eritysprosessin tiettyjen vai-*,*.· heiden suhteen (Novick et ai., 1980; 1981). Mutaatio pro- :t >: teiinissa, jota tarvitaan tietyssä siirtovaiheessa, joh- ;v, 35 taa eritettyjen proteiinien kertymiseen edeltävään kalvo- \ osastoon. Proteiinit voivat siten akkumuloitua ER:n ja

Golgin laitteen väliin tai rakkuloihin Golgin laitteen ja 4 114482 solukalvon välissä.

Yksityiskohtaisempi analyysi eritysprosessiin liittyvistä geeneistä ja proteiineista on tullut mahdolliseksi kloo-5 nattaessa geenejä ja karakterisoitaessa vastaavien prote-; iinien toimintoja. On hahmottumassa sellainen kuva, että kaikissa vaiheissa toimii useita toisiinsa vaikuttavia proteiineja. Äskettäin olemme kloonanneet kaksi uutta hiivageeniä, SS01 ja SS02, secl-1-defektin monikopioisina 10 suppressoreina kasvatuksessa ja erityksessä kohonneissa lämpötiloissa (Aalto et ai., 1993).

Monet S. cerevisiaesta identifioiduista ja eristetyistä geeneistä on löydetty ja kloonattu muista organismeista, 15 perustuen joko sekvenssihomologiaan hiivageenien suhteen tai hiivamutaatioiden komplementaatioon. Nisäkkään NSF-tekijä on hiivan SECl8-geenituotteen homologi ja sillä on samanlainen funktio proteiinin erityksessä (Wilson et ai., 1989). Yarrowia lipolytican (Lopez et ai., 1992) 20 SEC14-geeni on kloonattu ja karakterisoitu. Nisäkkään homologi hiivan SECl1-geenilie, joka koodittaa signaali-peptidaasin komponenttia, on kloonattu (Greenberg et ai., : ·’ 1989). Schizosaccharomyces pomben YPTl-geeni, joka koo- : dittaa pientä GTP:tä sitovaa proteiinia, kloonattiin 25 käyttäen koettimena hiivageeniä SEC4 (Fawell et ai., “>'Ί 1989), ja nisäkkään YPT1-vastineen osoitettiin olevan osa ; eritysmekanismia käyttämällä vasta-aineita hiivan Yptl- t t 1 ( proteiinille (Segev et ai., 1988). Nisäkkään rabl-prote-iini, jonka on osoitettu olevan homologinen Yptl:n suh-30 teen (Zaraoui eit aJ^. , 1989) voi korvata hiivan Yptl-funk-tion (Haubruck et ai., 1990).

» · ί,:,· Proteiinitasolla hiivan keksinnön mukaisten SSOl- ja SS02-geenien suhteen homologisia geenejä tavataan useista 35 lajeista mukaan lukien hiiri (Hirai et ai., 1992), rotta (Inoue et ai., 1992, Bennett et a_l., 1992) ja nematodi *· : (Ainscough et ai., 1991); EMBL Data Bank, talletusnumero 5 114482 M 75825), mikä osoittaa sen, että geenit ovat säilyneet evoluution kuluessa. Homologiset proteiinit toisissa lajeissa esiintyvät myös solun pinnalla tai ne ovat läheisesti tekemisissä synapsirakkulakuljetuksessa solun pin-5 taan, mikä osoittaa, että ne voivat olla toiminnallisesti samanlaisia kuin SS01 ja SS02. Suora osallistuminen eritykseen on kuitenkin osoitettu Ssol-proteiineilla, joista keksinnön mukaisesti on raportoitu (Aalto et ai., 1993). Hiivahomologeja synapsirakkulakalvoproteiineille, synap-10 tobreviineille, ovat Sncl- ja Snc2-proteiinit (Gerst et ai. 1992; Protopovov et ai., 1993).

Edellä mainitut esimerkit, joita on olemassa paljon enemmän, valaisevat eritysmekanismin yleispätevää luonnetta.

15 Hiivalla saadut tulokset ovat laajalti käyttökelpoisia muissa sienissä samoin kuin muissa eukaryoottisissa soluissa .

SSQ-geenien sekvenssien suhteen homologisten geenien kä- 20 sitetään toimivan myös muissa solunsisäisen proteiinikul- jetuksen/erityksen vaiheissa: SED5 (Hardwick ja Pelham, 1992) ER:n ja Golgin laitteen välissä, ja PEP12 (Becherer : ·* ja Jones, 1992) Golgin laitteen ja vakuolin, hiivan ly- • · · : sosomiosaston välissä. Tämä tukee edelleen SSQ-geenien ·,!.· 25 keskeistä ja säilynyttä osaa proteiinierityksessä ja so- lunsisäisessä kuljetuksessa. Toistaiseksi ei kuitenkaan i ole olemassa raportteja yli-ilmennettyjen SSO-homologien positiivisesta vaikutuksesta eritykseen hiiva- tai eläin-soluissa, joka vaikutus osoitetaan tässä keksinnössä SSO-30 geeneillä.

i · > > *

Muiden hiivojen kuten Kluyveromyceksen, Pichian, Schi-zosaccharomyceksen ja Hansenulan erityssysteemistä tiede-•,t: tään vähemmän, jotka kuitenkin ovat osoittautuneet käyt- 35 tökelpoisiksi isänniksi vieraiden proteiinien tuotantoon (Buckholz ja Gleeson, 1991) . Näiden hiivojen genetiikka ja molekyylibiologia eivät ole yhtä kehittyneet kuin Sac- 6 114482 charomyceksellä mutta näiden hiivojen hyödyt tuotan-toisäntinä ovat samat kuin Saccharomyceksellä. Tämä pätee myös rihmasieniin kuten Neurosporaan, Aspergillukseen ja Trichodermaan, joita on käytetty erittyvien vieraiden 5 proteiinien tuotantoon (Jeenes et ai., 1991). Koska rih-masienet kuuluvat taksonomisesti sienikuntaan ja niistä hyvin monet myös Ascomycetes-luokkaan kuten S. cere-visiaekin, on ilmeistä, että rihmasienten eritysmekanismi on samankaltainen kuin S. cerevisiaella. Rihmasienet ovat ! 10 hyvin tehokkaita omien hydrolyyttisten entsyymien erittä- I jiä. Vieraiden proteiinien tuotanto rihmasienissä on kui tenkin paljon tehottomampaa ja monissa tapauksissa tämä näyttää johtuvan tehottomasta erityksestä. Yhteispiirtee-nä kaikille sienille ovat esimerkiksi post-translaatio-15 naaliset modifikaatiot, joita esiintyy pitkin eritysreit-tiä.

Useita yritelmiä on tehty ja julkaistu aikaisemmin vieraan proteiinituotannon lisäämiseksi hiivoissa ja rih-20 masienissä samoin kuin muissa organismeissa. Huomattava määrä työtä on omistettu erilaisille promoottori- ja plasmidirakenteille transkriptiotason tai plasmidin ko-; ·* piomääräm lisäämiseksi (esim. Baldari et a].., 1987; Mar- .· .* tegani et: a^. , 1992; Irani ja Kilgore, 1988). Tavanomai- 25 nen lähestymistapa yrittää ja lisätä eritystä on hiivan T'.‘ signaalisekvenssien käyttäminen (Baldari, et ai., 1987, i Vanoni et ai., 1989). Sattumanvaraista mutatointia ja eritetyn proteiinin seulontaa (Smith et a_l., 1985; Sakai et ajL. , 1988; Schuster et ajL. , 1989; Suzuki et ai., 1989; 30 Sleep et ai., 1991; Lamsa ja Bloebaum, 1990; Dunn-Coleman et ai., 1991) tai vieraan proteiinin fuusiota tehokkaasti * i Ύ eritettyyn endogeeniseen proteiiniin (Ward et ai., 1990;

Harkki et ai., 1989; Nyyssönen et ai., 1993; Nyyssönen et • ai., patentti) on laajalti käytetty sekä hiivoilla että ;v, 35 rihmasienillä vieraiden proteiinien erittymisen tehosta- . miseksi. Kummallakin näistä menetelmistä on rajallinen 1 * i käyttö. Ylituotantomutantit, jotka on eristetty sattuman- 7 114482 varaisen mutatoinnin ja seulonnan avulla, ovat miltei poikkeuksetta resessiivisiä eikä niitä siten voi siirtää teollisiin hiivakantoihin, jotka ovat polyploideja. Ylituotanto johtuu usein muista muutoksista kuin lisääntynyt 5 eritys ja monissa tapauksissa se vaikuttaa seulonnassa käytettyyn proteiiniin. Fuusioproteiinitoimintamalli edellyttää fuusiorakenteen räätälöimistä kullekin vie-| raalle proteiinille erikseen.

! 10 Keksinnön mukainen toimintamalli on yleispätevämpi, jonka i ! mukaan lisätään erityksessä toimivien geenien kopiomäärää ja siten eritysmekanismiin kuuluvien komponenttien määrää: se on käytettävissä mille tahansa proteiinille ilman erityisiä fuusiorakenteita ja sovellettavissa diploidi-15 siin ja polyploidisiin kantoihin.

Ei tiedetä tarkalleen, mitkä vaiheet muodostavat pullonkauloja eritysprosessissa mutta voidaan nähdä ennalta, että niitä on useita. Mahdollisten sulkujen selvittäminen 20 aloitettiin aivan erityspolun päästä ja geenejä on kloonattu ja karakterisoitu, jotka osallistuvat eritysproses-sin aivan loppuvaiheeseen, jossa Golgin kompleksista ku- « · : ·' routuvat eritysrakkulat kohdentuvat ja sulautuvat solu- : .* kalvon yhteyteen vapauttaen eritetyt proteiinit solun 25 ulkopuolelle. Tässä vaiheessa toimiva SEC1 on aikaisemmin kloonattu ja karakterisoitu (Aalto et ai., 1991; Aalto et ; ai., 1992), ja myöhemmin on osoitettu, että SEC1 on vält- , , t - ' tämätön yksikopiogeeni (Aalto et ai., 1993). Keksinnön mukaiset SSO-geenit kloonattiin secl-1-mutaation moniko-30 pioisina suppressoreina (Aalto et ai., 1993).

» 1' Tässä keksinnössä kuvaillaan sellaisten geenien eristä- '..V minen, jotka yli-ilmentyessään tehostavat erittyvien pro- : jt: teiinien tuotantoa. Tässä keksinnössä kuvaillaan erityi- ;·)·. 35 sesti S. cerevisiaen SSOl- ja SS02-geenien eristäminen, \ jotka koodittavat Ssolp:tä ja vastaavasti Sso2p:tä, gee- ‘ ‘ nien karakterisointia ja niiden siirtämistä S. cere- 8 114482 visiaehen ja ylituotantoa siinä. Tässä keksinnössä kuvaillaan lisäksi SSO-homologin eristämistä Trichoderma reeseistä, geenin karakterisointia ja siirtämistä Tricho-dermaan ja ylituotantoa siinä.

5

Sekvenssihomologiat hiivan SSQ-geenien ja niiden eukary-oottisten vastineiden välillä osoittavat lisäksi, että tätä keksintöä voidaan käyttää uusien solulinjojen konstruointiin korkeammille eukaryooteille, joiden erityska-10 pasiteetti on lisääntynyt.

Tämä keksintö koskee siten uusia eukaryoottisia yhdistel-mäsoluja, edullisesti sieni-isäntäsoluja, jotka ilmentävät tehostetusti Sso-proteiinia (proteiineja), ja erityi-15 sesti hiivakantoja, jotka ilmentävät tehostetusti Ssol-ja/tai Sso2-proteiineja, samoin kuin Trichoderma-kantoja, jotka ilmentävät tehostetusti Trichoderman Sso-proteiinia. Tämä keksintö koskee myös prosessia (prosesseja), jonka avulla tuotetaan lisääntyneitä määriä erittyviä 20 proteiineja, yli-ilmentämällä geenejä, jotka ovat vuorovaikutuksessa SSQ-geenien kanssa, kuten SEC1:tä.

» · t

Keksinnön mukaisten eukaryoottisten solujen, jotka on • · transformoitu SSO-geeneillä tai SSQ-geenien kanssa vuoro-ui· 25 vaikutuksessa olevilla geeneillä, kyky tuottaa erittyviä 'ί proteiineja on lisääntynyt. Keksinnön mukaisia uusia eu- :; karyoottisia soluja, erityisesti hiivoja ja rihmasieniä, ,: voidaan käyttää myös hydrolyyttisten entsyymien tehok kaampaan tuotantoon ja esim. polymeeristen substraattien 30 hydrolyysiin, mistä on seurauksena parannuksia biotekni-,··, sissä prosesseissa kuten solumassatuotannossa tai leivin- hiivatuotannossa, johtuen lisääntyneestä solumassasta, tai muissa prosesseissa, joissa hydrolyyttisten entsyymi-en tehokas tuotanto ja/tai kasviaineksen tehokas hydro-35 lyysi on edullista.

< t * 1 I I | » 9 114482

Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuviot IA ja IB esittävät S. cerevisiaen SSOl- ja SS02-geenien cDNArt integroituina monikopioplasmidiin pMAC561, 5 josta on seurauksena plasmidit YEpSSOl ja vastaavasti YEpSS02.

Kuvio 2 esittää Western-analyysia, joka osoittaa Sso2-proteiinin yli-ilmentymistä YEpSS02:lla transformoidussa 10 hiivassa.

Kuvio 3 esittää (kanta sf750-14D) Bacilluksen erittyvän a-amylaasin lisääntyneen tuotannon cerevisiaesta, joka on transformoitu monikopioplasmidilla, joka ilmentää 15 SSOl- tai SS02-geeniä, ja toisella plasmidilla, joka ilmentää Bacilluksen α-amylaasigeeniä.

Kuvio 4 esittää Western-analyysiä Bacilluksen erittyvän α-amylaasin tuotosta S_^ cerevisiaen avulla SSOl- tai 20 SS02-geeniä ilmentävän monikopioplasmidin kanssa tai ilman .

Kuvio 5 esittää erittyvän Bacillus-α-amylaasin lisään-: .· tynyttä tuotantoa S. cerevisiaella (kanta DBY746), joka li,· 25 on transformoitu monikopioplasmidilla, joka ilmentää SS02-geeniä, ja toisella plasmidilla, joka ilmentää Ba-cilluksen a-amylaasia.

Kuvio 6 esittää erittyvän Bacillus-a-amylaasin lisään-30 tynyttä tuotantoa S. cerevisiaella (kanta DBY746), joka on transformoitu monikopioplasmidilla, joka ilmentää SECl-geeniä, ja toisella plasmidilla, joka ilmentää Ba-;.i,: cilluksen a-amylaasia.

* * 35 Kuvio 7 esittää SS02-ekspressiokasettia, jota reunustavat \ ribosomaaliset sekvenssit, integroituna BS+:aan ja muo dostaen vektorin pRbSS02.

10 1 1 4482

Kuvio 8 esittää kuudesta eri sienilajista peräisin olevan DNA:n hybridisaatiota hiivan SSQl-geenin kanssa.

5 Jotta keksinnön seuraava yksityiskohtainen kuvaus tulisi paremmin ymmärretyksi, voi olla hyödyllistä esittää määritelmät tämän jälkeen käytetyille ilmaisuille.

Geenin yli-ilmentyminen: Mainitun geenin koodittamaa pro-10 teiinia tuotetaan lisääntyvinä määrinä solussa. Tämä voidaan saada aikaan lisäämällä geenin kopiomäärää viemällä soluun ylimääräisiä geenikopioita plasmidissa tai integroituna genomiin. Yli-ilmentyminen voidaan myös saada aikaan asettamalla geeni sen omaa promoottoria voimak-15 kaamman promoottorin ohjaukseen. Proteiinin määrää solussa voidaan vaihdella muuttamalla geenin kopiomäärää ja/tai ilmentämiseen käytetyn promoottorin voimakkuutta.

Mutaation suppressio: Kun mutaation vaikutusta tietyssä 20 geenissä vähennetään tai se poistetaan mutaatiolla toisessa geenissä, tätä toista geeniä nimitetään ensimmäisen geenin suppressoriksi. Suppressiota voi esiintyä myös : yli-ilmennettäessä toisen geenin villityypin alleeli j edellä kuvaillulla menetelmällä. Tätä nimitetään yli-il- : : 25 mentämissuppressioksi. Jos yli-ilmentymisen aiheuttavat Ί1': suppressiogeenin monikopiot, suppressiota voidaan nimit- ' . tää myös monikopiosuppressioksi. Suppressioilmiö osoit- :·, taa, että nämä kaksi geeniä vaikuttavat toisiinsa geneet tisellä tasolla. Vuorovaikutus voi tapahtua myös fysikaa-30 lisella tasolla, suorana fyysisenä kosketuksena toisiinsa ;;; vaikuttavien geenien koodittamien kahden proteiinin vä-

Iillä.

Homologiset geenit, homologit: Geenit, jotka muistuttavat 35 läheisesti toisiaan DNA-sekvenssien suhteen mutta eivät *. *, ole identtisiä, ja/tai suorittavat samoja toimintoja, '· · ovat homologiset toistensa suhteen ja niitä nimitetään n 114482 toistensa homologeiksi.

Erittyvät proteiinit: Proteiinit, jotka solun sisältä ohjataan eritysreitille ja kuljetetaan sitä pitkin solun 5 ulkopuolelle, solukalvon ulkopuolelle, ovat nimeltään erittyvää proteiineja. Hiivassa proteiinit kuten inver-taasi voivat jäädä soluseinän yhteyteen tai voivat vapautua soluseinän kautta kasvualustaan kuten vieras proteiini Bacillus-a-amylaasi.

10 Tässä keksinnössä käytettävät SSOl- ja SS02-geenit eristetään organismista, joka sisältää nämä geenit, esim.

I Saccharomyces cerevisiaesta ja Trichoderma-lajeista. Myös muita sopivia hiivoja ja muita sieniä voidaan käyttää, 15 kuten esim. Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lac-tis, Pichia-lajit, Hansenula-lajit, Aspergillus-lajit, Neurospora-lajit ja Penicillium-lajit. Tulee huomata, että homologisia geenejä muista organismeista voidaan myös käyttää.

20

Sen lisäksi, muiden geenien, kuten SECT:n, jotka toimivat samassa vaiheessa kuin SSO-geenit, yli-ilmentäminen Sso-proteiinien ollessa läsnä normaaleina tai kohonneina ta-: ,· soina, johtaa lisääntyneeseen eritykseen. Eritysprosessia 25 edeltävissä vaiheissa toimivilla geeneillä voi hyvinkin Γ': olla samanlainen vaikutus. Eritysrakkuloiden vapautumista

Golgin laitteesta voidaan siten helpottaa lisäämällä SEC7- ja/tai SECl4-geenien kopiomääriä, joiden tiedetään toimivan tässä vaiheessa (Novick et ai., 1980), tai otsiin 30 mällä ja lisäämällä kopiomääriä geeneistä, jotka ovat vuorovaikutuksessa SEC7 : n ja/tai SEC14 :n kanssa, esim. niiden mutaatioiden suppressorit. Vastaavalla tavalla eritysprosessin mitä tahansa aikaisempaa vaihetta voidaan parantaa lisäämällä asiaankuuluvien geenien kopiomääriä.

..\ 35 Keksinnön mukaisesti S. cerevisiaesta eristetyt uudet \ geenit, SSOl ja SS02, edustavat duplikoituja geenejä, ’· ’’ mikä viittaa siihen, että niillä on tärkeä merkitys so- 12 1 1 4482 lussa. Perustuen SS01:n ja SSQ2:n ja niiden homologien konservoituneisuuteen muissa lajeissa, kuten edellä on mainittu, esitämme, että SSO-geenien lisääminen jossain muussa eukaryoottisessa lajissa, mm. muissa hiivoissa 5 rihmasienissä ja kasvi- ja eläinsoluissa, johtaisi proteiinin eritystehon lisääntymiseen.

Siitä syystä, että monet eritykseen osallistuvat geenit toimivat muissa organismeissa, tämä keksintö kattaa esi-10 merkiksi myös hiivageenien ilmentämisen rihmasienissä ja korkeammissa eukaryooteissa ja päinvastoin, tai jonkin eukaryoottisen geenin toisessa eukaryootissa, jotta saavutetaan tehostettu eritys.

15 Keksinnön mukaisilla geeneillä transformoitava isäntä voi olla mikä tahansa eukaryoottinen solu, joka on sopiva vieraan tai endogeenisen proteiinin tuottamiseen, esim. jokin S. cerevisiae -hiivakanta (esim. DBY746, AH22, S150-2B, GPY55-15Ba, VTT-A-63015), jokin Trichoderma-la-20 jeista kuten T. harzianum - ja T. reesei -kannat, jotka ovat peräisin luonnollisesta isolaatista QM6a, kuten RUTC-30, QM9416 ja VTT-D-79125, jokin Kluyveromyces-laji, : ‘ Sch. pombe, H. polymorpha, Pichia, Aspergillus, Neurospo- : .* ra, Yarrowia, Penicillium-laji tai jokin korkeammista 25 eukaryoottisotuista. Geenien siirtäminen näihin soluihin voidaan saada aikaan esimerkiksi käyttämällä tavanomai-siä, näille organismeille kuvailtuja menetelmiä.

SSOl:n tai SS02:n sisältävä DNA-sekvenssi eristetään S.

30 cerevisiaesta tavanomaisilla menetelmillä. Edullisessa suoritusmuodossa käytetään geeni- tai cDNA-kirjastoa mo- nikopioplasmidissa secl-1-mutantin lämpötilaherkkyyden suppressoimiseksi (Aalto et ai., 1991; 1993) tai sellais- : ten mutaatioiden suppressoimiseksi, jotka johtavat vaja- ;·'» 35 vuuteen S. cerevisiaen SSO-funktiossa tai muiden lajien » » \ analogisten mutaatioiden suppressoimiseksi. Muissa lähes- ‘ * tymistavoissa SSO-geenien tai SSO:n kaltaisten geenien 13 1 1 4482 tunnettua DNA-sekvenssiä käytetään konstruoitaessa koet-timia heterologiseen hybridisaatioon tai PCR-alukkeita SSO-geenien kloonaukseen. Vielä toisessa lähestymistavassa käytetään vasta-aineita tunnettuja SSO-geenejä ja 5 SSO:n kaltaisia geenejä vastaan geenin kloonaamiseksi va-kiomenetelmien avulla.

S. cerevisiaen SS01- ja SS02-geenejä vastaavat geenit j eristetään muista sienistä tai korkeammista eukaryooteis- 10 ta yhdellä tai useammalla seuraavista menetelmistä, joita on tässä yhteydessä kuvailtu erityisesti rihmasienelle Trichoderma reesei, ja joita voidaan modifioida tavanomaisen tietämyksen ja keinojen mukaisesti kyseiselle eukaryoottisolulle sopiviksi.

15 T. reesein cDNA-pankki konstruoidaan hiivavektoriin pFL60 kuten FI-patenttihakemuksessa 92 2373 (Buchert et: ai.) on kuvailtu. Tämä geenipankin DNA transformoidaan S. cere-visiae -kantaan H458 (Aalto et ai., 1993) ja seulotaan 20 eritysdefektin komplementaation suhteen kuten esim. esimerkissä 6 on kuvailtu. Plasmidi eristetään positiivisista klooneista ja geeni eristetään ja karakterisoidaan ·’ * käyttäen vakiomenetelmiä ja vastaava kromosomaalinen gee- • * ! ni eristetään. Onnistunut komplementaatio osoittaa, että 25 hiivan SSO-geenejä toiminnallisesti vastaavia geenejä esiintyy muissa sienissä kuten T. reeseissä.

Vaihtoehtoisesti, S. cerevisiaen Ssolp- ja/tai Sso2p-pro-teiineja vastaavia proteiineja koodittavat geenit voidaan 30 eristää cDNA-pankista tai kromosomaalisesta geenipankis-!!! ta, jotka on valmistettu T. reeseistä heterologisen hyb- *;* ridisaation avulla ei-tiukoissa olosuhteissa kuten esi- !,·; merkissä 7 on kuvailtu, ja jotka on karakterisoitu ta- vanomaisilla menetelmillä, ja niiden toiminta voidaan 35 osoittaa kuten edellä on kuvailtu. Samanlainen lähesty-mistäpä sopii kaikille organismeille, joilla on osoitettu ’* esiintyvän hiivan SSO-geeneille homologisia kromosomaa- i4 1 1 4482 lisiä sekvenssejä, analysoituna esimerkiksi kokonais-DNA:n Southern-hybridisaation avulla. On myös mahdollista, että geeni voidaan eristää ekspressiokirjastosta vasta-aineiden avulla, jotka on tehty hiivan Sso-proteiineja 5 vastaan.

Oligonukleotidialukkeita voidaan konstruoida vaihtoehtoisesti, perustuen homologioihin, joita tavataan vastaavien geenien sekvenssien välillä, jotka on eristetty useista 10 organismeista. Selviä homologioita havaitaan esimerkiksi alueilla, jotka ulottuvat aminohaposta 266 aminohappoon 287 Ssolp:ssä ja ah 269:stä ah 290:een Sso2p:ssä, jotka on esitetty SEKVENSSI ID NO:l:ssä ja vastaavasti SEKVENSSI ID NO:3:ssa. Näitä alukkeita käytetään T. reesein gee-15 nin monistamiseen PCR-reaktiossa.

Hiivan transformointiin sopivan plasmidin konstruoimiseksi SSOl- tai SS02-geeni kloonataan sopivaan hiivan eks-pressiovektoriin kuten pAAH5:een (Ammerer, 1983) tai sii-20 tä saatuihin vektoreihin (Ruohonen et ai., 1991; Ruohonen et ai., käsikirjoitus tekeillä, a), jotka sisältävät so-, pivia hiivan säätelyalueita. Näitä säätelyalueita voidaan * saada hiivageeneistä, kuten esimerkiksi ADHlrstä, GAL1- : GAL10: stä, PGKl:stä, CUPl:stä, GAPrstä, CYClrstä, PH05:s- 25 tä tai asparagiinisyntetaasigeenistä. Geenien ilmentämi-seen S. cerevisiaessa voidaan vaihtoehtoisesti käyttää ; ; : myös SSOl:n tai SS02:n säätelyalueita. SSOl- tai SS02- geenin sisältävä plasmidi kykenee replikoitumaan itsenäisesti transformoituna vastaanottavaan hiivakantaan. SSOl-30 tai SS02-geeni voidaan yhdessä sopivien hiivan säätelyllä alueiden kanssa kloonata myös yksikopioiseen hiivavekto- T riin kuten Hans Ronnen pHR70:een tai pRS313:een, pRS314:~ ään, pRS315:een tai pRS316:een (Sikorski ja Hieter, 1989) .

35 » *

Ylimääräisiä SSOl- tai SS02-kopioita voidaan vaihtoehto!- * · i —~· ‘ * sesti myös integroida hiivakromosomiin, esimerkiksi ri- is 1 1 4482 bosomaaliseen RNA-lokukseen. Tätä tarkoitusta varten sopivan plasmidin, esim. plasmidin pIRL9 (Hallborn et ai., patenttihakemus), ribosomaaliset sekvenssit vapautetaan ja kloonataan sopivasti BS+-vektoriin kuten kuviossa 7 on 5 esitetty. Geeni SSOl tai SSQ2, kytkettynä sopivien hiiva-promoottori- ja -terminaattorialueiden väliin, irrotetaan geenin sisältävästä hybridivektorista ja kloonataan edel-! lisessä vaiheessa saatuun plasmidiin. Tästä tuloksena \ saatavasta plasmidista voidaan irrottaa ribosomaalisten ! 10 sekvenssien reunustama ekspressiokasetti. Tämä fragmentti kotransformoidaan hiivaan yhdessä itsenäisesti replikoi-tuvan plasmidin kanssa, joka sisältää sopivan transfor-maatiomarkkerin. Tämä plasmidi voidaan myöhemmin poistaa soluista, jotka sisältävät ylimääräisiä kopioita SSOl-15 tai SS02-geenistä integroituneina kromosomissa, viljelemällä soluja ei-valikoivissa olosuhteissa. Tällä tavalla ! voidaan saada yhdistelmäkantoja, jotka eivät sisällä yh- ! tään ylimääräistä vierasta DNA:ta kuten bakteerisia vek- torisekvenssejä. Jos käytetään polyploidista hiivakantaa 20 kuten VTT-A-63015:ttä, geeni voi olla integroitunut myös elintärkeään lokukseen kuten ADH1- tai PGKl-lokukseen.

: ·' SSO-geenien ilmentämiseksi Trichodermassa, Trichoderman 1 sso-geeni liitetään esimerkiksi T. reesein cbhl-promoot- 25 torin ja -terminaattorin väliin ja ekspressiokasetti ’f: transformoidaan Trichoderma-kantaan, joka tuottaa esimer- • kiksi nisäkkään vasta-aineita, tai muuta vierasta prote- :‘j*; iinia, tai kantaan, joka tuottaa EGI-ydintä, jotain muuta sellulaasia tai hydrolyyttistä entsyymiä. Erityksen te-30 hostuminen olisi erityisen toivottavaa, kun sientä kasva-tetaan glukoosia sisältävillä alustoilla, ja tätä tarkoi-tusta varten sso-geeni (t) on ilmennettävä konstitutiivi-sista promoottoreista tai promoottoreista, jotka toimivat : glukoosialustalla.

;*!*. 35 \ \ Rihmasienillä sso-geeni integroidaan edullisesti genomiin

* I I

’ * käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä. Sopivia promootto- i6 1 1 4482 reja cbhl-promoottorin tai itse sso-geenin promoottorin lisäksi ovat esimerkiksi muut sellulaasipromoottorit, cbh2:n, egll:n, eg!2:n tai tef1:n, pgk:n, gpd:n, pki:n, glukoamylaasin, a-amylaasin tai alkoholidehydrogenaasin 5 promoottorit. Rihmasienillä transformaatio johtaa tavallisesti kantoihin, joissa on vaihtelevia määriä sso-gee-nikopioita integroituneena genomiin (Penttilä et ai., 1987), ja näistä voidaan seuloa kanta, jonka sso-ilmenty-mistaso on optimaalinen kasvuun ja lisääntyneeseen eri-10 tykseen.

Tämän keksinnön kohteina ovat siten SSO-geenit, erityisesti S. cerevisiaen SSOl- ja SS02-geenit, samoin kuin Trichoderma reesein ja muiden eukaryoottisten solujen 15 homologinen geeni(t). Geenien sekvenssi voidaan määrittää niitä sisältävistä plasmideista käyttäen esim. kaksijuos-teisen dideoksinukleotidin sekvensointimenetelmää (Za-gursky et ai., 1986). S. cerevisiaen SSOl-geenin sekvenssi on esitetty SEKVENSSILLÄ ID NO:l ja S. cerevisiaen 20 SS02-geenin sekvenssi on esitetty SEKVENSSILLÄ ID NO:3.

Tämän keksinnön toisena kohteena ovat spesifiset vekto- : .* rit, jotka sisältävät SSO-geenejä. Hiivan osalta sellai- • · · • V nen vektori on joko itsenäisesti replikoituva monikopioi- 25 nen tai yksikopioinen plasmidi tai vektori, joka kykenee integroitumaan kromosomiin kuten edellä on kuvailtu.

; Trichoderman osalta sellainen vektori on edullisesti plasmidi, josta ekspressiokasetti (promoottori-geeni-ter-minaattori) voidaan irrottaa restriktioentsyymeillä in-30 tegroitavaksi sienigenomiin.

Keksinnön vielä eräänä kohteena ovat hiivakannat tai muut sienikannat samoin kuin eukaryoottisolulinjät, jotka si- : sältävät ylimääräisiä SSO-geenikopioita joko replikoitu- 35 vassa plasmid (e) issa tai integroituneina kromosomeihin, » , josta on seurauksena eritetyjen proteiinien lisääntynyt ’ ‘ tuotanto, kuten hiivan invertaasin tai Trichoderman sei- 17 114482 lulaasien tai muiden hydrolaasien.

Siten menetelmässä uusien eukaryoottisten solujen konstruoimiseksi, jotka kykenevät ilmentämään tehostetusti 5 Sso-proteiinia (-proteiineja) (a) eristetään sopivasta luovuttajaorganismista DNA-sek-venssi(t) SS01 ja SS02, jotka on esitetty SEKVENSSISSÄ ID N0:1 ja vastaavasti ID NO:3, tai niiden sieniperäiset ho- 10 mologi(t), jotka koodittavat Sso-proteiinia (-proteiineja); (b) konstruoidaan vektori(t), jo(t)ka sisältää (sisältävät) vähintään yhden mainituista DNA-sekvensseistä ja 15 (c) transformoidaan vähintään yksi saaduista vektoreista sopiviin isäntäsoluihin.

Keksinnön eräänä kohteena ovat vielä eukaryoottiset so-20 lut, jotka ylimääräisten SSO-geenikopioiden lisäksi sisältävät DNA-sekvenssin, joka koodittaa erittyvää vierasta tai endogeenista proteiinia kuten α-amylaasia, sellu-: * laasia tai vasta-ainetta, ja kykenevät ilmentämään tätä : proteiinia.

·' 25 Tämä keksintö koskee siten menetelmää erittyvän vieraan ; tai endogeenisen proteiinin (proteiinien) tehokkaampaan tuottoon yli-ilmentämällä SSO-geeni (-geenejä). Tässä menetelmässä i. 30 I (a) eristetään sopivasta luovuttajaorganismista DNA-sek- ,’ venssi(t), jo(t)ka koodittaa (koodittavat) mainittua pro- teiinia (proteiineja); 35 (b) konstruoidaan vektori, joka sisältää vähintään yhden . mainituista DNA-sekvensseistä; ie 1 1 4482 (c) transformoidaan saatu vektori sopivaan isäntään, joka sisältää DNA-sekvenssin (-sekvenssejä), joita ovat SS01-ja SS02-sekvenssi, jotka on esitetty SEKVENSSISSÄ ID N0:1 ja vastaavasti ID NO:3, ja niiden sieniperäiset homolo-5 git, ja jotka ilmentävät tehostetusta Sso-proteiinia , (-proteiineja), jolloin saadaan yhdistelmäisäntäsoluja; tai vaihtoehtoisesti, transformoidaan vektori sopivaan isäntään ja transformoidaan tämä transformantti uudelleen DNA-sekvenssillä (-sekvensseillä), joita ovat SS01- ja 10 SS02-sekvenssi, jotka on esitetty SEKVENSSISSÄ ID NO:l ja vastaavasti ID NO:3, ja niiden sieniperäiset homologit, ja seulotaan solut, jotka tuottavat tehostetusti mainittua proteiinia (proteiineja) ja 15 (d) viljellään mainittuja yhdistelmäisäntäsoluja olosuh teissa, joissa on mahdollista ilmentää mainittua proteiinia (proteiineja).

Tämän keksinnön kohteena on lisäksi parantaa eritystä 20 optimoimalla Sso-proteiinitaso käyttäen erilaisia promoottoreja ja erilaisia geenikopiomääriä ja yhdistämällä SSO-geenit muiden eritykseen osallistuvien geenien kuten ! *’ SECl:n kanssa.

♦ » *

I 4 I

·,·,·* 25 Keksintö koskee siten menetelmää erittyvän vieraan tai ·;·: endogeenisen proteiinin (proteiinien) tuottamiseksi te- hostetussa määrin yli-ilmentämällä geeni (geenejä), jo(t)ka on (ovat) vuorovaikutuksessa SSO-geenin kanssa, esim. SECl-geeni, kun läsnä on normaaleja tai lisäänty-30 meitä määriä Sso-proteiinia (-proteiineja), jossa mene- [ telmässä 'i (a) eristetään sopivasta luovuttajaorganismista DNA-sek- : venssi(t), jo(t)ka koodittaa (koodittavat) mainittua pro- 35 teiinia (proteiineja); » ' * (b) konstruoidaan vektori, joka sisältää vähintään yhden 19 114482 mainituista DNA-sekvensseistä; (c) transformoidaan saatu vektori sopivaan isäntään, joka ilmentää Sso-proteiinia (-proteiineja) normaaleja tai li- 5 sääntyneitä määriä ja yli-ilmentää toista geeniä (muita geenejä), jotka ovat vuorovaikutuksessa SSO-geenin kanssa, esim. SEC1:tä, jolloin saadaan yhdistelmäisäntäsolu-ja; tai vaihtoehtoisesti transformoidaan vektori sopivaan isäntään ja tämä transformantti transformoidaan uudelleen 10 SSO-geenillä, jolla on DNA-sekvenssi, joka on esitetty SEKVENSSISSÄ ID NO:l (SSOl-sekvenssi) tai ID NO:3 (SS02-sekvenssi), tai SSO-geenin suhteen homologisella sieniperäisellä geenillä ja SSO-geenin kanssa vuorovaikutuksessa olevalla (olevilla) geenillä (geeneillä), esim. SEC2:llä, 15 ja seulotaan solut, jotka tuottavat mainittua proteiinia (proteiineja) tehostetusti ja (d) viljellään mainittuja yhdistelmäisäntäsoluja olosuhteissa, joissa on mahdollista ilmentää mainittua proteii- 20 nia (proteiineja).

Tämän keksinnön toisena kohteena on vielä menetelmä endo- • > * ·' geenisen erittyvän proteiinin tuotannon lisäämiseksi, - * » : ,· jossa menetelmässä : :.5 25 "i (a) transformoidaan solut, jotka tuottavat mainittua pro- teiinia, DNA-sekvenssillä (-sekvensseillä), joita ovat SSOl- ja SS02-sekvenssi, jotka on esitetty SEKVENSSISSÄ ID NO:l ja vastaavasti ID NO:3, ja niiden sieniperäiset ;t 30 homologit, yksin tai yhdessä SSO-geenin kanssa vuorovai- ! kutuksessa olevan (olevien) geeni(e)n, esim. SEC1:n kans- » ; ‘ sa, ' » ; (b) seulotaan transformantit, jotka tuottavat tehostetus- 35 sa määrin mainittua proteiinia, jolloin saadaan yhdistel-. mäsoluja proteiinituotannon tehostamiseksi ja 2o ^ 1 4482 (c) viljellään mainittuja yhdistelmäsoluja olosuhteissa, joissa on mahdollista ilmentää mainittua proteiinia.

Keksinnön eräänä kohteena ovat vielä sienikannat, jotka 5 sisältävät ylimääräisten SSO-geenien tai niiden homologien kopioiden lisäksi DNA-sekvenssin (-sekvenssejä), jo(t)ka koodittaa (koodittavat) hydrolyyttistä entsyymiä (entsyymejä) kuten a-amylaasia ja/tai glukoamylaasia tai lignoselluloosaa hydrolysoivia entsyymejä kuten sellulaa-10 siä (sellulaaseja), hemisellulaaseja tai lignanaaseja, joka antaa sienelle kyvyn lisääntyneeseen polymeeristen yhdisteiden, kuten tärkkelyksen tai lignoselluloosan hyd-rolyysiin, ja/tai tehostettuun kasvuun näillä substraateilla .

15

Keksintö koskee siten tehokasta biomassatuotantoa mainitulla raaka-aineella tai mainitun raaka-aineen tehokasta hydrolyysiä. Tässä menetelmässä 20 (a) eristetään sopivasta luovuttajaorganismista DNA-sek- venssi(t), jo(t)ka koodittaa (koodittavat) endogeenista tai vierasta hydrolyyttistä entsyymiä (entsyymejä); - t : ' (b) konstruoidaan sienivektori, joka sisältää vähintään -, *, * 25 yhden mainituista DNA-sekvensseistä; '!»<·» « » j (c) transformoidaan saatu vektori sopivaan sieni-isän-

- < t I

tään, joka sisältää DNA-sekvenssin (-sekvenssejä), joita ovat SSOl- ja SS02-sekvenssi, jotka on esitetty SEKVENS-, , 30 SISSÄ ID NO:l ja vastaavasti ID NO:3, ja niiden sienipe- räiset homologit, ja jotka ilmentävät tehostetusti Sso-proteiinia (-proteiineja), jolloin saadaan yhdistelmä-isäntäsoluja; tai vaihtoehtoisesti, transformoidaan vek-/, > tori sopivaan isäntään ja transformoidaan tämä transfor- 35 mäntti uudelleen DNA-sekvenssillä (-sekvensseillä), joita t ovat SSOl- ja SS02-sekvenssi, jotka on esitetty SEKVENS-1 ’ SISSÄ ID NO:l ja vastaavasti ID NO:3, ja niiden sienipe- 21 1 1 4482 räiset homologit, ja seulotaan solut, jotka tuottavat tehostetusta mainittua entsyymiä (entsyymejä) ja (d) viljellään mainittuja yhdistelmäisäntäsoluja olosuh-5 teissä, joissa on mahdollista ilmentää mainittua hydro-lyyttistä entsyymiä (entsyymejä).

Keksintö koskee myös menetelmää biomassatuotannon tehostamiseksi raaka-aineella tai raaka-aineen tehokasta hyd-10 rolyysiä, yli-ilmentämällä geenejä, jotka ovat vuorovaikutuksessa SSO-geenien kanssa, esim. SEC1:tä, kun läsnä on normaaleja tai lisääntyneitä määriä Sso-proteiinia (-proteiineja). Tässä menetelmässä 15 (a) eristetään sopivasta luovuttajaorganismista DNA-sek- venssi(t), jo(t)ka koodittaa (koodittavat) endogeenista tai vierasta hydrolyyttistä entsyymiä (entsyymejä); (b) konstruoidaan sienivektori, joka sisältää vähintään 20 yhden mainituista DNA-sekvensseistä; (c) transformoidaan saatu vektori sopivaan isäntään, joka ; ·’ ilmentää tehostetusti proteiineja, jotka ovat vuorovaiku- : ,1 tuksessa Sso-proteiini(e)n kanssa, kun läsnä on normaale- 25 ja tai lisääntyneitä määriä Sso-proteiinia (-proteiine-’!'·.1 ja), jolloin saadaan yhdistelmäisäntäsoluja, tai vaihto- ' ; ; ehtoisesti transformoidaan vektori sopivaan isäntään ja r » · transformoidaan tämä transformantti uudelleen SSO-geenil-lä, jolla on DNA-sekvenssi, joka on esitetty SEKVENSSISSÄ ;t 30 ID NO:l (SS02-sekvenssi) tai ID NO:3 (SS02-sekvenssi), f! tai SSO-geenille homologisella sieniperäisellä geenillä, !' ja SSO-geenin kanssa vuorovaikutuksessa olevalla (olevil- la) geen(e)illä, esim. SECl :llä, ja seulotaan solut, jot-; ka tuottavat tehostetusti mainittua entsyymiä (entsyyme- ·’,·. 35 jä) ja 1 (d) viljellään mainittuja yhdistelmäisäntäsoluja olosuh- 22 1 1 4482 teissä, joissa on mahdollista ilmentää mainittua hydro-lyyttistä entsyymiä (entsyymejä).

Mahdollisia käyttösovelluksia mainituista yhdistel-5 mäsoluista ovat esim. yksisolumassatuotanto, parannettu alkoholituotanto tai prosesseissa, joissa toivotaan raaka-aineen tehokasta hydrolyysiä.

Esimerkki 1: SS01- ja SS02-geenien kooditusalueiden kloo-10 naus Saccharomyces cerevisiaesta.

SSOl- ja SS02-geenit eristettiin secl-1-mutantin lämpöti-laherkän defektin suppressoreina (Novick ja Scheckman, 1979; Novick et ai., 1980). S. cerevisiae -kanta sf750-15 14Dck (a secl-1 hisl ura3-52 trp-289 leu2-112) (saatu Randy Scheckmanilta, University of California, Berkeley, CA) , transformoitiin (Ito et a_l. , 1983) hiivan cDNA-kir-jaston avulla, jonka olivat konstruoineet McKnight ja McConaughy (1983) kannasta X2180-1B 2y-pohjaiseen plasmi-20 diin, pMAC561:een, joka sisälsi TRPl-valintamarkkerin, ja valikoitiin Trp-prototrofiän suhteen 37°C:ssa. Koska transformanttien kasvu oli hankalaa 37°C:ssa, jatkotyö suoritettiin 36,5 tai 35°C:n lämpötiloissa, jotka silti ovat ei-sallivia secl-1:n suhteen. DNArta, joka oli eris-:,· 25 tetty (Keränen, 1986) neljästä hiivatransformantista, : joissa esiintyi Trp+-fenotyypin kosegregaatiota ja kasvua : ; 36,5°C:ssa, siirrettiin E. coliin (Hanahan, 1983). E.

. coli -transformanteista eristettyä plasmidi-DNA: ta käy tettiin S. cerevisiaen secl-1-kannan uudelleentransfor-30 mointiin.

;* Tehokas transformaatio kasvulle 36,5‘C:ssa saatiin ai- kaan. Restriktioentsyymianalyysi plasmideista osoitti, : että kaksi erilaista sekvenssiä saatiin talteen käytetys- 35 tä cDNA-kir jastosta. Insertti-DNA kahdesta eri kloonista,

I I

\ 1 ja 7, sekvensoitiin käyttäen kaksijuosteisella dideok- ’ * sinukleotidimenetelmällä (Zagursky et ai., 1986) ja sopi- 23 1 1 4482 vat subkloonit konstruoitiin tavanomaisilla yhdistelmä-DNA-menetelmillä (Maniatis et ai., 1982) tai spesifisten alukkeiden avulla. Kaksi kloonia sisälsi avoimen lukukehyksen, joka sisälsi 870 nukleotidia (klooni 1) ja vas-5 taavasti 885 nukleotidia (klooni 7). Koska johdetut aminohapposekvenssit eivät edustaneet Secl-proteiinin sekvenssiä (Aalto et ai., 1991), uusia geenejä nimitettiin tunnuksilla SSOl ja SS02 (Suppressor of Seel One). SSOl -ja SS02-kooditussekvenssit ja johdetut aminohapposekvens-10 sit on esitetty SEKVENSSISSÄ ID NO:l ja vastaavasti SEKVENSSISSÄ ID NO:3. Plasmideja, jotka sisälsivät SSOl- ja SS02-geenit nimitettiin tunnuksilla YEpSSOl ja vastaavasti YEpSS02, ja ne on esitetty kuvioissa IA ja IB.

15 Esimerkki 2: Sso2:n yli-ilmentyminen YEpSSQ2:lla transformoidulla hiivalla

Hiivakantaa sf750-14D, joka oli transformoitu kontrolli-plasmidilla pMA56 (A) (Ammerer, 1983) tai YEpSS02:lla 20 (B), kasvatettiin synteettisessä täydellisessä alustassa (Sherman et aJL., 1983), josta puuttui Trp. Hiivasolu-lysaatteja valmistettiin SDS:n läsnäollessa kuten Keränen • ' (1986) on kuvaillut. Kymmenen pg lysaateissa läsnäolevas- : ta kokonaishiivaproteiinista erotettiin SDS-PAGE:lla ja 25 analysoitiin Western-blottauksella käyttäen polyklonaali-*:* *: siä vasta-aineita, jotka oli tehty kanissa Sso2-proteii- • nia vastaan, ja alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuo-hen anti-kani IgGrtä ilmaisuun. Kuten kuviossa 2 on esitetty, Sso2:n määrä oli selvästi lisääntynyt YEpSS02- 30 transformantissa.

• I

‘;· Esimerkki 3: Erittyvän heteroloqisen proteiinin, Bacil- :_|_' luksen g-amylaasin tehostettu tuotanto hiivakannassa : : sf750-14D, joka yli-ilmentää SSOl:tä tai SS02:ta 35 , Hiivakanta sf750-14D, joka sisälsi joko SSOl- tai SS02- ’ * geenin monikopioplasmideissa YEpSSOl tai vastaavasti 24 1 1 4 482 YEpSS02, transformoitiin monikopioplasmidilla YEpaa5, joka sisälsi Bacilluksen α-amylaasigeenin liitettynä ADH1:n promoottorin ja terminaattorin väliin (Ruohonen et ai., 1987), modifioituna ilmentämisen tehostamiseksi 5 poistamalla oletetut inhibitiiviset sekvenssit promootto-riosan 5'-puolelta (Ruohonen et ai-, 1991; Ruohonen et ai., käsikirjoitus valmistumassa, a). Saatuja hiivakanto-ja, jotka sisälsivät YEpSS01:n ja YEpaa5:n (VTT-C-92072) tai YEpSS02:n ja YEpaa5:n (VTT-C-92073), kasvatettiin 10 valikoivassa alustassa 24’C:ssa ja a-amylaasin erittymistä kasvualustaan seurattiin mittaamalla a-amylaasiaktii-visuus käyttäen Phadebas-amylaasitestiä (Pharmacia Diagnostics AB, Ruotsi). Nämä kannat VTT-C-92072 ja VTT-C-92073 talletettiin Deutsche Sammlung von Mikroorganismen 15 und Zellkulturen GmbH -talletuslaitokseen (DSM) 30. syyskuuta 1992 talletusnumeroilla DSM 7253 ja vastaavasti 7254. Kuten kuviossa 3 on esitetty, lisääntynyt a-amylaa-siaktiivisuus saavutettiin kannoissa, jotka sisälsivät joko SSQ1:n (A) tai SSQ2:n () monikopioplasmidissa, ver-20 rattuna transformoimattomaan kontrollikantaan (·). YEpS-S01:n (Δ) tai YEpSS02:n (□) segregoituminen transforman-teista vähensi α-amylaasin erityksen kontrollitasoon ‘ osoittaen, että lisääntynyt eritys johtuu SSO-geenin si- ; '.· sältävien plasmidien läsnäolosta transformanteissa. a- *,·,ϊ 25 amylaasiproteiinin lisääntynyt määrä kasvualustassa il- ·.·’· maistiin Western-blottauksella (kuvio 4). Symbolit kuten ; kuviossa 3, S=standardi (Bacillus-g-amylaasi) .

♦ » »

Esimerkki 4: Erittyvän vieraan proteiinin, Bacillus-a-30 amylaasin ja erittyvän endogeenisen proteiinin, invertaa-;ϋ sin tehostunut tuottaminen hiivakannassa DBY746 yli-il- ·;1 mentämällä SSQ2 : ta .

; S. cerevisiae -kanta DBY746 (a his3Al leu2-3 leu2-112 • Λ 35 ura3-52 trp-289 cghR) (saatu David Botsteinilta, Depart- > » ment of Biology, Massachusetts Institute of Technology, i t » ’ ’· Cambridge, MA) , joka sisälsi plasmidin YEpaa6, joka si- 25 1 1 4482 saisi Bacilluksen α-amylaasigeenin liitettynä ADH1:n promoottorin ja terminaattorin väliin (Ruohonen et ai., 1987), modifioituna ilmentämisen tehostamiseksi poistamalla oletetut inhibitiiviset sekvenssit promoottoriosan 5 5'-puolelta (Ruohonen et ai., 1991; Ruohonen et ai., kä sikirjoitus valmistumassa, a), transformoitiin joko YEpS-S02:lla tai kontrolliplasmidilla pMA56 (Ammerer, 1983). Transformantteja kasvatettiin valikoivassa alustassa 30°C:ssa ja a-amylaasin eritystä kasvualustaan seurattiin 10 mittaamalla α-amylaasiaktiivisuus käyttäen Phadebas-amy-laasitestiä (Pharmacia Diagnostics AB, Ruotsi). Kuten kuviossa 5 on esitetty, lisääntynyt a-amylaasiaktiivisuus saavutettiin kannassa, joka sisälsi SS02:n (Δ) monikopio-plasmidissa, verrattuna kontrollikantaan, joka oli trans-15 formoitu kontrolliplasmidilla ilman SSO-geeniä (o). Mitään eroa ei havaittu hiivakasvussa kontrollitransforman-tin (·) ja SS02-transformantin (A) välillä. SSOl:n yli-ilmentäminen lisäsi α-amylaasin eritystä vastaavalla tavalla. Endogeenisen proteiinin, invertaasin, eritys te-20 hostui myös näissä olosuhteissa mitattuna myöhäisestä logaritmisesta kasvuvaiheesta aikaiseen stationaarivai-heeseen. Erittyvän invertaasin aktiivisuus YEpSS02-: transformantissa oli 1,4 kertaa suurempi kuin kontrolli- ! transformantissa, joka sisälsi pMA56:n. Koska SSO:n yli- 25 ilmentymisen tehostava vaikutus α-amylaasin eritykseen on ’:”: selvempi myöhemmin kasvun aikana, myös invertaasin eri- : tyksen tulisi olla tehokkaampaa myöhempinä ajankohtina.

Ennustettujen inhibitiivisten sekvenssien poistaminen 30 ADHl-promoottorista (edellä), jota käytettiin SS02:n il-mentämiseen YEpSS02:ssa, johti SS02:n pitkälliseen ilmen-;· tymiseen ja Sso2-proteiinin lisääntyneen tason pitkäaita kaiseen esiintymiseen ja siten jopa korkeampiin, alustaan eritetyn Bacillus-α-amylaasin loppuaktiivisuuksiin.

35 SS02: n ilmentyminen yksikopioplasmidissa tästä modifioi- » , dusta ÄDH1-promoottorista johti myös Sso2-proteiinien 1 : tasojen lisääntymiseen ja α-amylaasin tuotannon tehostu- 26 1 1 4482 miseen.

Esimerkki 5; Erittyvän vieraan proteiinin, Bacilluksen ot-amylaasin tehostunut tuotanto hiivassa, joka yli-ilmentää 5 SECl:tä yhdessä normaalien ja lisääntyneiden tasojen kanssa toiminnallisia Sso-proteiineja.

S. cerevisiae -kanta DBY746, joka sisälsi plasmidin YE-paa6, joka sisälsi Bacilluksen α-amylaasigeenin liitet-10 tynä ADH1:n promoottorin ja terminaattorin väliin (Ruohonen et ai., 1987), modifioituna ilmentämisen tehostamiseksi poistamalla oletetut inhibitiiviset sekvenssit pro-moottoriosan 5'-puolelta (Ruohonen et ai., 1991; Ruohonen et ai., käsikirjoitus valmistumassa, a), transformoitiin 15 joko monikopioplasmidilla YEpSECl, joka ilmentää SEC1-geeniä, tai kontrolliplasmidilla YEp24H (Aalto et ai., 1991; Ruohonen et ai., käsikirjoitus valmistumassa, b). Transformantteja kasvatettiin valikoivassa alustassa 30EC:ssa ja α-amylaasin eritystä kasvualustaan seurattiin 20 mittaamalla α-amylaaiaktiivisuus käyttäen Phadebas-amy- laasitestiä (Pharmacia Diagnostics AB, Ruotsi). Kuten kuviossa 6 on esitetty, lisääntynyt a-amylaasiaktiivisuus : saavutettiin kannassa, joka sisälsi SEC1;n monikopioplas- '.· midissa (□) , verrattuna kantoihin, jotka oli transformoi sit 25 tu vektorilla ilman SECl-geeniä (o). Mitään eroa ei ha-;·*: vaittu kasvussa transformanttien välillä.

Seclp:n ja Sso2p:n yli-ilmentäminen samaan aikaan tehosti α-amylaasin eritystä vielä enemmän. SSQ-geenejä ilmentä-= 30 vät plasmidit ovat saatavissa VTT: Itä Biotekniikan Labo- ( ratoriosta, Espoo, Suomi.

_: Esimerkki 6: Trichoderman sso-geenien eristäminen ilmen- tämällä hiivassa ja niiden ilmentäminen Trichodermassa 35 * ·

Hiivan ekspressiogeenipankki, joka oli valmistettu T.

• · reesein kannasta QM9414 kuten on kuvailtu (Buchert et 27 1 1 4482 ai., FI-patenttihakemus 922373), transformoitiin Saccha-romyces cerevisae -kantaan H458 (Aalto et ai·, 1993)(a SUC2 ade2-l canl-100 his3-ll,15 leu2-3,112 trpl-1 ura3-l ssol-δΐ::URA3 sso2-52::leu2::(GAL1:ssol,HIS3)) seulomalla 5 Ura-prototrofiän suhteen galaktoosialustalla. Transfor-mantit siirrettiin glukoosialustalle ja plasmidi otettiin talteen kasvavista pesäkkeistä ja uudelleentransformoi-tiin edellä mainittuun kantaan komplementaation osoittamiseksi. Saatiin yksi klooni, josta Sso-proteiinit eivät 10 poistuneet glukoosialustalla ja vastaava plasmidi nimitettiin pMS51:ksi. Saatu S. cerevisiae -kanta, joka sisälsi plasmidin pMS51, talletettiin Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH -talletuslaitokseen (DSM) 5. lokakuuta 1993 talletusnumerolla DSM 8604. Gee-15 nin kromosomaalinen kopio on eristetty genomisesta kosmi-dikirjastosta (Mäntylä et ai., 1992) käyttäen cDNA-kloo-nien 5'-päätä koettimena, valmistettuna PCR:n avulla.

Kosmidi eristetään signaalin antavista klooneista, ja edellä mainittua cDNArta vastaavat kloonit transformoi-20 daan T. reesei (Penttilä et ai., 1987) -kantaan, joka tuottaa CBHI-Fab-molekyylejä, VTT-D-91418 (CBS 287.91), jota Nyyssönen et a^. on kuvaillut (patenttihakemus).

: ' CBHI-Fab:n tuotantoa tutkitaan solunulkoisesta alustasta : .· Solca-floc-alustalla (Nyyssösen et ai. mukaisesti, pa- » •,25 tentti) .

* u

Esimerkki 7: Sienten sso-geenien eristäminen heterologi-:*. sen hybridisaation avulla 30 Genomista DNA:ta sienilajeista Saccharomyces cerevisae,

Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Pichia stipitis, Aspergillus nidulans ja Trichoderma reesei eristettiin, pilkottiin HindiII-restriktioentsyymillä, : erotettiin elektroforeettisesti 0,8 %:isella agaroosigee- ’·_ 35 Iillä ja blotattiin nailonsuotimelle. Suotimen Southern- , hybridisaatio suoritettiin erilaisissa tiukkuustasoissa • ’ käyttäen hiivan SSOl-geenin kooditusaluetta koettimena.

28 1 1 4482

Seoksen hybridisaatio, joka käsitti 30 % formamidia, 6xSSC:a, lOx Denhardtin liuosta, 0,5 % SDS:a, 100 pg/ml sillin sperman DNA:ta ja 10 pg/ml polyArta 35°C:ssa ja pesu 2 x 30 minuuttia 2xSSC:ssä, 0,1 % SDS:ssä 42°C:ssa, 5 osoitti useita hybridisoituvia vyöhykkeitä DNA:ssa, joka oli peräisin S. cerevisiaesta, K. lactiksesta, P. stipik-sestä ja T. reeseistä (kuvio 8). Kun hybridisaatio suoritettiin vähemmän tiukoissa olosuhteissa, hybridisaatiota havaittiin myös S. pomben DNA:11a. Genominen T. reesein 10 geenikirjasto, joka oli konstruoitu AEMBL3-vektorissa (Frischauf et ajL. , 1983) hybridisoitiin edellä kuvaillulla menetelmällä. Hybridisaatiosignaaleja tuottavat kloonit puhdistettiin ja niiden hybridisoituvat alueet kartoitettiin niiden DNA:n pilkonnoilla ja Southern-hybri-15 disaatioilla. Kolmea hybridisoituvaa λ-kloonia merkittiin tunnuksilla TSSOa, TSSOb ja TSSOc. Nämä kloonit talletettiin Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkul-turen GmbH (DSM) -talletuslaitokseen 5. lokakuuta 1993 talletusnumeroilla DSM 8601, DSM 8602 ja vastaavasti DSM 20 8603.

Talletetut mikro-organismit : .* Seuraavat mikro-organismit talletettiin Budapestin sopi- :,· 25 muksen mukaisesti (the Budapest Treaty) Sammlung von Mik- roorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) -talletuslai-tokseen, Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig, Saksa.

Kanta Talletusnumero Talletuspäivä 30 ^ Saccharomyces cerevisiae DSM 7253 30.9.1992 VTT-C-92072, joka sisälsi plasmidin YEpSSOl » 35 Saccharomyces cerevisiae DSM 7254 30.9.1992 VTT-C-92073, joka sisälsi * plasmidin YEpSS02 29 1 1 4482

Saccharomyces cerevisiae H458 (VTT-C-93002) , joka sisälsi plasmidin pMS51 DSM 8604 5.10.1993 5 Bakteriofagi-A-kanta SOa (VTT-H-93001) DSM 8601 5.10.1993

Bakteriofagi-λ-kanta TSSOb (VTT-H-93002) DSM 8602 5.10.1993 10

Bakteriofagi-λ-kanta TSSOc (VTT-H-93003) DSM 8603 5.10.1993 15

Viitejulkaisut

Aalto, M.K., Keränen, S. ja Ronne, H. 1992. A family of 20 proteins involved in intracellular transport. Cell 68, 181-182.

Aalto, M.K., Ronne, H. ja Keränen, S. 1993. Yeast synta-xins Ssolp and Sso2p belong to a family of membrane pro-25 teins that function in vesicular transport. EMBO J. 12, (painossa).

I » I

; Aalto, M.K., Ruohonen, L., Hosono, K. ja Keränen, S.

1991. Cloning and sequencing of the yeast Saccharomyces : .* 30 cerevisiae SEC1 gene localized on chromosome IV. Yeast 7, 643-650.

* t ·

Ammerer, G. 1983. Expression of genes in yeast using the . ADC1 promoter. Methods Enzymol. 101, 192-201.

·: i 35

Baldari, C., Murray, J.A.H., Ghiara, P., Cesareni, G. ja ' Galeotti, C.L. 1987. A novel peptide leader which allows efficient secretion of a fragment of human interleukin 1β in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J., 6, 229-234.

40

Becherer, K.A. ja Jones, E.W., 1992. Role of the PEPi2 gene product in vacuolar targetting in yeast. EMBL Data . \ Bank 31, talletusnumero M90395.

: : 45 Bennett, M.K., Calakos, N. ja Scheller, R.H. 1992. Syn- taxin: A synaptic protein implicated in docking of synap-tic vesicles at pre synaptic active zones. Science 257, 255-259.

i * · 114482 30

Buchert, J., Penttilä, M., Siika-aho, M., Saloheimo, A., Ranua, M. ja Viikari, L. 1992. Mannanaasientsyymit, niitä koodittavat geenit ja menetelmä näiden eristämiseksi sekä menetelmä lignoselluloosapitoisen massan valkaisemiseksi 5 (Mannanase enzymes, the encoding genes and method for their isolation, and a method for bleeching lignocellulo-se containing materials). FI-patenttihakemus 92 2373.

Buckholz, R.G. ja Gleeson, M.A. 1991. Yeast systems for 10 the commercial production of heterologous proteins. Bio/Technology 9, 1067-1072.

Dunn-Coleman, N., Bloebaum, P., Berka, R., Bodie, E., Robinson, N., Armstrong, G., Ward, M., Przetak, M., Car-15 ter, G., LaCost, R., Wilson, L., Kodama, K., Baliu, E., Bower, B., Lamsa, M. ja Heinsohn, H. 1991. Commercial levels of chymosin production by Aspergillus. Bio/Technology 9: 976-981.

20 Fawell, E., Hook, S. ja Armstrong, J., 1989. Nucleotide seguence of a gene encoding a YPTl-related protein from Schizosaccharomyces pombe. Nucl. Acid Res. 11, 4373.

Frischauf, A.-M., Lerach, H., Poutstka, A. ja Murray, N., 25 1983. Lambda replacement vectors carrying polylinker se quences. J. Mol. Biol. 170, 827-842.

Gerst, F.E., Rodgers, L., Riggs, M. ja Wigler, M. 1992. SNC1, a yeast homolog of the synaptic vesicle-associated 30 membrane protein/synaptobrevin gene family: Genetic interactions with the RAS and CAP genes. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 89, 4338-4342.

i Greenberg, G., Shelness, G.S. ja Blobel, G., 1989. A su- 35 bunit of mammalian signal peptidase is homologous to : *.· yeast SEC11 protein. J. Biol. Chem. 264, 15762-15765.

Hallborn, J. , Penttilä, M., Ojamo, H., Keränen, S. & *!*’! Hahn-Hägerdal, B. 1990. Xylose utilization by recombinant ; 40 yeasts. Kansainvälinen patenttihakemus WO 91/15588.

# * · I t * t

Hanahan, D. 1983. Studies on transformation of Esche-* richia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580.

:, 45 Hardwick, K.G. ja Pelham, H.R.B. 1992. SED5 encodes a 39 > KD integral membrane protein required for vesiccular transport between the ER and the Golgi complex. EMBL Data Bank 32, talletusnumero X66980.

50 Harkki, A., Uusitalo, J., Bailey, M., Penttilä, M. & : Knowles, J.K.C. 1989. A novel fungal expression system: ’ secretion of active calf chymosin from the filamentous fungus Trichoderma reesei. Bio/Technology 7: 596-603.

» : 55 Haubruck, H., Prange, R., Vorgias, C. ja Gallwitz, D.

3i 1 1 4482 1989. The ras-related mouse yptl protein can functionally replace the YTP1 gene product in yeast. EMBO J. 8, 1427-1432.

5 Hirai, Y. Takebe, K., Takashina, M., Kobayashi, S. ja

Takeichi, M. 1992. Epimorphin: a mesenchymal protein essential for epithelial morphogenesis. Cell 69, 471-481.

Inoue, A., Obata, K. ja Agakawa, K. 1992. Cloning and 10 sequence analysis of cDNA for a neuronal cell membrane antigen, HPC-1. J. Biol. Chem. 267, 10613-10619.

Irani, M.H. and Kilgore, T.L. 1988. High level expression in yeast. Eurooppalainen patenttihakemus EP 0 284 044 AI.

15

Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. ja Kimura, A. 1983. Transformation of intact yeast cells with alkali cations.

J. Bacteriol. 153, 163-168.

20 Jeenes, D., MacKenzie, D., Roberts, I. ja Archer, D.

1991. Heterologous protein production by filamentous fungi. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, vol.

9. ss. 327-367.

25 Keränen, S. 1986. Synthesis and processing of Semliki forest virus polyprotein in Saccharomyces cerevisiae: a yeast type glycosylation of El envelope protein. Gene 48, 267-275.

30 Lamsa, M. ja Bloebaum, P. 1990. Mutation and screening to increase chymosin yield in a genetically-engineered strain of Aspergillus avamori. J. Ind. Microbiol. 5, 229-238.

; 35 Lopez, M.C., Nicand, J.M. ja Gaillardin, C., 1992. SEC14 • deleted mutant of Yarrowia lipolytics is altered in the , ,·. secretion and differentation processes. 16th Interna- tional Conference on Yeast Genetics and Molecular Biolo-*;·'! gy. Wien, Itävalta, Elokuun 15.-21., 1992, Yeast 8 (Erik.

, . 40 painos) s. 473.

* > t

Maniatis, T., Fritsch, E.F. ja Sambrook, J. 1982. Mole-*·* ’ cular Cloning, A laboratory manual. Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

45

Martegani, E., Forlani, N., Mauri, I., Porro, D., Schleu-ning, W.D. ja Alberghina, L. 1992. Expression of high levels of human tissue plasminogen activator in yeast under the control of an inducible GAL promoter. Appi.

’’ 50 Microbiol. Biotechnol, 37, 604-608.

McKnight, G.L. ja McConnaughy, B.L.. 1983. Selection of functional cDNAs by complementation in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4412-4416.

·: 55 32 1 1 4 4 8 2 Mäntylä, A., Rossi, H., Vanhanen, S., Penttilä, M., Suominen, P. ja Nevalainen, H. 1992. Electrophoretic karyotyping of wild type and mutant Trichoderma reesei strains. Current Genetics 21:471-477.

5

Novick, P. ja Scheckman, R., 1979. Secretion and cell-surface growth are blocked in a temperature-sensitive mutant of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 76, 1858-1862.

10

Novick, P., Ferro, S. ja Scheckman, R. 1981. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell 25, 461-469.

Novick, P., Fields, C. ja Scheckman, R. 1980. Identifi-15 cation of 23 complementation groups required for post- translational events in the yeast secretory pathway. Cell 21, 205-215.

Nyyssönen, E., Keränen, S., Penttilä, M., Takkinen, K. ja 20 Knowles, J. K. C. 1990. Immunoglobulin production by Trichoderma. US-patentti n:o 5,610,034.

Nyyssönen, E., Penttilä, M., Harkki, A., Saloheimo, A., Knowles, J.K.C. ja Keränen, S. 1993. Efficient production 25 of antibodies by the filamentous fungus Trichoderma reesei. Bio/Technology 11, 591-595.

Penttilä, M.E., Nevalainen, H., Rättö, M., Salminen, E. ja Knowles, J.K.C. 1987. A versatile transformation sys-30 tern for the filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61, 155-164.

Protopopov, V., Govindan, B., Novick, P. ja Gerst, J.E.

: 1993. Homologs of the synaptobrevin/VAMP family of synap- 35 tic vesicle proteins function on the late secretory path-.* way in S. cerevisiae. Cell 74, (painossa).

\ Romanos, M.A., Scorer, C.A. ja Clare, J.J. 1992. Foreign J gene expression in yeast: a Review. Yeast 8^, 423-488.

40 : Ruohonen, L., Hackman, P., Lehtovaara, P., Knowles, J.C.K. ja Keränen, S. 1987. Efficient secretion of Bacillus amyloliquefaciens α-amylase by its own signal peptide in Saccharomyces cerevisiae host cells. Gene 59, 161-170.

:. 45 * Ruohonen, L., Penttilä, M. ja Keränen, S. 1991. Optimi zation of Bacillus a-amylase production by Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7, 337-346.

50 Sakai, A. Shimizu, Y. ja Hishinuma, F. 1988. Isolation : and characterization of mutants which show an oversecre tion phenotype in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 119, 499-506.

55 Schuster, J.R., Moyer, D.L., Lee, H., Dennis, A., Smith, 33 1 1 4482 B. ja Merryweather, J.P. 1989. Yeast mutants conferring resistance to toxic effects of cloned human insulin-like growth factor I. Gene 83, 47-55.

5 Segev, N., Mulholland, J. ja Botstein, D., 1988. The yeast GTP-binding YTPl-protein and a mammalian counterpart are associated with the secretion machinery. Cell 52, 915-924.

10 Sikorski, R.S. ja Hieter, P. 1989. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 122, 19-27.

15 Sleep, D., Belfield, G.P., Ballance, D.J., Steven, J.,

Jones, S. Evans, L.R., Moir, P.D. ja Goodey, A.R. 1991. Saccharomyces cerevisiae strains that overexpress heterologous proteins. Bio/Technology 9, 183-187.

20 Smith, R.A., Duncan, M.J. ja Moir, D.T. 1985. Heterologous protein secretion from yeast. Science 229, 1219-1224.

Suzuki, K., Ichikawa, K. ja Jigami, Y. 1989. Yeast 25 mutants with enhanced ability to secrete human lysozyme: Isolation and identification of a protease-deficient mutant. Mol. Gen. Genet. 219, 58-64.

Vanoni, M., Porro, D., Martegani, E. ja Alberghina, L.

30 1989. Secretion of Escherichia coli β-galactosidase in

Saccharomyces cerevisiae using the signal sequence from the glucoamylase-encoding STA2 gene. Biochem. Biophys.

Res. Commun. 164, 1331-1338.

! 35 Ward, M., Wilson, L.J., Kodama, K.H., Rey, M.W. ja Berka, R.M. 1990. Improved production of calf chymosin in Asper-gillus by expression as a glucoamylase-chymosin fusion.

'Ί Bio/Technology 8, 435-440.

: t M » 40 Wilson, D.W., Wilcox, C.A., Flynn, G.C., Chen, E., Unang, ; i W-J., Henzel, W.J., Block, M.R., Ullrich, A. ja Rothman, J.E., 1989. A fusion protein required for vehicle-me-’’ ’ diated transport in both mammalian cells and yeasts. Na ture 339, 355-359.

45 . . Zagursky, R.J., Berman, M.L., Baumeister, K. ja Lomax, N.

; j. 1986. Rapid and easy sequencing of large linear double 1 stranded DNA and supercoiled plasmid DNA. Gene Anal.

Techn. 2, 89-94.

50 ; Zaraoui, A., Touchot, N., Chardin, P. ja Tavitian, A.

1989. The human Rab genes encode family or GTP-binding proteins related to yeast YTPl and SEC4 products involved in secretion. J. Biol. Chem. 264, 12394-12401.

* 114482 34 SEKVENSSILUETTELO (1) YLEISET TIEDOT: (1) HAKIJA: (A) NIMI: Valtion teknillinen tutkimuskeskus (B) KATU: Vuorimiehentie 5 (C) KAUPUNKI: Espoo (E) MAA: Suomi (F) POSTINUMERO (ZIP): FIN-02150 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Erittyvien proteiinien lisääntynyt tuotanto eukaryoottisilla yhdistelmäsoluilla ( iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 4 (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin julkaisulupa #1.0, versio #1.25 (EPO) (vi) ETUOIKEUSTIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: FI 92 4494 (B) HAKEMISPÄIVÄ: 06-L0KAKUU-1992 (2) SEKVENSSIN ID N0:1 TIEDOT: • * (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: • · · • · (A) PITUUS: 870 emäsparia * (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA - mRNA (vi) ALKUPERÄ ·,· j (A) ORGANISMI: Saccharomvces cerevisae

,··\ (B) KANTA: X2180-1B

(ix) OMINAISPIIRRE: * » » · ^

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) SIJAINTI: 1..870 114482 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID N0:1: ATG AGT TAT AAT AAT CCG TAC CAG TTG GAA ACC CCT TTT GAA GAG TCA 48

Met Ser Tyr Asn Asn Pro Tyr Gin Leu Glu Thr Pro Phe Glu Glu Ser 15 10 15 TAC GAG TTG GAC GAA GGT TCG AGC GCT ATC GGT GCT GAA GGC CAC GAT 96

Tyr Glu Leu Asp Glu Gly Ser Ser Ala Ile Gly Ala Glu Gly His Asp 20 25 30 TTC GTG GGC TTC ATG AAT AAG ATC AGT CAA ATC AAT CGC GAT CTC GAT 144

Phe Vai Gly Phe Met Asn Lys Ile Ser Gin Ile Asn Arg Asp Leu Asp 35 40 45 AAG TAC GAC CAT ACC ATC AAC CAG GTC GAT TCT TTG CAT AAG AGG CTA 192

Lys Tyr Asp His Thr Ile Asn Gin Vai Asp Ser Leu His Lys Arg Leu 50 55 60 CTG ACC GAA GTT AAT GAG GAG CAA GCA AGT CAC TTA AGG CAC TCC CTG 240

Leu Thr Glu Vai Asn Glu Glu Gin Ala Ser His Leu Arg His Ser Leu 65 70 75 80 GAC AAC TTC GTC GCA CAA GCC ACG GAC TTG CAG TTC AAA CTG AAA AAT 288

Asp Asn Phe Vai Ala Gin Ala Thr Asp Leu Gin Phe Lys Leu Lys Asn 85 90 95 GAG ATT AAA AGT GCC CAA AGG GAT GGG ATA CAT GAC ACC AAC AAG CAA 336

Glu Ile Lys Ser Ala Gin Arg Asp Gly Ile His Asp Thr Asn Lys Gin 100 105 110 GCT CAG GCG GAA AAC TCC AGA CAA AGA TTT TTG AAG CTT ATC CAG GAC 384

Ala Gin Ala Glu Asn Ser Arg Gin Arg Phe Leu Lys Leu Ile Gin Asp 115 120 125 ;TAC AGA ATT GTG GAT TCC AAC TAC AAG GAG GAG AAT AAA GAG CAA GCC 432 : · Tyr Arg Ile Vai Asp Ser Asn Tyr Lys Glu Glu Asn Lys Glu Gin Ala * ; 130 135 140 "AAG AGG CAG TAT ATG ATC ATT CAA CCA GAG GCC ACC GAA GAT GAA G TT 480 ""Lys Arg Gin Tyr Het Ile Ile Gin Pro Glu Ala Thr Glu Asp Glu Vai . .145 150 155 160 ".GAA GCA GCC ATA AGC GAT GTA GGG GGC CAG CAG ATC TTC TCA CAA GCA 528 : ·' fclu Ala Ala Ile Ser Asp Vai Gly Gly Gin Gin Ile Phe Ser Gin Ala 165 170 175 . . TTG TTG AAT GCT AAC AGA CGT GGG GAA GCC AAG ACT GCT CTT G CG GAA 576 ' ! -“Leu Leu Asn Ala Asn Arg Arg Gly Glu Ala Lys Thr Ala Leu Ala Glu 180 185 190 ' » ♦ • GTC CAG GCA AGG CAC CAA GAG TTA TTG AAA CTA GAA AAA TCC ATG GCA 624 ·' .Vai Gin Ala Arg His Gin Glu Leu Leu Lys Leu Glu Lys Ser Met Ala • - 195 200 205 'GAA CTT ACT CAA TTG TTT AAT GAC ATG GAA GAA CTG GTA ATA GAA CAA 672 . , Glu Leu Thr Gin Leu Phe Asn Asp Met Glu Glu Leu Vai Ile Glu Gin ; ; 210 215 220 ‘, ,ϊ CAA GAA AAC GTA GAC GTC ATC GAC AAG AAC GTT GAA GAC GCT CAA CTC 720

Gin Glu Asn Vai Asp Vai Ile Asp Lys Asn Vai Glu Asp Ala Gin Leu 225 230 235 240 114482 36 CAC GTA GAA CAG GGT GTC GGT CAT ACC GAT AAA GCC GTC AAG AGT GCC 768

Asp Vai Glu Gin Gly Val Gly His Thr Asp Lye Ala Val Lys Ser Ala 245 250 255 AGA AAA GCA AGA AAG AAC AAG ATT AGA TGT TGG TTG ATT GTA TTC GCC 816

Arg Lye Ala Arg Lye Asn Lys lie Arg Cys Trp Leu lie Val Phe Ala 260 265 270 ATC ATT GTA GTC GTT GTT GTT GTC GTT GTT GTC CCA GCC GTT GTC AAA 864 lie lie Val Val Val Val Val Val Val Val Val Pro Ala Val Val Lye 275 280 285 ACG CGT 870

Thr Arg 290 (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 290 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:2: ·*·* Het Ser Tyr Aan Asn Pro Tyr Gin Leu Glu Thr Pro Phe Glu Glu Ser : 1 5 10 15 • « a l « · • * Tyr Glu Leu Asp Glu Gly Ser Ser Ala Ile Gly Ala Glu Gly His Asp 20 25 30 phe Vai Gly Phe Het Asn Lys Ile Ser Gin Ile Asn Arg Asp Leu Asp 35 40 45 ' Lys Tyr Asp His Thr Ile Asn Gin Vai Asp Ser Leu His Lys Arg Leu so 55 60 >

Leu Thr Glu Vai Asn Glu Glu Gin Ala Ser His Leu Arg His Ser Leu . . 65 70 75 80 • · ·

Asp Asn Phe Vai Ala Gin Ala Thr Asp Leu Gin Phe Lys Leu Lys Asn : : : es 90 95 t

Glu Ile Lys Ser Ala Gin Arg Asp Gly Ile His Asp Thr Asn Lys Gin 100 105 110 *··«* Ala Gin Ala Glu Asn Ser Arg Gin Arg Phe Leu Lys Leu Ile Gin Asp . 115 120 125

Tyr Arg Ile Vai Asp Ser Asn Tyr Lys Glu Glu Asn Lys Glu Gin Ala • ' 130 135 140

1 · I

Lys Arg Gin Tyr Het Ile Ile Gin Pro Glu Ala Thr Glu Asp Glu Vai 145 150 155 160

Glu Ala Ala Ile Ser Asp Vai Gly Gly Gin Gin Ile Phe Ser Gin Ala

165 170 17S

114482 37

Leu Leu Aan Ala Aan Arg Arg Gly Glu Ala Lya Thr Ala Leu Ala Glu 180 185 190

Vai Gin Ala Arg Hie Gin Glu Leu Leu Lys Leu Glu Lye Ser Het Ala 195 200 205

Glu Leu Thr Gin Leu Phe Aan Asp Met Glu Glu Leu Vai Ile Glu Gin 210 215 220

Gin Glu Aan Vai Aap Vai Ile Aap Lys Aan Vai Glu Asp Ala Gin Leu 225 230 235 240

Asp Vai Glu Gin Gly Vai Gly His Thr Asp Lys Ala Vai Lya Ser Ala 245 250 255

Arg Lys Ala Arg Lys Aan Lys Ile Arg Cys Trp Leu Ile Vai Phe Ala 260 265 270

Ile Ile Vai Vai Vai Vai Vai Vai Vai Vai Vai Pro Ala Vai Vai Lys 275 280 285

Thr Arg 290 (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 885 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JU0STEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA - mRNA (vi) ALKUPERÄ

* (A) ORGANISMI: Saccharomvces cerevisae (B) KANTA: X2180-1B

(ix) OMINAISPIIRRE:

V : (A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) SIJAINTI: 1..885 ; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:3: • · * * · · • ATG AGC AAC G CT AAT CCT TAT GAG AAT AAC AAT CCG TAC G CT G AA AAC 48 ·’· Met Ser Asn Ala Asn Pro Tyr Glu Asn Asn Asn Pro Tyr Ala Glu Asn 15 10 15 » ♦ · • · ...· TAT GAA ATG GAG GAC TTG GCT CCT ACT GGT CAC TCA GAT 96 • · Tyr Glu Met Gin Glu Asp Leu Asn Aan Ala Pro Thr Gly Hie Ser Asp i.i ; 20 25 30 GGT AGC GAC GAT TTC GTA GCT TTT ATG AAC AAG ATC AAC TCA ATA AAT 144

Gly Ser Asp Asp Phe Vai Ala Phe Met Asn Lys Ile Aan Ser Ile Aan 35 40 45 GCT AAC TTG TCC AGG TAC GAA AAC ATT ATC AAC CAA ATT GAT G CG CAA 192

Ala Αβη Leu Ser Arg Tyr Glu Aan Ile Ile Aan Gin Ile Aap Ala Gin 50 55 60 114482 38 CAC AAA GAC CTA CTT ACT CAA GTG AGT GAG GAA CAG GAG ATG GAA TTG 240

His Lye Asp Leu Leu Thr Gin Val Ser Glu Glu Gin Glu Met Glu Leu 65 70 75 80 AGA CGT TCT TTG GAC GAT TAC ATC TCT CAG GCC ACA GAT TTG CAG TAT 288

Arg Arg Ser Leu Asp Asp Tyr lie Ser Gin Ala Thr Asp Leu Gin Tyr

85 90 9S

CAA TTG AAA GCG GAT ATC AAA GAT GCC CAG AGA GAC GGA TTG CAC GAC 336

Gin Leu Lye Ala Asp lie Lys Asp Ala Gin Arg Asp Gly Leu His Asp 100 105 110 TCT AAT AAA CAG GCA CAA GCT GAA AAT TGC AGA CAG AAA TTC TTA AAA 384

Ser Asn Lys Gin Ala Gin Ala Glu Asn Cys Arg Gin Lys Phe Leu Lys 115 120 125 TTA ATT CAA GAC TAC AGA ATT ATC GAT TCT AAC TAC AAA GAA GAA AGC 432

Leu Ile Gin Asp Tyr Arg Ile He Asp Ser Asn Tyr Lys Glu Glu Ser 130 135 140 AAA GAG CAG GCG AAG AGA CAG TAC ACA ATT ATC CAA CCG GAA GCC ACT 480

Lys Glu Gin Ala Lys Arg Gin Tyr Thr He He Gin Pro Glu Ala Thr 145 150 155 160 GAC GAA GAA GTG GAA GCC GCC ATC AAC GAT GTC AAT GGC CAG CAG ATC 528

Asp Glu Glu Vai Glu Ala Ala He Asn Asp Vai Asn Gly Gin Gin He 165 170 175 TTT TCC CAA GCG TTG CTA AAC GCC AAT AGA CGT GGT GAG GCC AAG ACA 576 , . Phe Ser Gin Ala Leu Leu Asn Ala Asn Arg Arg Gly Glu Ala Lys Thr f ‘ : 180 185 190 • "I GCA TTG GCC GAA GTA CAG GCT AGA CAT CAA GAG TTG TTG AAG TTG GAA 624

Ala Leu Ala Glu Val Gin Ala Arg His Gin Glu Leu Leu Lys Leu Glu .:: 195 200 205 ’:1·' AAA ACA ATG GCT GAA CTT ACC CAA TTG TTC AAT GAC ATG AAA GAG TTG 672 . . Lys Thr Met Ala Glu Leu Thr Gin Leu Phe Asn Asp Met Lys Glu Leu :.: · 210 215 220 « 1 » V : GTC ATC GAA CAA CAA GAA AAT GTG GAT GTC ATT GAC AAA AAC GTC GAA 720

Val He Glu Gin Gin Glu Asn Vai Asp Val He Asp Lys Asn Val Glu 225 230 235 240 ; GAC GCT CAG CAA GAT GTA GAG CAA GGT GTG GGT CAC ACC AAC AAG GCC 768 ,·;· Asp Ala Gin Gin Asp Val Glu Gin Gly Val Gly His Thr Asn Lys Ala 245 250 255 ... GTT AAG AGT GCC AGA AAA GCA AGA AAA AAC AAA ATA AGA TGT TTG ATC 816

Val Lys ser Ala Arg Lys Ala Arg Lys Asn Lys He Arg Cys Leu He : 260 265 270 . ATC TGC TTT ATT ATC TTT GCT ATT GTT GTT GTC GTT GTG GTT GTT CCA 864 ; lie Cys Phe He He Phe Ala He Val Val Val Val Val Val Val Pro ;·'. 275 280 285 I 4 » TCC GTT GTG GAA ACA AGA AAG 8fit.

Ser Val Val Glu Thr Arg Lys 290 295 114482 39 (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 295 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:4:

Het Ser Asn Ala Asn Pro Tyr Glu Asn Aan Asn Pro Tyr Ala Glu Aan 15 10 15

Tyr Glu Het Gin Glu Aap Leu Asn Asn Ala Pro Thr Gly His Ser Aap 20 25 30

Gly Ser Aap Asp Phe Vai Ala Phe Met Asn Lys Ile Asn Ser Ile Aan 35 40 45

Ala Aan Leu Ser Arg Tyr Glu Asn Ile Ile Asn Gin Ile Aap Ala Gin 50 55 60

His Lys Asp Leu Leu Thr Gin Vai Ser Glu Glu Gin Glu Met Glu Leu 65 70 75 80

Arg Arg Ser Leu Aap Asp Tyr Ile Ser Gin Ala Thr Asp Leu Gin Tyr 85 90 95

Gin Leu Lys Ala Asp Ile Lys Asp Ala Gin Arg Asp Gly Leu His Aap 100 105 110

Ser Asn Lys Gin Ala Gin Ala Glu Asn Cya Arg Gin Lys Phe Leu Lys : 115 120 125 • Leu Ile Gin Asp Tyr Arg Ile Ile Asp Ser Aan Tyr Lys Glu Glu Ser 130 135 140 ; Lys Glu Gin Ala Lys Arg Gin Tyr Thr Ile Ile Gin Pro Glu Ala Thr : 145 ISO 155 160 • · * *.· · Aap Glu Glu Vai Glu Ala Ala Ile Asn Aap Vai Aan Gly Gin Gin Ile 165 170 175 : ,·. Phe Ser Gin Ala Leu Leu Asn Ala Asn Arg Arg Gly Glu Ala Ly a Thr : 180 185 190 • · · "·’ ’ Ala Leu Ala Glu Vai Gin Ala Arg His Gin Glu Leu Leu Lys Leu Glu 195 200 205 * · · ’.'.'I Lya Thr Met Ala Glu Leu Thr Gin Leu Phe Asn Asp Met Lye Glu Leu 210 215 220

Vai Ile Glu Gin Gin Glu Asn Vai Asp Vai Ile Asp Lys Asn Vai Glu :·: : 225 230 235 240 '···* Asp Ala Gin Gin Asp Vai Glu Gin Gly Vai Gly His Thr Aan Lys Ala 245 250 255

Vai Lys Ser Ala Arg Lys Ala Arg Lya Aan Lye Ile Arg Cys Leu Ile 260 265 270

Ile Cys Phe Ile Ile Phe Ala Ile Vai Vai Vai Vai Vai Vai Vai Pro 275 280 285

Ser Vai Vai Glu Thr Arg Lys 290 295

Claims (24)

1. 40 1 1 4482 1. secl-suppressorigeenin SSO eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on SSOl- tai SS02-sekvenssi, jot- 5 ka on kuvattu SEKVENSSISSÄ ID NO:l ja vastaavasti SEKVENSSISSÄ ID NO:3, tai niiden sieniperäinen homologi, joka DNA-sekvenssi, ollessaan yli-ilmennetty eukaryootti-sissa soluissa, tekee mainituista soluista kykeneviä tuottamaan lisääntyneitä määriä erittyviä proteiineja. 10
2. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että sekvenssi on peräisin sienestä ja ollessaan yli-ilmennetty sieni-isännässä, tekee mainitusta isännästä kykeneväisen tuottamaan lisääntyneitä määriä erittyviä 15 proteiineja.
3. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on SSOl- tai SS02-sekvenssi, jotka koodit-tavat polypeptidiä, joka sisältää olennaisesti SEKVENS-
4. 20 SISSÄ ID NO:2 ja vastaavasti ID NO:4 esitetyn aminohappo-sekvenssin, tai sen toiminnallinen osa.
5. 1 I . : 4. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin pa- ; tenttivaatimuksista 1-3 mukaisen DNA-sekvenssin. 25 » i ; .·, 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen vektori, tunnettu sii- t < · !.V tä, että vektori kykenee replikoitumaan itsenäisesti i · i transformoituna eukaryoottisiin soluihin. I I · ·>·· 30 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen vektori, tunnettu sii- ’...· tä, että vektori kykenee integroitumaan kromosomiin, kun \ se on transformoitu eukaryoottisiin soluihin. i » t · * · ’·’ 7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen vektori, tunnettu sii- : ” 35 tä, että se on hiivan ekspressiovektori, jolloin mainittu 114482 41 DNA-sekvenssi ilmentyy hiivageenin säätelyalueiden ohjauksessa.
6. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen vektori, tunnettu sii-5 tä, että mainitun hiivageenin säätelyalueita ovat SS01-geenin, SS02-geenin, SEC1-geenin, GAL1 - GAL10-geenien, alkoholidehydrogenaasigeenin ADH1, asparagiinisyntetaasi-geenin ja niiden toiminnallisten osien promoottorialueet.
7. 9. Patenttivaatimuksen 4 mukainen vektori, tunnettu sii tä, että se on rihmasienen ekspressiovektori, jolloin mainittu DNA-sekvenssi ilmentyy rihmasienessä toiminnallisten säätelyalueiden ohjauksessa.
8. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen vektori, tunnettu sii tä, että mainittuja rihmasienessä toiminnallisia säätelyalueita ovat sso-, cbhl-, cbh2-, egll-, egl2, tefl- pgk-, pki-qeenien, glukoamylaasin, a-amylaasin ja alkoholide-hydrogenaasin geenien promoottorialueet. 20
9. 11. Patenttivaatimuksen 4 mukainen vektori, tunnettu sii-ί *.· tä, että se on sienivektori, joita ovat YEpSSOl, jonka • \'· rakenne on esitetty kuviossa IA ja joka on talletettu : .· : hiivakannassa VTT-C-92072 talletusnumerolla DSM 7253, ja ·:··· 25 YEpSS02, jonka rakenne on esitetty kuviossa IB ja joka on : ·'. talletettu hiivakannassa VTT-C-92072 talletusnumerolla » · ♦ .’·!·! DSM 7254. * . 12. Eukaryoottiset yhdistelmäsolut, tunnetut siitä, että ;;; 30 ne sisältävät jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen ·;·* DNA-sekvenssin, ja ilmentävät tehostettuja Sso-proteiini- ; määriä.
10. 13. Patenttivaatimuksen 12 mukaiset eukaryoottiset yhdis-: 35 telmäsolut, tunnetut siitä, että ne ovat sienisoluja, ‘ * jotka ovat peräisin Saccharomyces-, Trichoderma- tai Klu- 114482 42 yveromyces-lajeista, Schizosaccharomyces pombesta, Pichia-lajeista, Hansenula-lajeista, Yarrowia-lajeista, Aspergillus-lajeista ja Neurospora-lajeista.
11. 14. Patenttivaatimuksen 13 mukaiset eukaryoottiset yhdis- telmäsolut, tunnetut siitä, että ne ovat sienisoluja, jotka kuuluvat Saccharomyces- ja Trichoderma-sukujen lajeihin .
12. 15. Patenttivaatimuksen 14 mukaiset eukaryoottiset yhdis- telmäsolut, tunnetut siitä, että ne ovat sienisoluja Saccharomyces cerevisiae -kannasta VTT-C-92072, jolla on talletusnumero DSM 7253.
13. 16. Patenttivaatimuksen 14 mukaiset eukaryoottiset yhdis- telmäsolut, tunnetut siitä, että ne ovat sienisoluja Saccharomyces cerevisiae -kannasta VTT-C-92073, jolla on talletusnumero DSM 7254.
14. 17. Menetelmä uusien eukaryoottisten solujen konstruoimi seksi, jotka kykenevät ilmentämään tehostetusti Sso-pro-teiinia (-proteiineja), tunnettu siitä, että menetelmässä ; (a) eristetään sopivasta luovuttajaorganismista DNA-sek- >...: 25 venssi(t) SSOl ja SS02, jotka on esitetty SEKVENSSISSÄ ID ; NO:l ja vastaavasti ID NO: 3, tai niiden sieniperäiset ho- * ♦ · mologi(t), jotka koodattavat Sso-proteiinia (-proteiineja); » ;;; 30 (b) konstruoidaan vektori, joka sisältää vähintään yhden I · mainituista DNA-sekvensseistä ja (c) transformoidaan vähintään yksi saaduista vektoreista sopiviin isäntäsoluihin. : '! 35 43 1 1 448 2
15. 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitava isäntä käsittää Saccharomy-ces-, Trichoderma- ja Kluyveromyces-lajit, Schizosaccha-romyces pomben, Pichia-lajit, Hansenula-lajit, Yarrowia- 5 lajit, Aspergillus-lajit ja Neurospora-lajit.
16. 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on Saccharomyces- tai Tricho-derma-suvun laji. 10
17. 20. Menetelmä erittyvän vieraan tai endogeenisen proteiini (e) n lisääntyneiden määrien tuottamiseksi yli-ilmen-tämällä SSO-geeniä (-geenejä), tunnettu siitä, että menetelmässä 15 (a) eristetään mainittua proteiinia (proteiineja) koodattava (t) DNA-sekvenssi(t) sopivasta luovuttajaorganismis-ta; 20 (b) konstruoidaan vektori, joka sisältää vähintään yhden mainituista DNA-sekvensseistä; : · : (c) transformoidaan saatu vektori sopivaan isäntään, joka : sisältää DNA-sekvenssin (-sekvenssejä) , joita ovat SSOl- ....| 25 ja SS02-sekvenssi, jotka on esitetty SEKVENSSISSÄ ID NO:l : .·. ja vastaavasti ID NO: 3, ja niiden sieniperäiset homolo- t · I ,·!·! git, ja jotka ilmentävät tehostetusti Sso-proteiinia (-proteiineja), jolloin saadaan yhdistelmäisäntäsoluja; . tai vaihtoehtoisesti, transformoidaan vektori sopivaan • · * ;;· 30 isäntään ja transformoidaan tämä transformantti uudelleen • · '«··* DNA-sekvenssillä (-sekvensseillä), joita ovat SSOl- ja : SS02-sekvenssi, jotka on esitetty SEKVENSSISSÄ ID NO:l ja vastaavasti ID NO:3, ja niiden sieniperäiset homologit, ja seulotaan solut, jotka tuottavat tehostetusti mainit- " 35 tua proteiinia (proteiineja) ja 114482 44 (d) viljellään mainittuja yhdistelmäisäntäsoluja olosuhteissa, joissa on mahdollista ilmentää mainittua proteiinia (proteiineja).
18. 21. Menetelmä erittyvän vieraan tai endogeenisen prote iini (e) n lisääntyneiden määrien tuottamiseksi yli-ilmen-tämällä SSO-geenin kanssa vuorovaikutuksessa olevaa (olevia) geeniä (geenejä), esim. SEC1:tä, kun läsnä on normaaleja tai lisääntyneitä määriä Sso-proteiinia (-prote-10 iineja), tunnettu siitä, että menetelmässä (a) eristetään mainittua proteiinia (proteiineja) koodattava (t) DNA-sekvenssi(t) sopivasta luovuttajaorganismis-ta; 15 (b) konstruoidaan vektori, joka sisältää vähintään yhden mainituista DNA-sekvensseistä; (c) transformoidaan saatu vektori sopivaan isäntään, joka 20 ilmentää Sso-proteiinia (-proteiineja) normaaleja tai lisääntyneitä määriä ja yli-ilmentää toista geeniä (muita geenejä), jotka ovat vuorovaikutuksessa SSO-geenin kanssa, esim. SEC1:tä, jolloin saadaan yhdistelmäisäntäsolu-; ja; tai vaihtoehtoisesti transformoidaan vektori sopivaan >;·: 25 isäntään ja tämä transformantti transformoidaan uudelleen : SSO-geenillä, jolla on DNA-sekvenssi, joka on esitetty ['·’:·[ SEKVENSSISSÄ ID NO:l (SSOl-sekvenssi) tai ID NO: 3 (SS02- sekvenssi), tai SSO-geenin suhteen homologisella sieniperäisellä geenillä ja SSO-geenin kanssa vuorovaikutuksessa ·;;; 30 olevalla (olevilla) geenillä (geeneillä), esim. SEClzllä, '*··* ja seulotaan solut, jotka tuottavat mainittua proteiinia (proteiineja) tehostetusti ja (d) viljellään mainittuja yhdistelmäisäntäsoluja olosuh- I 35 teissä, joissa on mahdollista ilmentää mainittua proteii nia (proteiineja). 45 1 1 4482
19. 22. Menetelmä endogeenisen erittyvän proteiinin tuotannon lisäämiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä 5 (a) transformoidaan solut, jotka tuottavat mainittua proteiinia, DNA-sekvenssillä (-sekvensseillä), joita ovat SSOl- ja SSO^-sekvenssi, jotka on esitetty SEKVENSSISSÄ ID N0:1 ja vastaavasti ID NO:3, ja niiden sieniperäiset 10 homologit, yksin tai yhdessä SSO-geenin kanssa vuorovaikutuksessa olevan (olevien) geeni(e)n, esim. SEC1:n kanssa, (b) seulotaan transformantit, jotka tuottavat tehostetus-15 ti mainittua proteiinia, jolloin saadaan yhdistelmäsoluja tehostettuun proteiinituotantoon, ja (c) viljellään mainittuja yhdistelmäsoluja olosuhteissa, jotka mahdollistavat mainitun proteiinin ilmentymisen. 20
20. 23. Menetelmä biomassan tuottamiseksi tehokkaasti raaka- • aineella tai raaka-aineen hydrolysoimiseksi tehokkaasti, | * : tunnettu siitä, että menetelmässä •-O 25 (a) eristetään endogeenista tai vierasta hydrolyyttistä ; entsyymiä (entsyymejä) koodittava (t) DNA-sekvenssi (t) » » · sopivasta luovuttajaorganismista; * · · » (b) konstruoidaan sienivektori, joka sisältää vähintään 30 yhden mainituista DNA-sekvensseistä; f 9 ' % : (c) transformoidaan saatu vektori sopivaan sieni-isän- tään, joka sisältää DNA-sekvenssin (-sekvenssejä), joita ovat SSOl- ja SS02-sekvenssi, jotka on esitetty SEKVENS-‘ ' 35 SISSÄ ID NO:l ja vastaavasti ID NO:3, ja niiden sienipe räiset homologit, ja jotka ilmentävät tehostetusti Sso- 114482 46 proteiinia (-proteiineja), jolloin saadaan yhdistelmä-isäntäsoluja; tai vaihtoehtoisesti, transformoidaan vektori sopivaan isäntään ja transformoidaan tämä transfor-mantti uudelleen DNA-sekvenssillä (-sekvensseillä), joita 5 ovat SS01- ja SS02-sekvenssi, jotka on esitetty SEKVENSSISSÄ ID N0:1 ja vastaavasti ID NO:3, ja niiden sieniperäiset homologit, ja seulotaan solut, jotka tuottavat tehostetusta mainittua entsyymiä (entsyymejä) ja 10 (d) viljellään mainittuja yhdistelmäisäntäsoluja olosuh teissa, joissa on mahdollista ilmentää mainittua hydro-lyyttistä entsyymiä (entsyymejä).
21. 24. Menetelmä biomassan tuottamiseksi tehokkaasti raaka-15 aineella tai raaka-aineen hydrolysoimiseksi tehokkaasti yli-ilmentämällä SSO-geenien kanssa vuorovaikutuksessa olevia geenejä, esim. SEC1:tä, kun läsnä on normaaleja tai lisääntyneitä määriä Sso-proteiinia (-proteiineja), tunnettu siitä, että menetelmässä 20 (a) eristetään sopivasta luovuttajaorganismista DNA-sek-venssi(t), jo(t)ka koodittaa (koodittavat) endogeenista ·*: tai vierasta hydrolyyttistä entsyymiä (entsyymejä) ; * · 25 (b) konstruoidaan vektori, joka sisältää vähintään yhden mainituista DNA-sekvensseistä; (c) transformoidaan saatu vektori sopivaan isäntään, joka ilmentää tehostetusti proteiineja, jotka ovat vuorovaiku- ·;;· 30 tuksessa Sso-proteiini (e) n kanssa, kun läsnä on normaale- * * ja tai lisääntyneitä määriä Sso-proteiinia (-proteiine-: ja), jolloin saadaan yhdistelmäisäntäsoluja, tai vaihto- ehtoisesti transformoidaan vektori sopivaan isäntään ja transformoidaan tämä transformantti uudelleen SSO-geenil-: “ 35 lä, jolla on DNA-sekvenssi, joka on esitetty SEKVENSSISSÄ ’ 1 ID NO:l (SSOl-sekvenssi) tai ID NO:3 (SS02-sekvenssi), 114482 47 tai SSO-geenille homologisella sieniperäisellä geenillä, ja SSO-geenin kanssa vuorovaikutuksessa olevalla (olevilla) geen(e)illä, esim. SEC1:llä, ja seulotaan solut, jotka tuottavat tehostetusti mainittua entsyymiä (entsyyme-5 jä) ja (d) viljellään mainittuja yhdistelmaisäntäsoluja olosuhteissa, joissa on mahdollista ilmentää mainittua hydro-lyyttistä entsyymiä (mainittuja hydrolyyttisiä entsyyme-10 jä).
22. 15 Patentkrav: