KR20210068408A - 가용성 bcma에 대한 항체 - Google Patents

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아그니에츠카 키엘체프스카
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암젠 인크
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Abstract

본 발명은 가용성 BCMA(sBCMA)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 항체를 포함하는 검출 시스템에 관한 것이다. 항체 또는 검출 시스템은 sBCMA의 검출 또는 정량화, sBCMA 관련 질환의 진단, 환자 계층화, 질환 진행 모니터링, 및 치료 반응의 평가에 이용될 수 있다.

Description

가용성 BCMA에 대한 항체
본 발명은 가용성 BCMA(sBCMA)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 항체를 포함하는 검출 시스템에 관한 것이다. 항체 또는 검출 시스템은 sBCMA의 검출 또는 정량화, sBCMA 관련 질환의 진단, 환자 계층화, 질환 진행 모니터링, 및 치료 반응의 평가에 이용될 수 있다.
[전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 포함]
본 명세서와 동시에 제출되어 다음과 같이 확인된 컴퓨터 판독 가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 그 전체가 참조로서 포함된다: 파일명 "53500A_Seqlisting.txt"의 34,276 바이트 아스키(텍스트) 파일; 2019년 9월 27일 생성.
다발성 골수종(MM)은 골수 미세환경에서 악성 형질 세포의 클론 증식, 혈액 또는 소변의 단클론 단백질 및 관련 장기 기능장애를 특징으로 하는 신생물성 형질 세포 장애이다. 다발성 골수종(MM)은 모든 암의 거의 2%와 혈액암(SEER)의 20%를 차지한다. 다발성 골수종은 여전히 불치성 암으로 남아 있지만, 최근 골수종의 병인에 대한 이해가 향상되어 새로운 치료법이 개발되고 생존율이 향상되었다. 치료법은 신생물성 세포 생존 및 증식을 뒷받침하는 신호전달 경로를 억제하도록 설계된 분자 표적화 요법을 포함한다. 이러한 표적 중 하나는 B 세포 성숙 항원으로, 이는 대체로 정상 형질 세포보다 악성 형질 세포에서 상대적으로 더 높은 수준으로 발현되고 리간드 APRIL 및 BAFF의 결합을 통해 증식 신호를 유도한다.
B 세포 성숙 항원(BCMA, TNFRSF17, CD269)은 TNF 수용체 슈퍼 패밀리에 속하는 막관통 단백질이다. BCMA 발현은 후기 형질 세포 분화 중에 선택적으로 유도되며, 나이브 및 기억 B 세포에는 부존재한다. BCMA가 리간드인 B 세포 활성화 인자(BAFF) 및 증식 유도 리간드(APRIL)에 결합하면, 골수 형질 세포 및 형질모세포의 생존이 촉진된다. BCMA는 정상적인 B 세포 항상성을 유지하지 않지만, 수명이 긴 형질 세포의 생존에 요구된다. BCMA의 mRNA 발현은 악성 형질 세포 장애에서 고도로 상승된다. 대조적으로, 정상 조직에서 BCMA mRNA 발현은 매우 낮고 수명이 긴 정상 형질 세포가 위치한 림프 조직으로 제한된다. BCMA 단백질 발현은 형질 세포에만 국한되고 형질모세포와 수명이 긴 형질 세포에 국한되는 것으로 보고되어 있으며, 다른 정상적인 인간 조직에서는 검출될 수 없다. BCMA는 MM 환자의 정상 형질 세포에 비해 대부분의 악성 형질 세포에서 상대적으로 더 높은 수준으로 발현된다. T 세포, 골수 세포 및 CD34+ 조혈 줄기 세포는 BCMA를 발현하지 않는다. 대부분의 악성 형질 세포에서 BCMA의 선택적 발현은 항체 기반 및 키메라 항원 수용체(CAR) 기반 요법에 매우 매력적인 표적이 되게 한다. MM 환자에 대한 BCMA 음성 프로파일에 대한 보고가 있는데, 이는 표적화 요법을 위해 환자 선택이 필요할 수 있음을 시사한다. BCMA의 검출은 단백질 발현에 제한되지 않을 수 있다. 최근의 연구는 혈청 BCMA의 변화가 MM 환자의 치료 반응 또는 질환 진행에 대한 바이오마커일 수 있음을 보여주었다.
BCMA는 세포 표면에서 제거될 수 있으며, 다발성 골수종 환자와 건강한 대상체의 혈청 샘플에서 발견되었다. 최근 간행물은 가용성 BCMA(sBCMA) 수준이 골수 생검에서 형질 세포의 비율, 임상 상태와 상관 관계가 있으며 M 단백질 수준의 변화로 추적될 수 있음을 보여주었다. 이 연구에서, 건강한 공여자는 완전 반응을 나타내는 환자에서 관찰된 중간값 수준과 유사한 sBCMA 혈액 농도 중간값을 나타냈다. 무증상 다발성 골수종 환자는 더 높은 농도를 나타낸 반면, 활동성의 비 치료 다발성 골수종 환자는 가장 높은 수준을 나타냈다. 무 진행 생존은 sBCMA 수치가 중간값을 초과하는 환자들과 비교할 때 중간값 미만의 sBCMA 수준의 환자에서 더 길었다. sBCMA 수준의 변화는 MM 환자의 치료 효능에 대한 빠르고 신뢰할 수 있는 지표일 수 있다. 가용성 BCMA는 질환 진행을 예측하거나 모니터링하는 데 사용될 수 있는데, 이 바이오마커는 비 분비성 질환이 있는 종양 부담이 적은 환자에서 검출될 수 있고, 신장 기능과 무관하기 때문이다.
따라서, 생물학적 샘플에서 높은 민감도, 재현성을 가지며, 이상적으로는 항체 또는 항체 구축물과 같은 잠재적으로 간섭하는 치료적 sBCMA 결합 분자의 존재 하에 안정적인 결과를 제공하는, sBCMA에 대한 신뢰할 수 있는 검출 시스템을 제공할 필요성이 매우 높다.
sBCMA를 검출하기 위한 항체 쌍을 생성하고자 본 발명자들은 BCMA에 대해 생성되고 BCMA에 대한 결합에 대해 ELISA 분석에서 양성으로 테스트된 약 400개의 XenoMouse® 하이브리도마를 스크리닝하였다. 그러나 sBCMA에 결합하는 단클론 항체의 존재 하에서 이들 XenoMouse® 하이브리도마의 스크리닝은 다른 방식의 포획 및 검출 항체 사용을 테스트할 경우조차도 임의의 샌드위치 항체를 확인하지 못했다(도 1b 참고). 다음으로, 토끼 면역화 캠페인을 수행하고, sBCMA에 결합하는 단클론 항체와 샌드위치 결합을 위한 토끼 혈청을 스크리닝하였다. 이 경우, 항체 생성을 위해 토끼를 이용하는 것의 이점은 다음과 같다:
- 상이한 항체 레퍼토리, 상이한 에피토프 공간(경쟁 없음)
- 강력한 면역 반응
- 유전자 전환 기반 면역계, 설치류보다 높은 체세포 초돌연변이 비율로 높은 친화도 유발
(sBCMA에 대한 총 226종의 토끼 항체 중) 3개의 샌드위치 항체의 존재가 증명될 수 있다. 이들 중 2개(sBCMA-mAb1 및 sBCMA-mAb2)는 sBCMA에 대한 결합을 위해 서로 경쟁하는 것으로 나타났다. 그들은 둘 다 치료적 항-BCMA 항체 구축물의 존재 하에 sBCMA에 결합할 수 있었다. 나아가, 항체 sBCMA-mAb3은 sBCMA-mAb1 및 치료적 항-BCMA 항체 구축물의 존재 하에 sBCMA에 결합하는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명은 일 양태에서 가용성 BCMA(sBCMA)에 결합하는 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 제공하며, 이때, sBCMA에 대한 항체(또는 항체 구축물)의 결합은 sBCMA에 결합하는 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 존재 하에 일어난다. 또한, 본 발명은 sBCMA에 결합하는 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 존재 하에 가용성 BCMA(sBCMA)에 결합하는 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 제공한다.
다음에서, 용어 "단클론 항체"가 사용될 때마다(즉, sBCMA에 결합하는 단클론 항체), 이러한 용어는 본원에서 아래에 정의되는 바와 같이, "항체 구축물" 또는 "항체 단편"도 포함하는 것을 의미한다. 나아가, 본 발명의 "단클론 항체(또는 항체 구축물)"(즉, sBCMA에 결합하는 단클론 항체 또는 항체 구축물)의 아래에 제공된 정의 및 설명은 본 발명의 임의의 "제1 단클론 항체(또는 항체 구축물)" 및 본 발명의 임의의 "제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)"에 유사하게 적용된다.
"항체"(때때로 면역글로불린으로도 알려짐)는 표적에 면역특이적으로 결합하는 단백질이다. 항체는 가변 영역을 통해 항원으로 불리는 고유한 표적을 인식한다. "항체"는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 하위유형을 포함함), IgA(IgA1 및 IgA2 하위유형을 포함함), IgM 및 IgE를 포함하는, 임의의 면역글로불린 이소형일 수 있다. 용어 "항체"는 예를 들어, 단클론, 키메라, 재조합, 탈면역화, 친화도 성숙, 인간화 및 인간 항체뿐만 아니라, 설치류, 토끼, 마우스, 래트, 햄스터, 염소 등과 같은 다른 종으로부터의 항체를 포함할 수 있다. 항체는 오로지 단일 공급원으로부터 유래할 수 있거나, 또는 "키메라"일 수 있다. 즉, 항체의 상이한 부분(예컨대, CDR, 프레임워크 영역, 가변 영역, 불변 영역)이 두 개의 상이한 항체로부터 유래할 수 있다. 본 발명에 따른 "항체"의 정의는 전장 항체를 포함하고, 또한, 낙타과 항체, 및 생명공학 또는 단백질 공학 방법 및 공정에 의해 생성된 기타 면역글로불린을 포함한다. 또한, 항체는 하이브리도마에서 생산될 수 있다.
온전한 IgG 항체는 일반적으로 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이다. "경쇄"는 하나의 도메인을 갖는 가변 영역("VL") 및 하나의 도메인을 갖는 불변 영역("CL")을 포함한다. 경쇄의 가변 영역은 폴리펩티드의 아미노 말단에 있다. 경쇄는 카파 쇄 및 람다 쇄를 포함한다. "중쇄"는 하나의 도메인을 갖는 가변 영역("VH") 및 온전한 IgG 항체의 경우, 세 개의 도메인: CH1, CH2, 및 CH3을 포함하는 불변 영역("VL")을 포함한다. VH는 폴리펩티드의 아미노 말단에 있고, CH 도메인은 카르복실 말단에 있으며, CH3은 폴리펩티드의 카르복시 말단에 가장 가깝다.
고전적 전장 항체 또는 면역글로불린에서, 각각의 경쇄(L)는 하나의 공유적 이황화 결합에 의해 중쇄(H)에 연결되는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 이소형에 따라 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. VH에 가장 근접한 중쇄 불변(CH) 도메인은 보통 CH1로 표기된다. 불변("C") 도메인은 항원 결합에 직접적으로 연루되지 않지만, 다양한 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 보체 활성화(보체 의존적 세포독성, CDC)를 나타낸다. 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체라 불리는 세포 표면 수용체 및 보체계의 일부 단백질과 상호작용하는 고전적 항체의 "꼬리" 영역이다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소형에서, Fc 영역은 항체의 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역(CH2 및 CH3)으로부터 유래된 2개의 동일한 단백질 단편으로 구성된다. IgM 및 IgE Fc 영역은 각각의 폴리펩티드 쇄에 3개의 중쇄 불변 도메인(CH2, CH3 및 CH4)을 함유한다. 또한, Fc 영역은 1개 이상의 이황화물 및 비 공유적 상호작용에 의해 서로 결합된 소위 "힌지" 영역의 일부를 함유한다. 천연 유래 IgG의 Fc 영역은 고도로 보존된 N 글리코실화 부위를 보유한다. Fc 단편의 글리코실화는 Fc 수용체 매개 활성에 필수적이다.
본 발명의 단클론 항체는 IgG, IgD, IgE, IgM 또는 IgA 항체일 수 있음이 고려된다. 일 구현예에 따르면, 단클론 항체는 IgG 항체, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다. 항체의 이소형 및 서브클래스는 토끼의 이소형 및 서브클래스일 수 있다(예를 들어, 토끼 IgG, 토끼 IgG1 등).
본 발명의 맥락에서, 용어 "가변"은 이들의 서열에서 가변성을 나타내고 특정 항체의 특이성 및 결합 친화도를 결정하는 데 연루되는 항체 또는 면역글로불린 도메인의 일부(즉, "가변 영역(들)")를 지칭한다. 보통, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 쌍은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다.
가변성은 항체의 가변 영역 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지 않으며; 이는 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 하위 도메인에 집중된다. 이들 하위 도메인은 "초가변 영역" 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 불린다. 가변 영역의 더 보존된(즉, 비 초가변) 부분은 "프레임워크"(FR) 영역으로 불리며, 3차원 공간에서 6개의 CDR에 대한 스캐폴드를 제공하여 항원 결합 표면을 형성한다. 천연 유래 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각은 주로 β-시트 배열을 채택하는 4개의 FR 영역(FR1, FR2, FR3, 및 FR4)을 포함한다. CDR과 함께, 그것들은 가변 중쇄 또는 경쇄 내에 다음의 서열을 형성한다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 각 쇄의 초가변 영역은 프레임워크 영역에 의해 아주 근접하게 함께 결합되고, 보통 다른 쇄의 초가변 영역과 함께, 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda, National Institute of Health. 1991 참고).
용어 "CDR" 및 이의 복수 "CDR들"은 상보성 결정 영역을 지칭하는데, 이 중 3개는 경쇄 가변 영역의 결합 특징을 구성하고(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3), 3개는 중쇄 가변 영역의 결합 특징을 구성한다(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3). CDR은 항체(또는 항체 구축물 또는 결합 도메인)와 항원의 특이적 상호작용을 담당하는 잔기 대부분을 포함하며, 따라서 항체 분자의 기능적 활성에 기여한다: 그들은 항원 특이성의 주된 결정기이다. CDR 경계 및 길이의 정확한 정의는 상이한 분류 및 넘버링 시스템의 대상이다. 따라서 CDR은 카바트(Kabat), 코티아(Chothia), 접촉 또는 본 명세서에 기술되는 넘버링 시스템을 포함하는 임의의 다른 경계 정의에 의해 지칭될 수 있다. 경계를 달리함에도 불구하고, 각각의 이들 시스템은 가변 서열 내에서 소위 "초가변 영역"을 구성하는 것과 어느 정도의 중복을 갖는다. 따라서, 이들 시스템에 따른 CDR 정의는 인접 프레임워크 영역에 대해 길이 및 경계 면적이 다를 수 있다. 예를 들어 카바트(교차종 서열 가변성을 기반으로 하는 접근법), 코티아(항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 기반으로 하는 접근법), 및/또는 맥컬럼(MacCallum)(앞서 인용한 Kabat et al.,; Chothia et al., J. MoI. Biol, 1987, 196: 901-917; 및 MacCallum et al., J. MoI. Biol, 1996, 262: 732) 참고. 항원 결합 부위를 특성화하기 위한 또 다른 표준은 Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되는 AbM 정의이다. 예를 들어, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg) 참고. 2개의 잔기 확인 기법이 동일한 영역은 아니지만, 중복 영역을 정의할 정도까지, 이들은 하이브리드 CDR을 정의하도록 조합될 수 있다. 그러나 소위 카바트 시스템에 따른 넘버링이 바람직하다.
전형적으로, CDR은 기본형(canonical) 구조로서 분류될 수 있는 루프 구조를 형성한다. 용어 "기본형 구조"는 항원 결합(CDR) 루프에 의해 채택되는 주된 쇄 입체형태를 지칭한다. 비교 구조 연구로부터, 6개의 항원 결합 루프 중 5개는 이용 가능한 입체형태의 제한된 레퍼토리만을 가지는 것으로 밝혀졌다. 각각의 기본형 구조는 폴리펩티드 골격의 비틀림 각도에 의해 특성화될 수 있다. 따라서, 항체 사이의 대응하는 루프는 대부분의 루프에서 높은 아미노산 서열 가변성에도 불구하고, 매우 유사한 3차원 구조를 가질 수 있다(Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). 더 나아가, 채택된 루프 구조와 그것을 둘러싸는 아미노산 서열 사이에는 관련성이 있다. 특정 기본형 부류의 입체형태는 루프의 길이 및 루프 내에서뿐만 아니라 보존된 프레임워크 내에서(즉, 루프 외부) 핵심 위치에 존재하는 아미노산 잔기에 의해 결정된다. 따라서 특정 기본형 부류에 대한 배치는 이들 핵심 아미노산 잔기의 존재를 기반으로 하여 이루어질 수 있다.
용어 "기본형 구조"는 또한 예를 들어, 카바트에 의해 목록이 만들어진 항체의 선형 서열에 관한 고려 사항을 포함할 수 있다(위에 인용한 Kabat et al.). 카바트 넘버링 계획(시스템)은 일치되는 방식으로 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하기 위해 널리 채택되는 표준이고, 본 명세서의 다른 곳에 또한 언급된 바와 같이 본 발명에 적용된 바람직한 계획이다. 추가의 구조적 고려 사항은 또한 항체의 기본형 구조를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 카바트 넘버링에 의해 완전히 반영되지 않는 이들 차이는 코티아 등의 넘버링 시스템에 의해 기술될 수 있고/있거나 다른 기법, 예를 들어, 결정학 및 2차원 또는 3차원 컴퓨터 모델링에 의해 밝혀질 수 있다. 따라서, 주어진 항체 서열은, 다른 것들 중에서도, (예를 들어, 라이브러리에서 다양한 기본형 구조를 포함하기 위한 바람을 기반으로 하여) 적절한 섀시 서열의 확인을 허용하는 기본형 부류에 위치될 수 있다. 항체 아미노산 서열의 카바트 넘버링 및 코티아 등(위에 인용됨)에 의해 기술된 바와 같은 구조적 고려 사항 및 항체 구조의 기본형 측면을 해석하기 위한 이들의 함의는 문헌에 기술되어 있다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 항체 구조에 관한 리뷰는 Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988 참조.
경쇄의 CDR3 및, 특히 중쇄의 CDR3은 경쇄 및 중쇄 가변 영역 내의 항원 결합에서 가장 중요한 결정기를 구성할 수 있다. 일부 항체, 항체 구축물 또는 결합 도메인에서, 중쇄 CDR3은 항원과 항체 사이의 주된 접촉 면적을 구성하는 것으로 나타난다. CDR3만이 다른 시험관 내 선택 계획은 항체 또는 항체 구축물/결합 도메인의 결합 특성을 달리 하거나 어느 잔기가 항원의 결합에 기여하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, CDR3은 전형적으로 항체 결합 부위 내에서 분자 다양성의 가장 큰 공급원이다. 예를 들어, CDR-H3은 2개의 아미노산 잔기만큼 짧거나 26개 아미노산보다 클 수 있다.
조립 및 체세포 돌연변이 후에 항체 유전자의 서열은 크게 달라지고, 이들 달라진 유전자는 1010개의 상이한 항체 분자를 암호화하는 것으로 추정된다(Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). 따라서, 면역계는 면역글로불린의 레퍼토리를 제공한다. 용어 "레퍼토리"는 적어도 하나의 면역글로불린을 암호화하는 적어도 하나의 서열로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 서열(들)은 중쇄의 V, D 및 J 분절, 및 경쇄의 V 및 J 분절의 생체 내 재배열에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 서열(들)은 재배열이 일어나는, 예를 들어 시험관 내 자극에 반응하여 세포로부터 생성될 수 있다. 대안적으로, 서열(들)의 일부 또는 전부는 DNA 스플라이싱, 뉴클레오티드 합성, 돌연변이 유발, 및 기타 방법에 의해 얻어질 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 5,565,332를 참조한다. 레퍼토리는 단지 하나의 서열을 포함할 수 있거나 유전적으로 다양한 무리에서 하나를 포함하는 복수의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체(및 항체 구축물)는 단클론인 것으로 고려된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단클론"으로 표시된 항체 또는 항체 구축물(mAb)은 실질적으로 균질한 항/항체 구축물의 집단으로부터 얻어진다. 즉, 집단에 포함된 개개 항체/항체 구축물은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 유래 돌연변이 및/또는 번역 후 변형(예를 들어, 이성질화, 아미드화)을 제외하고 동일하다(특히, 그들의 아미노산 서열과 관련하여). 단클론 항체/항체 구축물은 고도로 특이적이며, 전형적으로 상이한 결정기(또는 에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 항원 내의 단일 에피토프에 대해 유도된다. 이들의 특이성에 더하여, 단클론 항체는 하이브리도마 배양에 의해 합성되어, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론성"은 실질적으로 균질한 항체/항체 구축물의 집단으로부터 얻어지는 항체/항체 구축물의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
단클론 항체의 제조를 위해, 연속적 세포주 배양에 의해 생산되는 항체를 제공하는 임의의 기법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 단클론 항체/항체 구축물은 Koehler 등(Nature, 256: 495 (1975))에 의해 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 인간 단클론 항체를 생산하기 위한 추가적인 기법의 예는 트라이오마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법(Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) 및 EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96)을 포함한다.
그런 다음, 하이브리도마는 소정의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체/항체 구축물을 생산하는 하나 이상의 하이브리도마를 확인하기 위해 표준 방법, 예를 들어 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 및 표면 플라스몬 공명(BIACORE™) 분석을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 관련 항원의 임의 형태가 면역원, 예를 들어, 재조합 항원, 천연 유래 형태, 키메라 항원, 항원의 임의의 변이체 또는 단편뿐만 아니라 이의 항원 펩티드로서 사용될 수 있다. 비아코어(BIAcore™) 시스템에서 이용되는 표면 플라스몬 공명은 표적 항원의 에피토프에 결합하는 파지 항체/항체 구축물의 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).
항체, 항체 구축물 또는 결합 도메인을 제조하는 다른 예시적인 방법은 단백질 발현 라이브러리, 예를 들어, 파지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 파지 디스플레이는, 예를 들어 Ladner et al., 미국 특허 번호 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)에 기술되어 있다.
디스플레이 라이브러리의 사용에 더하여, 비 인간 동물, 예를 들어, 설치류(예를 들어, 마우스, 햄스터, 토끼 또는 래트)를 면역화하기 위해 관련 항원이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 비 인간 동물은 인간 면역글로불린 유전자의 적어도 일부를 포함한다. 예를 들어, 인간 Ig(면역글로불린) 좌위의 큰 단편을 가지고 마우스 항체 생산이 결핍된 마우스 혈통을 조작하는 것이 가능하다. 하이브리도마 기법을 사용하여, 요망되는 특이성을 갖는 유전자로부터 유래된 항원 특이적 단클론 항체가 생산되고 선택될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE™), Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096, 및 WO 96/33735 참고.
단클론 항체는 또한 비 인간 동물로부터 얻어질 수 있고, 이어서, 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 기법을 사용하여 변형, 예를 들어 인간화, 탈면역화, 렌더링된 키메라 등으로 될 수 있다. 변형된 항체, 구축물 또는 결합 도메인의 예에는 비 인간 항체/항체 구축물의 인간화 변이체, "친화도 성숙" 항체, 구축물 또는 결합 도메인(예를 들어, Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) 및 Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991) 참고) 및 변경된 효과기 기능(들)을 갖는 항체 변이체 또는 돌연변이체(예를 들어, 미국 특허 5,648,260, 인용된 Kontermann and D
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bel (2010) 및 인용된 Little (2009) 참고)가 포함된다.
면역학에서, 친화도 성숙은 B 세포가 면역 반응의 과정 동안 항원에 대해 증가된 친화도를 갖는 항체를 생성하는 과정이다. 동일한 항원에 대한 반복적인 노출로, 숙주는 연속적으로 더 큰 친화도의 항체를 생산할 것이다. 천연 표현형과 마찬가지로, 시험관 내 친화도 성숙은 돌연변이 및 선택의 원칙을 기반으로 한다. 시험관 내 친화도 성숙은 항체, 항체 단편, 항체 변이체, 항체 구축물 또는 결합 도메인을 최적화하기 위해 성공적으로 사용되었다. CDR 내부의 무작위 돌연변이는 방사선, 화학적 돌연변이원 또는 오류 유발 PCR을 이용하여 도입된다. 추가로, 유전적 다양성은 쇄 셔플링에 의해 증가될 수 있다. 파지 디스플레이와 같은 디스플레이 방법을 사용하는 2 또는 3회 라운드의 돌연변이 및 선택은 보통 낮은 나노몰 범위의 친화도를 갖는 항체, 항체 단편, 항체 변이체, 항체 구축물 또는 결합 도메인을 초래한다.
본 명세서에 기술된 항체(또는 항체 구축물)의 아미노산 서열 변형이 또한 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 펩티드 합성에 의해 또는 항체를 암호화하는 핵산 분자 내로 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써 제조된다. 아래에 기술된 아미노산 서열 변형 모두는 (sBCMA에 결합하는) 변형되지 않은 모 분자의 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 항체를 생성해야 한다.
용어 "아미노산" 또는 "아미노산 잔기"는 변형, 합성 또는 희귀 아미노산이 원하는 대로 사용될 수 있지만, 전형적으로는 당해 분야에서 인식되는 정의를 갖는 아미노산, 예를 들어, 알라닌(Ala 또는 A); 아르기닌(Arg 또는 R); 아스파라긴(Asn 또는 N); 아스파르트산(Asp 또는 D); 시스테인(Cys 또는 C); 글루타민(Gln 또는 Q); 글루탐산(Glu 또는 E); 글리신(Gly 또는 G); 히스티딘(His 또는 H); 이소류신(Ile 또는 I): 류신(Leu 또는 L); 리신(Lys 또는 K); 메티오닌(Met 또는 M); 페닐알라닌(Phe 또는 F); 프롤린(Pro 또는 P); 세린(Ser 또는 S); 트레오닌(Thr 또는 T); 트립토판(Trp 또는 W); 티로신(Tyr 또는 Y); 및 발린(Val 또는 V)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 지칭한다. 기본적으로 상이한 측쇄에 의해 결정된 아미노산의 네 가지 상이한 부류가 있다:
(1) 비 극성 및 중성(하전되지 않음): Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Val
(2) 극성 및 중성(하전되지 않음): Asn, Cys(약간만 극성임), Gln, Ser, Thr, Trp(약간만 극성임), Tyr
(3) 산성 및 극성(음으로 하전됨): Asp 및 Glu
(4) 염기성 및 극성(양으로 하전됨): Arg, His, Lys
소수성 아미노산은 지방족 또는 방향족 측쇄를 가지는지에 따라 나뉠 수 있다. Phe 및 Trp(매우 소수성임), Tyr 및 His(덜 소수성임)은 방향족 아미노산으로 분류된다. 엄격하게 말하자면, 지방족은 측쇄가 수소와 탄소 원자만을 함유함을 의미한다. 이 엄격한 정의에 의해, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산은 알라닌, 이소류신, 류신(또한 노르류신), 프롤린 및 발린이다. 매우 짧은 알라닌의 측쇄는 그것이 특별히 소수성이지 않음을 의미하고, 프롤린은 단백질에서 특별한 역할을 부여하는 특이한 기하학적 구조를 갖는다. 메티오닌은 황 원자도 함유하고 있지만, 이소류신, 류신 및 발린과 동일한 카테고리에 있다고 여기는 것이 종종 편리하다. 일관된 주제는 이들 아미노산이 주로 비 반응성이고 가요성의 측쇄를 함유한다는 점이다. 아미노산 알라닌, 시스테인, 글리신, 프롤린, 세린 및 트레오닌은 종종 이들이 모두 크기가 작다는 이유로 함께 분류된다. Gly 및 Pro은 쇄 배향에 영향을 미칠 수 있다.
아미노산 변형은, 예를 들어, 단클론 항체(항체 구축물)의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 잔기로의 삽입, 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및/또는 치환의 임의의 조합은, 최종 항체가 원하는 특성, 예를 들어, 변형되지 않은 모 분자의 생물학적 활성(예컨대, sBCMA와 결합)을 보유한다면, 최종 단클론 항체(항체 구축물)에 도달하도록 이루어진다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 개수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이, 항체의 번역 후 과정을 변경시킬 수 있다.
예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산이 각각의 CDR(물론, 그들의 길이에 의존함)에서 삽입, 결실 및/또는 치환될 수 있는 한편, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 25개의 아미노산이 각각의 FR에서 삽입, 결실 및/또는 치환될 수 있다. 아미노산 서열 삽입은 길이가 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 잔기로부터 10개 초과의, 예를 들어, 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위에 있는 N 말단 및/또는 C 말단 첨가뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열 내 삽입을 포함한다.
아미노산 변형, 특히 아미노산 치환의 최대 관심 부위는 초가변 영역, 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 개별 CDR을 포함하지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 FR 변경 또한 본 명세서에서 고려된다. 치환은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 보존적 치환일 수 있다. 바람직하게는, 각각 CDR 또는 FR의 길이에 따라, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산이 CDR에서 치환될 수 있는 한편, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 25개의 아미노산이 프레임워크 영역(FR)에서 치환될 수 있다. 예를 들어, CDR 서열이 6개의 아미노산을 포함하는 경우, 이들 아미노산 중 1, 2 또는 3개가 치환되는 것으로 고려된다. 유사하게, CDR 서열이 15개의 아미노산을 포함하는 경우, 이들 아미노산 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개가 치환되는 것으로 고려된다.
돌연변이 유발을 위한 바람직한 위치인 단클론 항체(항체 구축물) 내의 특정 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불리고, 예를 들어, Cunningham B.C. and Wells J.A. (Science. 1989 Jun 2;244(4908):1081-5)에 기술되어 있다. 여기서, 항체 내의 잔기 또는 잔기 군이 확인되고(예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 Arg, His, Lys, Asp, 및 Glu), 중성 또는 비 극성 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 표적 단백질의 에피토프와 각각의 아미노산(들)의 상호작용에 영향을 미친다. 알라닌 스캐닝은 주어진 단백질의 안정성 또는 기능에 대한 특정 잔기의 기여도를 결정하는 데 사용되는 기법이다. 알라닌은 부피가 크지 않고, 화학적으로 불활성인, 메틸 작용기(그럼에도 불구하고 다수의 다른 아미노산이 보유하는 2차 구조 선호도를 모방함) 덕분에 사용된다. 때때로, 발린 또는 류신과 같이 부피가 큰 아미노산은 돌연변이된 잔기의 크기 보존이 요망되는 경우에 사용될 수 있다. 또한, 이 기법은 특정 잔기의 측쇄가 생체활성에서 중요한 역할을 하는지를 결정하는 데에도 유용할 수 있다. 알라닌 스캐닝은 보통 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 또는 무작위로 PCR 라이브러리를 생성하여 달성된다. 나아가, 이론적 알라닌 치환을 기초로 한 열역학적 파라미터를 추정하는 계산 방법이 개발되었다. 데이터는 IR/NMR 분광학, 수학적 방법, 생물학적 분석법 등에 의해 테스트할 수 있다.
이어서, (예를 들어, 알라닌 스캐닝에 의해 결정된 바와 같은) 치환에 대한 작용 민감성을 보여주는 이들 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가적인 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개선될 수 있다. 따라서, 아미노산 서열 변화를 도입하기 위한 부위 또는 영역은 사전 결정되지만, 돌연변이의 성질 그 자체는 사전 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하거나 최적화하기 위해, 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행될 수 있고, 발현된 단클론 항체/항체 구축물 변이체는 요망되는 활성의 최적 조합을 위해 스크리닝된다. 공지된 서열을 갖는 DNA의 사전 결정된 부위에서 치환 돌연변이를 생성하기 위한 기법은 잘 알려져 있고, 예를 들어, M13 프라이머 돌연변이 유발 및 PCR 돌연변이 유발이 있다. 돌연변이체의 스크리닝은 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원(예를 들어, sBCMA) 결합 활성의 분석을 이용하여 수행된다.
일반적으로, 아미노산이 중쇄 및/또는 경쇄/가변 영역의 하나 이상 또는 모든 CDR에서 치환되는 경우, 그때 얻어지는 "치환된" 서열은 "본래" 또는 "모" CDR 서열과 적어도 60% 또는 65%, 더욱 바람직하게는 70% 또는 75%, 훨씬 더 바람직하게는 80% 또는 85%, 그리고 특히 바람직하게는 90% 또는 95% 동일/상동/유사하다는 것이 고려된다. 이는 본래의 서열과 치환된 서열 사이의 동일성/상동성/유사성의 정도가 CDR의 길이에 달려 있음을 의미한다. 예를 들어, 총 5개의 아미노산을 갖고 1개의 아미노산 치환을 포함하는 CDR은 "본래" 또는 "모" CDR 서열과 80% 동일하고, 총 10개의 아미노산을 갖고 1개의 아미노산 치환을 포함하는 CDR은 "본래" 또는 "모" CDR 서열과 90% 동일하다. 따라서, 본 발명의 단클론 항체의 치환된 CDR은 그들의 본래 서열에 대해 상이한 정도의 동일성을 가질 수 있고, 예를 들어, CDRL1은 80%의 상동성을 가질 수 있는 한편, CDRL3은 90%의 상동성을 가질 수 있다. 동일한 고려사항이 프레임워크 영역 및 전체 VH 및 VL 영역에 적용된다.
따라서, "변이체 CDR"은 본 발명의 모 CDR과 특정한 서열 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는 CDR이고, 모 CDR의 특이성 및/또는 활성의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함하지만 이에 한정되지 않는 생물학적 기능을 모 CDR과 공유한다. 일반적으로, 개별 변이체 CDR 사이의 아미노산 상동성, 유사성, 또는 동일성은 본 명세서에 제시된 모 서열에 대해 적어도 60%이고, 더 전형적으로 적어도 65% 또는 70%, 바람직하게는 적어도 75% 또는 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 및 더욱 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 거의 100%의 상동성, 유사성 또는 동일성으로 증가한다. "변이체 VH" 및 "변이체 VL"에도 동일한 사항이 적용된다. 일 구현예에 따르면, "변이체 VH" 및/또는 "변이체 VL" 내의 서열 변형은 CDR로 확대되지 않는다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 특정 서열("모" VH 및 VL)과 특정한 서열 상동성/동일성/유사성(위 참고)을 갖는 VH 및 VL 서열을 포함하는, 본 명세서에 정의된 바와 같은 단클론 항체(또는 항체 구축물)을 대상으로 하며, 이때, CDR 서열은 본 명세서에 정의된 특정 CDR 서열("모" CDR)과 100% 동일하다.
바람직한 치환(또는 교체)은 보존적 치환이다. 그러나 단클론 항체(항체 구축물)가 sBCMA에 결합하는 이의 능력을 보유하는 한, 그리고/또는 이의 CDR, FR, VH 및/또는 VL 서열이 본래 또는 모 서열과 적어도 60% 또는 65%, 더욱 바람직하게는 적어도 70% 또는 75%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 80% 또는 85%, 그리고 특히 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%의 동일성 정도를 갖는다면, 임의의 치환(비 보존적 치환 또는 아래 표 1에 열거된 "예시적인 치환"으로부터의 하나 이상을 포함)이 고려된다.
보존적 교체(보존적 돌연변이 또는 보존적 치환이라고도 함)는 주어진 아미노산을 유사한 생화학적 특성(예를 들어, 전하, 소수성, 크기)을 갖는 상이한 아미노산으로 변경하는 아미노산 교체이다. 단백질의 보존적 교체는 종종 비 보존적 교체보다 단백질 기능에 더 적은 영향을 미친다. 보존적 치환을 표 1에 제시하였다. 예시적인 보존적 치환을 "예시적인 치환"으로 제시하였다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하는 경우, 아미노산 부류에 대해 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같은 더 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물은 요망되는 특징에 대해 스크리닝될 수 있다.
[표 1] 아미노산 치환(aa = 아미노산)
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본 발명의 단클론 항체(항체 구축물)의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체형태로서, 치환 영역에서 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 큰 규모를 유지하는 데 대한 이들의 영향이 상당히 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 비 보존적 치환은 보통 위에 정의된 아미노산 부류(예컨대, 극성, 중성, 산성, 염기성, 지방족, 방향족, 작은…) 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 항체의 산화적 안정성을 개선하기 위해 항체의 적절한 입체형태를 유지하는 데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다.
아미노산 서열의 서열 동일성, 상동성 및/또는 유사성은 Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482의 국소 서열 동일성 알고리즘, Needleman and Wunsch(J Mol Biol. 1970 Mar;48(3):443-53)의 서열 동일성 정렬 알고리즘, Pearson and Lipman(Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Apr;85(8):2444-8)의 유사성 방법에 대한 조사, 이 알고리즘(Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group)(미국 위스콘신 주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재)에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)의 컴퓨터 실행, 바람직하게는 디폴트 설정을 이용하여 또는 검사에 의해 Devereux et al(Nucleic Acids Res.1984 Jan 11;12(1 Pt 1):387-95)에 기술된 Best Fit 서열 프로그램을 포함하나 이에 한정되지 않는, 당해 분야에 공지된 표준 기법을 이용하여 결정된다. 동일성 백분율은 다음 파라미터를 기반으로 하여 FastDB에 의해 계산되는 것이 고려된다: 미스매치 페널티 1; 갭 페널티 1; 갭 크기 페널티 0.33; 및 결합 페널티 30. 또한, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc. 참고.
유용한 알고리즘의 예는 PILEUP이다. PILEUP은 진행성, 쌍별 정렬을 사용하여 관련된 서열의 군으로부터 다중 서열 정렬을 생성한다. 또한, 정렬을 생성하기 위해 사용되는 클러스터링 관계를 나타내는 트리를 도표화할 수 있다. PILEUP은 Feng & Doolittle(J Mol Evol.1987;25(4):351-60)의 진행성 정렬 방법의 단순화를 이용하고; 이 방법은 Higgins and Sharp(Comput Appl Biosci. 1989 Apr;5(2):151-3)에 의해 기술된 것과 유사하다. 유용한 PILEUP 파라미터는 디폴트 갭 가중치 3.00, 디폴트 갭 길이 가중치 0.10, 및 가중치 부여된 말단 갭을 포함한다.
유용한 알고리즘의 또 다른 예는 Altschul et al.(J Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-10.); Altschul et al., (Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402); 및 Karlin and Altschul(Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jun 15;90(12):5873-7)에 기술된 BLAST 알고리즘이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 Altschul et al., (Methods Enzymol. 1996; 266:460-80)으로부터 얻어진 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2에서는 대부분 디폴트 값으로 설정된 몇 가지 검색 파라미터를 사용한다. 조절 가능한 파라미터는 다음의 값으로 설정된다: 중복 스팬=1, 중복 분율=0.125, 단어 역치(T)=II. HSP S 및 HSP S2 파라미터는 동적인 값이고 관심 대상의 서열이 검색되는 특정 데이터베이스의 조성 및 특정 서열의 조성에 따라 프로그램 자체에 의해 확립되지만; 값은 민감도를 높이기 위해 조정될 수 있다.
추가적인 유용한 알고리즘은 Altschul et al.(Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402)에 의해 보고되는 갭 BLAST이다. 갭 BLAST는 BLOSUM-62 치환 스코어; 9로 설정된 역치 T 파라미터; 갭이 없는 연장을 촉발시키기 위한 2-히트 방법, k의 갭 길이에 10+k를 부과; 16으로 설정된 Xu, 그리고 데이터베이스 검색 단계에 대해 40 및 알고리즘의 산출 단계에 대해 67로 설정된 Xg를 사용한다. 갭 정렬은 약 22 비트에 상응하는 스코어에 의해 촉발된다.
본원에 따라, 본 명세서에서 확인되는 단클론 항체(항체 구축물)을 암호화하는 핵산 서열에 대해 용어 "핵산 서열 동일성/상동성/유사성 백분율(%)"은, 항체의 암호화 서열에서 뉴클레오티드 잔기와 동일한 후보 서열에서의 뉴클레오티드 잔기의 백분율로서 정의된다. 두 서열을 정렬시켜 이들의 상동성을 결정하는 한 가지 방법은 디폴트 파라미터로 설정된 WU- Blast2의 BLASTN 모듈을 이용하며, 중복 스팬 및 중복 분율은 각각 1 및 0.125로 설정된다. 일반적으로, 개별 변이체 CDR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 본 명세서에 제시된 뉴클레오티드 서열 사이의 핵산 서열 상동성, 유사성 또는 동일성은 적어도 60%이고, 더 전형적으로는 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 거의 100%의 상동성, 유사성 또는 동일성으로 증가한다. 다시, 동일한 사항이 "변이체 VH" 및/또는 "변이체 VL"을 암호화하는 핵산 서열에 적용된다.
용어 "항체 구축물"은 구조 및/또는 기능이 항체, 예를 들어, 전장 면역글로불린 분자의 구조 및/또는 기능을 기반으로 하는 분자를 지칭한다. 따라서, 항체 구축물은 이의 표적 또는 항원에 면역특이적으로 결합하고/하거나, 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 또는 이로부터 유래된 도메인을 포함한다. 본 발명에 따른 항체 구축물은 면역특이적 표적 결합을 허용하는 항체의 최소한의 구조적 요건을 포함한다. 이러한 최소한의 요건은, 예를 들어 적어도 3개의 경쇄 CDR(즉, VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3) 및/또는 3개의 중쇄 CDR(즉, VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3), 바람직하게는 6개의 CDR 모두의 존재에 의해 정의될 수 있다. 따라서, 항체 구축물은 결합 도메인의 3개 또는 6개의 CDR의 존재에 의해 특성화될 수 있고, 당업자는 이러한 CDR이 결합 도메인에서 어디에(어떤 순서로) 위치하는지를 알고 있다.
또한, 본 발명에 따른 용어 "항체 구축물"은 전장 항체의 단편, 예컨대, VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, 경쇄(VL-CL), Fd(VH-CH1), 중쇄, Fab, Fab', F(ab')2 또는 "r IgG"(중쇄 및 경쇄로 구성된 "절반 항체")를 포함할 수 있다. 항체 단편은 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체 구축물은 항체 변이체 또는 항체 유도체로도 불리는 항체의 변형된 단편을 포함할 수 있다. 예는 scFv, 다이-scFv 또는 비(스)-scFv, scFv-Fc, scFv-지퍼, scFab, Fab2, Fab3, 다이아바디, 단쇄 다이아바디, 탠덤 다이아바디(Tandab's), 탠덤 다이-scFv, 탠덤 트라이-scFv, 다음과 같은 구조에 의해 예시되는 "미니바디": (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2, ((scFv)2-CH3 + CH3), ((scFv)2-CH3) 또는 (scFv-CH3-scFv)2, 멀티바디, 예컨대 트라이아바디 또는 테트라바디, 및 단일 도메인 항체, 예컨대 나노바디 또는 다른 가변 영역 또는 도메인과 관계 없이 항원 또는 표적에 특이적으로 결합하는 단지 하나의 가변 영역을 포함하는 단일 가변 도메인 항체(이것은 VHH, VH 또는 VL일 수 있음)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 항체 구축물의 추가로 가능한 형식은 크로스 바디, 맥시 바디, 헤테로 Fc 구축물, 모노 Fc 구축물 및 scFc 구축물이다. 이들 형식의 예는 본 명세서에서 아래에 기술될 것이다.
더 나아가, 용어 "항체 구축물"의 정의는 2가 및 다가/다중가의 구축물뿐만 아니라, 별개의 결합 도메인을 통해 2, 3개 이상의 항원 구조에 특이적으로 결합하는 이중특이적 및 다중특이적/다특이적 구축물을 포함한다. 항체 구축물은 구축물이 3가이고 이중특이적인 경우, 예를 들어, 하나의 표적에 대해 2개의 결합 도메인 및 또 다른 표적(예컨대, CD3)에 대해 1개의 결합 도메인을 갖거나, 또는 그 반대의 경우에서, 특이성보다 더 많은 결합가(binding valence)를 가질 수 있다. 일반적으로, 용어 "이중특이적"은 항체 구축물이 (적어도) 2개의 상이한 항원에 결합한다는 의미를 포함한다.
게다가, 용어 "항체 구축물"의 정의는 단지 하나의 폴리펩티드 쇄로 구성되는 분자뿐만 아니라 2, 3, 4개 이상의 폴리펩티드 쇄로 구성되는 분자를 포함하며, 이 쇄는 동일하거나(호모이량체, 호모삼량체 또는 호모 올리고머) 상이할 수 있다(헤테로이량체, 헤테로삼량체 또는 헤테로올리고머). 위의 확인된 항체 및 이들의 단편, 변이체, 유도체 및 이로부터 유래된 항체 구축물에 대한 예는 그 중에서도 Harlow and Lane, Antibodies: A laboratory manual, CSHL Press (1988); Kontermann and D
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bel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010; and Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009에 기술되어 있다.
용어 "결합 도메인" 또는 "~에 결합하는 도메인"은 본 발명과 관련하여 표적 또는 항원(본 명세서에서 sBCMA) 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하고/이와 상호작용하고/이를 인식하는 항체/항체 구축물의 도메인을 특징으로 한다. 결합 도메인의 구조 및 기능은 항체, 예를 들어, 전장 면역글로불린 분자의 구조 및/또는 기능을 기반으로 한다. 따라서, "결합 도메인" 또는 "~에 결합하는 도메인"은 면역특이적 표적 결합을 허용하는 항체의 최소한의 구조적 요건을 포함할 수 있다. 결합 도메인의 이러한 최소한의 구조적 요건은, 예를 들어 적어도 3개의 경쇄 CDR(즉, VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3) 및/또는 3개의 중쇄 CDR(즉, VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3), 바람직하게는 6개의 CDR 모두의 존재에 의해 정의될 수 있다. "~에 결합하는 도메인"(또는 "결합 도메인")은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있다. 그러나 둘 다를 포함할 필요는 없지만, VH 또는 VL 중 하나만을 포함할 수 있다. Fd 단편은, 예를 들어, 종종 온전한 항원 결합 도메인의 일부 항원 결합 기능을 보유한다.
"~에 결합하는 도메인"(또는 "결합 도메인") 또는 항체 구축물의 형식의 예는 전장 항체, 전장 항체의 단편(예컨대, VH, VHH, VL), (s)dAb, Fv, 경쇄(VL-CL), Fd(VH-CH1), 중쇄, Fab, Fab', F(ab')2 또는 "r IgG"("절반 항체")), 항체 변이체 또는 유도체, 예컨대, scFv, 다이-scFv 또는 비(스)-scFv, scFv-Fc, scFv-지퍼, scFab, Fab2, Fab3, 다이아바디, 단쇄 다이아바디, 탠덤 다이아바디(Tandab's), 탠덤 다이-scFv, 탠덤 트라이-scFv, "미니바디"((VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2, ((scFv)2-CH3 + CH3)), ((scFv)2-CH3) 또는 (scFv-CH3-scFv)2와 같은 형식으로부터 선택됨), 멀티바디, 예컨대, 트라이어바디 또는 테트라바디, 및 단일 도메인 항체, 예컨대, 나노바디 또는 단지 하나의 가변 도메인을 포함하는 단일 가변 도메인 항체(이는 VHH, VH 또는 VL일 수 있음)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. "~에 결합하는 도메인"(또는 "결합 도메인")의 형식의 추가 예는 (1) VL, VH, CL 및 CH1을 포함하는 항체 단편 또는 변이체(예컨대, Fab); (2) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 항체 단편 또는 변이체(예컨대, F(ab')2); (3) VH 및 CH1을 포함하는 항체 단편 또는 변이체(예컨대, Fd); (4) VL 및 CL을 포함하는 항체 단편 또는 변이체(예컨대, 경쇄); (5) VL 및 VH를 포함하는 항체 단편 또는 변이체(예컨대, Fv); (5) dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546)으로서 VH 도메인을 갖는 dAb 단편; (6) 중쇄 및/또는 경쇄의 적어도 3개의 분리된 CDR을 포함하는 항체 변이체; 및 (7) 단쇄 Fv(scFv)를 포함한다. 본 발명에 따른 항체 구축물 또는 결합 도메인의 구현예에 대한 예는, 예를 들어 WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, W O2014/144722, WO 2014/151910 및 WO 2015/048272에 기술되어 있다.
scFv에서, VH 영역 및 VL 영역은 VH-VL 또는 VL-VH의 순서로(N 말단에서 C 말단으로) 배열된다. VH 및 VL 영역은 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 통해 연결됨이 고려된다. 일 구현예에 따르면, VH 영역은 링커의 N 말단으로 위치되고, VL 영역은 링커의 C 말단으로 위치된다. 나아가, 항체 구축물의 2개의 scFv 도메인은 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 통해 연결되는 것이 가능하다. 항체 구축물은 예를 들어, (N 말단에서 C 말단으로) 제1 도메인 - 링커 - 제2 도메인의 순서로 도메인을 포함할 수 있다. 역 순서(제2 도메인 - 링커 - 제1 도메인)도 가능하다.
링커는 바람직하게는 펩티드 링커, 더욱 바람직하게는 짧은 펩티드 링커이다. 본 발명에 따라, "펩티드 링커"는 항체 구축물의 하나의 도메인의 아미노산 서열을 또 다른 (가변 및/또는 결합) 도메인(예를 들어, 가변 도메인 또는 결합 도메인)과 연결하는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 펩티드 링커의 필수적인 기술적 특징은 그것이 임의의 중합 활성을 포함하지 않는다는 점이다. 적합한 펩티드 링커 중에는 미국 특허 4,751,180 및 4,935,233 또는 WO 88/09344에 기술된 것들이 있다. 펩티드 링커는 또한 본 발명의 항체/항체 구축물에 다른 도메인 또는 모듈 또는 영역(예를 들어, 반감기 연장 도메인)을 부착시키기 위해 사용될 수 있다. 본 맥락에서, "짧은" 링커는 2 내지 50개의 아미노산, 바람직하게는 3 내지 35개, 4 내지 30개, 5 내지 25개, 6 내지 20개, 또는 6 내지 17개의 아미노산을 갖는다. 1개의 결합 도메인의 2개의 가변 영역들 사이의 링커는 2개의 결합 도메인들 사이의 링커와 상이한 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 전자가 후자보다 더 길 수 있다). 예를 들어, 1개의 결합 도메인의 2개의 가변 영역들 사이의 링커는 7 내지 15개의 아미노산, 바람직하게는 9 내지 13개의 아미노산의 길이를 가질 수 있고, 2개의 결합 도메인들 사이의 링커는 3 내지 10개의 아미노산, 바람직하게는 4 내지 8개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 추가로 펩티드 링커는 글리신/세린 링커임이 고려된다. 글리신/세린 링커 내의 아미노산의 대부분은 글리신 및 세린으로부터 선택된다.
상이한 결합 특이성을 갖는 2개의 결합 도메인을 연결하는 데 링커가 사용되는 경우에, 이 링커는 바람직하게는 각각의 도메인이 서로 독립적으로 그들의 차별적인 결합 특이성을 보유할 수 있음을 보장하기에 충분한 길이 및 서열을 갖는다. 항체 구축물에서 적어도 2개의 결합 도메인(또는 1개의 결합 도메인을 형성하는 2개의 가변 영역)을 연결하는 펩티드 링커의 경우, 이들 펩티드 링커는 단지 소수의 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 것이 고려된다. 따라서, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5개 아미노산 잔기의 펩티드 링커가 바람직하다. 5개 미만의 아미노산을 갖는 고려되는 펩티드 링커는 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산(들)을 포함하는데, 여기에서 Gly 풍부 링커가 바람직하다. 상기 "펩티드 링커"와 관련하여 "단일 아미노산" 링커는 Gly이다. 펩티드 링커의 또 다른 구현예는 아미노산 서열 Gly4Ser, 또는 이의 중합체, 즉, (Gly4Ser)x(여기서, x는 1 이상의 정수(예컨대, 2 또는 3)임)를 특징으로 한다. 상기 펩티드 링커의 특징은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, Dall'Acqua et al.(Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al.(Mol Immunol (1992) 29, 21-30) 및 Raag and Whitlow(FASEB (1995) 9(1), 73-80)에 기술되어 있다. 임의의 2차 구조를 촉진하지 않는 펩티드 링커가 바람직하다. 상기 도메인의 서로에 대한 연결은 예를 들어, 유전 공학에 의해 제공될 수 있다. 융합된 그리고 작동 가능하게 연결된 이중특이적 단일 쇄 구축물을 제조하고 포유류 세포 또는 박테리아에서 이들을 발현시키기 위한 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다(예를 들어, WO 99/54440 또는 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).
본 발명의 일 구현예에 따르면, sBCMA에 결합하는 본 발명의 항체 구축물은 "단쇄 항체 구축물"일 수 있다. Fv 단편의 2개의 도메인, 즉 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 VL과 VH 영역이 1가 분자를 형성하도록 쌍을 이루는 단일 단백질 쇄로서 이들이 생성되는 것을 가능하게 하는 -전술한 바와 같은- 인공 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다; 예를 들어, Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883 참고). 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 얻어지며, 단편은 전장 항체 또는 IgG와 동일한 방식으로 기능에 대해 평가된다. 따라서, 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 보통 짧은 링커 펩티드와 연결되는 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커는 보통 가요성을 위해 글리신뿐만 아니라 용해성을 위해 세린 또는 트레오닌도 풍부하고, VH의 N 말단을 VL의 C 말단과 연결하거나, 또는 그 반대로 연결할 수 있다. 이 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, 본래의 면역글로불린의 특이성을 보유한다.
"단일 도메인 항체"로 표시된 항체 구축물은 다른 가변 영역과 관계 없이, 특이적 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 하나의(단량체) 항체 가변 영역을 포함한다. 제1 단일 도메인 항체는 낙타과에서 발견된 중쇄 항체로부터 조작되었고, 이들은 VHH 단편으로 불린다. 연골어류는 또한 VNAR 단편으로 불리는 단일 도메인 항체가 얻어질 수 있는 중쇄 항체(IgNAR)를 갖는다. 대안적인 접근법은 공통 면역글로불린으로부터의 이량체 가변 영역을 단량체로 분할하고, 이에 따라 단일 도메인 Ab로서 VH 또는 VL을 얻는 것이다. 단일 도메인 항체로의 대부분의 연구는 현재 중쇄 가변 영역을 기반으로 하지만, 경쇄로부터 유래된 나노바디 또한 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. 단일 도메인 항체의 예는 sdAb, 나노바디 또는 단일 가변 도메인 항체로 지칭된다. (단일 도메인 mAb)2는 따라서 VH, VL, VHH 및 VNAR를 포함하는 군으로부터 개별적으로 선택되는 (적어도) 2개의 단일 도메인 단클론 항체 구축물로 구성되는 단클론 항체 구축물이다. 링커는 바람직하게는 펩티드 링커의 형태이다. 유사하게, "scFv-단일 도메인 mAb"는 위에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 단일 도메인 항체 및 위에 기술된 바와 같은 하나의 scFv 분자로 구성되는 단클론 항체 구축물이다. 또한, 링커는 바람직하게는 펩티드 링커의 형태이다.
일 구현예에 따르면, sBCMA에 결합하는 항체 또는 항체 구축물은 1개 이상의 폴리펩티드 또는 단백질의 형태이다. 단백질성 부분 이외에도, 이러한 폴리펩티드 및 단백질은 비 단백질성 부분(예를 들어, 글루타르알데히드와 같은 화학적 링커 또는 화학적 가교제)을 포함할 수 있다.
펩티드는 공유적 펩티드(아미드) 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체의 짧은 사슬이다. 따라서, 펩티드는 생물학적 올리고머 및 중합체의 광범위한 화학적 부류에 속한다. 펩티드 또는 폴리펩티드 쇄의 일부인 아미노산은 "잔기"라 지칭되고, 연속하여 넘버링될 수 있다. 고리형 펩티드를 제외한 모든 펩티드는 펩티드의 한쪽 말단에 N 말단 잔기와 나머지 말단에 C 말단 잔기를 갖는다. 올리고펩티드는 오로지 소수의 아미노산(보통 2 내지 20개)으로 구성된다. 폴리펩티드는 더 긴, 연속적인, 비 분지형의 펩티드 사슬이다. 펩티드는 크기를 기준으로 단백질과 구별되며, 임의의 기준으로 약 50개 이하의 아미노산을 함유하는 것으로 이해될 수 있다. 단백질은 일반적으로 생물학적 기능 방식으로 배열된 1개 이상의 폴리펩티드로 구성된다. 펩티드 대 폴리펩티드 및 단백질에 적용되는 실험실 기법의 측면은 다르지만(예를 들어, 전기영동, 크로마토그래피 등의 세부 사항), 펩티드를 폴리펩티드 및 단백질로부터 구별하는 크기 경계는 절대적이지 않다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 용어 "폴리펩티드"가 종종 바람직하다.
폴리펩티드는 추가로 다량체, 예를 들어 이량체, 삼량체 및 더 고차의 올리고머를 형성할 수 있고, 이들은 1개 초과의 폴리펩티드 분자로 구성된다. 이러한 이량체, 삼량체 등을 형성하는 폴리펩티드 분자는 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 이러한 다량체의 상응하는 더 고차의 구조는, 결과적으로 호모- 또는 헤테로이량체, 호모- 또는 헤테로삼량체 등으로 지칭된다. 헤테로다량체의 예는, 이의 천연 유래 형태에서 2개의 동일한 폴리펩티드 경쇄 및 2개의 동일한 폴리펩티드 중쇄로 구성되는 항체 또는 면역글로불린 분자이다. 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 또한 천연적으로 변형된 펩티드/폴리펩티드/단백질을 지칭하는데, 여기에서 변형은, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등과 같은 번역 후 변형에 의해 달성된다. "펩티드", "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 본 명세서에서 지칭될 때 페길화(pegylated)와 같이 화학적으로 변형될 수도 있다. 이러한 변형은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 본 명세서에서 이하에 기술된다.
용어 "(특이적으로 또는 면역특이적으로) 결합한다", "(특이적으로 또는 면역특이적으로) 인식한다", 또는 "(특이적으로 또는 면역특이적으로) 반응한다"는 본 발명에 따르면 항체, 항체 구축물 또는 결합 도메인이 표적 분자(항원), 본 명세서에서는 sBCMA 상의 주어진 에피토프와 상호작용하거나 (면역)특이적으로 상호작용함을 의미한다. 이러한 상호작용 또는 결합은 대안적인 물질(비 표적 분자)에 대해서보다 특이적인 표적 상의 에피토프에 대해 더 자주, 더 빠르게, 더 긴 지속기간으로, 더 큰 친화도로, 또는 전술한 것들의 일부 조합으로 일어난다. 그러나 상이한 종의 상동 단백질 사이에서의 서열 유사성으로 인해, 표적(예컨대, 인간 표적)에 면역특이적으로 결합하는 항체, 항체 구축물 또는 결합 도메인은 상이한 종(예컨대, 비 인간 영장류)으로부터의 상동성 표적 분자와 교차 반응할 수 있다. 따라서, 용어 "특이적/면역특이적 결합"은 하나를 초과하는 종의 에피토프 또는 구조적으로 관련된 에피토프에 대한 항체, 항체 구축물 또는 결합 도메인의 결합을 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "에피토프"는 결합 도메인, 항체 또는 항체 구축물에 의해 인식/면역특이적으로 인식되는 항원의 부분 또는 영역을 지칭한다. "에피토프"는 항원성이며, 따라서 용어 에피토프는 때때로 "항원 구조" 또는 "항원 결정기"로도 지칭된다. 에피토프에 결합하는 결합 도메인, 항체 또는 항체 구축물의 부분은 파라토프라 불린다. 특이적 결합은 결합 도메인, 항체 또는 항체 구축물 및 항원의 아미노산 서열에서 특이적 모티프에 의해 달성될 것으로 여겨진다. 따라서, 결합은 이들의 1차, 2차 및/또는 3차 구조의 결과뿐만 아니라 상기 구조의 잠재적인 2차 변형의 결과로서 달성된다. 파라토프와 이의 항원 결정기와의 특이적 상호작용은 항원에 대한 상기 부위의 단순한 결합을 초래할 수 있다. 일부 경우, 특이적 상호작용은 대안적으로 또는 추가적으로, 예를 들어, 항원의 입체형태 변화, 항원의 올리고머화 등의 유도에 기인하여 신호의 개시를 초래할 수 있다.
단백질 항원의 에피토프는 구조 및 파라토프와의 상호작용에 기초하여 두 개의 카테고리, 입체형태 에피토프 및 선형 에피토프로 나뉜다. 입체형태 에피토프는 항원의 아미노산 서열의 불연속적인 부분으로 구성된다. 이러한 에피토프는 항원의 3차원적 표면 특징 및 형상 또는 3차 구조(접힘)에 기초하여 파라토프와 상호작용한다. 에피토프의 입체형태를 결정하는 방법은 x-선 결정학, 2차원 핵 자기 공명(2D-NMR) 분광학 및 부위 지정 스핀 표지법 및 전자 상자성 공명(electron paramagnetic resonance: EPR) 분광학을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다. 대조적으로, 선형 에피토프는 1차 구조에 기초하여 파라토프와 상호작용한다. 선형 에피토프는 항원으로부터의 아미노산의 연속적인 서열에 의해 형성되고, 독특한 서열에서 전형적으로 적어도 3 또는 적어도 4, 그리고 더욱 일반적으로는 적어도 5 또는 적어도 6 또는 적어도 7, 예를 들어, 약 8 내지 약 10개의 아미노산을 포함한다.
BCMA 에피토프 맵핑을 위한 방법은 다음에 기술된다: 인간 BCMA 단백질의 세포 외 도메인 내의 사전 정의된 영역(보통 인접 아미노산 스트레치)이 또 다른 종(예컨대, 마우스, 그러나 항체가 종과 교차반응성을 나타내지 않는 한, 다른 종도 예상할 수 있음)의 BCMA의 상응하는 영역으로 교환/교체된다. 이러한 인간 BCMA/마우스(또는 기타 종) BCMA 키메라는 숙주 세포(예컨대, CHO 세포)의 표면에서 발현될 수 있다. 항체 또는 항체 구축물의 결합은 FACS 분석에 의해 테스트될 수 있다. 키메라 분자에 대한 항체 또는 항체 구축물의 결합이 완전히 폐지되거나 현저한 결합 감소가 관찰될 때, 이 키메라 분자에서 제거된 인간 BCMA의 영역이 면역특이적 에피토프-파라토프 인식과 관련이 있다고 결론지을 수 있다. 상기 결합의 감소는, 인간 BCMA에 대한 결합이 100%로 설정되는 인간(야생형) BCMA에 대한 결합과 비교하여, 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%; 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 또는 80%, 가장 바람직하게는 90%, 95% 또는 심지어는 100%이다. 대안적으로, 위에 기술된 에피토프 맵핑 분석은 BCMA의 서열로 1개 이상의 점 돌연변이를 도입함으로써 변형될 수 있다. 이러한 점 돌연변이는 예를 들어, 인간 BCMA와 마우스(또는 기타 종) BCMA 사이의 차이를 반영할 수 있다.
항체, 항체 구축물 또는 결합 도메인에 의한 인식에 대한 표적 항원의 특정 잔기의 기여도를 결정하는 추가의 방법은 알라닌 스캐닝(예를 들어, Morrison KL & Weiss GA. Curr Opin Chem Biol. 2001 Jun;5(3):302-7 참고)으로, 여기서 분석되는 각각의 잔기는 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발을 통해, 알라닌으로 교체된다. 알라닌은 부피가 크지 않고, 화학적으로 불활성인, 메틸 작용기(그럼에도 불구하고 다수의 다른 아미노산이 보유하는 2차 구조 기준을 모방함) 덕분에 사용된다. 때때로, 발린 또는 류신과 같이 부피가 큰 아미노산은 돌연변이된 잔기의 크기 보존이 요망되는 경우에 사용될 수 있다.
단클론 항체(또는 항체 구축물)과 표적 항원의 에피토프 사이의 상호작용은 가변 영역이 에피토프/표적 항원(본 명세서에서 sBCMA)에 대해서 주목할 만한 또는 유의미한 친화도를 나타내고, 일반적으로, 위에서 논의된, 예를 들어, 다른 종으로부터의, 상동성 표적과의 교차반응성에도 불구하고, 표적 항원(본 명세서에서 sBCMA) 이외의 단백질 또는 항원에 대해서 유의미한 친화도를 나타내지 않는다는 것을 의미한다. "유의미한 친화도"는 약 10-6 M 이하의 친화도(해리 상수, KD)를 갖는 결합을 포함한다. 바람직하게는, 결합 친화도가 약 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M 이하일 때 결합이 특이적인 것으로 고려된다. 따라서, 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)는 약 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M 이하의 sBCMA에 대한 친화도(KD)를 갖는 것이 고려된다. 이러한 값은 바람직하게는 표면 플라스몬 공명 분석, 예컨대, 비아코어(Biacore) 분석에서 측정된다. 실시예 3 참고.
단클론 항체(또는 항체 구축물)가 표적과 (면역)특이적으로 반응하거나 이에 결합하는지는 예를 들어, 원하는 표적 단백질 또는 항원에 대한 상기 항체의 친화도를 비 표적 단백질 또는 항원(본 명세서에서 sBCMA 이외의 단백질)에 대한 상기 항체의 친화도와 비교하여, 용이하게 테스트할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)는, 추가의 표적에 대한 임의의 추가의 결합 도메인(들)이 본 발명의 항체/항체 구축물에 의도적으로 도입되지 않는 한, sBCMA 이외의 단백질 또는 항원에 유의미하게 결합하지 않는다. 용어 "유의미하게 결합하지 않는다"는 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)이 sBCMA 이외의 단백질 또는 항원에 결합하지 않음을 의미한다. 따라서, 항체 구축물은 sBCMA에 대한 결합이 100%로 설정되는 sBCMA 이외의 단백질 또는 항원과 30% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 더욱 바람직하게는 10% 이하, 특히 바람직하게는 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 반응성을 보여준다. "반응성"은 예를 들어, 친화도 값으로 표현될 수 있다(위 참고). 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)는 인간 BAFF-R 및/또는 인간 TACI에 결합하지 않거나, 또는 이에 유의미하게 결합하지 않거나, 이와 상호작용하거나, 이를 인식하거나, 이에 면역특이적으로 결합하거나, 또는 이와 교차 반응하지 않음이 고려된다.
본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)는 "시험관 내 생성된 항체/항체 구축물" 및/또는 "재조합 항체/항체 구축물"일 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "시험관 내 생성된"은 위의 정의에 따른 항체/항체 구축물을 지칭하는데, 여기에서 가변 영역의 전부 또는 일부(예를 들어, 적어도 하나의 CDR)는 비 면역 세포 선택에서, 예를 들어, 시험관 내 파지 디스플레이에서, 단백질 칩 상에서 또는 후보 아미노산 서열을 항원에 결합하는 그들의 능력에 대해 테스트할 수 있는 임의의 다른 방법에서 생성된다. 따라서, 이 용어는 바람직하게는 동물에서 면역 세포의 게놈 재배열에 의해서만 생성되는 서열을 제외한다. 항체(또는 항체 구축물)는 파지 디스플레이 또는 라이브러리 스크리닝 방법에 의해 또는 이미 존재하는 (단클론) 항체로부터의 CDR 서열을 스캐폴드에 접합시켜 생산되거나 얻어질 수 있을 것으로 고려된다. "재조합 항체/항체 구축물"은 (그 중에서도) 재조합 DNA 기술 또는 유전 공학을 이용하여 생성되거나 생산된 항체/항체 구축물이다.
본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 바람직한 유형의 아미노산 치환 변이는 모 항체 구조의 초가변 영역 내의 하나 이상의 잔기들을 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가적인 개발을 위해 선택되는 생성된 변이체(들)는 이들이 생성된 모 항체 구조에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하기 위한 편리한 방식은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙을 포함한다. 간략하게는, 초가변 영역의 몇몇 부위(예를 들어, 6 또는 7개의 부위)가 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 변이체는 각각의 입자 내에서 패키징된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합물로서 섬유상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파지 디스플레이된 변이체는 본 명세서에 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 항원 결합에 상당히 기여하는 후보 초가변 영역 부위(변형을 위한 후보)를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발이 또한 수행될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항체/항체 구축물 결합 도메인과 이의 특이적인 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위하여, 항원 및 항체/항체 구축물 또는 결합 도메인 사이의 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 이로울 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 본 명세서에서 상술한 기법에 따른 치환에 대한 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널은 본 명세서에 기술되는 바와 같이 스크리닝을 거치고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체, 이들의 항원 결합 단편, 항체 구축물 또는 결합 도메인이 추가 개발을 위해 선택될 수 있다.
본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 한편, 이들이 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 쇄(들)의 나머지가 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체뿐만 아니라 이러한 항체의 단편 또는 변이체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인, "키메라" 버전을 포함한다(미국 특허 번호 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). 본 명세서에서 관심 대상의 키메라 항체, 항체 구축물 또는 결합 도메인은 예를 들어, 비 인간 영장류(예를 들어, 긴 꼬리 원숭이, 유인원 등) 및 인간 불변 영역 서열로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다. 키메라 항체 또는 항체 구축물을 제조하기 위한 다양한 접근법이 기술된 바 있다. 예컨대, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., 미국 특허 번호 4,816,567; Boss et al., 미국 특허 번호 4,816,397; Tanaguchi et al., EP 0171496; EP 0173494; 및 GB 2177096 참고.
"인간화" 단클론 항체, 이의 변이체 또는 단편, 항체 구축물 및 결합 도메인은 비 인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열(들)을 함유하는 대부분 인간 서열의 면역글로불린을 기반으로 한다. 대개, 인간화 항체, 이의 변이체 또는 단편, 항체 구축물 및 결합 도메인은 초가변 영역 또는 CDR이 원하는 특이성, 친화도, 능력 및/또는 생물학적 활성을 갖는 비 인간 종(공여자 항체), 예컨대, 설치류(예를 들어, 마우스, 햄스터, 래트 또는 토끼)의 초가변 영역 또는 CDR로부터의 잔기로 교체되는 인간 면역글로불린(수용자 항체)를 기반으로 한다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상응하는 비 인간 잔기로 교체된다. 더 나아가, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "인간화" 항체, 이의 변이체 또는 단편, 항체 구축물 및 결합 도메인은 또한 수용자 항체에서도 공여자 항체에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하고 최적화하기 위해 이루어진다. 인간화 항체, 이의 변이체 또는 단편, 항체 구축물 및 결합 도메인은 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인, 면역글로불린 불변 영역(예를 들어 Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 추가 세부 사항은 Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992) 참고.
인간화 항체, 이의 변이체 또는 단편, 항체 구축물 및 결합 도메인은 항원 결합에 직접적으로 수반되지 않는 (Fv) 가변 영역의 서열을 인간 (Fv) 가변 영역으로부터의 동등한 서열로 교체함으로써 생성될 수 있다. 이러한 분자를 생성하는 예시적인 방법은 Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; 및 US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 5,859,205; 및 US 6,407,213에서 제공된다. 이들 방법은 중쇄 또는 경쇄 중 적어도 하나로부터의 면역글로불린 (Fv) 가변 영역의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열을 단리하고, 조작하고 발현시키는 것을 포함한다. 이러한 핵산은 위에 기술한 바와 같이, 사전 결정된 표적에 대해서뿐만 아니라 다른 공급원으로부터의 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 얻을 수 있다. 그런 다음, 인간화 항체, 이의 변이체 또는 단편, 항체 구축물 또는 결합 도메인을 암호화하는 재조합 DNA는 적절한 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
인간화 항체, 이의 변이체 또는 단편, 항체 구축물 및 결합 도메인은 또한 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현하지만, 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 없는 마우스와 같은 유전자이식 동물을 사용하여 생산될 수 있다. Winter는 본 명세서에 기술되는 인간화 분자를 제조하는 데 사용될 수 있는 예시적인 CDR 접합 방법을 기술한다(미국 특허 번호 5,225,539). 특정 인간 서열의 모든 CDR은 비 인간 CDR의 적어도 일부로 교체될 수 있거나, 단지 일부의 CDR이 비 인간 CDR로 교체될 수 있다. 단지 사전 결정된 항원에 대한 인간화 분자의 결합에 요구되는 수의 CDR을 교체하는 것이 필요하다.
인간화 항체, 이의 변이체 또는 단편, 항체 구축물 또는 결합 도메인은 보존적 치환, 공통 서열 치환, 생식계열 치환 및/또는 복귀 돌연변이의 도입에 의해 최적화될 수 있다. 이러한 변경된 면역글로불린 분자는 당해 분야에 공지된 여러 가지 기법 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, 및 EP 239 400).
일 구현예에 따르면, 단클론 항체(또는 항체 구축물)는 "토끼"이다. 용어 "토끼 항체", "토끼 항체 구축물" 및 "토끼 결합 도메인"은 각각 당해 분야에 공지된 토끼 생식계열 면역글로불린 서열에 실질적으로 상응하는 가변 및 불변 영역 또는 도메인과 같은 항체 유래 영역을 갖는, 항체, 항체 구축물 및 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 토끼 항체 구축물 또는 결합 도메인은, 예를 들어 CDR에서, 그리고 특히 CDR3에서 토끼 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의하거나 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 토끼 항체, 항체 구축물 또는 결합 도메인은 토끼 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기로 교체되는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 위치를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 토끼 항체, 항체 구축물 및 결합 도메인의 정의는 또한 비 인공적으로 및/또는 유전적으로 변경된 토끼 서열의 항체만을 포함하는 완전 토끼 항체, 항체 구축물 및 결합 도메인을 고려한다.
본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)는 "단리된" 또는 "실질적으로 순수한" 항체임이 고려된다. 본 명세서에 기술되는 항체를 기술하기 위해 사용될 때, "단리된" 또는 "실질적으로 순수한"은 이의 생산 환경의 구성요소로부터 확인, 분리 및/또는 회수된 항체를 의미한다. 바람직하게는, 항체는 이의 생산 환경으로부터의 모든 다른 구성요소와 관련이 없거나 실질적으로 없다. 이의 생산 환경의 오염성 구성요소, 예를 들어 재조합 형질감염 세포로부터 초래된 것은 항체(또는 항체 구축물)에 대한 진단 용도를 방해할 수 있는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비 단백질성 화합물을 포함할 수 있다. 단리된 또는 실질적으로 순수한 항체(또는 항체 구축물)는 환경에 따라, 주어진 샘플 중 총 단백질/폴리펩티드 함량의 5 내지 99.9 중량%를 구성할 수 있음이 이해된다. 원하는 항체(또는 항체 구축물)는 유도성 프로모터 또는 고 발현 프로모터의 사용을 통해 현저히 더 높은 농도로 생산될 수 있다. 본 정의는 당해 분야에 공지된 매우 다양한 유기체 및/또는 숙주 세포에서의 항체(또는 항체 구축물)의 생산을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 (1) 스피닝 컵 서열분석장치(sequenator)의 사용에 의해 N 말단의 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는, 바람직하게는 은 염색을 사용하는 비 환원 또는 환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 균질성 정도로 정제될 것이다. 그러나 보통 단리된 항체 또는 항체 구축물은 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)는 가용성 BCMA(sBCMA)에 결합한다. "가용성 BCMA"는 막 결합 BCMA의 절단된 단편이다. 절단은 예를 들어, 세크레타제를 통해 일어나고, 탈락된 BCMA(sBCMA)가 세포 표면으로부터 방출된다. 가용성 BCMA 수준은 보통 건강한 개체에 비해 MM 환자에서 증가되지만, 다른 질환을 앓는 환자에서도 증가된다. 나아가, 환자 혈청의 sBCMA 수준은 질환 상태 및 예후와 관련이 있을 수 있다. 또한, sBCMA의 수준은 BCMA 과발현 또는 증가된 sBCMA 수준과 관련된 질환의 성공적인 요법 후에 현저히 감소될 수 있다. sBCMA는 인간 sBCMA인 것으로 고려된다. 전체(막 결합) 인간 BCMA 분자(B 세포 성숙 항원, TNFRSF17, CD269)의 아미노산 서열은 서열번호 33에 제시되어 있으며, 인간 BCMA의 세포 외 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 34에 제시되어 있다. 또한, 이 서열은 탈락된 또는 가용성 BCMA에 해당한다. 즉, sBCMA는 서열번호 34에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것으로 고려된다.
용어 "~의 존재 하에 결합이 일어난다"는, 본 발명의 맥락에서, 동일한 표적(본 명세서에서 sBCMA)에 대한 2개(또는 그 이상)의 항체(또는 항체 구축물)의 동시 결합이 있음을 의미한다. 즉, 2개(또는 그 이상)의 항체(또는 항체 구축물)는 표적(본 명세서에서 sBCMA)에 대한 결합을 위해 (서로) 경쟁하지 않거나 또는 유의미하게 경쟁하지 않는다. 일 구현예에 따르면, 이것은 또한 하나의 단클론 항체(또는 항체 구축물)가 제2 단클론 항체 또는 항체 구축물(또는 덧붙여, 제3 항체 또는 항체 구축물의, 아래 참고)의 sBCMA 에피토프와 상이한 sBCMA 에피토프에 결합함을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, sBCMA에 대한 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 결합은, sBCMA에 결합하는 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 존재 하에 일어나는 것 외에도, sBCMA에 결합하는 제3 항체 또는 항체 구축물의 존재 하에 일어난다. 이 제3 항체 또는 항체 구축물은 BCMA의 세포 외 도메인에 결합하는 치료적 항체 또는 항체 구축물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제3 항체 또는 항체 구축물은 BCMA의 에피토프 클러스터 3에 결합한다. 더욱 바람직하게는, 제3 항체 또는 항체 구축물은 인간 BCMA의 에피토프 클러스터 3에 결합한다. 인간 BCMA의 에피토프 클러스터 3에 대한 아미노산 서열은 서열번호 35에 제시되어 있다. BCMA의 상기 에피토프 클러스터 3에 결합하는 도메인을 갖는 항체 구축물은 WO 2013/072406에 자세히 기술되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 이러한 항체 구축물은 매우 유익한 에피토프/활성 관계를 갖는 것으로 나타났다. 본 발명의 "제3 항체 또는 항체 구축물"은 WO 2013/072406에서 청구된 바와 같이 BCMA에 결합하며 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역 및 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 도메인을 포함하는 것으로 고려된다. 또한, WO 2013/072406의 청구범위에서 개시된 바와 같이 BCMA에 결합하며 VH 영역 및/또는 VL 영역을 포함하는 도메인을 포함하는 것으로 고려된다. 또한, WO 2013/072406에 개시되고 청구된 바와 같이 BCMA에 결합하는 도메인 및 CD3에 결합하는 도메인(예컨대 인간 CD3, 바람직하게는 CD3-엡실론 또는 인간 CD3-엡실론)을 포함하는 것으로 고려된다. 또한, WO 2013/072406에서 정의되고 청구된 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, WO 2013/072406에서 정의되고 청구된 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하는 것이 고려된다.
(인간) CD3에 대한 또는 특이적으로 CD3 엡실론에 대한 항체(또는 이중특이적 항체 구축물)는 당해 분야에 공지되어 있으며, 이들의 CDR, VH 및 VL 서열은 본 발명의 "제1", "제2" 또는 "제3" 항체/항체 구축물의 제2 결합 도메인의 기초로 작용할 수 있다. 예를 들어, Kung et al.은 1979년에 인간 T 세포에서 CD3(구체적으로, CD3의 엡실론 쇄)을 인식하는 최초의 mAb인 OKT3(Ortho Kung T3)의 개발을 보고하였다. OKT3(무로모납)은 인간의 치료법에 이용 가능하게 된 뮤린 기원의 최초의 단클론 항체였다. 더 새로운 항-CD3 단클론 항체에는 오텔릭시주맙(TRX4), 테플리주맙(MGA031), 포랄루맙 및 비실리주맙이 포함되며, 이들 모두는 CD3의 엡실론 쇄를 표적으로 한다. (암) 표적 및 CD3에 대한 이중특이적 항체 구축물도 개발되고 있어 (전)임상 테스트되고 있으며, 이들의 CD3 결합 도메인(CDR, VH, VL)은 본 발명의 제1, 제2, 또는 제3 항체/항체 구축물의 제2 결합 도메인의 기초로 작용할 수 있다. 예로는 블리나투모맙, 솔리토맙(MT110, AMG 110), 카투막소맙, 두보툭시주맙(Duvortuxizumab), 에르툭막소맙(Ertumaxomab), 모수네투주맙(Mosunetuzumab), FBTA05(Bi20, TPBs05), CEA-TCB(RG7802, RO6958688), AFM11, 및 MGD006(S80880)이 포함되나 이에 한정되지 않는다. CD3 결합 도메인의 다른 예는 예를 들어, US 7,994,289 B2, US 7,728,114 B2, US 7,381,803 B1, US 6,706,265 B1에 개시되어 있다.
나아가, 본 발명의 제3 항체 구축물은 본 명세서에 기술된 BCMA에 결합하는 도메인, 본 명세서에 기술된 CD3에 결합하는 도메인, 및 항체 구축물의 반감기 연장을 제공하는 도메인을 포함하는 것이 고려된다. 이 후자의 도메인은 각각 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 폴리펩티드 단량체를 포함할 수 있고, 상기 2개의 폴리펩티드 단량체는 펩티드 링커를 통해 서로 융합된다. 이러한 항체 구축물 및 HLE 도메인은 WO 2017/134134에 자세히 기술되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.
추가의 구현예에서, "제3 항체 또는 항체 구축물"은 다음의 아미노산 서열을 갖는 것으로 WO 2014/089335에 개시된 항체/항체 구축물이다: WO 2014/089335의 VH-CDR(서열번호 4 내지 6), VL-CDR(서열번호 106 내지 108), VH(서열번호 206), VL(서열번호 240). 따라서, 제3 항체 또는 항체 구축물은 WO 2014/089335의 서열번호 4에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 5에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 WO 2014/089335의 서열번호 107에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 107에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 108에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함할 수 있다. 또한, WO 2014/089335의 서열번호 206에 제시된 바와 같은 VH 영역, 또는 WO 2014/089335의 서열번호 240에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함할 수 있다. 또한, 제3 항체 또는 항체 구축물은 본 명세서의 위에서 정의된 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 본 명세서의 위에서 정의된 항체(즉, WO 2014/089335로부터 언급된 서열을 갖는 항체)와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁할 수 있다.
본 발명의 단클론 항체/항체 구축물은 (a) 토끼 VH 영역, (b) 토끼 VL 영역 또는 (c) 토끼 VH 영역 및 토끼 VL 영역을 포함하는 것이 고려된다. 나아가, 전체 단클론 항체는 토끼 항체일 수 있다. 따라서, 항체/항체 구축물 그 자체의 가변 영역은 토끼에서 유래된다. 용어 "토끼 항체", "토끼 항체 구축물", "토끼 결합 도메인" 및 "토끼 VH/VL 영역"은 각각 당해 분야에 공지된 토끼 생식계열 면역글로불린 서열에 실질적으로 상응하는 가변 및 불변 영역 또는 도메인과 같은 항체 유래 영역을 포함하는, 항체, 항체 구축물, 결합 도메인 및 VH/VL 영역을 포함한다. 본 발명의 토끼 항체, 항체 구축물 또는 결합 도메인은 예를 들어, CDR에서, 특히 CDR3에서 토끼 생식계열 면역글로불린 서열에 의해서 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해서 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해서 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 토끼 항체, 항체 구축물 및 결합 도메인의 정의는 또한 비 인공적으로 및/또는 유전적으로 변경된 토끼 서열의 항체만을 포함하는 완전 토끼 항체, 항체 구축물, VH/VL 영역 및 결합 도메인을 고려한다. 이들은 예를 들어, 당해 분야에 공지된 표준 기법을 이용하여, 토끼를 이용한 면역화 캠페인에 의해 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 단클론 항체는 토끼 VH 영역 및/또는 토끼 VL 영역 및 sBCMA 검출 시스템의 요건 및 설계에 따라, 예를 들어, 토끼 불변 영역(예컨대, 서열번호 31의 예시적인 토끼 중쇄 불변 영역 또는 서열번호 32의 예시적인 토끼 경쇄 불변 영역), 또는 다른 종(인간, 마우스, 래트, 햄스터, 염소 등)으로부터의 불변 영역인, 항체 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단클론 항체 또는 항체 구축물은 다음을 포함한다:
a) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 3에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 5에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역;
b) 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 13에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 16에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역; 또는
c) 서열번호 21에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 23에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 24에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 25에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 26에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역.
나아가, 본 발명의 단클론 항체가 위의 a), b), 또는 c)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프와 결합하거나, 또는 위의 a), b), 또는 c)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁함이 고려된다.
항체, 항체 구축물 또는 결합 도메인이 또 다른 주어진 항체, 항체 구축물 또는 결합 도메인과 sBCMA(또는 BCMA의 세포 외 도메인)의 동일한 에피토프에 결합하는지는 상이한 분석법, 예를 들어, WO 2013/072406에 기술된 바와 같은 키메라 또는 돌연변이된 BCMA 분자를 이용한 에피토프 맵핑에 의해, 측정할 수 있다. 에피토프를 결정하는 다른 방법, 예컨대, 알라닌 스캐닝(예를 들어, Morrison KL & Weiss GA. Curr Opin Chem Biol. 2001 Jun;5(3):302-7 참고)이 본 명세서에 기술되는데, 알라닌 스캐닝에서 분석되는 표적 아미노산 서열 내의 각각의 잔기는 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이 유발을 통해, 알라닌으로 교체된다. 알라닌은 부피가 크지 않고, 화학적으로 불활성인, 메틸 작용기(그럼에도 불구하고 다수의 다른 아미노산이 보유하는 2차 구조 기준을 모방함) 덕분에 사용된다. 때때로, 발린 또는 류신과 같이 부피가 큰 아미노산은 돌연변이된 잔기의 크기 보존이 요망되는 경우에 사용될 수 있다. 아미노산의 체계적인 돌연변이를 표적 단백질의 서열에 도입하고 각 돌연변이된 단백질에 대한 항체의 결합을 테스트하여 에피토프를 포함하는 아미노산을 확인하는 이 방법은 "부위 지정 돌연변이 유발"이라고도 한다. 표적 항원에 항체 에피토프를 맵핑하는 데 이용할 수 있는 다른 방법은 고처리량 샷건 돌연변이 유발 에피토프 맵핑, 가교 결합 커플링된 질량분석법, X선 공결정학, 극저온 전자 현미경, 및 수소-중수소 교환이다.
항체 또는 항체 구축물이 또 다른 주어진 항체 또는 항체 구축물과 항원(예컨대, BCMA 또는 sBCMA)에 대한 결합을 위해 경쟁하는지는 경쟁적 ELISA와 같은 경쟁 분석에서 측정할 수 있다. 아비딘 커플링된 마이크로입자(비드)가 또한 사용될 수 있다. 아비딘 코팅된 ELISA 플레이트와 유사하게, 비오틴 결합 단백질과 반응할 때, 각각의 이들 비드는 분석이 수행될 수 있는 기질로서 사용될 수 있다. 항원은 비드 상에 코팅되고, 다음에 제1 항체로 사전 코팅된다. 제2 항체를 첨가하고, 임의의 추가적인 결합을 결정한다. 판독은 유세포 분석법을 통해서 수행한다. 자연적으로 BCMA를 발현하는 세포 또는 안정적으로 또는 일시적으로 BCMA로 형질전환된 세포를 이용하는 세포 기반의 경쟁 분석법이 이용될 수 있다. 나아가, 본 발명의 실시예 2b)는 sBCMA에 대한 결합에 대한 2개의 항체/항체 구축물 사이의 경쟁을 결정하는 데에도 사용될 수 있는 옥텟(Octet) 경쟁 분석법을 기술한다. 본 발명의 맥락에서 용어 "경쟁을 위해 결합한다"는 위에 개시된 분석법 중 임의의 하나에 의해 결정할 때, 2개의 테스트한 항체 사이에서 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의 경쟁이 일어남을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단클론 항체는
a) 서열번호 7, 17 또는 27 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 VH 영역;
b) 서열번호 8, 18 또는 28 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 VL 영역;
c) 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VL 영역;
d) 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 18에 제시된 바와 같은 VL 영역;
e) 서열번호 27에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL 영역;을 포함하거나,
또는 본 발명의 단클론 항체는
f) c)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 c)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하거나;
g) d)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 d)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하거나; 또는
h) e)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 e)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁한다.
본 발명의 단클론 항체(또는 "제1 단클론 항체") 및/또는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 제2 단클론 항체는 샘플의 sBCMA에 결합하는 것으로 고려된다. 일 구현예에 따르면, 이 샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 일 구현예에 따르면, 샘플은 인간의 샘플, 예를 들어, 인간의 생물학적 샘플이다. 생물학적 샘플은 (인간) 혈청 샘플, 혈장 샘플, 혈액 샘플, 골수 샘플 또는 조직 샘플일 수 있다. 또한, 샘플은 (인간) 골수 단핵구 세포 또는 (인간) 말초 혈액 단핵구 세포의 세포 배양물로부터 얻은 상청액일 수 있다. 샘플은 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환을 앓는 것으로 의심되거나 앓는(진단된) 대상체, 예를 들어, 인간 대상체, 또는 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환에 대한 치료를 받은 대상체로부터 얻을 수 있다.
"혈액"은 영양소와 산소 같은 필수 물질을 세포에 전달하고 대사성 노폐물을 동일한 세포로부터 멀리 운송하는 인간과 다른 동물의 체액이다. 척추 동물에서, 혈액은 혈장에 현탁된 혈액 세포로 구성된다. "혈장"은 여러 유형의 혈액 세포가 현탁된 혈액의 액체 구성성분이다. 혈장은 대부분 물이며, 용해된 단백질(예컨대, 혈청 알부민, 글로불린, 피브리노겐, 및 기타), 글루코스, 응고 인자, 전해질, 호르몬, 이산화탄소 및 산소를 함유한다. "혈청"은 응고 인자가 없는 혈장이다. 따라서 혈청에는 응고에 사용되지 않는 모든 혈장 단백질이 포함된다. "골수"는 뼈의 해면질 또는 해면골 부분에서 발견될 수 있는 반고체 조직이다. "조직"은 세포와 완전한 기관 사이의 세포의 유기적 수준이다. 조직은 특정 기능을 함께 수행하는 동일한 기원의 유사한 세포와 이들의 세포 외 기질의 집합체이다. 이어서, 기관은 여러 조직을 함께 기능적으로 집단화하여 형성된다.
본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 공유적 변형 또한 본 발명의 범주 내에 포함되고, 일반적으로, 항상은 아니지만, 번역 후에 행해진다. 예를 들어, 항체의 몇 가지 유형의 공유적 변형은 항체의 특정 아미노산 잔기를 선택된 측쇄나 N 또는 C 말단 잔기와 반응시킬 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자 내로 도입된다. 이작용성 작용제로의 유도체화는 다양한 방법, 특히 검출 방법에서 사용하기 위한 수불용성 지지체 기질 또는 표면에 본 발명의 항체를 가교시키는 데 유용하다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 빈번하게 탈아미드화된다. 대안적으로, 이들 잔기는 약간 산성인 조건 하에 탈아미드화된다. 이들 잔기 중 어느 하나의 형태는 본 발명의 범주 내에 속한다. 다른 변형은 프롤린과 리신의 수산화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), N 말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C 말단 카복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명에 따르면, 단클론 항체(또는 항체 구축물), "제1" 단클론 항체(또는 항체 구축물) 및/또는 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)은 검출 가능한 표지에 커플링된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 단클론 항체의 공유적 변형은 하나 이상의 표지, 예컨대, 검출 표지의 첨가를 포함한다. 표지 또는 표지기는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 암을 통해 항체물에 커플링될 수 있다. 단백질을 표지하는 다양한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있다. 용어 "표지" 또는 "표지기"은 임의의 검출 가능한 표지를 지칭한다. 일반적으로, 표지는 이들이 검출되는 분석에 따라 다양한 부류에 속하며 - 다음의 예를 포함하지만, 이로 한정되지 않는다:
a) 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종과 같은 방사성 또는 중 동위원소일 수 있는 동위원소 표지(예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)
b) 자성 표지(예를 들어, 자성 입자)
c) 산화환원 활성 모이어티
d) 광학 염료(발색단, 인광체 및 형광체를 포함하지만, 이로 한정되지 않음), 예를 들어 형광기(예를 들어, FITC, 로다민, 란탄족 인광체), 화학발광기, 및 "소분자" 형광 또는 단백질성 형광 중 하나일 수 있는 형광단
e) 효소기(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리 포스파타아제)
f) 비오틴이 결합된 기
g) 2차 리포터에 의해 인식되는 사전 결정된 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등)
"형광 표지"는 이의 고유 형광 특성을 통해 검출될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 적합한 형광 표지는 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린(Malacite green), 스틸벤, 루시퍼 옐로(Lucifer Yellow), 캐스케이드 블루제이(Cascade BlueJ), 텍사스 레드(Texas Red), 이아에단스(IAEDANS), 에단스(EDANS), 보디피 FL(BODIPY FL), LC 레드 640, Cy 5, Cy 5.5, LC 레드 705, 오리건 그린(Oregon green), 알렉사-플루오르(Alexa-Fluor) 염료(알렉사 플루오르 350, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680), 캐스케이드 블루, 캐스케이드 옐로 및 R-피코에리트린(PE)(Molecular Probes, 미국 오리건 주 유진 소재), FITC, 로다민 및 텍사스 레드(Pierce, 미국 일리노이 주 락포드 소재), Cy5, Cy5.5, Cy7(Amersham Life Science, 미국 펜실베이니아 주 피츠버그 소재)을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다. 형광단을 포함하는 적합한 광학 염료는 Richard P. Haugland에 의해 Molecular Probes Handbook에 기술되어 있다.
또한, 적합한 단백질성 형광 표지는 레닐라(Renilla) 종, 프틸로사르쿠스(Ptilosarcus) 종 또는 에쿼리아(Aequorea) 종의 GFP(Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP(Clontech Laboratories, Inc., Genbank® 수탁번호 U55762)를 포함하는 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질(BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), 강화 황색 형광 단백질(EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), 루시페라아제(Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β-갈락토시다아제(Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) 및 레닐라(WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, U.S. Patent Nos. 5,292,658; 5,418,155; 5,683,888; 5,741,668; 5,777,079; 5,804,387; 5,874,304; 5,876,995; 5,925,558)를 포함하지만, 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 항체/항체 구축물은 또한, 예를 들어, 분자의 단리에 도움을 주거나 분자의 적당한 약동학적 프로파일에 관련된 추가적인 도메인을 포함할 수 있다. 항체/항체 구축물의 단리를 돕는 도메인은 단리 방법, 예를 들어 단리 컬럼에서 포획될 수 있는 펩티드 모티브 또는 2차적으로 도입된 모이어티로부터 선택될 수 있다. 이러한 추가적인 도메인의 비 제한적 구현예는 Myc-태그, HAT-태그, HA-태그, TAP-태그, GST-태그, 키틴 결합 도메인(CBD-태그), 말토오스 결합 단백질(MBP-태그), Flag-태그, Strep-태그 및 이의 변이체(예를 들어, StrepII-태그) 및 His-태그로서 알려진 펩티드 모티브를 포함한다. 확인된 CDR을 특징으로 하는 본 명세서에 개시된 모든 항체 구축물은 분자의 아미노산 서열에서 연속 His 잔기, 예를 들어, 5개의 His 잔기, 또는 6개의 His 잔기(헥사-히스티딘)의 반복부로서 일반적으로 알려진 His-태그 도메인을 포함할 수 있다. His-태그는, 예를 들어, 항체 구축물의 N 말단 또는 C 말단에 위치할 수 있다. 일 구현예에서, 헥사-히스티딘 태그가 본 발명에 따른 항체 구축물의 C-말단에 펩티드 결합을 통해 연결된다.
본 발명은 추가로 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드/핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자는 뉴클레오티드로 구성된 생물고분자이다. 폴리뉴클레오티드는 쇄에서 공유 결합된 13개 이상의 뉴클레오티드 단량체로 구성되는 생물고분자이다. DNA(예를 들어 cDNA) 및 RNA(예를 들어 mRNA)는 별개의 생물학적 기능을 갖는 폴리뉴클레오티드/핵산 분자의 예이다. 뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산 분자의 단량체 또는 서브유닛으로서 작용하는 유기 분자이다. 본 발명의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 또는 단일 가닥, 선형 또는 원형일 수 있다. 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 벡터에 포함되는 것이 고려된다. 나아가, 이러한 벡터는 숙주 세포에 포함되는 것이 고려된다. 상기 숙주 세포는, 예를 들어 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드/핵산 분자로 형질전환 또는 형질감염 후에 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 발현할 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다.
유전 암호는 유전 물질(핵산) 내에 암호화된 정보가 단백질로 번역되는 규칙의 세트이다. 살아있는 세포에서의 생물학적 해독(decoding)은, tRNA 분자를 사용하여 아미노산을 운반하고 mRNA 3개의 뉴클레오티드를 한 번에 판독하도록 mRNA에 의해 특정된 순서로 아미노산을 연결하는 리보솜에 의해 달성된다. 이 암호는 단백질을 합성하는 동안 코돈으로 불리는 이들 뉴클레오티드 트리플렛의 서열이 어느 아미노산이 다음에 부가되는지를 지정하는 방법을 정의한다. 일부를 제외하고, 핵산 서열 내 3개의 뉴클레오티드 코돈은 단일 아미노산을 지정한다. 대다수의 유전자는 정확히 동일한 암호에 의해 암호화되기 때문에, 이 특정 암호는 종종 기본형 또는 표준 유전자 암호로서 지칭된다.
코돈의 축퇴성은 아미노산을 지정하는 3개 염기 쌍 코돈 조합의 다중성으로 발휘된 유전 암호의 중복이다. 암호화할 수 있는 아미노산보다 코돈이 더 많기 때문에 축퇴성이 발생한다. 하나의 아미노산을 암호화하는 코돈은 3개의 위치 중 임의의 위치에서 다를 수 있다. 그러나 자주 이러한 차이는 두 번째 또는 세 번째 위치에 있다. 예를 들어, 코돈 GAA와 GAG는 둘 다 글루탐산을 지정하고 중복성을 나타내지만, 어느 것도 임의의 다른 아미노산을 지정하지 않으므로, 모호성을 나타내지 않는다. 상이한 유기체의 유전 암호는 동일한 아미노산을 암호화하는 여러 코돈 중 하나를 나머지 것들보다 더 사용하는 쪽으로 편향될 수 있다. 즉, 우연히 예상보다 더 큰 빈도의 하나가 발견될 것이다. 예를 들어, 류신은 6개의 별개의 코돈에 의해 지정되지만, 이 중 일부는 거의 사용되지 않는다. 대부분의 유기체에 대한 게놈 코돈 사용 빈도를 자세히 설명하는 코돈 사용빈도표를 이용할 수 있다. 재조합 유전자 기술은 일반적으로 코돈 최적화라는 기법을 구현하여 이 효과를 이용하는데, 이때, 이러한 코돈을 사용하여, 예를 들어, 단백질 발현을 증가시키기 위하여, 각각의 숙주 세포(예컨대, 인간 햄스터 기원의 세포, 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포, 또는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 세포)에 의해 선호되는 폴리뉴클레오티드를 설계한다. 따라서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드/핵산 분자가 코돈 최적화되는 것이 고려된다. 그럼에도, 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드/핵산 분자는 원하는 아미노산을 암호화하는 임의의 코돈을 이용하여 설계될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드/핵산 분자는 하나의 단일 분자의 형태 또는 2개 이상의 개별 분자의 형태이다. 본 발명의 항체 구축물이 단쇄 항체 구축물인 경우, 이러한 구축물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드/핵산 분자는 또한 하나의 단일 분자의 형태일 가능성이 높을 것이다. 그러나 단클론 항체 또는 항체 구축물의 상이한 구성요소(예컨대, 중쇄 및 경쇄)가 개별 폴리펩티드 쇄에 위치하며, 이 경우 폴리뉴클레오티드/핵산 분자는 2개(또는 그 이상의) 개별 분자의 형태일 가능성이 높다는 것도 고려된다.
동일한 사항이 본 발명의 폴리뉴클레오티드/핵산 분자를 포함하는 벡터에 적용된다. 본 발명의 항체 구축물이 단쇄 항체 구축물인 경우, 하나의 벡터는 (하나의 단일 공개 해독틀, ORF로서) 하나의 단일 위치의 항체 구축물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 하나의 벡터는 (개별 ORF와 함께) 분리된 위치에 2개 이상의 폴리뉴클레오티드/핵산 분자를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 단클론 항체의 상이한 구성요소, 예컨대, 중쇄 및 경쇄, 또는 본 발명의 항체 구축물의 상이한 구성요소를 암호화한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드/핵산 분자를 포함하는 벡터는 하나의 단일 벡터 또는 2개 이상의 개별 벡터의 형태인 것이 고려된다. 일 구현예에서, 그리고 숙주 세포에서 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 발현시키기 위한 목적으로, 본 발명의 숙주 세포는 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드/핵산 분자를 포함하거나, 또는 하나의 단일 분자로서 암호화되든 개별 분자들/위치들로 암호화되든, 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 모든 구성요소를 의미하는, 그 전체로서 이러한 폴리뉴클레오티드/핵산 분자를 포함하는 벡터는, 번역 후에 조립되어, 함께 본 발명의 생물학적으로 활성인 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 형성할 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드/핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 보통 복제 및/또는 발현의 목적을 위하여, (외래) 유전 물질을 세포 내로 이동시키는 비히클로서 사용되는 핵산 분자이다. 용어 "벡터"는 플라스미드, 바이러스, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하지만, 이로 한정되지 않는다. 일부 벡터는 구체적으로 클로닝을 위해 설계되며(클로닝 벡터), 일부 벡터는 단백질 발현을 위해 설계된다(발현 벡터). 소위 전사 벡터는 주로 이들의 삽입체를 증폭시키는 데 사용된다. DNA의 조작은 정상적으로 E. 콜라이 벡터에서 수행되며, E. 콜라이 벡터는 E. 콜라이에서 유지에 필수적인 요소를 함유한다. 그러나 벡터는 또한 효모, 식물 또는 포유동물 세포와 같은 또 다른 유기체에서 유지되게 하는 요소를 가질 수 있으며, 이러한 벡터는 셔틀 벡터라 한다. 표적 또는 숙주 세포로의 벡터의 삽입은 보통 박테리아 세포의 경우 형질전환, 진핵생물 세포의 경우 형질감염이라 하며, 바이러스 벡터의 삽입은 종종 형질도입이라 한다.
일반적으로, 조작된 벡터는 복제 기점, 다중클로닝 부위 및 선택 가능한 마커를 포함한다. 벡터 자체는 일반적으로, 삽입체(이식유전자) 및 벡터의 "골격"으로서 작용하는 더 큰 서열을 포함하는 통상적으로 DNA 서열인 뉴클레오티드 서열이다. 유전 암호는 주어진 암호화 영역에 대한 폴리펩티드 서열을 결정하지만, 다른 게놈 영역이 이들 폴리펩티드가 생산되는 시기 및 장소에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 현대의 벡터는 이식유전자 삽입체 및 골격 이외의 추가적인 특징: 프로모터, 유전자 마커, 항생제 저항성, 리포터 유전자, 표적화 서열, 단백질 정제 태그를 포함할 수 있다. 발현 벡터(발현 구축물)로 불리는 벡터는 구체적으로 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 위한 것이며, 일반적으로 제어 서열을 갖는다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 코작(Kozak) 서열 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 위치되는 경우 "작동 가능하게 연결된다". 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하기 위해 위치되는 경우 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 뉴클레오티드 서열이 인접해 있고, 분비 리더의 경우, 인접하면서 리딩 단계에 있다는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 관례에 따라 사용된다.
"형질감염"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터를 포함)를 표적 세포 내로 의도적으로 도입하는 과정이다. 이 용어는 대부분 진핵 세포에서 비 바이러스 방법을 위해 사용된다. 형질도입은 종종 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 바이러스-매개 전달을 기술하기 위해 사용된다. 동물 세포의 형질감염은 전형적으로 세포 막에서 일시적 기공 또는 "구멍"의 개방을 수반하여, 물질의 흡수를 허용한다. 형질감염은 생물학적 입자(예컨대, 바이러스 형질도입이라고도 하는 바이러스 형질감염), 화학물질 기반의 방법(예를 들어, 인산칼슘, 리포펙션, Fugene, 양이온성 중합체, 나노입자의 이용) 또는 물리적 처리(예컨대, 전기천공, 미세주입, 유전자 총, 세포 압착, 자기감염, 정수압, 임페일펙션(impalefection), 초음파 처리, 광학 형질감염, 열 충격)을 이용하여 수행될 수 있다.
용어 "형질전환"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터를 포함)의 박테리아 내로의, 그리고 또한 식물 세포를 포함하는 비 동물 진핵 세포 내로의 비 바이러스 전달을 기술하기 위해 사용된다. 따라서, 형질전환은 그 주위로부터의 세포 막(들)을 통한 직접적 흡수 및 차후의 외인성 유전 물질(핵산 분자)의 혼입으로부터 초래되는 박테리아 또는 비 동물 진핵 세포의 유전적 변경이다. 형질전환은 인공 수단에 의해서 수행될 수 있다. 형질전환이 일어나기 위해서는, 세포 또는 박테리아가 반응능 상태에 있어야 하는데, 이는 기아 및 세포 밀도와 같은 환경 조건에 대한 시간 제한 반응으로서 일어날 수 있고, 또한 인공적으로 유도될 수 있다.
게다가, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드/핵산 분자 또는 본 발명의 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포" 또는 "수용자 세포"는 벡터, 외인성 핵산 분자, 및/또는 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 수용자; 및/또는 단클론 항체(또는 항체 구축물) 자체의 수용자일 수 있거나 수용자였던 임의의 개개 세포 또는 세포 배양물을 포함하고자 한다. 세포 내로의 각각의 물질의 도입은 형질전환, 형질감염 등에 의해 수행된다(위 참고). 용어 "숙주 세포"는 또한 단일 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 포함하고자 한다. 특정 변형이 자연적, 우연적 또는 의도적인 돌연변이에 기인하거나 환경적 영향에 기인하여 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실 (형태학적으로나 게놈 또는 총 DNA 보체에 있어) 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수도 있지만, 본 명세서에서 사용되는 용어의 범주 내에 여전히 포함된다. 적합한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포를 포함하고, 또한 박테리아(예컨대 E. 콜라이), 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 및 동물 세포, 예를 들어 곤충 세포 및 포유류 세포, 예를 들어, 햄스터, 뮤린, 래트, 마카크 또는 인간 세포를 포함하지만, 이로 한정되지 않는다.
원핵생물에 추가로, 진핵 미생물, 예를 들어 사상 진균 또는 효모는 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)에 대해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반 제빵 효모가 하등 진핵생물 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나 다수의 다른 속, 종, 및 균주, 예를 들어 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 K. 락티스(K. lactis), K. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16045), K. 위케라미이(K. wickeramii)(ATCC 24178), K. 왈티이(K. waltii)(ATCC 56500), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36906), K. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 K. 막시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402 226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183 070); 칸디다; 트리코더마 레시아(Trichoderma reesia)(EP 244 234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실륨(Penicillium), 톨리포클라듐(Tolypocladium) 및 아스퍼길러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 A. 니둘란스(A. nidulans) 및 A. 니거(A. niger)는 통상적으로 이용 가능하고, 본 명세서에서 유용하다.
글리코실화된 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 이집트 숲모기(Aedes aegypti)(모기), 흰줄숲모기(Aedes albopictus)(모기), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)(초파리), 및 누에나방(Bombyx mori)과 같은 숙주로부터의 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어, 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 누에나방(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주는 공개적으로 이용 가능하며, 이러한 바이러스는 본 발명에 따라 본 명세서에서 바이러스로서, 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다.
목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 애기장대 및 담배의 식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 식물 세포 배양물에서 단백질의 생산에 유용한 클로닝 및 발현 벡터는 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750, 및 Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986 참고.
그러나 척추동물 세포가 가장 유력하게 여겨져 왔으며, 배양물(세포 배양물)에서 척추동물 세포의 증식은 통상적인 절차가 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(예를 들어 COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(293 또는 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al. , J. Gen Virol. 36 : 59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포(예를 들어, BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(예를 들어, CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(예를 들어, CVI ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(예를 들어, VERO-76, ATCC CRL1587); 인간 자궁경부 암종 세포(예를 들어, HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(예를 들어, MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(예를 들어, BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(예를 들어, W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(예를 들어, Hep G2,1413 8065); 마우스 유방 종양(예를 들어, MMT 060562, ATCC CCL-51); TRI 세포(Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주(예를 들어, Hep G2)가 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 생산 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 발현을 허용하는 조건 하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하고 생산된 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 배양물로부터 회수하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "배양"은 배지에서 적합한 조건 하에 세포의 시험관 내 유지, 분화, 성장, 증식 및/또는 전파를 지칭한다. 세포는 적절한 온도와 가스 혼합물의 세포 성장 배지에서 성장하고 유지된다. 배양 조건은 각 세포 유형에 따라 크게 다르다. 일반적인 성장 조건은 약 37℃의 온도, 약 5%의 CO2 농도 및 약 95%의 습도이다. 성장 배지의 제조법은 예를 들어, 탄소원(예를 들어, 글루코스)의 pH 농도, 성장 인자의 성질 및 농도, 및 기타 영양소(예를 들어, 아미노산 또는 비타민)의 존재 하에서, 다양할 수 있다. 배지를 보충하는 데 사용되는 성장 인자는 종종 우태아 혈청(FBS), 우아 혈청(FCS), 말 혈청, 및 돼지 혈청과 같은 동물 혈액의 혈청으로부터 유래된다. 세포는 현탁액 중에서 또는 부착 배양물로서 성장할 수 있다. 또한, 부착 조건이 허용하는 것보다 더 높은 밀도로 성장할 수 있도록 현탁 배양물 중에서 생존할 수 있도록 변형된 세포주도 있다.
용어 "발현"은 전사, 전사 후 변형, 번역, 접힘, 번역 후 변형, 특정 세포 하 또는 세포 외 위치로의 표적화, 및 분비를 포함하지만, 이로 한정되지 않는 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 생산에 연루된 임의의 단계를 포함한다. 용어 "회수"는 세포 배양물로부터 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 단리하기 위한 일련의 과정을 지칭한다. "회수" 또는 "정제" 과정은 세포 배양물의 단백질 및 비 단백질 부분을 분리하고, 최종적으로 원하는 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 다른 모든 폴리펩티드 및 단백질로부터 분리할 수 있다. 분리 단계는 일반적으로 단백질 크기, 물리화학적 특성, 결합 친화도 및 생물학적 활성의 차이를 활용한다. 분취 정제는 후속 사용을 위해 비교적 많은 양의 정제된 단백질을 생산하는 것을 목표로 하는 반면, 분석 정제는 다양한 연구 또는 분석 목적을 위해 비교적 소량의 단백질을 생산한다.
재조합 기법을 사용할 때, 단클론 항체(또는 항체 구축물)는 주변 세포질 공간에서 세포 내 생산될 수 있거나, 배지로 직접 분비될 수 있다. 단클론 항체(또는 항체 구축물)가 제1 단계로서 세포 내 생산되는 경우, 숙주 세포 또는 용해된 단편 중 하나인 미립자 파편은, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)은 예를 들어, E. 콜라이와 같은 박테리아에서 생산될 수 있다. 발현 후, 구축물은 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리되고, 예를 들어, 친화도 크로마토그래피 및/또는 크기 배제를 통해 정제될 수 있다. 최종 정제는 포유동물 세포에서 발현되고 배지로 분비된 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 정제하는 방법과 비슷한 방식으로 수행될 수 있다. Carter et al. (Biotechnology (NY) 1992 Feb;10(2):163-7)에서는 E. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체를 단리하는 절차를 기술한다.
단클론 항체(또는 항체 구축물)가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액은 일반적으로 처음에 상업적으로 입수 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, 한외여과 유닛을 사용하여 농축된다.
숙주 세포로부터 제조된 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)는, 예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 회수되거나 정제될 수 있다. 회수되는 단클론 항체(또는 항체 구축물)에 따라 단백질 정제를 위한 다른 기법, 예를 들어 이온 교환 칼럼에서의 분별, 혼합 방식의 이온 교환, HIC, 에탄올 침전, 크기 배제 크로마토그래피, 역상 HPLC, 실리카에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로오스에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼)에서의 크로마토그래피, 면역친화도(예를 들어, 단백질 A/G/L) 크로마토그래피, 크로마토-포커싱, SDS-PAGE, 한외여과, 및 황산암모늄 침전이 또한 이용 가능하다. 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 억제하기 위해 전술한 임의의 단계에 포함될 수 있고, 항생제는 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
게다가, 본 발명은 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물) 또는 본 발명의 방법에 따라 생산된 단클론 항체(또는 항체 구축물)을 포함하는 조성물 또는 제형을 제공한다. 조성물은 바람직하게는 진단 조성물이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "진단 조성물"은 진단 키트 또는 검출 시스템에 사용하기에 적합한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 한 가지 가능한 진단 조성물은 하나의 또는 복수의 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를, 바람직하게는 샘플에서 sBCMA의 검출에 유용한 양으로 포함한다. 진단 조성물은 추가로 하나 이상의 담체, 안정화제, 부형제, 희석제, 용해제, 계면활성제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제의 적합한 제형을 포함할 수 있다. 본 발명의 진단 조성물은 액체, 동결 및 동결건조 조성물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
조성물은 담체, 예를 들어, 진단상 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 "진단상 허용 가능한 담체"는 진단 용도에 적합한 임의의 및 모든 수성 및 비수성 용액, 멸균 용액, 용매, 완충제, 예를 들어, 인산염 완충 식염수(PBS) 용액, 물, 현탁액, 에멀션, 예를 들어 오일/물 에멀션, 다양한 유형의 습윤제, 리포솜, 분산매 및 코팅제를 의미한다. 진단 조성물에서 이러한 매질 및 작용제의 용도는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다.
특정 구현예는 본 발명의 항체(또는 항체 구축물) 및 추가적인 1종 이상의 부형제, 예를 들어 본 명세서의 이 부문 및 다른 곳에 예시적으로 기술된 것들을 포함하는 진단 조성물을 제공한다. 부형제는 본 발명에서 매우 다양한 목적, 예를 들어 제형의 물리적, 화학적 또는 생물학적 특성의 조정, 예를 들어 점도의 조정, 그리고 또는 유효성을 개선하고/개선하거나, 예를 들어 제조, 운송, 저장, 사용 전 제조, 투여 중에 그리고 그 이후에 일어나는 스트레스에 기인하는 분해 및 손상에 대하여 이러한 제형 및 공정을 안정화시키도록 본 발명의 공정을 위해 사용될 수 있다. 부형제는 일반적으로 그들의 최저 유효 농도로 사용되어야 한다.
특정 구현예에서, 진단 조성물은, 예를 들어, pH, 삼투압, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용출 또는 방출 속도, 흡수 또는 침투와 같은 조성물의 특성한 특성을 변형시키거나, 유지하거나 보존하는 목적을 위한 제형화 물질을 함유할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18" Edition, 1990, Mack Publishing Company 참고). 이러한 구현예에서, 적합한 제형화 물질은 하기를 포함할 수 있지만, 이로 한정되지 않는다:
■아미노산
■항미생물제, 예컨대 항박테리아제 및 항진균제;
■항산화제
■생리적 pH 또는 약간 더 낮은 pH, 전형적으로는 약 5 내지 약 8 또는 9의 pH 범위 내에서 조성물을 유지하기 위해 사용되는 완충제, 완충제 시스템 및 완충 제제
■비 수성 용매, 식물유, 및 주사 가능한 유기 에스테르
■식염수 및 완충 매질을 포함하는, 물, 알코올성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액을 포함하는 수성 담체
■생분해성 중합체, 예를 들어 폴리에스테르
■증량제
■킬레이트제
■등장화제 및 흡수 지연제
■착화제
■충전제
■탄수화물
■(저분자량) 단백질, 폴리펩티드 또는 단백질성 담체, 바람직하게는 인간 기원의 것
■착색제 및 향미제
■황 함유 환원제
■희석제
■유화제
■친수성 중합체
■염 형성 반대 이온
■보존제
■금속 복합체
■용매 및 공용매
■당 및 당 알코올
■현탁제
■계면활성제 또는 습윤제
■안정성 향상제
■긴장성 향상제
■비경구 전달 비히클
■정맥 내 전달 비히클
진단 조성물의 상이한 구성 성분은 상이한 효과를 가질 수 있고, 예를 들어, 아미노산은 완충제, 안정화제 및/또는 항산화제로서 작용할 수 있으며; 만니톨은 증량제 및/또는 긴장성 향상제로서 작용할 수 있고; 염화나트륨은 전달 비히클 및/또는 긴장성 향상제로서 작용할 수 있는 것 등은 주지의 사실이다.
추가 양태에 따르면, 본 발명은 검출 시스템으로서,
a) sBCMA에 결합하는 제1 단클론 항체(또는 항체 구축물), 및
b) sBCMA에 결합하는 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)을 포함하고,
sBCMA에 대한 제1 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 결합은 sBCMA에 결합하는 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 존재 하에 일어나는 것인, 검출 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 검출 시스템으로서,
a) sBCMA에 결합하는 제1 단클론 항체(또는 항체 구축물), 및
b) sBCMA에 결합하는 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)을 포함하고,
sBCMA에 대한 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 결합은 sBCMA에 결합하는 제1 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 존재 하에 일어나는 것인, 검출 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 검출 시스템으로서,
a) sBCMA에 결합하는 제1 단클론 항체(또는 항체 구축물), 및
b) sBCMA에 결합하는 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)을 포함하고,
sBCMA에 대한 제1 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 결합은 sBCMA에 결합하는 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 존재 하에 일어나고, sBCMA에 대한 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 결합은 sBCMA에 결합하는 제1 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 존재 하에 일어나는 것인, 검출 시스템을 제공한다.
"검출 시스템"은 분석적 분석을 수행하기 위한 시약을 포함하는 키트 또는 도구(또는 진단 키트/도구)이다. 본 발명의 맥락에서, 이 분석은 샘플, 보통은 액체 샘플의 sBCMA의 존재를 검출 및/또는 정량화한다. 검출 시스템은 sBCMA에 결합하는 한 쌍의 항체(제1 및 제2 단클론 항체)를 포함한다. 일반적으로, 검출 시스템은 검출할 항원(예를 들어, "직접 ELISA"의 경우) 또는 sBCMA에 결합하는 (단클론) 항체("포획 항체"), 또는 sBCMA에 결합하는 항체(포획 항체)에 결합하는 "제2 항체"(예를 들어, 항-Fc 항체)를 고정시키기 위한 표면으로 작용하는 고체 지지체(예를 들어, 미세적정 플레이트 또는 막)의 사용을 수반한다. 일반적으로, 고정화는 비 특이적으로(표면에 대한 흡착을 통해) 또는 특이적으로(항체, 예를 들어 2차 항체에 의한 포획을 통해) 일어난다. 검출 시스템은 sBCMA에 결합하는 (단클론) 검출 항체(선택적으로 효소, 검출 가능한 표지 또는 리포터 기와 커플링됨), 및 선택적으로, 검출 항체에 결합하고 효소, 검출 가능한 표지 또는 리포터 기와 커플링되는 2차 항체(예를 들어, 항-Fc 항체)를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 포획 항체는 "sBCMA에 결합하는 제1 단클론 항체(또는 항체 구축물)"일 수 있고, 검출 항체는 "sBCMA에 결합하는 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)"이거나 그 반대일 수 있다. 즉, 본 발명의 제1 또는 제2 단클론 항체 또는 항체 구축물은 효소, 검출 가능한 표지 또는 리포터 기와 커플링될 수 있다.
매우 잘 알려진 검출 시스템은 ELISA 분석으로, 이는 본 발명의 목적에 사용될 수 있다. "샌드위치" ELISA는 샘플 항원(본 명세서에서 sBCMA)을 검출하거나 미지의 양의 항원을 정량화하는 데 사용된다. 단계에는 다음이 포함될 수 있다: 기지의 양의 소위 "포획 항체"가 결합된 표면을 제공한다. 이러한 결합은 표면에 대한 포획 항체의 흡착을 통해 또는 표면에 흡착되고 포획 항체에 결합하는 2차 항체(예를 들어, 항-Fc 항체)를 통해 직접 일어날 수 있다. 표면의 모든 비 특이적 결합 부위를 차단한다. 항원 함유 샘플을 표면에 적용시키고, 항원은 항체에 의해 포획(결합)된다. 결합되지 않은 항원을 제거하기 위해 플레이트를 세척한다. "검출 항체"가 추가되고 항원에 결합한다. 이 검출 항체는 효소, 검출 가능한 표지 또는 리포터 기와 커플링(예를 들어, 공유 결합)될 수 있다. 그렇지 않은 경우, 효소, 검출 가능한 표지 또는 리포터 기와 커플링되고 검출 항체, 예를 들어, 이의 Fc 영역에 결합하는 2차 항체를 적용시킨다. 임의의 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 플레이트를 세척한다. 광학 신호(예를 들어, 유색 또는 형광) 또는 전기화학적 신호와 같은 검출 가능한 형태로 (예를 들어, 효소에 의해) 전환되는 화학적 기질을 첨가한다. 플레이트 웰 또는 표면의 흡광도 또는 형광 또는 전기화학적 신호(예를 들어, 전류)를 측정하여 항원의 존재 및/또는 양을 결정한다. 일반적으로 사용되는 효소 마커는 다음을 포함한다:
-OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드)는 호박색으로 변하여 공액 단백질로 자주 사용되는 호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP)를 검출한다
-TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)는 HRP를 검출할 때 청색으로 변하고, 황색의 황산 또는 인산으로 변한다
-ABTS(2,2'-아지노비스 [3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산]-디암모늄 염)는 HRP를 검출할 때 녹색으로 변한다
-PNPP(p-니트로페닐 포스페이트, 이나트륨 염)는 알칼리 포스파타아제를 검출할 때 황색으로 변한다
전통적인 ELISA는 일반적으로 항원의 존재를 나타내기 위해 관찰 가능한 색상 변화를 생성하는 발색성 리포터 및 기질을 포함한다. 최신 ELISA 유사 기법은 플루오로제닉, 전기화학발광 및 정량적 PCR 리포터를 사용하여 정량화 가능한 신호를 생성한다. 이들 새로운 리포터는 더 높은 민감도와 멀티플렉싱을 포함한 다양한 이점을 가질 수 있다. 기술적인 측면에서, 이러한 분석은 "효소 연결"된 것이 아니기 때문에 엄격하게 "ELISA"가 아니나, 대신 일부 비 효소적 리포터와 연결된다. 그러나 이러한 분석의 일반 원칙이 거의 유사하다는 점을 고려하여, 이들은 종종 ELISA와 동일한 범주로 분류된다.
검출 시스템은 정성적 또는 정량적 형식으로 사용될 수 있다. 정성적 결과는 샘플에 대한 단순한 긍정 또는 부정의 결과(예 또는 아니요)를 제공한다. 긍정과 부정의 구분은 통계적일 수 있다. 표준 편차(검정 고유의 오차)의 2~3배는 종종 양성 샘플과 음성 샘플을 구분하는 데 사용된다. 정량적 형식에서, 샘플의 광학 밀도(OD) 또는 전기화학적 신호는 일반적으로 표적 분자(sBCMA)의 기지의 농도 용액의 연속 희석액인 표준 곡선과 비교된다.
본 발명에 따른 단클론 항체 및 본 명세서에서 위에 제공된 바와 같은 제2 단클론 항체의 정의 및 설명은 본 발명의 검출 시스템 내에 포함되는 제1 단클론 항체 및 제2 단클론 항체에 유사하게 적용된다. 예를 들어, sBCMA는 서열번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것으로 고려된다. 또한, sBCMA에 대한 제1 단클론 항체의 결합 및 sBCMA에 대한 제2 단클론 항체의 결합은 sBCMA에 결합하는 제3 항체 또는 항체 구축물의 존재 하에 일어나는 것으로 고려된다. 이러한 제3 항체 또는 항체 구축물은 치료적 항-BCMA 항체 또는 항체 구축물, 예를 들어 항체 약물 접합체(ADC) 또는 CD3xBCMA 이중특이적 항체일 수 있다. 제3 항체 또는 항체 구축물은 검출 시스템을 이용하여 분석될 샘플(예를 들어, 생물학적 샘플)에 존재할 수 있다. sBCMA에 결합하는 제3 항체/항체 구축물에 대한 자세한 내용은 상기 본 명세서 참고. 또한, 검출 시스템의 제1 단클론 항체(또는 항체 구축물)은 (a) 토끼 VH 영역, (b) 토끼 VL 영역 또는 (c) 토끼 VH 영역 및 토끼 VL 영역을 포함하는 것이 고려된다. 마찬가지로, 검출 시스템의 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)은 (a) 토끼 VH 영역, (b) 토끼 VL 영역 또는 (c) 토끼 VH 영역 및 토끼 VL 영역을 포함할 수 있다. 나아가, 검출 시스템의 전체 제1 단클론 항체 및/또는 전체 제2 단클론 항체는 토끼 항체일 수 있다. 또한, 검출 시스템의 제1 단클론 항체 및/또는 제2 단클론 항체는 약 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M 이하의 sBCMA에 대한 친화도(KD)를 갖는 것이 고려된다. 또한, 검출 시스템의 제1 단클론 항체 및/또는 검출 시스템의 제2 단클론 항체는 IgG, IgD, IgE, IgM 또는 IgA 항체인 것이 고려된다. 일 구현예에 따르면, 제1 및/또는 제2 단클론 항체는 IgG 항체, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다. 항체의 이소형 및 서브클래스는 토끼의 이소형 및 서브클래스일 수 있다(예를 들어, 토끼 IgG, 토끼 IgG1 등).
또한, 본 발명은 다음을 규정한다: 검출 시스템의 제1 단클론 항체(또는 항체 구축물)가
a) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 3에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 5에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나;
b) 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 13에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 16에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나;
c) a)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 a)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하거나; 또는
d) b)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 b)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하고/하거나;
검출 시스템의 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)가
e) 서열번호 21에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 23에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 24에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 25에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 26에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나; 또는
f) e)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 e)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁한다.
또한, 본 발명은 다음을 규정한다: 검출 시스템의 제1 단클론 항체(또는 항체 구축물)가
a) 서열번호 7 또는 17에 제시된 바와 같은 VH 영역을 포함하거나;
b) 서열번호 8 또는 18에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
c) 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
d) 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 18에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
e) c)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 c)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하거나; 또는
f) d)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 d)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하고/하거나;
검출 시스템의 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)가
g) 서열번호 27에 제시된 바와 같은 VH 영역을 포함하거나;
h) 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
i) 서열번호 27에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나; 또는
j) i)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 i)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁한다.
검출 시스템은 다음이 고려된다:
a) 제1 단클론 항체(또는 항체 구축물)가 포획 항체로 사용되고, 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)가 검출 항체로 사용되거나, 또는
b) 제1 단클론 항체(또는 항체 구축물)가 검출 항체로 사용되고, 제2 단클론 항체(또는 항체 구축물)가 포획 항체로 사용된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 다음을 위한 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)의 용도 또는 본 발명의 검출 시스템의 용도를 제공한다:
-샘플의 sBCMA의 검출;
-샘플의 sBCMA의 정량화;
-sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 진단;
-sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환으로 진단된 환자의 계층화;
-sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환 진행의 모니터링; 또는
-sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 치료에 대한 반응의 모니터링.
일 구현예에서, 샘플은 생물학적 샘플, 예를 들어, 인간의 생물학적 샘플이다. 샘플(생물학적 샘플/인간의 생물학적 샘플)은 혈청 샘플, 혈장 샘플, 혈액 샘플, 골수 샘플 또는 조직 샘플일 수 있다. 또한, 샘플은 골수 단핵구 세포 또는 말초 혈액 단핵구 세포의 세포 배양물로부터 얻은 상청액일 수 있다. 샘플은 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환을 앓는 것으로 의심되거나 앓는(진단된) 대상체, 예를 들어, 인간 대상체, 또는 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환에 대한 치료를 받은 대상체로부터 얻을 수 있다.
질환은 인간과 같은 유기체의 일부 또는 전부의 구조 또는 기능에 부정적으로 영향을 미치며 임의의 외부 손상으로 인한 것이 아닌 특정한 비정상적인 상태이다. 질환은 종종 특정 징후 및 증상과 관련된 "의학적 상태" 또는 "장애"로 해석된다. 본 발명에 따른 질환은 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련이 있다. 이 sBCMA는 예를 들어, 인간 대상체의, 골수, 혈액, 혈청 또는 혈장에서, 또는 예를 들어, 인간 대상체의, 골수 단핵구 세포 또는 말초 혈액 단핵구 세포의 세포 배양물로부터 얻은 상청액에서, 예를 들어, 검출 및/또는 정량화된다. 용어 "증가된"은 건강한 대상체, 즉, 이러한 질환이 없는 대상체와 비교하여 사용된다. 일 구현예에 따르면, sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환은 "BCMA 양성 신생물"이다.
"신생물"은 항상은 아니지만 보통 덩어리를 형성하는 조직의 비정상적 성장이다. 또한 덩어리를 형성할 때, 그것은 일반적으로 "종양"으로 지칭된다. 뇌종양에서, 세포의 제어되지 않은 분열은 신생물의 덩어리의 크기가 증가함을 의미하고, 두개내 공동과 같은 제한된 공간에서는 덩어리가 뇌 공간을 침범하여 뇌를 밀어내어, 뇌 조직의 압박 및 두개내압 증가 및 실질 파괴를 초래하기 때문에 이는 곧 문제가 된다. 본 발명에 따르면, "신생물" 또는 "종양"은 또한 BCMA, 특히, 세포 표면에 발현된 BCMA(예를 들어, BCMA 특이적 항체(네이키드 항체, 항체-약물 접합체(ADC), 이중특이적 항체, 예를 들어, BCMA 및 CD3에 대한 것들 포함) 및 세포 요법, 예를 들어, 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T))에 대한 치료법을 이용한 치료로부터 이익을 얻는 병태를 지칭하며, 이러한 치료법은 AMG 420, AMG 701, GSK 916, JNJ-64007957 (JNJ-7957), PF-06863135 (PF-3135), CC-93269, REGN5458, HPN217, TNB-383B, P-BCMA-101, JNJ-68284528, JCARH125, 및 bb2121을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 상태는 포유류를 문제의 병태(신생물 또는 종양)에 취약하게 만드는 이러한 병리적 병태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다.
신생물 또는 종양은 양성, 잠재적으로 악성(전암성), 또는 악성(암성)일 수 있다. 악성 신생물/종양을 일반적으로 암이라 칭한다. 이들은 보통 주변 조직을 침윤하고 파괴하며, 전이를 형성할 수 있다. 즉, 이들은 신체의 다른 부분, 조직 또는 기관으로 퍼진다. "원발성 종양"은 종양 진행이 시작되어 암성 덩어리를 생성하기 위해 진행된 해부학적 부위에서 성장하는 종양이다. 예를 들어, 뇌종양은 뇌 내에 비정상 세포가 형성될 때 발생한다. 대부분의 암은 원발 부위에서 발생하지만, 이후, 전이를 형성하거나 신체의 다른 부분(예를 들어, 조직 및 기관)으로 퍼진다. 이러한 추가 종양은 이차 종양이다. 대부분의 암은 신체의 다른 부위로 퍼진 후에도 계속해서 원발 부위의 이름을 붙인다.
림프종 및 백혈병은 조혈성 또는 림프성 신생물이다. 본 발명의 목적을 위하여, 림프종 및 백혈병은 또한 용어 "종양", "암", 또는 "신생물"에 포함된다. 림프종은 림프구(백혈구의 일 유형)에서 발생하는 혈액암군이다. 백혈병은 일반적으로 골수에서 시작하여 많은 수의 비정상적인 백혈구를 유발하는 암군이다. 이러한 백혈구는 충분히 발달하지 않으며 모세포 또는 백혈병 세포라 한다. 림프종 및 백혈병은 조혈 및 림프 조직의 광범위한 종양군의 일부이다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "신생물", "종양" 및 "암"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이들은 원발성 종양/암 및 이차성 종양/암(또는 "전이")뿐만 아니라, 덩어리 형성 신생물(종양) 및 림프성 신생물(예를 들어, 림프종 및 백혈병), 및 MRD도 포함한다.
용어 "미세잔존질환(minimal residual disease, MRD)"은 암 치료 후, 예를 들어, 환자가 관해 상태에 있을 때(환자에게 질환의 증상이나 징후가 없을 때), 환자에 남아 있는 적은 수의 잔존 암 세포의 존재에 대한 증거를 지칭한다. 암을 평가하거나 검출하는 데 사용되는 표준 테스트는 MRD를 검출할 만큼 충분히 민감하지 않기 때문에 매우 적은 수의 나머지 암 세포는 일반적으로 일상적인 방법으로 검출할 수 없다. 오늘날 유세포 분석법, PCR 및 차세대 시퀀싱과 같은 MRD에 대해 매우 민감한 분자 생물학 테스트를 사용할 수 있다. 이러한 테스트는 조직 샘플에서, 때로는 백만 개의 정상 세포 중 1개의 암세포만큼 낮은, 최소 수준의 암세포를 측정할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 신생물의 "예방", "치료" 또는 "개선"이라는 용어는 또한 MRD가 검출되었는지 관계 없이 "MRD의 예방, 치료 또는 개선"을 포함하는 것으로 고려된다.
BCMA 양성 신생물은 B 세포 신생물 또는 형질 세포 신생물인 것으로 고려된다. B 림프구로도 알려진 B 세포는 림프구 하위유형의 백혈구 유형이다. 그것들은 항체를 분비함으로써 적응 면역계의 체액성 면역 성분에서 기능한다. 추가로, B 세포는 항원을 제시하고(전문적인 항원 제시 세포로도 분류됨) 사이토카인을 분비한다. 포유류에서, B 세포는 대부분의 뼈의 중심부에 있는 골수에서 성숙한다. B 세포는 다른 두 부류의 림프구인 T 세포와 자연 살해(NK) 세포와 달리, 세포막에서 B 세포 수용체(BCR)를 발현한다. BCR은 B 세포가 특정 항원에 결합하게 하여, 이에 대해 항체 반응을 시작한다. 형질 B 세포, 플라스마 세포, 또는 효과기 B 세포라고도 하는, 형질 세포는 많은 부피의 항체를 분비하는 백혈구이다. 그것들은 일반적으로 혈장과 림프계에 의해 운반된다. 형질 세포는 골수에서 생겨난다. B 세포는 전구체 B 세포의 수용체를 밀접하게 모델링한 항체 분자를 생산하는 형질 세포로 분화한다. 혈액과 림프로 방출되면, 이들 항체 분자는 표적 항원에 결합하여 중화 또는 파괴를 시작한다.
"sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환", "BCMA 양성 신생물" 또는 "(BCMA 양성) B 세포 신생물 또는 형질 세포 신생물"은 다발성 골수종, 재발된 및/또는 불응성 다발성 골수종, 중쇄 다발성 골수종, 경쇄 다발성 골수종, 골수 외 골수종(골수 외 형질세포종, 골수 외 다발성 골수종), 형질세포종, 형질 세포 백혈병, 발덴스트롬 거대글로불린혈증(림프형질세포성 림프종), 무증상 골수종(무증상 다발성 골수종), 만성 림프성 백혈병(CLL), 원발성 CNS 림프종(PCNSL) 및 B 세포 비 호지킨 림프종(B-NHL)을 포함하나 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 다발성 골수종은 재발된 및/또는 불응성 다발성 골수종, 중쇄 다발성 골수종, 경쇄 다발성 골수종, 골수 외 다발성 골수종, 및 무증상 다발성 골수종으로 구성되거나 이를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
"진단" 또는 "의학적 진단"은 대상체의 증상 및 징후를 설명하는 장애 또는 병태를 결정하는 과정이다. 일반적으로, 진단 또는 의료 검사와 같은 하나 이상의 진단 절차가 과정 중에 수행된다. 의학에서, 용어 "모니터링"은 시간 경과에 따라 질환, 병태 또는 하나 또는 여러 의학적 파라미터를 관찰하는 것을 지칭한다. 의료용 모니터를 사용하여 특정 파라미터를 지속적으로 측정하고/측정하거나 의료 검사를 반복 수행하여 모니터링을 수행할 수 있다. 진단 또는 의료 검사는 질환, 질환 과정, 감수성을 검출, 진단 또는 모니터링하고/하거나 치료 과정을 결정하기 위하여 수행되는 의료 절차이다. 이는 임상 화학 및 분자 진단과 관련이 있으며, 절차는 일반적으로 의학 실험실에서 수행된다.
의학적 요법 또는 치료는 질환을 치유하거나 개선하기 위한 노력이다. 의료 분야에서, 일반적인 치료법은 약물을 포함한다. 약품(의약, 약제 또는 약물이라고도 지칭함)은 질환을 진단, 치유, 치료 또는 예방하는 데 사용된다. 따라서, 용어 "치료"는 치료적 처치와 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 치료는 질환, 질환의 증상, 또는 질환에 대한 소인을 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 교정, 향상, 개선, 또는 영향을 미치기 위한 목적으로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 질환, 이러한 질환의 증상, 또는 이러한 질환에 대한 소인을 갖는 환자 또는 필요로 하는 대상체로부터의 신체, 분리된 조직, 또는 세포에 대한 항-BCMA 항체 또는 항체 구축물의 적용 또는 투여를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 또한 샘플에서 sBCMA를 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하며, 방법은
(a) 샘플의 sBCMA의 함량을 결정하기 위하여 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 이용하거나, 또는 본 발명의 검출 시스템을 이용하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 결정된 sBCMA의 함량을 다음과 비교하는 단계를 포함한다:
(i) sBCMA 함량에 대해 사전 정의된 값,
(ii) 대조군 샘플에서 결정된 sBCMA의 함량, 또는
(iii) 이전의 시점에서 동일한 공급원 또는 대상체로부터 수득한 샘플에서 결정한 sBCMA의 함량.
본 발명의 목적을 위해, 용어 (sBCMA의) "함량"은 용어 (sBCMA의) "수준", "양" 또는 "농도"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. "sBCMA 함량에 대해 사전 정의된 값"은 사전 결정된 "컷오프 값"일 수 있다. 이 값은 예를 들어, 샘플의 특정한 sBCMA 함량이 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환, 또는 BCMA 양성 신생물을 나타내는 것임을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 샘플의 sBCMA 함량이 사전 결정된 컷오프 값보다 3 표준편차 위인 것으로 결정되면, 샘플이 수득된 대상체는 다발성 골수종(또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 다른 질환)에 대해 양성으로 간주된다. "대조군 샘플"은 보통 분석되는 샘플(예컨대, 혈청 샘플)과 동일한 속성의 공급원으로부터 수득된다. 대조군 샘플은 "정상" sBCMA 함량을 나타내는 샘플("음성 대조군 샘플")일 수 있거나, 또는 "비정상적으로 증가된" sBCMA 함량을 나타내는(예를 들어, 본 명세서에 정의된 바와 같은 질환을 앓는 대상체를 나타내는) 샘플("양성 대조군 샘플")일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환을 진단하는 방법을 제공하며, 방법은
(a) 샘플의 sBCMA의 함량을 결정하기 위하여 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 이용하거나, 또는 본 발명의 검출 시스템을 이용하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 결정된 sBCMA의 함량을 다음과 비교하는 단계를 포함한다:
(i) 이러한 질환의 부재를 나타내는, sBCMA 함량에 대한 사전 정의된 컷오프 값, 또는
(ii) 이러한 질환의 부재를 나타내는 대조군 샘플에서 결정된 sBCMA의 함량;
이때, (i)의 사전 정의된 컷오프 값 또는 (ii)의 대조군 샘플에서 결정된 sBCMA의 함량과 비교하여 단계 (a)에서 결정된 더 높은 함량의 sBCMA는 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 존재를 나타낸다.
추가 양태에서, 본 발명은 또한 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 진행을 모니터링하거나, sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법을 제공하며, 방법은
(a) 이러한 질환으로 진단된 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플의 제1 시점의 sBCMA의 함량을 결정하기 위하여 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 이용하거나, 또는 본 발명의 검출 시스템을 이용하는 단계;
(b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플의 제2(나중의) 시점 또는 치료 후의 sBCMA의 함량을 결정하기 위하여 본 발명의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 이용하거나, 또는 본 발명의 검출 시스템을 이용하는 단계; 및
(c) 단계 (a)에서 결정된 sBCMA의 함량을 단계 (b)에서 결정된 sBCMA의 함량과 비교하는 단계;를 포함하며,
단계 (b)에서 결정된 sBCMA의 함량과 비교하여 단계 (a)에서 결정된 더 높은 함량의 sBCMA는 질환이 진행 중임을 나타내고/내거나, 단계 (b)에서 결정된 sBCMA의 함량과 비교하여 단계 (a)에서 결정된 더 낮은 함량의 sBCMA는 상기 질환이 관해에 들어가고 있거나 상기 질환이 치료에 반응하고 있음을 나타낸다.
위의 방법에서 "샘플"은 생물학적 샘플, 예를 들어, 인간의 생물학적 샘플임이 고려된다. 샘플은 (인간) 혈청 샘플, 혈장 샘플, 혈액 샘플, 골수 샘플, 조직 샘플, 또는 (인간) 골수 단핵구 세포 또는 (인간) 말초 혈액 단핵구 세포의 세포 배양물로부터 얻은 상청액일 수 있다. 또한, "샘플"은 인간 대상체, 바람직하게는 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환을 앓는 것으로 의심되거나 앓는(진단된) 인간 대상체, 또는 본 명세서의 위에서 정의된 바와 같은, sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환에 대한 치료를 받은 대상체로부터 얻을 수 있다.
위의 방법에서 "sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환"은 BCMA 양성 신생물인 것이 고려된다. 질환 또는 BCMA 양성 신생물은 다발성 골수종, 재발된 및/또는 불응성 다발성 골수종, 중쇄 다발성 골수종, 경쇄 다발성 골수종, 골수 외 골수종(골수 외 형질세포종, 골수 외 다발성 골수종), 형질세포종, 형질 세포 백혈병, 발덴스트롬 거대글로불린혈증(림프형질세포성 림프종), 무증상 골수종(무증상 다발성 골수종), 만성 림프성 백혈병(CLL), 원발성 CNS 림프종(PCNSL) 및 B 세포 비 호지킨 림프종(B-NHL)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 다음의 항목에 관한 것이다:
항목 1. 가용성 BCMA(sBCMA)에 결합하는 단클론 항체로서, sBCMA에 대한 항체의 결합은 sBCMA에 결합하는 제2 단클론 항체의 존재 하에 일어나는 것인, 단클론 항체.
항목 2. 항목 1에 있어서, sBCMA는 서열번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것인, 단클론 항체.
항목 3. 항목 1 또는 2에 있어서, sBCMA에 대한 단클론 항체의 결합은 sBCMA에 결합하는 제3 항체 또는 항체 구축물의 존재 하에 일어나는 것인, 단클론 항체.
항목 4. 항목 3에 있어서, 제3 단클론 항체 또는 항체 구축물은 바람직하게는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, BCMA의 에피토프 클러스터 3, 바람직하게는 인간 BCMA의 에피토프 클러스터 3에 결합하는 것인, 단클론 항체.
항목 5. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 단클론 항체는 토끼 VH 영역 및/또는 토끼 VL 영역을 포함하는 것인, 단클론 항체.
항목 6. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 단클론 항체는 약 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M 이하의 sBCMA에 대한 친화도(KD)를 갖는 것인, 단클론 항체.
항목 7. 항목 6에 있어서, 친화도는 비아코어 분석에서 결정되는 것인, 단클론 항체.
항목 8. 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, 단클론 항체는
a) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 3에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 5에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나;
b) 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 13에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 16에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나;
c) 서열번호 21에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 23에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 24에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 25에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 26에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나;
d) a)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 a)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하거나;
e) b)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 b)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하거나;
f) c)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 c)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하는 것인, 단클론 항체.
항목 9. 항목 8에 있어서,
a) 서열번호 7과 적어도 60%, 65% 또는 70%, 바람직하게는 적어도 75% 또는 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 8과 적어도 60%, 65% 또는 70%, 바람직하게는 적어도 75% 또는 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고; 선택적으로 서열번호 1에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 3에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하고, 선택적으로 서열번호 4에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 5에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하거나;
b) 서열번호 17과 적어도 60%, 65% 또는 70%, 바람직하게는 적어도 75% 또는 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 18과 적어도 60%, 65% 또는 70%, 바람직하게는 적어도 75% 또는 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고; 선택적으로 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 13에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 16에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나; 또는
c) 서열번호 27과 적어도 60%, 65% 또는 70%, 바람직하게는 적어도 75% 또는 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 28과 적어도 60%, 65% 또는 70%, 바람직하게는 적어도 75% 또는 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고; 선택적으로 서열번호 21에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 23에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 24에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 25에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 26에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것인, 단클론 항체.
항목 10. 항목 8에 있어서, 단클론 항체는
a) 서열번호 7, 17 또는 27 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 VH 영역을 포함하거나;
b) 서열번호 8, 18 또는 28 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
c) 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
d) 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 18에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
e) 서열번호 27에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
f) c)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 c)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하거나;
g) d)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 d)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하거나; 또는
h) e)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 e)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하는 것인, 단클론 항체.
항목 11. 항목 7 내지 10 중 어느 한 항목에 있어서, sBCMA 에피토프에 대한 결합은 키메라 또는 돌연변이된 BCMA 분자를 이용한 에피토프 맵핑, 부위 지정 돌연변이 유발(예를 들어, 알라닌 스캐닝), 고처리량 샷건 돌연변이 유발 에피토프 맵핑, 가교 결합 커플링된 질량분석법, X선 공결정학, 극저온 전자 현미경, 및 수소-중수소 교환을 통해 결정되는 것인, 단클론 항체.
항목 12. 항목 7 내지 10 중 어느 한 항목에 있어서, sBCMA에 대한 결합을 위한 경쟁은 경쟁적 ELISA 분석, (본 명세서의 실시예 2에 기술된 바와 같은) 옥텟 경쟁 분석, 또는 아비딘 커플링된 미세입자를 이용한 경쟁 분석에서 결정되는 것인, 단클론 항체.
항목 13. 항목 7 내지 10 또는 12 중 어느 한 항목에 있어서, sBCMA에 대한 결합을 위한 경쟁은 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의, 테스트한 2개의 항체들 사이에서 일어나는 경쟁으로 정의되는 것인, 단클론 항체.
항목 14. 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목에 있어서, IgG, IgD, IgE, IgM 또는 IgA 항체, 바람직하게는 IgG 항체, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체인 것인, 단클론 항체.
항목 15. 항목 1 내지 14 중 어느 한 항목에 있어서, 단클론 항체 및/또는 제2 단클론 항체는 생물학적 샘플, 바람직하게는 인간의 생물학적 샘플, 예를 들어, (인간) 혈청 샘플, (인간) 혈장 샘플, (인간) 혈액 샘플, (인간) 골수 샘플, (인간) 조직 샘플, 또는 (인간) 골수 단핵구 세포 또는 (인간) 말초 혈액 단핵구 세포의 세포 배양물로부터 얻은 상청액의 sBCMA에 결합하는 것인, 단클론 항체.
항목 16. 항목 1 내지 15 중 어느 한 항목에서 정의된 바와 같은 단클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
항목 17. 항목 16에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
항목 18. 항목 16에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드로 또는 항목 17에서 정의된 바와 같은 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주 세포.
항목 19. 항목 1 내지 15 중 어느 한 항목에서 정의된 바와 같은 단클론 항체를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 단클론 항체의 발현을 허용하는 조건 하에서 항목 18에서 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양물로부터 생산된 단클론 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
항목 20. 항목 1 내지 15 중 어느 한 항목에서 정의된 바와 같거나, 또는 항목 19의 방법에 따라서 생산된 단클론 항체를 포함하는 조성물.
항목 21. 검출 시스템으로서,
a) sBCMA에 결합하는 제1 단클론 항체, 및
b) sBCMA에 대한 제2 단클론 항체 제1 단클론;을 포함하고,
sBCMA에 대한 제1 단클론 항체의 결합은 sBCMA에 결합하는 제2 단클론 항체의 존재 하에 일어나고/일어나거나, sBCMA에 대한 제2 단클론 항체의 결합은 sBCMA에 결합하는 제1 단클론 항체의 존재 하에 일어나는 것인, 검출 시스템.
항목 22. 항목 21에 있어서, sBCMA는 서열번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것인, 검출 시스템.
항목 23. 항목 21 또는 22에 있어서, sBCMA에 대한 제1 단클론 항체의 결합 및 sBCMA에 대한 제2 단클론 항체의 결합은 sBCMA에 결합하는 제3 항체 또는 항체 구축물의 존재 하에 일어나는 것인, 검출 시스템.
항목 24. 항목 23에 있어서, 제3 항체 또는 항체 구축물은 바람직하게는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, BCMA의 에피토프 클러스터 3, 바람직하게는 인간 BCMA의 에피토프 클러스터 3에 결합하는 것인, 검출 시스템.
항목 25. 항목 21 내지 24 중 어느 한 항목에 있어서, 제1 단클론 항체 및/또는 제2 단클론 항체는 토끼 VH 영역 및/또는 토끼 VL 영역을 포함하는 것인, 검출 시스템.
항목 26. 항목 21 내지 25 중 어느 한 항목에 있어서, 제1 단클론 항체 및/또는 제2 단클론 항체는 약 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M 이하의 sBCMA에 대한 친화도(KD)를 갖는 것인, 검출 시스템.
항목 27. 항목 21 내지 26 중 어느 한 항목에 있어서, 제1 단클론 항체는
a) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 3에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 5에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나;
b) 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 13에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 16에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나; 또는
c) a) 또는 b)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 a) 또는 b)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하고/하거나;
제2 단클론 항체는
d) 서열번호 21에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 23에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 24에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 25에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 26에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나; 또는
e) d)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 d)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하는 것인, 검출 시스템.
항목 28. 항목 27에 있어서, 제1 단클론 항체는
a) 서열번호 7 또는 17에 제시된 바와 같은 VH 영역을 포함하거나;
b) 서열번호 8 또는 18에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
c) 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
d) 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 18에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나; 또는
e) c) 또는 d)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 c) 또는 d)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하고/하거나;
제2 단클론 항체는
f) 서열번호 27에 제시된 바와 같은 VH 영역을 포함하거나;
g) 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
h) 서열번호 27에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나; 또는
i) h)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 h)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하는 것인, 검출 시스템.
항목 29. 항목 21 내지 28 중 어느 한 항목에 있어서, 제1 단클론 항체 및/또는 제2 단클론 항체는 IgG, IgD, IgE, IgM 또는 IgA 항체, 바람직하게는 IgG 항체, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체인 것인, 검출 시스템.
항목 30. 항목 21 내지 29 중 어느 한 항목에 있어서, 제1 단클론 항체는 포획 항체로 사용되고, 제2 단클론 항체는 검출 항체로 사용되거나, 또는 제1 단클론 항체는 검출 항체로 사용되고, 제2 단클론 항체는 포획 항체로 사용되는 것인, 검출 시스템.
항목 31. 다음을 위한 항목 1 내지 15 중 어느 한 항목의 단클론 항체 또는 항목 21 내지 30 중 어느 한 항목의 검출 시스템의 용도:
-샘플의 sBCMA의 검출;
-샘플의 sBCMA의 정량화;
-sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 진단;
-sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환으로 진단된 환자의 계층화;
-sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환 진행의 모니터링; 또는
-sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 치료에 대한 반응의 모니터링.
항목 32. 샘플에서 sBCMA를 검출 및/또는 정량화하는 방법으로서,
(a) 샘플의 sBCMA의 함량을 결정하기 위하여 항목 1 내지 15 중 어느 한 항목의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 이용하거나, 또는 항목 21 내지 30 중 어느 한 항목의 검출 시스템을 이용하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 결정된 sBCMA의 함량을 다음과 비교하는 단계를 포함하는 방법:
(i) sBCMA 함량에 대해 사전 정의된 값,
(ii) 대조군 샘플에서 결정된 sBCMA의 함량, 또는
(iii) 이전의 시점에서 동일한 공급원 또는 대상체로부터 수득한 샘플에서 결정한 sBCMA의 함량.
항목 33. sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환을 진단하는 방법으로서,
(a) 샘플의 sBCMA의 함량을 결정하기 위하여 항목 1 내지 15 중 어느 한 항목의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 이용하거나, 또는 항목 21 내지 30 중 어느 한 항목의 검출 시스템을 이용하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 결정된 sBCMA의 함량을 다음과 비교하는 단계를 포함하고,
(i) 이러한 질환의 부재를 나타내는, sBCMA 함량에 대한 사전 정의된 컷오프 값, 또는
(ii) 이러한 질환의 부재를 나타내는 대조군 샘플에서 결정된 sBCMA의 함량;
이때, (i)의 사전 정의된 컷오프 값 또는 (ii)의 대조군 샘플에서 결정된 sBCMA의 함량과 비교하여 단계 (a)에서 결정된 더 높은 함량의 sBCMA는 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 존재를 나타내는 것인, 방법.
항목 34. sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 진행을 모니터링하거나, sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법으로서,
(a) 이러한 질환으로 진단된 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플의 제1 시점의 sBCMA의 함량을 결정하기 위하여 항목 1 내지 15 중 어느 한 항목의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 이용하거나, 또는 항목 21 내지 30 중 어느 한 항목의 검출 시스템을 이용하는 단계;
(b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플의 제2 시점 또는 치료 후의 sBCMA의 함량을 결정하기 위하여 항목 1 내지 15 중 어느 한 항목의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 이용하거나, 또는 항목 21 내지 30 중 어느 한 항목의 검출 시스템을 이용하는 단계; 및
(c) 단계 (a)에서 결정된 sBCMA의 함량을 단계 (b)에서 결정된 sBCMA의 함량과 비교하는 단계;를 포함하며,
단계 (b)에서 결정된 sBCMA의 함량과 비교하여 단계 (a)에서 결정된 더 높은 함량의 sBCMA는 질환이 진행 중임을 나타내고/내거나, 단계 (b)에서 결정된 sBCMA의 함량과 비교하여 단계 (a)에서 결정된 더 낮은 함량의 sBCMA는 상기 질환이 관해에 들어가고 있거나 상기 질환이 치료에 반응하고 있음을 나타내는 것인, 방법.
항목 35. 항목 31의 용도 또는 항목 32 내지 34 중 어느 한 항목의 방법으로서, 샘플은 생물학적 샘플, 바람직하게는 인간의 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 혈액 샘플, 골수 샘플, 조직 샘플, 또는 골수 단핵구 세포 또는 말초 혈액 단핵구 세포의 세포 배양물로부터 얻은 상청액인 것인, 용도 또는 방법.
항목 36. 항목 31 또는 35의 용도 또는 항목 32 내지 35 중 어느 한 항목의 방법으로서, 샘플은 인간 대상체, 바람직하게는 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환을 앓는 것으로 의심되거나 앓는 인간 대상체, 또는 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환에 대한 치료를 받은 대상체로부터 얻는 것인, 용도 또는 방법.
항목 37. 항목 31, 35 또는 36 중 어느 한 항목의 용도 또는 항목 32 내지 36 중 어느 한 항목의 방법으로서, 질환은 다발성 골수종, 재발된 및/또는 불응성 다발성 골수종, 중쇄 다발성 골수종, 경쇄 다발성 골수종, 골수 외 골수종(골수 외 형질세포종, 골수 외 다발성 골수종), 형질세포종, 형질 세포 백혈병, 발덴스트롬 거대글로불린혈증(림프형질세포성 림프종), 무증상 골수종(무증상 다발성 골수종), 만성 림프성 백혈병(CLL), 원발성 CNS 림프종(PCNSL) 및 B 세포 비 호지킨 림프종(B-NHL)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 용도 또는 방법.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 문맥에서 명백히 달리 나타내지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "시약"에 대한 언급은 하나 이상의 이러한 상이한 시약을 포함하고, "방법"에 대한 언급은 본 명세서에 기술된 방법에 대해 변형되거나 대체될 수 있는 당업자에게 공지된 동등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞의 용어 "적어도"는 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 본 명세서에 기술된 본 발명의 구체적 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나, 통상적 실험만으로도 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명에 포함시키고자 한다.
용어 "및/또는"은 본 명세서에서 어디에 사용되거나 "및", "또는" 및 "상기 용어에 연결되는 요소의 모든 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 ±20% 이내, 바람직하게는 ±15% 이내, 더욱 바람직하게는 ±10% 이내, 가장 바람직하게는 ±5% 이내를 의미한다. 이는 또한 구체적인 값을 포함한다. 예를 들어, "약 50"은 값 "50"을 포함한다.
본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은, 정해진 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군을 포함하지만, 다른 어떤 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하지 않음을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용될 때 용어 "포함하는(comprising)"은 용어 "함유하는(containing)" 또는 "포함하는(including)" 또는 때때로 본 명세서에서 사용되는 용어 "갖는(having)"으로 대체될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "구성된"은 청구범위 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 제외한다. 본 명세서에서 사용될 때, "본질적으로 구성된"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 제외하지 않는다.
본 명세서의 각 경우에, 임의의 용어 "포함하는", "본질적으로 구성된" 및 "구성된"은 다른 두 용어 중 어느 하나로 교체될 수 있다.
위의 설명 및 아래의 실시예는 예시적인 방식을 제공하지만, 본 발명은 본 명세서에서 기술되는 특정 방법론, 기법, 프로토콜, 재료, 시약, 물질 등으로 한정되지 않고, 따라서 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 기술하려는 목적을 위해서이고, 청구범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범주를 제한하지 않고자 한다. 본 발명의 양태는 독립항에 제공된다. 본 발명의 일부 선택적인 특징은 종속항에 제공된다.
이상이든 이하이든 간에, 본 명세서의 내용 전체에 걸쳐 인용되는 모든 간행물 및 특허(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조자의 설명서, 지침서 등을 포함함)는 그 전체가 본 명세서에서 참조로 포함된다. 본 명세서에서의 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 개시보다 선행할 권리가 없다는 인정으로 해석되지 않을 것이다. 참조로 포함된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않을 경우, 본 명세서가 임의의 이러한 자료를 대체할 것이다.
본 발명 및 이의 이점의 더 양호한 이해는, 단지 예시적인 목적을 위해 제공되는 하기 실시예로부터 얻어질 것이다. 실시예는 어떤 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하려는 의도가 아니며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
도 1a 내지 도 1c는 실시예 1에 따라 수행된 분석법의 구성을 도시한 것이다. 도 1a는 BCMA 검출/정량화 ELISA 키트를 이용한 치료적 항-BCMA ab의 잠재적인 간섭을 테스트하기 위한 분석법의 구성을 보여준다. 도 1b는 단클론 치료적 항-sBCMA 항체의 존재 하에 BCMA에 대한 결합에 대한 XenoMouse® 항-BCMA 하이브리도마의 스크리닝에서 포획 및 검출 항체의 이용에 대한 3가지의 상이한 옥텟(Octet) 방식을 보여준다. 도 1c는 치료적 항-BCMA ab와 샌드위치 결합을 위한 토끼 혈청을 스크리닝하기 위한 분석법의 구성을 보여준다.
도 2는 옥텟 분석법에서 치료적 항-BCMA Ab(Ther-Ab2)와 샌드위치 결합을 위한 2개의 토끼 단클론 항-sBCMA Ab(sBCMA-mAb1 및 sBCMA-mAb2)의 특성화를 보여준다(실시예 2a 참고).
도 3은 토끼 단클론 항-sBCMA-mAb3이 sBCMA-mAb1 및 치료적 항-BCMA 항체 Ther-Ab2와 샌드위치 결합할 수 있음을 보여주는 옥텟 분석법의 결과를 보여준다(실시예 2c 참고).
도 4는 도 3에 제시된 결과를 확인시켜 주는 옥텟 분석법의 결과를 보여준다(실시예 2c 참고).
도 5는 비아코어(Biacore)를 통한 토끼 단클론 항-sBCMA 샌드위치 mAb(sBCMA-mAb1, -mAb2 및 -mAb3)의 친화도 결정 결과를 보여준다(도 3 참고).
실시예
실시예 1 : 토끼 단클론 항-sBCMA 샌드위치 mAb의 생성
본 노력의 목표는 치료적 항-BCMA 항체 또는 항체 구축물, 예컨대 "Ther-Ab1" 또는 "Ther-Ab2" 또는 다른 항체/항체 구축물, 예컨대, 동일하거나 유사한 CDR을 갖고/갖거나 sBCMA 내의 동일한 에피토프에 결합하는 것들의 존재 하에서도 sBCMA를 검출하기 위한 비 간섭 항체 쌍("샌드위치 쌍")을 생성하는 것이었다. Ther-Ab2는 이전에 BCMA 세포 외 도메인의 에피토프 클러스터 3(서열번호 35)에 결합하는 것으로 나타난 CD3xBCMA 이중특이적 반감기 연장된 항체 구축물이다. WO 2013/072406 참고. Ther-Ab1은 IgG1 형식을 갖고, 현재 상용 ELISA 키트(R&D systems 염소 다클론 항체 BCMA 포획 및 검출)를 이용한 BCMA 검출/정량화를 방해하는 것으로 나타났다. 도 1a 참고). Ther-Ab1은 다음의 아미노산 서열을 갖는 것으로 WO 2014/089335에 개시되어 있다: WO 2014/089335의 VH-CDR(서열번호 4 내지 6), VL-CDR(서열번호 106 내지 108), VH(서열번호 206), VL(서열번호 240).
다음 단계에서, BCMA에 대해 약 400개의 XenoMouse® 하이브리도마를 생성하고, BCMA에 대한 결합에 대해 ELISA 분석에서 양성으로 테스트되었다. 그러나 이러한 XenoMouse® 하이브리도마의 스크리닝은 상이한 옥텟 형식을 이용할 때에도 Ther-Ab1 샌드위치 항체를 확인하지 못했다(도 1b 참고).
후속 단계에서, 면역원으로서 BCMA를 포함하는 키메라 단백질을 이용하여 토끼 면역화 캠페인을 수행하였다. Ther-Ab1과 샌드위치 결합을 위한 토끼 혈청을 스크리닝하였다. 다음의 재료를 이용하였다:
■스트렙타비딘 바이오센서(Pall ForteBio 18-5021)
■비오틴이 결합된 BCMA
■Ther-Ab1
■토끼 배뇨말기 출혈
■토끼 무관 IgG(Abcam 172730)
■384 웰 평판 검은색 폴리프로필렌 마이크로플레이트(Greiner BioOne 781209)
■96 웰 평판 검은색 폴리프로필렌 마이크로플레이트(Greiner BioOne 655209)
■ForteBio 옥텟 HTX
■옥텟 분석 완충액(10 mM의 Tris, 0.1%의 Triton, 150 mM의 NaCl, 1 mM의 CaCl2, 0.1 mg/mL의 BSA, pH7.4)
모든 샘플은 옥텟 분석 완충액에 제조하였다. Ther-Ab1 및 토끼 무관 IgG를 10 μg/ml로 제조하고, 비오틴-BCMA를 0.15 μg/ml로 제조하였다. 샘플을 384 웰 플레이트에 80 μL/웰로 첨가하였다. 96 웰 플레이트를 이용하여 200 μL의 옥텟 완충액에 바이오센서를 사전 인큐베이션시켰다.
다음과 같이 실행시키는 ForteBio HTX 상에서 분석을 준비하였다(또한, 도 1c 참고)):
1. 기준선(옥텟 완충액, 60초)
2. 로딩(비오틴-BCMA, 300초)
3. 결합(Ther-Ab1, 900초)
4. 기준선(옥텟 완충액, 60초)
5. 샌드위치 항체(토끼 혈청 또는 무관 IgG 항체, 300초)
옥텟의 리포터 포인트 분석 기능을 이용하여 항체 샌드위치 단계의 결합 신호를 결정하였다. 계산된 신호가 절대값이 되도록 항체 샌드위치 단계를 먼저 영(0)으로 조정하였다. 옥텟에 의해 토끼 혈청에서 Ther-Ab1 샌드위치 항체를 확인하였다.
BCMA에 결합하는 토끼 유래 세포의 추가 강화 후, Ther-Ab2를 이용하여 또 다른 옥텟 BCMA 샌드위치 분석을 수행하여, Ther-Ab2 샌드위치 항체의 존재를 확인하였다.
마지막으로, 세 개의 새로운 토끼 항-sBCMA 항체를 확인하고(sBCMA-mAb1, sBCMA-mAb2, 및 sBCMA-mAb3), 이들의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 시퀀싱하였다. 다음 분석에서, 이들 항체를 더욱 상세히 특성화하였다.
실시예 2 : 옥텟 분석법에서 토끼 단클론 항-sBCMA 샌드위치 mAb의 특성화
a) Ther-Ab2와의 샌드위치 결합에 대해 정제된 재조합 항체 sBCMA-mAb1 및 sBCMA-mAb2를 스크리닝하였다. 다음의 재료를 이용하였다:
■항-huFc(동역학) 바이오센서(Pall ForteBio 18-5064)
■BCMA
■Ther-Ab2
■무관(CD3 x 표적-X) 이중특이적 항체 구축물(표적 결합 도메인에서만 Ther-Ab2와 상이함)
■sBCMA-mAb2 비정제, 정량화 상청액
■sBCMA-mAb1
■토끼 무관 IgG(Abcam 172730)
■384 웰 경사판 검은색 폴리프로필렌 마이크로플레이트(ForteBio 18-5080)
■96 웰 평판 검은색 폴리프로필렌 마이크로플레이트(GreinerBioOne 655209)
■ForteBio 옥텟 HTX
■옥텟 분석 완충액(10 mM의 Tris, 0.1%의 Triton, 150 mM의 NaCl, 1 mM의 CaCl2, 0.1 mg/mL의 BSA, pH7.4)
모든 샘플은 옥텟 분석 완충액에 제조하였다. 테스트 항체, 토끼 무관 IgG 및 무관 이중특이적 항체 구축물을 5 μg/mL로 제조하였다. BCMA는 2 μg/mL로 제조하였다. 샘플을 384 웰 플레이트에 60 μL/웰로 첨가하였다. 96 웰 플레이트를 이용하여 200 μL의 옥텟 완충액에 바이오센서를 사전 인큐베이션시켰다.
다음과 같이 실행시키는 ForteBio HTX 상에서 분석을 준비하였다:
1. 기준선(옥텟 완충액, 60초)
2. 제1 항체 로딩(Ther-Ab2 또는 무관 이중특이적 항체 구축물, 120초)
3. 활성화(BCMA, 120초)
4. 기준선(옥텟 완충액, 60초)
5. 제2 항체(sBCMA-mAb2, sBCMA-mAb1 또는 무관 토끼 항체, 120초)
옥텟의 리포터 포인트 분석 기능을 이용하여 제2 항체 단계의 결합 신호를 결정하였다. 계산된 신호가 절대값이 되도록 제2 항체 단계를 먼저 영(0)으로 조정하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. 토끼 항-sBCMA 항체 sBCMA-mAb1 및 sBCMA-mAb2는 Ther-Ab2와 샌드위치 결합하는 것으로 나타났다.
b) 실시예 2a)에 기술된 분석법에 따라, 추가의 옥텟 분석을 수행하였다. 다음의 구성은 항체 sBCMA-mAb1 및 sBCMA-mAb2가 유사한 sBCMA 에피토프를 공유함을 증명하였다(경쟁 분석):
1. 기준선(옥텟 완충액)
2. 제1 항체 로딩(Ther-Ab2)
3. 활성화(BCMA)
4. 기준선(옥텟 완충액)
5. 토끼 항체 1(sBCMA-mAb1, sBCMA-mAb2 또는 무관 토끼 IgG 항체, 아래 표 2 참고)
6. 토끼 항체 2(sBCMA-mAb2, sBCMA-mAb1 또는 무관 토끼 IgG 항체, 아래 표 2 참고)
[표 2] 상이한 실험 접근법(1~9)에서 토끼 항체 1과 2의 조합
Figure pct00004
c) 특히, sBCMA에 대한 226종의 토끼 항체 중 하나, 즉, sBCMA-mAb3만이 Ther-Ab2 및 sBCMA-mAb1과 샌드위치 결합할 수 있었다. 이는 다음 단계를 포함하는 옥텟 샌드위치 분석에서 증명되었다:
1. SA 옥텟 센서에서 B-염소 항-토끼 Fc를 포획한다
2. sBCMA-mAb1과 결합시킨다
3. 무관 IgG로 센서를 차단한다
4. Ther-Ab2 또는 무관 이중특이적 항체 구축물 +/- BCMA와 결합시킨다
5. sBCMA-mAb3과 결합시킨다
결과는 도 3에 도시되어 있다. 이들은 정제된 재조합 항체로서 sBCMA-mAb1 및 sBCMA-mAb3을 이용하고 다음 옥텟 샌드위치 단계를 포함하는 추가 분석에서 확인되었다:
1. SA 옥텟 센서에서 B-염소 항-토끼 Fc를 포획한다
2. sBCMA-mAb1과 결합시킨다
3. 무관 IgG로 센서를 차단한다
4. +/- BCMA와 결합시킨다
5. Ther-Ab2와 결합시킨다
6. sBCMA-mAb3과 결합시킨다
결과는 도 4에 도시되어 있다. 단계 2에서 sBCMA-mAb1을 무관 IgG로 교체하자 BCMA, Ther-Ab2 및 sBCMA-mAb3의 추가적 첨가 후 분석에서 어떠한 신호도 발생하지 않았다(음성 대조군).
d) 다음의 구성은 Ther-Ab2에 의한 최소한의 간섭의 측면에서 최적의 sBCMA / Ther-Ab2 샌드위치는 sBCMA-mAb1로 포획하고, sBCMA-mAb3으로 검출하는 것임을 증명하였다:
1. SA 옥텟 센서에서 B-염소 항-토끼 Fc를 포획한다
2. sBCMA-mAb1(구성 1)과 결합시키거나 sBCMA-mAb3(구성 2)과 결합시킨다
3. 무관 IgG로 센서를 차단한다
4. +/- BCMA와 결합시킨다
5. Ther-Ab2와 결합시킨다
6. sBCMA-mAb3(구성 1)과 결합시키거나 sBCMA-mAb1(구성 2)과 결합시킨다
BCMA이 있고 없는 구성 사이의 신호 차이는 포획 항체로서 sBCMA-mAb3을 이용하는 것과 비교하여 포획 항체로서 sBCMA-mAb1을 이용할 때 더욱 두드러졌다.
실시예 3 : 토끼 단클론 항-sBCMA 샌드위치 mAb의 친화도 결정
결합 친화도 프로파일을 다음의 토끼 단클론 항-sBCMA 샌드위치 결합 mAb에 대해 측정하였다:
-sBCMA-mAb1(모액 농도 1.43 mg/ml)
-sBCMA-mAb2(모액 농도 2.251 mg/ml)
-sBCMA-mAb3(모액 농도 0.78 mg/ml)
25℃에서 비아코어 3000(GE Healthcare)을 이용하여 실험을 수행하였다. 실행 완충제는 HBS-P(10 mM의 HEPES, pH7.4, 150 mM의 NaCl, 0.05%의 계면활성제 P-20) + 0.1%의 BSA였고, 높은 유속(100 μl/분)에서 동역학을 수행하였다. 10 mM의 글리신, pH 1.7을 재생에 사용하였다.
표면 준비: 염소 항-토끼 IgG Fc(제품 번호 111-005-046, Jackson Research)를 소듐 아세테이트, pH 5에 1/20으로 희석하고, 아민 커플링을 이용하는 CM5 센서의 기준 Fc(Fc 1) 및 샘플에 공유적으로 커플링시켰다. 개별 mAb를 HBS-P + 0.1% BSA에 희석하고, sBCMA에 대한 결합의 동역학 분석을 위해 0.3 μg/ml의 Fc 2, 3, 또는 4에 포획시켰다.
상호작용 파라미터: sBCMA(1.19 mg/ml의 모액)를 600 nM, 300 nM, 150 nM, 75 nM, 37.5 nM, 18.8 nM, 및 9.4 nM의 분석물로서 주입하고, 75 nM의 농축 실행을 2회 수행하여 재현성을 판단하였다. 결합 속도를 2.5분 동안 모니터링하였다. 더 느린 오프 레이트(off-rate)를 나타내는 mAb의 경우, 더욱 정확한 동역학을 결정하기 위하여 해리 시간은 20분이었다. 데이터는 기준 Fc 및 0 nM의 분석물 농도를 데이터로부터 제하였다는 점에서 이중 배경 참조되었다. 비아코어 평가 소프트웨어로부터 물질 전달이 있는 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 이용하였다.
결과는 도 5 및 다음 표 3에 도시되어 있다:
[표 3] 토끼 단클론 항-sBCMA 샌드위치 mAb의 친화도 결정
Figure pct00005
[표 4] 서열 표
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
SEQUENCE LISTING <110> Amgen Inc. <120> Antibodies aganist soluble BCMA <130> 32243/53500A/US <150> US 62/738,997 <151> 2018-09-28 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 1 Ser Gly Tyr Tyr Ile Cys 1 5 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 2 Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala 1 5 10 15 Lys Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 3 Asp Tyr Gly His Ser Tyr Trp Asn Leu 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 4 Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Arg Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 5 Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 6 Leu Gly Asp Tyr Tyr Val Ser Ser Tyr Gly Asn Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 7 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Phe 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly His Ser Tyr Trp Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Asp Tyr Tyr Val Ser Ser 85 90 95 Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 9 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Phe 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly His Ser Tyr Trp Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser 180 185 190 Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro 210 215 220 Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 225 230 235 240 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 245 250 255 Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr 260 265 270 Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln 275 280 285 Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His 290 295 300 Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys 305 310 315 320 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln 325 330 335 Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu 340 345 350 Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro 355 360 365 Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn 370 375 380 Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu 385 390 395 400 Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val 405 410 415 Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 420 425 430 Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 10 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 10 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Asp Tyr Tyr Val Ser Ser 85 90 95 Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp 100 105 110 Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Leu Phe Pro Pro Ser Ser Asp Glu Val 115 120 125 Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro 130 135 140 Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys 180 185 190 Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser 195 200 205 Phe Ser Arg Lys Asn Cys 210 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 11 Ser Ser Tyr Trp Ile Cys 1 5 <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 12 Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Gly Asp Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 1 5 10 15 Lys Gly <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 13 Asp Ala Ala Thr Ser Tyr Tyr Ser His Tyr Phe Thr Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 14 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Gly Leu Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 15 Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 16 Gln Val Thr His Tyr Glu Ser Gly Val Pro 1 5 10 <210> 17 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 17 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Gly Asp Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ala Ala Thr Ser Tyr Tyr Ser His Tyr Phe Thr Leu Trp 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 18 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Thr His Tyr Glu Ser Gly 85 90 95 Val Pro Leu Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Glu 100 105 <210> 19 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 19 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Gly Asp Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ala Ala Thr Ser Tyr Tyr Ser His Tyr Phe Thr Leu Trp 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr 130 135 140 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro 165 170 175 Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser 180 185 190 Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 195 200 205 Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys 210 215 220 Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro 275 280 285 Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu 290 295 300 Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro 340 345 350 Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys 370 375 380 Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln 405 410 415 Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 20 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 20 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Thr His Tyr Glu Ser Gly 85 90 95 Val Pro Leu Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Glu Gly Asp Pro Val 100 105 110 Ala Pro Thr Val Leu Leu Phe Pro Pro Ser Ser Asp Glu Val Ala Thr 115 120 125 Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val 130 135 140 Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu 145 150 155 160 Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr 180 185 190 Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Ser 195 200 205 Arg Lys Asn Cys 210 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 21 Ser Tyr Tyr Tyr Met Cys 1 5 <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 22 Cys Ile Phe Ser Asp Ser Gly Gly His Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala 1 5 10 15 Glu Gly <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 23 Asp Arg Arg Asp Val Val Tyr Ile Arg Asp Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 24 Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Asn Asn Asn Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 25 Gly Ala Ser Ser Leu Ala Ser 1 5 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 26 Ala Gly Tyr Lys Arg Tyr Asn Asn Asp Gly His Ala 1 5 10 <210> 27 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 27 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Met Asp Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Ala Cys Ile Phe Ser Asp Ser Gly Gly His Thr Ala Tyr Ala Ser 50 55 60 Trp Ala Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val 65 70 75 80 Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Arg Asp Val Val Tyr Ile Arg Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 28 Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Arg Tyr 85 90 95 Asn Asn Asp Gly His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 29 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 29 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Met Asp Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Ala Cys Ile Phe Ser Asp Ser Gly Gly His Thr Ala Tyr Ala Ser 50 55 60 Trp Ala Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val 65 70 75 80 Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Arg Asp Val Val Tyr Ile Arg Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser 165 170 175 Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val 180 185 190 Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu 275 280 285 Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro 290 295 300 Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg 340 345 350 Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala 370 375 380 Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg 405 410 415 Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 30 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 30 Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Arg Tyr 85 90 95 Asn Asn Asp Gly His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Leu Phe Pro Pro Ser Ser Asp 115 120 125 Glu Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr 130 135 140 Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr 145 150 155 160 Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr 165 170 175 Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser 180 185 190 His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val 195 200 205 Gln Ser Phe Ser Arg Lys Asn Cys 210 215 <210> 31 <211> 323 <212> PRT <213> Oryctolagus <400> 31 Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn 35 40 45 Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys 65 70 75 80 Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala 85 90 95 Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly 100 105 110 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 115 120 125 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 130 135 140 Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val 145 150 155 160 Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile 165 170 175 Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly 180 185 190 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 195 200 205 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val 210 215 220 Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser 225 230 235 240 Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu 245 250 255 Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala 260 265 270 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val 275 280 285 Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met 290 295 300 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser 305 310 315 320 Pro Gly Lys <210> 32 <211> 104 <212> PRT <213> Oryctolagus <400> 32 Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Leu Phe Pro Pro Ser Ser Asp 1 5 10 15 Glu Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr 20 25 30 Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr 35 40 45 Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr 50 55 60 Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser 65 70 75 80 His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val 85 90 95 Gln Ser Phe Ser Arg Lys Asn Cys 100 <210> 33 <211> 184 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 33 Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 30 Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser 35 40 45 Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu 50 55 60 Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile 65 70 75 80 Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu 85 90 95 Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu 100 105 110 Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys 115 120 125 Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe 130 135 140 Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys 145 150 155 160 Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu 165 170 175 Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg 180 <210> 34 <211> 54 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 34 Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 30 Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser 35 40 45 Val Lys Gly Thr Asn Ala 50 <210> 35 <211> 18 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 35 Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg 1 5 10 15 Tyr Cys

Claims (31)

  1. 가용성 BCMA(sBCMA)에 결합하는 단클론 항체로서, sBCMA에 대한 항체의 결합은 sBCMA에 결합하는 제2 단클론 항체의 존재 하에 일어나는 것인, 단클론 항체.
  2. 제1항에 있어서, sBCMA는 서열번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것인, 단클론 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, sBCMA에 대한 단클론 항체의 결합은 sBCMA에 결합하는 제3 항체 또는 항체 구축물의 존재 하에 일어나는 것인, 단클론 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론 항체는 토끼 VH 영역 및/또는 토끼 VL 영역을 포함하는 것인, 단클론 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론 항체는 약 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M 이하의 sBCMA에 대한 친화도(KD)를 갖는 것인, 단클론 항체.
  6. 제5항에 있어서, 친화도는 비아코어 분석에서 결정되는 것인, 단클론 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론 항체는
    a) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 3에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 5에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나;
    b) 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 13에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 16에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나;
    c) 서열번호 21에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 23에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 24에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 25에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 26에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나;
    d) a)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 a)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하거나;
    e) b)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 b)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하거나;
    f) c)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 c)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하는 것인, 단클론 항체.
  8. 제7항에 있어서, 단클론 항체는
    a) 서열번호 7, 17 또는 27 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 VH 영역을 포함하거나;
    b) 서열번호 8, 18 또는 28 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
    c) 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
    d) 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 18에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
    e) 서열번호 27에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
    f) c)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 c)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하거나;
    g) d)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 d)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하거나; 또는
    h) e)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 e)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하는 것인, 단클론 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, IgG, IgD, IgE, IgM 또는 IgA 항체, 바람직하게는 IgG 항체, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체인 것인, 단클론 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론 항체 및/또는 제2 단클론 항체는 인간 혈청, 인간 혈장 또는 인간 혈액 샘플의 sBCMA에 결합하는 것인, 단클론 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 단클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  13. 제11항에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드로 또는 제12항에 정의된 바와 같은 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주 세포.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 단클론 항체를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 단클론 항체의 발현을 허용하는 조건 하에서 제13항에 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양물로부터 생산된 단클론 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같거나, 또는 제14항의 방법에 따라서 생산된 단클론 항체를 포함하는 조성물.
  16. 검출 시스템으로서,
    a) sBCMA에 결합하는 제1 단클론 항체, 및
    b) sBCMA에 대한 제2 단클론 항체 제1 단클론;을 포함하고,
    sBCMA에 대한 제1 단클론 항체의 결합은 sBCMA에 결합하는 제2 단클론 항체의 존재 하에 일어나고/일어나거나, sBCMA에 대한 제2 단클론 항체의 결합은 sBCMA에 결합하는 제1 단클론 항체의 존재 하에 일어나는 것인, 검출 시스템.
  17. 제16항에 있어서, sBCMA는 서열번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것인, 검출 시스템.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, sBCMA에 대한 제1 단클론 항체의 결합 및 sBCMA에 대한 제2 단클론 항체의 결합은 sBCMA에 결합하는 제3 항체 또는 항체 구축물의 존재 하에 일어나는 것인, 검출 시스템.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단클론 항체 및/또는 제2 단클론 항체는 토끼 VH 영역 및/또는 토끼 VL 영역을 포함하는 것인, 검출 시스템.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단클론 항체 및/또는 제2 단클론 항체는 약 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M 이하의 sBCMA에 대한 친화도(KD)를 갖는 것인, 검출 시스템.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단클론 항체는
    a) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 3에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 5에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나;
    b) 서열번호 11에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 12에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 13에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 15에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 16에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나; 또는
    c) a) 또는 b)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 a) 또는 b)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하고/하거나;
    제2 단클론 항체는
    d) 서열번호 21에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열번호 23에 제시된 바와 같은 VH-CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 24에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열번호 25에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열번호 26에 제시된 바와 같은 VL-CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하거나; 또는
    e) d)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 d)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하는 것인, 검출 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 제1 단클론 항체는
    a) 서열번호 7 또는 17에 제시된 바와 같은 VH 영역을 포함하거나;
    b) 서열번호 8 또는 18에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
    c) 서열번호 7에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
    d) 서열번호 17에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 18에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나; 또는
    e) c) 또는 d)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 c) 또는 d)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하고/하거나;
    제2 단클론 항체는
    f) 서열번호 27에 제시된 바와 같은 VH 영역을 포함하거나;
    g) 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나;
    h) 서열번호 27에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 VL 영역을 포함하거나; 또는
    i) h)의 항체와 동일한 sBCMA 에피토프에 결합하거나, 또는 h)의 항체와 sBCMA에 대한 결합을 위해 경쟁하는 것인, 검출 시스템.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단클론 항체 및/또는 제2 단클론 항체는 IgG, IgD, IgE, IgM 또는 IgA 항체, 바람직하게는 IgG 항체, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체인 것인, 검출 시스템.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단클론 항체는 포획 항체로 사용되고, 제2 단클론 항체는 검출 항체로 사용되거나, 또는 제1 단클론 항체는 검출 항체로 사용되고, 제2 단클론 항체는 포획 항체로 사용되는 것인, 검출 시스템.
  25. 다음을 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단클론 항체 또는 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항의 검출 시스템의 용도:
    -샘플의 sBCMA의 검출;
    -샘플의 sBCMA의 정량화;
    -sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 진단;
    -sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환으로 진단된 환자의 계층화;
    -sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환 진행의 모니터링; 또는
    -sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 치료에 대한 반응의 모니터링.
  26. 샘플에서 sBCMA를 검출 및/또는 정량화하는 방법으로서,
    (a) 샘플의 sBCMA의 함량을 결정하기 위하여 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 이용하거나, 또는 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항의 검출 시스템을 이용하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 결정된 sBCMA의 함량을 다음과 비교하는 단계를 포함하는 방법:
    (i) sBCMA 함량에 대해 사전 정의된 값,
    (ii) 대조군 샘플에서 결정된 sBCMA의 함량, 또는
    (iii) 이전의 시점에서 동일한 공급원 또는 대상체로부터 수득한 샘플에서 결정한 sBCMA의 함량.
  27. sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환을 진단하는 방법으로서,
    (a) 샘플의 sBCMA의 함량을 결정하기 위하여 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 이용하거나, 또는 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항의 검출 시스템을 이용하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 결정된 sBCMA의 함량을 다음과 비교하는 단계를 포함하고,
    (i) 이러한 질환의 부재를 나타내는, sBCMA 함량에 대한 사전 정의된 컷오프 값, 또는
    (ii) 이러한 질환의 부재를 나타내는 대조군 샘플에서 결정된 sBCMA의 함량;
    이때, (i)의 사전 정의된 컷오프 값 또는 (ii)의 대조군 샘플에서 결정된 sBCMA의 함량과 비교하여 단계 (a)에서 결정된 더 높은 함량의 sBCMA는 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 존재를 나타내는 것인, 방법.
  28. sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 진행을 모니터링하거나, sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환의 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법으로서,
    (a) 이러한 질환으로 진단된 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플의 제1 시점의 sBCMA의 함량을 결정하기 위하여 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 이용하거나, 또는 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항의 검출 시스템을 이용하는 단계;
    (b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플의 제2 시점 또는 치료 후의 sBCMA의 함량을 결정하기 위하여 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단클론 항체(또는 항체 구축물)를 이용하거나, 또는 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항의 검출 시스템을 이용하는 단계; 및
    (c) 단계 (a)에서 결정된 sBCMA의 함량을 단계 (b)에서 결정된 sBCMA의 함량과 비교하는 단계;를 포함하며,
    단계 (b)에서 결정된 sBCMA의 함량과 비교하여 단계 (a)에서 결정된 더 높은 함량의 sBCMA는 질환이 진행 중임을 나타내고/내거나, 단계 (b)에서 결정된 sBCMA의 함량과 비교하여 단계 (a)에서 결정된 더 낮은 함량의 sBCMA는 상기 질환이 관해에 들어가고 있거나 상기 질환이 치료에 반응하고 있음을 나타내는 것인, 방법.
  29. 제25항의 용도 또는 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법으로서, 샘플은 생물학적 샘플, 바람직하게는 인간의 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 혈액 샘플, 골수 샘플, 조직 샘플, 또는 골수 단핵구 세포 또는 말초 혈액 단핵구 세포의 세포 배양물로부터 얻은 상청액인 것인, 용도 또는 방법.
  30. 제25항 또는 제29항의 용도 또는 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법으로서, 샘플은 인간 대상체, 바람직하게는 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환을 앓는 것으로 의심되거나 앓는 인간 대상체, 또는 sBCMA 또는 증가된 sBCMA와 관련된 질환에 대한 치료를 받은 대상체로부터 얻는 것인, 용도 또는 방법.
  31. 제25항, 제29항 또는 제30항 중 어느 한 항의 용도 또는 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법으로서, 질환은 다발성 골수종, 재발된 및/또는 불응성 다발성 골수종, 중쇄 다발성 골수종, 경쇄 다발성 골수종, 골수 외 골수종(골수 외 형질세포종, 골수 외 다발성 골수종), 형질세포종, 형질 세포 백혈병, 발덴스트롬 거대글로불린혈증(림프형질세포성 림프종), 무증상 골수종(무증상 다발성 골수종), 만성 림프성 백혈병(CLL), 원발성 CNS 림프종(PCNSL) 및 B 세포 비 호지킨 림프종(B-NHL)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 용도 또는 방법.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3819007A1 (en) * 2019-11-11 2021-05-12 Amgen Research (Munich) GmbH Dosing regimen for anti-bcma agents

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1985A (en) 1841-02-18 Charles m
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
ATE120761T1 (de) 1987-05-21 1995-04-15 Creative Biomolecules Inc Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
EP0575319B1 (en) 1991-03-11 1999-11-10 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning and expression of renilla luciferase
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
GB9206422D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Bolt Sarah L Antibody preparation
US7381803B1 (en) 1992-03-27 2008-06-03 Pdl Biopharma, Inc. Humanized antibodies against CD3
AU694745B2 (en) 1993-09-10 1998-07-30 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Uses of green fluorescent protein
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
ES2304786T3 (es) 1995-04-27 2008-10-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados.
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
WO1998026277A2 (en) 1996-12-12 1998-06-18 Prolume, Ltd. Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents
EP1064360B1 (en) 1998-03-27 2008-03-05 Prolume, Ltd. Luciferases, gfp fluorescent proteins, their nucleic acids and the use thereof in diagnostics
PT1071752E (pt) 1998-04-21 2003-11-28 Micromet Ag Polipeptidos especificos para cd19xcd3 e suas utilizacoes
GB9815909D0 (en) 1998-07-21 1998-09-16 Btg Int Ltd Antibody preparation
ATE251181T1 (de) 1998-07-28 2003-10-15 Micromet Ag Heterominikörper
KR101229731B1 (ko) 2003-10-16 2013-03-07 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 다중특이적 탈면역화된 ｃｄ3-바인더
US7728114B2 (en) 2004-06-03 2010-06-01 Novimmune S.A. Anti-CD3 antibodies and methods of use thereof
LT2520590T (lt) 2007-04-03 2018-09-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Susijusioms rūšims specifinis rišantis domenas
AU2009299794B2 (en) 2008-10-01 2015-08-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
US20130078250A1 (en) 2011-08-23 2013-03-28 Oliver Ast Bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN103748114B (zh) 2011-08-23 2017-07-21 罗切格利卡特公司 T细胞活化性双特异性抗原结合分子
TWI679212B (zh) * 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
TW201425336A (zh) 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
AR095374A1 (es) * 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res (Munich) Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
US20140308285A1 (en) 2013-03-15 2014-10-16 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
EP3424952A1 (en) 2013-03-15 2019-01-09 Amgen, Inc Heterodimeric bispecific antibodies
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
EP3733710A1 (en) 2013-09-25 2020-11-04 Amgen, Inc Hetrodimeric v-c-fc-v-c antibody
EP3029068A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
KR20190008171A (ko) * 2015-11-13 2019-01-23 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 항-bcma 폴리펩티드 및 단백질
WO2017123741A1 (en) * 2016-01-12 2017-07-20 Institute For Myeloma & Bone Cancer Research Improved methods for monitoring immune status of a subject
KR20180103084A (ko) 2016-02-03 2018-09-18 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 Bcma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물

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