ES2883371T3 - Polipéptidos de interleucina 2 mutantes - Google Patents

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Peter Bruenker
Anne Freimoser-Grundschober
Sylvia Herter
Thomas U Hofer
Ralf Hosse
Christian Klein
Ekkehard Moessner
Valeria G Nicolini
Pablo Umana
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Abstract

Un inmunoconjugado que comprende: (a) al menos un primer resto efector monocatenario; y (b) un primer y un segundo resto de unión a antígeno, en el que dicho resto efector monocatenario es un polipéptido de interleucina 2 (IL-2) mutante, que comprende tres mutaciones aminoacídicas que anulan o reducen la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de alta afinidad y conservan la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL- 2 de afinidad intermedia, cada uno comparado con un polipéptido de IL-2 natural, en el que dichas tres mutaciones aminoacídicas están en posiciones correspondientes al residuo 42, 45 y 72 de IL-2 humana de acuerdo con la SEQ ID NO: 1; en el que dichas tres mutaciones aminoacídicas del polipéptido de interleucina 2 mutante son las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G, en el que cada uno de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno es una molécula Fab; en el que dicho primer resto efector monocatenario comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con dicho primer resto de unión a antígeno; y en el que dicho segundo resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con dicho primer resto efector.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos de interleucina 2 mutantes
Campo de la invención
La presente invención en general se refiere a inmunoconjugados que comprenden polipéptidos de IL-2 mutantes que presentan propiedades mejoradas para su uso como agentes inmunoterápicos. Además, la invención se refiere a moléculas polinucleotídicas que codifican los inmunoconjugados, y vectores y células huésped que comprenden dichas moléculas polinucleotídicas. La invención se refiere además a procedimientos para producir los inmunoconjugados, composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos y usos de los mismos.
Antecedentes
La interleucina 2 (IL-2), también conocida como factor de crecimiento de linfocitos T (TCGF), es una glucoproteína globular de 15,5 kDa que desempeña un papel principal en la generación, supervivencia y homeostasis de los linfocitos. Tiene una longitud de 133 aminoácidos y consiste en cuatro hélices a anfipáticas antiparalelas que forman una estructura cuaternaria indispensable para su función (Smith, Science 240, 1169-76 (1988); Bazan, Science 257, 410-413 (1992)). Las secuencias de IL-2 de diferentes especies se encuentran bajo la RefSeq de NCBI n.os NP000577 (humano), NP032392 (ratón), NP446288 (rata) o NP517425 (chimpancé).
La IL-2 media su acción uniéndose a los receptores de IL-2 (IL-2R), que consisten en hasta tres subunidades individuales, de las que su diferente asociación puede producir formas receptoras que difieren en su afinidad por IL-2. La asociación de las subunidades a (CD25), p (CD122) y y (Yc, CD132) da como resultado un receptor de alta afinidad trimérico para IL-2. El receptor de IL-2 dimérico que consiste en las subunidades p y Y se denomina IL-2R de afinidad intermedia. La subunidad a forma el receptor de IL-2 de baja afinidad monomérico. Aunque el receptor de IL-2 de afinidad intermedia dimérico se une a IL-2 con una afinidad aproximadamente 100 veces menor que el receptor de alta afinidad trimérico, ambas variantes de receptor de IL-2 dimérico y trimérico pueden transmitir la señal tras la unión a IL-2 (Minami et al., Annu Rev Immunol 11,245-268 (1993)). Por consiguiente, la subunidad a, CD25, no es esencial para la señalización de IL-2. Confiere una unión de alta afinidad a su receptor, mientras que la subunidad p, CD122, y la subunidad Y son cruciales para la transducción de señales (Krieg et al., Proc Natl Acad Sci 107, 11906-11 (2010)). Los receptores de IL-2 triméricos incluyendo CD25 se expresan por linfocitos T reguladores (Treg) de forkhead box P3 (FoxP3)+ de CD4+ (en reposo). También se inducen de forma transitoria en linfocitos T activados convencionales, mientras que en el estado de reposo estas células solo expresan receptores de IL-2 diméricos. Los linfocitos Treg expresan constantemente el mayor nivel de CD25 in vivo (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005)).
La IL-2 se sintetiza principalmente por linfocitos T activados, en particular linfocitos T cooperadores CD4+. Estimula la proliferación y diferenciación de linfocitos T, induce la generación de linfocitos T citotóxicos (CTL) y la diferenciación de linfocitos de sangre periférica en linfocitos citotóxicos y linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK), promueve la expresión de moléculas citolíticas y de citocinas por linfocitos T, facilita la proliferación y diferenciación de linfocitos B y la síntesis de inmunoglobulina por linfocitos B, y estimula la generación, proliferación y activación de linfocitos citolíticos (NK) (revisado, por ejemplo, en Waldmann, Nat Rev Immunol 6, 595-601 (2009); Olejniczak y Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-89 (2008); Malek, Annu Rev Immunol 26, 453-79 (2008)).
Su capacidad para expandir poblaciones de linfocitos in vivo y para incrementar las funciones efectoras de estas células confiere efectos antitumorales a IL-2, lo que hace de la inmunoterapia con IL-2 una opción de tratamiento atractiva para determinados cánceres metastásicos. En consecuencia, se ha aprobado el tratamiento con IL-2 de dosis alta para su uso en pacientes con carcinoma de células renales metastásico y melanoma maligno.
Sin embargo, la IL-2 tiene una función doble en la respuesta inmunitaria ya que no solo media en la expansión y actividad de las células efectoras, sino que también está implicada de forma crucial en el mantenimiento de la tolerancia inmunológica periférica.
Un mecanismo principal subyacente a la autotolerancia periférica es la muerte celular inducida por activación (AICD) inducida por IL-2 en linfocitos T. La AICD es un proceso por el que los linfocitos T totalmente activados experimentan la muerte celular programada a través del acoplamiento de receptores de muerte expresados en la superficie celular tales como CD95 (también conocido como Fas) o el receptor TNF. Cuando los linfocitos T activados por antígeno que expresan el receptor de IL-2 de alta afinidad (después de la exposición previa a IL-2) durante la proliferación se reestimulan con antígeno por medio del complejo receptor de linfocitos T (TCR)/CD3, se induce la expresión del ligando Fas (FasL) y/o factor de necrosis tumoral (TNF), lo que hace que las células sean susceptibles de apoptosis mediada por Fas. Este proceso es dependiente de IL-2 (Lenardo, Nature 353, 858­ 61 (1991)) y está mediado por medio de STAT5. Por el proceso de AICD en linfocitos T, la tolerancia no se puede establecer solo para autoantígenos, sino también para antígenos persistentes que claramente no son parte de la constitución del huésped, tales como antígenos tumorales.
Además, la IL-2 también está implicada en el mantenimiento de los linfocitos T reguladores (Treg) CD4+ CD25+ periféricos (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005); D'Cruz y Klein, Nature Immunol 6, 1152-59 (2005); Maloy y Powrie, Nature Immunol 6, 1171-72 (2005), que también son conocidos como linfocitos T supresores. Anulan a los linfocitos T efectores para no destruir su propia diana, a través del contacto célula-célula inhibiendo la cooperación y activación de los linfocitos T, o bien a través de la liberación de citocinas inmunosupresoras tales como IL-10 o TGF-p. Se demostró que la disminución de linfocitos Treg potencia la inmunidad antitumoral inducida por IL-2 (Imai et al., Cancer Sci 98, 416-23 (2007)).
Por lo tanto, la IL-2 no es óptima para inhibir el crecimiento tumoral, porque en presencia de IL-2 los CTL generados podrían reconocer el tumor como propio y experimentar AICD o bien la respuesta inmunitaria se podría inhibir por linfocitos Treg dependientes de IL-2.
Otra preocupación con relación a la inmunoterapia con IL-2 son los efectos secundarios producidos por el tratamiento con IL-2 humana recombinante. Los pacientes que reciben un tratamiento con IL-2 de dosis alta experimentan con frecuencia acontecimientos adversos cardiovasculares, pulmonares, renales, hepáticos, gastrointestinales, neurológicos, cutáneos, hemáticos y sistémicos graves, que requieren un seguimiento intensivo y abordaje hospitalario. La mayoría de estos efectos secundarios se pueden explicar por el desarrollo del denominado síndrome de filtración vascular (o capilar) (VLS), un incremento patológico en la permeabilidad vascular que da lugar a una extravasación de líquido en múltiples órganos (provocando, por ejemplo, edema pulmonar y cutáneo y daño celular hepático) y disminución de líquido intravascular (provocando un descenso en la tensión arterial e incremento de compensación en la frecuencia cardíaca). No existe ningún tratamiento del VLS aparte de la retirada de IL-2. Se han sometido a prueba pautas posológicas de IL-2 de dosis baja en pacientes para evitar el VLS, sin embargo, a costa de resultados terapéuticos insuficientes. Se creía que el VLS se provocaba por la liberación de citocinas proinflamatorias, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF)-a de linfocitos NK activados por IL-2, sin embargo, recientemente se ha demostrado que el edema pulmonar inducido por IL-2 resultó de la unión directa de IL-2 a células endoteliales pulmonares, lo que expresó niveles de bajos a intermedios de receptores de IL-2 apY funcionales (Krieg et al., Proc Nat Acad Sci USA 107, 11906-11 (2010)).
Se han tomado varios enfoques para superar estos problemas asociados con la inmunoterapia con IL-2. Por ejemplo, se ha descubierto que la combinación de iL-2 con determinados anticuerpos monoclonales anti-IL-2 potencia los efectos del tratamiento de IL-2 in vivo (Kamimura et al., J Immunol 177, 306-14 (2006); Boyman et al., Science 311, 1924-27 (2006)). En un enfoque alternativo, se ha mutado IL-2 de diversas formas para reducir su toxicidad y/o incrementar su eficacia. Hu et al. (Blood 101, 4853-4861 (2003), publicación de patente de EE. UU. n.° 2003/0124678) han sustituido el residuo de arginina en la posición 38 de la IL-2 con triptófano para eliminar la actividad de vasopermeabilidad de IL-2. Shanafelt et al. (Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)) han mutado asparagina 88 en arginina para potenciar la selectividad de los linfocitos T sobre los linfocitos NK. Heaton et al. (Cancer Res 53, 2597-602 (1993); patente de EE. UU. n.° 5.229.109) han introducido dos mutaciones, Arg38Ala y Phe42Lys, para reducir la secreción de citocinas proinflamatorias de los linfocitos NK. Gillies et al. (publicación de patente de EE. UU. n.° 2007/0036752) han sustituido tres residuos de IL-2 (Asp20Thr, Asn88Arg y Gln126Asp) que contribuyen a la afinidad por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia para reducir el VLS. Gillies et al. (documento WO 2008/0034473) también han mutado la interfase de IL-2 con CD25 por sustitución aminoacídica de Arg38Trp y Phe42Lys para reducir la interacción con CD25 y la activación de linfocitos Treg para potenciar la eficacia. Con el mismo objetivo, Wittrup et al. (documento WO 2009/061853) han producido mutantes de IL-2 que tienen una afinidad potenciada por CD25, pero que no activan el receptor, por tanto actúan como antagonistas. Las mutaciones introducidas tenían como objetivo alterar la interacción con la subunidad p y/o y del receptor.
Sin embargo, se demostró que ninguno de los mutantes de IL-2 conocidos supera todos los problemas mencionados anteriormente asociados con la inmunoterapia con IL-2, a saber, la toxicidad provocada por la inducción del VLS, la tolerancia tumoral provocada por la inducción de AICD y la inmunosupresión provocada por la activación de linfocitos Treg. Por tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de potenciar además la utilidad terapéutica de las proteínas IL-2.
Sumario de la invención
La presente invención se basa, en parte, en el reconocimiento de que la interacción de IL-2 con la subunidad a del receptor de IL-2 de alta afinidad trimérico es responsable de los problemas asociados con la inmunoterapia con IL-2.
La invención se refiere a los siguientes inmunoconjugados, polinucleótidos, células huésped, procedimientos de producción de inmunoconjugados y composiciones farmacéuticas:
[1] Un inmunoconjugado que comprende: (a) al menos un primer resto efector monocatenario; y (b) un primer y un segundo resto de unión a antígeno, en el que dicho resto efector monocatenario es un polipéptido de interleucina 2 (IL-2) mutante, que comprende tres mutaciones aminoacídicas que anulan o reducen la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de alta afinidad y conservan la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, cada uno comparado con un polipéptido de lL-2 natural, en el que dichas tres mutaciones aminoacídicas están en posiciones correspondiente al residuo 42, 45 y 72 de IL-2 humana de acuerdo con la SEQ ID NO: 1; en el que dichas tres mutaciones aminoacídicas del polipéptido de interleucina 2 mutante son las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G, en el que cada uno de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno es una molécula Fab; en el que dicho primer resto efector monocatenario comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con dicho primer resto de unión a antígeno; y en el que dicho segundo resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con dicho primer resto efector. Un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante y un resto de unión a antígeno, en el que dicho polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19; y en el que dicho resto de unión a antígeno es una molécula de inmunoglobulina de subclase IgG1 específica para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), que comprende (i) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 41 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39; (ii) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 51 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 49; (iii) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 111 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 109; (iv) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 143 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 141; o (iv) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 151 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 149.
[2] El inmunoconjugado de [1], en el que el polipéptido de interleucina 2 mutante comprende además una mutación aminoacídica que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana.
[3] El inmunoconjugado de [2], en el que dicha mutación aminoacídica que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana es una sustitución aminoacídica seleccionada del grupo de T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K y T3P.
[4] El polipéptido de interleucina 2 mutante inmunoconjugado de [2] o [3], en el que dicha mutación aminoacídica que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana es la sustitución aminoacídica T3A.
[5] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [4], en el que dicho polipéptido de IL-2 mutante es una molécula de IL-2 humana.
[6] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [5], en el que dicho polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19.
[7] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [6], en el que dicho inmunoconjugado consiste en un primer resto efector y primer y segundo restos de unión a antígeno unidos por una o más secuencias conectoras.
[8] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [7], en el que dicha primera molécula Fab se une en su extremo carboxílico de la cadena pesada o ligera al aminoácido aminoterminal de dicho resto efector, y dicho resto efector se une en su aminoácido carboxiterminal al aminoácido aminoterminal de la cadena pesada o ligera de la segunda molécula Fab.
[9] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [8], en el que las regiones variables de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno son específicas para el mismo antígeno.
[10] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [8], en el que las regiones variables de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno son específicas para diferentes antígenos.
[11] El inmunoconjugado de [9] o [10], en el que dicho primer y/o dicho segundo restos de unión a antígeno son específicos para un antígeno seleccionado del grupo que consiste en la proteína de activación de fibroblastos (FAP), el proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP), el dominio A2 de tenascina (TNC-A2), el dominio A1 de tenascina (TNC-A1) y el dominio adicional B de fibronectina (EDB).
[12] El inmunoconjugado de [11], en el que dichos primer y/o segundo restos de unión a antígeno son específicos para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), y en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 y SEQ ID NO: 155, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 153.
[13] Un polinucleótido aislado que codifica un fragmento del inmunoconjugado de [1], en el que dicho polinucleótido codifica (i) las cadenas pesadas de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno y dicho primer resto efector; (ii) las cadenas ligeras de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno y dicho primer resto efector; o (iii) una cadena ligera de dicho primer resto de unión a antígeno, una cadena pesada de dicho segundo resto de unión a antígeno y dicho primer resto efector.
[14] Una célula huésped que comprende el polinucleótido de [13].
[15] Un procedimiento de producción del inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [12], en el que el procedimiento comprende cultivar la célula huésped de [13] en condiciones adecuadas para la expresión del inmunoconjugado.
[16] Una composición que comprende el inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [12] y un vehículo farmacéutico.
[17] El inmunoconjugado de uno cualquiera de [1] a [12] para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un paciente que necesita el mismo.
[18] El inmunoconjugado para su uso de acuerdo con [17], en el que dicha enfermedad es cáncer.
La presente divulgación proporciona un polipéptido de interleucina 2 (IL-2) mutante que comprende una primera mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de alta afinidad y conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, cada uno comparado con un polipéptido de IL-2 natural. En un modo de realización, dicha primera mutación aminoacídica está en una posición correspondiente al residuo 72 de IL-2 humana. En un modo de realización, dicha primera mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica, seleccionada del grupo de L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R y L72K. En un modo de realización más específico, dicha primera mutación aminoacídica es la sustitución aminoacídica L72G. En determinados modos de realización, el polipéptido de IL-2 mutante comprende una segunda mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de alta afinidad y conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de iL-2 de afinidad intermedia, cada uno comparado con un polipéptido de IL-2 natural. En un modo de realización, dicha segunda mutación aminoacídica está en una posición seleccionada de las posiciones correspondientes al residuo 35, 38, 42, 43 y 45 de IL-2 humana. En un modo de realización específico, dicha segunda mutación aminoacídica está en una posición correspondiente al residuo 42 de IL-2 humana. En un modo de realización más específico, dicha segunda mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica, seleccionada del grupo de F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R y F42K. En un modo de realización incluso más específico, dicha segunda mutación aminoacídica es la sustitución aminoacídica F42A. En determinados modos de realización, el polipéptido de interleucina 2 mutante comprende una tercera mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de alta afinidad y conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, cada uno comparado con un polipéptido de IL-2 natural. En un modo de realización particular, el polipéptido de interleucina 2 mutante comprende tres mutaciones aminoacídicas que anulan o reducen la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de alta afinidad y conservan la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, cada uno comparado con un polipéptido de IL-2 natural, en el que dichas tres mutaciones aminoacídicas están en posiciones correspondientes al residuo 42, 45 y 72 de IL-2 humana. En un modo de realización, dichas tres mutaciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas seleccionadas del grupo de F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R y L72K. En un modo de realización específico, dichas tres mutaciones aminoacídicas son las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G. En determinados modos de realización, el polipéptido de interleucina 2 mutante comprende además una mutación aminoacídica que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana es una sustitución aminoacídica seleccionada del grupo de t 3a , T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K y T3P. En un modo de realización específico, la mutación aminoacídica que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana es T3A. En determinados modos de realización, el polipéptido de IL-2 mutante es esencialmente una molécula de IL-2 de longitud completa, en particular una molécula de IL-2 de longitud completa humana.
La divulgación proporciona además un polipéptido de interleucina 2 mutante unido a un resto distinto de IL-2. En determinados modos de realización, dicho resto distinto de IL-2 es un resto dirigido. En determinados modos de realización, dicho resto distinto de IL-2 es un resto de unión a antígeno. En un modo de realización, dicho resto de unión a antígeno es un anticuerpo. En otro modo de realización, dicho resto de unión a antígeno es un fragmento de anticuerpo. En un modo de realización más específico, dicho resto de unión a antígeno se selecciona de una molécula Fab y una molécula scFv. En un modo de realización particular, dicho resto de unión a antígeno es una molécula Fab. En otro modo de realización, dicho resto de unión a antígeno es una molécula scFv. En modos de realización particulares, el polipéptido de IL-2 mutante se une a un primer y un segundo resto distinto de IL-2. En un modo de realización de este tipo, el polipéptido de interleucina 2 mutante comparte un enlace peptídico carboxiterminal con dicho primer resto distinto de IL-2 y un enlace peptídico aminoterminal con dicho segundo resto distinto de IL-2. En un modo de realización, dicho resto de unión a antígeno es una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización más específico, dicho resto de unión a antígeno es una molécula de inmunoglobulina de clase IgG, en particular una de subclase IgG1. En determinados modos de realización, dicho resto de unión a antígeno se dirige a un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de célula tumoral, en particular un antígeno seleccionado del grupo de proteína de activación de fibroblastos (FAP), el dominio A1 de tenascina C (TNC A1), el dominio A2 de tenascina C (TNC A2), el dominio adicional B de fibronectina (EDB), antígeno carcinoembrionario (CEA) y el proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP).
También se proporciona por la divulgación un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento, y un resto de unión a antígeno. En un modo de realización del inmunoconjugado descrito en el presente documento, el polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con dicho resto de unión a antígeno. En modos de realización particulares, el inmunoconjugado comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización de este tipo, el polipéptido de IL-2 mutante comprendido en el inmunoconjugado descrito en el presente documento comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con un primer resto de unión a antígeno y un segundo resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con i) el polipéptido de IL-2 mutante o bien ii) dicho primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno comprendido en el inmunoconjugado descrito en el presente documento es un anticuerpo, en otro modo de realización, dicho resto de unión a antígeno es un fragmento de anticuerpo. En un modo de realización específico, dicho resto de unión a antígeno se selecciona de una molécula Fab y una molécula scFv. En un modo de realización particular, dicho resto de unión a antígeno es una molécula Fab. En otro modo de realización particular, dicho resto de unión a antígeno es una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización más específico, dicho resto de unión a antígeno es una molécula de inmunoglobulina de clase IgG, en particular una de subclase IgG1. En determinados modos de realización, dicho resto de unión a antígeno se dirige a un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de célula tumoral, en particular un antígeno seleccionado del grupo de proteína de activación de fibroblastos (FAP), el dominio A1 de tenascina C (TNC A1), el dominio A2 de tenascina C (TNC A2), el dominio adicional B de fibronectina (EDB), antígeno carcinoembrionario (CEA) y el proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP).
La divulgación proporciona además polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado como se describe en el presente documento, vectores de expresión que comprenden dichos polinucleótidos y células huésped que comprenden los polinucleótidos o los vectores de expresión.
También se proporciona un procedimiento de producción de un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado como se describe en el presente documento, una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y procedimientos de uso de un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado como se describe en el presente documento.
En particular, la divulgación se refiere a un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesite el mismo. En un modo de realización particular, dicha enfermedad es cáncer. En un modo de realización particular, el individuo es un ser humano.
La divulgación también se refiere al uso del polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado como se describe en el presente documento para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad en un individuo que necesite el mismo.
Además, la divulgación se refiere al tratamiento de una enfermedad en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado como se describe en el presente documento. Dicha enfermedad preferentemente es cáncer.
La divulgación también se refiere a la estimulación del sistema inmunitario de un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad eficaz de una composición que comprende el polipéptido de IL-2 mutante o el inmunoconjugado descrito en el presente documento en una forma farmacéuticamente aceptable.
Definiciones
Los términos se usan en el presente documento como se usan en general en la técnica, a menos que se defina de otro modo en lo que sigue.
El término "interleucina 2" o "IL-2" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier IL-2 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) a menos que se indique de otro modo. El término engloba IL-2 sin procesar, así como cualquier forma de IL-2 que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de IL-2, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una IL-2 humana ejemplar se muestra en la SEQ ID NO: 1. La IL-2 humana sin procesar comprende adicionalmente un péptido señal de 20 aminoácidos N terminales que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 272, que está ausente en la molécula de IL-2 madura.
El término "mutante de IL-2" o "polipéptido de IL-2 mutante" como se usa en el presente documento pretende englobar cualquier forma mutante de las diversas formas de la molécula de IL-2 incluyendo IL-2 de longitud completa, formas truncadas de IL-2 y formas donde IL-2 se une a otra molécula tal como por fusión o conjugación química. "Longitud completa" cuando se usa en referencia a IL-2 pretende querer decir la molécula de IL-2 de longitud natural madura. Por ejemplo, IL-2 humana de longitud completa se refiere a una molécula que tiene 133 aminoácidos (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 1). Las diversas formas de mutantes de IL-2 se caracterizan por tener al menos una mutación aminoacídica que afecta a la interacción de IL-2 con CD25. Esta mutación puede implicar la sustitución, deleción, truncamiento o modificación del residuo aminoacídico natural situado normalmente en esa posición. Son preferentes los mutantes obtenidos por sustitución aminoacídica. A menos que se indique de otro modo, un mutante de IL-2 se puede denominar en el presente documento secuencia peptídica mutante de IL-2, polipéptido mutante de IL-2, proteína mutante de IL-2 o análogo mutante de IL-2.
La designación de las diversas formas de IL-2 se realiza en el presente documento con respecto a la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1. Se pueden usar diversas designaciones en el presente documento para indicar la misma mutación. Por ejemplo, se puede indicar una mutación de fenilalanina en la posición 42 a alanina como 42A, A42, A42, F42A o Phe42Ala.
El término "mutación aminoacídica", como se usa en el presente documento, pretende englobar sustituciones, deleciones, inserciones y modificaciones aminoacídicas. Se puede realizar cualquier combinación de sustitución, deleción, inserción y modificación para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión reducida a CD25. Las deleciones e inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen deleciones e inserciones de aminoácidos amino y/o carboxiterminales. Un ejemplo de una deleción terminal es la deleción del residuo de alanina en la posición 1 de la IL-2 humana de longitud completa. Las mutaciones aminoacídicas preferentes son las sustituciones aminoacídicas. Con el propósito de alterar, por ejemplo, las características de unión de un polipéptido de IL-2, son en particular preferentes las sustituciones aminoacídicas no conservadoras, es decir, el reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas diferentes. Las sustituciones aminoacídicas preferentes incluyen reemplazar un aminoácido hidrófobo por uno hidrófilo. Las sustituciones aminoacídicas incluyen el reemplazo por aminoácidos no naturales o por derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar (por ejemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metilhistidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). Se pueden generar mutaciones aminoacídicas usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis dirigida al sitio, PCR, síntesis génica y similares. Se contempla que también pueden ser útiles procedimientos de alteración del grupo de cadena lateral de un aminoácido por procedimientos distintos de genomanipulación, tales como modificación química.
Como se usa en el presente documento, una forma "natural" de IL-2 es una forma de IL-2 que, de otro modo, es igual al polipéptido de IL-2 mutante, excepto en que la forma natural tiene un aminoácido natural en cada posición de aminoácido del polipéptido de IL-2 mutante. Por ejemplo, si el mutante de IL-2 es la IL-2 de longitud completa (es decir, IL-2 no fusionada ni conjugada con ninguna otra molécula), la forma natural de este mutante es IL-2 natural de longitud completa. Si el mutante de IL-2 es una fusión entre IL-2 y otro polipéptido codificado hacia 3' de IL-2 (por ejemplo, una cadena de anticuerpo), la forma natural de este mutante de IL-2 es IL-2 con una secuencia de aminoácidos natural fusionada al mismo polipéptido hacia 3'. Además, si el mutante de IL-2 es una forma truncada de IL-2 (la secuencia mutada o modificada dentro de la porción no truncada de IL-2), entonces la forma natural de este mutante de IL-2 es una IL-2 truncada de forma similar que tiene una secuencia natural. Con el propósito de comparar la afinidad de unión al receptor de IL-2 o la actividad biológica de diversas formas de mutantes de IL-2 con la correspondiente forma natural de IL-2, el término natural engloba formas de IL-2 que comprenden una o más mutaciones aminoacídicas que no afectan a la unión al receptor de IL-2 en comparación con la IL-2 natural, tal como, por ejemplo, una sustitución de cisteína en una posición correspondiente al residuo 125 de IL-2 humana por alanina. En algunos modos de realización, la IL-2 natural para el propósito de la presente divulgación comprende la sustitución aminoacídica C125A (véase SEQ ID NO: 3). En determinados modos de realización de acuerdo con la divulgación, el polipéptido de IL-2 natural con el que se compara el polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En otros modos de realización, el polipéptido de IL-2 natural con el que se compara el polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
El término "CD25" o "subunidad a del receptor de IL-2" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier CD25 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) a menos que se indique de otro modo. El término engloba el CD25 no procesado "de longitud completa", así como cualquier forma de CD25 que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de CD25, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. En determinados modos de realización, CD25 es CD25 humano. La secuencia de aminoácidos de un CD25 humano ejemplar (con la secuencia señal, marca Avi y marca His) se muestra en la SEQ ID NO: 278.
El término "receptor de IL-2 de afinidad alta" como se usa en el presente documento, se refiere a la forma heterotrimérica del receptor de IL-2, que consiste en la subunidad y del receptor (también conocida como subunidad y del receptor de citocina común, Yc, o CD132), la subunidad p del receptor (también conocida como CD122 o p70) y la subunidad a del receptor (también conocida como CD25 o p55). El término "receptor de IL-2 de afinidad intermedia" por contraste se refiere al receptor de IL-2 que incluye solo la subunidad Y y la subunidad p, sin la subunidad a (para una revisión véase, por ejemplo, Olejniczak y Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)).
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un receptor) y su compañero de unión (por ejemplo, un ligando). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, receptor y ligando). La afinidad de una molécula X por su compañera Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y kas, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. La afinidad se puede medir por procedimientos bien establecidos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento.
La afinidad del polipéptido de IL-2 mutante o natural por diversas formas del receptor de IL-2 se puede determinar de acuerdo con el procedimiento expuesto en los ejemplos por resonancia de plasmón superficial (SPR), usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare) y subunidades de receptor tales como las que se pueden obtener por expresión recombinante (véase, por ejemplo, Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)). De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de los mutantes de IL-2 por diferentes formas del receptor de IL-2 usando líneas celulares conocidas por expresar una o la otra de dichas formas del receptor. Los modos de realización ilustrativos y ejemplares específicos para medir la afinidad de unión se describen a continuación en el presente documento.
Por "linfocito T regulador" o "linfocito Treg" se quiere decir un tipo especializado de linfocito T CD4+ que puede suprimir las respuestas de otros linfocitos T. Los linfocitos Treg se caracterizan por la expresión de la subunidad a del receptor de IL-2 (CD25) y el factor de transcripción forkhead box P3 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)) y desempeñan un papel crítico en la inducción y mantenimiento de la autotolerancia periférica a antígenos, incluyendo los expresados por tumores. Los linfocitos Treg requieren de IL-2 para su función y desarrollo e inducción de sus características supresoras.
Como se usa en el presente documento, el término "células efectoras" se refiere a una población de linfocitos que median en los efectos citotóxicos de IL-2. Las células efectoras incluyen linfocitos T efectores tales como linfocitos T citotóxicos CD8+, linfocitos NK, linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK) y macrófagos/monocitos.
Como se usa en el presente documento, el término "resto de unión a antígeno" se refiere a una molécula polipeptídica que se une específicamente a un determinante antigénico. En un modo de realización, un resto de unión a antígeno puede dirigir la entidad a la que se fija (por ejemplo, una citocina o un segundo resto de unión a antígeno) a un sitio diana, por ejemplo a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que lleva el determinante antigénico. Los restos de unión a antígeno incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, como se define además en el presente documento. Los restos de unión a antígeno preferentes incluyen un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende una región variable de la cadena pesada del anticuerpo y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo. En determinados modos de realización, los restos de unión a antígeno pueden incluir regiones constantes del anticuerpo como se define además en el presente documento y es conocido en la técnica. Las regiones constantes de la cadena pesada útiles incluyen cualquiera de los cinco isotipos: a, 5, £, Y o |j. Las regiones constantes de la cadena ligera útiles incluyen cualquiera de los dos isotipos: k y A.
Por "se une específicamente" se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de un resto de unión a antígeno para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)).
Como se usa en el presente documento, el término "determinante antigénico" es sinónimo de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (por ejemplo, un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional compuesta por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un resto de unión a antígeno, formando un complejo de resto de unión a antígeno-antígeno. Se pueden encontrar determinantes antigénicos útiles, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células enfermas, libres en el suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (MEC).
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de, o de manera intercambiable con, cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, incluyendo sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos no naturales. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o producir por tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Se puede generar de cualquier manera, incluyendo por síntesis química. Un polipéptido como se describe en el presente documento puede tener un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más o 2000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no tienen necesariamente dicha estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, se denominan desplegados.
Por un polipéptido "aislado" o una variante o derivado del mismo se entiende un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado se puede retirar de su entorno natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de forma recombinante expresados en células huésped se consideran aislados para el propósito de la divulgación, ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente por cualquier técnica adecuada.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, b La s T-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (que, de forma alternativa, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos de B. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se indique específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.
El término "polinudeótido" se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN derivado de virus o ADN de plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en los ácidos peptidonucleicos (APN)). El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a uno cualquiera o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.
Por molécula de ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido terapéutico contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente divulgación. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterógenas o polinucleótidos (parcial o sustancialmente) purificados en solución. Un polinucleótido aislado incluye una molécula polinucleotídica contenida en células que contienen normalmente la molécula polinucleotídica, pero la molécula polinucleotídica está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. Las moléculas de ARN aislado incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro descritos en el presente documento, así como formas de hebra positiva y negativa, y formas bicatenarias. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma o un finalizador de la transcripción.
Por un ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, un 95 % "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia descrita en el presente documento, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia se puede delecionar o sustituir con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta un 5 % de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como una cuestión práctica, se puede determinar de forma convencional si cualquier secuencia polinucleotídica particular es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento, usando programas informáticos conocidos, tales como los analizados anteriormente para polipéptidos (por ejemplo, ALIGN-2).
El término "casete de expresión" se refiere a un polinucleótido generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y un promotor. En determinados modos de realización, el casete de expresión descrito en el presente documento comprende secuencias polinucleotídicas que codifican polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados como se describe en el presente documento o fragmentos de los mismos.
El término "vector" o "vector de expresión" es sinónimo de "construcción de expresión" y se refiere a una molécula de ADN que se usa para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que se asocia de forma funcional en una célula diana. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. El vector de expresión descrito en el presente documento comprende un casete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez que el vector de expresión está en el interior de la célula diana, la molécula de ácido ribonucleico o proteína que se codifica por el gen se produce por el mecanismo de transcripción y/o traducción celular. En un modo de realización, el vector de expresión descrito en el presente documento comprende un casete de expresión que comprende secuencias polinucleotídicas que codifican polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados como se describe en el presente documento o fragmentos de los mismos.
El término "artificial" se refiere a una composición sintética o no derivada de células huésped, por ejemplo, un oligonucleótido sintetizado químicamente.
Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.
El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.
Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.
269-315 (1994); véanse también el documento WO93/16185; y las patentes de EE. UU. n.os 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos del epítopo de unión al receptor de rescate y que tienen un incremento de la semivida in vivo, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129­ 134 (2003); y Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat. Med. 9, 129-134 (2003). Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
El término "molécula de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glucoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio variable pesado o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados regiones constantes de la cadena pesada. De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio variable ligero o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio constante ligero (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de una inmunoglobulina se puede asignar a una de cinco clases, llamadas a (IgA), 5 (IgD), £ (IgE), y (IgG) o |j (IgM), de las que algunas se pueden dividir además en subclases, por ejemplo, Y1 (IgG1), Y2 (IgG2), Y3 (IgG3), Y4 (IgG4), a1 (IgA1) y a2 (IgA2). La cadena ligera de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente en dos moléculas Fab y un dominio Fc, unidos por medio de la región bisagra de inmunoglobulina.
El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria a parte o la totalidad de un antígeno. Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, por uno o más dominios variables de anticuerpo (también llamados regiones variables de anticuerpo). Preferentemente, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen, en general, estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno.
El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden en general residuos aminoacídicos de los bucles hipervariables y/o de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), siendo las últimas las de variabilidad de secuencia más alta y/o estando implicadas en el reconocimiento antigénico. Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR comprenden en general los residuos aminoacídicos que forman los bucles hipervariables. Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), y estos términos se usan en el presente documento de manera intercambiable en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular se ha descrito por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) y por Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), donde las definiciones incluyen la superposición o subconjuntos de residuos aminoacídicos cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo esté dentro del alcance del término como se define y se usa en el presente documento. Los residuos aminoacídicos apropiados que engloban las CDR, como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen a continuación en la tabla 1 a modo de comparación. Los números de residuos exactos que engloba una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.
TABLA1. Definiciones de CDR1
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1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la tabla 1 es de acuerdo con las convenciones de numeración expuestas por Kabat et al. (véase a continuación).
2 "AbM" con una "b" minúscula, como se usa en la tabla 1, se refiere a las CDR como se define por el programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.
Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para secuencias de región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de la región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de posiciones de residuos aminoacídicos específicas en una región variable de anticuerpo son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.
Las secuencias polipeptídicas del listado de secuencias (es decir, SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, etc.) no se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, está dentro de la habilidad del experto en la técnica convertir la numeración de las secuencias del listado de secuencias a la numeración de Kabat.
"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, y y M, respectivamente.
El término "región Fc" se usa en el presente documento para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente por extenderse desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no.
Una "modificación que promueve la heterodimerización" es una manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido, por ejemplo, una cadena pesada de inmunoglobulina, que reduce o impide la asociación del polipéptido con un polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación que promueve la heterodimerización como se usa en el presente documento incluye en particular las modificaciones separadas realizadas en cada uno de dos polipéptidos deseados para formar un dímero, en el que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de los dos polipéptidos. Por ejemplo, una modificación que promueve la heterodimerización puede alterar la estructura o carga de uno o ambos de los polipéptidos deseados para formar un dímero para hacer su asociación estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. La heterodimerización se produce entre dos polipéptidos no idénticos, tales como dos cadenas pesadas de inmunoglobulina en las que otros componentes inmunoconjugados fusionados a cada una de las cadenas pesadas (por ejemplo, el polipéptido de IL-2) no son los mismos. En los inmunoconjugados de la presente divulgación, la modificación que promueve la heterodimerización está en la(s) cadena(s) pesada(s), específicamente en el dominio Fc, de una molécula de inmunoglobulina. En algunos modos de realización, la modificación que promueve la heterodimerización comprende una mutación aminoacídica, específicamente una sustitución aminoacídica. En un modo de realización particular, la modificación que promueve la heterodimerización comprende una mutación aminoacídica separada, específicamente una sustitución aminoacídica, en cada una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina.
El término "funciones efectoras" cuando se usa en referencia a los anticuerpos se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión al receptor Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B), y activación de linfocitos B.
Un "receptor Fc activador" es un receptor Fc que, después del acoplamiento por una región Fc de un anticuerpo, provoca acontecimientos de señalización que estimulan a la célula portadora del receptor para realizar funciones efectoras. Los receptores Fc activadores incluyen FcYRIIIa (CDl6a), FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89).
Como se usa en el presente documento, se considera que los términos "genomanipular, genomanipulado, genomanipulación" incluyen cualquier manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La genomanipulación incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación, o del grupo de cadena lateral de aminoácidos individuales, así como combinaciones de estos enfoques.
Como se usa en el presente documento, el término "inmunoconjugado" se refiere a una molécula polipeptídica que incluye al menos un resto de IL-2 y al menos un resto de unión a antígeno. En determinados modos de realización, el inmunoconjugado comprende al menos un resto de IL-2 y al menos dos restos de unión a antígeno. Los inmunoconjugados particulares de acuerdo con la divulgación consisten esencialmente en un resto de IL-2 y dos restos de unión a antígeno unidos por una o más secuencias conectoras. El resto de unión a antígeno se puede unir al resto de IL-2 por una variedad de interacciones y en una variedad de configuraciones como se describe en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término "resto de unión a antígeno de control" se refiere a un resto de unión a antígeno como existiría libre de otros restos de unión a antígeno y restos efectores. Por ejemplo, cuando se compara un inmunoconjugado Fab-IL2-Fab como se describe en el presente documento con un resto de unión a antígeno de control, el resto de unión a antígeno de control es Fab libre, en el que tanto el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab como la molécula Fab libre se pueden unir específicamente al mismo determinante antigénico.
Como se usa en el presente documento, los términos "primero" y "segundo" con respecto a los restos de unión a antígeno, etc., se usan por conveniencia para distinguir cuando hay más de uno de cada tipo de resto. El uso de estos términos no pretende conferir un orden u orientación específica del inmunoconjugado a menos que así se establezca explícitamente.
Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene efectos adversos de una enfermedad.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). Preferentemente, el individuo o sujeto es un ser humano.
El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la composición.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural de una enfermedad en el individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados descritos en el presente documento se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.
Descripción detallada de los modos de realización
La presente invención tiene como objetivo proporcionar un polipéptido de IL-2 mutante que tiene propiedades mejoradas para inmunoterapia. En particular, la invención tiene como objetivo eliminar las propiedades farmacológicas de IL-2 que contribuyen a la toxicidad pero que no son esenciales para la eficacia de IL-2. Como se analiza anteriormente, las diferentes formas del receptor de IL-2 consisten en subunidades diferentes y presentan afinidades diferentes por IL-2. El receptor de IL-2 de afinidad intermedia, que consiste en las subunidades de receptores p y y, se expresa en células efectoras en reposo y es suficiente para la señalización de IL-2. El receptor de IL-2 de alta afinidad, que comprende adicionalmente la subunidad a del receptor, se expresa principalmente en linfocitos T reguladores (Treg) así como en células efectoras activadas donde su acoplamiento por IL-2 puede promover la inmunosupresión mediada por linfocitos Treg o muerte celular inducida por activación (AICD), respectivamente. Por tanto, sin quedar vinculado a ninguna teoría, reducir o anular la afinidad de IL-2 por la subunidad a del receptor de IL-2 debería reducir la regulación por disminución inducida por IL-2 de la función celular efectora por los linfocitos T reguladores y el desarrollo de tolerancia tumoral por el proceso de AICD. Por otra parte, mantener la afinidad por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia debería conservar la inducción de la proliferación y activación de células efectoras como linfocitos NK y T por IL-2.
Ya existen varios mutantes de IL-2 en la técnica, sin embargo, los autores de la invención han descubierto mutaciones aminoacídicas novedosas del polipéptido de IL-2 y combinaciones de las mismas que son en particular adecuadas para conferir a la IL-2 las características deseadas para inmunoterapia.
La divulgación proporciona un polipéptido de interleucina 2 (IL-2) mutante que comprende una mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 y conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia cada uno comparado con un polipéptido de iL-2 natural.
Los mutantes de IL-2 humana (hIL-2) con afinidad disminuida por CD25 se pueden generar, por ejemplo, por sustitución aminoacídica en la posición de aminoácido 35, 38, 42, 43, 45 o 72 o combinaciones de las mismas. Las sustituciones aminoacídicas ejemplares incluyen K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R y L72K. Los mutantes de IL-2 particulares descritos en el presente documento comprenden una mutación en una posición de aminoácido correspondiente al residuo 42, 45 o 72 de IL-2 humana, o una combinación de las mismas. Estos mutantes presentan una afinidad de unión sustancialmente similar por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia y tienen una afinidad sustancialmente reducida por la subunidad a del receptor de IL-2 y el receptor de IL-2 de alta afinidad en comparación con una forma natural del mutante de IL-2.
Otras características de mutantes útiles pueden incluir la capacidad de inducir la proliferación de linfocitos T y/o NK que portan el receptor de IL-2, la capacidad de inducir la señalización de IL-2 en linfocitos T y/o NK que portan el receptor de IL-2, la capacidad de generar el interferón (IFN)-y como una citocina secundaria por linfocitos NK, una capacidad reducida para inducir la elaboración de citocinas secundarias, en particular IL-10 y TNF-a, por células mononucleares de sangre periférica (PBMC), una capacidad reducida para activar linfocitos T reguladores, una capacidad reducida para inducir apoptosis en linfocitos T y un perfil de toxicidad reducido in vivo.
En un modo de realización de acuerdo con la divulgación, la mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de alta afinidad y conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia está en una posición correspondiente al residuo 72 de IL-2 humana. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica. En un modo de realización, dicha sustitución aminoacídica se selecciona del grupo de L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R y L72K. En un modo de realización más específico, dicha mutación aminoacídica es la sustitución aminoacídica L72G.
En un aspecto particular, la divulgación proporciona un polipéptido de IL-2 mutante que comprende una primera y una segunda mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 y conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de iL-2 de afinidad intermedia. En un modo de realización, dicha primera mutación aminoacídica está en una posición correspondiente al residuo 72 de IL-2 humana. En un modo de realización, dicha primera mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica. En un modo de realización específico, dicha primera mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica, seleccionada del grupo de L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R y L72K. En un modo de realización incluso más específico, dicha sustitución aminoacídica es L72G. Dicha segunda mutación aminoacídica está en una posición diferente a dicha primera mutación aminoacídica. En un modo de realización, dicha segunda mutación aminoacídica está en una posición seleccionada de una posición correspondiente al residuo 35, 38, 42, 43 y 45 de IL-2 humana. En un modo de realización, dicha segunda mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica. En un modo de realización específico, dicha sustitución aminoacídica se selecciona del grupo de K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R e Y45K. En un modo de realización particular, dicha segunda mutación aminoacídica está en una posición correspondiente al residuo 42 o 45 de IL-2 humana. En un modo de realización específico, dicha segunda mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica, seleccionada del grupo de F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R e Y45K. En un modo de realización más específico, dicha segunda mutación aminoacídica es la sustitución aminoacídica F42A o Y45A. En un modo de realización más particular, dicha segunda mutación aminoacídica es en la posición correspondiente al residuo 42 de IL-2 humana. En un modo de realización específico, dicha segunda mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica, seleccionada del grupo de F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R y F42K. En un modo de realización más específico, dicha sustitución aminoacídica es F42A. En otro modo de realización, dicha segunda mutación aminoacídica es en la posición correspondiente al residuo 45 de IL-2 humana. En un modo de realización específico, dicha segunda mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica, seleccionada del grupo de Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R e Y45K. En un modo de realización más específico, dicha sustitución aminoacídica es Y45A. En determinados modos de realización, el polipéptido de IL-2 mutante comprende una tercera mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 y conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, cada uno comparado con un polipéptido de IL-2 natural. Dicha tercera mutación aminoacídica es en una posición diferente de dichas primera y segunda mutaciones aminoacídicas. En un modo de realización, dicha tercera mutación aminoacídica está en una posición seleccionada de una posición correspondiente al residuo 35, 38, 42, 43 y 45 de IL-2 humana. En un modo de realización preferente, dicha tercera mutación aminoacídica está en una posición correspondiente al residuo 42 o 45 de IL-2 humana. En un modo de realización, dicha tercera mutación aminoacídica está en una posición correspondiente al residuo 42 de IL-2 humana. En otro modo de realización, dicha tercera mutación aminoacídica está en una posición correspondiente al residuo 45 de IL-2 humana. En un modo de realización, dicha tercera mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica. En un modo de realización específico, dicha sustitución aminoacídica se selecciona del grupo de K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R e Y45K. En un modo de realización más específico, dicha sustitución aminoacídica se selecciona del grupo de F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R e Y45K. En un modo de realización incluso más específico, dicha sustitución aminoacídica es F42A o Y45A. En un modo de realización, dicha sustitución aminoacídica es F42A. En otro modo de realización, dicha sustitución aminoacídica es Y45A. En determinados modos de realización, el polipéptido de IL-2 mutante no comprende una mutación aminoacídica en la posición correspondiente al residuo 38 de IL-2 humana.
En un aspecto incluso más particular de la divulgación se proporciona un polipéptido de IL-2 mutante que comprende tres mutaciones aminoacídicas que anulan o reducen la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 pero conservan la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia. En un modo de realización, dichas tres mutaciones aminoacídicas están en posiciones correspondientes a los residuos 42, 45 y 72 de IL-2 humana. En un modo de realización, dichas tres mutaciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas. En un modo de realización, dichas tres mutaciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas seleccionadas del grupo de F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R y L72K. En un modo de realización específico, dichas tres mutaciones aminoacídicas son las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G.
En determinados modos de realización, dicha mutación aminoacídica reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 en al menos 5 veces, específicamente al menos l0 veces, más específicamente al menos 25 veces. En modos de realización donde existe más de una mutación aminoacídica que reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2, la combinación de estas mutaciones aminoacídicas puede reducir la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 en al menos 30 veces, al menos 50 veces, o incluso al menos 100 veces. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica o combinación de mutaciones aminoacídicas anula la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 de modo que no es detectable ninguna unión por resonancia de plasmón superficial como se describe a continuación en el presente documento.
Una unión sustancialmente similar al receptor de afinidad intermedia, es decir, la conservación de la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por dicho receptor, se logra cuando el mutante de IL-2 presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de una forma natural del mutante de IL-2 por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia. Los mutantes de IL-2, como se describe en el presente documento, pueden presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad.
Los autores de la invención han descubierto que una reducción de la afinidad de IL-2 por la subunidad a del receptor de IL-2 en combinación con la eliminación de la O-glucosilación de IL-2 da como resultado una proteína IL-2 con propiedades mejoradas. Por ejemplo, la eliminación del sitio de O-glucosilación da como resultado un producto más homogéneo cuando el polipéptido de IL-2 mutante se expresa en células de mamífero tales como células CHO o HEK.
Por tanto, en determinados modos de realización, el polipéptido de IL-2 mutante descrito en el presente documento comprende una mutación aminoacídica adicional que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica adicional que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana es una sustitución aminoacídica. Las sustituciones aminoacídicas ejemplares incluyen T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K y T3P. En un modo de realización específico, dicha mutación aminoacídica adicional es la sustitución aminoacídica T3A.
En determinados modos de realización, el polipéptido de IL-2 mutante es esencialmente una molécula de IL-2 de longitud completa. En determinados modos de realización, el polipéptido de IL-2 mutante es una molécula de IL-2 humana. En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 con al menos una mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor IL-2 pero conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de iL-2 de afinidad intermedia, en comparación con un polipéptido de IL-2 que comprende la SEQ ID NO: 1 sin dicha mutación. En otro modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3 con al menos una mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 pero conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con un polipéptido de IL-2 que comprende la SEQ ID NO: 3 sin dicha mutación.
En un modo de realización específico, el polipéptido de IL-2 mutante puede provocar una o más de las respuestas celulares seleccionadas del grupo que consiste en: proliferación en una célula linfocitaria T activada, diferenciación en una célula linfocitaria T activada, actividad de linfocitos T citotóxicos (CTL), proliferación en un linfocito B activado, diferenciación en un linfocito B activado, proliferación en un linfocito citolítico (NK), diferenciación en un linfocito NK, secreción de citocina por un linfocito T activado o un linfocito NK, y citotoxicidad antitumoral de linfocitos NK/linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK).
En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante tiene una capacidad reducida para inducir la señalización de IL-2 en linfocitos T reguladores, en comparación con un polipéptido de IL-2 natural. En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante induce menos muerte celular inducida por activación (AICD) en linfocitos T, en comparación con un polipéptido de IL-2 natural. En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante tiene un perfil de toxicidad reducido in vivo, en comparación con un polipéptido de IL-2 natural. En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante tiene una semivida en suero prolongada, en comparación con un polipéptido de IL-2 natural.
Un polipéptido de IL-2 mutante particular descrito en el presente documento comprende cuatro sustituciones aminoacídicas en las posiciones correspondientes a los residuos 3, 42, 45 y 72 de IL-2 humana. Las sustituciones de aminoácidos específicas son T3A, F42A, Y45A y L72G. Como se demuestra en los ejemplos adjuntos, dicho polipéptido de IL-2 mutante cuádruple presenta ninguna unión detectable a CD25, capacidad reducida para inducir apoptosis en linfocitos T, capacidad reducida para inducir la señalización de IL-2 en linfocitos Treg y un perfil de toxicidad reducido in vivo. Sin embargo, retiene la capacidad de activar la señalización de IL-2 en células efectoras, para inducir la proliferación de células efectoras y para generar IFN-y por linfocitos NK como una citocina secundaria.
Además, dicho polipéptido de IL-2 mutante tiene otras propiedades ventajosas, tales como hidrofobicidad superficial reducida, buena estabilidad y buen rendimiento de expresión, como se describe en los ejemplos. De forma inesperada, dicho polipéptido de IL-2 mutante también proporciona una semivida en suero prolongada, en comparación con IL-2 natural.
Los mutantes de IL-2 como se describe en el presente documento, además de tener mutaciones en la región de IL-2 que forma la interfase de IL-2 con CD25 o el sitio de glucosilación, también pueden tener una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos fuera de estas regiones. Dichas mutaciones adicionales en IL-2 humana pueden proporcionar ventajas adicionales tales como un incremento en la expresión o estabilidad. Por ejemplo, la cisteína en la posición 125 se puede reemplazar con un aminoácido neutro tal como serina, alanina, treonina o valina, proporcionando C125S IL-2, C125A IL-2, C125T IL-2 o C125V IL-2, respectivamente, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.518.584. Como se describe en la misma, también se puede delecionar el residuo de alanina N terminal de IL-2 proporcionando dichos mutantes como des-A1 C125s o des-A1 C125A. De forma alternativa o conjunta, el mutante de IL-2 puede incluir una mutación con lo que la metionina que se produce normalmente en la posición 104 de IL-2 humana natural se reemplaza por un aminoácido neutro tal como alanina (véase la patente de EE. UU. n.° 5.206.344). Los mutantes resultantes, por ejemplo, des-A1 M104A IL-2, des-A1 M104A C125S IL-2, M104A IL-2, M104A C125A IL-2, des-A1 M104A C125A IL-2 o M104A C125S IL-2 (estos y otros mutantes se pueden encontrar en la patente de EE. UU. n.° 5.116.943 y en Weiger et al., Eur J Biochem 180, 295-300 (1989)) se pueden usar junto con las mutaciones de IL-2 particulares como se describe en el presente documento.
Por tanto, en determinados modos de realización, el polipéptido de IL-2 mutante descrito en el presente documento comprende una mutación aminoacídica adicional en una posición correspondiente al residuo 125 de IL-2 humana. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica adicional es la sustitución aminoacídica C125A.
El experto en la técnica podrá determinar qué mutaciones adicionales pueden proporcionar ventajas adicionales para el propósito de la invención. Por ejemplo, apreciará que las mutaciones aminoacídicas en la secuencia de IL-2 que reducen o anulan la afinidad de IL-2 por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, tales como D20T, N88R o Q126D (véase, por ejemplo, el documento US 2007/0036752), pueden no ser adecuadas para incluirse en el polipéptido de IL-2 mutante descrito en el presente documento.
En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante descrito en el presente documento comprende una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 19. En un modo de realización específico, el polipéptido de IL-2 mutante descrito en el presente documento comprende una secuencia de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 19. En un modo de realización incluso más específico, el polipéptido de IL-2 mutante comprende una secuencia de SEQ ID NO: 19.
Los polipéptidos de IL-2 mutantes, como se describe en el presente documento, son en particular útiles en el contexto de las proteínas de fusión de IL-2 tales como los inmunoconjugados que portan IL-2. Dichas proteínas de fusión comprenden un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento fusionado a un resto distinto de IL-2. El resto distinto de IL-2 puede ser una proteína sintética o natural o una porción o variante de la misma. Los restos distintos de IL-2 ejemplares incluyen albúmina, o dominios de anticuerpos tales como dominios Fc o dominios de unión a antígeno de inmunoglobulinas.
Los inmunoconjugados que portan IL-2 son proteínas de fusión que comprenden un resto de unión a antígeno y un resto de IL-2. Incrementan significativamente la eficacia del tratamiento con IL-2 dirigiendo directamente la IL-2, por ejemplo, hacia un microentorno tumoral. De acuerdo con la divulgación, un resto de unión a antígeno puede ser un anticuerpo completo o inmunoglobulina, o una porción o variante de los mismos que tiene una función biológica tal como afinidad de unión específica a antígeno.
Los beneficios del tratamiento con inmunoconjugados son fácilmente evidentes. Por ejemplo, un resto de unión a antígeno de un inmunoconjugado reconoce un epítopo específico de tumor y da como resultado que la molécula de inmunoconjugado se dirija al sitio del tumor. Por lo tanto, se pueden suministrar concentraciones altas de IL-2 en el microentorno tumoral, dando como resultado de este modo la activación y proliferación de una variedad de células inmunitarias efectoras mencionadas en el presente documento usando una dosis mucho menor del inmunoconjugado de la que se requeriría para la IL-2 no conjugada. Además, puesto que la aplicación de IL-2 en forma de inmunoconjugados permite dosis menores de la propia citocina, se restringe la posibilidad de efectos secundarios indeseables de IL-2, y dirigir la IL-2 a un sitio específico en el cuerpo por medio de un inmunoconjugado también puede dar como resultado una reducción de la exposición sistémica y, por tanto, menos efectos secundarios que los obtenidos con la IL-2 no conjugada. Además, el incremento de la semivida en circulación de un inmunoconjugado en comparación con la IL-2 no conjugada contribuye a la eficacia del inmunoconjugado. Sin embargo, esta característica de los inmunoconjugados de IL-2 puede agravar de nuevo los potenciales efectos secundarios de la molécula de IL-2: debido a la semivida en circulación significativamente más larga del inmunoconjugado de IL-2 en la circulación sanguínea en relación con la IL-2 no conjugada, se incrementa la probabilidad de que la IL-2 u otras porciones de la molécula de proteína de fusión activen componentes en general presentes en la vasculatura. La misma preocupación se aplica a otras proteínas de fusión que contienen IL-2 fusionada con otro resto tal como Fc o albúmina, dando como resultado una semivida prolongada de IL-2 en la circulación. Por lo tanto, un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento, con toxicidad reducida en comparación con las formas naturales de IL-2, es en particular ventajoso.
En consecuencia, la divulgación proporciona además un polipéptido de IL-2 mutante como se describe anteriormente en el presente documento, unido a al menos un resto distinto de IL-2. En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante y el resto distinto de IL-2 forman una proteína de fusión, es decir, el polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico con el resto distinto de iL-2. En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante se une a un primer y un segundo resto distinto de IL-2. En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con el primer resto de unión a antígeno, y el segundo resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con i) el polipéptido de IL-2 mutante o bien ii) el primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico, el polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico carboxiterminal con dicho primer resto distinto de IL-2 y un enlace peptídico aminoterminal con dicho segundo resto distinto de IL-2. En un modo de realización, dicho resto distinto de IL-2 es un resto dirigido. En un modo de realización particular, dicho resto distinto de IL-2 es un resto de unión a antígeno (formando, por tanto, un inmunoconjugado con el polipéptido de IL-2 mutante, como se describe en más detalle a continuación en el presente documento). En determinados modos de realización, el resto de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno es un anticuerpo de longitud completa. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno es una molécula de inmunoglobulina, en particular una molécula de inmunoglobulina de clase IgG, más en particular una molécula de inmunoglobulina de subclase IgG1. En un modo de realización de este tipo, el polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico aminoterminal con una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno es un fragmento de anticuerpo. En algunos modos de realización, dicho resto de unión a antígeno comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada del anticuerpo y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo. En un modo de realización más específico, el resto de unión a antígeno es una molécula Fab o una molécula scFv. En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno es una molécula Fab. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno es una molécula scFv. En un modo de realización, dicho resto de unión a antígeno se dirige a un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de célula tumoral. En un modo de realización preferente, dicho antígeno se selecciona del grupo de proteína de activación de fibroblastos (FAP), el dominio A1 de tenascina C (TNC A1), el dominio A2 de tenascina C (TNC A2), el dominio adicional B de fibronectina (EDB), antígeno carcinoembrionario (CEA) y el proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP). Cuando el polipéptido de IL-2 mutante se une a más de un resto de unión a antígeno, por ejemplo, un primer y un segundo resto de unión a antígeno, cada resto de unión a antígeno se puede seleccionar independientemente de diversas formas de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, el primer resto de unión a antígeno puede ser una molécula Fab y el segundo resto de unión a antígeno puede ser una molécula scFv. En un modo de realización específico, cada uno de dicho primer y dicho segundo restos de unión a antígeno es una molécula scFv o cada uno de dicho primer y dicho segundo restos de unión a antígeno es una molécula Fab. En un modo de realización particular, cada uno de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno es una molécula Fab. Asimismo, cuando el polipéptido de IL-2 mutante se une a más de un resto de unión a antígeno, por ejemplo, un primer y un segundo resto de unión a antígeno, el antígeno al que se dirige cada uno de los restos de unión a antígeno se puede seleccionar independientemente. En un modo de realización, dicho primer y dicho segundo restos de unión a antígeno se dirigen a diferentes antígenos. En otro modo de realización, dicho primer y dicho segundo restos de unión a antígeno se dirigen al mismo antígeno. Como se describe anteriormente, el antígeno es en particular un antígeno presentado en una célula tumoral o en un entorno de célula tumoral, más en particular un antígeno seleccionado del grupo de proteína de activación de fibroblastos (FAP), el dominio A1 de tenascina C (TNC A1), el dominio A2 de tenascina C (TNC A2), el dominio adicional B de fibronectina (EDB), antígeno carcinoembrionario (CEA) y el proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP). La región de unión a antígeno puede incorporar además cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento con relación a los dominios de unión a antígeno de los inmunoconjugados.
Inmunoconjugados
En un aspecto particular, la divulgación proporciona un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante que comprende una o más mutaciones aminoacídicas que anulan o reducen la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 y conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, y al menos un resto de unión a antígeno. En un modo de realización descrito en el presente documento, la mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 y conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia está en una posición seleccionada de una posición correspondiente al residuo 42, 45 y 72 de IL-2 humana. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica seleccionada del grupo de F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R y L72K, más específicamente una sustitución aminoacídica seleccionada del grupo de F42A, Y45A y L72G. En un modo de realización, la mutación aminoacídica está en una posición correspondiente al residuo 42 de IL-2 humana. En un modo de realización específico, dicha mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica, seleccionada del grupo de F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R y F42. En un modo de realización incluso más específico, dicha sustitución aminoacídica es F42A. En otro modo de realización, la mutación aminoacídica está en una posición correspondiente al residuo 45 de IL-2 humana. En un modo de realización específico, dicha mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica, seleccionada del grupo de Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R e Y45K. En un modo de realización incluso más específico, dicha sustitución aminoacídica es Y45A. Aún en otro modo de realización, la mutación aminoacídica está en una posición correspondiente al residuo 72 de IL-2 humana. En un modo de realización específico, dicha mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica seleccionada del grupo de L72G, L72A, l72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R y L72K. En un modo de realización incluso más específico, dicha sustitución aminoacídica es L72G. En determinados modos de realización, el polipéptido de iL-2 mutante descrito en el presente documento no comprende una mutación aminoacídica en una posición correspondiente al residuo 38 de IL-2 humana. En un modo de realización particular, el polipéptido de IL-2 mutante comprendido en el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende al menos una primera y una segunda mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 y conserva la afinidad del polipéptido de iL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia. En un modo de realización, dicha primera y segunda mutaciones aminoacídicas están en dos posiciones seleccionadas de las posiciones correspondientes al residuo 42, 45 y 72 de IL-2 humana. En un modo de realización, dicha primera y segunda mutaciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas. En un modo de realización, dichas primera y segunda mutaciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas seleccionadas del grupo de F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R y L72K. En un modo de realización particular, dicha primera y segunda mutaciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas seleccionadas del grupo de F42A, Y45A y L72G. El polipéptido de IL-2 mutante puede incorporar además cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en los párrafos precedentes con relación a los polipéptidos de IL-2 mutantes de la divulgación. En un modo de realización, dicho polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con dicho resto de unión a antígeno comprendido en el inmunoconjugado, es decir, el inmunoconjugado es una proteína de fusión. En determinados modos de realización, dicho resto de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En algunos modos de realización, dicho resto de unión a antígeno comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada del anticuerpo y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo. La región de unión a antígeno puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos anteriormente o a continuación en el presente documento con relación a los dominios de unión a antígeno.
Formatos de inmunoconjugados
Los formatos de inmunoconjugado en particular adecuados se describen en la publicación de PCT n.° WO 2011/020783. Estos inmunoconjugados comprenden al menos dos dominios de unión a antígeno. Por tanto, en un modo de realización, el inmunoconjugado de acuerdo con la presente divulgación comprende al menos un primer polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento, y al menos un primer y un segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización particular, dicho primer y segundo resto de unión a antígeno se seleccionan independientemente del grupo que consiste en una molécula Fv, en particular una molécula scFv, y una molécula Fab. En un modo de realización específico, dicho primer polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con dicho primer resto de unión a antígeno y dicho segundo resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con i) el primer polipéptido de IL-2 mutante o bien ii) el primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización particular, el inmunoconjugado consiste esencialmente en un primer polipéptido de IL-2 mutante y primer y segundo restos de unión a antígeno, unidos por una o más secuencias conectoras. Dichos formatos tienen la ventaja de que se unen con alta afinidad al antígeno diana (tal como un antígeno tumoral), pero unión solo monomérica al receptor de IL-2, evitando, por tanto, dirigir el inmunoconjugado a las células inmunitarias que portan el receptor de IL-2 en otras localizaciones distintas del sitio diana. En un modo de realización particular, un primer polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un primer resto de unión a antígeno y además comparte un enlace peptídico aminoterminal con un segundo resto de unión a antígeno. En otro modo de realización, un primer resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un primer polipéptido de IL-2 mutante, y además comparte un enlace peptídico aminoterminal con un segundo resto de unión a antígeno. En otro modo de realización, un primer resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico aminoterminal con un primer polipéptido de IL-2 mutante, y además comparte un péptido carboxiterminal con un segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización particular, un polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región variable de la cadena pesada y además comparte un enlace peptídico aminoterminal con una segunda región variable de la cadena pesada. En otro modo de realización, un polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región variable de la cadena ligera y además comparte un enlace peptídico aminoterminal con una segunda región variable de la cadena ligera. En otro modo de realización, una primera región variable de la cadena pesada o ligera se une por un enlace peptídico carboxiterminal a un primer polipéptido de IL-2 mutante y se une además por un enlace peptídico aminoterminal a una segunda región variable de la cadena pesada o ligera. En otro modo de realización, una primera región variable de la cadena pesada o ligera se une por un enlace peptídico aminoterminal a un primer polipéptido de IL-2 mutante y se une además por un enlace peptídico carboxiterminal a una segunda región variable de la cadena pesada o ligera. En un modo de realización, un polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera cadena pesada o ligera de Fab y además comparte un enlace peptídico aminoterminal con una segunda cadena pesada o ligera de Fab. En otro modo de realización, una primera cadena pesada o ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un primer polipéptido de IL-2 mutante y además comparte un enlace peptídico aminoterminal con una segunda cadena pesada o ligera de Fab. En otros modos de realización, una primera cadena pesada o ligera de Fab comparte un enlace peptídico aminoterminal con un primer polipéptido de iL-2 mutante y además comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada o ligera de Fab. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos un primer polipéptido de IL-2 mutante que comparte un enlace peptídico aminoterminal con una o más moléculas de scFv y que además comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una o más moléculas de scFv.
Otros formatos de inmunoconjugado en particular adecuados comprenden una molécula de inmunoglobulina como resto de unión a antígeno. En un modo de realización de este tipo, el inmunoconjugado comprende al menos un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento, y una molécula de inmunoglobulina, en particular una molécula de IgG, más en particular una molécula de IgG1. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende no más de un polipéptido de IL-2 mutante. En un modo de realización, la molécula de inmunoglobulina es humana. En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con la molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización, el inmunoconjugado consiste esencialmente en un polipéptido de IL-2 mutante y una molécula de inmunoglobulina, en particular una molécula de IgG, más en particular una molécula de IgG1, unida por una o más secuencias conectoras. En un modo de realización específico, el polipéptido de IL-2 mutante se une en su aminoácido aminoterminal al aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En determinados modos de realización, la molécula de inmunoglobulina comprende en el dominio Fc una modificación que promueve la heterodimerización de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina no idénticas. El sitio de interacción proteínaproteína más extensa entre las dos cadenas polipeptídicas de un dominio Fc de IgG humana es en el dominio CH3 del dominio Fc. Por tanto, en un modo de realización, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc. En un modo de realización específico, dicha modificación es una modificación de botón en ojal que comprende una modificación de botón en una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina y una modificación de ojal en la otra de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. La tecnología de botón-en-ojal se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una correspondiente cavidad ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica. En un modo de realización específico, una modificación de botón comprende la sustitución aminoacídica T366W en una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina, y la modificación de ojal comprende las sustituciones aminoacídicas T366S, L368A e Y407V en la otra de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina. En otro modo de realización específico, la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la modificación de botón comprende adicionalmente la sustitución aminoacídica S354C, y la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la modificación de ojal comprende adicionalmente la sustitución aminoacídica Y349C. La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos cadenas pesadas, estabilizando además el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
En un modo de realización particular, el polipéptido de IL-2 mutante se une al aminoácido carboxiterminal de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la modificación de botón.
En un modo de realización alternativo, una modificación que promueve la heterodimerización de dos cadenas polipeptídicas no idénticas comprende una modificación que media los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación de PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la interfase de las dos cadenas polipeptídicas por residuos aminoacídicos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable pero la heterodimerización se vuelve electrostáticamente favorable.
Un dominio Fc confiere al inmunoconjugado propiedades farmacocinéticas favorables, incluyendo una semivida en suero larga lo que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y una proporción de distribución tejidosangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a dirigir de forma indeseable el inmunoconjugado a células que expresan receptores Fc en lugar de a las células que portan antígenos preferentes. Además, la coactivación de las vías de señalización del receptor Fc puede dar lugar a la liberación de citocinas que, en combinación con el polipéptido de IL-2 y la semivida larga del inmunoconjugado, da como resultado una activación excesiva de receptores de citocinas y efectos secundarios graves tras la administración sistémica. De acuerdo con esto, se ha descrito que los inmunoconjugados IgG-IL-2 convencionales se asocian con reacciones a la infusión (véase, por ejemplo, King et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004)).
En consecuencia, en determinados modos de realización, la molécula de inmunoglobulina comprendida en el inmunoconjugado descrito en el presente documento se genomanipula para tener una afinidad de unión reducida por un receptor Fc. En un modo de realización de este tipo, la inmunoglobulina comprende en su dominio Fc una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del inmunoconjugado por un receptor Fc. Típicamente, la misma o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del inmunoconjugado por el receptor Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces. En modos de realización donde existe más de una mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del inmunoconjugado por el receptor Fc, la combinación de estas mutaciones aminoacídicas puede reducir la afinidad de unión del dominio Fc por el receptor Fc en al menos 10 veces, al menos 20 veces o incluso al menos 50 veces. En un modo de realización, el inmunoconjugado que comprende una molécula de inmunoglobulina genomanipulada presenta menos de un 20 %, en particular menos de un 10 %, más en particular menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor Fc en comparación con un inmunoconjugado que comprende una molécula de inmunoglobulina no genomanipulada. En un modo de realización, el receptor Fc es un receptor Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor Fc es un receptor Fcy, más específicamente un receptor FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de estos receptores. En algunos modos de realización también se reduce la afinidad de unión por un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión por C1q. En un modo de realización, no se reduce la afinidad de unión por el receptor Fc neonatal (FcRn). Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión de la inmunoglobulina por dicho receptor, cuando la inmunoglobulina (o el inmunoconjugado que comprende dicha inmunoglobulina) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada de la inmunoglobulina (o el inmunoconjugado que comprende dicha forma no genomanipulada de la inmunoglobulina) por FcRn. Las inmunoglobulinas, o inmunoconjugados que comprenden dichas inmunoglobulinas, pueden presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En un modo de realización, la mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica. En un modo de realización, la inmunoglobulina comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 de la cadena pesada de inmunoglobulina (numeración de Kabat). En un modo de realización más específico, la sustitución aminoacídica es P329A o P329G, en particular, P329G. En un modo de realización, la inmunoglobulina comprende otra sustitución aminoacídica en una posición seleccionada de S228, E233, L234, L235, N297 y P331 de la cadena pesada de inmunoglobulina. En un modo de realización más específico, la otra sustitución aminoacídica es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En un modo de realización particular, la inmunoglobulina comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones P329, L234 y L235 de la cadena pesada de inmunoglobulina. En un modo de realización más particular, la inmunoglobulina comprende las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (LALA P329G). Esta combinación de sustituciones aminoacídicas anula casi por completo la unión al receptor Fcy de una molécula de IgG humana y, por consiguiente, disminuye la función efectora incluyendo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
En determinados modos de realización, el inmunoconjugado comprende uno o más sitios de escisión proteolítica localizados entre el polipéptido de IL-2 mutante y restos de unión a antígeno.
Los componentes del inmunoconjugado (por ejemplo, restos de unión a antígeno y/o polipéptido de IL-2 mutante) se pueden unir directamente o a través de diversos conectores, en particular conectores peptídicos que comprenden uno o más aminoácidos, típicamente, aproximadamente 2-20 aminoácidos, que se describen en el presente documento o son conocidos en la técnica. De forma adecuada, los péptidos conectores no inmunógenos incluyen, por ejemplo, los péptidos conectores (G4S)n, (SG4)n o G4(SG4)n, en los que n es en general un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4.
Restos de unión a antígeno
El resto de unión a antígeno del inmunoconjugado descrito en el presente documento es en general una molécula polipeptídica que se une a un determinante antigénico específico y puede dirigir la entidad a la que se fija (por ejemplo, un polipéptido de IL-2 mutante o un segundo resto de unión a antígeno) a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. El inmunoconjugado se puede unir a determinantes antigénicos encontrados, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células enfermas, libres en el suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (MEC).
Los ejemplos no limitantes de antígenos tumorales incluyen MAGE, MART-1/melan A, gp100, dipeptidilpeptidasa IV (DpPIV), proteína de unión a adenosinadesaminasa (ADAbp), ciclofilina b, antígeno colorrectal asociado (CRC)C017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionario (CEA) y sus epítopos inmunogénicos CAP-1 y CAP-2, etv6, amll, antígeno prostético específico (PSA) y sus epítopos inmunogénicos PSA-1, PSA-2 y PSA-3, antígeno prostético específico de membrana (PSMA), receptor de linfocitos T/cadena zeta-CD3, familia MAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), familia GAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, a-fetoproteína, E-cadherina, a-catenina, p-catenina y Y-catenina, p120ctn, gp100 Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína de poliposis adenomatosa coli (APC), fodrina, conexina 37, idiotipo de Ig, p15, gp75, gangliósidos GM2 y GD2, productos víricos tales como proteínas del papilomavirus humano, familia Smad de antígenos tumorales, lmp-1, P1A, antígeno nuclear codificado por EBV (e BnA)-1, glucógeno fosforilasa cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7, y c-erbB-2.
Los ejemplos no limitantes de antígenos víricos incluyen hemaglutinina del virus de la gripe, PLM-1 del virus de Epstein-Barr, glucoproteína E2 del virus de la hepatitis C, gp160 del VIH y gp120 del VIH.
Los ejemplos no limitantes de antígenos de la MEC incluyen sindecano, heparanasa, integrinas, osteopontina, enlace, cadherinas, laminina, EGF de tipo laminina, lectina, fibronectina, Notch, tenascina y matrixina.
Los inmunoconjugados descritos en el presente documento se pueden unir a los siguientes ejemplos específicos no limitantes de antígenos de superficie celular: FAP, Her2, EGFR, IGF-1R, CD2 (antígeno de superficie de linfocitos T), CD3 (heteromultímero asociado al TCR), CD22 (receptor de linfocitos B), CD23 (receptor de IgE de baja afinidad), CD30 (receptor de citocinas), CD33 (antígeno de superficie celular mielocítico), CD40 (receptor del factor de necrosis tumoral), IL-6R (receptor de IL6), CD20, MCSP y PDGFpR (receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas p).
En un modo de realización, el inmunoconjugado descrito en el presente documento, comprende dos o més restos de unión a antígeno, en el que cada uno de estos restos de unión a antígeno se une específicamente al mismo determinante antigénico. En otro modo de realización, el inmunoconjugado descrito en el presente documento, comprende dos o més restos de unión a antígeno, en el que cada uno de estos restos de unión a antígeno se une específicamente a diferentes determinantes antigénicos.
El resto de unión a antígeno puede ser cualquier tipo de anticuerpo o fragmento del mismo que retiene la unión específica a un determinante antigénico. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de Vh, fragmentos de Vl, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos (véase, por ejemplo, Hudson y Souriau, Nature Med 9, 129-134 (2003)).
Los restos de unión a antígeno en particular adecuados se describen en la publicación de PCT n.° WO 2011/020783.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o més restos de unión a antígeno que son específicos para el dominio adicional B de fibronectina (EDB). En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o més restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal L19 por la unión a un epítopo de EDB. Véase, por ejemplo, la publicación de PCT WO 2007/128563 A1. Aún en otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. Aún en otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena ligera de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena ligera de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que un primer scFv derivado del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un segundo scFv derivado del anticuerpo monoclonal L19.
En un modo de realización més específico, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 199 o una variante de la misma que retiene la funcionalidad. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una cadena ligera de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. En un modo de realización més específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 201 o una variante de la misma que retiene la funcionalidad. Aún en otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la Se Q ID NO: 199 y la SEQ ID NO: 201 o variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los polipéptidos se unen covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.
En un modo de realización, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que son específicos para el dominio A1 de tenascina (TNC-A1). En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal F16 por la unión a un epítopo del TNC-A1. Véase, por ejemplo, la publicación de PCT WO 2007/128563 A1. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que son específicos para el dominio A1 y/o el A4 de tenascina (TNC-A1 o TNC-A4 o TNC-A1/A4). En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para el dominio A1 de tenascina comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para el dominio A1 de tenascina. Aún en otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena ligera de Fab específica para el dominio A1 de tenascina comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena ligera de Fab específica para el dominio A1 de tenascina. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que un primer scFv específico para el dominio A1 de tenascina comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un segundo scFv específico para el dominio A1 de tenascina. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de inmunoglobulina específica para TNC-A1 comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante.
En un modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la s Eq ID NO: 33 o bien a la SEQ ID NO: 35, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 29 o bien a la SEQ ID NO: 31, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En un modo de realización más específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SeQ ID NO: 33 o bien a la SEQ ID NO: 35 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 29 o bien a la SEQ ID NO: 31 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad.
En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID No : 34 o bien a la SEQ ID NO: 36. Aún en otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 34 o bien de la SEQ ID NO: 36. En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 30 o bien a la SEQ ID NO: 32. Aún en otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 30 o bien de la SEQ ID NO: 32.
En un modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 203 o a variantes de la misma que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 205 o bien a la SEQ ID NO: 215, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la s Eq ID NO: 207 o bien a la SEQ ID NO: 237 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 205 y a la SEQ ID NO: 207 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la s Eq ID NO: 215 y a la SEQ ID NO: 237 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad.
En un modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 204. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 204. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 206 o bien a la SEQ ID NO: 216. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 206 o bien de la SEQ ID NO: 216. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 208 o bien a la SEQ ID NO: 238. Aún en otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 208 o bien de la SEQ ID NO: 238.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que son específicos para el dominio a 2 de tenascina (TNC-A2). En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de tenascina comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de tenascina. Aún en otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena ligera de Fab específica para el dominio A2 de tenascina comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de I L-2 mutante, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena ligera de Fab específica para el dominio A2 de tenascina. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de inmunoglobulina específica para TNC-A2 comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante.
En un modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183 y SEQ ID NO: 187, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 185, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En un modo de realización más específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183 y SEQ ID NO: 187, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 185, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad.
En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, s Eq ID NO: 180, SEQ ID NO: 184 y SEQ ID NO: 188. Aún en otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184 y SEQ ID NO: 188. En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 186. Aún en otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 186.
En un modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243 y SEQ ID NO: 245, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249 y SEQ ID NO: 251, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad descrita en el presente documento. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243 y SEQ ID NO: 245 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249 y SEQ ID NO: 251 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 241 y a la SEQ ID NO: 249 o bien a la SEQ ID NO: 251, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 243 y a la SEQ ID NO: 247 o bien a la SEQ ID NO: 249, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 245 y a la SEQ ID NO: 247, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad.
En un modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244 y SEQ ID NO: 246. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de la s Eq ID NO: 242, SEQ ID NO: 244 y SEQ ID NO: 246. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250 y SEQ ID NO: 252. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250 y SEQ ID NO: 252.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que son específicos para la proteína de activación de fibroblastos (FAP). En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para FAP comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para FAP. Aún en otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena ligera de Fab específica para FAP comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena ligera de Fab específica para FAP. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de inmunoglobulina específica para FAP comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante.
En un modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 y SEQ ID NO: 155, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 153, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En un modo de realización más específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 y SEQ ID NO: 155, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 153, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En un modo de realización, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 41 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39. En un modo de realización, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 51 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 49. En un modo de realización, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 111 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 109. En un modo de realización, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 143 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 141. En un modo de realización, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 151 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 149.
En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 156. Aún en otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 156. En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150 y SEQ ID NO: 154. Aún en otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, s Eq ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150 y SEQ ID NO: 154.
En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227 y SEQ ID NO: 229, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235 y SEQ ID NO: 239 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 211 o a la SEQ ID NO: 219 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 233 o a variantes de la misma que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227 y SEQ ID NO: 229, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la Se Q ID NO: 231 o a variantes de la misma que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 213 y a la SEQ ID NO: 235 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 217 y a la SEQ ID NO: 239 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 219 y a la SEQ ID NO: 233 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 221 y a la SEQ ID NO: 231 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 223 y a la SEQ ID NO: 231 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la s Eq ID NO: 225 y a la SEQ ID NO: 231 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 227 y a la SEQ ID NO: 231 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 229 y a la SEQ ID NO: 231 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende dos secuencias polipeptídicas que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 211 y a la SEQ ID NO: 233 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad.
En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301 y SEQ ID NO: 315, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303 y SEQ ID NO: 317, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 297 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 299 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 233 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la s Eq ID NO: 301 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 303 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 231 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad. Aún en un modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la s Eq ID NO: 315 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la Se Q ID NO: 317 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 233 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad.
En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228 y SEQ ID NO: 230. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228 y SEQ ID NO: 230. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 y SEQ ID NO: 240. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 y SEQ ID NO: 240.
En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 302 y SEQ ID NO: 316. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 302 y SEQ ID NO: 316. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 304 y SEQ ID NO: 318. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 304 y SEQ ID NO: 318.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que son específicos para el proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP). En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para MCSP comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para MCSP. Aún en otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena ligera de Fab específica para MCSP comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una molécula de IL-2, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena ligera de Fab específica para MCSP. En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de inmunoglobulina específica para MCSP comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante.
En un modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 189 o bien de SEQ ID NO: 193 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 191 o bien de SEQ ID NO: 197 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En un modo de realización más específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 189 o bien de SEQ ID NO: 193, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 191 o bien de SEQ ID NO: 197, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En un modo de realización más específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 189, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 191. En otro modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 193, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 191.
En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 190 o bien SEQ ID NO: 194. Aún en otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por la secuencia polinucleotídica de la s Eq ID NO: 190 o bien de la SEQ ID NO: 194. En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 192 o bien SEQ ID NO: 198. Aún en otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 192 o bien de la SEQ ID NO: 198.
En un modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 253 o bien a la SEQ ID NO: 257, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la s Eq ID NO: 255 o bien a la SEQ ID NO: 261, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 253 o bien a la SEQ ID NO: 257 o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la Se Q ID NO: 255 o bien a la SEQ ID NO: 261, o a variantes de las mismas que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la s Eq ID NO: 253 o a variantes de la misma que retienen la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 255 o a variantes de la misma que retienen la funcionalidad. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 257 o a variantes de la misma que retienen la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la Se Q ID NO: 255 o a variantes de la misma que retienen la funcionalidad.
En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 254 o bien de SEQ ID NO: 258. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 254 o bien de la SEQ ID NO: 258. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 256 o bien de SEQ ID NO: 262. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 256 o bien de la SEQ ID NO: 262.
En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que son específicos para el antígeno carcinoembrionario (ACE).
En otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para CEA comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para CEA. Aún en otro modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para CEA comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para CEA. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una cadena pesada de inmunoglobulina específica para CEA comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante. En un modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 313 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad. En otro modo de realización específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ iD NO: 311 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad. En un modo de realización más específico, los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 313, o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 311, o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad.
En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 314. Aún en otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena pesada de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 314. En otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 312. Aún en otro modo de realización específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera de los restos de unión a antígeno del inmunoconjugado se codifica por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 312.
En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 319, o a variantes de la misma que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 321, o a variantes de la misma que retienen la funcionalidad. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 323, o a variantes de la misma que retienen la funcionalidad. En un modo de realización más específico, el inmunoconjugado descrito en el presente documento comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 319 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 321 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 323 o a una variante de la misma que retiene la funcionalidad.
En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 320. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 320. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 322. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 322. En otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 324. Aún en otro modo de realización específico, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 324.
Los restos de unión a antígeno descritos en el presente documento incluyen los que tienen secuencias que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a las secuencias peptídicas expuestas en las SEQ ID NO 23-261 (números impares), 297-303 (números impares), 311 y 313, incluyendo fragmentos funcionales o variantes de las mismas. La divulgación también engloba los restos de unión a antígeno que comprenden las secuencias de SEQ ID NO 23-261 (números impares), 297-303 (números impares), 311 y 313 con sustituciones aminoacídicas conservadoras.
Polinucleótidos
La divulgación proporciona además polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento incluyen los que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a las secuencias expuestas en las SEQ ID NO 2, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24-262 (números pares), 293-296 y 298-324 (números pares) incluyendo fragmentos funcionales o variantes de las mismas.
Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de IL-2 mutantes no unidos a un resto distinto de IL-2 se expresan en general como un único polinucleótido que codifica el polipéptido completo.
En un modo de realización, la presente divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de IL-2 mutante, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de IL-2 mutante de SEQ ID NO: 7, 11, 15 o 19. La divulgación también engloba un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de IL-2 mutante, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica un polipéptido de IL-2 mutante de SEQ ID NO: 7, 11, 15 o 19 con sustituciones aminoacídicas conservadoras.
En otro modo de realización, la divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de IL-2 mutante, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 y SEQ ID NO: 296. En otro modo de realización, la divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de IL-2 mutante, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 y SEQ ID NO: 296. En otro modo de realización, la divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 y SEQ ID NO: 296. En otro modo de realización, la divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 8, Se Q ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 y SEQ ID NO: 296.
Los polinucleótidos que codifican inmunoconjugados como se describe en el presente documento se pueden expresar como un único polinucleótido que codifica el inmunoconjugado completo o como múltiples (por ejemplo, dos o más) polinucleótidos que se expresan conjuntamente. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se expresan conjuntamente se pueden asociar, por ejemplo, a través de enlaces disulfuro u otros medios para formar un inmunoconjugado funcional. Por ejemplo, la porción de la cadena pesada de un resto de unión a antígeno se puede codificar por un polinucleótido separado a partir de la porción del inmunoconjugado que comprende la porción de la cadena ligera del resto de unión a antígeno y el polipéptido de IL-2 mutante. Cuando se expresan conjuntamente, los polipéptidos de la cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de la cadena ligera para formar el resto de unión a antígeno. De forma alternativa, en otro ejemplo, la porción de la cadena ligera del resto de unión a antígeno se podría codificar por un polinucleótido separado a partir de la porción del inmunoconjugado que comprende la porción de la cadena pesada del resto de unión a antígeno y el polipéptido de IL-2 mutante. En un modo de realización, un polinucleótido aislado como se describe en el presente documento codifica un fragmento de un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante y un resto de unión a antígeno. En un modo de realización, un polinucleótido aislado como se describe en el presente documento codifica la cadena pesada de un resto de unión a antígeno y un polipéptido de IL-2 mutante. En otro modo de realización, un polinucleótido aislado como se describe en el presente documento codifica la cadena ligera de un resto de unión a antígeno y un polipéptido de IL-2 mutante.
En un modo de realización específico, un polinucleótido aislado como se describe en el presente documento codifica un fragmento de un inmunoconjugado que comprende al menos un polipéptido de IL-2 mutante, y al menos un, preferentemente dos o más restos de unión a antígeno, en el que un primer polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con un primer resto de unión a antígeno y un segundo resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con el primer polipéptido de IL-2 mutante o bien el primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización, los restos de unión a antígeno se seleccionan independientemente del grupo que consiste en una molécula Fv, en particular una molécula scFv y una molécula Fab. En otro modo de realización específico, el polinucleótido codifica las cadenas pesadas de dos de los restos de unión a antígeno y un polipéptido de IL-2 mutante. En otro modo de realización específico, el polinucleótido codifica las cadenas ligeras de dos de los restos de unión a antígeno y un polipéptido de IL-2 mutante. En otro modo de realización específico, el polinucleótido codifica una cadena ligera de uno de los restos de unión a antígeno, una cadena pesada de un segundo resto de unión a antígeno y un polipéptido de IL-2 mutante.
En otro modo de realización específico, un polinucleótido aislado como se describe en el presente documento codifica un fragmento de un inmunoconjugado, en el que el polinucleótido codifica las cadenas pesadas de dos moléculas Fab y un polipéptido de IL-2 mutante. En otro modo de realización específico, un polinucleótido aislado como se describe en el presente documento codifica un fragmento de un inmunoconjugado, en el que el polinucleótido codifica las cadenas ligeras de dos moléculas Fab y un polipéptido de IL-2 mutante. En otro modo de realización específico un polinucleótido aislado como se describe en el presente documento codifica un fragmento de un inmunoconjugado, en el que el polinucleótido codifica la cadena pesada de una molécula Fab, la cadena ligera de una segunda molécula Fab y un polipéptido de IL-2 mutante.
En un modo de realización, un polinucleótido aislado como se describe en el presente documento codifica un
inmunoconjugado que comprende al menos un polipéptido de IL-2 mutante, unido en sus aminoácidos amino y
carboxiterminales a una o más moléculas de scFv.
En un modo de realización, un polinucleótido aislado como se describe en el presente documento codifica un
fragmento de un inmunoconjugado, en el que el polinucleótido codifica la cadena pesada de una molécula de
inmunoglobulina, en particular una molécula de IgG, más en particular una molécula de IgG1 y un polipéptido de
IL-2 mutante. En un modo de realización más específico, el polinucleótido aislado codifica la cadena pesada de
una molécula de inmunoglobulina y un polipéptido de IL-2 mutante, en el que el polipéptido de IL-2 mutante
comparte un enlace peptídico aminoterminal con la cadena pesada de inmunoglobulina.
En otro modo de realización, la presente divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un
inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una
secuencia de la región variable como se muestra en SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47,
49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105,
107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 o 313. En otro modo de realización, la presente divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica
un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica
una secuencia polipeptídica como se muestra en SEQ ID No : 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217,
219, 221,223, 225, 227, 229, 231,233, 235, 237, 239, 241,243, 245, 247, 249, 251,253, 255, 257, 259, 261,297,
299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 o 323. En otro modo de realización, la divulgación se dirige además a un
polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido
comprende una secuencia que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o
99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44,
46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102,
104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148,
150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194,
196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240,
242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 298, 300, 302, 304, 312, 314, 316, 318, 320, 322 o 324. En
otro modo de realización, la divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado o
fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ
ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78,
80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128,
130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174,
176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220,
222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 298, 300,
302, 304, 312, 314, 316, 318, 320, 322 o 324. En otro modo de realización, la divulgación se dirige a un
polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido
comprende una secuencia que codifica una secuencia de la región variable que es al menos aproximadamente un
80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23,
25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83,
85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133,
135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179,
181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 o 313. En otro modo de realización, la divulgación se dirige a un
polinucleótido aislado que codifica un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido
comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %,
96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 199, 201, 203, 205, 207, 209,
211,213, 215, 217, 219, 221,223, 225, 227, 229, 231,233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251,253, 255,
257, 259, 261,297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 o 323. La divulgación engloba un polinucleótido aislado que
codifica un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que
codifica las secuencias de la región variable de SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49,
51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107,
109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153,
155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311
o 313 con sustituciones aminoacídicas conservadoras. La divulgación también engloba un polinucleótido aislado
que codifica un inmunoconjugado como se describe en el presente documento o fragmento del mismo, en el que
el polinucleótido comprende una secuencia que codifica las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: SEQ ID NO:
199, 201,203, 205, 207, 209, 211,213, 215, 217, 219, 221,223, 225, 227, 229, 231,233, 235, 237, 239, 241,243,
245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 o 323 con sustituciones
aminoacídicas conservadoras.
En determinados modos de realización, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otros modos de realización,
un polinucleótido como se describe en el presente documento es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero
(ARNm). El ARN como se describe en el presente documento puede ser monocatenario o bicatenario.
Procedimientos recombinantes
Se pueden preparar polipéptidos de IL-2 mutantes como se describe en el presente documento por deleción, sustitución, inserción o modificación usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios nucleotídicos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación. A este respecto, se ha descrito la secuencia de nucleótidos de IL-2 natural por Taniguchi et al., (Nature 302, 305-10 (1983)) y el ácido nucleico que codifica IL-2 humana está disponible en depósitos públicos tales como American Type Culture Collection (Rockville MD). La secuencia de la IL-2 humana natural se muestra en la SEQ ID NO: 1. La sustitución o inserción puede implicar residuos aminoacídicos naturales así como no naturales. La modificación aminoacídica incluye procedimientos bien conocidos de modificación química tales como la adición de sitios de glucosilación o fijaciones glucídicas, y similares.
Los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados como se describe en el presente documento se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis peptídica en estado sólido o producción recombinante. Para la producción recombinante, se aíslan uno o más polinucleótidos que codifican dicho polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado (fragmento), por ejemplo, como se describe anteriormente, y se insertan en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho polinucleótido se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales. En un modo de realización, se proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende uno o más de los polinucleótidos como se describe en el presente documento. Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de un polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado (fragmento) junto con señales de control transcripcionales/traduccionales apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación genética. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); y Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o puede ser un fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que el polinucleótido que codifica el mutante de IL-2 o el inmunoconjugado (fragmento) (es decir, la región codificante) se clona en asociación funcional con un promotor y/u otros elementos de control de transcripción o traducción. Como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, si está presente, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores transcripcionales, intrones, regiones no traducidas 5' y 3' y similares, no es parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes pueden estar presentes en una única construcción polinucleotídica, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones polinucleotídicas separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector como se describe en el presente documento puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector como se describe en el presente documento puede codificar una o más poliproteínas, que se separan de forma postraduccional o cotraduccional en las proteínas finales por medio de escisión proteolítica. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico como se describe en el presente documento puede codificar regiones codificantes heterógenas, fusionadas o bien no fusionadas a un primer o segundo polinucleótido que codifica los polipéptidos como se describe en el presente documento, o variante o derivado de los mismos. Las regiones codificantes heterógenas incluyen sin limitación elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterógeno. Una asociación funcional es cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal forma que dispone la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la(s) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de a Dn (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado con la misma) se "asocian de forma funcional" si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico ni interfiere con la capacidad del molde de ADN para transcribirse. Por tanto, una región promotora se asociaría de forma funcional con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor puede efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores, operadores, represores y señales de finalización de la transcripción, se pueden asociar de forma funcional con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de célula. Los promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción se divulgan en el presente documento. Una variedad de regiones de control de la transcripción son conocidas por los expertos en la técnica. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción, que funcionan en células de vertebrados, tales como, pero sin limitarse a, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (por ejemplo, el promotor temprano inmediato, junto con intrón-A), virus de simio 40 (por ejemplo, el promotor temprano) y retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovina y p-globina de conejo, así como otras secuencias que pueden controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido así como promotores inducibles (por ejemplo, promotores inducibles por tetraciclinas). De forma similar, una variedad de elementos de control de la traducción son conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a sitios de unión a ribosomas, codones de iniciación y finalización de la traducción y elementos derivados de sistemas víricos (en particular un sitio de entrada al ribosoma interno o IRES, también denominado secuencia CITE). El casete de expresión también puede incluir otros rasgos característicos tales como un origen de replicación y/o elementos de integración cromosómica tales como repeticiones terminales largas (RTL) retrovíricas o repeticiones terminales invertidas (RTI) víricas adenoasociadas (VAA).
Las regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos descritas en el presente documento se pueden asociar con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido como se describe en el presente documento. Por ejemplo, si se desea la secreción del polipéptido de IL-2 mutante, el ADN que codifica una secuencia señal se puede disponer hacia 5' del ácido nucleico que codifica los aminoácidos maduros de la IL-2 mutante. Lo mismo se aplica a los inmunoconjugados descritos en el presente documento o fragmentos de los mismos. De acuerdo con la hipótesis de señal, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la técnica saben que los polipéptidos secretados por células de vertebrado en general tienen un péptido señal fusionado al extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido traducido para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. Por ejemplo, la IL-2 humana se traduce con una secuencia señal de 20 aminoácidos en el extremo N del polipéptido, que posteriormente se escinde para producir la IL-2 humana madura de 133 aminoácidos. En determinados modos de realización, se usa el péptido señal natural, por ejemplo el péptido señal de IL-2 o un péptido señal de la cadena pesada o la cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad para dirigir la secreción del polipéptido que se asocia de forma funcional con él. De forma alternativa, se puede usar un péptido señal de mamífero heterógeno, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder natural se puede sustituir con la secuencia líder del activador tisular del plasminógeno (TPA) humano o pglucuronidasa de ratón. Las secuencias de aminoácidos y polinucleótidos ejemplares de los péptidos señal secretores se muestran en las SEQ ID NO 236-273.
El ADN que codifica una secuencia proteica corta que se podría usar para facilitar la purificación posterior (por ejemplo, una marca histidina) o ayudar a marcar el mutante de IL-2 o inmunoconjugado se puede incluir dentro o en los extremos del polinucleótido que codifica el mutante de IL-2 o inmunoconjugado (fragmento).
En otro modo de realización se proporciona una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos como se describe en el presente documento. En determinados modos de realización se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores como se describe en el presente documento. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento con relación a polinucleótidos y vectores, respectivamente. En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado o transfectado con) un vector que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido de iL-2 mutante descrito en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier tipo de sistema celular que se puede genomanipular para generar los polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados descritos en el presente documento o fragmentos de los mismos. Las células huésped adecuadas para replicar y para sustentar la expresión de polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados son bien conocidas en la técnica. Dichas células se pueden transfectar o transducir según sea apropiado con el vector de expresión particular y se pueden cultivar grandes cantidades de células que contienen vectores para sembrar fermentadores a gran escala para obtener cantidades suficientes del mutante de IL-2 o inmunoconjugado para aplicaciones clínicas. Las células huésped adecuadas incluyen microorganismos procariotas, tales como E. coli, o diversas células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos en bacterias, en particular cuando no es necesaria la glucosilación. Después de la expresión, se puede aislar el polipéptido a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente. Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), y Li et al., Nat Biotech 24, 210­ 215 (2006). Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos (glucosilados) también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar junto con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas). También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas de células de mamífero que se adaptan para el cultivo en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (Co S-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293T como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A), células de pulmón humano (W138), células de hígado humano (Hep G2), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI (como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC 5 y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO dhfr (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); y líneas de células de mieloma tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de proteínas, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol.
248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, células de levadura, células de insecto, células bacterianas y células vegetales, por nombrar solo unas pocas, pero también células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado. En un modo de realización, la célula huésped es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (HEK) o célula linfoide (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20).
Las tecnologías estándar son conocidas en la técnica por expresar genes exógenos en estos sistemas. Las células que expresan un polipéptido de IL-2 mutante fusionado a la cadena pesada o bien la ligera de un dominio de unión a antígeno tal como un anticuerpo, se pueden genomanipular para expresar también la otra de las cadenas del anticuerpo de modo que el producto de fusión de IL-2 mutante expresado es un anticuerpo que tiene tanto una cadena pesada como una ligera.
En un modo de realización, se proporciona un procedimiento de producción de un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado como se describe en el presente documento, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado, como se proporciona en el presente documento, en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado, y opcionalmente recuperar el polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado de la célula huésped (o medio de cultivo de célula huésped).
En determinados modos de realización descritos en el presente documento, el polipéptido de IL-2 mutante se une a al menos un resto distinto de IL-2. Se puede preparar un mutante de IL-2 donde el segmento de polipéptido de IL-2 mutante se une a una o más moléculas tales como un polipéptido, proteína, glúcido, lípido, ácido nucleico, polinucleótido o moléculas que son combinaciones de estas moléculas (por ejemplo, glucoproteínas, glucolípidos, etc.). El polipéptido de IL-2 mutante también se puede unir a un resto orgánico, resto inorgánico o sustancia farmacéutica. Como se usa en el presente documento, una sustancia farmacéutica es un compuesto que contiene materia orgánica de aproximadamente 5000 dalton o menos. El polipéptido de IL-2 mutante también se puede unir a cualquier agente biológico incluyendo compuestos terapéuticos tales como agentes antineoplásicos, agentes antimicrobianos, hormonas, inmunomoduladores, agentes antiinflamatorios y similares. También se incluyen radioisótopos tales como los útiles para formación de imágenes así como para tratamiento.
El polipéptido de IL-2 mutante también se puede unir a múltiples moléculas del mismo tipo o a más de un tipo de molécula. En determinados modos de realización, la molécula que se une a IL-2 puede conferir la capacidad de dirigir la IL-2 a tejidos o células específicos en un animal, y se denomina en el presente documento "resto dirigido". En estos modos de realización, el resto dirigido puede tener afinidad por un ligando o receptor en el tejido o célula diana, dirigiendo de este modo la IL-2 al tejido o célula diana. En un modo de realización particular, el resto dirigido dirige la IL-2 a un tumor. Los restos dirigidos incluyen, por ejemplo, restos de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de los mismos) específicos para proteínas de superficie celular o intracelulares, ligandos de receptores biológicos y similares. Dichos restos de unión a antígeno pueden ser específicos para antígenos asociados a tumor tales como los descritos en el presente documento.
Un polipéptido de IL-2 mutante se puede fusionar genéticamente a otro polipéptido, por ejemplo un anticuerpo monocatenario, o (parte de) las cadenas pesadas o ligeras de un anticuerpo, o se puede conjugar químicamente a otra molécula. La fusión de un polipéptido de IL-2 mutante a parte de una cadena pesada de un anticuerpo se describe en los ejemplos. Un mutante de IL-2 que es una fusión entre un polipéptido de IL-2 mutante y otro polipéptido se puede diseñar de modo que la secuencia de IL-2 se fusione directamente al polipéptido o indirectamente a través de una secuencia conectora. La composición y longitud del conector se pueden determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y se pueden someter a prueba para determinar su eficacia. Un ejemplo de una secuencia conectora entre IL-2 y una cadena pesada de anticuerpo se encuentra en las secuencias mostradas, por ejemplo, en las SEQ ID No 209, 211, 213, etc. También se pueden incluir secuencias adicionales para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la fusión si se desea, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de endopeptidasa. Además, un mutante de IL-2 o proteína de fusión del mismo también se puede sintetizar químicamente usando procedimientos de síntesis polipeptídica como es bien conocido en la técnica (por ejemplo, síntesis en fase sólida de Merrifield). Los polipéptidos de IL-2 mutantes se pueden conjugar químicamente a otras moléculas, por ejemplo, otro polipéptido, usando procedimientos de conjugación química bien conocidos. Se pueden usar reactivos de reticulación bifuncionales tales como reactivos de reticulación homofuncionales y heterofuncionales bien conocidos en la técnica para este propósito. El tipo de reactivo de reticulación a usar depende de la naturaleza de la molécula que se va a acoplar a IL-2 y se puede identificar fácilmente por los expertos en la técnica. De forma alternativa, o además, la iL-2 mutante y/o la molécula a la que se pretende conjugar se puede derivatizar químicamente de modo que se pueden conjugar las dos en una reacción separada como también es bien conocido en la técnica.
En determinados modos de realización, el polipéptido de IL-2 mutante se une a uno o más restos de unión a antígeno (es decir, es parte de un inmunoconjugado) que comprende al menos una región variable del anticuerpo que se puede unir a un determinante antigénico. Las regiones variables pueden formar parte de y derivarse de anticuerpos naturales o no naturales y fragmentos de los mismos. Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los anticuerpos no naturales se pueden construir usando síntesis peptídica en fase sólida, se pueden producir de forma recombinante (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.186.567) o se pueden obtener, por ejemplo, cribando colecciones combinatorias que comprenden cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (véase, por ejemplo la patente de EE. UU. n.° 5.969.108 concedida a McCafferty). Los inmunoconjugados, restos de unión a antígeno y procedimientos para producir los mismos también se describen en detalle en la publicación de PCT n.° WO 2011/020783.
Cualquier especie animal de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o región variable se puede unir a un polipéptido de IL-2 mutante. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, dominios de unión a antígeno o regiones variables no limitantes útiles en la presente invención pueden ser de origen murino, primate o humano. Si el conjugado o fusión de IL-2 mutante/anticuerpo se destina a uso humano, se puede usar una forma quimérica del anticuerpo en la que las regiones constantes del anticuerpo son de un ser humano. También se puede preparar una forma humanizada o completamente humana del anticuerpo de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.565.332 concedida a Winter). La humanización se puede lograr por diversos procedimientos incluyendo, pero sin limitarse a (a) injertar las CDR no humanas (por ejemplo, anticuerpo donante) en regiones estructurales y constantes humanas (por ejemplo, anticuerpo receptor) con o sin retención de los residuos estructurales cruciales (por ejemplo, los que son importantes para retener buena afinidad de unión a antígeno o funciones de anticuerpo), (b) injertar solo las regiones determinantes de especificidad no humanas (SDR o a-CDR; los residuos cruciales para la interacción anticuerpo-antígeno) en regiones estructurales y constantes humanas, o (c) trasplantar todos los dominios variables no humanos, pero "enmascararlos" con una sección similar a humana por reemplazo de residuos de superficie. Los anticuerpos humanizados y procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.os 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (que describen un injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (que describen el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) y Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección guiada" al reordenamiento de FR). Los anticuerpos humanos y regiones variables humanas se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk y van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) y Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Las regiones variables humanas pueden formar parte de y derivarse de anticuerpos monoclonales humanos preparados por el procedimiento de hibridoma (véase, por ejemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). También se pueden preparar anticuerpos humanos y regiones variables humanas administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos inalterados o anticuerpos inalterados con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica (véase, por ejemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)). También se pueden generar anticuerpos humanos y regiones variables humanas aislando secuencias de regiones variables de clones de Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano (véase, por ejemplo, Hoogenboom et al., en Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); y McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Una descripción detallada de la preparación de restos de unión a antígeno para inmunoconjugados por presentación en fagos se puede encontrar en los ejemplos adjuntos a la publicación de PCT n.° WO 2011/020783.
En determinados modos de realización, los restos de unión a antígeno útiles en la presente invención se pueden genomanipular para tener una afinidad de unión potenciada de acuerdo con, por ejemplo, los procedimientos divulgados en la publicación de PCT n.° WO 2011/020783 (véanse los ejemplos relativos a maduración por afinidad) o la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0132066. Se puede medir la capacidad del inmunoconjugado descrito en el presente documento para unirse a un determinante antigénico específico a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien de otras técnicas consabidas para un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un sistema BIACORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o dominio variable que compite con un anticuerpo de referencia por la unión a un antígeno particular, por ejemplo, un anticuerpo que compite con el anticuerpo L19 por la unión al dominio adicional B de fibronectina (EDB). En determinados modos de realización, un anticuerpo competidor de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) que se une por el anticuerpo de referencia. Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). En un ensayo de competencia ejemplar, se incuba un antígeno inmovilizado (por ejemplo, EDB) en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al antígeno (por ejemplo, anticuerpo L19) y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión al antígeno. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba el antígeno inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al antígeno, se retira el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión al antígeno. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Puede ser deseable una modificación química adicional del mutante de IL-2 o inmunoconjugado mutante descrito en el presente documento. Por ejemplo, se pueden mejorar los problemas de inmunogenicidad y semivida corta por conjugación con polímeros de cadena sustancialmente lineal tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG) (véase, por ejemplo, el documento WO 87/00056).
Se pueden purificar mutantes de IL-2 e inmunoconjugados preparados como se describe en el presente documento por técnicas conocidas en la técnica tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como carga neta, hidrofobia, hidrofilia, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. Para la purificación por cromatografía de afinidad, se puede usar un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se une el polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de IL-2 mutante. Para la purificación por cromatografía de afinidad de inmunoconjugados como se describe en el presente documento, se puede usar una matriz de proteína A o proteína G. Por ejemplo, se pueden usar cromatografía de afinidad de proteína A o G y cromatografía de exclusión por tamaño secuenciales para aislar un inmunoconjugado esencialmente como se describe en los ejemplos. Se puede determinar la pureza de los polipéptidos de IL-2 mutantes y proteínas de fusión de los mismos por cualquiera de una variedad de procedimientos analíticos bien conocidos incluyendo electroforesis en gel, cromatografía de líquidos de alta presión y similares. Por ejemplo, se demostró que las proteínas de fusión de la cadena pesada expresadas como se describe en los ejemplos estaban intactas y apropiadamente ensambladas como se demostró por SDS-PAGE reductora (véase por ejemplo, la figura 14). Se resolvieron dos bandas a aproximadamente Mr 25.000 y Mr 60.000, correspondientes a los pesos moleculares predichos de la cadena ligera y la cadena pesada de inmunoglobulina/proteína de fusión de IL-2.
Ensayos
Los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.
Ensayos de afinidad
Se puede determinar la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante o natural por diversas formas del receptor de IL-2 de acuerdo con el procedimiento expuesto en los ejemplos por resonancia de plasmón superficial (SPR), usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y subunidades receptoras tales como las que se pueden obtener por expresión recombinante (véase, por ejemplo, Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)). Se puede generar un heterodímero de subunidades p/Y del receptor de IL-2 recombinante fusionando cada una de las subunidades a un monómero de dominio Fc de anticuerpo modificado por la tecnología de botones en ojales (véase, por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 5.731.168) para promover la heterodimerización de la subunidad de receptor apropiada/proteínas de fusión Fc (véase las SEQ ID NO 102 y 103). De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de los mutantes de IL-2 por diferentes formas del receptor de IL-2 usando líneas celulares conocidas por expresar una o la otra de dichas formas del receptor. Se describe un modo de realización ilustrativo y ejemplar específico para medir la afinidad de unión en lo que sigue y en los ejemplos a continuación. De acuerdo con un modo de realización, se mide Kd por resonancia de plasmón superficial usando un aparato BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C con receptores de IL-2 inmovilizados en chips CM5. En resumen, se activan chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el receptor de IL-2 recombinante con acetato de sodio 10 mM, pH 5,5, a 0,5-30 |jg/ml antes de la inyección a un caudal de 10 jl/minuto para lograr aproximadamente 200 - 1000 (para la subunidad a de IL-2R) o 500-3000 (para heterodímero de botones en ojales Py de IL-2R) unidades de respuesta (UR) de la proteína acoplada. Después de la inyección del receptor de IL-2, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de tres veces del polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado (intervalo entre de ~0,3 nM a 300 nM) en HBS-EP+ (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Ed Ta 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 30 jl/min. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (programa informático de evaluación BIACORE ® T100 versión 1.1.1) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (Kd) como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).
Se puede determinar fácilmente la unión de inmunoconjugados como se describe en el presente documento a receptores Fc por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de los dominios Fc o de los inmunoconjugados que comprenden un dominio Fc por los receptores Fc usando líneas celulares conocidas por expresar receptores Fc particulares, tales como linfocitos NK que expresan el receptor FcYIIIa. De acuerdo con un modo de realización, se mide Kd por resonancia de plasmón superficial usando un aparato BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C con receptores Fc inmovilizados en chips c M5. En resumen, se activan chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el receptor Fc recombinante con acetato de sodio 10 mM, pH 5,5, a 0,5-30 |jg/ml antes de la inyección a un caudal de 10 jl/minuto para lograr aproximadamente 100-5000 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del receptor Fc, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de tres a cinco veces del inmunoconjugado (intervalo entre de ~0,01 nM a 300 nM) en HBS-EP+ (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 30-50 jl/min. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (programa informático de evaluación BIACORE ® T100 versión 1.1.1) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (Kd) como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).
Ensayos de actividad
Se puede medir indirectamente la capacidad de un mutante de IL-2 para unirse a receptores de IL-2 sometiendo a ensayo los efectos de la activación inmunitaria que se produce hacia 3' de la unión a receptor.
En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar polipéptidos de IL-2 mutantes que tienen actividad biológica. Las actividades biológicas pueden incluir, por ejemplo, la capacidad de inducir la proliferación de linfocitos T y/o NK que portan el receptor de IL-2, la capacidad de inducir la señalización de IL-2 en linfocitos T y/o NK que portan el receptor de IL-2, la capacidad de generar el interferón (IFN)-y como una citocina secundaria por linfocitos NK, una capacidad reducida para inducir la elaboración de citocinas secundarias, en particular IL-10 y TNF-a, por células mononucleares de sangre periférica (PBMC), una capacidad reducida para inducir la apoptosis en linfocitos T, la capacidad de inducir regresión tumoral y/o mejorar la supervivencia, y un perfil de toxicidad reducido, en particular vasopermeabilidad reducida, in vivo. También se proporcionan polipéptidos de IL-2 mutantes que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro.
En determinados modos de realización, se somete a prueba un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento para determinar dicha actividad biológica. Una variedad de procedimientos son bien conocidos en la técnica para determinar actividades biológicas de IL-2, y también los detalles para muchos de estos procedimientos se divulgan en los ejemplos adjuntos con el presente documento. Los ejemplos proporcionan un ensayo adecuado para someter a prueba mutantes de IL-2 como se describe en el presente documento para determinar su capacidad de generar iFN-y por linfocitos NK. Se incuban linfocitos NK cultivados con el polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugados descritos en el presente documento, y se mide posteriormente la concentración de IFN-y en el medio de cultivo por ELISA.
La señalización inducida por IL-2 induce varias vías de señalización, e implica las moléculas de señalización JAK (cinasa Jano) y STAT (transductor de señales y activador de transcripción). La interacción de IL-2 con las subunidades p y y del receptor da lugar a la fosforilación del receptor y de JAK1 y JAK3, que se asocian con la subunidad p y y, respectivamente. A continuación, STAT5 se asocia con el receptor fosforilado y se autofosforila en un residuo de tirosina fundamental. Esto da como resultado la disociación de STAT5 del receptor, dimerización de STAT5 y translocación de los dímeros de STAT5 al núcleo donde promueven la transcripción de genes diana.
Por tanto, se puede evaluar la capacidad de los polipéptidos de IL-2 mutantes para inducir la señalización a través del receptor de IL-2, por ejemplo, midiendo la fosforilación de STAT5. Los detalles de este procedimiento se divulgan en los ejemplos. Se tratan PBMC con polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados como se describe en el presente documento y se determinan los niveles de STAT5 fosforilado por citometría de flujo.
Se puede medir la proliferación de linfocitos T o linfocitos NK en respuesta a IL-2 incubando linfocitos T o linfocitos NK aislados de la sangre con polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados como se describe en el presente documento, seguido de la determinación del contenido de ATP en lisados de las células tratadas. Antes del tratamiento, se pueden preestimular los linfocitos T con fitohemaglutinina (PHA-M). Este ensayo, descrito en los ejemplos, permite la cuantificación sensible del número de células viables, sin embargo existen numerosos ensayos alternativos adecuados conocidos en la técnica (por ejemplo, ensayo de incorporación de [3H]-timidina, ensayos de ATP Cell Titer Glo, ensayo Alamar Blue, ensayo w ST-1, ensayo MTT).
También se proporciona un ensayo para la determinación de apoptosis de linfocitos T y AICD en los ejemplos, en los que se tratan linfocitos T con un anticuerpo inductor de apoptosis después de la incubación con los polipéptidos de iL-2 mutantes o inmunoconjugados descritos en el presente documento y se cuantifican células apoptóticas por detección con citometría de flujo de exposición a fosfatidilserina/anexina. Son conocidos en la técnica otros ensayos.
Se pueden evaluar los efectos de IL-2 mutante sobre el crecimiento tumoral y la supervivencia en una variedad de modelos tumorales de animal conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden implantar xenoinjertos de líneas celulares cancerosas humanas en ratones inmunodeficientes, y tratar con polipéptidos de iL-2 mutantes o inmunoconjugados como se describe en el presente documento, como se describe en los ejemplos.
Se puede determinar la toxicidad de polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados descritos en el presente documento in vivo en base a la mortalidad, observaciones en vivo (síntomas visibles de efectos adversos, por ejemplo, comportamiento, peso corporal, temperatura corporal) y patología clínica y anatómica (por ejemplo, mediciones de valores del análisis bioquímico de la sangre y/o análisis histopatológicos).
Se puede examinar la vasopermeabilidad inducida por tratamiento con IL-2 en un modelo animal de vasopermeabilidad con pretratamiento. En general, se administra el mutante de IL-2 o inmunoconjugado descrito en el presente documento a un animal adecuado, por ejemplo, un ratón, y posteriormente se le inyecta al animal una molécula indicadora de filtración vascular con diseminación de la vasculatura que refleja la extensión de la permeabilidad vascular. Preferentemente, la molécula indicadora de filtración vascular es lo suficientemente grande para revelar la permeabilidad con la forma natural de IL-2 usada para pretratamiento. Un ejemplo de una molécula indicadora de filtración vascular puede ser una proteína sérica tal como albúmina o una inmunoglobulina. Preferentemente, la molécula indicadora de filtración vascular se marca de forma detectable tal como con un radioisótopo para facilitar la determinación cuantitativa de la distribución tisular de la molécula. Se puede medir la permeabilidad vascular para vasos presentes en cualquiera de una variedad de órganos corporales internos tales como hígado, pulmón y similares, así como un tumor, incluyendo un tumor que se xenoinjerta. El pulmón es un órgano preferente para medir la vasopermeabilidad de los mutantes de IL-2 de longitud completa.
Composiciones, formulaciones y vías de administración
En otro aspecto, la divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos a continuación. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de los polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de los polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
También se proporciona un procedimiento de producción de un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado como se describe en el presente documento en una forma adecuada para su administración in vivo, comprendiendo el procedimiento (a) obtener un polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado como se describe en el presente documento, y (b) formular el polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, con lo que una preparación de polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado se formula para su administración in vivo.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados disueltos o dispersos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son en general no tóxicas para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, es decir, no producen una reacción adversa, alérgica u otra indeseable cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos un polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado y opcionalmente un ingrediente activo adicional será conocida por los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990. Además, para administración animal (por ejemplo, humana), se entenderá que las preparaciones deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza como se requiere por la Oficina de Normas biológicas de la FDA o las autoridades correspondientes en otros países. Las composiciones preferentes son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Las composiciones de IL-2 ejemplares se describen en las patentes de EE. UU. n.os 4.604.377 y 4.766.106. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, antioxidantes, proteínas, fármacos, estabilizantes de fármacos, polímeros, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, tintes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como se conocerá por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
La composición puede comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si se va a administrar en forma sólida, líquida o aerosol, y si es necesario que sea estéril para dichas vías de administración como inyección. Se pueden administrar polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados como se describe en el presente documento (y cualquier agente terapéutico adicional) por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intraesplénica, intrarrenal, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntiva, intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo, inhalación por aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada con baño de células diana directo, por medio de un catéter, por medio de un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o por otro procedimiento o cualquier combinación de los anteriores como se conocería por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990). La administración parenteral, en particular inyección intravenosa, se usa más comúnmente para administrar moléculas polipeptídicas tales como los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados descritos en el presente documento.
Las composiciones parenterales incluyen las diseñadas para administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para inyección, se pueden formular los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados descritos en el presente documento en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón de solución salina fisiológica. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De forma alternativa, los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril sin pirógenos, antes de su uso. Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando los polipéptidos de IL-2 o inmunoconjugados descritos en el presente documento en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados a continuación, como se requiera. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los procedimientos preferentes de preparación son técnicas de secado al vacío o liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de un medio líquido previamente filtrado estéril del mismo. El medio líquido se debe tamponar adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido se debe volver isotónico en primer lugar antes de la inyección con solución salina o glucosa suficiente. La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas se debe mantener al mínimo en un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (p Eg ). Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener compuestos que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano o similares.
Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones inyectables oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleatos de etilo o triglicéridos, o liposomas.
Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a ed. Mack Printing Company, 1990). Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. En modos de realización particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable se puede conseguir por el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.
Además de las composiciones descritas previamente, los inmunoconjugados también se pueden formular como una preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular.
Por tanto, por ejemplo, los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como sal escasamente soluble.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados descritos en el presente documento se pueden fabricar por medio de procedimientos de mezcla, disolución, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o coadyuvantes fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.
Los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o sal. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que retienen sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos de lo que son las correspondientes formas de base libre.
Procedimientos y composiciones terapéuticos
Cualquiera de los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados proporcionados en el presente documento se puede usar en procedimientos terapéuticos. Los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados como se describe en el presente documento se pueden usar como agentes inmunoterápicos, por ejemplo, en el tratamiento de cánceres.
Para su uso en procedimientos terapéuticos, los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados como se describe en el presente documento se formularían, dosificarían y administrarían de forma consistente con la buena práctica médica. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente concreto, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos.
Los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados como se describe en el presente documento son útiles en el tratamiento de enfermedades donde la estimulación del sistema inmunitario del huésped es beneficiosa, en condiciones particulares donde es deseable una respuesta inmunitaria celular potenciada. Estas pueden incluir enfermedades donde la respuesta inmunitaria del huésped es insuficiente o deficiente. Las enfermedades para las que se pueden administrar los polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados descritos en el presente documento comprenden, por ejemplo, un tumor o infección donde una respuesta inmunitaria celular sería un mecanismo crucial para la inmunidad específica. Las enfermedades específicas para las que se pueden emplear los mutantes de IL-2 como se describe en el presente documento incluyen cáncer, por ejemplo, carcinoma de células renales o melanoma; inmunodeficiencia, específicamente en pacientes infectados por el VIH, pacientes inmunodeprimidos, infección crónica y similares. Los polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados descritos en el presente documento se pueden administrar per se o en cualquier composición farmacéutica adecuada.
En un aspecto, se proporcionan polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados como se describe en el presente documento para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporcionan polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En determinados modos de realización, se proporcionan polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados como se describe en el presente documento para su uso en un procedimiento de tratamiento. En un modo de realización, la divulgación proporciona un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesite el mismo. En determinados modos de realización, la divulgación proporciona un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de IL-2 mutante o el inmunoconjugado. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización preferente, la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otros modos de realización, la divulgación proporciona un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado para su uso en la estimulación del sistema inmunitario. En determinados modos de realización, la divulgación proporciona un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado para su uso en un procedimiento de estimulación del sistema inmunitario en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado para estimular el sistema inmunitario. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un mamífero, preferentemente un ser humano. "Estimulación del sistema inmunitario" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede incluir uno cualquiera o más de un incremento general en la función inmunitaria, un incremento en la función de los linfocitos T, un incremento en la función de los linfocitos B, un restablecimiento de la función linfocítica, un incremento en la expresión de los receptores de IL-2, un incremento en el grado de respuesta de los linfocitos T, un incremento en la actividad de los linfocitos citolíticos naturales o actividad de los linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK) y similares.
En otro aspecto, la divulgación proporciona el uso de un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado como se describe en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita el mismo. En un modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un individuo que tiene la enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización preferente, la enfermedad es cáncer. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otro modo de realización, el medicamento es para estimular el sistema inmunitario. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de estimulación del sistema inmunitario en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para estimular el sistema inmunitario. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano. "Estimulación del sistema inmunitario" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede incluir uno cualquiera o más de un incremento general en la función inmunitaria, un incremento en la función de los linfocitos T, un incremento en la función de los linfocitos B, un restablecimiento de la función linfocítica, un incremento en la expresión de los receptores de IL-2, un incremento en el grado de respuesta de los linfocitos T, un incremento en la actividad de los linfocitos citolíticos naturales o actividad de los linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK) y similares.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad en un individuo que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado como se describe en el presente documento. En un modo de realización, se administra una composición a dicho individuo, que comprende el polipéptido de IL-2 mutante o el inmunoconjugado como se describe en el presente documento en una forma farmacéuticamente aceptable. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización preferente, la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para estimular el sistema inmunitario en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado para estimular el sistema inmunitario. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano. "Estimulación del sistema inmunitario" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede incluir uno cualquiera o más de un incremento general en la función inmunitaria, un incremento en la función de los linfocitos T, un incremento en la función de los linfocitos B, un restablecimiento de la función linfocítica, un incremento en la expresión de los receptores de IL-2, un incremento en el grado de respuesta de los linfocitos T, un incremento en la actividad de los linfocitos citolíticos naturales o actividad de los linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK) y similares.
Se entiende que cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores se puede llevar a cabo usando un inmunoconjugado como se describe en el presente documento en lugar de o además de un polipéptido de IL-2 mutante.
En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo, preferentemente cáncer. Los ejemplos no limitantes de cánceres incluyen cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de huesos y cáncer de riñón. Otros trastornos de proliferación celular que se pueden tratar usando un polipéptido de IL-2 mutante o un inmunoconjugado de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, neoplasias localizadas en el: abdomen, hueso, mama, aparato digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroidea), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, aparato genital femenino, piel, tejidos blandos, bazo, región torácica y aparato genitourinario. También se incluyen afecciones o lesiones precancerosas y metástasis de cáncer. En determinados modos de realización, el cáncer se elige del grupo que consiste en cáncer de células renales, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello. De forma similar, también se pueden tratar otros trastornos de proliferación celular por los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados descritos en el presente documento. Los ejemplos de dichos trastornos de proliferación celular incluyen, pero no se limitan a: hipergammaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura, sarcoidosis, síndrome de Sézary, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de Gaucher, histiocitosis y cualquier otra enfermedad de proliferación celular, además de neoplasia, localizada en un sistema o aparato enumerado anteriormente. En otro modo de realización, la enfermedad se relaciona con autoinmunidad, rechazo de trasplante, respuestas inmunitarias postraumáticas y enfermedades infecciosas (por ejemplo, VIH). Más específicamente, los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados se pueden usar en la eliminación de células implicadas en trastornos mediados por células inmunitarias, incluyendo linfoma; autoinmunidad, rechazo de trasplante, enfermedad injerto contra huésped, isquemia y apoplejía. Un experto en la técnica reconoce fácilmente que en muchos casos los polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados puede que no proporcionen una cura sino que solo proporcionan un beneficio parcial. En algunos modos de realización, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por tanto, en algunos modos de realización, una cantidad de polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz". El sujeto, paciente o individuo que necesita tratamiento es típicamente un mamífero, más específicamente un ser humano.
Los inmunoconjugados descritos en el presente documento también son útiles como reactivos de diagnóstico. La unión de un inmunoconjugado a un determinante antigénico se puede detectar fácilmente usando un anticuerpo secundario específico para el polipéptido de IL-2. En un modo de realización, el anticuerpo secundario y el inmunoconjugado facilitan la detección de la unión del inmunoconjugado a un determinante antigénico localizado en la superficie de una célula o tejido.
En algunos modos de realización, se administra una cantidad eficaz de los polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados descritos en el presente documento a una célula. En otros modos de realización, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de los polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados descritos en el presente documento a un individuo para el tratamiento de una enfermedad.
Para la prevención o tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de un polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado como se describe en el presente documento (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la vía de administración, el peso corporal del paciente, el tipo de polipéptido (por ejemplo, IL-2 no conjugada o inmunoconjugado), la gravedad y progresión de la enfermedad, si se administra el anticuerpo con propósitos preventivos o terapéuticos, procedimientos terapéuticos previos o coincidentes, la anamnesis del paciente y respuesta al polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado, y el criterio del médico especialista. El facultativo responsable para su administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los ingrediente(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto concreto. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración por inyección intravenosa rápida e infusión pulsada.
Una administración individual de IL-2 no conjugada puede variar de aproximadamente 50.000 UI/kg a aproximadamente 1.000.000 UI/kg o más, más típicamente, aproximadamente 600.000 UI/kg de IL-2. Esto se puede repetir varias veces al día (por ejemplo, 2-3 x), durante varios días (por ejemplo, aproximadamente 3-5 días consecutivos) y a continuación se puede repetir una o más veces después de un período de descanso (por ejemplo, aproximadamente 7-14 días). Por tanto, una cantidad terapéuticamente eficaz puede comprender solo una administración individual o muchas administraciones durante un período de tiempo (por ejemplo, aproximadamente 20-30 administraciones individuales de aproximadamente 600.000 UI/kg de IL-2 cada una dadas durante un período de aproximadamente 10-20 días). Cuando se administra en forma de un inmunoconjugado, una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de IL-2 mutante puede ser menor que para el polipéptido de IL-2 mutante no conjugado.
De forma similar, el inmunoconjugado se administra de forma adecuada al paciente una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg - 10 mg/kg) de inmunoconjugado puede ser una dosificación inicial candidata para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del inmunoconjugado estaría en el intervalo de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg/peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable en los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg/peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg/peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, etc., en base a los números descritos anteriormente. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del inmunoconjugado). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. La evolución de este tratamiento se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
Los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados descritos en el presente documento se usarán en general en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Para su uso para tratar o evitar un estado de enfermedad, los polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados descritos en el presente documento, o composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran o se aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, en especial en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
Para la administración sistémica, se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. A continuación se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en circulación que incluye la CI50 como se determina en cultivo celular. Se puede usar dicha información para determinar con más exactitud dosis útiles en seres humanos.
También se pueden estimar dosificaciones iniciales a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración en seres humanos en base a datos en animales.
Se pueden ajustar individualmente la cantidad e intervalo de dosificación para proporcionar niveles plasmáticos de los polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados que sean suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosificaciones de paciente habituales para administración por inyección varían de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg/día, típicamente de aproximadamente 0,5 a 1 mg/kg/día. Se pueden lograr niveles plasmáticos terapéuticamente eficaces administrando dosis múltiples cada día. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por HPLC.
En los casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz de los inmunoconjugados puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación excesiva.
Una dosis terapéuticamente eficaz de los polipéptidos de IL-2 mutantes o inmunoconjugados descritos en el presente documento proporcionará en general beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad y eficacia terapéutica de un mutante de IL-2 o inmunoconjugado se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivo celular o animales de experimentación (véanse, por ejemplo, los ejemplos 8 y 9). Se pueden usar ensayos de cultivo celular y estudios en animales para determinar la DL50 (la dosis letal para un 50 % de una población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en un 50 % de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se puede expresar como la proporción DL50/DE50. Son preferentes mutantes de IL-2 e inmunoconjugados que presentan índices terapéuticos grandes. En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante o el inmunoconjugado descrito en el presente documento presenta un índice terapéutico alto. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificaciones adecuadas para su uso en seres humanos. Preferentemente, la dosificación se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo, la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, la afección del sujeto y similares. La formulación exacta, vía de administración y dosificación se pueden elegir por el médico concreto en vista de la afección del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1, p. 1).
El médico especialista para pacientes tratados con mutantes de IL-2 o inmunoconjugados como se describe en el presente documento sabrá cómo y cuándo finalizar, interrumpir o ajustar la administración debido a la toxicidad, disfunción orgánica y similares. A la inversa, el médico especialista también sabrá ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluyendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el abordaje del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección que se va a tratar, con la vía de administración y similares. La gravedad de la afección, por ejemplo, se puede evaluar, en parte, por procedimientos de evaluación de pronóstico estándar. Además, la dosis y quizás la frecuencia de dosis también variarán de acuerdo con la edad, peso corporal y respuesta del paciente concreto.
La dosis terapéutica máxima de un polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado que comprende dicho polipéptido se puede incrementar a partir de la usada para IL-2 natural o un inmunoconjugado que comprende IL-2 natural, respectivamente.
Otros agentes y tratamientos
Los polipéptidos de IL-2 mutantes y los inmunoconjugados descritos en el presente documento se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes en el tratamiento. Por ejemplo, un polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado como se describe en el presente documento se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. El término "agente terapéutico" engloba cualquier agente administrado para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier ingrediente activo adecuado para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se ven afectadas de forma adversa entre sí. En determinados modos de realización, un agente terapéutico adicional es un agente inmunomodulador, un agente citostático, un inhibidor de la adhesión celular, un agente citotóxico, un activador de la apoptosis celular o un agente que incrementa la sensibilidad de las células por los inductores apoptóticos. En un modo de realización particular, el agente terapéutico adicional es un agente antineoplásico, por ejemplo, un alterador de los microtúbulos, un antimetabolito, un inhibidor de topoisomerasas, un intercalador de a Dn , un agente alquilante, un tratamiento hormonal, un inhibidor de cinasas, un antagonista de receptores, un activador de la apoptosis de células tumorales o un agente antiangiogénico.
Dichos otros agentes están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado usada, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores analizados anteriormente. Los polipéptidos de iL-2 mutantes e inmunoconjugados se usan en general en las mismas dosificaciones y con vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empírica/clínicamente que es apropiada.
Dichas politerapias destacadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma o en composiciones separadas), y la administración separada, caso en el que se puede producir la administración del polipéptido de IL-2 mutante o inmunoconjugado descrito en el presente documento antes de, simultáneamente y/o después de la administración del agente terapéutico adicional y/o coadyuvante. También se pueden usar polipéptidos de IL-2 mutantes e inmunoconjugados como se describe en el presente documento en combinación con tratamiento con radiación.
Artícu los de fabricación
En otro aspecto de la divulgación se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o terapéutico de otro modo. El artículo de fabricación en este modo de realización de la divulgación puede comprender además un prospecto del envase que indica que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado como se describe en el presente documento en lugar de o además de un polipéptido de IL-2 mutante.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Representación esquemática de los formatos de inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab (A) e IgG-IL-2 (B), que comprenden polipéptido de iL-2 mutante.
Figura 2. Purificación de la construcción natural de IL-2 no marcada. (A) Cromatograma de la purificación con marca His para la IL-2 no marcada natural; (B) SDS PAGE de proteína purificada (Bis-Tris al 8-12 % (NuPage, Invitrogen), tampón de migración MES).
Figura 3. Purificación de la construcción natural de IL-2 no marcada. (A) Cromatograma de la cromatografía de exclusión por tamaño para la IL-2 natural; (B) SDS PAGE de proteína purificada (Bis-Tris al 8-12 % (NuPage, Invitrogen), tampón de migración MES).
Figura 4. Cromatografía de exclusión por tamaño analítica para la IL-2 natural como se determina en una Superdex 75, 10/300 GL. El grupo 1 comprende un 74 % de la especie de 23 kDa y un 26 % de la especie de 20 kDa, el grupo 2 comprende un 40 % de la especie de 22 kDa y un 60 % de la especie de 20 kDa.
Figura 5. Purificación de la construcción de mutante cuádruple de IL-2 no marcada. (A) Cromatograma de la purificación con marca His para el mutante cuádruple de IL-2; (B) SDS PAGE de proteína purificada (Bis-Tris al 8­ 12 % (NuPage, Invitrogen), tampón de migración MES).
Figura 6. Purificación de la construcción de mutante cuádruple de IL-2 no marcada. (A) Cromatograma de la cromatografía de exclusión por tamaño para el mutante cuádruple de IL-2; (B) SDS PAGE de proteína purificada (Bis-Tris al 8-12 % (NuPage, Invitrogen), tampón de migración MES).
Figura 7. Cromatografía de exclusión por tamaño analítica para el mutante cuádruple de IL-2 como se determina en una Superdex 75, 10/300 GL (grupo 2, 20 kDa).
Figura 8. Unión simultánea a IL-2R y FAP humana por Fab-IL-2-Fab a base de 29B11 dirigido a FAP que comprende IL-2 natural o mutante cuádruple. (A) Configuración del ensayo de SPR; (B) sensograma de SPR. Figura 9. Inducción de la liberación de IFN-y por células NK92 por Fab-IL-2-Fab a base de 4G8 dirigido a FAP que comprende IL-2 natural o mutante, en comparación con proleucina, en solución.
Figura 10. Inducción de la proliferación de linfocitos NK aislados (fondo) por Fab-IL-2-Fab a base de 4G8 dirigido a FAP que comprende IL-2 natural o mutante, en comparación con proleucina, en solución.
Figura 11. Inducción de la proliferación de linfocitos T CD3+ activados por Fab-IL-2-Fab a base de 4G8 dirigido a FAP que comprende IL-2 natural o mutante, en comparación con proleucina, en solución.
Figura 12. Inducción de la muerte celular inducida por activación (AICD) de linfocitos T sobreestimulados por Fab-IL-2-Fab a base de 4G8 dirigido a FAP que comprende IL-2 natural o mutante, en comparación con proleucina, en solución.
Figura 13. Ensayo de FACS con fosfo-STAT5 en solución con Fab-IL-2-Fab a base de 4G8 dirigido a FAP que comprende IL-2 natural o mutante cuádruple, en comparación con proleucina, en solución. (A) Linfocitos T reguladores (CD4+CD25+FOXP3+); (B) linfocitos T CD8+ (CD3+CD8+); (C) linfocitos T CD4+ (CD4+CD25'CD127+); (D) linfocitos NK (CD3'CD56+).
Figura 14. Purificación del inmunoconjugado Fab-IL-2 qm-Fab a base de 28H1 dirigido a FAP. (A) Perfil de elución de la columna de proteína G. (B) Perfil de elución de la columna de exclusión por tamaño Superdex 200. (C) SDS-PAGE con Tris-glicina Novex al 4-20 % del producto final con la muestra no reducida y reducida.
Figura 15. Purificación del inmunoconjugado Fab-IL-2 qm-Fab dirigido a FAP a base de 4G8. (A) Perfil de elución de la columna de proteína A. (B) Perfil de elución de la columna de exclusión por tamaño Superdex 200. (C) NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel (Invitrogen), tampón de migración MOPS del producto final con la muestra no reducida y reducida.
Figura 16. Purificación del inmunoconjugado Fab-IL-2QM-Fab dirigido a MCSP con MHLG1 KV9. (A) Perfil de elución de la columna de proteína A. B) Perfil de elución de la columna de exclusión por tamaño Superdex 200. C) NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, tampón de migración MOPS del producto final con la muestra no reducida y reducida.
Figura 17. Unión dirigida de construcciones Fab-IL-2-Fab en células HEK 293-FAP humana.
Figura 18. Unión dirigida de construcciones Fab-IL-2-Fab en células HEK 293-FAP humana.
Figura 19. Especificidad de unión de construcciones Fab-IL-2-Fab como se determina en células HEK 293-DPPIV humana y HEK 293 con transfección simulada. La unión de un anticuerpo DPPIV (CD26) específico se muestra a la derecha.
Figura 20. Análisis de la internalización de FAP tras la unión de construcciones Fab-IL-2-Fab a FAP en fibroblastos GM05389.
Figura 21. Liberación de IFN-y inducida por IL-2 por células NK92 en solución.
Figura 22. Liberación de IFN-y inducida por IL-2 por células NK92 en solución.
Figura 23. Proliferación inducida por IL-2 de células NK92 en solución.
Figura 24. Evaluación de los clones de Fab-IL-2-Fab 28H1 frente a 29B11 frente a 4G8 en ensayo de fosforilación de STAT5 con PBMC en solución. (A) Linfocitos NK (CD3-CD56+); (B) linfocitos T CD8+ (CD3+CD8+); (C) linfocitos T CD4+ (CD3+CD4+CD25-CD127+); (D) linfocitos T reguladores (CD4+CD25+FOXP3+).
Figura 25. Eficacia de los inmunoconjugados Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 dirigidos a FAP en la línea celular de adenocarcinoma de células renales humanas ACHN.
Figura 26. Eficacia de los inmunoconjugados FAP-IL-2 qm-Fab 4G8 y Fab-IL-2 qm-Fab 28H1 dirigidos a FAP en la línea celular de carcinoma de pulmón de Lewis de ratón LLC1.
Figura 27. Eficacia de los inmunoconjugados Fab-IL-2 wt-Fab 28H1 y Fab-IL-2 qm-Fab 28H1 dirigidos a FAP en la línea celular de carcinoma de pulmón de Lewis de ratón LLC1.
Figura 28. Pequeño aumento (100x) de pulmones de ratones tratados con control de vehículo (A) o 9 |jg/g de IL-2 wt (B) o IL-2 qm (C). Los pulmones de ratones tratados con 9 jg /g de IL-2 wt muestran infiltrado mononuclear vasocéntrico que se ha movido hacia los espacios alveolares. También está presente edema y hemorragia. Se observa infiltrado marginal en los ratones tratados con IL-2 qm alrededor de unos pocos vasos.
Figura 29. Mayor aumento (200x) de pulmones mostrados en la figura 28. La marginación e infiltración de células mononucleares en y alrededor de los vasos sanguíneos es más grave en ratones tratados con IL-2 wt (A) que en ratones tratados con IL-2 qm (B y C).
Figura 30. Pequeño aumento (100x) de hígados de ratones tratados con control de vehículo (A) o 9 jg /g de IL-2 wt (B) o IL-2 qm (C). Se observa infiltración vasocéntrica en ratones tratados con IL-2 wt.
Figura 31. Secreción de IFN-y por células NK92 tras la incubación con diferentes preparaciones de IL-2 natural (wt) y mutante cuádruple (qm) durante 24 (A) o 48 horas (B).
Figura 32. Proliferación de células NK92 tras la incubación con diferentes preparaciones de IL-2 natural (wt) y mutante cuádruple (qm) durante 48 horas.
Figura 33. Proliferación de células NK92 tras la incubación con diferentes preparaciones de IL-2 natural (wt) y mutante cuádruple (qm) durante 48 horas.
Figura 34. Proliferación de linfocitos NK tras la incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-228H1 dirigidos a FAP o proleucina durante 4 (A), 5 (B) o 6 (C) días.
Figura 35. Proliferación de linfocitos T CD4 tras la incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-2 28H1 dirigidos a FAP o proleucina durante 4 (A), 5 (B) o 6 (C) días.
Figura 36. Proliferación de linfocitos T CD8 tras la incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-2 28H1 dirigidos a FAP o proleucina durante 4 (A), 5 (B) o 6 (C) días.
Figura 37. Proliferación de linfocitos NK (A), linfocitos T CD4 (B) y linfocitos T CD8 (C) tras la incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-2 o proleucina durante 6 días.
Figura 38. Fosforilación de STAT en linfocitos NK (A), linfocitos T CD8 (B), linfocitos T CD4 (C) y linfocitos T reguladores (D) después de 30 min de incubación con proleucina, IL-2 natural producida internamente e IL-2 mutante cuádruple.
Figura 39. Fosforilación de STAT en linfocitos NK (A), linfocitos T CD8 (B), linfocitos T CD4 (C) y linfocitos T reguladores (D) después de 30 min de incubación con proleucina, IgG-IL-2 que comprende IL-2 natural o IgG-IL-2 que comprende IL-2 mutante cuádruple.
Figura 40. Supervivencia de ratones Black 6 después de la administración (una vez al día durante siete días) de diferentes dosis de inmunoconjugados de IL-2 que comprenden IL-2 natural o mutante cuádruple.
Figura 41. Concentraciones séricas de inmunoconjugados de IL-2 después de una administración i.v. única de construcciones IgG-IL-2 dirigidas a FAP (A) y no dirigidas (B) que comprenden IL-2 natural (wt) o bien mutante cuádruple (qm).
Figura 42. Concentraciones séricas de inmunoconjugados de IL-2 después de una administración i.v. única de construcciones Fab-IL-2-Fab no dirigidas que comprenden IL-2 natural (wt) o bien mutante cuádruple (qm). Figura 43. Purificación de IL-2 mutante cuádruple. (A) Cromatografía por iones metálicos inmovilizados; (B) cromatografía de exclusión por tamaño; (C) SDS PAGE en condiciones no reductoras (NuPAGE Novex Bis-Tris gel (Invitrogen), tampón de migración MES); (D) cromatografía de exclusión por tamaño analítica (Superdex 75 10/300 GL).
Figura 44. Proliferación de linfocitos T CD8 (A) y CD4 (B) preactivados después de seis días de incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-2.
Figura 45. Muerte celular inducida por activación de linfocitos T CD3+ después de seis días de incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-2 y tratamiento durante la noche con anticuerpo anti-Fas.
Figura 46. Purificación del inmunoconjugado IgG-IL-2 mutante cuádruple (qm) a base de 4G8 dirigido a FAP. A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de proteína A. B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. C) SDS-PAGE analítica (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, tampón de migración MOPS) del producto final. D) Cromatografía de exclusión por tamaño analítica del producto final en una columna Superdex 200 (contenido en monómero de un 97 %).
Figura 47. Purificación del inmunoconjugado IgG-IL-2 qm a base de 28H1 dirigido a FAP. A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de proteína A. B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. C) SDS-PAGE analítica (reducida: NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, tampón de migración MOPS; no reducida: NuPAGE Tris-Acetate, Invitrogen, tampón de migración Tris-acetato) del producto final. D) Cromatografía de exclusión por tamaño analítica del producto final en una columna Superdex 200 (contenido en monómero de un 100 %).
Figura 48. Unión del inmunoconjugado IgG-IL-2 qm a base de 4G8 dirigido a FAP a FAP humana expresada en células HEK 293 transfectadas de forma estable como se mide por FACS, en comparación con la correspondiente construcción Fab-IL-2 qm-Fab.
Figura 49. Liberación de interferón (IFN)-y en células NK92 inducida por el inmunoconjugado IgG-IL-2 qm a base de 4G8 dirigido a FAP en solución, en comparación con la construcción Fab-IL-2 qm-Fab a base de 28Hl. Figura 50. Detección de STAT5 fosforilado por FACS en diferentes tipos de células después de su estimulación durante 20 min con inmunoconjugado IgG-IL-2 qm en base a 4G8 dirigido a FAP en solución, en comparación con las construcciones Fab-IL-2-Fab y Fab-IL-2 qm-Fab a base de 28H1 así como proleucina. A) Linfocitos NK (CD3‘ CD56+); B) linfocitos T CD8+ (CD3+CD8+); C) linfocitos T CD4+ (CD3+CD4+CD25'CD127+); D) linfocitos T reguladores (CD4+CD25+FOXP3+).
Divulgación
Ejemplos
Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden poner en práctica diversos otros modos de realización, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
Ejemplo 1
Procedimientos generales
Técnicas de ADN recombinante
Se usaron procedimientos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La información general con respecto a las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas se da en: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed., publicación de los NIH n.° 91-3242.
Secuenciación de ADN
Se determinaron secuencias de ADN por secuenciación de doble hebra.
Síntesis génica
Se generaron segmentos de genes deseados, cuando se requirió, por PCR usando moldes apropiados o bien se sintetizaron por Geneart AG (Ratisbona, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR por síntesis génica automatizada. En casos donde no estaba disponible ninguna secuencia génica exacta, se diseñaron cebadores oligonucleotídicos en base a las secuencias de los homólogos más cercanos y se aislaron los genes por RT-PCR a partir del ARN que se origina en el tejido apropiado. Se clonaron los segmentos génicos flanqueados por sitios de escisión de endonucleasas de restricción singulares en vectores de clonación/secuenciación estándar. Se purificó el ADN plasmídico a partir de bacterias transformadas y se determinó la concentración por espectroscopia UV. Se confirmó la secuencia de ADN de los fragmentos génicos subclonados por secuenciación de ADN. Se diseñaron segmentos génicos con sitios de restricción adecuados para permitir la subclonación en los respectivos vectores de expresión. Se diseñaron todas las construcciones con una secuencia de ADN del extremo 5' que codifica un péptido líder que se dirige a proteínas para su secreción en células eucariotas. Las SEQ ID NO: 263-273 dan péptidos líder ejemplares y las secuencias polinucleotídicas que los codifican.
Preparación de fusiones de la subunidad Py de IL-2R-Fc y fusión de la subunidad a de IL-2R y Fc
Para estudiar la afinidad de unión por el receptor de IL-2, se generó un instrumento que permitió la expresión de un receptor de IL-2 heterodimérico; se fusionó la subunidad p del receptor de IL-2 a una molécula de Fc que se genomanipuló para heterodimerizar (Fc(ojal)) (véase las SEQ ID NO: 274 y 275) usando la tecnología de "botones en ojales" (Merchant et al., Nat Biotech. 16, 677-681 (1998)). A continuación se fusionó la subunidad y del receptor de IL-2 a la variante de Fc(botón) (véase las SEQ ID NO: 276 y 277), que se heterodimerizó con Fc(ojal). A continuación se usó esta proteína de fusión-Fc heterodimérica como sustrato para analizar la interacción IL-2/receptor de IL-2. Se expresó la subunidad a de IL-2R como una cadena monomérica con un sitio de escisión AcTev y una marca Avi-His (SEQ ID NO: 278 y 279). Se expresaron de forma transitoria las respectivas subunidades de IL-2R en HEK 293 de EBNA con suero para la construcción de la subunidad pY de IL-2r y sin suero para la construcción de la subunidad a. Se purificó la construcción de la subunidad pY de IL-2R en proteína A (GE Healthcare), seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (GE Healthcare, Superdex 200). Se purificó la subunidad a de IL-2R por medio de la marca His en una columna NiNTA (Qiagen) seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (GE Healthcare, Superdex 75).
Preparación de inmunoconjugados
Se pueden encontrar detalles sobre la preparación y purificación de inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab, incluyendo generación y maduración por afinidad de restos de unión a antígeno en los ejemplos adjuntos en la publicación de PCT n.° WO 2011/020783. Como se describe en la misma, se han generado diversos dominios de unión a antígeno dirigidos a FAP por presentación en fagos, incluyendo los designados como 4G8, 3F2, 28H1, 29B11, 14B3 y 4B9 usados en los siguientes ejemplos. El clon 28H1 es un anticuerpo madurado por afinidad basado en el clon original 4G8, mientras que los clones 29B11, 14B3 y 4B9 son anticuerpos madurados por afinidad en base al clon original 3F2. El dominio de unión a antígeno designado como MHLG1 KV9 usado en el presente documento se dirige a MCSP.
Las secuencias de inmunoconjugados que comprenden IL-2 natural que se usaron en los siguientes ejemplos también se pueden encontrar en la publicación de PCT n.° WO 2011/020783. Las secuencias correspondientes a los inmunoconjugados que comprenden IL-2 mutante cuádruple que se usaron en los siguientes ejemplos son: 4G8: SEQ ID NO 211 y 233; 3F2: SEQ ID NO 209 y 231; 28H1: SEQ ID NO 219 y 233; 29B11: SEQ ID NO 221 y 231; 14B3: SEQ ID NO 229 y 231; 4B9: SEQ ID NO 227 y 231; MHLG1-KV9: SEQ ID NO 253 y 255. Se generaron las secuencias de ADN por síntesis génica y/o técnicas de biología molecular clásicas y se subclonaron en vectores de expresión de mamífero (uno para la cadena ligera y uno para la cadena pesada/proteína de fusión de IL-2) bajo el control de un promotor de VSMP y hacia 5' de un sitio de poliA sintético, portando cada vector una secuencia del VEB OriP. Se produjeron inmunoconjugados como se aplica en los ejemplos a continuación cotransfectando exponencialmente células HEK293-EBNA en crecimiento con los vectores de expresión de mamífero usando transfección con fosfato de calcio. De forma alternativa, se transfectaron por polietilenimina (PEI) células HEK293 en crecimiento en suspensión con los respectivos vectores de expresión. De forma alternativa, se usaron grupos de células CHO transfectadas de forma estable o clones de células CHO para la producción en medio sin suero. Si bien las construcciones Fab-IL-2-Fab dirigidas a FAP a base de 4G8 que comprenden IL-2 natural o mutante (cuádruple) se pueden purificar por cromatografía de afinidad usando una matriz de proteína A, las construcciones Fab-IL-2-Fab dirigidas a FAP a base de 28H1 madurado por afinidad se purificaron por cromatografía de afinidad en una matriz de proteína G a pequeña escala.
En resumen, se purificó Fab-IL-2-Fab 28H1 dirigido a FAP, que comprende IL-2 natural o mutante (cuádruple) a partir de sobrenadantes celulares por una etapa de afinidad (proteína G) seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200, GE Healthcare). Se equilibró la columna de proteína G en fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5, se cargó el sobrenadante, y se lavó la columna con fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5. Se eluyó el Fab-IL-2-Fab con ácido fórmico 8,8 mM, pH 3. Se agruparon las fracciones eluidas y se refinaron por cromatografía de exclusión por tamaño en el tampón de formulación final: fosfato de potasio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7. Los resultados ejemplares de purificación y analítica se dan a continuación.
Se purificaron Fab-IL-2-Fab 3F2 o Fab-IL-2-Fab 4G8 dirigidos a FAP, que comprenden IL-2 natural o mutante (cuádruple), por un procedimiento similar compuesto de una etapa de afinidad usando proteína A seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200, GE Healthcare). Se equilibró la columna de proteína A en fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5, se cargó el sobrenadante, y se lavó la columna con fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 7,5, seguido de un lavado con fosfato de sodio 13,3 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 5,45. Opcionalmente se realizó un tercer lavado con MES 10 mM, cloruro de sodio 50 mM, pH 5. Se eluyó el Fab-IL-2-Fab con citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM, pH 3. Se agruparon las fracciones eluidas y se refinaron por cromatografía de exclusión por tamaño en el tampón de formulación final: fosfato de potasio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7. Se dan los procedimientos de purificación detallados ejemplares y los resultados para las construcciones seleccionadas a continuación.
Se generaron proteínas de fusión IgG-IL-2 qm dirigidas a FAP en base a los anticuerpos frente a FAP 4G8, 4B9 y 28H1, en las que se fusionó una única IL-2 mutante cuádruple (qm) al extremo C de una cadena pesada heterodimérica como se muestra en la figura 1B. Se logra el direccionamiento al estroma tumoral donde se expresa selectivamente la FAP por medio de la región Fab de anticuerpo bivalente (efecto de avidez). Se logra la heterodimerización que da como resultado la presencia de una única IL-2 mutante cuádruple por aplicación de la tecnología de botón en ojal. Para minimizar la generación de fusiones IgG-citocina homodiméricas, se fusionó la citocina al extremo C (con deleción del residuo Lys C terminal) de la cadena pesada de IgG que contiene un botón por medio de un conector G4-(SG4)2 o (G4S)3. La fusión anticuerpo-citocina tiene propiedades similares a IgG. Para reducir la unión a FcYR/función efectora y evitar la coactivación de FcR, se introdujeron mutaciones P329G L234A L235A (LALA) en el dominio Fc. Las secuencias de estos inmunoconjugados se dan en las SEQ ID NO 297, 299 y 233 (28H1), las SEQ ID NO 301,303 y 231 (4B9), y las SEQ ID NO 315, 317 y 233 (4G8)). Además, se generaron una proteína de fusión IgG-IL-2 qm dirigida a CEA y una proteína de fusión IgG-IL-2 qm DP47GS no dirigida de control en las que la IgG no se une a una diana especifica. Las secuencias de estos inmunoconjugados se dan en las SEQ ID NO 305, 307 y 309 (DP47GS), y las SEQ ID NO 319, 321 y 323 (CH1A1A).
Se generaron las construcciones IgG-IL-2 por expresión transitoria en células de EBNA HEK293 y se purificó esencialmente como se describe anteriormente para las construcciones Fab-IL-2-Fab. En resumen, se purificaron proteínas de fusión IgG-IL-2 por una etapa de afinidad con proteína A (HiTrap ProtA, GE Healthcare) equilibrada en fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5. Después de cargar el sobrenadante, se lavó primero la columna con fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5 y posteriormente se lavó con fosfato de sodio 13,3 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 5,45. Se eluyó la proteína de fusión IgG-citocina con citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM, pH 3. Se neutralizaron las fracciones y se agruparon y purificaron por cromatografía de exclusión por tamaño (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare) en el tampón de formulación final: fosfato de potasio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7. A continuación se dan procedimientos de purificación detallados ejemplares y los resultados para construcciones seleccionadas. Se determinó la concentración de proteína de las muestras de proteínas purificadas midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos. Se analizaron la pureza y el peso molecular de los inmunoconjugados por SDSPAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y se tiñeron con azul de Coomassie (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen). Se usó el sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (geles Tris-glicina al 4-20 % o Bis-Tris al 3-12 %). Se analizó el contenido de agregado de las muestras de inmunoconjugados usando una columna de exclusión por tamaño analítica Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare) en MOPS 2 mM, NaCl 150 mM, NaN3 al 0,02 %, tampón de migración pH 7,3 a 25 °C.
Afinidad de unión a FAP
Se determinó la actividad de unión a FAP de los fragmentos Fab escindidos usados en estos ejemplos como restos de unión a antígeno por resonancia de plasmón superficial (SPR) en un aparato Biacore. En resumen, se inmovilizó un anticuerpo anti-His (Penta-His, Qiagen 34660) en chips CM5 para capturar FAP-His humana, murina o de macaco cangrejero 10 nM (20 s). La temperatura fue de 25 °C y se usó HBS-EP como tampón. La concentración de analito Fab fue de 100 nM hasta 0,41 nM (duplicados) a un caudal de 50 |jl/min (asociación: 300 s, disociación: 600 s (4B9, 14B3, 29B11,3F2) o 1200 s (28H1,4g 8), regeneración: 60 s, glicina 10 mM, pH 2). Se realizó el ajuste en base a un modelo de unión 1:1, RI=0, Rmáx=local (debido al formato de captura). La tabla 2 da las afinidades monovalentes como se determina por SPR.
TABLA 2. Afinidad (Kd) de fragmentos Fab dirigidos a FAP por FAP como se determina por SPR.
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Ensayos de actividad biológica con inmunoconjugados de IL-2 dirigidos
Se investigó la actividad biológica de inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab dirigidos a FAP o MCSP y de inmunoconjugados IgG-IL-2 dirigidos a FAP, que comprenden IL-2 natural o mutante (cuádruple), en varios ensayos celulares en comparación con IL-2 comercialmente disponible (proleucina, Novartis, Chiron).
Liberación de IFN-y por linfocitos NK (en solución)
Se incubaron células NK92 privadas de IL-2 (100.000 células/pocillo en placas de 96-U-pocillos) con diferentes concentraciones de inmunoconjugados de IL-2, que comprenden IL-2 natural o mutante (cuádruple), durante 24 h en medio NK (MEM alfa de Invitrogen (n.° 22561-021) complementado con FCS al 10 %, suero de caballo al 10 %, 2-mercaptoetanol 0,1 mM, inositol 0,2 mM y ácido fólico 0,02 mM). Se recogieron los sobrenadantes y se analizó la liberación de IFN-y usando el kit II de ELISA de IFN-y antihumano de Becton Dickinson (n.° 550612). La proleucina (Novartis) sirvió como control positivo para la activación mediada por IL-2 de las células.
Proliferación de linfocitos NK
Se extrajo sangre de voluntarios sanos con jeringuillas que contenían heparina y se aislaron las PBMC. Se aislaron linfocitos NK humanos intactos de las PBMC usando el kit II de aislamiento de linfocitos NK humanos de Miltenyi Biotec (n.° 130-091-152). Se comprobó la expresión de CD25 de las células por citometría de flujo. Para los ensayos de proliferación, se incubaron 20.000 linfocitos NK humanos aislados durante 2 días en una incubadora humidificada a 37 °C, CO2 al 5 % en presencia de diferentes inmunoconjugados de IL-2, que comprenden IL-2 natural o mutante (cuádruple). La proleucina (Novartis) sirvió como control. Después de 2 días, se midió el contenido en ATP de los lisados celulares usando el ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo de Promega (n.° G7571/2/3). Se calculó el porcentaje de crecimiento estableciendo la concentración de proleucina más alta a una proliferación de un 100 % y las células no tratadas sin estímulo de IL-2 a una proliferación de un 0 %.
Ensayo de fosforilación de STAT5
Se extrajo sangre de voluntarios sanos con jeringuillas que contenían heparina y se aislaron las PBMC. Se trataron las PBMc con inmunoconjugados de iL-2, que comprenden IL-2 natural o mutante (cuádruple), en las concentraciones indicadas o con proleucina (Novartis) como control. Después de 20 min de incubación a 37 °C, se fijaron las PBMC con tampón Cytofix precalentado (Becton Dickinson n.° 554655) durante 10 min a 37 °C, seguido de permeabilización con tampón Phosflow Perm Buffer III (Becton Dickinson n.° 558050) durante 30 min a 4 °C. Se lavaron las células dos veces con PBS que contenía BSA al 0,1 % antes de realizar la tinción para FACS usando mezclas de anticuerpos de citometría de flujo para la detección de diferentes poblaciones celulares y la fosforilación de STAT5. Se analizaron muestras usando un FACSCantoII con HTS de Becton Dickinson.
Se definieron linfocitos NK como CD3'CD56+, se definieron linfocitos T CD8 positivos como CD3+CD8+, se definieron linfocitos T CD4 positivos como CD4+CD25'CD127+ y se definieron linfocitos Treg como CD4+CD25+FoxP3+.
Proliferación y AICD de linfocitos T
Se extrajo sangre de voluntarios sanos con jeringuillas que contenían heparina y se aislaron las PBMC. Se aislaron linfocitos T intactos usando el kit II de aislamiento de la totalidad de linfocitos T de Miltenyi Biotec (n.° 130-091­ 156). Se preestimularon linfocitos T con 1 |jg/ml de PHA-M (Sigma Aldrich n.° L8902) durante 16 h antes de añadir proleucina o inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab, que comprenden IL-2 natural o mutante (cuádruple), a las células lavadas durante otros 5 días. Después de 5 días, se midió el contenido en ATP de los lisados celulares usando el ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo de Promega (n.° G7571/2/3). Se calculó la proliferación relativa estableciendo la concentración más alta de proleucina a una proliferación de un 100 %.
Se sometieron a ensayo la exposición a fosfatidilserina (PS) y muerte celular de linfocitos T por análisis de citometría de flujo (FACSCantoII, BD Biosciences) de anexina V (Annexin-V-FLUOS Staining Kit, Roche Applied Science) y células teñidas con yoduro de propidio (Pl). Para inducir la muerte celular inducida por activación (AICD), se trataron los linfocitos T con un anticuerpo anti-Fas inductor de apoptosis (clon Ch11 de Millipore) durante 16 h después de las 16 h con PHA-M y 5 días de tratamiento con inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab. Se realizó la tinción con anexina V de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se lavaron las células con tampón de unión de anexina V (reserva 1x: Hepes 0,01 M/NaOH pH 7,4, NaCl 0,14 M, CaCh 2,5 mM) y se tiñeron durante 15 min a TA en la oscuridad con anexina V-FITC (Roche). Se lavaron de nuevo las células en tampón de unión de anexina V antes de la adición de 200 jl/pocillo de tampón de unión de anexina V que contenía PI (0,3 jg/ml). Se analizaron de inmediato las células por citometría de flujo.
Unión a células que expresan FAP
Se midió la unión de inmunoconjugados IgG-IL-2 qm y Fab-IL-2 qm-Fab dirigidos a FAP a FAP humana expresada en células HEK293 transfectadas de forma estable por FACS. En resumen, se incubaron 250.000 células por pocillo con la concentración indicada de los inmunoconjugados en una placa de 96 pocillos de fondo redondo, se incubó durante 30 min a 4 °C, y se lavó una vez con PBS/BSA al 0,1 %. Los inmunoconjugados unidos se detectaron después de la incubación durante 30 min a 4 °C con anticuerpo específico de anti-F(ab')2 humano de cabra de fragmento F(ab')2 AffiniPure conjugado con FITC (Jackson Immuno Research Lab n.° 109-096-097, solución de trabajo: diluida 1:20 en PBS/BSA al 0,1 %, recién preparada) usando un FACS CantoII (programa informático FACS Diva).
Análisis de internalización de FAP tras la unión por FACS
Para varios anticuerpos FAP conocidos en la técnica se describe que inducen la internalización de FAP tras la unión (descrito, por ejemplo, en Baum et al., J Drug Target 15, 399-406 (2007); Bauer et al., Journal of Clinical Oncology, 2010 ASCO Annual Meeting Proceedings (edición posterior a la reunión), vol. 28 (suplemento 20 de mayo) resumen n.° 13062 (2010); Ostermann et al., Clin Cancer Res 14, 4584-4592 (2008)). Por tanto, se analizaron las propiedades de internalización de los inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab de la invención. En resumen, se separaron células GM05389 (fibroblastos de pulmón humano,) cultivadas en medio EMEM con FCS al 15 %, se lavaron, se contaron, se comprobó su viabilidad y se sembraron a una densidad de 2x105 células/pocillo en placas de 12 pocillos. Al día siguiente, se diluyeron inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab dirigidos a FAP en medio frío y se dejó que se unieran a la superficie celular durante 30 min en hielo. Se separó por lavado el exceso de anticuerpo no unido usando PBS frío y las células se incubaron además en 0,5 ml de medio precalentado completo a 37 °C para los períodos de tiempo indicados. Cuando se alcanzaron los diferentes puntos temporales, se transfirieron las células en hielo, se lavaron una vez con PBS frío y se incubaron con el anticuerpo secundario (específico de anti-F(ab')2 humano de cabra de fragmento F(ab')2 AffiniPure conjugado con FITC, Jackson ImmunoResearch Lab n.° 109-096-097, dilución 1:20) durante 30 min a 4 °C. A continuación se lavaron dos veces las células con PBS/BSA al 0,1 %, se transfirieron a una placa de 96 pocillos, se centrifugó durante 4 min a 4 °C, 400 x g y se resuspendieron los sedimentos celulares por agitación en vórtex. Se fijaron las células usando 100 |jl de PFA al 2 %. Para la medición de FACS, se resuspendieron células en 200 jl/muestra de PBS/BSA al 0,1 % y se midió con el protocolo de placa en FACS CantolI (programa informático FACs Diva).
Ejemplo 2
Se diseñaron versiones mutadas de IL-2 que comprendían una o más de las siguientes mutaciones (en comparación con la secuencia de IL-2 natural mostrada en la SEQ ID NO: 1):
1. T3A: inactivación del sitio de O-glucosilación previsto
2. F42A: inactivación de la interacción IL-2/IL-2R a
3. Y45A: inactivación de la interacción IL-2/IL-2R a
4. L72G: inactivación de la interacción IL-2/IL-2R a
5. C125A: mutación previamente descrita para evitar dímeros de IL-2 con puentes disulfuro
Un polipéptido de IL-2 mutante que comprende todas las mutaciones 1-4 se indica en el presente documento como IL-2 mutante cuádruple (qm). Puede comprender además la mutación 5 (véase SEQ ID NO: 19).
Además de las tres mutaciones F42A, Y45A y L72G diseñadas para interferir con la unión a CD25, se eligió la mutación T3A para eliminar el sitio de O-glucosilación y obtener un producto proteico con mayor homogeneidad y pureza cuando se expresa el polipéptido de IL-2 qm o inmunoconjugado en células eucariotas tales como células CHO o HEK293.
Para los propósitos de purificación, se introdujo una marca His6 en el extremo C unido por medio de una secuencia VD. Para su comparación, se generó una versión análoga no mutada de IL-2 que solo contenía la mutación C145A para evitar puentes disulfuro intermoleculares no deseados (SEQ ID NO: 3). Los respectivos pesos moleculares sin secuencia señal fueron 16423 D para IL-2 no marcada y 16169 D para la IL-2 qm no marcada. Se transfectaron las IL-2 natural y mutante cuádruple con marca His en células HEK de EBNA en medio sin suero (medio F17). Se intercambió el tampón del sobrenadante filtrado sobre un flujo cruzado, antes de cargarlo en un cartucho NiNTA Superflow (5 ml, Qiagen). Se lavó la columna con tampón de lavado: fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,4 y se eluyó con tampón de elución: fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, imidazol 0,5 M, pH 7,4. Después de cargar, se lavó la columna con 8 volúmenes de columna (VC) de tampón de lavado, 10 VC de tampón de elución al 5 % (corresponde a imidazol 25 mM), a continuación se eluyó con un gradiente de imidazol 0,5 M. Se refinó el eluido agrupado por cromatografía de exclusión por tamaño en una columna HiLoad 16/60 Superdex75 (GE Healthcare) en MOPS 2 mM, cloruro de sodio 150 mM, acida de sodio al 0,02 %, pH 7,3. La figura 2 muestra el cromatograma de la purificación con marca His para la IL-2 no marcada natural. Se preparó el grupo 1 a partir de las fracciones 78-85, el grupo 2 a partir de las fracciones 86-111. La figura 3 muestra el cromatograma de la cromatografía de exclusión por tamaño para la IL-2 natural, para cada grupo se agruparon las fracciones 12 a 14. La figura 4 muestra la cromatografía de exclusión por tamaño analítica para IL-2 natural como se determina en una columna Superdex 75, 10/300 GL (GE Healthcare) en MOPS 2 mM, cloruro de sodio 150 mM, acida de sodio al 0,02 %, pH 7,3. El grupo 1 y 2 contenían 2 proteínas de aproximadamente 22 y 20 kDa. El grupo 1 tenía más de la proteína grande, y el grupo 2 tenía más de la proteína pequeña, supuestamente esta diferencia se debe a diferencias en la O-glucosilación. Los rendimientos fueron aproximadamente 0,5 mg/l de sobrenadante para el grupo 1 y aproximadamente 1,6 mg/l de sobrenadante para el grupo 2. La figura 5 muestra el cromatograma de la purificación con marca His para la IL-2 mutante cuádruple. Se preparó el grupo 1 a partir de las fracciones 59-91, el grupo 2 a partir de las fracciones 92-111. La figura 6 muestra el cromatograma de la cromatografía de exclusión por tamaño para la IL-2 mutante cuádruple, aquí solo se mantuvieron las fracciones 12 a 14 del grupo 2. La figura 7 muestra la cromatografía de exclusión por tamaño analítica para la IL-2 mutante cuádruple como se determina en una columna Superdex 75, 10/300 g L (GE Healthcare) en MOPS 2 mM, cloruro de sodio 150 mM, acida de sodio al 0,02 %, pH 7,3. La preparación para la IL-2 mutante cuádruple no marcada contenía solo una proteína de 20 kD. Esta proteína tiene el sitio de O-glucosilación inactivado. Se almacenaron las alícuotas de la IL-2 no marcada natural y mutante cuádruple congeladas a -80 °C. Los rendimientos fueron de aproximadamente 0,9 mg/l de sobrenadante.
Se purificó un segundo lote de IL-2 mutante cuádruple con marca His como se describe anteriormente por cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) y seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Los tampones usados para IMAC fueron Tris 50 mM, imidazol 20 mM, NaCl 0,5 M, pH 8, para equilibración y lavado de columna, y Tris 50 mM, imidazol 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8, para elución. El tampón usado para SEC y el tampón de formulación final fue histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6. La figura 43 muestra el resultado de esa purificación. El rendimiento fue de 2,3 ml/l de sobrenadante.
Posteriormente, se determinaron la afinidad por el heterodímero Py de IL-2R y la subunidad a de IL-2R por resonancia de plasmón superficial (SPR). En resumen, se inmovilizó el ligando (subunidad a de IL-2R humana (Fc2) o bien heterodímero botón p ojal y de IL2-R humana (Fc3)) en un chip CM5. Posteriormente, se aplicaron IL-2 no marcada natural (grupo 1 y 2) o mutante cuádruple, y proleucina (Novartis/Chiron) al chip como analitos a 25 °C en tampón HBS-EP en concentraciones que varían de 300 nM hasta 1,2 nM (dil. 1:3). El caudal fue de 30 |jl/min y se aplicaron las siguientes condiciones para la asociación: 180 s, disociación: 300 s, y regeneración: 2 x 30 s MgCl23 M para el heterodímero botón p ojal y de IL2-R, 10 s NaOH 50 mM para la subunidad a de IL-2R. Se aplicó una unión 1:1 para el ajuste (unión 1:1, Rl^0, Rmáx=local para Py de IL-2R, Kd aparente, unión 1:1, RI=0, Rmáx=local para a de IL-2R). La tabla 3 muestra los respectivos valores de Kd para la unión de IL-2 humana natural y mutante cuádruple así como de proleucina a Py de IL-2R y subunidad a de IL-2R.
TABLA 3. Afinidad de los polipéptidos de IL-2 mutantes por el IL-2R de afinidad intermedia y la subunidad a de IL-2R.
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Los datos muestran que la IL-2 mutante cuádruple no marcada muestra el comportamiento deseado y ha perdido la unión para la subunidad a de IL-2R mientras que se retiene la unión a Py de IL-2R y es comparable a la respectiva construcción de IL-2 natural y proleucina. Las diferencias entre los grupos 1 y 2 de la IL-2 natural se pueden atribuir probablemente a diferencias en la O-glucosilación. Esta variabilidad y heterogeneidad se han superado en la IL-2 mutante cuádruple por introducción de la mutación T23A.
Ejemplo 3
Las tres mutaciones F42A, Y45A y L72G y la mutación T3A se introdujeron en el formato Fab-IL-2-Fab (figura 1A) usando el anticuerpo anti-FAP 4G8 como dominio dirigido modelo, como mutantes individuales: 1) IL-24G8 T3A, 2) IL-24G8 F42A, 3) IL-24G8 Y45A, 4) IL-24G8 L72G, o se combinaron en construcciones Fab-IL-2 mt-Fab como: 5) mutante triple F42A/Y45A/L72G, o bien como: 6) mutante cuádruple T3A/F42A/Y45A/L72G para inactivar también el sitio de O-glucosilación. La Fab-IL-2 wt-Fab a base de 4G8 sirvió de comparación. Todas las construcciones contenían la mutación C145A para evitar los dímeros de IL-2 con puentes disulfuro. Se expresaron las diferentes construcciones Fab-IL 2-Fab en células HEK 293 y se purificaron como se describe anteriormente por medio de proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño como se especifica anteriormente. Posteriormente, se determinó la afinidad de las variantes de IL 2 seleccionadas para el heterodímero Py de IL 2R humana y murina y para la subunidad a de IL-2R humana y murina por resonancia de plasmón superficial (SPR) (Biacore) usando el heterodímero Py de IL-2R recombinante y la subunidad a de IL-2R monomérica en las siguientes condiciones: Se inmovilizó la subunidad a de IL-2R en dos densidades y se usó la cubeta de lectura con mayor inmovilización para los mutantes que habían perdido la unión a CD25. Se usaron las siguientes condiciones: inmovilización química: heterodímero Py de IL-2R humano 1675 UR; heterodímero Py de IL-2R de ratón 5094 UR; subunidad a de IL-2R humana 1019 UR; subunidad a de IL-2R humano 385 UR, subunidad a de IL-2R murino 1182 UR; subunidad a de IL-2R murino 378 UR, temperatura: 25 °C, analitos: construcciones Fab-variantes de IL-2-Fab 4G8 de 3,1 nM a 200 nM, flujo 40 |jl/min, asociación: 180 s, disociación: 180 s, regeneración: glicina 10 mM, pH 1,5, 60 s, 40 jl/min. Ajuste: modelo de reacción de dos estados (cambio conformacional), RI=0, Rmáx=local. Los resultados del análisis cinético se dan en la tabla 4.
TABLA 4. Afinidad de inmunoconjugados dirigidos a FAP que comprenden polipéptidos de IL-2 mutantes por el IL-2R de afinidad intermedia y la subunidad a de IL-2R (Kd).
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La unión simultánea al heterodímero Py de IL-2R y FAP se demostró por SPR. En resumen, se inmovilizó la construcción de botón en ojal Py de IL-2R humano en un chip CM5 químicamente y se capturaron construcciones Fab-IL-2-Fab 10 nM durante 90 s. La FAP humana sirvió como analito a las concentraciones de 200 nM hasta 0,2 nM. Las condiciones fueron: temperatura: 25 °C, tampón: HBS-EP, flujo: 30 |jl/min, asociación: 90 s, disociación: 120 s. Se realizó la regeneración durante 60 s con glicina 10 mM pH 2. Se realizó el ajuste con un modelo para unión 1:1, RI t 0, Rmáx=global. El ensayo de puente por SPR mostró que las construcciones Fab-IL-2-Fab, tanto natural como mutante cuádruple, así como las basadas en el fijador de FAP madurado por afinidad 28H1 o los anticuerpos 3F2 o 4G8 originales, se podían unir a una concentración de 10 nM simultáneamente al heterodímero Py de IL-2R inmovilizado en el chip así como a la FAP humana usada como analito (figura 8). Las afinidades determinadas se muestran en la tabla 5.
TABLA 5. Afinidad de inmunoconjugados dirigidos a FAP, que comprenden polipéptidos de IL-2 mutantes y unidos al IL-2R de afinidad intermedia, por FAP (Kd).
Figure imgf000055_0002
Tomados conjuntamente, los datos de SPR mostraron que i) la mutación T3A no influye en la unión a CD25, ii) las tres mutaciones F42A, Y45A y L72G no influyen en la afinidad por el heterodímero Py de IL 2R si bien reducen la afinidad por CD25 en este orden: wt = T3A > Y45A (aproximadamente 5x menor) > L72G (aproximadamente 10x menor) > F42A (aproximadamente 33x menor); iii) la combinación de las tres mutaciones F42a , Y45A y L72G con o sin el mutante en el sitio de O-glucosilación T3A da como resultado una pérdida completa de unión a CD25 como se determina en condiciones de SPR, iv) aunque se reduce la afinidad de IL-2 humana por el heterodímero Py de IL-2R murino y la subunidad a de IL-2R en aproximadamente un factor de 10 en comparación con los receptores de IL-2 humana, las mutaciones seleccionadas no influyen en la afinidad por el heterodímero Py de IL-2R murino, pero anulan la unión a la subunidad a de IL-2R murino en consecuencia. Esto indica que el ratón representa un modelo válido para el estudio de los efectos farmacológicos y toxicológicos de los mutantes de IL-2, aunque la IL-2 global presenta menos toxicidad en roedores que en seres humanos.
Aparte de la pérdida de O-glucosilación, una ventaja adicional de la combinación de las cuatro mutaciones T3A, f42A, Y45A, L72G es una menor hidrofobicidad de superficie de la IL-2 mutante cuádruple debido al intercambio de residuos hidrófobos expuestos en superficie tales como fenilalanina, tirosina o leucina por alanina. Un análisis de la temperatura de agregación por dispersión de luz dinámica mostró que la temperatura de agregación para los inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab dirigidos a FAP que comprenden IL-2 natural o mutante cuádruple estaban en el mismo intervalo: aproximadamente 57-58 °C para el Fab-IL-2-Fab original 3F2 y para el derivado de 3F2 29B11 madurado por afinidad; y en el intervalo de 62-63 °C para el Fab-IL-2-Fab original 4G8 y los derivados de 4G8 28H1, 4B9 y 14B3 madurados por afinidad, lo que indica que la combinación de las cuatro mutaciones no tiene impacto negativo sobre la estabilidad de las proteínas. En apoyo a las propiedades favorables de la IL-2 mutante cuádruple seleccionada, los rendimientos de expresión transitoria indicaron que el mutante cuádruple en el formato Fab-IL-2 qm-Fab pueden incluso dar como resultado mayores rendimientos de expresión que los observados para las respectivas construcciones Fab-IL-2 wt-Fab. Finalmente, el análisis farmacocinético muestra que tanto Fab-IL-2 qm-Fab a base de 4G8 como Fab-IL-2 wt-Fab tienen propiedades FC comparables (véase el ejemplo 9 a continuación). En base a estos datos y los datos celulares descritos en el ejemplo 4 a continuación, se seleccionó el mutante cuádruple T3A, F42A, Y45A, L72G como combinación ideal de mutaciones para anular la unión a CD25 de IL-2 en el inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab dirigido.
Ejemplo 4
Los inmunoconjugados Fab-IL2-Fab dirigidos a FAP a base de 4G8, que comprenden IL-2 natural o los mutantes individuales IL-2 4G8 T3A, IL-2 4G8 F42A, IL-2 4G8 Y45A, IL-2 4G8 L72G o la respectiva IL-2 mutante triple (F42A/Y45A/L72G) o cuádruple (T3A/F42A/Y45A/L72G), se sometieron a prueba posteriormente en ensayos celulares en comparación con proleucina como se describe anteriormente.
Se midió la liberación de IFN-y inducida por IL-2 después de la incubación de la línea de linfocitos NK NK92 con las construcciones (figura 9). Las células NK92 expresan CD25 en su superficie. Los resultados muestran que el inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab que comprende IL-2 natural era menos potente en inducir la liberación de IFN-y que proleucina como se podía esperar de la afinidad aproximadamente 10 veces menor del Fab-IL-2 wt-Fab para el heterodímero Py de IL-2R. La introducción de mutaciones individuales que interfieren con la unión a CD25 así como la combinación de las tres mutaciones que interfieren con la unión a CD25 en el mutante triple de IL-2 dio como resultado construcciones Fab-IL-2-Fab que eran comparables con la construcción de IL-2 natural en términos de potencia e inducción absoluta de liberación de IFN-y dentro del error del procedimiento.
TABLA 6. Inducción de la liberación de IFN-y de linfocitos NK por
inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab que comprenden polipéptidos de IL-2 mutantes.
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Posteriormente, se evaluó la inducción de proliferación de linfocitos NK humanos aislados por inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab en un ensayo de proliferación (Cell Titer Glo, Promega) (figura 10). Al contrario que las células NK92, los linfocitos NK recién aislados no expresan CD25 (o solo muy pocas cantidades). Los resultados muestran que el inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab que comprende IL-2 natural era aproximadamente 10 veces menos potente en inducir la proliferación de linfocitos Nk que proleucina, como se podía esperar de la afinidad aproximadamente 10 veces menor del inmunoconjugado Fab-IL-2 wt-Fab para el heterodímero Py de IL-2R. La introducción de mutaciones individuales que interfieren con la unión a CD25 así como la combinación de las tres mutaciones que interfieren con CD25 en el mutante triple de IL-2 dio como resultado construcciones Fab-IL-2-Fab que eran comparables con la construcción de IL-2 natural en términos de potencia e inducción absoluta de proliferación; solo existió un desplazamiento muy pequeño de potencia observado para el mutante triple Fab-IL-2-Fab. En un segundo experimento, se evaluó la inducción de proliferación de linfocitos T activados con PHA después de la incubación con diferentes cantidades de proleucina e inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab (figura 11). Como los linfocitos T activados expresan CD25, se pudo observar una reducción clara en la proliferación de linfocitos T tras la incubación con los inmunoconjugados que comprenden los mutantes individuales de IL-2 F42A, L72G o Y45A; mostrando F42A la reducción más considerable seguido de L72G e Y45A, mientras que cuando se usó Fab-IL-2 wt-Fab o Fab-IL-2 (T3A)-Fab, casi se retuvo la activación en comparación con proleucina. Estos datos reflejan la reducción en la afinidad por CD25 como se determina por SPR (ejemplo anterior). La combinación de las tres mutaciones que interfieren con la unión a CD25 en la IL-2 mutante triple dio como resultado un inmunoconjugado que medió en la inducción significativamente reducida de la proliferación de linfocitos T en solución. De acuerdo con estos hallazgos, se midió la muerte celular de linfocitos T como se determina por tinción con anexina V/PI después de sobreestimulación inducida por una primera estimulación durante 16 h con 1 |jg/ml de PHA, una segunda estimulación durante 5 días con proleucina o los respectivos inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab, seguido de una tercera estimulación con 1 jg/m l de PHA. En esta situación, se observó que la muerte celular inducida por activación (AICD) en linfocitos T sobreestimulados se redujo considerablemente comprendiendo los inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab los mutantes individuales de IL-2 f42A, L72G e Y45A que interfieren con la unión a CD25, mostrando F42A y L72G la reducción más considerable, lo que era similar a la reducción lograda por la combinación de las tres mutaciones en el inmunoconjugado que comprende la IL-2 mutante triple (figura 12). En el último conjunto de experimentos, se estudiaron los efectos del Fab-IL-2 qm-Fab sobre la inducción de fosforilación de STAT5 en comparación con Fab-IL-2 wt-Fab y proleucina sobre linfocitos NK humanos, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y linfocitos Treg de PBMC humanas (figura 13). Para linfocitos NK y linfocitos T CD8+ que muestran ninguna o muy poca expresión de CD25 (lo que quiere decir que la señalización de IL-2R está mediada por medio del heterodímero Py de IL-2R) los resultados muestran que el formato Fab-IL-2-Fab que comprende IL-2 natural era aproximadamente 10 veces menos potente en inducir la fosforilación de STAT5 que proleucina, y que el Fab-IL-2 qm-Fab era comparable a la construcción Fab-IL-2 wt-Fab. En linfocitos T CD4+, que muestran una regulación por incremento rápida de CD25 tras la estimulación, el Fab-IL-2 qm-Fab era menos potente que el inmunoconjugado Fab-IL-2 wt-Fab, pero todavía mostraba una inducción comparable de señalización de IL-2R a concentraciones de saturación. Esto contrasta con los linfocitos Treg donde la potencia del Fab-IL-2 qm-Fab se redujo significativamente en comparación con el inmunoconjugado Fab-IL-2 wt-Fab debido a la alta expresión de CD25 en linfocitos Treg y la posterior alta afinidad de unión del inmunoconjugado Fab-IL-2 wt-Fab por CD25 en linfocitos Treg. Como consecuencia de la anulación de la unión a CD25 en el inmunoconjugado Fab-IL-2 qm-Fab, la señalización de IL-2 en linfocitos Treg solo se activa por medio del heterodímero Py de IL-2R a concentraciones donde se activa la señalización de IL-2r en células efectoras negativas para CD25 a través del heterodímero Py de IL-2R. Tomados conjuntamente, la IL-2 mutante cuádruple descrita aquí puede activar la señalización de IL-2R a través del heterodímero Py de IL-2R, pero tampoco da como resultado AICd ni una estimulación preferencial de linfocitos Treg sobre otras células efectoras.
Ejemplo 5
En base a los datos descritos en los ejemplos 2 y 3 se generaron inmunoconjugados Fab-IL-2 qm-Fab dirigidos a FAP madurados por afinidad en base a clones 28H1 o 29B11 y se purificaron como se describe anteriormente en la sección de procedimientos generales. En más detalle, se purificó el Fab-IL-2 qm-Fab dirigido 28H1 dirigido a FAP por una etapa de afinidad (proteína G) seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200). Se realizó la equilibración de columna en PBS y se cargó sobrenadante de un grupo de CHO estable (medio CDCHO) sobre una columna de proteína G (GE Healthcare), se lavó la columna con PBS y posteriormente se eluyeron las muestras con HCl 2,5 mM y se neutralizaron de inmediato las fracciones con 10x PBS. Se realizó la cromatografía de exclusión por tamaño en el tampón de formulación final: fosfato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7 en una columna Superdex 200. La figura 14 muestra los perfiles de elución de la purificación y los resultados de la caracterización analítica del producto por SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel al 4-20 %, Invitrogen, tampón de migración MOPS, reducida y no reducida). Dada la baja capacidad de unión del fragmento Fab de 28H1 a la proteína G y la proteína A, etapas de captura adicionales pueden dar como resultado mayores rendimientos.
Se purificaron los inmunoconjugados Fab-IL-2 qm-Fab 4G8, 3F2 y 29B11 dirigidos a FAP y Fab-IL-2 qm-Fab MHLG1 KV9 dirigido a MCSP por una etapa de afinidad (proteína A) seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200). Se realizó la equilibración de columna en fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5 y se cargó el sobrenadante sobre la columna de proteína A. Se realizó un primer lavado en fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5 seguido de un segundo lavado: fosfato de sodio 13,3 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 5,45. Se eluyeron los inmunoconjugados Fab-IL-2 qm-Fab en citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM pH 3. Se realizó la cromatografía de exclusión por tamaño en el tampón de formulación final: fosfato de potasio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7. La figura 15 muestra los perfiles de elución de la purificación y los resultados de la caracterización analítica del producto por SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel al 4-20 %, Invitrogen, tampón de migración MOPS, reducida y no reducida) para el inmunoconjugado Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 y la figura 16 para el Fab-IL-2 qm-Fab MHLG1 KV9.
Se generaron proteínas de fusión IgG-IL-2 qm dirigidas a FAP en base a los anticuerpos frente a FAP 4G8, 4B9 y 28H1, y una proteína de fusión IgG-IL-2 qm no dirigida DP47GS de control como se describe anteriormente en la sección de procedimientos generales. Las figuras 46 y 47 muestran los respectivos cromatogramas y perfiles de elución de la purificación (A, B) así como la SDS-PAGe y cromatografías de exclusión por tamaño analíticas de las construcciones purificadas finales (C, D) para las construcciones a base de 4G8 y 28H1. Los rendimientos de expresión transitoria fueron de 42 mg/l para el inmunoconjugado IgG-IL-2 qm a base de 4G8 y de 20 mg/l para el de a base de 28H1.
Se determinó la actividad de unión a FAP de los inmunoconjugados IgG-IL-2 qm en base a anticuerpos anti-FAP 4G8 y 28H1 por resonancia de plasmón superficial (SPR) en un aparato Biacore en comparación con los correspondientes anticuerpos IgG no modificados. En resumen, se inmovilizó un anticuerpo anti-His (Penta-His, Qiagen 34660) en chips CM5 para capturar FAP humana con marca His 10 nM (20 s). La temperatura fue de 25 °C y se usó HBS-EP como tampón. La concentración de analito fue de 50 nM hasta 0,05 nM a un caudal de 50 |jl/min (asociación: 300 s, disociación: 900 s, regeneración: 60 s con glicina 10 mM, pH 2). El ajuste se realizó en base a un modelo de unión 1:1,
RI=0, Rmáx=local (debido al formato de captura). La tabla 7 da las afinidades bivalentes aparentes estimadas (avidez en pM) como se determina por SPR ajustada con unión 1:1, RI=0, Rmáx=local.
TABLA 7.
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Los datos muestran que dentro del error del procedimiento, la afinidad por la FAP humana se retiene para el inmunoconjugado a base de 28H1 o solo disminuye ligeramente para el inmunoconjugado a base de 4G8 en comparación con los correspondientes anticuerpos no modificados.
Ejemplo 6
Se determinó la afinidad de los inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab a base de 28H1 y 29B11 madurados por afinidad dirigidos a FAP, comprendiendo cada uno IL-2 natural o mutante cuádruple, y del Fab-IL-2 wt-Fab a base de 3F2 por resonancia de plasmón superficial (SPR) para el heterodímero Py de IL-2R humano, murino y de macaco cangrejero usando el heterodímero Py de IL-2R recombinante en las siguientes condiciones: ligando: heterodímero botón p ojal y de IL-2R humano, murino y de macaco cangrejero inmovilizado en chip CM5, analito: Fab-IL-2-Fab 28H1 o 29B11 (que comprende IL-2 natural o mutante cuádruple), Fab-IL-2-Fab 3F2 (que comprende IL-2 natural), temperatura: 25 °C o 37 °C, tampón: HBS-EP, concentración de analito: de 200 nM hasta 2,5 nM, flujo: 30 |jl/min, asociación: 300 s, disociación: 300 s, regeneración: 60 s MgCh 3 M, ajuste: unión 1:1, RI^ 0, Rmáx=global. Se determinó la afinidad del inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab a base de 29B11 y 28H1 madurado por afinidad dirigido a FAP, conteniendo cada uno IL-2 natural o mutante cuádruple, y del Fab-IL-2 wt-Fab a base de 3F2 por resonancia de plasmón superficial (SPR) para la subunidad a de IL-2R humano, murino y de macaco cangrejero usando la subunidad a de IL-2R monomérico recombinante en las siguientes condiciones: ligando: subunidad a de IL-2R humano, murino y de macaco cangrejero inmovilizado en un chip CM5, analito: Fab-IL-2-Fab 28H1 o 29B11 (que comprende IL-2 natural o mutante), Fab-IL-2-Fab 3F2 (que comprende IL-2 natural), temperatura: 25 °C o 37 °C, tampón: HBS-EP, concentración de analito de 25 nM hasta 0,3 nM, flujo: 30 jl/min, asociación: 120 s, disociación: 600 s, regeneración: ninguna, ajuste: unión 1:1, RI=0, Rmáx=global.
Los resultados del análisis cinético con el heterodímero Py de IL-2R se dan en la tabla 8.
TABLA 8. Unión de inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab que comprenden Fab madurado por afinidad e IL-2 mutante a heterodímeros Py de IL-2R.
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Si bien se describe que la afinidad de IL-2 humana por el heterodímero Py de IL 2R humano es de alrededor de 1 nM, los inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab (que comprenden IL-2 natural o mutante cuádruple) tienen ambos una afinidad reducida de entre 6 y 10 nM, y como se muestra para la IL-2 no marcada anteriormente, la afinidad por el IL-2R murino es de alrededor de 10 veces más débil que para el IL-2R humano y de macaco cangrejero.
Los resultados del análisis cinético con la subunidad a de IL-2R se dan en la tabla 9. En las condiciones elegidas, no existe ninguna unión detectable de los inmunoconjugados que comprenden la IL-2 mutante cuádruple a la subunidad a de IL-2R humano, murino o de macaco.
TABLA 9. Unión de inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab que comprenden Fab madurado por afinidad e IL-2 mutante a subunidades a de IL-2R.
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Se determinó la afinidad de los inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab MHLG1-KV9 dirigidos a MCSP, que comprenden la IL-2 natural o mutante cuádruple, por resonancia de plasmón superficial (SPR) por el heterodímero Py de IL-2R humano usando el heterodímero Py de IL-2R recombinante en las siguientes condiciones: se inmovilizó el heterodímero botón p ojal y de IL-2R humano en un chip CM5 (1600 UR). Se usaron Fab-IL-2 wt-Fab y Fab-IL-2 qm-Fab MHLG1-KV9 como analito a 25 °C en tampón HBS-P. La concentración de analito fue de 300 nM hasta 0,4 nM (dil. 1:3) para Py de IL-2R a un flujo de 30 |jl/min (tiempo de asociación de 180 s, tiempo de disociación de 300 s). Se realizó la regeneración durante 2x30 s con MgCh 3 M para Py de IL-2R. Se ajustaron los datos usando una unión 1:1, RI^0, Rmáx=local para Py de IL-2R.
Se determinó la afinidad de los inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab MHLG1-KV9 dirigidos a MCSP, que comprenden la IL-2 natural o mutante cuádruple, por resonancia de plasmón superficial (SPR) por la subunidad a de IL-2R humano usando subunidad a de IL-2R monomérico recombinante en las siguientes condiciones: se inmovilizó la subunidad a de IL-2R humano en un chip CM5 (190 UR). Se usaron Fab-IL-2 wt-Fab y Fab-IL-2 qm-Fab MHLG1-KV9 como analito a 25 °C en tampón HBS-P. La concentración de analito fue de 33,3 nM hasta 0,4 nM (dil. 1:3) para a de IL-2R a un flujo de 30 jl/m in (tiempo de asociación de 180 s, tiempo de disociación de 300 s). Se realizó la regeneración durante 10 s con NaOH 50 mM para a de IL-2R. Se ajustaron los datos usando una unión 1:1, RI=0, Rmáx=global para a de IL-2R.
Los resultados del análisis cinético con el heterodímero Py de IL-2R se dan en la tabla 10.
TABLA 10.
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Los datos confirman que el inmunoconjugado Fab-IL-2 qm-Fab MHLG1-KV9 dirigido a MCSP ha retenido la afinidad por el receptor Py de IL-2R, mientras que la afinidad de unión a CD25 se anula en comparación con el inmunoconjugado que comprende IL-2 natural.
Posteriormente, se determinó la afinidad de los inmunoconjugados IgG-IL-2 qm a base de 4G8 y 28H1 por el heterodímero Py de IL-2R y la subunidad a de IL-2R por resonancia de plasmón superficial (SPR) en comparación directa con el formato de inmunoconjugado Fab-IL-2 qm-Fab. En resumen, se inmovilizaron los ligandos (la subunidad a de IL-2R humano o bien el heterodímero Py de IL-2R humano) en un chip CM5. Posteriormente, se aplicaron los inmunoconjugados IgG-IL-2 qm a base de 4G8 y 28H1 o los inmunoconjugados Fab-IL-2 qm-Fab a base de 4G8 y 28H1 al chip como analitos a 25 °C en tampón HBS-EP en concentraciones que varían de 300 nM hasta 1,2 nM (dil. 1:3). El caudal fue de 30 |jl/min y se aplicaron las siguientes condiciones para la asociación: 180 s, disociación: 300 s, y regeneración: 2 x 30 s con MgCh 3 M para el heterodímero Py de IL-2R, 10 s con NaOH 50 mM para la subunidad a de IL-2R. Se aplicó una unión 1:1 para el ajuste (unión 1:1, Rl^0), Rmáx=local para Py de IL-2R, Kd aparente, unión 1:1, RI=0, Rmáx=local para a de IL-2R). Los respectivos valores de Kd se dan en la tabla 11.
TABLA 11.
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Los datos muestran que los inmunoconjugados IgG-IL-2 qm a base de 4G8 y 28H1 se unen con una afinidad al menos tan buena como los inmunoconjugados Fab-IL-2 qm-Fab al heterodímero Py de IL-2R, mientras que no se unen a la subunidad a de IL-2R debido a la introducción de las mutaciones que interfieren con la unión a CD25. En comparación con los correspondientes inmunoconjugados Fab-IL-2 qm-Fab, la afinidad de las proteínas de fusión IgG-IL-2 qm parece que se potencia ligeramente dentro del error del procedimiento.
Ejemplo 7
En un primer conjunto de experimentos, se confirmó que los inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab dirigidos a FAP que comprenden IL-2 natural o bien mutante se pudieron unir a células HEK 293-FAP que expresan FAP humanas por FACS (figura 17) y que la mutación cuádruple de IL-2 no tuvo ningún impacto sobre la unión a las células que expresan FAP (figura 18).
TABLA 12. Unión de inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab a células HEK que expresan FAP.
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En particular, estos experimentos de unión mostraron que los fijadores de FAP madurados por afinidad 28H1, 29B11, 14B3 y 4B9 como Fab-IL-2 qm-Fab mostraron una unión absoluta superior a las células diana HEK 293-FAP en comparación con los inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab en base a los fijadores de FAP originales 3F2 (29B11, 14B3, 4B9) y 4G8 (28H1) (figura 17), mientras que retenían una alta especificidad y ninguna unión a células HEK 293 transfectadas con DPPIV, un homólogo cercano de FAP, o células HEK 293 con transfección simulada. Para su comparación, se usó el clon de anticuerpo anti-CD26-PE humana DPPIV de ratón M-A261 (BD Biosciences, n.° 555437) como control positivo (figura 19). El análisis de las propiedades de internalización mostró que la unión de inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab no da como resultado la inducción de la internalización de FAP (figura 20).
En otro experimento, se midió por FACS la unión de los inmunoconjugados IgG-IL-2 qm y Fab-IL-2 qm-Fab a base de 4G8 dirigidos a FAP a FAP humanas expresadas en células HEK293 transfectadas de forma estable. Los resultados se muestran en la figura 48. Los datos muestran que el inmunoconjugado IgG-IL-2 qm se une a células que expresan FAP con un valor de CE50 de 0,9 nM, comparable al de la correspondiente construcción Fab-IL-2 qm-Fab a base de 4G8 (0,7 nM).
Posteriormente se sometieron a prueba los inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab anti-FAP madurados por afinidad que comprenden IL-2 natural o el mutante cuádruple en ensayos celulares en comparación con proleucina como se describe en los ejemplos anteriores.
Se midió la liberación de IFN-y inducida por IL-2 en el sobrenadante por ELISA después de la incubación de la línea de linfocitos NK NK92 con estos inmunoconjugados (figura 21) durante 24 h. Las células NK92 expresan CD25 en su superficie. Los resultados muestran que el inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab que comprende IL-2 natural era menos potente en inducir la liberación de IFN-y que proleucina como se podía esperar de la afinidad aproximadamente 10 veces menor del inmunoconjugado Fab-IL-2 wt-Fab para el heterodímero Py de IL-2R. Los inmunoconjugados Fab-IL-2 qm-Fab eran bastante comparables con la respectiva construcción natural para un clon seleccionado en términos de potencia e inducción absoluta de liberación de IFN-y a pesar del hecho de que las células NK92 expresan algo de CD25. Sin embargo, se pudo observar que el Fab-IL-2 qm-Fab 29B11 indujo menos liberación de citocinas en comparación con el Fab-IL-2 wt-Fab 29B11 así como las construcciones de 28H1 y 4G8, para las que solo existió un pequeño desplazamiento en la potencia observada para Fab-IL-2 qm-Fab sobre Fab-IL-2 wt-Fab.
Además, se comparó el inmunoconjugado Fab-IL-2 qm-Fab a base de MHLG1-KV9 dirigido a MCSP con los inmunoconjugados Fab-IL-2 qm-Fab a base de 28H1 y 29B11 en el ensayo de liberación de IFN-y en células NK92. La figura 22 muestra que el Fab-IL-2 qm-Fab a base de MHLG1-KV9 dirigido a MCSP es bastante comparable en inducir la liberación de IFN-y con los inmunoconjugados Fab-IL-2 qm-Fab dirigidos a FAP.
Posteriormente, se evaluó la inducción de proliferación de células NK92 por IL-2 durante un período de 3 días en un ensayo de proliferación por medición de ATP usando CellTiter Glo (Promega) (figura 23). Dado que las células NK92 expresan cantidades bajas de CD25, se pudo detectar una diferencia entre inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab que comprenden IL-2 natural e inmunoconjugados que comprenden IL-2 mutante cuádruple en el ensayo de proliferación, sin embargo, en condiciones de saturación ambos lograron una inducción absoluta de proliferación similar.
En otro experimento, se estudiaron los efectos del inmunoconjugado Fab-IL-2 qm-Fab dirigido a FAP madurado por afinidad 28H1 sobre la inducción de fosforilación de STAT5 en comparación con Fab-IL-2 wt-Fab 28H1 y proleucina en linfocitos NK humanos, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y linfocitos Treg de PBMC humanas (figura 24). Para linfocitos NK y linfocitos T CD8+, que muestran ninguna o muy poca expresión de CD25 (lo que quiere decir que la señalización de IL-2R está mediada por medio del heterodímero Py de IL-2R), los resultados mostraron que el inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab que comprende IL-2 natural era aproximadamente >10 veces menos potente en inducir la liberación de IFN-y que proleucina, y que el inmunoconjugado Fab-IL-2 qm-Fab era solo muy ligeramente menos potente que la construcción Fab-IL-2 Wt-Fab. En linfocitos T CD4+, que muestran una regulación por incremento rápida de CD25 tras la estimulación, el Fab-IL-2 qm-Fab era significativamente menos potente que el inmunoconjugado Fab-IL-2 wt-Fab, pero todavía mostraba una inducción comparable de señalización de IL-2R a concentraciones de saturación. Esto contrasta con los linfocitos Treg, donde la potencia del Fab-IL-2 qm-Fab se redujo significativamente en comparación con la construcción Fab-IL-2 wt-Fab debido a la alta expresión de CD25 en linfocitos Treg y la posterior alta afinidad de unión de la construcción Fab-IL-2 wt-Fab por CD25 en linfocitos Treg. Como consecuencia de la anulación de la unión a CD25 en el inmunoconjugado Fab-IL-2 qm-Fab, la señalización de IL-2 en linfocitos Treg solo se activa por medio del heterodímero Py de IL-2R a concentraciones donde se activa la señalización de IL-2R en células efectoras negativas para CD25 a través del heterodímero Py de IL-2R. Los respectivos valores de CE50 en pM se dan en la tabla 13.
TABLA 13. Inducción de la liberación de IFN-y de linfocitos NK por inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab dirigidos a FAP 28H1 que comprenden polipéptidos de IL-2 mutantes.
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En otro conjunto de experimentos, se investigó la actividad biológica de los inmunoconjugados IgG-IL-2 qm y Fab-IL-2 qm-Fab a base de 4G8 dirigidos a FAP en varios ensayos celulares.
Se estudiaron los inmunoconjugados IgG-IL-2 qm a base de 4G8 y Fab-IL-2 qm-Fab a base de 28H1 dirigidos a FAP para determinar la inducción de liberación de IFN-y por células NK92 como se induce por la activación de la señalización de Py de IL-2R. La figura 49 muestra que el inmunoconjugado IgG-IL-2 qm a base de 4G8 dirigido a FAP fue igualmente eficaz en inducir la liberación de IFN-y que el inmunoconjugado Fab-IL-2 qm-Fab a base de 28H1 madurado por afinidad.
También se estudiaron los efectos del inmunoconjugado IgG-IL-2 qm a base de 4G8 dirigido a FAP sobre la inducción de fosforilación de STAT5 en comparación con los inmunoconjugados Fab-IL-2 wt-Fab y Fab-IL-2 qm-Fab a base de 28H1 así como proleucina en linfocitos NK humanos, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y linfocitos Treg de PBMC humanas. Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 50. Para linfocitos NK y linfocitos T CD8+, el inmunoconjugado IgG-IL-2 qm a base de 4G8 fue <10 veces menos potente en inducir la fosforilación de STAT5 que proleucina, pero ligeramente más potente que los inmunoconjugados Fab-IL-2 wt-Fab y Fab-IL-2 qm-Fab a base de 28H1. En linfocitos T CD4+, el inmunoconjugado IgG-IL-2 qm a base de 4G8 fue menos potente que el inmunoconjugado Fab-IL-2 wt-Fab 28H1, pero ligeramente más potente que el inmunoconjugado Fab-IL-2 qm-Fab 28H1, y todavía mostró inducción de la señalización de IL-2R en concentraciones de saturación comparable con proleucina y Fab-IL-2 wt-Fab 28H1. Esto contrasta con los linfocitos Treg donde la potencia de los inmunoconjugados IgG-IL-2 qm a base de 4G8 y Fab-IL-2 qm-Fab 28H1 se redujo significativamente en comparación con el inmunoconjugado Fab-IL-2 wt-Fab.
Tomados conjuntamente, la IL-2 mutante cuádruple descrita aquí puede activar la señalización de IL-2R a través del heterodímero Py de IL-2R similar a IL-2 natural, pero no da como resultado una estimulación preferencial de linfocitos Treg sobre otras células efectoras.
Ejemplo 8
Se evaluaron los efectos antitumorales de los inmunoconjugados Fab-IL-2 qm-Fab dirigidos a FAP in vivo en comparación con los inmunoconjugados Fab-IL-2 wt-Fab dirigidos a FAP en modelos singénicos de xenoinjerto de ACHN y LLC1. Todos los inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab dirigidos a FAP (que comprenden IL-2 natural o mutante cuádruple) reconocen la FAP murina así como el IL-2R murino. Si bien el modelo de xenoinjerto de ACHN en ratones transgénicos con FcyRIII humano SCID es considerablemente positivo para FAP en IHQ, es un modelo inmunodeficiente y solo puede reflejar mecanismos efectores inmunitarios mediados por linfocitos NK y/o macrófagos/monocitos, pero carece de inmunidad mediada por linfocitos T y, por tanto, no puede reflejar la AlCD o los efectos mediados a través de linfocitos Treg. El modelo de LLC1 singénico, por el contrario, en ratones totalmente inmunocompetentes puede reflejar mecanismos efectores inmunitarios mediados por linfocitos T adaptativos también, pero muestra una expresión bastante baja de FAP en el estroma murino. Cada uno de estos modelos, por tanto, refleja parcialmente la situación que se encuentra en los tumores humanos.
Modelo de xenoinjerto de carcinoma de células renales de ACHN
Se sometieron a prueba los inmunoconjugados Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 dirigidos a FAP usando la línea celular de adenocarcinoma de células renales humanas ACHN, se inyectaron por vía intrarrenal en ratones transgénicos con FcyRIII humano SCID. Se obtuvieron originalmente células de ACHN de la ATCC (American Type Culture Collection) y después de su expansión se depositaron en el banco de células interno Glycart. Se cultivaron células de ACHn en DMEM que contenía FCS al 10 %, a 37 °C en una atmósfera saturada en agua de CO2 al 5 %. Se usó el paso 18 in vitro para inyección intrarrenal, con una viabilidad de un 98,4 %. Se realizó una pequeña incisión (2 cm) en el flanco derecho y pared peritoneal de ratones SCID anestesiados. Se inyectaron cincuenta |jl de suspensión celular (1x106 células de ACHN en medio AimV) de forma subcapsular 2 mm en el riñón. Se cerraron las heridas cutáneas y la pared peritoneal usando pinzas. Se mantuvieron los ratones SCID-FcyRIII hembra (GLYCART-RCC), de 8-9 semanas de edad al principio del experimento (criadas en RCC, Suiza) en condiciones sin patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). Se revisó y aprobó el protocolo de estudio experimental por el gobierno local (P 2008016).
Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo con regularidad. A los ratones se les inyectaron por vía intrarrenal el día 0 del estudio 1x106 células de ACHN, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, a los ratones se les inyectó i.v. Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 tres veces a la semana durante tres semanas. A todos los ratones se les inyectaron i.v. 200 j l de la solución apropiada. A los ratones en el grupo de vehículo se les inyectó PBS y a los grupos de tratamiento inmunoconjugado Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 o Fab-IL-2 qm-Fab 4G8. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por 200 jl, las soluciones madre se diluyeron con PBS cuando fue necesario. La figura 25 muestra que ambos inmunoconjugados Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 mediaron con eficacia superior en términos de una mediana de la supervivencia potenciada en comparación con el grupo de vehículo con una ventaja para el inmunoconjugado Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 sobre Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 en términos de eficacia.
TABLA 14-A.
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Modelo singénico de carcinoma pulmonar de Lewis LLC1
Se sometieron a prueba los inmunoconjugados Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 y Fab-IL-2 qm-Fab 28H1 dirigidos a FAP usando la línea celular de carcinoma pulmonar de Lewis LLC1 de ratón, inyectados i.v. en ratones Black 6. Se obtuvieron originalmente las células de carcinoma pulmonar de Lewis LLC1 de ATCC y después de su expansión se depositaron en el banco de células interno Glycart. La línea de células tumorales se cultivó de forma rutinaria en DMEM que contenía FCS al 10 % (Gibco) a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con CO2 al 5 %. Se usó el paso 10 para trasplante, a una viabilidad de un 97,9 %. Se inyectaron i.v. 2x105 células por animal en la vena de la cola en 200 |jl de medio de cultivo celular Aim V (Gibco). Se mantuvieron los ratones Black 6 (Charles River, Alemania) de 8-9 semanas de edad al principio del experimento en condiciones sin patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). Se revisó y aprobó el protocolo de estudio experimental por el gobierno local (P 2008016). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo con regularidad. A los ratones se les inyectaron i.v. el día 0 del estudio 2x105 células LLC1, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, a los ratones se les inyectó i.v. Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 o Fab-IL-2 qm-Fab 28H1, tres veces a la semana durante tres semanas. A todos los ratones se les inyectaron i.v. 200 j l de la solución apropiada. A los ratones en el grupo de vehículo se les inyectó PBS y al grupo de tratamiento las construcciones Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 o Fab-IL-2 qm-Fab 28H1. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por 200 jl, las soluciones madre se diluyeron con PBS cuando fue necesario. La figura 26 muestra que las construcciones Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 o Fab-IL-2 qm-Fab 28H1 madurado por afinidad mediaron con eficacia superior en términos de una mediana de la supervivencia potenciada en comparación con el grupo de vehículo.
TABLA 14-B.
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En otro experimento, se sometieron a prueba los inmunoconjugados Fab-IL-2 wt-Fab 28H1 y Fab-IL-2 qm-Fab 28H1 dirigidos a FAP en la misma línea celular de carcinoma pulmonar de Lewis LLC1 de ratón, inyectados i.v. en ratones Black 6. Se usó el paso 9 para trasplante, a una viabilidad de un 94,5 %. Se inyectaron i.v. 2x105 células por animal en la vena de la cola en 200 j l de medio de cultivo celular Aim V (Gibco). A los ratones se les inyectaron i.v. el día 0 del estudio 2x105 células l Lc 1, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, a los ratones se les inyectó i.v. Fab-IL-2 wt-Fab 28H1 o Fab-IL-2 qm-Fab 28H1, tres veces a la semana durante tres semanas. A todos los ratones se les inyectaron i.v. 200 j l de la solución apropiada. A los ratones en el grupo de vehículo se les inyectó PBS y al grupo de tratamiento las construcciones Fab-IL-2 wt-Fab 28H1 o Fab-IL-2 qm-Fab 28H1. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por 200 jl, las soluciones madre se diluyeron con PBS cuando fue necesario. La figura 27 muestra que los inmunoconjugados Fab-IL-2 wt-Fab 28H1 y Fab-IL-2 qm-Fab 28H1 mediaron con eficacia superior en términos de una mediana de la supervivencia potenciada en comparación con el grupo de vehículo con una ligera ventaja para el inmunoconjugado Fab-IL-2 wt-Fab 28H1 sobre Fab-IL-2 qm-Fab 28H1 en términos de eficacia.
TABLA 14-C.
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Ejemplo 9
Posteriormente se comparó el Fab-IL-2 qm-Fab dirigido a FAP a base de 4G8 con el inmunoconjugado Fab-IL-2 wt-Fab dirigido a FAP a base de 4G8 en un estudio de toxicidad intravenosa y toxicocinética de siete días en ratones Black 6. La tabla 15 muestra el diseño de estudio de los estudios de toxicidad y toxicocinética.
TABLA 15. Diseño de estudio.
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El propósito del presente estudio era caracterizar y comparar los perfiles de toxicidad y toxicocinética de interleucina-2 (IL-2) natural (wt) de Fab-IL-2-Fab 4G8 dirigido a FAP e IL-2 mutante cuádruple (qm) de Fab-IL-2-Fab G48 dirigido a FAP después de la administración intravenosa una vez al día a ratones macho que no portan tumores durante 7 días. Para el presente estudio, a 5 grupos de 5 ratones macho/grupo se les administró por vía intravenosa 0 (control de vehículo), 4,5 o 9 |jg/g/día de IL-2 wt, o 4,5 o 9 |jg/g/día de IL-2 qm. A 4 grupos adicionales de 6 ratones macho/grupo se les administró 4,5 o 9 jg/g/día de IL-2 wt, o 4,5 o 9 jg/g/día de IL-2 qm para evaluar la toxicocinética. Se cambió la duración del estudio de 7 días a 5 días debido a signos clínicos observados en los animales a los que se le dio 4,5 y 9 jg/g/día de IL-2 wt. La evaluación de la toxicidad se basó en la mortalidad, observaciones en vivo, peso corporal y patología clínica y anatómica. Se extrajo sangre en diversos puntos temporales de animales en los grupos de toxicocinética para el análisis de toxicocinética. Los datos de toxicocinética mostraron que los ratones tratados con IL-2 wt o IL-2 qm tenían niveles plasmáticos mensurables hasta el último momento de extracción de sangre, lo que indica que se expuso a los ratones a los respectivos compuestos en toda la duración del tratamiento. Los valores del ABCO-inf del día 1 sugieren una exposición comparable de IL-2 wt e IL-2 qm en ambos niveles de dosis. Se tomaron muestras escasas el día 5 y mostraron concentraciones plasmáticas equivalentes al día 1, lo que sugiere que no se produjo ninguna acumulación después de 5 días de dosificación de cada compuesto. Con más detalles, se observaron los siguientes hallazgos.
Toxicocinética
La tabla 16 resume la media de los parámetros de toxicocinética en plasma para el Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 dirigido a FAP y el Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 dirigido a FAP como se determina por WinNonLin versión 5.2.1 y un ELISA específico de kappa comercial (Human Kappa ELISA Quantitation Set, Bethyl Laboratories).
TABLA 16.
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*Los parámetros de TC se calcularon en WinNonIin versión 5.2.1 usando análisis no compartimental
Las concentraciones séricas individuales se dan en lo que sigue:
Día de
extracción Conc. sérica Conc. media Gru o dosis de san re Tiem o h Animal n /ml n /ml
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Estos datos muestran que tanto el Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 como el Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 muestran propiedades farmacocinéticas comparables con exposición ligeramente mayor para el Fab-IL-2 qm-Fab 4G8.
Mortalidad
En el grupo de 9 |jg/g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 dirigido a FAP, se produjo mortalidad relacionada con el tratamiento en un animal antes de la necropsia el día 5. Se observaron hipoactividad, piel fría y postura encorvada antes de la muerte. Este animal probablemente murió debido a una combinación de infiltración celular en el pulmón que iba unida a edema y hemorragia y necrosis de médula ósea notable. La mortalidad se resume en la tabla 17.
TABLA 17. Mortalidad el día 5.
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* en vía de necropsia
** se planeó el estudio para siete días pero todos los ratones tratados con el inmunoconjugado de IL-2 natural se vieron notablemente afectados el día 5 y se sacrificaron ya que no se esperaba que sobrevivieran.
Observaciones clínicas
Se observaron observaciones de hipoactividad, piel fría y postura encorvada en animales a los que se les dio 4,5 y 9 jg/g/día de IL-2 wt. Las observaciones clínicas se resumen en la tabla 18.
TABLA 18. Observaciones clínicas el día 5.
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Peso corporal
Se observó una disminución moderada en el peso corporal después de 5 días de tratamiento en animales a los que se les dio 4,5 y 9 (9 % y 11 %, respectivamente) |jg/g/día de IL-2 wt. Se observó una ligera disminución en el peso corporal después de 5 días de tratamiento en animales a los que se les dio 4,5 o 9 (2 % y 1 %, respectivamente) jg/g/día de IL-2 qm. También se observó una disminución moderada (9 %) en el peso corporal en controles de vehículo después de 5 días de tratamiento. Sin embargo, el porcentaje de disminución sería de un 5 % si se excluye un potencial valor atípico (animal n.° 3). La pérdida de peso corporal en el grupo de vehículo se puede atribuir al estrés.
Hematología
Se observó un recuento plaquetario reducido en animales a los que se les dio 4,5 (~4,5 veces) y 9 jg/g/día (~11 veces) de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8, correlacionado con una reducción de megacariocitos en la médula ósea así como efectos de consumo sistémico (fibrina) en el bazo y pulmón de estos animales (véase la sección Histopatología a continuación). Estos hallazgos indicaron que la reducción de plaquetas se debía probablemente a efectos combinados de consumo y disminución en la producción/acumulación en médula ósea debido al incremento en la producción de linfocitos/mielocitos como efecto directo o indirecto de IL-2.
Los hallazgos hematológicos de una relación incierta con la administración del compuesto consistieron en disminuciones del recuento linfocitario absoluto con Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 a 4,5 (~5 veces) y 9 jg /g (~3 veces) en comparación con la media del valor del grupo de control de vehículo. Estos hallazgos carecían de una dependencia de la dosis clara, pero se podrían considerar secundarios a los efectos asociados con el estrés observados en las observaciones en vivo o la farmacología exagerada del compuesto (linfocitos que migran hacia los tejidos). No existieron cambios hematológicos relacionados con el tratamiento atribuidos a la administración de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8. Unos pocos hallazgos hematológicos aislados fueron estadísticamente diferentes de sus respectivos controles. Sin embargo, estos hallazgos fueron de magnitud insuficiente para sugerir una pertinencia patológica.
Patología e histopatología macroscópica
Los hallazgos macroscópicos relacionados con el tratamiento incluyeron esplenomegalia hallada en 5/5 y 4/5 de los ratones de los grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8, respectivamente, y en 1/5 en ambos grupos de tratamiento de 4,5 y 9 jg /g de Fab-lL-2 qm-Fab 4G8.
Estuvieron presentes hallazgos histopatológicos relacionados con el tratamiento en los grupos a los que se les dio 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 en pulmón, médula ósea, hígado, bazo y timo, con diferencias en la incidencia, graduación de gravedad o naturaleza de los cambios, como se informa a continuación.
Los hallazgos histopatológicos relacionados con el tratamiento en el pulmón consistieron en infiltración mononuclear hallada de leve a notable en 5/5 de los ratones de los grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y marginalmente en 5/5 de los ratones de los grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8. La infiltración mononuclear consistió en linfocitos (de los que algunos se observó que tenían gránulos citoplásmicos) así como macrófagos reactivos. A menudo se observó que estas células tenían patrones vasocéntricos, a menudo con marginación observada dentro de los vasos en el pulmón. También se observaron estas células rodeando los vasos, pero en casos más graves, el patrón estaba más difuso. Se observó hemorragia de marginal a leve en 5/5 de los ratones de los grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y marginalmente en 2/5 de los ratones en el grupo de 9 jg /g de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8. Aunque a menudo se observó la hemorragia de forma perivascular, en los casos más graves, se observó en espacios alveolares. Se observó edema de leve a moderado en 5/5 de los ratones en los grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y marginalmente en 5/5 de los ratones en el grupo de 9 jg /g de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8. Aunque con frecuencia se observó el edema de forma perivascular, en los casos más graves, también se observó en espacios alveolares. Se observó degeneración celular marginal y cariorrexis en 2/5 y 5/5 de los ratones en los grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8, respectivamente y consistió en degeneración de leucocitos infiltrantes o reactivos. Los animales seleccionados con tinciones MSB fueron positivos para fibrina hallada dentro de los pulmones de animales en ambos grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 lo que se correlaciona en parte con la reducción de plaquetas observada en estos animales.
Los cambios relacionados con el tratamiento en la médula ósea incluyeron un incremento de marginal a leve de la celularidad de médula global en 5/5 de los ratones y 2/5 de los ratones de ambos grupos de 4,5 y 5/5 de los ratones y 2/5 de los ratones de ambos grupos de 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y Fab-IL-2 qm-Fab 4G8, respectivamente. Esto se caracterizó por un incremento de marginal a moderado de la hiperplasia por linfocitos-mielocitos en estos grupos que se apoyó en parte, por el incremento en los números de linfocitos T CD3 positivos dentro de la médula y senos (específicamente linfocitos T, confirmado por inmunohistoquímica con el marcador de la totalidad de linfocitos T CD3 realizada en animales seleccionados). El incremento de linfocitos T CD3 positivos fue moderado en ambos grupos de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y de marginal a leve en ambos grupos de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8. Se observaron disminuciones de marginales a leves en megacariocitos en 2/5 de los ratones en el grupo de 4,5 y 5/5 de los ratones en el grupo de 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y se observaron disminuciones de marginales a moderadas en precursores eritroides en 3/5 de los ratones en el grupo de 4,5 y 5/5 de los ratones en el grupo de 9 |jg/g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8. Se observó necrosis de médula ósea en 1/5 de los ratones en el grupo de 4,5 (mínima) y 5/5 de los ratones en el grupo de 9 (de leve a notable) jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8. El número reducido de megacariocitos en la médula ósea se correlacionó con la disminución de plaquetas que se pudo deber a la acumulación directa de la médula ósea por el incremento de precursores de linfocitos/mieloides y/o la necrosis de médula ósea, y/o consumo de plaquetas debido a inflamación en diversos tejidos (véase bazo y pulmón). La disminución de precursores eritroides observada en la médula ósea, no se correlacionó con los hallazgos hematológicos de la sangre periférica probablemente debido a efectos temporales (observados en la médula ósea antes que en la sangre periférica) y la semivida más larga de los eritrocitos periféricos (en comparación con las plaquetas). El mecanismo de necrosis de médula ósea en la médula ósea puede ser secundario debido a un hacinamiento evidente de la cavidad de médula (debido a la producción y crecimiento de linfocitos/mielocitos), liberación sistémica o local de citocinas de los tipos de células en proliferación, posiblemente relacionado con los efectos locales de hipoxia u otros efectos farmacológicos del compuesto.
Los hallazgos relacionados con el tratamiento en el hígado consistieron en infiltrado de células mononucleares principalmente vasocéntrico de leve a moderado y necrosis de células individuales de marginal a leve en 5/5 de los ratones de los grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8. Se observó necrosis de células individuales marginal en 2/5 y 4/5 de los ratones en los grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8, respectivamente. El infiltrado mononuclear consistió principalmente en linfocitos (específicamente linfocitos T, confirmado por inmunohistoquímica con el marcador de la totalidad de linfocitos T CD3 realizada en animales seleccionados) que se observaron más a menudo de forma vasocéntrica así como con marginación dentro de los vasos centrales y portales. Los animales seleccionados para tinción inmunohistoquímica por F4/80 mostraron un incremento en números y tamaño (activado) de macrófagos/células de Kupffer en todos los sinusoides hepáticos en los grupos de 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y Fab-IL-2 qm-Fab 4G8.
Los hallazgos relacionados con el tratamiento en el bazo consistieron en hiperplasia/infiltración linfoide de moderada a notable e hiperplasia/infiltración de macrófagos de leve a moderada en 5/5 de los ratones en los grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 e hiperplasia/infiltración linfoide de leve a moderada con hiperplasia/infiltración de macrófagos de marginal a leve en 5/5 de los ratones en los grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8. La inmunohistoquímica para 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 mostró diferentes patrones usando el marcador de la totalidad de linfocitos T CD3, así como el marcador de macrófagos F4/80. Para 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8, el patrón de inmunorreactividad de linfocitos T y macrófagos permaneció principalmente dentro de las áreas de pulpa roja, ya que la arquitectura de los folículos primarios se había alterado por linfocitólisis y necrosis (descrito a continuación). Para 9 jg /g de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8, las tinciones especiales mostraron un patrón similar al del control de vehículo, pero con expansión de la pulpa blanca de la vaina linfoide periarteriolar (PALS), por una población de linfocitos T y un área de pulpa roja expandida mayor. La positividad de linfocitos T y macrófagos también fue evidente dentro de la pulpa roja, con un patrón similar al grupo de control de vehículo, pero expandido. Estos hallazgos se correlacionan con los hallazgos macroscópicos de esplenomegalia. Se observó necrosis de forma marginal en 3/5 de los ratones y de forma marginal a leve en 5/5 de los ratones en los grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8, respectivamente. La necrosis se localizó normalmente alrededor del área de los folículos primarios y los animales seleccionados usando tinción MSB dieron positivo para fibrina en ambos grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 lo que se correlaciona en parte con la reducción de plaquetas observada en estos animales. Se observó linfocitólisis en los grupos de 4,5 jg /g (de mínima a leve) y 9 jg /g (de moderada a notable) de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8.
Los hallazgos relacionados con el tratamiento en el timo incluyeron incrementos de mínimos a leves en linfocitos en ambos grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y de 4,5 ug/g de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8. La corteza y médula no fueron individualmente evidentes, en los grupos de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8, pero la inmunohistoquímica para el marcador de la totalidad de linfocitos T (CD3) en animales seleccionados en los grupos de 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y 9 jg /g de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 mostró una considerable positividad por la mayoría de las células dentro del timo. Se consideró que un incremento de linfocitos en el timo era un efecto farmacológico directo de ambos compuestos donde IL-2 indujo la proliferación de linfocitos que migraron al timo (linfocitos T) desde la médula ósea para diferenciación y expansión clonal adicional. Esto se produjo en todos los grupos excepto en el de 9 jg /g de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8, lo que es probablemente un efecto temporal. La linfocitólisis fue leve en el grupo de 4,5 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8, y fue de moderada a notable en el grupo de 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8. Se observó disminución linfoide moderada en ambos grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8. Si bien estos hallazgos parecen más sólidos en los grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8, estos animales se describieron como moribundos el día 5, y la linfocitólisis de leve a notable así como la disminución linfoide moderada se puede relacionar con esta observación en vivo (efectos relacionados con el estrés debido a una mala condición física).
Los hallazgos histopatológicos de relación incierta con la administración del compuesto en el hígado consistieron en un infiltrado/activación de células mixtas (linfocitos y macrófagos) marginal observado como pequeños focos/microgranulomas dispersos aleatoriamente en todo el hígado en 5/5 de los ratones en ambos grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8. También se observó este cambio marginal en el grupo de control de vehículo pero con menor incidencia y gravedad. Se observó dilatación glandular y atrofia gástrica de forma marginal a leve en 5/5 de los ratones y se observó atrofia vellosa ileal de forma marginal en 3/5 de los ratones en el grupo de 9 |jg/g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8. Este hallazgo se atribuye, lo más probablemente, a una mala condición física observada en estos ratones tales como reducción en el peso corporal, en especial en el grupo de 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 observado en las observaciones en vivo.
Los hallazgos en el sitio de inyección incluyeron infiltrado de células mixtas, edema perivascular y miodegeneración que se observó igualmente en el control de vehículo, los grupos de 9 jg /g de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 y 9 jg /g de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8. Un animal tuvo necrosis epidérmica. Estos hallazgos no se atribuyeron al/a los propio(s) tratamiento(s), sino a la inyección i.v. diaria y a la manipulación de la cola. Otro animal tuvo infiltración de macrófagos del músculo esquelético (observado en el corte histológico de tejido pulmonar) asociada con miodegeneración y miorregeneración probablemente debido a una lesión crónica y no se atribuyó al tratamiento. Se observó disminución linfoide marginal en 3/5 y 4/5 de los ratones en los grupos de 4,5 y 9 jg /g de Fab-IL-2 qm-Fab 4G8, respectivamente y se atribuyó lo más probablemente a cambios fisiológicos normales observados en el timo a medida que los ratones envejecían (también observado en incidencia, 4/5 de los ratones, y gravedad similares en animales de control de vehículo).
En conclusión, la administración intravenosa diaria de Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 o Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 en dosis de 4,5 o 9 jg/g/día durante hasta 5 días en ratones macho dio como resultado hallazgos histológicos relacionados con el tratamiento similares con ambos compuestos. Sin embargo, los hallazgos fueron en general más predominantes y más graves con Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 dirigido a FAP en el pulmón (figura 28 y 29) (infiltración mononuclear que consistía en linfocitos y macrófagos reactivos, hemorragia y edema), médula ósea (hiperplasia linfomieloide e incremento en la celularidad), hígado (figura 30) (necrosis de células individuales, incremento de células de Kupffer/macrófagos en número y activación), bazo (extremadamente agrandado, infiltración de macrófagos y linfocitos/hiperplasia) y timo (incremento en linfocitos). Además, solo se observó mortalidad, linfocitólisis, necrosis o degeneración celular en el pulmón, bazo, médula ósea y timo, así como reducción de megacariocitos y eritrocitos en médula ósea y reducción de plaquetas en sangre periférica en animales a los que se les dio IL-2 wt. En base a los hallazgos de patología clínica y anatómica, así como observaciones clínicas, y la exposición sistémica comparable de ambos compuestos, la IL-2 qm en las condiciones del presente estudio presentó notablemente menos toxicidad sistémica después de 5 dosis que la IL-2 wt.
Ejemplo 10
Inducción de secreción de IFN-y por linfocitos NK por IL-2 natural y mutante cuádruple
Se privaron células NK-92 durante 2 h antes de sembrar 100.000 células/pocillo en una placa de fondo F de 96 pocillos. Se valoraron las construcciones de IL-2 en las células NK-92 sembradas. Después de 24 h o 48 h, se centrifugaron las placas antes de recoger los sobrenadantes para determinar la cantidad de IFN-y humano usando un ELISA para IFN-y comercial (BD n.° 550612).
Se sometieron a prueba dos preparaciones internas diferentes de IL-2 natural (que probablemente difiere ligeramente en sus perfiles de O-glucosilación, véase el ejemplo 2), una IL-2 natural disponible comercialmente (proleucina) e IL-2 mutante cuádruple preparada internamente (primer lote).
La figura 31 muestra que la IL-2 mutante cuádruple es igualmente potente que la IL-2 natural obtenida comercialmente (proleucina) o producida internamente en inducir la secreción de IFN-y por linfocitos NK durante 24 (A) o 48 horas (B).
Ejemplo 11
Inducción de proliferación de linfocitos NK por IL-2 natural y mutante cuádruple
Se privaron células NK-92 durante 2 h antes de sembrar 10.000 células/pocillo en placas de fondo transparente F negras de 96 pocillos. Se valoraron las construcciones de IL-2 en las células NK-92 sembradas. Después de 48 h, se midió el contenido en ATP para determinar el número de células viables usando el kit de "ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo" de Promega de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se sometieron a prueba las mismas preparaciones de IL-2 que en el ejemplo 10.
La figura 32 muestra que todas las moléculas sometidas a prueba pudieron inducir la proliferación de linfocitos NK. A bajas concentraciones (< 0,01 nM) la IL-2 mutante cuádruple fue ligeramente menos activa que la IL-2 natural producida internamente, y todas las preparaciones internas fueron menos activas que la IL-2 natural obtenida comercialmente (proleucina).
En un segundo experimento, se sometieron a prueba las siguientes preparaciones de IL-2: IL-2 natural (grupo 2), IL-2 mutante cuádruple (primer y segundo lote).
La figura 33 muestra que todas las moléculas sometidas a prueba fueron aproximadamente activas de forma similar en inducir la proliferación de linfocitos NK, siendo las dos preparaciones de IL-2 mutante solo mínimamente menos activas que las preparaciones de IL-2 natural a las concentraciones más bajas.
Ejemplo 12
Inducción de proliferación de PBMC humanas por inmunoconjugados que comprenden IL-2 natural o mutante cuádruple
Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO, EE. UU.). En resumen, se extrajo sangre venosa de voluntarios sanos en jeringuillas heparinizadas. Se diluyó la sangre 2:1 con PBS sin calcio ni magnesio, y se estratificó en Histopaque-1077. Se centrifugó el gradiente a 450 x g durante 30 min a temperatura ambiente (TA) sin interrupciones. Se recogió la interfaz que contenía las PBMC y se lavó tres veces con PBS (350 x g seguido de 300 x g durante 10 min a TA).
Posteriormente, se marcaron las PBMC con CFSE (éster succinimidílico de carboxifluoresceína) 40 nM durante 15 min a 37 °C. Se lavaron las células con 20 ml de medio antes de recuperar las PBMC marcadas durante 30 min a 37 °C. Se lavaron las células, se contaron, y se sembraron 100.000 células en placas de fondo en U de 96 pocillos. Se valoraron proleucina prediluida (IL-2 natural disponible comercialmente) o inmunoconjugados de IL-2 sobre las células sembradas que se incubaron durante los puntos temporales indicados. Después de 4-6 días, se lavaron las células, se tiñeron con marcadores de superficie celular apropiados, y se analizaron por FACS usando un FACSCantoII de BD. Se definieron linfocitos NK como CD37CD56+, linfocitos T CD4 como CD3+/CD8' y linfocitos T CD8 como CD3+/CD8+.
La figura 34 muestra la proliferación de linfocitos NK después de la incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-2 28H1 dirigidos a FAP durante 4 (A), 5 (B) o 6 (C) días. Todas las construcciones sometidas a prueba indujeron la proliferación de linfocitos NK de manera dependiente de la concentración. La proleucina fue más eficaz que los inmunoconjugados a menores concentraciones, sin embargo, esta diferencia ya no existió a mayores concentraciones. En puntos temporales más tempranos (día 4), las construcciones de IgG-IL-2 parecieron ligeramente más potentes que las construcciones de Fab-IL-2-Fab. En puntos temporales posteriores (día 6), todas las construcciones tuvieron una eficacia comparable, siendo la construcción Fab-IL-2 qm-Fab la menos potente a las concentraciones bajas.
La figura 35 muestra la proliferación de linfocitos T CD4 después de la incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-2 28H1 dirigidos a FAP durante 4 (A), 5 (B) o 6 (C) días. Todas las construcciones sometidas a prueba indujeron la proliferación de linfocitos T CD4 de manera dependiente de la concentración. La proleucina tuvo mayor actividad que los inmunoconjugados, y los inmunoconjugados que comprenden IL-2 natural fueron ligeramente más potentes que los que comprenden IL-2 mutante cuádruple. Como para los linfocitos NK, la construcción Fab-IL-2 qm-Fab tuvo la actividad más baja. Lo más probablemente es que los linfocitos T CD4 en proliferación sean parcialmente linfocitos T reguladores, al menos para las construcciones de IL-2 natural.
La figura 36 muestra la proliferación de linfocitos T CD8 después de la incubación con diferentes inmunoconjugados de IL-2 28H1 dirigidos a FAP durante 4 (A), 5 (B) o 6 (C) días. Todas las construcciones sometidas a prueba indujeron la proliferación de linfocitos T CD8 de manera dependiente de la concentración. La proleucina tuvo mayor actividad que los inmunoconjugados, y los inmunoconjugados que comprenden IL-2 natural fueron ligeramente más potentes que los que comprenden IL-2 mutante cuádruple. Como para los linfocitos NK y T CD4, la construcción Fab-IL-2 qm-Fab tuvo la actividad más baja.
La figura 37 representa los resultados de otro experimento, en el que se compararon IgG-IL-228H1 dirigido a FAP, que comprende IL-2 natural o bien mutante cuádruple, y proleucina. El tiempo de incubación fue de 6 días. Como se muestra en la figura, las tres construcciones de IL-2 inducen la proliferación de linfocitos NK (A) y T CD8 (C) de manera dependiente de la dosis con potencia similar. Para linfocitos T CD4 (B), el inmunoconjugado IgG-IL2 qm tiene una menor actividad, en particular a las concentraciones del medio, lo que se podría deber a su falta de actividad sobre linfocitos T CD25 positivos (incluyendo reguladores) que son un subconjunto de los linfocitos T CD4.
Ejemplo 13
Activación de células efectoras por IL-2 natural y mutante cuádruple (ensayo de pSTAT5)
Se prepararon PBMC como se describe anteriormente. Se sembraron 500.000 PBMC/pocillo en placas de fondo en U de 96 pocillos y se dejaron en reposo 45 min a 37 °C en medio RPMI que contenía FCS al 10 % y Glutamax al 1 % (Gibco). Después de esto, se incubaron las PBMC con proleucina, IL-2 natural producida internamente o IL-2 mutante cuádruple a las concentraciones indicadas durante 20 min a 37 °C para inducir la fosforilación de STAT5. Posteriormente, se fijaron de inmediato las células (tampón Cytofix de BD) durante 10 min a 37 °C y se lavaron una vez, seguido de una etapa de permeabilización (tampón de permeabilización III Phosflow de BD) durante 30 min a 4 °C. Después de esto, se lavaron las células con PBS/BSA al 0,1 % y se tiñeron con mezclas de anticuerpos FACS para la detección de linfocitos NK (CD3-/CD56+), linfocitos T c D8+ (CD3+/CD8+), linfocitos T CD4+ (CD3+/CD4+/CD25-/CD127+) o linfocitos Treg (CD4+/CD25+/CD127-/FoxP3+), así como pSTAT5 durante 30 min a TA en la oscuridad. Se lavaron las células dos veces con PBS/BSA al 0,1 % y se resuspendieron en PFA al 2 % antes del análisis de citometría de flujo (FACSCantoII de BD).
La figura 38 muestra la fosforilación de STAT en linfocitos NK (A), linfocitos T CD8 (B), linfocitos T CD4 (C) y linfocitos T reguladores (D) después de 30 min de incubación con proleucina, IL-2 natural producida internamente (grupo 2) e IL-2 mutante cuádruple (lote 1). Las tres preparaciones de IL-2 fueron igualmente potentes en inducir la fosforilación de STAT en linfocitos NK así como T CD8. En linfocitos T CD4 e incluso más en linfocitos T reguladores, la IL-2 mutante cuádruple tuvo menor actividad que las preparaciones de IL-2 natural.
Ejemplo 14
Activación de células efectoras por IgG-IL-2 natural y mutante cuádruple (ensayo de pSTAT5)
Las condiciones experimentales fueron como se describe anteriormente (véase el ejemplo 13).
La figura 39 muestra la fosforilación de STAT en linfocitos NK (A), linfocitos T CD8 (B), linfocitos T CD4 (C) y linfocitos T reguladores (D) después de 30 min de incubación con proleucina, IgG-IL-2 que comprende IL-2 natural o IgG-IL-2 que comprende IL-2 mutante cuádruple. En todos los tipos de células la proleucina fue más potente en inducir la fosforilación de STAT que los inmunoconjugados IgG-IL-2. Las construcciones IgG-IL-2 natural y mutante cuádruple fueron igualmente potentes en linfocitos NK así como T CD8. En linfocitos T CD4 e incluso más en linfocitos T reguladores, el IgG-IL-2 mutante cuádruple tuvo menor actividad que el inmunoconjugado IgG-IL-2 natural.
Ejemplo 15
Dosis tolerada máxima (DTM) de los inmunoconjugados Fab-IL-2 wt-Fab y Fab-IL-2 qm-Fab dirigidos a FAP
Se sometieron a prueba dosis crecientes de inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab dirigidos a FAP, que comprendían IL-2 natural (wt) o bien mutante cuádruple (qm), en ratones Black 6 inmunocompetentes sin tumores. Se mantuvieron los ratones Black 6 hembra (Charles River, Alemania) de 8-9 semanas de edad al principio del experimento en condiciones sin patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). Se revisó y aprobó el protocolo de estudio experimental por el gobierno local (P 2008016). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo con regularidad.
A los ratones se les inyectó i.v. una vez al día durante 7 días Fab-IL-2 wt-Fab 4G8 a dosis de 60, 80 y 100 |jg/ratón o Fab-IL-2 qm-Fab 4G8 a dosis de 100, 200, 400, 600 y 1000 |jg/ratón. A todos los ratones se les inyectaron i.v.
200 j l de la solución apropiada. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por 200 jl, se diluyeron las soluciones madre con PBS como fue necesario.
La figura 40 muestra que la DTM (dosis tolerada máxima) para Fab-IL-2 qm-Fab es 10 veces mayor que para Fab-IL-2 wt-Fab, a saber 600 jg/ratón diaria durante 7 días para Fab-IL-2 qm-Fab frente a 60 jg/ratón diaria durante 7 días para Fab-IL-2 wt-Fab.
TABLA 19.
Figure imgf000071_0001
Ejemplo 16
Farmacocinética de una dosis individual de IgG-IL2 w t y qm dirigidos a FAP y no dirigidos
Se realizó un estudio farmacocinético (FC) de dosis individual en 129 ratones inmunocompetentes sin tumores para inmunoconjugados IgG-IL2 dirigidos a FAP que comprenden IL-2 natural o bien mutante cuádruple, e inmunoconjugados IgG-IL2 no dirigidos que comprenden IL-2 natural o bien mutante cuádruple.
Se mantuvieron 129 ratones hembra (Harlan, Reino Unido) de 8-9 semanas de edad al principio del experimento en condiciones sin patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). Se revisó y aprobó el protocolo de estudio experimental por el gobierno local (P 2008016). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo con regularidad.
A los ratones se les inyectó i.v. una vez IgG-IL2 wt 28H1 (2,5 mg/kg) o IgG-IL2 qm 28H1(5 mg/kg) dirigido a FAP, o IgG-IL2 wt DP47GS (5 mg/kg) o IgG-IL2 qm DP47GS (5 mg/kg) no dirigido. A todos los ratones se les inyectaron i.v. 200 |jl de la solución apropiada. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por 20o pl, se diluyeron las soluciones madre con PBS como fue necesario.
Se extrajo sangre de los ratones a 1, 8, 24, 48, 72, 96 h, y después de esto cada 2 días durante 3 semanas. Se extrajeron los sueros y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis por ELISA. Se determinaron las concentraciones de inmunoconjugados en suero usando un ELISA para la cuantificación del anticuerpo inmunoconjugado de IL2 (Roche-Penzberg). Se midió la absorción usando una longitud de onda de medición de 405 nm y una longitud de onda de referencia de 492 nm (lector de microplacas ajustable VersaMax, Molecular Devices).
La figura 41 muestra la farmacocinética de estos inmunoconjugados de IL-2. Ambas construcciones IgG-IL2 qm dirigida a FAP (A) y no dirigida (B) tienen una semivida en suero más larga (aprox. 30 h) que las correspondientes construcciones IgG-I L2 wt (aprox. 15 h).
TABLA 20.
Figure imgf000072_0001
Ejemplo 17
Farmacocinética de una dosis individual de Fab-IL-2 wt-Fab y Fab-IL-2 qm-Fab no dirigidos
Se realizó un estudio farmacocinético (FC) de dosis individual en 129 ratones inmunocompetentes sin tumores para inmunoconjugados Fab-IL-2-Fab no dirigidos que comprenden IL-2 natural o bien mutante cuádruple.
Se mantuvieron 129 ratones hembra (Harlan, Reino Unido) de 8-9 semanas de edad al principio del experimento en condiciones sin patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). Se revisó y aprobó el protocolo de estudio experimental por el gobierno local (P 2008016). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo con regularidad.
A los ratones se les inyectó i.v. una vez Fab-IL-2 wt-Fab DP47GS a una dosis de 65 nmol/kg o Fab-IL-2 qm-Fab DP47GS a una dosis de 65 nM/kg. A todos los ratones se les inyectaron i.v. 200 |jl de la solución apropiada. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por 200 pl, se diluyeron las soluciones madre con PBS como fue necesario.
Se extrajo sangre de los ratones a 0,5, 1, 3, 8, 24, 48, 72, 96 horas y después de esto cada 2 días durante 3 semanas. Se extrajeron los sueros y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis por ELISA. Se determinaron las concentraciones de inmunoconjugados en suero usando un ELISA para la cuantificación del anticuerpo inmunoconjugado de IL2 (Roche-Penzberg). Se midió la absorción usando una longitud de onda de medición de 405 nm y una longitud de onda de referencia de 492 nm (lector de microplacas ajustable VersaMax, Molecular Devices).
La figura 42 muestra la farmacocinética de estos inmunoconjugados de IL-2. Las construcciones Fab-IL2-Fab wt y qm tienen una semivida en suero de aprox. 3-4 h. La diferencia en la semivida en suero entre construcciones que comprenden IL-2 natural o mutante cuádruple es menos pronunciada para las construcciones Fab-IL-2-que para los inmunoconjugados de tipo IgG, que per se tienen semividas más largas.
TABLA 21.
Figure imgf000073_0001
Ejemplo 18
Muerte celular inducida por activación de PBMC activadas por IL-2
Se preactivaron PBMC recién aisladas de donantes sanos durante la noche con PHA-M a 1 pg/ml en RPMI1640 con FCS al 10 % y glutamina al 1 %. Después de la preactivación, se recogieron las PBMC, se marcaron con CFSE 40 nM en PBS y se sembraron en placas de 96 pocillos a 100.000 células/pocillo. Se estimularon las PBMC preactivadas con diferentes concentraciones de inmunoconjugados de IL-2 (IgG-IL-2 wt 4B9, IgG-IL-2 qm 4B9, Fab-IL-2 wt-Fab 4B9 y Fab-IL-2 qm-Fab 4B9). Después de seis días de tratamiento con IL-2, se trataron las PBMC con 0,5 pg/ml de anticuerpo anti-Fas activador durante la noche. Se analizó la proliferación de linfocitos T CD4 (CD3+c D8‘) y CD8 (CD3+CD8+) después de seis días por dilución con CFSE. Se determinó el porcentaje de linfocitos T vivos después del tratamiento anti-Fas seleccionando en CD3+ células vivas negativas para anexina V.
Como se muestra en la figura 44, todas las construcciones indujeron la proliferación de linfocitos T preactivados. A bajas concentraciones, las construcciones que comprenden IL-2 wt natural fueron más activas que las construcciones que comprenden IL-2 qm. IgG-IL-2 wt, Fab-IL-2 wt-Fab y proleucina tuvieron una actividad similar. Fab-IL-2 qm-Fab fue ligeramente menos activa que IgG-IL-2 qm. Las construcciones que comprenden IL-2 natural fueron más activas sobre linfocitos T CD4 que sobre linfocitos T CD8, debido lo más probablemente a la activación de linfocitos T reguladores. Las construcciones que comprenden IL-2 mutante cuádruple fueron activas de forma similar sobre linfocitos T CD8 y CD4.
Como se muestra en la figura 45, los linfocitos T estimulados con altas concentraciones de IL-2 natural son más sensibles a la apoptosis inducida por anti-Fas que los linfocitos T tratados con IL-2 mutante cuádruple.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un inmunoconjugado que comprende:
(a) al menos un primer resto efector monocatenario; y
(b) un primer y un segundo resto de unión a antígeno,
en el que dicho resto efector monocatenario es un polipéptido de interleucina 2 (IL-2) mutante, que comprende tres mutaciones aminoacídicas que anulan o reducen la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de alta afinidad y conservan la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, cada uno comparado con un polipéptido de IL-2 natural, en el que dichas tres mutaciones aminoacídicas están en posiciones correspondientes al residuo 42, 45 y 72 de IL-2 humana de acuerdo con la SEQ ID NO: 1; en el que dichas tres mutaciones aminoacídicas del polipéptido de interleucina 2 mutante son las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G,
en el que cada uno de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno es una molécula Fab;
en el que dicho primer resto efector monocatenario comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con dicho primer resto de unión a antígeno; y
en el que dicho segundo resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino o carboxiterminal con dicho primer resto efector.
2. El inmunoconjugado de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de interleucina 2 mutante comprende además una mutación aminoacídica que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana.
3. El inmunoconjugado de la reivindicación 2, en el que dicha mutación aminoacídica que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana es una sustitución aminoacídica seleccionada del grupo de T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K y T3P.
4. El polipéptido de interleucina 2 mutante inmunoconjugado de la reivindicación 2 o 3, en el que dicha mutación aminoacídica que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana es la sustitución aminoacídica T3A.
5. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polipéptido de IL-2 mutante es una molécula de IL-2 humana.
6. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19.
7. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho inmunoconjugado consiste en un primer resto efector y primer y segundo restos de unión a antígeno unidos por una o más secuencias conectoras.
8. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha primera molécula Fab se une en su extremo carboxílico de la cadena pesada o ligera al aminoácido aminoterminal de dicho resto efector, y dicho resto efector se une en su aminoácido carboxiterminal al aminoácido aminoterminal de la cadena pesada o ligera de la segunda molécula Fab.
9. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que las regiones variables de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno son específicas para el mismo antígeno.
10. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que las regiones variables de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno son específicas para diferentes antígenos.
11. El inmunoconjugado de la reivindicación 9 o 10, en el que dicho primer y/o dicho segundo restos de unión a antígeno son específicos para un antígeno seleccionado del grupo que consiste en la proteína de activación de fibroblastos (FAP), el proteoglucano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP), el dominio A2 de tenascina (TNC-A2), el dominio A1 de tenascina (TNC-A1) y el dominio adicional B de fibronectina (EDB).
12. El inmunoconjugado de la reivindicación 11, en el que dichos primer y/o segundo restos de unión a antígeno son específicos para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), y en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ
ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO:
87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111,
SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135,
SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 y SEQ ID NO: 155, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 37, SEQ ID
NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65,
SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID
NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO:
117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 153.
13. Un polinucleótido aislado que codifica un fragmento del inmunoconjugado de la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido codifica
(i) las cadenas pesadas de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno y dicho primer resto efector;
(ii) las cadenas ligeras de dichos primer y segundo restos de unión a antígeno y dicho primer resto efector; o
(iii) una cadena ligera de dicho primer resto de unión a antígeno, una cadena pesada de dicho segundo resto de unión a antígeno y dicho primer resto efector.
14. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 13.
15. Un procedimiento de producción del inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el procedimiento comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 13 en condiciones adecuadas para la expresión del inmunoconjugado.
16. Una composición que comprende el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un vehículo farmacéutico.
17. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un paciente que necesita el mismo.
18. El inmunoconjugado para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicha enfermedad es cáncer.
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