JP2024511465A - Ｎｋ細胞エンゲージングのためにサイトカインに融合したｎｋｐ４６結合性部位、がん抗原結合性部位を含む多特異性タンパク質 - Google Patents

Ｎｋ細胞エンゲージングのためにサイトカインに融合したｎｋｐ４６結合性部位、がん抗原結合性部位を含む多特異性タンパク質 Download PDF

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Abstract

ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６およびサイトカイン受容体に結合し、かつ適宜、ＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａにさらに結合し、かつ標的細胞（例えばがん細胞）上の対象とする抗原（例えばがん抗原）にも結合する、多特異性タンパク質。多特異性タンパク質は、対象とする抗原を発現する標的細胞（例えば、疾患に寄与する細胞、がん細胞）に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を増加させる能力を有する。【選択図】図１Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月２６日に出願された米国仮出願第６３／１６６，３７４号の利益を主張し、その開示は、任意の図面および配列表を含む、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、電子的な形式の配列表と共に出願されている。配列表は、８２０ＫＢのサイズの、２０２２年３月２２日に作成された「ＮＫｐ４６－１２ ＰＣＴ＿ＳＴ２５ ｔｘｔ」という名称のファイルとして提供される。電子的な形式の配列表中の情報は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
エフェクター細胞に結合し、エフェクター細胞を、複数の受容体との相互作用を介して対象とする標的細胞を溶解するように特異的に再方向付けする多特異性タンパク質が提供される。タンパク質は、疾患、特にがんまたは感染性疾患の処置において有用性を有する。
インターロイキン２（ＩＬ２またはＩＬ－２）は、ＮＫ細胞により発現されるサイトカイン受容体に作用する多能性サイトカインの１つの例である。ＩＬ－２は、活性化されたＴ細胞、特にＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により主に産生され、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖および分化の補助において機能する。ＩＬ－２はまた、Ｔｒｅｇの機能および生存のために必須である。真核細胞において、ヒトＩＬ－２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８）は、２０残基のシグナル配列を有する１５３アミノ酸の前駆体ペプチドとして合成され、前駆体ペプチドは、配列番号４０４のアミノ酸配列を有する成熟した分泌されるＩＬ－２を生じさせる。インターロイキン２は、４つのアンチパラレルの両親媒性アルファヘリックスを有する。これらの４つのアルファヘリックスは、その機能のために必須である四次構造を形成する。ほとんどの場合において、ＩＬ－２は、３つの異なる受容体：インターロイキン２受容体アルファ（ＩＬ－２Ｒα；ＣＤ２５）、インターロイキン２受容体ベータ（ＩＬ－２Ｒβ；ＣＤ１２２）、およびインターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ－２Ｒγ；ＣＤ１３２）を通じて働く。ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２ＲγはＩＬ－２シグナル伝達のために必須であり、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）はシグナル伝達のために必要でないが、受容体に対するＩＬ－２の高親和性結合を付与することができる。ＩＬ－２Ｒα、β、およびγの組合せにより形成される三量体受容体（ＩＬ－２αβγ）はＩＬ－２高親和性受容体（ＫＤ 約１０ｐＭ）であり、二量体受容体（ＩＬ－２βγ）は中親和性受容体（ＫＤ 約１ｎＭ）である。
免疫細胞は二量体または三量体ＩＬ－２受容体を発現する。二量体受容体は細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）上に発現され、三量体受容体は活性化されたリンパ球およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋阻害性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上に主に発現される。休止したエフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞は細胞表面上にＣＤ２５を有しないので、それらはＩＬ－２に対して相対的に非感受性である。Ｔｒｅｇ細胞は、身体中で最も高いレベルのＣＤ２５を一貫して発現する。組織中に典型的には存在する低濃度のＩＬ－２に起因して、ＩＬ－２は、高親和性受容体複合体（ＣＤ２５：ＣＤ１２２：ＣＤ１３２）を発現する細胞を優先的に活性化させ、したがって通常の状況下で、ＩＬ－２はＴｒｅｇ細胞増殖を優先的に刺激する。
ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、およびＩＦＮ－αは、受容体結合、複合体アセンブリーおよびシグナル伝達の多くの態様をＩＬ－２と共有する。例えばＩＬ－１５、ＩＬ－２１およびＩＬ－７は、ＩＬ－２のようにいずれも、共通γ鎖受容体（ＣＤ１３２）を介してＮＫ細胞に作用する。ＩＬ－１５は、３つのサブユニット：ＩＬ－１５Ｒα、ＣＤ１２２、およびＣＤ１３２から構成されるＩＬ－１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）に結合する。これらのサブユニットの２つ、ＣＤ１２２およびＣＤ１３２はＩＬ－２の受容体と共有されるが、ＩＬ－２受容体は追加のサブユニット（ＣＤ２５）を有する。ＩＬ－１５Ｒα（ＣＤ２１５）は、非常に高い親和性でＩＬ１５に特異的に結合し、他のサブユニットから独立してＩＬ－１５に結合する能力を有する。ＩＬ－２１はＩ型サイトカインの別の例であり、そのＩＬ－２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）とヘテロ二量体受容体複合体を形成することが示されている。
ＮＫ細胞は、抗腫瘍免疫を媒介する潜在能力を有する。しかしながら、ＮＫ細胞は、ＩＬ－２がＩＦＮ－ａと共に投与された場合にそれらの過剰活性化および複数の炎症性サイトカインの分泌を通じてマウスにおいて毒性を引き起こすことが示されている［Rothschilds et al, Oncoimmunology. 2019;8(5)］。追加的に、ＮＫ細胞はまた、これもまたＩＬ－２Ｒβｙを通じてシグナル伝達するサイトカインＩＬ－１５の毒性を引き起こすことが示された［Guo et al, J Immunol. 2015;195(5):2353-64を参照する国際公開第２０２０２４７８４３号パンフレットを参照］。
サイトカイン、例えばＩＬ－２により媒介される免疫毒性に対する１つの潜在的な解決策は、それを腫瘍特異的抗体と融合または会合させることであった。しかしながら、ＩＬ－２はインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で抗腫瘍効果において抗腫瘍抗体と実際に協同するが、同じ分子中にＩＬ－２および抗腫瘍抗原抗体を含めることは有効性も毒性の利点も示さないことが見出された。ＩＬ－２部分は体内分布を完全に支配し、無関連の抗原を認識する免疫サイトカインは、抗体と組み合わせられた場合に腫瘍特異的な免疫サイトカインと同等に機能するという観察を説明した［Tzeng et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2015 Mar 17; 112(11): 3320-332］。
ＮＫ細胞に対するサイトカインの効果に焦点を当てた研究は、単一のサイトカインまたは単純な組合せに一般に集中してきた。より最近において、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、およびＩＦＮ－αは、単独でおよび組合せで、ＩＬ－２と協同する潜在能力があり、また、非常に低濃度の、先天および適応の両方の共通γ鎖サイトカインは、等しく低い濃度のＩＬ－１８と協同して、迅速かつ強力なＮＫ細胞ＣＤ２５およびＩＦＮ－γ発現を駆動することが報告されている（Nielsen et al. Front Immunol. 2016; 7: 101）。しかしながら、ヒトへのサイトカインの投与は毒性を伴っており、これはサイトカインとの組合せ処置を困難なものとする。さらには、ＮＫ細胞におけるサイトカイン受容体シグナル伝達経路と他の活性化受容体との間の潜在的な相乗作用または相互作用に関しては依然としてほとんど分かっていない。したがって、疾患、特にはがんの処置においてＮＫ細胞を動員するための新たな仕方に対する必要性が存在する。
本発明は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６およびサイトカイン受容体に結合し、かつ適宜、ＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａにさらに結合し、かつ標的細胞（例えばがん細胞）上の対象とする抗原（例えばがん抗原）にも結合する機能的な多特異性タンパク質の発見から生じたものである。多特異性タンパク質は、対象とする抗原を発現する標的細胞（例えば、疾患に寄与する細胞、がん細胞）に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を増加させる能力を有する。
ＮＫ細胞の表面においてＮＫｐ４６におよびサイトカイン受容体にシスで（適宜ＣＤ１６Ａをさらに通じて）結合する多特異性タンパク質の能力は、特に有利な細胞表面受容体シグナル伝達に繋がり、次いでＮＫ細胞による強力な抗腫瘍応答を結果としてもたらすと考えられる。
ＩＬ２媒介性免疫毒性は、ＮＫ細胞により駆動されることが公知である。しかしながら、ＩＬ－２部分を有する本開示の多特異性タンパク質は、免疫毒性なしに強いＮＫ細胞媒介性抗腫瘍活性を示した。多特異性タンパク質におけるサイトカインの組込みは、単独でのサイトカインと比較して、ＮＫ細胞におけるサイトカイン受容体媒介性活性の効力を２桁の規模で増加させた。並行して、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６Ａの両方に結合し、かつ野生型ＩＬ－２のＮＫ細胞上のその受容体に対する親和性を実質的に保持するサイトカイン（ＩＬ－２変異型）を含む場合に、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞増殖の誘導のためのそのＥＣ５０を十分に下回る腫瘍細胞に向けた細胞傷害性の誘導のためのＥＣ５０を示した。多特異性タンパク質は、したがって、サイトカインが減弱される場合であっても、意義のあるサイトカイン受容体シグナル伝達および／またはＮＫ細胞増殖を誘導し始める濃度においてＮＫ細胞媒介性細胞傷害性の活性化において非常に有効である。これは観察される毒性の欠如を説明する可能性があり、使用される（例えば、投与される）タンパク質の濃度（例えば、用量）は非常に有効であり得るが、ＮＫ細胞媒介性免疫毒性を引き起こすレベルを下回ったままであり得る。該タンパク質は、したがって、異なるサイトカインおよびサイトカインの異なるレベルの減弱を容易に統合することができる多用途のプラットフォームとなる。
タンパク質が、ＣＤ２５に対する結合の喪失を伴うＩＬ２変異型として具現化されたＣＤ１２２ ＡＢＤを組み込むように作られた場合、多特異性タンパク質は、ネイティブなＩＬ－２と比較して、Ｔｒｅｇ細胞におけるシグナル伝達および／またはＴｒｅｇ細胞の活性化を誘導する能力における４－ｌｏｇの減少を示した。ネイティブなＩＬ－２と比較したＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導する能力における上述の２－ｌｏｇの増加と組み合わせられた場合、多特異性タンパク質は、Ｔｒｅｇにおけるものと比較してＮＫ細胞においてサイトカイン受容体シグナル伝達の誘導の効力における１，０００，０００倍の増加を有する。よって、ＣＤ１２２結合性多特異性タンパク質は、抗腫瘍応答に負に影響し得るＴｒｅｇ増殖を最小化しながらＮＫ細胞増殖および／または浸潤を媒介する濃度において使用され得る。
用いられるタンパク質は、一価の方式でのみ腫瘍細胞上のそれらの標的に結合するように設計されているにもかかわらず非常に好都合なインビボ有効性を示した。腫瘍細胞上の標的抗原に対する多価結合により引き起こされる親和性における増加を回避することにより、腫瘍抗原、ＮＫｐ４６（およびＣＤ１６Ａ）ならびにサイトカイン受容体に対する一価結合は、多特異性タンパク質が容易にチューニングされることを可能にした。各々のＡＢＤ（すなわち腫瘍抗原ＡＢＤ、ＣＤ１６Ａ ＡＢＤ、ＮＫｐ４６ ＡＢＤおよびサイトカイン受容体ＡＢＤ）は、インビボでＮＫ細胞媒介性抗腫瘍活性の増強に対する別個の寄与を提供することが観察された。一価腫瘍抗原結合性を有する例示的なタンパク質は、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤにより付与される親和性よりも高くないＮＫ細胞上のその受容体に対する結合を付与する親和性を有するサイトカインを組み込んだ。従来的な抗体は二価で結合し、したがってそれらの標的に対してかなりより高い結合親和性を典型的には有するにもかかわらず、抗腫瘍細胞活性は同等の従来的な抗体よりも高かった。
インビボで、多特異性タンパク質は腫瘍におけるＮＫ細胞浸潤を劇的に増加させ；多特異性タンパク質は、同じ抗腫瘍ＶＨ／ＶＬペアを共有するゴールドスタンダードのＡＤＣＣ誘導性抗体オビヌツズマブによる１．３倍の増加と比較して、およびＣＤ１２２ ＡＢＤを欠いた同じ多特異性タンパク質による１．６倍の増加と比較して、腫瘍中のＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞における９倍の増加を引き起こした。
実施例では、Ｔ細胞上のその受容体（ＣＤ２５）に対する親和性を低減させるために改変されているが、ＮＫ細胞上のその受容体（ＣＤ１２２および／またはＣＤ１３２）に対する実質的に完全な親和性（野生型ＩＬ－２と同等）を保持した変異型ＩＬ－２サイトカイン（ＩＬ－２ｖ）を使用した。ＮＫｐ４６結合性ドメイン（ＦａｂまたはｓｃＦｖ中に含まれるＶＨ／ＶＬペアとして例示される）、ＣＤ１６結合性Ｆｃドメインおよびサイトカインは、タンパク質内で互いに隣接して連続して置かれており、各々は、短い柔軟性ペプチドリンカーのみにより隣接するエレメント（すなわちＮＫｐ４６ ＡＢＤ、Ｆｃドメインまたはサイトカイン）から分離されていた。多特異性タンパク質のこれらの構成は、同じ細胞表面上でのＮＫｐ４６およびサイトカイン受容体の同時エンゲージメントを可能にするようにそれぞれの抗原結合性ドメインを提示するように設計された［すなわちＮＫｐ４６において、サイトカイン受容体（およびさらにＣＤ１６Ａ）はシスで結合している］。さらに、実施例では、ＣＤ１６Ａに結合するＦｃドメインを使用したところ、ＣＤ１６Ａに対する結合は、腫瘍およびＮＫ標的化された体内分布に負に影響せず、代わりにＮＫｐ４６、ＣＤ１６Ａおよびサイトカイン受容体の三重の同時エンゲージメントに繋がり、次いでＮＫ細胞上のその受容体に対する結合親和性を保持するサイトカインの組込みを可能にすることが示された。ＫＤについて低いナノモル濃度範囲内（約１５ｎＭのＫＤ）のＮＫｐ４６に対する結合親和性を付与する抗ＮＫｐ４６ ＶＨ／ＶＬドメインを多特異性タンパク質中に組み込むことにより、ＮＫ細胞において強力なシグナル伝達を媒介するために十分なＮＫ細胞上のそれらの受容体に対する良好な親和性、適宜実質的に完全な結合親和性を保持するサイトカインを使用することができた。典型的には、サイトカイン、例えば本明細書において記載されるものは、ＮＫｐ４６に対する多特異性タンパク質の親和性以下の強さであるＮＫ細胞上のそれらの受容体に対する結合についての親和性を一般に有する（親和性はＫＤとして決定され得る）。
これらの結果を考慮して、サイトカインＩＬ２およびサイトカイン受容体複合体ＩＬ２βγについて図１において示されるように、サイトカイン、例えば１型サイトカイン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７もしくはＩＬ－１２サイトカイン、ＩＬ－１８サイトカインまたは１型インターフェロン（例えばＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β）をＮＫｐ４６保有ＮＫ細胞表面に標的化することは、サイトカインの受容体（例えばＩＬ２／１５βγ、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＬ－２７Ｒａ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＦＮＡＲ）に対するシス提示を促進すると考えられる。本明細書において示されるように、ＣＤ１６Ａ結合性ＡＢＤまたはＮＫｐ４６結合性ＡＢＤのいずれかに直ちに隣接して（かつそのＣ末端側に）置かれたＩＬ２ｖは、三重の受容体シス提示が起こることを可能にした（ＩＬ２ｖは、５アミノ酸もの短い残基のリンカーペプチドにより隣接するドメインに接続された）。有利なことに、ＣＤ１６Ａ結合性ＡＢＤとしての（ｎａｓ）二量体Ｆｃドメインの使用はＦｃＲｎを提供し、これは次いでインビボでＮＫ細胞の腫瘍浸潤および増殖を誘導するために十分に長い半減期を付与する。
ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６に方向付けられた多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のそれらの受容体（例えばＣＤ１２２）に対する結合親和性の低減の要求なしに広範囲のサイトカインが使用および／または試験されることを可能にするという利点を有する。サイトカインは、したがって、その受容体に対する結合親和性を減弱または減少させるために改変されていてもよく、または改変されていなくてもよい。ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６に方向付けられた多特異性タンパク質は、そのため、いくつかのサイトカインのいずれか（ａｙｎ）１つをそれらの野生型形態において使用することができ、特にはその場合、サイトカインは、ＮＫ細胞上のその受容体において実質的に低減された活性を有さず、かつ／または、その受容体に対するサイトカインの親和性は、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性以下の強さである。よって、任意の実施形態において、サイトカインＡＢＤ（例えば多特異性タンパク質内のサイトカイン部分）は、野生型形態のサイトカインと比較して実質的に低減していないＮＫ細胞上のその受容体に対する結合親和性および／または活性（例えばシグナル伝達の誘導）を有するとして特定され得る。適宜、サイトカイン部分は、野生型形態のサイトカインを用いて観察される場合の少なくとも７０％または８０％であるＮＫ細胞上のその受容体（例えばＣＤ１２２）におけるシグナル伝達を誘導する。よって、任意の実施形態において、サイトカインＡＢＤ（例えば多特異性タンパク質内のサイトカイン部分）は、野生型形態のサイトカインと比較して実質的に低減していないＮＫ細胞上のその受容体に対する親和性を有するとして特定され得る。一部の実施形態において、サイトカイン部分は、野生型形態のサイトカインの場合の３－ｌｏｇ、２－ｌｏｇまたは１－ｌｏｇ以内のＮＫ細胞上のその受容体（例えばＣＤ１２２）に対する結合親和性を有する（例えば、サイトカイン部分は、野生型形態のサイトカインについて観察される場合よりも３－、２－または１－ｌｏｇ以下で高いサイトカイン受容体に対する結合についてのＫＤを有する）。親和性は、ＳＰＲを使用して決定される、組換え受容体タンパク質に対する結合についてのＫＤであり得る。サイトカインのシグナル伝達または受容体結合親和性は、他は同等である多特異性タンパク質中に組み込まれた場合として特定され得る。
低い免疫毒性と組み合わせられた高い有効性は、したがって、特には長いインビボ半減期を有する治療剤のために、個々のＮＫ細胞上のＮＫｐ４６およびサイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）、およびさらにＣＤ１６Ａの各々に結合する能力を組み合わせた治療用分子という特定の利点となる。特に、ＦｃＲｎに結合するＦｃドメインの組込みは、インビボで、ＮＫ細胞が腫瘍の部位において増殖および蓄積することを可能にするために十分に長い半減期を可能にした。
多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞活性（例えば、腫瘍浸潤性ＮＫ細胞によるものを含む、ＮＫ細胞増殖、活性化、細胞傷害性および／またはサイトカイン放出）の増強において高い効力であるが、サイトカインＩＬ－６およびＴＮＦ－αの低い全身性増加または放出により立証されるように、低い免疫毒性を有することに起因して、特に有利である。本開示は、ＮＫｐ４６およびサイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）およびＣＤ１６Ａ結合性ドメインの間の十分な距離を可能にして、３つすべての受容体が単一のＮＫ細胞により結合されることを可能にし、それにより、組み合わせられたＮＫ細胞受容体活性化を提供するタンパク質フォーマットを使用する例を提供する。重要なことに、単一の細胞上での組み合わせられた結合は、ＮＫｐ４６発現および／またはＣＤ１６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞）の最小のオフターゲット免疫毒性および同胞性殺傷の欠如の原因となる可能性があり、その理由は、多特異性タンパク質は、ＮＫｐ４６および／またはＣＤ１６＋エフェクター細胞の表面においてサイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）に加えて少なくとも１つの活性化受容体により結合されるからである。
多特異性タンパク質は、ＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞およびＮＫｐ４６＋ＣＤ１６Ａ－ ＮＫ細胞の両方の活性および／または増殖を増強するそれらの能力に起因してさらに有利である。本明細書において示されるように、ＣＤ１６Ａに対する結合の非存在下での、ＮＫｐ４６およびＣＤ１２２に対する組み合わせられた二重の結合は、ＮＫ細胞活性の強い増強を実証する。健常個体において、ＣＤ１６－集団は全ＮＫ細胞集団の５～１５％を表し、一部のがん患者においてＣＤ１６－ ＮＫ細胞の割合は大きく増加しており、全ＮＫ細胞集団の５０％程度を構成する。さらに、腫瘍微環境は、細胞の表面からのＣＤ１６Ａのシェディングを誘導することまたはＣＤ１６Ａ＋ ＮＫ細胞からＣＤ１６－ ＮＫ細胞への変換を促進することのいずれかによりＣＤ１６Ａ＋ ＮＫ細胞の表現型に影響することが示されている。追加的に、ＣＤ１６Ａの多型に起因して、一部の個体は、ＡＤＣＣを媒介する能力の低減を結果としてもたらすＣＤ１６Ａにおける（例えばＣＤ１６Ａの残基１５８における）突然変異を有する。腫瘍中のＮＫｐ４６＋ ＮＫ細胞の数および活性化の両方を増加させながら、例えば腫瘍環境において起こり得るように、ＣＤ１６Ａ不全を克服することは、特に有利である。いっそうさらに、多特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄを介する結合もシグナル伝達も要求せず、例えば胃および前立腺がんにおいて一般的なまたは共通の特色であることが公知であるように、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄの表面発現の相対的に低いレベルにより特徴付けられるＮＫおよび／またはＴ細胞を有する患者においてＮＫ細胞活性を増強するために使用され得る。
提供されるのは、特に、（ａ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＮＫｐ４６結合性ドメイン、（ｂ）対象とする抗原（例えば腫瘍関連またはがん抗原；標的細胞により発現されて存在する対象とする抗原）に結合する結合性ドメイン、（ｃ）ヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに結合する適宜のＣＤ１６Ａ結合性ドメイン（例えばＦｃ二量体）、ならびに（ｃ）ＮＫ細胞上に発現されるヒトサイトカイン受容体ポリペプチド［例えば受容体、例えばＣＤ１２２（ＩＬ２／１５Ｒβ）、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＬ－２７Ｒａ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＦＮＡＲ（ＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２）］に結合する抗原結合性ドメインを含む、多特異性タンパク質である。提供されるのはまた、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＮＫｐ４６結合性ドメイン、対象とする抗原（例えば腫瘍関連またはがん抗原；標的細胞により発現されて存在する対象とする抗原）に結合する結合性ドメイン、ヒトＦｃＲｎにより結合される（かつ適宜、ヒトＣＤ１６Ａポリペプチドによりさらに結合される）Ｆｃドメイン（例えばＦｃドメイン二量体）、ならびにヒトサイトカイン受容体ポリペプチド［例えばＣＤ１２２（ＩＬ２／１５Ｒβ）、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＬ－２７Ｒａ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＦＮＡＲ（ＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２）］に結合する抗原結合性ドメインを含む、多特異性タンパク質である。サイトカイン受容体に結合する抗原結合性ドメインは、その野生型形態と比較して非ＮＫ細胞（例えばＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞）上に見出される受容体対応物に対する結合を低減させる改変を有する変異型サイトカインであり得る。
任意の実施形態において、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＡＢＤおよびヒトサイトカイン受容体に結合するＡＢＤは、膜平面結合コンフォメーション（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｌａｎａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を取る能力を有するように構成されているとして特定され得る。
任意の実施形態において、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞の表面上のＮＫｐ４６およびサイトカイン受容体、および適宜さらにＣＤ１６Ａと相互作用するか、それに結合するか、または同時エンゲージングする能力を有するとして特定され得る。
任意の実施形態において、適宜、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＡＢＤおよびヒトサイトカイン受容体に結合するＡＢＤ、および適宜さらにＦｃドメインは、多特異性タンパク質内で連続して（例えば多特異性タンパク質のＮおよびＣ末端に関して）位置付けられているかまたは接続されているとして特定される。
ＮＫｐ４６に結合するＡＢＤ（例えばＦａｂ、単一可変ドメインまたはｓｃＦｖ）は、適宜、Ｉｇ由来（例えばヒンジドメインもしくは重鎖もしくは軽鎖定常ドメインからのペプチド）または非Ｉｇ由来ドメインリンカーによりＣＤ１６Ａ結合性ドメイン（例えばＦｃドメイン）に接続されているとして特定され得、適宜、ドメインリンカーは柔軟性ポリペプチドリンカーである。サイトカイン受容体に結合するＡＢＤは、適宜、多特異性タンパク質の残部またはＮＫｐ４６ ＡＢＤにドメインリンカー、適宜柔軟性ポリペプチドリンカーにより接続された野生型または変異型サイトカインを含むとして特定され得る。サイトカインは、多特異性タンパク質上のＮＫｐ４６結合性ドメインおよびＣＤ１６Ａ結合性ドメインの両方に対してＣ末端に位置付けられているとして特定され得、かつ、適宜さらに、サイトカインは、１５、１０もしくは５残基またはより短いペプチドリンカーを介して多特異性タンパク質の残部（または例えば、そのドメイン、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ）に接続されている。ＮＫｐ４６およびＣＤ１６Ａ結合性ドメインは、適宜、多特異性タンパク質上で互いに隣接して置かれているとして、かつ、適宜、１５、１０もしくは５残基またはより短い長さを有するペプチドリンカー（例えば免疫グロブリン由来リンカー、例えばヒンジ由来リンカー、非免疫グロブリン由来リンカー、柔軟性リンカー）により互いに接続されているとして特定され得る。
１つの実施形態において、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＡＢＤは、タンパク質内（またはそのポリペプチド鎖上）でＦｃドメインに隣接して位置付けられており、かつヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＡＢＤおよびＦｃドメインのうちの１つは、ヒトサイトカイン受容体に結合するＡＢＤに隣接して位置付けられており、適宜さらに、ヒトサイトカインに結合するＡＢＤは、２０個または２０個未満のアミノ酸残基、適宜１５個未満のアミノ酸残基、適宜１０個未満のアミノ酸残基、適宜５～１５残基、適宜５～１０残基、適宜３～５残基を有するリンカーペプチドによりヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＡＢＤまたはＦｃドメインに接続されている。
任意の態様において、サイトカイン受容体に結合するＡＢＤは、ヒトサイトカインポリペプチド、例えばＣＤ１２２（ＩＬ２／１５Ｒβ）、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＬ－２７Ｒａ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＦＮＡＲ（ＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２）であり得る。サイトカイン受容体に結合するＡＢＤは、適宜、それが結合するサイトカイン受容体に対する結合親和性を低減させるために改変された（例えばアミノ酸改変を導入することによる）ヒトサイトカインポリペプチド（例えばＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１）であり得、適宜、結合親和性は、ＮＫ細胞の表面において発現されない受容体または非ＮＫ細胞（例えばＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞）の表面においても発現される受容体について選択的に低減されている。例えば、ヒトサイトカイン受容体に結合するＡＢＤは、非改変または野生型サイトカインポリペプチドと比較してＴ細胞上に存在するサイトカイン受容体に対する低減された結合親和性を示す変異型サイトカインであり得る。
本明細書にさらに記載されるように、サイトカインがその天然の結合パートナーとして１つより多くの受容体を有し、かつ受容体のうちの１つが非ＮＫ細胞上に発現される場合、サイトカインポリペプチドは、その野生型サイトカイン対応物と比較して非ＮＫ細胞（例えばＴｒｅｇ細胞、Ｔ細胞）上に発現されるそのような受容体に対する結合を低減させるために改変され得る。
ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペアのＣＤＲを組み込んだタンパク質により例示される１つの実施形態において、ＮＫｐ４６結合性ドメインはＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ１／Ｄ２ジャンクションに結合する。ＮＫｐ４６結合性ドメインと複合体化したＮＫｐ４６のＸ線結晶学研究に基づいて、ＮＫｐ４６結合性ポリペプチドおよびＩＬ－２部分のジャンクションは、細胞表面から約７０オングストロームにおいて位置付けられ、これは、ＣＤ１２２のサイトカイン結合性部位についての細胞表面からの予測される距離に対応すると考えられる。図１Ｃに示されるように、ＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ１／Ｄ２ジャンクションに対するおよび／またはＮＫｐ４６－１により結合される領域もしくはエピトープに対する結合は、サイトカイン受容体、例えばＣＤ１２２の最適なエンゲージメントを可能にするＮＫ細胞表面からの距離におけるＮＫｐ４６ ＡＢＤの位置付けを提供することができる。次いで、低減された長さ（例えば２～５残基、２～１０残基；３、４、５、６、７、８、９または１０残基）のドメインリンカーは、効力におけるいかなる減少もなしにサイトカインとＮＫｐ４６ ＡＢＤまたは多特異性タンパク質の残部との間に使用され得る。ＮＫｐ４６上の他のドメインが結合される場合、より長いドメインリンカー、例えば５～１５残基、１０～１５残基、またはより長いものが使用され得る。限られた数の非常に短いリンカーを有する本明細書において記載されるタンパク質は、したがって、最小の非天然（または非免疫グロブリン由来）アミノ酸配列を有するという利点を有する。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、サイトカイン受容体結合性ドメイン、例えばＮＫ細胞の表面において発現される受容体に結合するサイトカインに、適宜ドメインリンカーを介して、融合したＮＫｐ４６結合性ドメインまたはその部分を含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、サイトカイン受容体結合性ドメイン、例えばＮＫ細胞の表面において発現される受容体に結合するサイトカインに、適宜ドメインリンカーを介して、融合したＮＫｐ４６結合性ドメインまたはその部分を含む。１つの実施形態において、ＮＫｐ４６結合性ドメインの部分は、相補的な可変ドメイン（例えば第２の定常領域に融合した第２の可変ドメイン）と共に、ＮＫｐ４６に結合するＡＢＤ（例えば、Ｆａｂ）を形成する単一可変ドメイン（例えば第１の定常ドメインに融合した第１の可変ドメイン）を含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、（ｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、可変ドメインを含むＮＫｐ４６結合性ドメインまたはその部分、ヒトＣＨ１またはＣＬ定常ドメイン、適宜ドメインリンカー、および野生型または変異型ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドを含む、第１のポリペプチド鎖、ならびに
（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、（ｉ）の可変ドメインと会合してＮＫｐ４６結合性ドメインを形成する可変ドメイン、およびヒトＣＨ１またはＣＬ定常ドメインを含む、第２のポリペプチド鎖
を含み；
（ｉ）および（ｉｉ）の定常ドメインのうちの１つはＣＨ１であり、かつ他方はＣＬであり、その結果、（ｉ）および（ｉｉ）の定常ドメインはＣＨ１－ＣＬ二量体化により会合する。１つの実施形態において、タンパク質は、二量体Ｆｃドメインおよび対象とする抗原に結合するＡＢＤをさらに含む。
１つの実施形態において、提供されるのは、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ－サイトカイン単位を含むタンパク質である。１つの実施形態において、タンパク質は、会合して、がん抗原または対象とする他の抗原に結合するＡＢＤを形成するＶＨおよびＶＬ、ならびにＮＫｐ４６ ＡＢＤ－サイトカイン単位［ならびに適宜さらにＣＤ１６Ａ ＡＢＤ（例えば二量体Ｆｃドメイン）］を含む、多特異性タンパク質である。ＮＫｐ４６ ＡＢＤ－サイトカイン単位は、ＮＫ細胞の表面において発現される受容体に結合するサイトカインに、適宜ドメインリンカーを介して、融合したＮＫｐ４６ ＡＢＤを含む。
本明細書における任意の実施形態において、多特異性タンパク質は、そのため、２つのポリペプチド鎖の会合から形成され、かつ以下の構造：
［式中、
Ｖａ－２およびＶｂ－２は各々ＶＨドメインまたはＶＬドメインであり、Ｖａ－２およびＶｂ－２のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－２およびＶｂ－２は、ＮＫｐ４６に結合するＡＢＤを形成しており；
ＣＨ１はヒト免疫グロブリンＣＨ１ドメインであり、かつＣＬはヒト軽鎖定常ドメインであり；
（ＣＨ１またはＣＬ）ａおよび（ＣＨ１またはＣＬ）ｂのうちの１つはＣＨ１であり、かつ他方はＣＬであり、その結果、（ＣＨ１／ＣＬ）ペアが形成され；
Ｌ、Ｌ１およびＬ２は各々アミノ酸ドメインリンカーであり、Ｌ、Ｌ１およびＬ２は、異なるかまたは同じであり得、Ｌ１は、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ－サイトカイン単位を多特異性タンパク質の残部（例えば、ＶＨおよびＶＬを含み、かつ会合して、がん抗原に結合するＡＢＤを形成するタンパク質）に接続するリンカーであり；かつＣｙｔは、ＮＫ細胞上に存在するサイトカイン受容体に結合するサイトカインポリペプチドまたはその部分であり、適宜、Ｃｙｔは、野生型または変異型ヒトＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドである。Ｃｙｔは、遊離Ｃ末端を有する（その遊離末端においてＣｙｔに融合したさらなるドメインもアミノ酸配列も有しない）として特定され得る。適宜、鎖１は、遊離Ｃ末端を有するとして特定され得る。「－」は、他のアミノ酸残基への共有結合（例えばペプチド結合）を介する接続を指し示すために特定され得る］
のうちの１つを有するＮＫｐ４６ ＡＢＤ－サイトカイン単位を含むことができる。
１つの実施形態において、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ－サイトカイン単位は、（ｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１１２、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９または２３６～３１３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む可変ドメインを含むＮＫｐ４６結合性ドメインまたはその部分、ヒトＣＨ１またはＣＬ定常ドメイン、適宜ドメインリンカー、および配列番号４０４～４３９のいずれかのアミノ酸配列に対してまたはその少なくとも４０、５０、６０、８０もしくは１００個の連続するアミノ酸のその断片に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む野生型または変異型ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドを含む、第１のポリペプチド鎖；ならびに
（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、（ｉ）の可変ドメインと会合してＮＫｐ４６結合性ドメインを形成する可変ドメインであって、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０または３１４～４０３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む、可変ドメイン、およびヒトＣＨ１またはＣＬ定常ドメインを含む、第２のポリペプチド鎖
を含む。
１つの実施形態において、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ－サイトカイン単位は、（ｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０または３１４～４０３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む可変ドメインを含むＮＫｐ４６結合性ドメインまたはその部分、ヒトＣＨ１またはＣＬ定常ドメイン、適宜ドメインリンカー、および配列番号４０４～４３９のいずれかのアミノ酸配列に対してまたはその少なくとも４０、５０、６０、８０もしくは１００個の連続するアミノ酸のその断片に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む野生型または変異型ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドを含む、第１のポリペプチド鎖；ならびに
（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、（ｉ）の可変ドメインと会合してＮＫｐ４６結合性ドメインを形成する可変ドメインであって、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１１２、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９または２３６～３１３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む、可変ドメイン、およびヒトＣＨ１またはＣＬ定常ドメインを含む、第２のポリペプチド鎖
を含む。
ＮＫｐ４６ ＡＢＤ－サイトカイン単位がタンパク質の１つのポリペプチド鎖上に置かれている別の実施形態において、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ－サイトカイン単位は、構造：
－Ｌ１－Ｖａ－２－Ｌ２－Ｖｂ－２－Ｌ３－Ｃｙｔ
［式中、
Ｖａ－２およびＶｂ－２は各々ＶＨドメインまたはＶＬドメインであり、Ｖａ－２およびＶｂ－２のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－２およびＶｂ－２は、ＮＫｐ４６に結合するＡＢＤを形成しており；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は各々アミノ酸ドメインリンカーであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は異なるかまたは同じであり得、Ｌ１は、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ－サイトカイン単位を多特異性タンパク質の残部（例えば、ＶＨおよびＶＬを含み、かつ会合して、がん抗原に結合するＡＢＤを形成するタンパク質）に接続するリンカーであり；かつＣｙｔは、ＮＫ細胞上に存在するサイトカイン受容体に結合するサイトカインポリペプチドまたはその部分であり、適宜、Ｃｙｔは、野生型または変異型ヒトＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドである。Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、１５、１０もしくは５残基またはより短い長さを有するとして各々独立して特定され得る］
を有することができる。
本明細書における任意の実施形態の１つの態様において、サイトカインまたはサイトカイン受容体ＡＢＤ（遊離サイトカインとして、または多特異性タンパク質中に組み込まれたものとして）は、ＳＰＲにより決定された場合に、１μＭもしくはそれ未満、２００ｎＭもしくはそれ未満、１００ｎＭもしくはそれ未満、５０ｎＭもしくはそれ未満、または２５ｎＭもしくはそれ未満の結合親和性（ＫＤ）でその受容体に結合する。１つの実施形態において、サイトカインまたはサイトカイン受容体ＡＢＤは、ＳＰＲにより決定された場合に、１ｎＭまたは１ｎＭより高い、適宜１０ｎＭより高い、適宜１５ｎＭより高い結合親和性（ＫＤ）でその受容体に結合する。１つの実施形態において、サイトカインまたはサイトカイン受容体ＡＢＤは、ＳＰＲにより決定された場合に、約１ｎｍ～約２００ｎｍ、適宜約１ｎｍ～約１００ｎｍ、適宜約１０ｎＭ～約１μＭ、適宜約１０ｎＭ～約２００μＭ、適宜約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、適宜約１５ｎＭ～約１μＭ、または適宜約１５ｎＭ～約２００ｎＭの結合親和性（ＫＤ）でその受容体に結合する。
１つの実施形態において、サイトカインは、野生型サイトカイン、またはＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導する野生型サイトカイン対応物の能力の少なくとも８０％を有するその断片もしくは変異型であり、適宜、シグナル伝達は、単離されたサイトカイン部分をＮＫ細胞と接触させ、ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴリン酸化を測定することにより評価される。１つの実施形態において、サイトカインは、野生型サイトカイン、または、野生型サイトカイン対応物と比較して、ＮＫ細胞上に存在するそのサイトカイン受容体に対する親和性の少なくとも７０％、８０％もしくは９０％を保持するその断片である。１つの実施形態において、サイトカインは、野生型サイトカイン対応物と比較して、ＮＫ細胞上に存在するそのサイトカイン受容体に対する親和性の少なくとも７０％、８０％または９０％を保持する変異型サイトカインである。１つの実施形態において、サイトカインは、ＮＫ細胞上に存在するサイトカイン受容体に対するサイトカインの親和性を実質的に低減させる突然変異を含まない。１つの実施形態において、多特異性タンパク質（または多特異性タンパク質中に含まれる場合のサイトカイン）は、その野生型サイトカイン対応物を単独で用いて観察される場合よりも低いＮＫ細胞におけるサイトカイン経路シグナル伝達についてのＥＣ５０を呈する。１つの実施形態において、多特異性タンパク質（または多特異性タンパク質中に含まれる場合のサイトカイン）は、サイトカインを単独で用いて、または同等の構造であるがＮＫｐ４６ ＡＢＤおよび／もしくはＣＤ１６ ＡＢＤを欠いたタンパク質において観察される場合よりも低いＮＫ細胞におけるサイトカイン経路シグナル伝達についてのＥＣ５０を呈する。適宜、ＮＫ細胞におけるサイトカイン経路シグナル伝達についてのＥＣ５０は、少なくとも１０倍または１００倍低く、適宜、サイトカイン経路シグナル伝達は、それぞれのサイトカインまたは多特異性タンパク質をＮＫ細胞と接触させ、ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴリン酸化を測定することにより評価される。
１つの実施形態において、Ｆｃドメイン（またはＣＤ１６結合性ドメイン）、ＮＫｐ４６結合性ドメインおよびサイトカイン受容体結合性ドメインが、それらのそれぞれのＮＫｐ４６、ＣＤ１６Ａまたはサイトカイン受容体結合パートナーに、そのような結合パートナーが細胞（例えばＮＫ細胞）の表面において一緒に存在する場合に結合する能力を各々有するように、多特異性タンパク質は構成される。一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、ＮＫｐ４６に対する一価結合（例えば多特異性タンパク質は１つのみのＮＫｐ４６ ＡＢＤを含む）、対象とする抗原に対する一価（または適宜二価）結合、ＣＤ１６Ａに対する一価結合（例えば多特異性タンパク質は１つのみのＦｃドメイン二量体を含む）、およびサイトカイン受容体に対する一価結合（例えば、多特異性タンパク質は１つのみのサイトカイン受容体ＡＢＤを含む）により特徴付けられ得る。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、例えば、多特異性タンパク質内のドメインの配置または構成を通じて、適宜、伸長された構成にある場合に１８オングストローム（５アミノ酸残基）、３６オングストローム（１０残基）または５４オングストローム（１５残基）の最大の潜在的な長さを有する１つまたは複数のドメインリンカーの使用（ｕｓｅ ｏｆ ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｕｓｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｌｉｎｋｅｒｓ）を通じて、ＮＫｐ４６結合性ドメインおよびサイトカイン受容体結合性ドメイン、および、存在し、かつＣＤ１６に結合する能力を有する場合に、ＣＤ１６結合性ドメインが、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６Ａおよびサイトカイン受容体の各々がＮＫ細胞の表面において結合しているような膜平面結合コンフォメーションを取ることができるように構成されている。
多特異性タンパク質は、そのため、サイトカイン受容体結合性ドメインが、多量体タンパク質内でトポロジカルに、多特異性タンパク質内のＮＫｐ４６結合性ドメインおよびＣＤ１６Ａ結合性ドメインの両方に対して末端（例えばＣ末端）に置かれるように構成され得る。例えば、サイトカイン受容体ＡＢＤは、多特異性タンパク質のポリペプチド鎖上でＣ末端に置くことができ、その結果、位置付けは、サイトカイン受容体ＡＢＤが多量体タンパク質内でトポロジカルにＣ末端にあることを可能とする。ＮＫｐ４６ ＡＢＤおよびＣＤ１６Ａ ＡＢＤ（例えば二量体Ｆｃドメイン）は、タンパク質中でトポロジカルに互いに隣接して位置付けることができ、適宜、短いドメインリンカーを介して互いに接続される。ＮＫｐ４６ ＡＢＤ、ＣＤ１６Ａ ＡＢＤおよびサイトカイン（またはその部分）は、そのため、タンパク質中（またはそのポリペプチド鎖上）で接続され得るか、または連続して位置付けられ得る。有利には、タンパク質は、二量体Ｆｃドメイン（例えば別々のポリペプチド鎖上に置かれた２つのＦｃ単量体からなるとして特定されるＦｃドメイン）を含む。そのため、多特異性タンパク質において、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ、二量体Ｆｃドメインおよびサイトカインは、有利には、トポロジカルに（多特異性タンパク質のトポロジー内で）互いに隣接して位置付けられる。１つの実施形態において、ＮＫｐ４６結合性ドメイン（またはその部分、例えばＶＨもしくはＶＬ）およびＦｃドメイン単量体（またはＣＤ１６Ａ結合性ドメイン）は、同じポリペプチド鎖上で互いに隣接して置かれ、例えば隣接するＮＫｐ４６結合性ドメインおよびＣＤ１６Ａ結合性ドメインは、いかなる介在性タンパク質ドメインもなしに（例えば抗原に結合する介在性ドメインなしに）ドメインリンカーにより分離可能であり、かつサイトカイン部分はそのＣ末端に置かれ得る。
例えば、特に有利なＮＫ細胞増強活性を有する好ましい多特異性タンパク質において、多特異性タンパク質は、異なるポリペプチド鎖（ＣＨ３－ＣＨ３会合を介して二量体化する）上に位置付けられた第１および第２のＦｃドメイン単量体を含むＦｃドメイン二量体を含む。第１のＦｃドメイン単量体は、そのＣ末端において抗ＮＫｐ４６ ＡＢＤ（またはその部分）に融合することができ、抗ＮＫｐ４６ ＡＢＤ（またはその部分）は次いで、そのＣ末端においてサイトカインに融合している。抗ＮＫｐ４６ ＡＢＤの部分は、例えば［（ＶＨまたはＶＬ）－ＣＨ１］単位または［（ＶＨまたはＶＬ）－ＣＬ］単位であり得、ＡＢＤはＦａｂである。図２Ａ～２Ｃ、２Ｅ、２Ｇ～２Ｊ、２Ｌ、２Ｍは、抗ＮＫｐ４６ ＡＢＤおよびサイトカインが、ＮおよびＣ末端に関してトポロジカルに互いに隣接しており、かつ１つのＦｃドメイン単量体を介して融合している例示的なドメイン構成を示す。図２Ｄ、２Ｆ、２Ｋおよび２Ｎは、抗ＮＫｐ４６ ＡＢＤおよびサイトカインが、異なるＦｃドメイン単量体のＣ末端に各々融合しているドメイン構成を示す。
任意の実施形態において、サイトカイン受容体結合性ドメイン（サイトカイン受容体ＡＢＤ）、ＮＫｐ４６結合性ドメイン（ＮＫｐ４６ ＡＢＤ）およびＣＤ１６結合性ドメイン（ＣＤ１６ ＡＢＤ）は、ドメインが、多量体（例えばヘテロ多量体）タンパク質上で、互いに隣接しているか、またはＮ末端からＣ末端へ連続している構成において配向されるように多特異性タンパク質を構成する１つまたは複数のポリペプチド鎖内で置かれているとして特定され得る。ドメインは、適宜、ドメインリンカー、例えば予め決定された抗原にそれ自体は結合しない５～２０残基の連結性ペプチドにより分離され得る。
任意の実施形態において、多特異性タンパク質は、例えば、多特異性タンパク質内のドメインの配置または構成を通じて、ＮＫｐ４６ ＡＢＤおよびサイトカイン受容体ＡＢＤ（例えばサイトカイン部分）が、多特異性タンパク質分子内のＦｃドメイン二量体の同じ側または面にあり、それにより、膜平面結合コンフォメーションにおいてＮＫｐ４６、ＣＤ１６Ａおよびサイトカイン受容体に結合する能力を増強する位置を取る能力を有するように構成されているとして特定され得る。この構成は、例えば、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ（または、ＡＢＤが２つのポリペプチド鎖の会合から形成される場合に、その部分）およびサイトカイン受容体ＡＢＤ（または、ＡＢＤが２つのポリペプチド鎖の会合から形成される場合に、その部分）を同じポリペプチド鎖上にＦｃドメイン単量体のうちの１つと共に位置付けることにより、本開示のヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体タンパク質のいずれかにおいて（ｉｎ ａｎｙ ｉｎ ａｎｙ ｏｆ）容易に実行され得る。
多特異性タンパク質は、式（Ｘ１）－Ｌ１－（Ｘ２）－Ｌ２－（Ｘ３）［式中、Ｘ１およびＸ２のうちの１つはＮＫｐ４６ ＡＢＤ（例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ）またはその部分（例えば部分は、ＶＨもしくはＶＬ、ＶＨ－ＣＨ１、ＶＨ－ＣＬ、ＶＬ－ＣＬ、ＶＬ－ＣＨ１であってもよい）であり、かつ他方はＦｃ二量体またはその部分（例えばＦｃ単量体）であり、かつＸ３はサイトカインであり、Ｌ１およびＬ２は各々適宜のドメインリンカーである］を有することができる。サイトカインは、それ（またはその部分）が置かれたポリペプチド鎖のＣ末端において位置付けられる。Ｌ１は、共有結合（例えばペプチド結合）を介してＸ１およびＸ２を接続する。Ｌ２は、共有結合（例えばペプチド結合）を介してＸ２およびＸ３を接続する。Ｘ１～Ｘ３は、適宜、タンパク質のトポロジカルなＮ末端からＣ末端へ配置されているとして特定され得る。多特異性タンパク質は、例えばＸ１の（ｏｉｆ）Ｎ末端において接続されているか、またはタンパク質のトポロジー内でＮ末端に位置付けられた、対象とする抗原に結合するＡＢＤをさらに含むことができる。
本明細書において実証されるように、異なるエレメントＸ１、Ｘ２およびＸ３（およびさらに、対象とする抗原に結合するＡＢＤ）は各々、タンパク質内の２つまたはより多くの異なるポリペプチド鎖上に容易に分布され得ることが理解される。１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、適宜、式（Ｘ１）－Ｌ１－（Ｘ２）－Ｌ２－（Ｘ３）（式中、Ｘ１およびＸ２のうちの１つはＮＫｐ４６ ＡＢＤまたはその部分であり、かつ他方はＦｃ単量体であり、かつＸ３はサイトカインまたはその部分であり、Ｌ１およびＬ２は各々適宜のドメインリンカーである）を含む第１のポリペプチド鎖を含むとして特徴付けられ得る。サイトカインは、そのため、それ（またはその部分）が置かれたポリペプチド鎖のＣ末端において位置付けられ得る。多特異性タンパク質は、対象とする抗原に結合するＡＢＤをさらに含むことができ、ＡＢＤ（またはその部分）は、第１のポリペプチド鎖上に、または第１のポリペプチド鎖（もしくはタンパク質の任意の他の鎖）と会合する（例えば二量体化する）別々のポリペプチド鎖上に置かれている。タンパク質は次に、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ（ＮＫｐ４６ ＡＢＤがＡＢＤの部分である場合）、Ｆｃ単量体（Ｆｃ二量体を形成するため）、サイトカイン（サイトカインがサイトカインの部分である場合）および／または対象とする抗原に結合するＡＢＤのための相補的なドメインを提供する１、２またはより多くの追加のポリペプチド鎖を含むことができる。そのような追加のポリペプチド鎖は、そのため、非共有結合性相互作用および適宜さらなる共有結合性相互作用を介してタンパク質の第１のまたは他のポリペプチド鎖と会合する（例えば二量体化する）ことができる。
別の実施形態において、多特異性タンパク質は、適宜、（ｉ）式（Ｘ１）－Ｌ１－（Ｘ２ａ）（式中、Ｘ１は第１のＦｃ単量体であり、かつＸ２ａはＮＫｐ４６ ＡＢＤの第１の部分である）を含む第１のポリペプチド鎖、および（ｉｉ）式（Ｘ２ｂ）－Ｌ２－（Ｘ３）［式中、Ｘ２ｂは、Ｘ２ａと会合してＮＫｐ４６ ＡＢＤを形成するＮＫｐ４６ ＡＢＤの第２の部分（例えばＶＨまたはＶＬ、ＶＨ－ＣＨ１、ＶＨ－ＣＬ、ＶＬ－ＣＬ、ＶＬ－ＣＨ１）であり、かつＸ３はサイトカインまたはその部分である］を含む第２のポリペプチド鎖を含むとして特徴付けられ得る。Ｌ１およびＬ２は各々ドメインリンカーである。多特異性タンパク質は、対象とする抗原に結合するＡＢＤをさらに含むことができ、ＡＢＤ（またはその部分）は、第１のポリペプチド鎖上（例えばＸ１のＮ末端）にまたは第１のポリペプチド鎖（もしくはタンパク質の任意の他の鎖）と会合する（例えば二量体化する）別々のポリペプチド鎖上に置かれている。多特異性タンパク質は、ＣＤ１６Ａに結合するＡＢＤをさらに含むことができ、適宜、ＡＢＤは二量体Ｆｃドメインであり；ＣＤ１６Ａ（またはその部分）に結合するＡＢＤは、第１のポリペプチド鎖上（例えばＸ１のＮ末端）に置くことができ（ｃａ ｂｅ ｐｌａｃｅｄ）、かつ、ＡＢＤが二量体Ｆｃドメインである場合、Ｆｃ単量体のうちの１つは第１のポリペプチド鎖上に置くことができ、かつ第２のＦｃ単量体は、第１のポリペプチド鎖と会合する（例えば二量体化する）別々のポリペプチド鎖上に置くことができる。
１つの実施形態において、ＮＫｐ４６結合性ドメインは、多特異性タンパク質のＮＫｐ４６結合性ドメインが、細胞の表面においてＮＫｐ４６に結合している場合に、細胞膜から約７０オングストロームであるようにＮＫｐ４６に結合する。ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペアのＣＤＲを組み込んだタンパク質により例示される１つのそのような実施形態において、ＮＫｐ４６結合性ドメインはＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ１／Ｄ２ジャンクションに結合する。適宜、ＮＫｐ４６結合性ドメインは、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドと比較して、ＮＫｐ４６突然変異体２（残基Ｋ４１、Ｅ４２およびＥ１１９において突然変異を有する）ならびに突然変異体Ｓｕｐｐ７（残基Ｙ１２１およびＹ１９４において突然変異を有する）に対する減少した結合性を呈する。１つの実施形態において、ＮＫｐ４６抗原結合性ドメインは、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドと比較して、突然変異：Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１およびＹ１９４のうちの１、２、３、４または５つを有するＮＫｐ４６突然変異体ポリペプチドに対する減少した結合性を示すとして特徴付けられ得る。
１つの実施形態において、ＮＫｐ４６結合性ドメインは、多特異性タンパク質のＮＫｐ４６結合性ドメインが、細胞の表面においてＮＫｐ４６に結合している場合に、細胞膜から約７０オングストローム未満、適宜約５０オングストローム未満であるようにＮＫｐ４６に結合する。ＮＫｐ４６－４ ＶＨ／ＶＬペアのＣＤＲを組み込んだタンパク質により例示される１つのそのような実施形態において、ＮＫｐ４６結合性ドメインは、Ｄ１／Ｄ２ジャンクションと比較してＮＫ細胞膜のより近位に位置付けられるＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ１ドメインに結合する。任意に、ＮＫｐ４６結合性ドメインは、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドと比較して、ＮＫｐ４６突然変異体６（残基Ｒ１０１およびＶ１０２において突然変異を有する）ならびに突然変異体Ｓｕｐｐ６（残基Ｅ１０４およびＬ１０５において突然変異を有する）に対する減少した結合性を呈する。１つの実施形態において、ＮＫｐ４６抗原結合性ドメインは、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドと比較して、突然変異：Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４およびＬ１０５のうちの１、２、３または４つを有するＮＫｐ４６突然変異体ポリペプチドに対する減少した結合性を示すとして特徴付けられ得る。１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、Ｄ１ドメイン内で結合するＮＫｐ４６結合性ドメインとサイトカインとの間に少なくとも１０個のアミノ酸残基のドメインリンカーを含む。
ＮＫｐ４６－３ ＶＨ／ＶＬペアのＣＤＲを組み込んだタンパク質により例示される別の実施形態において、ＮＫｐ４６結合性ドメインは、Ｄ１／Ｄ２ジャンクションと比較してＮＫ細胞膜のより近位に位置付けられるＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ２ドメインに結合する。任意に、ＮＫｐ４６結合性ドメインは、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドと比較して、ＮＫｐ４６突然変異体１９（残基Ｉ１３５、およびＳ１３６において突然変異を有する）ならびに突然変異体Ｓｕｐｐ８（残基Ｐ１３２およびＥ１３３において突然変異を有する）に対する減少した結合性を呈する。１つの実施形態において、ＮＫｐ４６抗原結合性ドメインは、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドと比較して、突然変異：Ｉ１３５、Ｓ１３６、Ｐ１３２およびＥ１３３のうちの１、２、３または４つを有するＮＫｐ４６突然変異体ポリペプチドに対する減少した結合性を示すとして特徴付けられ得る。１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、Ｄ２ドメイン内で結合するＮＫｐ４６結合性ドメインとサイトカインとの間に少なくとも１０個のアミノ酸残基のドメインリンカーを含む。
本明細書における任意の実施形態において、多特異性タンパク質は、１つのみのサイトカイン受容体結合性ドメインを有することにより特徴付けられ得る。
本明細書における任意の実施形態において、多特異性タンパク質は、１つのみのＮＫｐ４６結合性ドメインを有することにより特徴付けられ得る。
ある特定の例示的なヘテロ多量体タンパク質は、構造１ａまたは１ｂの以下の一般的なドメイン編成を含むことができ、該編成において、ＣＤ１６ ＡＤＣ（例えばＦｃドメイン）およびＮＫｐ４６ ＡＢＤはタンパク質内で互いに直ちに隣接しており、かつＮＫｐ４６ ＡＢＤはサイトカイン受容体ＡＢＤ［サイトカイン（Ｃｙｔ）として具体化される］に直ちに隣接しており、かつＮＫｐ４６ ＡＢＤは、ＣＤ１６ ＡＢＤとＣｙｔとの間に差し挟まれている：
（ＣＤ１６ ＡＢＤ）（ＮＫｐ４６ ＡＢＤ）（Ｃｙｔ） （構造１ａ）
または
（Ｆｃドメイン二量体）（ＮＫｐ４６ ＡＢＤ）（Ｃｙｔ） （構造１ｂ）
ＮＫｐ４６ ＡＢＤおよびＣＤ１６ＡＢＤ（例えばＦｃドメイン二量体）はドメインリンカーにより接続されており、かつＮＫｐ４６ ＡＢＤおよびＣｙｔはドメインリンカーにより接続されている。
ＮＫｐ４６ ＡＢＤは、好都合には、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体またはｓｃＦｖであり得る。ＣＤ１６ ＡＢＤは、Ｆｃドメイン、Ｆｃドメイン二量体、ヒトＩｇＧ１サブタイプのＦｃドメインであり得る。Ｃｙｔは、例えばＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドであり得、適宜、ポリペプチドは、野生型ヒトサイトカイン対応物から少なくとも１つの残基だけ異なる変異型サイトカインである。
構造１ａのタンパク質は、ＣＤ１６ ＡＢＤ（例えばＦｃドメイン二量体）の末端（例えばＮ末端）に置かれた標的細胞上の対象とする抗原に結合するＡＢＤ（抗原ＡＢＤ）を含むことができ、これは例えば、以下の構造１ｃまたは１ｄ：
（抗原ＡＢＤ）ｎ（ＣＤ１６ ＡＢＤ）（ＮＫｐ４６ ＡＢＤ）（Ｃｙｔ） （構造１ｃ）
または
（抗原ＡＢＤ）ｎ（Ｆｃドメイン二量体）（ＮＫｐ４６ ＡＢＤ）（Ｃｙｔ） （構造１ｄ）
［式中、
「ｎ」は１または２であり、かつ抗原ＡＢＤおよびＣＤ１６ ＡＢＤ（例えばＦｃドメイン二量体）はリンカーにより接続されており、適宜、リンカーは免疫グロブリンヒンジポリペプチドであり、ＣＤ１６ ＡＢＤおよびＮＫｐ４６ ＡＢＤはリンカーにより接続されており、かつＮＫｐ４６ ＡＢＤおよびＣｙｔはリンカーにより接続されている］
を有するヘテロ多量体タンパク質における場合である。「ｎ」が２である場合、構造１ｄはまた、構造１ｅとしても表され得る：
（抗原ＡＢＤ）
（Ｆｃドメイン二量体）（ＮＫｐ４６ ＡＢＤ）（Ｃｙｔ） （構造１ｅ）
（抗原ＡＢＤ）
任意の実施形態において、多特異性タンパク質は、ＮＫｐ４６ポリペプチドおよびサイトカイン受容体の各々に一価で結合すること、および対象とする抗原を発現する標的細胞をＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞が溶解することを指令する能力を有することとして特徴付けられ得る。有利には、１つの実施形態（ｏｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）において、ＮＫ細胞および標的細胞の存在下で（ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ）、多特異性タンパク質は、（ｉ）標的細胞上の対象とする抗原、（ｉｉ）ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６、（ｉｉｉ）ＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａおよび（ｉｖ）ＮＫ細胞上のサイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＬ－２７Ｒａ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＦＮＡＲ）に結合することができ、かつ標的細胞およびＮＫ細胞上のそのようなタンパク質に結合した場合に、ＮＫｐ４６（タンパク質はＮＫｐ４６アゴニストとして作用する）およびサイトカイン受容体（タンパク質はサイトカイン受容体アゴニストとして作用する）を通じてＮＫ細胞におけるシグナル伝達および／またはＮＫ細胞の活性化を誘導し、それにより、特にＮＫｐ４６により伝達される活性化シグナルを介して、ＮＫ細胞の活性化および／または標的細胞の溶解を促進することができる。
１つの実施形態において、ＮＫ細胞および標的細胞の存在下で、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞の細胞傷害性、ＮＫ細胞におけるサイトカイン受容体経路シグナル伝達（ＳＴＡＴシグナル伝達により評価された場合）および／またはＮＫ細胞の活性化を誘導することができ、そのような細胞傷害性、活性化および／またはシグナル伝達は、多特異性タンパク質が標的細胞の非存在下でＮＫ細胞と接触された場合に観察される場合よりも大きい（例えば少なくとも１００倍または１０００倍低いＥＣ５０値）。
適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６およびＣＤ１２２に結合することができ（例えば、タンパク質は、ＩＬ２またはＩＬ１５部分、適宜、ＣＤ２５に対する減少した結合性を有する改変型または変異型ＩＬ２またはＩＬ１５を含む）、かつ、ＮＫｐ４６およびＣＤ１２２の両方に結合した場合に、ＮＫｐ４６およびＣＤ１２２の両方を通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１２２に結合することができ、かつ、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６およびＣＤ１２２に結合した場合に、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１２２を通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。サイトカイン受容体シグナル伝達は、ＳＴＡＴ５を測定することにより評価可能であり、適宜、観察されるシグナル伝達は、ＮＫｐ４６結合性ドメインが対照ＡＢＤ（例えばアッセイシステム中に存在するいかなるタンパク質にも結合しないもの）で置き換えられている比較用タンパク質を用いて観察される場合よりも大きい。
適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６およびＩＬ－２１Ｒに結合することができ（例えばタンパク質はＩＬ２１部分を含む）、かつ、ＮＫｐ４６およびＩＬ－２１Ｒの両方に結合した場合に、ＮＫｐ４６およびＩＬ－２１Ｒの両方を通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－２１Ｒに結合することができ、かつ、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－２１Ｒに結合した場合に、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－２１Ｒを通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。適宜、サイトカインシグナル伝達は、ＳＴＡＴ３を測定することにより評価され、観察されるシグナル伝達は、ＮＫｐ４６結合性ドメインが対照ＡＢＤ（例えばアッセイシステム中に存在するいかなるタンパク質にも結合しないもの）で置き換えられている比較用タンパク質を用いて観察される場合よりも大きい。
適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６およびＩＬ－１８Ｒに結合することができ（例えばタンパク質はＩＬ１８部分を含む）、かつ、ＮＫｐ４６ならびにＩＬ－１８Ｒ（ＩＬ－１８Ｒαおよび／またはＩＬ－１８Ｒβ）の両方に結合した場合にＮＫｐ４６およびＩＬ－１８Ｒの両方を通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－１８Ｒに結合することができ、かつ、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－１８Ｒに結合した場合に、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－１８Ｒを通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。適宜、サイトカインシグナル伝達（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）は、ＳＴＡＴ３を測定することにより評価され、観察されるシグナル伝達は、ＮＫｐ４６結合性ドメインが対照ＡＢＤ（例えばアッセイシステム中に存在するいかなるタンパク質にも結合しないもの）で置き換えられている比較用タンパク質を用いて観察される場合よりも大きい。
適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６ならびにＩＬ－７Ｒ［例えばＩＬ－７Ｒα（ＣＤ１２７）および／またはＣＤ１３２］に結合することができ（例えばタンパク質はＩＬ－７部分を含む）、かつ、ＮＫｐ４６およびＩＬ－７Ｒの両方に結合した場合に、ＮＫｐ４６およびＩＬ－７Ｒαの両方を通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－７Ｒに結合することができ、かつ、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－７Ｒに結合した場合に、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－７Ｒを通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。適宜、サイトカインシグナル伝達は、ＳＴＡＴ５を測定することにより評価され、観察されるシグナル伝達は、ＮＫｐ４６結合性ドメインが対照ＡＢＤ（例えばアッセイシステム中に存在するいかなるタンパク質にも結合しないもの）で置き換えられている比較用タンパク質を用いて観察される場合よりも大きい。
適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６ならびにＩＬ－２７Ｒ（例えばＩＬ－２７Ｒαおよび／またはＧＰ１３０）に結合することができ（例えばタンパク質はＩＬ－２７部分を含む）、かつ、ＮＫｐ４６およびＩＬ－２７Ｒの両方に結合した場合に、ＮＫｐ４６およびＩＬ－２７Ｒの両方を通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－２７Ｒに結合することができ、かつ、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－２７Ｒに結合した場合に、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－２７Ｒを通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。ＮＫｐ４６および／またはＣＤ１６Ａを介するシグナル伝達は、ＮＫ細胞活性化のマーカー（例えば実施例において使用されたマーカー、ＣＤ６９発現など）により評価され得る。適宜、サイトカインシグナル伝達は、ＳＴＡＴ１を測定することにより評価され、観察されるシグナル伝達は、ＮＫｐ４６結合性ドメインが対照ＡＢＤ（例えばアッセイシステム中に存在するいかなるタンパク質にも結合しないもの）で置き換えられている比較用タンパク質を用いて観察される場合よりも大きい。
適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６ならびにＩＬ－１２Ｒ（例えば、ＩＬ－１２Ｒβ１および／またはＩＬ－１２Ｒβ２）に結合することができ（例えばタンパク質はＩＬ－２７部分を含む）、かつ、ＮＫｐ４６およびＩＬ－１２Ｒの両方に結合した場合に、ＮＫｐ４６およびＩＬ－１２Ｒの両方を通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－１２Ｒに結合することができ、かつ、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－１２Ｒに結合した場合に、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＬ－１２Ｒを通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。適宜、サイトカインシグナル伝達は、ＳＴＡＴ４を測定することにより評価され、観察されるシグナル伝達は、ＮＫｐ４６結合性ドメインが対照ＡＢＤ（例えばアッセイシステム中に存在するいかなるタンパク質にも結合しないもの）で置き換えられている比較用タンパク質を用いて観察される場合よりも大きい。
適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６およびＩＦＮＡＲに結合することができ、かつ、ＮＫｐ４６ならびにＩＦＮＡＲ（ＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２）の両方に結合した場合に、ＮＫｐ４６およびＩＦＮＡＲの両方を通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。例えば、多特異性タンパク質はＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－β部分を含むことができる。適宜、多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＦＮＡＲに結合することができ、かつ、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＦＮＡＲの両方に結合した場合に、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＩＦＮＡＲを通じてＮＫ細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。適宜、サイトカインシグナル伝達は、ＳＴＡＴ［例えば、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２またはＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ）－９］を測定することにより評価され、観察されるシグナル伝達は、ＮＫｐ４６結合性ドメインが対照ＡＢＤ（例えばアッセイシステム中に存在するいかなるタンパク質にも結合しないもの）で置き換えられている比較用タンパク質を用いて観察される場合よりも大きい。
ＮＫｐ４６および／またはＣＤ１６Ａを介するシグナル伝達は、ＮＫ細胞活性化のマーカー（例えば実施例において使用されたマーカー、ＣＤ６９発現など）により評価され得る。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、ヒトＦｃドメインの少なくとも部分、例えばＦｃドメインがヒトＦｃＲｎポリペプチドにより結合されるような十分な部分を含み、適宜、ＳＰＲにより評価された場合の前記ＦｃＲｎ結合親和性は、従来的なヒトＩｇＧ１抗体の場合の１－ｌｏｇ以内である。
多特異性タンパク質は、有利には、ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞およびＣＤ１６－ ＮＫ細胞の両方を強力に動員することができる（すべてのＮＫ細胞はＮＫｐ４６＋である）。
１つの態様において、多特異性タンパク質は、２つまたはより多くのポリペプチド鎖を含み、すなわち複数鎖タンパク質（多量体タンパク質とも称される）を含む。例えば、多特異性タンパク質または複数鎖タンパク質は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体もしくはヘテロ四量体であり得るか、または４つより多くのポリペプチド鎖を含んでもよい。
任意の抗原結合性ドメイン［例えば対象とする抗原（例えば腫瘍抗原）、ＮＫｐ４６、またはサイトカイン受容体に結合するＡＢＤ］は、例えばｓｃＦｖまたは単一抗原結合性ドメイン、例えばｓｄＡｂまたはナノボディ、ＶＮＡＲまたはＶＨＨドメインまたはＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質モジュールとして、単一のポリペプチド鎖上に完全に含有され得る。代替的に、抗原結合性ドメインは、別々のポリペプチド鎖上に置かれた２つまたはより多くのタンパク質ドメインから作ることができ、その結果、２つまたはより多くの相補的なタンパク質ドメイン（例えばＶＨ／ＶＬペアとして）が多量体タンパク質中で会合している場合に抗原結合性ドメインはその標的に結合する。
多特異性タンパク質は、一価または多価方式において対象とする抗原（例えばがん抗原）に結合することができる。多特異性タンパク質が、対象とする抗原に一価で結合し、ＮＫ４６に一価で結合し、かつサイトカイン受容体に一価で結合する場合、多特異性タンパク質は、１：１：１の構成を有するとして指し示され得る。多特異性タンパク質が、対象とする抗原に二価で結合し、ＮＫ４６に一価で結合し、かつサイトカイン受容体に一価で結合する場合、多特異性タンパク質は、２：１：１の構成を有するとして指し示され得る。異なる１：１：１および２：１：１の構成の代表的な例を図２において示す。
任意の態様において、多特異性タンパク質は、１つまたは複数の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）の運動（鎖内ドメイン運動）の自由度または柔軟性が、例えば従来的なヒトＩｇＧ抗体のＡＢＤと比較して、増加している構造を有するとして特徴付けられ得る。１つの実施形態において、提供されるのは、第１の抗原結合性ドメインの抗原結合性部位および第２の抗原結合性ドメインの抗原結合性部位が、増強された機能、例えば、ＮＫｐ４６シグナル伝達および標的細胞の溶解を誘導する多特異性タンパク質の能力を結果としてもたらす距離、例えば、適宜８０オングストローム（Å）未満の距離により分離されることを可能にする構造を含む多特異性タンパク質である。ＡＢＤが、より大きい柔軟性を有する、および／または最適化された距離により分離されている多特異性タンパク質は、溶解性ＮＫｐ４６標的シナプスの形成を増強して、ＮＫｐ４６媒介性シグナル伝達を増強し得る。そのような柔軟性および／または運動のドメインは、ＮＫｐ４６結合性ドメインをＦｃドメイン（例えばＦｃドメイン二量体、またはより一般には多特異性タンパク質の残部）から分離するリンカー（例えば柔軟なアミノ酸ベースリンカー）の使用を通じて容易に達成され得る。
任意の態様において、多特異性タンパク質は、抗原結合性ドメインの運動の増加した自由度（例えば、従来的なヒトＩｇＧ抗体、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＡＢＤと比較して）を有するとして特徴付けられ得る。そのようなタンパク質の１つの例は、抗原結合性ドメイン（例えば、ＮＫｐ４６に結合するＡＢＤ）が柔軟性リンカーを介してＦｃドメインに連結または融合している多量体Ｆｃドメイン含有タンパク質（例えばヘテロ二量体またはヘテロ三量体）である。リンカーは、屈曲し、それにより、リンカーにおいてＡＢＤとＦｃドメインとの間（または２つのＡＢＤの間）の角度を潜在的に減少させる能力を付与することにより１つまたは複数のＡＢＤの運動の柔軟性または自由度を提供することができる。適宜、両方の抗原結合性ドメイン（および適宜、追加のＡＢＤが多特異性タンパク質中に存在する場合により多くのもの）は、リンカー、典型的には柔軟性ペプチドリンカーを介してＦｃドメインに連結または融合している。適宜、運動の増加した自由度を有するタンパク質は、ＮＫｐ４６結合性部位と対象とする抗原に結合する部位との間の距離が、両方の結合性ドメインがＦａｂであるタンパク質において観察される場合よりも小さいか、または全長抗体におけるよりも小さいコンフォメーションをタンパク質が取ることを可能にする。
ＡＢＤは、ドメインリンカーを介してＦｃドメイン単量体（またはそのＣＨ２もしくはＣＨ３ドメイン）に接続され得る。リンカーは、ポリペプチドリンカー、例えば、少なくとも５残基、少なくとも１０残基、少なくとも１５残基、少なくとも２０残基、またはより多くの残基の長さを含むペプチドリンカーであり得る。他の実施形態において、リンカーは、２～４残基、２～５残基、２～６残基、２～８残基、５～１０残基、２～１５残基、４～１５残基、３～１５残基、５～１５残基、１０～１５残基、４～２０残基、５～２０残基、２～２０残基、１０～３０残基、または１０～５０残基の長さを含む。適宜、リンカーは、抗体定常領域に由来するアミノ酸配列、例えば、ＣＨ１もしくはＣκドメイン（例えばＣＨ１もしくはＣκドメインからのＮ末端配列）またはヒンジからのアミノ酸配列を含む。適宜、リンカーはアミノ酸配列ＲＴＶＡを含む。適宜、リンカーは、グリシンおよび／またはセリン残基を主にまたは排他的に含む、例えば、アミノ酸配列（ＧｘＳ）ｎ（Ｇは、１、２、３または４であり、かつｎは、１～１０、１～６または１～４の整数である）を含む柔軟性リンカーである。適宜、リンカーは、１～２０個または１～１０個のさらなるアミノ酸残基を含む。
１つの実施形態において、提供されるのは、ポリペプチド鎖１、２および３：
［式中、
Ｖａ－１、Ｖｂ－１、Ｖａ－２およびＶｂ－２は各々ＶＨドメインまたはＶＬドメインであり、Ｖａ－１およびＶｂ－１は対象とする抗原に結合し［適宜、Ｖａ－１およびＶｂ－１のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－１およびＶｂ－１は、対象とする抗原に結合する第１の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）を形成し］、Ｖａ－２およびＶｂ－２のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－２およびＶｂ－２は、ＮＫｐ４６に結合する第２のＡＢＤを形成しており；
ＣＨ１はヒト免疫グロブリンＣＨ１ドメインであり、かつＣＬはヒト軽鎖定常ドメインであり；
（ＣＨ１またはＣＬ）ａおよび（ＣＨ１またはＣＬ）ｃのうちの１つはＣＨ１であり、かつ他方はＣＬであり、その結果、（ＣＨ１／ＣＬ）ペアが形成され；
（ＣＨ１またはＣＬ）ｂおよび（ＣＨ１またはＣＬ）ｄのうちの１つはＣＨ１であり、かつ他方はＣＬであり、その結果、（ＣＨ１／ＣＬ）ペアが形成され；
ヒンジは免疫グロブリンヒンジ領域またはその部分であり；
Ｌ１およびＬ２は各々アミノ酸ドメインリンカーであり、Ｌ１およびＬ２は異なるかまたは同じであり得；
ＣＨ２およびＣＨ３はそれぞれヒト免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインであり；かつ
Ｃｙｔは、ＮＫ細胞上に存在するサイトカイン受容体に結合するサイトカインポリペプチドまたはその部分であり、適宜、Ｃｙｔは、野生型または変異型ヒトＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドである］
を有するヘテロ三量体である。同じドメインおよびドメインリンカーを使用して作られ得る別の実施形態において、提供されるのは、ポリペプチド鎖１、２および３：
を有するヘテロ三量体である。
１つの実施形態において、提供されるのは、ポリペプチド鎖１および２：
［式中、
Ｖａ－１、Ｖｂ－１、Ｖａ－２およびＶｂ－２は各々ＶＨドメインまたはＶＬドメインであり、Ｖａ－１およびＶｂ－１は対象とする抗原に結合し［適宜、Ｖａ－１およびＶｂ－１のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－１およびＶｂ－１は、対象とする抗原に結合する第１の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）を形成し］、Ｖａ－２およびＶｂ－２のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－２およびＶｂ－２は、ＮＫｐ４６に結合する第２のＡＢＤを形成しており；
ＣＨ１はヒト免疫グロブリンＣＨ１ドメインであり、かつＣＬは軽鎖定常ドメインであり；
（ＣＨ１またはＣＬ）ａおよび（ＣＨ１またはＣＬ）ｂのうちの１つはＣＨ１であり、かつ他方はＣＬであり、その結果、（ＣＨ１／ＣＬ）ペアが形成され；
ヒンジは免疫グロブリンヒンジ領域またはその部分であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は各々アミノ酸ドメインリンカーであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は異なるかまたは同じであり得；
ＣＨ２およびＣＨ３はそれぞれヒト免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインであり；かつ
Ｃｙｔは、ＮＫ細胞上に存在するサイトカイン受容体に結合するサイトカインポリペプチドまたはその部分であり、適宜、Ｃｙｔは、野生型または変異型ヒトＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドである］
を有するヘテロ二量体である。
本開示は、本明細書においてさらに記載されているさらなるヘテロ二量体、ヘテロ三量体およびヘテロ四量体多特異性分子およびドメイン配置をさらに提供する。１つの態様において、多特異性タンパク質は、図２Ａ～２Ｎのいずれかにおいて示されている構造またはドメイン配置を有するヘテロ多量体、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体である。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＡＢＤ（例えば、抗ＮＫｐ４６ ＡＢＤ、対象とする抗原または腫瘍抗原に結合するＡＢＤ）は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、各々のＶＨおよびＶＬが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－１～ＣＤＲ－３）を含む、ＶＨおよびＶＬを含むとして特定され得る。本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＶＨは、ヒトＶＨドメインのアミノ酸配列を有するとして特定され得る。本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＶＬは、ヒトＶＬドメインのアミノ酸配列を有するとして特定され得る。
実施形態のいずれかの１つの態様において、ＶＨ領域は、ＩＧＨＶ１－１８、ＩＧＨＶ１－２、ＩＧＨＶ１－２４、ＩＧＨＶ１－３、ＩＧＨＶ１－４５、ＩＧＨＶ１－４６、ＩＧＨＶ１－５８、ＩＧＨＶ１－６９、ＩＧＨＶ１－６９－２、ＩＧＨＶ１－６９Ｄ、ＩＧＨＶ１－８、ＩＧＨＶ２－２６、ＩＧＨＶ２－５、ＩＧＨＶ２－７０、ＩＧＨＶ２－７０Ｄ、ＩＧＨＶ３－１１、ＩＧＨＶ３－１３、ＩＧＨＶ３－１５、ＩＧＨＶ３－２０、ＩＧＨＶ３－２１、ＩＧＨＶ３－２３、ＩＧＨＶ３－２３Ｄ、ＩＧＨＶ３－３０、ＩＧＨＶ３－３０－３、ＩＧＨＶ３－３０－５、ＩＧＨＶ３－３３、ＩＧＨＶ３－４３、ＩＧＨＶ３－４３Ｄ、ＩＧＨＶ３－４８、ＩＧＨＶ３－４９、ＩＧＨＶ３－５３、ＩＧＨＶ３－６２、ＩＧＨＶ３－６４、ＩＧＨＶ３－６４Ｄ、ＩＧＨＶ３－６６、ＩＧＨＶ３－７、ＩＧＨＶ３－７２、ＩＧＨＶ３－７３、ＩＧＨＶ３－７４、ＩＧＨＶ３－９、ＩＧＨＶ３－ＮＬ１、ＩＧＨＶ４－２８、ＩＧＨＶ４－３０－２、ＩＧＨＶ４－３０－４、ＩＧＨＶ４－３１、ＩＧＨＶ４－３４、ＩＧＨＶ４－３８－２、ＩＧＨＶ４－３９、ＩＧＨＶ４－４、ＩＧＨＶ４－５９、ＩＧＨＶ４－６１、ＩＧＨＶ５－１０－１、ＩＧＨＶ５－５１、ＩＧＨＶ６－１、ＩＧＨＶ７－４－１、ＩＧＨＶ１－３８－４、ＩＧＨＶ１／ＯＲ１５－１、ＩＧＨＶ１／ＯＲ１５－５、ＩＧＨＶ１／ＯＲ１５－９、ＩＧＨＶ１／ＯＲ２１－１、ＩＧＨＶ２－７０、ＩＧＨＶ２／ＯＲ１６－５、ＩＧＨＶ３－１６、ＩＧＨＶ３－２０、ＩＧＨＶ３－２５、ＩＧＨＶ３－３５、ＩＧＨＶ３－３８、ＩＧＨＶ３－３８－３、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１５－７、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６－１０、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６－１２、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６－１３、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６－１７、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６－２０、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６－６、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６－８、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６－９、ＩＧＨＶ４－６１、ＩＧＨＶ４／ＯＲ１５－８、ＩＧＨＶ７－８１、およびＩＧＨＶ８－５１－１からなる群から選択されるヒトＶ遺伝子群の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適宜、ＶＨ領域は、前記遺伝子からのアミノ酸配列（例えばＣＤＲおよび／またはヒトフレームワーク領域、例えばＫａｂａｔ番号付けによるもの）を含むＶＨを含む。実施形態のいずれかの１つの態様において、ＶＨ領域は、配列番号２３６～３１３のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
実施形態のいずれかの１つの態様において、ＶＬ領域は、ＩＧＫＶ１－１２、ＩＧＫＶ１－１３、ＩＧＫＶ１－１６、ＩＧＫＶ１－１７、ＩＧＫＶ１－２７、ＩＧＫＶ１－３３、ＩＧＫＶ１－３９、ＩＧＫＶ１－５、ＩＧＫＶ１－６、ＩＧＫＶ１－８、ＩＧＫＶ１－９、ＩＧＫＶ１－ＮＬ１、ＩＧＫＶ１Ｄ－１２、ＩＧＫＶ１Ｄ－１３、ＩＧＫＶ１Ｄ－１６、ＩＧＫＶ１Ｄ－１７、ＩＧＫＶ１Ｄ－３３、ＩＧＫＶ１Ｄ－４３、ＩＧＫＶ１Ｄ－８、ＩＧＫＶ２－２４、ＩＧＫＶ２－２８、ＩＧＫＶ２－２９、ＩＧＫＶ２－３０、ＩＧＫＶ２－４０、ＩＧＫＶ２Ｄ－２６、ＩＧＫＶ２Ｄ－２８、ＩＧＫＶ２Ｄ－２９、ＩＧＫＶ２Ｄ－３０、ＩＧＫＶ２Ｄ－４０、ＩＧＫＶ３－１１、ＩＧＫＶ３－１５、ＩＧＫＶ３－２０、ＩＧＫＶ３Ｄ－１１、ＩＧＫＶ３Ｄ－１５、ＩＧＫＶ３Ｄ－２０、ＩＧＫＶ３Ｄ－７、ＩＧＫＶ４－１、ＩＧＫＶ５－２、ＩＧＫＶ６－２１、ＩＧＫＶ６Ｄ－２１、ＩＧＫＶ１－３７、ＩＧＫＶ１／ＯＲ２－０、ＩＧＫＶ１／ＯＲ２－１０８、ＩＧＫＶ１Ｄ－３７、ＩＧＫＶ１Ｄ－４２、ＩＧＫＶ２Ｄ－２４、ＩＧＫＶ３－７、ＩＧＫＶ３／ＯＲ２－２６８、ＩＧＫＶ３Ｄ－２０、ＩＧＫＶ６Ｄ－４１、ＩＧＬＶ１－３６、ＩＧＬＶ１－４０、ＩＧＬＶ１－４４、ＩＧＬＶ１－４７、ＩＧＬＶ１－５１、ＩＧＬＶ１０－５４、ＩＧＬＶ２－１１、ＩＧＬＶ２－１４、ＩＧＬＶ２－１８、ＩＧＬＶ２－２３、ＩＧＬＶ２－８、ＩＧＬＶ３－１、ＩＧＬＶ３－１０、ＩＧＬＶ３－１２、ＩＧＬＶ３－１６、ＩＧＬＶ３－１９、ＩＧＬＶ３－２１、ＩＧＬＶ３－２２、ＩＧＬＶ３－２５、ＩＧＬＶ３－２７、ＩＧＬＶ３－９、ＩＧＬＶ４－３、ＩＧＬＶ４－６０、ＩＧＬＶ４－６９、ＩＧＬＶ５－３７、ＩＧＬＶ５－３９、ＩＧＬＶ５－４５、ＩＧＬＶ５－５２、ＩＧＬＶ６－５７、ＩＧＬＶ７－４３、ＩＧＬＶ７－４６、ＩＧＬＶ８－６１、ＩＧＬＶ９－４９、ＩＧＬＶ１－４１、ＩＧＬＶ１－５０、ＩＧＬＶ１１－５５、ＩＧＬＶ２－３３、ＩＧＬＶ３－３２、ＩＧＬＶ５－４８およびＩＧＬＶ８／ＯＲ８－１からなる群から選択されるヒトＶ遺伝子群の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適宜、ＶＬ領域は、前記遺伝子からのアミノ酸配列（例えばＣＤＲおよび／またはヒトフレームワーク領域、例えばＫａｂａｔ番号付けによるもの）を含むＶＬを含む。実施形態のいずれかの１つの態様において、ＶＬ領域は、配列番号３１４～４０３のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＡＢＤはｓｃＦｖまたはＦａｂを含み、ｓｃＦｖは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１１２、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４および２３６～３１３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、ドメインリンカー、ならびに配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５および３１４～４０３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含み；かつＦａｂは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１１２、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４および２３６～３１３のいずれかから選択される配列に対して（ｔｏ ａ ｓｅｌｅｃｔｅｄ）少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのＶＨ、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５および３１４～４０３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのＶＬ、配列番号１５６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのヒトＣＨ１ドメインならびに配列番号１５９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのヒトＣＬドメインを含み、ＶＨはＣＨ１またはＣＬドメインのうちの１つに融合しており、かつＶＬはＣＨ１またはＣＬドメインのうちの他方に融合している。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＩＬ２は、配列番号４０４～４１７のいずれかのＩＬ－２ポリペプチドに対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適宜、ＩＬ２は、ＣＤ２５に対する結合性を低減させる２、３、４、５またはより多くのアミノ酸置換、例えば本明細書において開示される残基のいずれかにおける置換をさらに含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＩＬ１５は、配列番号４１８のいずれかのＩＬ－１５ポリペプチドに対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＩＬ１２は、配列番号４３８および／もしくは４３９のいずれかのＩＬ－１２ポリペプチドに対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＩＬ７は、配列番号４３５のいずれかのＩＬ－７ポリペプチドに対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＩＬ２７は、配列番号４３６および／もしくは４３７のいずれかのＩＬ－２１ポリペプチドに対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＩＬ２１は、配列番号４２０もしくは４２１のいずれかのＩＬ－２７ポリペプチドに対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＩＬ１８は、配列番号４２２のいずれかのＩＬ－１８ポリペプチドに対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＩＦＮ－αは、配列番号４２３～４３３のいずれかのＩＦＮ－αポリペプチドに対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＩＦＮ－βは、配列番号４３４のいずれかのＩＦＮ－αポリペプチドに対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、Ｆｃドメインは、配列番号１６０～１６５のいずれかのＦｃポリペプチドに対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのそれぞれは、配列番号１５６、１５７もしくは１５８のＣＨ１ポリペプチドに対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ＣＫまたはＣＬドメインは、配列番号１５９のいずれかのＣＫポリペプチドに対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ヒンジドメインは、配列番号１６６～１７０のいずれかのＣＫポリペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、多特異性タンパク質は、
（ａ）対象とする抗原に結合するＡＢＤであって、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４および２３６～３１３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％または９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、ドメインリンカー、ならびに配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５および３１４～４０３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＡＢＤ；ならびに
（ｂ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＡＢＤであって、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１１２、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９および２３６～３１３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％または９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、ドメインリンカー、ならびに配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０および３１４～４０３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＡＢＤ；
（ｃ）２つのＦｃドメイン単量体ポリペプチドを含むＦｃドメイン二量体であって、各々のＦｃドメイン単量体ポリペプチドが、配列番号１６０～１６５から選択される配列に対して少なくとも７０％、８０％または９０％同一のアミノ酸配列を含む、Ｆｃドメイン二量体；ならびに
（ｄ）多特異性タンパク質のポリペプチド鎖のうちの１つのＣ末端にドメインリンカーを介して融合した、配列番号４０４～４３６から選択される配列に対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも７０％、８０％または９０％同一のアミノ酸配列を含むサイトカインポリペプチド
を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、ヒンジドメインは、配列番号１６６～１７０のいずれかのＣＫポリペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、多特異性タンパク質は、
（ａ）対象とする抗原に結合するＡＢＤであって、ｓｃＦｖまたはＦａｂを含み、
ａ．ｓｃＦｖが、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４および２３６～３１３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、ドメインリンカー、ならびに配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５および３１４～４０３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含み；かつ
ｂ．Ｆａｂが、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４および２３６～３１３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのＶＨ、配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５および３１４～４０３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのＶＬ、配列番号１５６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのヒトＣＨ１ドメインならびに配列番号１５９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのヒトＣＬドメインを含み、ＶＨがＣＨ１またはＣＬドメインのうちの１つに融合しており、かつＶＬがＣＨ１またはＣＬドメインのうちの他方に融合している、ＡＢＤ、
（ｂ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＡＢＤであって、ｓｃＦｖまたはＦａｂを含み、
ａ．ｓｃＦｖが、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１１２、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９および２３６～３１３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、ドメインリンカー、ならびに配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０および３１４～４０３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含み；かつ
ｂ．Ｆａｂが、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１１２、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９および２３６～３１３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのＶＨ、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０および３１４～４０３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのＶＬ、配列番号１５６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのヒトＣＨ１ドメインならびに配列番号１５９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのヒトＣＬドメインを含み、ＶＨがＣＨ１またはＣＬドメインのうちの１つに融合しており、かつＶＬがＣＨ１またはＣＬドメインのうちの他方に融合している、ＡＢＤ、
（ｃ）２つのＦｃドメイン単量体ポリペプチドを含むＦｃドメイン二量体であって、各々のＦｃドメイン単量体ポリペプチドが、配列番号１６０～１６５から選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、Ｆｃドメイン二量体；ならびに
（ｄ）多特異性タンパク質のポリペプチド鎖のうちの１つのＣ末端にドメインリンカーを介して融合した、配列番号４０４～４３６から選択される配列に対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むサイトカインポリペプチド
を含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、本明細書において記載されるヘテロ三量体タンパク質の第１の鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、本明細書において記載されるヘテロ三量体タンパク質の第２の鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび本明細書において記載されるヘテロ三量体タンパク質の第３の鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、本明細書において記載されるヘテロ二量体タンパク質の第１の鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、および本明細書において記載されるヘテロ二量体タンパク質の第２の鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、本明細書において記載されるヘテロ三量体タンパク質の第１の鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、本明細書において記載されるヘテロ三量体タンパク質のアミノ酸配列（ａｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むポリペプチドおよび本明細書において記載されるヘテロ三量体タンパク質の第３の鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、本明細書において記載されるヘテロ二量体タンパク質の第１の鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および本明細書において記載されるヘテロ二量体タンパク質の第２の鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、配列番号１７５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１７６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号１７７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、配列番号１９３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１８５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号１９４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、配列番号１９９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２００のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号２０１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、配列番号２０９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号２１１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、配列番号２１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２１３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号２１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、配列番号２１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２１６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号２１７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、配列番号２１８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２１９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号２２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
１つの態様において、本発明は、本明細書において開示されるＴ５、Ｔ６、Ｔ２５またはＴ２６タンパク質の第１のポリペプチド鎖の配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖；本明細書において開示されるそれぞれのＴ５、Ｔ６、Ｔ２５またはＴ２６タンパク質の第２のポリペプチド鎖の配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；および適宜、本明細書において開示されるＴ５、Ｔ６、Ｔ２５またはＴ２６タンパク質の第３のポリペプチド鎖の配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖を含む、単離された多特異性ヘテロ三量体タンパク質を提供する。１つの実施形態において、ＣＤＲは、配列同一性を計算するために考慮される配列から除外される。１つの実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬ可変領域は、ポリペプチド鎖の配列同一性を計算するために考慮される配列から除外される。適宜、各々のＶＨ領域は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１１２、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４または（ｏｒ ａｎｄ）２３６～３１３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適宜、各々のＶＬ領域は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５または３１４～４０３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、提供されるのは、第１のポリペプチド鎖、および／または第２のポリペプチド鎖、および／または第３のポリペプチド鎖および／または第４のポリペプチドをコードする組換え核酸である。本明細書において記載される実施形態のいずれかの１つの態様において、本発明は、第１のポリペプチド鎖、および／または第２のポリペプチド鎖および／または第３のポリペプチド鎖をコードする核酸を含む組換え宿主細胞であって、適宜、少なくとも１、２、３または４ｍｇ／Ｌの収率（精製の前または後の最終の生産性または濃度）と共に本発明に従って多量体または他のタンパク質を産生する、組換え宿主細胞を提供する。提供されるのはまた、本発明による第１のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸、本発明による第２のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸、および、適宜、本発明による第３のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸を含む、キットまたは核酸のセットである。提供されるのはまた、本発明による二量体、三量体および四量体タンパク質を作製する方法である。
別の実施形態において、本開示は、抗原結合性タンパク質、特にはＦｃドメインを有する抗原結合性タンパク質における使用のために特に適する新規の変異型ＩＬ－２ポリペプチドを提供し、いっそうさらに、Ｆｃドメインは、ＣＤ１６Ａおよび／または他のＦｃガンマ受容体に結合する能力を減少または欠如させるために改変されている。本明細書において提供されるのは、アミノ酸置換Ｔ４１Ａを含む改変型または変異型ＩＬ－２ポリペプチドであって、残基の番号付けが配列番号４０４のＩＬ－２ポリペプチドに関するものである、ポリペプチドである。１つの実施形態において、本明細書において提供されるのは、少なくとも２、３、４、５、６またはより多くのアミノ酸置換を含む改変型または変異型ＩＬ－２ポリペプチドであって、置換Ｔ４１Ａを含む、ポリペプチドである。１つの実施形態において、本明細書において提供されるのは、少なくとも３つのアミノ酸置換を含む改変型または変異型ＩＬ－２ポリペプチドであって、ヒト野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して残基Ｒ３８、Ｆ４２およびＴ４１において置換を含み、残基の番号が配列番号４０４のＩＬ－２ポリペプチドに関するものである、ポリペプチドである。１つの態様において、改変型または変異型ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒト野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して少なくとも３つのアミノ酸置換を含み、ポリペプチドは、置換：Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＴ４１Ｘを含み、Ｘは任意のアミノ酸残基である。１つの態様において、改変型または変異型ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒト野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して少なくとも３つ（例えば３、４、５、６またはより多く）のアミノ酸置換を含み、ポリペプチドは、置換：Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＴ４１Ａを含む。１つの態様において、改変型または変異型ＩＬ２は配列番号４０８のアミノ酸配列を含む。１つの態様において、改変型または変異型ＩＬ２は、配列番号４０８のＩＬ－２ポリペプチドに対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。提供されるのはまた、上述の改変型または変異型ＩＬ－２ポリペプチドを含むタンパク質またはポリペプチドである。１つの実施形態において、提供されるのは、異種アミノ酸配列またはポリペプチドに融合（例えば、そのＮ末端において融合）した改変型または変異型ＩＬ－２ポリペプチドである。１つの実施形態において、提供されるのは、改変型または変異型ＩＬ－２ポリペプチドを含む、対象とする抗原（例えばがん抗原、または免疫細胞上、適宜ＮＫ細胞上の受容体）に結合するポリペプチドまたはタンパク質（例えばＦｃドメイン含有タンパク質、抗原結合性タンパク質、多特異性タンパク質、または抗体）であり、適宜、ＩＬ－２ポリペプチドはドメインリンカーを介してポリペプチドまたはタンパク質に融合しており、適宜、ＩＬ－２ポリペプチドはドメインリンカーを介してタンパク質またはポリペプチドのＣ末端に融合している。１つの実施形態において、変異型ＩＬ－２を含むタンパク質またはポリペプチドはヒトＦｃドメインを含み、いっそうさらに、Ｆｃドメインは、ＣＤ１６Ａおよび／または他のＦｃガンマ受容体に結合する能力を減少または欠如させるために改変されている。一部の実施形態において、改変型ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２と比べてＣＤ２５に対する低減された結合親和性を有する。一部の実施形態において、改変型ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２と比べて、休止したまたは活性化されたＴ細胞に対する低減された活性を有する。
方法のいずれも、特に「発明の詳細な説明」におけるものを含む、本出願において記載される任意の工程を含むとしてさらに特徴付けられ得る。本発明はさらに、本明細書において記載されるタンパク質を同定、試験および／または作製する方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法のいずれかにより取得可能な多特異性タンパク質に関する。本開示はさらに、本明細書において開示される多特異性タンパク質のうちの少なくとも１つを含有する薬学的または診断用製剤に関する。本開示はさらに、処置または診断の方法において主題多特異性タンパク質を使用する方法に関する。
本発明のこれらのおよび追加の有利な態様および特色は、本明細書の他の箇所にさらに記載され得る。
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄは、１つの面において腫瘍細胞上の腫瘍抗原に結合し、別の面においてＩＬ２βγ複合体、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６Ａの三重の受容体シス提示を介してＮＫ細胞に結合する変異型ＩＬ２（ＩＬ２ｖ）を含む多特異性ＮＫ細胞エンゲージャー（ＮＫＣＥ）タンパク質についての構造／機能関係性を示す。ＮＫ細胞上のＩＬ２ｖ捕捉は、ＣＤ１２２に対する結合を向上させ、かつＣＤ２５媒介性ＩＬ－２提示を模倣し得る。 図２Ａは、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１２２、ならびに腫瘍細胞上のＣＤ２０に結合するＴ５フォーマットの例示的な多特異性タンパク質を示す。図２Ｂ～２Ｎは、対象とする抗原（例えばがん抗原）に結合する部位の数（１または２つの部位）、およびＦｃドメイン二量体の辺りのドメインの構成において異なる多特異性タンパク質の異なる構成を示す。図２Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、ＭおよびＮにおいて、ＣＨ３ドメイン中の星印は、突然変異Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）を指し示す。 野生型ＩＬ－２または変異型ＩＬ２のいずれかを含有し、かつＮＫｐ４６、ＣＤ１６Ａおよび対象とする抗原に対する結合を欠いていたＴ６フォーマットタンパク質によるＴＲｅｇ細胞の活性化。変異型ＩＬ２を含有するＴ６タンパク質は、野生型ＩＬ－２を含有するＴ６タンパク質と比較してＴｒｅｇ細胞を活性化させる能力の強い減少を示した。 図４は、ＮＫ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５細胞の％を示す。ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖおよびＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖは、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の同等の活性化を示した。しかしながら、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは、ＮＫｐ４６にもＣＤ１６Ａにも結合しないＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２と比較して、ＮＫ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５＋細胞のパーセントにおける約２－ｌｏｇの増加を結果としてもたらした。ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖタンパク質は、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を上回るＮＫ細胞の選択的な活性化を可能にした。 図５は、ＮＫ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５細胞の％を示す。ＣＤ１６およびＮＫｐ４６の両方に結合する（ＩＬ２ｖ部分に加えて）ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは、ＣＤ２０－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖと比較して、ＮＫ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５＋細胞のパーセントにおける効力における強い増加（約１－ｌｏｇの増加）を結果としてもたらした。ＮＫ細胞におけるＩＬ－２Ｒシグナル伝達はしたがってＮＫｐ４６およびＣＤ１６の各々により増強され、ＩＬ－２Ｒに加えてＮＫｐ４６およびＣＤ１６の両方が結合された場合に特に強い増強を有した。 図６は、腫瘍細胞の非存在下でのＣＤ６９発現ＮＫ細胞の％を示す。ＣＤ２０、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６に結合するがＩＬ２ｖ部分を欠いたＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６は腫瘍細胞の非存在下でＮＫ細胞を活性化させなかったが、ＩＬ２ｖ部分を含有するすべてのタンパク質は強いＮＫ細胞活性化を結果としてもたらし、追加の利益が、ＣＤ１６およびＮＫｐ４６結合性を欠いたＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖタンパク質と比較して、ＮＫｐ４６結合性ドメインおよび野生型Ｆｃドメインを有するタンパク質について見られた。 図７は、ｙ軸上に腫瘍細胞の非存在下での増殖性ＮＫ細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示す。ＣＤ２０、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６に結合するがＩＬ２ｖ部分を欠いたＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６はＮＫ細胞の増殖を誘導しなかったが、ＩＬ２ｖ部分を含有するすべてのタンパク質は、効力において差異を有したが、強いＮＫ細胞増殖を結果としてもたらした。ＮＫｐ４６結合性ドメインおよび／または野生型Ｆｃドメイン（ＩＬ２ｖに加えて）を有するすべてのＮＫ細胞エンゲージャータンパク質は、ＣＤ１６およびＮＫｐ４６結合性を欠いたＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖタンパク質と比較して、ＮＫ細胞増殖の誘導においてより強力であった。 図８Ａおよび図８Ｂは、ＥＴ比１０：１での細胞傷害性アッセイにおいてＮＫ細胞により誘導された特異的溶解％を示す。図８Ｃおよび図８Ｄは、ＥＴ比２：１での細胞傷害性アッセイにおいてＮＫ細胞により誘導された特異的溶解％を示す。ＣＤ１６およびＮＫｐ４６の両方（ＣＤ２０に加えて）に結合する能力を保持するＮＫ細胞エンゲージャーのすべては、腫瘍細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性の誘導におけるＥＣ５０値の観点において、同様に高い効力を示した。ＩＬ－２ポリペプチド［野生型または突然変異体ＩＬ２ｖ（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｅｄ ＩＬ２ｖ）のいずれか］の性質はＮＫ細胞の細胞傷害性に差次的に影響しないようであり、さらにはＩＬ２の存在は、野生型またはＩＬ２ｖのいずれであれ、細胞傷害性の誘導におけるＥＣ５０値の向上を結果としてもたらさなかった。 図９は、ＮＫ細胞エンゲージャーおよび腫瘍細胞の存在下でのＮＫ細胞によるサイトカイン産生を示す。ＮＫｐ４６結合性ドメインおよび野生型Ｆｃドメインを有するＮＫ細胞エンゲージャータンパク質は、ＮＫ細胞によるＭＩＰ１ｂおよびＩＦＮγ産生の誘導においてより強力であった。腫瘍標的化の非存在下で、ＣＤ２０に結合しないＩＣ－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖコンストラクトにより例示されるように、ＮＫ細胞エンゲージャーはＮＫ細胞によるサイトカイン産生を誘発しなかった。 図１０は、ＣＤ２０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１２２に結合するＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質のマウスへの投与（右パネル）は、オビヌツズマブ（左パネル）と比較して、単回注射として強い抗腫瘍有効性を示したことを示す。 図１１は、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖの２５μｇ用量の投与は、マウスにおける大容量の腫瘍において非常に強いかつ長い抗腫瘍活性を結果としてもたらし、研究の持続期間にわたり腫瘍が３００ｍｍ３の容量を一般に下回ったままとなることを可能にしたことを示す。 図１２は、ＣＤ２０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１２２に結合するＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質は、腫瘍が６０ｍｍ３の容量まで成長した腫瘍移植後９日目に開始して、１週により分離された２回の注射として投与された場合に、マウス腫瘍モデルにおいて強い有効性を示したことを示す。比較において、ＣＤ２０－Ｔ５－ＩＣ－ＩＬ２ｖ群およびＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６において、腫瘍は処置後の週の間にいくぶん最初に制御されたが、次にその後に３００ｍｍ３の容量を超えて急速に成長した。ＮＫｐ４６およびＣＤ１２２結合性は、腫瘍成長を効率的に制御するために重要であり、それらの同時の標的化はＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ分子の強い抗腫瘍有効性を駆動する。 図１３の左手パネルは、ＣＤ２０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１２２に結合するＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質により処置されたマウスから採取された腫瘍はｎｃｒ１転写物（ＮＫｐ４６タンパク質をコードし、ＮＫ細胞に高度に特異的である）の高い発現を示し、腫瘍におけるＮＫ細胞浸潤の増加を実証したことを示す。比較において、ＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６タンパク質またはオビヌツズマブにより処置されたマウスにおいて採取された腫瘍はｎｃｒ１転写物の軽微に過ぎない増加を示し、腫瘍におけるはるかにより低いＮＫ細胞浸潤物を明らかにした。右手パネルは、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質により処置されたマウスにおいて採取された腫瘍は、他の処置条件と比較してインターフェロンガンマ（ｉｆｎｇ）転写物のより高い発現を示し、ＮＫ細胞が活性化されることを示したことを示す。 図１４は右上パネルにおいて、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャーを用いた処置は腫瘍成長を制御したことを示す（処置の日を、矢印を用いて示している）。しかしながら、ＮＫ細胞枯渇は、約３０日目までに腫瘍成長の制御の喪失を結果としてもたらしたが（右下パネル）、ＮＫ細胞について枯渇されていないマウスにおいて腫瘍は依然として制御される。 図１５は、ＰＢＭＣの中でのｐＳＴＡＴ５細胞の％を示す。すべてのＧＡ１０１－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質は、ＩＬ２ｖとＮＫｐ４６結合性ＦａｂのＣ末端との間のリンカーの長さがどれほどであっても、ＴＲｅｇ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＣＤ４ Ｔ細胞を上回って優先的にＮＫ細胞においてＩＬ２Ｒシグナル伝達を誘導するそれらの能力において同等であった。 図１６は、ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペアに基づくＮＫｐ４６結合性ドメインが、１０アミノリンカー、短い（５ａａ）リンカーまたは長い（１５ａａ）リンカーと共に、Ｆｃドメイン二量体とＣ末端ＩＬ２ｖとの間に位置付けられている「Ｔ５」および「Ｔ６」フォーマットのＮＫＣＥタンパク質により増強された細胞傷害性を示し；タンパク質は、腫瘍細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を増強するそれらの能力においてすべて同等であった。 図１７は、ＮＫｐ４６－４ ＶＨ／ＶＬペアに基づくＮＫｐ４６結合性ドメインが、１０アミノリンカー、短い（５ａａ）リンカーまたは長い（１５ａａ）リンカーと共に、Ｆｃドメイン二量体とＣ末端ＩＬ２ｖとの間に位置付けられている「Ｔ５」および「Ｔ６」フォーマットのＮＫＣＥタンパク質により増強された細胞傷害性を示し；タンパク質は、腫瘍細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を増強するそれらの能力においてすべて同等であった。 図１８は、図１５、図１６および図１７において試験されたタンパク質の構造を示す。 図１９は、ＰＢＭＣ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５細胞の％を示す。異なるＩＬ－２部分を有するＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ２およびＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ３は同等であり、各々は、野生型ＩＬ－２を含有し、かつＮＫｐ４６にもＣＤ１６Ａにも結合しないＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２（ＩＬ２ｐＷＴ）と比較して、ＮＫ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５＋細胞のパーセントにおける約２－ｌｏｇの増加を結果としてもたらした。ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖタンパク質は、したがって、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を上回るＮＫ細胞の選択的な活性化を可能にした。異なる「非アルファ」サイトカイン変異型の置換は、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を上回ってＮＫ細胞を選択的に活性化させるＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖタンパク質の能力に影響しなかった。 図２０は、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャーの２５または７０μｇ用量を用いた処置後の経時的なＩＬ－６産生および右パネルはＴＮＦα産生を示し；左バーは７０μｇ用量についてのサイトカインの血漿濃度を示し、右バーは２５μｇ用量についてのサイトカインの血漿濃度を示す。 図２１Ａおよび図２１Ｂは、フォーマット２（Ｆ２）、フォーマット５（Ｆ５）、フォーマット７（Ｆ７）、フォーマット１３（Ｆ１３）およびフォーマット１４（Ｆ１４）タンパク質を含む、多特異性タンパク質の作用の機序を研究するために使用されたサイトカイン部分を欠いた異なる多特異性タンパク質のドメイン構造を示す。 図２２（２２Ａ：ＣＤ１０７および２２Ｂ：ＣＤ６９）は、標的抗原発現細胞の存在下でのＣＤ１９、ＣＤ１６ＡおよびＮＫｐ４６に結合する多特異性タンパク質によるＮＫ細胞の活性化を示す。ＣＤ１９×ＮＫｐ４６結合性タンパク質（ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４またはＮＫｐ４６－９可変領域をそれぞれ含む）の各々は、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化させた。 図２３は、精製されたＮＫ細胞が、ＣＤ１９×ＮＫｐ４６結合性タンパク質によりＣＤ１９陽性Ｄａｕｄｉ腫瘍標的細胞を溶解することを指令する能力を示す。そのＦｃドメインがＮ２９７置換に起因してＣＤ１６Ａに結合しないＣＤ１９－Ｆ６－ＮＫｐ４６タンパク質は、Ｄａｕｄｉ標的細胞のＮＫ細胞溶解の媒介において二価ＣＤ１９結合性全長ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体と同程度に強力であり、そのＦｃドメインがＣＤ１６Ａに結合するＣＤ１９－Ｆ５－ＮＫｐ４６（Ｆ５フォーマットタンパク質）はよりいっそう強力であった。 図２４は、そのＦｃドメインがＣＤ１６に結合するＮＫｐ４６×ＥＧＦＲ ＮＫＣＥタンパク質は、Ａ５４９標的細胞溶解の媒介において非常に強力であることを示す。 図２５は、そのＦｃドメインがＣＤ１６に結合するＮＫｐ４６×ＲＯＲ１ ＮＫＣＥタンパク質は、Ｍｉｎｏ腫瘍標的細胞溶解の媒介において非常に強力であることを示す。 図２６は、そのＦｃドメインがＣＤ１６に結合するＮＫｐ４６×ＫＩＲ３ＤＬ２ ＮＫＣＥタンパク質は、ＨＵＴ７８腫瘍標的細胞溶解の媒介において非常に強力であることを示す。 図２７は、ｙ軸上にＮＫ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示し、ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５とのインキュベーションは、ＮＫｐ４６にもＣＤ１６Ａにも結合しないＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣｂ－ＩＬ１５と比較して、ＮＫ細胞の中でのＳＴＡＴ５リン酸化についてのＥＣ５０における減少を誘導した。 図２８は、ｙ軸上に増殖性ＮＫ、ＣＤ４ ＴまたはＣＤ８ Ｔ細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示し、ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５とのインキュベーションは、ＮＫｐ４６にもＣＤ１６Ａにも結合しないＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１５タンパク質と比較した効力における増加と共に、強いＮＫ細胞増殖を結果としてもたらした。効力における増加はＮＫ細胞について選択的であり、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞増殖の誘導についてＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５による効力の増加はなかった。 図２９は、ｙ軸上にＮＫ細胞による腫瘍細胞の特異的溶解％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示す。標的化された細胞上のＣＤ２０に対する結合性を欠いたＩＣ－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５は、腫瘍細胞に向けた有意な細胞傷害性を誘導しなかったが、ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５は高い効力を示した。 図３０の左手パネルは、ｙ軸上にＣＤ６９発現ＮＫ細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示し、右手パネルはＮＫ細胞におけるＣＤ６９発現のメジアン蛍光強度（ｍｅｄＦＩ）を示す。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖは、ＮＫ細胞上のＣＤ１６ＡにもＮＫｐ４６にも結合しないＧＡ１０１－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１８ｖと比較して、ＮＫ細胞の活性化についてのＥＣ５０において２桁の規模の範囲内の減少を誘導した。 図３１は、ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖとのインキュベーションにおける、ｙ軸上にＩＦＮ－γ発現ＮＫ細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示し、該インキュベーションは、ＮＫ細胞上のＣＤ１６ＡにもＮＫｐ４６にも結合しないＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１８ｖと比較して、ＮＫ細胞の活性化についてのＥＣ５０において２桁の規模の範囲内の減少を誘導した。 図３２は、ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖタンパク質とのインキュベーションにおける、ｙ軸上に増殖性ＮＫ、ＣＤ４ ＴまたはＣＤ８ Ｔ細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示し、該インキュベーションは、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を上回る選択的な強いＮＫ細胞増殖を結果としてもたらした。ＣＤ１６ＡにもＮＫｐ４６にも結合しないＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１８ｖタンパク質はＮＫ細胞の有意な活性化を示さなかった。 図３３は、ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖタンパク質とのインキュベーションにおける、ｙ軸上にＮＫ細胞による腫瘍細胞の特異的溶解％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示す。標的化された細胞上のＣＤ２０に対する結合性を欠いたＩＣ－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖは有意な細胞傷害性を誘導しなかった。 図３４は、ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＦＮαｖとのインキュベーションにおける、ｙ軸上にＮＫ細胞、ＣＤ４ ＴまたはＣＤ８ Ｔ細胞の中でのｐＳＴＡＴ３細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示し、該インキュベーションは、いかなる有意なＮＫ細胞活性化も誘導しなかったＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＦＮαｖと比較して、ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞を上回ってＮＫ細胞に選択的に強力なＳＴＡＴ３リン酸化を誘導した。 図３５は、ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＦＮαｖとのインキュベーションにおける、ｙ軸上にＮＫ細胞による腫瘍細胞の特異的溶解％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示し、該インキュベーションは、ＮＫ細胞の細胞傷害性の誘導におけるＥＣ５０値の観点において高い効力を示した。 図３６は、ＮＫＣＥタンパク質を用いた非ヒト霊長動物の処置の１４日前から処置の３０日後までにかけてのＢ細胞数（細胞／μＬ）のベースラインからの差異を示し、ＮＫＣＥタンパク質はＢ細胞枯渇を誘導したが、対照（媒体）は誘導しなかったことを示す。 図３７は、非ヒト霊長動物へのＮＫＣＥタンパク質の投与後２４時間の経過にかけての異なるサイトカインの産生を示す。 図３８は、処置の１４日前から処置の３０日後までの期間にかけてのＮＫＣＥまたは媒体を用いて処置された非ヒト霊長動物についての赤血球細胞、血小板、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均血球容量、平均血球ヘモグロビンおよび平均血球ヘモグロビン濃度についての平均値を示す。 図３９は、処置の１４日前から処置の３０日後までの期間にかけての非ヒト霊長動物における白血球、リンパ球、単球、好中球、好酸球および好塩基球細胞のレベルを示す。 図４０は、処置の１４日前から処置の３０日後までの期間にかけての非ヒト霊長動物におけるＮＫ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＦｏｘＰ３－ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞のレベルを示す。 図４１は、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを用いた処置後のマウスにおける腫瘍からの細胞におけるＮＫ１．１およびＣＤ３の発現についての染色についてのフローサイトメトリーの結果を示し、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは腫瘍部位においてＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋ＣＤ３－）の蓄積を刺激したことを示す。 図４２は、マウスの処置後の、脾臓当たりのＮＫ細胞の数、脾臓中のＣＤ６９発現ＮＫ細胞および脾臓中のＫｉ６７発現ＮＫ細胞の％を示す。ＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６タンパク質およびオビヌツズマブはＮＫ細胞の数を増加させなかったが、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを用いた処置は脾臓中のＮＫ細胞における強い増加を引き起こした。追加的に、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは、全ＮＫ細胞の中での活性化されたまたは増殖性のＮＫ細胞における強い増加を引き起こした。 図４３は、マウスの処置後の、血液１μＬ当たりのＮＫ細胞の数、血液中のＣＤ６９発現ＮＫ細胞の％、脾臓中のＣＤ６９発現ＮＫ細胞および脾臓中のＫｉ６７発現ＮＫ細胞の％を示す。ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを用いた処置は、血液１μｌ当たりのおよび脾臓中のＮＫ細胞数における強い増加の他に、血液および脾臓中のＮＫ細胞の中での活性化された（ＣＤ６９発現）ＮＫ細胞における強い増加を引き起こした。
定義
本明細書において使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味することがある。請求項において使用される場合、語「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と組み合わせて使用される場合、語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つより多くを意味することがある。
「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）が使用される場合、これは、適宜、「から本質的になる」、または適宜、「からなる」により置き換えられ得る。
本明細書において使用される場合、用語「抗原結合性ドメイン」または「ＡＢＤ」は、エピトープに免疫特異的に結合する能力を有する３次元構造を含むドメインを指す。そのため、１つの実施形態において、前記ドメインは、超可変領域、適宜抗体鎖のＶＨおよび／またはＶＬドメイン、適宜少なくともＶＨドメインを含むことができる。別の実施形態において、結合性ドメインは抗体鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでもよい。別の実施形態において、結合性ドメインは、非免疫グロブリンスキャフォールドからのポリペプチドドメインを含んでもよい。
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味において使用されており、全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、ならびに、所望される生物学的活性を呈する限り、抗体断片および誘導体を特に含む。抗体の産生に関連する様々な技術は、例えば、Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)において提供されている。「抗体断片」は、全長抗体の部分、例えばその抗原結合性または可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（典型的には抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメイン）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片（典型的にはＶＨおよびＣＨ１ドメイン）、ならびにｄＡｂ（典型的にはＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、ならびにＶ－ＮＡＲドメイン；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ならびにカッパボディ（例えば、Ill et al., Protein Eng 1997;10: 949-57を参照）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；ならびに抗体断片から形成される多特異性抗体断片、ならびに単離されたＣＤＲまたは抗原結合性残基もしくはポリペプチドが会合または連結して一緒になって機能的抗体断片を形成することができる１つまたは複数の単離されたＣＤＲまたは機能的なパラトープを含む。様々なタイプの抗体断片が、例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23, 1126-1136；国際公開第２００５０４０２１９号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号明細書および同第２００２０１６１２０１号明細書において記載または総説されている。
用語「超可変領域」は、本明細書において使用される場合、抗原結合性の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基［例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）および８９～９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）；Kabat et al. 1991］ならびに／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基［例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）および９１～９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917］を一般に含む。典型的には、この領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al.、上掲において記載される方法により行われる。本明細書における「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基番号付け」および「Ｋａｂａｔに従って」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのためのこの番号付けシステムを指す。Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用して、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮、またはそれへの挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含有することがある。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に挿入された単一のアミノ酸（Ｋａｂａｔに従って残基５２ａ）ならびに重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えばＫａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準的」なＫａｂａｔ番号付けされた配列との抗体の配列の相同性の領域におけるアライメントにより所与の抗体について決定されてもよい。
本明細書において使用されている「フレームワーク」または「ＦＲ」残基により、ＣＤＲとして定義される領域を除外した抗体可変ドメインの領域が意味される。各々の抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲにより分離された連続する領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）にさらに分けられ得る。
本明細書において定義されている「定常領域」により、軽鎖または重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の１つによりコードされる抗体由来定常領域が意味される。
本明細書において使用されている「定常軽鎖」または「軽鎖定常領域」または「ＣＬ」により、カッパ（Ｃκ）またはラムダ（Ｃλ）軽鎖によりコードされる抗体の領域が意味される。定常軽鎖は、単一のドメインを典型的には含み、本明細書において定義されるように、Ｃκ、またはＣλの１０８～２１４位を指し、番号付けはＥＵインデックスによるものである（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda）。
本明細書において使用されている「定常重鎖」または「重鎖定常領域」により、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロン遺伝子によりコードされて、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する抗体の領域が意味される。全長ＩｇＧ抗体について、本明細書において定義されている定常重鎖は、ＣＨ１ドメインのＮ末端からＣＨ３ドメインのＣ末端を指し、そのため１１８～４４７位を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものである。
本明細書において使用されている「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」により、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含む単位が意味される。用語Ｆａｂは、ＶＬ－ＣＬ部分と会合するＶＨ－ＣＨ１部分を含む単位の他に、軽鎖ドメインと重鎖ドメインとの間のクロスオーバーまたはインターチェンジがあるクロスオーバーＦａｂ構造を含む。例えば、Ｆａｂは、ＶＬ－ＣＨ１単位と会合するＶＨ－ＣＬ単位を有してもよい。Ｆａｂは、単離状態のこの領域、またはタンパク質、多特異性タンパク質もしくはＡＢＤ、もしくは本明細書において概説されている任意の他の実施形態の文脈におけるこの領域を指すことがある。
本明細書において使用されている「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」により、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片であって、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在するものが意味される。一般に、Ｆｖポリペプチドは、抗原結合のための所望される構造をｓｃＦｖが形成することを可能にするＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖを産生する方法は当技術分野において周知である。ｓｃＦｖを産生する方法の総説には、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照。
本明細書において使用されている「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖ領域」により、単一の抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含むポリペプチドが意味される。
本明細書において使用されている「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」により、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除外した抗体の定常領域を含むポリペプチドが意味される。そのため、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのＮ末端にある柔軟性ヒンジを指す。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、ＦｃはＪ鎖を含んでもよい。ＩｇＧについて、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣγ２（ＣＨ２）およびＣγ３（ＣＨ３）ならびに適宜Ｃγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、そのカルボキシル末端に対して残基Ｃ２２６、Ｐ２３０またはＡ２３１を含むように通常は定義され、番号付けはＥＵインデックスによるものである。Ｆｃは、単離状態のこの領域、または、以下に記載されるように、Ｆｃポリペプチドの文脈におけるこの領域を指すことがある。本明細書において使用されている「Ｆｃポリペプチド」または「Ｆｃ由来ポリペプチド」により、Ｆｃ領域の全体または部分を含むポリペプチドが意味される。本明細書におけるＦｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合物およびＦｃ断片を含むがそれに限定されない。また、本発明によるＦｃ領域は、Ｆｃ関連エフェクター機能を変更する（増強するかまたは減少させる）少なくとも１つの改変を含有する変異型を含む。また、本発明によるＦｃ領域は、例えば、異なるアイソタイプまたは種の抗体に由来する、異なるＦｃ領域の異なる部分またはドメインを含むキメラＦｃ領域を含む。
本明細書において使用されている「可変領域」により、軽鎖（κおよびλを含む）ならびに重鎖免疫グロブリン遺伝子座位をそれぞれ構成するＶＬ［Ｖκ（Ｖκ）およびＶλを含む］ならびに／またはＶＨ遺伝子のいずれかにより実質的にコードされる１つまたは複数のＩｇドメインを含む抗体の領域が意味される。軽鎖または重鎖可変領域（ＶＬまたはＶＨ）は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」として参照される３つの超可変領域を差し挟まれた「フレームワーク」または「ＦＲ」領域からなる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、例えばＫａｂａｔ［"Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983)を参照］、およびＣｈｏｔｈｉａにおけるように、精密に定義されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成軽鎖および重鎖の組み合わせられたフレームワーク領域は、抗原に対する結合の主な原因となるＣＤＲを位置付けおよびアライメントするために役立つ。
用語「～に特異的に結合する」は、抗体またはポリペプチドが、単離された標的細胞の表面上に存在する組換え形態のタンパク質、その中のエピトープ、またはネイティブなタンパク質のいずれかを使用して評価された場合に、結合パートナー、例えばＮＫｐ４６に、好ましくは競合結合アッセイにおいて、結合できることを意味する。競合結合アッセイおよび特異的結合を決定するための他の方法は、以下にさらに記載されており、当技術分野において周知である。
抗体またはポリペプチドが特定の多特異性タンパク質または特定のモノクローナル抗体（例えば、抗ＮＫｐ４６一特異性抗体または多特異性タンパク質の文脈におけるＮＫｐ４６－１、－２、－４、－６または－９）と「競合する」と言われる場合、それは、抗体またはポリペプチドが、組換え標的（例えばＮＫｐ４６）分子または表面発現される標的（例えばＮＫｐ４６）分子のいずれかを使用する結合アッセイにおいて特定の多特異性タンパク質またはモノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が、結合アッセイにおいてＮＫｐ４６ポリペプチドまたはＮＫｐ４６発現細胞に対するＮＫｐ４６－１、－２、－４、－６または－９の結合性を低減させる場合、抗体は、それぞれＮＫｐ４６－１、－２、－４、－６または－９と「競合する」と言われる。
用語「親和性」は、本明細書において使用される場合、エピトープに対する抗体またはタンパク質の結合の強さを意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］（式中、［Ａｂ－Ａｇ］は抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合の抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は未結合の抗原のモル濃度である）として定義される解離定数ＫＤにより与えられる。親和性定数ＫＡは１／ＫＤにより定義される。タンパク質の親和性を決定する好ましい方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、およびMuller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)（これらの参考文献は参照により本明細書に全体が組み込まれる）において見出され得る。タンパク質の親和性を決定するための当技術分野において周知の１つの好ましいおよび標準的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング［例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析デバイスを用いる分析によるもの］の使用である。
本発明の文脈内において、「決定因子」は、ポリペプチド上の相互作用または結合の部位を呼称する。
用語「エピトープ」は、抗原決定因子を指し、抗体またはタンパク質が結合する抗原上の区画または領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接的に関与するアミノ酸残基の他に、特有の抗原結合性抗体またはペプチドにより有効に遮断されるアミノ酸残基、すなわち、抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。それは、例えば、抗体または受容体と組み合わせられ得る複合体抗原分子上の最も単純な形態または最小の構造的区画である。エピトープは、リニアまたはコンフォメーショナル／構造的であり得る。用語「リニアエピトープ」は、アミノ酸の直鎖状配列（一次構造）上で連続するアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。用語「コンフォメーショナルまたは構造的エピトープ」は、すべてが連続しているわけではなく、そのため、分子のフォールディング（二次、三次および／または四次構造）により互いに近接状態とされるアミノ酸の直鎖状配列の分離された部分を表すアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。コンフォメーショナルエピトープは３次元構造に依存している。用語「コンフォメーショナル」は、したがって多くの場合に、「構造的」（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）と交換可能に使用される。エピトープは、数ある中でも、アラニンスキャニング、ファージディスプレイ、Ｘ線結晶学、アレイベースオリゴ－ペプチドスキャニングまたはｐｅｐｓｃａｎ分析、部位特異的突然変異誘発、ハイスループット突然変異誘発マッピング、Ｈ／Ｄ－Ｅｘ質量分析、相同性モデリング、ドッキング、水素－重水素交換を含むがそれに限定されない当技術分野において公知の異なる方法により同定され得る。［例えば、Tong et al., Methods and Protocols for prediction of immunogenic epitopes", Briefings in Bioinformatics 8(2):96-108; Gershoni, Jonathan M; Roitburd-Berman, Anna; Siman-Tov, Dror D; Tarnovitski Freund, Natalia; Weiss, Yael (2007). "Epitope Mapping". BioDrugs 21 (3): 145-56;およびFlanagan, Nina (May 15, 2011); "Mapping Epitopes with H/D-Ex Mass Spec: ExSAR Expands Repertoire of Technology Platform Beyond Protein Characterization", Genetic Engineering & Biotechnology News 31 (10)を参照］。
「価」（ｖａｌｅｎｔ）または「価数」（ｖａｌｅｎｃｙ）は、抗原結合性タンパク質中の決定された数の抗原結合性部分の存在を表す。天然ＩｇＧは２つの抗原結合性部分を有し、二価である。特定の抗原のための１つの結合性部分を有する分子は、その抗原について一価である。
本明細書において「アミノ酸改変」により、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失が意味される。本明細書におけるアミノ酸改変の例は置換である。本明細書において「アミノ酸改変」により、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失が意味される。本明細書において「アミノ酸置換」または「置換」により、タンパク質配列中の所与の位置にけるアミノ酸の、別のアミノ酸での置き換えが意味される。例えば、置換Ｙ５０Ｗは、５０位におけるチロシンがトリプトファンで置き換えられている、親ポリペプチドの変異型を指す。アミノ酸置換は、野生型タンパク質中に存在する残基／残基の位置／突然変異体タンパク質中に存在する残基を列記することにより指し示される。ポリペプチドの「変異型」は、参照ポリペプチド、典型的にはネイティブなまたは「親」ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異型は、ネイティブなアミノ酸配列内のある特定の位置において１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を有してもよい。
「保存的」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似した物理化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において公知であり、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
用語「同一性」または「同一の」は、２つまたはより多くのポリペプチドの配列の間の関係性において使用される場合、２つまたはより多くのアミノ酸残基のストリングの間のマッチの数により決定される場合の、ポリペプチドの間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により対処されるギャップアライメント（存在する場合）と共に２つまたはより多くの配列のうちのより小さいものの間の同一のマッチのパーセントを測定する。関連するポリペプチドの同一性は、公知の方法により容易に算出され得る。そのような方法は、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991;およびCarillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)において記載されているものを含むが、それに限定されない。
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列の間の最大のマッチを与えるように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムにおいて記載されている。２つの配列の間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムの方法は、ＧＡＰ［Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.］、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ［Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)］を含む、ＧＣＧプログラムパッケージを含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他のソース（BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al.、上掲）から公開されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
「単離された」分子は、それが属する分子のクラスに関して見出される組成物中の主な種である分子である（すなわち、分子は、組成物の分子のタイプの少なくとも約５０％を構成し、典型的には、組成物中の分子、例えば、ペプチドの種の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはより多くを構成する）。一般的に、ポリペプチドの組成物は、組成物中のすべての存在するペプチド種の文脈において、または少なくとも提案される使用の文脈における実質的に活性のペプチド種に関して、ポリペプチドについて９８％、９８％、または９９％の均質性を呈する。
本明細書における文脈において、「処置」または「処置する」は、文脈に矛盾しない限り、疾患または障害の１つまたは複数の症状または臨床的に関連する所見を予防するか、軽減するか、管理するか、治癒するか、または低減させることを指す。例えば、疾患または障害の症状または臨床的に関連する所見が同定されていない患者の「処置」は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅまたはｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）療法である一方、疾患または障害の症状または臨床的に関連する所見が同定されている患者の「処置」は予防的療法を一般に構成しない。
本明細書において使用される場合、語句「ＮＫ細胞」は、非従来的な免疫に関与するリンパ球の亜集団を指す。ＮＫ細胞は、ある特定の特徴および生物学的特性、例えばヒトＮＫ細胞についてのＣＤ５６および／またはＮＫｐ４６を含む特異的な表面抗原の発現、細胞表面上のアルファ／ベータまたはガンマ／デルタＴＣＲ複合体の非存在、特異的細胞溶解機構の活性化により「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現しない細胞に結合し、それを殺傷する能力、腫瘍細胞またはＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する他の疾患細胞を殺傷する能力、ならびに免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を理由として同定され得る。これらの特徴および活性のいずれも、当技術分野において周知の方法を使用してＮＫ細胞を同定するために使用され得る。ＮＫ細胞の任意の亜集団もまた用語ＮＫ細胞により包含される。本明細書の文脈において、「活性」ＮＫ細胞は、標的細胞を溶解するかまたは他の細胞の免疫機能を増強する能力を有するＮＫ細胞を含む、生物学的に活性のＮＫ細胞を呼称する。ＮＫ細胞は、当技術分野において公知の様々な技術、例えば血液試料からの単離、サイタフェレーシス、組織または細胞収集などにより得られ得る。ＮＫ細胞を伴うアッセイのための有用なプロトコールは、Natural Killer Cells Protocols (edited by Campbell KS and Colonna M). Humana Press. pp. 219-238 (2000)において見出され得る。
本明細書において使用される場合、ＮＫｐ４６において「アゴニスト」活性を有する剤は、「ＮＫｐ４６シグナル伝達」を引き起こすかまたは増加させることができる剤である。「ＮＫｐ４６シグナル伝達」は、細胞内シグナル伝達経路を活性化させるかまたは伝達するＮＫｐ４６ポリペプチドの能力を指す。ＮＫｐ４６シグナル伝達活性における変化は、例えば、例えばシグナル伝達成分のリン酸化をモニターすることにより、ＮＫｐ４６シグナル伝達経路における変化を測定するために設計されたアッセイ、ある特定のシグナル伝達成分の、他のタンパク質もしくは細胞内構造物との会合を測定するか、もしくは成分、例えばキナーゼの生化学的活性におけるアッセイ、もしくはＮＫｐ４６感受性プロモーターおよびエンハンサーの制御下のレポーター遺伝子の発現を測定するために設計されたアッセイにより、または間接的にＮＫｐ４６ポリペプチドにより媒介される下流の効果（例えばＮＫ細胞における特異的細胞溶解機構の活性化）により測定され得る。レポーター遺伝子は、天然に存在する遺伝子（例えばサイトカイン産生をモニターする）であり得るか、または細胞に人工的に導入された遺伝子であり得る。他の遺伝子をそのような調節エレメントの制御に置くことができ、該遺伝子はそのため、ＮＫｐ４６シグナル伝達のレベルをレポートするために役立つ。
「ＮＫｐ４６」は、Ｎｃｒ１遺伝子により、またはそのような遺伝子から調製されたｃＤＮＡによりコードされるタンパク質またはポリペプチドを指す。任意の天然に存在するアイソフォーム、アレル、オルソログまたは変異型は用語ＮＫｐ４６ポリペプチドにより包含される（例えば、配列番号１、またはその少なくとも２０、３０、５０、１００もしくは２００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して９０％、９５％、９８％または９９％同一のＮＫｐ４６ポリペプチド）。ヒトＮＫｐ４６の３０４アミノ酸残基配列（アイソフォームａ）は以下に示される：
MSSTLPALLC VGLCLSQRIS AQQQTLPKPF IWAEPHFMVP KEKQVTICCQ GNYGAVEYQL HFEGSLFAVD RPKPPERINK VKFYIPDMNS RMAGQYSCIY RVGELWSEPS NLLDLVVTEM YDTPTLSVHP GPEVISGEKV TFYCRLDTAT SMFLLLKEGR SSHVQRGYGK VQAEFPLGPV TTAHRGTYRC FGSYNNHAWS FPSEPVKLLV TGDIENTSLA PEDPTFPADT WGTYLLTTET GLQKDHALWD HTAQNLLRMG LAFLVLVALV WFLVEDWLSR KRTRERASRA STWEGRRRLN TQTL（配列番号１）
配列番号１はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００４８２０に対応し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ヒトＮＫｐ４６ ｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４８２９において記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ポリペプチドの産生
本明細書において記載されるタンパク質は、好都合には、周知の免疫グロブリン由来ドメイン、特に重鎖および軽鎖可変ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２およびＣＨ３定常ドメイン、ならびに野生型または変異型サイトカインポリペプチドを使用して構成および産生され得る。共通のポリペプチド鎖上に置かれたドメインは、関係する特定のドメインに依存して、直接的またはリンカーを介した接続のいずれかで互いに融合され得る。免疫グロブリン由来ドメインは、好ましくは、ヒト化されているか、またはヒト起源であり、それにより、ヒトに投与された場合の免疫原性のリスクの減少が提供される。本明細書において示されるように、最小の非免疫グロブリン連結アミノ酸配列（例えば４または５個以下のドメインリンカー、一部の場合には、１または２個もの少なさのドメインリンカー、および短い長さのドメインリンカーの使用）を使用し、それにより免疫原性のリスクをさらに低減する有利なタンパク質フォーマットが記載される。
免疫グロブリン可変ドメインは抗体（免疫グロブリン鎖）に一般的に由来し、例えば、２つのポリペプチド鎖上に見出される会合したＶＬおよびＶＨドメイン、または単鎖抗原結合性ドメイン、例えばｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｄＡｂ、Ｖ－ＮＡＲドメインもしくはＶＨＨドメインの形態である。対合および／またはフォールディングのための実質的なさらなる要求なしにＦａｂまたはｓｃＦｖからの広範囲の可変領域の使用を直接的に可能にする本明細書において開示されるある特定の有利なタンパク質フォーマットにおいて、抗原結合性ドメイン（例えば、ＡＢＤ１およびＡＢＤ２）はまた、ＦａｂまたはｓｃＦｖとして抗体から容易に誘導され得る。
用語「抗原結合性タンパク質」は、抗原結合特性を有する免疫グロブリン誘導体を指すために使用され得る。結合性タンパク質は、標的抗原に結合する能力を有する免疫学的に機能的な免疫グロブリン部分を含む。免疫学的に機能的な免疫グロブリン部分は、免疫グロブリン、もしくはその部分、免疫グロブリン部分に由来する融合ペプチドまたは抗原結合性部位を形成する免疫グロブリン部分を組み合わせたコンジュゲートを含んでもよい。各々の抗原結合性部分は、抗原結合性部分の由来となる免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の少なくとも必然的に１、２または３つのＣＤＲを含む。一部の態様において、抗原結合性タンパク質は単一のポリペプチド鎖（単量体）からなることができる。他の実施形態において、抗原結合性タンパク質は少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。そのような抗原結合性タンパク質は、多量体、例えば、二量体、三量体または四量体である。抗原結合性タンパク質の例は、それらの抗原についての特異性および親和性を保持する抗体断片、抗体誘導体または抗体様結合性タンパク質を含む。
典型的には、抗体は、そのための抗体（例えばヒトポリペプチド）を得ることが所望されるポリペプチド、またはその断片もしくは誘導体、典型的には免疫原性断片を含む免疫原を用いる、非ヒト動物、例えば、マウス、ラット、モルモットまたはウサギの免疫化により最初に得られる。抗原を用いて非ヒト哺乳動物を免疫化する工程は、マウスにおいて抗体の産生を刺激するための当技術分野において周知の任意の方式において実行されてもよい［例えば、E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照；その全開示は参照により本明細書に組み込まれる］。ヒト抗体はまた、免疫化のために、ヒト抗体レパートリーを発現するように操作されているトランスジェニック動物を使用することにより［Jakobovitz et al. Nature 362 (1993) 255］、またはファージディスプレイ法を使用する抗体レパートリーの選択により産生されてもよい。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）が免疫化のために使用され得る。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、その免疫グロブリン遺伝子が機能的なヒト免疫グロブリン遺伝子により置き換えられているマウス宿主である。そのため、このマウスによりまたはこのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマにおいて産生された抗体は既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは米国特許第６，１６２，９６３号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において記載されている。抗体はまた、例えば［Ward et al. Nature, 341 (1989) p. 544；その全開示は参照により本明細書に組み込まれる］において開示されるように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択により産生されてもよい。ファージディスプレイ技術［McCafferty et al (1990) Nature 348:552-553］は、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから抗体を産生するために使用され得る。例えば、Griffith et al (1993) EMBO J. 12:725- 734；米国特許第５，５６５，３３２号明細書；米国特許第５，５７３，９０５号明細書；米国特許第５，５６７，６１０号明細書；および米国特許第５，２２９，２７５号明細書を参照。コンビナトリアルライブラリーがヒト起源の可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーを含む場合、コンビナトリアルライブラリーからの選択はヒト抗体をもたらす。
任意の実施形態において、抗原結合性ドメインは、ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、元々の抗体の所望される特異性、親和性、および能力を維持しながら元々の抗体（親またはドナー抗体、例えばマウスまたはラット抗体）のＣＤＲからの残基により置き換えられているヒト化抗体から得られ得る。非ヒト生物を起源とする核酸によりその一部または全体がコードされる親抗体のＣＤＲは、ヒト抗体可変領域のベータシートフレームワーク中に全体的にまたは部分的にグラフトされて、グラフトされたＣＤＲによりその特異性が決定される抗体が作出される。そのような抗体の作出は、例えば、国際公開第９２／１１０１８号パンフレット、Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536において記載されている。抗原結合性ドメインは、そのため、非ヒト超可変領域またはＣＤＲおよびヒトフレームワーク領域配列（適宜、復帰突然変異を有する）を有することができる。
追加的に、広範囲の抗体が、ＤＮＡおよび／もしくはアミノ酸配列を含む、科学および特許文献において、または商用供給業者から利用可能である。抗体は、典型的には、予め決定された抗原に対して方向付けられている。抗体の例は、排除されるべき標的細胞、例えば増殖性細胞または疾患病理に寄与する細胞により発現される抗原を認識する抗体を含む。例は、腫瘍抗原、微小生物（例えば細菌もしくは寄生生物）抗原またはウイルス抗原を認識する抗体を含む。
代替的に、本明細書において記載されるタンパク質において使用される抗原結合性ドメインは、様々な非免疫グロブリンスキャフォールド、例えば、スタフィロコッカス（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡのＺ－ドメインに基づくアフィボディ、操作されたＫｕｎｉｔｚドメイン、ヒトフィブロネクチンＩＩＩの１０番目の細胞外ドメインに基づくモノボディまたはアドネクチン、リポカリンから誘導されるアンチカリン、ＤＡＲＰｉｎｓ（登録商標）（設計されたアンキリンリピートドメイン；ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎｓ）、多量体化されたＬＤＬＲ－Ａモジュール、アビマーまたはシステインリッチノッチンペプチドのいずれかから容易に誘導され得る。例えば、Gebauer and Skerra (2009) Current Opinion in Chemical Biology 13:245-255（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照。
本明細書においてさらに例示されるように、抗原結合性ドメインは好都合にはＶＨおよびＶＬ（ＶＨ／ＶＬペア）を含むことができる。一部の実施形態において、ＶＨ／ＶＬペアは、ＣＨ１およびＣＬドメイン（ＣＨ１／ＣＬペア）をさらに含むＦａｂ構造中に組み込まれ得る。ＶＨ／ＶＬペアは、互いと会合して抗原結合性ドメインを形成している１つのＶＨおよび１つのＶＬドメインを指す。ＣＨ１／ＣＬペアは、共有結合性または非共有結合性相互作用、好ましくは非共有結合性相互作用により互いに結合し、そのためヘテロ二量体（例えば、１つまたは複数のさらなるポリペプチド鎖を含むことができるタンパク質、例えばヘテロ三量体、ヘテロ四量体、ヘテロ五量体内のもの）を形成している１つのＣＨ１および１つのＣＬドメインを指す。ペアを形成する定常鎖ドメインは、同じポリペプチド鎖上に、または異なるポリペプチド鎖上に任意の好適な組合せで存在することができる。
ＮＫｐ４６に結合する例示的なＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬドメインは、本明細書において提供される抗ＮＫｐ４６抗体から誘導され得るか、（セクション「ＮＫｐ４６可変領域およびＣＤＲ配列」を参照）、またはＰＣＴ国際公開第２０１６／２０７２７８号パンフレットおよび国際公開第２０１７／１１４６９４号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）のＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬドメインのいずれかから選択され得る。可変領域は、直接的に使用され得るか、またはＮＫｐ４６抗体からの超可変もしくはＣＤＲ領域を選択し、かつそれらを所望されるＶＬもしくはＶＨフレームワーク、例えばヒトフレームワーク中に置くことにより改変され得る。ＮＫｐ４６に結合する抗原結合性ドメインはまた、抗体を生成する方法を使用してデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）で誘導され得る。抗体は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合性について試験され得る。本明細書における任意の実施形態の１つの態様において、ＮＫｐ４６に結合するポリペプチド（例えば多特異性タンパク質）は、細胞の表面上に発現されるＮＫｐ４６、例えばＮＫ細胞により発現されるネイティブなＮＫｐ４６に結合する能力を有する。
対象とする抗原に結合する抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）は、所望される予め決定された対象とする抗原（例えばＮＫｐ４６以外の抗原）に基づいて選択可能であり、例えば、がん抗原、例えば腫瘍細胞上に、および／もしくは、腫瘍促進効果を媒介する能力を有する免疫細胞、例えば単球もしくはマクロファージ、適宜、サプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、もしくは骨髄由来抑制細胞上に存在する抗原（がんの処置のため）；細菌もしくはウイルス抗原（感染性疾患の処置のため）；または炎症促進性免疫細胞、例えばＴ細胞、好中球、マクロファージ上などに存在する抗原（炎症性および／もしくは自己免疫障害の処置のため）を含んでもよい。
本明細書において使用される場合、用語「細菌抗原」は、インタクトな、弱毒化されたもしくは殺傷された細菌、任意の構造的なもしくは機能的な細菌タンパク質もしくは炭水化物、または抗原性であるために十分な長さ（典型的には約８アミノ酸もしくはより長い）の細菌タンパク質の任意のペプチド部分を含むが、それに限定されない。例はグラム陽性細菌抗原およびグラム陰性細菌抗原を含む。一部の実施形態において、細菌抗原は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、特にヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）；ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、特にボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種、特にレジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）；マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）種、特にＭ．ツベルクローシス（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アビウム（Ｍ． ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラレ（Ｍ． ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシー（Ｍ． ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ゴルドネ（Ｍ． ｇｏｒｄｏｎａｅ）；スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特にスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）；ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、特にＮ．ゴノレエ（Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、Ｎ．メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、特にリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、特にＳ．ピオゲネス（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アガラクチエ（Ｓ． ａｇａｌａｃｔｉａｅ）；Ｓ．フェカリス（Ｓ． ｆａｅｃａｌｉｓ）；Ｓ．ボビス（Ｓ． ｂｏｖｉｓ）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；嫌気性ストレプトコッカス種；病原性カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種；ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、特にヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特にバシラス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；エリシペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）種、特にエリシペロトリックス・ルシオパチエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、特にＣ．ペルフリンゲンス（Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ｃ．テタニ（Ｃ． ｔｅｔａｎｉ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、特にエンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、特にクレブシエラ１Ｓニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ １Ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、特にパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種；フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）；ストレプトバシラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特にストレプトバシラス・モニリホルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）；トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、特にトレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）；レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）；病原性エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種；およびアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、特にアクチノマイセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉ）からなる群から選択される細菌に由来する。
本明細書において使用される場合、用語「ウイルス抗原」は、インタクトな、弱毒化されたもしくは殺傷されたウイルス全体、任意の構造的なもしくは機能的なウイルスタンパク質、または抗原性であるために十分な長さ（典型的には約８アミノ酸もしくはより長い）のウイルスタンパク質の任意のペプチド部分を含むが、それに限定されない。ウイルス抗原の供給源は、ファミリー：レトロウイルス科［例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ－１（ＨＴＬＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ－ＩＩＩ／ＬＡＶとしても参照される）、またはＨＩＶ－ＩＩＩ；および他の分離株、例えばＨＩＶ－ＬＰ］；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水胞性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンタンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ボルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；ならびにイリドウイルス科（例えば、アフリカ豚熱ウイルス）；ならびに未分類のウイルス［例えば、デルタ肝炎因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥性サテライトであると考えられる）、Ｃ型肝炎；ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス］からのウイルスを含むが、それに限定されない。代替的に、ウイルス抗原は、組換えにより産生されてもよい。
本明細書において使用される場合、用語「がん抗原」および「腫瘍抗原」は、交換可能に使用され、がん細胞により差次的に発現されるか、または腫瘍促進効果（例えば免疫抑制効果）を有する非腫瘍細胞（例えば免疫細胞）により発現され、それにより、がん細胞を標的化するために活用され得る抗原（ＮＫ細胞上に発現されるサイトカイン受容体、ＮＫｐ４６、およびＣＤ１６以外）を指す。がん抗原は、腫瘍特異的であるらしい免疫応答を潜在的に刺激することができる抗原であり得る。これらの抗原の一部は、正常細胞によりコードされるが、必ずしも発現されないか、またはより低いレベルもしくはより低い頻度で発現される。これらの抗原は、正常細胞において通常はサイレントな（すなわち、発現されない）抗原、分化のある特定のステージにおいてのみ発現される抗原、ならびに一時的に発現される抗原、例えば胚性および胎児抗原として特徴付けられ得る。他のがん抗原は、突然変異体細胞遺伝子、例えばがん遺伝子（例えば、活性化されたｒａｓがん遺伝子）、抑制因子遺伝子（例えば、突然変異体ｐ５３）、内部欠失または染色体転座の結果としてもたらされる融合タンパク質によりコードされる。さらに他のがん抗原は、ウイルス遺伝子、例えばＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルス上に保有されるものによりコードされ得る。さらに他のがん抗原は、腫瘍促進効果に寄与するかまたはそれを媒介する能力を有する免疫細胞、例えば免疫逃避に寄与する細胞、単球またはマクロファージ、適宜、サプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、または骨髄由来抑制細胞上に発現され得る。
がん抗原は、通常は、過剰発現されるか、もしくは異常な時点において発現される正常細胞表面抗原であるか、または標的化された細胞の集団により発現される。理想的には、標的抗原は、増殖性細胞（例えば、腫瘍細胞）または腫瘍促進性細胞（例えば免疫抑制効果を有する免疫細胞）上にのみ発現されるが、これは実際にはほとんど観察されない。結果として、標的抗原は、多くの場合に、増殖性／疾患組織と健常組織との間の差次的発現に基づいて選択される。がん抗原の例は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｃｒｙｐｔｏ、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４７、糖タンパク質ＮＭＢ、ＣａｎＡｇ、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ）、Ｓｉｇｌｅｃファミリーメンバー、例えばＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２）またはＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ３）、ＣＤ７９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＰＳＣＡ、Ｌ１－ＣＡＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＢＣＭＡ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ７０、Ｅ－セレクチン、ＥｐｈＢ２、メラノトランスフェリン、Ｍｕｄ ６およびＴＭＥＦＦ２を含む。がん抗原の例はまた、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）、例えばサイトカイン受容体、キラー－Ｉｇ様受容体、ＣＤ２８ファミリータンパク質、例えば、キラー－Ｉｇ様受容体３ＤＬ２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＰＤ－Ｌ１を含む。例はまた、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、主要組織適合複合体クラスＩ関連ＡおよびＢ鎖ポリペプチド（ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ）、ＨＬＡ－Ｇ、アデノシンデアミナーゼ結合性タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）－Ｃ０１７－１Ａ／ＧＡ７３３、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、受容体タンパク質チロシンキナーゼ３（ＴＹＲＯ－３）、ネクチン（例えばネクチン－４）、主要組織適合複合体クラスＩ関連ＡおよびＢ鎖ポリペプチド（ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合性タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリーのタンパク質、レチノイン酸早期転写物－１（ＲＡＥＴ１）ファミリーのタンパク質、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ならびにその免疫原性エピトープＣＡＰ－１およびＣＡＰ－２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３－ゼータ鎖、ＭＡＧＥファミリー腫瘍抗原、ＧＡＧＥファミリー腫瘍抗原、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、ＤＲ５、ＲＯＲ１［受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１またはＮＴＲＫＲ１（ＥＣ ２．７．１０．１）としても公知］、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ－１、ＮＡＧ、ＧｎＴ－Ｖ、ＭＵＭ－１、ＣＤＫ４、ＭＵＣファミリー、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、アンジオポエチン－２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－アルファ、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ヒトＥＧＦ様受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＥＲ－３、ＨＥＲ－４または少なくとも１つのＨＥＲサブユニットを含むヘテロ二量体受容体、ガストリン放出ペプチド受容体抗原、Ｍｕｃ－１、ＣＡ１２５、インテグリン受容体、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリン、αＩＩｂβ３－インテグリン、ＰＤＧＦベータ受容体、ＳＶＥ－カドヘリン、ｈＣＧ、ＣＳＦ１Ｒ（腫瘍関連単球およびマクロファージ）、α－フェトプロテイン、Ｅ－カドヘリン、α－カテニン、β－カテニンおよびγ－カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｃｄｃ２７、腺腫様大腸ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ－イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ウイルス産生物、例えばヒトパピローマウイルスタンパク質、ｉｍｐ－１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）－１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２（ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０）、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－１およびＣＴ－７、ならびにｃ－ｅｒｂＢ－２を含むが、これは網羅的であることを意図されない。
適宜、多特異性タンパク質は、間質改変部分（ｓｔｒｏｍａｌ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）、例えば、間質の成分、例えばＥＣＭ成分、例えば、グリコサミノグリカン、例えば、ヒアルロナン（ヒアルロン酸もしくはＨＡとしても公知）、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン、エンタクチン、テネイシン、アグリカンおよびケラチン硫酸；または細胞外タンパク質、例えば、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、およびビトロネクチンを変更または分解する能力を有する部分を除外するか、または要求しないとして特定され得る。例えば、間質改変部分は、ヒアルロナン分解酵素、ヒアルロナン合成を阻害する剤、またはヒアルロン酸に対する抗体分子であり得る。適宜、多特異性タンパク質は、メソテリン標的化部分またはメソテリン結合性ＡＢＤを除外するとして特定され得る。適宜、多特異性タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１標的化部分、ＨＥＲ３標的化部分、ＩＧＦＩＲ標的化部分またはヒアルロニダーゼ１標的化部分、または間質標的化部分もしくはＡＢＤとがん抗原標的化部分との組合せ（ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａ ｓｔｒｏｍａ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ ｏｒ ＡＢＤ ａｎｄ ａ ｃａｎｃｅｒ－ａｎｔｉｇｅｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を除外するとして特定され得る。適宜、がん抗原または対象とする抗原は、ＰＤ－Ｌ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦＩＲまたはヒアルロニダーゼ１以外であるとして特定され得る。
例として、対象とする抗原に結合するＡＢＤがＨＥＲ２ポリペプチドに結合する場合、例示的なＶＨおよびＶＬペアは、抗体トラスツズマブ、ペルツズマブまたはマルゲツキシマブから選択され得る：
トラスツズマブ重鎖可変領域
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR
IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG
GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS
（配列番号１３２）
トラスツズマブ軽鎖可変領域
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS
RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK
（配列番号１３３）
マルゲツキシマブＶＨ：
QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQR PEQGLEWIGRIYPTNGYTRY
DPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW
GQGASVTVSS（配列番号１３４）
マルゲツキシマブＶＬ：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS
ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG
GTKVEIK（配列番号１３５）
別の例において、対象とする抗原に結合するＡＢＤがＣＤ１９ポリペプチドに結合する場合、例示的なＶＨおよびＶＬペアは、ブリナツモマブからのＶＨおよびＶＬペアから選択され得る。
ブリナツモマブＶＨ：
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSS（配列番号１３６）
ブリナツモマブＶＬ：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK（配列番号１３７）
別の例において、対象とする抗原に結合するＡＢＤがＣＤ２０ポリペプチドに結合する場合、例示的なＶＨおよびＶＬペアは、リツキシマブおよびオビヌツズマブからのＶＨおよびＶＬペアから選択され得る：
リツキシマブＶＨ：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA（配列番号１３８）
リツキシマブＶＬ：
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK（配列番号１３９）
オビヌツズマブＶＨ：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSS（配列番号１４０）
オビヌツズマブＶＬ：
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIK（配列番号１４１）
別の例において、対象とする抗原に結合するＡＢＤがＥＧＦＲポリペプチドに結合する場合、例示的なＶＨおよびＶＬペアは、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、デパツキシズマブおよびネシツムマブからのＥＧＦＲ結合性ＶＨおよびＶＬペアから選択され得る：
セツキシマブＶＨ：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA（配列番号１４２）
セツキシマブＶＬ：
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK（配列番号１４３）
パニツムマブＶＨ：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSS（配列番号１４４）
パニツムマブＶＬ：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIK（配列番号１４５）
ニモツズマブＶＨ：
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSS（配列番号１４６）
ニモツズマブＶＬ：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQI（配列番号１４７）
ネシツムマブＶＨ：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS（配列番号１４８）
ネシツムマブＶＬ：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQYGSTPLTFGGGTKAEIK（配列番号１４９）
デパツキシズマブＶＨ：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSISSDFAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGNTRYQPSLKSRITISRDTSKNQFFLKLNSVTAADTATYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSS（配列番号１５０）
デパツキシズマブＶＬ：
DIQMTQSPSSMSVSVGDRVTITCHSSQDINSNIGWLQQKPGKSFKGLIYHGTNLDDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPWTFGGGTKLEIK（配列番号１５１）
別の例において、対象とする抗原に結合するＡＢＤがＢＣＭＡポリペプチドに結合する場合、例示的なＶＨおよびＶＬペアは、ベランタマブ、テクリスタマブ、エルラナタマブまたはパブルタマブからのＢＣＭＡ結合性ＶＨおよびＶＬペアから選択され得る：
ベランタマブＶＨ：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSS（配列番号１５２）
ベランタマブＶＬ：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIK（配列番号１５３）
パブルタマブＶＨ：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNHIIHWVRQAPGQCLEWMGYINPYPGYHAYNEKFQGRATMTSDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYYRDTDVLDYWGQGTLVTVSS（配列番号１５４）
パブルタマブＶＬ：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEPEDIATYYCQQGNTLPWTFGCGTKVEIK（配列番号１５５）
別の例において、対象とする抗原に結合するＡＢＤがＰＤ－Ｌ１ポリペプチドに結合する場合、例示的なＶＨおよびＶＬペアは、米国特許第７，９４３，７４３号明細書（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において示される抗体３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７、および１３Ｇ４からの、または抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａ［アテゾリズマブ、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標）、例えば、米国特許第８，２１７，１４９号明細書を参照、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈからの抗ＰＤ－Ｌ１］、ＭＤＸ－１１０５（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂからの抗ＰＤ－Ｌ１）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ；Ｐｆｉｚｅｒからの抗ＰＤ－Ｌ１）およびＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａからの抗ＰＤ－Ｌ１）のいずれかのＰＤ－Ｌ１結合性ＶＨおよびＶＬペアから選択され得る。
別の例において、対象とする抗原に結合するＡＢＤがＢ７－Ｈ３ポリペプチドに結合する場合、例示的なＶＨおよびＶＬペアは、エノブリツズマブ、ＰＣＴ国際公開第２０１８／１２９０９０号パンフレットにおいて示されるＴＲＬ４５４２、ＰＣＴ国際公開第２０１８／２０９３４６号パンフレットにおいて示される８Ｈ９、またはＰＣＴ国際公開第２０１６／１０６００４号パンフレット、国際公開第２０１７／１８０８１３号パンフレット、国際公開第２０１９／０２４９１１号パンフレット、国際公開第２０１９／２２５７８７号パンフレット、国際公開第２０２０／０６３６７３号パンフレット、国際公開第２０２０／０９４１２０号パンフレット、国際公開第２０２０／１０２７７９号パンフレット、国際公開第２０２０／１４００９４号パンフレットおよび国際公開第２０２０／１５１３８４号パンフレットの抗体のいずれかのＢ７－Ｈ３結合性ＶＨおよびＶＬペアから選択され得る。使用され得る単一ドメインＢ７Ｈ３ ＡＢＤの例は、ＰＣＴ国際公開第２０２０／０４１６２６号パンフレットにおいて記載されているＡｆｆｉｂｏｄｙ（商標）フォーマットならびにＰＣＴ国際公開第２０２０／０７６９７０号パンフレットおよび国際公開第２０２１／２４７７９４号パンフレットの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。上記のＶＨ、ＶＬおよびＣＤＲ配列の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
別の例において、対象とする抗原に結合するＡＢＤがＢ７－Ｈ６ポリペプチドに結合する場合、例示的なＶＨおよびＶＬペアは、米国特許第１１，０３４，７６６号明細書；米国特許第８，８２２，６５２号明細書；米国特許第９，６７６，８５５号明細書；米国特許第１１，０３４，７６６号明細書；米国特許第１１，０３４，７６７号明細書またはＰＣＴ国際公開第２０１３／０３７７２７号パンフレットもしくは国際公開第２０２１／０６４１３７号パンフレットにおいて示されるＢ７－Ｈ６結合性ＶＨおよびＶＬペアから選択され得る。
別の例において、対象とする抗原に結合するＡＢＤがＢ７－Ｈ４ポリペプチドに結合する場合、例示的なＶＨおよびＶＬペアは、アルセバリマブのＢ７－Ｈ４結合性ＶＨおよびＶＬまたは米国特許第１０，６２６，１７６号明細書；米国特許第９，６７６，８５４号明細書；米国特許第９，５７４，０００号明細書；米国特許第１０，１５０，８１３号明細書；米国特許第１０，８１４，０１１号明細書もしくはＰＣＴ国際公開第２００９／０７３５３３号パンフレット、国際公開第２０１９／１６５０７７号パンフレット、国際公開第２０１９／１６９２１２号パンフレット、国際公開第２０１９／１４７６７０号パンフレット、国際公開第２０２１／１５５３０７号パンフレット、国際公開第２０２２／０３９４９０号パンフレット、国際公開第２０１９／１５４３１５号パンフレットもしくは国際公開第２０２１／１８５９３４号パンフレットにおいて示されるＶＨおよびＶＬペアから選択され得る。
１つの実施形態において、対象とする抗原に結合するＡＢＤは、がん抗原、ウイルス抗原、微小生物抗原、または感染した細胞（例えばウイルスに感染した細胞）上もしくは炎症促進性免疫細胞上に存在する抗原に結合する。１つの実施形態において、前記抗原は、腫瘍細胞、および感染した細胞または炎症促進細胞上に選択的に発現または過剰発現されるポリペプチドである。１つの実施形態において、前記抗原は、阻害された場合に、腫瘍細胞、感染した細胞または炎症促進細胞の増殖および／または生存を減少させるポリペプチドである。
ポリペプチド中に組み込まれるＡＢＤは、多特異性ＮＫｐ４６結合性タンパク質中に含められるのに先立って任意の所望される活性について試験することができ、例えばＡＢＤは、その結合パートナーに対する結合性（例えば結合親和性）について好適なフォーマット（例えば従来的なＩｇＧ抗体、ｆａｂ、Ｆａｂ’２またはｓｃＦｖとして）において試験され得る。
抗体に由来するＡＢＤは、最小でも結合活性を付与するために十分な超可変領域を一般に含む。ＡＢＤは、リンカーエレメント（例えばリンカーペプチド、ＣＨ１、ＣκもしくはＣλドメイン、ヒンジ、またはその断片）を含むがそれに限定されない、所望され得るような他のアミノ酸または機能的ドメインを含んでもよいことが理解される。１つの例において、ＡＢＤは、ｓｃＦｖ、ＶＨドメインおよびＶＬドメイン、または単一ドメイン抗体（ナノボディもしくはｄＡｂ）、例えばＶ－ＮＡＲドメインもしくはＶＨＨドメインを含む。ＡＢＤは、互いと会合してＡＢＤを形成するＶＨおよびＶＬドメインから作られ得る。
１つの実施形態において、ＮＫｐ４６および対象とする抗原のためのＡＢＤを形成するＶＨおよびＶＬペアの１つまたは両方は、タンデム可変領域（柔軟性ポリペプチドリンカーにより分離されたＶＨおよびＶＬドメイン）、例えばｓｃＦｖ内にある。
１つの実施形態において、ＮＫｐ４６および対象とする抗原のための１つまたは両方のＡＢＤは、従来的なまたは非従来的なＦａｂ構造を有することができる。Ｆａｂ構造は、ＣＨ１ドメインに連結したＶＨまたはＶＬ可変ドメインおよび相補的なＣκ（またはＣλ）定常ドメインに連結した相補的な可変ドメイン（それぞれＶＬまたはＶＨ）として特徴付け可能であり、ＣＨ１およびＣκ（またはＣλ）定常ドメインは会合（二量体化）する。例えば、Ｆａｂは、第２の鎖上のＶＬ－Ｃκ単位（Ｃκに融合したＶＬ）と二量体化する第１のポリペプチド鎖上のＶＨ－ＣＨ１単位（ＣＨ１に融合したＶＨ）から形成され得る。代替的に、Ｆａｂは、第２の鎖上のＶＬ－ＣＨ１単位（ＣＨ１に融合したＶＬ）と二量体化する第１のポリペプチド鎖上のＶＨ－Ｃκ単位（Ｃκに融合したＶＨ）から形成され得る。
一部の実施形態において、ＮＫｐ４６および対象とする抗原のためのＡＢＤのうちの１つは、可変ドメインがＣＨ１ドメインに連結しており、かつ相補的な可変ドメインが相補的なＣκ（またはＣλ）定常ドメインに連結しているＦａｂ構造を含み、ＣＨ１およびＣκ（またはＣλ）定常ドメインは会合してヘテロ二量体タンパク質を形成しており、かつ他のＡＢＤは、ｓｃＦｖまたは単一結合性ドメイン（例えばＶｈＨドメイン、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標）、ＤＡＲＰｉｎ）を含むかまたはからなる。ｓｃＦｖまたは単一結合性ドメインは、適宜、ＣκもしくはＣλドメインまたはヒンジドメインに融合することができる。
ＣＨ１および／またはＣκドメインは次に、適宜各々の場合においてヒンジ領域（または好適なドメインリンカー）を介して、ＣＨ２ドメインに連結され得る。ＣＨ２ドメインは次にＣＨ３ドメインに連結される。ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、そのため適宜、全長Ｆｃドメイン（適宜、全長Ｆｃドメイン；Ｃ末端リジンを欠いたＣＨ３ドメインを除く）として具体化され得る。
ＣＤ１６ ＡＢＤは、存在する場合に、ヒトＣＤ１６Ａならびに適宜他のＦｃγ受容体、例えば、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４に結合する能力を有するＦｃドメイン二量体として容易に具体化され得る。１つの実施形態において、Ｆｃ部分は、宿主細胞中でのポリペプチドの産生により、またはＮ２９７連結グリコシル化をもたらすプロセス、例えば哺乳動物細胞により得られてもよい。１つの実施形態において、Ｆｃ部分は、ＣＤ１６またはＣＤ１６Ａに対する結合性を増加させる、例えばＣＨ２ドメイン中の、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むヒトガンマアイソタイプ定常領域を含む。
代替的に、ＣＤ１６Ａ ＡＢＤは、存在する場合に、配列番号５０４および５０５のＣＤ１６Ａ結合性ＶＨおよびＶＬペア、もしくは配列番号５０６および５０７のＣＤ１６Ａ結合性ＶＨおよびＶＬペアのアミノ酸配列を含むことができるか、またはその重鎖および軽鎖Ｋａｂａｔ ＣＤＲを含むことができる。いっそうさらに、代替的に、ＣＤ１６Ａ ＡＢＤは、存在する場合に、配列番号５０８において示されるアミノ酸配列を有するＣＤ１６Ａ結合性単一ＶＨドメイン［例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＱ５２４３５；Behar et al., (2008) Protein Eng Des Sel. (1):1-10を参照］として具体化され得る。
サイトカイン受容体抗原結合性ドメインは、サイトカイン、（例えば１型サイトカイン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７もしくはＩＬ－１２サイトカイン、ＩＬ－１８サイトカインまたは１型インターフェロン、例えばＩＦＮ－αもしくはＩＦＮ－β）として容易に具体化され得る。例示的なサイトカイン受容体ＡＢＤおよび改変されたサイトカインは本明細書においてさらに記載されている。
所望される特異性および／または活性を有する適切な抗原結合性ドメインが一旦同定されたら、ＡＢＤの各々（ｅａｃｈ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒ ＡＢＤ）をコードする核酸は、好適な配置において、適切な発現ベクターまたはベクターのセット中に、任意のエレメント、例えばＣＨ１、ＣＫ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはその部分、突然変異体ＩＬ２ポリペプチドならびに適切な宿主中へのトランスフェクションのための任意の他の適宜のエレメントをコードするＤＮＡ（例えばヒンジ由来またはリンカーエレメントをコードするＤＮＡ）と共に、別々に置かれ得る。ＡＢＤは、そのタイプのポリペプチドの機能が生成されて、互いに作動可能に連結した所望されるドメインを有するＦｃポリペプチドが産生されるように、発現ベクター中、または別々のベクター中に配置される。宿主は次に、多特異性ポリペプチドの組換え産生のために使用される。
例えば、ポリペプチド融合産物は、１つのＡＢＤまたはその部分（例えばＶＨ、ＶＬもしくはＶＨ／ＶＬペア）がＣＨ２ドメインのＮ末端に作動可能に連結しており（例えば直接的に、またはＣＨ１、ＣκもしくはＣλ定常領域および／もしくはヒンジ領域を介して）、かつＣＨ２ドメインがそのＣ末端においてＮ末端ＣＨ３ドメインに作動可能に連結しているベクターから産生され得る。別のＡＢＤまたはその部分は、第１のＡＢＤを含むポリペプチドと二量体、例えばヘテロ二量体を形成する第２のポリペプチド鎖上にあり得る。
多特異性ポリペプチドは次に、適切な宿主細胞中で、または任意の好適な合成プロセスにより産生され得る。多特異性ポリペプチドの発現のために選択される宿主細胞は、限定なしに、免疫グロブリンＣＨ２ドメインにおいてタンパク質を装飾するオリゴ糖部分の組成におけるバリエーションを含む、最終組成物にとっての重要な寄与因子である。そのため、本発明の１つの態様は、多特異性ポリペプチドがＦｃＲｎおよびＣＤ１６結合性を保持するように所望される治療用タンパク質を発現する産生細胞の使用および／または開発のための適切な宿主細胞の選択を伴う。宿主細胞は、哺乳動物起源であってもよいか、またはＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ－１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫もしくは植物細胞、もしくはその任意の派生物、不死化もしくは形質転換された細胞から選択されてもよい。宿主細胞は、Ｎ結合型グリコシル化ポリペプチドを産生する能力を有する任意の好適な種または生物、例えばヒトまたは齧歯動物ＩｇＧタイプＮ結合型グリコシル化を産生する能力を有する哺乳動物宿主細胞であってもよい。
タンパク質フォーマット
多量体の多特異性タンパク質、例えばヘテロ二量体、ヘテロ三量体およびヘテロ四量体は、様々なフォーマットに従って産生され得る。異なるポリペプチド鎖上の異なるドメインは会合して多量体タンパク質を形成する（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｎｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｔｈａｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｔｏ ｆｏｒｍ ａ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ．）。よって、広範囲のタンパク質フォーマットが、ＣＤ１６結合性ＡＢＤの存在が所望されるか否かに依存して、ＣＤ１６またはＣＤ１６Ａならびに適宜他のＦｃγ受容体、例えば、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４）に対する追加的な結合性を有するまたは有しない状態で、ヒトＦｃＲｎポリペプチド（新生児Ｆｃ受容体）に結合する能力を有するＦｃドメイン二量体と共に（ａｒｏｕｎｄ）構築され得る。本明細書において示されるように、ＮＫ細胞の細胞傷害性の最大の増強は、活性化ヒトＣＤ１６受容体（ＣＤ１６Ａ）［ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＣＤ１６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＣＤ１６Ａ） ｂｉｎｄｉｎｇ］に対する実質的な結合性を有するＦｃ部分の使用を通じて得ることができ；そのようなＣＤ１６結合性は、本明細書においてさらに記載されるように、好適なＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインの使用を通じて得られ得る。１つの実施形態において、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ１アイソタイプ定常領域に由来する。改変されたＣＨ３ドメインの使用もまた、広範囲のヘテロ多量体タンパク質構造の使用の可能性に寄与する。よって、タンパク質は、ヒトＦｃドメイン単量体（すなわちＣＨ２－ＣＨ３単位）、適宜、優先的なＣＨ３－ＣＨ３ヘテロ二量体化を起こす能力を有するＣＨ３ドメインを含むＦｃドメイン単量体に融合した可変ドメインを各々が含む第１および第２のポリペプチド鎖を含み、第１および第２の鎖はＣＨ３－ＣＨ３二量体化を介して会合し、タンパク質は結果的にＦｃドメイン二量体を含む。各々の鎖の可変ドメインは、同じまたは異なる抗原結合性ドメインの部分であり得る。
多特異性タンパク質は、そのため、好都合には、ＣＨ１ドメイン、ＣＬドメイン、Ｆｃドメインおよびサイトカイン、およびドメインリンカーと共に、ｓｃＦｖまたはＦａｂ構造として配置されたＶＨおよびＶＬペアを使用して構築され得る。好ましくは、タンパク質は、最小の非天然配列、例えば非Ｉｇリンカーの最小の使用、適宜、抗体由来配列ではない５、４、３、２または１つ以下のドメインリンカーを使用し、適宜、ドメインリンカーは、１５、１０または５個以下のアミノ酸残基の長さである。１つの実施形態において、ＣＤ１６ ＡＢＤはＦｃドメイン二量体である。Ｆｃドメイン二量体Ｆｃドメイン二量体（Ｆｃ ｄｏｍａｉｎ ｄｉｍｅｒＦｃ ｄｏｍａｉｎ ｄｉｍｅｒ．）。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質（例えば二量体、三量体、四量体）は、以下：ドメインが、２、３または４つのポリペプチド鎖のいずれかに置くことができること、ＮＫｐ４６ ＡＢＤが、Ｆｃドメインとサイトカイン受容体ＡＢＤとの間に差し挟まれていること［例えば、タンパク質は、Ｃ末端において末端または遠位サイトカイン受容体ＡＢＤを有し、かつトポロジカルなＮ末端において末端または遠位の対象とする抗原（抗原）ＡＢＤを有する］、ＮＫｐ４６ ＡＢＤが、Ｆｃドメイン二量体のポリペプチド鎖のうちの１つにヒンジポリペプチドまたは柔軟性リンカーを介して接続されていること、ならびにサイトカイン受容体に結合するＡＢＤが、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ（例えばＮＫｐ４６ ＡＢＤが２つの鎖上に含有される場合にそのポリペプチド鎖のうちの１つ）に柔軟性リンカー（例えばＧおよびＳ残基を含むリンカー）（「ｎ」は１または２である）を介して接続されていることのいずれかのドメイン配置を含んでもよい：
（抗抗原ＡＢＤ）ｎ－（Ｆｃドメイン二量体）－（ＮＫｐ４６ ＡＢＤ）－（サイトカイン受容体ＡＢＤ）。
サイトカイン受容体ＡＢＤは、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１またはＩＦＮ－αポリペプチドであり得る。Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン二量体（例えばヒトＦｃＲｎおよび／またはＦｃγ受容体に結合する）であるとして特定され得る。１つの実施形態において、対象とする抗原（例えばがん抗原）のＡＢＤおよびＮＫｐ４６ ＡＢＤのうちの１つまたは両方は、タンデム可変領域内に存在する２つの可変領域から形成され、会合して特定のＡＢＤを形成する可変領域は、同じポリペプチド鎖上または異なるポリペプチド鎖上にあり得る。別の実施形態において、対象とする抗原のＡＢＤおよびＮＫｐ４６ ＡＢＤのうちの１つまたは両方はタンデム可変領域を含み、かつ他方はＦａｂ構造を含む。別の実施形態において、対象とする抗原およびＮＫｐ４６ ＡＢＤの両方はＦａｂ構造を含む。別の実施形態において、対象とする抗原およびＮＫｐ４６ ＡＢＤのうちの１つはＦａｂ構造を含み、かつ他方はｓｃＦｖ構造を含む。
ヘテロ二量体およびヘテロ三量体
本開示は、対象とする抗原（一価でまたは二価で）ならびに一価でＮＫｐ４６、ＣＤ１６Ａおよびサイトカイン受容体の各々に結合する多量体多特異性タンパク質を作製する有利なアプローチを提供する。該アプローチは、ＮＫｐ４６ ＡＢＤがＦｃドメインとサイトカインポリペプチドとの間に位置付けられているドメイン構成を容易に可能とする。これらの構成は、ヒトＣＨ１またはＣκ定常ドメイン［Ｖ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位］に融合した少なくとも１つの重鎖または軽鎖可変ドメインを各々が含む本明細書において記載される異なるポリペプチド鎖のアセンブリーを通じて達成可能であり、タンパク質鎖はＣＨ１－Ｃκ二量体化を起こし、かつ非共有結合性相互作用および適宜さらに、それぞれのＣＨ１ドメインとＣκドメインとの間に形成されるジスルフィド結合により互いに結合される。
ＮＫｐ４６結合性ＡＢＤ、対象とする抗原に結合するＡＢＤ、サイトカイン受容体結合性ＡＢＤ（例えばＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチド）およびＦｃドメイン二量体を有する（ｈａｖｅ）例示的なヘテロ二量体またはヘテロ三量体ポリペプチドは、適宜、例えばＣＨ１－Ｃκヘテロ二量体化および／またはＣＨ３－ＣＨ３二量体化により、中心鎖と各々が会合する１つまたは複数の鎖として産生され得る。異なる変異型は、本明細書の実施例において示されるように、産生され得る。
１つの実施形態において、単離または精製されたヘテロ二量体またはヘテロ三量体タンパク質は、少なくとも２または３つのポリペプチド鎖を含み、各々のポリペプチド鎖はＶ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、それにより、鎖は、非共有結合性相互作用により互いに結合しており、かつ適宜、ＣＨ１ドメインとＣκドメインとの間のジスルフィド結合を介してさらに結合しており、いっそうさらに適宜、鎖は、それぞれの可変領域、ＣＨ１およびＣκドメイン、ならびにＦｃ部分のＣＨ３ドメインの間の非共有結合性相互作用により結合している。
１つの例において、タンパク質は、ＣＨ３－ＣＨ３二量体化を起こす能力を有するＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むヒトＦｃドメイン単量体にそのＣ末端において融合しているＣＨ１またはＣκドメイン［Ｖ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位］に融合した可変ドメインを各々が含む第１および第２のポリペプチド鎖を含み、第１および第２の鎖は、ＣＨ１－ＣκおよびＣＨ３－ＣＨ３二量体化を介して会合しており、その結果、タンパク質はＦｃドメイン二量体を含む。各々の鎖の可変ドメインは、同じまたは異なる抗原結合性ドメインの部分であり得る。
可変および定常領域は、各々の鎖がその所望される相補的なパートナー鎖と優先的に会合するように選択および構成され得る。結果としてもたらされる多量体タンパク質は、組換え宿主細胞を使用する従来的な産生方法を使用して信頼性をもってかつ高い生産性で産生され得る。いずれのＶＨまたはＶＬが単位中のＣＨ１およびＣκと会合するべきかの選択は、所望される多量体の形成を駆動するように対合されるべき単位の間の親和性に基づく。結果としてもたらされる多量体は、相補的なＶＨドメインとＶＬドメインとの間の非共有結合性相互作用により、相補的なＣＨ１ドメインとＣκドメインとの間の非共有結合性相互作用により、および適宜さらに、相補的なＣＨ１ドメインとＣκドメインとの間のジスルフィド結合（および適宜さらに、相補的なヒンジドメインの間のジスルフィド結合）により結合する。ＶＨ－ＶＬの会合はＶＨ－ＶＨまたはＶＬ－ＶＬよりも強く、結果的に、本明細書において示されるように、ＶＨまたはＶＬをＣＨ１またはＣκのいずれかの隣に置くことができ、結果としてもたらされるＶ－Ｃ単位は好ましくはそのＶ－Ｃ対応物とパートナー形成する。例えばＶＨ－Ｃκは、ＶＨ－ＣＨ１よりも優先的にＶＬ－ＣＨ１と対合する。追加的に、Ｆｃドメインを含めることにより、好ましい鎖対合はさらに向上され、２つのＦｃ単量体含有鎖はＦｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインの間の非共有結合性相互作用により結合する。Ｆｃ対合と適宜さらに組み合わせられた異なるＶ－Ｃ組合せは、それにより、ドメイン配置中で「Ｃｙｔ」として表される、サイトカイン（例えばＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチド）を含むヘテロ多量体タンパク質を作製するためのツールを提供する。
１つの例において、多特異性タンパク質は、ヒトＦｃドメイン単量体にそのＣ末端において融合したＣＨ１またはＣκドメインに融合した可変ドメイン［Ｖ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位］を各々が含む第１および第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体であり、第１の鎖のＶ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位は、第２の鎖のＶ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位とＣＨ１－Ｃκ二量体化を起こしており、それにより、第１の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ１）およびＦｃドメイン二量体を形成しており、ポリペプチド鎖のうちの１つは、第２の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ２）を形成する抗原結合性ドメインをさらに含み、かつＦｃドメイン二量体はヒトＣＤ１６ポリペプチドに結合し、ＡＢＤ１およびＡＢＤ２のうちの１つはＮＫｐ４６に結合し、かつ他方は対象とする抗原（例えば腫瘍抗原）に結合する。
１つの例において、タンパク質は、ドメイン配置：
［式中、Ｖａ－１、Ｖｂ－１、Ｖａ－２およびＶｂ－２は各々ＶＨドメインまたはＶＬドメインであり、かつＶａ－１およびＶｂ－１のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、その結果、Ｖａ－１およびＶｂ－１は第１の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）を形成しており、Ｖａ－２およびＶｂ－２のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、その結果、Ｖａ－２およびＶｂ－２は第２の抗原結合性ドメインを形成しており、ＡＢＤのうちの１つはＮＫｐ４６に結合し、かつ他方は対象とする抗原に結合する］
を有する。
他の例において、タンパク質は、ヘテロ三量体であり、かつＣＨ１またはＣκドメインに融合した可変ドメイン［Ｖ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位］を各々が含む３つのポリペプチド鎖を含み、第１の（中心）鎖は、２つのＶ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位および該単位の間に差し挟まれたヒトＦｃドメインを含み、第２の鎖は、１つのＶ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位およびヒトＦｃドメイン単量体を含み、かつ第３の鎖は、１つのＶ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位およびサイトカインポリペプチド（Ｃｙｔ）を含み、中心鎖のＶ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位のうちの１つは、第２の鎖のＶ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位とＣＨ１－Ｃκ二量体化を起こしており、それにより第１の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ１）およびＦｃドメイン二量体を形成しており、かつ中心鎖のＶ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位の他方は、第３の鎖のＶ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位とＣＨ１－Ｃκ二量体化を起こしており、それにより第２の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ２）を形成しており、かつＦｃドメインはヒトＣＤ１６ポリペプチドに結合する。１つの実施形態において、Ｆｃドメインは、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）においてＮ結合型グリコシル化を含む。
１つの例において、タンパク質は、ドメイン配置：
を有する。
別の例において、タンパク質は、ドメイン配置：
を有する。
上記のヘテロ三量体タンパク質の１つの特有の例において、Ｆｃドメインとサイトカインとの間に差し挟まれたＦａｂ構造はＮＫｐ４６結合性ＡＢＤである（すなわちＮＫｐ４６結合性ＡＢＤがＦｃドメインとＣ末端サイトカインとの間に差し挟まれている）。第１のポリペプチド中のＦｃドメインは、そのＣ末端においてＶＨドメインのＮ末端にリンカーを介して接続（例えば融合）されている。第３のポリペプチド中の定常ドメイン（それぞれのドメイン配置中のＣＨ１またはＣＫドメイン）は、そのＣ末端においてサイトカインポリペプチドのＮ末端にリンカーを介して接続（例えば融合）されている。ＦｃドメインのＮ末端にある各々の定常ドメイン（それぞれのドメイン配置中のＣＨ１またはＣＫドメイン）は、定常ドメインのＣ末端においてＦｃドメインのＮ末端にヒンジ領域を介して融合している。
適宜、本発明の多特異性タンパク質のいずれも、ヘテロ二量体化を促進するためのアミノ酸改変（例えば置換）を含むＣＨ１、ＣＬまたはＣＨ３ドメインを含んでもよい。例えば、ヘテロ二量体化改変は、立体的反発、電荷ステアリング相互作用、または鎖間ジスルフィド結合形成を多くの場合に伴い、抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインインターフェースは、Ｆｃ二量体インターフェース間の電荷極性の変更を作出するために突然変異しており、その結果、静電気的にマッチしたＦｃ鎖の共発現は好都合な誘引性相互作用をサポートし、それにより、所望されるＦｃヘテロ二量体形成を促進する一方、不都合な反発的電荷相互作用は望ましくないＦｃホモ二量体形成を抑制する。
１つの例において、第１の（中心）ポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖上の相補的な可変ドメインと共に、第１の抗原結合性ドメイン（例えば対象とする抗原に結合するＡＢＤ）を形成する１つの可変ドメイン、およびＦｃドメインを提供する。第１の（中心）ポリペプチド鎖はまた、相補的な可変ドメインと対合して第２の抗原結合性ドメイン（例えばＮＫｐ４６に結合するＡＢＤ）を形成する第２の可変ドメイン（例えば、ＦｃドメインのＣ末端において、第１の可変ドメインからの差し挟まれたＦｃドメインの反対端に置かれる）を提供し；第２の可変ドメインに相補的な可変ドメインは、中心ポリペプチド上に（例えばタンデム可変ドメインコンストラクト、例えばｓｃＦｖ中の第２の可変ドメインに隣接して）置かれ得るか、または別々のポリペプチド鎖上、特に第３のポリペプチド鎖上に置かれ得る。第２の（および存在する場合に第３の）ポリペプチド鎖は、中心ポリペプチド鎖とＣＨ１－Ｃκヘテロ二量体化により会合して、非共有結合性相互作用および適宜、相補的なＣＨ１ドメインとＣκドメインとの間のさらなる鎖間ジスルフィド結合（および適宜、ヒンジ領域の間の鎖間ジスルフィド結合）を形成しており、所望されるＶＨ－ＶＬ対合を優先的に結果としてもたらす好ましい二量体化構成を生じさせるためにＣＨ／ＣＫおよびＶＨ／Ｖκドメインが選択される限り、一次多量体ポリペプチドが形成される。残りの望ましくない対合は、産生の間に最小のままとすることが可能であり、かつ／または精製工程の間に除去される。三量体において、またはポリペプチドが三量体の調製のために構築される場合、天然に存在しないＶＨ－ＣＫまたはＶＫ－ＣＨ１ドメイン配置を含む１つのポリペプチド鎖が一般に存在する。サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－β）は次に、ポリペプチド鎖のうちの１つのＣ末端において置かれ得る。サイトカインはドメインリンカーを介して融合可能であり、本明細書におけるある特定のドメイン配置において示されていないが、任意のドメイン配置は、２つのドメインを分離するドメインリンカーを含むとして特定され得る。例えば、これらの構造において、サイトカインは、第１の（中心）ポリペプチド鎖のＣ末端において、または第３のポリペプチド鎖（そのような第３の鎖が存在する場合）のＣ末端において置かれ得る。
ＮＫｐ４６ ＡＢＤがＦｃドメインとサイトカイン（Ｃｙｔ）との間に差し挟まれており、かつサイトカイン部分が異なるポリペプチド鎖（例えば第２のポリペプチド鎖）上に置かれているヘテロ二量体タンパク質における使用のための中心ポリペプチド鎖のドメイン配置（左から右にＮ末端からＣ末端へ）の例は、各々のＶが可変ドメインである以下のもののいずれかを含む：
Ｖａ－１－（ＣＨ１もしくはＣκ）－Ｆｃドメイン－Ｖａ－２－Ｖｂ－２ （第１／中心鎖）
または
Ｖａ－１－Ｖｂ－１－Ｆｃドメイン－Ｖａ－２－（ＣＨ１もしくはＣκ） （第１／中心鎖）
サイトカイン部分が中心鎖上に置かれているヘテロ二量体タンパク質における使用のための中心ポリペプチド鎖のドメイン配置のさらなる例は以下を含む：
Ｖａ－１－（ＣＨ１もしくはＣκ）－Ｆｃドメイン－Ｖａ－２－Ｖｂ－２－Ｃｙｔ （第１／中心鎖）
または
Ｖａ－１－Ｖｂ－１－Ｆｃドメイン－Ｖａ－２－（ＣＨ１もしくはＣκ）－Ｃｙｔ （第１／中心鎖）
ＮＫｐ４６ ＡＢＤがＦｃドメインとサイトカイン（Ｃｙｔ）との間に差し挟まれており、かつサイトカイン部分が異なるポリペプチド鎖（例えば第２または第３のポリペプチド鎖）上に置かれているヘテロ三量体タンパク質における使用のための中心ポリペプチド鎖のドメイン配置（左から右にＮ末端からＣ末端へ）の例は以下を含むことができる：
Ｖａ－１－（ＣＨ１またはＣκ）ａ－Ｆｃドメイン－Ｖａ－２－（ＣＨ１またはＣκ） （第１／中心鎖）
サイトカイン部分が中心鎖上に置かれているヘテロ三量体タンパク質における使用のための中心ポリペプチド鎖のドメイン配置のさらなる例は以下を含む：
Ｖａ－１－（ＣＨ１またはＣκ）ａ－Ｆｃドメイン－Ｖａ－２－（ＣＨ１またはＣκ）－Ｃｙｔ （第１／中心鎖）
上記の例において、Ｖドメインが鎖上でタンデムに互いに直ちに隣接して配置されている場合、Ｖのうちの１つは軽鎖可変ドメインであり、かつ他のＶは重鎖可変ドメインであり、かつ２つのＶドメインは、柔軟性ポリペプチドリンカーにより分離され、かつ一緒になってｓｃＦｖを形成している。
中心ポリペプチド鎖のさらなる例は以下を含む：
Ｖａ－１－（ＣＨ１もしくはＣＫ）ａ－Ｆｃドメイン－Ｖ２－Ｃｙｔ
または
Ｖ２－Ｆｃドメイン－Ｖａ－１－（ＣＨ１もしくはＣＫ）－Ｃｙｔ
［式中、Ｖ２は単一ドメインＡＢＤ（例えばｄＡｂ、ＶＨＨ、ＤＡＲＰｉｎ）である］。
中心鎖のＦｃドメインは、完全なＦｃドメイン、または第２のポリペプチド鎖のＦｃドメインと二量体Ｆｃを形成した場合に所望される機能性（例えば、ＦｃＲｎに対する結合性、ＣＤ１６に対する結合性、ＣＨ３－ＣＨ３二量体化）を付与するために十分なその部分であってもよい。
第２のポリペプチド鎖は次に、免疫グロブリン可変ドメイン、および、中心ポリペプチド鎖とのＣＨ１－Ｃκヘテロ二量体化を可能にするように選択される、ＣＨ１またはＣκ定常領域、例えば、（ＣＨ１またはＣκ）ｂ単位を含むように構成可能であり；免疫グロブリン可変ドメインは、ＣＨ１またはＣκドメインに隣接する中心鎖の可変ドメインと相補的となるように選択され、それにより、相補的な可変ドメインは、第１の対象とする抗原のための抗原結合性ドメインを形成する。
例えば、ＮＫｐ４６ ＡＢＤがＦｃとサイトカインとの間に差し挟まれているタンパク質における使用のための第２のポリペプチド鎖は、ドメイン配置：
Ｖｂ－１－（ＣＨ１またはＣκ）ｂ－Ｆｃドメイン
を含むことができ、その結果、（ＣＨ１またはＣκ）ｂは中心鎖上の（ＣＨ１またはＣκ）ａと二量体化し、かつＶｂ－１は中心鎖のＶａ－１と共に抗原結合性ドメインを形成する。中心鎖のＶａ－１が軽鎖可変ドメインである場合、Ｖｂ－１は重鎖可変ドメインであり；中心鎖のＶａ－１が重鎖可変ドメインである場合、Ｖｂ－１は軽鎖可変ドメインである。
ヘテロ二量体において、第２の対象とする抗原のための抗原結合性ドメインは次に、ＡＢＤを形成する（例えばｓｃＦｖ単位を形成する）中心鎖上のタンデム可変ドメインとして構成されるＶａ－２およびＶｂ－２から形成され得る。
結果としてもたらされるヘテロ二量体は、例えば、以下の構成を有することができる（図２Ｃ、２Ｄおよび２Ｇおよび２Ｈにおいて示されるフォーマットＴ１３およびＴ１３Ａとして示されるそのようなタンパク質のさらなる例を参照）：
（式中、第１のポリペプチド鎖のＶａ－１および第２のポリペプチド鎖のＶｂ－１のうちの１つは軽鎖可変ドメインであり、かつ他方は重鎖可変ドメインであり、かつＶａ－２およびＶｂ－２のうちの１つは軽鎖可変ドメインであり、かつ他方は重鎖可変ドメインである）。Ｖａ－２およびＶｂ－２は、ポリペプチドリンカーにより分離されているとして特定され得る（Ｖａ－２およびＶｂ－２はｓｃＦｖを形成する）。Ｖａ－２およびＶｂ－２は、ＮＫｐ４６に結合するＡＢＤを形成し、かつＶａ－１およびＶｂ－１は、対象とする抗原（例えばがん抗原）に結合するＡＢＤを形成する。
ヘテロ多量体タンパク質のドメイン配置の例は、以下を含み、適宜、ヒンジドメインのうちの１つまたは両方は柔軟性リンカーポリペプチドにより置き換えられており、ＮＫｐ４６ ＡＢＤはｓｃＦｖまたは単一ドメインＡＢＤ（例えばｄＡｂ、ＶＨＨ、ＤＡＲＰｉｎ）であり、かつＦｃドメインはＮＫｐ４６ ＡＢＤにリンカーポリペプチドにより（ｔｏ ｔｈｅ ＮＫｐ４６ ＡＢＤ ａ ｌｉｎｋｅｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）融合しており、かつＮＫｐ４６ ＡＢＤはサイトカインポリペプチドにドメインリンカー（例えば柔軟性ポリペプチドリンカー）により融合している：
ＮＫｐ４６ ＡＢＤがＦｃドメインとサイトカインポリペプチドとの間に差し挟まれているヘテロ三量体タンパク質は、例えば、第１のＣＨ１またはＣκ定常領域に融合した第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２のＣＨ１またはＣκ定常領域に融合した第２の可変ドメイン（Ｖ）、および第１の可変ドメインと第２の可変ドメインとの間に差し挟まれたＦｃドメインまたはその部分［すなわちＦｃドメインは第１の（Ｖ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位と第２の（Ｖ－（ＣＨ１／Ｃκ）単位との間に差し挟まれている］を含む中心（第１）のポリペプチド鎖を使用することにより形成され得る。例えば、本発明によるヘテロ三量体タンパク質における使用のための中心ポリペプチド鎖は、以下のようなドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）を有することができる：
Ｖａ－１－（ＣＨ１またはＣκ）ａ－Ｆｃドメイン－Ｖａ－２－（ＣＨ１またはＣκ）ｂ。
第１のポリペプチド鎖は、適宜、そのＣ末端において置かれたＣｙｔをさらに有することができる。
第２のポリペプチド鎖は次に、ドメイン配置（左から右にＮ末端からＣ末端へ）：
Ｖｂ－１－（ＣＨ１またはＣκ）ｃ－Ｆｃドメイン
を含むことができ、その結果、（ＣＨ１またはＣκ）ｃは中心鎖上の（ＣＨ１またはＣκ）ａと二量体化し、かつＶａ－１およびＶｂ－１は、対象とする抗原に結合する抗原結合性ドメインを形成する。
第３のポリペプチド鎖は次に、以下のドメイン配置（左から右にＮ末端からＣ末端へ）：
Ｖｂ－２－（ＣＨ１またはＣκ）ｄ－Ｃｙｔ
を含むことができ、その結果、（ＣＨ１またはＣκ）ｄは中心鎖上の（ＣＨ１またはＣκ）ｂ単位と二量体化し、かつＶａ－２およびＶｂ－２はＮＫｐ４６結合性ドメインを形成する。
適宜、Ｃｙｔが第１のポリペプチド鎖のＣ末端において置かれる場合、第３のポリペプチド鎖は、以下のドメイン配置（左から右にＮ末端からＣ末端へ）を含むことができる：
Ｖｂ－２－（ＣＨ１またはＣκ）ｄ
Ｃｙｔが第３のポリペプチド鎖上に置かれている、結果としてもたらされるヘテロ三量体のドメイン構成の例（図２においてフォーマットＴ５、Ｔ６としても示される）は以下において示される：
Ｃｙｔが第１のポリペプチド鎖上に置かれている、結果としてもたらされるヘテロ三量体のドメイン構成は以下において示される：
そのため、ＮＫｐ４６ ＡＢＤがＦｃドメインとサイトカインポリペプチドとの間に差し挟まれている三量体ポリペプチドにおいて、第１のポリペプチドは、別々のポリペプチド鎖上の可変ドメイン（すなわち第２および第３の鎖の可変ドメイン）と抗原結合性ドメインを各々が形成する２つの可変ドメインを有することができ、第２のポリペプチド鎖は１つの可変ドメインを有し、かつ第３のポリペプチドは１つの可変ドメインを有し、かつポリペプチド鎖のうちの１つは、そのＣ末端に融合したサイトカインポリペプチドを含む。
三量体ポリペプチドは、適宜、以下のように特徴付けられる３つのポリペプチド鎖を含むことができる：
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へ、第１のＣＨ１またはＣκ定常領域に融合した第１の可変ドメイン（Ｖ）、ヒンジドメインまたはその部分、Ｆｃドメインまたはその部分、および第２のＣＨ１またはＣκ定常領域に融合した第２の可変ドメイン（Ｖ）を含む第１のポリペプチド鎖；
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ、第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１またはＣκ定常領域に相補的であるように選択され、その結果、第１および第２のポリペプチドがＣＨ１－Ｃκヘテロ二量体を形成する、ＣＨ１またはＣκ定常領域に融合した可変ドメイン、ヒンジドメインまたはその部分、およびＦｃドメインを含む第２のポリペプチド鎖；ならびに
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端へ、ＣＨ１またはＣκ定常領域に融合した可変ドメイン、およびサイトカインポリペプチド（例えば柔軟性ポリペプチドリンカーを介して定常領域に融合している）を含む第３のポリペプチド鎖であって、可変ドメインおよび定常領域は、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインおよび第２のＣＨ１またはＣκ定常領域に相補的であるように選択され、その結果、第１および第３のポリペプチドは、非共有結合性相互作用および適宜さらに、第３のポリペプチドのＣＨ１またはＣκ定常領域と第１のポリペプチドの第２のＣＨ１またはＣκ定常領域との間に形成されるが、第３のポリペプチドのＣＨ１またはＣκ定常領域と第１のポリペプチドの第１のＣＨ１またはＣκ定常領域との間には形成されないジスルフィド結合により結合したＣＨ１－Ｃκヘテロ二量体を形成しており、
第１、第２および第３のポリペプチドはヘテロ三量体を形成しており、かつ第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインおよび第２のポリペプチド鎖の可変ドメインは、対象とする抗原（例えば標的細胞上、がん抗原）に特異的な抗原結合性ドメインを形成しており、かつ第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインおよび第３のポリペプチド鎖上の可変ドメインは、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合性ドメインを形成している。
そのような三量体二特異性ポリペプチドのための潜在的なドメイン配置の例は、以下の表２において示されるものを含むがそれに限定されない：
別の態様において、三量体ポリペプチドは、適宜、以下の３つのポリペプチド鎖を含むとして特徴付けられ得る：
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へ、第１のＣＨ１またはＣκ定常領域に融合した第１の可変ドメイン（Ｖ）、ヒンジドメインまたはその部分、Ｆｃドメインまたはその部分、および第２のＣＨ１またはＣκ定常領域に融合した第２の可変ドメイン（Ｖ）、およびサイトカインポリペプチド（例えば第２のＣＨ１またはＣκ定常領域に柔軟性ポリペプチドリンカーを介して融合している）を含む第１のポリペプチド鎖；
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ、第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１またはＣκ定常領域に相補的であるように選択され、その結果、第１および第２のポリペプチドがＣＨ１－Ｃκヘテロ二量体を形成する、ＣＨ１またはＣκ定常領域に融合した可変ドメイン、ヒンジドメインまたはその部分、ならびにＦｃドメインを含む第２のポリペプチド鎖；ならびに
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端へ、ＣＨ１またはＣκ定常領域に融合した可変ドメインを含む第３のポリペプチド鎖であって、可変ドメインおよび定常領域は、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインおよび第２のＣＨ１またはＣκ定常領域に相補的であるように選択され、その結果、第１および第３のポリペプチドは、非共有結合性相互作用および適宜さらに、第３のポリペプチドのＣＨ１またはＣκ定常領域と第１のポリペプチドの第２のＣＨ１またはＣκ定常領域との間に形成されるが、第３のポリペプチドのＣＨ１またはＣκ定常領域と第１のポリペプチドの第１のＣＨ１またはＣκ定常領域との間には形成されないジスルフィド結合により結合したＣＨ１－Ｃκヘテロ二量体を形成しており、
第１、第２および第３のポリペプチドはＣＨ１－Ｃκヘテロ三量体を形成しており、かつ第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインおよび第２のポリペプチド鎖の可変ドメインは対象とする抗原（例えば標的細胞上、がん抗原）に特異的な抗原結合性ドメインを形成しており、かつ第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインおよび第３のポリペプチド鎖上の可変ドメインは、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合性ドメインを形成している。
そのような三量体二特異性ポリペプチドのための潜在的なドメイン配置の例は、以下の表３において示されるものを含むがそれに限定されない：
類似した設計を使用して、対象とする抗原に二価で結合し、ＮＫｐ４６に一価で結合し、かつサイトカイン受容体に一価で結合するいっそうさらなる多特異性タンパク質が産生可能であり、すなわち、多特異性タンパク質は２：１：１の構成を有する。例を図２において示す。
対象とする抗原に各々が結合する２つのＡＢＤを有する多特異性タンパク質の１つの例において、ヘテロ二量体タンパク質は、以下のドメイン配置を含む：
これらの構造において、第１および第２の鎖のＦｃドメインはＣＨ３－ＣＨ３二量体化を介して会合しており、かつ第２の鎖上の（ＣＨ１またはＣκ）ｂおよび第１の鎖上の（ＣＨ１またはＣκ）ａはＣＨ１－Ｃκ二量体化を起こしており、ＮＫｐ４６に結合するＡＢＤ１ならびにＡＢＤ２およびＡＢＤ３は各々、異なるポリペプチド鎖上の相補的なドメインとの会合なしに対象とする抗原（例えばがん抗原）に結合することができる自己完全的な（ｓｅｌｆ－ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）抗原結合性ドメインであり、各々の（ＣＨ１またはＣκ）ｂおよび（ＣＨ１またはＣκ）ａはＦｃドメインに免疫グロブリンヒンジアミノ酸配列を介して融合しており、かつＣｙｔはサイトカインポリペプチド（例えば柔軟性ポリペプチドリンカーを介してＡＢＤ１に融合している）である。ヘテロ二量体タンパク質の別の表現は、
であり、式中、各々のＶドメインペアＶａ１－Ｖｂ１、Ｖａ２－Ｖｂ２およびＶａ３－Ｖｂ３は、ドメインリンカーを介して融合したＶＨおよびＶＬを含み、その結果、ペアはｓｃＦｖ抗原結合性ドメインを形成している。
対象とする抗原に各々が結合する２つのＡＢＤを有する多特異性タンパク質の例において、ヘテロ三量体タンパク質は、以下のドメイン配置を含む：
これらの構造において、第１および第３の鎖のＦｃドメインはＣＨ３－ＣＨ３二量体化を介して会合しており、第３の鎖上の（ＣＨ１またはＣκ）ｃおよび中心鎖上の（ＣＨ１またはＣκ）ａはＣＨ１－Ｃκ二量体化を起こしており、かつ第１の鎖上の（ＣＨ１またはＣκ）ｂおよび第２の鎖上の（ＣＨ１またはＣκ）ｄはＣＨ１－Ｃκ二量体化を起こしている。Ｖａ１およびＶｂ１は、ＮＫｐ４６に結合する第１の抗原結合性ドメインを形成している。ＡＢＤ２およびＡＢＤ３は各々、例えば異なるポリペプチド鎖上の相補的な可変ドメインとの会合を要求することなく、対象とする抗原（例えばがん抗原）に結合することができる自己完全的な抗原結合性ドメインである。ＡＢＤ２およびＡＢＤ３は、例えば各々、単鎖上に置かれ、かつ柔軟性ペプチドリンカーにより分離された単一ドメインＡＢＤまたはＶＨおよびＶＫペア（任意の所望される順序において）（例えばｓｃＦｖとして）を含むことができ、その結果、ヘテロ三量体タンパク質は以下を含むことができる：
結果としてもたらされるヘテロ三量体の可能な構成の例は、Ｎ末端からＣ末端へ以下のドメイン配置を有する構造である：

対象とする抗原に各々が結合する２つのＡＢＤを有する多特異性タンパク質の別の例において、ＮＫｐ４６ ＡＢＤがＦｃドメインとサイトカインとの間に差し挟まれているヘテロ四量体タンパク質が構築可能であり、これは例えば、以下のドメイン配置を有する分子であり：
式中、第１の鎖および第２の鎖はＣＨ３－ＣＨ３二量体化により会合しており、かつ第１の鎖および第３の鎖はＣＨ１またはＣκ二量体化により会合しており、第１の鎖および第３の鎖のドメインは、第１および第３の鎖がＣＨ１－Ｃκ二量体化により会合することを可能とするために相補的であるように選択され、第２の鎖および第４の鎖のドメインは、第２および第４の鎖がＣＨ１－Ｃκ二量体化により会合することを可能とするために相補的であるように選択され、かつ各々のＶドメインペアＶａ１およびＶｂ１、Ｖａ２およびＶｂ２ならびにＶａ３およびＶｂ３は、ＶＨおよびＶＬを含み、その結果、ペアはＡＢＤを形成しており、Ｖａ－１およびＶｂ－１は、ドメインリンカーにより分離されて、ＮＫｐ４６に結合するｓｃＦｖを形成しており、かつＶａ１およびＶｂ１ペアならびにＶａ２およびＶｂ２ペアは各々、対象とする抗原に結合するＡＢＤを形成している。
そのような構成の例は、以下の表４において示されるものを含む：
ドメイン配置はまた、以下のようにそれぞれ表すことができ、式中、各々のＬはドメインリンカーである：
ＮＫｐ４６ ＡＢＤおよびサイトカイン受容体ＡＢＤがＦｃドメインのＮおよびＣ末端に関して「シス」で位置付けられる場合（例えば、両方が二量体ＦｃのＣ末端側に置かれている場合）、それらは、好ましくは、膜平面結合コンフォメーションにおいてＮＫｐ４６、ＣＤ１６Ａおよびサイトカイン受容体に結合する能力を増強するように位置付けられる。１つの実施形態において、シス配置は、ＮＫｐ４６ ＡＢＤがＦｃドメインのＣ末端（シス）に位置付けられるように、Ｆｃドメインを含むポリペプチド鎖上にＮＫｐ４６ ＡＢＤを位置付けること（例えばｓｃＦｖとして）、およびＮＫｐ４６ ＡＢＤのトポロジカルにＣ末端にサイトカイン受容体ＡＢＤ（例えばサイトカイン）を位置付けることにより得られる。１つの実施形態において、シス配置（Ｆｃドメインの末端に関して）は、Ｆｃドメインを含む第１のポリペプチド鎖上にＮＫｐ４６結合性Ｆａｂの部分を位置付けること、および第１の鎖上、または第１の鎖と会合し、かつＮＫｐ４６結合性Ｆａｂの相補的な部分を含む第２のポリペプチド鎖上にサイトカイン受容体ＡＢＤ（例えばサイトカイン）を位置付けることにより得られ、適宜、第２のポリペプチド鎖はＦｃドメインを欠いている。例示的なシス配置において、ＮＫｐ４６ ＡＢＤの第１の部分は、Ｆｃドメインを含む第１のポリペプチド鎖上に位置付けることが可能であり、かつサイトカイン受容体ＡＢＤ（例えばサイトカイン）は、Ｆｃドメインを欠いているがＮＫｐ４６ ＡＢＤの相補的な第２の部分を有する異なる第２のポリペプチド鎖上に位置付けられ、第２のポリペプチド鎖および第２の部分は、第１のポリペプチド鎖および第１の部分と会合してＮＫｐ４６ ＡＢＤ（例えばＮＫｐ４６結合性Ｆａｂ）を形成する。ＡＢＤまたはＦａｂの部分は、例えば、そのＶＨもしくはＶＬドメイン、ＶＨ－ＣＨ１、ＶＫ－ＣＨ１、ＶＬ－ＣＬまたはＶＬ－ＣＬドメインであり得る。適宜、サイトカイン受容体ＡＢＤが、第１もしくは第２の鎖上のＮＫｐ４６ ＡＢＤの相補的なＶＨ－ＣＨ１、ＶＫ－ＣＨ１、ＶＬ－ＣＬもしくはＶＬ－ＣＬ成分のＣ末端に隣接して、または第１の鎖上のＦｃドメインのＣ末端に隣接して位置付けられることが特定され得る。
任意の実施形態において、タンパク質が、ＣＨ３－ＣＨ３会合を介して二量体化する別々の鎖上に置かれた第１および第２のＦｃドメイン単量体を含むＦｃドメイン二量体を有し、Ｆｃドメイン単量体のうちの１つが抗ＮＫｐ４６ ＡＢＤおよびサイトカインの両方に接続されており、かつ他の（第２の）Ｆｃドメイン単量体が遊離Ｃ末端を有する（抗ＮＫｐ４６ ＡＢＤもサイトカインもそのＣ末端に融合していない）ことが特定されてもよい。
適宜、本明細書における任意の実施形態において、同じポリペプチド鎖上の異なるドメインの間（例えば、タンデムで置かれた２つのＶドメインの間、ＶドメインとＣＨ１またはＣκドメインとの間、ＣＨ１またはＣκドメインとＦｃドメインとの間、Ｆｃドメイン単量体とＶドメインとの間、Ｆｃドメイン単量体とサイトカインとの間）の融合または連結は、介在性アミノ酸配列を介して、例えばヒンジ領域またはリンカーペプチドを介して起こってもよい。一般に、本明細書におけるドメイン配置または構造は、ドメインリンカーを示すことなく描写され、ドメイン配置は、特定されるドメインの間にドメインリンカーを有するとして特定され得ることが理解される。例えば、サイトカインは、隣接するドメインにドメインリンカーを介して融合しているとして特定され得、かつドメインリンカーは、関連するドメイン配置または構造中に挿入され得る。別の例において、タンデム可変ドメイン（例えばｓｃＦｖ中）は、ドメインリンカーを介して互いに融合しているとして特定され得、かつドメインリンカーは、関連するドメイン配置または構造中の２つのＶ領域の間に挿入され得る。別の例において、ＣＨ１またはＣＬ（もしくはＣＫ）定常領域は、そのＦｃドメインまたはＣＨ２ドメインにドメインリンカーもしくはヒンジドメインまたはその部分を介して融合可能であり、よってドメインリンカーもしくはヒンジドメインまたはその部分は、関連するドメイン配置または構造中のＣＨ１またはＣＬドメインとＦｃドメインまたはＣＨ２ドメインとの間に挿入され得る。示されるリンカーを有する多特異性タンパク質のドメイン配置の例は、フォーマット「Ｔ５」における代表的なヘテロ三量体について図２Ａにおいて示されており、これは、ドメインリンカー、例えばヒンジおよびグリシン－セリンリンカー、ならびに鎖間ジスルフィドブリッジを示す。
本明細書における任意の実施形態において、ポリペプチド鎖（例えば、鎖１、２、３または４）は、遊離Ｎおよび／またはＣ末端を有する（ポリペプチド鎖の末端において他のタンパク質ドメインはない）として特定され得る。
本明細書における任意の実施形態において、本明細書において記載されるタンパク質ドメインは、適宜、Ｎ末端からＣ末端へと指し示されるとして特定され得る。実例の目的のための本開示のタンパク質配置は、Ｎ末端（左）からＣ末端（右）へと示されている。ポリペプチド鎖上の隣接するドメインは、互いに融合しているとして参照され得る（例えば、ドメインは、その左においてドメインのＣ末端に融合しているということができ、かつ／またはドメインは、その右においてドメインのＮ末端に融合しているということができる）。本明細書において記載されるタンパク質ドメインは、互いに直接的に（例えばＣＨ１もしくはＣＬドメインに直接的に融合したＶドメイン）、またはポリペプチド鎖上のドメインを接続するために役立つリンカーもしくは短い介在性アミノ酸配列を介して融合することができる（例えば、それらは、適宜、他の予め決定された機能性を欠いているか、または予め決定されたリガンドに対する特異的結合性を欠いているとして特定されてもよい）。２つのポリペプチド鎖は、非共有結合性相互作用により互いに結合しており（「｜」により指し示される）、適宜、相補的なＣＨ１およびＣκドメイン内のシステイン残基の間に形成される鎖間ジスルフィド結合を介してさらに結合され得る。
接続およびリンカー
一般に、組換え技術により生成される、伝統的なペプチド結合を含む、多特異性タンパク質において使用され得る多数の好適なリンカーがある。一部の実施形態において、リンカーは「ドメインリンカー」であり、これは、本明細書において概説されている任意の２つのドメインを連結して一緒にするために使用される。隣接するタンパク質ドメインは、ドメインリンカーにより互いに接続または融合されているとして特定され得る。例示的なドメインリンカーは、（ポリ）ペプチドリンカー、適宜、柔軟性（ポリ）ペプチドリンカーである。本明細書において交換可能に使用されるペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、特定のドメイン、例えばヒンジ、ＣＨ１もしくはＣＬドメインに由来する部分配列を有してもよいか、または以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、もしくはＴｈｒを主に含んでもよい。リンカーペプチドは、２つの分子が所望される活性を保持するように互いに対して正確なコンフォメーションを取るような仕方で該２つの分子を連結するために十分な長さを有するべきである。１つの実施形態において、リンカーは、約１～５０アミノ酸の長さ、好ましくは約２～３０アミノ酸の長さである。１つの実施形態において、４～２０アミノ酸の長さのリンカーが使用されてもよく、約５～約１５個のアミノ酸は一部の実施形態において用途を有する。任意の好適なリンカーが使用され得るが、多くの実施形態において、リンカー（例えば柔軟性リンカー）は、例えば（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＳＳ）ｎ、（ＧＳＳＳＳ）ｎおよび（ＧＧＧＳ）ｎ［ｎは少なくとも１の整数である（適宜、ｎは、１、２、３または４である）］を含む、グリシン－セリンポリペプチドまたはポリマー、グリシン－アラニンポリペプチド、アラニン－セリンポリペプチド、および他の柔軟性リンカーを利用することができる。グリシンおよびセリン残基を含むリンカーは、プロテアーゼ耐性を一般に提供する。（ＧＳ）１リンカーの１つの例は、アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するリンカーであり；そのようなリンカーは、ドメインをＦｃドメイン（またはそのＣＨ３ドメイン）のＣ末端に融合させるために有用であり得る。一部の実施形態において、例えば、ｎ＝１～２０である（Ｇ２Ｓ）ｎ、例えば、（Ｇ２Ｓ）、（Ｇ２Ｓ）２、（Ｇ２Ｓ）３、（Ｇ２Ｓ）４、（Ｇ２Ｓ）５、（Ｇ２Ｓ）６、（Ｇ２Ｓ）７もしくは（Ｇ２Ｓ）８、または、例えば、ｎが１～１５の整数である（Ｇ３Ｓ）ｎを含むペプチドリンカーが使用される。１つの実施形態において、ドメインリンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドを含み、例えば、ｎは、１～１０、適宜１～６、適宜１～４の整数である。一部の実施形態において、例えば、ｎ＝１～２０である、（ＧＳ２）ｎ、（ＧＳ３）ｎまたは（ＧＳ４）ｎ、例えば、（ＧＳ２）、（ＧＳ２）２、（ＧＳ２）３、（ＧＳ３）１、（ＧＳ３）２、（ＧＳ３）３、（ＧＳ４）１、（ＧＳ４）２、（ＧＳ４）３を含むペプチドリンカーが使用され、例えば、ｎは１～１５の整数である。１つの実施形態において、ドメインリンカーは、（ＧＳ４）ｎペプチドを含み、例えば、ｎは、１～１０、適宜１～６、適宜１～４の整数である。１つの実施形態において、ドメインリンカーはＣ末端ＧＳジペプチドを含み、例えば、リンカーは、（ＧＳ４）を含み、かつアミノ酸配列ＧＳＳＳＳ、ＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳ、ＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧＳまたはＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳを有する。
ペプチドまたはドメインリンカーのいずれも、少なくとも２残基、３残基、４残基、少なくとも５残基、少なくとも１０残基、少なくとも１５残基、少なくとも２０残基、またはより多くの残基の長さを含むように特定されてもよい。他の実施形態において、リンカーは、２～４残基、２～４残基、２～６残基、２～８残基、２～１０残基、２～１２残基、２～１４残基、３～１５残基、４～１５残基、２～１６残基、２～１８残基、２～２０残基、２～２２残基、２～２４残基、２～２６残基、２～２８残基、２～３０残基、２～５０残基、または１０～５０残基の長さを含む。
ポリペプチドリンカーの例は、ＣＨ１またはＣＬドメインからの配列断片を含んでもよく；例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の４～１２または５～１２個のアミノ酸残基は、ｓｃＦｖ部分の連結における使用のために特に有用である。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えばＣＫまたはＣλに由来することができる。リンカーは、例えばＣｙ１、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ４およびＣμを含む、任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来することができる。リンカー配列はまた、他のタンパク質、例えばＩｇ様タンパク質（例えばＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、および他のタンパク質からの他の天然配列に由来してもよい。ある特定のドメイン配置において、ＶＨおよびＶＬドメインは、リンカーペプチドにより分離されてタンデムに別のドメインに連結しており（例えばｓｃＦｖ）、次いでＦｃドメイン（またはそのＣＨ２ドメイン）のＮまたはＣ末端に融合している。そのようなタンデム可変領域またはｓｃＦｖは、Ｆｃドメインにヒンジ領域もしくはその部分、ＣＨ１もしくはＣＬドメインのＮ末端断片、またはグリシンおよびセリン含有柔軟性ポリペプチドリンカーを介して接続され得る。
Ｆｃドメインは、他のドメインに、任意の好適な連結性アミノ酸配列を含む、免疫グロブリン由来配列を介してまたは非免疫グロブリン配列を介して接続され得る。有利には、免疫グロブリン由来配列は、ＣＨ１またはＣＬドメインとＦｃドメインとの間で容易に使用可能であり、これは特に、ＣＨ１またはＣＬドメインがそのＣ末端においてＦｃドメイン（またはＣＨ２ドメイン）のＮ末端に融合される場合に該当する。免疫グロブリンヒンジ領域またはヒンジ領域の部分は、ポリペプチド鎖上でＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に存在することができ、そしてそれが一般的である。ヒンジまたはその部分はまた、ＣＬがポリペプチド鎖上でＦｃドメインに隣接している場合に、ポリペプチド鎖上でＣＬ（例えばＣκ）ドメインとＦｃドメインのＣＨ２ドメインとの間に置かれ得る。しかしながら、ヒンジ領域は、適宜、例えば、好適なリンカーペプチド、例えば柔軟性ポリペプチドリンカーにより置き換えられ得ることが理解される。
ＮＫｐ４６ ＡＢＤおよびサイトカイン受容体ＡＢＤ（例えば、サイトカイン）は、有利には、多特異性タンパク質の残部に（例えばまたはその定常ドメインもしくはＦｃドメインに）、従来的な（例えば野生型全長ヒトＩｇＧ）抗体と比較してより低い構造的剛性または堅さに繋がる柔軟性リンカー（例えばポリペプチドリンカー）（例えばＡＢＤとＦｃドメインとの間または中で）を介して連結される。例えば、多特異性タンパク質は、従来的な（例えば野生型全長ヒトＩｇＧ）抗体中の２つのＡＢＤと比較してドメイン運動の範囲の増加を可能にする構造または柔軟性リンカーをＮＫｐ４６ ＡＢＤと定常ドメインまたはＦｃドメインとの間に有してもよい。特に、構造または柔軟性リンカーは、従来的なヒトＩｇＧ１抗体中の抗原結合性部位と比較してより大きい鎖内ドメイン運動を抗原結合性部位に付与するように構成され得る。剛性またはドメイン運動／鎖間ドメイン運動は、例えば、コンピュータモデリング、電子顕微鏡法、分光法、例えば核磁気共鳴（ＮＭＲ）、Ｘ線結晶学、またはリンカーもしくはヒンジを含むタンパク質の回転運動の半径を測定もしくは比較するための沈降速度分析超遠心分離（Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｖｅｌｏｃｉｔｙ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）（ＡＵＣ）により決定され得る。試験タンパク質またはリンカーは、試験タンパク質が、比較用タンパク質、例えば、ＩｇＧ１抗体またはヒンジの値から、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％異なる、先行する一文において記載される試験のうちの１つから得られた値を有する場合に、比較用タンパク質と比べてより低い剛性を有し得る。サイトカインは、例えば、ＣＨ３ドメインのＣ末端に、ＧＳＳＳＳ（配列番号１７１）、ＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳ（配列番号１７２）、ＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１７３）またはＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳ（配列番号１７４）から選択されるリンカーにより融合され得る。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、ＮＫｐ４６ ＡＢＤおよび対象とする抗原に結合するＡＢＤが、前記ＡＢＤの間に約８０オングストローム未満、約６０オングストローム未満または約４０～６０オングストロームの範囲を含む間隔を有することを可能にするＮＫｐ４６ ＡＢＤとＦｃドメインとの間の構造または柔軟性リンカーを有してもよい。
そのＣ末端において、Ｆｃドメイン（またはそのＣＨ３ドメイン）は、ＮＫｐ４６ ＡＢＤまたはサイトカインポリペプチドのＮ末端にポリペプチドリンカー、例えばグリシン－セリン含有リンカー、適宜アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するリンカーを介して接続され得る。
ある特定の実施形態において、Ｆａｂ（例えばＮＫｐ４６ ＡＢＤ）のＣＨ１またはＣＬドメインは、そのＣ末端においてサイトカインのＮ末端に柔軟性ポリペプチドリンカー、例えばグリシン－セリン含有リンカーを介して融合される。好ましくは、リンカーは、少なくとも４個のアミノ酸残基の鎖長を有し、適宜、リンカーは、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基の長さを有する。
ある特定の実施形態において、ＮＫｐ４６ ＡＢＤは、ＦｃドメインのＣ末端に置かれており、かつＮＫｐ４６は、多特異性タンパク質中でＦｃドメインとサイトカインポリペプチドとの間に位置付けられている。ＮＫｐ４６ ＡＢＤは、そのＮ末端（ＶＨまたはＶＬドメインのＮ末端）においてＦｃドメインのＣ末端に十分な長さのリンカー（例えばグリシンおよびセリン含有リンカー、配列ＳＴＧＳを有するリンカー、柔軟性ポリペプチドリンカー）を介して接続または融合しており、それにより、ＮＫｐ４６結合性ＡＢＤは、ＮＫ細胞の表面においてＮｋｐ４６に結合することを可能にするような仕方でフォールディングおよび／または配向性を取ると同時に、隣接するＦｃドメイン（またはより一般には多特異性タンパク質の残部）に対して十分な距離および運動の範囲を有し、その結果、Ｆｃドメインが、同じＮＫ細胞の表面において発現されるＣＤ１６により同時に見出され得ることを可能にする。追加的に、ＮＫｐ４６ ＡＢＤが多特異性タンパク質中でＦｃドメインとサイトカインポリペプチドとの間に置かれている場合、ｓｃＦｖ ＮＫｐ４６ ＡＢＤのＶＨもしくはＶＬのＣ末端、またはＦａｂ ＮＫｐ４６ ＡＢＤのＣＨ１もしくはＣＬドメインは、サイトカインポリペプチドのＮ末端に十分な長さの柔軟性リンカー（例えば柔軟性ポリペプチドリンカー）を介して接続または融合しており、それにより、ＮＫｐ４６結合性ＡＢＤは、ＮＫ細胞の表面においてＮｋｐ４６に結合することを可能にするような仕方でフォールディングおよび／または配向性を取ると同時に、隣接するサイトカインポリペプチドに対して十分な距離および運動の範囲を提供し、その結果、サイトカインポリペプチドがまた、ＮＫ細胞の表面において発現されるそのサイトカイン受容体により同時に結合され得ることを可能にする。好ましくは、リンカーは、少なくとも４個のアミノ酸残基の鎖長を有し、適宜、リンカーは、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基の長さを有する。
タンデム可変領域（例えばｓｃＦｖ）中で、２つのＶドメイン（例えばＶＨドメインおよびＶＬドメイン）は、ＡＢＤが、ＡＢＤが結合することが意図される抗原に結合することを可能にするような仕方でフォールディングすることを可能にするために十分な長さのリンカーにより一般に連結して一緒にされる。リンカーの例は、グリシンおよびセリン残基を含むリンカー、例えば、アミノ酸配列ＧＥＧＴＳＴＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＡＤ（配列番号５０９）を含む。別の特有の実施形態において、ｓｃＦｖのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３により連結して一緒にされる。
１つの実施形態において、ｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬドメインをＦｃドメインのＣＨ２ドメインに連結するために使用される（ポリ）ペプチドリンカーは、ＣＨ１ドメインもしくはＣＬドメインおよび／またはヒンジ領域の断片を含む。例えば、ＣＨ１のＮ末端アミノ酸配列は、野生型抗体の天然の構造に可能な限り近い構造を模倣するために可変ドメインに融合され得る。１つの実施形態において、リンカーは、ヒンジドメインまたはＮ末端ＣＨ１アミノ酸からのアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、リンカーペプチドは、定型的なＶＫ－ＣＫエルボージャンクションを模倣し、例えば、リンカーはアミノ酸配列ＲＴＶＡを含むかまたはからなる。
１つの実施形態において、ＣＨ１またはＣＫドメイン（例えばＦａｂのＣＨ１またはＣＫドメイン）のＣ末端をＣＨ２ドメインのＮ末端と接続するために使用されるヒンジ領域は、ヒンジ領域の断片（例えばシステイン残基を有しない切断されたヒンジ領域）であるか、またはシステイン残基、適宜、ヒンジ領域中の両方のシステイン残基を除去する（例えば別のアミノ酸により置換するか、もしくは欠失させる）１つもしくは複数のアミノ酸改変を含んでもよい。システインの除去は、望ましくないジスルフィド結合形成、例えば、単量体ポリペプチド中のジスルフィドブリッジの形成を予防するために有用であり得る。
本明細書における「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」は、抗体の第１の定常ドメインと第２の定常ドメインとの間の柔軟なポリペプチドまたはリンカーを指す。構造的に、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインはＥＵ ２２０位において終了し、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインはＥＵ ２３７位の残基において始まる。そのため、ＩｇＧのためにヒンジは２２１位（ＩｇＧ１中のＤ２２１）～２３６位（ＩｇＧ１中のＧ２３６）を一般に含み、番号付けはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによるものである。ポリペプチド内に見出される定常領域ドメイン内の特有のアミノ酸残基に対する参照は、他に指し示されなければまたは他に文脈に矛盾しなければ、ＩｇＧ抗体の文脈において、Ｋａｂａｔに従って定義される。
１つの実施形態において、ヒンジ領域（またはその断片）は、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジドメインに由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｏｒｍ）。例えば、ヒンジドメインは、アミノ酸配列：ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号１６６）もしくはその最初の８残基を含む断片、または以上のいずれかに対して少なくとも６０％、７０％、８０％もしくは９０％同一のアミノ酸配列を含んでもよく、適宜、１つまたは両方のシステインは、欠失しているか、または異なるアミノ酸残基、適宜セリンにより置換されている。
１つの実施形態において、ヒンジ領域（またはその断片）は、ヒトＩｇＭ抗体のＣμ２－Ｃ Ｃμ３ヒンジドメインに由来する。例えば、ヒンジドメインは、アミノ酸配列：ＮＡＳＳＭＣＶＰＳＰＡＰＥＬＬ（配列番号１６７）、またはそれに対して少なくとも６０％、７０％、８０％もしくは９０％同一のアミノ酸配列を含んでもよく、適宜、１つまたは両方のシステインは、欠失しているか、または異なるアミノ酸残基により置換されている。
非共有結合または相互作用を介して互いと二量体化および会合するポリペプチド鎖は、それぞれのＣＨ１およびＣκドメインの間、および／または鎖上のそれぞれのヒンジドメインの間に形成される鎖間ジスルフィド結合により追加的に結合していてもよく、またはそうでなくてもよい。ＣＨ１、Ｃκおよび／またはヒンジドメイン（または他の好適な連結性アミノ酸配列）は、適宜、鎖の所望される対合が助長され、かつ望ましくないまたは不正確なジスルフィド結合形成が回避されるように鎖間ジスルフィド結合が鎖の間に形成されるように構成され得る。例えば、対合すべき２つのポリペプチド鎖が各々、ヒンジドメインに隣接するＣＨ１またはＣκを有する場合、それぞれのＣＨ１／Ｃκ－ヒンジセグメントの間の鎖間ジスルフィド結合形成のために利用可能なシステインの数が低減される（または完全に排除される）ようにポリペプチド鎖は構成され得る。例えば、それぞれのＣＨ１、Ｃκおよび／またはヒンジドメインのアミノ酸配列は、ポリペプチドのＣＨ１／Ｃκおよびヒンジドメインの両方におけるシステイン残基を除去するために改変可能であり；それにより、二量体化する２つの鎖のＣＨ１およびＣκドメインは非共有結合性相互作用を介して会合する。
別の例において、ヒンジドメインに隣接する（例えば、Ｎ末端にある）ＣＨ１またはＣκドメインは、鎖間ジスルフィド結合を形成する能力を有するシステインを含み、かつＣＨ１またはＣκのＣ末端に置かれたヒンジドメインは、ヒンジの１つまたは両方のシステイン（例えばＫａｂａｔに従ってヒトＩｇＧ１ヒンジについて番号付けされた場合にＣｙｓ ２３９およびＣｙｓ ２４２）の欠失または置換を含む。１つの実施形態において、ヒンジ領域（またはその断片）は、アミノ酸配列：ＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬ（配列番号１６８）、またはそれに対して少なくとも６０％、７０％、８０％もしくは９０％同一のアミノ酸配列を含む。
別の例において、ヒンジドメインに隣接する（例えば、Ｎ末端にある）ＣＨ１またはＣκドメインは、鎖間ジスルフィド結合を形成する能力を有するシステイン残基において欠失または置換を含み、かつＣＨ１またはＣκのＣ末端に置かれたヒンジドメインは、ヒンジの１つまたは両方のシステイン（例えばＫａｂａｔに従ってヒトＩｇＧ１ヒンジについて番号付けされた場合にＣｙｓ ２３９およびＣｙｓ ２４２）を含む。１つの実施形態において、ヒンジ領域（またはその断片）は、アミノ酸配列：ＴＨＴＣＳＳＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号１６９）、またはそれに対して少なくとも６０％、７０％、８０％もしくは９０％同一のアミノ酸配列を含む。
別の例において、ヒンジ領域はＩｇＭ抗体に由来する。そのような実施形態において、ＣＨ１／ＣＫ対合は、ＩｇＭ抗体におけるＣμ２ドメインホモ二量体化を模倣する。例えば、ヒンジドメインに隣接する（例えば、Ｎ末端にある）ＣＨ１またはＣκドメインは、鎖間ジスルフィド結合を形成する能力を有するシステインにおいて欠失または置換を含み、かつＣＨ１またはＣκのＣ末端に置かれたＩｇＭヒンジドメインは、ヒンジの１つまたは両方のシステインを含む。１つの実施形態において、ヒンジ領域（またはその断片）は、アミノ酸配列：ＴＨＴＣＳＳＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号１７０）、またはそれに対して少なくとも６０％、７０％、８０％もしくは９０％同一のアミノ酸配列を含む。
ポリペプチドリンカーの代替として、様々な非タンパク質性ポリマーまたは化学的リンカーが多特異性タンパク質において用途を有し得る。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマーを含むがそれに限定されない非タンパク質性ポリマーは、リンカーとして用途を有し得る。一部の例において、多特異性タンパク質のポリペプチド鎖中のアミノ酸配列は、反応性基、適宜保護された反応性基を導入するために改変されてもよく、そのように改変されたタンパク質または鎖は次に、相補的な反応性基を含むリンカーまたはポリペプチドと反応させられる。一部の例において、多特異性タンパク質のポリペプチド鎖中のアミノ酸残基は、反応性基を含むリンカーに（相補的な反応性基を有するリンカーを用いて機能化された第２のポリペプチドとのさらなる反応のため）、または酵素触媒された反応を介して直接的に第２のポリペプチドに結合することができる。例えば、アクセプターグルタミンまたはリジンを含むポリペプチドは、トランスグルタミン酵素（例えば細菌トランスグルタミナーゼ、ＢＴＧ）の存在下で第一級アミンを含むリンカーと反応することができ、その結果、トランスグルタミナーゼ酵素は、ポリペプチドの一次構造内の、例えば免疫グロブリン定常ドメイン内の、または定常領域に挿入もしくは付加（例えば、融合）されたＴＧａｓｅ認識タグ内のアクセプターグルタミン残基へのリンカーのコンジュゲーションを触媒する。第２のポリペプチドもまた、類似した方式においてリンカーを用いて機能化することができ、コンジュゲートされたリンカーの各々が相補的な反応性基（例えば１つのポリペプチドのリンカー上のＲおよび他のポリペプチドのリンカー上のＲ’）を有する場合、２つの機能化されたポリペプチドは、反応の残基を含むリンカーまたはＲ’とＲを介して結合するように反応することができる。反応性基ペアＲおよびＲ’の例は、双直交反応する能力を有する範囲の基を含み、例えば、アジドとシクロオクチンとの間（銅フリークリック化学）、ニトロンとシクロオクチンとの間の１，３－双極子付加環化、アルデヒドおよびケトンからのオキシム／ヒドラゾン形成ならびにテトラジンライゲーションがある（国際公開第２０１３／０９２９８３号パンフレットも参照）。結果としてもたらされるリンカーおよび機能化された抗体、またはそのＹエレメントはそのため、ＲおよびＲ’の反応の結果としてもたらされるＲＲ’基、例えばトリアゾールを含むことができる。抗体へのＢＴＧ媒介性コンジュゲーションにおける使用のための方法およびリンカーは、ＰＣＴ国際公開第２０１４／２０２７７３号パンフレット（その開示は参照により組み込まれる）において記載されている。「ＴＧａｓｅ」または「ＴＧ」と交換可能に使用される「トランスグルタミナーゼ」は、ε－（γ－グルタミル）リジンイソペプチド結合を結果としてもたらす、ペプチド結合したグルタミンのγ－カルボキサミド基と、リジンまたは構造的に関連する第一級アミン、例えばアミノペンチル基、例えばペプチド結合したリジンのε－アミノ基との間のアシル転移反応を通じてタンパク質を架橋する能力を有する酵素を指す。ＴＧａｓｅは、特に、細菌トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）、例えばＥＣ参照番号ＥＣ ２．３．２．１３を有する酵素（タンパク質－グルタミン－γ－グルタミルトランスフェラーゼ）を含む。用語「アクセプターグルタミン」残基は、抗体のグルタミン残基を指す場合に、ＴＧａｓｅにより認識され、かつグルタミンとリジンまたは構造的に関連する第一級アミン、例えばアミノペンチル基との間の反応を通じてＴＧａｓｅにより架橋され得るグルタミン残基を意味する。好ましくは、アクセプターグルタミン残基は、表面に露出されたグルタミン残基である。用語「ＴＧａｓｅ認識タグ」は、アクセプターグルタミン残基を含むアミノ酸の配列であって、ポリペプチド配列中に組み込まれた（例えば付加された）場合に、好適な条件下で、ＴＧａｓｅにより認識され、アミノ酸の配列内のアミノ酸側鎖と反応パートナーとの間の反応を通じてＴＧａｓｅによる架橋に繋がるものを指す。認識タグは、酵素認識タグを含むポリペプチド中に天然に存在しないペプチド配列であってもよい。ＴＧａｓｅ認識タグの例は、国際公開第２０１２／０５９８８２号パンフレットおよび国際公開第２０１４／０７２４８２号パンフレットにおいて開示されているアミノ酸配列（これらの配列の開示は参照により本明細書に組み込まれる）を含む。
定常領域
定常領域ドメインは、定常重鎖（ＣＨ１）および軽鎖（ＣＬ、ＣκまたはＣλ）ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ならびにＣＨ３ドメインを含む、任意の好適なヒト抗体、特にはガンマアイソタイプのヒト抗体に由来することができる。
重鎖定常ドメインに関して、「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従って１１８～２２０位を一般に指す。文脈に依存して、ＣＨ１ドメイン（例えばドメイン配置において示されている）は、適宜、ＣＨ１がヒンジ領域の少なくとも部分を含むようにヒンジ領域中に伸長した残基を含むことができる。例えば、ポリペプチド鎖上のＣ末端および／またはＦｃドメインのＣ末端、および／またはＦｃドメインであるかもしくはそのＣ末端にあるＦａｂ構造内に位置付けられた場合に、ＣＨ１ドメインは、適宜、ヒンジ領域の少なくとも部分を含むことができ、例えば、ＣＨ１ドメインは、少なくとも上ヒンジ領域、例えばヒトＩｇＧ１ヒンジの上ヒンジ領域を含むことができ、適宜さらに、上ヒンジの末端スレオニンはセリンにより置き換えられ得る。そのようなＣＨ２ドメインは、したがって、そのＣ末端においてアミノ酸配列：ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＳ（配列番号４４０）を含むことができる。
例示的なヒトＣＨ１ドメインアミノ酸配列は以下を含む：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV（配列番号１５６）
または
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHS（配列番号１５７）
または
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT（配列番号１５８）
例示的なヒトＣκドメインアミノ酸配列は以下を含む：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ （配列番号１５９）。
一部の例示的な構成において、多特異性タンパク質は、可変領域、ＣＨ１および／またはＣＬドメインが、ＣＫドメインとのＣＨ１ドメインの所望される鎖対合を促進するためにノブ－イントゥー－ホールまたは静電ステアリングアプローチにおいてアミノ酸置換を導入することにより操作された１または２つのＦａｂ（例えば１つのＦａｂはＮＫｐ４６に結合し、他方は対象とする抗原に結合する）を含むヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体であり得る。一部の例示的な構成において、多特異性タンパク質は、ＦａｂがＶＨ／ＶＬクロスオーバー（ＶＨおよびＶＬが互いに置き換わっている）またはＣＨ１／ＣＬクロスオーバー（ＣＨ１およびＣＬが互いに置き換わっている）を有し、かつＣＨ１および／またはＣＬドメインが、ノブ－イントゥー－ホールまたは静電ステアリングにより正確な鎖会合を促進するためのアミノ酸置換を含む、１または２つのＦａｂ（例えば１つのＦａｂはＮＫｐ４６に結合し、他方は対象とする抗原に結合する）を含むヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体であり得る。
「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従って２３７～３４０位を一般に指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従って３４１～４４７位を一般に指す。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、任意の好適な抗体に由来することができる。そのようなＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、野生型ドメインとして使用可能であるか、または改変されたＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインのための基礎として役立ち得る。適宜、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、ヒト起源であるか、または別の種（例えば、齧歯動物、ウサギ、非ヒト霊長動物）のものを含んでもよいか、または改変されているかもしくはキメラのＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメイン、例えば、異なる抗体アイソタイプもしくは種の抗体からの、異なるＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインからの部分もしくは残基を含むものを含んでもよい。
ドメイン配置のいずれにおいても、Ｆｃドメイン単量体は、ＣＨ２－ＣＨ３単位（全長ＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはその断片）を含んでもよい。Ｆｃドメイン単量体を有する２つの鎖を含むヘテロ二量体またはヘテロ三量体（すなわちヘテロ二量体またはヘテロ三量体はＦｃドメイン二量体を含む）において、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３－ＣＨ３二量体化の能力を有する（例えば、それは、野生型ＣＨ３ドメインまたは所望されるＣＨ３－ＣＨ３二量体化を促進するための改変を有するＣＨ３ドメインを含む）。
例示的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ２－ＣＨ３（Ｆｃ）ドメインアミノ酸配列は以下を含む：
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号１６０）
Ｆｃドメインは、適宜、Ｃ末端リジン（Ｋ）をさらに含んでもよい。一部の例示的な構成において、多特異性タンパク質は、ポリペプチド鎖が、所望されるタンパク質を生成するように互いの間でのヘテロ二量体化のために操作されている、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体であり得る。所望される鎖対合がＣＨ１－Ｃκ二量体化により駆動されないか、または一般に対合の増強が所望される実施形態において、鎖は、優先的な鎖対合を助長する、例えば所望される２つの異なる鎖のヘテロ二量体化を２つの同一の鎖のホモ二量体化よりも助長する、アミノ酸改変（例えば、置換）を有する定常またはＦｃドメインを含んでもよい。
一部の実施形態において、「ノブ－イントゥー－ホール」アプローチが使用され、該アプローチにおいて、抗体が優先的にヘテロ二量体化するようにドメインインターフェース（例えば抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインインターフェース）は突然変異される。インターフェース（例えばＦｃ二量体インターフェース）間の電荷極性の変更を作出するために突然変異が導入可能であり、その結果、静電気的にマッチした鎖（例えばＦｃ含有鎖）の共発現は好都合な誘引性相互作用をサポートし、それにより、所望されるヘテロ二量体（例えばＦｃヘテロ二量体）形成が促進される一方、不都合な反発的電荷相互作用は、望ましくないヘテロ二量体（例えば、Ｆｃホモ二量体）形成を抑制する。例えば、Brinkmann and Kontermann, 2017 MAbs, 9(2): 182-212（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において総説されている突然変異およびアプローチを参照。例えば、１つの重鎖はＴ３６６Ｗ置換を含み、かつ第２の重鎖は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換を含む。例えば、Ridgway et al (1996) Protein Eng., 9, pp. 617-621; Atwell (1997) J. Mol. Biol., 270, pp. 26-35；および国際公開第２００９／０８９００４号パンフレット（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照。例えば、第１のＦｃ単量体上の「ホール」突然変異はＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含むことができ、かつ第２のＦｃ単量体上の相補的な「ノブ」突然変異はＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）を含むことができる。別のアプローチにおいて、１つの重鎖はＦ４０５Ｌ置換を含み、かつ第２の重鎖はＫ４０９Ｒ置換を含む。例えば、Labrijn et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 110, pp. 5145-5150を参照。別のアプローチにおいて、１つの重鎖は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖ置換を含み、かつ第２の重鎖は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｓ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗ置換を含む。例えば、Von Kreudenstein et al., (2013) mAbs 5:646-654を参照。別のアプローチにおいて、１つの重鎖は、Ｋ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄの両方の置換を含み、かつ第２の重鎖は、Ｄ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋの両方の置換を含む。例えば、Gunasekaran et al., (2010) J. Biol. Chem. 285:19637-19646を参照。別のアプローチにおいて、１つの重鎖は、Ｄ２２１Ｅ、Ｐ２２８ＥおよびＬ３６８Ｅ置換を含み、かつ第２の重鎖は、Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、およびＫ４０９Ｒ置換を含む。例えば、Strop et al., (2012) J. Mol. Biol. 420: 204-219を参照。別のアプローチにおいて、１つの重鎖は、Ｓ３６４ＨおよびＦ４０５Ａ置換を含み、かつ第２の重鎖は、Ｙ３４９Ｔおよび、Ｔ３９４Ｆ置換を含む。例えば、Moore et al., (2011) mAbs 3: 546-557を参照。別のアプローチにおいて、１つの重鎖はＨ４３５Ｒ置換を含み、かつ第２の重鎖は、適宜、置換を含んでもよく、または含まなくてもよい。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号明細書を参照。そのようなヘテロ多量体抗体が、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４に由来するＦｃ領域を有する場合、これらの抗体のＦｃ領域は、ＣＤ１６結合性を可能にするアミノ酸改変を含有するように操作され得る。一部の実施形態において、抗体は、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）において哺乳動物抗体タイプＮ結合型グリコシル化を含んでもよい。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、アフィニティー精製培地、例えばプロテインＡに対する結合性に影響するＣＨ３ドメイン中の１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば置換）を含む。プロテインＡに対する結合性を減少させる突然変異のＣＨ３ドメインの１つへの導入は、望ましくない鎖対合を所望されるタンパク質から区別するために使用され得る。例えば、突然変異は、アミノ酸Ｈ４３５およびＹ４３６（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）、例えばＨ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆにおいて導入され得る。１つの実施形態において、ＣＤ１６Ａに対する結合性を保持するために改変された二量体Ｆｃドメインを有する多特異性タンパク質において、第１のＦｃ単量体（例えばポリペプチド鎖のうちの１つ上）は、配列番号１６１に対して少なくとも９０％、９５％または９９％同一のアミノ酸配列を含み、かつ第２のＦｃ単量体（例えば別のポリペプチド鎖上）は、配列番号１６２に対して少なくとも９０％、９５％または９９％同一のアミノ酸配列を含む。適宜、Ｆｃ単量体の各々は、そのＮ末端において配列番号１６６のヒンジアミノ酸配列に融合している。
一部の実施形態において、ジスルフィド結合の１つまたは複数のペア、例えばＡ２８７ＣおよびＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９ＣおよびＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２ＣおよびＶ３０２Ｃ、ならびにＶ３２３ＣおよびＩ３３２Ｃが、安定性を増加させるために、例えばさらに、他のＦｃ改変により引き起こされる安定性の喪失に対して（ｔｏ ａ ｌｏｓｓ ｏｆ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、Ｆｃ領域中に導入される。追加の例は、Ｆｃ安定性および凝集抵抗性を増強するためにＫ３３８Ｉ、Ａ３３９Ｋ、およびＫ３４０Ｓ突然変異を導入することを含む（Gao et al, 2019 Mol Pharm. 2019;16:3647）。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質（ｗｈｅｒｅ ａ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ヒトＦｃガンマ受容体に対する低減された結合性を有することが意図される。一部の実施形態において、多特異性タンパク質が、ヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに対する低減された結合性（ならびに適宜さらに、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４に対する低減された結合性）を有することが意図される場合、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインであり、適宜さらに、Ｆｃドメインは、ヒンジジスルフィドを安定化させるためのＳ２２８Ｐ突然変異を含む。１つの実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインに対して少なくとも９０％、９５％または９９％同一のアミノ酸配列を有し、適宜、Ｋａｂａｔ Ｓ２２８Ｐ突然変異をさらに含む。
実施形態において、多特異性タンパク質が、ヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに対する低減された結合性（ならびに適宜さらに、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４に対する低減された結合性）を有することが意図される場合、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメイン（またはそれを含むＦｃドメイン）は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）に対する結合性を減少または消失させるための改変を含んでもよい。例えば、Ｆｃドメイン二量体タンパク質中の残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＣＨ２突然変異は、ＣＤ１６Ａ結合性を実質的に排除することができる。しかしながら、他の構成が実行され得ることを当業者は理解する。例えば、２３３～２３６位におけるヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２残基中へのならびに／または３２７、３３０および３３１位における残基中への置換は、Ｆｃγ受容体に対する結合性、ならびにそのためＡＤＣＣおよびＣＤＣを大きく低減させることが示された。さらには、Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164(8):4178-84は、Ｋ３２２を含む、異なる位置におけるアラニン置換は、補体活性化を有意に低減させることを実証した。
１つの実施形態において、Ｋａｂａｔ重鎖残基２９７におけるアスパラギン（Ｎ）は、アスパラギン以外の残基（例えばグルタミン、グルタミン以外の残基、例えばセリン）により置換され得る。
１つの実施形態において、ＣＤ１６Ａに対する結合性を低減させるために改変されたＦｃドメインは、Ｋａｂａｔ残基２３４、２３５および３２２におけるＦｃドメイン中の置換を含む。１つの実施形態において、タンパク質は、Ｋａｂａｔ残基２３４、２３５および３３１におけるＦｃドメイン中の置換を含む。１つの実施形態において、タンパク質は、Ｋａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７および３３１におけるＦｃドメイン中の置換を含む。１つの実施形態において、タンパク質は、Ｋａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７、３３０および３３１におけるＦｃドメイン中の置換を含む。１つの実施形態において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１サブタイプのものである。アミノ酸残基は、ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けに従って指し示される。
１つの実施形態において、ＣＤ１６Ａに対する結合性を低減させるために改変されたＦｃドメインは、Ｋａｂａｔ残基２３３～２３６のうちの１つもしくは複数、適宜、残基２３３～２３７のうちの１つもしくは複数、または残基２３４、２３５および／もしくは２３７のうちの１、２もしくは３つにおけるアミノ酸改変（例えば置換）、ならびにＫａｂａｔ残基３３０および／または３３１におけるアミノ酸改変（例えば置換）を含む。そのようなＦｃドメインの１つの例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３３１における置換（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１ＳまたはＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。そのようなＦｃドメインの別の例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＰ３３１における置換（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。そのようなＦｃドメインの別の例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０およびＰ３３１における置換（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。１つの実施形態において、抗体は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７Ｘ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７Ｘ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｎ２９７Ｘ／Ｐ３３１Ｓ置換、またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／ Ｎ２９７Ｘ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み、Ｘは、アスパラギン以外の任意のアミノ酸であり得る。１つの実施形態において、Ｘはグルタミンであり；別の実施形態において、Ｘは、グルタミン以外の残基（例えばセリン）である。
１つの実施形態において、ＣＤ１６Ａに対する低いまたは低減された結合性を有するＦｃドメインはヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインは、以下のアミノ酸配列（Ｓ２２８Ｐ置換を有するヒトＩｇＧ４）、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を有する。
１つの実施形態において、ＣＤ１６Ａに対する結合性を低減させるために改変されたＦｃドメインは、以下のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９９％同一であるが、Ｋａｂａｔ ２３４、２３５および３３１位（下線）におけるアミノ酸残基を保持しているアミノ酸配列を含む：
（配列番号１６３）
１つの実施形態において、ＣＤ１６Ａに対する結合性を低減させるために改変されたＦｃドメインは、以下のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９９％同一であるが、Ｋａｂａｔ ２３４、２３５、２３７、３３０および３３１位（下線）におけるアミノ酸残基を保持しているアミノ酸配列を含む：
（配列番号１６４）
上記のＦｃドメイン配列のいずれも、適宜、天然に存在する配列におけるように、Ｃ末端リジン（Ｋ）をさらに含むことができる。
ＣＤ１６（ＣＤ１６Ａ）に対する結合性が所望される本明細書におけるある特定の実施形態において、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメイン（またはそれを含むＦｃドメイン）は、野生型ドメインもしくは野生型ヒトＩｇＧ１ドメインからのＣＤ１６インターフェース残基を有するドメインであってもよいか、またはヒトＣＤ１６および適宜別の受容体、例えばＦｃＲｎに対する結合性を増加させる１つもしくは複数のアミノ酸改変（例えばアミノ酸置換）を含んでもよい。適宜、改変は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、例えばヒトＦｃＲｎに結合するＦｃ由来ポリペプチドの能力を実質的に減少も消失もさせない。典型的な改変は、少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば置換、欠失、挿入）、および／または変更されたタイプのグリコシル化、例えば、低フコシル化を含む改変されたヒトＩｇＧ１由来定常領域を含む。そのような改変は、Ｆｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）との相互作用に影響することができる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ １６）は活性化（すなわち、免疫系増強）受容体であり、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害（すなわち、免疫系減弱）受容体である。改変は、例えば、エフェクター（例えばＮＫ）細胞上のＦｃγＲＩＩＩａに対するＦｃドメインの結合を増加させ、かつ／またはＦｃγＲＩＩＢに対する結合性を減少させるものであってもよい。改変の例は、ＰＣＴ国際公開第２０１４／０４４６８６号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において提供されている。ＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃＲｎ結合性に影響する（それを増強する）特有の突然変異（ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン中）もまた以下に記載される。


一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、Ｆｃ領域のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸改変を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはより多くのアミノ酸改変を有する）変異型Ｆｃ領域を含み、改変はヒトＣＤ１６ポリペプチドに対する結合性を増強する。他の実施形態において、多特異性タンパク質は、アミノ酸２３７～３４１のＦｃ領域のＣＨ２ドメイン中に、または残基２３１～３４１を含む下ヒンジ－ＣＨ２領域内に少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはより多くのアミノ酸改変）を含む。一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、少なくとも２つのアミノ酸改変（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、またはより多くのアミノ酸改変）を含み、そのような改変のうちの少なくとも１つはＣＨ３領域内にあり、かつ少なくとも１つのそのような改変はＣＨ２領域内にある。包含されるのはまた、ヒンジ領域中のアミノ酸改変である。１つの実施形態において、包含されるのは、ＣＨ１ドメイン中、適宜、残基２１６～２３０（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）を含む上ヒンジ領域中のアミノ酸改変である。Ｆｃ改変の任意の好適な機能的な組合せ、例えば、米国特許第７，６３２，４９７号明細書；同第７，５２１，５４２号明細書；同第７，４２５，６１９号明細書；同第７，４１６，７２７号明細書；同第７，３７１，８２６号明細書；同第７，３５５，００８号明細書；同第７，３３５，７４２号明細書；同第７，３３２，５８１号明細書；同第７，１８３，３８７号明細書；同第７，１２２，６３７号明細書；同第６，８２１，５０５号明細書および同第６，７３７，０５６号明細書；ならびに／またはＰＣＴ国際公開第２０１１／１０９４００号パンフレット；国際公開第２００８／１０５８８６号パンフレット；国際公開第２００８／００２９３３号パンフレット；国際公開第２００７／０２１８４１号パンフレット；国際公開第２００７／１０６７０７号パンフレット；国際公開第０６／０８８４９４号パンフレット；国際公開第０５／１１５４５２号パンフレット；国際公開第０５／１１０４７４号パンフレット；国際公開第０４／１０３２２６９号パンフレット；国際公開第００／４２０７２号パンフレット；国際公開第０６／０８８４９４号パンフレット；国際公開第０７／０２４２４９号パンフレット；国際公開第０５／０４７３２７号パンフレット；国際公開第０４／０９９２４９号パンフレットおよび国際公開第０４／０６３３５１号パンフレット；ならびに／またはLazar et al. (2006) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103(11): 405-410; Presta, L.G. et al. (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4):487-490; Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 26; 277(30):26733-26740およびShields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604のいずれかにおいて開示されている異なるＦｃ改変の任意の組合せを行うことができる。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、野生型Ｆｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはより多くのアミノ酸改変）を含むＦｃドメインを含み、その結果、分子は、野生型Ｆｃ領域を含む同じ分子と比べてヒトＣＤ１６に対する増強された結合親和性を有し、適宜、変異型Ｆｃ領域は、２２１、２３９、２４３、２４７、２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１６、３２０、３２２、３２６、３２９、３３０、３３２、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３５９、３６０、３７０、３７３、３７６、３７８、３９２、３９６、３９９、４０２、４０４、４１６、４１９、４２１、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８および／または４３９（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）のうちのいずれか１つまたは複数の位置における置換を含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、野生型Ｆｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはより多くのアミノ酸改変）を含むＦｃドメインを含み、その結果、分子は、野生型Ｆｃ領域を含む分子と比べてヒトＣＤ１６に対する増強された結合親和性を有し、適宜、変異型Ｆｃ領域は、２３９、２９８、３３０、３３２、３３３および／または３３４のうちのいずれか１つまたは複数の位置における置換（例えばＳ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａおよび／またはＫ３３４Ａ置換）を含み、適宜、変異型Ｆｃ領域は、残基Ｓ２３９およびＩ３３２における置換、例えばＳ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ置換（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）を含む。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、Ｋａｂａｔ残基Ｎ２９７におけるＮ結合型グリコシル化を含むＦｃドメインを含む。一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、ヒトＣＤ１６に対する結合親和性を増加させる変更されたグリコシル化パターンを含むＦｃドメインを含む。そのような炭水化物改変は、例えば、変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞中で多特異性タンパク質をコードする核酸を発現させることにより達成され得る。変更されたグリコシル化機構を有する細胞は当技術分野において公知であり、組換え抗体を発現し、それにより、変更されたグリコシル化を有する抗体を産生するための宿主細胞として使用され得る。例えば、Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1の他に、欧州特許第１１７６１９５号明細書；ＰＣＴ国際公開第０６／１３３１４８号パンフレット；国際公開第０３／０３５８３５号パンフレット；国際公開第９９／５４３４２号パンフレット（これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照。１つの態様において、多特異性タンパク質は、１つまたは複数の低フコシル化された定常領域を含有する。そのような多特異性タンパク質は、アミノ酸変更を含んでもよいか、もしくはアミノ酸変更を含まなくてもよく、かつ／または低フコシル化を結果としてもたらす条件下で発現もしくは合成もしくは処理されてもよい。１つの態様において、多特異性タンパク質組成物は、組成物中の抗体種のうちの少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７５、８５、９０、９５％または実質的にすべてが、フコースを欠いたコア炭水化物構造（例えば複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造）を含む定常領域を有する、本明細書において記載される多特異性タンパク質を含む。１つの実施形態において、提供されるのは、フコースを有するコア炭水化物構造を含むＮ結合型グリカンを含まない多特異性タンパク質組成物である。コア炭水化物は好ましくはＡｓｎ２９７における糖鎖である。
適宜、Ｆｃドメイン二量体を含む多特異性タンパク質は、例えば、表面プラズモン共鳴により評価された場合に、従来的なヒトＩｇＧ１抗体の場合の１－ｌｏｇ以内のヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに対する結合親和性を有することにより特徴付けられ得る。
１つの実施形態において、Ｆｃ受容体結合性を増強するためにＦｃドメインが操作されているＦｃドメイン二量体を含む多特異性タンパク質は、例えば、表面プラズモン共鳴により評価された場合に、従来的なまたは野生型のヒトＩｇＧ１抗体の場合よりも少なくとも１－ｌｏｇ高いヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに対する結合親和性を有することにより特徴付けられ得る。
１つの実施形態において、Ｆｃドメイン二量体を含む多特異性タンパク質は、例えば、表面プラズモン共鳴により評価された場合に、従来的なヒトＩｇＧ１抗体の場合の１－ｌｏｇ以内のヒトＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）ポリペプチドに対する結合親和性を有することにより特徴付けられ得る。
適宜、Ｆｃドメイン二量体を含む多特異性タンパク質は、表面プラズモン共鳴［例えば、本明細書中の実施例におけるように、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上に固定化された二特異性抗体および固定化された二特異性抗体上に注入される可溶性ＣＤ１６ポリペプチドの段階希釈液を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行われるＳＰＲ測定により評価された場合に、１０－５Ｍ（１０μモル濃度）未満、適宜１０－６Ｍ（１μモル濃度）未満のヒトＦｃ受容体ポリペプチド（例えば、ＣＤ１６Ａ）に対する結合性（一価）についてのＫｄにより特徴付けられ得る。
サイトカイン受容体ＡＢＤ
ＮＫ細胞上のサイトカイン受容体に結合する抗原結合性ドメイン（サイトカイン受容体ＡＢＤ）は、有利には、サイトカイン受容体ＡＢＤがＮＫ細胞の表面上のサイトカイン受容体に結合するような好適なサイトカインポリペプチドまたはポリペプチド断片を含むことができる。サイトカインは、例えば、全長野生型ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αもしくはＩＦＮ－βポリペプチド、そのようなサイトカインのためのＮＫ細胞受容体に結合するために十分なその断片、または以上のいずれかの変異型であり得る。サイトカイン分子は、ヒトサイトカインの少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または１００個の連続するアミノ酸を含む断片であり得、サイトカインは、ＮＫ細胞の表面上に存在するそのサイトカイン受容体に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態において、サイトカインは、例えば、非ＮＫ細胞、例えばＴｒｅｇ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞上に存在する受容体に対する結合親和性を減少させるための、野生型ヒトサイトカインと比較して１つまたは複数のアミノ酸改変（例えばアミノ酸置換）を含むヒトサイトカインの変異型である。サイトカインは、例えば、Ｉ型サイトカイン、および、共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）と会合する受容体サブユニット（例えば、ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－１５ＲβまたはＩＬ－２１Ｒ）サブユニットを含むヘテロ多量体またはヘテロ二量体受容体複合体を介してシグナル伝達する共通サイトカイン受容体ガンマ鎖（ｃｇ鎖）サイトカインファミリーのメンバーであり得る。
１つの実施形態において、ＮＫｐ４６および適宜さらにＣＤ１６Ａに結合する多特異性タンパク質は、ヒト野生型サイトカイン対応物と比較して、ＮＫ細胞上に発現されるサイトカイン受容体における結合親和性を減弱（低減）させるために改変されたサイトカイン［またはその変異型の断片（ｏｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔ ｔｈｅｒｅｏｆ）］を組み込んでいる。改変されたサイトカイン（またはその変異型の断片）は、ヒト野生型サイトカイン対応物と比較して、ＮＫ細胞上に発現されるサイトカイン受容体における部分的な活性および／または結合親和性を保持する。１つの実施形態において、サイトカインは、ＮＫ細胞上のその受容体を通じたシグナル伝達を誘導する野生型サイトカイン対応物の能力の少なくとも５％、１０％、２０％または５０％を保持する。
１つの実施形態において、ＮＫｐ４６および適宜さらにＣＤ１６Ａに結合する多特異性タンパク質は、ヒト野生型サイトカイン対応物と比較してＮＫ細胞上に発現されるサイトカイン受容体における実質的に完全な活性および／または結合親和性を保持する野生型サイトカイン（またはその変異型の断片）の組込みを可能にする。１つの実施形態において、サイトカインは、野生型サイトカインもしくはその断片であるか、または改変されたサイトカインであって、サイトカインが、シグナル伝達を誘導する能力の実質的な低減を有しないかつ／またはＮＫ細胞上のその受容体（例えばＣＤ１２２、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＬ－２７Ｒａ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ）における結合親和性の実質的な低減を有しないものである。１つの実施形態において、サイトカインは、ＮＫ細胞上のその受容体（例えばＣＤ１２２、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＬ－２７Ｒａ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ）を通じたシグナル伝達を誘導するその能力を実質的に低減させる改変（例えば、置換、欠失など）を含まない。１つの実施形態において、サイトカインは、ＮＫ細胞上のその受容体（例えばＣＤ１２２、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＬ－２７Ｒａ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ）を通じたシグナル伝達を誘導する野生型サイトカイン対応物の能力の少なくとも８０％、９０％を保持する。適宜、シグナル伝達は、サイトカイン（例えば組換えタンパク質ドメインとしてまたは本開示の多特異性タンパク質内）をＮＫ細胞と接触させ、シグナル伝達を測定すること、例えばＮＫ細胞におけるＳＴＡＴリン酸化を測定することにより評価される。
一部の実施形態において、約１５ｎＭの範囲内のＮＫｐ４６についてのＫＤを有する本明細書において開示される例示的な抗ＮＫｐ４６ ＶＨ／ＶＬペア、またはその機能的に保存的な変異型が、多特異性タンパク質において使用される場合、サイトカインまたはサイトカイン受容体ＡＢＤ（遊離サイトカインとして、または多特異性タンパク質中に組み込まれたものとして）は、ＳＰＲにより決定された場合に、２００ｎＭもしくはそれ未満、１００ｎＭもしくはそれ未満、５０ｎＭもしくはそれ未満または２５ｎＭもしくはそれ未満の結合親和性（ＫＤ）でその受容体に結合するとして特定され得る。１つの実施形態において、サイトカインまたはサイトカイン受容体ＡＢＤは、ＳＰＲにより決定された場合に、１ｎＭまたは１ｎＭより高い、適宜１０ｎＭより高い、適宜１５ｎＭより高い結合親和性（ＫＤ）でその受容体に結合する。１つの実施形態において、サイトカインまたはサイトカイン受容体ＡＢＤは、ＳＰＲにより決定された場合に、約１ｎｍ～約２００ｎｍ、適宜）［（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）］約１ｎｍ～約１００ｎｍ、適宜約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、適宜約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、適宜約１５ｎＭ～約１００ｎＭの結合親和性（ＫＤ）でその受容体に結合する。
サイトカイン結合性ＡＢＤがＣＤ１２２結合性ＡＢＤである場合、ＡＢＤは、ＣＤ１２２ ＡＢＤがＣＤ１２２に結合するような好適なインターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドであるか、またはそれを含むことができる。本明細書において例示されるように、ＡＢＤは、有利には、野生型ヒトインターロイキン－２と比較してＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）に対する低減された結合性（例えば、例えばＳＰＲにより決定された場合に、低減または消失された結合親和性）を有する変異型または改変型ＩＬ－２ポリペプチドである。そのような変異型または改変型ＩＬ－２ポリペプチドはまた、本明細書において「ＩＬ２ｖ」または「非アルファＩＬ－２」として参照される。ＣＤ１２２結合性ＡＢＤは、適宜、野生型ヒトＩＬ－２の場合と実質的に同等であるか、または野生型ヒトＩＬ－２と比較して低減されたヒトＣＤ１２２に対する結合親和性を有するとして特定され得る。ＣＤ１２２結合性ＡＢＤは、適宜、野生型ヒトＩＬ－２の場合と実質的に同等であるＣＤ１２２シグナル伝達を誘導する能力および／またはＣＤ１２２に対する結合親和性を有するとして特定され得る。１つの実施形態において、ＣＤ１２２結合性ＡＢＤは、ＣＤ１２２に対する結合親和性における低減よりも大きいＣＤ２５に対する結合親和性における低減、例えばＣＤ２５に対する結合親和性における少なくとも１－ｌｏｇ、２－ｌｏｇまたは３－ｌｏｇの低減および１－ｌｏｇ未満のＣＤ１２２に対する結合親和性における低減を有する。
例えば、ヘテロ多量体多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６およびＣＤ１２２、および適宜さらにＣＤ１６Ａに結合する能力を有し、かつ対象とする抗原を発現する標的細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する能力を有し、かつ
（ａ）対象とする抗原に結合するＡＢＤ、
（ｂ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＡＢＤ、
（ｃ）ＦｃＲｎ、および適宜さらにＣＤ１６Ａに結合する能力を有するＦｃドメインまたはその部分、ならびに
（ｄ）ヒトＣＤ１２２ポリペプチドに結合するＡＢＤであって、ＡＢＤが、そのようなＡＢＤを含むポリペプチド鎖のＣ末端に置かれており、適宜、そのようなＡＢＤが、ＣＤ１２２に結合するＩＬ－２ポリペプチドまたはその部分を含み、かつヒト野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較してそれぞれヒトＣＤ２５に対する低減された結合親和性を示す、ＡＢＤ
を含むとして特定され得る。ＣＤ１２２に結合するＡＢＤはそのため、例えば、ポリペプチド鎖上のＦｃドメインおよび／またはＮＫｐ４６に結合するＡＢＤのＣ末端におよび／またはそれに隣接して置かれ得る。
ＩＬ－２は、単量体ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）としての形態においてＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）に結合し、続いてＩＬ－２Ｒγ（ＣＤ１３２；共通γ鎖とも称される）サブユニットを動員すると考えられている。表面においてＣＤ２５を発現しない細胞において、ＣＤ１２２に対する結合性（例えば低減された結合性）は、したがって、適宜、ＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体におけるまたはそれに対する結合性であるとして特定され得る。ＣＤ１２２（またはＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体）は、適宜、ＮＫ細胞の表面に存在するとして特定され得る。表面においてＣＤ２５を発現する細胞において、ＩＬ－２は、単量体ＩＬ－２受容体としての形態においてＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）に結合し、続いてサブユニットＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγと会合すると考えられている。ＣＤ２５に対する結合性（例えば低減された結合性、部分的に低減された結合性）は、したがって、適宜、ＣＤ２５：ＣＤ１２２複合体またはＣＤ２５：ＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体におけるまたはそれに対する結合性であるとして特定され得る。
本明細書における多特異性タンパク質において、多特異性タンパク質は、適宜、多特異性タンパク質が細胞（例えばＮＫ細胞、ＣＤ１２２＋ＣＤ２５－細胞）の表面においてＮＫｐ４６（および適宜さらにＣＤ１６）に結合している場合に、ＣＤ１２２ ＡＢＤ（例えばＩＬ２ｖ）が前記細胞の表面においてＣＤ１２２に結合する能力を有するように構成されているかつ／またはコンフォメーションにある（もしくはコンフォメーションを取る能力を有する）として特定され得る。適宜、さらに、多特異性タンパク質：ＣＤ１２２複合体は、前記細胞の表面においてＣＤ１３２に結合する能力を有する。
ＣＤ１２２ ＡＢＤまたはＩＬ２ｖは、改変型ＩＬ－２ポリペプチド、例えば、ＣＤ１２２に対する結合性における減少を伴いまたは伴わずに、ＣＤ２５に対する結合性を減少させる１つまたは複数の（ｏｎｅ ｍｏｒｅ）アミノ酸置換、挿入または欠失を導入することにより改変された単量体ＩＬ－２ポリペプチドであり得る。
一部の実施形態において、ＣＤ２５に対する結合性が選択的に減少されることが求められる場合、ＩＬ－２ポリペプチドは、それを、ＣＤ２５に対する結合性のさらなる減少または消失を結果としてもたらす１つまたは複数の他の追加の分子、例えばポリマーまたは（ポリ）ペプチドと結合または会合させることにより改変され得る。例えば、野生型または突然変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒトＩＬ－２のＣＤ２５結合性部位をシールドするか、マスクするか、それに結合するか、またはそれと相互作用し、それによりＣＤ２５に対する結合性を減少させる別の部分を該ＩＬ－２ポリペプチドに結合させることにより改変またはさらに改変され得る。一部の例において、分子、例えばポリマー（例えばＰＥＧポリマー）は、例えばＩＬ－２ポリペプチド上の特有の部位において専用の化学的フックを含有するアミノ酸を設置するための導入（例えば置換）により、ＣＤ２５により結合されるＩＬ－２上のエピトープをシールドまたはマスクするためにＩＬ－２ポリペプチドにコンジュゲートされる。他の例において、野生型または変異型ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒトＩＬ－２のＣＤ２５結合性部位に結合するかまたはそれと相互作用し、それによりＣＤ２５に対する結合性を減少させる抗ＩＬ－２モノクローナル抗体または抗体断片に結合される。
任意の実施形態において、ＩＬ２ポリペプチドは、全長ＩＬ－２ポリペプチドであり得るか、または、断片もしくはそれを含むＩＬ２ｖが特定される活性を保持する（例えば、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、少なくとも部分的なＣＤ１２２結合性を保持する）限り、ＩＬ－２ポリペプチド断片であり得る。
本明細書において示されるように、ＩＬ２ｖポリペプチドは、有利には、ヒトＣＤ１２２に結合する少なくとも（ａｔ ｌｅａｓｔ ａｔ ｌｅａｓｔ）一部の、または適宜実質的に完全な、能力を保持しながら、ヒトＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）に結合するその能力を低減させるように設計された１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むＩＬ－２ポリペプチドを含むことができる。
ＣＤ２５＋細胞上のＩＬ－２の活性化バイアスを低減させる様々なＩＬ２ｖまたは非アルファＩＬ－２部分が記載されている。そのようなＩＬ２ｖは、ＩＬ－２Ｒαに対する結合性を低減させ、かつＩＬ－２Ｒβに対する少なくとも部分的な結合性を維持する。いくつかのＩＬ２ｖポリペプチドが記載されており、多くは、ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基領域３５～７２および／または７９～９２中に突然変異を有する。例えば、ＩＬ－２Ｒαに対する親和性の減少は、野生型ＩＬ－２ポリペプチドの配列中の以下の残基：Ｒ３８、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、およびＬ７２（アミノ酸残基番号付けは、配列番号４０４において示される成熟ＩＬ－２ポリペプチドを参照している）の１つまたは複数を置換することにより得られてもよい。
野生型成熟ヒトＩＬ－２タンパク質および最初の３つの残基ＡＰＴを欠いた野生型成熟ＩＬ－２ｐタンパク質断片は以下のそれぞれ配列番号４０４および４０５において示される：
野生型成熟ヒトＩＬ－２
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT（配列番号４０４）
野生型成熟ＩＬ－２ｐ：
SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT（配列番号４０５）
例示的なＩＬ２ｖ（本明細書の実施例においてもＩＬ２ｖと称される）は、適宜さらに３つのＮ末端残基ＡＰＡの欠失と共に、以下に示されるように、５つのアミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２ＧおよびＣ１２５Ａを有する野生型ＩＬ－２のアミノ酸を有することができる：
APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT（配列番号４０６）
１または２つもの少ない突然変異は、ＩＬ－２ＲαおよびＬ－２Ｒβに対する結合性を低減させることができる。例えば、本明細書における多特異性タンパク質において例示されるように、野生型ＩＬ－２ｐアミノ酸配列中に２つのアミノ酸置換Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋを有するＩＬ２ｖポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβに対する結合性の保持と共に、ＩＬ－２Ｒαに対する結合性の好適な低減を示し、本明細書においてＩＬ２ｖ２と称される、高度に活性の多特異性タンパク質を結果としてもたらした。
ＩＬ２ｖ２（Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ置換）：
（配列番号４０７）
１つの実施形態において、ＩＬ２ｖポリペプチドは、本明細書においてＩＬ２ｖ３と称される、以下に示されるような、３つのアミノ酸置換Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＴ４１Ａを有する野生型ＩＬ－２ｐアミノ酸配列を有する：
ＩＬ２ｖ３（Ｒ３８Ａ／Ｔ４１Ａ／Ｆ４２Ｋ置換）：
（配列番号４０８）
そのため、１つの実施形態において、ＩＬ２変異型は、ヒト野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して少なくとも１つまたは少なくとも２つのアミノ酸改変（例えば置換、挿入、欠失）を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２ｖは、ヒト野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、Ｒ３８置換（例えばＲ３８Ａ）およびＦ４２置換（例えば、Ｆ４２Ｋ）を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２ｖは、ヒト野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、Ｒ３８置換（例えばＲ３８Ａ）、Ｆ４２置換（例えば、Ｆ４２Ｋ）およびＴ４１置換（例えばＴ４１Ａ）を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２ｖは、ヒト野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、Ｔ３置換（例えばＴ３Ａ）、Ｆ４２置換（例えば、Ｆ４２Ａ）、Ｙ４５置換（例えばＹ４５Ａ）、Ｌ７２置換（例えばＬ７２Ｇ）およびＣ１２５置換（例えばＣ１２５Ａ）を含む。適宜、ＩＬ２ｖは、配列番号４０４～４０９のポリペプチドと同一であるか、またはそれに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含む。適宜、ＩＬ２ｖはヒトＩＬ－２ポリペプチドの断片を含み、断片は、配列番号４０４～４０９のポリペプチドの４０、５０、６０、７０もしくは８０個のアミノ酸の連続する配列と同一であるか、またはそれに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列（ａｍｉｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する。
位置の任意の組合せが改変され得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２変異型は、２つまたはより多くの改変を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－２変異型は、３つまたはより多くの改変を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－２変異型は、４、５、または６つまたはより多くの改変を含む。
ＩＬ２変異型ポリペプチドは、例えば、２、３、４、５、６または７つのアミノ酸改変（例えば置換）を含むことができる。例えば、米国特許第５，２２９，１０９号明細書（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ置換を有するヒトＩＬ２ポリペプチドを提供する。米国特許第９，４４７，１５９号明細書（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇ置換を有するヒトＩＬ２ポリペプチドを記載している。米国特許第９，２６６，９３８号明細書（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、例えばＩＬ－２Ｒα受容体に対する親和性を低減または消失させるための三重突然変異Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇを含む、残基Ｌ７２（例えばＬ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、およびＬ７２Ｋ）、残基Ｆ４２（例えばＦ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、およびＦ４２Ｋ）；ならびに残基Ｙ４５（例えば、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５ＲおよびＹ４５Ｋ）において置換を有するヒトＩＬ２ポリペプチドを記載している。いっそうさらに国際公開第２０２０／０５７６４６号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、アミノ酸残基Ｋ３５、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｙ４５、Ｅ６１およびＥ６８の間の様々な組合せにおけるアミノ酸置換を含むＩＬ－２ｖポリペプチドのアミノ酸配列に関する。いっそうさらに、国際公開第２０２０２５２４１８号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、少なくとも１つのアミノ酸残基位置Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｙ１０７、またはＳ１２５が別のアミノ酸で置換されたＩＬ－２ｖポリペプチドのアミノ酸配列に関し、例えば、アミノ酸置換は、１９位におけるＬ１９Ｄ、Ｌ１９Ｈ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｐ、Ｌ１９Ｑ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｙの置換、３８位におけるＲ３８Ａ、Ｒ３８Ｆ、Ｒ３８Ｇの置換、４１位におけるＴ４１Ａ、Ｔ４１Ｇ、およびＴ４１Ｖの置換、４２位におけるＦ４２Ａの置換、４４位におけるＦ４４ＧおよびＦ４４Ｖの置換、６２位におけるＥ６２Ａ、Ｅ６２Ｆ、Ｅ６２Ｈ、およびＥ６２Ｌの置換、６５位におけるＰ６５Ａ、Ｐ６５Ｅ、Ｐ６５Ｇ、Ｐ６５Ｈ、Ｐ６５Ｋ、Ｐ６５Ｎ、Ｐ６５Ｑ、Ｐ６５Ｒの置換、６８位におけるＥ６８Ｅ、Ｅ６８Ｆ、Ｅ６８Ｈ、Ｅ６８Ｌ、およびＥ６８Ｐの置換、１０７位におけるＹ１０７Ｇ、Ｙ１０７Ｈ、Ｙ１０７ＬおよびＹ１０７Ｖの置換、ならびに１２５位におけるＳ１２５Ｉの置換、１２６位におけるＱ１２６Ｅの置換からなる群から選択される。位置の番号付けは野生型成熟ヒトＩＬ－２に関する。
改変型ＩＬ－２は、適宜、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチド（例えば配列番号４０４のアミノ酸配列を含む）と比較して、少なくとも１－ｌｏｇ、適宜少なくとも２－ｌｏｇ、適宜少なくとも３－ｌｏｇ減少したＣＤ２５またはＣＤ２５：ＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体に対する結合性についてのＫＤを呈するとして特定され得る。改変型ＩＬ－２は、適宜、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＣＤ２５またはＣＤ２５：ＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体に対する２０％、３０％、４０％または５０％未満の結合親和性を呈するとして特定され得る。ＩＬ２は、適宜、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＣＤ１２２またはＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体に対する少なくとも５０％、７０％、８０％または９０％の結合親和性を呈するとして特定され得る。一部の実施形態において、ＩＬ２は、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＣＤ１２２またはＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体に対する少なくとも５０％、６０％、７０％または８０％であるが１００％未満の結合親和性を呈する。一部の実施形態において、ＩＬ２ｖは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＣＤ２５に対する５０％未満の結合親和性およびＣＤ１２２に対する少なくとも５０％、６０％、７０％または８０％の結合親和性を呈する。
ＣＤ２５およびＣＤ１２２ならびにその複合体に対する野生型および開示される突然変異体ポリペプチドの結合親和性における差異は、例えば、当業者が精通しているタンパク質－タンパク質相互作用の親和性を測定する標準的な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにおいて測定され得る。
例示的なＩＬ２変異型ポリペプチドは、配列番号４０４のアミノ酸配列を有する野生型成熟ＩＬ－２ポリペプチドと比べて１つもしくはより多くの、２つもしくはより多くの、または３つもしくはより多くのＣＤ２５親和性低減性アミノ酸置換を有する。１つの実施形態において、例示的なＩＬ２ｖポリペプチドは、以下の群：Ｑ１１、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｑ２２、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｌ７２、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｔ１２３、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｉ１２９、およびＳ１３０から選択される１つもしくはより多くの、２つもしくはより多くの、または３つもしくはより多くの置換された残基を含む。
１つの実施形態において、例示的なＩＬ２変異型ポリペプチドは、アミノ酸残基位置Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｙ１０７、またはＳ１２５のうちの１、２、３、４、５またはより多くが別のアミノ酸で置換されている。
１つの実施形態において、ＣＤ２５またはそれを含むタンパク質複合体（例えば、ＣＤ２５：ＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体）に対する親和性の減少は、野生型成熟ＩＬ－２ポリペプチドの配列中の以下の残基：Ｒ３８、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、およびＬ７２のうちの１つまたは複数を置換することにより得られてもよい。
１つの実施形態において、ＣＤ１２２ ＡＢＤまたはＩＬ－２ポリペプチドはＩＬ－２模倣性ポリペプチドである。例えばSilva et al, (2019) Nature 565(7738): 186-191および国際公開第２０２０／００５８１９号パンフレット（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載されるように、合成ＩＬ－２／ＩＬ－１５ポリペプチド模倣物は、ＣＤ１２２に結合するがＣＤ２５には結合しないようにコンピュータにより設計可能であり、これはまた、ＣＤ１２２に結合するがＣＤ２５には結合しないＩＬ－２およびＩＬ－１５模倣性ポリペプチドを提供する。
例えば、ＩＬ－２模倣性ポリペプチドは、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含む天然に存在しないポリペプチドとして特徴付け可能であり、
（ａ）Ｘ１は、ＥＨＡＬＹＤＡＬ（配列番号４０９）に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり；
（ｂ）Ｘ２は、少なくとも８アミノ酸の長さのヘリカルペプチドであり；
（ｃ）Ｘ３は、ＹＡＦＮＦＥＬＩ（配列番号４１０）に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり；
（ｄ）Ｘ４は、ＩＴＩＬＱＳＷＩＦ（配列番号４１１）に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、ポリペプチド中で任意の順序であってもよく、
アミノ酸リンカーが任意のドメインの間に存在してもよく、かつポリペプチドはＣＤ１２２（またはＣＤ１２２：ＣＤ１３２ヘテロ二量体）に結合する。適宜、ポリペプチドは、２００ｎＭもしくはそれ未満、１００ｎＭもしくはそれ未満、５０ｎＭもしくはそれ未満または２５ｎＭもしくはそれ未満の結合親和性でＣＤ１２２：ＣＤ１３２ヘテロ二量体に結合する。
１つの態様において、本発明は、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含む天然に存在しないポリペプチドであって、
（ａ）Ｘ１が、アミノ酸（ａｍｍｏ ａｃｉｄ）配列ＥＨＡＬＹＤＡＬ（配列番号４０９）を含むペプチドであり；
（ｂ）Ｘ２が、少なくとも８アミノ酸の長さのヘリカルペプチドであり；
（ｃ）Ｘ３が、アミノ酸配列ＹＡＦＮＦＥＬＩ（配列番号４１０）を含むペプチドであり；
（ｄ）Ｘ４が、アミノ酸配列ＩＴＩＬＱＳＷＩＦ（配列番号４１１）を含むペプチドであり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４が、ポリペプチド中で任意の順序であってもよく、
アミノ酸リンカーが任意のドメインの間に存在してもよく、かつポリペプチドがＣＤ１２２（またはＣＤ１２２：ＣＤ１３２ヘテロ二量体）に結合する、ポリペプチドを提供する。適宜、ポリペプチドは、２００ｎＭもしくはそれ未満、１００ｎＭもしくはそれ未満、５０ｎＭもしくはそれ未満または２５ｎＭもしくはそれ未満、適宜約１ｎｍ～約１００ｎｍ、適宜約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、適宜約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、適宜約１５ｎＭ～約１００ｎＭの結合親和性でＣＤ１２２：ＣＤ１３２ヘテロ二量体に結合する。
１つの例において、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４は任意の好適な長さであってもよく、すなわち、各々のドメインは、それぞれ配列番号４０９、４１０および４１１のペプチド以外の任意の好適な数の追加のアミノ酸を含有してもよい。１つの実施形態において、Ｘ１は、ペプチド ＰＫＫＫＩＱＬＨＡＥＨＡＬＹＤＡＬＭＩＬＮＩ（配列番号４１２）に対してその長さに沿って少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり；Ｘ３は、アミノ酸配列ＬＥＤＹＡＦＮＦＥＬＩＬＥＥＩＡＲＬＦＥＳＧ（配列番号４１３）に対してその長さに沿って少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり；かつＸ４は、アミノ酸配列ＥＤＥＱＥＥＭＡＮＡＩＩＴＩＬＱＳＷＩＦＳ（配列番号４１４）に対してその長さに沿って少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。
１つの例において、コンピュータにより設計される合成ＩＬ－２ポリペプチドまたは模倣物（またはＣＤ１２２ ＡＢＤ）は、［（ＧＳ４）３ドメインリンカーを有するまたは有しない］以下において示されるアミノ酸配列［ネオロイキン（ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ）］を含む：
PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS（配列番号４１５）
または
GSSSSGSSSSGSSSSPKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS（配列番号４１６）
さらに他の例において、ＩＬ－２ポリペプチドは、それを、ＣＤ２５に対する結合性の減少を結果としてもたらす１つまたは複数の他の追加の化合物、化学的化合物、ポリマー（例えばＰＥＧ）、またはポリペプチドもしくはポリペプチド鎖と接続、融合、結合または会合させることにより改変される。例えば、野生型ＩＬ－２ポリペプチドまたはその断片は、ヒトＩＬ－２のＣＤ２５結合性部位に結合するかまたはそれと相互作用し、それによりＣＤ２５に対する結合性を減少させる抗ＩＬ－２モノクローナル抗体またはその抗体断片を含むがそれに限定されない、ＣＤ２５結合性ペプチドまたはポリペプチドをそれに結合させることにより改変され得る。
１つの例において、ＩＬ－２は、受容体ドメイン、例えば、サイトカイン受容体ドメインをさらに含む。１つの実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ－２受容体、またはその断片（例えば、ＩＬ－２受容体アルファのＩＬ－２結合性ドメイン）を含む。１つの例において、Lopes et al, J Immunother Cancer. 2020; 8(1)（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載されるように、ＣＤ２５由来ポリペプチドはＩＬ－２ポリペプチドに融合している。１つの例において、ＩＬ－２は、ＣＤ２５ポリペプチドに融合した循環置換された（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ ｐｅｒｍｕｔｅｄ）（ｃｐ）ＩＬ－２を含む変異型融合タンパク質である（例えば、ＰＣＴ国際公開第２０２０／２４９６９３号パンフレットを参照；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＤ１２２ ＡＢＤが、ＣＤ２５ポリペプチドに融合した循環置換された（ｃｐ）ＩＬ－２を含む場合、ＡＢＤは、ＰＣＴ国際公開第２０１３／１８４９４２号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載されるｃｐＩＬ－２：ＩＬ－２Ｒａポリペプチドまたはタンパク質を含むことができる。例えば、ＣＤ２５ポリペプチドに融合した置換された（ｐｅｒｍｕｔｅｄ）（ｃｐ）ＩＬ－２変異型は、アミノ酸配列：
SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGSS STKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK PLEEVLNLAQGSGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLY MLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLP GHCREPPPWENEATERIYHFWGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWT QPQLICTG（配列番号４１７）、または配列番号４１７の約２０アミノ酸から全長までの連続するストレッチにかけて約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。
１つの例において、ＩＬ－２は、特異的な抗ＩＬ－２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と会合しており、そのためＩＬ－２／抗ＩＬ－２ ｍＡｂ複合体（ＩＬ－２ｃｘ）を形成している。そのような複合体は、ＣＤ２５結合性を克服することが示されている［Boyman et al., Science 311, 1924-1927 (2006)］。例示的な抗ＩＬ２抗体は抗体ＮＡＲＡ１である。ＰＣＴ国際公開第２０１７／１２２１３０号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、柔軟性リンカーが、ＮＡＲＡ１の軽鎖または重鎖の可変領域にＩＬ－２を接続するために使用されている融合タンパク質を記載している。Sahin et al. [Nature Communications volume 11, Article number: 6440 (2020)]は、ＩＬ－２が、ＮＡＲＡ１の軽鎖の相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）と接触させられ、かつそれに結合しており、ＩＬ－２が抗体断片（または断片のポリペプチド鎖）上のその抗原結合性溝に結合しているタンパク質複合体を結果としてもたらす、改善されたコンストラクトを記載している。
他の例において、ＩＬ－２ポリペプチドまたはその断片は、選択された位置において導入された天然アミノ酸または非天然アミノ酸に共有結合された対象とする部分（例えば化合物、化学的化合物、ポリマー、直鎖状または分岐鎖状ＰＥＧポリマー）をそれに結合させることにより改変され得る。そのような改変型インターロイキン２（ＩＬ－２）ポリペプチドは、改変型ＩＬ－２ポリペプチドとＣＤ２５との間の結合性を低減させるがＣＤ１２２：ＣＤ１３２シグナル伝達複合体に対する意義のある結合性を保持するポリペプチド上の位置において少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むことができ、ＣＤ２５に対する低減された結合性は、野生型ＩＬ－２ポリペプチドとＣＤ２５との間の結合性と比較したものである。非天然アミノ酸は、ＩＬ－２の残基Ｋ３５、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｌ７２、Ｍ１０４、Ｃ１０５、およびＹ１０７のうちのいずれか１つまたは複数において位置付けられ得る。ＰＣＴ国際公開第２０１９／０２８４１９号パンフレットおよび国際公開第２０１９／０１４２６７号パンフレット（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）において開示されるように、非天然アミノ酸は、直交性ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡペアにより改変型ＩＬ－２ポリペプチド中に組み込まれ得る。非天然アミノ酸は、例えば、リジンアナログ、芳香族側鎖、アジド基、アルキン基、またはアルデヒドもしくはケトン基を含むことができる。改変型ＩＬ－２ポリペプチドは次に、水溶性ポリマー、脂質、タンパク質、またはペプチドに非天然アミノ酸を通じて共有結合され得る。好適なポリマーの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカリド）、ポリ（ａ－ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）、またはその組合せ、または多糖、例えばデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アミロース、ヘパリン、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、デキストリン、もしくはヒドロキシエチル－デンプン（ＨＥＳ）を含む。
一部の例において、例示的なＩＬ２ｖ／非アルファＩＬ－２コンジュゲートは、ＩＬ－２ポリペプチド中のアミノ酸残基（例えばＫ３５、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｋ４３、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｅ６８、Ｙ４５、Ｖ６９、およびＬ７２から選択される位置における残基）が、ポリマーに化学的リンカーを介して結合された天然または非天然アミノ酸残基により置き換えられたＩＬ－２ポリペプチドの全長または断片を含むことができる。ポリマーは、ＰＥＧポリマー、例えば５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、および６０ｋＤａから選択される平均分子量を有するＰＥＧ基であり得る。
改変型ＩＬ２ポリペプチドは、改変型ＩＬ－２ポリペプチドとＣＤ２５との間の結合性を低減させるが、ＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体を形成するＣＤ１２２：ＣＤ１３２シグナル伝達複合体との意義のある結合性を保持するポリペプチド上の位置において少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むことができ、ＣＤ２５に対する低減された結合性は、野生型ＩＬ－２ポリペプチドとＣＤ２５との間の結合性と比較したものである。例示的なＩｌ２ｖ／非アルファＩＬ－２コンジュゲートはＴＨＯＲ－７０７（Ｓｙｎｔｈｏｒｘ ｉｎｃ）である。
例えば、ＰＣＴ国際公開第２０２０／１６３５３２号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載されるように、ＩＬ－２コンジュゲート中のアミノ酸残基は、式（Ｉ）：
［式中、
ＺはＣＨ２であり、かつＹは
であるか、
ＹはＣＨ２であり、かつＺは
であるか、
ＺはＣＨ２であり、かつＹは
であるか、または
ＹはＣＨ２であり、かつＺは
であり、
かつＷは、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、および６０ｋＤａから選択される平均分子量を有するＰＥＧ基であり；かつ
Ｘは、構造：
を有する］
の構造により置き換えられる。
１つの実施形態において、ＩＬ－２は、放出可能なポリマー（例えば放出可能なＰＥＧポリマー）を含み、例えばＩＬ－２は、インビボおよび／またはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でＣＤ２５結合性における減少を結果としてもたらす放出可能なポリマーにコンジュゲート、連結または結合している。そのような改変型ＩＬ－２の例はベムペガルデスロイキンまたはＲＳＬＡＩＬ－２（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎｃ．）を含み、これは、ＩＬ－２と比べてＣＤ２５に対する親和性における約６０倍の減少を呈するが、ＩＬ－２と比べてＣＤ１２２に対する親和性における約５倍のみの減少を呈する。「ベムペガルデスロイキン」（ＣＡＳ番号１９３９１２６－７４－５）は、ヒトインターロイキン－２（デス－１－アラニン、１２５－セリン）が、そのアミノ残基において平均で６個の［（２，７－ビス｛［メチルポリ（オキシエチレン）ｉｏｋＤ］カルバモイル｝－９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル部分でＮ置換されているＩＬ－２である。ＰＣＴ国際公開第２０２０／０９５１８３号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において開示されるように、含まれる放出可能なＰＥＧは、アミド連結［フルオレン－Ｃ（０）－ＮＨ～］を介してフルオレン環上の２および７位から伸長しており、かつフルオレン環の９位にメチレン基（－ＣＨ２－）を介して結合されたカルバミン酸窒素原子への結合を介するＩＬ－２への放出可能な共有結合を有するポリ（エチレングリコール）鎖を用いて２，７，９－置換されたフルオレンに基づき得る。改変型ＩＬ－２は、以下の式：
［式中、各々の「ｎ」は、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ単位の数であり、約３～約４０００の整数、またはより好ましくは約２００～３００の整数である。「ｍ」は、ＩＬ－２に結合されたポリエチレングリコール部分の数を指し、１、２、３、７および７より大きい整数からなる群から選択される整数である］により包含される化合物を含むことができる。一部の実施形態において、各々の「ｎ」はおおよそ同じであり、すなわち、フルオレニルコアに共有結合的に結合された各々のポリエチレングリコール「アーム」の重量平均分子量はおおよそ同じである。適宜、各々のＰＥＧアームの重量平均分子量は約１０，０００ダルトンであり、その結果、全体的な分岐ポリマー部分の重量平均分子量は約２０，０００ダルトンである。
サイトカイン結合性ＡＢＤがＣＤ１２２結合性ＡＢＤである別の実施形態において、ＡＢＤは、ＣＤ１２２ ＡＢＤがＣＤ１２２に結合するような好適なインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）ポリペプチドであるか、またはそれを含むものであり得る。一部の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ－１５分子、例えば、ＩＬ－１５、例えば、ヒトＩＬ－１５の全長、断片または変異型（ＩＬ－１５ｖ）である。一部の実施形態において、ＩＬ－１５分子は、例えば、配列番号４１８のアミノ酸配列を有する、野生型ヒトＩＬ－１５アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－１５分子は、配列番号４１８の成熟野生型ヒトＩＬ－１５アミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ配列を含む。他の実施形態において、ＩＬ－１５分子は、例えば、１つまたは複数のアミノ酸改変を有する、ヒトＩＬ－１５の変異型である。適宜、ＩＬ－１５は、ヒトＩＬ－１５ポリペプチドの断片を含み、断片は、配列番号４１８の野生型成熟ヒトＩＬ－１５ポリペプチドの４０、５０、６０、７０もしくは８０個のアミノ酸の連続する配列と同一であるか、またはそれに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列を有する。
野生型成熟ヒトＩＬ－１５：
NW VNVISDLKKI EDLIQSMHID ATLYTESDVH PSCKVTAMKC FLLELQVISL ESGDASIHDT VENLIILANN SLSSNGNVTE SGCKECEELE EKNIKEFLQS FVHIVQMFIN TS（配列番号４１８）
一部の実施形態において、例えば、米国特許第２０１６／０１８４３９９号明細書において記載されるように、ＩＬ－１５変異型は、４５、５１、５２、または７２位（ヒトＩＬ－１５の配列、配列番号４１８に関する）において改変（例えば置換）を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－１５変異型は、４、５、または６またはより多くの改変を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－１５変異型は、８、１０、６１、６４、６５、７２、１０１、または１０８位（ヒトＩＬ－１５の配列、配列番号４１８に関する）のアミノ酸において１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－１５変異型は、野生型ＩＬ－１５と比較して増加したＣＤ１２２に対する親和性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－１５変異型は、野生型ＩＬ－１５と比較して減少したＣＤ１２２に対する親和性を有する。一部の実施形態において、突然変異は、Ｄ８Ｎ、Ｋ１０Ｑ、Ｄ６１Ｎ、Ｄ６１Ｈ、Ｅ６４Ｈ、Ｎ６５Ｈ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｈ、Ｑ１０１Ｎ、Ｑ１０８Ｎ、またはＱ１０８Ｈ（ヒトＩＬ－１５の配列、配列番号４１８に関する）から選択される。位置の任意の組合せが突然変異され得る。一部の実施形態において、ＩＬ－１５変異型は、２つまたはより多くの突然変異を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－１５変異型は、３つまたはより多くの突然変異を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－１５変異型は、４、５、または６またはより多くの突然変異を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－１５変異型は、６１および６４位における突然変異を含む。一部の実施形態において、６１および６４位における突然変異はＤ６１ＮまたはＤ６１ＨおよびＥ６４ＱまたはＥ６４Ｈである。一部の実施形態において、ＩＬ－１５変異型は６１および１０８位における突然変異を含む。一部の実施形態において、６１および１０８位における突然変異はＤ６１ＮまたはＤ６１ＨおよびＱ１０８ＮまたはＱ１０８Ｈである。
ＩＬ－１５Ｒαの細胞外ドメインは、ＩＬ－１５に結合する、ｓｕｓｈｉドメインとして参照されるドメインを含む。一般的なｓｕｓｈｉドメインは、補体制御タンパク質（ＣＣＰ）モジュールまたはショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）としても参照され、補体システムの複数のメンバーを含む、いくつかのタンパク質中に見出されるタンパク質ドメインである。ｓｕｓｈｉドメインは、約６０アミノ酸の配列ストレッチを含む、４つの高度に保存されたシステイン残基のうちの第１および第４のシステインにより結合されるベータ－サンドイッチフォールドを取る（Norman, Barlow, et al. J Mol Biol. 1991;219(4):717-25）。ＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインの第１および第４のシステインにより結合されるアミノ酸残基は、最小ドメインとして参照される６２アミノ酸ポリペプチドを含む。最小ｓｕｓｈｉドメインのＮおよびＣ末端においてＩＬ－１５Ｒαの追加のアミノ酸を含むこと、例えばＮ末端ＩｌｅおよびＴｈｒならびにＣ末端ＩｌｅおよびＡｒｇ残基を含むことは、６５アミノ酸伸長されたｓｕｓｈｉドメインを結果としてもたらす。
ＣＤ１２２ ＡＢＤは、受容体ドメイン、例えば、サイトカイン受容体ドメインをさらに含むことができる。１つの実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ－１５受容体、またはその断片（例えば、ＩＬ－１５受容体アルファのＩＬ－１５結合性ドメイン）を含む。
一部の実施形態において、ＣＤ１２２ ＡＢＤは、ＩＬ－１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒα）ｓｕｓｈｉドメイン、第１のドメインリンカー、およびＩＬ－１５ポリペプチドに結合し、例えばＮ末端からＣ末端へ、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインはドメインリンカーに融合しており、次いでドメインリンカーはＩＬ－１５ポリペプチドに融合している。適宜、ＩＬ－１５ポリペプチドは、例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、変異型ＩＬ－１５ポリペプチドである。他の実施形態において、変異型ＩＬ－１５ドメインは、配列番号４１８のアミノ酸配列ならびにＮ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、およびＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。
本明細書において記載されているｓｕｓｈｉドメインは、野生型ｓｕｓｈｉドメインと比べて１つまたは複数の突然変異を含んでもよい。一部の実施形態において、ＩＬ－ｌ５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインは以下のアミノ酸配列を含む：
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR（配列番号４１９）
ＩＬ－１５ポリペプチドは、いくつかの公知の技術のいずれかを使用して、例えばＩＬ－１５Ｒαに対する結合性の減少を結果としてもたらす化学的化合物、ポリマー（例えばＰＥＧ）、またはポリペプチドもしくはポリペプチド鎖へのコンジュゲーションまたは結合により、ＩＬ－１５ポリペプチドを１つまたは複数の他の追加の化合物と接続、融合、結合または会合させることにより改変され得る。１つの例において、野生型ＩＬ－１５ポリペプチドまたはその断片は、ヒトＩＬ－１５のＩＬ－１５Ｒα結合性部位に結合するかまたはそれと相互作用し、それによりＩＬ－１５Ｒαに対する結合性を減少させる抗ＩＬ－１５モノクローナル抗体またはその抗体断片を含むがそれに限定されない、ＩＬ－１５Ｒα結合性ペプチドまたはポリペプチドを野生型ＩＬ－１５ポリペプチドまたはその断片に結合させることにより改変され得る。
別の例において、ＩＬ－１５ポリペプチドまたはその断片は、選択された位置において導入された新規のアミノ酸に共有結合された対象とする部分（例えば化合物、化学的化合物、ポリマー、直鎖状または分岐鎖状ＰＥＧポリマー）をそれに結合させることにより改変され得る。そのような改変型ＩＬ－１５ポリペプチドは、改変型ＩＬ－１５ポリペプチドとＩＬ－１５Ｒαとの間の結合性を低減させるがＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体を形成するＣＤ１２２：ＣＤ１３２シグナル伝達複合体との意義のある結合性を保持するポリペプチド上の位置において少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むことができ、ＩＬ－１５Ｒαに対する低減された結合性は、野生型ＩＬ－１５ポリペプチドとＩＬ－１５Ｒαとの間の結合性と比較したものである。非天然アミノ酸は、ＩＬ－１５の残基Ｎ１、Ｗ２、Ｖ３、Ｎ４、１６、Ｓ７、Ｄ８、Ｋ１０、Ｋ１１、Ｅ１３、Ｄ１４、Ｌ１５、Ｑ１７、Ｓ１８、Ｍ１９、Ｈ２０、１２１、Ｄ２２、Ａ２３、Ｔ２４、Ｌ２５、Ｙ２６、Ｅ２８、Ｓ２９、Ｄ３０、Ｖ３１、Ｈ３２、Ｐ３３、Ｓ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｖ３７、Ｔ３８、Ｋ４１、Ｌ４４、Ｅ４６、Ｑ４８、Ｖ４９、Ｓ５１、Ｌ５２、Ｅ５３、Ｓ５４、Ｇ５５、Ｄ５６、Ａ５７、Ｓ５８、Ｈ６０、Ｄ６１、Ｔ６２、Ｖ６３、Ｅ６４、Ｎ６５、Ｉ６７、Ｉ６８、Ｌ６９、Ｎ７１、Ｎ７２、Ｓ７３、Ｌ７４、Ｓ７５、Ｓ７６、Ｎ７７、Ｇ７８、Ｎ７９、Ｖ８０、Ｔ８１、Ｅ８２、Ｓ８３、Ｇ８４、Ｃ８５、Ｋ８６、Ｅ８７、Ｃ８８、Ｅ８９、Ｅ９０、Ｌ９１、Ｅ９２、Ｅ９３、Ｋ９４、Ｎ９５、１９６、Ｋ９７、Ｅ９８、Ｌ１００、Ｑ１０１、Ｓ１０２、Ｖ１０４、Ｈ１０５、Ｑ１０８、Ｍ１０９、Ｆ１１０、Ｉ１１１、Ｎ１１２、Ｔ１１３、およびＳ１１４のうちのいずれか１つまたは複数において位置付けられ得る。国際公開第２０１９１６５４５３号パンフレット、国際公開第２０１９／０２８４１９号パンフレットおよび国際公開第２０１９／０１４２６７号パンフレット（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）において開示されるように、非天然アミノ酸は、直交性ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡペアにより改変型ＩＬ－２ポリペプチド中に組み込まれ得る。非天然アミノ酸は、例えば、リジンアナログ、芳香族側鎖、アジド基、アルキン基、またはアルデヒドもしくはケトン基を含むことができる。改変型ＩＬ－１５ポリペプチドは次に、水溶性ポリマー、脂質、タンパク質、またはペプチドに非天然アミノ酸を通じて共有結合され得る。好適なポリマーの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカリド）、ポリ（ａ－ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）、またはその組合せ、または多糖、例えばデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アミロース、ヘパリン、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、デキストリン、もしくはヒドロキシエチル－デンプン（ＨＥＳ）を含む。
例えば、国際公開第２０２０／１６３５３２号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載されるように、ＩＬ－１５コンジュゲート中のアミノ酸残基は、式（Ｉ）：
［式中、
ＺはＣＨ２であり、かつＹは
であるか、
ＹはＣＨ２であり、かつＺは
であるか、
ＺはＣＨ２であり、かつＹは
であるか、または
ＹはＣＨ２であり、かつＺは
であり、
かつＷは、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、および６０ｋＤａから選択される平均分子量を有するＰＥＧ基であり；かつ
Ｘは、構造：
を有する］
の構造により置き換えられる。
１つの実施形態において、ＩＬ－１５は、放出可能なポリマー（例えば放出可能なＰＥＧポリマー）を含み、例えば、ＩＬ－１５は、インビボおよび／またはインビトロでＩＬ－１５Ｒ結合性における減少を結果としてもたらす放出可能なポリマーにコンジュゲート、連結または結合している。例は、ＰＣＴ国際公開第２０２０／０９７５５６号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において開示される化合物を含む。例えば、改変型ＩＬ－１５は、構造：
［式中、（ｎ）は約１５０～約３，０００の整数であり、（ｍ）は、２、３、４、および５から選択される整数であり、（ｎ’）は１であり、かつ～ＮＨ～はＩＬ－１５ポリペプチドのアミノ基を表す］
を有する化合物を含むことができる。
サイトカイン結合性ＡＢＤがＩＬ－２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）結合性ＡＢＤに結合する別の実施形態において、ＡＢＤは、ＩＬ－２１Ｒ ＡＢＤがＮＫ細胞の表面上のＩＬ－２１Ｒに結合するような好適なインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）ポリペプチドであるか、またはそれを含むものであり得る。ＩＬ－２１Ｒは、ＩＬ－２受容体およびＩＬ－１５受容体と構造が類似しており、これらのサイトカイン受容体の各々は共通ガンマ鎖（γｃ）を含む。一部の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ－２１分子、例えば、ＩＬ－２１、例えば、ヒトＩＬ－２１の全長、断片または変異型である。実施形態において、ＩＬ－２１分子は、例えば、配列番号４２０のアミノ酸配列を有する、野生型ヒトＩＬ－２１である。一部の実施形態において、ＩＬ－１５分子は、配列番号４２０の成熟野生型ヒトＩＬ－２１アミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ配列を含む。他の実施形態において、ＩＬ－２１分子は、例えば、１つまたは複数のアミノ酸改変を有する、ヒトＩＬ－２１の変異型である。適宜、ＩＬ－２１はヒトＩＬ－２１ポリペプチドの断片を含み、断片は、配列番号４２０のポリペプチドの４０、５０、６０、７０もしくは８０個のアミノ酸の連続する配列と同一であるか、またはそれに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列を有する。
野生型成熟ヒトＩＬ－２１：
HKSSSQ GQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEF LPAPEDVETN CEWSAFSCFQ KAQLKSANTG NNERIINVSI KKLKRKPPST NAGRRQKHRL TCPSCDSYEK KPPKEFLERF KSLLQKMIHQ HLSSRTHGSE DS（配列番号４２０）
一部の実施形態において、ＩＬ－２１変異型は、ヒトＩＬ－２１Ｒに結合する実質的な能力を保持しながら、ヒトＩＬ－２１Ｒに結合するその能力を低減させるように設計された１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むＩＬ－２１ポリペプチドを含むことができる。例えば、ＩＬ－２１は、ＳＰＲにより決定された場合に、約０．０４ｎＭより高いかまたは約０．０４ｎＭであるＫＤでヒトＩＬ－２１Ｒに結合するとして特徴付けられ得る。
そのようなＩＬ－２１変異型の例はＰＣＴ国際公開第２０１９０２８３１６号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において提供されている。例示的な態様において、アミノ酸置換は、配列番号４２０の番号付けに従って１０、１４、２０、７５、７６、７７、７８および８１からなる群から選択される２つのアミノ酸位置に、または配列番号４２１のアミノ酸位置番号付けに従って５、９、１５、７０、７１、７２、７３、および７６からなる群から選択される２つのアミノ酸位置に位置する。例示的な態様において、ＩＬ－２１変異型は、アミノ酸配列：
QGQDX HMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPE FLPAP EDVET NCEWS AFSCF QKAQL KSANT GNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGR RQKHR LTCPS CDSYE KKPPK EFLXX FXXLL XXMXX QHXSS RTHGS EDS（配列番号４２１）を含み、Ｘは任意のアミノ酸を表し、かつＩＬ－２１変異型アミノ酸配列は、ヒトＩＬ－２１のアミノ酸配列（配列番号４２０）から少なくとも１アミノ酸だけ異なる。
例示的な態様において、ＩＬ－２１変異型は、配列番号４２１においてＸにより指定される位置において少なくとも１つのアミノ酸だけ配列番号４２０から異なる配列番号４２１の配列を含む。例示的な態様において、ＩＬ－２１変異型は、配列番号４２０に対して少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または約９０％より高い（例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％）配列同一性を有する。
例示的な実施形態において、ＩＬ－２１変異型は、配列番号４２０のアミノ酸位置番号付けに従って、アミノ酸配列のＮ末端半分内において、例えば１０～３０または１３～２８位（両方とも両端を含む）内の位置において、野生型ＩＬ－２１アミノ酸配列と比べてアミノ酸置換を含む。他の例示的な実施形態において、ＩＬ－２１変異型は、配列番号４２０のアミノ酸位置番号付けに従って、アミノ酸配列のＣ末端半分内において、例えば、１０５～１３８または１１４～１２８位（両方とも両端を含む）内の位置において、野生型ＩＬ－２１アミノ酸配列と比べてアミノ酸置換を含む。他の例示的な実施形態において、ＩＬ－２１変異型は、配列番号４２０のアミノ酸位置番号付けに従って、アミノ酸配列の３分割の中央において、例えば、６０～９０または７０～８５位（両方とも両端を含む）内の位置において、野生型ＩＬ－２１アミノ酸配列と比べてアミノ酸置換を含む。
適宜、ＩＬ－２１変異型は、野生型ＩＬ－２１アミノ酸配列と比べて、１つのみのアミノ酸置換を含む。適宜、アミノ酸置換は、配列番号４２０のアミノ酸位置番号付けに従って、１０、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２８、７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、８０、８１、８２、８３、８４、８５、１１４、１１５、１１７、１１８、１２１、１２２、１２４、１２５、または１２８からなる群から選択されるアミノ酸位置に位置する。
サイトカイン結合性ＡＢＤがＩＬ－１８受容体（ＩＬ－１８Ｒα）結合性ＡＢＤに結合する別の実施形態において、ＡＢＤは、ＩＬ－１８Ｒ ＡＢＤがＮＫ細胞の表面上のＩＬ－１８Ｒαに結合するような好適なインターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチドであるか、またはそれを含むものであり得る。一部の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ－１８分子、例えば、ＩＬ－１８、例えば、ヒトＩＬ－１８の全長、断片または変異型である。実施形態において、ＩＬ－１８分子は、例えば、配列番号４２２のアミノ酸配列を有する、野生型ヒトＩＬ－１８である。一部の実施形態において、ＩＬ－１８分子は、配列番号４２２の成熟野生型ヒトＩＬ－１８アミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ配列を含む。他の実施形態において、ＩＬ－１８分子は、例えば、１つまたは複数のアミノ酸改変を有する、ヒトＩＬ－１８の変異型である。適宜、ＩＬ－１８はヒトＩＬ－１８ポリペプチドの断片を含み、断片は、配列番号４２２のポリペプチドの４０、５０、６０、７０もしくは８０個のアミノ酸の連続する配列と同一であるか、またはそれに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列を有する。
野生型成熟ヒトＩＬ－１８：
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED（配列番号４２２）
１つの実施形態において、ＩＬ－１８は、ＩＬ－１８Ｒαに対する親和性を実質的に減少させないままＩＬ－１８ＢＰに対するその結合親和性を減少させるために改変される。例えば、ＩＬ－１８は、適宜Ｋ５３および／またはＭ６０における置換とさらに組み合わせて、ＩＬ－１８Ｒα結合性に関与しない位置Ｍ５１、Ｓ５５、Ｒ１０４および／またはＮ１１０における改変、例えばアミノ酸置換を含んでもよい（位置は野生型成熟ＩＬ－１８アミノ酸配列に関する）。１つの実施形態において、ＩＬ－１８は、Ｍ５１Ｓ、Ｓ５５Ａ、Ｒ１０４Ｑ、Ｒ１０４ＫもしくはＲ１０４Ｓおよび／またはＮ１１０Ａ置換を有する。１つの実施形態において、ＩＬ－１８はＫ５３ＳまたはＫ５３Ａ置換を含む。１つの実施形態において、ＩＬ－１８はＭ６０ＳまたはＭ６０Ｋ置換を含む。
別の実施形態において、サイトカイン結合性ＡＢＤは、Ｉ型インターフェロン受容体、例えばインターフェロン－α受容体（ＩＦＮ－αＲ）に結合する。ＡＢＤは、ＩＦＮ－α ＡＢＤがＮＫ細胞の表面上のＩＦＮ－αＲに結合するような好適なＩ型インターフェロン、例えばインターフェロン－α（ＩＦＮ－α）またはインターフェロン－β（ＩＦＮ－β）ポリペプチドであるか、またはそれを含むものであり得る。インターフェロン－α受容体は、インターフェロンα／β受容体（ＩＦＮＡＲ）としても公知であり、２つのサブユニットＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２から構成されるヘテロ二量体膜貫通型受容体である。Ｉ型ＩＦＮについて、主なＳＴＡＴシグナル伝達複合体は、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、およびＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ）－９からなるＩＦＮ刺激性遺伝子因子３により形成される。一部の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－β分子、例えば、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－β、例えば、ヒトＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βの全長、断片または変異型、例えばヒトＩＦＮ－α１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１２、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６またはＩＦＮ－α１７ポリペプチドである。一部の実施形態において、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－β分子は、例えば、配列番号４２３～４３４のいずれかのアミノ酸配列を有する、野生型ヒトＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βである。他の実施形態において、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－β分子は、例えば、１つまたは複数のアミノ酸改変を有する、ヒトＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βの変異型である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－β分子は、それぞれ配列番号４２３～４３４の成熟野生型ヒトＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ配列を含む。他の実施形態において、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－β分子は、例えば、１つまたは複数のアミノ酸改変を有する、ヒトＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βの変異型である。適宜、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βはヒトＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドの断片を含み、断片は、配列番号４２３～４３４のポリペプチドの４０、５０、６０、７０もしくは８０個のアミノ酸の連続する配列と同一であるか、またはそれに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列を有する。
野生型ヒトＩＦＮ－α成熟タンパク質：
ＩＦＮα２
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE（配列番号４２３）
ＩＦＮα１
CDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNADSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE（配列番号４２４）
ＩＦＮα４
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMGRISHFSCLKDRHDFGFPEEEFDGHQFQKTQAISVLHEMIQQTFNLFSTEDSSAAWEQSLLEKFSTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSFSTNLQKRLRRKD（配列番号４２５）
ＩＦＮα５
CDLPQTHSLSNRRTLMIMAQMGRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSATWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACMMQEVGVEDTPLMNVDSILTVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSANLQERLRRKE(配列番号４２６）
ＩＦＮα６
CDLPQTHSLGHRRTMMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFRFPQEEFDGNQFQKAEAISVLHEVIQQTFNLFSTKDSSVAWDERLLDKLYTELYQQLNDLEACVMQEVWVGGTPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSSSRNLQERLRRKE（配列番号４２７）
ＩＦＮα７
CDLPQTHSLRNRRALILLAQMGRISPFSCLKDRHEFRFPEEEFDGHQFQKTQAISVLHEMIQQTFNLFSTEDSSAAWEQSLLEKFSTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNEDFILAVRKYFQRITLYLMEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSFSTNLKKGLRRKD（配列番号４２８）
ＩＦＮα８
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFEFPQEEFDDKQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAALDETLLDEFYIELDQQLNDLESCVMQEVGVIESPLMYEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSSCAWEVVRAEIMRSFSLSINLQKRLKSKE（配列番号４２９）
ＩＦＮα１０
CDLPQTHSLGNRRALILLGQMGRISPFSCLKDRHDFRIPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTEDSSAAWEQSLLEKFSTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLIERKYSPCAWEVVRAEIMRSLSFSTNLQKRLRRKD（配列番号４３０）
ＩＦＮα１４
CNLSQTHSLNNRRTLMLMAQMRRISPFSCLKDRHDFEFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMMQQTFNLFSTKNSSAAWDETLLEKFYIELFQQMNDLEACVIQEVGVEETPLMNEDSILAVKKYFQRITLYLMEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSFSTNLQKRLRRKD（配列番号４３１）
ＩＦＮα１６
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMGRISHFSCLKDRYDFGFPQEVFDGNQFQKAQAISAFHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYIELFQQLNDLEACVTQEVGVEEIALMNEDSILAVRKYFQRITLYLMGKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSFSTNLQKGLRRKD（配列番号４３２）
ＩＦＮα１７
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMGRISPFSCLKDRHDFGLPQEEFDGNQFQKTQAISVLHEMIQQTFNLFSTEDSSAAWEQSLLEKFSTELYQQLNNLEACVIQEVGMEETPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSFSTNLQKILRRKD（配列番号４３３）
ある特定の態様において、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－β変異型ポリペプチドは、それぞれ配列番号４２３～４３４に対して少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または約９０％より高い（例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％）配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態において、野生型または改変型シグナル伝達剤は、その受容体、特にはＩＦＮＡＲ２に対する減少した結合親和性を有する改変型インターフェロン－αである。そのような実施形態において、改変型ＩＦＮα１、ＩＦＮα２、ＩＦＮα４、ＩＦＮα５、ＩＦＮα６、ＩＦＮα７、ＩＦＮα８、ＩＦＮα１０、ＩＦＮα１２、ＩＦＮα１４、ＩＦＮα１６またはＩＦＮα１７剤は、ＩＦＮＡＲ（ＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２鎖）に対する親和性および／またはそれにおけるシグナル伝達の誘導の低減を有する。
野生型ＩＦＮα１を例外として、野生型ＩＦＮは、例えば、マイクロカロリメータ（ｍｉｃｒｏｃａｌ）またはＳＰＲにより決定された場合に、０．１ｎＭ～５ｎＭの親和性（ＫＤ）でＩＦＮＡＲ２に、約１μＭの親和性でＩＦＮＡＲ１に結合する。ＩＦＮα１は、約２００ｎＭのＫＤでＩＦＮＡＲ２に結合する。一部の実施形態において、ＩＦＮは、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性と等しいかまたはそれ未満のＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２に対する親和性を有するように改変される。一部の実施形態において、ＩＦＮは、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性よりも少なくとも１－ｌｏｇ低いＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２に対する親和性を有するように改変される。
例えば、本明細書において示される例示的なＮＫｐ４６ ＡＢＤにおいて、ＮＫｐ４６ ＡＢＤは、約１５ｎＭのＮＫｐ４６結合性についてのＫＤを有する。ＩＦＮは、そのため、１０倍（１－ｌｏｇ）～１０００倍（３－ｌｏｇ）の結合親和性の低減（１－ｌｏｇ～３－ｌｏｇのＫＤにおける増加）を引き起こす改変の導入により改変され得る。ＩＦＮは、以下の表において示されるアミノ酸置換のいずれかを含むことができる。以下の表は、野生型対応物と比較して少なくとも１ ｌｏｇおよび野生型対応物と比較して３－ｌｏｇ以下の親和性における減少（より高いＫＤ）のカットオフを用いた、ＩＦＮＡＲ２に対するＩＦＮ－αポリペプチドの結合親和性を減少させる例示的な単一アミノ酸置換を示す。表は、野生型サイトカインと比較して突然変異したサイトカインのＩＦＮＡＲ２についてのＫＤ値に基づく相対的な親和性を示す。
以下の表は、親和性における少なくとも２倍の減少を有する、ＩＦＮＡＲ１に対するＩＦＮ－αポリペプチドの結合親和性を減少させる例示的な単一アミノ酸置換を示す。表は、野生型サイトカインと比較して突然変異したサイトカインのＩＦＮＡＲ１についてのＫＤ値に基づく相対的な親和性を示す。
ＩＦＮα２の突然変異体形態はまた、例えば、ＰＣＴ国際公開第２００８／１２４０８６号パンフレット、国際公開第２０１０／０３０６７１号パンフレット、国際公開第２０１３／０５９８８５号パンフレット、国際公開第２０１３／１０７７９１号パンフレット、国際公開第２０１５／００７５２０号パンフレットおよび国際公開第２０２０／１９８６６１号パンフレット（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている。
一部の実施形態において、前記ＩＦＮα２突然変異体（ＩＦＮα２ａまたはＩＦＮα２ｂ）は、１４４～１５４位における１つまたは複数のアミノ酸、例えば１４８、１４９および／または１５３位のアミノ酸において突然変異している。一部の実施形態において、ＩＦＮα２突然変異体は、国際公開第２０１３／１０７７９１号パンフレットにおいて記載される、Ｌ１５３Ａ、Ｒ１４９Ａ、およびＭ１４８Ａから選択される１つまたは複数の突然変異を含む。一部の実施形態において、ＩＦＮα２突然変異体は、ＩＦＮＡＲ１に対する低減された親和性および／または活性を有する。一部の実施形態において、ＩＦＮα２突然変異体は、国際公開第２０１０／０３０６７１号パンフレットにおいて記載されるように、Ｆ６４Ａ、Ｎ６５Ａ、Ｔ６９Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、およびＹ８９Ａから選択される１つまたは複数の突然変異を含む。一部の実施形態において、ＩＦＮα２突然変異体は、国際公開第２００８／１２４０８６号パンフレットにおいて記載されるようにＫ１３３Ａ、Ｒ１４４Ａ、Ｒ１４９Ａ、およびＬ１５３Ａから選択される１つまたは複数の突然変異を含む。一部の実施形態において、ＩＦＮα２突然変異体は、国際公開第２０１５／００７５２０号パンフレットおよび国際公開第２０１０／０３０６７１号パンフレットにおいて記載されるように、Ｒ１２０ＥおよびＲ１２０Ｅ／Ｋ１２１Ｅから選択される１つまたは複数の突然変異を含む。１つの実施形態において、突然変異体ヒトＩＦＮα２は、配列番号４２３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、突然変異体ＩＦＮα２は、配列番号４２３に関して位置Ｌ１５、Ａ１９、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｌ２６、Ｆ２７、Ｌ３０、Ｌ３０、Ｋ３１、Ｄ３２、Ｒ３３、Ｈ３４、Ｄ３５、Ｑ４０、Ｈ５７、Ｅ５８、Ｑ６１、Ｆ６４、Ｎ６５、Ｔ６９、Ｌ８０、Ｙ８５、Ｙ８９、Ｄ１１４、Ｌ１１７、Ｒ１２０、Ｒ１２５、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｒ１４４、Ａ１４５、Ｍ１４８、Ｒ１４９、Ｓ１５２、Ｌ１５３、およびＮ１５６において１つまたは複数の突然変異を有する。一部の実施形態において、ヒトＩＦＮα２突然変異体は、国際公開第２０１３／０５９８８５号パンフレットにおいて開示されるように、Ｌ１５Ａ、Ａ１９Ｗ、Ｒ２２Ａ、Ｒ２３Ａ、Ｌ２６Ａ、Ｆ２７Ａ、Ｌ３０Ａ、Ｌ３０Ｖ、Ｋ３１Ａ、Ｄ３２Ａ、Ｒ３３Ｋ、Ｒ３３Ａ、Ｒ３３Ｑ、Ｈ３４Ａ、Ｄ３５Ａ、Ｑ４０Ａ、Ｔ１０６Ａ、Ｔ１０６Ｅ、Ｄ１１４Ｒ、Ｌ１１７Ａ、Ｒ１２０Ａ、Ｒ１２５Ａ、Ｋ１３４Ａ、Ｒ１４４Ａ、Ａ１４５Ｇ、Ａ１４５Ｍ、Ｍ１４８Ａ、Ｒ１４９Ａ、Ｓ１５２Ａ、Ｌ１５３Ａ、およびＮ１５６Ａから選択される１つまたは複数の突然変異を含み、例えば一部の実施形態において、ヒトＩＦＮα２突然変異体は、突然変異Ｈ５７Ｙ、Ｅ５８Ｎ、Ｑ６１Ｓ、および／もしくはＬ３０Ａ；突然変異Ｈ５７Ｙ、Ｅ５８Ｎ、Ｑ６１Ｓ、および／もしくはＲ３３Ａ；突然変異Ｈ５７Ｙ、Ｅ５８Ｎ、Ｑ６１Ｓ、および／もしくはＭ１４８Ａ；突然変異Ｈ５７Ｙ、Ｅ５８Ｎ、Ｑ６１Ｓ、および／もしくはＬ１５３Ａ；突然変異Ｎ６５Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、および／もしくはＹ８９Ａ；または突然変異Ｎ６５Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、Ｙ８９Ａ、および／もしくはＤ１１４Ａを含む。
実施形態において、野生型または改変型シグナル伝達剤は、その受容体、特にはＩＦＮＡＲ２に対する減少した結合親和性を有する改変型インターフェロン－αである。そのような実施形態において、改変型ＩＦＮα２剤は、ＩＦＮＡＲ（ＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２鎖）に対する親和性および／またはそれにおけるシグナル伝達の誘導の低減を有する。
一部の実施形態において、ＩＦＮα１インターフェロンは、配列番号４２４に関して位置Ｌ１５、Ａ１９、Ｒ２３、Ｓ２５、Ｌ３０、Ｄ３２、Ｒ３３、Ｈ３４、Ｑ４０、Ｃ８６、Ｄ１１５、Ｌ１１８、Ｋ１２１、Ｒ１２６、Ｅ１３３、Ｋ１３４、Ｋ１３５、Ｒ１４５、Ａ１４６、Ｍ１４９、Ｒ１５０、Ｓ１５３、Ｌ１５４、およびＮ１５７における１つまたは複数のアミノ酸において突然変異を有するように改変される。突然変異は、適宜、疎水性突然変異であり得、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選択され得る。一部の実施形態において、ＦＮα１インターフェロンは、配列番号４２４に関してＬ１５Ａ、Ａ１９Ｗ、Ｒ２３Ａ、Ｓ２５Ａ、Ｌ３０Ａ、Ｌ３０Ｖ、Ｄ３２Ａ、Ｒ３３Ｋ、Ｒ３３Ａ、Ｒ３３Ｑ、Ｈ３４Ａ、Ｑ４０Ａ、Ｃ８６Ｓ、Ｃ８６Ａ、Ｄ１１５Ｒ、Ｌ１１８Ａ、Ｋ１２１Ａ、Ｋ１２１Ｅ、Ｒ１２６Ａ、Ｒ１２６Ｅ、Ｅ１３３Ａ、Ｋ１３４Ａ、Ｋ１３５Ａ、Ｒ１４５Ａ、Ｒ１４５Ｄ、Ｒ１４５Ｅ、Ｒ１４５Ｇ、Ｒ１４５Ｈ、Ｒ１４５Ｉ、Ｒ１４５Ｋ、Ｒ１４５Ｌ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｑ、Ｒ１４５Ｓ、Ｒ１４５Ｔ、Ｒ１４５Ｖ、Ｒ１４５Ｙ、Ａ１４６Ｄ、Ａ１４６Ｅ、Ａ１４６Ｇ、Ａ１４６Ｈ、Ａ１４６Ｉ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｌ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４６Ｎ、Ａ１４６Ｑ、Ａ１４６Ｒ、Ａ１４６Ｓ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、Ａ１４６Ｙ、Ｍ１４９Ａ、Ｍ１４９Ｖ、Ｒ１５０Ａ、Ｓ１５３Ａ、Ｌ１５４Ａ、およびＮ１５７Ａから選択される１つまたは複数の突然変異を有するように改変される。一部の実施形態において、ＦＮα１突然変異体は、配列番号４２４に関してＬ３０Ａ／Ｈ５８Ｙ／Ｅ５９Ｎ／Ｑ６２Ｓ、Ｒ３３Ａ／Ｈ５８Ｙ／Ｅ５９Ｎ／Ｑ６２Ｓ、Ｍ１４９Ａ／Ｈ５８Ｙ／Ｅ５９Ｎ／Ｑ６２Ｓ、Ｌ１５４Ａ／Ｈ５８Ｙ／Ｅ５９Ｎ／Ｑ６２Ｓ、Ｒ１４５Ａ／Ｈ５８Ｙ／Ｅ５９Ｎ／Ｑ６２Ｓ、Ｄ１１５Ａ／Ｒ１２１Ａ、Ｌ１１８Ａ／Ｒ１２１Ａ、Ｌ１１８Ａ／Ｒ１２１Ａ／Ｋ１２２Ａ、Ｒ１２１Ａ／Ｋ１２２Ａ、およびＲ１２１Ｅ／Ｋ１２２Ｅから選択される１つ以上の複数の突然変異を含む。一部の実施形態において、ＩＦＮ－α１は、望ましくないジスルフィド対合を低減させる１つまたは複数の突然変異を含む変異型であり、１つまたは複数の突然変異は、例えば、配列番号４２４に関してアミノ酸位置Ｃ１、Ｃ２９、Ｃ８６、Ｃ９９、またはＣ１３９におけるものである。一部の実施形態において、位置Ｃ８６における突然変異は、例えば、Ｃ８６ＳまたはＣ８６ＡまたはＣ８６Ｙであり得る。
実施形態において、野生型または改変型シグナル伝達剤はＩＦＮ－βである。一部の実施形態において、ＩＦＮ－βは、以下において示されている配列を有するヒトのものである：
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN（配列番号４３４）
一部の実施形態において、ヒトＩＦＮ－βは、Ｍｅｔ－１欠失およびＣｙｓ－１７のＳｅｒへの突然変異を有する非グリコシル化形態のヒトＩＦＮ－βである。様々な実施形態において、改変型ＩＦＮ－βは、ＩＦＮＡＲのＩＦＮＡＲ１サブユニットに対するその結合性またはその親和性を低減させる１つまたは複数の突然変異を有する。１つの実施形態において、改変型ＩＦＮ－βは、ＩＦＮＡＲ１における低減された親和性および／または活性を有する。様々な実施形態において、改変型ＩＦＮ－βは、ヒトＩＦＮ－βであり、かつ位置Ｆ６７、Ｒ７１、Ｌ８８、Ｙ９２、１９５、Ｎ９６、Ｋ１２３、およびＲ１２４において１つまたは複数の突然変異を有する。一部の実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、Ｆ６７Ｇ、Ｆ６７Ｓ、Ｒ７１Ａ、Ｌ８８Ｇ、Ｌ８８Ｓ、Ｙ９２Ｇ、Ｙ９２Ｓ、Ｉ９５Ａ、Ｎ９６Ｇ、Ｋ１２３Ｇ、およびＲ１２４Ｇから選択される置換である。
一部の実施形態において、改変型ＩＦＮ－βは、ＩＦＮＡＲのＩＦＮＡＲ２サブユニットに対するその結合性またはその親和性を低減させる１つまたは複数の突然変異を有する。１つの実施形態において、改変型ＩＦＮ－βは、ＩＦＮＡＲ２において低減された親和性および／または活性を有する。様々な実施形態において、改変型ＩＦＮ－βは、ヒトＩＦＮ－βであり、かつ位置Ｗ２２、Ｒ２７、Ｌ３２、Ｒ３５、Ｖ１４８、Ｌ１５１、Ｒ１５２、およびＹ１５５における１つまたは複数の突然変異を有する。一部の実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、Ｗ２２Ｇ、Ｒ２７Ｇ、Ｌ３２Ａ、Ｌ３２Ｇ、Ｒ３５Ａ、Ｒ３５Ｇ、Ｖ１４８Ｇ、Ｌ１５１Ｇ、Ｒ１５２Ａ、Ｒ１５２Ｇ、およびＹ１５５Ｇから選択される置換である。
例示的なＩＦＮ－β突然変異は、ＰＣＴ国際公開第２０２０／１９８６６１号パンフレット、国際公開第２０００／０２３１１４号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１５００１１７３２号明細書（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている。
サイトカイン結合性ＡＢＤがＩＬ－７受容体（ＩＬ－７Ｒ）結合性ＡＢＤに結合する別の実施形態において、ＡＢＤは、ＩＬ－７Ｒ ＡＢＤがＮＫ細胞の表面上のＩＬ－７Ｒαに結合するような好適なインターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドであるか、またはそれを含むものであり得る。一部の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ－７分子、例えば、ＩＬ－７、例えば、ヒトＩＬ－７の全長、断片または変異型である。実施形態において、ＩＬ－７分子は、例えば、配列番号４３５のアミノ酸配列を有する、野生型ヒトＩＬ－７である。一部の実施形態において、ＩＬ－７分子は、配列番号４３５の成熟野生型ヒトＩＬ－７アミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ配列を含む。他の実施形態において、ＩＬ－７分子は、例えば、１つまたは複数のアミノ酸改変を有する、ヒトＩＬ－７の変異型である。適宜、ＩＬ－７はヒトＩＬ－７ポリペプチドの断片を含み、断片は、配列番号４３５のポリペプチドの４０、５０、６０、７０もしくは８０個のアミノ酸の連続する配列と同一であるか、またはそれに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列を有する。
野生型成熟ヒトＩＬ－７：
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH（配列番号４３５）
野生型ＩＬ－７は、例えば、マイクロカロリメータまたはＳＰＲにより決定された場合に、約５０～１００ｎＭの親和性（ＫＤ）でＩＬ－７Ｒαに結合する。一部の実施形態において、ＩＬ－７は、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性と等しいかまたはそれ未満のＩＬ－７Ｒαに対する親和性を有するように改変される。一部の実施形態において、ＩＬ－７は、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性よりも少なくとも１－ｌｏｇ低いＩＬ－７Ｒαに対する親和性を有するように改変される。一部の実施形態において、ＩＬ－７は、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性よりも少なくとも１－ｌｏｇ低いが、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性よりも３－ｌｏｇ、または適宜２－ｌｏｇ以下だけ低いＩＬ－７Ｒαに対する親和性を有するように改変される。例えば、本明細書において示される例示的なＮＫｐ４６ ＡＢＤにおいて、ＮＫｐ４６ ＡＢＤは、約１５ｎＭのＮＫｐ４６結合性についてのＫＤを有する。ＩＬ－７は、そのため、ＩＬ－７とＩＬ－７Ｒαとの間の親和性の低減を引き起こすアミノ酸置換Ｑ２２Ａ、Ｄ７４Ａおよび／またはＫ８１Ａ（野生型成熟ＩＬ－７アミノ酸配列に関する）などの改変の導入により改変され得る。
サイトカイン結合性ＡＢＤがＩＬ－２７受容体（ＩＬ－２７Ｒ）結合性ＡＢＤに結合する別の実施形態において、ＡＢＤは、ＩＬ－２７Ｒ ＡＢＤがＮＫ細胞の表面上のＩＬ－２７Ｒ（ＷＳＸ－１および／またはｇｐ１３０）に結合するような好適なインターロイキン－２７（ＩＬ－２７）ポリペプチドであるか、またはそれを含むものであり得る。一部の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ－２７分子、例えば、Ｐ２８およびＥＢＩ３サブユニットを含む全長、断片または変異型、例えば、Ｐ２８およびＥＢＩ３サブユニットを含むヒト単鎖またはヘテロ二量体ＩＬ－２７であり、適宜、ＩＬ－２７のＥＢＩ３およびｐ２８サブユニットは、ドメインリンカー［例えば、柔軟性ポリペプチドリンカー、グリシン・セリン残基を含有するリンカー、（Ｇ４Ｓ）２または（Ｇ４Ｓ）３リンカー］により連結されて単鎖フォーマットとされている。ＥＢＩ３のＮ末端に連結したｐ２８のＣ末端またはその逆のいずれかを通じて、柔軟性リンカーによりＥＢＩ３サブユニットに連結したｐ２８サブユニットからなるＩＬ－２７の単鎖形態が生成され得る。実施形態において、ＩＬ－２７分子は、野生型ヒトＩＬ－２７、例えば、配列番号４３６および４３７のアミノ酸配列を含む単鎖融合生成物もしくはヘテロ二量体または配列番号４３６および４３７のいずれかのＩＬ２７Ｒ結合性断片である。一部の実施形態において、ＩＬ－２７分子は、配列番号４３６の成熟野生型ヒトＩＬ－２７ ｐ２８サブユニットアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列および／または配列番号４３７の成熟野生型ヒトＩＬ－２７ ＥＢＩ３サブユニットアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列を含む。他の実施形態において、ＩＬ－２７分子は、例えば、１つまたは複数のアミノ酸改変を有する、ヒトＩＬ－２７の変異型である。適宜、ＩＬ－２７は、ヒトＩＬ－２７ ｐ２８サブユニットポリペプチドの断片であって、配列番号４３６のポリペプチドの４０、５０、６０、７０もしくは８０個のアミノ酸の連続する配列と同一であるか、もしくはそれに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列を有する、断片、および／または、ヒトＩＬ－２７ ＥＢＩ３サブユニットポリペプチドの断片であって、配列番号４３７のポリペプチドの４０、５０、６０、７０もしくは８０個のアミノ酸の連続する配列と同一であるか、もしくはそれに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列を有する、断片を含む。ｐ２８サブユニットは、そのＮ末端において多特異性タンパク質（またはそのＮＫｐ４６ ＡＢＤ）に連結しているとして特定され得る。ＥＢＩ３サブユニットは、そのＮ末端において、ｐ２８サブユニットのＣ末端に、適宜ドメインリンカーを介して、連結しているとして特定され得るか、またはｐ２８サブユニットと会合する別々のポリペプチド上に置かれているとして特定され得る。
野生型成熟ヒトＩＬ－２７ ｐ２８サブユニット：
FPRPPGRPQLSLQELRREFTVSLHLARKLLSEVRGQAHRFAESHLPGVNLYLLPLGEQLPDVSLTFQAWRRLSDPERLCFISTTLQPFHALLGGLGTQGRWTNMERMQLWAMRLDLRDLQRHLRFQVLAAGFNLPEEEEEEEEEEEEERKGLLPGALGSALQGPAQVSWPQLLSTYRLLHSLELVLSRAVRELLLLSKAGHSVWPLGFPTLSPQP（配列番号４３６）
野生型成熟ヒトＩＬ－２７ ＥＢＩ３サブユニット：
RKGPPAALTLPRVQCRASRYPIAVDCSWTLPPAPNSTSPVSFIATYRLGMAARGHSWPCLQQTPTSTSCTITDVQLFSMAPYVLNVTAVHPWGSSSSFVPFITEHIIKPDPPEGVRLSPLAERQLQVQWEPPGSWPFPEIFSLKYWIRYKRQGAARFHRVGPIEATSFILRAVRPRARYYVQVAAQDLTDYGELSDWSLPATATMSLGK（配列番号４３７）
一部の実施形態において、ＩＬ－２７は、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性と等しいかまたはそれ未満であるＷＳＸ－１および／またはｇｐ１３０に対する親和性を有するように改変される。一部の実施形態において、ＩＬ－２７は、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性よりも少なくとも１－ｌｏｇ低いＷＳＸ－１および／またはｇｐ１３０に対する親和性を有するように改変される。一部の実施形態において、ＩＬ－２７は、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性よりも少なくとも１－ｌｏｇ低いが、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性よりも３－ｌｏｇ、または適宜２－ｌｏｇ以下だけ低いＷＳＸ－１および／またはｇｐ１３０に対する親和性を有するように改変される。
サイトカイン結合性ＡＢＤがＩＬ－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）結合性ＡＢＤに結合する別の実施形態において、ＡＢＤは、ＩＬ－１２Ｒ ＡＢＤがＮＫ細胞の表面上のＩＬ－１２Ｒ（ＩＬ－１２Ｒβ１および／またはＩＬ－１２Ｒβ２）に結合するような好適なインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）ポリペプチドであるか、またはそれを含むものであり得る。一部の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ－１２分子、例えば、Ｐ３５およびＰ４０サブユニットを含む全長、断片または変異型、例えば、Ｐ３５およびＰ４０サブユニットを含むヒト単鎖またはヘテロ二量体ＩＬ－１２であり、適宜、ＩＬ－１２のｐ４０およびｐ３５サブユニットは、ドメインリンカー［例えば、柔軟性ポリペプチドリンカー、グリシン・セリン残基を含有するリンカー、（Ｇ４Ｓ）２または（Ｇ４Ｓ）３リンカー］により連結されて単鎖フォーマットとされている。ｐ４０のＮ末端に連結したｐ３５のＣ末端またはその逆のいずれかを通じて、柔軟性リンカーによりｐ４０サブユニットに連結したｐ３５サブユニットからなるＩＬ－１２の単鎖形態が生成され得る。実施形態において、ＩＬ－１２分子は、野生型ヒトＩＬ－１２、例えば、配列番号４３８および４３９のアミノ酸配列を含む単鎖融合生成物もしくはヘテロ二量体または配列番号４３８もしくは４３９のいずれかのＩＬ１２Ｒ結合性断片である。一部の実施形態において、ＩＬ－１２分子は、配列番号４３８の成熟野生型ヒトＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列および／または配列番号４３９の成熟野生型ヒトＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列を含む。他の実施形態において、ＩＬ－１２分子は、例えば、１つまたは複数のアミノ酸改変を有する、ヒトＩＬ－１２の変異型である。適宜、ＩＬ－１２は、ヒトＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットポリペプチドの断片であって、配列番号４３８のポリペプチドの４０、５０、６０、７０もしくは８０個のアミノ酸の連続する配列と同一であるか、もしくはそれに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列を有する、断片、および／または、ヒトＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットポリペプチドの断片であって、配列番号４３９のポリペプチドの４０、５０、６０、７０もしくは８０個のアミノ酸の連続する配列と同一であるか、もしくはそれに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列を有する、断片を含む。ｐ３５（アルファ）およびＰ４０（ベータ）は、Ｐ３５サブユニットのＣｙｓ７４とＰ４０サブユニットのＣｙｓ１７７との間のジスルフィドブリッジにより連結しているとして特定され得る。ｐ３５サブユニットは、そのＮ末端において多特異性タンパク質（またはそのＮＫｐ４６ ＡＢＤ）に連結しているとして特定され得る。ｐ４０サブユニットは、そのＮ末端において、ｐ３５サブユニットのＣ末端に、適宜ドメインリンカーを介して、連結しているとして特定され得るか、またはｐ３５サブユニットと会合する別々のポリペプチド上に置かれているとして特定され得る。
野生型成熟ヒトＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット：
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS（配列番号４３８）
野生型成熟ヒトＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット：
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS（配列番号４３９）
野生型ＩＬ－１２二量体は、例えば、マイクロカロリメータまたはＳＰＲにより決定された場合に、約５～７ｎＭおよび５ｎＭの親和性（ＫＤ）でそれぞれＩＬ－１２Ｒβ１およびＩＬ－１２Ｒβ２に結合し、かつＩＬ－１２二量体は、約５０ｐＭのＫＤでＩＬ１２Ｒβ１：ＩＬ－１２Ｒβ２二量体に結合する。一部の実施形態において、ＩＬ－１２は、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性と等しいかまたはそれ未満であるＩＬ－１２Ｒβ１および／またはＩＬ－１２Ｒβ２に対する親和性を有するように改変される。一部の実施形態において、ＩＬ－１２は、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性よりも少なくとも１－ｌｏｇ低いＩＬ－１２Ｒβ１および／またはＩＬ－１２Ｒβ２に対する親和性を有するように改変される。一部の実施形態において、ＩＬ－１２は、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性よりも少なくとも１－ｌｏｇ低い（１－ｌｏｇ高いＫＤ）が、ＮＫｐ４６に対するＮＫｐ４６ ＡＢＤの親和性よりも３－ｌｏｇ、または適宜２－ｌｏｇ以下だけ低いＩＬ－１２Ｒβ１および／またはＩＬ－１２Ｒβ２に対する親和性を有するように改変される。
ＮＫｐ４６可変領域およびＣＤＲ配列
一部の実施形態において、多特異性タンパク質またはそのＮＫｐ４６ ＡＢＤ（またはＡＢＤの由来となる抗ＮＫｐ４６抗体）は、ＮＫｐ４６のＤ１ドメイン、ＮＫｐ４６のＤ２ドメインに結合するか、または配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ１およびＤ２ドメインにまたがる領域（Ｄ１およびＤ２ドメインの境界、Ｄ１／Ｄ２ジャンクションにある）に結合する。一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、または１０－１０Ｍ未満のＫＤにより特徴付けられる、全長ＩｇＧ抗体としての、ヒトＮＫｐ４６に対する親和性を有する抗ＮＫｐ４６抗体からのＶＨ／ＶＬペアを含む。一部の実施形態において、多特異性タンパク質（またはそのＮＫｐ４６結合性ＡＢＤ）は、ＳＰＲにより決定された場合に、１～１００ｎＭ、適宜１～５０ｎＭ、適宜１～２０ｎＭ、適宜約１０または１５ｎＭの、ヒトＮＫｐ４６に対する親和性（ＫＤ）を有する。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質（またはそのＮＫｐ４６結合性ＡＢＤもしくはＶＨ／ＶＬペア、例えば多特異性タンパク質においてもしくは従来的な全長抗体として構成された場合）は、抗体ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６またはＮＫｐ４６－９とＮＫｐ４６上の実質的に同じ領域、部位またはエピトープにおいてＮＫｐ４６に結合する。別の実施形態において、抗体は、ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６またはＮＫｐ４６－９により結合されるセグメントまたはエピトープと少なくとも部分的にオーバーラップするか、またはその中の少なくとも１つの残基を含む。１つの実施形態において、エピトープのすべての鍵となる残基は、ドメインＤ１またはＤ２に対応するセグメント中にある。１つの実施形態において、抗体または多特異性タンパク質は、Ｄ１ドメイン中に存在する残基の他に、Ｄ２ドメイン中に存在する残基に結合する。１つの実施形態において、抗体は、配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドのドメインＤ１またはＤ２に対応するセグメント中の１、２、３、４、５、６、７またはより多くの残基を含むエピトープに結合する。１つの実施形態において、抗体は、ドメインＤ１に結合し、かつ残基Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４および／またはＬ１０５のうちの１、２、３、または４つを含むエピトープにさらに結合する。
別の実施形態において、抗体または多特異性タンパク質は、Ｄ１／Ｄ２ドメインジャンクションにおいてＮＫｐ４６に結合し、かつ残基Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１および／またはＹ１９４のうちの１、２、３、４または５つを含むかまたはからなるエピトープに結合する。
別の実施形態において、抗体または多特異性タンパク質は、ドメインＤ２に結合し、かつ残基Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、および／またはＳ１３６のうちの１、２、３、または４つを含むエピトープに結合する。
提供される実施例セクションは、突然変異体ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドのシリーズを記載している。実施例において、ＮＫｐ４６突然変異体をトランスフェクトされた細胞に対する多特異性タンパク質の結合性を測定し、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（配列番号１）に結合する抗ＮＫｐ４６抗体の能力と比較した。本明細書において記載されている抗ＮＫｐ４６抗体またはＮＫｐ４６結合性多特異性タンパク質と突然変異体ＮＫｐ４６ポリペプチドとの間の結合性における低減は、結合親和性における低減（例えば、公知の方法、例えば特定の突然変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験により、もしくは突然変異体ポリペプチドに対する結合性のＢｉａｃｏｒｅ試験により測定された場合）および／または抗ＮＫｐ４６抗体のトータル結合能力における低減（例えば、ポリペプチド濃度に対する抗ＮＫｐ４６抗体濃度のプロットにおけるＢｍａｘにおける減少により立証される）があることを意味する。結合性における有意な低減は、突然変異した残基はＮＫｐ４６に対する抗ＮＫｐ４６抗体の結合に直接的に関与しているか、または抗ＮＫｐ４６抗体もしくはＮＫｐ４６結合性多特異性タンパク質がＮＫｐ４６に結合している場合に結合性タンパク質に近接していることを指し示す。抗体エピトープは、そのため、好ましくは、そのような残基を含み、そのような残基に隣接する追加の残基を含んでもよい。
一部の実施形態において、結合性における有意な低減は、ＮＫｐ４６ ＡＢＤまたはＮＫｐ４６結合性多特異性タンパク質と突然変異体ＮＫｐ４６ポリペプチドとの間の結合親和性および／または能力が、抗体と野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、配列番号１において示されるポリペプチド）との間の結合性と比べて４０％より大きく、５０％より大きく、５５％より大きく、６０％より大きく、６５％より大きく、７０％より大きく、７５％より大きく、８０％より大きく、８５％より大きく、９０％より大きくまたは９５％より大きく低減していることを意味する。ある特定の実施形態において、結合性は、検出可能な限度未満に低減している。一部の実施形態において、結合性における有意な低減は、突然変異体ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する抗ＮＫｐ４６抗体の結合性が、抗ＮＫｐ４６抗体と野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド［例えば、配列番号１において示されるポリペプチド（またはその細胞外ドメイン）］との間で観察される結合性の５０％未満（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％未満）である場合に立証される。そのような結合測定は、当技術分野において公知の様々な結合アッセイを使用して行われ得る。１つのそのようなアッセイの特有の例は実施例セクションにおいて記載される。
一部の実施形態において、ＮＫｐ４６結合性多特異性タンパク質は、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、配列番号１）中の残基が置換されている突然変異体ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して有意により低い結合性を呈する。本明細書において使用される簡略化された表記において、フォーマットは、野生型残基：ポリペプチド中の位置：突然変異体残基であり、残基の番号付けは配列番号１において指し示される通りである。
一部の実施形態において、ＮＫｐ４６結合性多特異性タンパク質（ＮＫｐ４６ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）は、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して残基Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４および／またはＬ１０５（配列番号１に関する）のいずれか１つまたは複数の突然変異（例えば、アラニン置換）を有する突然変異体ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して減少した結合性を有する。
一部の実施形態において、ＮＫｐ４６結合性多特異性タンパク質は、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して残基Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１および／またはＹ１９４（配列番号１に関する）の１つまたは複数において突然変異（例えば、アラニン置換）を有する突然変異体ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して減少した結合性を有する。
一部の実施形態において、ＮＫｐ４６結合性多特異性タンパク質は、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して残基Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、および／またはＳ１３６（配列番号１に関する）の１つまたは複数において突然変異（例えば、アラニン置換）を有する突然変異体ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して減少した結合性を有する。
抗体ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６およびＮＫｐ４６－９の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、本明細書中の表Ｂ（それぞれ配列番号３、５、７、９、１１および１３）において列記されており、抗体ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６およびＮＫｐ４６－９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列もまた、本明細書中の表Ｂ（それぞれ配列番号４、６、８、１０、１２および１４）において列記されている。
ＮＫｐ４６結合性多特異性タンパク質は、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６またはＮＫｐ４６－９と本質的に同じエピトープまたは決定因子に結合する；適宜、抗体は、抗体ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６またはＮＫｐ４６－９の超可変領域を含む。本明細書における実施形態のいずれにおいても、抗体ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６またはＮＫｐ４６－９は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列により特徴付けられ得る。１つの実施形態において、抗体は、ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６またはＮＫｐ４６－９のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。提供されるのはまた、ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６またはＮＫｐ４６－９の重鎖可変領域を含む抗体である。１つの実施形態によれば、抗体は、ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６またはＮＫｐ４６－９の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。提供されるのはまた、ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６またはＮＫｐ４６－９の軽鎖可変領域のＣＤＲの１、２または３つをさらに含むポリペプチドである。適宜、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つまたは複数は、１、２、３、４または５またはより多くのアミノ酸改変（例えば置換、挿入または欠失）を含有してもよい。
多特異性タンパク質またはＮＫｐ４６結合性ＡＢＤは、例えば、以下を含むことができる：
（ａ）適宜、１、２、３もしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されていてもよい、表Ｂにおいて記載されているＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６もしくはＮＫｐ４６－９の重鎖可変領域；
（ｂ）適宜、１、２、３もしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されていてもよい、表Ｂにおいて記載されているＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６もしくはＮＫｐ４６－９の軽鎖可変領域（ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ＮＫｐ４６－１， ＮＫｐ４６－２， ＮＫｐ４６－３， ＮＫｐ４６－４， ＮＫｐ４６－６ ｏｒ ＮＫｐ４６－９）；
（ｃ）適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸により置換されていてもよい、表Ｂにおいて記載されているＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６もしくはＮＫｐ４６－９の重鎖可変領域；および、適宜、１、２、３もしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されていてもよい、表Ｂにおいて記載されているＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６もしくはＮＫｐ４６－９のそれぞれの軽鎖可変領域；
（ｄ）適宜、ＣＤＲ中の１、２、３もしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されていてもよい、表Ａにおいて示されているＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６もしくはＮＫｐ４６－９の重鎖ＣＤＲ １、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列；
（ｅ）適宜、ＣＤＲ中の１、２、３もしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されていてもよい、表Ａにおいて示されているＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６もしくはＮＫｐ４６－９の軽鎖ＣＤＲ １、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列；または
（ｆ）適宜、ＣＤＲ中の１、２、３もしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されていてもよい、表Ａにおいて示されているＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６もしくはＮＫｐ４６－９の重鎖ＣＤＲ １、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列；ならびに、適宜、ＣＤＲ中の１、２、３もしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されていてもよい、表Ａにおいて示されているそれぞれのＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６もしくはＮＫｐ４６－９抗体の軽鎖ＣＤＲ １、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列。
１つの実施形態において、上述のＣＤＲは、例えば表Ａにおいて示されている、Ｋａｂａｔによるものである。１つの実施形態において、上述のＣＤＲは、例えば表Ａにおいて示されている、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けによるものである。１つの実施形態において、上述のＣＤＲは、例えば表Ａにおいて示されている、ＩＭＧＴ番号付けによるものである。
本明細書における実施形態のいずれかの別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれも、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列により、かつ／または対応する配列番号もしくは表Ａにおいて列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲのセットと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有するとして特徴付けられてもよい。
別の態様において、多特異性タンパク質は、上記の（ａ）～（ｆ）によるモノクローナル抗体とＮＫｐ４６上のエピトープに対する結合について競合する。
ＩＭＧＴ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義システムによる、ＣＤＲの配列は、以下の表Ａにおいて要約される。本発明による抗体の可変鎖の配列は、以下の表Ｂにおいて列記される。本明細書における任意の実施形態において、ＶＬまたはＶＨ配列は、シグナルペプチドまたはその任意の部分を含有するかまたは欠くように特定または番号付けされ得る。
表Ｂ


ＮＫｐ４６ ＡＢＤのＶＨおよびＶＬペアは、適宜、抗体ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６またはＮＫｐ４６－９のいずれかのＶＨおよびＶＬの機能保存的変異型であり得る。「機能保存的変異型」は、タンパク質（例えば抗体または抗体断片）中の所与のアミノ酸残基が、類似した特性（例えば、極性、水素結合潜在能力、酸性、塩基性、疎水性、および芳香族など）を有するアミノ酸を用いたアミノ酸の置き換えを含むが、それに限定されない、タンパク質の全体的なコンフォメーションおよび機能を変更することなく変化している変異型である。保存されているとして指し示されるもの以外のアミノ酸はタンパク質中で異なってもよく、その結果、類似した機能の任意の２つのタンパク質の間のタンパク質またはアミノ酸配列類似性パーセントは、変動してもよく、例えば、アライメントスキーム、例えばクラスター方法に従って決定された場合に７０％～９９％であってもよく、類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく。「機能保存的変異型」はまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定された場合に本明細書において上記に定義されているＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する能力を有する抗体と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、いっそう好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ本明細書において上記に定義されているＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する能力を有する抗体と同じまたは実質的に類似した特性または機能を有するポリペプチドを含む。
例示的なヒト化されたＶＨおよびＶＬドメインは、例えば表５において示される配列番号のアミノ酸を有する、抗体ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６またはＮＫｐ４６－９の抗原結合性領域の全体を含むことができる。
ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ－４６－４、ＮＫｐ４６－６またはＮＫｐ４６－９抗体の軽鎖可変領域は、それぞれの抗体について、ヒト軽鎖ＦＲ１フレームワーク領域；表Ａにおいて記載されているアミノ酸配列、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列であって、これらのアミノ酸の１つもしくは複数が異なるアミノ酸により置換されていてもよい、配列を含むＬＣＤＲ１領域；ヒト軽鎖ＦＲ２フレームワーク領域；表Ａにおいて記載されているアミノ酸配列、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列であって、これらのアミノ酸の１つもしくは複数が異なるアミノ酸により置換されていてもよい、配列を含むＬＣＤＲ２領域；ヒト軽鎖ＦＲ３フレームワーク領域；および表Ａにおいて記載されているアミノ酸配列、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列であって、これらのアミノ酸の１つもしくは複数が欠失しているか、もしくは異なるアミノ酸により置換されていてもよい、配列を含むＬＣＤＲ３領域を含んでもよい。適宜、可変領域は、ヒト軽鎖ＦＲ４フレームワーク領域をさらに含む。ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ－４６－４、およびＮＫｐ４６－９ ＶＨ／ＶＬドメインのヒト化は、ＰＣＴ国際公開第２０１７１１４６９４号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載されており、アミノ酸配列は以下において示される。
ＮＫｐ４６－１：「Ｈ１」重鎖可変領域
（配列番号１１２）
ＮＫｐ４６－１：「Ｈ３」重鎖可変領域
（配列番号１１３）
ＮＫｐ４６－１：「Ｌ１」軽鎖可変領域
（配列番号１１４）
ＮＫｐ４６－２：「Ｈ１」重鎖可変領域
（配列番号１１５）
ＮＫｐ４６－２：「Ｈ２」重鎖可変領域
（配列番号１１６）
ＮＫｐ４６－２：「Ｈ３」重鎖可変領域
（配列番号１１７）
ＮＫｐ４６－２：「Ｌ１」軽鎖可変領域
（配列番号１１８）
ＮＫｐ４６－３：「Ｈ１」重鎖可変領域
（配列番号１１９）
ＮＫｐ４６－３：「Ｈ３」重鎖可変領域
（配列番号１２０）
ＮＫｐ４６－３：「Ｈ４」重鎖可変領域
（配列番号１２１）
ＮＫｐ４６－３：「Ｌ１」軽鎖可変領域
（配列番号１２２）
ＮＫｐ４６－４：「Ｈ１」重鎖可変領域
（配列番号１２３）
ＮＫｐ４６－４：「Ｈ２」重鎖可変領域
（配列番号１２４）
ＮＫｐ４６－４：「Ｈ３」重鎖可変領域
（配列番号１２５）
ＮＫｐ４６－４：「Ｌ２」軽鎖可変領域
（配列番号１２６）
ＮＫｐ４６－９：「Ｈ１」重鎖可変領域
（配列番号１２７）
ＮＫｐ４６－９：「Ｈ２」重鎖可変領域
（配列番号１２８）
ＮＫｐ４６－９：「Ｈ３」重鎖可変領域
（配列番号１２９）
ＮＫｐ４６－９：「Ｌ１」軽鎖可変領域
（配列番号１３０）
ＮＫｐ４６－９：「Ｌ２」軽鎖可変領域
（配列番号１３１）
ＶＨおよびＶＬの組合せの例は以下を含む：
（ａ）配列番号３のＣＤＲ１、２および３ならびにヒトＩＧＨＶ１－６９遺伝子セグメントに由来するＦＲ１、２および３を含むＶＨ、ならびに配列番号４のＣＤＲ１、２および３ならびにヒトＩＧＫＶ１－３３遺伝子セグメントに由来するＦＲ１、２および３を含むＶＬ；
（ｂ）配列番号５のＣＤＲ１、２および３ならびにヒトＩＧＨＶ４－３０－４遺伝子セグメントのＦＲ１、２および３を含むＶＨ、ならびに配列番号６のＣＤＲ１、２および３ならびにヒトＩＧＫＶ１－３９遺伝子セグメントに由来するＦＲ１、２および３を含むＶＬ；
（ｃ）配列番号７のＣＤＲ１、２および３ならびにヒトＩＧＨＶ１－６９遺伝子セグメントに由来するＦＲ１、２および３を含むＶＨ、ならびに配列番号８のＣＤＲ１、２および３ならびにヒトＩＧＫＶ３－１１および／もしくはＩＧＫＶ３－１５遺伝子セグメントに由来するＦＲ１、２および３を含むＶＬ；
（ｄ）配列番号９のＣＤＲ１、２および３ならびにヒトＩＧＨＶ１－４６および／もしくはＩＧＨＶ１－６９遺伝子セグメントに由来するＦＲ１、２および３を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ１、２および３ならびにヒトＩＧＫＶ１－ＮＬ１遺伝子セグメントに由来するＦＲ１、２および３を含むＶＬ；または
（ｅ）配列番号１３のＣＤＲ１、２および３ならびにヒトＩＧＨＶ４－３０－４遺伝子セグメントに由来するＦＲ１、２および３を含むＶＨ、ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、２および３ならびにヒトＩＧＫＶ１－３９遺伝子セグメントに由来するＦＲ１、２および３を含むＶＬ。
別の態様において、ヒト化された抗ＮＫｐ４６ ＶＨおよびＶＬの組合せの例は以下を含む：
（ａ）ＮＫｐ４６－１ Ｈ１もしくはＨ３可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、およびＮＫｐ４６－１ Ｌ１可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｂ）ＮＫｐ４６－２ Ｈ１、Ｈ２もしくはＨ３可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、およびＮＫｐ４６－２ Ｌ１可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｃ）ＮＫｐ４６－３ Ｈ１、Ｈ３もしくはＨ４可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、およびＮＫｐ４６－３ Ｌ１可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｄ）ＮＫｐ４６－４ Ｈ１可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、およびＮＫｐ４６－４ Ｌ２可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｅ）ＮＫｐ４６－９ Ｈ２可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、およびＮＫｐ４６－９ Ｌ１もしくはＬ２可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｆ）ＮＫｐ４６－９ Ｈ３可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、およびＮＫｐ４６－９ Ｌ１もしくはＬ２可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬ。
表５


活性試験
多特異性タンパク質は、生物学的活性、例えば、抗原結合性、ＮＫ細胞の増殖を誘発する能力、ＮＫによる標的細胞溶解を誘発する、および／または、ＮＫ細胞により誘発される任意の特有のシグナル伝達活性、例えばサイトカイン産生もしくは活性化のマーカーの細胞表面発現を含む、ＮＫ細胞の活性化を誘発する能力について評価され得る。１つの実施形態において、提供されるのは、本開示の多特異性タンパク質の生物学的活性、例えば、抗原結合性、それにより誘発される標的細胞溶解および／または特有のシグナル伝達活性を誘発する能力を評価する方法である。多特異性タンパク質の構成要素のうちの１つ（例えばＮＫｐ４６結合性ＡＢＤ、対象とする抗原に結合するＡＢＤ、Ｆｃドメイン、サイトカイン受容体ＡＢＤなど）の特有の寄与または活性が評価される場合、多特異性フォーマットは、対象とする構成要素（例えばドメイン）の評価を可能とする好適なフォーマットにおいて産生され得ることが理解される。本開示はまた、多特異性タンパク質の試験、評価、作製および／または産生における使用のためのそのような方法を提供する。例えば、サイトカインの寄与または活性が評価される場合、多特異性タンパク質は、サイトカインを有するタンパク質、および、サイトカインが、それを欠失させるか、または他にその活性をモジュレートするように改変されている別のタンパク質（例えば、２つの多特異性タンパク質はそれ以外は同じまたは同等の構造を有する）として産生され、対象とするアッセイにおいて試験され得る。例えば、抗ＮＫｐ４６ ＡＢＤの寄与または活性が評価される場合、多特異性タンパク質は、ＡＢＤを有するタンパク質、および、ＡＢＤが存在しないか、またはＮＫｐ４６に結合しないＡＢＤ（例えば、アッセイシステム中に存在しない抗原に結合するＡＢＤ）により置き換えられている別のタンパク質として産生可能であり、２つの多特異性タンパク質はそれ以外は同じまたは同等の構造を有し、かつ２つの多特異性タンパク質は対象とするアッセイにおいて試験される。別の例において、対象とする抗原（例えば腫瘍抗原）に対するＡＢＤの寄与または活性が評価される場合、多特異性タンパク質は、ＡＢＤを有するタンパク質、および、ＡＢＤが存在しないか、または腫瘍抗原もしくは対象とする抗－抗原に結合しないＡＢＤ（例えば、アッセイシステム中に存在しない抗原に結合するＡＢＤ、異なる腫瘍抗原に結合するＡＢＤ）により置き換えられている別のタンパク質として産生可能であり、２つの多特異性タンパク質はそれ以外は同じまたは同等の構造を有し、かつ２つの多特異性タンパク質は対象とするアッセイにおいて試験される。
本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、タンパク質がＮＫｐ４６発現細胞（例えば精製されたＮＫ細胞）および対象とする抗原（例えば腫瘍抗原）を発現する標的細胞（例えば腫瘍細胞）の存在下でインキュベートされた場合に、ＮＫｐ４６発現細胞（例えばＮＫ細胞、レポーター細胞）の活性化を誘導する能力を有する。
本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、タンパク質がＮＫｐ４６発現細胞（例えば精製されたＮＫ細胞）および対象とする抗原を発現する標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＮＫｐ４６発現細胞（例えばＮＫ細胞、レポーター細胞）においてＮＫｐ４６シグナル伝達を誘導する能力を有する。本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、タンパク質がＣＤ１６ＡおよびＮＫｐ４６発現細胞（例えば精製されたＮＫ細胞）ならびに対象とする抗原を発現する標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＣＤ１６ＡおよびＮＫｐ４６発現細胞（例えばＮＫ細胞、レポーター細胞）においてＣＤ１６Ａシグナル伝達を誘導する能力を有する。
適宜、ＮＫ細胞活性化またはシグナル伝達は、活性化の細胞表面マーカー、例えばＣＤ１０７、ＣＤ６９、Ｓｃａ－１またはＬｙ－６Ａ／Ｅ、ＫＬＲＧ１などの発現の増加により特徴付けられる（ｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）。
本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、タンパク質がＮＫｐ４６および／またはＣＤ１６発現細胞（例えば精製されたＮＫ細胞）の存在下で、適宜標的細胞の非存在下で、インキュベートされた場合に、ＮＫｐ４６および／またはＣＤ１６発現細胞（例えばＮＫ細胞、レポーター細胞）の細胞表面上に存在するＣＤ１３７の増加を誘導する能力を有する。
本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、サイトカイン受容体ＡＢＤ（例えばサイトカイン、ＣＤ１２２ ＡＢＤ）を欠いた同じ多特異性タンパク質と比較して少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍、ＮＫ細胞を活性化させるかまたはその増殖を増強する能力を有する。適宜、多特異性タンパク質は、ＣＤ２５発現Ｔ細胞の活性化またはその増殖の増強についてのＥＣ５０よりも少なくとも１０倍、５０倍または１００倍低いＮＫ細胞の活性化またはその増殖の増強についてのＥＣ５０を示す。
本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍ＣＤ２５発現Ｔ細胞を上回ってＮＫ細胞を活性化させるかまたはその増殖を増強する能力を有する。適宜、ＣＤ２５発現Ｔ細胞は、ＣＤ４ Ｔ細胞、適宜Ｔｒｅｇ細胞、またはＣＤ８ Ｔ細胞である。
サイトカイン受容体ＡＢＤ含有タンパク質による細胞（例えばＮＫ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞）におけるサイトカイン受容体を介する活性化または増殖の増強は、多特異性タンパク質を用いた処理後の前記細胞におけるｐＳＴＡＴまたは細胞増殖マーカー（例えばＫｉ６７）の発現を測定することにより決定され得る。ＣＤ１２２ ＡＢＤ含有タンパク質による細胞（例えばＮＫ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞）におけるＩＬ－２Ｒ経路を介する活性化または増殖の増強は、多特異性タンパク質を用いた処理後の前記細胞におけるｐＳＴＡＴ５または細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現を測定することにより決定され得る。ＩＬ－２およびＩＬ－１５はＳＴＡＴ５タンパク質のリン酸化に繋がり、ＳＴＡＴ５タンパク質は細胞増殖、生存、分化およびアポトーシスに関与する。リン酸化されたＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）は核に移行して、ＣＤ２５を含む標的遺伝子の転写を調節する。ＳＴＡＴ５はまたＮＫ細胞生存のために要求され、ＮＫ細胞はＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路により緊密に調節される。本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、タンパク質がＮＫｐ４６発現細胞（例えば精製されたＮＫ細胞）の存在下でインキュベートされた場合に、ＮＫｐ４６発現細胞（例えばＮＫ細胞）においてＳＴＡＴ５シグナル伝達を誘導する能力を有する。本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍ＣＤ２５発現Ｔ細胞を上回ってＮＫ細胞においてｐＳＴＡＴ５の発現の増加を引き起こす能力を有する。適宜、多特異性タンパク質は、ＣＤ２５発現Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５の発現の誘導についてのそのＥＣ５０よりも少なくとも１０倍、５０倍または１００倍低いＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ５の発現の誘導についてのＥＣ５０を示す。同様に、サイトカイン受容体シグナル伝達はまた、他のサイトカイン／サイトカイン受容体ペア、例えばＩＬ－１５（ＳＴＡＴ５）、ＩＬ－２１（ＳＴＡＴ３）、ＩＬ－２７（ＳＴＡＴ１）、ＩＬ－１２（ＳＴＡＴ４）などについて評価され得る。
活性は、例えば、適宜さらに標的細胞（例えば腫瘍細胞）の存在下で、ＮＫｐ４６発現細胞（またはアッセイに依存してＣＤ２５発現細胞）を多特異性ポリペプチドと接触させることにより測定され得る。一部の実施形態において、活性は、例えば、標的細胞およびＮＫ細胞（すなわちＮＫｐ４６発現細胞）を、多特異性ポリペプチドの存在下で、互いと接触させることにより測定される。ＮＫｐ４６発現細胞は、精製されたＮＫ細胞もしくはＮＫｐ４６発現細胞として、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団内のＮＫｐ４６発現細胞として用いられてもよい。標的細胞は、対象とする抗原を発現する細胞、または適宜腫瘍細胞であり得る。
１つの例において、多特異性タンパク質は、それぞれＮＫ細胞活性と関連付けられるとして当技術分野において公知の任意の特性または活性、例えば、細胞傷害性（ＣＤ１０７）またはサイトカイン産生（例えばＩＦＮ－γもしくはＴＮＦ－α）のマーカー、細胞内遊離カルシウムレベルにおける増加、例えば再方向付け殺傷アッセイにおいて、標的細胞を溶解する能力などにおける測定可能な増加を引き起こす能力について評価され得る。
標的細胞（対象とする抗原を発現する標的細胞）およびＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞の存在下で、多特異性タンパク質は、インビトロでＮＫ細胞活性と関連付けられる特性または活性（例えば、ＮＫ細胞の細胞傷害性、ＣＤ１０７発現、ＩＦＮγ産生、標的細胞の殺傷の活性化）における増加を引き起こす能力を有する。例えば、本発明による多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞活性を検出するアッセイ、例えば、ＮＫ活性化マーカーの発現を検出するか、またはＮＫ細胞の細胞傷害性を検出するアッセイ、例えば、ＣＤ１０７もしくはＣＤ６９発現、ＩＦＮγ産生を検出するアッセイ、または細胞傷害性の古典的なインビトロクロム放出試験により測定された場合に、多特異性タンパク質と接触させられていない同じＮＫ細胞および標的細胞を用いて同じエフェクター：標的細胞比を用いて達成される場合と比較して約２０％より大きく、好ましくは少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、またはより大きくＮＫ細胞活性を増加させるその能力に基づいて選択され得る。ＮＫ細胞活性化を検出するためおよび細胞傷害性アッセイのためのプロトコールの例は、本明細書中の実施例の他に、例えば、Pessino et al, J. Exp. Med, 1998, 188 (5): 953-960; Sivori et al, Eur J Immunol, 1999. 29:1656-1666; Brando et al, (2005) J. Leukoc. Biol. 78:359-371; El-Sherbiny et al, (2007) Cancer Research 67(18):8444-9;およびNolte-'t Hoen et al, (2007) Blood 109:670-673)において記載されている。細胞傷害性の古典的なインビトロクロム放出試験において、標的細胞は、ＮＫ細胞の追加に先立って５１Ｃｒを用いて標識され、次に殺傷は、殺傷の結果としての、培地への細胞からの５１Ｃｒの放出に比例しているとして概算される。適宜、本発明による多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞活性のアッセイ（例えば対象とする抗原を発現する標的細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を検出するアッセイ）により測定された場合に、同じ対象とする抗原に結合する従来的なヒトＩｇＧ１抗体と比較して標的細胞に向けたＮＫ細胞活性、すなわち、標的細胞の溶解を誘導するより大きい能力を有するその能力について選択され得るか、または該能力により特徴付けられ得る。
本明細書において示されるように、多特異性タンパク質の異なるＡＢＤは、インビボで強力な抗腫瘍活性を最終的に顕現する多特異性タンパク質の全体的な活性に寄与する。本明細書において例示される試験方法は、特定のＡＢＤを欠いた多特異性タンパク質の変異型を作製することおよび／または特定のＡＢＤのための受容体を欠いた細胞を使用することにより多特異性タンパク質の異なる個々のＡＢＤの活性のインビトロ評価を可能とする。
例えば、多特異性タンパク質は、以下のいずれかにより特徴付けられ得る：
－ サイトカイン受容体ＡＢＤを欠いた同じ多特異性タンパク質と比較して少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍増加した（例えば少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍低いＥＣ５０を有する）ＮＫ細胞の活性化もしくは増殖の増強を引き起こす能力［例えば、多特異性タンパク質を用いた処理後の前記細胞におけるｐＳＴＡＴもしくは細胞増殖マーカー（例えばＫｉ６７）の発現を測定することにより決定される］；
－ 例えば、ＣＤ１０７もしくはＣＤ６９発現、ＩＦＮγ産生を検出するアッセイ、もしくは細胞傷害性の古典的なインビトロクロム放出試験において決定された場合に、機能的なＮＫｐ４６ ＡＢＤを欠いたかつ／もしくはＣＤ１６Ａドメインを欠いた（例えばＣＤ１６Ａ結合性を低減もしくは消失させるために改変されたＦｃ領域を有する）同じ多特異性タンパク質と比較して少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍増加した（例えば少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍低いＥＣ５０を有する）腫瘍細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性における増加を引き起こす能力；
－ 例えば、ＣＤ１０７もしくはＣＤ６９発現、ＩＦＮγ産生を検出するアッセイ、もしくは細胞傷害性の古典的なインビトロクロム放出試験において決定された場合に、対象とする抗原（例えば腫瘍抗原）に結合するドメインを欠いた同じ多特異性タンパク質と比較して少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍増加した（例えば少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍低いＥＣ５０を有する）腫瘍細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性における増加を引き起こす能力；ならびに／または
－ 例えば、多特異性タンパク質を用いたＰＢＭＣの処理後のＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴもしくは細胞増殖マーカー（例えばＫｉ６７）の発現を測定することにより決定された場合に、ＮＫｐ４６ ＡＢＤを欠いたおよび／もしくはＣＤ１６Ａドメインを欠いた（例えばＣＤ１６Ａ結合性を低減もしくは消失させるために改変されたＦｃ領域を有する）同じ多特異性タンパク質と比較して少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍増加した（例えば少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍低いＥＣ５０を有する）前記ＮＫ細胞の活性化もしくは増殖の増強を引き起こす能力；
－ Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞および／もしくはＣＤ８ Ｔ細胞の活性化もしくは増殖の増強と比較して少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍増加した（例えば少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍低いＥＣ５０を有する）ＮＫ細胞の活性化もしくは増殖の増強を引き起こす能力［例えば、多特異性タンパク質を用いたＰＢＭＣの処理後の前記ＮＫ、ＴＲｅｇ、ＣＤ４ Ｔ細胞および／もしくはＣＤ８ Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴもしくは細胞増殖マーカー（例えばＫｉ６７）の発現を測定することにより決定される］。
実施例において開示されるように、比較用タンパク質において欠失しているドメインは、多特異性タンパク質の構造を維持するが試験システム中のいかなる抗原にも結合しない代用ドメイン（例えばＶＨおよびＶＬペア）であるとして特定され得る。本明細書において示されるように、本開示による多特異性タンパク質は、サイトカイン受容体ＡＢＤ（例えばＣＤ１２２ ＡＢＤ）を含まない場合およびＣＤ１６に結合しないＦｃドメインを有する場合、タンパク質が標的細胞上の対象とする抗原に結合していない場合に（例えば対象とする抗原および／または標的細胞の非存在下で）ＮＫ細胞のＮＫｐ４６シグナル伝達（および／またはその結果としてもたらされるＮＫ活性化）を実質的に誘導しない。そのため、多特異性タンパク質の一価ＮＫｐ４６結合性構成要素はそれ自体はＮＫｐ４６シグナル伝達を引き起こさない。よって、ＣＤ１６に結合するＦｃドメインを有する多特異性タンパク質の場合、そのような多特異性タンパク質は、サイトカイン受容体ＡＢＤ（例えばＣＤ１２２ ＡＢＤ）が不活性化されている（例えば、改変、マスクまたは欠失されており、それにより、ＩＬ－２Ｒに結合するその能力が排除されている）構成において産生可能であり、タンパク質は、ＣＤ１６陰性ＮＫ細胞による、ＮＫｐ４６発現に対するこの多特異性タンパク質の効果を試験することによりＮＫｐ４６シグナル伝達またはＮＫｐ４６媒介性ＮＫ細胞活性化を誘発するその能力について評価され得る。多特異性タンパク質は、適宜、多特異性タンパク質が標的細胞の非存在下でＮＫｐ４６発現ＣＤ１６陰性細胞（例えば、精製されたＮＫ細胞または精製されたレポーター細胞）とインキュベートされた場合にそのようなＮＫｐ４６発現ＣＤ１６陰性細胞（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞、レポーター細胞）によるＮＫｐ４６シグナル伝達を実質的に引き起こさない（または増加させない）として特徴付けられ得る。
本明細書における任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、例えば、以下により特徴付けられ得る：
（ａ）多特異性タンパク質がＮＫｐ４６発現細胞（例えば精製されたＮＫ細胞）の存在下でインキュベートされた場合にＮＫｐ４６発現細胞（例えばＮＫ細胞）においてサイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）シグナル伝達を誘導する能力を有すること（例えば、ＳＴＡＴシグナル伝達を評価すること、例えばＳＴＡＴリン酸化を評価することにより決定される）；
（ｂ）ＮＫｐ４６（および適宜さらにＣＤ１６）を発現するＮＫ細胞および標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＮＫ細胞が標的細胞を溶解するのを誘導する能力を有すること；ならびに
（ｃ）多特異性タンパク質が、サイトカイン受容体ＡＢＤ（例えばＣＤ１２２ ＡＢＤ）を欠くように改変されているかまたは不活性化されたサイトカイン受容体ＡＢＤを含む場合に、標的細胞の非存在下で、ＮＫ細胞（適宜ＣＤ１６陰性ＮＫ細胞、ＣＤ１６を発現しないＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞）、適宜精製されたＮＫ細胞とインキュベートされた場合に、ＮＫ細胞活性化もしくは細胞傷害性を欠如しているおよび／またはＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性を欠如していること。
細胞タイプおよびエフェクター：標的比を含むがそれに限定されない、アッセイ条件および方法は、適宜、本明細書の実施例によるものであるとして特定され得る。
化合物の使用
１つの態様において、提供されるのは、それを必要とする哺乳動物（例えばヒト）における疾患の処置、予防または診断用の薬学的調製物を製造するための、多特異性タンパク質、該タンパク質（もしくはそのポリペプチド鎖）を発現する細胞および／または該タンパク質をロードされているかもしくはそれと共にインキュベートされた細胞（例えばＮＫ細胞）のいずれかの使用である。提供されるのはまた、医薬または医薬中の活性成分もしくは活性物質としての上記に定義される化合物のいずれかの使用である。さらなる態様において、本発明は、投与（例えば、皮下または静脈内注射による）のための固体または液体製剤を提供するために本明細書において定義されている化合物または組成物を含有する医薬組成物を調製する方法を提供する。そのような方法または製法は、該化合物を医薬的に許容される担体と混合する工程を含むとして特定され得る。
１つの態様において、提供されるのは、本明細書において記載される多特異性タンパク質もしくは抗体、またはそれを含む（医薬）組成物を使用または投与することにより、個体において予め定義された状態を処置するか、予防するか、もしくはより一般にはそれに影響するか、またはある特定の状態を検出する方法である。
例えば、１つの態様において、本発明は、それを必要とする患者（例えばがん、またはウイルスもしくは細菌感染症を有する患者）においてＮＫｐ４６発現細胞、特にはＮＫｐ４６＋ ＮＫ細胞（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞、ＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞）の活性および／または増殖を回復させるかまたは増強する方法であって、本明細書において記載される多特異性タンパク質を前記患者に投与する工程を含む、方法を提供する。１つの態様において、本発明は、ＣＤ２５発現リンパ球、例えばＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞を上回ってＮＫ細胞の活性および／または増殖を選択的に回復させるかまたは増強する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は、増加したリンパ球（例えばＮＫ細胞）活性が有益であるか、または不十分なＮＫ細胞活性により引き起こされるかもしくは特徴付けられる疾患、例えばがん、またはウイルスもしくは微小生物／細菌感染症を有する患者においてＮＫｐ４６＋リンパ球（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞、ＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞）の活性を増加させることに方向付けられている。
１つの態様において、本発明は、それを必要とする患者（例えば固形腫瘍を有する患者）において腫瘍浸潤性ＮＫ細胞または腫瘍内ＮＫｐ４６発現細胞、特にはＮＫｐ４６＋ ＮＫ細胞（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞、ＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞）の活性および／または増殖を回復させるかまたは増強する方法であって、本明細書において記載される多特異性タンパク質を前記患者に投与する工程を含む、方法を提供する。
１つの態様において、本発明は、それを必要とする患者（例えば固形腫瘍を有する患者）において腫瘍浸潤性ＮＫ細胞または腫瘍内ＮＫｐ４６発現細胞、特には活性化されたＮＫｐ４６発現細胞、特にはＮＫｐ４６＋ ＮＫ細胞（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞、ＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞）の数を増加させる方法であって、本明細書において記載される多特異性タンパク質を前記患者に投与する工程を含む、方法を提供する。
別の態様において、本発明は、それを必要とする患者（例えばがん、またはウイルス、寄生生物もしくは細菌感染症を有する患者）においてＮＫｐ４６＋ ＮＫ細胞（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞、ＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞）の活性および／または増殖を回復させるかまたは増強する方法であって、患者に由来する細胞、例えば、免疫細胞、および適宜、対象とする抗原を発現する標的細胞を、本発明による多特異性タンパク質と接触させる工程ならびに多特異性タンパク質で処理された細胞を患者中に再注入する工程を含む、方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、増加したリンパ球（例えばＮＫ細胞）活性が有益であるか、または不十分なＮＫ細胞活性により引き起こされるかもしくは特徴付けられる疾患、例えばがん、またはウイルスもしくは微小生物、例えば、細菌もしくは寄生生物感染症を有する患者においてＮＫｐ４６＋リンパ球（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞）の活性を増加させることに方向付けられている。
別の態様において、本発明は、それを必要とする患者（例えばがん、またはウイルス、寄生生物もしくは細菌感染症を有する患者）においてＮＫｐ４６＋ ＮＫ細胞（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞、ＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞）の活性および／または増殖を回復させるかまたは増強する方法であって、患者に由来する細胞、例えば、免疫細胞を、本発明による多特異性タンパク質と接触させる工程、および多特異性タンパク質で処理された細胞を患者中に再注入する工程を含む、方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、増加したリンパ球（例えばＮＫ細胞）活性が有益であるか、または不十分なＮＫ細胞活性により引き起こされるかもしくは特徴付けられる疾患、例えばがん、またはウイルスもしくは微小生物、例えば、細菌もしくは寄生生物感染症を有する患者においてＮＫｐ４６＋リンパ球（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞）の活性を増加させることに方向付けられている。
別の実施形態において、主題多特異性タンパク質は、処置される患者または異なるドナーに由来する免疫細胞、特にはＮＫ細胞と組み合わせて使用または投与されてもよく、これらのＮＫ細胞は、それを必要とする患者、例えば増加したリンパ球（例えばＮＫ細胞）活性が有益であるか、または不十分なＮＫ細胞活性により引き起こされるかもしくは特徴付けられる疾患、例えばがん、またはウイルスもしくは微小生物、例えば、細菌もしくは寄生生物感染症を有する患者に投与されてもよい。ＮＫ細胞は（ＣＡＲ－Ｔ細胞と異なり）ＴＣＲを発現しないので、これらのＮＫ細胞は、異なるドナーに由来するものであっても、ＧＶＨＤ反応を誘導しない［例えば、Glienke et al., "Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells", Front. Pharmacol. 6, Art. 21:1-6 (2015); Hermanson and Kaufman, Front. Immunol. 6, Art. 195:1-6 (2015)を参照］。
１つの実施形態において、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６およびＣＤ１２２を含む、エフェクター細胞の複数の活性化受容体を介してＮＫ細胞活性化、増殖、腫瘍浸潤および／または標的細胞溶解を媒介する本明細書において開示される多特異性タンパク質は、そのエフェクター細胞または腫瘍浸潤性エフェクター細胞（例えばＮＫｐ４６＋ ＮＫ細胞）が低機能であるか、疲弊しているかまたは抑制されている個体、例えば、１もしくは複数の阻害性受容体（例えばＴＩＭ－３、ＰＤ１、ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴなど）の発現および／もしくは上方調節、またはＣＤ１６の発現の下方調節もしくは低いレベル（例えば、上昇した割合のＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞の存在）により特徴付けられる意義のあるエフェクター細胞の集団を有する患者の処置のために有利に使用され得る。
本明細書において記載される多特異性ポリペプチドまたは細胞は、抗体を用いて処置され得る障害、例えばがん、固形および非固形腫瘍、血液学的悪性腫瘍、感染症、例えばウイルス感染症、ならびに炎症性または自己免疫障害を予防または処置するために使用され得る。
１つの実施形態において、対象とする抗原（非ＮＫｐ４６ 抗原）は、癌腫、例えば膀胱、頭頸部、***、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺および皮膚の癌腫、例えば扁平上皮細胞癌；リンパ球系列の造血腫瘍、例えば白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫；骨髄系列の造血腫瘍、例えば急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病；間葉起源の腫瘍、例えば線維肉腫および横紋筋肉腫；他の腫瘍、例えば神経芽腫および神経膠腫；中枢および末梢神経系の腫瘍、例えば星細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、および神経鞘腫；間葉起源の腫瘍、例えば線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫；ならびに他の腫瘍、例えば黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、精上皮腫、甲状腺濾胞がんおよび奇形癌、リンパ球系列の造血腫瘍、例えばＴ細胞およびＢ細胞腫瘍、以下に限定されないが例えばＴ細胞障害、例えばＴ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、例えば小細胞および大脳様細胞タイプのもの；大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）、好ましくはＴ細胞タイプのもの；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ Ｔ－ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性および免疫芽球性サブタイプ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；退形成（Ｋｉ １＋）大細胞リンパ腫；腸Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球性；ならびにリンパ腫／白血病（Ｔ－Ｌｂｌｙ／Ｔ－ＡＬＬ）からなる群から選択されるがんのタイプの悪性細胞の表面上に発現される抗原である。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、癌腫、例えば膀胱、頭頸部、***、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺および皮膚の癌腫、例えば扁平上皮細胞癌；リンパ球系列の造血腫瘍、例えば白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫；骨髄系列の造血腫瘍、例えば急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病；間葉起源の腫瘍、例えば線維肉腫および横紋筋肉腫；他の腫瘍、例えば神経芽腫および神経膠腫；中枢および末梢神経系の腫瘍、例えば星細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、および神経鞘腫；間葉起源の腫瘍、例えば線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫；ならびに他の腫瘍、例えば黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、精上皮腫、甲状腺濾胞がんおよび奇形癌からなる群から選択されるがんを予防または処置するために使用される。本発明に従って処置され得る他の例示的な障害は、リンパ球系列の造血腫瘍、例えばＴ細胞およびＢ細胞腫瘍、以下に限定されないが例えばＴ細胞障害、例えばＴ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、例えば小細胞および大脳様細胞タイプのもの；大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）、好ましくはＴ細胞タイプのもの；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ Ｔ－ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性および免疫芽球性サブタイプ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；退形成（Ｋｉ １＋）大細胞リンパ腫；腸Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球性；ならびにリンパ腫／白血病（Ｔ－Ｌｂｌｙ／Ｔ－ＡＬＬ）を含む。
１つの例において、腫瘍抗原は、リンパ腫細胞または白血病細胞の表面上に発現される抗原であり、かつ多特異性タンパク質は、リンパ腫または白血病を有する個体に投与され、かつ／または該個体の処置のために使用される。適宜、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０またはＣＤ３３から選択される。
１つの実施形態において、本明細書において記載される本発明の多特異性ポリペプチドまたは細胞組成物は、本開示の多特異性タンパク質が特異的に結合する対象とする抗原（例えば腫瘍抗原）を発現する腫瘍細胞により特徴付けられるがんを予防または処置するために使用され得る。
１つの態様において、処置の方法は、個体に本明細書において記載される多特異性タンパク質を、例えば、本明細書において開示されている疾患、例えば上記に同定されるがんのいずれかの処置のための、治療有効量において投与することを含む。治療有効量は、疾患または障害を有する患者において治療効果を有する（または疾患もしくは障害を有する患者および該患者と実質的に類似した特徴を有する患者の少なくとも実質的な割合においてそのような効果を促進、増強、および／もしくは誘導する）任意の量であってもよい。
多特異性タンパク質は、個体から得られた生物学的試料（例えばがん細胞、がん組織またはがん隣接組織を含む生物学的試料）中の標的細胞上の対象とする抗原（例えば腫瘍抗原）の発現を検出する先行する工程と共にまたは（ｗｉｔｈ ｏｕｒ）該工程なしで使用されてもよい。別の実施形態において、本開示は、それを必要とする個体においてがんを処置または予防する方法であって、
ａ）対象とする抗原（例えば多特異性タンパク質がその対象とする抗原のＡＢＤを介して特異的に結合する対象とする抗原）を発現する個体からの試料中の細胞（例えば腫瘍細胞）を検出すること、ならびに
ｂ）対象とする抗原を発現する細胞が、適宜、少なくとも参照レベルに対応する（例えば多特異性タンパク質から実質的な利益を誘導する個体に対応する）レベルにおいて、または適宜、参照レベルと比較して増加した（例えば健常個体もしくは本明細書において記載されるタンパク質から実質的な利益を誘導しない個体に対応する）レベルにおいて、試料中に含まれると決定されたら、対象とする抗原、ＮＫｐ４６、サイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）、および適宜ＣＤ１６Ａに結合する（例えば、そのＦｃドメインを介して）本開示の多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む、方法を提供する。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、対象とする抗原の表面発現の低いレベルにより特徴付けられる腫瘍を処置するために使用される。よって、腫瘍またはがんは、低いレベルの腫瘍抗原を発現する細胞により特徴付けられ得る。適宜、腫瘍抗原のレベルは、がん細胞１個当たり１００，０００個未満の腫瘍抗原コピーである。一部の態様において、腫瘍抗原のレベルは、がん細胞１個当たり９０，０００個未満、７５，０００個未満、５０，０００個未満、または４０，０００個未満の腫瘍抗原コピーである。使用は、適宜、対象の１つまたは複数のがん細胞の腫瘍抗原のレベルを検出することをさらに含む。
多特異性タンパク質は、処置される個体からのＮＫ細胞を検出するかまたは特徴付ける先行する工程と共にまたは該工程なしで使用されてもよい。適宜、１つの実施形態において、本発明は、それを必要とする個体においてがんを処置または予防する方法であって、
ａ）個体からの腫瘍試料中（または腫瘍内および／もしくは隣接組織内）のＮＫ細胞（例えば腫瘍浸潤性ＮＫ細胞）を検出すること、ならびに
ｂ）腫瘍または腫瘍試料が、適宜、参照レベルと比較して減少したレベルまたは数において（例えば、従来的なＩｇＧ抗体療法、例えば同じがん抗原に結合する従来的なＩｇＧ１抗体から誘導される利益がないか、低いかまたは不十分である個体に対応するレベルにおいて）、ＮＫ細胞の少ない数または低い活性により特徴付けられると決定されたら、がん抗原、ＮＫｐ４６（例えば、一価で）、サイトカイン受容体（例えば、ＣＤ１２２）および適宜ＣＤ１６Ａに結合する多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む、方法を提供する。
一部の実施形態において、個体は、ＣＤ１６（例えばＣＤ１６Ａ）欠損腫瘍微環境により特徴付けられる腫瘍を有する。適宜、多特異性タンパク質を使用する処置の方法は、個体からの試料（例えば腫瘍試料）中のＣＤ１６の発現レベルを検出する工程を含む。ＣＤ１６を検出することは、適宜、ＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂのレベルを検出することを含む。一部の態様において、ＣＤ１６欠損微環境は、造血幹細胞移植を受けた患者において評価される。適宜、ＣＤ１６欠損微環境は浸潤性ＮＫ細胞の集団を含み、かつ浸潤性ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較して５０％未満のＣＤ１６の発現を有する。一部の態様において、浸潤性ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較して３０％未満、２０％未満、または１０％未満のＣＤ１６の発現を有する。適宜、ＣＤ１６欠損微環境は浸潤性ＮＫ細胞の集団を含み、かつ浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１０％は、対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する。一部の態様において、浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％は、対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する。
適宜、１つの実施形態において、提供されるのは、それを必要とする個体においてがんを処置または予防する方法であって、
ａ）個体からの腫瘍または腫瘍試料（例えば、腫瘍および／または隣接組織内）からの細胞（例えば腫瘍浸潤性ＮＫ細胞）におけるＣＤ１６発現を検出すること、ならびに
ｂ）腫瘍または腫瘍試料がＣＤ１６欠損微環境により特徴付けられると決定されたら、がん抗原、ＮＫｐ４６、およびサイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）（および適宜さらにＣＤ１６Ａ）に結合する多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む方法である。
適宜、１つの実施形態において、提供されるのは、それを必要とする個体においてがんを処置または予防する方法であって、
ａ）個体からの腫瘍試料中（または腫瘍内および／もしくは隣接組織内）のＮＫ細胞（例えば腫瘍浸潤性ＮＫ細胞）の表面におけるＣＤ１６発現を検出すること、ならびに
ｂ）腫瘍または腫瘍試料が、適宜、参照レベルと比較して増加したレベルまたは数において、ＣＤ１６－ ＮＫ細胞の上昇した割合により特徴付けられると決定されたら、がん抗原、ＮＫｐ４６、およびサイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）（および適宜さらにＣＤ１６Ａ）に結合する多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む方法である。
１つの実施形態において、本開示は、それを必要とする個体において疾患（例えばがん）を処置または予防する方法であって、
ａ）個体からの試料中（例えば循環中または腫瘍環境中）の免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞、Ｔ細胞）上の１または複数の阻害性受容体の細胞表面発現を検出すること、ならびに
ｂ）適宜、参照レベルと比較して増加したレベルにおける（例えば、健常個体、免疫疲弊も抑制も患っていない個体、または本明細書において記載されるタンパク質から実質的な利益を誘導しない個体と比較して増加したレベルにおける）、免疫エフェクター細胞上の１または複数の阻害性受容体の細胞表面発現が決定されたら、対象とする抗原（例えばがん抗原）、ＮＫｐ４６（例えば、一価で）、およびサイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）（および適宜さらにＣＤ１６Ａ）に結合する多特異性タンパク質（例えば多特異性タンパク質）を個体に投与すること
を含む方法を提供する。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、胃がんまたは前立腺がんを有する個体を処置するために使用される。免疫エフェクター細胞上のＮＫＧ２Ｄの減少した細胞表面発現が胃がんおよび前立腺がんにおいて観察されている。
一部の実施形態において、個体は、ＮＫＧ２Ｄの発現の減少、例えば細胞表面発現の減少により特徴付けられるＮＫ細胞および／またはＴ細胞を有する。発現のレベルは、例えば、参照値、例えば健常個体においてＮＫおよび／またはＴ細胞上に観察されるＮＫＧ２Ｄレベルに対応する参照値と比較され得る。一部の実施形態において、個体は、腫瘍微環境中のＮＫおよび／またはＴ細胞上のＮＫＧ２Ｄの発現の減少により特徴付けられるＮＫおよび／またはＴ細胞を有する。一部の実施形態において、個体は、腫瘍微環境中のＮＫＧ２Ｄの可溶性リガンド、例えば可溶性ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢまたはＵＬＢＰタンパク質の存在（例えば増加したレベルにおけるもの）を有する。
１つの実施形態において、本開示は、それを必要とする個体において疾患（例えばがん）を処置または予防する方法であって、
ａ）個体からの試料中（例えば循環中または腫瘍環境中）の免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞、Ｔ細胞）上のＮＫＧ２Ｄポリペプチドの細胞表面発現を検出すること、ならびに
ｂ）適宜、参照レベルと比較して減少したレベルにおける（例えば、健常個体、免疫疲弊も抑制も患っていない個体、または本明細書において記載されるタンパク質から実質的な利益を誘導しない個体と比較して増加したレベルにおける）、免疫エフェクター細胞上の１または複数の阻害性受容体の細胞表面発現の減少が決定されたら、対象とする抗原（例えばがん抗原）、ＮＫｐ４６（例えば、一価で）、およびサイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）（および適宜さらにＣＤ１６Ａ）に結合する多特異性タンパク質（例えば多特異性タンパク質）を個体に投与すること
を含む方法を提供する。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、単剤療法（他の治療剤を伴わない）として、または別々に投与される１つもしくは複数の他の治療剤との併用処置において使用されてもよい。１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドとの併用処置の非存在下で投与される。
多特異性タンパク質はまた、キット中に含まれ得る。キットは、適宜、任意の数のポリペプチドおよび／または他の化合物、例えば、１、２、３、４、または任意の他の数の多特異性タンパク質および／または他の化合物をさらに含有してもよい。キットの内容物のこの記載は、いかなるようにも限定的でないことが理解される。例えば、キットは、他のタイプの治療用化合物を含有してもよい。適宜、キットはまた、例えば、本明細書において記載される方法、例えば特有の疾患状態の検出または処置における方法を詳述する、ポリペプチドを使用するための指示書を含む。
提供されるのはまた、主題多特異性タンパク質および適宜、上記に定義されている他の化合物を含む、医薬組成物である。多特異性タンパク質および適宜別の化合物は、薬学的担体と共に精製された形態において医薬組成物として投与されてもよい。形態は、意図される投与のモードおよび治療的なまたは診断的な応用に依存する。薬学的担体は、化合物を患者にデリバリーするために好適な任意の適合性の非毒性物質であり得る。医薬的に許容される担体は当技術分野において周知であり、例えば、水性溶液、例えば（無菌）水または生理緩衝食塩水または他の溶媒もしくは媒体、例えばグリコール、グリセロール、油、例えばオリーブ油もしくは注射用有機エステル、アルコール、脂肪、ワックス、および不活性固体を含む。医薬的に許容される担体は、例えば化合物を安定化させるかまたはその吸収を増加させるために作用する生理学的に許容される化合物をさらに含有してもよい。そのような生理学的に許容される化合物は、例えば、炭水化物、例えばグルコース、スクロースもしくはデキストラン、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸もしくはグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定化剤もしくは賦形剤を含む。生理学的に許容される化合物を含む、医薬的に許容される担体の選択は、例えば、組成物の投与の経路に依存することは当業者に公知である。医薬的に許容されるアジュバント、緩衝化剤、および分散剤などもまた医薬組成物中に組み込まれ得る。そのようなアジュバントの非限定的な例は、無機および有機アジュバント、例えばミョウバン、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウム、スクアレン、リポソーム、リポ多糖、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ、一本鎖（ｓ－ｓ）ＤＮＡ、およびＴＬＲアゴニスト、例えば非メチル化ＣｐＧを例として含む。
本発明による多特異性タンパク質は非経口的に投与され得る。非経口投与用の化合物の調製物は無菌でなければならない。滅菌は、適宜凍結乾燥および再構成に先立つかまたはその後になされる、無菌濾過膜を通じた濾過により容易に達成される。化合物の投与のための非経口経路は、公知の方法、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、または病巣内経路による注射または注入に従う。化合物は、注入により連続的にまたはボーラス注射により投与されてもよい。静脈内注入用の典型的な組成物は、特定のタイプの化合物およびその要求される投薬レジメンに依存して、２０％のアルブミン溶液および１ｍｇ～１０ｇの化合物を適宜補充された、１００～５００ｍｌの無菌０．９％ ＮａＣｌまたは５％のグルコースを含有するように構成され得る。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は当技術分野において周知である。
多特異性タンパク質の調製
実施例において使用されたようなＩＬ－２変異型を含む例示的な「Ｔ５」フォーマット多特異性タンパク質のドメイン構造を図２Ａおよび図２Ｇにおいて示し、これはヒト化されたＮＫ４６－１ ＶＨおよびＶＬペアをＮＫｐ４６ ＡＢＤとして組み込んでいる。図２Ａは、ドメインリンカー、例えばヒンジおよびグリシン－セリンリンカー、ならびに鎖間ジスルフィドブリッジを示す。ＣＤ１６Ａ結合性を実質的に消失させるためのＮ２９７Ｓ突然変異を有するがそれ以外はフォーマットＴ５と同等である例示的な「Ｔ６」フォーマットのドメイン構造を図２Ｉにおいて示す。Ｔ５鎖Ｌ（鎖３としても参照される）を構築するために、ＮＫｐ４６結合性ＡＢＤ中のＮＫｐ４６－１ ＶＫドメインと通常は会合しているＣＫドメインをＣＨ１ドメインにより置き換えた。Ｔ２５フォーマットは、ＮＫｐ４６－１ ＶＫドメインと通常は会合しているＣＫドメインおよびＶＨと通常は会合しているＣＨ１がそれらと会合したままであるようなＮＫｐ４６結合性ＡＢＤのＣＨ１およびＣＫの置き換えによりＴ５フォーマットから異なる。鎖Ｌ（鎖３）と鎖Ｈ（鎖１）との間の正確な対合およびＨ鎖とＬ鎖との間の適正なジスルフィド結合の形成を確実にするために、ヒトＩｇＧ１の上ヒンジ残基を、鎖ＬをＩＬ－２変異型に接続するリンカーの上流において鎖ＬのＣＨ１ドメインのＣ末端において加えた。他のタンパク質フォーマットを図２Ｂ～２Ｎにおいて示す。実施例において使用されたようなＩＬ－１５、ＩＬ－１８（ＩＬ－１８ｖ）またはＩＦＮ－α（ＩＦＮαｖ）変異型を含む例示的な「Ｔ５」フォーマット多特異性タンパク質のドメイン構造を図２Ｏ、２Ｐ、２Ｑおよび２Ｒにおいて示し、これらはヒト化されたＮＫｐ４６－１またはＮＫｐ４６－４ ＶＨおよびＶＫドメインのいずれかを組み込んでいる。
各々の多特異性抗原結合性タンパク質のための各々のポリペプチド鎖をコードする配列をｐＴＴ－５ベクター中のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位との間に挿入した。３つのベクター（エンドトキシンフリーミディプレップまたはマキシプレップとして調製された）を使用して、ＰＥＩの存在下（３７℃、５％ ＣＯ２、１５０ｒｐｍ）でＥＸＰＩ－２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）への共トランスフェクトを行った。該細胞を使用して１×１０６細胞／ｍｌ（ＥＸＰＩ２９３培地、Ｇｉｂｃｏ）の密度において培養フラスコへの播種を行った。参照として、「Ｔ５」コンストラクトのために、０．１μｇ／ｍｌ（ポリペプチド鎖Ｉ）、０．４μｇ／ｍｌ（ポリペプチド鎖ＩＩ）、または０．８μｇ／ｍｌ（ポリペプチド鎖ＩＩＩ）のＤＮＡ比を使用した。バルプロ酸（最終濃度０．５ｍＭ）、グルコース（４ｇ／Ｌ）およびトリプトンＮ１（０．５％）を加えた。上清を６日後に採取し、０．２２μｍのポアを有するＳｔｅｒｉｃｕｐフィルターに通過させた。
ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、参照番号１７－１２７９－０３）を使用して採取後の上清から多特異性抗原結合性タンパク質を精製した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製を次に行い、予想されるサイズにおいて溶出されたタンパク質を最後に０．２２μｍデバイスにおいて濾過した。
産生された多特異性タンパク質のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を以下の表６において示す。

［実施例１］
ＩＬ２ｖはＴｒｅｇにおけるＩＬ２Ｒ活性化を制限する
突然変異体ＩＬ－２の１つのＣ末端部分を含有するヘテロ三量体Ｆｃドメイン含有タンパク質ＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖを、Ｔｒｅｇ細胞を活性化させるその能力について評価した。ＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖは、野生型ヒトＩＬ－２と比較してＣＤ２５に対する減少した結合親和性を付与する変異型ＩＬ－２ポリペプチド（ＩＬ－２ｖ）、突然変異Ｔ３Ａ、Ｃ１２５Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇを含むヒトＩＬ－２ポリペプチドを組み込んでいる。
ヘテロ三量体ＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖタンパク質は、Ｔ６フォーマットタンパク質（全体構造について図２Ｉを参照）であり、これはＩＬ２ｖがアイソタイプ対照（ＩＣ）Ｆａｂの鎖の１つのＣ末端に融合しており、次いで該Ｃ末端はＣＤ１６Ａ結合性を実質的に排除するために突然変異したＦｃドメインのＣ末端に融合しており、次いで該Ｃ末端は別のＩＣ Ｆａｂに融合している。ＩＣ Ｆａｂは、試験システム中のいかなるタンパク質にも結合しないＶＨ／ＶＬを有する。ヘテロ三量体ＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖを、ＩＬ２ｖが野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドにより置き換えられた同一のヘテロ三量体タンパク質（ＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｐＷＴ）、および組換えにより産生された全長野生型ＩＬ－２（ｒｅｃ ＩＬ－２）と比較した。
簡潔に述べれば、１Ｍ／ウェルの精製されたＰＢＭＣを９６ウェルプレート中に播種し、増加性用量の組換えｈｕＩＬ－２、ＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２またはＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖ（１３３ｎＭ～０．０００００１３ｎＭの用量）を用いて３７℃、５．５％ＣＯ２のインキュベーター中で２０分間処理した。ＳＴＡＴ５リン酸化を次に、Ｔｒｅｇ（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＦｏｘＰ３＋に関してゲーティングされた）に関するフローサイトメトリーにより分析した。
結果を図３において示す。ＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖ（「ＩＬ２ｖイムノコンジュゲート」）は、ＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ＷＴ（「ＩＬ２ｐＷＴイムノコンジュゲート」）および野生型ＩＬ－２（「Ｒｅｃ－ｈｕＩＬ２」）と比較して、Ｔｒｅｇの中でのＳＴＡＴ５リン酸化についてのＥＣ５０における約３－ｌｏｇの増加を結果としてもたらした。突然変異したヒトＩＬ－２を組み込んだＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖタンパク質は、したがって、野生型ＩＬ－２と比較してＴｒｅｇ細胞におけるサイトカイン受容体シグナル伝達を活性化させる能力の強い減少を示す。
［実施例２］
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖは選択的にＮＫ細胞においてＩＬ２Ｒ活性化を促進する
我々は、ＮＫｐ４６結合機能を実施例１のＦｃドメイン含有およびＩＬ２ｖ含有ヘテロ三量体タンパク質に加えることはＮＫ細胞におけるＩＬ－２Ｒシグナル伝達を促進するかどうかを評価した。我々はしたがって、ＮＫｐ４６に結合し、かつＩＬ２ｖ部分を含有するＮＫ細胞エンゲージャー（ＮＫＣＥ）タンパク質（ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖ）としても参照される異なる多特異性タンパク質を評価した。周知の抗腫瘍抗体との比較を提供するために、ＦＤＡ承認済みのヒト化抗体ＧＡ１０１（オビヌツズマブ、Ｒｏｃｈｅ）からの抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペアを組み込むことによりＮＫＣＥをＣＤ２０に結合させた。
ヘテロ三量体Ｆｃドメイン含有タンパク質ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを、Ｔｒｅｇ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞におけるサイトカイン受容体シグナル伝達を活性化させるその能力について評価した。図２Ａおよび図２Ｇにおいて示されるＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖタンパク質フォーマットは、Ｎ末端に位置付けられたＣＤ２０に結合する抗原結合性ドメインを有し、かつ突然変異Ｔ３Ａ、Ｃ１２５Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇを含むＣ末端に位置付けられたＩＬ－２ｖ、野生型Ｆｃドメイン（すなわちヒトＣＤ１６Ａに結合するもの）、ならびにＦｃドメインとＩＬ２ｖとの間に置かれたＮＫｐ４６に結合する抗原結合性ドメインを組み込んでいる。
簡潔に述べれば、１Ｍ／ウェルの精製されたＰＢＭＣを９６ウェルプレート中に播種し、増加性用量のＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖまたはＩＬ２ｖイムノコンジュゲート（１３３ｎＭ～０．０００００１３ｎＭの用量）を用いて３７℃、５．５％ＣＯ２のインキュベーター中で２０分間処理した。ＳＴＡＴ５リン酸化を次に、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）、ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ８＋）、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３－）およびＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＦｏｘＰ３＋に関してゲーティングされた）に関するフローサイトメトリーにより分析した。
結果を図４において示しており、該図は、ｙ軸上に標的化された細胞の中でのｐＳＴＡＴ５細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖおよびＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖは、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の同等の活性化を示した。しかしながら、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは、ＮＫｐ４６にもＣＤ１６Ａにも結合しないＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２と比較して、ＮＫ細胞の中でのＳＴＡＴ５リン酸化についてのＥＣ５０における約２桁の規模の減少を誘導した。ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖタンパク質は、したがって、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を上回るＮＫ細胞における選択的なサイトカイン受容体シグナル伝達を可能にした。
［実施例３］
ＣＤ１６およびＮＫｐ４６の両方は、ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖにより誘導されるＮＫ細胞におけるＩＬ２Ｒシグナル伝達を促進するために重要である
我々は、ＩＬ－２Ｒに加えてＣＤ１６および／またはＮＫｐ４６に結合する多特異性タンパク質によるＮＫ細胞におけるＩＬ－２Ｒシグナル伝達に対する効果を調べることを試みた。
同じ全体構造を共有するが、ＮＫｐ４６および腫瘍抗原結合性ドメインが、ドメイン構造を維持するがアッセイシステム中の任意のタンパク質に対する結合性を欠いたアイソタイプ対照（ＩＣ）ドメインを用いて個々に置き換えられているか、またはＦｃドメインが、ＣＤ１６Ａに結合するＦｃドメイン（「Ｔ５」タンパク質におけるもの）であるか、もしくはＣＤ１６Ａ結合性を欠いた突然変異したＦｃドメイン（Ｎ２９７Ｓ）（「Ｔ６」タンパク質におけるもの）であるヘテロ三量体ＩＬ２ｖおよびＦｃドメイン含有タンパク質のシリーズを構築した。試験タンパク質はこの実験において以下を含んだ：
－ ＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、ＩＣ ＶＨ／ＶＬ、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異させたＦｃドメイン二量体、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異させたＦｃドメイン二量体、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＩＣ－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合する野生型Ｆｃドメイン二量体、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異させたＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合する野生型Ｆｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
簡潔に述べれば、１Ｍ／ウェルの精製されたＰＢＭＣを９６ウェルプレート中に播種し、増加性用量の様々なＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖ（１３３ｎＭ～０．０００００１３ｎＭの用量）を用いて３７℃、５．５％のＣＯ２のインキュベーター中で２０分間処理した。ＳＴＡＴ５リン酸化を次に、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ ＣＤ５６＋に関してゲーティングされた）に関するフローサイトメトリーにより分析した。
結果を図５において示しており、該図は、ｙ軸上にＮＫ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。ＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖおよびＣＤ２０－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖは、ＮＫ細胞におけるＩＬ２Ｒシグナル伝達の同等の促進を示し、ＣＤ２０結合性ドメインは、腫瘍標的細胞が存在しないこのモデルにおいて効果を有しないことを示した。その野生型Ｆｃドメイン二量体を介してＣＤ１６結合能力を追加的に有するＣＤ２０－Ｔ５－ＩＣ－ＩＬ２ｖは、ＮＫ細胞におけるＩＬ２Ｒシグナル伝達の増加を結果としてもたらした。ＮＫｐ４６に結合することができるがＣＤ１６に結合することができないＣＤ２０－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは、ＣＤ１６に結合するがＮＫｐ４６に結合しないＣＤ２０－Ｔ５－ＩＣ－ＩＬ２ｖと比較してＮＫ細胞におけるＩＬ２Ｒシグナル伝達の促進においてより強力であった。しかしながら、ＣＤ１６およびＮＫｐ４６の両方に結合する（ＩＬ２ｖ部分に加えて）ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは、ＣＤ２０－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖと比較して、ＮＫ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５＋細胞のパーセントにおける効力における強い増加（ＥＣ５０における約１－ｌｏｇの減少）を結果としてもたらした。ＮＫ細胞におけるＩＬ－２Ｒシグナル伝達はしたがってＮＫｐ４６およびＣＤ１６の各々により増強され、ＩＬ－２Ｒに加えてＮＫｐ４６およびＣＤ１６の両方が結合された場合に特に強い増強を有した。
［実施例４］
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖは標的細胞の存在下および非存在下でＮＫ細胞活性化を誘導する
この実験において、ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質を、腫瘍標的細胞の存在下または非存在下のいずれかで、ＮＫ細胞の活性化を誘導するそれらの能力について評価した。
ヘテロ三量体ＩＬ２ｖおよびＦｃドメイン含有タンパク質のシリーズを、個々におよび組合せにおいて、試験して、異なるＮＫおよび標的細胞受容体に対する結合性の効果を評価した。試験タンパク質はこの実験において以下を含んだ：
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ－２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペアを含有する。Ｆ５タンパク質は、ＩＬ２ｖが存在しないことを除いて、Ｔ５タンパク質と同じ本質的なドメイン配置を共有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＩＣ－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異させたＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＩＣ－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異させたＦｃドメイン二量体、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
簡潔に述べれば、精製されたＮＫ細胞を、試験タンパク質の存在下で５日間培養した。フローサイトメトリーによりモニターされるＮＫ細胞上のＣＤ６９活性化マーカー発現の定量化によりＮＫ細胞活性化を評価した。
結果を図６において示しており、該図は、腫瘍細胞の非存在下における、ｙ軸上にＣＤ６９発現ＮＫ細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。ＣＤ２０、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６に結合するがＩＬ２ｖ部分を欠いたＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６は腫瘍細胞の非存在下でＮＫ細胞を活性化させなかったが、ＩＬ２ｖ部分を含有するすべてのタンパク質は強いＮＫ細胞活性化を結果としてもたらし、追加の利益が、ＣＤ１６およびＮＫｐ４６結合性を欠いたＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖタンパク質と比較して、ＮＫｐ４６結合性ドメインおよび野生型Ｆｃドメインを有するタンパク質について見られた。
［実施例５］
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖはＮＫ細胞増殖を促進する
この実験において、ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質を、５日のインキュベーションにおいてＮＫ細胞の増殖を誘導するそれらの能力について評価した。
試験タンパク質はこの実験において以下を含んだ：
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ－２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペアを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＩＣ－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア（アッセイシステム中のいかなるタンパク質にも結合しないアイソタイプ対照ＶＨ／ＶＬペア）、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異させたＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＩＣ－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異させたＦｃドメイン二量体、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
簡潔に述べれば、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（商標）（ＣＴＶ）で標識された精製されたＮＫ細胞を１３３ｎＭ～０．０００１ｎＭの用量範囲のＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖと５日間培養した。フローサイトメトリーによりモニターされる希釈されたＣＴＶシグナルを示すＮＫ細胞のパーセンテージの定量化によりＮＫ細胞増殖を評価した。
結果を図７において示しており、該図は、ｙ軸上に腫瘍細胞の非存在下での増殖性ＮＫ細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。ＣＤ２０、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６に結合するがＩＬ２ｖ部分を欠いたＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６はＮＫ細胞の増殖を誘導しなかったが、ＩＬ２ｖ部分を含有するすべてのタンパク質は、効力において差異を有したが、強いＮＫ細胞増殖を結果としてもたらした。ＮＫｐ４６結合性ドメインおよび／または野生型Ｆｃドメイン（ＩＬ２ｖに加えて）を有するすべてのＮＫ細胞エンゲージャータンパク質は、ＣＤ１６およびＮＫｐ４６結合性を欠いたＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖタンパク質と比較して、ＮＫ細胞増殖の誘導においてより強力であった。
［実施例６］
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖはＥＴ比１０：１での標準的なインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて腫瘍細胞殺傷を促進する
この実験において、ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質を、カルセイン放出をリードアウトとして使用する標準的な４時間細胞傷害性アッセイにおいて１０：１のエフェクター：標的比において２人のヒトドナーからのＮＫ細胞によるＲＡＪＩ腫瘍細胞の殺傷を誘導するそれらの能力について評価した。
試験タンパク質はこの実験において以下を含んだ：
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ３：トポロジカルにトポロジカルなＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ－２ｖ３を含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｐＷＴ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドであるＩＬ－２ｐＷＴを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペアを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＩＣ－ＩＬ２ｖ３：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖ３を含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異させたＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペアを含有する。
－ ＩＣ－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
簡潔に述べれば、精製されたＮＫ細胞を完全培地中で終夜静置した。精製されたＮＫ細胞を次に、カルセインを以前にロードされたＲａｊｉ腫瘍細胞と１０：１の比において共培養した。細胞を、上記される試験タンパク質（６６ｎＭ～０．００００００６ｎＭの用量）と３７℃、５．５％のＣＯ２のインキュベーター中で４ｈインキュベートした。
結果を図８Ａおよび図８Ｂにおいて示しており、各々のパネルは１人のヒトＮＫ細胞ドナーを表し、ｙ軸上にＮＫ細胞により誘導された特異的溶解％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。全体的な結果は２人のヒトドナーの間で一貫していた。標的化された細胞上のＣＤ２０に対する結合性を欠いたＩＣ－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは有意な細胞傷害性を誘導しなかった。ＣＤ１６およびＮＫｐ４６の両方（ＣＤ２０に加えて）に結合する能力を保持するＮＫ細胞エンゲージャーのすべては、腫瘍細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性の誘導におけるＥＣ５０値の観点において、同様に高い効力を示した。対照的に、ＣＤ１６結合性またはＮＫｐ４６結合性のいずれかを欠いたＮＫ細胞エンゲージャーはより低い効力を示した。ＩＬ－２ポリペプチド（野生型または突然変異体ＩＬ２ｖのいずれか）の性質はＮＫ細胞の細胞傷害性に差次的に影響しないようであり、さらにはＩＬ２の存在は、野生型またはＩＬ２ｖのいずれであれ、いかなるＩＬ－２部分も有しないＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６ ＮＫ細胞エンゲージャーと比較して細胞傷害性の誘導におけるＥＣ５０値の向上を結果としてもたらさなかった。しかしながら、ＩＬ－２部分の存在は溶解の最大レベルを増加させた。
［実施例７］
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖはＥＴ比２：１での標準的なインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて腫瘍細胞殺傷を促進する
この実験において、ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質を、Ｃｒ５１をリードアウトとして使用する（ｓｕｉｎｇ）標準的な４時間細胞傷害性アッセイにおいて２：１のエフェクター：標的比において２人のヒトドナーからのＮＫ細胞によるＲＡＪＩ腫瘍細胞の殺傷を誘導するそれらの能力について評価した。
試験タンパク質はこの実験において以下を含んだ：
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ－２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペアを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＩＣ－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：を含有する トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異させたＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア。
－ ＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異させたＦｃドメイン二量体、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
簡潔に述べれば、精製されたＮＫ細胞を完全培地中で終夜静置した。静置させたＮＫ細胞を次に、５１Ｃｒを以前にロードしたＲａｊｉ腫瘍細胞と２：１の比において共培養した。細胞を、上記される試験タンパク質（２０～０．０００１ｕｇ／ｍｌの用量）と３７℃、５．５％のＣＯ２のインキュベーター中で４ｈインキュベートした。
結果を図８Ｃおよび図８Ｄにおいて示しており、各々は１人のヒトＮＫ細胞ドナーを表し、ｙ軸上にＮＫ細胞により誘導された特異的溶解％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。全体的な結果は２人のヒトドナーの間で一貫していた。ＣＤ２０、ＣＤ１６およびＮＫｐ４６に対する結合性を欠いたＩＣ－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは有意な細胞傷害性を誘導しなかった。ＣＤ１６およびＮＫｐ４６の両方（ＣＤ２０に加えて）に結合する能力を保持するＮＫ細胞エンゲージャーのすべては、腫瘍細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する強い能力を示した。ＣＤ１６結合性またはＮＫｐ４６結合性のいずれかを欠いたＮＫ細胞エンゲージャーは、ＥＣ５０値の観点においてより低い効力を示した。いかなるＩＬ２ｖ部分も有しないＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６ ＮＫ細胞エンゲージャーは、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ３ ＮＫ細胞エンゲージャーと同等の効力であったが、後者は溶解のより高いプラトーを示した。
［実施例８］
腫瘍細胞上にエンゲージングされた場合にＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖはサイトカインを誘導する
この実験において、ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質を、０．５：１のエフェクター：標的比においてＲＡＪＩ腫瘍細胞と共培養された場合にＮＫ細胞によるサイトカイン産生を誘導するそれらの能力について評価した。試験は、細胞内フローサイトメトリーをリードアウトとして使用するＧｏｌｇｉ ｓｔｏｐの存在下での標準的な４時間サイトカインアッセイであった。
試験タンパク質はこの実験において以下を含んだ：
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ－２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｆ２５－ＮＫｐ４６：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペアを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＩＣ－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異させたＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＩＣ－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：トポロジカルにＮ末端からＣ末端へ、ＩＣ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する。
簡潔に述べれば、新たに精製されたＮＫ細胞をＲａｊｉ腫瘍細胞と０．５：１の比において共培養した。細胞をＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐの存在下で上記される試験タンパク質（１３ｎＭ～０．００００１ｎＭの用量）と３７℃、５．５％のＣＯ２のインキュベーター中でインキュベートした。４ｈ後に、ＩＦＮγおよびＭＩＰ１βを、ＮＫ細胞に関してゲーティングされた細胞内フローサイトメトリーにより分析した。
図９において示される結果は、ｙ軸上にＩＦＮ－γ陽性ＮＫ細胞の％（左）およびＮＫ細胞上のＭＩＰ１βのＭｅｄｆｉ（右）ならびにｘ軸上に試験分子濃度を示す。標的化された細胞上のＣＤ２０に対する結合性を欠いたＮＫ細胞エンゲージャーは、ＩＦＮ－γ産生もＭＩＰ１β産生も誘導しなかった。ＣＤ１６およびＮＫｐ４６の両方（ＣＤ２０に加えて）に結合する能力を保持するＮＫ細胞エンゲージャーのすべては、試験分子のより低い用量において最も高いレベルのＩＦＮ－γおよびＭＩＰ１βを誘導した。対照的に、ＣＤ１６結合性またはＮＫｐ４６結合性のいずれかを欠いたＮＫ細胞エンゲージャーは、試験分子のより低い用量においてサイトカイン産生のより低い効力を示した。ＮＫｐ４６に結合することができるがＣＤ１６に結合することができないＣＤ２０－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは、サイトカインの誘導においてより低い効率であったが、その野生型Ｆｃドメイン二量体を介してＣＤ１６に結合するがＮＫｐ４６に結合しないＣＤ２０－Ｔ５－ＩＣ－ＩＬ２ｖは、試験分子の最も高い用量において高いサイトカイン産生を結果としてもたらした。いかなるＩＬ－２部分も有しないＣＤ２０－Ｆ２５－ＮＫｐ４６ ＮＫ細胞エンゲージャーと比較してＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ分子中のＩＬ２ｖの存在は、これらのサイトカインを産生するＮＫ細胞の能力をわずかに増加させるようである。
［実施例９］
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖはインビボで強い抗腫瘍有効性を有する
この実験において、ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ［Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合する野生型Ｆｃドメイン二量体（ＣＤ１６結合性を減少させるための突然変異を含まない）、マウス（ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＮＫｐ４６に結合する抗ＮＫｐ４６ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する］の単回注射をヒトがんのマウスモデルにおいてそのインビボ抗腫瘍活性について評価した。
ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質を、商用のゴールドスタンダードであるＦｃ増強抗ＣＤ２０抗体オビヌツズマブと比較した。簡潔に述べれば、ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスの皮下にマトリゲル中の５×１０６個のＲＡＪＩ細胞を移植した。移植の９日後に、異なる用量のＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ（７０ｕｇ、１０ｕｇ、２ｕｇおよび０．４ｕｇ）、異なる用量のオビヌツズマブ（１５００ｕｇ、１５０ｕｇ、５０ｕｇおよび１５ｕｇ）ならびに媒体としてＰＢＳの単回の静脈内注射を用いてマウスを処置した。腫瘍成長を経時的に追跡した。
結果を図１０において示す。ＣＤ２０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１２２に結合するＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質（右パネル）は、このモデルにおいて限られた活性を示したオビヌツズマブ（左パネル）と比較して、単回注射として強い有効性を示した。１０μｇ用量のＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは、約２０日にわたり４０ｍｍ３の容量を超える腫瘍成長を予防する抗腫瘍活性を結果としてもたらした。７０μｇ用量のＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは非常に強い抗腫瘍活性を結果としてもたらし、腫瘍は研究の持続期間にわたり４０ｍｍ３の容量を超えて成長しなかった。
［実施例１０］
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖはインビボで大容量の腫瘍に対する強い抗腫瘍有効性を有する
この実験において、ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ（Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖを含有する）を用いた週毎の処置を、腫瘍を処置の前に３００ｍ３の大きい容量まで成長させたヒトがんのマウスモデルにおいてそのインビボ抗腫瘍活性について評価した。
簡潔に述べれば、ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスの皮下にマトリゲル中の５×１０６個のＲＡＪＩ細胞を移植した。腫瘍が２８０ｍｍ３の平均容量に達した移植の１１日後に、２５ｕｇのＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖまたは対照媒体としてのＰＢＳの週毎に繰り返される静脈内注射を用いてマウスを処置した。腫瘍成長を経時的に追跡した。
結果を図１１において示す。ＣＤ２０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１２２に結合するＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質（右パネル）は、腫瘍移植後１１日目に開始した週毎の注射として強い有効性を示した。２５μｇ用量のＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは非常に強いかつ長い抗腫瘍活性を結果としてもたらし、腫瘍は最初に容量を減少させ、次に研究の持続期間にわたり３００ｍｍ３を下回る容量を概ね保った。比較において、媒体対照群において、腫瘍は腫瘍移植後の日々において３００ｍｍ３を超える容量に急速に成長した。ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ分子は大容量の腫瘍を長期間制御するために効率的であることを実験は示した。
［実施例１１］
ＮＫｐ４６およびＩＬ２ｖの両方はインビボで強い有効性のために要求される
この実験において、異なるＮＫ細胞エンゲージャータンパク質の２回の注射を用いた処置をヒトがんのマウスモデルにおいてそれらのインビボ抗腫瘍活性について評価した。試験されたタンパク質は以下の通りであった：
－ Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、マウスからのＮＫｐ４６に結合する抗ＮＫｐ４６ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ－２ｖを含有するＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ。
－ ＮＫｐ４６結合性を欠いたＣＤ２０－Ｔ５－ＩＣ－ＩＬ２ｖ、
－ ＣＤ１２２結合性を欠いたＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６。
－ ＰＢＳを媒体および陰性対照として注射した。
簡潔に述べれば、ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスの皮下にマトリゲル中の５×１０６個のＲＡＪＩ細胞を移植した。腫瘍細胞移植後９日目および１６日目に２５ｕｇのＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ、２５ｕｇのＣＤ２０－Ｔ５－ＩＣ－ＩＬ２ｖ、２５ｕｇのＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６または対照媒体としてのＰＢＳの２回の静脈内注射によりマウスを処置した。腫瘍成長を経時的に追跡した。
結果を図１２において示す。ＣＤ２０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１２２に結合するＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質は、腫瘍が６０ｍｍ３の容量まで成長した腫瘍移植後９日目に開始して、１週により分離された２回の注射として強い有効性を示した。２５μｇ用量のＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは非常に強い抗腫瘍活性を結果としてもたらし、腫瘍は研究の持続期間にわたり６０ｍｍ３の容量の範囲内に概ね留まった。比較において、ＣＤ２０－Ｔ５－ＩＣ－ＩＬ２ｖ群およびＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６において、腫瘍は処置後の週の間にいくぶん最初に制御されたが、次に急速にその後３００ｍｍ３の容量を超えて成長した。ＮＫｐ４６結合性およびＣＤ１２２結合性の両方は、腫瘍成長を効率的に制御するために重要であり、それらの同時の標的化はＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ分子の強い抗腫瘍有効性を駆動することを実験は示す。
［実施例１２］
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖは固形腫瘍においてＮＫ細胞蓄積および炎症性微環境を誘導する
この実験において、我々は、ヒトがんのインビボマウスモデルにおいて腫瘍におけるＮＫ細胞蓄積を誘導するＮＫ細胞エンゲージャーＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６およびＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖの能力を試験した。試験された分子は以下の通りであった：
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗マウスＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ－２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６：Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗マウスＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペアを含有する。
－ オビヌツズマブ。
簡潔に述べれば、ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスの皮下にマトリゲル中の５×１０６個のＲＡＪＩ細胞を移植した。Ｒａｊｉ細胞移植の２０日後に、７０ｕｇのＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ、１２５ｕｇのＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６、６００ｕｇのオビヌツズマブおよび対照媒体としてのＰＢＳの単回の静脈内注射によりマウスを処置した。３日後に、腫瘍をＲＮＡ抽出のために採取した。ｃＤＮＡを腫瘍全体ｍＲＮＡ抽出物から調製し、ｑＰＣＲを行ってｎｃｒ１およびｉｆｎ－γ（ｉｆｎｇ）転写物発現を定量化して、腫瘍におけるＮＫ細胞浸潤物および活性化を評価した。結果を図１３において示す。ＣＤ２０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１２２に結合するＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質により処置されたマウスから採取された腫瘍はｎｃｒ１転写物（ＮＫｐ４６タンパク質をコードし、ＮＫ細胞に高度に特異的である）の高い発現を示し、腫瘍におけるＮＫ細胞浸潤の増加を実証した。比較において、ＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６タンパク質またはオビヌツズマブにより処置されたマウスにおいて採取された腫瘍はｎｃｒ１転写物の軽微に過ぎない増加を示し、腫瘍におけるはるかにより低いＮＫ細胞浸潤物を明らかにした。さらには、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質により処置されたマウスから採取された腫瘍は、他の処置条件と比較してｉｆｎｇ転写物のより高い発現を示した。ＣＤ１２２結合性を欠いたＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６により処置されたマウスにおいて採取された腫瘍もまた、オビヌツズマブまたはＰＢＳ注射マウスからの腫瘍と比較してｉｆｎｇ転写物のより低いが有意な増加を示した。ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖタンパク質は、標的化された腫瘍においてＮＫ細胞動員および活性化を促進することを結果は示す。
［実施例１３］
ＮＫ細胞は固形腫瘍成長を制御するＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖ有効性を駆動する
この実験において、我々は、ヒトがんのインビボマウスモデルにおいて腫瘍細胞増殖を制御するＮＫ細胞エンゲージャーＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖの能力に対するＮＫ細胞のインビボ枯渇の効果を評価した。
簡潔に述べれば、ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスの皮下にマトリゲル中の５×１０６個のＲＡＪＩ細胞を移植した。腫瘍が７０ｍｍ３に達した１０日目に２５ｕｇのＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖをマウスに注射し、続いて１週後に２回目の注射を行った。ＮＫ枯渇は、９日目（処置前）に開始し、全部で６回の投与にわたり繰り返された週１回投与された抗アシアロＧＭ１抗体の注射により実行した。腫瘍成長を経時的に追跡した。
結果を図１４において示す。ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャーを用いた処置は腫瘍成長を制御したことを右上パネルは示す。しかしながら、ＮＫ細胞枯渇は、約３０日目までに腫瘍成長の制御の喪失を結果としてもたらしたが（右下パネル）、ＮＫ細胞について枯渇されていないマウスにおいて腫瘍は依然として制御される。ＮＫ細胞は、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャーにより誘導される抗腫瘍活性のために重要であることをこれらのデータは示す。
［実施例１４］
異なるリンカー長さを有するＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖ分子
ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６、ＣＤ１６およびＣＤ１２２の各々に同時に結合する能力に対するＮＫＣＥ内のドメイン位置付けの潜在的な効果を考慮して、我々は、ＩＬ－２Ｒシグナル伝達を誘導する能力に対するＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖタンパク質中の異なる構造的改変の効果を調べることを試みた。
腫瘍抗原（ＣＤ２０；抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペアを指す「ＧＡ１０１」としても交換可能に指し示される）、ＣＤ１６（二量体野生型Ｆｃドメインを含めることによる）、ＮＫｐ４６およびＣＤ１２２（ＩＬ２ｖ分子を含めることによる）にすべて結合する異なるヘテロ三量体タンパク質のシリーズを比較した。ＧＡ１０１－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖにより例示されるタンパク質の１つのシリーズにおいて、ＮＫｐ４６結合性ドメイン（Ｆａｂとして）をＦｃドメイン二量体のＣ末端に置き、ＩＬ２ｖをＮＫｐ４６結合性ＦａｂのＣ末端に置いた（ＮＫｐ４６、ＦｃおよびＩＬ２ｖ部分のドメイン配置は、Ｎ末端からＣ末端へ：二量体Ｆｃ － 抗ＮＫｐ４６ Ｆａｂ － ＩＬ２ｖ）。ＩＬ２ｖをＮＫｐ４６結合性ドメインから分離する柔軟なドメインリンカーの長さを変動させ、５アミノ酸残基の短いリンカー、ＧＡ１０１－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖの１０アミノ酸残基リンカー、および１５アミノ酸残基の長いリンカーを含めた。
試験されたタンパク質は以下の通りであった：
－ 組換えヒトＩＬ－２
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ短鎖リンカー
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ長鎖リンカー
簡潔に述べれば、１Ｍ／ウェルの精製されたＰＢＭＣを９６ウェルプレート中に播種し、増加性用量の様々なＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖ（１３３ｎＭ～０．０００００１３ｎＭの用量）を用いて３７℃、５．５％のＣＯ２のインキュベーター中で２０分間処理した。ＳＴＡＴ５リン酸化を次に、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ ＣＤ５６＋に関してゲーティングされる）、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３－）、ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ８＋）およびＴｒｅｇ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ２５ｈｉ ＦｏｘＰ３＋）に関するフローサイトメトリーにより分析した。
結果を図１５において示しており、該図は、ｙ軸上にＰＢＭＣの中でのｐＳＴＡＴ５細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。すべてのＧＡ１０１－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質は、使用されたリンカーの長さにかかわらずＴＲｅｇ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＣＤ４ Ｔ細胞を上回って優先的にＮＫ細胞において強力なＩＬ２Ｒシグナル伝達を誘導した。
［実施例１５］
ＮＫｐ４６上の遠位エピトープに結合するＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖは細胞傷害性を誘導する強い能力を保持する
この実験は、標的細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する能力に対するＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖタンパク質中の異なる構造的改変の効果を調べるために行った。この実験において、ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質を、Ｃｒ５１をリードアウトとして使用する標準的な４時間細胞傷害性アッセイにおいて１０：１のエフェクター：標的比において休止した精製されたＮＫ細胞によるＲＡＪＩ腫瘍細胞の殺傷を誘導するそれらの能力について評価した。実験のこのシリーズにおいて、我々は、多特異性タンパク質内の異なるドメイン位置付け、ＩＬ２ｖ部分を多特異性タンパク質の残部から分離するドメインリンカーの異なる長さ、およびＮＫｐ４６分子上の遠位部位に結合する異なるＮＫｐ４６結合性ドメインを試験した。
ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペアを組み込んだＮＫＣＥタンパク質をいずれも使用した実施例２～１４において記載された多特異性タンパク質に加えて、代わりにＮＫｐ４６－４ ＶＨ／ＶＬペアを組み込んだＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－４－ＩＬ２ｖ中の追加のＣＤ２０結合性ＮＫＣＥタンパク質を試験した。エピトープマッピング実験およびGauthier et al. 2019 (Cell 177:1701-1713)において示されるように、ＮＫｐ４６－１抗体は、ドメイン１とドメイン２との間の遷移において位置するＮＫｐ４６上のエピトープに結合するが、ＮＫｐ４６－４抗体はＮＫｐ４６のＤ１ドメインのＮ末端部分上のエピトープに結合する。
ＮＫｐ４６のＮ末端部分への結合の３次元モデリングは、そのような状況において抗ＮＫｐ４６－４ ＶＨ／ＶＬペアは、ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペアと比較して細胞膜のより近くに位置付けられること、およびそのような結合は、そのＩＬ－２結合性部位が細胞表面から約７０オングストロームに位置付けられるＣＤ１２２と相互作用するＩＬ２ｖ部分の能力を損ない得ることを示唆した（図１Ｃを参照）。結果的に、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－４－ＩＬ２ｖは、５アミノ酸残基の短いリンカー、標準的な１０アミノ酸残基リンカー、および１５アミノ酸残基の長いリンカーを含む、ＩＬ２ｖをＮＫｐ４６結合性ドメインから分離する柔軟なドメインリンカーについて３つの異なる長さを用いて産生した。
試験されたタンパク質は以下の通りであった：
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－１－ＩＬ２ｖ
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－１－ＩＬ２ｖ短鎖リンカー
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－１－ＩＬ２ｖ長鎖リンカー
－ ＣＤ２０－Ｔ６－ＮＫｐ４６－１－ＩＬ２ｖ
－ ＩＣ－Ｔ６－ＮＫｐ４６－１－ＩＬ２ｖ
－ ＩＣ－Ｔ５－ＮＫｐ４６－１－ＩＬ２ｖ
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－４－ＩＬ２ｖ
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－４－ＩＬ２ｖ短鎖リンカー
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－４－ＩＬ２ｖ長鎖リンカー
結果を図１６、および図１７において示しており、該図は、ｙ軸上に特異的溶解％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。図１６は、ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペアに基づくＮＫｐ４６結合性ドメインが、１０アミノリンカー、短い（５ａａ）リンカーまたは長い（１５ａａ）リンカーを用いて、野生型Ｆｃドメイン二量体とＣ末端ＩＬ２ｖとの間に位置付けられている「Ｔ５」および「Ｔ６」フォーマットにおけるＮＫＣＥタンパク質により増強された細胞傷害性を示し；タンパク質は、より短いまたはより長いリンカーによるＮＫ細胞傷害性に対する負の影響力なしに、腫瘍細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を増強するそれらの能力においてすべて同等であった。
図１７は、ＮＫｐ４６－４ ＶＨ／ＶＬペアに基づくＮＫｐ４６結合性ドメインが、１０アミノリンカー、短い（５ａａ）リンカーまたは長い（１５ａａ）リンカーを用いて、野生型Ｆｃドメイン二量体とＣ末端ＩＬ２ｖとの間に位置付けられている「Ｔ５」および「Ｔ６」フォーマットにおけるＮＫＣＥタンパク質により増強された細胞傷害性を示し；タンパク質は、腫瘍細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を増強するそれらの能力においてすべて同等であった。ＮＫＣＥタンパク質により標的化されるＮＫｐ４６結合性部位はしたがって細胞傷害性の能力に影響しない。
図１８は、図１６、図１７および図１８において試験されたタンパク質の構造を示す。
［実施例１６］
異なるサイトカイン変異型はＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖにより誘導されるＩＬ２Ｒシグナル伝達に負に影響しない
Ｔｒｅｇを含む、Ｔ細胞上のＩＬ－２Ｒαを上回るＮＫ細胞上のＩＬ－２Ｒβに対する結合性についての選好性を付与するために、実施例２～１６のＮＫＣＥタンパク質において使用されたＩＬ２ｖ部分を、ＩＬ２ｖ３として参照される新たなＩＬ２ｖ部分と共に選択した。この実験は、ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖにより誘導されるＩＬ２Ｒシグナル伝達に影響する能力に対するサイトカインタンパク質中の異なる構造的改変の効果を調べるために行った。
Ｔｒｅｇ細胞発現鎖（ＩＬ－２Ｒα）を上回るＮＫ発現受容体鎖（ＩＬ－２Ｒβ）に対する優先的な結合性を維持しながらＩＬ２ｖアミノ酸配列を変動させた異なるＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖタンパク質を調製した。ＮＫＣＥタンパク質を次に、Ｔ細胞を上回ってＮＫ細胞においてＩＬ２Ｒを差次的に誘導する能力について試験して、異なるサイトカイン変異型が高親和性ＩＬ－２Ｒαβγ複合体を上回るＩＬ－２Ｒβの選択的な標的化に影響するかどうかを評価した。
以下のように、３つのＩＬ－２突然変異体ポリペプチドを産生し、ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖタンパク質上のＣ末端に置いた：
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ：Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖ（成熟野生型ヒトＩＬ－２に関して突然変異Ｔ３Ａ、Ｃ１２５Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇ）を含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ２：Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖ２（成熟野生型ヒトＩＬ－２に関して突然変異Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ）を含有する。
－ ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ３：Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、抗ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ＩＬ２ｖ３（成熟野生型ヒトＩＬ－２に関して突然変異Ｒ３８Ａ／Ｔ４１Ａ／Ｆ４２Ｋ）を含有する。
簡潔に述べれば、１Ｍ／ウェルの精製されたＰＢＭＣを９６ウェルプレート中に播種し、増加性用量の様々なＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖ（１３３ｎＭ～０．０００００１３ｎＭの用量）を用いて３７℃、５．５％ＣＯ２のインキュベーター中で２０分間処理した。ＳＴＡＴ５リン酸化を次に、ＰＢＭＣに関するフローサイトメトリーにより分析し、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）、ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ８＋）、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３－）およびＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＦｏｘＰ３＋に関してゲーティングされた）に関してゲーティングした。
結果を図１９において示しており、該図は、ｙ軸上にＰＢＭＣ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ２およびＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ３は同等であり、各々は、野生型ＩＬ－２を含有し、かつＮＫｐ４６にもＣＤ１６Ａにも結合しないＩＣ－Ｔ６－ＩＣ－ＩＬ２（ＩＬ２ｐＷＴ）と比較して、ＮＫ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５＋細胞のパーセントにおける約２－ｌｏｇの増加を結果としてもたらした。ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖタンパク質は、したがって、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を上回るＮＫ細胞の選択的な活性化を可能にした。異なる「非アルファ」サイトカイン変異型の置換は、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を上回ってＮＫ細胞を選択的に活性化させるＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖタンパク質の能力に影響しなかった。ＮＫ細胞およびＴｒｅｇの活性化についてのＥＣ５０値を以下において示す。



［実施例１７］
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖはマウスにおいてインビボで最小の全身性サイトカイン放出を誘導する
この実験において、我々は、マウスにおいてＮＫ細胞エンゲージャーＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを用いた処置の全身性サイトカイン放出に対する効果を評価した。ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスに、用量レベル当たり４匹のマウスを用いて、２５μｇまたは７０μｇのいずれかのＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖの単回注射を注射した。血漿中のマウスＩＬ－６およびＴＮＦα産生を経時的に１４日間モニターした。
結果を図２０において示しており、左パネルはＩＬ－６産生を示し、右パネルはＴＮＦα産生を示す。処置後の各々の時点（Ｄは日数を指し示す）について、左バーは７０μｇ用量についてのサイトカインの血漿濃度を示し、右バーは２５μｇ用量についてのサイトカインの血漿濃度を示す。図１０は、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ ＮＫ細胞エンゲージャーを用いた処置は、１０ｕｇを上回る用量の単回注射を使用して腫瘍成長を制御したことを示す。これらのデータは、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは処置後３日の間に最小の全身性サイトカイン産生を誘導したに過ぎず、その後に全身性サイトカイン産生を誘導しなかったことを示し、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは、処置は強力な抗腫瘍およびＮＫ細胞細胞傷害活性を示す用量におけるものであるにもかかわらず、免疫毒性を伴わないことを示唆する。
［実施例１８］
腫瘍抗原の作用の機序、ＮＫＣＥタンパク質のＮＫｐ４６およびＣＤ１６結合性構成要素
これらの実験は、サイトカイン部分を含めることなしに、ＮＫＣＥタンパク質の作用の機序におけるＮＫ細胞上のＮＫｐ４６およびＣＤ１６Ａの役割を説明するために示す。ＦｃγＲ（ＣＤ１６を含む）に対する結合性が低いかもしくは実質的に欠如しているか、またはＦｃγＲ（ＣＤ１６を含む）に対する結合性を有する異なるＮＫＣＥタンパク質フォーマットを産生し、例えばヒトＣＤ１６に対する結合親和性は、ＳＰＲにより評価された場合に、野生型ヒトＩｇＧ１抗体の場合の１－ｌｏｇ以内であった。
腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖに由来する可変ドメインＤＮＡおよびアミノ酸配列ならびにＮＫｐ４６に特異的な抗体からの異なる可変領域を使用する多特異性タンパク質の調製における使用のために異なるコンストラクトを作製した。ＰＣＴ国際公開第２０１６／２０７２７３号パンフレットにおけるように、タンパク質をクローニング、産生および精製した。ドメイン構造を異なるフォーマットについて図２１Ａおよび図２１Ｂにおいて示す。
フォーマット２（Ｆ２）：ＣＤ１９－Ｆ２－ＮＫｐ４６－３
単量体Ｆｃドメインを有し、したがってＣＤ１６に結合しないＦ２ポリペプチドのドメイン構造を図２１Ａにおいて示す。単量体ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃ部分についてのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、ＣＨ３ヘテロ二量体化を予防するためのＣＨ３ドメイン突然変異（ＥＵ番号付け）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７ＡおよびＫ４０９Ｙを含有する。ヘテロ二量体は以下から構成される：
（１）以下（Ｎ末端からＣ末端へ）のように配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
（Ｖκ－ＶＨ）抗ＣＤ１９－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ 抗ＮＫｐ４６－ＣＨ１
および
（２）以下（Ｎ末端からＣ末端へ）のように配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：ＶＫ抗ＮＫｐ４６－ＣＫ。
（ＶＫ－ＶＨ）単位は、ＶＨドメイン、リンカーおよびＶＫ単位（すなわちｓｃＦｖ）から構成された。二特異性ポリペプチドの他のフォーマットと同様に、ＤＮＡ配列は、ＣＨ３－ＶＨジャンクションにおいて特有のＳａｌＩ制限部位を挿入するために設計されたアミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードした。実施例２－１におけるようにタンパク質をクローニング、産生および精製した。ＣＤ１９－Ｆ２－ＮＫｐ４６－３ポリペプチド鎖１についてのアミノ酸配列を配列番号２２１において、およびＣＤ１９－Ｆ２－ＮＫｐ４６－３ポリペプチド鎖２についてのアミノ酸配列を配列番号２２２において示す。
フォーマット５（Ｆ５）：ＣＤ１９－Ｆ５－ＮＫｐ４６－３
三量体Ｆ５ポリペプチドのドメイン構造を図２１Ａにおいて示しており、ヒンジドメイン（図中で鎖上のＣＨ１／ＣκドメインとＣＨ２ドメインとの間に指し示される）の間の鎖間結合およびＣＨ１ドメインとＣκドメインとの間の鎖間結合は鎖間ジスルフィド結合である。ヘテロ三量体は以下から構成される：
（１）以下（Ｎ末端からＣ末端へ）のように配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
ＶＨ 抗ＣＤ１９－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ 抗ＮＫｐ４６－Ｃκ
および
（２）以下（Ｎ末端からＣ末端へ）のように配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：Ｖκ抗ＣＤ１９－ＣＫ－ＣＨ２－ＣＨ３
および
（３）以下（Ｎ末端からＣ末端へ）のように配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：Ｖκ抗ＮＫｐ４６－ＣＨ１。
３つの鎖のアミノ酸配列を配列番号２２３（鎖２）、２２４（鎖１）および２２５（鎖３）において示す。
フォーマット６（Ｆ６）：ＣＤ１９－Ｆ６－ＮＫｐ４６－３
Ｆ６タンパク質は、Ｆ５と同じであるが、Ｎ結合型グリコシル化を回避するためのＮ２９７Ｓ置換を含有する。Ｆ６タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列を配列番号２２６（鎖２）、２２７（鎖１）および２２８（鎖３）において示す。
フォーマット７（Ｆ７）：ＣＤ１９－Ｆ７－ＮＫｐ４６－３
ヘテロ三量体Ｆ７ポリペプチドのドメイン構造を図２１Ａにおいて示す。Ｆ７タンパク質は、Ｖκ抗ＮＫｐ４６－ＣＨ１鎖との中心鎖の二量体種の微量集団の形成を予防するための、Ｃ末端においてＦｃドメインに連結されたＣＨ１およびＣκドメイン中のシステインからセリンへの置換を除いて、Ｆ６と同じである。７６タンパク質（７６ ｐｒｏｔｅｉｎ）の３つの鎖のアミノ酸配列を配列番号２２９（鎖２）、２３０（鎖１）および２３１（鎖３）において示す。
フォーマット１３（Ｆ１３）：ＣＤ１９－Ｆ１３－ＮＫｐ４６－３
二量体Ｆ１３ポリペプチドのドメイン構造を図２１Ａにおいて示しており、ヒンジドメイン（鎖上でＣＨ１／ＣκドメインとＣＨ２ドメインとの間に指し示される）の間の鎖間結合およびＣＨ１ドメインとＣκドメインとの間の鎖間結合は鎖間ジスルフィド結合である。ヘテロ二量体は以下から構成される：
（１）以下（Ｎ末端からＣ末端へ）のように配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
ＶＨ 抗ＣＤ１９－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ －（ＶＨ－Ｖκ）抗ＮＫｐ４６
および
（２）以下（Ｎ末端からＣ末端へ）のように配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：Ｖκ抗ＣＤ１９－Ｃκ－ＣＨ２－ＣＨ３。
（ＶＨ－Ｖκ）単位は、ＶＨドメイン、リンカーおよびＶκ単位（ｓｃＦｖ）から構成された。
Ｆ１３タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列を配列番号２３２および２３３において示す。
フォーマット１４（Ｆ１４）：ＣＤ１９－Ｆ１４－ＮＫｐ４６－３
二量体Ｆ１４ポリペプチドのドメイン構造を図２１Ｂにおいて示す。Ｆ１４ポリペプチドは、Ｆ１３フォーマットの構造を共有する二量体ポリペプチドであるが、野生型Ｆｃドメイン（ＣＨ２－ＣＨ３）の代わりに、Ｆ１４二特異性フォーマットは、Ｎ結合型グリコシル化を消失させるためのＣＨ２ドメイン突然変異Ｎ２９７Ｓを有する。Ｆ１４タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列を配列番号２３４および２３５において示す。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＮＫｐ４６結合親和性の決定
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００の一般的手順および試薬
ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で２５℃で行った。すべてのＢｉａｃｏｒｅ実験において、ＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＮａＯＨ １０ｍＭをそれぞれランニング緩衝液および再生緩衝液とした。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いてセンサーグラムを分析した。プロテインＡは（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から購入した。ヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質は、Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａにおいてクローニング、産生および精製された。
プロテインＡの固定化
プロテインＡタンパク質をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層中のカルボキシル基に共有結合的に固定化した。ＥＤＣ／ＮＨＳ［Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリドおよびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）］を用いてチップ表面を活性化させた。プロテインＡをカップリング緩衝液（１０ｍＭのアセテート、ｐＨ ５．６）中に１０μｇ／ｍｌまで希釈し、適切な固定化レベル（すなわち２０００ＲＵ）に達するまで注入した。１００ｍＭのエタノールアミン（ｐＨ ８）（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、残留する活性化された基の失活を行った。
結合性研究
抗体を次に、ＮＫｐ４６－３抗体からの抗ＮＫｐ４６可変領域を有する異なるフォーマットとして試験し、全長ヒトＩｇＧ１としてのＮＫｐ４６－３抗体と比較した。二特異性タンパク質を１μｇ／ｍＬにおいてプロテインＡチップ上に捕捉させ、捕捉された二特異性抗体上に組換えヒトＮＫｐ４６タンパク質を５μｇ／ｍＬにおいて注入した。ブランクサブトラクションのために、ＮＫｐ４６タンパク質をランニング緩衝液で置き換えてサイクルを再び行った。ＦＡＣＳスクリーニングのために、ＰＥを用いて標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を使用して上清中の反応性抗体の存在を検出した。
親和性研究
製造業者（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｗｉｚａｒｄ）により推奨されている通常の捕捉動力学的プロトコールに従って一価親和性研究を実行した。６．２５～４００ｎＭの範囲に及ぶヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質の７つの段階希釈液を、捕捉された二特異性抗体上に逐次的に注入し、再生前に１０分間解離させた。１：１動力学的結合モデルを使用して完全センサーグラムセットをフィッティングした。
結果
試験されたフォーマットのすべては、ＮＫｐ４６－３可変領域を使用した場合にＮＫｐ４６に対する結合性を保持した。一価親和性ならびに動力学的会合および解離速度定数を以下の表７において示す。
表７


低いＥＴ比における枯渇性抗腫瘍ｍＡｂ：ＮＫｐ４６×ＣＤ１９二特異性タンパク質を用いた比較的有効性
これらの研究は、ＮＫＣＥタンパク質が、低いエフェクター：標的比においてがん標的細胞に向けたＮＫｐ４６媒介性ＮＫ細胞活性化を媒介できるかどうかを調べることを目的とした。この実施例において使用されたＥＴ比は１：１であり、これは、インビボで遭遇される状況により近いと考えられる。ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４またはＮＫｐ４６－９からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有するＦ２フォーマット（ＣＤ１６Ａ結合性を欠いている）による配置を有するＮＫｐ４６×ＣＤ１９二特異性タンパク質を、
（ａ）全長単一特異性抗ＮＫｐ４６抗体（ヒトＩｇＧ１としてのＮＫｐ４６－３）、および
（ｂ）ＡＤＣＣ誘導性抗体対照比較物としての全長ヒトＩｇＧ１としての抗ＣＤ１９抗体
と比較した。
実験は、リツキシマブ（高い発現レベルを有する標的抗原のための抗ＣＤ２０ ＡＤＣＣ誘導性抗体対照）；抗ＣＤ５２抗体アレムツズマブ（ヒトＩｇＧ１；標的上およびＮＫ細胞上の両方に存在するＣＤ５２標的に結合する）、ならびに陰性対照アイソタイプ対照治療抗体（標的細胞上に存在する標的に結合しないヒトＩｇＧ１；ＨＵＧ１－ＩＣ）を対照としてさらに含んだ。ＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）の存在下、ＣＤ１９陰性、ＣＤ１６陽性標的細胞（ＨＵＴ７８ Ｔリンパ腫細胞）の存在下、および標的細胞の非存在下でのＣＤ６９またはＣＤ１０７発現により評価される場合の、ＮＫ細胞活性化に対する機能的な効果について異なるタンパク質を試験した。
フローサイトメトリーによりＮＫ細胞上のＣＤ６９およびＣＤ１０７発現を評価することによりＮＫ活性化を試験した。アッセイを９６Ｕウェルプレート中、ウェル当たり最終１５０μＬの完全ＲＰＭＩ中で実行した。エフェクター細胞は、ドナーから精製された新鮮なＮＫ細胞であった。標的細胞は、Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９陽性）、ＨＵＴ７８（ＣＤ１９陰性）またはＫ５６２（ＮＫ活性化対照細胞株）であった。Ｋ５６２陽性対照に加えて、以下のような３つの条件を試験した：
＞ ＮＫ細胞単独
＞ ＮＫ細胞 ｖｓ Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９＋）
＞ ＮＫ細胞 ｖｓ ＨＵＴ７８（ＣＤ１９－）
エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比は１：１であり、抗体希釈範囲は１０μｇ／ｍＬで開始して１／４の希釈であった（ｎ＝８の濃度）。抗体、標的細胞およびエフェクター細胞を混合し；３００ｇで１分スピンし；３７℃で４ｈインキュベートし；５００ｇで３分スピンし；染色緩衝液（Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ；ＳＢ）を用いて２回洗浄し；５０μＬの染色Ａｂミックスを加え；３００ｇで３０分インキュベートし；ＳＢを用いて２回洗浄し；ＣｅｌｌＦｉｘを用いてペレットを再懸濁し（ｗａｓｈｅｄ ｔｗｉｃｅ ｗｉｔｈ ＳＢ ｒｅｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｐｅｌｌｅｔ ｗｉｔｈ Ｃｅｌｌ Ｆｉｘ）；４℃で終夜貯蔵し；Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＨＴＳ）を用いて蛍光検出した。
結果
上記の実験の結果を図２２において示す（２２Ａ：ＣＤ１０７および２２Ｂ：ＣＤ６９）。標的抗原発現細胞の存在下で、二特異性抗ＮＫｐ４６×抗ＣＤ１９抗体の各々（ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４またはＮＫｐ４６－９可変領域をそれぞれ含む）は、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化させた。
Ｄａｕｄｉ細胞の存在下で二特異性抗ＮＫｐ４６×抗ＣＤ１９抗体により誘導された活性化は、全長ヒトＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体により誘発されたものよりもはるかに強力であった。このＡＤＣＣ誘導性抗体はこの設定において低い活性を有した。さらには、この低いＥ：Ｔ比の設定において、ＮＫＣＥにより誘導された活性化は、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブと同等に強力であり、差異は、差異が２．５：１のＥＴ比において観察された濃度よりも１０倍高い最も高い濃度においてのみ観察された。
標的細胞の非存在下または標的抗原陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下で、全長抗ＮＫｐ４６抗体およびアレムツズマブは、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下で観察されたものと類似したレベルのベースライン活性化を示した。抗ＮＫｐ４６×抗ＣＤ１９抗体はＨＵＴ７８細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化させなかった。
ＮＫｐ４６およびＣＤ１６トリガリングの組合せ
ＮＫｐ４６－３からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有するＦ５フォーマットによる配置を有するヒトＣＤ１６に結合するＮＫｐ４６×ＣＤ１９ ＮＫＣＥタンパク質を、Ｆ６フォーマット（ＣＤ１６結合性を欠く）における同じ二特異性抗体、およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗ＣＤ１９抗体の他に、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と、ＣＤ１９陽性Ｄａｕｄｉ腫瘍標的細胞を溶解するように精製されたＮＫ細胞に指令する機能的な能力について比較した。
簡潔に述べれば、ＥＦＳバフィコートからの新鮮なヒトの精製されたＮＫ細胞の細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレート中での古典的な４ｈ ５１Ｃｒ放出アッセイにおいて評価した。ＤａｕｄｉまたはＨＵＴ７８細胞（ＣＤ１９を発現しない陰性対照細胞）を５１Ｃｒを用いて標識し、次にＮＫ細胞と、１０：１に等しいエフェクター／標的比において、１／１０の希釈（ｎ＝８の濃度）を伴う１０μｇ／ｍｌから開始する希釈範囲における試験抗体の存在下で混合した。
短い遠心分離および３７℃で４時間のインキュベーション後に、５０μＬの上清を取り出し、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）中に移し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ ｂｅｔａ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて５１Ｃｒ放出を測定した。すべての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（実験的な放出の平均ｃｐｍ － 自発的な放出の平均ｃｐｍ）／（総放出の平均ｃｐｍ － 自発的な放出の平均ｃｐｍ）。総放出のパーセンテージは、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）を用いた標的細胞の溶解により得られ、自発的な放出は培地（エフェクターもＡｂもなし）中の標的細胞に対応する。
これらの実験の結果を図２３において示す。そのＦｃドメインがＮ２９７置換に起因してＣＤ１６に結合しないＣＤ１９－Ｆ６－ＮＫｐ４６（Ｆ６フォーマットにおける二特異性タンパク質）は、Ｄａｕｄｉ標的細胞のＮＫ細胞溶解の媒介において全長ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体と同程度に強力であった。対照ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体はＣＤ１９に二価で結合し、さらに抗ＣＤ１９抗体はＣＤ１６により結合されることを特に考慮すれば、この結果は顕著である。Ｆ６タンパク質をまた、Ｋａｂａｔ残基２９７におけるアスパラギンを例外としてＣＤ１９－Ｆ６－ＮＫｐ４６タンパク質と同一であるタンパク質ＣＤ１９－Ｆ５－ＮＫｐ４６と比較した。そのＦｃドメインがＣＤ１６に結合するＣＤ１９－Ｆ５－ＮＫｐ４６（Ｆ５フォーマットタンパク質）によるＣＤ１６トリガリングにより媒介される強いＮＫ活性化にもかかわらず、Ｆ５フォーマットは、全長ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体またはＦ６フォーマット二特異性タンパク質よりも（ｔｈａｔ）Ｄａｕｄｉ標的細胞溶解の媒介においてはるかに強力であった。ＮＫｐ４６は、ＣＤ１６がトリガーされる場合であっても標的細胞溶解を増強できることをこれは示唆する。実際に、同等のレベルの標的細胞溶解において、ＣＤ１９－Ｆ５－ＮＫｐ４６は全長抗ＣＤ１９ ＩｇＧ１よりも少なくとも１０００倍強力であった。
ＦｃＲｎに対する異なる二特異性フォーマットの結合性
ＰＣＴ国際公開第２０１６／２０７２７３号パンフレットにおいて記載されるように、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層中のカルボキシル基に共有結合的に組換えＦｃＲｎタンパク質を固定化することにより表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりヒトＦｃＲｎに対する異なる抗体フォーマットの親和性を研究した。インタクトなヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラ全長抗ＣＤ１９抗体およびＮＫｐ４６－３からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有するＮＫｐ４６×ＣＤ１９ ＮＫＣＥを試験し；各々のアナライトについて、定常状態または１：１ ＳＣＫ結合モデルを使用して全センサーグラムをフィッティングした。
これらの実験の結果を以下の表８において示す。Ｆｃドメイン二量体を有するＮＫＣＥタンパク質（フォーマットＦ５、Ｆ６、Ｆ１３、Ｆ１４）は、全長ＩｇＧ１抗体の場合と類似した親和性でＦｃＲｎに結合した。単量体Ｆｃドメインを有する他のＮＫＣＥタンパク質（Ｆ３、Ｆ４、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１；以下において示さず）もまたＦｃＲｎに対する結合親和性を示したが、Ｆｃドメイン二量体を有する二特異性タンパク質よりも低い親和性であった。
表８


ＦｃγＲに対する結合性
異なる多量体Ｆｃタンパク質を評価して、そのような二特異性単量体Ｆｃタンパク質がＦｃγ受容体に対する結合性を保持できるかどうかを評価した。
ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で２５℃で行った。すべてのＢｉａｃｏｒｅ実験において、ＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および１０ｍＭのＮａＯＨ、５００ｍＭのＮａＣｌをそれぞれランニング緩衝液および再生緩衝液とした。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いてセンサーグラムを分析した。組換えヒトＦｃＲ（ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１６ａおよびＣＤ１６ｂ）をクローニング、産生および精製した。
Ｆ５およびＦ６ ＮＫＣＥタンパク質ＣＤ１９－Ｆ５－ＮＫｐ４６－３またはＣＤ１９－Ｆ６－ＮＫｐ４６－３をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層中のカルボキシル基に共有結合的に固定化した。ＥＤＣ／ＮＨＳ［Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリドおよびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）］を用いてチップ表面を活性化させた。二特異性抗体をカップリング緩衝液（１０ｍＭのアセテート、ｐＨ ５．６）中に１０μｇ／ｍｌまで希釈し、適切な固定化レベル（すなわち８００～９００ＲＵ）に達するまで注入した。１００ｍＭのエタノールアミン（ｐＨ ８）（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、残留する活性化された基の失活を行った。
古典的な動力学的ウィザードに従って（製造業者により推奨されるように）一価親和性研究を評価した。ＣＤ６４について０．７～６０ｎＭおよびすべての他のＦｃＲについて６０～５０００ｎＭの範囲に及ぶ可溶性アナライト（ＦｃＲ）の段階希釈液を、固定化された二特異性抗体上に注入し、再生前に１０分間解離させた。ＣＤ６４について１：１動力学的結合モデルを使用し、すべての他のＦｃＲについて定常状態親和性モデルを用いて完全センサーグラムセットをフィッティングした。
全長野生型ヒトＩｇＧ１はすべてのカニクイザルおよびヒトＦｃγ受容体に結合するが、ＣＤ１９－Ｆ６－ＮＫｐ４６－３二特異性抗体は受容体のいずれにも結合しないことを結果は示した。ＣＤ１９－Ｆ５－ＮＫｐ４６－３は、他方で、ヒト受容体ＣＤ６４（ＫＤ＝０．７ｎＭ）、ＣＤ３２ａ（ＫＤ＝８４６ｎＭ）、ＣＤ３２ｂ（ＫＤ＝１８５０ｎＭ）、ＣＤ１６ａ（ＫＤ＝１０９８ｎＭ）およびＣＤ１６ｂ（ＫＤ＝２４２６ｎＭ）の各々に結合した。従来的なヒト抗ＩｇＧ１抗体は、これらのＦｃ受容体に対する同等の結合性を有する（ＫＤは以下の表において示される）。


ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質は異なる腫瘍抗原にわたり強力である
Ｆ５フォーマットによる配置を有するヒトＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体を有するＮＫｐ４６結合性ＮＫＣＥタンパク質を、腫瘍抗原結合性ＶＨ／ＶＬペアを変動させて構築した。
ＥＧＦＲ：
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ＥＧＦＲおよびＴＧＦαを含む、その特異的なリガンドの結合により活性化される膜貫通タンパク質である。ＥＧＦＲ過剰発現または過剰活性に繋がる突然変異は、肺扁平上皮細胞癌、肛門がん、神経膠芽腫、および頭頸部がんを含む、多数のがんと関連付けられている。ＦＤＡ承認済みの抗体セツキシマブ［Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）］からのＶＨおよびＶＬドメインを含むＥＧＦＲ ＡＢＤ、ＮＫｐ４６－１ ＶＨ／ＶＬペア、ならびにヒトＣＤ１６に結合するＦｃドメインを組み込んだ、Ｆ５フォーマットを有するＮＫｐ４６×ＥＧＦＲ ＮＫＣＥタンパク質を調製した。タンパク質を、同じＶＨおよびＶＬドメインを有する全長抗ＥＧＦＲ ＩｇＧ１抗体と比較した。
図２４は、そのＦｃドメインがＣＤ１６Ａに結合するＮＫｐ４６×ＥＧＦＲ ＮＫＣＥタンパク質は、Ａ５４９標的細胞溶解の媒介において非常に強力であり、ＥＧＦＲに二価で結合する全長ＩｇＧ１の能力にもかかわらず、全長ＩｇＧ１抗ＥＧＦＲ抗体と同等に強力であることを示す。
ＲＯＲ１：
ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１）は、細胞表面受容体のＲＯＲサブファミリーに属するグリコシル化されたＩ型膜タンパク質である。それは、触媒活性を欠き、かつ非カノニカルなＷｎｔシグナル伝達経路と相互作用し得る偽キナーゼである。ＲＯＲ１は、成体組織において非常に低いレベルで発現されるが、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病において最初により高いレベルで発現されることが見出された。ＲＯＲ１は引き続いて、例えば、***、肺、卵巣および膵臓がんを含む、多様な組織に由来するヒトがんにおいて中程度にまたは強く発現されることが見出された。ＮＫｐ４６－１ ＡＢＤおよびヒトＣＤ１６に結合するＦｃドメインを組み込んだ、Ｆ５フォーマットを有するＮＫｐ４６×ＲＯＲ１ ＮＫＣＥタンパク質を調製した。タンパク質を、同じＶＨおよびＶＬドメインを有する全長ＩｇＧ１抗ＲＯＲ１抗体と比較した。
図２５は、そのＦｃドメインがＣＤ１６Ａに結合するＮＫｐ４６×ＲＯＲ１ ＮＫＣＥタンパク質は、Ｍｉｎｏ腫瘍標的細胞溶解の媒介において非常に強力であり、かつさらに、ＲＯＲ１に二価で結合する全長ＩｇＧ１の能力にもかかわらず、全長ＩｇＧ１抗ＲＯＲ１抗体の１０倍よりも高い効力を有することを示す。
ＫＩＲ３ＤＬ２
ＫＩＲ３ＤＬ２（ＣＤ１５８ｋ）は、健常な循環性ＮＫおよびＣＤ８＋ Ｔリンパ球のサブセット上に発現される細胞表面受容体である。ＫＩＲ３ＤＬ２はまた、皮膚Ｔ細胞リンパ腫中および様々なタイプの末梢Ｔ細胞リンパ腫中の悪性腫瘍細胞の表面上に見出されている。ＮＫｐ４６－１ ＡＢＤおよびヒトＣＤ１６に結合するＦｃドメインを組み込んだ、フォーマット５の構造を有するＮＫｐ４６×ＫＩＲ３ＤＬ２ ＮＫＣＥを調製した。タンパク質を、同じＶＨおよびＶＬドメインを有する全長ＩｇＧ１抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体と比較した。
図２６は、そのＦｃドメインがＣＤ１６Ａに結合するＮＫｐ４６×ＫＩＲ３ＤＬ２ ＮＫＣＥタンパク質は、ＨＵＴ７８腫瘍標的細胞溶解の媒介において非常に強力であり、かつさらに、ＫＩＲ３ＤＬ２に二価で結合する全長ＩｇＧ１の能力にもかかわらず、全長ＩｇＧ１抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体よりも有意に強力であることを示す。
［実施例１９］
ＮＫＣＥ－ＩＬ１５はＮＫ細胞の活性化を促進する
図２の「Ｔ５」フォーマットにおけるヘテロ三量体ＮＫｐ４６結合性ＮＫＣＥタンパク質を、ＩＬ－２ｖ含有ＮＫＣＥ分子と同様であるが、ＩＬ－２ｖ部分の代わりに野生型ＩＬ－１５部分を含むように調製し、ＮＫ細胞のＩＬ－２Ｒ活性化を促進するその能力について評価した。ＦＤＡ承認済みのヒト化抗体ＧＡ１０１からの抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペアを組み込むことによりＮＫＣＥをＣＤ２０に結合させた。
ヘテロ三量体Ｆｃドメイン含有タンパク質ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５を、ＮＫ細胞におけるサイトカイン受容体シグナル伝達を活性化させるその能力について評価した。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５タンパク質は、図２Ｇにおいて示されるドメイン構造（構造Ｔ５Ａ）、ならびに表６において示されるアミノ酸配列および配列番号４４７～４７９のポリペプチド鎖を有し、かつＮ末端に位置付けられたＣＤ２０に結合する抗原結合性ドメインを有し、かつＣ末端に位置付けられたＩＬ１５、野生型Ｆｃドメイン（すなわちヒトＣＤ１６Ａに結合するもの）、およびＦｃドメインとＩＬ１５部分との間に置かれたＶＨ／ＶＬペアＮＫｐ４６－４に由来するＮＫｐ４６に結合する抗原結合性ドメインを組み込んでいる。ＮＫｐ４６結合性ＶＨ／ＶＬペアが、実験系中のいかなる抗原にも結合しないＶＨ／ＶＬペアにより置き換えられており、かつＦｃドメインが、ＣＤ１６Ａに対する結合性を消失させるための突然変異Ｎ２９７Ｓ（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）を含むことを除いてＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５と同じアミノ酸配列を有するＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１５タンパク質もまた試験した。
簡潔に述べれば、１Ｍ／ウェルの精製されたＰＢＭＣを９６ウェルプレート中に播種し、増加性用量のＮＫＣＥ－ＩＬ１５を用いて３７℃において２０分間処理した。ＳＴＡＴ５リン酸化を次に、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）に関するフローサイトメトリーにより分析した。
結果を図２７において示しており、該図は、ｙ軸上にＮＫ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５は、ＮＫｐ４６にもＣＤ１６Ａにも結合しないＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１５と比較して、ＮＫ細胞の中でのＳＴＡＴ５リン酸化についてのＥＣ５０における少なくとも１桁の規模の減少を誘導した。
［実施例２０］
ＮＫＣＥ－ＩＬ１５はＮＫ細胞増殖を促進する
この実験において、野生型ＩＬ１５含有ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５およびＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣｂ－ＩＬ１５を、６日のインキュベーションにおいて、ＮＫ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞またはＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を誘導するそれらの能力について評価した。
簡潔に述べれば、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔで標識された精製されたＰＢＭＣをある用量範囲のＮＫＣＥ－ＩＬ１５と６日間培養した。ＮＫ細胞（ＣＤ３－ ＣＤ５６＋）、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋）およびＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ８＋）に関して、フローサイトメトリーによりモニターされた希釈されたＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）シグナルを示す細胞のパーセンテージの定量化により細胞増殖を評価した。
結果を図２８において示しており、該図は、ｙ軸上に増殖性ＮＫ、ＣＤ４ ＴまたはＣＤ８ Ｔ細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５は、ＮＫｐ４６にもＣＤ１６Ａにも結合しないＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１５タンパク質と比較して、ＮＫ細胞増殖についての少なくとも１－ｌｏｇの効力における増加と共に、強いＮＫ細胞増殖を結果としてもたらした。効力における増加はＮＫ細胞について選択的であり、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞増殖の誘導についてＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５による効力の増加はなかった。
［実施例２１］
ＮＫＣＥ－ＩＬ１５は標準的なインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて腫瘍細胞殺傷を促進する
この実験において、野生型ＩＬ１５含有ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５およびＩＣ－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５を、精製されたヒトＮＫ細胞によるＲＡＪＩ腫瘍細胞の殺傷を誘導するそれらの能力について評価した。ＣＤ２０結合性ＶＨ／ＶＬペアが、実験系中に存在するいかなる抗原にも結合しないＶＨ／ＶＬペア（ＩＣ）により置き換えられていることを除いて、ＩＣ－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５タンパク質はＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５と同一である。簡潔に述べれば、精製されたＮＫ細胞を、カルセインを以前にロードされたＲａｊｉ腫瘍細胞と１０：１の比において共培養した。細胞を、上記される試験タンパク質ＮＫＣＥ－ＩＬ１５と３７℃、５．５％のＣＯ２のインキュベーター中で４ｈインキュベートした。
結果を図２９において示しており、該図は、ｙ軸上にＮＫ細胞により誘導された特異的溶解％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。標的化された細胞上のＣＤ２０に対する結合性を欠いたＩＣ－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５は有意な細胞傷害性を誘導しなかった。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１５は、他方、腫瘍細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性の誘導におけるＥＣ５０値の観点において高い効力を示した。
［実施例２２］
ＮＫＣＥ－ＩＬ１８ｖは、ＮＫ細胞の活性化を促進するようにＩＬ１８ｖ活性を再方向付けする
図２Ｇの「Ｔ５Ａ」フォーマットにおけるヘテロ三量体ＮＫｐ４６結合性ＮＫＣＥタンパク質を、ＩＬ－２ｖ含有ＮＫＣＥ分子についてと同様であるが、ＩＬ－２ｖ部分の代わりにＩＬ－１８の変異型（ＩＬ－１８ｖ）部分を有するように調製し、ＮＫ細胞のＩＬ－１８Ｒ活性化を促進するその能力について評価した。図２Ｉの「Ｔ６ＡＢ３」構造を有する対照タンパク質を調製した。ＦＤＡ承認済みのヒト化抗体ＧＡ１０１からの抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペアを組み込むことによりＮＫＣＥタンパク質をＣＤ２０に結合させた。
ヘテロ三量体Ｆｃドメイン含有タンパク質ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖを、ＮＫ細胞を活性化させるその能力について評価した。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖタンパク質は、図２Ｇにおいて示されるドメイン構造、ならびに表６において示されるアミノ酸配列および配列番号４８６～４８８のポリペプチド鎖を有し、ＣＤ２０に結合する抗原結合性ドメインがＮ末端に位置付けられており、かつＣ末端に位置付けられたＩＬ１８ｖ、野生型Ｆｃドメイン（すなわちヒトＣＤ１６Ａに結合するもの）、およびＦｃドメインとＩＬ１８ｖ部分との間に置かれたＶＨ／ＶＬペアＮＫｐ４６－４に由来するＮＫｐ４６に結合する抗原結合性ドメインを組み込んでいる。ＮＫｐ４６にもＣＤ１６Ａにも結合しないＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１８ｖタンパク質を、ＮＫ細胞に結合しない対照分子として使用した。
簡潔に述べれば、０．１Ｍ／ウェルの精製されたＮＫ細胞を９６ウェルプレート中に播種し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２の存在下において、増加性用量の各々のＮＫＣＥ－ＩＬ１８ｖタンパク質を用いて終夜処理した。細胞を、ＣＤ６９発現細胞の％およびＣＤ６９発現のｍｅｄＦＩについてフローサイトメトリーにより分析した。
結果を図３０において示しており、左手パネルは、ｙ軸上にＣＤ６９発現ＮＫ細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示しており、右手パネルはＮＫ細胞におけるＣＤ６９発現のメジアン蛍光強度（ｍｅｄＦＩ）を示している。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖは、ＮＫ細胞上のＣＤ１６ＡにもＮＫｐ４６にも結合しないＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１８ｖと比較して、ＮＫ細胞の活性化についてのＥＣ５０において２桁の規模の範囲内の減少を誘導した。
［実施例２３］
ＮＫＣＥ－ＩＬ１８ｖはＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生を促進するようにＩＬ１８ｖ活性を再方向付けする
この実験において、ＩＬ１８ｖ含有ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖおよびＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１８ｖを、ＮＫ細胞によるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）産生を促進するそれらの能力について評価した。精製されたＮＫ細胞を、９６ウェルプレート中で１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２の存在下において、ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖまたはＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１８ｖを用いて終夜処理した。ＩＦＮ－γをフローサイトメトリーにより分析した。
結果を図３１において示しており、ｙ軸上にＩＦＮ－γ発現ＮＫ細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖは、ＮＫ細胞上のＣＤ１６ＡにもＮＫｐ４６にも結合しないＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１８ｖと比較して、ＮＫ細胞の活性化についてのＥＣ５０において２桁の規模の範囲内の減少を誘導した。
［実施例２４］
ＮＫＣＥ－ＩＬ１８ｖはＮＫ細胞増殖を促進する
この実験において、ＩＬ１８ｖ含有ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖおよびＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１８ｖを、６日のインキュベーションにおいて、ＮＫ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞またはＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を誘導するそれらの能力について評価した。ＮＫｐ４６結合性ＶＨ／ＶＬペアが、実験系中のいかなる抗原にも結合しないＶＨ／ＶＬペアにより置き換えられており、かつＦｃドメインが、ＣＤ１６Ａに対する結合性を消失させる突然変異Ｎ２９７Ｓを含むことを除いて、ＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１８ｖタンパク質はＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖと同じアミノ酸配列を有する。
簡潔に述べれば、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔで標識された精製されたＰＢＭＣをある用量範囲のＮＫＣＥ－ＩＬ１８ｖと６日間培養した。ＮＫ細胞（ＣＤ３－ ＣＤ５６＋）、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋）およびＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ８＋）に関して、フローサイトメトリーによりモニターされた希釈されたＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）シグナルを示す細胞のパーセンテージの定量化により細胞増殖を評価した。
結果を図３２において示しており、該図は、ｙ軸上に増殖性ＮＫ、ＣＤ４ ＴまたはＣＤ８ Ｔ細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖは強いＮＫ細胞増殖を結果としてもたらした。ＣＤ１６ＡにもＮＫｐ４６にも結合しないＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１８ｖタンパク質はＮＫ細胞の有意な活性化を示さなかった。ＣＤ２０Ａ－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖによる強いＮＫ細胞増殖はＮＫ細胞について選択的であり、ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞において有意な増殖は誘導されなかった。ＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＬ１８ｖもまた、ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞増殖の有意な誘導を示さなかった。
［実施例２５］
ＮＫＣＥ－ＩＬ１８ｖは標準的なインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて腫瘍細胞殺傷を促進する
この実験において、ＩＬ１８ｖ含有ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖおよびＩＣ－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖを、ヒトドナーからのＮＫ細胞によるＲＡＪＩ腫瘍細胞の殺傷を誘導するそれらの能力について評価した。ＣＤ２０結合性ＶＨ／ＶＬペアが、実験系中に存在するいかなる抗原にも結合しないＶＨ／ＶＬペア（ＩＣ）により置き換えられていることを除いて、ＩＣ－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖタンパク質はＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖと同一である。
簡潔に述べれば、ヒトの精製されたＮＫ細胞を、カルセインを以前にロードされたＲａｊｉ腫瘍細胞と１０：１の比において共培養した。細胞を試験ＮＫＣＥ－ＩＬ１８ｖタンパク質と３７℃、５．５％のＣＯ２のインキュベーター中で４ｈインキュベートした。
結果を図３３において示しており、該図は、ｙ軸上にＮＫ細胞により誘導された特異的溶解％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。標的化された細胞上のＣＤ２０に対する結合性を欠いたＩＣ－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖは有意な細胞傷害性を誘導しなかった。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＬ１８ｖは、他方、腫瘍細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性の誘導におけるＥＣ５０値の観点において高い効力を示した。
［実施例２６］
ＮＫ細胞標的化は活性化を促進するようにＮＫ細胞に対するＩＦＮαｖ活性を再方向付けする
図２の「Ｔ５Ａ」フォーマットにおけるヘテロ三量体ＮＫｐ４６結合性ＮＫＣＥタンパク質を、ＩＬ－２ｖ含有ＮＫＣＥ分子についてと同様であるが、ＩＬ－２ｖ部分の代わりに変異型ＩＦＮα（ＩＦＮαｖ）部分を含むように調製し、ＮＫ細胞のＩＦＮＡＲ媒介性活性化を促進するその能力について評価した。ＦＤＡ承認済みのヒト化抗体ＧＡ１０１からの抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペアを組み込むことによりＮＫＣＥをＣＤ２０に結合させた。
ヘテロ三量体Ｆｃドメイン含有タンパク質ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＦＮαｖを、ＮＫ細胞を活性化させるその能力について評価した。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＦＮαｖタンパク質は、図２Ｇにおいて示されるドメイン構造、ならびに表６において示されるアミノ酸配列および配列番号４９５～４９７のポリペプチド鎖を有し、かつＮ末端に位置付けられたＣＤ２０に結合する抗原結合性ドメインを有し、かつＣ末端に位置付けられたＩＦＮαｖ、野生型Ｆｃドメイン（すなわちヒトＣＤ１６Ａに結合するもの）、およびＦｃドメインとＩＦＮαｖ部分との間に置かれたＶＨ／ＶＬペアＮＫｐ４６－４に由来するＮＫｐ４６に結合する抗原結合性ドメインを組み込んでいる。ＮＫｐ４６結合性ＶＨ／ＶＬペアが、実験系中のいかなる抗原にも結合しないＶＨ／ＶＬペアにより置き換えられており、かつＦｃドメインが、ＣＤ１６Ａに対する結合性を消失させる突然変異Ｎ２９７Ｓを含むことを除いて、ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＦＮαｖと同じアミノ酸配列を有するＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＦＮαｖタンパク質もまた対照として試験した。
簡潔に述べれば、１Ｍ／ウェルの精製されたＰＢＭＣを９６ウェルプレート中に播種し、増加性用量のＮＫＣＥ－ＩＦＮαｖを用いて３７℃において２０分間処理した。ＳＴＡＴ３リン酸化を次に、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ ＣＤ５６＋）、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋）およびＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ８＋）に関するフローサイトメトリーにより分析した。
結果を図３４において示しており、該図は、ｙ軸上にＮＫ細胞、ＣＤ４ ＴまたはＣＤ８ Ｔ細胞の中でのｐＳＴＡＴ３細胞の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＦＮαｖは、いかなる有意なＮＫ細胞活性化も誘導しなかったＣＤ２０－Ｔ６ＡＢ３－ＩＣ－ＩＦＮαｖと比較して、ＮＫ細胞の中で強力なＳＴＡＴ３リン酸化を誘導した。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＦＮαｖの強力なＮＫ細胞活性化活性はＮＫ細胞について選択的であり、ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞の有意な活性化はなかった。
［実施例２７］
ＮＫＣＥ－ＩＦＮαｖは標準的なインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて腫瘍細胞殺傷を促進する
この実験において、ＩＦＮαｖ含有ＮＫ細胞エンゲージャータンパク質ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＦＮαｖおよびＩＣ－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＦＮαｖを、ＮＫ細胞によるＲＡＪＩ腫瘍細胞の殺傷を誘導するそれらの能力について評価した。ＣＤ２０結合性ＶＨ／ＶＬペアが、実験系中に存在するいかなる抗原にも結合しないＶＨ／ＶＬペア（ＩＣ）により置き換えられていることを除いて、ＩＣ－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＦＮαｖタンパク質はＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＦＮαｖと同一である。
簡潔に述べれば、ヒトの精製されたＮＫ細胞を、カルセインを以前にロードされたＲａｊｉ腫瘍細胞と１０：１の比において共培養した。細胞を試験ＮＫＣＥ－ＩＦＮαｖタンパク質と３７℃、５．５％のＣＯ２のインキュベーター中で４ｈインキュベートした。
結果を図３５において示しており、該図は、ｙ軸上にＮＫ細胞により誘導された特異的溶解％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。標的化された細胞上のＣＤ２０に対する結合性を欠いたＩＣ－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＦＮαｖは有意な細胞傷害性を誘導しなかった。ＣＤ２０－Ｔ５Ａ－ＮＫｐ４６－ＩＦＮαｖは、他方、腫瘍細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性の誘導におけるＥＣ５０値の観点において高い効力を示した。
［実施例２８］
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖは非ヒト霊長動物においてインビボで最小の全身性サイトカイン放出を誘導する
ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ処置後のマウスにおいて観察された好都合な安全性プロファイル（実施例１８を参照）に従って、我々は、非ヒト霊長動物においてＮＫ細胞エンゲージャーＧＡ１０１－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ（配列番号１７５～１７７）を用いる処置の効果を評価した。用量レベル当たり４匹の動物を用いて、カニクイザル（Ｍ． ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に０．０５ｍｇ／ｋｇ体重（低用量）もしくは０．５ｍｇ／ｋｇ体重（高用量）のいずれかのＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ（ＣＤ１６Ａ結合性を有する）、または０．５ｍｇ／ｋｇのＧＡ１０１－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ（配列番号１８４～１８６；Ｎ２９７Ｓ突然変異はＣＤ１６Ａに対する結合性の欠如を付与する）の単回の静脈内注射を注射した。
図３６は、ＮＫＣＥタンパク質を用いた処置（処置は０日目である）の１４日前から処置の３０日後までにかけてのＢ細胞数（細胞／μＬ）のベースラインからの差異を示しており、ＮＫＣＥタンパク質はＢ細胞枯渇を誘導したが、対照（媒体）は誘導しなかったことを示す。
図３７は、ＮＫＣＥタンパク質の投与後２４時間の経過にかけての異なるサイトカインの産生を示す。処置後の各々の時点について、サイトカインの血漿濃度を血清１ｍＬ当たりのｎｇにおいて示している。これらのデータは、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは処置後２４時間の間に最小の全身性サイトカイン産生を誘導したに過ぎないことを示し、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖは、その強力な細胞枯渇活性にもかかわらず、免疫毒性を伴わないことを示唆する。Ｔ細胞エンゲージャータンパク質を用いた同等の実験において観察されたサイトカイン濃度値を考慮すれば安全性プロファイルは特に顕著である。例えば、Engelberts et al., (Ebiomedicine 2020 vol. 52, 102625）は、突然変異の導入によりサイレンシングされたＦｃドメインと共に、制御されたＦａｂアーム交換により生成される、ＣＤ３およびＣＤ２０を認識する全長ヒトＩｇＧ１二特異性抗体（ｂｓＡｂ）である１ｍｇ／ｋｇのＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）－ＣＤ３ｘＣＤ２０の投与において以下の値を報告している：ＩＦＮ－γ（１ｎｇ／ｍＬより高い）、ＩＬ－６（８ｎｇ／ｍＬより高い）、ＴＮＦα（１．７ｎｇ／ｍＬより高い）、ＩＬ－１０（１０ｎｇ／ｍＬより高い）、ＩＬ－８（５ｎｇ／ｍＬより高い）、ＭＣＰ（５００ｎｇ／ｍＬより高い）。
注射部位において反応は観察されなかった。行動スコア付けを１～３０のスケールにおいて実行し、２０～３０は増加的に重度の困難を指し示し、１２～２０は増加的に困難の徴候を指し示し、１２は行動の大きな変更を指し示し、７は中等度の行動の変更を指し示し、１は健常個体を指し示す。ＮＫＣＥは、いかなる困難も引き起こさず、いっそうさらには中等度の行動の変更と関連付けられるレベルを十分に下回った。臨床的な検査において、観察されたすべてのパラメーターは正常な値の範囲内のままであった。血液分析において、ナトリウム、カリウム、塩素、重炭酸塩、リン、フェリチンおよびフルクトサミン、アルブミン、グロブリン、クレアチニン、尿素、総タンパク質、コレステロール、トリグリセリド、ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴアルカリホスファターゼの血中レベルを含む、ＮＫＣＥを用いて処置された動物について観察されたすべてのパラメーターは、媒体に概ね類似し、正常な値の範囲内のままであった。図３８は、処置の１４日前から処置の３０日後までの期間にかけてのＮＫＣＥまたは媒体を用いて処置された動物についての赤血球細胞、血小板、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均血球容量、平均血球ヘモグロビンおよび平均血球ヘモグロビン濃度についての平均値を示す。図３９は、処置の１４日前から処置の３０日後までの期間にかけての白血球、リンパ球、単球、好中球、好酸球および好塩基球細胞の平均レベルを示す。図４０は、処置の１４日前から処置の３０日後までの期間にかけてのＮＫ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＦｏｘＰ３－ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞の平均レベルを示す。ＮＫＣＥタンパク質のすべては、３日目および７日目においてＮＫ細胞の拡大増殖を誘導した。ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞の増加が、高用量のタンパク質においてＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖおよびＣＤ２０－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖの両方と共に観察されたが、より低い用量のＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖにおいては観察されなかった。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増加が、ＣＤ２０－Ｔ６－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを用いて観察されたが、低または高用量のＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを用いた場合には観察されなかった。
［実施例２９］
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖ療法は免疫適格マウスにおいて腫瘍床中のＮＫ細胞を増加させる
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖタンパク質を免疫適格マウス固形腫瘍モデルにおいてＮＫ細胞の腫瘍内蓄積に対するそれらの効果について評価した。
簡潔に述べれば、ｈｕＣＤ２０（ヒトＣＤ２０）発現Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ６マウス中に移植した。１日目および８日目において、２５μｇのＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを用いてマウスを処置した。フローサイトメトリーによりＮＫ細胞浸潤について１３日目に腫瘍を分析した。ＮＫ細胞はＮＫ１．１＋ＣＤ３－として同定した。
結果を図４１において示す。ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋ＣＤ３－）は、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを用いた処置の非存在下で腫瘍中のＣＤ４５＋細胞の２０．４％であった。しかしながら、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを用いてマウスを処置した場合、ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋ＣＤ３－）は腫瘍中の全ＣＤ４５＋細胞の５０．４％であり、腫瘍部位においてＮＫ細胞蓄積を刺激するＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖの強い能力を実証した。
［実施例３０］
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖ処置は免疫不全マウスの脾臓においてＮＫ細胞拡大増殖および活性化を誘導する
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖタンパク質を、ＮＫ細胞が機能的なままである免疫不全マウスモデルにおいて腫瘍区画の外側のＮＫ数および活性化細胞に対するそれらの効果について評価した。
簡潔に述べれば、ＲＡＪＩ ｓｃ腫瘍を保有するＣＢ１７ ＳＣＩＤ（免疫不全）を、７０μｇのＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖ、１２５μｇのＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６（ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖと同じ構造を共有するがＩＬ２ｖ部分を欠いている）または６００μｇのオビヌツズマブの単回ｉ．ｖ．注射を用いて処置した。処置の３日後に、脾臓をフローサイトメトリーによりＮＫ細胞数、ＣＤ６９およびＫｉ６７発現について分析した。
結果を図４２において示す。ＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６およびオビヌツズマブを用いた処置はＮＫ細胞の数を増加させなかったが、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを用いた処置は脾臓中のＮＫ細胞における強い増加を引き起こした。追加的に、ＣＤ２０－Ｆ５－ＮＫｐ４６またはオビヌツズマブを用いた処置は、全ＮＫ細胞の中での活性化されたまたは増殖性のＮＫ細胞の割合を増加させなかったが、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを用いた処置は、全ＮＫ細胞の中での活性化されたまたは増殖性のＮＫ細胞における強い増加を引き起こした。これらのデータは、ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖは、腫瘍微環境の外側でＮＫ細胞の集団を拡大増殖させて、免疫不全マウスにおいて抗腫瘍活性に潜在的に寄与し得るＮＫ細胞のプールを生成できることを指し示す。
［実施例３１］
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖ処置は免疫適格腫瘍保有マウスの血液および脾臓においてＮＫ細胞拡大増殖および活性化を誘導する
ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖタンパク質を、固形腫瘍を保有する免疫適格マウスにおいて血液および脾臓中のＮＫ細胞数および活性化に対するそれらの効果について評価した。
簡潔に述べれば、ｈｕＣＤ２０Ｂ１６Ｆ１０（ヒトＣＤ２０発現マウスＢ１６Ｆ１０細胞）皮下腫瘍を保有するＣ５７ＢＬ６マウス（免疫適格）を、２５μｇのＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを単回のｉ．ｖ．注射において用いて処置した。脾臓および血液中のＮＫ細胞数およびＣＤ６９発現をフローサイトメトリーにより処置後の＋４日目に分析した。
結果を図４３において示す。ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを用いた処置は、血液１μｌ当たりのおよび脾臓中のＮＫ細胞数における強い増加を引き起こした。追加的に、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫｐ４６－ＩＬ２ｖを用いた処置は、血液および脾臓中のＮＫ細胞の中での活性化された（ＣＤ６９発現）ＮＫ細胞における強い増加を引き起こした。脾臓および血液の両方における細胞の大部分は活性化された［対照（媒体）で処置されたマウスにおける２０％と比較して、８０％の範囲内のＮＫ細胞はＣＤ６９陽性であった］。これらのデータは、ＮＫＣＥ－ＩＬ２ｖは血液および脾臓中のＮＫ細胞の集団を拡大増殖させて、免疫適格マウスにおいて抗腫瘍活性に潜在的に寄与し得るＮＫ細胞のプールを生成できることを指し示す。
［実施例３２］
抗ＮＫｐ４６抗体のエピトープマッピング
Ａ．競合アッセイ
競合アッセイを表面プラズモン共鳴（以下に記載される方法によるＳＰＲ）により実行した。
ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で２５℃で行った。すべてのＢｉａｃｏｒｅ実験において、ＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＮａＯＨ １０ｍＭ ＮａＣｌ ５００ｍＭをそれぞれランニング緩衝液および再生緩衝液とした。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いてセンサーグラムを分析した。抗６ｘＨｉｓタグ抗体はＱＩＡＧＥＮから購入した。ヒト６ｘＨｉｓタグ付加ＮＫｐ４６組換えタンパク質（ＮＫｐ４６－Ｈｉｓ）は、Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａにおいてクローニング、産生および精製された。
抗Ｈｉｓ抗体をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層中のカルボキシル基に共有結合的に固定化した。ＥＤＣ／ＮＨＳ［Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリドおよびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）］を用いてチップ表面を活性化させた。プロテインＡおよび抗Ｈｉｓ抗体をカップリング緩衝液（１０ｍＭのアセテート、ｐＨ ５．６）中に１０μｇ／ｍｌまで希釈し、適切な固定化レベル（すなわち２０００～２５００ＲＵ）に達するまで注入した。１００ｍＭのエタノールアミン（ｐＨ ８）（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、残留する活性化された基の失活を行った。
ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３またはＮＫｐ４６－４に対応するＮＫｐ４６結合性領域を有する通常の親ヒトＩｇＧ１キメラ抗体を、抗６ｘＨｉｓタグ抗体チップを使用して行った競合研究のために使用した。ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３またはＮＫｐ４６－４に基づくＮＫｐ４６結合性領域を有する二特異性抗体を１μｇ／ｍＬにおいてプロテインＡチップ上に捕捉させ、組換えヒトＮＫｐ４６タンパク質を、ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３またはＮＫｐ４６－４群の第２の試験二特異性抗体と共に５μｇ／ｍＬにおいて注入した。
結果は、ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３またはＮＫｐ４６－４のいずれもＮＫｐ４６への結合について互いと競合しないことを実証した。よって、これらの抗体は各々、異なるＮＫｐ４６エピトープに結合するかまたはそれと相互作用する。
Ｂ．ＮＫｐ４６突然変異体に対する結合性
これらの抗ＮＫｐ４６抗体のエピトープを定義するために、我々は、ＮＫｐ４６の２つのドメインにかけての分子表面において露出されるアミノ酸の１、２または３つの置換により定義されるＮＫｐ４６突然変異体を設計した。このアプローチは、以下の表において示されるように、４２個の突然変異体の生成に繋がり、それをＨｅｋ－２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。以下の表９における標的化されたアミノ酸突然変異は、配列番号１の番号付け、およびJaron-Mendelson et al. (2012) J. Immunol. 88(12):6165-74において使用された番号付けにも対応させて示している。
表９





Ｃ．突然変異体の生成
ＮＫｐ４６突然変異体をＰＣＲにより生成させた。増幅された配列をアガロースゲル上に流し、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して精製した。各々の突然変異体について生成された２または３つの精製されたＰＣＲ生成物を次に、ＣｌｏｎＴｅｃｈ ＩｎＦｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いて、発現ベクター中にライゲートした。突然変異した配列を含有するベクターをミニプレップとして調製し、シークエンシングした。シークエンシング後に、突然変異した配列を含有するベクターを、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標） Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを使用してミディプレップとして調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用してベクターを用いてトランスフェクトし、導入遺伝子発現についての試験に先立って３７℃のＣＯ２インキュベーター中で２４時間インキュベートした。
Ｄ．ＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクト細胞に対する抗ＮＫｐ４６結合性のフローサイトメトリー分析
すべての抗ＮＫｐ４６抗体を、各々の突然変異体に対するそれらの結合性についてフローサイトメトリーにより試験した。第１の実験は、特定の濃度（１０μｇ／ｍｌ）において１またはいくつかの突然変異体に対する結合性を喪失する抗体を同定するために行った。結合性の喪失を確認するために、結合性がＮＫｐ４６突然変異により影響されたようである抗体を使用して抗体の滴定を行った（１－０．１－０．０１－０．００１μｇ／ｍｌ）。
Ｅ．結果
抗体ＮＫｐ４６－１は、野生型ＮＫ４６と比較して突然変異体２（残基Ｋ４１、Ｅ４２およびＥ１１９において突然変異を有する）（ＮＫｐ４６野生型における番号付け）に対する減少した結合性を有した。同様に、ＮＫｐ４６－１はまた、補充的な突然変異体Ｓｕｐｐ７（残基Ｙ１２１およびＹ１９４において突然変異を有する）に対する減少した結合性を有した。
抗体ＮＫｐ４６－３は、突然変異体１９（残基Ｉ１３５、およびＳ１３６において突然変異を有する）に対する減少した結合性を有した。同様に、ＮＫｐ４６－３はまた、補充的な突然変異体Ｓｕｐｐ８（残基Ｐ１３２およびＥ１３３において突然変異を有する）に対する減少した結合性を有した。
抗体ＮＫｐ４６－４は、突然変異体６（残基Ｒ１０１、およびＶ１０２において突然変異を有する）に対する減少した結合性を有した。同様に、ＮＫｐ４６－４はまた、残基Ｅ１０４およびＬ１０５において突然変異を有する補充的な突然変異体Ｓｕｐｐ６に対する減少した結合性を有した。
これらの方法を使用して、我々は、抗ＮＫｐ４６抗体ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－３およびＮＫｐ４６－４のためのエピトープを同定した。ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－３およびＮＫｐ４６－１のエピトープはそれぞれＮＫｐ４６ Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメインおよびＤ１／Ｄ２ジャンクション上にあることを我々は決定した。Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４およびＬ１０５は、ＮＫｐ４６－４結合性のための必須の残基であり、ＮＫｐ４６－４エピトープの部分を定義した。ＮＫｐ４６－１エピトープのエピトープは、Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１およびＹ１９４残基を含む。ＮＫｐ４６－３のエピトープは、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、およびＳ１３６残基を含む。
すべての見出しおよび副見出しは、簡便性のためにのみ本明細書において使用されており、いかなるようにも本発明を限定するとして解釈されるべきではない。すべての可能なバリエーションにおける上記される要素の任意の組合せは、本明細書において他に指し示されないか、または他に明確に文脈に矛盾しなければ、本発明により包含される。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において他に指し示されなければ、範囲内に入る各々の別々の値に個々に言及する簡略化された方法として役立つことが単に意図され、各々の別々の値は、それが本明細書において個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。他に記載されなければ、本明細書において提供されるすべての正確な値は、対応するおおよその値の代表的なものである（例えば、特定の因子または測定に関して提供されるすべての正確な例示的な値は、適切な場合に、「約」により改変された、対応するおおよその測定値も提供すると考えられ得る）。本明細書において記載されるすべての方法は、本明細書において他に指し示されないか、または他に明確に文脈に矛盾しなければ、任意の好適な順序において行われ得る。
本明細書において提供される任意のおよびすべての例、または例示的な表現（例えば、「例えば」）の使用は、本発明をより良好に説明することが単に意図され、他に指し示されなければ、本発明の範囲に対する限定を課さない。本明細書中のいかなる記載も、明示的に記載されなければ、任意の要素が本発明の実施にとって必須であることを指し示すとして解釈されるべきではない。
１つまたは複数の要素への言及などの用語を使用する本発明の任意の態様または実施形態の本明細書における記載は、他に記載されないか、または明確に文脈に矛盾しなければ、その１つまたは複数の特定の要素「からなる」か、「から本質的になる」か、またはそれを「実質的に含む」本発明の類似した態様または実施形態のためのサポートを提供することが意図される（例えば、特定の要素を含むとして本明細書において記載される組成物は、他に記載されないか、または明確に文脈に矛盾しなければ、その要素からなる組成物もまた記載するとして理解されるべきである）。
本発明は、適用法により許容される最大の程度まで本出願において提示される態様または請求項において記載される主題のすべての改変および均等物を含む。
本明細書において参照されるすべての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが特におよび個々に指し示されたかのようにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以上の発明が、理解を明確にする目的のために実例および例によってある程度詳細に記載されたが、ある特定の変更および改変が、添付の請求項の精神または範囲から離れることなくそれに対してなされてもよいことは本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかとなる。

Claims (55)

  1. 標的細胞により発現される対象とする抗原に結合する能力を有し、かつＮＫ細胞の表面におけるＮＫｐ４６、サイトカイン受容体および適宜ＣＤ１６Ａに結合する能力をさらに有し、かつ対象とする抗原を発現する標的細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する能力を有する、多特異性タンパク質であって、
    （ａ）対象とする抗原に結合する抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）；
    （ｂ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＡＢＤ；
    （ｃ）ＦｃＲｎに結合する能力を有するＦｃドメイン、またはＦｃドメインの部分（ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ａｎ Ｆｃ ｄｏｍａｉｎ）；および
    （ｄ）ＮＫ細胞上に存在するヒトサイトカイン受容体に結合するＡＢＤ
    を含み、
    ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記ＡＢＤが、適宜Ｉｇ由来または非Ｉｇ由来ポリペプチドリンカーを介して、前記Ｆｃドメインに接続されており、かつヒトサイトカイン受容体に結合する前記ＡＢＤが、ポリペプチドリンカーを介して、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記ＡＢＤまたは前記Ｆｃドメインに接続されている、前記タンパク質。
  2. 前記タンパク質が、対象とする抗原に結合する１つのみのＡＢＤを有し、その結果、前記タンパク質が、対象とする前記抗原に一価で結合し、適宜さらに、前記タンパク質が、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する１つのみのＡＢＤ、サイトカイン受容体に結合する１つのみのＡＢＤ、および１つのみのＦｃドメイン二量体を有する、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 前記サイトカイン受容体に結合する前記ＡＢＤが、ポリペプチドリンカーを介して、ＮＫｐ４６に結合する前記ＡＢＤに接続されている、請求項１または２に記載のタンパク質。
  4. ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記ＡＢＤおよびヒトサイトカイン受容体に結合する前記ＡＢＤ、および適宜さらに前記Ｆｃドメインが、前記多特異性タンパク質内で前記多特異性タンパク質のＮおよびＣ末端に関して連続して位置付けられている、請求項１、２または３に記載のタンパク質。
  5. ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記ＡＢＤおよびヒトサイトカイン受容体に結合する前記ＡＢＤ、および適宜前記Ｆｃドメインが、膜平面結合コンフォメーションを取る能力を有するように構成されており、その結果、前記タンパク質が、ＮＫ細胞の表面上のＮＫｐ４６および前記サイトカイン受容体、および適宜さらにＣＤ１６Ａに結合する能力を有する、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  6. ヒトサイトカインに結合する前記ＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記ＡＢＤまたは前記Ｆｃドメインに、２０個または２０個未満のアミノ酸残基、適宜１５個未満のアミノ酸残基、適宜１０個未満のアミノ酸残基、適宜５～１５残基、適宜５～１０残基、適宜３～５残基を有するリンカーペプチドにより接続されている、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  7. ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記ＡＢＤが、前記Ｆｃドメインに、１５個または１５個未満のアミノ酸残基、適宜１０個未満のアミノ酸残基、適宜４～１５残基、適宜３～１０残基、適宜４～５残基を有するリンカーペプチドにより接続されている、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  8. ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記ＡＢＤが、前記Ｆｃドメインに、２０個または２０個未満のアミノ酸残基、適宜１５個未満のアミノ酸残基、適宜４～１５残基、適宜４～１０残基、適宜３～５残基を有する、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｕｌｉｎ）由来リンカーペプチドにより接続されており、適宜、前記リンカーがアミノ酸配列ＲＴＶＡを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  9. ＮＫｐ４６に結合する前記ＡＢＤが、前記Ｆｃドメインと前記サイトカイン受容体に結合する前記ＡＢＤとの間に差し挟まれている、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  10. 各々のＡＢＤが、ＶＨおよび／もしくはＶＬドメインまたはその断片を含み、適宜、ＶＨおよび／またはＶＬが３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ－３）を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  11. 適宜、１５個または１５個未満のアミノ酸残基を有するドメインリンカーを介して、ＮＫ細胞の表面において発現される受容体に結合するサイトカインに融合したヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＡＢＤを含む、タンパク質。
  12. ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記ＡＢＤが、前記ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ１／Ｄ２ジャンクションに結合するＶＨおよび／またはＶＬドメインを含み、かつ前記サイトカインが改変型ＩＬ－２ポリペプチドである、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  13. ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記ＡＢＤが、そのＣ末端において、ドメインリンカーを介して、前記サイトカインのＮ末端に融合しており、適宜、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記ＡＢＤがｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有する、請求項１１または１２に記載のタンパク質。
  14. 第１および第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体、または第１、第２および第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体（ｈｅｔｅｒｏｔｉｍｅｒ）である、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  15. （ｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、ＮＫｐ４６に結合する可変ドメイン、ヒトＣＨ１またはＣＬ定常ドメイン、適宜ドメインリンカー、および野生型または変異型ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドを含む、第１のポリペプチド鎖、ならびに
    （ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、（ｉ）の前記可変ドメインと会合してＮＫｐ４６結合性ドメインを形成する可変ドメイン、およびヒトＣＨ１またはＣＬ定常ドメインを含む、第２のポリペプチド鎖
    を含み；
    （ｉ）および（ｉｉ）の前記定常ドメインのうちの１つがＣＨ１であり、かつ他方がＣＬであり、その結果、（ｉ）および（ｉｉ）の前記定常ドメインがＣＨ１－ＣＬ二量体化により会合している、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  16. ドメイン配置：
    ［式中、
    Ｖａ－２およびＶｂ－２は各々ＶＨドメインまたはＶＬドメインであり、Ｖａ－２およびＶｂ－２のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－２およびＶｂ－２は、ＮＫｐ４６に結合する第２のＡＢＤを形成しており；
    ＣＨ１はヒト免疫グロブリンＣＨ１ドメインであり、かつＣＬはヒト軽鎖定常ドメインであり；
    （ＣＨ１またはＣＬ）ａおよび（ＣＨ１またはＣＬ）ｂのうちの１つはＣＨ１であり、かつ他方はＣＬであり、その結果、（ＣＨ１／ＣＬ）ペアが形成され；
    Ｌはドメインリンカーであり；かつ
    Ｃｙｔは、ＮＫ細胞上に存在するサイトカイン受容体に結合するサイトカインポリペプチドまたはその部分であり、適宜、Ｃｙｔは、野生型または変異型ヒトＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドである］
    を有するＮＫｐ４６ ＡＢＤ－サイトカイン単位を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  17. （ａ）（ｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１１２、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９もしくは２３６～３１３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含む可変ドメインを含むＮＫｐ４６結合性ドメインもしくはその部分、ヒトＣＨ１もしくはＣＬ定常ドメイン、ドメインリンカー、および配列番号４０４～４３９のいずれかのアミノ酸配列に対してもしくはその少なくとも４０、５０、６０、８０もしくは１００個の連続するアミノ酸のその断片に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含む野生型もしくは変異型ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αもしくはＩＦＮ－βポリペプチドを含む、第１のポリペプチド鎖、ならびに
    （ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、（ｉ）の前記可変ドメインと会合してＮＫｐ４６結合性ドメインを形成する可変ドメインであって、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０もしくは３１４～４０３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含む、前記可変ドメイン、およびヒトＣＨ１もしくはＣＬ定常ドメインを含む、第２のポリペプチド鎖；
    または
    （ｂ）（ｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０もしくは３１４～４０３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含む可変ドメインを含むＮＫｐ４６結合性ドメインもしくはその部分、ヒトＣＨ１もしくはＣＬ定常ドメイン、ドメインリンカー、および配列番号４０４～４３９のいずれかのアミノ酸配列に対してもしくはその少なくとも４０、５０、６０、８０もしくは１００個の連続するアミノ酸のその断片に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含む野生型もしくは変異型ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αもしくはＩＦＮ－βポリペプチドを含む、第１のポリペプチド鎖、ならびに
    （ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端へ、（ｉ）の前記可変ドメインと会合してＮＫｐ４６結合性ドメインを形成する可変ドメインであって、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１１２、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９もしくは２３６～３１３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含む、前記可変ドメイン、およびヒトＣＨ１もしくはＣＬ定常ドメインを含む、第２のポリペプチド鎖
    を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  18. ドメイン配置：
    －Ｌ１－Ｖａ－２－Ｌ２－Ｖｂ－２－Ｌ３－Ｃｙｔ
    ［式中、
    Ｖａ－２およびＶｂ－２は各々ＶＨドメインまたはＶＬドメインであり、Ｖａ－２およびＶｂ－２のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－２およびＶｂ－２は、ＮＫｐ４６に結合する第２のＡＢＤを形成しており；
    Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は各々ドメインリンカーであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は異なるかまたは同じであり得、Ｌ１は、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ－サイトカイン単位を前記タンパク質の残部に接続するドメインリンカーであり；かつＣｙｔは、ＮＫ細胞上に存在するサイトカイン受容体に結合するサイトカインポリペプチドまたはその部分であり、適宜、Ｃｙｔは、野生型または変異型ヒトＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドである］
    を有する前記ＮＫｐ４６ ＡＢＤ－サイトカイン単位を含むポリペプチドを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
  19. サイトカイン受容体に結合する前記ＡＢＤが、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較してＣＤ２５に対する結合性の低減を示すＩＬ－２ポリペプチドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  20. 前記タンパク質もしくはヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記ＡＢＤが、ＳＰＲにより決定された場合に、１～１００ｎＭのＫＤでヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、かつ／または前記タンパク質もしくは前記サイトカインが、ＳＰＲにより決定された場合に、１０ｎＭ～１μＭのＫＤで前記ヒトサイトカイン受容体に結合する、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  21. 多特異性ポリペプチドが、表面プラズモン共鳴により評価された場合に、全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体の場合と実質的に同等である一価結合についての親和性で、ヒトＦｃγ受容体、適宜ＣＤ１６Ａに結合する、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  22. 表面上に固定化された前記タンパク質が、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して表面プラズモン共鳴により決定された場合に、２０００ｎＭ以下、適宜１０００～２０００ｎＭ、適宜１１００または１３００ｎＭである、一価結合についてのＫＤで可溶性ヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに結合する、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  23. 前記サイトカイン受容体が、ＮＫ細胞の表面において存在し、かつ共通γ鎖（γＣ；ＣＤ１３２）と会合する受容体であり、適宜さらに、前記サイトカイン受容体が、中親和性ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ受容体（ＣＤ１２２）またはＩＬ－２１Ｒ（ＣＤ３６０）であり、かつ適宜、前記サイトカインポリペプチドが、ＩＬ－２、ＩＬ－１５またはＩＬ－２１である、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  24. 前記タンパク質が、
    （ａ）Ｎ末端からＣ末端へ、第１の可変ドメイン（Ｖ）、ＣＫ定常領域の第１のＣＨ１、Ｆｃドメインまたはその部分、第２の可変ドメイン（Ｖ）およびＣＫ定常領域の第２のＣＨ１を含む、第１のポリペプチド鎖；
    （ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ、第１の可変ドメイン（Ｖ）、ＣＨ１またはＣＫ定常領域、およびＦｃドメインまたはその部分を含む、第２のポリペプチド鎖であって、前記ＶドメインおよびＣＨ１またはＣκ定常領域が、前記第１のポリペプチド鎖の前記第１のＶドメインおよび第１のＣＨ１またはＣκ定常領域に相補的であるように選択され、その結果、前記第１および第２のポリペプチドがＣＨ１－Ｃκヘテロ二量体を形成しており、前記ＣＨ１－Ｃκヘテロ二量体において、前記第１のポリペプチド鎖の前記第１の可変ドメインおよび前記第２のポリペプチドの前記第１の可変ドメインが、対象とする前記抗原に結合する第１の抗原結合性ドメインを形成している、前記第２のポリペプチド鎖；ならびに
    （ｃ）Ｎ末端からＣ末端へ、可変ドメイン（Ｖ）およびＣＨ１またはＣＫ定常領域を含む、第３のポリペプチド鎖であって、前記ＶドメインおよびＣＨ１またはＣκ定常領域が、前記第１のポリペプチド鎖の前記第２のＶドメインおよび第２のＣＨ１またはＣκ定常領域に相補的であるように選択され、その結果、前記第１および第３のポリペプチドがＣＨ１－Ｃκヘテロ二量体を形成しており、前記ＣＨ１－Ｃκヘテロ二量体において、前記第１のポリペプチド鎖の前記第２の可変ドメインおよび前記第３のポリペプチドの前記可変ドメインが、ＮＫｐ４６に結合する第２の抗原結合性ドメインを形成している、前記第３のポリペプチド鎖
    を含む、単離されたヘテロ三量体ポリペプチドであり、かつ
    前記第１または第３のポリペプチド鎖のうちの１つが、適宜ドメインリンカーを介して、そのＣ末端に共有結合されたサイトカイン、適宜ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチド、適宜ＩＬ－２ｖまたはＩＬ１５ｖをさらに含む、請求項１～１７または１９～２３のいずれか一項に記載のタンパク質。
  25. ポリペプチド鎖１、２および３：
    ［式中、
    Ｖａ－１、Ｖｂ－１、Ｖａ－２およびＶｂ－２は各々ＶＨドメインまたはＶＬドメインであり、Ｖａ－１およびＶｂ－１のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－１およびＶｂ－１は、対象とする抗原に結合する第１の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）を形成しており、Ｖａ－２およびＶｂ－２のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－２およびＶｂ－２は、ＮＫｐ４６に結合する第２のＡＢＤを形成しており；
    ＣＨ１はヒト重鎖定常ドメイン１であり、かつＣＬはヒト軽鎖定常ドメインであり；
    （ＣＨ１またはＣＬ）ａおよび（ＣＨ１またはＣＬ）ｃのうちの１つはＣＨ１であり、かつ他方はＣＬであり、その結果、（ＣＨ１／ＣＬ）ペアが形成され；
    （ＣＨ１またはＣＬ）ｂおよび（ＣＨ１またはＣＬ）ｄのうちの１つはＣＨ１であり、かつ他方はＣＬであり、その結果、（ＣＨ１／ＣＬ）ペアが形成され；
    ヒンジは免疫グロブリンヒンジ領域またはその部分であり；
    Ｌ１およびＬ２は各々ドメインリンカーであり、Ｌ１およびＬ２は異なるかまたは同じであり得；
    ＣＨ２およびＣＨ３はそれぞれヒト免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインであり；かつ
    Ｃｙｔは、ＮＫ細胞上に存在するサイトカイン受容体に結合するサイトカインポリペプチドまたはその部分であり、適宜、Ｃｙｔは、野生型または変異型ヒトＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドである］
    を有するヘテロ三量体である、請求項１～１７または１９～２４に記載の多特異性タンパク質。
  26. ドメイン配置：
    を有する、請求項１～１７または１９～２５のいずれか一項に記載のタンパク質。
  27. ポリペプチド鎖１、２および３：
    ［式中、
    Ｖａ－１、Ｖｂ－１、Ｖａ－２およびＶｂ－２は各々ＶＨドメインまたはＶＬドメインであり、Ｖａ－１およびＶｂ－１のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－１およびＶｂ－１は、対象とする抗原に結合する第１の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）を形成しており、Ｖａ－２およびＶｂ－２のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－２およびＶｂ－２は、ＮＫｐ４６に結合する第２のＡＢＤを形成しており；
    ＣＨ１はヒト重鎖定常ドメイン１であり、かつＣＬはヒト軽鎖定常ドメインであり；
    （ＣＨ１またはＣＬ）ａおよび（ＣＨ１またはＣＬ）ｃのうちの１つはＣＨ１であり、かつ他方はＣＬであり、その結果、（ＣＨ１／ＣＬ）ペアが形成され；
    （ＣＨ１またはＣＬ）ｂおよび（ＣＨ１またはＣＬ）ｄのうちの１つはＣＨ１であり、かつ他方はＣＬであり、その結果、（ＣＨ１／ＣＬ）ペアが形成され；
    ヒンジは免疫グロブリンヒンジ領域またはその部分であり；
    Ｌ１およびＬ２は各々ドメインリンカーであり、Ｌ１およびＬ２は異なるかまたは同じであり得；
    ＣＨ２およびＣＨ３はそれぞれヒト免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインであり；かつ
    Ｃｙｔは、ＮＫ細胞上に存在するサイトカイン受容体に結合するサイトカインポリペプチドまたはその部分であり、適宜、Ｃｙｔは、野生型または変異型ヒトＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドである］
    を有するヘテロ三量体である、請求項１～１７または１９～２４のいずれか一項に記載のタンパク質。
  28. ドメイン配置：
    を有する、請求項１～１７、１９～２４または２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
  29. （ａ）Ｎ末端からＣ末端へ、第１の可変ドメイン（Ｖ）、ＣＫ定常領域のＣＨ１（ａ ＣＨ１ ｏｆ ＣＫ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）、Ｆｃドメインまたはその部分、第２の可変ドメインおよび第３の可変ドメイン、およびＮＫ細胞上に存在するサイトカイン受容体に結合する野生型または変異型サイトカインを含む、第１のポリペプチド鎖；ならびに
    （ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ、第１の可変ドメイン（Ｖ）、ＣＨ１またはＣＫ定常領域、およびＦｃドメインまたはその部分を含む、第２のポリペプチド鎖であって、前記ＣＨ１またはＣκ定常領域が、前記第１のポリペプチド鎖の前記ＣＨ１またはＣκ定常領域に相補的であるように選択され、その結果、前記第１および第２のポリペプチドがＣＨ１－Ｃκヘテロ二量体を形成しており、前記ＣＨ１－Ｃκヘテロ二量体において、前記第１のポリペプチド鎖の前記第１の可変ドメインおよび前記第２のポリペプチドの前記第１の可変ドメインが第１の抗原結合性ドメインを形成しており；かつ前記第２の可変ドメインおよび第３の可変ドメインが第２の抗原結合性ドメインを形成している、前記第２のポリペプチド鎖
    を含む単離されたヘテロ二量体ポリペプチドである、請求項１～１４または１８～２３のいずれか一項に記載のタンパク質。
  30. ポリペプチド鎖１および２：
    ［式中、
    Ｖａ－１、Ｖｂ－１、Ｖａ－２およびＶｂ－２は各々ＶＨドメインまたはＶＬドメインであり、Ｖａ－１およびＶｂ－１のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－１およびＶｂ－１は、対象とする抗原に結合する第１の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）を形成しており、Ｖａ－２およびＶｂ－２のうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶａ－２およびＶｂ－２は、ＮＫｐ４６に結合する第２のＡＢＤを形成しており；
    ＣＨ１は重鎖定常ドメイン１であり、かつＣＬは軽鎖定常ドメインであり；
    （ＣＨ１またはＣＬ）ａおよび（ＣＨ１またはＣＬ）ｂのうちの１つはＣＨ１であり、かつ他方はＣＬであり、その結果、（ＣＨ１／ＣＬ）ペアが形成され；
    ヒンジは免疫グロブリンヒンジ領域またはその部分であり；
    Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は各々ドメインリンカーであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は異なるかまたは同じであり得；
    ＣＨ２およびＣＨ３はそれぞれヒト免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインであり；かつ
    Ｃｙｔは、ＮＫ細胞上に存在するサイトカイン受容体に結合するサイトカインポリペプチドまたはその部分であり、適宜、Ｃｙｔは、野生型または変異型ヒトＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－２７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－βポリペプチドである］
    を有するヘテロ二量体である、請求項１～１４、１８～２３または２９のいずれか一項に記載のタンパク質。
  31. 対象とする抗原に結合する前記ＡＢＤが免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ領域が、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４または２３６～３１３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが、配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５または３１４～４０３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  32. ＮＫｐ４６に結合する前記ＡＢＤが免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ領域が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１１２、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９または２３６～３１３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０または３１４～４０３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  33. Ｆｃドメインが、配列番号１６０～１６５のいずれかのＦｃポリペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  34. ＣＨ１ドメインが、配列番号１５６のいずれかのＣＨ１ポリペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  35. ＣＫまたはＣＬドメインが、配列番号１５６のいずれかのＣＫポリペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  36. 前記多特異性タンパク質が、
    （ａ）対象とする前記抗原に結合するＡＢＤであって、ｓｃＦｖまたはＦａｂを含み、
    ａ．前記ｓｃＦｖが、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４および２３６～３１３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、ドメインリンカー、ならびに配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５および３１４～４０３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含み；かつ
    ｂ．前記Ｆａｂが、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４および２３６～３１３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのＶＨ、配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５および３１４～４０３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのＶＬ、配列番号１５６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのヒトＣＨ１ドメインならびに配列番号１５９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのヒトＣＬドメインを含み、前記ＶＨが前記ＣＨ１またはＣＬドメインのうちの１つに融合しており、かつ前記ＶＬが前記ＣＨ１またはＣＬドメインのうちの他方に融合している、対象とする前記抗原に結合する前記ＡＢＤ、
    （ｂ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＡＢＤであって、ｓｃＦｖまたはＦａｂを含み、
    ａ．前記ｓｃＦｖが、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１１２、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９および２３６～３１３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、ドメインリンカー、ならびに配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０および３１４～４０３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含み；かつ
    ｂ．前記Ｆａｂが、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１１２、１１３、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９および２３６～３１３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのＶＨ、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０および３１４～４０３のいずれかから選択される配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのＶＬ、配列番号１５６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのヒトＣＨ１ドメインならびに配列番号１５９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む１つのヒトＣＬドメインを含み、前記ＶＨが前記ＣＨ１またはＣＬドメインのうちの１つに融合しており、かつ前記ＶＬが前記ＣＨ１またはＣＬドメインのうちの他方に融合している、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記ＡＢＤ、
    （ｃ）第１および第２のＦｃ単量体を含むＦｃドメイン二量体であって、各々のＦｃ単量体が、配列番号１６０～１６５から選択される配列に対して少なくとも８０％または９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記Ｆｃドメイン二量体；ならびに
    （ｄ）前記多特異性タンパク質の前記ポリペプチド鎖のうちの１つのＣ末端にドメインリンカーを介して融合した、配列番号４０４～４３９から選択される配列に対して、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも８０％または９０％同一のアミノ酸配列を含むサイトカインポリペプチド
    を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  37. 前記標的細胞が腫瘍細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  38. 対象とする前記抗原ががん抗原である、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  39. 対象とする前記抗原が、感染性因子または感染した細胞により発現される、請求項１～３７のいずれか一項に記載のタンパク質。
  40. 前記多特異性タンパク質が、ＮＫｐ４６－１、ＮＫｐ４６－２、ＮＫｐ４６－３、ＮＫｐ４６－４、ＮＫｐ４６－６またはＮＫｐ４６－９ ＶＨおよびＶＬドメインを含むモノクローナル抗体とＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合について競合する、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  41. 前記多特異性タンパク質が、
    （ａ）野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して残基Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４および／またはＬ１０５において突然変異を有する突然変異体ＮＫｐ４６ポリペプチド；
    （ｂ）野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して残基Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１および／またはＹ１９４のうちのいずれか１つまたは複数において突然変異を有する突然変異体ＮＫｐ４６ポリペプチド；ならびに
    （ｃ）野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して残基Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、および／またはＳ１３６のうちのいずれか１つまたは複数において突然変異を有する突然変異体ＮＫｐ４６ポリペプチド
    からなる群から選択される突然変異体ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する減少した結合性を有する、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  42. ＮＫｐ４６に結合する前記抗原結合性ドメインが、
    （ａ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ １、２および３を含む重鎖ならびに配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ １、２および３を含む軽鎖；
    （ｂ）配列番号５の重鎖可変領域のＣＤＲ １、２および３を含む重鎖ならびに配列番号６の軽鎖可変領域のＣＤＲ １、２および３を含む軽鎖；
    （ｃ）配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ １、２および３を含む重鎖ならびに配列番号８の軽鎖可変領域のＣＤＲ １、２および３を含む軽鎖；
    （ｄ）配列番号９の重鎖可変領域のＣＤＲ １、２および３を含む重鎖ならびに配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ １、２および３を含む軽鎖；
    （ｅ）配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ １、２および３を含む重鎖ならびに配列番号１２の軽鎖可変領域のＣＤＲ １、２および３を含む軽鎖；または
    （ｆ）配列番号１３の重鎖可変領域のＣＤＲ １、２および３を含む重鎖ならびに配列番号１４の軽鎖可変領域のＣＤＲ １、２および３を含む軽鎖
    を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  43. 前記請求項のいずれか一項に記載の多特異性タンパク質、および医薬的に許容される担体またはアジュバントを含む、医薬組成物。
  44. 請求項１～４２のいずれか一項に記載の多特異性タンパク質の前記ポリペプチド鎖のうちの１、２、３または４つ（ｏｎｅ， ｔｗｏ， ｔｈｒｅｅ ｏｆ ｆｏｕｒ）（またはすべて）を発現する組換え細胞。
  45. ＮＫ細胞組成物を調製する方法であって、ＮＫ細胞、適宜単離されたＮＫ細胞を、インビトロで、請求項１～４２のいずれか一項に記載の多特異性タンパク質と共にインキュベートするか、または前記多特異性タンパク質と接触させることを含む、前記方法。
  46. 請求項４５に記載の方法に従って得られるＮＫ細胞の組成物。
  47. 疾患の処置用の医薬としての、および／または疾患の処置用の医薬の製造における、請求項１～４２、４３または４６のいずれか一項に記載のタンパク質または組成物の使用。
  48. 疾患を有する対象においてＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞および／またはＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞のＮＫ細胞活性化、細胞傷害性および／または増殖を増強する方法であって、前記対象に請求項１～４２のいずれかに記載の多特異性タンパク質を投与することを含む、前記方法。
  49. 適宜さらに毒性が低減された状態で、疾患を有する対象においてＮＫ細胞および／または腫瘍に非常に強力なサイトカインをデリバリーするかまたは導く方法であって、前記対象に請求項１～４２のいずれかに記載の多特異性タンパク質を投与することを含む、前記方法。
  50. 前記サイトカインが、野生型サイトカイン対応物と比較して、ＮＫ細胞上に存在するそのサイトカイン受容体に対する親和性の少なくとも７０％、８０％または９０％を保持する変異型もしくは野生型サイトカインまたはそのサイトカイン断片である、請求項４５～４９に記載の方法または使用。
  51. 前記多特異性タンパク質（または前記多特異性タンパク質中に含まれる場合の前記サイトカイン）が、単独で前記サイトカインを用いて、または前記ＮＫｐ４６ ＡＢＤおよび／もしくはＣＤ１６ ＡＢＤが対照ＡＢＤにより置き換えられているタンパク質において観察される場合よりも低いＮＫ細胞におけるサイトカイン経路シグナル伝達についてのＥＣ５０を呈し、適宜、ＮＫ細胞におけるサイトカイン経路シグナル伝達についての前記ＥＣ５０が、少なくとも１０倍または１００倍低く、適宜、サイトカイン経路シグナル伝達が、前記サイトカインをＮＫ細胞と接触させ、前記ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴリン酸化を測定することにより評価される、請求項４５～５０に記載の方法または使用。
  52. 前記疾患ががんまたは感染性疾患である、請求項４７～５１に記載の使用。
  53. ヘテロ多量体タンパク質を作製する方法であって、
    （ａ）請求項１４～２３または２９～４２のいずれかに記載の少なくとも第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を用意すること；
    （ｂ）請求項１４～２３または２９～４２のいずれかに記載の少なくとも第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を用意すること；ならびに
    （ｃ）宿主細胞中で前記第１および第２の核酸を発現させて、それぞれ前記第１および第２のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し；産生された前記タンパク質をアフィニティー精製支持体、適宜プロテインＡ支持体上にロードし、前記ヘテロ多量体タンパク質を回収すること
    を含む、前記方法。
  54. ヘテロ多量体タンパク質を作製する方法であって、
    （ａ）請求項１４～２８または３１～４２のいずれかに記載の第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を用意すること；
    （ｂ）請求項１４～２８または３１～４２のいずれかに記載の第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を用意すること；
    （ｃ）請求項１４～２８または３１～４２のいずれかに記載の第３のポリペプチド鎖を含む第３の核酸を用意すること；ならびに
    （ｄ）宿主細胞中で前記第１、第２および第３の核酸を発現させて、それぞれ前記第１、第２および第３のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し；産生された前記タンパク質をアフィニティー精製支持体、適宜プロテインＡ支持体上にロードし、前記ヘテロ多量体タンパク質を回収すること
    を含む、前記方法。
  55. ポリペプチドを同定または評価する方法であって、
    （ａ）請求項１～４２のいずれかに記載のタンパク質の１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ）のポリペプチドをコードする核酸を用意する工程；
    （ｂ）宿主細胞中で前記核酸を発現させて、それぞれ前記タンパク質を産生し；前記タンパク質を回収する工程；ならびに
    （ｃ）産生された前記タンパク質を対象とする生物学的活性について評価する工程
    を含む、前記方法。
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