CN114369153A - 一种白介素-2突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种IL‑2突变体，在人IL‑2的基础上，将与IL2Rα结合相关的氨基酸位点进行替换、删除和添加中的一种或多种突变，获得与IL2Rα结合能力降低的IL‑2突变体；其中，与IL2Rα结合相关的氨基酸位点为野生型IL‑2的第30‑75位。本发明的IL‑2突变体与IL2Rα的相互作用被降低，表达量提高。

Description

一种白介素-2突变体
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种白介素-2突变体。
背景技术
白介素-2(IL-2)，于1976年被发现，当时被称为T细胞生长因子(TCGF)，是一种在维持T淋巴细胞和NK细胞的正常功能中起着重要作用的球状糖蛋白。天然IL-2是一个具有133个氨基酸残基组成的多肽，分子量大约15kD,有三个半胱氨酸残基，分别位于第58、105和125位。翻译后修饰包括第3位的Thr糖基化，第58位和105位半胱氨酸残基形成二硫键，并形成其功能必不可少的主要由4个α螺旋以及一些连接序列(loop)组成的高级结构(Bazan等，Science257,410-413(1992))。
IL-2主要由活化的T细胞生成，它能促进T细胞的增殖和分化，维持T细胞活性；刺激天然杀伤(NK)细胞的生成、增殖和活化，并诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的生成以及诱导和激活淋巴因子激活的杀细胞(LAK)及肿瘤浸润淋巴细胞；促进T细胞表达细胞因子和细胞溶解分子，促进B细胞的增殖(Waldmann等,Nat Rev Immunol6,595-601(2009))；这些细胞都有或间接有杀伤外源微生物感染细胞以及癌变细胞的作用，因此IL-2有很好的抗病毒、抗癌作用和广泛的临床应用潜力。
IL-2通过结合IL-2受体(IL2R)来介导其作用，IL-2受体由3个亚基组成，分别为α(CD25)、β(CD122)和γ(CD132)受体亚基，其中α受体主要表达在T抑制细胞(Treg)和一些内皮细胞(endothelial cells)表面，而β和γ受体亚基则高表达于效应性T细胞(Teff)和NK细胞。IL-2对不同受体亚基的复合物形式的亲和力是不同的，IL-2对α、β和γ受体亚基组成的复合体的亲和力是最高的，对由β和γ受体亚基组成的复合体的亲和力则为中等(约降低100倍)，而IL-2与两种形式的受体亚基组合结合后均能传递信号(Minami等，Annu RevImmunol 11，245-268(1993))。但是临床在IL-2低剂量的条件下，是会优先和Treg细胞表面上的高亲和力受体结合，则会产生免疫抑制，达不到治疗的效果。高剂量的IL-2会通过激活大量的效应T细胞从而中和Treg激活带来的免疫抑制，同时也会出现更多的毒副作用，以及细胞凋亡(activation induced cell apoptosis)
基于IL-2的抗肿瘤作用，高剂量IL-2(阿地白介素)于1992年通过FDA批准用于黑色素瘤和肾细胞癌的临床治疗。但是接受高剂量IL-2治疗的患者经常经历严重的副作用，包括心血管、肺水肿、肝、胃肠、神经学和血液学等事件，大多数的这些副作用可由血管(或毛细管)渗漏综合征(VLS)的来解释，也是临床和动物实验评价IL-2治疗副作用的一项指标。而引起VLS是由于内皮细胞上表达有IL-2的高亲和力受体(α、β和γ亚基)(Krieg等，Proc Nat Acad Sci USA107,11906-11(2010))，所以减弱或消除与α受体结合将有减少IL-2的促进T抑制细胞增殖活性的功能，同时还可减少对内皮细胞α受体的结合，从而降低或消除IL-2治疗引起的毒副作用。
IL-2与α受体亚基的结合位点主要在第37，38，41，42，43，44，45，61，62，65，68和72位氨基酸位点(Rickert.M等(2005)Science 308:1477-1480),Merck和Roche公司或其它科研机构围绕这些与α受体亚基结合的IL-2表面氨基酸做了一些突变，如Merck公司的突变体(R38W、F42K,WO2008003473A2)，降低与α受体亚基的相互作用，以其达到效应T细胞活化以增强功效；而Roche的IL-2突变体(F42A、Y45A和L72G,US 2016/0208017A1)，其与α受体不结和，但可以正常结合β和γ受体亚基，并可以发挥效应，目前正在临床中。
已公开的CN111018961A专利申请中采用了两种方式去消除与IL2Rα受体的结合，一是利用在IL-2内部引入额外的二硫键，其不仅可以使得IL-2从结构上更加稳定，而且还可以形成屏障，破坏与α受体的结合平面；另一种则是利用一封闭模块和IL-2的α受体接合面之间形成二硫键，形成一个全新的分子封闭模块/IL-2异源二聚体(heterodimer)。该复合物无法与体内的内源性α受体结合，但是可以与β和γ受体亚基结合。
因此降低或消除IL-2与α受体亚基的相互作用，可能是治疗有效性并减少肿瘤患者治疗副作用的一个重要方面。
发明内容
有鉴于现有技术中IL-2药物会先与高亲和性受体结合，导致产生免疫抑制，达不到治疗的效果，且高剂量IL-2的使用会出现更多的毒副作用以及细胞凋亡的情况，本发明所要解决的技术问题是提供一种与高亲和性受体结合性降低的IL-2突变体。
本发明的第一个方面提供了一种IL-2突变体，在IL-2的基础上，将与IL2Rα结合相关的氨基酸位点进行替换、删除和添加中的一种或多种突变，获得与IL2Rα结合能力降低的IL-2突变体；其中，与IL2Rα结合相关的氨基酸位点为野生型IL-2的第30-75位。可选地，与IL2Rα结合相关的氨基酸位点为野生型IL-2的第35-75位；可选地，与IL2Rα结合相关的氨基酸位点为野生型IL-2的第37-75位。
进一步地，替换和添加选取突变后能使IL-2突变体结构趋于稳定和/或能量较小的氨基酸残基。
进一步地，对第35-45位中的一个或多个氨基酸进行替换、删除和添加中的一种或多种突变。
进一步地，对第35-37位、41-43位的氨基酸进行替换，对第38-40位的氨基酸进行删除。
进一步地，还对第45位的氨基酸进行替换。
可选地，第35位氨基酸的替换为K35G或K35M；第36位氨基酸的替换为L36G或L36H；第37位氨基酸的替换为T37G；第41位氨基酸的替换为T41G或T41L；第42位氨基酸的替换为F42G或G42D；第43位氨基酸的替换为K43G；第45位氨基酸的替换为Y45G。
在另一个具体实施方式中，对31-32位中的一个或两个氨基酸进行替换、删除和添加中的一种或多种突变。
进一步地，对第31-32位的氨基酸进行替换。
进一步地，第31位氨基酸替换为Y31G；第32位氨基酸替换为K32G。
在另一个实施方式中，还将第125位半胱氨酸突变为侧链较小的氨基酸。
进一步地，侧链较小的氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸。
进一步地，所述野生型IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
可选地，IL-2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-7所示。
本发明的第二个方面提供了一种分离的多核苷酸，其编码如权上所述的IL-2突变体。
本发明的第三个方面提供了一种表达载体，包含如上所述的一种分离的多核苷酸。
本发明的第四个方面提供了一种宿主细胞，包含如上所述的一种分离的多核苷酸。
本发明的第五个方面提供了一种组合物，包含如上所述的IL-2突变体以及药学可接受载体。
本发明的第六个方面提供了如上所述的IL-2突变体用于制备用于治疗疾病的药物或制剂中的用途。
本发明的第七个方面提供了如上所述的IL-2突变体在制备用于刺激个体的免疫***的组合物中的用途。
本发明的第八个方面提供了一种生成IL-2突变体的方法，该方法包括在适合于表达所述IL-2突变体的条件下培养如上所述的宿主细胞。
本发明的IL-2突变体，对IL-2中与IL2Rα结合相关的氨基酸位点进行替换、删除和添加中的一种或多种突变，从而降低了与IL2Rα的结合，还能提高IL-2突变体的表达量。本发明中的IL-2突变体为减少VLS或降低或消除IL-2治疗引起的毒副作用带来的新的方向。
附图说明
图1是IL-2和IL2Rα三维结构示意图(PDB ID 2b5i)。
图2是本发明实施例中的IL-2突变体与IL-2wt C125A序列对比图(部分)。
图3是本发明实施例中的IL-2突变体的SDS-PAGE电泳图。其中，“还原”为上样缓冲液中加入还原剂2-巯基乙醇；“非还原”为上样缓冲液中不加还原剂2-巯基乙醇。
图4是本发明实施例中的IL-2突变体的CTLL2细胞增殖实验。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。
本文中，IL-2突变体和野生型IL-2的相关氨基酸位置，以野生型IL-2的氨基酸序列(如SEQ ID NO.1)为基准进行计算。
野生型IL-2(IL-2wt，SEQ ID NO.1)：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT。
野生型IL-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本文中，“IL2Rα”是指白介素-2受体α，也称为“α受体亚基”；“IL2Rβ”是指白介素-2受体β，也称为“β受体亚基”；“IL2Rγ”是指白介素-2受体γ，也称为“γ受体亚基”；“IL2Rβγ”是指白介素-2受体β和受体γ形成的复合物，也称为“β和γ受体亚基复合物”。
本文中，“突变”包括对氨基酸进行替换、删除和添加。
本发明的具体实施方式中，为了能降低或消除IL-2与α受体的结合，对IL-2中与IL2Rα结合相关的氨基酸位点，即第30-75位进行突变。进行突变的基础序列可以是IL-2野生型，也可以是与IL-2野生型的氨基酸序列具有80％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％及99％以上同源性的序列。
在一个具体实施方式中，对第35-45位中的一个或多个氨基酸进行替换、删除和添加中的一种或多种突变，减少IL-2突变体与IL2Rα的结合。
在另一个具体实施方式中，对31-32位以及第35-45位中的一个或两个氨基酸进行替换、删除和添加中的一种或多种突变，减少IL-2突变体与IL2Rα的结合。
具体地，通过IL-2和IL2Rα的结合三维结构发现，IL-2位于第37，38，41，42，43，44，45，61，62，65，68和72位等氨基酸位点与IL2Rα的结合有关，因此通过生物信息学和蛋白质工程学设计，在第30位～第75位氨基酸进行突变、删减、添加，从而改变IL-2与IL2Rα的结合。
在一些实施例中，设计获得的IL-2突变体的氨基酸序列如表1所示：
表1设计获得的IL-2突变体的氨基酸序列
Figure BDA0003091707560000051
表1中设计获得的IL-2突变体氨基酸序列的编码核苷酸序列如表2所示：
表2设计获得的IL-2突变体的核苷酸序列
Figure BDA0003091707560000061
Figure BDA0003091707560000071
表达宿主可以是E.Coli或哺乳动物细胞。
实施例1 IL-2以及突变体的制备
本实施例中对IL-2wt(C125A)和突变体进行分别表达，并依靠分子C端带有的HPC4标签进行纯化和制备。
1.1表达质粒构建
委托苏州金唯智生物科技有限公司合成带有IL-2wt(C125A，SEQ ID NO.1)和突变体的基因，并克隆到pTT5通用载体。转化DH10B、测序和保菌，从而得到需要的IL-2野生型和突变体质粒。
1.2质粒提取及HEK293细胞准备
1.2.1质粒提取
按照《Qiagen Mini-prep Kit》和《Qiagen Endofree Maxi-prep Kit》提到的操作方法，进行IL-2wt(C125A)和IL-2突变体的制备。
1.2.2 HEK293细胞准备
新鲜传代的密度为1-1.2*106/ml的HEK293细胞(National Research Council,Canada)用于瞬时表达。
1.3 HEK293瞬时表达
1.3.1试剂制备
A)G418溶液:称取250mg GeneticinTM加入4.5ml超纯水溶解，超纯水定容至5ml，0.22um滤膜过滤，-20℃保存
B)PEI溶液：称取50mgPEI加入45ml超纯水溶解，1M NaOH调节pH至7.0，超纯水定容至50ml，0.22um滤膜过滤，-20℃保存
C)培养基：在1L FreeStyleTM 293Expression Medium中加入10ml PluronicdTMF-68和500ul G418
D)质粒提前准备在2ml去内毒素离心管中。
E)根据转染需要体积准备好新鲜传代至1-1.2×106个/ml的细胞悬液
1.3.2配制转染试剂-质粒复合物
A液：质粒1μg/mL+Opti-MEMTM 33.3ul/mL
B液：PEI 2μg/mL+Opti-MEMTM 33.3ul/mL
将B液倒入A液混匀孵育10min后，加入细胞悬液1mL，可按等比例放大。
1.3.3表达培养和收获
在115rpm，36.8℃，5％CO2培养5天后，离心8500rpm 15min，收集细胞上清。
1.4纯化制备
所有IL-2wt(C125A)和IL-2突变体C端都带有HPC4标签，因此可以用偶联有HPC4抗体的填料进行亲和纯化，然后再经过凝胶过滤层析(superdex200)进行进一步纯化得到纯度较高的蛋白，经过纯化后推算IL-2wt C125A表达量为～9.9mg/L，384和386表达量分别为18.6mg/L和19.6mg/L。按照《分子克隆》描述的方法进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示。
实施例2通过生物膜干涉技术(biolayer interferomeory，BLI)测定hIL2突变体分别与IL2Rβ和IL2Rα的亲和力
1.实验材料
实验所用蛋白均为本公司生产，IL2Rα-his，IL2Rβ-Fc/Fc以及IL2突变体通过HEK293瞬时表达以及亲和纯化后获得。缓冲液配方(10mM HEPES,150mM氯化钠，3mM EDTA,0.1％BSA和0.05％吐温20)；ProA传感器(Pall Fortebio公司，货号#18-5010)；HISIK传感器(Pall Fortebio公司，货号#18-5120)；BLI设备为Pall Fortebio公司生产的OctetRED96；数据获取和分析工作分别采用Data acquisition 11.0和Data analysis 11.0软件进行。
2.实验方法
2.1 IL2Rβ-Fc/Fc准备
用缓冲液稀释IL2Rβ-Fc/Fc至浓度10ug/ml，加入96孔测定板第2列，控制程序中设为Loading,600s。
2.2 IL2Rα-his准备
用缓冲液稀释IL2Rα-his至浓度10ug/ml，加入96孔测定板第3列，控制程序中设为Loading,600s.
2.3样品准备
用缓冲液将IL2突变体稀释到100nM，然后1：1向下系列稀释6个梯度(共7个梯度)至浓度为1.625nM以及0浓度，分别加入96孔测定板5-9列，控制程序中设定为Association，200s。在96孔测定板第1，4，10，11列加入缓冲液，12列加入PH1.7的甘氨酸，上述样品和溶液的加样量均为200ul。
2.4检测与IL2Rβ-Fc/Fc的亲和力
取8个ProA传感器分别置于传感器支架第1列的A-H，在Data acquisition 11.0软件中将检测条件设置如下：1预湿：Baseline，60s，位置：第1列。2循环检测：第2列：loading，600s；第4列：Baselinel，60s；样品5-9列：Association，200s，第10列：Dissociation，600s；第11列：中和；第12列：再生。
2.5检测与IL2Rα的结合
取8个HISIK传感器分别置于传感器支架第2列的A-H，在Data acquisition11.0软件中将检测条件设置如下：1预湿：Baseline，60s，位置：第1列。2循环检测：第3列：loading，600s；第4列：Baseline1，60s；样品5-9列：Association，200s，第10列：Dissociation，600s；第11列：中和；第12列：再生。
2.6数据分析
使用Data analysis 11.0软件对数据进行分析。以0浓度为对照扣减背景，通过Fitting curve计算KD值。
3.结果
结果如表3所示，经过设计的IL-2突变体都不与IL2Rα受体结合，但都保持了与IL2Rβ的结合。
表3 IL-2突变体与IL2Rα受体和IL2Rβ受体的亲和力
蛋白名称 与IL2Rα的亲和力(M) 与IL2Rβ的亲和力(M)
IL-2wt C125A 8.21E-09 2.23E-07
IL-2突变体383 N.B 2.40E-07
IL-2突变体384 N.B 1.50E-07
IL-2突变体385 N.B 7.26E-07
IL-2突变体386 N.B 1.90E-07
N.B：Non binding，不结合
实施例3促进T细胞的增殖实验
CTLL-2(T细胞)的增殖实验是普遍应用的细胞水平测定白介素刺激免疫细胞活性的实验。因此，此处通过CTLL-2细胞的增殖实验来查看IL-2突变体的生物活性。
1.CTLL-2细胞准备：将细胞用含有FBS和Rat-T-Stim的培养液重悬起来。
2.加样：将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1ml。同时将待测样品IL-2突变体386的蛋白(即实施例1中制备的蛋白)分别做倍比稀释，每孔加入0.1ml，每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔(100ul细胞+100ul培养液)。37度，5％CO2孵育72小时。
3.MTS加入：每孔加入20μl
Figure BDA0003091707560000101
AQueous One Solution Reagent，37度，5％CO2孵育2～4小时。
4.测定：用酶标测定仪于波长490nm测吸光值(A)并计算EC50值。
5.结果：如图4所示，IL-2突变体都具有CTLL2细胞增殖活性，说明突变没有严重影响β和γ受体亚基复合物的信号传导功能。突变体对CTLL2细胞的增殖活性低于阳性对照，是因为IL-2突变体386不结合IL2Rα受体亚基，而阳性对照结合IL2Rα受体后，可以增强与IL2Rβ的结合，所以对于CTLL2细胞增殖活性更高。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京志道生物科技有限公司
<120> 一种白介素-2突变体
<130> CN010-21002PICN
<150> CN202011114023.7
<151> 2020-10-18
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence (人工序列)
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 2
<211> 399
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列)
<400> 2
gcccccacaa gctccagcac caagaagaca cagctgcagc tggaacatct gctgctggac 60
ctccagatga ttctgaacgg catcaacaac tacaagaatc ccaagctgac aagaatgctc 120
accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgagctga agcatctgca gtgtctggag 180
gaggagctga agcctctgga agaggtgctg aatctggccc agtccaagaa cttccatctg 240
aggcctagag atctgatcag caacatcaac gtcatcgtgc tggagctgaa gggcagcgag 300
accaccttca tgtgcgagta cgccgatgag accgccacca tcgtggagtt tctgaataga 360
tggatcacct tctgccagag catcatcagc acactgacc 399
<210> 3
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence (人工序列)
<400> 3
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 4
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence (人工序列)
<400> 4
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Phe Gly Met Pro Lys Lys Ala Thr
35 40 45
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
50 55 60
Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg
65 70 75 80
Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser
85 90 95
Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val
100 105 110
Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr
115 120 125
Leu Thr
130
<210> 5
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence (人工序列)
<400> 5
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Met Gly Gly Leu Gly Gly Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr
35 40 45
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
50 55 60
Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg
65 70 75 80
Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser
85 90 95
Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val
100 105 110
Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr
115 120 125
Leu Thr
130
<210> 6
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence (人工序列)
<400> 6
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Met His Gly Leu Asp Gly Phe Gly Met Pro Lys Lys Ala Thr
35 40 45
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
50 55 60
Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg
65 70 75 80
Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser
85 90 95
Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val
100 105 110
Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr
115 120 125
Leu Thr
130
<210> 7
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence (人工序列)
<400> 7
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Gly Gly
20 25 30
Asn Pro Met His Gly Leu Asp Gly Phe Gly Met Pro Lys Lys Ala Thr
35 40 45
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
50 55 60
Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg
65 70 75 80
Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser
85 90 95
Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val
100 105 110
Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr
115 120 125
Leu Thr
130
<210> 8
<211> 399
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列)
<400> 8
gctcccacaa gctccagcac caagaagaca cagctgcagc tggaacatct gctgctggac 60
ctccagatga ttctgaacgg catcaacaac tacaagaatc ccaagctgac aagaatgctc 120
accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgagctga agcatctgca gtgtctggag 180
gaggagctga agcctctgga agaggtgctg aatctggccc agtccaagaa cttccatctg 240
aggcctagag atctgatcag caacatcaac gtcatcgtgc tggagctgaa gggcagcgag 300
accaccttca tgtgcgagta cgccgatgag accgccacca tcgtggagtt tctgaataga 360
tggatcacct tcgcccagag catcatcagc acactgacc 399
<210> 9
<211> 444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列)
<400> 9
gctcccacct ccagcagcac caagaagacc cagctccagc tggagcatct gctgctggat 60
ctgcagatga ttctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccggaggagg aggaggaggc 120
tttggcatgc ccaagaaggc caccgagctg aaacatctgc agtgtctgga ggaggagctg 180
aagcctctgg aagaggtgct caatctggcc cagagcaaga acttccatct gagacctaga 240
gatctgatca gcaacatcaa cgtgatcgtg ctggagctca agggcagcga gaccaccttc 300
atgtgcgagt acgccgacga gaccgccacc atcgtggagt ttctgaatag atggatcacc 360
ttctgccaga gcatcatcag cacactgacc ggcggaggcg gaagcgaaga ccaagtggac 420
cccagactga ttgacggaaa gtga 444
<210> 10
<211> 444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列)
<400> 10
gctcccacct ccagcagcac caagaagacc cagctccagc tggagcatct gctgctggat 60
ctgcagatga ttctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccatgggagg actgggaggc 120
ttttacatgc ccaagaaggc caccgagctg aaacatctgc agtgtctgga ggaggagctg 180
aagcctctgg aagaggtgct caatctggcc cagagcaaga acttccatct gagacctaga 240
gatctgatca gcaacatcaa cgtgatcgtg ctggagctca agggcagcga gaccaccttc 300
atgtgcgagt acgccgacga gaccgccacc atcgtggagt ttctgaatag atggatcacc 360
ttctgccaga gcatcatcag cacactgacc ggcggaggcg gaagcgaaga ccaagtggac 420
cccagactga ttgacggaaa gtga 444
<210> 11
<211> 444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列)
<400> 11
gctcccacct ccagcagcac caagaagacc cagctccagc tggagcatct gctgctggat 60
ctgcagatga ttctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccatgcacgg actggacggc 120
tttggcatgc ccaagaaggc caccgagctg aaacatctgc agtgtctgga ggaggagctg 180
aagcctctgg aagaggtgct caatctggcc cagagcaaga acttccatct gagacctaga 240
gatctgatca gcaacatcaa cgtgatcgtg ctggagctca agggcagcga gaccaccttc 300
atgtgcgagt acgccgacga gaccgccacc atcgtggagt ttctgaatag atggatcacc 360
ttctgccaga gcatcatcag cacactgacc ggcggaggcg gaagcgaaga ccaagtggac 420
cccagactga ttgacggaaa gtga 444
<210> 12
<211> 444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列)
<400> 12
gctcccacct ccagcagcac caagaagacc cagctccagc tggagcatct gctgctggat 60
ctgcagatga ttctgaacgg catcaacaac ggaggaaacc ccatgcacgg actggacggc 120
tttggcatgc ccaagaaggc caccgagctg aaacatctgc agtgtctgga ggaggagctg 180
aagcctctgg aagaggtgct caatctggcc cagagcaaga acttccatct gagacctaga 240
gatctgatca gcaacatcaa cgtgatcgtg ctggagctca agggcagcga gaccaccttc 300
atgtgcgagt acgccgacga gaccgccacc atcgtggagt ttctgaatag atggatcacc 360
ttctgccaga gcatcatcag cacactgacc ggcggaggcg gaagcgaaga ccaagtggac 420
cccagactga ttgacggaaa gtga 444

Claims (17)

1.一种IL-2突变体，其特征在于，在人IL-2的基础上，将与IL2Rα结合相关的氨基酸位点进行替换、删除和添加中的一种或多种突变，获得与IL2Rα结合能力降低的IL-2突变体；其中，与IL2Rα结合相关的氨基酸位点为野生型IL-2的第30-75位。
2.如权利要求1所述的IL-2突变体，其特征在于，替换和添加选取突变后能使IL-2突变体结构趋于稳定和/或能量较小的氨基酸残基。
3.如权利要求1所述的IL-2突变体，其特征在于，对第35-45位中的一个或多个氨基酸进行替换、删除和添加中的一种或多种突变。
4.如权利要求3所述的IL-2突变体，其特征在于，对第35-37位、41-43位的氨基酸进行替换，对第38-40位的氨基酸进行删除。
5.如权利要求4所述的IL-2突变体，其特征在于，还对第45位的氨基酸进行替换。
6.如权利要求5所述的IL-2突变体，其特征在于，第35位氨基酸的替换为K35G或K35M；第36位氨基酸的替换为L36G或L36H；第37位氨基酸的替换为T37G；第41位氨基酸的替换为T41G或T41L；第42位氨基酸的替换为F42G或G42D；第43位氨基酸的替换为K43G；第45位氨基酸的替换为Y45G。
7.如权利要求1所述的IL-2突变体，其特征在于，还将第125位半胱氨酸突变为侧链较小的氨基酸。
8.如权利要求7所述的IL-2突变体，其特征在于，所述侧链较小的氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸。
9.如权利要求1所述的IL-2突变体，其特征在于，所述野生型IL-2的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
10.如权利要求1所述的IL-2突变体，其特征在于，所述IL-2突变体的氨基酸序列如SEQID NO.3-7所示。
11.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其编码如权利要求1～10中任一项所述的IL-2突变体。
12.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求11所述的一种分离的多核苷酸。
13.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求11所述的一种分离的多核苷酸。
14.一种组合物，其特征在于，包含如权利要求1～10中任一项所述的IL-2突变体以及药学可接受载体。
15.如权利要求1～10中任一项所述的IL-2突变体用于制备用于治疗疾病的药物或制剂中的用途。
16.如权利要求1～10中任一项所述的IL-2突变体在制备用于刺激个体的免疫***的组合物中的用途。
17.一种生成IL-2突变体的方法，其特征在于，所述方法包括在适合于表达所述IL-2突变体的条件下培养如权利要求13所述的宿主细胞。
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