KR20200078312A - 신규 면역 억제 인터루킨 2 (Interleukin 2) 아날로그 - Google Patents

신규 면역 억제 인터루킨 2 (Interleukin 2) 아날로그 Download PDF

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KR20200078312A
KR20200078312A KR1020190120725A KR20190120725A KR20200078312A KR 20200078312 A KR20200078312 A KR 20200078312A KR 1020190120725 A KR1020190120725 A KR 1020190120725A KR 20190120725 A KR20190120725 A KR 20190120725A KR 20200078312 A KR20200078312 A KR 20200078312A
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이효란
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허용호
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한미약품 주식회사
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Abstract

본 발명은 천연형에 비해 인터루킨 2 알파 수용체 결합력 및 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 변화된, 인터루킨 2 아날로그에 관한 것이다.

Description

신규 면역 억제 인터루킨 2 (Interleukin 2) 아날로그 {Novel immune suppressing IL-2 analogs}
본 발명은 신규한 인터루킨 2 아날로그에 관한 것이다.
인터루킨 2 (Interleukin 2)는 총 133개의 아미노산 잔기로 구성된 분자량 약 15 kDa의 중요한 면역 자극제로서, T 세포와 B 세포를 포함하는 면역 체계의 다양한 세포를 활성화시킨다. 인터루킨 2의 면역 자극제로서의 높은 효능은 암과 에이즈를 포함한 다양한 면역관련 병증을 치료하기 위해 사용할 수 있다 (대한민국 공개특허 제10-2017-0070091호). 현재 인터루킨 2 (Interleukin 2, 상표 명 Proleukin)는 전이성 신세포암 및 전이성 흑색종의 치료용으로 FDA 승인을 받은 의약이다. 그러나 높은 복용량의 인터루킨 2 요법과 연관된 심각한 독성 때문에 적용 가능한 환자가 제한되며, 실제로 적합한 환자의 소수에 대해서만 이 치료 요법을 수행하고 있다. 인터루킨 2에 연관된 독성은 심한 열, 메스꺼움, 구토, 혈관 누출(vascular leak), 심한 저혈압, 폐 부종, 및 간 손상을 일으키는 혈관 누출 증후군 (Vascular leak syndrome)을 포함한다.
인터루킨 2는 3가지 서브유닛의 수용체를 가지고 있다. 그 서브유닛은 알파 체인 (IL-2Rα, CD25), 베타 체인 (IL-2Rβ 또는 CD122) 및 감마 체인 (IL-2Rγ 또는 CD132)으로 이루어져 있고, 인터루킨 2가 수용체의 각 조합에 결합함으로써 그 의 다양한 발현적 기능을 발휘 할 수 있다. 단일의 인터루킨 2 알파 수용체는 낮은 친화성 인터루킨 2 수용체로 불리며, 신호전달에는 관여하지 않는다. 인터루킨 2 베타 및 감마 수용체의 복합체는 중간 친화성으로 인터루킨 2에 결합한다. 인터루킨 2 알파, 베타 및 감마 수용체의 복합체는 높은 친화성으로 인터루킨 2에 결합한다. 인터루킨 2 베타 및 감마 수용체의 복합체는 다중 신호전달 경로의 키나아제 활성화를 통한 효과적인 신호 변환에 필요하다. 특히 인터루킨 2 베타 및 감마 결합 수용체 는 CD8+ 세포 및 자연 살해(NK) 세포에서 두드러진다. 또한 높은 친화성의 인터루킨 2 알파, 베타 및 감마 수용체의 복합체는 보통 CD4+ T 조절 세포(Treg)뿐 만 아니라 최근 활성화된 T 세포에서 발견된다.
한편, 인터루킨 2의 다양한 면역관련 병증의 치료제로서의 가능성에도 불구하고, 독성 및 부작용을 감소시키면서도 복용량의 감소를 시킬 수 있는 약제의 존재가 미비한 상태로, 새롭고 향상된 약제에 관한 연구가 더욱 필요하다.
본 발명의 하나의 목적은 천연형 인터루킨 2와 비교하여 인터루킨 알파 수용체 및 베타 수용체에 대한 결합력이 변화된, 인터루킨 2 아날로그를 제공하는 것이다.
상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에 비하여 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력이 증가하고, 인터루킨 베타 수용체 결합력이 감소 또는 증가한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 인터루킨 2 아날로그를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 천연형 인터루킨 2에서 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함하는, 천연형 인터루킨 2와 비교하여 인터루킨 2의 인터루킨 2 알파 수용체 및 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 변화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양태는 신규한 인터루킨 2 아날로그이다. 상기 인터루킨 2 (interleukin 2, IL-2) 아날로그는 천연형에 비해 인터루킨 2 알파 수용체 결합력 및/또는 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 변화된, 인터루킨 아날로그이다.
하나의 구체예로서, 상기 결합력의 변화는 인터루킨 2 알파 수용체 결합력은 증가하고, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력은 감소 또는 증가한 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 인터루킨 2 베타 수용체 결합력의 감소 또는 증가는 천연형 인터루킨 2와 비교하여 결합력이 10% 내지 200%인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 하나 이상의 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변이가 일어난 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번, 61번, 62번, 68번 및 125번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 변이된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번, 61번, 62번, 68번 및 125번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환 또는 제거된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는, (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 변이된, 인터루킨 2 아날로그; (b) 천연형 인터루킨 2 중 61번 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된, 인터루킨 2 아날로그; (c) 천연형 인터루킨 2 중 62번 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된, 인터루킨 2 아날로그; (d) 천연형 인터루킨 2 중 68번 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된, 인터루킨 2 아날로그; 및 (e) 천연형 인터루킨 2 중 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된, 인터루킨 2 아날로그 중에서 선택된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 및 61번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 및 62번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; 및 (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 및 68번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그 중에서 선택된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 세린으로, 61번 아미노산이 아스파르트산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 세린으로, 61번 아미노산이 글루타민으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 세린으로, 62번 아미노산이 글루타민으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; 및 (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 세린으로, 68번 아미노산이 아스파르트산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그 중에서 선택된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 16, 18, 20 및 22로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는, 상기 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는, 분리된 핵산; 상기 핵산을 포함하는, 재조합 발현 벡터; 상기 벡터를 포함하는, 형질전환체이다.
본 발명을 구현하기 위한 또 하나의 양태는 상기 인터루킨 2 아날로그를 제조하는 방법이다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는, 천연형 인터루킨 2에서 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함하는, 천연형 인터루킨 2와 비교하여 인터루킨 2의 인터루킨 2 알파 수용체 및 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 변화시키는 방법이다.
하나의 구체예로서, 상기 결합력의 변화는 인터루킨 2 알파 수용체 결합력은 증가시키고, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력은 감소 또는 증가시키는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 변이는 1번, 61번, 62번, 68번 및 125번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 변이시키는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 변이는 (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번 및 61번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번 및 62번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; 또는 (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번 및 68번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 는 생체 내에서 인터루킨 2 알파 수용체 결합력 및/또는 베타 수용체 결합력이 천연형에 비해 변화된 아날로그로서, 다양한 용도로 사용될 수 있다.
도 1은 인터루킨 2 아날로그 정제 후 순도 분석 결과이다(RPC: RP-HPLC).
도 2는 인터루킨 2 아날로그의 인터루킨 2 알파 수용체의 결합력을 확인한 결과이다. (A)는 인터루킨 2 아날로그 1, (B)는 인터루킨 2 아날로그 2, (C)는 인터루킨 아날로그 3, (D)는 인터루킨 아날로그 4, 및 (E)는 인터루킨 아날로그 5이다.
도 3은 인터루킨 2 아날로그의 인터루킨 2 베타 수용체의 결합력을 확인한 결과이다. (A)는 인터루킨 2 아날로그 1, (B)는 인터루킨 2 아날로그 2, (C)는 인터루킨 아날로그 3, (D)는 인터루킨 아날로그 4, 및 (E)는 인터루킨 아날로그 5이다.
본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
본 명세서 전반을 통하여, 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재하였다.
알라닌 A 아르기닌 R
아스파라긴 N 아스파르트산D
시스테인 C 글루탐산 E
글루타민 Q 글리신 G
히스티딘 H 이소류신 I
류신 L 리신 K
메티오닌 M 페닐알라닌 F
프롤린 P 세린 S
트레오닌 T 트립토판 W
티로신 Y 발린 V
본 발명의 하나의 양태는 인터루킨 2 아날로그를 제공한다. 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에 비해 인터루킨 2 알파 수용체 결합력 및/또는 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 변화된 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 결합력의 변화는 천연형 인터루킨 2에 비하여 인터루킨 2 알파 수용체 결합력은 증가되고, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력은 감소 또는 증가한 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, "인터루킨 2 (interleukin 2, IL-2)"란 생체 내 면역 시스템에서 신호 전달을 하는 사이토카인의 일종으로 면역 조절제를 의미한다. 인터루킨 2는 일반적으로 약 15 kDa의 중요한 면역 자극제로 이의 서열 정보는 NCBI의 GenBank 등의 공지된 데이터 베이스에서 얻을 수 있다.
본 발명에서 용어, "인터루킨 2 아날로그"란 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변형된 것을 의미하며, 특히 본 발명에서는 천연형에 비해 인터루킨 2 수용체에 대한 결합력이 변화된 것으로, 알파 수용체에 대한 결합력이 증가되고/또는 베타 수용체에 대한 결합력이 감소 또는 증가한, 인터루킨 2의 아미노산이 변이된 인터루킨 2 아날로그일 수 있다.
상기 인터루킨 2 아날로그는 비자연적인(non-naturally occurring) 것일 수 있다.
상기 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 것이란 천연형 인터루킨 2에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것일 수 있다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번, 61번, 62번, 68번 및 125번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환 또는 결실된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 변이 위치 외에 당업계에 알려진, 펩타이드의 활성에 영향을 미치지 않으면서 펩타이드의 안정성 및 반감기 증가를 위해 수행될 수 있는 정도의 아미노산 잔기의 치환, 부가, 결실, 수식 등을 포함하는 인터루킨 2 펩타이드 역시 본 발명의 범주에 포함된다.
상기 천연형 인터루킨 2는 인간 인터루킨 2 일 수 있으며, 서열번호 23일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 천연형 인터루킨 2는 인간 인터루킨 2 이외에 상업적으로 구매 가능한 Proleukin® 일 수 있으며, 이는 본 발명의 인터루킨 아날로그 2와 인터루킨 2 알파 수용체 및 베타 수용체의 결합력의 비교 대상이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로 서열번호 14일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 인터루킨 2 아날로그는, (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 변이된, 인터루킨 2 아날로그; (b) 천연형 인터루킨 2 중 61번 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된, 인터루킨 2 아날로그; (c) 천연형 인터루킨 2 중 62번 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된, 인터루킨 2 아날로그; (d) 천연형 인터루킨 2 중 68번 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된, 인터루킨 2 아날로그; 및 (e) 천연형 인터루킨 2 중 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된, 인터루킨 2 아날로그 중 선택된 것일 수 있다.
또 하나의 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는, (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 및 61번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 및 62번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; 및 (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 및 68번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그 중에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 천연형 인터루킨 2에 비해 인터루킨 2 알파 수용체 및/또는 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 변화된 인터루킨 2 아날로그는 제한 없이 포함된다. 상기 결합력의 변화는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는, (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 세린으로, 61번 아미노산이 아스파르트산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 세린으로, 61번 아미노산이 글루타민으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 세린으로, 62번 아미노산이 글루타민으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; 및 (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 세린으로, 68번 아미노산이 아스파르트산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
또 하나의 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 16, 18, 20 및 22로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본원에서 '특정 서열번호로 구성되는 인터루킨 2 아날로그'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 인터루킨 2 아날로그와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
이상의 내용은 본 발명의 다른 구체예 혹은 다른 양태에도 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 위치에서의 아미노산이 변이된 인터루킨 2 아날로그는 인터루킨 2의 알파 수용체와의 결합력을 증가 및/또는 베타 수용체와의 결합력을 감소 또는 증가시켜 in vitro 활성을 변화시키는 새로운 인터루킨 2의 대체제로 이용될 수 있다.
또한, 인터루킨 2의 아날로그의 제조를 위한 이러한 변형은 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질, 예를 들어 측쇄 작용기의 변형, 분자 내 공유결합, 예컨대, 측쇄 간 고리 형성, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 인산화, 아미노헥산화, 바이오틴화 등과 같이 개질함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다.
또한, 천연형 인터루킨 2의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가된 것을 모두 포함한다.
상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하다.
아미노산 유도체도 마찬가지 방식으로 입수할 수 있는데, 그 예를 일부만 들자면 4-이미다조아세트산 (4-imidazoacetic acid) 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 (인터루킨 2 아날로그 펩타이드)는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 및/또는 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태일 수 있다.
특히, 화학적으로 합성한 펩타이드의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화 (acetylation) 및/또는 C-말단을 아미드화 (amidation)할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그는 펩타이드 형태인 바, 펩타이드 그 자체, 이의 염 (예컨대, 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함한다. 또한, 펩타이드는 약학적으로 허용되는 임의의 형태일 수 있다.
상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-P-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산，밴젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.
본 발명에서 천연형 인터루킨 2 수용체에 대한 어떠한 인터루킨 2 아날로그의 결합력이란 수용체에 대한 친화력을 측정하는 방법으로 공지의 다양한 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 그 예로, SPR(surface Plasmon resonance)를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력(100%)과 비교하여 약 101% 또는 그 이상, 약 150% 또는 그 이상, 약 200% 또는 그 이상, 약 250% 또는 그 이상, 약 300% 또는 그 이상, 약 350% 또는 그 이상, 약 400% 또는 그 이상, 약 450% 또는 그 이상, 약 500% 또는 그 이상, 약 550% 또는 그 이상, 약 600% 또는 그 이상, 약 650% 또는 그 이상, 약 700% 또는 그 이상, 약 750% 또는 그 이상, 약 800% 또는 그 이상, 약 850% 또는 그 이상, 약 900% 또는 그 이상, 약 950% 또는 그 이상, 약 1000% 또는 그 이상의 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력을 나타낼 수 있다. 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 인터루킨 2 아날로그의 천연형 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력은 천연형 인터루킨 2의 약 150% 내지 약 1000%인 것이 적절 적절하나 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2와 대비하여 강하면 본 발명의 범주에 속한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력(100%)과 비교하여 감소 또는 증가한 것일 수 있다. 상기 베타 수용체 결합력의 감소 또는 증가한 범위는 천연형 인터루킨 2와 비교하여 결합력이 10% 내지 200%인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
그 예로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력과 비교하여 감소된 것은, 99% 또는 그 이하, 약 95% 또는 그 이하, 약 90% 또는 그 이하, 약 85% 또는 그 이하, 약 80% 또는 그 이하, 약 75% 또는 그 이하, 약 70% 또는 그 이하, 약 65% 또는 그 이하, 약 60% 또는 그 이하, 약 55% 또는 그 이하, 약 50% 또는 그 이하, 약 45% 또는 그 이하, 약 40% 또는 그 이하, 약 35% 또는 그 이하, 약 30% 또는 그 이하, 약 25% 또는 그 이하, 약 20% 또는 그 이하, 약 15% 또는 그 이하, 약 10% 또는 그 이하의 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력을 나타낼 수 있다. 또 하나의 예로 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력과 비교하여 증가된 것은, 약 101% 또는 그 이상, 약 105% 또는 그 이상, 약 110% 또는 그 이상, 약 120% 또는 그 이상, 약 130% 또는 그 이상, 약 140% 또는 그 이상, 약 150% 또는 그 이상, 약 160% 또는 그 이상, 약 170% 또는 그 이상, 약 180% 또는 그 이상, 약 190% 또는 그 이상, 약 195% 또는 그 이상, 약 200% 또는 그 이상의 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력을 나타낼 수 있으나 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2와 대비하여 증가하면 본 발명의 범주에 속한다. 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 인터루킨 2 아날로그의 천연형 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력은 천연형 인터루킨 2의 약 10% 내지 약 200%인 것이 적절 적절하나 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2와 대비하여 감소하거나 증가한 것이면 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에 비해 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력이 증가되고, 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 감소 또는 증가된 것을 특징으로 한다.
본 발명이 구체적인 실시 형태에서는 본 발명의 인터루킨 2 아날로그를 제조하기 위하여, 천연형 인터루킨 2를 바탕으로 변이를 도입한 인터루킨 2 아날로그를 제조하였다.
구체적으로 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2의 1번째 아미노산인 알라닌을 제거하고 125번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환한 아날로그 1를 코딩하는 핵산서열인 서열번호 13인 인터루킨 2 del A1, C125S 아날로그를 코딩하는 핵산 서열을 백본으로 사용하였다.
나머지 인터루킨 2 아날로그는 아날로그 1번 서열을 포함하여, 천연형 인터루킨 2의 61번째 아미노산인 글루탐산을 아스파르트산으로 치환한 아날로그 2의 DNA 서열인 서열번호 15인 인터루킨 2 delA1, C125S, E61D 아날로그; 61번째 아미노산인 글루탐산을 글루타민으로 치환한 아날로그 3의 DNA 서열인 서열번호 17인 인터루킨 2 delA1, C125S, E61Q; 62번째 아미노산인 글루탐산을 아스파르트산으로 치환한 아날로그 4의 DNA 서열인 서열번호 19인 인터루킨 2 delA1, C125S,E62Q; 68번째 아미노산인 글루탐산을 아스파르트산으로 치환한 아날로그 5의 DNA 서열인 서열번호 21인 인터루킨 2 delA1, C125S, E68D의 아날로그를 제작 하였다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 상기 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 사용하기 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 핵산 구조물(construct)을 의미한다. 본 발명은 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그를 수득할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "형질전환(transformation)"는 DNA를 숙주세포 내로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.
본 발명에 적합한 숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(Sf9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 형질전환체를 이용하여 인터루킨 2 아날로그를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 하기 단계를 포함하는 상기 인터루킨 2 아날로그를 제조하는 방법을 제공한다:
a) 상기 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 배양하여 인터루킨 2 아날로그를 발현시키는 단계; 및
b) 발현된 인터루킨 2 아날로그를 분리 및 정제하는 단계.
본 발명에서 형질전환체의 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 숙주세포 배양의 요건을 충족해야 한다. 숙주세포의 성장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.
사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.
마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양 도중에 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예: 공기)를 주입한다.
본 발명에 따른 형질전환체의 배양은 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 또한 배양은 원하는 인터루킨 2 아날로그의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 지속되는데, 이러한 목적으로 배양은 보통 10 내지 160시간 동안 지속될 수 있다.
전술한 바와 같이 숙주세포에 따라 적절한 배양 조건을 조성해주면 본 발명에 따른 형질전환체는 인터루킨 2 아날로그를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 생산된 인터루킨 2 아날로그는 숙주세포의 세포질 내, 원형질막 공간(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.
숙주세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 적용할 수 있다.
본 발명의 구체예로서, 인터루킨 2 아날로그를 제조하는 방법은
(a) 상기 인터루킨 2 아날로그를 발현시키는 단계; 및
(b) 발현된 인터루킨 2 아날로그를 분리해 내는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예로써, 형질전환체로부터 봉입체 형태로 발현된 인터루킨 2 아날로그를 분리 및 정제하기 위하여 하기 단계를 추가적으로 포함할 수 있다:
b-1) 상기 a) 단계의 배양액으로부터 형질전환체를 수확하여 파쇄하는 단계;
b-2) 파쇄된 세포 용해물로부터 발현된 인터루킨 2 아날로그를 회수하여 리폴딩하는 단계; 및
b-3) 리폴딩된 인터루킨 2 아날로그를 크기 배제 크로마토그래피로 정제하는 단계.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 인터루킨 2 아날로그를 펩타이드 합성법에 의해 제조하는 방법을 제공한다. 이와 같은 펩타이드 합성은 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 서열이 제공되어 있는 바, 공지의 펩타이드 합성법을 이용해 제한없이 제조할 수 있다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그의 변이는 천연형 인터루킨 2 중 번, 61번, 62번, 68번 및 125번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 변이된 것일 수 있다. 이와 같은 인터루킨 2 아날로그는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는, 천연형 인터루킨 2에서 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함하는, 천연형 인터루킨 2와 비교하여 인터루킨 2의 인터루킨 2 알파 수용체 및/또는 인터루킨 2 베타 수용체를 결합력을 변화시는 방법이다. 상기 결합력의 변화는 인터루킨 2 알파 수용체 결합력은 증가시키고, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력은 감소 또는 증가하는 것일 수 있다.
인터루킨 2 아날로그, 결합력, 변이는 상기에서 설명한 바와 같다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 천연형 인터루킨 2 및 인터루킨 2 아날로그 발현 벡터의 제작
133개의 아미노산을 코딩하는 천연형 인터루킨 2 발현 벡터를 제작하기 위해, 보고된 인터루킨 2 서열 (NM_000586.3)을 바탕으로 합성한 인터루킨 2를 pET-22b 벡터 (Novagen)에 클로닝하였다. 아울러, 상기 인터루킨 2를 주형으로 하여 인터루킨 2의 아미노산을 변형시킨 신규한 인터루킨 2 아날로그를 제작하였다.
하기 표 1에 각각의 아미노산의 변화 서열 및 아날로그 이름을 나타냈다. 이들 인터루킨 2 아날로그들을 제작하기 위해 순방향 (F) 및 역방향 (R) 프라이머를 합성한 후 (표 2), PCR을 진행하여 각각의 아날로그 유전자를 증폭하였다.
표 2의 각각의 아날로그에 대한 프라이머 서열은 각각 순방향 및 역방향 프라이머를 나타낸다. 하기 표2의 볼드체는 변이 위치를 나타낸 것이다.
인터루킨 2 아날로그 종류와 변이 위치 및 그 변화 서열
아날로그 변이 위치 및 변화 서열
아날로그 #1 delA1, C125S
아날로그 #2 delA1, C125S, E61D
아날로그 #3 delA1, C125S, E61Q
아날로그 #4 delA1, C125S, E62Q
아날로그 #5 delA1, C125S, E68D
delA1은 인터루킨 2의 첫번째 아미노산인 알라닌을 결실시킨 것을 의미한다.
인터루킨 2 아날로그 증폭을 위한 프라이머
아날로그 서열 서열번호
아날로그 #1 F: CGCCATATGCCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAA 1
R: CGGGATCCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTT 2
F: AGATGGATTACCTTTAGTCAAAGCATCATCTCA 3
R: TGAGATGATGCTTTGACTAAAGGTAATCCATCT 4
아날로그 #2 F: CTTCAGTGTCTAGAAGACGAACTCAAACCTCTG 5
R: CAGAGGTTTGAGTTCGTCTTCTAGACACTGAAG 6
아날로그 #3 F: CTTCAGTGTCTAGAACAGGAACTCAAACCTCTG 7
R: CAGAGGTTTGAGTTCCTGTTCTAGACACTGAAG 8
아날로그 #4 F: CTTCAGTGTCTAGAAGAACAGCTCAAACCTCTG 9
R: CAGAGGTTTGAGCTGTTCTTCTAGACACTGAAG 10
아날로그 #5 F: CTCAAACCTCTGGAGGACGTGCTAAATTTAGCT 11
R: AGCTAAATTTAGCACGTCCTCCAGAGGTTTGAG 12
인터루킨 2 아날로그 증폭을 위한 PCR 조건은 95℃ 30초, 55℃에서 60초, 65℃에서 6.5분으로 이 과정을 16회 반복하였다. 원하는 부위의 아미노산이 정상적으로 바뀌어 있는지 여부를 확인하기 위해, 상기 조건에서 얻어진 돌연변이 (mutagenesis) 산물은 서열 분석을 수행하였으며, 각각의 인터루킨 2 아날로그들의 목적하는 변이 위치에 변이된 서열로 치환된 것을 확인하였다. 이렇게 얻어진 발현 벡터를 pET22b-인터루킨 2 아날로그 1 내지 5라 명명하였다.
하기 표 3에 각각의 인터루킨 2 아날로그 1 내지 5까지의 DNA 서열 및 단백질 서열을 나타냈다. 하기 표 3 내의 볼드체는 변이 위치를 나타낸 것이다.
인터루킨 2 아날로그 DNA 서열 및 단백질 서열
아날로그 서열 서열번호
아날로그 #1
 DNA CC
TACTTCAAGT TCTACAAAGA AAACACAGCT ACAACTGGAG CATTTACTGC TGGATTTACA GATGATTTTG AATGGAATTA ATAATTACAA GAATCCCAAA CTCACCAGGA TGCTCACATT TAAGTTTTAC ATGCCCAAGA AGGCCACAGA ACTGAAACAT CTTCAGTGTC TAGAAGAAGA ACTCAAACCT CTGGAGGAAG TGCTAAATTT AGCTCAAAGC AAAAACTTTC ACTTAAGACC CAGGGACTTA ATCAGCAATA TCAACGTAAT AGTTCTGGAA CTAAAGGGAT CTGAAACAAC ATTCATGTGT GAATATGCTG ATGAGACAGC AACCATTGTA GAATTTCTGA ACAGATGGAT TACCTTTAGT CAAAGCATCA TCTCAACACT GACTTGA		 13
단백질 PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT FKFYMPKKAT ELKHLQCLEE ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFSQSIIST LT 14
아날로그
#2 		DNA CC
TACTTCAAGT TCTACAAAGA AAACACAGCT ACAACTGGAG CATTTACTGC TGGATTTACA GATGATTTTG AATGGAATTA ATAATTACAA GAATCCCAAA CTCACCAGGA TGCTCACATT TAAGTTTTAC ATGCCCAAGA AGGCCACAGA ACTGAAACAT CTTCAGTGTC TAGAAGACGA ACTCAAACCT CTGGAGGAAG TGCTAAATTT AGCTCAAAGC AAAAACTTTC ACTTAAGACC CAGGGACTTA ATCAGCAATA TCAACGTAAT AGTTCTGGAA CTAAAGGGAT CTGAAACAAC ATTCATGTGT GAATATGCTG ATGAGACAGC AACCATTGTA GAATTTCTGA ACAGATGGAT TACCTTTAGT CAAAGCATCA TCTCAACACT GACTTGA		 15
단백질 PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT FKFYMPKKAT ELKHLQCLED ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFSQSIIST LT 16
아날로그 #3 DNA CC
TACTTCAAGT TCTACAAAGA AAACACAGCT ACAACTGGAG CATTTACTGC TGGATTTACA GATGATTTTG AATGGAATTA ATAATTACAA GAATCCCAAA CTCACCAGGA TGCTCACATT TAAGTTTTAC ATGCCCAAGA AGGCCACAGA ACTGAAACAT CTTCAGTGTC TAGAACAGGA ACTCAAACCT CTGGAGGAAG TGCTAAATTT AGCTCAAAGC AAAAACTTTC ACTTAAGACC CAGGGACTTA ATCAGCAATA TCAACGTAAT AGTTCTGGAA CTAAAGGGAT CTGAAACAAC ATTCATGTGT GAATATGCTG ATGAGACAGC AACCATTGTA GAATTTCTGA ACAGATGGAT TACCTTTAGT CAAAGCATCA TCTCAACACT GACTTGA		 17
단백질 PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT FKFYMPKKAT ELKHLQCLEQ ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFSQSIIST LT 18
아날로그 #4 DNA CC
TACTTCAAGT TCTACAAAGA AAACACAGCT ACAACTGGAG CATTTACTGC TGGATTTACA GATGATTTTG AATGGAATTA ATAATTACAA GAATCCCAAA CTCACCAGGA TGCTCACATT TAAGTTTTAC ATGCCCAAGA AGGCCACAGA ACTGAAACAT CTTCAGTGTC TAGAAGAACA GCTCAAACCT CTGGAGGAAG TGCTAAATTT AGCTCAAAGC AAAAACTTTC ACTTAAGACC CAGGGACTTA ATCAGCAATA TCAACGTAAT AGTTCTGGAA CTAAAGGGAT CTGAAACAAC ATTCATGTGT GAATATGCTG ATGAGACAGC AACCATTGTA GAATTTCTGA ACAGATGGAT TACCTTTAGT CAAAGCATCA TCTCAACACT GACTTGA		 19
단백질 PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT FKFYMPKKAT ELKHLQCLEE QLKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFSQSIIST LT 20
아날로그 #5 DNA CC
TACTTCAAGT TCTACAAAGA AAACACAGCT ACAACTGGAG CATTTACTGC TGGATTTACA GATGATTTTG AATGGAATTA ATAATTACAA GAATCCCAAA CTCACCAGGA TGCTCACATT TAAGTTTTAC ATGCCCAAGA AGGCCACAGA ACTGAAACAT CTTCAGTGTC TAGAAGAAGA CCTCAAACCT CTGGAGGAAG TGCTAAATTT AGCTCAAAGC AAAAACTTTC ACTTAAGACC CAGGGACTTA ATCAGCAATA TCAACGTAAT AGTTCTGGAA CTAAAGGGAT CTGAAACAAC ATTCATGTGT GAATATGCTG ATGAGACAGC AACCATTGTA GAATTTCTGA ACAGATGGAT TACCTTTAGT CAAAGCATCA TCTCAACACT GACTTGA		 21
단백질 PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT FKFYMPKKAT ELKHLQCLEE ELKPLEDVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFSQSIIST LT 22
실시예 2: 인터루킨 2 아날로그의 발현
상기 실시예 1에서 제조한 발현 벡터를 이용하여, T7 프로모터 조절하의 재조합 인터루킨 2 아날로그를 발현시켰다. 각각의 재조합 인터루킨 2 아날로그 발현 벡터로 발현 대장균 균주, E. coli BL21DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λ(DE3); 노바젠)을 형질 전환하였다. 형질전환 방법은 노바젠사에서 추천하는 방법을 이용하였다. 각 재조합 발현 벡터가 형질 전환된 각각의 단일 콜로니를 취하여, 암피실린(50㎍/ml)이 포함된 2X 루리아 브로스(Luria Broth) 배지에 접종하고, 37℃에서 15시간 동안 배양하였다. 재조합 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 2X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여, 각 1ml씩 cryo-튜브에 분주하고, -150℃에 보관하였다. 이를 재조합 단백질의 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.
재조합 인터루킨 2 아날로그들의 발현을 위하여, 각 세포 스톡 1 바이알(vial)을 녹여 500 ml의 2X LB에 접종하고, 37℃에서 14 ~ 16시간 동안 진탕 배양하였다. OD.600 nm의 값이 4.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 5 L 발효기(Bioflo-320, NBS, 미국)를 이용하여, 종 배양액을 1.6 L의 발효 배지에 접종하고, 초기 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 37℃, 공기량 2.0 L/min(1vvm), 교반 속도 650 rpm 및 30% 암모니아수를 사용하여, pH 6.70으로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가 배지(feeding solution)을 첨가하여 유가배양을 진행하였다. 균주의 성장은 OD 값에 의해 모니터링하고, OD 값 70 이상에서 최종 농도 50 0μM의 IPTG를 도입하였다. 배양은 IPTG 도입 후 약 23~25시간까지 더 진행하였으며, 배양 종료 후 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수확하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 3: 인터루킨 2 아날로그의 추출 및 재접힘(refolding)
상기 실시예 2에서 얻은 인터루킨 2 아날로그 발현 대장균으로부터 인터루킨 2 아날로그를 가용성 형태로 바꾸기 위해 세포를 파쇄하고 재접힘하였다. 배양액 100 mL 분량에 해당하는 세포 펠렛을 1 - 200 mL의 파쇄 완충 용액 (20 mM Tris-HCl pH 9.0, 1 mM EDTA pH 9.0, 0.2 M NaCl, 0.5% Triton X-100)에 부유시킨 후, 미세용액화(Microfludizer)를 이용하여 15,000 psi로 재조합 대장균을 파쇄하였다. 13,900 g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 버리고, 400 mL의 첫번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH9.0)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 400 mL의 두번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 2% Triton X-100)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 400 mL의 세번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 1% sodium deoxycholorate)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 400 mL의 네번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 1 M NaCl)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 세척된 대장균 봉입체 (inclusion body) 펠렛을 수득하였다. 세척된 봉입체 펠렛을 400 mL의 가용/환원화 완충액 (6 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA pH 9.0, 50 mM DTT)에 재부유하여 50℃에서 30분 동안 교반하였다. 가용/환원된 인터루킨 2 아날로그에 증류수 100 mL를 넣어 6 M Guanidine을 4.8 M Guanidine으로 희석한 후 13,900 g에서 30분간 원심분리하여 펠렛은 버리고 용액만 수득하였다. 희석된 용액에 증류수 185.7 mL를 추가로 넣어 4.8 M Guanidine을 3.5 M Guanidine으로 희석한 후 100% acetic acid를 이용하여 pH를 5.0로 맞추었다. pH 조정된 용액을 상온에서 1시간 교반하였다. 불순물이 침전된 용액은 13,900 g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 마지막 세척 완충 용액 (3.5 M Guanidine, 20 mM Sodium Acetate pH 5.0, 5 mM DTT)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 세척된 인터루킨 2 아날로그를 400 mL의 재접힘 완충 용액 (6 mM Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM CuCl2)으로 용해시킨다. 혼합용액을 4℃에서 15 - 24 시간 동안 교반함으로서 재접힘 과정을 수행하였다.
실시예 4: 크기 배제 컬럼 크로마토그래피
상기 실시예 3에서 얻은 인터루킨 2 아날로그 재접힘 용액을 크기 배제 컬럼에 적용하여 정제하기 위하여 1 mL이하로 농축하였다. 컬럼은 재접힘 용액 도입 전 완충 용액 (2 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0)으로 평형화하였고, 재접힘 용액 도입 후 완충 용액 흘려주어 용출하였다. 용출된 시료는 Guanidine을 포함하고 있어 안정화 용액 (10 mM Sodium Acetate pH 4.5, 5% Trehalose)으로 바꿔준 후 RP-HPLC, peptide mapping 분석을 통해 순도를 측정하였다 (도 1).
실시예 5: 인터루킨 2 아날로그의 수용체 결합력 평가
상기 실시예 4에서 얻은 인터루킨 2 아날로그들의 인터루킨 2 알파 수용체와 베타 수용체 각각의 수용체 결합력을 측정하기 위하여 surface plasmon resonance (SPR, BIACORE T200, GE healthcare)을 사용하였다.
먼저 CM5칩(GE healthcare사)에 아민 결합법(amine coupling)을 통해 항 인간 면역글로블린 항체(Abcam사, #ab97221)를 약 5,000 RU (resonance unit)만큼 고정화한 후, 항원 항체 결합 반응을 이용하여 인간 면역글로블린 Fc부위가 결합된 인터루킨 2 알파 수용체(SYMANSIS사, #4102H) 또는 인터루킨 2 베타 수용체(SYMANSIS사, #4122H)를 각각 면역글로블린 항체에 결합시켜 최종 고정화 하였다. 그 다음으로 상기에서 재조한 재조합 인터루킨 2 아날로그들을 농도별로 희석하고 인터루킨 2 수용체가 최종 고정된 CM5칩에 흘려주어 각 인터루킨 2 수용체의 결합력을 측정하였다. 결합력은 결합 속도(Ka)와 해리 속도(Kd)를 이용하여 측정하였으며, 10 uL/분의 유속으로 인터루킨 2 아날로그들을 3분간 흘려 결합 속도를 측정하고, 동일한 시간과 유속으로 실험 버퍼만 흘려 주어 각 인터루킨 2 수용체로부터의 해리 속도를 측정하였다. 측정이 완료되면, Biaevaluation 프로그램에서 1:1 binding fitting model에 따라 수용체의 결합력 평가를 진행하였다.
시험 결과(도 2, 도 3 및 표 4)에서 명시된 바와 같이 인터루킨 2 아날로그 중 아날로그 2번, 3번, 4번, 5번의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력은 대조군으로 사용한 천연형 인터루킨 2 (아날로그 1)에 비하여 높게 측정되었으며, 반면 위의 2번, 3번, 4번, 5번 물질은 인터루킨 2 베타 수용체에 대하여 천연형 인터루킨 2에 비하여 증가 또는 감소된 결합력이 확인되었다. 이를 통해 인터루킨 2의 61번, 및/또는 62번 및/또는 68번 아미노산 서열이 인터루킨 2 알파 또는 베타 수용체의 결합에 영향력이 있음을 확인하였다. 또한, 이는 해당 아미노산의 서열을 치환 함으로써 인터루킨 2 수용체의 결합력을 변화시킬 수 있음을 시사하는 바이다.
인터루킨 2 아날로그의 인터루킨 2 알파 또는 베타 수용체 결합력
인터루킨 2 수용체 시험 물질 Ka
(1/MS, X105)		 Kd
(1/s, 10-3)		 KD
(nM)
알파 수용체 천연형 IL-2 41.2 ± 5.2 70.2 ± 6.2 17.1 ± 0.7
아날로그 02 85.3 ± 22.8 60.0 ± 14.1 7.1 ± 0.2
아날로그 03 94.2 ± 109.9 206.5 ± 128.0 54.3 ± 43.6
아날로그 04 0.4 ± 0.0 21.4 ± 3.0 478.7 ± 57.5
아날로그 05 101.5 ± 15.0 26.3 ± 3.4 2.6 ± 0.0
베타 수용체 천연형 IL-2 n.a n.a 242.3 ± 27.6
아날로그 02 n.a n.a 124.9 ± 5.1
아날로그 03 n.a n.a 108.1 ± 94.0
아날로그 04 n.a n.a 533.4 ±166.9
아날로그 05 n.a n.a 1124.2 ± 2.6
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> Novel immune suppressing IL-2 analogs <130> KPA181571-KR-P1 <150> KR 10-2018-0167797 <151> 2018-12-21 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer of analog 1 <400> 1 cgccatatgc ctacttcaag ttctacaaag aaaa 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer of analog 1 <400> 2 cgggatcctc aagtcagtgt tgagatgatg cttt 34 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer of analog 1 <400> 3 agatggatta cctttagtca aagcatcatc tca 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer of analog 1 <400> 4 tgagatgatg ctttgactaa aggtaatcca tct 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer of analog 2 <400> 5 cttcagtgtc tagaagacga actcaaacct ctg 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer of analog 2 <400> 6 cagaggtttg agttcgtctt ctagacactg aag 33 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial 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acatgcccaa gaaggccaca gaactgaaac atcttcagtg tctagaagaa 180 gaactcaaac ctctggagga agtgctaaat ttagctcaaa gcaaaaactt tcacttaaga 240 cccagggact taatcagcaa tatcaacgta atagttctgg aactaaaggg atctgaaaca 300 acattcatgt gtgaatatgc tgatgagaca gcaaccattg tagaatttct gaacagatgg 360 attaccttta gtcaaagcat catctcaaca ctgacttga 399 <210> 14 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 1 <400> 14 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn 20 25 30 Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys 35 40 45 Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro 50 55 60 Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg 65 70 75 80 Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys 85 90 95 Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 100 105 110 Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile 115 120 125 Ser Thr Leu Thr 130 <210> 15 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 2 <400> 15 cctacttcaa gttctacaaa gaaaacacag ctacaactgg agcatttact gctggattta 60 cagatgattt tgaatggaat taataattac aagaatccca aactcaccag gatgctcaca 120 tttaagtttt acatgcccaa gaaggccaca gaactgaaac atcttcagtg tctagaagac 180 gaactcaaac ctctggagga agtgctaaat ttagctcaaa gcaaaaactt tcacttaaga 240 cccagggact taatcagcaa tatcaacgta atagttctgg aactaaaggg atctgaaaca 300 acattcatgt gtgaatatgc tgatgagaca gcaaccattg tagaatttct gaacagatgg 360 attaccttta gtcaaagcat catctcaaca ctgacttga 399 <210> 16 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 2 <400> 16 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn 20 25 30 Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys 35 40 45 Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Lys Pro 50 55 60 Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His 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tttaagtttt acatgcccaa gaaggccaca gaactgaaac atcttcagtg tctagaagaa 180 gacctcaaac ctctggagga agtgctaaat ttagctcaaa gcaaaaactt tcacttaaga 240 cccagggact taatcagcaa tatcaacgta atagttctgg aactaaaggg atctgaaaca 300 acattcatgt gtgaatatgc tgatgagaca gcaaccattg tagaatttct gaacagatgg 360 attaccttta gtcaaagcat catctcaaca ctgacttga 399 <210> 22 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 5 <400> 22 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn 20 25 30 Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys 35 40 45 Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro 50 55 60 Leu Glu Asp Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg 65 70 75 80 Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys 85 90 95 Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 100 105 110 Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile 115 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Claims (16)

  1. 천연형에 비해 인터루킨 2 알파 수용체 결합력 및 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 변화된, 인터루킨 2 아날로그로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 하나 이상의 아미노산이 변이된, 인터루킨 2 아날로그.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합력의 변화는 인터루킨 2 알파 수용체 결합력은 증가되고, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력은 감소 또는 증가된 것인, 인터루킨 2 아날로그.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인터루킨 2 베타 수용체 결합력의 감소 또는 증가는 천연형 인터루킨 2와 비교하여 결합력이 10% 내지 200%인 것인, 인터루킨 2 아날로그.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변이는 천연형 인터루킨 2 중 하나 이상의 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변이인, 인터루킨 2 아날로그.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번, 61번, 62번, 68번 및 125번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된 것인, 인터루킨 2 아날로그.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 하기 아날로그 중 어느 하나인 것인 인터루킨 2 아날로그:
    (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 변이된, 인터루킨 2 아날로그;
    (b) 천연형 인터루킨 2 중 61번 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된, 인터루킨 2 아날로그;
    (c) 천연형 인터루킨 2 중 62번 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된, 인터루킨 2 아날로그;
    (d) 천연형 인터루킨 2 중 68번 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된, 인터루킨 2 아날로그; 및
    (e) 천연형 인터루킨 2 중 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된, 인터루킨 2 아날로그.
  7. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 하기 아날로그 중 어느 하나인 것인 인터루킨 2 아날로그:
    (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 및 61번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 및 62번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; 및
    (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 및 68번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 하기 아날로그 중 어느 하나인 것인 인터루킨 2 아날로그:
    (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 세린으로, 61번 아미노산이 아스파르트산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 세린으로, 61번 아미노산이 글루타민으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 세린으로, 62번 아미노산이 글루타민으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; 및
    (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 세린으로, 68번 아미노산이 아스파르트산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그.
  9. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 16, 18, 20 및 22로 이루어진 군에서 선택된 것인, 인터루킨 2 아날로그.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는, 분리된 핵산.
  11. 제10항에 따른 핵산을 포함하는, 재조합 발현 벡터.
  12. 제11항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는, 인간을 제외한 형질전환체.
  13. 천연형 인터루킨 2에서 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함하는, 천연형 인터루킨 2와 비교하여 인터루킨 2의 인터루킨 2 알파 수용체 및 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 변화시키는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 결합력의 변화는 인터루킨 2 알파 수용체 결합력은 증가시키고, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력은 감소 또는 증가시키는 것인, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 변이는 천연형 인터루킨 2 중 1번, 61번, 62번, 68번 및 125번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 변이시키는 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 변이는
    (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번 및 61번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나;
    (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번 및 62번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; 또는
    (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번 및 68번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 것인, 방법.
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