ES2800330T3 - Composiciones que comprenden Anticuerpos anti-IGF-1R y Métodos para obtener dichos Anticuerpos - Google Patents

Abstract

Una proteína de unión a antígeno, en donde dicha proteína de unión a antígeno (a) comprende una combinación L16/H16 de un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en donde dicho dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32; y dicho dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 136; o (b) comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende i. la secuencia CDR1 de los restos 24 a 39 de la SEQ ID NO: 32; y ii. la secuencia CDR2 de los restos 55 a 61 de la SEQ ID NO: 32; y; iii. la secuencia CDR3 de los restos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 32; y un dominio variable de cadena pesada que comprende i. la secuencia CDR1 de los restos 31 a 36 de la SEQ ID NO: 136; y ii. la secuencia CDR2 de los restos 51 a 66 de la SEQ ID NO: 136; y; iii. la secuencia CDR3 de los restos 99 a 108 de la SEQ ID NO: 136; en donde dicha proteína de unión a antígeno se une al IGF-1R humano.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden Anticuerpos anti-IGF-1 R y Métodos para obtener dichos Anticuerpos Referencia a solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° de Ser. 60/638.961, presentada el 22 de diciembre de 2004

Campo de la invención

Esta solicitud proporciona composiciones y métodos relacionados con anticuerpos antirreceptor de IGF-1.

Antecedentes de la invención

Los factores de crecimiento similares a la insulina 1 y 2 (IGF-1 e IGF-2, respectivamente) promueven la diferenciación y proliferación de una amplia variedad de tipos de células de mamíferos.

IGF-1 e IGF-2 circulan ampliamente por todo el cuerpo en el plasma. Ejercen sus efectos sobre las células mediante la unión y activación del receptor de IGF-1 (IGF-1 R). IGF-1 R es un miembro de la familia de receptores de factores de crecimiento tirosina quinasa. Su secuencia de aminoácidos es aproximadamente un 70 % idéntica a la del receptor de insulina.

Las actividades anormales de IGF-1, IGF-2 y/o IGF-1R están asociadas con una serie de afecciones médicas, incluyendo diversos tipos de cáncer, defectos de crecimiento (p. ej., acromegalia, gigantismo y baja estatura), psoriasis, ateroesclerosis, reestenosis de músculo liso después de angioplastia de los vasos sanguíneos, diabetes, proliferación microvascular, neuropatía, pérdida de masa muscular y osteoporosis.

Se han empleado varios enfoques para interferir con la actividad y/o expresión del IGF-1 R in vitro e in vivo para demostrar el papel crítico de este receptor en la biología de las células tumorales. Se ha mostrado, por ejemplo, que los anticuerpos o los anticuerpos monocatenarios dirigidos a IGF-1 R inhiben la proliferación de varias líneas celulares tumorales in vitro e in vivo, p. ej., en modelos de xenoinjertos, y conducen a una regulación negativa de los receptores de la superficie celular. Por ejemplo, los documentos WO 2004/083248 y WO 2004/087756 divulgan anticuerpos humanos anti-IGF-1 R y métodos para usar los anticuerpos para tratar cánceres de animales.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 proporciona secuencias de nucleótidos que codifican los dominios variables de cadena ligera L1 a L52 y los dominios variables de cadena pesada H1 a H52.

La Figura 2 proporciona secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena ligera L1 a L52. Se indican las regiones CDR y FR.

La Figura 3 proporciona secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada H1 a H52. Se indican las regiones CDR y FR.

La Figura 4 proporciona secuencias de aminoácidos de las regiones CDR1 de la cadena ligera de los dominios variables de cadena ligera L1 a L52. También se proporcionan secuencias consenso para grupos de secuencias CDR relacionadas.

La Figura 5 proporciona secuencias de aminoácidos de las regiones CDR2 de la cadena ligera de los dominios variables de cadena ligera L1 a L52. También se proporcionan secuencias consenso para grupos de secuencias CDR relacionadas.

La Figura 6 proporciona secuencias de aminoácidos de las regiones CDR3 de la cadena ligera de los dominios variables de cadena ligera L1 a L52. También se proporcionan secuencias consenso para grupos de secuencias CDR relacionadas.

La Figura 7 proporciona secuencias de aminoácidos de las regiones CDR1 de la cadena pesada de los dominios variables de cadena pesada H1 a H52. También se proporcionan secuencias consenso para grupos de secuencias CDR relacionadas.

La Figura 8 proporciona secuencias de aminoácidos de las regiones CDR2 de la cadena pesada de los dominios variables de cadena pesada H1 a H52. También se proporcionan secuencias consenso para grupos de secuencias CDR relacionadas.

La Figura 9 proporciona secuencias de aminoácidos de las regiones CDR3 de la cadena pesada de los dominios variables de cadena pesada H1 a H52. También se proporcionan secuencias consenso para grupos de secuencias CDR relacionadas.

La Figura 10 proporciona la secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de IGF-1 R humano fusionado a una región Fc de IgG1 humana (subrayada) con un sitio de escisión intermedio de caspasa-3 (negrita).

La Figura 11 proporciona la secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del receptor de insulina humana fusionado a una región Fc de IgG1 humana (subrayado).

La Figura 12 proporciona la secuencia de proteínas de un dominio extracelular de IGF-1R humano (incluido el péptido señal) fusionado en el extremo C con avidina de pollo. El iniciador encontrado en el ECD de IGF-1R se designa posición 1 en esta figura.

La Figura 13 proporciona la secuencia de polipéptidos de una región constante de anticuerpo de cadena ligera kappa humana y una región constante de anticuerpo de cadena pesada de IgG1.

La Figura 14 proporciona un gráfico que ilustra que cuatro anticuerpos presentados en fagos se unen significativamente mejor a una molécula ⁱGF-1 R-Fc que a un Fc de receptor de insulina o a un Fc murino.

La Figura 15 proporciona gráficos que ilustran la capacidad de ciertos anticuerpos para competir por la unión a IGF-1 R con IGF-1 e IGF-2.

La Figura 16 proporciona gráficos que ilustran la capacidad de ciertos anticuerpos para inhibir el crecimiento de células 32D hu |Gf-1 R+IRS-1.

La Figura 17 proporciona gráficos que ilustran la capacidad de ciertos anticuerpos para inhibir el crecimiento de células Balb/C 3T3 hu IGF-1 R.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno, en donde dicha proteína de unión a antígeno comprende:

(a) una combinación L16/H16 de un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en donde dicho dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32; y dicho dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 136; o (b) un dominio variable de cadena ligera que comprende: i. la secuencia CDR1 de los restos 24 a 39 de la SEQ ID NO: 32; ii. la secuencia CDR2 de los restos 55 a 61 de la SEQ ID NO: 32; y; iii. la secuencia CDR3 de los restos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 32; y un dominio variable de cadena pesada que comprende: i. la secuencia CDR1 de los restos 31 a 36 de la SEQ ID NO: 136; ii. la secuencia CDR2 de los restos 51 a 66 de la SEQ ID NO: 136; y iii. la secuencia CDR3 de los restos 99 a 108 de la SEQ ID NO: 136; en donde dicha proteína de unión a antígeno se une al IGF-1 R humano.

En una realización, la proteína de unión a antígeno comprende además: a. la secuencia constante de la cadena ligera kappa de la figura 13, b. la secuencia constante de la cadena pesada de IgG1 de la Figura 13, o c. la secuencia constante de la cadena ligera kappa de la Figura 13 y la secuencia constante de la cadena pesada de IgG1 de la Figura 13. En otra realización, la proteína de unión a antígeno, cuando se une a IGF-1R: a. inhibe IGF-1R; b. compite de manera cruzada con un anticuerpo de referencia para la unión a IGF-1 R; c. se une al mismo epítopo de IGF-1 R que dicho anticuerpo de referencia; d. se une a lGF-1 R con sustancialmente la misma Kd que dicho anticuerpo de referencia; o e. se une a IGF-1R con sustancialmente la misma constante de disociación que dicho anticuerpo de referencia; en donde dicho anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada que es L16H16. En otra realización, la proteína de unión a antígeno tiene una o más de las siguientes propiedades: (a) cuando se une a IGF-1R humano, inhibe la unión de IGF-1 y/o IGF-2 a dicho IGF-1R humano; (b) inhibe el crecimiento de una célula cancerosa en más de aproximadamente el 80 % en presencia de un estimulante del crecimiento seleccionado del grupo que consiste en suero, IGF-1 e IGF-2, en donde dicha célula cancerosa de acuerdo con este aspecto de la invención puede ser una célula de cáncer de mama humana MCF-7; (c) se une a IGF-1R humano con una selectividad que es al menos cincuenta veces mayor que su selectividad para el receptor de insulina humano; (d) inhibe el crecimiento tumoral in vivo; (e) inhibe la fosforilación de tirosina mediada por IGF-1 R; (f) se une específicamente a IGF-1 R de un primate no humano, un mono cynomolgus, un chimpancé, un mamífero no primate, un roedor, un ratón, una rata, un hámster, una cobaya, un gato o un perro. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende: a. un anticuerpo humano; b. un anticuerpo humanizado; c. un anticuerpo quimérico; d. un anticuerpo monoclonal; e. un anticuerpo policlonal; f. un anticuerpo recombinante; g. un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno; h. un anticuerpo monocatenario; i. un diacuerpo; j. un triacuerpo; k. un tetracuerpo; l. un fragmento Fab; m. un fragmento F(ab ')2; n. un anticuerpo de dominio; o. un anticuerpo IgD; p. un anticuerpo IgE; q. un anticuerpo IgM; r. un anticuerpo IgG1; s. un anticuerpo IgG2; t. un anticuerpo IgG3; u. un anticuerpo IgG4; o v. un anticuerpo IgG4 que tiene al menos una mutación en una región bisagra que alivia la tendencia a formar un enlace disulfuro dentro de la cadena H.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica dicha proteína de unión a antígeno. En una realización, dicho polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico de dominio variable de cadena ligera de la Figura 1 y/o una secuencia de ácido nucleico de dominio variable de cadena pesada de la Figura 1. En otra realización, un plásmido comprende dicho polinucleótido. En otra realización, dicho plásmido es un vector de expresión. En otra realización, una célula comprende dicho polinucleótido. En otra realización, un cromosoma de dicha célula comprende dicho polinucleótido. En otra realización, dicha célula es un hibridoma. En otra realización, un vector de expresión comprende dicho polinucleótido. En otra realización, dicha célula es una célula CHO. En otra realización, la presente invención proporciona un método para preparar una proteína de unión a antígeno que se une a IGF-1 R humano, que comprende incubar dicha célula en condiciones que le permiten expresar dicha proteína de unión a antígeno.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión a antígeno. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno y una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una afección en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto dicha composición farmacéutica, en donde dicha afección es tratable reduciendo la actividad de IGF-1R en dicho sujeto. En otra realización, dicho sujeto es un ser humano. En otra realización, dicha afección es una afección cancerosa. En otra realización, dicha afección es mieloma múltiple, un tumor líquido, cáncer de hígado, un trastorno del timo, una enfermedad autoinmunitaria mediada por linfocitos T, un trastorno endocrinológico, isquemia o un trastorno neurodegenerativo, en donde opcionalmente, dicho tumor líquido se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfocítica aguda (LLA) y leucemia mielógena crónica (LMC); en donde opcionalmente, dicho cáncer de hígado se selecciona del grupo que consiste en hepatoma, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, angiosarcomas, hemangiosarcomas, hepatoblastoma; en donde opcionalmente, dicho trastorno de timo se selecciona del grupo que consiste en timoma y tiroiditis; en donde opcionalmente, dicha enfermedad autoinmunitaria mediada por linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en Esclerosis Múltiple, Artritis Reumatoide, Lupus Eritematoso Sistémico (LES), enfermedad de Grave, Tiroiditis de Hashimoto, Miastenia Grave, Tiroiditis autoinmunitaria, Enfermedad de Bechet; en donde opcionalmente, dicho trastorno endocrinológico se selecciona del grupo que consiste en Diabetes de Tipo II, hipertiroidismo, hipotiroidismo, tiroiditis, hiperadrenocorticismo e hipoadrenocorticismo; en donde opcionalmente, dicha isquemia es isquemia posterior a infarto de miocardio; o en donde opcionalmente, dicho trastorno neurodegenerativo es la Enfermedad de Alzheimer. En otra realización, dicha afección se selecciona del grupo que consiste en acromegalia, cáncer de vejiga, tumor de Wilm, cáncer de ovarios, cáncer pancreático, hiperplasia benigna de próstata, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de hueso, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de cuello de útero, sarcoma sinovial, diarrea asociada a carcinoide metastásico, tumores secretores de péptidos intestinales vasoactivos, gigantismo, psoriasis, ateroesclerosis, restenosis del músculo liso de los vasos sanguíneos, proliferación microvascular inapropiada, glioblastoma, meduloblastoma, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer oral, leucoplasia oral, neoplasia intraepitelial de próstata, cáncer de ano, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hueso, cáncer metastásico, policitemia rubra vera, una afección benigna relacionada con el estrés oxidativo, retinopatía del prematuro, síndrome de la dificultad respiratoria agua, una sobredosis de acetaminofeno, displasia broncopulmonar, fibrosis quística, fibrosis pulmonar y retinopatía diabética. En otra realización, la proteína de unión a antígeno o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una de las realizaciones descritas anteriormente comprende además administrar a dicho sujeto un segundo tratamiento. En otra realización, dicho segundo tratamiento se administra a dicho sujeto antes y/o simultáneamente con y/o después de que dicha composición farmacéutica se administre a dicho sujeto. En otra realización, dicho segundo tratamiento comprende tratamiento con radiación, cirugía o administración de una segunda composición farmacéutica, en donde opcionalmente, dicha segunda composición farmacéutica comprende un agente seleccionado del grupo que consiste en un corticosteroide, un antiemético, clorhidrato de ondansetrón, clorhidrato de granisetrón, metroclopramida, domperidona, haloperidol, ciclizina, lorazepam, proclorperazina, dexametasona, levomepromazina, tropisetrón, una vacuna contra el cáncer, un agente inhibidor de GM-CSF, una vacuna de ADN de GM-CSF, una vacuna basada en células, una vacuna de células dendríticas, una vacuna viral recombinante, una vacuna de proteína de choque térmico (HSP), una vacuna tumoral alogénica, una vacuna tumoral autóloga, un analgésico, ibuprofeno, naproxeno, trisalicilato de magnesio de colina, un clorhidrato de oxicodona, un agente antiangiogénico, un agente antivascular, bevacizumab, un anticuerpo anti-VEGF, un anticuerpo del receptor de anti-VEGF, un fragmento de receptor de VEGF soluble, un anticuerpo anti-TWEAK, un anticuerpo del receptor de anti-TWEAK, un fragmento del receptor de TWEAK soluble, AMG 706, AMG 386, un agente antiproliferativo, un inhibidor de la proteína farnesil transferasa, un inhibidor de avp3, un inhibidor de avp5, un inhibidor de p53, un inhibidor del receptor Kit, un inhibidor del receptor ret, un inhibidor de PDGFR, un inhibidor de la secreción de la hormona del crecimiento, un inhibidor de la angiopoyetina, un agente inhibidor de macrófagos infiltrante del tumor, un agente inhibidor de c-fms, un anticuerpo anti-c-fms, un agente inhibidor de CSF-1, un anticuerpo anti-CSF-1, un fragmento de c-fms soluble, pegvisomant, gemcitabina, panitumumab, irinotecán y SN-38. En otra realización, la proteína de unión a antígeno o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una de las realizaciones descritas anteriormente comprende además administrar a dicho sujeto un tercer tratamiento, en donde opcionalmente, dicha afección es un cáncer, dicho segundo tratamiento comprende administrar panitumumab y dicho tercer tratamiento comprende administrar gemcitabina.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno o una composición farmacéutica para su uso en un método para disminuir la actividad de IGF-1 R en un sujeto que lo necesite.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno o una composición farmacéutica para su uso en un método para disminuir la señalización de IGF-1 R en un sujeto que lo necesite.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno o una composición farmacéutica para su uso en un método para inhibir la unión de IGF-1 y/o IGF-2 a IGF-1R en un sujeto que lo necesite. El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada de la invención

Ahora se hará referencia en detalle a diferentes realizaciones ejemplares, ilustrándose ejemplos de estas en las figuras adjuntas. Referencias a "realizaciones", "aspectos"o "artículos"en lo sucesivo en el presente documento se refieren a realizaciones, aspectos y elementos descritos en el presente documento o descritos y reivindicados en el presente documento. Debe entenderse que la siguiente descripción detallada se proporciona para dar al lector una comprensión más completa de ciertas realizaciones, características y detalles de aspectos de la invención, y no deben interpretarse como una limitación del alcance de la invención.

La presente divulgación proporciona composiciones, kits y métodos relacionados con las moléculas que se unen al Receptor del Factor de Crecimiento Similar a la Insulina ("IGF-1R''), incluidas las moléculas que agonizan o antagonizan el IGF-1R, tal como los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y derivados de anticuerpos anti-IGF-1 R, p. ej., anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpos anti-IGF-1R antagonistas. También se proporcionan ácidos nucleicos, y derivados y fragmentos de los mismos, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica todo o una porción de un polipéptido que se une a ⁱGF-1 R, p. ej., un ácido nucleico que codifica todo o parte de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-IGF-1 R, plásmidos y vectores que comprenden tales ácidos nucleicos, y células o líneas celulares que comprenden tales ácidos nucleicos y/o vectores y plásmidos. Los métodos proporcionados incluyen, por ejemplo, métodos para elaborar, identificar o aislar moléculas que se unen a IGF-1 R, como los anticuerpos anti-IGF-1 R, métodos para determinar si una molécula se une a IGF-1 R, métodos para determinar si una molécula agoniza o antagoniza IGF-1 R y métodos para preparar composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden una molécula que se une a IGF-1 R. También se proporcionan proteínas de unión a antígeno o composiciones para su uso en métodos para administrar una molécula que se une IGF-1 R a un sujeto, por ejemplo, por ejemplo, métodos para tratar una afección mediada por IGF-1 R, y para agonizar o antagonizar una actividad biológica de IGF-1 R, IGF-1, y/o IGF-2 in vivo o in vitro.

Las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas se indican usando abreviaturas convencionales de una o tres letras. A menos que se indique otra cosa, las secuencias de polipéptidos tienen sus extremos amino a la izquierda y sus extremos carboxi a la derecha, y las secuencias de ácido nucleico monocatenario, y la cadena superior de las secuencias de ácido nucleico bicatenario, tienen sus extremos 5’ a la izquierda y sus extremos 3’ a la derecha. También se puede describir una determinada secuencia polipeptídica o polinucleotídica explicando cómo difiere de una secuencia de referencia.

Las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas de dominios variables de cadena ligera y pesada particulares se muestran en las Figuras 1, 2 y 3, donde están marcadas, por ejemplo, L1 (" dominio variable de cadena ligera 1 "), HI ("dominio variable de cadena pesada 1"), etc. Los anticuerpos que comprenden una cadena ligera y una cadena pesada de las Figuras 2 y 3 se indican combinando el nombre de los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada. Por ejemplo, "L4H7", indica un anticuerpo que comprende el dominio variable de cadena ligera de L4 y el dominio variable de cadena pesada de H7.

A menos que se defina lo contrario en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados comúnmente entendidos por los expertos en la materia. Además, a no ser que el contexto requiera otra cosa, los términos en singular incluirán las pluralidades, y los términos en plural incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en el presente documento son bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente invención, en general, se realizan de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Véase, p. ej., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) y Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realizan comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. La terminología usada en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica que se describen en el presente documento son los conocidos y comúnmente usados en la técnica. Se pueden usar las técnicas convencionales para las síntesis químicas, los análisis químicos, la preparación, formulación y administración de productos farmacéuticos, y el tratamiento de pacientes.

Los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, se entenderán como que tienen los siguientes significados:

La expresión "molécula aislada" (en la que la molécula es, por ejemplo, un polipéptido, un polinucleótido o un anticuerpo) es una molécula que en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociada con componentes asociados de manera natural que la acompañan en su estado nativo, (2) está sustancialmente libre de otras moléculas de la misma especie; (3) se expresa por una célula de una especie diferente; o (4) no se da en la naturaleza. Por lo tanto, una molécula que se sintetiza químicamente, o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula a partir de la que se origina de forma natural, se "aislará" de sus componentes asociados de manera natural. Una molécula también puede volverse esencialmente libre de componentes asociados de manera natural mediante el aislamiento, usando técnicas de purificación bien conocidas en la materia. La pureza u homogeneidad de la molécula se puede ensayar mediante una serie de medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la pureza de una muestra polipeptídica puede ensayarse usando electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción del gel para visualizar el polipéptido usando técnicas bien conocidas en la materia. Para ciertos fines, se puede proporcionar una resolución más alta usando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para la purificación.

Las expresiones "inhibidor de IGF-1R" y "antagonista de IGF-1R" se usan indistintamente. Cada una es una molécula que inhibe de forma detectable al menos una función de IGF-1R. Por el contrario, un "agonista de IGF-1R" es una molécula que aumenta de manera detectable al menos una función de IGF-1 R. La inhibición causada por un inhibidor de IGF-1 R no tiene que ser completa siempre que sea detectable usando un ensayo apropiado. Se puede usar cualquier ensayo de una función de IGF-1 R, se proporcionan en el presente documento, ejemplos de los mismos. Ejemplos de funciones de IGF-1R que se pueden inhibir por un inhibidor de IGF-1R, o aumentar por un agonista de IGF-1 R, incluyen la unión a IGF-1, IGF-12 y/u otra molécula activadora de IGF-1R, actividad quinasa, señalización cadena abajo, y así sucesivamente. Ejemplos de tipos de inhibidores de IGF-1 R y agonistas de IGF-1 R incluyen, aunque sin limitación, polipéptidos de unión a IGF-1 R tales como proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, proteínas de unión a antígeno que inhiben a IGF-1 R), anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y derivados de anticuerpos.

Los términos "péptido," "polipéptido" y "proteína" se refieren cada uno a una molécula que comprende dos o más restos de aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Estos términos abarcan, p. ej., proteínas nativas y artificiales, fragmentos de proteína y análogos polipeptídicos (tales como muteínas, variantes y proteínas de fusión) de una secuencia de proteína, así como proteínas modificadas después de la traducción, o si no,covalentemente o no covalentemente. Un péptido, un polipéptido o una proteína puede ser monomérico o polimérico.

La expresión "fragmento polipeptídico", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una eliminación amino-terminal y/o carboxi-terminal en comparación con una proteína de longitud completa correspondiente. Los fragmentos pueden ser, por ejemplo, de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoácidos de longitud. Los fragmentos también pueden ser, por ejemplo, de al menos I . 000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 aminoácidos de longitud. Un fragmento puede comprender además, en uno o ambos de sus extremos, uno o más aminoácidos adicionales, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de una proteína de origen natural diferente (p.ej, un dominio Fc o cremallera de leucina) o una secuencia de aminoácidos artificial (p.ej, una secuencia enlazadora artificial). Los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos que se han modificado de cualquier manera y por cualquier motivo, por ejemplo, para: (1) reducir la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducir la susceptibilidad a la oxidación, (3) alterar la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alterar las afinidades de unión y (4) conferir o modificar otras propiedades fisicoquímicas o funcionales. Los análogos incluyen muteínas de un polipéptido. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (p.ej., sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (p.ej., en la porción del polipéptido fuera del/de los dominio/s que forma/n contactos intermoleculares). Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es aquella que no cambia sustancialmente las características estructurales de la secuencia precursora (p. ej., un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que se produzca en la secuencia precursora, ni alterar otros tipos de estructura secundaria que caractericen la secuencia precursora o que sean necesarios para su funcionalidad). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias polipeptídicas reconocidas en la técnica se describen en “Proteins, “Structures and Molecular Principles” (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); “Introduction to Protein Structure” (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N. Y. (1991)); y Thornton et at. Nature 354:105 (1991).

La presente divulgación también proporciona análogos no peptídicos de polipéptidos de unión a IGF-1 R. Los análogos no peptídicos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos con propiedades análogas a las del péptido plantilla. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "péptidos miméticos" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Los péptidos miméticos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigmático (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: --CH2NH--, -CH2S--, --CH2--CH2- -, --CH=CH-(ds y trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2-- y --CH2SO--, mediante métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por un D-aminoácido del mismo tipo (p. ej., D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica pueden generarse mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)), por ejemplo, mediante la adición de restos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan al péptido.

Una "variante" de un polipéptido (p. ej., un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en donde uno o más restos de aminoácidos se insertan, eliminan y/o sustituyen en la secuencia de aminoácidos en relación con otra secuencia polipeptídica. Las variantes como se divulgan en el presente documento incluyen proteínas de fusión. Un "derivado" de un polipéptido es un polipéptido (p. ej., un anticuerpo) que se ha modificado químicamente, p. ej., mediante conjugación a otro resto químico tal como, por ejemplo, polietilenglicol, albúmina (p. ej., albúmina de suero humano), fosforilación y glicosilación. A menos que se indique otra cosa, el término "anticuerpo" incluye, además de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos y muteínas de los mismos, ejemplos de los cuales se describen a continuación.

Una "proteína de unión a antígeno" es una proteína que comprende una porción que se une a un antígeno y, opcionalmente, una porción de armazón o región marco que permite que la porción de unión a antígeno adopte una conformación que promueva la unión de la proteína de unión a antígeno al antígeno. Ejemplos de proteínas de unión a antígeno incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, una porción de unión a antígeno de un anticuerpo), derivados de anticuerpos y análogos de anticuerpos. La proteína de unión a antígeno puede comprender, por ejemplo, un armazón proteico alternativo o un armazón artificial con CDR injertadas o derivados de CDR. Dichos armazones incluyen, aunque sin limitación, armazones derivados de anticuerpos que comprenden mutaciones introducidas para, por ejemplo, estabilizar la estructura tridimensional de la proteína de unión a antígeno, así como armazones totalmente sintéticos que comprenden, por ejemplo, un polímero biocompatible. Véase, por ejemplo, Korndorfer et al., 2003, “Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volumen 53, Issue 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. Además, se pueden utilizar miméticos de anticuerpos peptídicos ("PAM"), así como armazones basados en miméticos de anticuerpos que utilizan componentes de fibronección como un armazón.

Una proteína de unión a antígeno puede tener, por ejemplo, la estructura de una inmunoglobulina de origen natural. Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina de origen natural, cada tetrámero se compone de dos pares de cadenas polipeptídicas idénticas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, generalmente, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N. Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo de modo que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión.

Las cadenas de inmunoglobulinas de origen natural presentan la misma estructura general de regiones marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Del extremo N al extremo C, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de los aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicación de NIH N.° 91-3242, 1991.

Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción de unión a antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto para la unión específica, a menos que se especifique lo contrario. Las porciones de unión a antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno incluyen, entre otros, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio (dAb) y fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir una unión a antígeno específica del polipéptido.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que tiene los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1 ; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd tiene los dominios Vh y Ch1; un fragmento Fv tiene los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb tiene un dominio V^h, un dominio V^l o un fragmento de unión a antígeno de un dominio V^h o V^l (Patentes de EE. UU. N.° 6.846.634, 6.696.245, Publicaciones de solicitud de EE. UU. N.° 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291,04/0009507, 03/0039958, Ward et al., Nature 341:544-546, 1989).

Un anticuerpo monocatenario (scFv) es un anticuerpo en el que una región Vl y una Vh se unen a través de un enlazador (p. ej., una secuencia sintética de restos de aminoácidos) para formar una cadena de proteína continua en donde el enlazador es lo suficientemente largo para permitir que la cadena de proteína se pliegue sobre sí misma y forme un sitio de unión a antígeno monovalente (véase, p. ej., Bird et al., 1988, Science 242:423-26 y Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas polipeptídicas, en donde cada cadena polipeptídica comprende dominios V^h y V^l unidos por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios en la misma cadena, permitiendo así que cada dominio se empareje con un dominio complementario en otra cadena polipeptídica (véase, p.ej., Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 y Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-23). Si las dos cadenas polipeptídicas de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo resultante de su emparejamiento tendrá dos sitios de unión a antígeno idénticos. Las cadenas polipeptídicas que tienen diferentes secuencias se pueden usar para preparar un diacuerpo con dos sitios de unión a antígeno diferentes. De manera similar, los tricuerpos y los tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas polipeptídicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión a antígeno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.

Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y las regiones marco (FR) de un anticuerpo dado pueden identificarse utilizando el sistema descrito por Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicación de NIH N.° 91-3242, 1991. Se pueden incorporar una o más CDR en una molécula covalentemente o no covalentemente para convertirla en una proteína de unión a antígeno. Una proteína de unión a antígeno puede incorporar la(s) CDR como parte de una cadena polipeptídica más grande, puede enlazar covalentemente la(s) CDR a otra cadena polipeptídica, o puede incorporar la(s) CDR de manera no covalente. Las CDR permiten que la proteína de unión a antígeno se una específicamente a un antígeno particular de interés.

Una proteína de unión a antígeno puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana de origen natural tiene generalmente dos sitios de unión idénticos, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de unión diferentes.

La expresión "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una realización, todos los dominios variables y constantes pueden derivar de secuencias de inmunoglobulina humana (un anticuerpo completamente humano). Estos anticuerpos pueden prepararse de una variedad de formas, cuyos ejemplos se describen a continuación, que incluyen la inmunización con un antígeno de interés de un ratón genéticamente modificado para expresar anticuerpos derivados de genes que codifican cadenas pesadas y/o ligeras humanas.

Un anticuerpo humanizado tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana por una o más sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de aminoácidos, de modo que es menos probable que el anticuerpo humanizado induzca una respuesta inmunitaria y/o induzca una respuesta inmunitaria menos grave, en comparación con el anticuerpo de la especie no humana, cuando se administra a un sujeto humano. En una realización, determinados aminoácidos de los dominios marco conservados y dominios constantes de las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo de la especie no humana se mutan para producir el anticuerpo humanizado. En otra realización, el(los) dominio(s) constante(s) de un anticuerpo humano pueden fusionarse al(a los) dominio(s) variable(s) de una especie no humana. En otra realización, uno o más restos de aminoácidos en una o más secuencias de CDR de un anticuerpo no humano se cambian para reducir la probable inmunogenicidad del anticuerpo no humano cuando se administra a un sujeto humano, en donde los restos de aminoácidos cambiados tampoco son críticos para la unión inmunoespecífica del anticuerpo a su antígeno, o los cambios en la secuencia de aminoácidos que se realizan son cambios conservativos, de modo que la unión del anticuerpo humanizado al antígeno no es significativamente peor que la unión del anticuerpo no humano al antígeno. Ejemplos de cómo producir anticuerpos humanizados se pueden encontrar en las patentes de EE.UU. n.° 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293.

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo, y una o más regiones de uno o más anticuerpos diferentes. En una realización, una o más de las CDR derivan de un anticuerpo anti-IGF-1R humano. En otra realización, todas las CDR derivan de un anticuerpo anti-IGF-1R humano. En otra realización, las CDR de más de un anticuerpo anti-IGF-1R humano se mezclan y se combinan en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo anti-IGF-1 R humano, una CDR2 y una CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo anti-IGF-1R humano y las CDR de la cadena pesada de un tercer anticuerpo anti-IGF-1R. Además, las regiones marco pueden derivar de uno de los mismos anticuerpos anti-IGF-1R, de uno o más anticuerpos diferentes, tal como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado. En un ejemplo de un anticuerpo quimérico, una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a, homóloga a o derivada de un anticuerpo de una determinada especie o perteneciente a una determinada clase o subclase de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es(son) idéntica(s) a, homóloga(s) a o derivada(s) de uno o varios anticuerpo(s) de otra especie, o perteneciente(s) a otra clase o subclase de anticuerpos. También se incluyen fragmentos de dichos anticuerpos que muestran la actividad biológica deseada (es decir, la capacidad de unirse específicamente a IGF-1R). Véase, p. ej., la patente de Estados Unidos N.° 4.816.567 y Morrison, 1985, Science 229:1202-07.

Un "anticuerpo neutralizante" o "un anticuerpo inhibidor" es un anticuerpo que inhibe la unión de IGF-1R a IGF-I y/o IGF-2 cuando un exceso del anticuerpo anti-IGF-1R reduce la cantidad de IGF-I y/o IGF-2 unida a IGF-1R en al menos aproximadamente un 20 % usando el ensayo descrito en el Ejemplo 9. En diversas realizaciones, el anticuerpo reduce la cantidad de IGF-I y/o IGF-2 unida a IGF-1 R en al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % y 99,9 %.

Un "anticuerpo activador" es un anticuerpo que activa el IGF-1R en al menos aproximadamente un 20 % cuando se añade a una célula, tejido u organismo que expresa IGF-1R, donde "100 % de activación" es el nivel de activación alcanzado en condiciones fisiológicas por la misma cantidad molar de IGF-1 y/o IGF-2. En diversas realizaciones, el anticuerpo activa la actividad de IGF-1 R en al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 450 %, 500 %, 750 % o 1000 %.

Los expertos en la materia pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos siguiendo las enseñanzas de la presente memoria descriptiva y usando técnicas bien conocidas en la materia. Los extremos amino y carboxi preferidos de los fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de los datos de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o patentadas. Se pueden usar métodos de comparación informatizados para identificar motivos de secuencia o dominios de configuración de proteínas predichos que se produzcan en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Véase, p. ej., Bowie et al., 1991, Science 253:164.

Un "anticuerpo injertado con CDR" es un anticuerpo que comprende una o más CDR derivadas de un anticuerpo de una especie o isotipo en particular y el marco de otro anticuerpo de la misma o diferente especie o isotipo.

Un "anticuerpo multiespecífico" es un anticuerpo que reconoce más de un epítopo en uno o más antígenos. Una subclase de este tipo de anticuerpo es un "anticuerpo biespecífico" que reconoce dos epítopos distintos en el mismo o en diferentes antígenos.

Una proteína de unión a antígeno "se une específicamente" a un antígeno (p. ej., IGF-1R humano) si se une al antígeno con una constante de disociación de 1 nanomolar o menos.

Un “dominio de unión a antígeno”, “región de unión a antígeno”, o "sitio de unión a antígeno" es una porción de una proteína de unión a antígeno que contiene restos de aminoácidos (u otros restos) que interactúan con un antígeno y contribuyen a la especificidad y afinidad de la proteína de unión a antígeno por el antígeno. Para un anticuerpo que se une específicamente a su antígeno, esto incluirá al menos parte de al menos uno de sus dominios CDR.

Un "epítopo" es la porción de una molécula que está unida por una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, por un anticuerpo). Un epítopo puede comprender porciones no contiguas de la molécula (p. ej., en un polipéptido, los restos de aminoácidos que no son contiguos en la secuencia primaria del polipéptido pero que, en el contexto de la estructura terciaria y cuaternaria del polipéptido, están lo suficientemente cerca entre sí para unirse a una proteína de unión a antígeno).

El "porcentaje de identidad" de dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos se determina comparando las secuencias usando el programa informático GAP (una parte del paquete GCG Wisconsin, versión 10.3 (Accelrys, San Diego, CA)) usando sus parámetros predeterminados.

Los términos "polinucleótido", "oligonucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente en todo el documento e incluyen las moléculas de ADN (p. ej., ADNc o ADN genómico), moléculas de ARN (p. ej., ARNm), análogos de ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos (p. ej., ácidos nucleicos peptídicos y análogos de nucleótidos de origen no natural) e híbridos de los mismos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria. En una realización, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden un marco de lectura abierto contiguo que codifica un anticuerpo o un fragmento, derivado, muteína o variante de los mismos, de la invención. Dos polinucleótidos monocatenarios son "el complemento" entre sí si sus secuencias pueden alinearse en una orientación antiparalela de modo que cada nucleótido de un polinucleótido sea opuesto a su nucleótido complementario en el otro polinucleótido, sin la introducción de espacios, y sin nucleótidos no emparejados en el extremo 5' o en el extremo 3' de cualquiera de las secuencias. Un polinucleótido es "complementario" a otro polinucleótido si los dos polinucleótidos pueden hibridar entre sí en condiciones moderadamente rigurosas. Por lo tanto, un polinucleótido puede ser complementario a otro polinucleótido sin ser su complemento.

Un "vector" es un ácido nucleico que puede usarse para introducir otro ácido nucleico unido al mismo en una célula. Un "plásmido" es un tipo de vector, que se refiere a una molécula de ADN bicatenaria lineal o circular en la que se pueden ligar segmentos de ácidos nucleicos adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico (p. ej., retrovirus defectuosos para la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), en donde se pueden introducir segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que comprenden un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (p. ej., vectores no episómicos de mamífero) se integran en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora y, de este modo, se replican junto con el genoma del hospedador. Un "vector de expresión" es un tipo de vector que puede dirigir la expresión de un polinucleótido seleccionado.

Una secuencia de nucleótidos está "operativamente unida" a una secuencia reguladora si la secuencia reguladora afecta a la expresión (p. ej., al nivel, al tiempo o a la ubicación de la expresión) de la secuencia de nucleótidos. Una "secuencia reguladora" es un ácido nucleico que afecta a la expresión (p. ej., al nivel, al tiempo o a la ubicación de la expresión) de un ácido nucleico al que está operativamente unido. La secuencia reguladora puede, por ejemplo, ejercer sus efectos directamente sobre el ácido nucleico regulado o mediante la acción de una o más moléculas diferentes (p. ej., polipéptidos que se unen a la secuencia reguladora y/o al ácido nucleico). Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación). Se describen ejemplos adicionales de secuencias reguladoras en, por ejemplo, Goeddel, 1990, “Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, C^a y Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06.

Una "célula hospedadora" es una célula que puede usarse para expresar un ácido nucleico, p. ej., un ácido nucleico de la invención. Una célula hospedadora puede ser un procariota, por ejemplo, E. coli o puede ser un eucariota, por ejemplo, un eucariota unicelular (p. ej., una levadura u otro hongo), una célula vegetal (p. ej., una célula vegetal de tabaco o de tomate), una célula animal (p. ej., una célula humana, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón o una célula de insecto) o un hibridoma. Los ejemplos de células hospedadoras incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (véase Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO) o sus derivados, tales como Veggie CHO y líneas celulares relacionadas que crecen en medios sin suero (véase Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31) o la cepa de CHO DX-B11, que es deficiente en DHFR (véase Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20), células HeLa, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) (véase McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821), células de riñón embrionario humano tales como 293, 293 EBNA o MSR 293, células epidérmicas A431 humanas, células Colo205 humanas, otras líneas celulares de primate transformadas, células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, HL-60, U937, células HaK o Jurkat. Normalmente, una célula hospedadora es una célula cultivada que puede transformarse o transfectarse con un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que luego puede expresarse en la célula hospedadora. La expresión "célula hospedadora recombinante" puede usarse para indicar una célula hospedadora que se ha transformado o transfectado con un ácido nucleico que se va a expresar. Una célula hospedadora también puede ser una célula que comprende el ácido nucleico, pero que no lo expresa a un nivel deseado a menos que se introduzca una secuencia reguladora en la célula hospedadora de manera que se una operativamente al ácido nucleico. Se entiende que la expresión célula hospedadora no solo se refiere a la célula objeto en particular, sino a la progenie o a la posible progenie de dicha célula. Debido a que se pueden producir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a, p. ej., mutación o influencia ambiental, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero aun así se incluyen dentro del alcance de la expresión como se usa en el presente documento.

IGF-1R

IGF-1R es un receptor transmembrana tirosina quinasa (Blume-Jensen et al., 2001, Nature 411:355-65). El IGF-1R humano se sintetiza como un polipéptido precursor de 1367 aminoácidos que incluye un péptido señal de 30 aminoácidos eliminado durante la translocación en el retículo endoplásmico (Swiss-Prot: P08069). El prorreceptor de IGF-1R está glicosilado y se escinde por una proteasa en las posiciones 708-711 (contando desde el primer aminoácido después de la secuencia del péptido señal) durante la maduración en el RE-golgi, lo que da como resultado la formación de una cadena a (1-707 ) y una cadena p (712-1337) que permanecen unidas por enlaces disulfuro (Bhaumick et al., 1981, Proc Natl Acad Sci USA 78:4279-83, Chernausek et al., 1981, Biochemistry 20:7345-50, Jacobs et al., 1983, Proc Natl Acad Sci USA 80:1228-31, LeBon et al., 1986, J Biol Chem 261:7685-89, Elleman, et al., 2000, Biochem J 347:771-79). La forma predominante del Ig F-1 R (e INSR) que existe en la superficie de la célula es un dímero procesado y glicosilado (ap)2 proteolíticamente, unido covalentemente por uno o más enlaces disulfuro.

La porción extracelular del IGF-1 R consiste en la cadena a y 191 aminoácidos de la cadena p (712-905). El receptor contiene una sola secuencia de extensión transmembrana (906-929) y un dominio citoplásmico de 408 restos que incluye una tirosina quinasa funcional (Rubin et al., 1983, Nature 305:438-440). El análisis de secuencia comparativo ha revelado que el IGF-1 R se compone de 11 motivos estructurales distintos (revisado por Adams et al., 2000, Cell Mol Life Sci 57:1050-93, Marino-Buslje et al., 1998, FEBS Ltrs 441:331-36, Ward et al., 2001, BMC Bioinformatics 2:4). La mitad N-terminal del dominio extracelular contiene dos dominios homólogos denominados L1 (1-151) y L2 (299-461) (Ward et al., 2001, supra) separados por una región rica en cisteína (CR) (152-298) que consiste en varios módulos estructurales con enlaces disulfuro que se alinean con las unidades de repetición presentes en el receptor de TNF y en la laminina (Ward et al., 1995, Proteins 22:141-53). Se ha resuelto la estructura cristalina del dominio L1-CR-L2 (Garrett et al., 1998, Nature 394:395-99). Al dominio L2 le siguen tres dominios de fibronectina de tipo III (Marino-Buslje et al., 1998, supra, Mulhern et al., 1998, Trends Biochem Sci 23:465-66, Ward et al., 1999, Growth Factors 16:315-22). El primer dominio FnIII (FnIII-1, 461-579) tiene una longitud de 118 aminoácidos. El segundo dominio FnIII (FnI11-2, 580-798) está interrumpido por una secuencia de inserción principal (ID) de aproximadamente 120 aminoácidos de longitud. El dominio ID incluye un sitio de escisión de la furina proteasa que separa las cadenas a y p del receptor maduro. El tercer dominio FnIII (FnIII-3) está ubicado completamente en la cadena p (799-901) que termina varios restos antes de la secuencia transmembrana. El dominio catalítico de la tirosina quinasa IGF-1R está ubicado entre las posiciones de aminoácidos 973-1229, y se ha resuelto su estructura (Favelyukis et al., 2001, Nature Structural Biol 8:1058-63, Pautsch et al., 2001, Structure 9:955-65). La quinasa está flanqueada por dos regiones reguladoras, la región yuxtamembrana (930-972) y una cola C-terminal de 108 aminoácidos (1220-1337) (Surmacz et al., 1995, Experimental Cell Res 218:370-80, Hongo et al., 1996, Oncogene 12:1231-38). Las dos regiones reguladoras contienen restos de tirosina que sirven como sitios de acoplamiento para las proteínas de transducción de señales cuando son fosforiladas por la tirosina quinasa IGF-1 R activada (revisado por Baserga (ed.), 1998 The IGF-1 Receptor in Normal and Abnormal Growth, Hormones and Growth Factors in Development and Neoplasia, Wiley-Liss, Inc., Adams et al., 2000, Cell Mol Life Sci 57:1050-93).

La secuencia de aminoácidos de IGF-1 R es aproximadamente un 70 % idéntica al receptor de insulina (INSR; Swiss-Prot: P06213). La mayor homología entre los receptores se encuentra en el dominio tirosina quinasa (84 %); la identidad más baja se encuentra en la región CR y el extremo C. El IGF-1 R también está altamente relacionado (~ 55 % idéntico) con el receptor relacionado con la insulina (IRR; Swiss-Prot: P14616).

El IGF-1R humano puede activarse por los factores de crecimiento similares a la insulina, IGF-1 e IGF-2 e insulina (INS) (Hill et al., 1985, Pediatric Research 19:879-86). IGF-1 e IGF-2 son genes no alélicos codificados (Brissenden et al., 1984, Nature 310: 781-8, Bell et al., 1985, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 82: 6450-54) y ambos genes expresan proteínas alternativas relacionadas por empalme de ARN diferencial y procesamiento de proteínas. Las formas maduras más comunes y bien estudiadas de IGF-1 e IGF-2 tienen una longitud de 70 y 67 aminoácidos respectivamente (Jansen et al., 1983, Nature 306:609-11, Dull et al., 1984, Nature 310: 777-81). Estas proteínas (y sus isoformas) son idénticas en las posiciones 11/21 al péptido A de la insulina, e idénticas en las posiciones 12/30 con el péptido B de la insulina.

El IGF-1 R se expresa en todos los tipos de células en el animal adulto normal, excepto en los hepatocitos del hígado y en las células B maduras. El plasma sanguíneo humano contiene altas concentraciones de IGF-1 e IGF-2 e IGF-1 puede detectarse en la mayoría de los tejidos. El receptor es un componente integral del mecanismo fisiológico que controla el tamaño y la homeostasis de los órganos. Sin pretender quedar ligado a una teoría particular, la "Hipótesis de la somatomedina" afirma que el crecimiento somático mediado por la hormona de crecimiento (GH) que se produce durante la infancia y la adolescencia depende de la forma endocrina de IGF-1 que se produce principalmente y es secretada por el hígado (Daughaday, 2000, Pediatric Nephrology 14: 537-40). La síntesis de IGF-1 hepático se estimula por la liberación de GH en la hipófisis en respuesta a la GHRH hipotalámica (hormona liberadora de GH). La concentración sérica de IGF-1 aumenta más de 100 veces entre los 5-15 años en los seres humanos. La biodisponibilidad de IGF-1 está regulada por la proteína de unión a IGF 3 (IGFBP3) con aproximadamente el 99 % del factor de crecimiento compartimentado en el estado unido. La deficiencia primaria de IGF-1 que surge a partir de la deleción parcial de genes, y la deficiencia secundaria de IGF-1 que resulta de defectos en la producción o señalización de GH no son letales (Woods, 1999, IGF Deficiency in Contemporary Endocrinology: The IGF System, R. a. R. Rosenfeld, C. Jr. Totowa, ed.s, Humana Press, NJ: 651-74). Los individuos afectados presentan retraso en el crecimiento al nacer, crecen lentamente y pueden enfrentar ciertas anomalías del SNC. La señalización de IGF-1 R promueve el crecimiento celular y la supervivencia a través de la activación dependiente de la proteína del adaptador IRS de la ruta PI3Quinasa/Akt. IGF-1 R transmite una señal a sus sustratos principales, IRS-1 a través de IRS-4 y las proteínas Shc (Blakesley et al., 1999, IGF-1 receptor function: transducing the IGF-1 signal into intracellular events in The IGF System, R. G. a. R. Rosenfeld, Jr. C.T. Totowa, ed.s, Humana Press, NJ: 143-63). Esto da como resultado la activación de las vías de señalización Ras/Raf/MAP PI3Qinasa/Akt. Sin embargo, la inducción de la supervivencia celular mediada por Akt a través de IRS es la respuesta de la ruta dominante en la estimulación con IGF de la mayoría de las células. Véase la figura 10.

Proteínas de unión a Antígeno

En un aspecto, la presente invención proporciona proteínas de unión a antígeno (p. ej., anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos, muteínas de anticuerpos y variantes de anticuerpos), que se unen a IGF-1 R, p. ej., IGF-1 R humano.

Las proteínas de unión a antígeno de acuerdo con la presente invención incluyen proteínas de unión a antígeno que inhiben una actividad biológica de IGF-1 R. Ejemplos de tales actividades biológicas incluyen la unión a una molécula de señalización (p. ej., IGF-1 y/o IGF-2), y la transducción de una señal en respuesta a la unión de una molécula de señalización.

Diferentes proteínas de unión a antígeno pueden unirse a diferentes dominios o epítopos de IGF-1 R o actuar por diferentes mecanismos de acción. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitación, proteínas de unión a antígeno que interfieren con la unión de IGF-1 y/o IGF-2 a IGF-1R o que inhiben la transducción de señales. El sitio de acción puede ser, por ejemplo, intracelular (p. ej., al interferir con una cascada de señalización intracelular) o extracelular. Una proteína de unión a antígeno no necesita inhibir completamente una actividad inducida por IGF-1 y/o IGF-2 para encontrar su uso en la presente invención; en cambio, también se contemplan para su uso proteínas de unión a antígeno que reducen una actividad particular de IGF-1 y/o IGF-2. (Los análisis en el presente documento sobre mecanismos de acción particulares de las proteínas de unión a antígeno que se unen a IGF-1R en el tratamiento de enfermedades particulares son solamente ilustrativas, y los métodos presentados en el presente documento no están vinculados por ellos).

Se ha observado que IGF-1 e IGF-2 muestran cada uno unión bifásica a IGF-1R. Se ha informado que la unión de alta afinidad tiene una KD en el intervalo de 0,2 nM; la unión de alta afinidad, aproximadamente diez veces más alta. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona un inhibidor de IGF-1 R que inhibe la unión tanto de alta como de baja afinidad de IGF-1 y/o IGF-2 a IGF-R. Se ha sugerido que la unión de alta afinidad, en lugar de la unión de baja afinidad, de IGF-1 y/o IGF-2 a IGF-1 R es necesaria para el cambio de conformación que activa la actividad tirosina quinasa de IGF-1 R. Por lo tanto, en otra realización, el inhibidor de IGF-1 R inhibe preferentemente la unión de alta afinidad de IGF-1 y/o IGF-2 a IGF-1 R en comparación con la unión de baja afinidad.

En otro aspecto, como se reivindica o divulga en el presente documento, se proporcionan proteínas de unión a antígeno que comprenden una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en L1 a L52 y/o una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en H1 a H52, y fragmentos, derivados, muteínas y variantes de las mismas (véanse las figuras 2 y 3). Dicha proteína de unión a antígeno se puede denotar usando la nomenclatura "LxHy", en donde "x" corresponde al número de la región variable de la cadena ligera e "y" corresponde al número de la región variable de la cadena pesada como están marcadas en las Figuras 2 y 3. Por ejemplo, L2H1 se refiere a una proteína de unión a antígeno con una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de L2 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de H1, como se muestra en las Figuras 2 y 3. Las Figuras 2 y 3 también indican la ubicación de las regiones CDR y marco de cada una de estas secuencias de dominio variable. Las regiones CDR de cada cadena ligera y pesada también se agrupan por tipo y por similitud de secuencia en las Figuras 4 a 9. Las proteínas de unión a antígeno como se reivindica o divulga en el presente documento incluyen, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno que tienen una combinación de dominios variables de cadena ligera y cadena pesada seleccionados del grupo de combinaciones que consiste en L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H28, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, L39H39, L40H40, L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H47, L48H48, L49H49, L50H50, L51H51 y L52H52.

Realizaciones particulares de proteínas de unión a antígeno como se reivindica o divulga en el presente documento comprenden una o más secuencias de aminoácidos que son idénticas a las secuencias de aminoácidos de una o más de las CDR y/o FR ilustradas en las Figuras 2 a 9. En una realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR1 de cadena ligera ilustrada en la Figura 4. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR2 de cadena ligera ilustrada en la Figura 5. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR3 de cadena ligera ilustrada en la Figura 6. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR1 de cadena pesada ilustrada en la Figura 7. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR2 de cadena pesada ilustrada en la Figura 8. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR3 de cadena pesada ilustrada en la Figura 9. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR1 de cadena ligera ilustrada en la Figura 2. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR2 de cadena ligera ilustrada en la Figura 2. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR3 de cadena ligera ilustrada en la Figura 2. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR4 de cadena ligera ilustrada en la Figura 2. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR1 de cadena pesada ilustrada en la Figura 3. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR2 de cadena pesada ilustrada en la Figura 3. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR3 de cadena pesada ilustrada en la Figura 3. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR4 de cadena pesada ilustrada en la Figura 3.

Las secuencias de nucleótidos de la Figura 1, o las secuencias de aminoácidos de las Figuras 2 a 9, pueden alterarse, por ejemplo, por mutagénesis aleatoria o por mutagénesis dirigida al sitio (p. ej., mutagénesis específica del sitio dirigida a oligonucleótidos) para crear un polinucleótido alterado que comprende una o más sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos particulares en comparación con el polinucleótido no mutado. Ejemplos de técnicas para realizar tales alteraciones se describen en Walder et al., 1986,Gene 42:133; Bauer et al. 1985, Gene 37:73; Craik, BioTechniques, enero de 1985, 12-19; Smith et al., 1981, Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press; y las patentes de Estados Unidos N.° 4.518.584 y 4.737.462. Estos y otros métodos pueden usarse para preparar, por ejemplo, derivados de anticuerpos anti-IGF-1 R que tienen una propiedad deseada, por ejemplo, mayor afinidad, avidez o especificidad para IGF-1 R, mayor actividad o estabilidad in vivo o in vitro o efectos secundarios in vivo reducidos en comparación con el anticuerpo no derivatizado.

Otros derivados de anticuerpos anti-IGF-1 R dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o agregados de anticuerpos anti-IGF-1 R o fragmentos de los mismos, con otras proteínas o polipéptidos, tal como por la expresión de proteínas de fusión recombinantes que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados al extremo N o C de un polipéptido de anticuerpo anti-IGF-1 R. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un polipéptido de señal heteróloga (o líder), p. ej., el líder del factor alfa de levadura, o un péptido tal como un epítopo marcador. Las proteínas de fusión que contienen proteínas de unión a antígeno pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de la proteína de unión a antígeno (p. ej., poli-His). Una proteína de unión a antígeno también puede unirse al péptido FlAg Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYk Dd DDK) (SEQ ID NO: 255) como se describe en Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988 y en la patente de Estados Unidos 5.011.912. El péptido FLAG es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico (mAb), permitiendo un ensayo rápido y una purificación fácil de la proteína recombinante expresada. Los reactivos útiles para preparar proteínas de fusión en las que el péptido FLAG se fusiona con un polipéptido dado están disponibles comercialmente (Sigma, St. Louis, MO).

Los oligómeros que contienen una o más proteínas de unión a antígeno pueden emplearse como antagonistas de IGF-1R. Los oligómeros pueden estar en forma de dímeros, trímeros u oligómeros superiores unidos covalentemente o no covalentemente. Los oligómeros que comprenden dos o más proteínas de unión a antígeno se contemplan para su uso, siendo un ejemplo un homodímero. Otros oligómeros incluyen heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etc.

Una realización está dirigida a oligómeros que comprenden múltiples proteínas de unión a antígeno unidas mediante interacciones covalentes o no covalentes entre restos peptídicos fusionados con las proteínas de unión a antígeno. Dichos péptidos pueden ser enlazadores peptídicos (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Las cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos se encuentran entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de proteínas de unión a antígeno adheridas a ellos, como se describe con mayor detalle a continuación.

En realizaciones particulares, los oligómeros comprenden de dos a cuatro proteínas de unión a antígeno. Las proteínas de unión a antígeno del oligómero pueden estar en cualquier forma, tal como cualquiera de las formas descritas anteriormente, p. ej., variantes o fragmentos. Preferentemente, los oligómeros comprenden proteínas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a IGF-1 R.

En una realización, se prepara un oligómero usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (que incluyen el dominio Fc) se ha descrito, p. ej., por Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; y Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, Supl.4, páginas 10.19.1 - 10.19.11.

Una realización como se divulga en el presente documento está dirigida a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas fusionando un fragmento de unión a IGF-1R de un anticuerpo anti-IGF-1R a la región Fc de un anticuerpo. El dímero se puede producir, por ejemplo, insertando una fusión génica que codifica la proteína de fusión en un vector de expresión apropiado, expresando la fusión génica en las células hospedadoras transformadas con el vector de expresión recombinante, y permitiendo que la proteína de fusión expresada se junte de forma muy similar a las moléculas de anticuerpos, tras lo cual se forman enlaces disulfuro entre cadenas entre los restos Fc para producir el dímero.

El término "polipéptido de Fc" como se usa en el presente documento incluye formas nativas y muteínas de polipéptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. También se incluyen formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la dimerización. Las proteínas de fusión que comprenden restos Fc (y oligómeros formados a partir de ellos) ofrecen la ventaja de una purificación fácil mediante cromatografía de afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína G.

Un polipéptido Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151, es un polipéptido monocatenario que se extiende desde la región bisagra N-terminal al extremo C nativo de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Otro polipéptido Fc útil es la muteína Fc descrita en la Patente de Estados Unidos 5.457.035 y en Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la secuencia Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 se cambió de Leu a Ala, el aminoácido 20 se cambió de Leu a Glu, y el aminoácido 22 ha sido cambiado de Gly a Ala. La muteína muestra una afinidad reducida por los receptores de Fc.

En otras realizaciones, la porción variable de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo anti-IGF-1 R puede sustituirse por la porción variable de una cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo.

Como alternativa, el oligómero es una proteína de fusión que comprende múltiples proteínas de unión a antígeno, con o sin enlazadores peptídicos (péptidos espaciadores). Entre los enlazadores peptídicos adecuados están los descritos en las patentes de EE.UU. 4.751.180 y 4.935.233.

Otro método para preparar proteínas de unión al antígeno oligoméricas implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de unión al ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), y desde entonces se han encontrado en una variedad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran los péptidos de origen natural y derivados de los mismos que dimerizan o trimerizan. Ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la proteína D del surfactante de pulmón (SPD) se decribe en Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma se describe en Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. En un enfoque, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento de anticuerpo anti-IGF-1 R o derivado fusionado con un péptido de cremallera de leucina se expresan en células hospedadoras adecuadas, y los fragmentos o derivados de anticuerpo anti-IGF-1 R oligoméricos solubles que se forman se recuperan del sobrenadante de cultivo.

En un aspecto, la presente invención proporciona proteínas de unión a antígeno que interfieren con la unión de IGF-1 y/o IGF-2 a un IGF-1R. Dichas proteínas de unión a antígeno pueden prepararse contra IGF-1R, o un fragmento, variante o derivado del mismo, y se pueden analizar en ensayos convencionales para determinar la capacidad de interferir con la unión de IGF-1 y/o IGF-2 a IGF-1 R. Ejemplos de ensayos adecuados son los ensayos que prueban las proteínas de unión a antígeno para determinar la capacidad de inhibir la unión de IGF-1 y/o IGF-2 a células que expresan IGF-1R, o que prueban las proteínas de unión a antígeno para determinar la capacidad de reducir una respuesta biológica o celular que se da como resultado de la unión de IGF-1 y/o IGF-2 a los receptores de IGF-1 R de la superficie celular.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que bloquea la unión de IGF-1 y/o IGF-2 a IGF-1R pero no bloquea significativamente la unión de insulina al receptor de insulina (INS-R). En una realización, la proteína de unión a antígeno no se une a INS-R. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se une a INS-R con una afinidad tan baja que no bloquea efectivamente la unión de la insulina a INS-R. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se une a INS-R, pero la INS-R unida a proteína de unión a antígeno aún puede unirse a insulina. En otra realización, la selectividad de la proteína de unión a antígeno para IGF-1 R es al menos 50 veces mayor que su selectividad para el receptor de insulina. En otra realización, la selectividad de la proteína de unión a antígeno es más de 100 veces mayor que su selectividad para el receptor de insulina.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que demuestra selectividad de especie. En una realización, la proteína de unión a antígeno se une a uno o más IGF - 1R de mamífero, por ejemplo, a IGF-1 R humano y a uno o más IGF-1 R de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, gato, conejo, perro, cabra oveja, vaca, caballo, camello y de primate no humanos. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se une a uno o más IGF-1R de primates, por ejemplo, a IGF-1R humano y uno o más IGF-1R de cynomolgus, tití, rhesus y chimpancé. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se une específicamente a IGF-1R humano, de cynomolgus, de tití, de rhesus o de chimpancé. En otra realización, la proteína de unión a antígeno no se une a uno o más IGF-1 R de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, gato, conejo, perro, cabra oveja, vaca, caballo, camello y primate no humanos. En otra realización, la proteína de unión a antígeno no se une a una especie de mono del Nuevo Mundo, tal como un tití. En otra realización, la proteína de unión a antígeno no muestra unión específica a ninguna proteína de origen natural que no sea IGF-1 R. En otra realización, la proteína de unión a antígeno no muestra unión específica a ninguna proteína de origen natural distinta de IGF-1 R de mamífero. En otra realización, la proteína de unión a antígeno no muestra unión específica a ninguna proteína de origen natural distinta de IGF-1 R de primate. En otra realización, la proteína de unión a antígeno no muestra unión específica a ninguna proteína de origen natural que no sea IGF-1 R humano. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se une específicamente a IGF-1 R de ratón, rata, mono cynomolgus y humano. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se une específicamente a IGF-1 R de ratón, rata, mono cynomolgus y humano con una afinidad de unión similar. En otra realización, la proteína de unión a antígeno bloquea la unión de IGF-1 e IGF-2 humanos con IGF-1 R de ratón, rata, mono cynomolgus y humano. En otra realización, la proteína de unión a antígeno bloquea la unión de IGF-1 e IGF-2 humanos con IGF-1 R de ratón, rata, mono cynomolgus y humano con similar K i En otra realización, la proteína de unión a antígeno bloquea la unión de IGF-1 e IGF-2 humanos con IGF-1R de ratón, rata, mono cynomolgus y humano con una Ki de entre aproximadamente 0,57 y aproximadamente 0,61 nM.

Se puede determinar la selectividad de una proteína de unión a antígeno para un IGF-1 R usando métodos bien conocidos en la técnica y siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva. Por ejemplo, se puede determinar la selectividad usando Transferencia Western, FACS, ELISA o RIA.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que se une a IGF-1 R (p. ej., un anticuerpo anti-IGF-1 R), que tiene una o más de las siguientes características: se une tanto a IGF-1 R humano como murino, inhibe la unión tanto de IGF-1 como de IGF-2 a IGF-1R humano, inhibe la unión tanto de IGF-1 como de IGF-2 a IGF-1R murino, inhibe preferentemente la unión de alta afinidad de IGF-1 y/o de IGF-2 a IGF-1R, se une al dominio L2 de IGF-1 R, causa relativamente poca regulación a la baja del IGF-1 R expresado en la superficie celular después de 17 horas de exposición (en comparación a MAB391 (R&D systems, Minneapolis, MN); p. ej., la cantidad de IGF-1 R se reduce en menos del 20 %), causa un nivel de regulación descendente del IGF-1 R expresado en la superficie celular en células tumorales de xenoinjerto Colo-205 o MiaPaCa-2 en ratones como MAB391 después de cuatro semanas de dosis semanales de 200 microgramos.

Los fragmentos de unión a antígeno de las proteínas de unión a antígeno de la invención pueden producirse mediante técnicas convencionales. Ejemplos de tales fragmentos incluyen, aunque sin limitación, fragmentos Fab y F(ab')2. También se contemplan los fragmentos y derivados de anticuerpos producidos por técnicas de ingeniería genética.

Las realizaciones adicionales incluyen anticuerpos quiméricos, p. ej., versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales no humanos (p. ej., murinos). Dichos anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante técnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a seres humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende el dominio variable de un anticuerpo murino (o todo o parte del sitio de unión a antígeno del mismo) y un dominio constante derivado de un anticuerpo humano. Como alternativa, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de dominio variable (que carece del sitio de unión a antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y modificados genéticamente adicionalmente incluyen los descritos en Riechmann et al., 1988, Nature 332:323, Liu et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439, Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7:934 y Winter et al., 1993, TIPS 14:139. En una realización, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo injertado con CDR. Las técnicas para humanizar anticuerpos se analizan en, p. ej., la solicitud de patente de Estados Unidos. N.° 10/194.975 (publicada el 27 de febrero de 2003 ), las patentes de Estados Unidos con números 5.869.619, 5.225.539, 5.821.337, 5.859.205, Padlan et al., 1995, FASEB J. 9:133-39, y Tamura et al., 2000, J. Immunol. 164:1432-41.

Se han desarrollado procedimientos para generar anticuerpos humanos o parcialmente humanos en animales no humanos. Por ejemplo, se han preparado ratones en los que se han inactivado uno o más genes de inmunoglobulina endógenos por diversos medios. Se han introducido genes de inmunoglobulinas humanas en los ratones para reemplazar los genes de ratón inactivados. Los anticuerpos producidos en el animal incorporan cadenas polipeptídicas de inmunoglobulinas humanas codificadas por el material genético humano introducido en el animal. En una realización, un animal no humano, tal como un ratón transgénico, se inmuniza con un polipéptido IGF-1R, de manera que se generan en el animal los anticuerpos dirigidos contra el polipéptido IGF-1R. Un ejemplo de un inmunógeno adecuado es un IGF-1R humano soluble, tal como un polipéptido que comprende el dominio extracelular de la proteína de la Figura 10, u otro fragmento inmunogénico de la proteína de la Figura 10. Ejemplos de técnicas para la producción y uso de animales transgénicos para la producción de anticuerpos humanos o parcialmente humanos se describen en las patentes de EE.UU. 5.814.318, 5.569.825 y 5.545.806, Davis et al., 2003, Production of human antibodies from transgenic mice in Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ:191-200, Kellermann et al., 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97, Russel et al., 2000, Infect Immun. 68:1820-26, Gallo et al., 2000, Eur J Immun. 30:534-40, Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25, Green, 1999, J Immunol Methods. 231:11-23, Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42, Green et al., 1998, J Exp Med. 188:483-95, Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14, Tsuda et al., 1997, Genomics. 42:413-21, Mendez et al., 1997, Nat Genet. 15:146-56, Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63, Arbones et al., 1994, Immunity. 1:247-60, Green et al., 1994, Nat Genet. 7:13-21, Jakobovits et al., 1993, Nature.

362:255-58, Jakobovits et al., 1993, Proc Natl Acad Sci U S A. 90:2551-55. Chen, J., M. Trounstine, F. W. Alt, F. Young, C. Kurahara, J. Loring, D. Huszar. "Immunoglobulin gene rearrangement in B cell deficient mice generated by targeted deletion of the JH locus." International Immunology 5 (1993): 647-656, Choi et al., 1993, Nature Genetics 4: 117-23, Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 845-51, Harding et al., 1995, Annals of the New York Academy of Sciences, Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59, Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg et al., 1995, Internal Review of Immunology 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14: 826, Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20: 6287-95, Taylor et al., 1994, International Immunology 6: 579-91, Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16: 133-43, Tomizuka et al., 2000, Proceedings of the National Academy of Sciences uSa 97: 722-27, Tuaillon et al., 1993, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 90: 3720-24, and Tuaillon et al., 1994, Journal of Immunology 152: 2912-20.

En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen a IGF-1 R. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando cualquier técnica conocida en la materia, p. ej., inmortalizando células de bazo extraídas del animal transgénico después de completar el programa de inmunización. Las células del bazo pueden inmortalizarse utilizando cualquier técnica conocida en la materia, p. ej., fusionándolas con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para su uso en procedimientos de fusión que producen hibridomas preferentemente no producen anticuerpos, tienen una alta eficiencia de fusión y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que apoyan el crecimiento de solo las células fusionadas deseadas (hibridomas). Ejemplos de líneas celulares adecuadas para su uso en fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; ejemplos de líneas celulares usadas en fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas celulares útiles para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

En una realización, se produce una línea celular de hibridoma inmunizando un animal (p.ej, un animal transgénico que tiene secuencias de inmunoglobulinas humanas) con un inmunógeno de IGF-1 R; recogiendo células de bazo del animal inmunizado; fusionando las células del bazo recogidas con una línea celular de mieloma, generando así células de hibridoma; estableciendo líneas celulares de hibridoma a partir de las células de hibridoma e identificando una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que se une a un polipéptido IGF-1R. Tales líneas celulares de hibridoma y anticuerpos monoclonales anti-IGF-1 R producidos por ellos, están abarcados por la presente invención.

Los anticuerpos monoclonales secretados por una línea celular de hibridoma pueden purificarse utilizando cualquier técnica conocida en la materia. Los hibridomas o mAb pueden analizarse adicionalmente para identificar mAb con propiedades particulares, tales como la capacidad de bloquear una actividad inducida por iGF-1 y/o IGF-2. Ejemplos de tales análisis se proporcionan en los ejemplos a continuación.

La evolución molecular de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en el centro del sitio de unión del anticuerpo también se ha utilizado para aislar anticuerpos con mayor afinidad, por ejemplo, anticuerpos que tienen mayor afinidad por c-erbB-2, como se describe en Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551. Por consiguiente, tales técnicas son útiles en la preparación de anticuerpos para IGF-1 R.

Las proteínas de unión a antígeno dirigidas contra un IGF-1R pueden usarse, por ejemplo, en ensayos para detectar la presencia de polipéptidos IGF-1 R, ya sea in vitro o in vivo. Las proteínas de unión a antígeno también pueden emplearse en la purificación de proteínas IGF-1 R mediante cromatografía de inmunoafinidad. Las proteínas de unión a antígeno que adicionalmente pueden bloquear la unión de IGF-1 y/o IGF-2 a IGF-1R pueden usarse para inhibir una actividad biológica que resulta de dicha unión. Las proteínas de unión al antígeno bloqueantes pueden usarse en los métodos de la presente invención. Tales proteínas de unión a antígeno que funcionan como antagonistas de IGF-1 y/o IGF-2 pueden emplearse en el tratamiento de cualquier afección inducida por IGF-1 y/o IGF-2, incluyendo, pero sin limitación, cáncer. En una realización, se emplea un anticuerpo monoclonal anti-IGF-1R humano generado por procedimientos que implican la inmunización de ratones transgénicos para tratar tales afecciones.

Las proteínas de unión a antígeno pueden emplearse en un procedimiento in vitro, o administrarse in vivo para inhibir una actividad biológica inducida por IGF-1 y/o IGF-2. De este modo, se pueden tratar los trastornos causados o exacerbados (directa o indirectamente) por la interacción de IGF-1 y/o IGF-2 con lGF-1R de la superficie celular, cuyos ejemplos se proporcionan anteriormente. En una realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en un método terapéutico que comprende la administración in vivo de una proteína de unión a antígeno bloqueante de IGF-1 y/o IGF-2 a un mamífero que lo necesite en una cantidad eficaz para reducir una actividad biológica inducida por IGF-1 y/o IGF-2.

Las proteínas de unión a antígeno de la invención incluyen anticuerpos monoclonales parcialmente humanos y completamente humanos que inhiben una actividad biológica de IGF-1 y también inhiben una actividad biológica de IGF-2. Una realización se dirige a un anticuerpo monoclonal humano que bloquea al menos parcialmente la unión de IGF-1 y de IGF-2 a una célula que expresa IGF-1R humano. En una realización, los anticuerpos se generan inmunizando un ratón transgénico con un inmunógeno de IGF-1R. En otra realización, el inmunógeno es un polipéptido IGF-1 R humano (por ejemplo, un fragmento soluble que comprende todo o parte del dominio extracelular de IGF-1R). También se proporcionan en el presente documento, las líneas celulares de hibridoma derivadas de tales ratones inmunizados, en donde el hibridoma secreta un anticuerpo monoclonal que se une a IGF-1 R.

Aunque los anticuerpos humanos, parcialmente humanos o humanizados serán adecuados para muchas aplicaciones, particularmente aquellas que involucran la administración del anticuerpo a un sujeto humano, para ciertas aplicaciones serán adecuados otros tipos de proteínas de unión a antígeno. Los anticuerpos no humanos de la invención pueden ser, por ejemplo, derivados de cualquier animal productor de anticuerpos, tal como ratón, rata, conejo, cabra, burro o primate no humano (tal como mono (p. ej., mono cynomolgus o rhesus) o simio (p. ej., chimpancé)). Los anticuerpos no humanos de la invención se pueden usar, por ejemplo, en aplicaciones in vitro y basadas en cultivo celular o cualquier otra aplicación donde una respuesta inmunitaria al anticuerpo de la invención no se produce, es insignificante, puede prevenirse, no es una preocupación o se desea. En una realización, un anticuerpo no humano de la invención se administra a un sujeto no humano. En otra realización, el anticuerpo no humano no provoca una respuesta inmunitaria en el sujeto no humano. En otra realización, el anticuerpo no humano es de la misma especie que el sujeto no humano, p. ej., un anticuerpo de ratón de la invención se administra a un ratón. Un anticuerpo de una especie particular se puede producir, por ejemplo, inmunizando un animal de esa especie con el inmunógeno deseado (p.ej, un polipéptido IGF-1 R soluble) o usando un sistema artificial para generar anticuerpos de esa especie (p.ej, un sistema bacteriano o basado en la presentación en fagos para generar anticuerpos de una especie en particular) o convirtiendo un anticuerpo de una especie en un anticuerpo de otra especie reemplazando, p. ej., la región constante del anticuerpo con una región constante de las otra especie o reemplazando uno o más restos de aminoácidos del anticuerpo para que se asemeje más a la secuencia de un anticuerpo de la otra especie. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico que comprende secuencias de aminoácidos derivadas de anticuerpos de dos o más especies diferentes.

Las proteínas de unión a antígeno pueden prepararse por cualquiera de una serie de técnicas convencionales. Por ejemplo, pueden purificarse a partir de células que los expresan naturalmente (por ejemplo, un anticuerpo puede purificarse a partir de un hibridoma que lo produce), o producirse en sistemas de expresión recombinante, utilizando cualquier técnica conocida en la materia. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).

Cualquier sistema de expresión conocido en la técnica se puede usar para preparar los polipéptidos recombinantes de la invención. En general, las células hospedadoras se transforman con un vector de expresión recombinante que comprende ADN que codifica un polipéptido deseado. Entre las células hospedadoras que pueden emplearse se encuentran procariotas, levaduras o células eucariotas superiores. Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o bacilos. Las células eucariotas superiores incluyen células de insecto y líneas celulares establecidas de origen mamífero. Ejemplos de células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) ( Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), células L, células 293, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino CHO, células HeLa, las líneas celulares BHK (A^t CC CRL 10) y la línea celular CVI/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CV1 (A^t C^c CCL 70) (véase McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821. Los vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamíferos se describen por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985).

Las células transformadas pueden cultivarse en condiciones que promueven la expresión del polipéptido, y el polipéptido puede recuperarse mediante procedimientos convencionales de purificación de proteínas. Uno de tales procedimientos de purificación incluye el uso de cromatografía de afinidad, p. ej., sobre una matriz que tiene la todo o una porción (p.ej, el dominio extracelular) de IGF-1R unido a la misma. Los polipéptidos contemplados para su uso en el presente documento incluyen polipéptidos de anticuerpos anti-IGF-1 R de mamífero recombinantes sustancialmente homogéneos sustancialmente libres de materiales endógenos contaminantes.

Las proteínas de unión a antígeno pueden prepararse y analizarse para las propiedades deseadas, por cualquiera de una serie de técnicas conocidas. Algunas de las técnicas implican el aislamiento de un ácido nucleico que codifica una cadena polipeptídica (o porción de la misma) de una proteína de unión a antígeno de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF-1 R), y la manipulación del ácido nucleico mediante tecnología de ADN recombinante. El ácido nucleico puede fusionarse con otro ácido nucleico de interés o alterarse (p.ej, por mutagénesis u otras técnicas convencionales) para añadir, eliminar o sustituir uno o más restos de aminoácidos, por ejemplo.

En un aspecto, la presente invención proporciona fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo anti-IGF-1 R de la invención. Dichos fragmentos pueden consistir completamente en secuencias derivadas de anticuerpos o pueden comprender secuencias adicionales. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen fragmentos Fab, F(ab')2, anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, triacuerpos, tetra cuerpos y anticuerpos de dominio. Se proporcionan otros ejemplos en Lunde et al., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:500-06.

Los anticuerpos monocatenarios pueden formarse uniendo fragmentos de dominio variable de cadena pesada y ligera (región Fv) a través de un puente de aminoácidos (enlazador peptídico corto), dando como resultado una cadena polipeptídica única. Dichos Fv monocatenarios (scFv) se han preparado fusionando el ADN que codifica un enlazador peptídico entre los ADN que codifican los dos polipéptidos de dominio variable (V^l y V^h). Los polipéptidos resultantes pueden plegarse sobre sí mismos para formar monómeros de unión a antígeno, o pueden formar multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros y tetrámeros), dependiendo de la longitud de un enlazador flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Al combinar diferentes polipéptidos que comprenden V^l y V^h, se pueden formar scFv multiméricos que se unen a diferentes epítopos (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos monocatenarios incluyen las descritas en la Patente de Estados Unidos N.° 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87. Los anticuerpos monocatenarios derivados de los anticuerpos proporcionados en el presente documento incluyen, aunque sin limitación, scFv que comprenden las combinaciones de dominios variables L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H28, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, L39H39, L40H40, L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H47, L48H48, L49H49, L50H50, L51H51 y L52H52) como se reivindica o divulga en el presente documento.

Las proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y derivados de anticuerpos) de la invención pueden comprender cualquier región constante conocida en la técnica. La región constante de cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de la cadena ligera de tipo kappa o lambda, p. ej., una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda humana. La región constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena pesada de tipo alfa, delta, épsilon, gamma o mu, p. ej., una región constante de cadena pesada de tipo alfa, delta, épsilon, gamma o mu humana. En una realización, la región constante de la cadena ligera o pesada es un fragmento, derivado, variante o muteína de una región constante de origen natural.

Se conocen técnicas para derivar un anticuerpo de una subclase o isotipo diferente de un anticuerpo de interés, es decir, el cambio de subclase. Por lo tanto, los anticuerpos IgG pueden derivar de un anticuerpo IgM, por ejemplo, y viceversa. Tales técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo original), pero también muestran propiedades biológicas asociadas con un isotipo o subclase de anticuerpo diferente de la del anticuerpo original. Se pueden emplear técnicas de ADN recombinante. El ADN clonado que codifica polipéptidos de anticuerpos particulares puede emplearse en tales procedimientos, p. ej., el ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Véase también Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol.178:303-16.

En una realización, una proteína de unión a antígeno de la invención comprende el dominio de cadena pesada de IgG1 de la Figura 13 o un fragmento del dominio de cadena pesada de IgG1 de la Figura 13. En otra realización, una proteína de unión a antígeno de la invención comprende la región de cadena constante de cadena ligera kappa de la Figura 13 o un fragmento de la región constante de cadena ligera kappa de la Figura 13. En otra realización, una proteína de unión a antígeno de la invención comprende tanto el dominio de cadena pesada de IgG1 o un fragmento del mismo, de la Figura 13 como el dominio de cadena ligera kappa, o un fragmento del mismo, de la Figura 13.

Por consiguiente, las proteínas de unión a antígeno como se reivindica o divulga en el presente documento incluyen aquellas que comprenden, por ejemplo, las combinaciones de dominios variables L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18,

, , , , , , , , y , que enen un so po deseado (por ejemplo, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE e IgD) así como fragmentos Fab o F(ab')2 de los mismos. Por otra parte, si se desea una IgG4, también se puede desear introducir una mutación puntual (CPSCP -> CPPCP) en la región bisagra como se describe en Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407) para aliviar una tendencia a formar enlaces disulfuro dentro de la cadena H que pueden conducir a la heterogeneidad en los anticuerpos IgG4.

Por otra parte, también se conocen técnicas para derivar proteínas de unión a antígeno que tienen propiedades diferentes (es decir, afinidades variables para el antígeno al que se unen). Una de estas técnicas, denominada intercambio de cadenas, consiste en mostrar repertorios de genes de dominios variables de inmunoglobulinas en la superficie del bacteriófago filamentoso, a menudo denominada presentación en fagos. El intercambio de cadenas se ha utilizado para preparar anticuerpos de alta afinidad con el hapteno 2-feniloxazol-5-ona, como se describe por Marks et al., 1992, BioTechnology, 10:779.

En realizaciones particulares, las proteínas de unión a antígeno de la presente invención tienen una afinidad de unión (Ka) por IGF-1R de al menos 106, medida como se describe en los Ejemplos. En otras realizaciones, las proteínas de unión a antígeno muestran una Ka de al menos 107 al menos 108, al menos 109 o al menos 1010.

En otra realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que tiene una baja tasa de disociación de IGF-1R. En una realización, la proteína de unión a antígeno tiene una Koff de 1 x10-4 s-1 o menor. En otra realización, la Koff es 5x10-5 s-1 o menor. En otra realización, la Koff es sustancialmente la misma que la de un anticuerpo que tiene una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionadas del grupo de combinaciones que consiste en L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, ^l6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H28, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, L39H39, L40H40, L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H47, L48H48, L49H49, L50H50, L51H51 y L52H52. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se une a IGF-1R con sustancialmente la misma Koff que un anticuerpo que comprende una o más CDR de un anticuerpo que tiene una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionadas del grupo de combinaciones que consiste en L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, l6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H28, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, L39H39, L40H40, L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H47, L48H48, L49H49, L50H50, L51H51 y L52H52. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se une a IGF-1R con sustancialmente la misma Koff que un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos ilustradas en las Figuras 2 a 9. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se une a IGF-1R con sustancialmente la misma Koff que un anticuerpo que comprende una o más CDR de un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos ilustradas en las Figuras 2 a 9.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que se une al dominio L2 de IGF-1 R humano. Las proteínas de unión a antígeno que se unen al dominio L2 se pueden preparar usando cualquier técnica conocida en la materia. Por ejemplo, tales proteínas de unión a antígeno pueden aislarse utilizando el polipéptido IGF-1R de longitud completa (por ejemplo, en una preparación unida a membrana), un fragmento de dominio extracelular soluble de IGF-1 R (cuyo ejemplo se proporciona en el Ejemplo 1), o un fragmento más pequeño del dominio extracelular de IGF-1 R que comprende o consiste en el dominio L2 (cuyos ejemplos se proporcionan en el Ejemplo 10). Las proteínas de unión a antígeno así aisladas se pueden analizar para determinar su especificidad de unión usando cualquier método conocido en la técnica (cuyo ejemplo se proporciona en el Ejemplo 10).

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que se une a IGF-1R humano expresado en la superficie de una célula y, cuando está unido, inhibe la actividad de señalización de IGF-1R en la célula sin causar una reducción significativa en la cantidad de IGF-1R en la superficie de la célula. Se puede usar cualquier método para determinar o estimar la cantidad de IGF-1R en la superficie y/o en el interior de la célula. En una realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que se une al dominio L2 de un IGF-1R humano expresado en la superficie de una célula y, cuando está unido, inhibe la actividad de señalización de IGF-1R en la célula sin aumentar significativamente la tasa de internalización del IGF-1R desde la superficie de la célula. En otras realizaciones, la unión de la proteína de unión a antígeno a la célula que expresa IGF-1 R hace que se interiorice menos de aproximadamente el 75 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 1 % o 0,1 % del iGf-1R de la superficie celular. En otro aspecto, la unión de la proteína de unión a antígeno a la célula que expresa IGF-1R causa una reducción gradual en la cantidad de IGF-1 R en la superficie celular, de modo que, en unas pocas horas de contacto de la célula con la proteína de unión a antígeno, se detecta poca o ninguna disminución de IGF-1R de la superficie celular, pero, después de varios días o semanas de exposición de la célula a la proteína de unión a antígeno, se detecta una disminución marcada de IGF-1 R de la superficie celular.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que tiene una semivida de al menos un día in vitro o in vivo (p.ej, cuando se administra a un sujeto humano). En una realización, la proteína de unión a antígeno tiene una semivida de al menos tres días. En otra realización, la proteína de unión a antígeno tiene una semivida de cuatro días o más. En otra realización, la proteína de unión a antígeno tiene una semivida de ocho días o más. En otra realización, la proteína de unión a antígeno se derivatiza o modifica de tal manera que tenga una semivida más larga en comparación con la proteína de unión a antígeno no derivatizada o no modificada. En otra realización, la proteína de unión a antígeno contiene una o más mutaciones puntuales para aumentar la semivida en suero, tal como se describe en el documento WO 00/09560, publicado el 24 de febrero de 2000.

La presente invención proporciona además proteínas de unión a antígeno multiespecíficas, por ejemplo, proteína de unión a antígeno biespecífica, p. ej., proteína de unión a antígeno que se une a dos epítopos diferentes de IGF-1 R, o a un epítopo de IGF-1 R y a un epítopo de otra molécula, a través de dos sitios o regiones de unión a antígeno diferentes. Por otra parte, la proteína de unión a antígeno biespecífica como se divulga en el presente documento puede comprender un sitio de unión a IGF-1 R de uno de los anticuerpos descritos en el presente documento y una segunda región de unión a IGF-1 R de otro de los anticuerpos descritos en el presente documento. Como alternativa, una proteína de unión a antígeno biespecífica puede comprender un sitio de unión a antígeno de uno de los anticuerpos descritos en el presente documento y un segundo sitio de unión a antígeno de otro anticuerpo IGF-1 R que se conoce en la técnica, o de un anticuerpo que se prepara por métodos conocidos o por los métodos descritos en el presente documento.

Se conocen en la técnica numerosos métodos de preparación de anticuerpos biespecíficos y se analizan en la solicitud de patente de Estados Unidos 09/839.632, publicada el 20 de abril de 2001. Tales métodos incluyen el uso de hibridomas híbridos como los descritos por Milstein et al., 1983, Nature 305:537, y otros (Patente de Estados Unidos 4.474.893, Patente de Estados Unidos 6.106.833) y el acoplamiento químico de fragmentos de anticuerpos (Brennan et al., 1985, Science 229:81; Glennie et al., 1987, J. Immunol. 139:2367; Patente de Estados Unidos 6.010.902). Por otra parte, los anticuerpos biespecíficos pueden producirse a través de medios recombinantes, por ejemplo, mediante el uso de restos de cremallera de leucina (es decir, de las proteínas Fos y Jun, que forman preferentemente heterodímeros; Kostelny et al., 1992, J. Immnol. 148:1547) u otras estructuras de dominio interactivo de cerradura y llave como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.582.996. Las técnicas útiles adicionales incluyen las descritas en Kortt et al., 1997, supra; Patente de Estados Unidos 5.959.083; y la Patente de EE.UU. 5.807.706.

En otro aspecto, la proteína de unión a antígeno de la presente invención comprende un derivado de un anticuerpo. El anticuerpo derivatizado puede comprender cualquier molécula o sustancia que imparta una propiedad deseada al anticuerpo, tal como un aumento de la semivida en un uso particular. El anticuerpo derivatizado puede comprender, por ejemplo, un resto detectable (o marcado) (p. ej., una molécula radiactiva, colorimétrica, antigénica o enzimática, una perla detectable (tal como una perla magnética o electrodensa (p.ej oro) o una molécula que se une a otra molécula (p.ej, biotina o estreptavidina)), un resto terapéutico o diagnóstico (p.ej, un resto radiactivo, citotóxico o farmacéuticamente activo) o una molécula que aumenta la idoneidad del anticuerpo para un uso particular (p.ej, administración a un sujeto, tal como un sujeto humano u otros usos in vivo o in vitro). Ejemplos de moléculas que pueden usarse para derivatizar un anticuerpo incluyen albúmina (p. ej., albúmina sérica humana) y polietilenglicol (PEG). Los derivados de anticuerpos unidos a albúmina y PEGilados pueden prepararse usando técnicas bien conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo está conjugado o unido de otro modo a transtiretina (TTR) o una variante de TTR. La TTR o variante de TTR puede modificarse químicamente con, por ejemplo, un compuesto químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli(n-vinil pirrolidona), polietilenglicoles, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcoholes polivinílicos. Publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 20030195154.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de análisis de una molécula que se une a IGF-1R utilizando las proteínas de unión a antígeno de la presente invención. Se puede utilizar cualquier técnica de análisis adecuada. En una realización, una molécula de IGF-1R o un fragmento de la misma a la que se une una proteína de unión a antígeno de la presente invención, se pone en contacto con la proteína de unión a antígeno de la invención y con otra molécula, en donde la otra molécula se une a IGF-1 R si reduce la unión de la proteína de unión a antígeno a IGF-1 R. La unión de la proteína de unión a antígeno se puede detectar utilizando cualquier método adecuado, p. ej., un ensayo ELISA. La detección de la unión de la proteína de unión a antígeno a IGF-1R se puede simplificar marcando de manera detectable la proteína de unión a antígeno, como se ha analizado anteriormente. En otra realización, la molécula de unión a IGF-IR se analiza adicionalmente para determinar si inhibe la señalización de IGF-1 R, mediada por IGF-1 y/o IGF-2.

Ácidos nucleicos

En un aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos aislados. Los ácidos nucleicos como se reivindica o divulga en el presente documento comprenden, por ejemplo, polinucleótidos que codifican la totalidad o parte de una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, una o ambas cadenas de un anticuerpo de la invención o un fragmento, derivado, muteína o variante de los mismos, polinucleótidos suficientes para su uso como sondas de hibridación, cebadores de PCR o cebadores de secuenciación para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido, ácidos nucleicos antisentido para inhibir la expresión de un polinucleótido y secuencias complementarias de lo anterior. Los ácidos nucleicos pueden ser de cualquier longitud. Pueden ser, por ejemplo, de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 o más nucleótidos de longitud, y/o puede comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o ser parte de un ácido nucleico más grande, por ejemplo, un vector. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden comprender nucleótidos de ARN y/o de ADN, y variantes artificiales de los mismos (p. ej., ácidos nucleicos peptídicos).

Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de anticuerpos (p.ej, cadena pesada o ligera, solo dominio variable o longitud completa) pueden aislarse de linfocitos B de ratones que se han inmunizado con IGF-1 R. El ácido nucleico puede aislarse mediante procedimientos convencionales tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La Figura 1 proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones variables de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera que se muestran en las Figuras 2 y 3. Los técnicos expertos apreciarán que, debido a la degeneración del código genético, cada una de las secuencias polipeptídicas en las Figuras 2 a 9 también está codificada por un gran número de otras secuencias de ácidos nucleicos. La presente invención proporciona cada secuencia de nucleótidos degenerada que codifica cada proteína de unión a antígeno como se reivindica o divulga en el presente documento.

La invención proporciona además ácidos nucleicos que hibridan con otros ácidos nucleicos. (p.ej, ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos de la Figura 1) en condiciones particulares de hibridación. Los métodos para hibridar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Como se define en el presente documento, una condición de hibridación moderadamente rigurosa utiliza una solución de prelavado que contiene cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 5X, SDS al 0,5 %, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampón de hibridación de aproximadamente un 50 % de formamida, SSC 6X y una temperatura de hibridación de 55 0C (u otras soluciones de hibridación similares, tal como aquella que contiene aproximadamente un 50 % de formamida, con una temperatura de hibridación de 42 ° C) y condiciones de lavado de 60 ° C, en SSC 0,5X, SDS al 0,1 %. Una condición de hibridación rigurosa hibrida en ^s SC 6X a 45 0C, seguida de uno o más lavados en SSC 0,1X, SDS al 0,2 % a 68 0C. Asímismo, un experto en la materia puede manipular las condiciones de hibridación y/o lavado para aumentar o disminuir la rigurosidad de la hibridación, de modo que los ácidos nucleicos comprendan secuencias de nucleótidos que sean al menos un 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95. 98 o 99 % idénticas entre sí generalmente permanecen hibridados entre sí. Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridación y la guía para diseñar condiciones adecuadas se establecen en, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Capítulos 9 y 11; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4) y puede determinarse fácilmente por los expertos en la técnica basándose en, por ejemplo, la longitud y/o composición de bases del ADN.

Los cambios pueden introducirse por mutación en un ácido nucleico, conduciendo así a cambios en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido (p.ej, una proteína de unión a antígeno) que codifica. Las mutaciones pueden introducirse usando cualquier técnica conocida en la técnica. En una realización, se cambian uno o más restos de aminoácidos particulares usando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis dirigida al sitio. En otra realización, se cambian uno o más restos seleccionados al azar usando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis al azar. Como quiera que se haga, un polipéptido mutante puede expresarse y analizarse para determinar una propiedad deseada (p.ej, unión a IGF-1 R o bloqueo de la unión de IGF-1 y/o IGF-2 a IGF-1 R).

Las mutaciones pueden introducirse en un ácido nucleico sin alterar significativamente la actividad biológica de un polipéptido que codifica. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en restos de aminoácidos no esenciales. En una realización, una secuencia de nucleótidos proporcionada en la Figura 1, o un fragmento, variante o derivado deseado de la misma, se muta de tal manera que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una o más deleciones o sustituciones de restos de aminoácidos que se muestran en las Figuras 2 a 9 como restos en los que difieren dos o más secuencias. En otra realización, la mutagénesis inserta un aminoácido adyacente a uno o más restos de aminoácidos que se muestran en las Figuras 2 a 9 como restos en los que difieren dos o más secuencias. Como alternativa, se pueden introducir una o más mutaciones en un ácido nucleico que cambia selectivamente la actividad biológica (p. ej., la unión de IGF-1R, inhibiendo IGF-1 y/o IGF-2, etc.) de un polipéptido que codifica. Por ejemplo, la mutación puede cambiar cuantitativa o cualitativamente la actividad biológica. Ejemplos de cambios cuantitativos incluyen aumentar, reducir o eliminar la actividad. Ejemplos de cambios cualitativos incluyen cambiar la especificidad por el antígeno de una proteína de unión a antígeno.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona moléculas de ácidos nucleicos que son adecuadas para su uso como cebadores o sondas de hibridación para la detección de secuencias de ácidos nucleicos de la invención. Una molécula de ácido nucleico de la divulgación puede comprender solo una porción de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de longitud completa de la invención, por ejemplo, un fragmento que se puede usar como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción activa (p. ej., una porción de unión a IGF-1R) de un polipéptido de la invención.

Se pueden usar sondas basadas en la secuencia de un ácido nucleico de la invención para detectar el ácido nucleico o ácidos nucleicos similares, por ejemplo, trasncritos que codifican un polipéptido de la invención. La sonda puede comprender un grupo de marcadores, p. ej., un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Tales sondas pueden usarse para identificar una célula que expresa el polipéptido.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención o una porción del mismo. Ejemplos de vectores incluyen, aunque sin limitación, plásmidos, vectores virales, vectores de mamíferos no episómicos y vectores de expresión, por ejemplo, vectores de expresión recombinantes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden comprender un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora. Los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células hospedadoras que se van a usar para la expresión, que están unidas operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras (p.ej, potenciador de genes tempranos de SV40, promotor del virus del sarcoma de Rous y promotor del citomegalovirus), aquellos que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células hospedadoras (p.ej, secuencias reguladoras específicas de tejido, véase Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237) y aquellas que dirigen la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en respuesta a un tratamiento o afección particular (p. ej., el promotor de metalotionina en células de mamíferos y el promotor sensible a tet y/o sensible a estreptomicina tanto en sistemas procariotas como eucariotas) (véase id.). Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedadoras para producir de ese modo proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en el presente documento.

En otro aspecto, la presente invención proporciona células hospedadoras en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota (p. ej., E. coli) o célula eucariota (por ejemplo, células de levaduras, insectos o mamíferos (p. ej., células CHO). El ADN del vector se puede introducir en células procariotas o eucariotas mediante técnicas convencionales de transformación o transfección. Para la transfección estable en células de mamífero, se sabe que, según el vector de expresión y la técnica de transfección utilizada, solo una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (p.ej, para resistencia a antibióticos) generalmente se introduce en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tal como G418, higromicina y metotrexato. Las células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante selección por fármacos. (p.ej, las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán), entre otros métodos.

Indicaciones

En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno como se reivindica para su uso en métodos de tratamiento de un sujeto. El método puede, por ejemplo, tener un efecto generalmente saludable sobre el sujeto, p. ej., puede aumentar la longevidad esperada del sujeto. Como alternativa, el método puede, por ejemplo, tratar, prevenir, curar, aliviar o mejorar ("tratar") una enfermedad, trastorno, afección o dolencia ("una afección"). Entre las condiciones a tratar de acuerdo con la presente invención están las condiciones caracterizadas por la expresión o actividad inapropiadas de IGF-1, IGF-2 y/o IGF-1R. En algunas de estas afecciones, el nivel de expresión o actividad es demasiado alto, y el tratamiento comprende administrar un antagonista de IGF-1 R como se describe en el presente documento. En otras afecciones similares, el nivel de expresión o de actividad es demasiado bajo, y el tratamiento comprende administrar un agonista de IGF-1 R como se describe en el presente documento.

Un ejemplo de un tipo de afección que puede tratarse utilizando los métodos y composiciones de la presente invención es una afección que implica el crecimiento celular, por ejemplo, una afección cancerosa. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona composiciones para su uso en métodos para tratar una afección cancerosa. La afección cancerosa puede ser cualquier afección cancerosa que pueda tratarse utilizando las composiciones comprendidas en el presente documento, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno que antagonizan con IGF-1 R tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpos anti-IGF-1 R. Ejemplos de afecciones cancerosas incluyen, por ejemplo, Leucemia linfoblástica aguda, Carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con SIDA, Linfoma relacionado con SIDA, cáncer de ano, Astrocitoma Cerebeloso Infantil, Astrocitoma Cerebral Infantil, Carcinoma de células basales, Cáncer de Conducto Biliar Extrahepático, cáncer de vejiga, Osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, Tumores cerebrales (por ejemplo, Glioma del tronco encefálico, Astrocitoma cerebeloso, Astrocitoma cerebral/Glioma maligno, Ependimoma, Meduloblastoma, Tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, Glioma de la vía óptica e hipotalámico), Cáncer de mama, Adenomas bronquiales/carcinoides, Linfoma de Burkitt, Tumor carcinoide, Tumor carcinoide gastrointestinal, Carcinoma de sitio primario desconocido, Sistema nervioso central primario, Astrocitoma cerebeloso, Astrocitoma cerebral/Glioma maligno, Cáncer de cuello de útero, Cánceres infantiles, Leucemia Linfocítica crónica, Leucemia Mielógena crónica, Trastornos crónicos mieloproliferativos, Cáncer de colon, Cáncer colorrectal, Linfoma cutáneo de linfocitos T, Cáncer de endometrio, Ependimoma, Cáncer de esófago, Familia de tumores de Ewing, Tumor de células germinales extracraneales, Tumor de células germinales extragonadales, Cáncer de Conducto Biliar Extrahepático, Melanoma intraocular de Cáncer de ojo, Retinoblastoma de cáncer de ojo, Cáncer de vesícula biliar, Cáncer gástrico (estómago), Tumor carcinoide gastrointestinal, Tumor de células germinales (por ejemplo, Extracraneal, Extragonadal y de Ovarios), Tumor Trofoblástico Gestacional, Glioma (por ejemplo, de Tallo cerebral adulto, infantil, Astrocitoma Cerebral Infantil, de Vía óptica e Hipotalámica Infantil), Leucemia de células pilosas, Cáncer de cabeza y cuello, Cáncer hepatocelular (hígado), Linfoma de Hodgkin, Cáncer hipofaríngeo, Glioma hipotalámico y de la Vía Óptica, Melanoma intraocular, Carcinoma de células de islote (páncreas), Sarcoma de Kaposi, Cáncer de riñón (células renales), Cáncer de laringe, Leucemia (por ejemplo, Linfoblástica Aguda, Mieloide Aguda, Linfocítica Crónica, Mielógena Crónica y de Células Pilosas), Cáncer De Labio y de La Cavidad Oral, Cáncer de hígado, Cáncer de Pulmón No Microcítico, Cáncer de Pulmón microcítico, Linfoma (por ejemplo, relacionado con el SIDA, de Burkitt, cutáneo de linfocitos T, de Hodgkin, No de Hodgkin y del Sistema Nervioso Central Primario), Macroglobulinemia de Waldenstrom, Histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, Meduloblastoma, Melanoma, Melanoma Intraocular (ojo), Carcinoma de células de Merkel, Mesotelioma, Cáncer Escamoso Metastásico De Cuello Con Tumor Primario Oculto, Síndrome De Neoplasia Endocrina Múltiple, Mieloma Múltiple/ Neoplasias de Células Plasmáticas, Micosis fungoides, Síndromes mielodisplásicos, Enfermedades Mielodisplásicas/Mieloproliferativas, Leucemia Mielógena, Leucemia Mieloide Crónica, Mieloma Múltiple, Trastornos crónicos mieloproliferativos, Cáncer de Cavidad nasal y de seno paranasal, Cáncer Nasofaríngeo, Neuroblastoma, Cáncer Oral, Cáncer Orofaríngeo, Osteosarcoma/ Histiocitoma Fibroso Maligno de Hueso, Cáncer de Ovarios, Cáncer Epitelial de Ovarios, Tumor de células germinales ováricas, Tumor ovárico de bajo potencial maligno, Cáncer pancreático, Cáncer Pancreático De Células De Islote, Cáncer de seno paranasal y de Cavidad nasal, Cáncer de paratiroides, Cáncer de pene, Feocromocitoma, Pineoblastoma, Tumor de la pituitaria, Neoplasia de células plasmáticas/Mieloma múltiple, Blastoma pleuropulmonar, Linfoma Primario del Sistema Nervioso Central, Cáncer de Próstata, Cáncer de Recto, Cáncer de células renales (riñón), Cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, Retinoblastoma, Rabdomiosarcoma, Cáncer de Glándulas Salivares, Sarcoma de tejidos blandos, Sarcoma uterino, Síndrome de Sezary, Cáncer de Piel de No Melanoma, Carcinoma de piel de células de Merkel, Cáncer del intestino delgado, Sarcoma de tejidos blandos, Carcinoma de células escamosas, Linfoma cutáneo de linfocitos T, Cáncer testicular, Timoma, Carcinoma de Timo, Cáncer de tiroides, Tumor Trofoblástico Gestacional, Carcinoma de sitio primario desconocido, Cáncer de sitio primario desconocido, Cáncer de Uretra, Cáncer uterino de endometrio, Sarcoma uterino, Cáncer vaginal, Glioma de la vía óptica e hipotalámico, Cáncer Vulvar, Macroglobulinemia de Waldenstrom y Tumor de Wilms.

Cuatro grupos diferentes han estudiado un total de 425 cánceres de mama, en su mayoría ductales, y 48 muestras de tejidos normales o benignas por radioinmunoensayo ("RIA") o inmunohistoquímica ("IHC") (Papa et al., 1993, Cancer Research 53: 3736-40, Happerfield et al., 1997, Journal of Pathology 183: 412-17; Ellis et al., 1998, Breast Cancer Research & Treatment 52: 175-84, Lee et al., 1998, Breast Cancer Research & Treatment 47: 295-302, Schnarr et al., 2000, International Journal of Cancer 89: 506-13). Estos estudios sugieren que la expresión elevada de IGF-1R, en el orden de 5-10 veces, se asocia con un pronóstico favorable y biomarcadores (ER+ PR+), lo que sugiere que el estrógeno y el IGF cooperan en el mantenimiento o la progresión de un tumor bien diferenciado. De manera similar, se ha demostrado que el estrógeno es esencial para el crecimiento y la supervivencia de la línea celular de cáncer de mama ER+MCF-7, y en este contexto, el tratamiento con estrógeno regula al alza el IGF-1R (revisado en Ellis et al., 1998, Breast Cancer Research & Treatment 52: 175-84). Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en un método para tratar cáncer de mama en un sujeto que necesita dicho tratamiento, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de IGF-1R como se describe en el presente documento. En otra realización, el método comprende además administrar un inhibidor de hormonas, p. ej., un inhibidor de estrógenos.

Se ha informado un análisis retrospectivo IHC de IGF-1R para una colección de 12 adenomas colónicos, 36 adenocarcinomas colorrectales primarios y 27 metástasis correspondientes, y 34 tejidos normales adyacentes (Hakam et al., 1999, Human Pathology. 30: 1128-33). La frecuencia de la tinción IHC de moderada a fuerte parece aumentar drásticamente con una etapa y un grado tumoral mayores (0 % normal frente al 93 % en metástasis). Los resultados son consistentes con el análisis de ARN mediante el ensayo de protección de RNasa ("RPA") (Freier et al., 1999, Gut 44: 704-08). Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en un método para tratar cáncer de colon en un sujeto que necesita dicho tratamiento, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de IGF-1 R como se describe en el presente documento.

El IGF-1 en plasma alto y el IGFbp3 reducido en hombres de 40-80 años de edad se asocian con un mayor riesgo de cáncer de próstata (Chan et al., 1998, Science 279: 563-6). El alto IGF-1 se asocia con un riesgo de otros cánceres, incluido el de mama (Hankinson et al., 1998, Lancet 351: 1393-96), colon (Ma et al., 1999, Journal of the National Cancer Institute 91: 620-25) y pulmón (Yu et al., 1999, Journal of the National Cancer Institute 91: 151-56). En modelos de ratones transgénicos, la incidencia de tumores se incrementa por la sobreexpresión de IGF-1 en diversas ubicaciones (Bol et al., 1997, Oncogene 14: 1725-34; DiGiovanni et al., 2000, Cancer Research 60: 1561­ 70; DiGiovanni et al., 2000, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97: 3455-60, Hadsell et al., 2000, Oncogene 19: 889-98). Estos estudios en ratones apuntan a un papel para el IGF-1 producido tanto en suero como en estroma. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en un método para tratar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de IGF-1 R como se describe en el presente documento, en donde el antagonista inhibe la activación de IGF-1R por IGF-1. En otra realización, el sujeto tiene cáncer. En otra realización, el sujeto tiene un tumor. En otra realización, el cáncer es cáncer de próstata, mama, de colon o de pulmón.

Se ha observado que el hueso es la principal fuente de IGF-1 en el cuerpo. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona composiciones para su uso en métodos para inhibir IGF-1 R en un hueso de un sujeto. En una realización, un inhibidor de IGF-1 R de la presente invención se administra a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar, un tumor en un hueso. El tumor puede ser, por ejemplo, un tumor primario o un tumor metastásico. El tratamiento opcionalmente comprende además administrar al sujeto uno o más tratamientos terapéuticos /o paliativos adicionales, por ejemplo, un tratamiento antitumoral (p. ej., quimioterapia, radioterapia o terapia anti hormonal) o un tratamiento que inhibe el recambio óseo (p. ej., denosumab (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA)).

IGF-2 se sobreexpresa en una variedad de tumores y tejidos estromales. Los niveles de IGF-2 aparecen especialmente altos (hasta 40 veces) en los cánceres de hígado primarios (Cariani et al., 1988, Cancer Research 48: 6844-49) y en adenocarcinoma de colon (Freier et al., 1999, Gut 44: 704-08). Muchos de los trastornos de crecimiento excesivo se asocian con una mayor incidencia de tumores infantiles. Entre el cinco y el diez por ciento de los individuos con un trastorno de crecimiento prenatal o síndrome de Beckwith-Weidmann (BWS) o hemihiperplasia desarrollan tumores como el nefroblastoma, carcinoma suprarrenal y neuroblastoma (revisado por Morison et al., 1998, Molecular Medicine Today 4: 110-05). El factor de predisposición tumoral en estos niños parece ser la pérdida en mosaico de la impronta del gen IGF-2 materno, o la duplicación del brazo cromosómico paterno (11p) que porta IGF-2. Ambas alteraciones aumentarían el nivel de expresión de IGF-2. La sobreexpresión de IGF-2 como resultado de la disomía uniparental en mosaico o la pérdida de la impronta de IGF-2 también se ha detectado en los tumores de Wilms. Los trastornos de crecimiento no se observan en estos niños, aunque las alteraciones del gen IGF-2 también se producen en algunos tejidos normales, lo que quizás refleja la distribución tisular de las células afectadas. La impronta del gen materno IGF-2 también se produce en ratones, y los efectos de la sobreexpresión de IGF-2 son consistentes con la situación humana (Cariani et al., 1991, Journal of Hepatology 13: 220-26, Schirmacher et al., 1992, Cancer Research 52: 2549-56; Harris et al., 1998, Oncogene 16: 203-09). La incidencia de tumores y organomegalia aumenta en ratones que expresan transgénicamente el exceso de IGF-2 (Christofori et al., 1994, Nature 369: 414-18, Ward et al., 1994, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91: 10365-9, Wolf et al., 1994, Endocrinology 135: 1877-86, Bates et al., 1995, British Journal of Cancer 72: 1189-93, Hassan et al., 2000, Cancer Research 60: 1070-76). La sobreexpresión local de IGF-2 aumenta la apariencia espontánea de tumores de próstata, mamarios, intestinales, hepáticos y epidérmicos. La expresión específica en plasma utilizando promotores hepáticos eleva los carcinomas hepatocelulares y linfoma. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en un método para tratar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de IGF-1 R como se describe en el presente documento, en donde el antagonista inhibe la activación de IGF-1 R por IGF-2. En otra realización, el sujeto tiene cáncer. En otra realización, el sujeto tiene un tumor. En otra realización, el sujeto tiene cáncer de hígado, adenocarcinoma de colon, Síndrome de Beckwith-Weidmann, hemihiperplasia, nefroblastoma, carcinoma suprarrenal, neuroblastoma, pérdida en mosaico de la impronta del gen IGF-2 materno, duplicación del brazo cromosómico paterno (11 p), aumento de la expresión de IGF-2, un tumor (p.ej, un tumor de próstata mamario, intestinal, hepático, epidérmico o de Wilms), organomegalia, carcinoma hepatocelular o linfoma.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en métodos para prevenir o inhibir la propagación de un cáncer a otra parte del cuerpo o para tratar un cáncer que se ha propagado a otra parte del cuerpo. En una realización, el cáncer se ha propagado a un ganglio linfático regional. En otra realización, el cáncer es metastásico. El tumor primario puede ser cualquier tipo de tumor, por ejemplo, un tumor de adenocarcinoma (p.ej, un tumor de adenocarcinoma de próstata, un tumor de carcinoma de mama o un tumor de carcinoma de células renales), un tumor de cáncer de pulmón no microcítico o microcítico, un tumor de cáncer de tiroides, etc. El sitio del tumor metastásico puede estar en cualquier parte del cuerpo. Puede estar, por ejemplo, en hueso, en el sistema linfático, pulmón, cerebro, ojo, piel, páncreas o hígado. En una realización particular, un sujeto que tiene una enfermedad tumoral se trata con una cantidad eficaz de una composición inhibidora de IGF-1R de la presente invención, de manera que se evita que el tumor primario haga metástasis. En otra realización particular, un sujeto que tiene un tumor primario se trata con una cantidad eficaz de una composición inhibidora de IGF-1 R de la presente invención, de manera que se inhibe que el tumor primario haga metástasis. En otra realización particular, un sujeto que tiene un tumor metastásico se trata con una cantidad eficaz de una composición inhibidora de IGF-1 R de la presente invención, de manera que se inhibe el crecimiento y la propagación del tumor secundario. En otra realización particular, un sujeto que tiene un tumor metastásico se trata con una cantidad eficaz de una composición inhibidora de IGF - 1R de la presente invención, de manera que el tumor secundario se reduce de tamaño. En una realización más particular, el tumor primario es un tumor de adenocarcinoma, un tumor de cáncer de pulmón no microcítico, un tumor de cáncer de pulmón microcítico o un cáncer de tiroides. En otra realización más particular, el tumor metastásico es en un hueso. En otra realización más particular, se evita o inhibe la formación de un tumor metastásico en un hueso. En otra realización más particularmente definida, el método comprende tratar al sujeto con una composición inhibidora de IGF-1 R como de la presente invención y uno o más tratamientos diferentes (p. ej., un tratamiento que destruye o inhibe el crecimiento de células cancerosas, como radiación, terapia hormonal, o quimioterapia, o un tratamiento que inhibe el recambio óseo, como denosumab), cuyos ejemplos no limitativos se proporcionan en el presente documento. Uno o más tratamientos diferentes pueden incluir, por ejemplo, el estándar de cuidado para el estado particular del sujeto y/o el cuidado paliativo.

Sin pretender quedar vinculado a teoría particular alguna, las células tumorales parecen depender de la vía de señalización de PI3 quinasa/Akt para resistir la actividad inductora de apoptosis de la terapia quimioterapéutica, de radiación y anti hormonal. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en métodos de tratamiento de un sujeto que necesita dicho tratamiento que comprende administrar al sujeto un antagonista de IGF-1 R de la presente invención y un agente quimioterapéutico, radiación y/o una terapia antihormonal. Este concepto se ha validado experimentalmente en modelos de cultivos celulares y modelos de tumores de roedores mediante mutaciones negativas antisentido y dominantes (revisado por Baserga et al., 1997, Biochimica et Biophysica Acta 1332: F105-26, Baserga, 2000, Oncogene 19: 5574-81). En una realización, los agentes quimioterapéuticos se seleccionan del grupo que consiste en inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos intercalantes, inhibidores de factores de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasas, agentes anti-supervivencia, modificadores de la respuesta biológica, antihormonas, p. ej., agentes antiandrógenos y antiangiogénesis.

Un ejemplo de un agente quimioterapéutico que se puede administrar en combinación con un inhibidor del receptor de IGF-1 de la invención es CPT-11. CPT-11 (Irinotecán Clorhidrato Trihidrato) es un derivado semisintético, soluble en agua de la camptotecina, un alcaloide vegetal. CPT-11 y un metabolito asociado llamado SN38 inhiben la topoisomerasa 1 (TOPO1). Esta enzima introduce roturas reversibles de una sola hebra en el ADN que permiten el desenrollamiento y permiten que se lleve a cabo la replicación del ADN. La inhibición de TOPO1 previene la unión de nuevo de las roturas de una sola hebra después de la replicación del ADN, lo que da como resultado un gran aumento de la fragmentación cromosómica. Este daño en el ADN promueve la muerte celular por apoptosis a través de la acción de p53 y otros sistemas que monitorizan la integridad del genoma. El efecto citotóxico de la CPT-11 se limita generalmente a las células que están replicando el ADN (fase S). Las células quiescentes no se ven afectadas en gran medida.

En otra realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en el tratamiento de un sujeto que lo necesita con una cantidad eficaz de un antagonista de IGF-1 R de la presente invención y con una cantidad eficaz de un agente inductor de apoptosis.

En otra realización, un agente antiangiogénesis, tal como un inhibidor de MMP-2 (metaloproteinasa 2 de matriz), un inhibidor de MMP-9 (metaloproteinasa 9 de matriz) y/o un inhibidor de COX-II (ciclooxigenasa II), se usa junto con un compuesto de la invención. Ejemplos de inhibidores de COX-II útiles incluyen CELEBREX ™ (alecoxib), BEXTRA ™ (valdecoxib) y VIOXX ™ (rofecoxib). Ejemplos de inhibidores útiles de la metaloproteinasas de matriz se describen en el documento WO 96/33172 (publicado el 24 de octubre de 1996), el documento WO 96/27583 (publicado el 7 de marzo de 1996), la Solicitud de Patente Europea N.° 97304971.1 (publicada el 8 de julio de 1997), la Solicitud de Patente Europea N.° 99308617.2 (publicada el 29 de octubre de 1999), el documento W^o 98/07697 (publicado el 26 de febrero de 1998), el documento WO 98/03516 (publicado el 29 de enero de 1998), el documento WO 98/34918 (publicado el 13 de agosto de 1998), el documento WO 98/34915 (publicado el 13 de agosto de 1998), el documento Wo 98/33768 (publicado el 6 de agosto de 1998), el documento Wo 98/30566 (publicado el 16 de julio de 1998), la publicación de patente europea número 606.046( publicada el 13 de julio de 1994 ), la publicación de patente europea número 931.788 ( publicada el 28 de julio de 1999 ), el documento WO 90/05719 (publicado el 31 de mayo de 1990), el documento ^w O 99/52910 (publicado el 21 de oct. de 1999), el documento ^w O 99/52889 (publicado el 21 de oct. de 1999), el documento WO 99/29667 (publicado el 17 de junio de 1999), la Solicitud Internacional PCT N.° PCT/IB98/01113 (publicada el 21 de julio de 1998), la Solicitud de Patente Europea N.° 99302232.1 (publicada el 25 de marzo de 1999), la solicitud de patente de Gran Bretaña N.° 9912961.1 (publicada el 3 de junio de 1999), la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 60/148.464 (publicada el 12 de agosto de 1999), la Patente de EE.UU. N° 5.863.949 (expedida el 26 de enero de 1999), la Patente de EE.UU. N° 5.861.510 (expedida el 19 de enero de 1999) y en la Publicación de Patente Europea 780.386 (publicada el 25 de junio de 1997). En una realización, el inhibidor de MMP es uno que no demuestra artralgia. En otra realización, el inhibidor de MMP inhibe selectivamente MMP-2 y/o MMP-9 en relación con otras metaloproteinasas de matriz (es decir, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 y MMP-13). Algunos ejemplos específicos de inhibidores de MMP útiles en la presente invención son AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830, y los compuestos enumerados en la siguiente lista: ácido propiónico 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi) benceno-sulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclopentil)-amino]; hidroxiamida del ácido 3-exo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-biciclo [3.2.1]o-ctane-3-carboxílico; hidroxiamida del ácido (2R, 3R) 1-[4- (2-cloro-4-fluoro-benciloxi)-bencenosulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidina-2-carboxílico; hidroxiamida del ácido 4-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-carboxílico; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi) -bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclobutil)-amino]-propiónico; Hidroxiamida del ácido 4-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-carboxílico; Hidroxiamida del ácido (R) 3-[4- (4-clorofenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-piran-3-carboxílico; Hidroxiamida del ácido (2R, 3R) 1-[4-(4-fluoro-2-metilbenciloxi)-bencenosulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidina-2-carboxílico; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi) -bencenos-sulfonil]-(1 -hidroxicarbamoil-1 -metil-etil)-amino]-propiónico; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(4-hidroxicarbamoiltetrahidro-piran-4-il)-amino]-propiónico; hidroxiamida del ácido 3-exo-3-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-iciclo [3.2.1]octano-3-carboxílico; hidroxiamida del ácido 3-endo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-iciclo [3.2.1]octano-3-carboxílico; y hidroxiamida del ácido (R) 3-[4- (4-fluoro-fenoxi)-benzenosulfonilamino]-tetrahidrofuran-3-carboxílico; y sales, solvatos, derivados y otras preparaciones farmacéuticamente aceptables de los compuestos.

Las mutaciones esporádicas que inactivan el producto del gen PETN se producen con relativa frecuencia en la mayoría de los cánceres humanos (Yamada et al., 2001, J Cell Sci 114:2375-82, Hill et al., 2002, Pharmacol Therapeut 93:243-51). La pérdida de PTEN hace que el estado fosforilado de Akt persista a través de la pérdida de la capacidad de regular a la baja las señales estimulantes que se originan a partir de IGF-1R y otras fuentes. El estado del supresor de tumores p53 también influye en la actividad del sistema de señalización de IGF-1R. En el estado fundamental, la transcripción basal o constitutiva de IGF-1 R es reprimida por p53 a través de un mecanismo indirecto. La activación de Akt promueve la fosforilación de mdm2, que luego se une al supresor de tumores p53 y promueve su degradación (Mayo et al., 2002, TIBS 27:462-67), lo que da como resultado una mayor expresión de IGF-1 R. Un resultado similar se observa cuando p53 se inactiva por mutación. Cuando se expresa de forma transitoria en Saos-2 (una línea celular de osteosarcoma humano) y RD (una línea celular de rabdomiosarcoma), p53 de tipo silvestre es capaz de suprimir la actividad de un constructo promotor de IGF-1 R cotransfectado, mientras que las versiones mutantes de p53 derivadas de tumores no tienen efecto. Se ha propuesto que el aumento del nivel de IGF-1 R promueve la resistencia a la apoptosis asociada con la pérdida de p53 en células malignas (Werner et al., 2000, Cell Mol Life Sci 57:932-42). Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en un método para tratar una afección cancerosa en un sujeto que necesita dicho tratamiento que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de IGF-1 R como se describe en el presente documento, en donde la afección cancerosa se caracteriza por células que tienen una expresión o actividad reducida de p53.

También se ha demostrado que WT1 (proteína supresora de tumor de riñón de Wilms 1) se une y reprime el promotor IGF-1 R. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en un método para tratar una afección cancerosa en un sujeto que necesita dicho tratamiento que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de IGF-1 R como se describe en el presente documento en donde la afección cancerosa se caracteriza por una expresión o actividad reducida de WT1.

Se ha demostrado que la proliferación de fibroblastos normales requiere, en condiciones de cultivo definidas, la acción combinada de IGF y un factor de crecimiento del estroma (p. ej., PDGF, EGF) para aumentar la Ras/Raf/Map Quinasa y promover la entrada en el ciclo celular (la transición de G0 a G1). Los fibroblastos derivados de ratones IGF-1 R (-/-) no responden al factor de crecimiento solo o a la mayoría de los oncogenes (p. ej., Ras oncogénico) que activan la ruta de la Ras/Raf/Map Quinasa. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en un método para tratar a un sujeto que necesita dicho tratamiento que comprende administrar al sujeto un antagonista de IGF-1 R como se describe en el presente documento y un agente que se dirige a un factor de crecimiento y/o un receptor de factor de crecimiento, tal como un receptor del factor de crecimiento tirosina quinasa, p. ej., el EGFR, HER-2, bcr-abl, VEGFR, Kit, raf, mTOR, CDK1/2, VEGFR2, PKCp, Mek y/o KDR. Ejemplos de moléculas que se dirigen a dichos factores de crecimiento y/o receptores incluyen panitumumab (Abgenix, Fremont, CA/Amgen, Thousand Oaks, CA), HERCEPTIN™ (Genentech, South San Francisco, CA), GLEEVEC™ (Novartis, East Hanover, NJ), IRESSA™ (AstraZeneca, Wilmington, DE), ERBITUX™, (ImClone, New York, NY), AVASTIN™, (Genentech), PTK787 (Novartis), SU11248 (Pfizer, New York, NY), T^a RCEVA™ (OSI Pharmaceuticals, Melville, NY), 43-9006 (Bayer, West Haven, CT), CCI-779 (Wyeth, Madison, NJ), RAD001 (Novartis), BMS-387032 (Bristol-Myers Squibb, New York, NY), IMC-1C11 (ImClone), LY333531 (Eli Lilly, Indianapolis, IN), PD 184352 (Pfizer), 2C4 (Genentech)y GW2016 (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC).

El papel de IGF-1R en neoplasias malignas hematológicas se ha revisado por (Novak et al., 2003, Insulin-Like Growth Factors and Hematological Malignancies in Insulin-Like Growth Factors, LeRoith et al., ed.s, Landes Bioscience). Un papel funcional para el IGF-1R en neoplasias malignas hematopoyéticas se demuestra, por ejemplo, por la capacidad de los anticuerpos monoclonales de IGF-1 R para bloquear el crecimiento de células transformadas en cultivo. Se ha encontrado que IGF-I potencia el crecimiento de la leucemia mielógena aguda humana recién aislada y los blastos de leucemia linfoblástica aguda. Con respecto a las neoplasias malignas de linfocitos T, se ha demostrado que IGF-I influye en el crecimiento de células de linfoma murino que tienen un fenotipo de células pre-T y, se descubrió que las células de leucemia linfoblástica aguda del linaje T primario humano, inmaduras y maduras, expresan grandes cantidades de IGF-1 R. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en métodos para tratar una neoplasia hematológica en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto un antagonista de IGF-1 R como se describe en el presente documento. En otra realización, la neoplasia maligna es una leucemia mielógena aguda, una leucemia linfoblástica aguda o una neoplasia maligna de linfocitos T.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para identificar sujetos que tienen más probabilidades de beneficiarse del tratamiento utilizando las composiciones y/o métodos de tratamiento de la presente invención. Tales métodos pueden permitir que un cuidador adapte mejor un régimen terapéutico a las necesidades de un sujeto en particular y reduzca la probabilidad de un curso de tratamiento ineficaz o contraproducente. En una realización, la presente invención proporciona un método para determinar si un sujeto es un candidato para el tratamiento utilizando una composición o un método como se describe en el presente documento que comprende determinar si un tipo de célula diana en el sujeto expresa IGF-1 R, en donde si el tipo de célula diana expresa IGF-1 R, entonces el sujeto es un candidato para el tratamiento. En otra realización, el método comprende determinar el número promedio aproximado de moléculas de IGF-1R por célula diana, en donde 102, 103, 104, 105, o 106 IGF-1R por célula indica que el sujeto es candidato para el tratamiento. El número promedio aproximado de moléculas de IGF-1 R por célula diana se puede determinar utilizando cualquier técnica conocida en la materia, por ejemplo, tiñendo una muestra que comprenda células del tipo de célula diana con una molécula de unión a IGF-1R, y detectando la cantidad de molécula de unión a IGF-1R unida a la muestra, donde la cantidad de molécula de unión a IGF-1R detectada es proporcional al número promedio de moléculas de IGF-1 R en la muestra. En otra realización, el método comprende comparar el número promedio aproximado de moléculas de IGF-1 R por célula diana con un patrón de referencia, en el que si el número promedio aproximado de moléculas de IGF-1R por célula diana es mayor que el patrón de referencia, entonces, es más probable que el sujeto se beneficie del tratamiento usando las composiciones y/o métodos de tratamiento como se divulga en el presente documento. En otra realización, el tipo de célula diana es un tipo de célula cancerosa. En otra realización, el tipo de célula diana es un tipo de célula de cáncer de colon, un tipo de célula de cáncer de mama, un tipo de célula NSCLC, o un tipo de célula leucémica.

En otra realización, un sujeto que es candidato para el tratamiento se identifica mediante la detección de IGF-1 y/o IGF-2 en el tipo de célula diana, o en el estrato del tipo de célula diana. En otra realización, el tipo de célula diana es un tipo de célula cancerosa. En otra realización, el tipo de célula diana es un tipo de célula de cáncer de colon, un tipo de célula de cáncer de mama, un tipo de célula NSCLC, o un tipo de célula leucémica.

En otra realización, un sujeto que es candidato para el tratamiento se identifica mediante la detección de actividad de señalización mediada por IGF-1 R en el tipo de célula diana, en donde la señalización mediada por IGF-1 R en el tipo de célula diana indica que el sujeto es candidato para el tratamiento. Ejemplos de moléculas que pueden controlarse para determinar cambios dependientes de IGF-1 R se muestran en la Figura 10, tales como moléculas en la ruta P13/Akt, p. ej., IGF-1R, adaptadores IRS, Akt, etc. Dichas moléculas pueden controlarse para determinar, por ejemplo, un cambio en el estado de fosforilación, p. ej., un aumento en la fosforilación. Los anticuerpos fosfoespecíficos que reconocen las formas activadas de estos marcadores de proteínas están altamente desarrollados y estos reactivos han demostrado ser confiables para la detección de inmunotransferencia en sistemas experimentales.

Las composiciones y/o métodos de la presente divulgación también se pueden usar, por ejemplo, en tratamientos cosméticos, en tratamientos veterinarios, para aumentar la longevidad, para tratar defectos reproductivos y para tratar una variedad de trastornos relacionados con el crecimiento.

Métodos terapéuticos y administración de proteínas de unión a antígeno

Ciertos métodos proporcionados en el presente documento comprenden administrar una proteína de unión a antígeno que se une a IGF-1R a un sujeto, reduciendo así una respuesta biológica inducida por IGF-1 que desempeña un papel en una afección particular. Como se reivindica o divulga en el presente documento, dichos métodos implican poner en contacto IGF-1 R endógeno con una proteína de unión a antígeno que se une a IGF-1 R, p. ej., a través de la administración a un sujeto o en un procedimiento ex vivo.

El término "tratamiento" abarca el alivio o la prevención de al menos un síntoma u otro aspecto de un trastorno, o la reducción de la gravedad de la enfermedad, y similares. Una proteína de unión a antígeno no necesita efectuar una cura completa o erradicar cada síntoma o manifestación de una enfermedad, para constituir un agente terapéutico viable. Como se reconoce en el campo pertinente, los fármacos empleados como agentes terapéuticos pueden reducir la gravedad de una patología determinada, pero no es necesario que se eliminen todas las manifestaciones de la enfermedad para que se consideren terapéuticos útiles. De manera similar, un tratamiento administrado profilácticamente no necesita ser completamente eficaz para prevenir la aparición de una afección para constituir un agente profiláctico viable. Simplemente reduciendo el impacto de una enfermedad (por ejemplo, reduciendo el número o la gravedad de sus síntomas o aumentando la eficacia de otro tratamiento o produciendo otro efecto beneficioso) o reduciendo la probabilidad de que se produzca o empeore la enfermedad en un sujeto, es suficiente. Una realización de la divulgación está dirigida a un método que comprende administrar a un paciente un antagonista de IGF-1R en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejora sostenida con respecto al momento inicial de un indicador que refleja la gravedad del trastorno particular.

Como se entiende en el campo pertinente, las composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de la invención se administran a un sujeto de una manera apropiada para la indicación. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo, pero sin limitación, por vía parenteral, vía tópica o por inhalación. Si se inyectan, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar, por ejemplo, por vía intraarticular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal o subcutánea, mediante inyección de bolo o infusión continua. Se contempla la administración localizada, p. ej., en un sitio de enfermedad o lesión, como la administración transdérmica y la liberación sostenida desde implantes. La administración por inhalación incluye, por ejemplo, la inhalación nasal u oral, el uso de un nebulizador, inhalación del antagonista en forma de aerosol, y similares. Otras alternativas incluyen gotas para los ojos; preparaciones orales que incluyen píldoras, jarabes, pastillas o chicles; y preparaciones tópicas como lociones, geles, sprays y ungüentos.

También se contempla el uso de proteínas de unión a antígeno en procedimientos ex vivo. Por ejemplo, la sangre u otro fluido corporal de un paciente puede ponerse en contacto con una proteína de unión a antígeno que se une a IGF-1 R ex vivo. La proteína de unión a antígeno puede estar unida a una matriz insoluble adecuada o material de soporte sólido.

Ventajosamente, las proteínas de unión a antígeno se administran en forma de una composición que comprende uno o más componentes adicionales tales como un transportador, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Opcionalmente, la composición comprende además uno o más agentes fisiológicamente activos, por ejemplo, una segunda sustancia inhibidora del receptor de IGF-1, una sustancia antiangiogénica, una sustancia quimioterapéutica, una sustancia analgésica, etc., cuyos ejemplos no exclusivos se proporcionan en el presente documento. En diversas realizaciones particulares, la composición comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis agentes fisiológicamente activos además de una proteína de unión a antígeno de unión a IGF-1 R

En una realización, la composición farmacéutica comprende una proteína de unión a antígeno de la invención junto con una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en un tampón, un antioxidante tal como ácido ascórbico, un polipéptido de bajo peso molecular (tal como aquellos que tienen menos de 10 aminoácidos), una proteína, un aminoácido, un hidrato de carbono tal como glucosa, sacarosa o dextrinas, un agente quelante tal como EDTA, glutatión, un estabilizador y un excipiente. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina de suero coespecífica son ejemplos de diluyentes apropiados. De acuerdo con los estándares apropiados de la industria, también se pueden añadir conservantes tales como el alcohol bencílico. La composición se puede formular como un liofilizado usando soluciones de excipientes apropiadas (p. ej., sacarosa) como diluyentes. Los componentes adecuados no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. Otros ejemplos de componentes que pueden emplearse en formulaciones farmacéuticas se presentan en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 16a edición. (1980) y 20a Ed. (2000), Mack Publishing Company, Easton, PA.

Los kits para su uso por profesionales médicos incluyen una sustancia inhibidora del receptor de IGF-1 de la invención y un marcador u otras instrucciones para su uso en el tratamiento de cualquiera de las afecciones analizadas en el presente documento. En una realización, el kit incluye una preparación estéril de una o más proteínas de unión a antígeno que se unen a IGF-1R, que puede estar en forma de una composición como se divulga anteriormente, y puede estar en uno o más viales.

Las dosis y la frecuencia de administración pueden variar de acuerdo con factores tales como la vía de administración, las proteínas de unión a antígeno particulares empleadas, la naturaleza y la gravedad de la enfermedad a tratar, si la afección es aguda o crónica, y el tamaño y el estado general del sujeto. Las dosis apropiadas se pueden determinar mediante procedimientos conocidos en la técnica pertinente, p. ej., en ensayos clínicos que pueden implicar estudios de aumento de la dosis.

Se puede administrar una sustancia inhibidora del receptor de IGF-1 de la invención, por ejemplo, una vez o más de una vez, p. ej., a intervalos regulares durante un período de tiempo. En realizaciones particulares, una proteína de unión a antígeno se administra durante un período de al menos un mes o más, p. ej., durante uno, dos o tres meses o incluso indefinidamente. Para tratar afecciones crónicas, en general, es más eficaz el tratamiento a largo plazo. Sin embargo, para tratar afecciones agudas, la administración durante períodos más cortos, p. ej., de una a seis semanas, puede ser suficiente. En general, la proteína de unión a antígeno se administra hasta que el paciente manifieste un grado de mejora médicamente relevante con respecto al momento inicial para el indicador o los indicadores escogidos.

Realizaciones particulares de la presente descripción implican administrar una proteína de unión a antígeno a una dosis de aproximadamente 1 ng de proteína de unión a antígeno por kg de peso del sujeto por día ("1ng/kg/día") a aproximadamente 10 mg/kg/día, más preferentemente de aproximadamente 500 ng/kg/día a aproximadamente 5 mg/kg/día, y lo más preferentemente de aproximadamente 5 pg/kg/día a aproximadamente 2 mg/kg/día, a un sujeto. En realizaciones adicionales, una proteína de unión a antígeno se administra a adultos una vez por semana, dos veces por semana o tres o más veces por semana, para tratar una enfermedad, afección o trastorno mediados por IGF-1 y/o IGF-2, p. ej., un trastorno médico divulgado en el presente documento. Si se inyecta, la cantidad eficaz de proteína de unión a antígeno por dosis para adultos puede variar de 1-20 mg/m2, y preferentemente es de aproximadamente 5-12 mg/m2. Como alternativa, se puede administrar una dosis fija; la cantidad puede variar de 5­ 100 mg/dosis. Un intervalo para una dosis fija es de aproximadamente 20-30 mg por dosis. En una realización de la presente divulgación, se administra una dosis fija de 25 mg/dosis de manera repetida mediante inyección. Si se utiliza una vía de administración diferente a la inyección, la dosis se ajusta de acuerdo con las prácticas médicas convencionales. Un ejemplo de un régimen terapéutico implica inyectar una dosis de aproximadamente 20-30 mg de proteína de unión a antígeno de una a tres veces por semana durante un período de al menos tres semanas, aunque puede ser necesario el tratamiento durante períodos más prolongados para inducir el grado de mejora deseado. Para sujetos pediátricos (edad 4-17), un régimen adecuado ejemplar implica la inyección subcutánea de 0,4 mg/kg, hasta una dosis máxima de 25 mg de proteína de unión a antígeno administrada dos o tres veces por semana.

Realizaciones particulares de los métodos proporcionados en el presente documento implican la inyección subcutánea de 0,5 mg a 10 mg, preferentemente de 3 a 5 mg, de una proteína de unión a antígeno, una o dos veces por semana. Otra realización está dirigida a la administración pulmonar (p. ej., por nebulizador) de 3 o más mg de proteína de unión a antígeno una vez por semana.

Ejemplos de regímenes terapéuticos proporcionados en el presente documento comprenden la inyección subcutánea de una proteína de unión a antígeno una vez por semana, a una dosis de 1,5 a 3 mg, para tratar una afección en la que la señalización de IGF-1R desempeña un papel. Ejemplos de tales afecciones se proporcionan en el presente documento e incluyen, por ejemplo, cáncer, acromegalia y otros trastornos de sobrecrecimiento, diabetes, obesidad, degeneración macular y envejecimiento. La administración semanal de la proteína de unión a antígeno continúa hasta que se logre un resultado deseado, p. ej., disminuyen los síntomas del sujeto. El tratamiento puede reanudarse según sea necesario o, como alternativa, se pueden administrar dosis de mantenimiento.

Otros ejemplos de regímenes terapéuticos proporcionados en el presente documento comprenden la administración subcutánea o intravenosa de una dosis de 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 o 20 miligramos de un inhibidor de IGF-1R de la presente invención por kilogramo de masa corporal del sujeto (mg/kg). La dosis se puede administrar una vez al sujeto, o más de una vez en un cierto intervalo, por ejemplo, una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, tres veces al mes, dos veces al mes, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses o una vez al año. La duración del tratamiento, y cualquier cambio en la dosis y/o la frecuencia del tratamiento, se pueden alterar o variar durante el curso del tratamiento para satisfacer las necesidades particulares del sujeto.

En otra realización, una proteína de unión a antígeno se administra al sujeto en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejora, preferentemente una mejora sostenida, en al menos un indicador que refleja la gravedad del trastorno que se está tratando. Se pueden evaluar diversos indicadores que reflejan la extensión de la dolencia, enfermedad o afección del sujeto para determinar si la cantidad y la duración del tratamiento son suficientes. Dichos indicadores incluyen, por ejemplo, indicadores clínicamente reconocidos de la gravedad de la enfermedad, los síntomas o las manifestaciones del trastorno en cuestión. En una realización, una mejora se considera sostenida si el sujeto muestra la mejora en al menos dos ocasiones separadas por dos a cuatro semanas. El grado de mejoría generalmente lo determina un médico, que puede tomar esta determinación basándose en los signos, síntomas, biopsias u otros resultados de las pruebas, y que también puede emplear cuestionarios que se administran al sujeto, tales como cuestionarios de calidad de vida desarrollados para una enfermedad dada.

Los niveles elevados de IGF-1 y/o IGF-2 se asocian con varios trastornos, incluyendo, por ejemplo, cáncer (p. ej., cánceres de pulmón, próstata, mama y colon), y acromegalia y otros trastornos de sobrecrecimiento (p. ej., niños constitucionalmente altos). Los sujetos con un trastorno dado pueden analizarse, para identificar a aquellos individuos que tienen niveles elevados de IGF-1 y/o IGF-2, identificando así a los sujetos que más pueden beneficiarse del tratamiento con una proteína de unión a antígeno que se une a IGF-1 R. Por lo tanto, los métodos de tratamiento proporcionados en el presente documento comprenden opcionalmente una primera etapa para medir los niveles de IGF-1 y/o IGF-2 de un sujeto. Se puede administrar una proteína de unión a antígeno a un sujeto en el que los niveles de IGF-1 y/o IGF-2 están elevados por encima de lo normal. En una realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en un método para tratar un trastorno de sobrecrecimiento (p. ej., acromegalia) que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una proteína de unión a antígeno de la presente invención y pegvisomant.

Los niveles de un sujeto de IGF-1 y/o IGF-2 pueden controlarse antes, durante y/o después del tratamiento con una proteína de unión a antígeno, para detectar cambios, si los hubiera, en sus niveles. Para algunos trastornos, la incidencia de niveles elevados de IGF-1 y/o IGF-2 puede variar de acuerdo con factores tales como la etapa de la enfermedad o la forma particular de la enfermedad. Se pueden emplear técnicas conocidas para medir los niveles de IGF-1 y/o IGF-2, p. ej., en el suero de un sujeto. Los niveles de IGF-1 y/o IGF-2 en muestras de sangre pueden medirse utilizando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, ELISA.

Realizaciones particulares de los métodos y composiciones de la invención implican el uso de una proteína de unión a antígeno y uno o más antagonistas de IGF-1 R adicionales, por ejemplo, dos o más proteínas de unión a antígeno de la invención o una proteína de unión a antígeno de la invención y uno o más antagonistas de IGF-1 R diferentes. En realizaciones adicionales, la proteína de unión a antígeno se administra sola o en combinación con otros agentes útiles para tratar la afección con la que se ve afectado el paciente. Ejemplos de tales agentes incluyen fármacos tanto proteicos como no proteicos. Cuando se administran de forma simultánea múltiples agentes terapéuticos, las dosis se pueden ajustar en consecuencia, como se reconoce en el campo pertinente. La "administración conjunta" y la terapia de combinación no se limitan a la administración simultánea, sino que también incluyen regímenes de tratamiento en los que se administra una proteína de unión a antígeno al menos una vez durante un curso de tratamiento que implica administrar al paciente otro agente terapéutico.

Ejemplos de otros agentes que pueden administrarse conjuntamente con una proteína de unión a antígeno son otras proteínas de unión a antígeno o polipéptidos terapéuticos que se eligen de acuerdo con la afección particular a tratar. Como alternativa, los fármacos no proteínicos que son útiles para tratar una de las afecciones particulares analizadas anteriormente pueden administrarse conjuntamente con un antagonista de IGF-1 R.

Terapia de combinación

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno para su uso en un método para tratar a un sujeto con una proteína de unión a antígeno inhibidora de IGF-1 R y uno o más tratamientos diferentes. En una realización, dicha terapia de combinación logra una sinergia o un efecto aditivo, por ejemplo, atacando múltiples sitios o dianas moleculares en un tumor. Los tipos de terapias de combinación que se pueden usar en relación con la presente invención incluyen inhibir o activar (según corresponda) múltiples nodos en una única vía relacionada con la enfermedad, múltiples vías en una célula diana y múltiples tipos celulares dentro de un tejido diana ( por ejemplo, dentro de un tumor). Por ejemplo, un inhibidor de IGF-1R de la presente invención se puede combinar con un tratamiento que inhibe IGF-1, promueve la apoptosis, inhibe la angiogénesis o inhibe los macrófagos. En otra realización, un agente dirigido, que, cuando se usa por sí solo, no logra provocar un efecto terapéuticamente deseado, podría usarse para, por ejemplo, sensibilizar células cancerosas o aumentar el efecto del tratamiento de otros agentes. En otra realización, se usa un inhibidor de IGF-1 R de acuerdo con la invención en combinación con un fármaco citotóxico u otro agente dirigido que induce la apoptosis. En otra realización, se usa un inhibidor de IGF-1R en combinación con uno o más agentes que inhiben diferentes dianas que están implicadas en la supervivencia celular (p. ej., PKB, mTOR), diferentes tirosina quinasas receptoras (p. ej., ErbB1, ErbB2, c-Met, c-kit) o diferentes tipos celulares (p. ej., inhibidores de KDR, c-fms). En otra realización, se añade un inhibidor de IGF-1R de la invención al tratamiento de referencia existente para una afección particular. Ejemplos de agentes terapéuticos incluyen, aunque sin limitación, gemcitabina, taxol, taxotere y CPT-11.

En otra realización, un método de terapia de combinación comprende administrar al sujeto dos, tres, cuatro, cinco, seis, o más de los agonistas o antagonistas de IGF-1 R descritos en el presente documento. En otra realización, el método comprende administrar al sujeto dos o más tratamientos que juntos inhiben o activan (directa o indirectamente) la transducción de señales mediada por IGF-1 R. Ejemplos de tales métodos incluyen el uso de combinaciones de dos o más proteínas de unión a antígeno inhibidoras de IGF-1R, de una proteína de unión a antígeno inhibidora de IGF-1R y uno o más agonistas o antagonistas de IGF-1, IGF-2, y/o IGF-1R diferentes (p. ej., polipéptidos de unión a IGF-1 y/o IGF-2, polipéptidos de unión a IGF-1R, derivados de IGF-1 y/o IGF-2, anticuerpos anti-IGF-1 y/o IGF-2, ácidos nucleicos antisentido contra IGF-1, IGF-2, y/o IGF-1R, u otras moléculas que se unen a polipéptidos o ácidos nucleicos de IGF-1, IGF-2 y/o IGF-1R) o de una proteína de unión a antígeno inhibidora de IGF-1R y pueden emplearse uno o más tratamientos diferentes (p. ej., cirugía, ultrasonidos, radioterapia, quimioterapia o tratamiento con otro agente anticanceroso), tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de E^e .UU. N° 5.473.054 (expedida el 5 de diciembre de 1995), 6.051.593 (expedida el 18 de abril de 2000), 6.084.085 (expedida el 4 de julio de 2000), 6.506.763 (expedida el 14 de enero de 2003), Las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos números 03/0092631 (publicada el 15 de mayo de 2003 ), 03/0165502 (publicada el 4 de sept. de 2003), 03/0235582 (publicada el 25 de diciembre de 2003), 04/0886503 (publicada el 6 de mayo de 2004), 05/0272637 (publicada el 8 de diciembre de 2005), Las publicaciones PCT N° de Ser. WO 99/60023 (publicada el 25 de noviembre de 1999), WO 02/053596 (publicado el 11 de julio de 2002), WO 02/072780 (publicada el 19 de sept. de 2002), WO 03/027246 (publicado el lunes, 3 de marzo de 2003), ^w O 03/020698 (publicado el jueves, 13 de marzo de 2003), WO 03/059951 (publicado el jueves, 24 de julio de 2003), WO 03/100008 (publicada el 4 de diciembre de 2003), WO 03/106621 (publicada el 24 de diciembre de 2003), WO 04/071529 (publicado el jueves, 26 de agosto de 2004), WO 04/083248 (publicada el 30 de sept. de 2004), WO 04/087756 (publicada el 14 de oct. de 2004), WO 05/112969 (publicada el 1 de diciembre de 2005), Kull et al., 1983, J Biol Chem 258:6561-66, Flier et al., 1986, Proc Natl Acad Sci USA 83:664-668, Conover et al., 1987, J Cell Physiol 133:560-66, Rohlik et al., 1987, Biochem Biophys Res Comm 149:276-81, Arteaga et al., 1989, J Clinical Investigation 84:1418-23, Arteaga et al., 1989, Cancer Res 49:6237-41, Gansler et al., 1989, American J Pathol 135:961-66, Gustafson et al., 1990, J Biol Chem 265:18663-67, Steele-Perkins et al., 1990, Biochem Biophys Res Comm 171:1244-51, Cullen et al., 1992, Mol Endocrinol 6:91-100, Soos et al., 1992, J Biol Chem 267:12955-63, Xiong et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:5356-60, Brunner et al., 1993, Euro J Cancer 29A:562-69, Furlanetto et al., 1993, Cancer Res 53:2522-26, Li et al., 1993, Biochem Biophys Res Comm 196:92-98, Kalebic et al., 1994, Cancer Res 54:5531-34, Lahm et al., 1994, Intl J Cancer 58:452-59, Zia et al., 1996, J Cell Biochem Supp 24:269-75, Jansson et al., 1997, J Biol Chem 272:8189-97, Scotlandi et al., 1998, Cancer Res 58:4127-31, Logie et al., 1999, Li et al., 2000, Cancer Immunol Immunotherapy 49:243-52, J Mol Endocrinol 23:23-32, De Meyts et al., 2002, Nature Reviews 1:769-83, Hailey et al., 2002, Mol Cancer Therapeutics 1:1349-53, Maloney et al., 2003, Cancer Research 63:5073-83, Burtrum et al., 2003, Cancer Research 63:8912-21 y Karavitaki et al., 2004, Hormones 3:27-36, en métodos y composiciones de la presente invención. Además, se pueden usar uno o más anticuerpos o derivados de anticuerpos anti-IGF-1 R en combinación con una o más moléculas u otros tratamientos, en donde la(s) otra(s) molécula(s) y/o el(los) tratamiento(s) no se unen directamente a o no afectan a IGF-1R, IGF-1 o IGF-2, pero cuya combinación es efectiva para tratar o prevenir una afección, tal como cáncer o un trastorno de sobrecrecimeinto (p. ej., acromegalia). En una realización, una o más de la(s) molécula(s) y/o tratamiento(s) trata(n) o previene(n) una afección causada por una o más de la otra(s) molécula(s) o tratamiento(s) en el curso de la terapia, p. ej., náuseas, fatiga, alopecia, caquexia, insomnio, etc. En todos los casos en los que se utiliza una combinación de moléculas y/u otros tratamientos, la(s) molécula(s) individual(es) y/o el(los) tratamiento(s) pueden administrarse en cualquier orden, durante cualquier período de tiempo, lo que es eficaz, p. ej., simultáneamente, consecutivamente, o alternativamente. En una realización, el método de tratamiento comprende completar un primer curso de tratamiento con una molécula u otro tratamiento antes de comenzar un segundo curso de tratamiento. El tiempo transcurrido entre el final del primer curso de tratamiento y el comienzo del segundo curso de tratamiento puede ser cualquier período de tiempo que permita que el curso total de la terapia sea eficaz, p. ej., segundos, minutos, horas, días, semanas, meses o incluso años.

En otra realización, el método comprende administrar uno o más de los antagonistas de IGF-1 R descritos en el presente documento y uno o más tratamientos diferentes (p. ej., un tratamiento terapéutico o paliativo), por ejemplo, tratamientos contra el cáncer (tal como cirugía, ecografía, radioterapia, quimioterapia o tratamiento con otro agente anticanceroso). Cuando un método comprende administrar más de un tratamiento a un sujeto, debe entenderse que el orden, tiempo, número, concentración y volumen de las administraciones están limitados solo por los requisitos médicos y las limitaciones del tratamiento, es decir, dos tratamientos se pueden administrar al sujeto, p. ej., simultáneamente, consecutivamente, alternativamente o de acuerdo con cualquier otro régimen. Ejemplos de agentes que pueden administrarse en combinación con los antagonistas de IGF-1R descritos en el presente documento incluyen, aunque sin limitación, agentes estimulantes de neutrófilos, irinotecán, SN-38, gemcitabina, herstatina, o un derivado de herstatina de unión a IGF-1 R (como se describe, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente N.° 05/0272637), AVASTIN® (Genentech, South San Francisco, CA), HERCEPTIN® (Genentech), RITUXAN® (Genentech), ARIMIDEX® (AstraZeneca, Wilmington, DE), Ir Es SA® (AstraZeneca), BEXXAR® (Corixa, Seattle, WA), ZEV^a LⁱN® (Biogen Idec, Cambridge, MA), ERBⁱT^uX® (Imclone Systems Inc., New York, NY), GEMZAR® (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), CAMPTOSAR® (Pfizer, New York, NY), GLEEVEC® (Novartis), SU-11248 (Pfizer), BMS-354825 (Bristol-Myers Squibb), panitumumab (Abgenix, Fremont, CA/Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) y denosumab (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA).

Los ejemplos siguientes, tanto reales como pronósticos, se proporcionan con el propósito de ilustrar realizaciones o características específicas de la presente invención y no limitan su alcance.

Ejemplo 1: Preparación de Anticuerpos

Este ejemplo demuestra un método para preparar anticuerpos que reconocen el receptor de IGF-1. Los polipéptidos del receptor de IGF-1 pueden emplearse como inmunógenos para generar anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales. Se reconoce que se pueden emplear polipéptidos en diversas formas como inmunógenos, p. ej., proteínas de longitud completa, fragmentos de las mismas, proteínas de fusión de las mismas, tales como fusiones Fc, células que expresan la proteína recombinante en la superficie celular, etc.

Para resumir un ejemplo de tal procedimiento, un inmunógeno de IGF-1R emulsionado en adyuvante completo de Freund se inyecta por vía subcutánea en ratas Lewis, en cantidades que varían de 10-100 pl. Tres semanas después, los animales inmunizados se refuerzan con inmunógeno adicional emulsionado en adyuvante incompleto de Freund y se refuerzan cada tres semanas a partir de entonces. Las muestras de suero se toman periódicamente por sangrado retro-orbital o escisión de la punta de la cola para analizarlas mediante el análisis de transferencia puntual, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas), o la inhibición de la unión de 125I-IGF-1 o 125I-IGF-2 a los extractos de células que expresan IGF-1R. Tras la detección de un título de anticuerpo apropiado, los animales positivos reciben una inyección intravenosa final de antígeno en solución salina. Tres o cuatro días después, los animales se sacrifican, se recogen los esplenocitos y se fusionan con la línea celular de mieloma murino AG8653.

Las líneas celulares de hibridoma resultantes se colocan en placas de microtitulación en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células sin fusionar, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.

Se analizan los clones de hibridoma generados de este modo, para determinar la reactividad con IGF-1R. El análisis inicial de los sobrenadantes de hibridoma utiliza una captura de anticuerpos y la unión del receptor 125I-IGF-1 parcialmente purificado. Los hibridomas que son positivos en este método de análisis se prueban mediante una captura de anticuerpos modificada para detectar líneas celulares de hibridomas que producen anticuerpos bloqueantes. De este modo se detectan los hibridomas que secretan un anticuerpo monoclonal capaz de inhibir la unión de 125I-IGF-1 a células que expresan IGF-1R. Dichos hibridomas se inyectan, a continuación, en las cavidades peritoneales de ratones atímicos para producir líquido ascítico que contiene altas concentraciones (> 1 mg/ml) de anticuerpo monoclonal anti-IGF-1 R. Los anticuerpos monoclonales resultantes pueden purificarse por precipitación con sulfato de amonio seguida de cromatografía de exclusión en gel y/o cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína G.

Se pueden usar métodos similares para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos. Véase, p. ej., Chekn et al., 1993, lnternat. Immunol. 5: 647-56; Chen et al., 1993, EMBO J. 12: 821-30; Choi et al., 1993, Nature Genetics 4: 117-23; Fishwild et al., 1996, Nature Biotech. 14: 845-51; Harding et al., 1995, Annals New York Acad. Sci.; Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59; Lonberg, 1994, Handbook Exper.l Pharmacol. 113: 49-101; Lonberg et al., 1995, Internal Rev. Immunol. 13: 65-93; Morrison, 1994, Nature 368: 812-13; Neuberger, 1996, Nature Biotech. 14: 826; Taylor et al., 1992, Nuc. Acids Res. 20: 6287-95; Taylor et al., 1994, lnternat. Immunol. 6: 579-91; Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16: 133-43; Tomizuka et al., 2000, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97: 722-27; Tuaillon et al., 1993, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 3720-24; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152: 2912-20; Russel et al., 2000, Infection and Immunity April 2000: 1820-26; Gallo et al., 2000, Eur. J. Immunol. 30: 534-40; Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25; Green, 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23; Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Rev. 31:33-42; Green et al., 1998, J. Exp. Med. 188: 483-95; Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7: 607-14; Tsuda et al., 1997, Genomics 42: 413-21; Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15: 146-56; Jakobovits, 1996, Weir's Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System Vol. IV, 194.1-194.7; Mendez et al., 1995, Genomics 26: 294-307; Jakobovits, 1994, Current Biol. 4: 761-63; Arbones, 1994, Immunity 1: 247-60; Green et al., 1994, Nature Genetics 7: 13-21; Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 255-58; Jakobovits et al., 1993,. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 2551-55.

Ejemplo 2: Aislamiento de IGF-1R(ECD)-C3-muIgG1 humano

Este ejemplo proporciona un método para producir un fragmento soluble de IGF-1 R sea útil para generar anticuerpos. Clonación de pDSRa:huIGF-1 R(ECD)-C3-muIgG1 Fc

Se usaron los cebadores 2830-36:

5' AGCAAGCTTCCACCATGAAGTCTGGCTCCGGAGGAGG 3' SEQ ID NO:256) y

2830-38: 5' ATTTGTCGACTTCGTCCAGATGGATGAAGTTTTCAT 3', SEQ ID NO:257)

para amplificar la secuencia de ADNc del dominio extracelular (1-906) de IGF-1R humano. Los cebadores incluían una secuencia de inicio de la traducción de Kozak (subrayada arriba) que precede al codón de inicio, los sitios de restricción para la subclonación subsiguiente y un sitio de caspasa-3, que se inserta junto al extremo C del dominio extracelular. Se realizó la PCR en un PerkinElmer 2400 (PerkinElmer, Torrance, CA) en las siguientes condiciones: 1 ciclo a 95 ° C durante 2 min, 23 ciclos a 95 0C durante 30 segundos, 58,5 0C durante 30 segundos y 72 0C durante 3 minutos y 1 ciclo a 72 0C durante 10 minutos. Las condiciones de reacción finales fueron 1X pfu de tampón TURBO® (Stratagene, La Jolla, CA), DNTP 200 pM, 2 pM de cada cebador, 5 U pfu de TURBO® (Stratagene) y 1 ng de ADN plantilla. El producto de la PCR se purificó utilizando una columna de Nucleospin Clontech (Clontech, Palo Alto, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se digirió con Hind III y Sal I (Roche, Indianápolis, IN) y se purificó en gel. El inserto de IGF-1R humano se ligó a pDSRa-muIgG1 digerido con HindIII/SalI. La integridad del inserto se confirmó por secuenciación de ADN. La secuencia de la proteína codificada por el marco de lectura abierto resultante (IGF-1R-C3-muFc) se muestra en la Figura 10. El vector de expresión final, pDSRa:huIGF1 R(ECD)-C3-muIgG1 Fc, se describe en la Tabla 1.

Tabla 1

continuación

Expresión de IGF-1 R(ECD)-C3-muIgG1 Fc humano

Se transfectaron quince microgramos de vector de expresión linealizado pDSRa:huIGF1R(ECD)-C3-muIgG1Fc en células AM-1/D CHOd utilizando el reactivo de lipofección LT1 (PanVera Corp., Madison, WI) y se cultivaron las células en condiciones para permitir la expresión y secreción de proteínas en el medio celular. Se seleccionaron veinticuatro colonias después de 10-14 días en medio de selección de DHFR (Medio Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen) complementado con suero bovino fetal dializado al 10 %, 1x penicilina-estreptomicina (Invitrogen)) y se evaluaron los niveles de expresión por transferencia Western. Para realizar este ensayo, se añadieron 0,5 ml de medio sin suero a un solo pocillo de células confluentes cultivadas en una placa de 24 pocillos (Falcon). El medio condicionado se recuperó después de 48 h. Las muestras para la transferencia de Western se procesaron en gel de Tris-glicina al 10 % (Novex) y se transfirieron en una membrana de nitrocelulosa de 0,45 pm (Invitrogen), utilizando la célula Mini Trans-Blot (Biorad). Las membranas de transferencia se incubaron con anticuerpo IgG Fc anti-ratón de conejo, conjugado con peroxidasa de rábano picante (Pierce). El clon que expresa el nivel más alto de IGF-1R(ECD)-C3-muIgG1Fc se expandió en medio de selección de DHFR y se inocularon 2 x 107 células en 50 frascos rotatorios cada una (Corning) en 250 ml de DMEM de alto contenido de glucosa (Invitrogen), FBS dializado al 10 % (Invitrogen), 1x glutamina (Invitrogen), 1x aminoácidos no esenciales (Invitrogen), 1x piruvato de sodio (Invitrogen). El medio se gasificó con CO2/aire de equilibrio al 10% durante 5 segundos antes de tapar el frasco rotatorio. Los frascos rotatorios se mantuvieron a 370C en rejillas rotatorias que giraban a 0,75 rpm.

Cuando las células alcanzaron aproximadamente el 85-90 % de confluencia (después de aproximadamente 5-6 días en cultivo), se descartó el medio de crecimiento, las células se lavaron con 100 ml de PBS y se añadieron 200 ml de medio de producción (DMEM al 50 % (Invitrogen)/F12 al 50 % ( Invitrogen), 1x glutamina (Invitrogen), 1x aminoácidos no esenciales (Invitrogen), 1x piruvato de sodio (Invitrogen), DMSO al 1,5% (Sigma )). El medio condicionado se recogió y se reemplazó a intervalos de una semana. Se filtraron los 30 litros resultantes de medio condicionado a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 pm (Corning, Acton, MA).

Purificación de IGF-1 R(ECD)-C3-muIgG1 Fc humano

El filtrado resultante del medio condicionado se concentró 20 veces utilizando un cartucho enrollado en espiral (valor límite de peso molecular = 10 kDa), a continuación se diluyó 1:1 con KCl 3 M, glicina 1 M, pH 9.0 para llevar la concentración de sal final hasta KCl 1,5 M, glicina 0,5 M, pH 9,0. Esta muestra se aplicó a una columna r-proteína A-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) que se había equilibrado en KCl 1,5 M, glicina 0,5 M, pH 9,0. Se lavó la columna con 40 volúmenes de columna del mismo tampón, a continuación se eluyó con 20 volúmenes de columna de glicina-HCl 0,1 M, pH 2,8. Se recogieron fracciones de cinco ml y se neutralizaron inmediatamente con 1 ml de Tris-HCl 1 M, pH 7,5. Se identificaron las fracciones que contenían huIGF1R(ECD)-C3-muIgGFc mediante SDS-PAGE, se agruparon y se dializaron frente a solución salina tamponada con fosfato. El rendimiento fue de 2,4 mg/l de medio condicionado. Las principales especies de proteínas detectadas fueron las cadenas a y p maduras y la Fc murina, cada una de las cuales parecía estar adecuadamente glicosilada en función de sus pesos moleculares elevados y heterogéneos. El IGF-IR(ECD) no procesado, así como el IGF-IR(ECD) glicosilado, pero no escindido proteolíticamente, también estaban presenten en la preparación. El desplazamiento en las bandas a pesos moleculares más altos en condiciones no reductoras indica que los enlaces disulfuro se unen a las cadenas a y p. La secuenciación amino-terminal del producto final indicó que el 60% de la proteína se procesó correctamente entre las cadenas a y p de IGF-1 R(ECD), mientras que el 40 % permaneció sin procesar.

Ejemplo 3: Aislamiento de INSR(ECD)-muIgG1 humano

Este ejemplo presenta un método de clonación y expresión de un fragmento soluble del receptor de insulina humano. Clonación de pDSRa:huINSR(ECD)-muIgG1 Fc

Se utilizaron los cebadores 2830-40:

5' AGCAAGCTTCCACCATGGGCACCGGGGGCCGG 3' SEQ ID NO:259 (sitio Hind III subrayado) y 2830-41: 5' ATTTGTCGACTTTTGCAATATTTGACGGGACGTCTAA 3' SEQ ID NO:260

(sitio Sal I subrayado) para amplificar el dominio extracelular de INSR humano (1-929) y el plásmido precursor de INSR que codifica la forma B de la variante de corte y empalme de INSR (Ullrich et al., 1985, Nature 313:756-61; Ebina et al., 1985, Cell 40:747-58). Los cebadores incluían una secuencia de inicio de la traducción de Kozak que precede al codón de inicio y los sitios de restricción para la subclonación posterior. Se realizó la PCR en un PerkinElmer 2400 en las siguientes condiciones: 1 ciclo a 95 ° C durante 2 min, 32 ciclos a 95 0C durante 30 segundos, 58,5 0C durante 30 segundos y 72 0C durante 3 minutos y 1 ciclo a 72 0C durante 10 minutos. Las condiciones de reacción finales fueron 1X pfu de tampón TURBO®, DNTP 200 pM, 2 pM de cada cebador, 5 U pfu de TURBO® (Stratagene) y 10 ng de ADN plantilla. El producto de la PCR se purificó utilizando una columna de NUCLEOSPIN® (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se digirió con Hind II y SalI (Roche) y se purificó en gel antes de la unión a pDSRa-muIgG1 digerido con HindIII/Sa/I. La integridad del inserto se confirmó por secuenciación de ADN. La secuencia de proteínas de INSR-muFc se muestra en la Figura 11. El vector de expresión final se describe en la Tabla 2.

Tabla 2

continuación

Expresión de INSR(ECD)-C3-muIgG1 Fc humano

Se transfectaron células AM-1/D CHOd con 15 pm de vector de expresión linealizado pDSRa:huINSR(ECD)-muIgGIFc utilizando el reactivo de lipofección FUGENE™ 6 (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN), a continuación, se cultivaron en condiciones para permitir la expresión y secreción de proteínas en el medio celular. Las colonias se seleccionaron y analizaron como se describe anteriormente.

Purificación de INSR(ECD)-C3-muIgG1Fc humano

El medio condicionado filtrado que contenía huINSR(ECD)-muIgGFc se concentró 17 veces utilizando un cartucho enrollado en espiral (valor límite de peso molecular = 10 kDa), a continuación se diluyó 1:1 con KCl 3 M, glicina 1 M, pH 9.0 para llevar la concentración de sal final hasta KCl 1,5 M, glicina 0,5 M, pH 9,0. Esta muestra se aplicó a una columna rProteína A-Sepharose (Pharmacia) que se había equilibrado en KCl 1,5 M, glicina 0,5 M, pH 9,0. Se lavó la columna con 40 volúmenes de columna del mismo tampón, a continuación se eluyó con 20 volúmenes de columna de glicina-HCl 0,1 M, pH 2,8. Se recogieron fracciones de cinco ml y se neutralizaron inmediatamente con 1ml de Tris-HCl 1 M, pH 7,5. Se identificaron las fracciones que contenían huINSR(ECD)-muIgGFc mediante SDS-PAGE, se agruparon y se dializaron frente a solución salina tamponada con fosfato. El rendimiento fue de 0,9 mg/l de medio condicionado. Las principales especies de proteínas fueron las cadenas a y p maduras y la Fc murina. Cada una de estas especies parecía estar adecuadamente glicosilada en función de sus pesos moleculares elevados y heterogéneos. El INSR(ECD) sin procesar, así como el INSR(ECD) glicosilado, pero no escindido proteolíticamente, también estaba presente en la preparación. El desplazamiento en las bandas a pesos moleculares más altos en condiciones no reductoras indicó que los enlaces disulfuro se unieron a las cadenas a y p. La secuenciación aminoterminal del producto final indicó que el 87 % de la proteína se procesó correctamente entre las cadenas a y p del INSR(ECD), mientras que el 13 % permaneció sin procesar.

Ejemplo 3: Análisis inicial para el Fab de fago anti-IGF-IR

Este ejemplo proporciona un método para identificar anticuerpos anti-IGF-1 R.

Se obtuvo una biblioteca de Fab Target Quest Q ("la biblioteca TQ"; Target Quest, Maastricht, Países Bajos), que se construyó utilizando linfocitos de sangre periférica de cuatro donantes sanos y linfocitos esplénicos de un paciente con carcinoma gástrico. La diversidad de la biblioteca fue de 3,7 x 1010 clones, que contenían 3x109 cadenas pesadas. Se han publicados la fuente, los métodos de análisis y la caracterización de la biblioteca (de Haard et al, 1999, J Biol Chem 274:18218-30). Las Dynabeads (200 pl) M-450 sin recubrir (número de catálogo 140.02, Dynal, Lake Success, NY) se lavaron 3 veces con PBS, se resuspendieron en 200 pl de IGF1R(ECD)-C3-mFc a una concentración de 0,5 pM en PBS y se incubaron a 4 0C en un rotador durante la noche. Las perlas recubiertas con IGF-1R(ECD)-C3-mFc se lavaron 3x con 1 ml de leche en polvo (M) desnatada al 2 % en PBS (MPBS al 2%) y a continuación, se bloquearon con 1 ml de MPBS al 2 % a temperatura ambiente durante 1 hora. En paralelo, se bloquearon previamente 750 pl de la biblioteca TQ (4x1012 pfu) mezclando con 250 pl de MPBS al 8 % a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora. Se transfirieron 500 pl de perlas bloqueadas a otro tubo de microcentrífuga y se separaron de la solución de bloqueo en un separador magnético. La mezcla de fagos previamente bloqueada se añadió a las perlas bloqueadas y se incubó durante 90 minutos en un rotador a temperatura ambiente. Los fagos unidos a las perlas se separaron del fago no unido y a continuación se lavaron 6X con 1 ml de MPBS al 2 %/Tween 20 al 0,1 %, 6X con 1 ml de PBS/Tween 20 al 0,1 %, 2X con PBS con un cambio de tubos entre diferentes soluciones de lavado. El fago unido se eluyó con 1 ml de TEA 0,1 M (pH 11) durante 10 minutos, a continuación, se separó inmediatamente de las perlas y se neutralizó con 0,5 ml de Tris.HCl 1 M. El conjunto de fagos eluidos se mezcló con 4 ml de caldo 2x YT (10 g de extracto de levadura, 16 g de bacto-triptona, 5 g de NaCl por litro de agua) y 5 ml de cultivo bacteriano TG1 (D.O. 590 aproximadamente 0,5) en un tubo cónico de 50 ml. La mezcla de infección se incubó a 37 0C en una incubadora durante 30 minutos, a continuación, se centrifugó a 3500 rpm durante 20 minutos. El sedimento celular se resuspendió en 1500 pl de caldo 2xYT-CG y se esparcieron 300 pl en cada una de cinco placas 2xYT-CG (caldo 2x YT que contenía 100 pg/ml de carbenicilina y glucosa al 2 %). Después de 20 horas de incubación a 30°C, se añadieron 4 ml de 2x YT-AG a cada placa y las células se recuperaron con un raspador de células de las placas. Esta etapa se repitió tres veces. Una pequeña porción de las células recuperadas se usó para el rescate de fagos (véase a continuación). La suspensión celular restante se centrifugó a 3500 rpm durante 20 min. El sedimento celular se suspendió en una cantidad de glicerol al 50 % aproximadamente la mitad del volumen del tamaño del sedimento y se almacenó a -80 °C.

Para rescatar el fago, la suspensión celular amplificada en placas se usó para inocular 40 ml de 2x YT-CG a una DO590 de aproximadamente 0,05. El cultivo se incubó a 37 ° C en un agitador a DO5900,5. El cultivo de la fase de registro se infectó con el fago auxiliar M13KO7 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, n.° de catálogo 18311-019, 1.1 x 1011 pfu/ml) en M.O.I. 20 seguido de incubación a 37 ° C durante 30 min. Las células infectadas se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 min. El sedimento celular se resuspendió en 200 ml de 2xYT-CK (100 pg/ml de carbenicilina y 40 pg/ml de kanamicina) y se transfirió a dos matraces de 250 ml y se incubó a 30 °C con agitación a 270 rpm durante 20 horas. El cultivo durante la noche se centrifugó a 4000 rpm durante 20 minutos para eliminar los restos celulares. La centrifugación se repitió para asegurar la eliminación de los residuos celulares. Se añadió aproximadamente 1/5 de volumen de solución de PEG (PEG 8000 al 20 %, NaCl 2,5 M) al sobrenadante para precipitar las partículas de fago. La mezcla se incubó en hielo durante al menos 1 hora, seguido de centrifugación a 4000 rpm durante 20 minutos para recoger las partículas de fago precipitadas. El sedimento de fagos se resuspendió en 1 ml de PBS y se transfirió a un tubo de microcentrífuga. La suspensión de fagos se dejó en hielo durante 1 hora para permitir la suspensión completa de las partículas de fagos, y se aclaró por centrifugación a 14.000 rpm durante 2 minutos para eliminar los desechos celulares residuales. Se repitió la etapa de precipitación de fagos. El sedimento final de fagos se suspendió en PBS después del aclarado. La suspensión de fagos rescatados se utilizó en la siguiente ronda de selección.

Se realizaron cuatro rondas de selección que incluyeron alteraciones de varios parámetros de unión convencionales. La segunda ronda de selección fue idéntica a la primera ronda de selección. Las variaciones en el número de fagos de entrada y el reactivo de elución se introdujeron en las rondas tres y cuatro. Para la selección de la tercera ronda, se seleccionaron 5x1011 pfu de fagos y los fagos unidos se eluyeron con IGF-1 1 pM (número de catálogo 13769, Sigma, St. Louis, MO) o con una concentración 1 pM de un anticuerpo quimérico aIR3-huFc para producir dos agrupaciones de tres rondas, TQ4-3IS y TQ4-3CA. La selección de la ronda cuatro se llevó a cabo en grupos de fagos rescatados de ambos grupos de la ronda tres. Se incluyeron dos rondas de selección negativa con DYNABEADS® recubiertas con Fc de IgG de ratón (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) para eliminar los aglutinantes de Fc de ratón antes de la selección con IGF-1 R real. El tiempo de incubación para la selección negativa fue de 30 minutos cada uno. Se seleccionaron por separado 3,78x10” pfu del grupo TQ4-3IS y 3,75x1012 pfu del grupo TQ4-3CA. Los fagos unidos se eluyeron con IGF-21 pM (número de catálogo 12526, Sigma, St. Louis, MO) para obtener dos grupos de la ronda 4, TQ4-4ISI2 y TQ4-4CAI2. La secuencia de aproximadamente 96-192 insertos de ADN de fago se determinó en cada paso de elución.

En algunos casos, se realizó un análisis secundario. Las mezclas de ADN fagémido de la biblioteca TQ total, y el fago seleccionado amplificado después de varias rondas de selección contra IGF-1 R, se prepararon usando un kit de ADN Maxiprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA). Las cuatro preparaciones de ADN se digirieron con Asc I y EcoR I (New England Biolab, Beverly, MA). Los dos fragmentos Asc I/EcoR I resultantes se separaron en geles preparativos de agarosa al 0,5 %. Los fragmentos de 2,1 kb que contenían cadenas pesadas se purificaron en gel a partir del fago seleccionado de IGF-1 R. Los fragmentos de 3,9 kb que contenían las cadenas ligeras y la porción del vector pCES1 se purificaron en gel a partir del ADN total de la biblioteca TQ. Los fragmentos de 2.1 kb se ligaron a los fragmentos de 3,9 kb de la muestra de ADN de la biblioteca TQ en una proporción de 3:1. El ADN ligado se precipitó y se utilizó para transformar células TG1 por electroporación. El tamaño de la biblioteca de la biblioteca secundaria de intercambio de cadena ligera resultante fue de 8,8x108. Después de la secuenciación de 96 clones seleccionados al azar, se obtuvieron 76 secuencias de cadenas ligeras únicas, lo que indica que el intento de intercambio de cadenas ligeras fue exitoso.

La condición de unión, lavado y elución para analizar la biblioteca de intercambio de cadenas ligeras fue esencialmente la misma que la descrita para el análisis inicial. Sin embargo, se incluyeron varias variaciones para aumentar la presión de selección para la amplificación de los aglutinantes de IGF-1 R con afinidades más altas, especialmente aquellos con constantes de disociación significativamente más lentas. Estos parámetros fueron: mayor número de fagos de entrada (2-2,7 x1013 pfu), menor volumen de perlas (100 pl para la primera ronda, 50 pl para la segunda ronda y 25 pl para la tercera ronda), y tiempo de elución específico extendido hasta 20 horas. Los tampones de elución fueron T^ea 0,1 M para la primera ronda (RD1), IGF-1 1 pM en MPBS al 0,4 % para RD2 e IGF-1 o IGF-21 pM en MPBS al 0,4 % para RD3. En RD2 Y RD3, se descartaron los aglutinantes que se eluyeron en 15 minutos o 2 horas. La elución se continuó y los fagos eluidos se recogieron después de 8-10 horas y nuevamente después de 20 horas.

Análisis ELISA de Fab de fago

En bloques de pocillo profundo de 2 ml de 96 pocillos, se inocularon 480 pl/pocillo de caldo 2xYT-CG con 20 pl de cultivos durante la noche de los clones individuales, después se incubaron a 37 0C, 300 rpm durante 3 horas. A cada pocillo, se añadieron 50 pl de fago auxiliar M13KO7 diluido 1:3 para infectar las células. El bloque se incubó a 37 0C sin agitación durante 30 minutos y a continuación se agitó suavemente durante otros 30 minutos a 150 rpm. El bloque se centrifugó a 3600 rpm durante 20 minutos para sedimentar las células infectadas. El sedimento celular en cada pocillo se suspendió en 480 pl de 2xYT-CK (caldo 2xYT que contenía 100 pg/ml de carbenicilina y 40 pg/ml de kanamicina) y se incubó a 30 0C durante la noche durante aproximadamente 20 horas. Los residuos celulares se separaron por centrifugación a 3600 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante del fago rescatado se usó en el ELISA del fago para verificar la unión específica a IGF-1R, reactiva cruzada a INSR o a Fc de ratón de clones individuales.

Se recubrieron tres juegos de inmunoplacas Nunc MaxiSorb con 100 pl/pocillo de IGF-1R-C3-mFc a 5 pg/ml, INSR-mFc a 5 pg ml o IgG1 de ratón (número de catálogo 010-0103, Rockland, Gilbertsville, PA) a 2 pg/ml en PBS, respectivamente, a 4 0C durante una noche. Las placas recubiertas se lavaron 3x con 300 pl/pocillo de PBS. Las placas lavadas se bloquearon con 300 pl/pocillo de MPBS al 2 % a temperatura ambiente durante una hora. Mientras tanto, los fagos rescatados de clones individuales se bloquearon previamente mezclando 170 pl de fago rescatado con 170 pl de MPBS al 4 %. Las placas bloqueadas se lavaron 5x con 300 pl/pocillo de TBST (TBS: Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM; Tween-20. 0,1 %). Se distribuyeron 100 pl/pocillo de diluciones de fagos bloqueados previamente a cada conjunto de placas recubiertas, que se incubaron a temperatura ambiente en un balancín durante 90 minutos. Las placas se lavaron 5x con 300 pl/pocillo de TBST. Se distribuyeron 100 pl/pocillo de anti-M13-HRP en MPBS al 2 % (dilución 1:3000, número de catálogo 27-9421-01, Amersham Pharmacia Biotech) y las placas se incubaron a temperatura ambiente en un balancín durante una hora. Las placas se lavaron 5x con 300 pl/pocillo de TBST. Se añadieron 100 pl/pocillo del sustrato 1-Step™ ABTS (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, número de catálogo 37615). Las placas se incubaron durante una hora. Se midió la DO405 para la detección de la señal.

Los anticuerpos presentados en fago no mostraron esencialmente reactividad cruzada con el receptor de insulina y con el dominio Fc murino. La señal observada en el ELISA de IGF-1R es, por lo tanto, específica para el dominio extracelular de IGF-1R. Los resultados de ensayos similares para cuatro de los anticuerpos presentados en fagos se muestran en la Figura 14.

Se secuenciaron los insertos de ADN de los clones IGF-1 R positivo, INSR y mu IgG1 negativo. Se identificaron cincuenta y dos secuencias Fab únicas, que tienen las siguientes combinaciones de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada: L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20, H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H28, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, L39H39, L40H40, L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H47, L48H48, L49H49, L50H50, L51H51 y L52H52, en donde "Lx" indica el número "x" de dominio variable de cadena ligera y "Hx" indica el número "x" de dominio variable de cadena pesada. La Figura 1 presenta las secuencias de polinucleótidos de cada uno de estos dominios variables ligeros y pesados. Las figuras 2 y 3 presentan las correspondientes secuencias de aminoácidos.

Ejemplo 4: Subclonación de V^h y V^l en vectores de expresión de IgG1

Este ejemplo presenta un método para subclonar las secuencias de dominio variable identificadas previamente en un vector de expresión de IgG1.

Construcción de pDSRa20 y pDSRa20:hIgG1CH

El vector de expresión pDSRa20:hIgG1CH (documento WO 90/14363) era un derivado de pDSR19:hIgG1CH (véase la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. N° 60/370.407, publicada el 5 de abril de 2002, "Human Anti-OPGL Neutralizing Antibodies As Selective OPGL Pathway Inhibitors,"). El plásmidopDSRa19:hIgG1CH codificó una región variable de rata/región constante humana IgG1 (rVh/hCh1). El plásmido se construyó mediante la unión de tres piezas del producto de PCR de la región variable del anticuerpo de rata terminado de Xba I y BsmB I, la región constante de IgG1 humana (Ch1, dominios bisagra, Ch2 y Ch3) derivada de la escisión mediante Sal I y el aislamiento en gel del fragmento de BsmB I y SalI del plásmido lineal pDSRa19: hIgG1 C^h (extremos (HindIII y BsmB I) y un pDSRa19 linealizado con extremos Xba I y Sal I. Se produjo pDSRa20 cambiando el nucleótido 2563 en pDSRa19 de una guanosina a una adenosina por mutagénesis dirigida al sitio. El vector de expresión de la cadena pesada, pDSRa20: hIgG1CH región variable de rata/región constante humana IgG1 (rVh/hCh1), es de 6163 pares de bases y contiene las 7 regiones funcionales descritas en la Tabla 3.

Tabla 3

El plásmido lineal pDSRa20:hIgG1CH se preparó digiriendo el plásmido pDSR20:región variable de rata/región constante humana IgG1 con las enzimas de restricción Xba I y BsmB I para eliminar la región variable de rata y purificarse utilizando un kit de extracción de gel QIAquick. El plásmido lineal pDSRa20:hIgG1CH que contiene el dominio de la región constante de IgG1 humana de 1,0 kpb se usó para aceptar secuencias codificantes de cadena pesada variables anti-IGF-1 R.

Construcción de los clones de Expresión de Cadena Pesada de IgG1 anti-IGF-1 R

La secuencia que codifica la región variable anti-IGF-1 R de las cadenas pesadas se amplificó a partir de ADN de fagémido con cebadores de oligonucleótidos complementarios. Los cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se diseñaron para incorporar un sitio Hind III, sitio Xba I, secuencia Kozak (CCACC) y secuencia señal (el péptido traducido es M^dMRV-^pA^q LLGLLLLWLRGARC; SEQ ID NO: 263) en el extremo 5 'de la región variable, mientras que se añadió un sitio BsmB I en el extremo 3' del producto de PCR. Los productos de PCR se digirieron con Xba I y and BsmB I y a continuación, se clonaron en el vector de expresión pDSRa20:hIgG1CH lineal de Xba I BsmB I que contiene la región constante de IgG1 humana (Figura 13). Los vectores de expresión finales contenían las siete regiones funcionales descritas en la Tabla 4.

Tabla 4

Construcción de los Clones de Expresión de Cadena Variable de IgG1 anti-IGF-1 R.

Las cadenas ligeras codificadas en el fago anti-IGF-1 R eran de clase kappa o lambda. Se clonaron utilizando uno de los dos enfoques. Los cebadores complementarios se diseñaron para añadir un sitio Hind III, un sitio Xba I, se añadieron la secuencia Kozak (CCACC) y la secuencia señal (el péptido traducido es MDMRVPAQLLGLLLLLWLRGARC, SEQ ID NO: 264) al extremo 5 'de la región codificante. Aquellas cadenas que tenían regiones de codificación libres de errores se clonaron como productos de longitud completa. Las cadenas ligeras de longitud completa se clonaron como fragmentos Xba I y Sal I en el vector de expresión pDSRa20. Los vectores de expresión finales contenían las siete regiones funcionales descritas en la Tabla 5.

Tabla 5

continuación

Algunos clones kappa tenían errores en sus regiones constantes en comparación con la secuencia de la región constante humana natural. Para eliminar estas discrepancias, la región variable kappa se amplificó con un cebador que introduciría un sitio Xba I en el extremo 5' y un sitio BsmB I en el extremo 3'. Este fragmento se unió a continuación junto con una región constante kappa humana (Figura 13) con un BsmB I compatible en el extremo 5 'y un extremo 3' Sal I en pDSRa20 con extremos Xba I y Sal I.

Ejemplo 5: Expresión Transitoria de Anticuerpos

Este ejemplo proporciona un método de expresión transitoria de anticuerpos anti-IGF-1 R.

Los anticuerpos se expresaron de forma transitoria en células 293T adaptadas a la suspensión sin suero. Todas las transfecciones se realizaron como cultivos de 250 ml. En resumen, se centrifugaron 1,25 x 108 células (5,0 x 105 células/ml x 250 ml) a 2.500 RPM durante 10 minutos a 4 °C para eliminar el medio condicionado. Las células se resuspendieron en DMEM sin suero y se centrifugaron nuevamente a 2.500 RPM durante 10 minutos a 4 °C. Después de aspirar la solución de lavado, las células se resuspendieron en medio de crecimiento [DMEM/F12 (3:1) 1x Insulina-Transferrina-Suplemento de selenio IX Pen Strep Glut L-Glutamina 2 mM HEPES 20 mM Pluronic F68 al 0,01 %] en un cultivo del matraz giratorio de 500 ml. El cultivo de matraz giratorio se mantuvo en una placa de agitación magnética a 125 RPM que se colocó en un incubador humidificado mantenido a 37 0C y CO2 al 5 %. El ADN plasmídico se incubó con el reactivo de transfección en un tubo cónico de 50 ml. El complejo ADN-reactivo de transfección se preparó en 5 % del volumen de cultivo final en DMEM sin suero. Un microgramo de ADN plasmídico por mililitro de cultivo se añadió primero a DMEM sin suero, seguido de 1 pl de cultivo X-TremeGene RO-1539/ml. Los complejos se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos y a continuación se añadieron a las células en el matraz giratorio. La transfección/expresión se realizó durante 7 días, después de lo cual se recogió el medio condicionado mediante centrifugación a 4.000 RPM durante 60 minutos a 4 0C.

Si la transfección inicial no produjo los 100 pg de anticuerpo purificado requeridos, esos clones se reexpresaron en frascos rotatorios. Estas transfecciones utilizaron células adherentes 293T cultivadas y mantenidas en DMEM complementado con FBS al 5 % 1x Aminoácidos no esenciales 1x Pen Strep Glut 1x Piruvato Sódico. Aproximadamente, se sembraron 4-5 x 107 células 293T en frascos rotatorios de 850 cm2 durante la noche. Las células previamente sembradas se transfectaron a continuación al día siguiente usando el reactivo de transfección FUGENE ™ 6. La mezcla ADN-reactivo de transfección se preparó en aproximadamente 6,75 ml de DMEM sin suero. Se añadieron primero 675 pl de reactivo de transfección FUGENE™ 6, seguido de 112,5 pg de ADN plasmídico. El complejo se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla completa se añadió a continuación a un frasco rotatorio. El frasco rotatorio se infundió con una mezcla de gas de CO2 al 5 %, se tapó herméticamente y se colocó en una incubadora a 37 0C en una rejilla rotatoria que giraba a 0,35 RPM. La transfección se realizó durante 24 horas, después de lo cual el medio se reemplazó con 100 ml de DMEM IX Insulina-Transferrina-suplemento de Selenio+ IX Pen Strep Glu IX Aminoácidos no esenciales IX Piruvato sódico. Normalmente, se obtuvieron 2-3 cosechas (100 ml) de cada frasco rotatorio a un intervalo de 48 horas. El medio condicionado sin suero recogido se agrupó y se centrifugó a 4.000 RPM durante 30 minutos a 4 °C.

Eejmplo 6: Purificación a Pequeña Escala del Anticuerpo Anti-IGF-1 R

Este ejemplo proporciona un método para purificar anticuerpos anti-IGF-1 R a pequeña escala.

El medio condicionado se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 pm y se concentró aproximadamente 8 veces utilizando una membrana de flujo tangencial Vivaflow 20050 K (Vivascience, Goettingen, Alemania). La resina de flujo rápido de rProteína A-SEPHAROSE ™(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) se lavó con solución salina tamponada con fosfato (cloruro de potasio 2,7 mM, cloruro de sodio 138 mM, fosfato de potasio 1,5 mM y fosfato de sodio 8,1 mM, pH 7,4) (PBS) cuatro veces y a continuación se aplicó directamente al medio concentrado. La cantidad de resina utilizada se basó en la concentración de anticuerpos determinada por ELISA, donde se utilizó 1 pl de resina por 5 pg de anticuerpo. El medio se incubó durante la noche a 4 °C con agitación suave. La resina se centrifugó a 500 g durante 10 min. a 4 °C. El sobrenadante se decantó como la fracción no unida. La resina se lavó con PBS cuatro veces durante un minuto a temperatura ambiente con agitación suave, recogiendo cada vez la resina por centrifugación a 500 g durante 10 min. a 4 °C. El anticuerpo se eluyó incubando la resina con 1,5 volúmenes de glicina 0,1 M, pH 3,0 durante 10 min. a temperatura ambiente. La resina se centrifugó a 500 g durante 10 min. a 4 °C y el sobrenadante se decantó como anticuerpo eluido. La etapa de elución descrita anteriormente se repitió por un total de tres eluciones; cada vez el material eluido se neutralizó con 0,04 volúmenes de tris-HCl 1,0 M, pH 9,2. La muestra se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 pm. La concentración de proteínas se determinó mediante el método de Bradford utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) según las instrucciones suministradas utilizando IgG humana (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) como un patrón. La muestra se comparó con una IgG1 humana, patrón K (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) utilizando un gel de poliacrilamida SDS con tris-glicina al 4-20 % teñido con tinte azul brillante de Coomassie. Ninguna proteína contaminante era visible en estas preparaciones.

Ejemplo 7: Aislamiento de Clones de CHO Estables que Expresan Anticuerpos

Este ejemplo proporciona un método para aislar líneas celulares de CHO estables que expresan anticuerpos anti-IGF-1R.

La expresión estable de IgG1 TQ11C, TQ25, TQ 58 y TQ59 se logró mediante cotransfección de células CHO AM1-D (Patente de Estados Unidos N° 6.210.924) con construcciones de expresión de IgG1 de cadena pesada y ligera de pDSRa20. Las transfecciones de plásmidos se realizaron utilizando LF2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, Se sembraron 4 x células 106AM1-D CHO 24 horas antes de la transfección, en placas de petri de plástico FALCON™ de 100 mm de diámetro (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) en 10 ml de Medio Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen) complementado con suero fetal bovino al 5 %, 1x penicilina-estreptomicina y glutamina (Invitrogen), aminoácidos no esenciales (Invitrogen), piruvato de sodio y HTA (hipoxantina sódica 0,1 mM, timidina 16 nM; Invitrogen). Aproximadamente 15 mg de cada ADN de plásmido de cadena ligera y pesada de pDSRa21se linealizaron utilizando Pvu I (New England Biolabs) y se diluyeron en 2 ml de OPTI-MEM® (Invitrogen). Los plásmidos diluidos se mezclaron con 75 pl de LIPOFECtAm INE™ 2000 (LF2000; GIBCO/BRL) diluidos en 2 ml de OPTI-MEM® y la mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. Al día siguiente se añadió medio de crecimiento fresco. Las células se cultivaron en medio de crecimiento completo durante 48 horas, a continuación, se sembraron en medio de selección HT en diluciones 1:20 y 1:50. Aproximadamente 2 semanas después de la transfección, se recogieron 12-24 colonias visibles en placas de 24 pocillos, usando los discos de clonación estériles (RPI). Los clones que expresan el nivel más alto de IgG1 TQ11C, TQ25, TQ58 y TQ59 se identificaron mediante análisis de inmunotransferencia Western. Para realizar este ensayo, se añadieron 0,5 ml de medio sin suero a un solo pocillo de células confluentes cultivadas en una placa de 24 pocillos (BD Falcon). El medio condicionado se recuperó después de 24 horas y se mezclaron 10 pl de CM con un volumen igual de tampón de carga para ejecutar un gel de proteína de poliacrilamida Tris-glicina al 10 % (Invitrogen). El gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa de tamaño de poro de 0,45 pm (Invitrogen) y se realizó un análisis de transferencia Western utilizando una dilución 1:1000 de anticuerpo anti-Fc de IgG humana de cabra ImmunoPure (Pierce Biotechnology, Inc., Inc., Rockford, IL) y ECL como agente de detección.

Ejemplo 8: Expresión de Anticuerpos a media escala

Este ejemplo proporciona un método para expresar anticuerpos antiIGF-1R expresador por líneas celulares CHO estables.

Las líneas celulares CHO producidas de acuerdo con el Ejemplo 7 se expandieron a matraces de cultivo de tejidos T-175 (Falcon) para aumentar la expresión. Se usó un matraz T175 confluente (aproximadamente 2 -3 x 107 células) para sembrar 3 frascos rotatorios de 850 cm2 (Corning Life Sciences, Acton, MA), y se usaron tres frascos rotatorios confluentes (aproximadamente 1-2 x 108 células por frasco rotatorio) para sembrar 30 rodillos en 250 ml de DMEM con alto contenido de glucosa (Invitrogen), FBS dializado al 10 % (Invitrogen), 1x glutamina (Invitrogen), 1x aminoácidos no esenciales (Invitrogen), 1x piruvato de sodio (Invitrogen). El medio se infundió con CO2/aire de equilibrio al 10% durante 5 segundos antes de tapar el frasco rotatorio. Los frascos rotatorios se incubaron a 37 0C en rejillas rotatorias que giraban a 0,75 rpm.

Cuando las células alcanzaron aproximadamente el 85-90 % de confluencia (aproximadamente 5-6 días en cultivo), se descartó el medio de crecimiento, las células se lavaron con 100 ml de PBS y se añadieron 200 ml de medio de producción (DMEM al 50 % (Invitrogen)/F12 al 50 % ( Invitrogen), 1x glutamina (Invitrogen), 1x aminoácidos no esenciales (Invitrogen), 1x piruvato de sodio (Invitrogen), DMSO al 1,5 % (Sigma). El medio condicionado se cosechó cada siete días para un total de cuatro cosechas.

El medio condicionado se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 pm y se concentró aproximadamente 10 veces utilizando una membrana de flujo tangencial de 30 K desechable de Sartorius Sartocon (Sartorius AG, Goettingen, Alemania). El material concentrado se aplicó a una columna de 10 ml de rProteína A Sepharose a 4 0C y el flujo se recogió como la fracción no unida. La columna se lavó con cuatro volúmenes de columna de PBS. La muestra unida se eluyó con aproximadamente cuatro volúmenes de columna de glicina 0,1 M, pH 3,0. El pico de eluato se recogió y se neutralizó con 0,04 volúmenes de tris-HCl 1,0 M, pH 9,2. El eluato se dializó frente a 150 volúmenes de PBS durante la noche a 4 °C. La muestra se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 pm y la concentración de proteína se midió determinando la absorbancia a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción de 14.000 M-1. La muestra se comparó con una IgG1 humana, patrón K (Sigma-Aldrich, St. Louis, St. Louis, MO) utilizando un gel tris-glicina SDS-PAGE al 4-20 % teñido con tinte azul brillante de Coomassie. Los niveles de endotoxinas en cada preparación de anticuerpos se determinaron utilizando el ensayo de Lisado de Amebocitos de Limulus Pyrotell (Asociados de Cape Cod, Inc., Falmouth, Ma) de acuerdo con las instrucciones suministradas.

Ejemplo 9: Ensayos de Competición de Respuesta a la Dosis ORIGEN®

Este ejemplo proporciona métodos para probar la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión del ligando a IGF-1R.

Se usó un ensayo de unión ORIGEN® para determinar si los anticuerpos IgG1 TQ11C, TQ25, TQ 58 y TQ59 podrían bloquear la unión del ligando a IGF-1R utilizando los procedimientos proporcionados por el fabricante (Igen, Inc., Gaithersburg, MD). Para marcar IGF-1 e IGF-2 con rutenio, las proteínas liofilizadas se disolvieron en PBS para dar una solución de 1,0 mg/ml. EL marcador (ORI-TAG-NHS éster de Igen, N° de Cat. 110034) se añadió a la proteína en una proporción molar de 5:1 (marcador: proteína) de un marcador patrón de 5 mg/ml en DMSO. La mezcla se incubó a temperatura ambiente (20-22 0C) durante 1 hora en la oscuridad, a continuación, se trató con 20 pl de glicina 2M durante 10 minutos a temperatura ambiente. La proteína marcada se separó del marcador libre mediante la aplicación a una columna NAP-5 de Amersham Biosciences (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) equilibrada en PBS y se recogieron fracciones de 0,33 ml. La concentración de proteínas de las fracciones se determinó mediante el ensayo de proteínas Micro BCA (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL). Las fracciones dos y tres contenían proteínas significativas y se combinaron. La cantidad de marcador de rutenio incorporado se evaluó utilizando la siguiente fórmula: compuesto de rutirutenio tris-bipiridilo (Ru(bpy)32+) marcado de IGF-1 y IGF-2.

Se usaron perlas paramagnéticas Dynal M450 recubiertas con IgG anti-ratón de oveja como fase de soporte sólido para el IGF-1 R (ECD)-C3-muFc. Las perlas M450 se prepararon para la carga del receptor lavándolas tres veces con tampón de ensayo que contenía 1x PBS, TWEEN ™ 20 al 0,05 % (ICI Americas, Inc., Wilmington DE) BSA al 0,1 %, azida sódica al 0,01 %. El IGF-1R(ECD)-C3-muFc se unió durante 1 hora en una proporción de 50 ng de receptor por 1 x 106 perlas M450 en un volumen de 25 pl de tampón de ensayo. Para generar datos de dosisrespuesta, los anticuerpos o los factores IGF-1 e IGF-2 no marcados se añadieron a concentraciones crecientes (10-11M a 10-6M) simultáneamente con Ru-IGF-1 1 nM o Ru-IGF-2 2 nM. El volumen de reacción final fue de 100 pl. Después de incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 2 h, se usó un analizador M8 (Igen) para eliminar el ligando marcado con rutenio libre y determinar la cantidad de ligando unido al receptor. Los datos se expresaron como el porcentaje de ligando total restante menos el fondo restante después de la competencia con el exceso de IGF-1 o IGF-2 de crecimiento sin marcar. Las curvas de competencia se generaron con el software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) utilizando un modelo de equilibrio de un solo componente. Esencialmente, toda la unión (> 98 %) se hizo competir con el exceso de factores de crecimiento no marcados. Los anticuerpos de control positivo en el análisis de unión fueron los anticuerpos aIR3 anti-IGF-1 R murinos (Calbiochem, San Diego, CA) o MAB391 (R&D systems, Minneapolis, MN), 24-57 (Biocarta, San Diego, CA) y 1H7 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). El anticuerpo de control negativo era un anticuerpo anti-CD20. Los datos de la competencia de ligandos se muestran en la Figura 15. Los valores de Ki y de inhibición máxima observados para las reacciones de unión de IGF-1 e IGF-2 se enumeran en la Tabla 6.

Tabla 6

Ejemplo 10: Ensayos de Competición de Respuesta a la Dosis SPA

Este ejemplo presenta un ensayo de centelleo por proximidad (SPA) para evaluar el efecto de los anticuerpos en la interacción de la insulina (INS) con el receptor de insulina (INSR) y de IGF-1 e IGF-2 a IGF-1 R.

Reacciones de unión a IGF-1R para los anticuerpos TQ11C, TQ25, TQ 58 y TQ59 IgG1 contenían 1x PBS, TWEEN® 20 al 0,05 % (Mallinkrodt), BSA al 0,1 % (EM Science, Gibbstown, NJ), 50 ng de IGF-1R(ECD)-C3-muFc, 500 ug de IgG fluoromicroesferas SPA PVT anti-IgG de ratón (Amersham) e IGF-1 o IGF-2 marcado con 125I obtenido de Amersham a una concentración final de 0,64 nM. El volumen de reacción total fue de 100 pl. Las reacciones de unión a INSR fueron idénticas, excepto que contenían 50 ng de INSR(ECD)-muFc y 125I-INS (Amersham) 0,64 nM. El receptor se cargó en microesferas SPA PVT durante 1 hora a temperatura ambiente antes del ensamblaje de las reacciones de unión. Para generar datos de dosis-respuesta, los anticuerpos o los factores de crecimiento no marcados se añadieron a concentraciones crecientes (10-11M a 10-6M) simultáneamente con factores de crecimiento marcados con 125I. Esencialmente, toda la unión se hizo competir con el exceso de factores de crecimiento no marcados. El fondo independiente del receptor, causado por la estimulación y aleatoria de las microesferas SPT PVT, fue inferior al 0,5 % del cpm de 125I de entrada. Los datos se expresaron como el porcentaje de ligando total restante menos el fondo restante después de la competencia con el exceso de IGF-1 o IGF-2 de crecimiento sin marcar. Las curvas de competencia se generaron con el software GraphPad Prism utilizando un modelo de equilibrio de un solo componente.

Ejemplo 11: Anticuerpo Unión a IGF-1R

Este ejemplo proporciona un método para detectar la unión de un anticuerpo anti-IGF-1 R a IGF-1 R.

El BIACORE® 2000, chip del sensor CM5, surfactante P20, HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 3,4 mM, P20 al 0,005 %, pH 7,4), kit de acoplamiento de amina, acetato 10 mM, pH 4,5 y glicina 10 mM, pH 1,5 se adquirieron todos de BIACore, Inc. (Piscataway, NJ). La solución salina tamponada con fosfato (PBS, IX, sin cloruro de calcio, sin cloruro de magnesio) era de Gibco. La seroalbúmina bovina (BSA, fracción V, libre de IgG) era de Sigma. La proteína G recombinante (''rProteína G") era de Pierce Biotechnology.

La inmovilización de la rProteína G e IGF-1 R-C3-muFc en la superficie del chip del sensor se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando un flujo continuo de HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 3,4 mM, P20 al 0,005 %, pH 7,4 (tampón HBS-EP). En resumen, los grupos carboxilo en las superficies de los chips del sensor se activaron inyectando 60 pl de una mezcla que contenía N-etil-N'-(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) 0,2 M y N-hidroxisuccinimida 0,05 M (NHS). Se obtuvieron superficies específicas inyectando la rProteína A (Pierce) o IGF-1 R-C3-mFc diluidos en acetato 10 mM, pH 4,5 a concentraciones entre 20 y 50 pg/ml. El exceso de grupos reactivos en las superficies se desactivó inyectando 60 pl de etanolamina 1 M. Los niveles finales inmovilizados fueron 5.000­ 6.000 unidades de resonancia (UR) para las superficies de Proteína G, y ~7.800 UR para las superficies de IGF-1 R-mFc. También se preparó una superficie de referencia en blanco, acoplada de manera simulada en el chip sensor IGF-1 R-mFc.

El análisis cinético de la interacción entre IGF-1R-mFc y los anticuerpos se realizó de la siguiente manera. Los anticuerpos, así como un anticuerpo de control positivo (quimera anti-IR3-CDR-humano-ratón) se diluyeron en PBS P20 al 0,005 % 0,1 mg/ml de BSA y se inyectaron sobre las superficies de Proteína G para capturar los anticuerpos. IGF-1R-mFc se diluyó en PBS P20 al 0,005 % 0,1 mg/ml de BSA de 500 nM a 3,9 nM, y cada concentración se inyectó sobre las superficies del anticuerpo capturado, así como sobre una superficie de proteína G en blanco para la sustracción del fondo. Después de una disociación de 10 minutos, cada superficie se regeneró inyectando glicina 10 mM, pH 1,5. El análisis cinético de los sensogramas resultantes se realizó utilizando BIAEvaluation, v. 3.2 (BIACore, Inc.).

Se realizó un análisis de afinidad de la solución incubando dos concentraciones diferentes (0,2 nM y 1 nM) de anticuerpo con concentraciones variables (0,01 nM a 50 nM) de IGF-1 R-mFc en PBS P-20 al 0,005 % 0,1 mg/ml de BSA. Las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente durante al menos cinco horas para permitir que las muestras alcanzaran el equilibrio. Las muestras se inyectaron a continuación sobre la superficie inmovilizada de IGF-1 R-mFc. Después de la inyección de la muestra, las superficies se regeneraron inyectando 25 pl de glicina 8 mM, pH 1,5. La señal de unión obtenida es proporcional al anticuerpo libre en solución en equilibrio. La constante de equilibrio de disociación (Kd) se obtuvo a partir del análisis de regresión no lineal de las curvas de competencia utilizando un modelo de unión homogénea de doble curva en un sitio (software KinExA v. 2.3, Sapidyne Instruments Inc., Boise ID). Los datos se muestran en la Tabla 7

Tabla 7

Ejemplo 12: Mapeo de epítopos de Proteínas de Fusión con Avidina

Este ejemplo proporciona un método para determinar el epítopo de IGF-1 R unido por un anticuerpo anti-IGF-1 R. Los subdominios de IGF-1R unidos por los anticuerpos TQ11C, TQ25, TQ58 y TQ59 se determinaron utilizando proteínas de fusión avidina-IGF-1 R. Para expresar cada proteína, las secuencias de ADN codificantes del IGF-1 R completo(ECD) se clonaron en el vector de expresión pCep4-avidina-C, de modo que la secuencia de avidina de pollo se une al extremo C de la proteína IGF-1R expresada. La secuencia de codificación del ECD (1-932) se amplificó por PCR a partir de un plásmido IGF-1R parental utilizando los cebadores de PCR 2804-25:

5' GCAAGCTTGGGAGAAATCTGCGGGCCAG 3' SEQ ID NO:265

y 2826-68:

5' ATTGCGGCCGCTTCATATCCTGTTTTGGCCTG 3' SEQ ID NO:266

Los cebadores incluyen un sitio 5' Hind III y un sitio 3' Not I para clonar en pCep4avidina-C. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión avidina-IGF-IR(ECD) humana se muestra en la Figura 12. Las construcciones de subdominios de IGF-1 R utilizadas para el mapeo de epítopos incluyeron: L1 (1 -151), CR (152-298), L2 (299-461), FnIII-1 (461-579), FnIII-2/ID (580-798), FnIII-3 (799-901), L1+CR+L2 (1-461) y L1+CR (1-298). Las coordenadas de aminoácidos del subdominio de IGF-1R representadas en cada plásmido de expresión se dan entre paréntesis. La secuencia codificante de cada dominio se amplificó por PCR a partir de un clon de ADNc de IGF1R parental utilizando los siguientes pares de cebadores:

L1:

2804-25: (SEQ ID NO:265)

2804-19:

5' ATTGCGGCCGCCCCACATTCCTTTGGGGGC 3'SEQ ID NO:267

CR:

2804-38:

5' AGCAAGCTTGGACCTGTGTCCAGGGACC 3' SEQ ID NO:268

2804-20:

5' ATTGCGGCCGCGCAAGGACCTTCACAAGGG 3' SEQ ID NO:269

L2:

2804-39:

5' AGCAAGCTT GCCGAAGGT CT GT GAGGAAG 3' SEQ ID NO:270

2804-23:

5' ATTGCGGCCGCACTTTCACAGGAGGCTCTC 3' SEQ ID NO:271

FnIII-1:

2808-08:

5' AGCAAGCTTGGACGTCCTGCATTTCACCTC 3' SEQ ID NO:2722804-52:

5' ATTGCGGCCGCGGTGCGAATGTACAAGATCTC 3' SEQ ID NO:273

FnIII-2+ID:

2804-41:

5' AGCAAGCTTGAATGCTTCAGTTCCTTCCATTC 3' SEQ ID NO:274

2804-51:

5' ATTGCGGCCGCAGTCCTTGCAAAGACGAAGTTG 3' SEQ ID NO:275

FnIII-3:

2804-42:

5' AGCAAGCTTGATGCCCGCAGAAGGAGCAG 3' SEQ ID NO:2762804-50:

5' ATTGCGGCCGCTTTAATGGCCACTCTGGTTTC 3' SEQ ID NO:277

L1+CR+L2:

2804-25:

5' AGCAAGCTTGGGAGAAATCTGCGGGCCAG 3' SEQ ID NO:278

2804-23 (SEQ ID NO:272)

L1+CR:

2804-25: AGC AAG CTT GGG AGA AAT CTG CGG GCC AG (SEQ ID NO:279)

2804-20 (SEQ ID NO:270)

Los cebadores incluyeron el sitio Hind III y Not I para la clonación como se describe para el IGF-1R (ECD). Los subdominios de IGF-1 R se clonaron en el vector de expresión pCep4avidina-N de tal manera que la secuencia de avidina de pollo (con secuencia de señal endógena) se une al extremo N de las proteínas IGF-1 R expresadas. La expresión de cada proteína de fusión con avidina se logró mediante la transfección transitoria de células 293-EBNA humanas (Invitrogen) en cultivos en frascos rotatorios. Las células se cultivaron y mantuvieron en DMEM complementado con FBS al 5 % 1x Aminoácidos No Esenciales 1x Pen Strep Glut 1x Piruvato Sódico. Se sembraron aproximadamente 4-5 x 107 células 293-EBNA en frascos rotatorios de 850 cm2 durante la noche. Las células previamente sembradas se transfectaron con ADN de plásmido pCep4-avidina a continuación al día siguiente usando el reactivo de transfección FUGENE ™ 6. La mezcla ADN-reactivo de transfección se preparó en aproximadamente 6,75 ml de DMEM sin suero. Se añadieron primero 675 pl de reactivo de transfección FUGENE™ 6, seguido de 112,5 pg de ADN plasmídico. El complejo se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla completa se añadió a continuación a un frasco rotatorio. El frasco rotatorio se gasificó con una mezcla de gas de CO2 al 5 %, se tapó herméticamente y se colocó en una incubadora a 37 0C en una rejilla rotatoria que giraba a 0,35 RPM. La transfección se realizó durante 24 horas, después de lo cual el medio se reemplazó con 100 ml de DMEM IX Insulina-Transferrina-suplemento de Selenio+ IX Pen Strep Glu IX Aminoácidos no esenciales IX Piruvato sódico. La recolección del medio condicionado y el reemplazo con medio fresco se realizaron a intervalos de 48 horas (2-3 ciclos). El medio condicionado sin suero recogido se agrupó y se aclaró por centrifugación a 10.000 x g durante 30 minutos a 4 °C.

La concentración de avidina-fusión en cada medio condicionado se determinó utilizando un método cuantitativo basado en FACS. La proteína de fusión con avidina en 200 pl de medio condicionado se capturó por incubación durante 2 horas a temperatura ambiente con 5 pl (~ 3,5 x 105) de perlas de poliestireno recubiertas con biotina (Spherotech, Inc., Libertyville, IL). El medio condicionado se eliminó mediante tres ciclos de centrifugación y resuspensión de las perlas recubiertas con avidina en PBS que contenía BSA al 0,5 % (BPBS). Las perlas con avidina se tiñeron con 1 pg/ml de anticuerpo anti-avidina de cabra marcado con FITC (Vector Lab Burlingame, CA) en 1 ml de BPBS. Después de 0,5 h, los complejos anticuerpo-perlas de incubación se recogieron mediante centrifugación a 1800 rpm durante 5 minutos y el sedimento se lavó tres veces. La fluorescencia de FITC se detectó con un FACSCAN (Beckton Dickson Bioscience, Franklin Lakes, NJ). La señal se convirtió en masa proteica utilizando una curva patrón derivada de avidina recombinante. Para el mapeo de epítopos, las perlas de biotina se cargaron con 50-100 ng de proteína de fusión con avidina por ~3,5 x 105 perlas de perlas por incubación con la cantidad apropiada (1-20 ml) de medio condicionado. Las perlas cargadas se lavaron ampliamente y se resuspendieron en 1 ml de BPBS. Para todos los experimentos, las perlas con biotina se bloquearon con BSA al 10 % en PBS antes de cargar la proteína de fusión.

Método 1, Ensayo de un Color: Las perlas de poliestireno recubiertas con biotina cargadas con IGF-1R (ECD) y las proteínas de fusión del subdominio de IGF-1R se mezclaron con 1 pg de anticuerpo anti-IGF-1R en 1 ml de BPBS. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, Se añadieron 4 ml de tampón de lavado y los complejos anticuerpo-perlas se recogieron por centrifugación durante 5 minutos a 750 g. El sedimento se lavó 3 veces por resuspensión en 4 ml de BPBS. El anticuerpo unido a los complejos de perlas con avidina se detectó mediante el tratamiento con 0,5 pg/ml de anti-F(ab')2 humano de cabra marcado con ficoeritrina-(PE) (Southern Biotech Associates, Inc., Birmingham, AL) en 1 ml de BPBS. Se descubrió que los anticuerpos probados se unen a la proteína de fusión con avidina que contiene el ECD de IGF-1 R completo y el dominio L2. La unión a L1, CR o FnIII-1 no se detectó en este experimento. También se observó una reacción relativamente débil con el dominio L1.

Método 2, Ensayo de dos Colores: Para monitorizar simultáneamente las cantidades de anticuerpo monoclonal anti-IGF-1 R y la fusión con avidina unida a las perlas de biotina, se incluyó el anticuerpo anti-avidina marcado con FITC (1 pg/ml) en la reacción de unión en combinación con 0,5 pg/ml de anti-IgG1 humana de cabra marcada con PE. Las perlas se prepararon para el análisis FACSCAN como se describe para el ensayo de un color.

Método 3, Competencia de Anticuerpos: Para preparar el marcado con fluoresceína, los anticuerpos se dializaron o se resuspendieron a una concentración de 1 mg/ml en PBS (pH 8,5). Se añadieron isómeros mezclados del marcador ácido [6-fluoresceína-5-(y-6)-carboxamido] hexanoico, succinimidil éster 5(6) -SFX] de Molecular Probes (Eugene, OR, Cat. No. F2181) a la proteína en una proporción molar 9,5:1 (marcador: proteína) de un marcador patrón de 5 mg/ml en DMSO. La mezcla se incubó a 4 °C durante la noche en la oscuridad. El anticuerpo marcado se separó del marcador libre mediante diálisis en PBS. Las proporciones FITC/anticuerpo obtenidas oscilaron entre 3 y 8. Para cada experimento de competencia, se montó una reacción de unión que contenía un exceso de 50 veces (10-50 pg/ml) de anticuerpo competidor no marcado, 3,5 x 105 perlas de biotina recubiertas con proteína de fusión con avidina en BPBS. El anticuerpo marcado con FITC (1 pg/ml) se añadió después de una incubación previa de 30 minutos. El proceso siguió el método de un color desde este punto en adelante.

Cada uno de los cuatro anticuerpos probados se une al dominio L2 de IGF-1 R, tal como se muestra en la Tabla 8. Sin embargo, los contactos precisos de aminoácidos de cada anticuerpo en el dominio L2 de IGF-1 R pueden diferir.

Tabla 8

Ejemplo 13: Unión de anticuerpos a IGF-1R de la superficie celular

Este ejemplo proporciona un método para detectar la unión de un anticuerpo anti-IGF-1 R a - IGF-1 R expresado en la superficie celular.

La capacidad de los anticuerpos TQ11C, TQ25, TQ58 y TQ59 para unirse a IGF-1R humano presentado en la superficie celular se evaluó utilizando fibroblastos Balb/C 3T3 y células humanas de cáncer de mama MCF-7 diseñadas para sobreexpresar el receptor IGF-1R humano en un nivel de ~ 3-4 x 105 moléculas por célula. Se derivó una línea celular Balb/C 3T3 que sobreexpresa de forma estable el IGF-1 R humano (~ 3x105 receptores por célula) utilizando un vector retroviral esencialmente como lo describen Pietrzkowski et al., 1992, Cell Growth Differentiation 3:199-205. Las células de cáncer de mama MCF-7 que sobreproducen huIGF-1 R se transfectaron con un vector de expresión pcDNA3.1 (Invitrogen Corp.). Las células resistentes a la zeocina que expresan un alto nivel de hu IGF-1 R (~4 x 105 receptores por célula) se expandieron después de la selección por FACS utilizando el anticuerpo monoclonal aIR3 anti-IGF-1R y un anticuerpo IgG anti-murino de cabra marcado con PE (Laboratorios Caltag, Burlingame, CA). El proceso de selección y expansión se repitió cuatro veces.

La tinción del anticuerpo del receptor IGF-1 R y la expresión del receptor se monitorizaron mediante FACS de la siguiente manera: las células se liberaron de los matraces T175 (Corning) lavando 2 veces con exceso de PBS (sin Ca/Mg) seguido de un tratamiento con 5 ml de Tampón de Disociación Celular (Sigma) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se recogieron por centrifugación y se lavaron dos veces resuspendiéndolas en PBS y por centrifugación. Para la tinción primaria del anticuerpo, se añadió 1 pg de anticuerpo a 106 células resuspendidas en 100 pl de PBS más BSA al 0,5 % (BPBS) y las células se incubaron a 4 0C durante 1,5 h. Las células se recogieron por centrifugación y se lavaron dos veces con BPBS para eliminar el anticuerpo primario no unido. Las células se resuspendieron en 100 pl de BPBS y se incubaron con 1 pg de anti-F(ab')2 humano de cabra marcado con FITC (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) a 4 0C durante 30 minutos. Después del lavado para eliminar el anticuerpo secundario con FITC no unido, las células se resuspendieron en 1 ml de PBS BSA al 0,5 % y la fluorescencia de las células con FITC se detectó con un FACSCAN (Beckton Dickson Bioscience, Franklin Lakes, NJ). Los niveles de fluorescencia se convirtieron en niveles de receptores absolutos utilizando microperlas de Quantum (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN) con capacidad de unión a IgG1 predeterminada para generar una curva patrón. La reducción de datos se realizó con el software QuickCal v2.1 (Verity Software House, Topsham, ME) proporcionado por el fabricante.

EL pico de la intensidad de la fluorescencia del marcaje del anticuerpo anti-IGF-1 R de los sobreexpresores de IGF-1R se incrementó 10-20 veces en relación con las células Balb/C 3T3 y MCF-7 parentales para cada uno de los anticuerpos probados. Este es el resultado predicho para un anticuerpo que se une específicamente a IGF-1 R. La fluorescencia de fondo de las células tratadas sin anticuerpos o secundarias marcadas con FITC solo fueron insignificantes.

Ejemplo 14: Inhibición de IGF-1R

Este ejemplo presenta métodos para detectar la inhibición de IGF-1 R mediante anticuerpos anti-IGF-1 R.

Inhibición celular de 32D hu IGF-1 R+IRS-1

Las células 32D murinas que coexpresan el receptor IGF-1R humano (20 K por célula) y el IRS-1 humano han demostrado ser un sistema eficaz para examinar los componentes moleculares de señalización de IGF-1 R Valentinis et al., 1999, J Biol Chem 274:12423-30. Las células 32D normales expresan niveles relativamente bajos de los ortólogos murinos de estos dos productos génicos. Las células 32D normalmente requieren IL3 para el crecimiento y la supervivencia. IGF-1 o IGF-2 pueden reemplazar a IL3 en las células 32D huIGF-1R+IRS-1 como se muestra en la Figura 16, panel A. La CE50 a la curva de respuesta a la dosis de IGF-1 fue de aproximadamente 0,5 nM, mientras que la CE50 de IGF-2 (2,8 nM) es aproximadamente seis veces más alta, lo que refleja una afinidad más débil de IGF-2 por IGF-1R. Para evaluar la capacidad de los anticuerpos TQ11C, t Q25, TQ58 y TQ59 para bloquear la estimulación de IGF-1 o IGF-2, se sembraron placas de microtitulación de 96 pocillos con 30.000 células 32D hu IGF-1R+IRS-1 por pocillo en un volumen de 200 pl de RPMI (Gibco/BRL) que contenía suero bovino fetal al 5 % (Gibc /BRL) y 1x de penicilina, estreptomicina, glutamina (Giboco/BRL) y concentraciones crecientes de anticuerpo (10-12M a 10-6M) o ningún anticuerpo. Se añadió IGF-1 (2 nM), IGF-2 (8 nM) o nada después de 1 hora de incubación previa con anticuerpo. Se añadió 3H-timidina (1 pCi por pocillo) a las 27 h después de la adición del anticuerpo. Las células se recogieron 21 horas más tarde, y se determinó la incorporación de 3H-timidina en el ADN para cada muestra. Los ensayos se realizaron por triplicado. Se usó un anticuerpo anti-CD20 como control negativo. Cada uno de los anticuerpos TQ11C, TQ25, TQ58 y TQ59 fue capaz de bloquear completamente la estimulación mediada por IGF-1 e IGF-2 de las células 32D. La reducción de la proliferación de fondo en ausencia de IGF-1 e IGF-2 añadidos se debe a la inhibición de los niveles séricos de IGF-1 e IGF-2. Los datos de unión se analizaron utilizando el software GraphPad PRIZM™. Los datos se muestran en la Figura 16.

Inhibición celular de IGF-1 R humano en Balb/C 3T3

IGF-1 estimula en gran medida la incorporación de 3H-timidina mediante cultivos sin suero de fibroblastos embrionarios de ratón (Balb/C 3T3 o NIH 3T3 ) que sobreexpresan IGF-1R (~ 1 x 106 IGF1R por célula). Kato et al., 1993, J Biol Chem 268:2655-61; Pietrzkowski et al., 1992, Cell Growth Differentiation 3:199-205. Este fenómeno se recapitula tanto con IGF-1 como con IGF-2 en una línea celular Balb/C 3T3 hu sobreexpresora de IGF-1 R humano. Ambos factores de crecimiento estimularon la incorporación de la 3H-timidina en aproximadamente 20 veces. La

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión a antígeno, en donde dicha proteína de unión a antígeno

(a) comprende una combinación L16/H16 de un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en donde dicho dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32; y

dicho dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 136; o (b) comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende

i. la secuencia CDR1 de los restos 24 a 39 de la SEQ ID NO: 32; y

ii. la secuencia CDR2 de los restos 55 a 61 de la SEQ ID NO: 32; y;

iii. la secuencia CDR3 de los restos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 32;

y un dominio variable de cadena pesada que comprende

i. la secuencia CDR1 de los restos 31 a 36 de la SEQ ID NO: 136; y

ii. la secuencia CDR2 de los restos 51 a 66 de la SEQ ID NO: 136; y;

iii. la secuencia CDR3 de los restos 99 a 108 de la SEQ ID NO: 136;

en donde dicha proteína de unión a antígeno se une al IGF-1R humano.

2. La proteína de unión a antígeno de la Reivindicación 1 que comprende además:

a. la secuencia constante de la cadena ligera kappa de la Figura 13,

b. la secuencia constante de la cadena pesada de IgG1 de la Figura 13 o

c. la secuencia constante de la cadena ligera kappa de la Figura 13 y la secuencia constante de la cadena pesada de IgG1 de la Figura 13.

3. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha proteína de unión a antígeno comprende:

a. un anticuerpo humano;

b. un anticuerpo humanizado;

c. un anticuerpo quimérico;

d. un anticuerpo monoclonal;

e. un anticuerpo recombinante; un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno; un anticuerpo monocatenario; un diacuerpo; un triacuerpo; un tetracuerpo; un fragmento Fab; un fragmento F(ab’)2;

f. un anticuerpo IgD; un anticuerpo IgE; un anticuerpo IgM; un anticuerpo IgG1; un anticuerpo IgG2; un anticuerpo IgG3; un anticuerpo IgG4; o un anticuerpo IgG4 que tiene al menos una mutación en una región bisagra que alivia la tendencia a formar un enlace disulfuro dentro de la cadena H.

4. Un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica dicha proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho polinucleótido comprende opcionalmente una secuencia del ácido nucleico de dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 31 y una secuencia del ácido nucleico de dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 135.

5. Un plásmido que comprende dicho polinucleótido de la Reivindicación 4, en donde dicho plásmido es opcionalmente un vector de expresión.

6. Una célula que comprende dicho polinucleótido de la Reivindicación 4, en donde opcionalmente

a. un cromosoma de dicha célula comprende dicho polinucleótido;

b. dicha célula es un hibridoma;

c. un vector de expresión comprende dicho polinucleótido; y o

d. dicha célula es una célula CHO.

7. Un método para preparar una proteína de unión a antígeno que se une a IGF-1 R humano, que comprende incubar dicha célula de la Reivindicación 6 en condiciones que le permiten expresar dicha proteína de unión a antígeno.

8. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

9. Una proteína de unión a antígeno, en donde dicha proteína de unión a antígeno

(a) comprende una combinación L16/H16 de un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en donde dicho dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32; y

dicho dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 136; o (b) comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende

i. la secuencia CDR1 de los restos 24 a 39 de la SEQ ID NO: 32; y

ii. la secuencia CDR2 de los restos 55 a 61 de la SEQ ID NO: 32; y;

iii. la secuencia CDR3 de los restos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 32;

y un dominio variable de cadena pesada que comprende

i. la secuencia CDR1 de los restos 31 a 36 de la SEQ ID NO: 136; y

ii. la secuencia CDR2 de los restos 51 a 66 de la SEQ ID NO: 136; y;

iii. la secuencia CDR3 de los restos 99 a 108 de la SEQ ID NO: 136; en donde dicha proteína de unión a antígeno se une al IGF-1R humano o la proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3 o la composición farmacéutica de la Reivindicación 8 para su uso en el tratamiento de una afección en un sujeto, en donde dicha afección es tratable reduciendo la actividad de IGF-1R en dicho sujeto, en donde, opcionalmente, dicho sujeto es un ser humano.

10. La proteína de unión a antígeno o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde

a. dicha afección es una afección cancerosa;

b. dicha afección es mieloma múltiple, un tumor líquido, cáncer de hígado, un trastorno del timo, una enfermedad autoinmunitaria mediada por linfocitos T, un trastorno endocrinológico, isquemia o un trastorno neurodegenerativo,

en donde opcionalmente

dicho tumor líquido se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfocítica aguda (LLA) y leucemia mielógena crónica (LMC);

dicho cáncer de hígado se selecciona del grupo que consiste en hepatoma, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, angiosarcomas, hemangiosarcomas, hepatoblastoma;

donde dicho trastorno de timo se selecciona del grupo que consiste en timoma y tiroiditis; dicha enfermedad autoinmunitaria mediada por linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en Esclerosis Múltiple, Artritis Reumatoide, Lupus Eritematoso Sistémico (LES), enfermedad de Grave, Tiroiditis de Hashimoto, Miastenia Grave, Tiroiditis autoinmunitaria, Enfermedad de Bechet;

dicho trastorno endocrinológico se selecciona del grupo que consiste en Diabetes de tipo II, hipertiroidismo, hipotiroidismo, tiroiditis, hiperadrenocorticismo e hipoadrenocorticismo;

dicha isquemia es isquemia posterior a infarto de miocardio; o

dicho trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer; o

c. dicha afección se selecciona del grupo que consiste en acromegalia, cáncer de vejiga, tumor de Wilm, cáncer de ovarios, cáncer pancreático, hiperplasia benigna de próstata, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de hueso, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de cuello de útero, sarcoma sinovial, diarrea asociada a carcinoide metastásico, tumores secretores de péptidos intestinales vasoactivos, gigantismo, psoriasis, ateroesclerosis, restenosis del músculo liso de los vasos sanguíneos, proliferación microvascular inapropiada, glioblastoma, meduloblastoma, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer oral, leucoplasia oral, neoplasia intraepitelial de próstata, cáncer de ano, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hueso, cáncer metastásico, policitemia rubra vera, una afección benigna relacionada con el estrés oxidativo, retinopatía del prematuro, síndrome de la dificultad respiratoria agua, una sobredosis de acetaminofeno, displasia broncopulmonar, fibrosis quística, fibrosis pulmonar y retinopatía diabética.

11. La proteína de unión a antígeno o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con las Reivindicaciones 9 o 10, que comprende además administrar a dicho sujeto un segundo tratamiento.

12. La proteína de unión a antígeno o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la Reivindicación 11 en donde

a. dicho segundo tratamiento se administra a dicho sujeto antes y/o simultáneamente con y/o después de que dicha composición farmacéutica se administre a dicho sujeto;

b. dicho segundo tratamiento comprende tratamiento con radiación, cirugía o administración de una segunda composición farmacéutica,

en donde opcionalmente, dicha segunda composición farmacéutica comprende un agente seleccionado del grupo que consiste en un corticosteroide, un antiemético, clorhidrato de ondansetrón, clorhidrato de granisetrón, metroclopramida, domperidona, haloperidol, ciclizina, lorazepam, proclorperazina, dexametasona, levomepromazina, tropisetrón, una vacuna contra el cáncer, un agente inhibidor de GM-CSF, una vacuna de ADN de GM-CSF, una vacuna basada en células, una vacuna de células dendríticas, una vacuna viral recombinante, una vacuna de proteína de choque térmico (HSP), una vacuna tumoral alogénica, una vacuna tumoral autóloga, un analgésico, ibuprofeno, naproxeno, trisalicilato de magnesio de colina, un clorhidrato de oxicodona, un agente antiangiogénico, un agente antivascular, bevacizumab, un anticuerpo anti-VEGF, un anticuerpo del receptor de anti-VEGF, un fragmento de receptor de VEGF soluble, un anticuerpo anti-TWEAK, un anticuerpo antirreceptor TWEAK, un fragmento del receptor de TWEAK soluble, AMG 706, AMG 386, un agente antiproliferativo, un inhibidor de la proteína farnesil transferasa, un inhibidor de avp3, un inhibidor de avp5, un inhibidor de p53, un inhibidor del receptor Kit, un inhibidor del receptor ret, un inhibidor de PDGFR, un inhibidor de la secreción de la hormona del crecimiento, un inhibidor de la angiopoyetina, un agente inhibidor de macrófagos infiltrante del tumor, un agente inhibidor de c-fms, un anticuerpo anti-c-fms, un agente inhibidor de CSF-1, un anticuerpo anti-CSF-1, un fragmento de c-fms soluble, pegvisomant, gemcitabina, panitumumab, irinotecán y SN-38;

c. un tercer tratamiento se administra adicionalmente a dicho sujeto; y/o

d. un tercer tratamiento se administra adicionalmente a dicho sujeto, en donde dicha afección es un cáncer, dicho segundo tratamiento comprende administrar panitumumab y dicho tercer tratamiento comprende administrar gemcitabina.

13. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 o la composición farmacéutica de la Reivindicación 8 para su uso en un método para

a. disminuir la actividad de IGF-1R en un sujeto que lo necesite;

b. disminuir la señalización de IGF-1 R en un sujeto que lo necesite; o

c. inhibir la unión de IGF-1 y/o IGF-2 a IGF-1 R en un sujeto que lo necesite.