CN103319597B - 一种抗***-1受体抗体及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗***-1受体抗体及其编码基因和应用。该IGF-1R抗体的重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为：GYSISSGYYWG、NIYHSGSTNYNPSLKS、QGGSYSTDY；轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为：SGSRSNIGSNPAN、SNNQRPS、SSWDDSLNGP。重链可变区、轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1和3所示。所述应用为抗IGF-1R抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。与现有技术相比，本发明抗IGF-1R抗体能有效抑制IGF-1R高表达的肿瘤细胞的生长。

Description

一种抗***-1受体抗体及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种抗***-1受体抗体及其编码基因和应用。

背景技术

***-1受体（Insulin-like Growth Factor-1Receptor，IGF-1R）是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体糖蛋白。它由四个亚单位组成，即二个胞外的α亚单位，以及二个具有跨膜和胞内部分的β亚单位。IGF-1R的α亚单位与配体结合而激活β亚单位的酪氨酸激酶活性。

IGF-1R在结构上与胰岛素受体（Insulin Receptor，IR）有很高的相似性。在细胞转导过程中，***-1（IGF-1）与其受体（IGF-1R）结合而导致信号传导介质的聚集，从而活化特殊的信号传导途径，包括ras-raf-MAPK、P13-K/Akt-1途径等。ras-raf-MAPK途径会刺激细胞增生，而P13-K/Akt-1途径则启动细胞的一些其他功能，包括转录、代谢、生长和翻译等。

研究表明，IGF-1R在多种肿瘤细胞中有异常高的表达，例如乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、血性肉瘤（sarcoma）、***癌、肝癌、卵巢癌、胃癌等等（R.Baserga,F.Peruzzi,K.Reiss.(2003).“TheIGF-1Receptor in Cancer Biology.”Int.J.Cancer.107:873-877.；M.Chitnis,J.Yuen,A.Protheroe,et al.(2008).“The Type1Insulin-Like GrowthFactor Receptor Pathway.”Clinical Cancer Res.14(20):6364-6370.；M.Fidler,D.Shersher,J.Borgia,P.Bonomi.(2012).“Targeting the Insulin-LikeGrowth Factor Receptor Pathway in Lung Cancer:Problems and Pitfalls.”Therap.Adv in Med.Oncol.4(2):51-60.；方维丽等.2008.“***-1受体与胃癌发生发展关系的研究。”《中华消化杂志》.28(8):522-526.；王晓鹏等.2007.“阻断***I型受体对肝癌细胞生长的影响。”《中华普通外科杂志》.22(3):211-214.）。

若干抗IGF-1R抗体在***的临床试验中（包括与其他化疗手段联合治疗的临床试验）显示了疗效（A.Gombos,O.Metzger-Filho,L.Lago,A.Awada-Hussein.(2012).“Clinical Development of Insulin-like GrowthFactor Receptor-1(IGF-1R)Inhibitors:at the Crossroad.”Invest New Drugs.30:2433-2422.；M.Fidler,D.Shersher,J.Borgia,P.Bonomi.(2012).“Targeting the Insulin-Like Growth Factor Receptor Pathway in Lung Cancer:Problems and Pitfalls.”Therap.Adv in Med.Oncol.4(2):51-60.；J.Rodon,V.DeSantos,R.Ferry Jr.,R.Kurzrock.(2008).“Early Drug Development ofInhibitors of the Insulin-like Growth Factor-I Receptor Pathway:Lessons fromthe First Clinical Trials.”Mol.Cancer Ther.7:2575-2588.）。因此，获得能抑制肿瘤生长的全人源抗IGF-1R抗体显得非常有意义。

发明内容

本发明提供了一种抗***-1受体（IGF-1R）抗体，该抗体为全人源抗IGF-1R抗体，与IGF-1R具有高亲和力，能用于治疗人体疾病。

一种抗***-1受体抗体，为抗体Ⅱ，其重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为：GYSISSGYYWG、NIYHSGSTNYNPSLKS、QGGSYSTDY（SEQ IDNo.3～5）；

CDRH1位于重链可变区第26～36位，CDRH2位于重链可变区第51～66位，CDRH3位于重链可变区第99～107位；

其轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为：SGSRSNIGSNPAN、SNNQRPS、SSWDDSLNGP（SEQ IDNo.8～10）；

CDRL1位于轻链可变区第23～36位，CDRL2位于轻链可变区第51～57位，CDRL3位于轻链可变区第90～99位。

在抗体分子可变区上，三个高变区的氨基酸序列存在很大的变异性，而高变区之间的区域氨基酸序列则变化较小。这三个高变区在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，因此又被称为互补决定区（CDR），不同重链轻链的CDR决定了抗体对抗原的特异性。

优选地，抗体Ⅱ的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

抗体Ⅱ可以是全抗体或全抗体的抗原结合部分。所述全抗体优选为IgG1型；所述抗原结合部分优选为Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段或单链抗体，更优选为单链抗体。

抗原结合部分既保留了能与抗原特异结合的区域，又避免了Fc片段的抗原性而引起的副作用；其中单链抗体具有易渗透肿瘤组织中增加药物浓度，免疫原性小，在体内循环的半衰期短、易于清除，易于与毒素或酶基因连接从而直接获得免疫毒素或酶标抗体等优点。

抗原结合部分可以通过DNA重组技术或或通过酶促或化学裂解全抗体来制备。本发明抗IGF-1R单链抗体的制备方法为：采用公开号为CN1444651A的中国专利文献公开的方法构建人单链抗体文库，并在该人单链抗体文库中筛选抗IGF-1R抗体。

本发明还提供了所述抗IGF-1R抗体的编码基因，其中，抗体Ⅱ重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供了含有所述编码基因的重组载体或表达***。所述重组载体的原始载体为pACT2或pET27b。

本发明还提供了所述抗IGF-1R抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明抗IGF-1R抗体能特异地结合人IGF-1R，有效抑制IGF-1R高表达的肿瘤细胞的生长。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的抗IGF-1R抗体是能用于治疗人体疾病的高亲和力全人源抗IGF-1R抗体，能特异结合人IGF-1R，有效抑制肿瘤细胞的生长。

附图说明

图1为本发明单链抗体的结构示意图；

图2为本发明抗IGF-1R单链抗体#IGF1Rα-7的ELISA检测结果；

图3为本发明抗IGF-1R抗体DB#7抑制结肠癌肿瘤生长结果；

图4本发明抗IGF-1R抗体DB#7与5-FU联用抑制结肠癌肿瘤生长结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1抗IGF-1R单链抗体的筛选

采用公开号为CN1444651A的中国专利文献公开的方法构建人单链抗体文库，并在该人单链抗体文库中筛选抗IGF-1R单链抗体，具体实施过程如下：

1扩增得到人抗体重链和轻链可变区DNA

以来自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白细胞的poly A+RNA（购自Clontech）为模板，利用oligo（dT）和随机引物（random primers），使用逆向转录酶试剂盒（购自Clontech），根据Clontech试剂盒所提供的方法指南，将poly A+RNA逆向转录成cDNA。

以上述cDNA为模板，利用一系列识别人抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因的引物，进行PCR扩增得到人抗体中所有的重链可变区和轻链可变区的DNA序列。一系列识别人抗体重链和轻链可变区基因的引物序列如下：

第一组为扩增人抗体重链可变区（VH）基因的5’-端引物（SEQ IDNo.11～17），包括：

VH1b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC(C/G)G-3’；

VH2b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA-3’；

VH3b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTACAGCAGTGG G-3’；

VH4b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACGAGGTGCAGCTG(G/T)TGGAG(A/T)C(C/T)-3’；

VH5b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTCCAGCT(G/T)GT(A/G)CAGTCTGG-3’；

VH6b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAG(A/G)TCACCTTGAAGGAGTCTG-3’；

VH7b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGGTG(C/G)A(A/G)TCTGG-3’；

第二组为扩增人抗体重链可变区(VH)基因的3’-端引物（SEQ IDNo.18～23），包括：

VH1f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGAC(A/G)GTGACCAGGGTG-3’；

VH2f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT-3’；

VH3f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAAGAGACGGTGACCATTGT-3’；

VH4f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC-3’；

VH5f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCGGTTGGGGCGGATGCACTCC-3’；

VH6f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCC(C/G)GATGGGCCCTTGGTGGA(A/G)GC-3’；

第三组为扩增人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的5’-端引物（SEQ IDNo.24～32），包括：

VL1b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTGT(C/G)(C/G/T)TGACGCAGCCGCC-3’；

VL2b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATG(A/T)GCTGAC(A/T)CAGCCAC-3’；

VL3b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATGAGCTGA(C/T)(A/G)CAGC(C/T)ACC-3’；

VL4b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCCTGTGCTGACTCA(A/G)(C/T)C-3’；

VL5b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAG(A/G/T)CTGTGGTGAC(C/T)CAGGAGCC-3’；

VL6b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCC(A/T)G(G/T)GCTGACTCAGCC(A/C)CC-3’；

VL7b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTCTGAGCTGA(C/G)TCAGGA(C/G)CC-3’；

VL8b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTG(C/T)(C/T)CTGA(C/T)TCAGCCT-3’；

VL9b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTAATTTTATGCTGACTCAGCCCC-3’；

第四组为扩增人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的3’-端引物（SEQ IDNo.33～34），包括：

VL1f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATAGGACGGT(C/G)A(C/G)CTTGGTCC-3’；

VL2f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGAGAGGACGGTCAGCTGGGTGC-3’；

第五组为扩增人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的5’-端引物（SEQ IDNo.35～38），包括：

VK1b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGACATCC(A/G)G(A/G/T)TGACCCAGTCTCC-3’；

VK2b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAATTGT(A/G)(A/T)TGAC(A/G)CAGTCTCC-3’；

VK3b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGATATTGTG(A/C)TGAC(C/G/T)CAG(A/T)CTCC-3’；

VK4b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAACGACACTCACGCAGTCTC-3’；

第六组为扩增人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的3’-端引物（SEQ IDNo.39～42），包括：

VK1f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATTTCCACCTTGGTCC-3’；

VK2f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATCTCCA(C/G)CTTGGTCC-3’；

VK3f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATATCCACTTTGGTCC-3’；

VK4f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTAATCTCCAGTCGTGTCC-3’。

扩增人抗体中的重链可变区(VH)时，利用第一组引物与第二组引物的组合，即有42个PCR反应；扩增人抗体中的λ-轻链可变区(Vλ)时，利用第三组引物与第四组引物的组合，即有18个PCR反应；扩增人抗体中的k轻链可变区(Vk)时，利用第五组引物与第六组引物的组合，即有16个PCR反应。

第一组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2（Hua SB,Luo Y,Qiu M,Chan E,Zhou H,Zhu L.(1998)Gene.215:143-152.）（Hua SB,Qiu M,ChanE,Zhu L,Luo Y.(1997)Plasmid.38:91-96.）多克隆位点的上游同源序列（下划线部分）；第四组和第六组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2多克隆位点的下游同源序列（下划线部分）；而第二组、第三组和第五组引物中包含有连接肽序列（下划线部分），连接肽用于连接抗体的重链可变区和轻链可变区。

扩增时，PCR反应体系与反应条件均相同，PCR反应体系为：

将上述各组分混合均匀后置于PCR仪中进行反应。反应条件为：94℃解链1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2.5分钟，循环30次。

2连接载体多克隆位点的同源序列和连接肽序列

（1）以步骤1中PCR所得的人抗体重链可变区DNA为模板，分别以引物7和引物8为上游引物和下游引物，序列为：

上游引物（引物7，SEQ ID No.43，下划线部分为载体pACT2多克隆位点的上游同源序列）：

5’-ACCCCACCAAACCCAAAAAAAGAGATCTGTATGGCTTACCC ATACGATGTTCCAGATTAC-3’；

下游引物（引物8，SEQ ID No.44，下划线部分为连接肽反链序列）：

5’-ACTGCCTCCACCACCGCTGCCACCTCCGCCAGATCCTCCGCC GCCTGATCCACCACCGCC-3’；

进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。反应完成后获得含5’-载体pACT2多克隆位点的上游同源序列和3’-连接肽反链序列的人抗体重链可变区DNA序列。

（2）以步骤1中PCR所得的人抗体轻链可变区DNA为模板，以引物9和引物10分别为下游引物和上游引物，序列如下：

上游引物（引物10，SEQ ID No.45，下划线部分为连接肽顺链序列）：

5’-GGCGGTGGTGGATCAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGG CAGCGGTGGTGGAGGCAGT-3’；

下游引物（引物9，SEQ ID No.46，下划线部分为载体pACT2多克隆位点的下游同源序列）：

5’-GAGATGGTGCACGATGCACAGTTGAAGTGAACTTGCGGGGT TTTTCAGTATCTACGA-3’；

进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。反应完成后获得含3’-载体pACT2多克隆位点的下游同源序列和5’-连接肽顺链序列的人抗体轻链可变区DNA序列。

3连接单链抗体

将步骤2中PCR扩增得到的含载体pACT2多克隆位点的同源序列和连接肽序列的人抗体重链可变区DNA和轻链可变区DNA混合，以该混合DNA为模板，分别以引物7和引物9为上游引物和下游引物，进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。

如图1所示，反应完成后得到包括人抗体重链可变区DNA序列、轻链可变区DNA序列、载体pACT2多克隆位点同源序列以及连接肽DNA序列的单链抗体（scFv）DNA。

4构建人单链抗体基因文库

将步骤3获得的单链抗体DNA与经限制性内切酶（Bam HI和Eco RI）处理后的酵母双杂交载体pACT2按照原Clontech公司提供的方法（YeastProtocol Handbook,PT3024-1）共同转化进入酵母菌株Y187（MATα,ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trp1-901,leu2-3,112,gal4Δ,gal80Δ,met-,URA3::GAL1_UAS-GAL1_TATA-lac Z,MEL1）内，经细胞内同源重组后将单链抗体DNA整合到pACT2载体上，从而得到酵母双杂交单链抗体文库，单链抗体DNA片段与pACT2载体上的Gal4激活区域（Activation Domain，AD）融合在一起。

为检查该单链抗体基因文库的质量，从中随机挑出了21个克隆，对***片段进行测序分析。分析结果表明，所有克隆都包括与Gal4融合在一起的单链抗体DNA片段，而且所有单链抗体DNA序列都是独特的。

经同源重组而得到的酵母双杂交单链抗体基因文库中抗体DNA拷贝数大约有1×10⁸个，可应用于酵母双杂交技术筛选特定的抗体。

5筛选抗体

（1）抗体筛选

使用人***-1受体（IGF-1R）作为抗原，对酵母双杂交单链抗体基因文库进行抗体筛选。

将编码人IGF-1Rα亚单位的DNA重组到载体pGBKT7中，构建pGBK-IGF1Rα。pGBK-IGF1Rα编码Gal4DNA结合区域（Binding Domain，BD），并在其C端融合了人IGF-1Rα亚单位。

在编码人IGF-1Rα亚单位的DNA序列得到验证后，将pGBK-IGF1Ra质粒DNA转化入酵母菌株AH109（MATa,trp1-901,leu2-3,112,ura3-52,his3-200,gal4Δ,gal80Δ,LYS2::GAL1_UAS-GAL1_TATA-HIS3,GAL2_UAS-GAL2_TATA-ADE2,URA3::MEL1_UAS-MEL1_TATA-lac Z）；带有pGBK-IGF1Rα质粒的AH109酵母可在不含色氨酸的合成培养基（SD/-W）上生长。

将等量的含pGBK-IGF1Rα的MATa型酵母细胞（AH109菌株）与含单链抗体基因文库的MATα型酵母细胞（Y187菌株）进行共同培养，使此二型细胞交配结合。由于载有单链抗体基因文库的pACT2载体含有Leu2基因，且pGBK-IGF1Rα包含Trp1基因，因此，包含两种质粒的酵母细胞可以生长在不含亮氨酸和丝氨酸的酵母合成培养基（SD/-LW）。

存在scFv/IGF1Rα相互作用的细胞会激活整合在菌株基因组中的报告基因ADE2和HIS3，从而使得酵母细胞可以生长在缺乏腺嘌呤，组氨酸，亮氨酸和色氨酸的培养基（SD/-AHLW）上，并在该平板培养基上形成菌落。

（2）特异性抗体筛选

1）β半乳糖苷酶分析

由于存在scFv/IGF1Rα相互作用的细胞也会激活整合在菌株基因组中的另一报告基因lac Z，因此检测酵母细胞内β半乳糖苷酶是否表达可判断酵母细胞内scFv/IGF1Rα的存在。

在筛选培养基（SD/-AHLW）上总共挑选出35个菌落，使用β半乳糖苷酶检测法检测lac Z表达。检测方法如下：

①将存在scFv/IGF1Ra相互作用的酵母接种到筛选培养基（SD/-AHLW）平板上生长；

②将酵母菌落转移到Whatman五号滤纸上；

③将带有酵母细胞菌落的滤纸浸入液氮之中，使细胞破裂；

④将滤纸从液氮中取出，并置于30℃的烘箱内；重复步骤（3）和（4）两次；

⑤将滤纸铺于适量的X-gal溶液中，并置于37℃的温箱内约15分钟；若菌落处显示蓝色，表明为β半乳糖苷酶阳性，即lac Z基因被激活表达。

其中，X-gal溶液配方如下：

16.1g/L Na₂HPO₄·7H₂O；

5.50g/L NaH₂PO₄·H₂O；

0.75g/L KCl；

0.246g/L MgSO₄·7H₂O；

35mg/L X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)；

5mMβ-巯基乙醇；pH7.0。

检测结果：上述挑选出的35个菌落中，有22个是β半乳糖苷酶阳性，表明在这些菌落中报告基因lacZ被激活了。

2）特异结合分析

对上述22个β半乳糖苷酶阳性菌落的scFv进行特异性分析，以验证单链抗体scFv是否特异性地与IGF-1R的α亚基部分结合。由于IGF-1R的结构与胰岛素受体（IR）很相似，应剔除与IR相结合的抗体。

将编码人胰岛素受体（IR）α亚单位的DNA克隆到载体pGBKT7构建pGBKT-IRα，pGBKT-IRα编码Gal4DNA结合区域（BD）并在其C端融合了人IR的α亚单位。

从上述22个β半乳糖苷酶阳性的酵母中提取含有scFv的pACT2质粒DNA，再分别与pGBKT7空载体DNA、pGBKT-IRα质粒DNA、pGBKT-Lam质粒DNA（编码Gal4DNA结合区域并在其C端融合有人核纤层蛋白C）共同转化到AH109酵母细胞内；转化后的酵母细胞先铺于SD/-LW平板培养基上生长，然后转移到SD/-AHLW平板培养基上；对长出的菌落作β半乳糖苷酶分析，验证为阳性的菌落视为含有非特异性的scFv，将其剔除。

经上述特异性分析后，得到一个对人IGF-1R具有特异性的单链抗体，编号为#IGF1Rα-7，使用ABI自动测序仪对该单链抗体进行测序分析，结果显示：

#IGF1Rα-7重链可变区的DNA序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列（SEQ ID No.2）为：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSGYYWGWFRQPPGKGLEWIGNIYHSGSTNYNPSLKSRVTMSVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARQGGSYSTDYWGQGTLVTVSSGSASAPT；

下划线部分依次为三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3（SEQ IDNo.3～5）；

#IGF1Rα-7的轻链可变区的DNA序列如SEQ ID No.6所示，氨基酸序列（SEQ ID No.7）为：

SYELMQLPSASGTPGQRVTISCSGSRSNIGSNPANWYQQFPGTAPKLFIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCSSWDDS LNGPVFGTGTKLTVL；

下划线部分依次为三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3（SEQ IDNo.8～10）。

实施例2特异性检测

1抗体表达与纯化

将单链抗体#IGF1Rα-7的编码基因克隆到表达载体pET27b(+)中，构建得到pET27b-IGF1Rα；

将pET27b-IGF1Rα转化入表达细菌E.coli BL21(DE3)，并按照Novagen公司提供的方法用IPTG（0.5mM）诱导表达；表达出的目标蛋白中，scFv的N端是pelB序列，pelB序列可将表达后的scFv分泌到BL21(DE3)的周质腔（periplasmic space）中；scFv的C端含有一个HSV标记物和一个6×His标记物，方便目标蛋白的纯化；

应用Qiagen公司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱分离纯化得到抗人IGF-1R的单链抗体。

2ELISA测试单链抗体的特异性

重组人IGF-1R的蛋白质购自北京义翘神州生物技术有限公司。ELISA测试方法如下：

（1）用IGF-1R包被96-孔板，在2-8℃过夜；

（2）包被后的96-孔板再用SuperBlock作封闭处理；

（3）将单链抗体#IGF1Rα-7在0.02%BSA中作系列稀释后加入已包被有IGF-1R的96-孔中，与IGF-1R结合；

（4）将96-孔板清洗后，加入稀释5000倍的鼠抗HSV标记物的抗体，用来检测结合了的单链抗体；

（5）将96-孔板清洗后，加入稀释10000倍的山羊抗鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶偶联物；

（6）将96-孔板最终清洗后，应用辣根过氧化物酶底物TMB试剂作显色处理；

（7）用0.5M的硫酸终止反应，并检测450nm的吸收光谱。

检测结果如图2所示，表明单链抗体#IGF1Rα-7能有效地结合人***-1受体。

实施例3抗IGF-1R抗体抑制肿瘤的生长

委托北京义翘神州生物技术有限公司制备全长重组人源抗IGF-1R抗体DB#7。DB#7为IgG1型，其可变区序列与单链抗体#IGF1Rα-7的可变区序列相同。

根据文献（1999.“Inhibition of Epidermal growth factorreceptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas withCP-358:Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects inathymic mice.”J.Pharmacol.Exp.Ther.291:739-748.）中记载的方法，在无胸腺裸鼠（nu/nu）体内诱导肿瘤。

将结肠腺癌Colo205细胞（ATCC CCL222）（约5x10⁶个细胞）与Matrigel制剂皮下注射到3-4周的无胸腺裸鼠（nu/nu）体内诱导肿瘤；在肿瘤形成到约200mm³大小时，将上述抗体以单剂单次（500μg/次，腹膜内i.p.注射）方式注射入裸鼠体内；用游标卡尺测量肿瘤的二个直径来确定肿瘤的尺寸，并根据文献（“Protocols for screening chemical agents andnatural products against animal tumors and other biological systems.”CancerChemother.Rep.3:1-104.）记载的方法计算肿瘤的体积，肿瘤体积=（长度x[宽度]²）/2。

图3所示的为用抗体DB#7单剂单次处理后肿瘤大小与时间变化的关系，对照组用生理盐水处理。检测结果表明，抗体DB#7对的结肠腺癌Colo205细胞具有明显的肿瘤抑制效果。

实施例4组合物抑制肿瘤生长

将结肠腺癌Colo205细胞（ATCC CCL222）（约5x10⁶个细胞）与Matrigel制剂皮下注射到3-4周的无胸腺裸鼠（nu/nu）体内诱导肿瘤；在肿瘤形成到约200mm³大小时，在第0、7、14、21天时用实施例3的抗体单剂（500μg/次，腹膜内i.p.注射）、5-FU单剂（100mg/kg，静脉i.v.注射）、二者组合（抗体+5-氟脱氧尿核苷，静脉i.v.注射）分别处理裸鼠。

肿瘤大小变化如图4所示。结果表明，与对照组相比，抗体DB#2每7天一次注射能更有效地抑制肿瘤的生长。此外，与对照组，单独用抗体处理组或单独5-FU处理组相比，将抗体DB#2与5-FU联用时大大增强了肿瘤抑制效果。

Claims (8)

1.一种抗***-1受体抗体，其特征在于，为抗体Ⅱ，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；

重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为：GYSISSGYYWG、NIYHSGSTNYNPSLKS、QGGSYSTDY；其轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为：SGSRSNIGSNPAN、SNNQRPS、SSWDDSLNGP。

2.如权利要求1所述的抗***-1受体抗体，其特征在于，所述抗体Ⅱ为全抗体或全抗体的抗原结合部分。

3.如权利要求2所述的抗***-1受体抗体，其特征在于，所述全抗体为IgG1型。

4.如权利要求2所述的抗***-1受体抗体，其特征在于，所述抗原结合部分为Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段或单链抗体。

5.如权利要求1所述的抗***-1受体抗体的编码基因，其特征在于，抗体Ⅱ的重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

6.含有如权利要求5所述的编码基因的重组载体。

7.含有如权利要求5所述的编码基因的表达***。

8.如权利要求1～4任一所述的抗***-1受体抗体在制备抗肿瘤药物中的应用；其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗结肠癌药物。