TW202317614A - 使用岩藻糖苷酶控制糖基化蛋白的去岩藻糖基化水平 - Google Patents

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Abstract

本文提供了獲得去岩藻糖基化糖型水平增加的重組糖基化蛋白之方法。在示例性實施方式中，該等方法包括將純化的重組糖基化蛋白用人廣泛特異性岩藻糖苷酶孵育並將該重組糖基化蛋白與該岩藻糖苷酶分離。

Description

使用岩藻糖苷酶控制糖基化蛋白的去岩藻糖基化水平
本揭露關於糖基化蛋白領域。特別地，本揭露關於藉由對純化的蛋白質進行岩藻糖苷酶處理並使糖基化蛋白與岩藻糖苷酶分離來獲得去岩藻糖基化增加的糖基化蛋白（如抗體）之方法。
基於重組單株抗體（mAb）的治療藥物係已投入使用的生物製劑，其已被用於治療疾病，如癌症、炎症和其他自體免疫障礙。參見，例如，Sha等人, 2016, Trends Biotechnol [生物技術趨勢] 34:835-846。在翻譯後修飾期間，mAb經歷糖基化，這係最常見和最重要的、但也最複雜的修飾之一。這一步驟的複雜性源於糖（聚糖）部分與蛋白質共價附接（最常見於Asn（N-連接）或Ser/Thr（O-連接）殘基）所涉及的化學異質性。附接到Fc區的N-連接聚糖組成物係mAb的一項關鍵品質屬性。糖基化在多項細胞功能中起作用，該等細胞功能包括例如蛋白質折疊、品質控制、分子投送和分選以及細胞表面受體相互作用。糖基化水平影響重組蛋白藥物的治療功效，因為它影響治療性糖蛋白的生物活性、藥物動力學、免疫原性、溶解性和體內清除率。單株抗體（mAb）的糖基化還影響安全性，因此瞭解影響和匹配糖基化譜在生物相似性藥物開發中至關重要。聚糖被認為會影響抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）活性以及補體依賴性細胞毒性（CDC），這係mAb的關鍵效應子功能。參見，例如Liu等人, 2015, J Pharm Sci [藥物科學雜誌] 104:1866-1884。
糖基化關注的一個領域係調節最終藥物物質中的去岩藻糖基化物種，以優化IgG分子的治療功能。特別地，Fc糖型譜係重組抗體的重要產品品質屬性，因為它們直接影響抗體的臨床功效和藥物動力學。Fc區與各種細胞受體（如Fc受體）和其他免疫分子（如補體蛋白）結合。這一結合介導例如肥大細胞、嗜鹼性球和嗜酸性球的調理、細胞裂解和去顆粒的過程。參見Woof等人, 2004, Nat Rev Immunol [自然綜述免疫學] 4:89-99。發現缺乏附接到核心聚糖結構的單糖岩藻糖有助於增強ADCC功能和治療藥物的結合親和力。參見Zhang等人, 2016, MAbs [單株抗體] 8:205-215。
在上游生產期間，mAb上的聚糖譜可因細胞系、製程條件、培養基和飼料配方以及早期發育階段的基因工程化的變化而有所不同。參見，例如，Ehret等人, 2019, Biotechnology and Bioengineering [生物技術與生物工程] 116:816-830。考慮到在細胞攝取、生長和收穫期間所涉及到的複雜難題，該等變數在調節糖基化水平中的作用複雜並且難以實施。
已描述了許多不同的減少岩藻糖基化的方法。美國專利案號10,407,673；10,077,434；9,540,673；8,642,292；8,409,838；7,919,313；和7,214,775；美國專利申請公開案號US 2020/0199236；US 2019/0185898；US 2019/0112358；US 2018/0251572；和US 2018/0171028；以及國際專利申請公開案號WO 2020/042015；WO 2020042022；和WO 2019/246383描述了修飾了岩藻糖基化途徑中的酶或敲除了編碼岩藻糖基化途徑中的酶（如岩藻糖基轉移酶（FUT8））的基因的宿主細胞，該岩藻糖基化途徑中的酶。美國專利案號10,676,772；和10,167,492；美國專利申請公開案號US 2020/0131518；以及國際專利申請公開案號WO 2020/033827；WO 2020/094694；WO 2019/224333；WO 2019/191150；和WO 2018/114929描述了藉由修改細胞培養條件來控制岩藻糖基化。美國專利案號9,504,702；和國際專利申請公開案號WO 2019/196697描述了使用岩藻糖或甘露糖類似物來抑制岩藻糖基化。美國專利案號9,096,877描述了對Fc區胺基酸序列進行工程化以產生減弱翻譯後岩藻糖基化的突變。美國專利案號10,087,236描述了對人抗體、嵌合抗體或人源化抗體的Fc糖基化模式的逐步修改，其中一個步驟使用α-岩藻糖苷酶，且其他步驟使用糖基轉移酶，如內-β-N-乙醯基-胺基葡萄糖苷酶或α-2,6-唾液酸轉移酶。
雖然有許多方法影響抗體特定糖型的水平，但是生物製藥行業仍需要簡單有效的方法來操縱和控制重組生產治療性抗體期間的總去岩藻糖基化糖型水平。
本揭露提供了一種用於獲得去岩藻糖基化糖型水平增加的重組糖基化蛋白之方法，該方法包括：a) 將純化的重組糖基化蛋白與人廣泛特異性岩藻糖苷酶在適合岩藻糖苷酶活性的緩衝液中並且在適合增加該重組糖基化蛋白的去岩藻糖基化的條件下孵育一段時間；和b) 將該去岩藻糖基化糖型水平增加的重組糖基化蛋白與該岩藻糖苷酶分離；其中該重組糖基化蛋白不與糖基轉移酶或唾液酸轉移酶反應。
在某些實施方式中，人岩藻糖苷酶為α-(1-2,3,4,6)-L-岩藻糖苷酶。在某些實施方式中，岩藻糖苷酶以1,000 U/mmol至100,000 U/mmol重組糖基化蛋白的水平存在。在某些實施方式中，岩藻糖苷酶以5,000 U/mmol至25,000 U/mmol重組糖基化蛋白的水平存在。
在某些實施方式中，孵育持續1小時至24小時。
在某些實施方式中，緩衝液具有約4.0至約5.0的pH。在某些實施方式中，緩衝液為醋酸鈉、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）或2-(N-𠰌啉代)乙磺酸（MES）。
在某些實施方式中，溫度選自30°C至40°C的溫度。在某些實施方式中，溫度選自35°C至38°C的溫度。
在某些實施方式中，純化的重組糖基化蛋白的量大於或等於10 g/L。
在某些實施方式中，岩藻糖苷酶固定在固相上，如蛋白質A層析樹脂。
在某些實施方式中，純化的重組糖基化蛋白已藉由一或多個層析步驟純化。
在某些實施方式中，重組糖基化蛋白的A1G0、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5中一或多個的水平增加。在某些實施方式中，重組糖基化蛋白的高甘露糖（HM）糖型的水平降低。在某些實施方式中，重組糖基化蛋白的Man5、Man6、Man7、Man8和/或Man9中一或多個的水平降低。在某些實施方式中，半乳糖基化百分比降低。在某些實施方式中，唾液酸化百分比降低。
在某些實施方式中，使用一或多個純化步驟將重組糖基化蛋白與岩藻糖苷酶分離。在某些實施方式中，一或多個純化步驟選自滲濾、超濾和無菌過濾。
在某些實施方式中，重組糖基化蛋白為抗體、肽體或Fc融合蛋白。在某些實施方式中，重組糖基化蛋白係與以下結合的抗體：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11A、CD11B、CD11C、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31,CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD45RA、CD45RB、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD79α、CD79β、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CD109、CD114、CD 115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CDw128、CD129、CD130、CDw131、CD132、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CD146、CD147、CD148、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD182、促紅血球生成素、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、G-CSF、IL-15、GM-CSF、OSM、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、TNFβ、LTβ、CD40配體、Fas配體、CD27配體、CD30配體、4-BBL、TGFβ、IL-1α、IL-1β、IL-1 RA、IL-10、IL-12、MIF、IL-16、IL-17、IL-18、升糖素受體、IL-17受體A、骨硬化蛋白、IGF-1受體、肌生成抑制蛋白、表皮生長因子受體、SARS冠狀病毒、OPGL、血管生成素-2、NGF、TGF-β II型受體、結締組織生長因子、備解素、CTLA-4、干擾素-γ、MAdCAM、澱粉樣蛋白、胰島素樣生長因子I、介白素-1β、c-Met、M-CSF、MUC18、介白素-4受體、成纖維細胞生長因子樣多肽、α-4 β-7、激活素受體樣激酶-1、激活素A、血管生成素-1、血管生成素-2、C-FMS、甘丙肽、胰島素樣生長因子、LDCAM、DKK1、骨保護素、OV064、PSMA、PAR2、鐵調素、B7L-1、c-Kit、ULBP、TSLP、SIGIRR、HER-3、共濟失調蛋白-1樣多肽、TNF-α轉化酶、IL1-R1、TGF-β II型受體、TNF受體樣分子、結締組織生長因子、TRAIL受體-2、促紅血球生成素受體、B7RP1、備解素、RANKL、碳酸酐酶IX（CA IX）腫瘤抗原、甲狀旁腺激素、ACPL、單核細胞趨化蛋白-1、SCF、4-1BB、PDGFD、Flt-3配體、金屬蛋白酶抑制劑、LERK-5、LERK-6、腦源性神經營養因子、上皮源性T細胞介素、神經營養因子NNT-1、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶kexin 9型（PCSK9）、IL-18受體或C-FMS。在某些實施方式中，重組蛋白係以下之一：莫羅單抗-CD3（以商品名Orthoclone Okt3®上市的產品）、阿昔單抗（以商品名Reopro®上市的產品）、利妥昔單抗（以商品名MabThera®、Rituxan®上市的產品）、巴厘昔單抗（以商品名Simulect®上市的產品）、達利珠單抗（以商品名Zenapax®上市的產品）、帕立珠單抗（以商品名Synagis®上市的產品）、英利昔單抗（以商品名Remicade®上市的產品）、曲妥珠單抗（以商品名Herceptin®上市的產品）、阿侖單抗（以商品名MabCampath®、Campath-1H®上市的產品）、阿達木單抗（以商品名Humira®上市的產品）、托西莫單抗-I131（以商品名Bexxar®上市的產品）、依法珠單抗（以商品名Raptiva®上市的產品）、西妥昔單抗（以商品名Erbitux®上市的產品）、替伊莫單抗（以商品名Zevalin®上市的產品）、奧馬珠單抗（以商品名Xolair®上市的產品）、貝伐單抗（以商品名Avastin®上市的產品）、那他珠單抗（以商品名Tysabri®上市的產品）、蘭尼單抗（以商品名Lucentis®上市的產品）、帕尼單抗（以商品名Vectibix®上市的產品）、依庫麗單抗（以商品名Soliris®上市的產品）、培戈-瑟托利珠單抗（以商品名Cimzia®上市的產品）、戈利木單抗（以商品名Simponi®上市的產品）、康納單抗（以商品名Ilaris®上市的產品）、卡托索單抗（以商品名Removab®上市的產品）、優特克單抗（以商品名Stelara®上市的產品）、托珠單抗（以商品名RoActemra®、Actemra®上市的產品）、奧法木單抗（以商品名Arzerra®上市的產品）、地諾單抗（以商品名Prolia®上市的產品）、貝利單抗（以商品名Benlysta®上市的產品）、雷昔庫單抗、伊匹單抗（以商品名Yervoy®上市的產品）、帕妥珠單抗（以商品名Perjeta®上市的產品）、阿達木單抗、英利昔單抗、依那西普、戈利木單抗、培戈-瑟托利珠單抗；康納單抗；優特克單抗、布瑞吉努單抗；達利珠單抗、貝利單抗；依帕珠單抗；達利珠單抗；伊雷單抗、吉妥珠單抗、阿侖單抗；伊匹單抗；西妥昔單抗；曲妥珠單抗、帕妥珠單抗；司妥昔單抗；貝伐單抗；以及托珠單抗。
本發明部分基於以下發現：不含任何其他岩藻糖基化途徑酶（如糖基轉移酶或唾液酸轉移酶）的人α-(1-2,3,4,6)-L-岩藻糖苷酶能夠增加純化的IgG1抗體中的去岩藻糖基化。增加或切割底物上聚糖殘基的糖酶類可用於在下游加工的分離和純化階段期間直接操縱mAb的糖基化。在下游加工階段期間應用該等酶規避了哺乳動物細胞生長期間所涉及的細胞內糖基化途徑的複雜性和可變性。使用糖酶能實現更緊密的創新者匹配，並且有助於早期選擇具有更高滴度或相同品質屬性的殖株。一種此類糖酶為岩藻糖苷酶，其屬於糖基水解酶家族29和95（GH29和GH95），能夠使岩藻糖殘基從底物上切割下來。
已表明使用來自 Omnitrophica細菌的廣泛特異性岩藻糖苷酶成功去除了N-連接糖蛋白上的核心岩藻糖。參見Vainauskas等人, 2018, Nature [自然], 8:9504。α1-2,4,6岩藻糖苷酶O能將α1-2、α1-4和α1-6連接的核心岩藻糖殘基從N-聚糖上切割下來，從而增加去岩藻糖基化物種的百分比。
令人驚訝的是，一項使用來自智人、牛腎或 Omnitophica細菌的三種岩藻糖苷酶在岩藻糖基化mAb上進行的研究表明，只有來自智人的α-(1-2,3,4,6)-L-岩藻糖苷酶顯示出有希望的結果。雖然這表明可將核心岩藻糖殘基從完整的糖基化mAb上切割下來，但其他核心和支鏈聚糖殘基的存在可能會造成立體阻礙，干擾來自其他物種的岩藻糖苷酶的活性。
因此，在下游抗體生產過程中，人岩藻糖苷酶可藉由切割最終藥物物質中的核心岩藻糖從而增加去岩藻糖基化物種的百分比而用作岩藻糖基化的強力調節劑。這可在沒有參與糖基化的其他酶（如糖基轉移酶和唾液酸轉移酶）的幫助下完成。調節去岩藻糖基化物種的一項選擇係在下游加工中使用可商購的岩藻糖苷酶。
岩藻糖苷酶為將岩藻糖殘基從聚糖上分解下來的酶。在本揭露之某些實施方式中，岩藻糖苷酶為來自哺乳動物、較佳的是來自靈長類動物、更較佳的是來自人的岩藻糖苷酶。在本揭露之某些實施方式中，岩藻糖苷酶為廣譜岩藻糖苷酶，例如，α-(1-2,3,4,6)-L-岩藻糖苷酶。在某些實施方式中，岩藻糖苷酶來自岩藻糖苷酶GH29家族。
代表性岩藻糖苷酶包括由FUCA1基因編碼的酶條目EC 3.2.1.51，該基因編碼包括基因庫（GenBank）登錄號NP_000138.2、XP_005245878.1、XP_011539469、和XP_016856394.1在內的蛋白質序列。
除非本文中另外指示或上下文明顯相矛盾，否則在描述本揭露的上下文中（特別是在以下請求項的上下文中）使用術語「一個/一種（a/an）」和「該（the）」以及類似指示物將視為涵蓋單數與複數兩者。除非另作描述，否則術語「包含」、「具有」、「包括」和「含有」將視為開放性術語（還即意指「包括（但不限於）」）。
除非本文另外指示，否則在本文引證值之範圍僅旨在用作單獨提及每個單獨的值落在該範圍內和每個端點的速記方法，並且每個單獨的值和端點被併入本說明書中就像它被單獨地在本文引證一樣。
除非另外要求保護，否則關於本文提供的任何和所有實例或示例性語言（例如「例如」）的使用僅旨在更好地描述本揭露，而非對本揭露之範圍施加限制。本說明書中的語言不應當被解釋為指示任何未要求保護的要素為實踐本揭露所必需。
在本文中描述了本揭露之較佳的實施方式，包括諸位發明人已知用於實施本揭露的最佳模式。在閱讀前述描述後，那些較佳的實施方式的變化對於熟悉該項技術者可以變得清楚。諸位發明人預期熟練技術者視情況採用此類變化，並且諸位發明人旨在以除本文具體描述外的方式實踐本揭露。因此，本揭露包括所附請求項中敘述的主題的為適用法律所允許的所有修改和等同物。此外，除非本文另外指示或上下文另外明顯矛盾，否則本揭露涵蓋上述要素呈所有可能變化的任何組合。
本文提供的發明涉及在藉由有糖基化能力的細胞進行重組生產期間增加蛋白質的去岩藻糖基化水平之方法。不受特定理論的束縛，據信本文揭露的方法提供了用於包含較高去岩藻糖基化水平的給定重組蛋白的組成物之手段。
如本文所用，術語「去岩藻糖基化糖型（afucosylated glycoform或afuco glycoform）」或「去岩藻糖基化聚糖」或「Afuco」或「AF」或「最終去岩藻糖基化」係指缺乏與N-糖基化位點的Asn形成醯胺鍵所涉及的GlcNAc殘基上的核心岩藻糖（例如，α1,6-連接的岩藻糖）的糖型。去岩藻糖基化糖型包括但不限於A1G0、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5。另外的去岩藻糖基化聚糖包括例如A1G1a、G0[H3N4]、G0[H4N4]、G0[H5N4]、FO-N[H3N3]。參見，例如，Reusch和Tejada, 2015, Glycobiology [糖生物學] 25(12):1325-1334。
如本文所用，術語「高甘露糖」或「HM」或「最終HM」涵蓋包含5、6、7、8或9個甘露糖殘基的糖型。
在示例性方面，去岩藻糖基化聚糖的水平和HM糖型的量經由HILIC確定。在酶切割N-聚糖後，進行HILIC以獲得具有幾個峰的層析圖，其中的每個峰代表不同糖型的平均分佈（量）。
出於該等目的，%峰面積 = 峰面積/總峰面積 x 100%，並且%總峰面積 = 樣本總面積/標準品總面積 x 100%。用於確定%糖型的計算可如下進行： %去岩藻糖基化糖型 = % A1G0 + % A2G0 + % A2G1a + % A2G1b + % A2G2 + % A1G1M5。 %高甘露糖糖型 = % Man5（如果可檢測到） + % Man6（如果可檢測到） + % Man7（如果可檢測到） + % Man8（如果可檢測到） + % Man9（如果可檢測到）
「岩藻糖基化」係指多糖和寡糖（例如N-聚糖、O-聚糖和糖脂）上岩藻糖殘基的程度和分佈。具有非岩藻糖基化或「去岩藻糖基化」N-聚糖的治療性糖蛋白（例如，抗體或Fc融合蛋白），因FcγRIIIa結合能力的增強而表現出顯著增強的抗體依賴性細胞性細胞毒性（ADCC），而補體依賴性細胞毒性（CDC）或抗原結合能力則沒有任何可檢測到的變化。在某些情況中，例如，在癌症治療中，未岩藻糖基化或「去岩藻糖基化」抗體係理想的，因為它們能在低劑量下實現治療功效，同時引發針對腫瘤細胞的高細胞性細胞毒性並經由增強的與FcγRIIIa的相互作用在NK細胞中觸發高效應子功能。在其他情況中，例如，在炎性疾病或自體免疫疾病的治療中，增強的ADCC和FcγRIIIa結合並不是理想的，因此在其N-聚糖中具有較高水平岩藻糖殘基的治療性糖蛋白可為較佳的。如本文所用，術語「%去岩藻糖」係指感興趣的重組糖蛋白上存在的未岩藻糖基化N-聚糖的百分比。較高%的去岩藻糖指示較大數量的未岩藻糖基化N-聚糖，且較低%的去岩藻糖指示較大數量的岩藻糖基化N-聚糖。
「唾液酸化」係指多糖和寡糖（例如，N-聚糖、O-聚糖和糖脂）上唾液酸殘基的類型和分佈。唾液酸最常見於聚糖的末端位置。唾液酸化可顯著影響該等蛋白質的安全性和功效特徵。特別地，一些生物藥的體內半衰期與寡糖唾液酸化程度有關。此外，唾液酸化模式可為製造期間產品一致性的非常有用的衡量標準。在哺乳動物表現系統中產生的生物藥中發現的兩種主要類型的唾液酸殘基為N-乙醯基-神經胺酸（NANA）和N-羥乙醯基神經胺酸（NGNA）。該等通常作為末端結構出現，該等末端結構附接到N-連接聚糖和O-連接聚糖二者的非還原性末端處的半乳糖（Gal）殘基上。
「半乳糖基化」係指半乳糖殘基在多糖和寡糖上的類型和分佈。半乳糖係指一組單糖，包含開鏈和環狀形式。重要的半乳糖二糖形式為半乳糖-α-1,3-半乳糖（α-gal）。
本發明提供了一種獲得去岩藻糖基化糖型水平增加的重組糖基化蛋白之方法。在示例性方面，重組糖基化蛋白藉由有糖基化能力的細胞在熟悉該項技術者已知的細胞培養中產生。重組糖基化蛋白較佳的是在與岩藻糖苷酶反應之前使用一或多個步驟從細胞培養收穫物中純化，該一或多個步驟包括離心和柱純化。
岩藻糖苷酶單位：一個α-L-岩藻糖苷酶活性單位定義為在pH 4.0的醋酸鈉緩衝液（100 mM）中，每分鐘從對硝基苯基-α-L-岩藻哌喃糖苷（1 mM）釋放一微莫耳對硝基苯酚（pNP）所需的酶量。
在示例性實施方式中，該方法包括將純化的糖蛋白與岩藻糖苷酶在約2.5至約5.0的pH下孵育。例如，pH為2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。在示例性方面，pH大於約3.0且小於約5.0。在示例性方面，pH大於約4.0且小於約5.0。在示例性方面，pH為4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。在示例性方面，pH為4.0或5.0。
在示例性實施方式中，該方法包括將糖蛋白與岩藻糖苷酶孵育指定反應時間。在示例性方面，反應時間為約3小時至6天（例如，約3、4、6、9、12、15、18、21或24小時或約2、3、4、5或約6天）。在示例性方面，反應期為約1天。
在示例性實施方式中，該方法進一步包括將反應於25°C至60°C的溫度孵育。在示例性實施方式中，溫度為約30°C至約50°C、約35°C至約50°C、約35°C至約40°C。在某些實施方式中，溫度為36°C、37°C或38°C，或者在36°C ± 1°C、37°C ± 1°C或38°C ± 1°C範圍內。
在示例性實施方式中，反應在100 mM醋酸鈉緩衝液（pH 4.0至pH 5.0）中進行。其他合適的緩衝液包括但不限於磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）和MES。
在某些實施方式中，反應體積為1 ml至500 ml。在某些實施方式中，反應體積為1 ml至250 ml。在某些實施方式中，反應體積為1 ml至200 ml。在某些實施方式中，反應體積為1 ml至100 ml。在某些實施方式中，反應體積為約1 ml、約5 ml、約10 ml、約25 ml、約50 ml、約100 ml、約200 ml、約250 ml或500 ml。
在某些實施方式中，岩藻糖苷酶或重組糖基化蛋白可被固定在柱上，以提供對pH、滯留時間、溫度和其他因素的精確控制。在一個實施方式中，本發明之方法涵蓋使用固體支持物進行親和層析以分離mAb，隨後，當該mAb與支持物結合時在單個步驟中對其進行酶法修飾。親和層析柱係熟悉該項技術者已知的，包括柱或其他類型的固體支持物。該方法可以採用各種常規的固相萃取裝置，如小型層析柱、旋轉柱或移液管尖端。柱典型地填充有固體相或固定相或者固體介質或固定介質（統稱為「固相」），這與傳統親和層析法一樣。
固相包含選擇用於其與靶標mAb的特異性生物相互作用的分子，並且在本文中稱為「親和配體」對抗體有親和力的任何配體可用於該等方法。用於本發明之方法的親和配體包括蛋白質A（一種來自葡萄球菌屬細菌細胞壁的表面蛋白質）和蛋白質G（一種來自鏈球菌屬細菌的細胞表面蛋白質）。對於免疫球蛋白有親和力的此類配體包括但不限於：蛋白質A（天然的、重組的）、蛋白質G（天然的、重組的和合成的）、蛋白質A-G融合蛋白、蛋白質L。該等可獲得自各種商業來源，包括但不限於西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich）和瑞普利金公司（Repligen）。
親和配體必須被固定在固體介質上，該固體介質在純化和修飾期間保留在裝置上。固體介質包括但不限於瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、聚丙烯、聚苯乙烯及對非靶標蛋白質和修飾酶的非特異性吸附可忽略不計的其他合成聚合物。親和配體藉由例如各種化學物質（例如，N-羥基琥珀醯亞胺（NHS）酯、環氧化物、醛或溴化氰）中的任一種與固相共價連接到固體支持物上。此類軛合化學係本領域熟知的，如以下中所示：Hermanson, G. Τ., Bioconjugate Techniques [生物軛合技術], Academic Press [學術出版社] (荷蘭阿姆斯特丹, 2008年編) 和Wong, S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking [蛋白質軛合和交聯化學], CRC Press [CRC出版社] (佛羅里達州博卡拉頓, 1991)。
蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A-G、蛋白質L和抗體片段到瓊脂糖或瓊脂糖凝膠或其他基質的固定形式可商購自各種來源，包括但不限於西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich）、賽默飛世爾科技公司（ThermoFisher Scientific）和通用電氣醫療集團（GE Healthcare），用於捕獲和純化抗體。取決於所需產品的規模，用於修飾的裝置可使用可商購的親和層析空柱來容易地設計。該等柱中的緩衝液交換可藉由重力流動或離心或藉由泵來進行。此類空柱可商購自各種來源，包括但不限於賽默飛世爾科技公司（ThermoFisher Scientific）和伯樂實驗室（Bio-Rad Laboratories）。
在本發明方法的實施方式中，所使用的柱係帶有固定化蛋白質A的微型旋轉柱，該蛋白質A對免疫球蛋白具有強親和力。緩衝液和孵育條件的優化對於獲得進行修飾的理想結果來說係非常重要的。在裝載所選擇的mAb溶液之前，將帶有固定化親和配體的柱用洗滌緩衝液洗滌，該mAb溶液含有具有不同Fc區聚糖結構的異源mAb群。在孵育一段時間之後，將柱再次洗滌，隨後施加優化的反應緩衝液，該反應緩衝液含有反應物混合物（酶、輔因子和核苷酸糖中的一或多種）。在約30°C至約40°C（在多個方面中約為36°C至37°C）的溫度再孵育一段時間之後，將柱再次用洗滌緩衝液洗滌，隨後施加洗脫緩衝液以釋放具有所需糖基化的修飾mAb。隨後可使用熟悉該項技術者所理解的視需要的中和緩衝液以獲得約7.2的最終pH。
洗滌緩衝液被設計為在洗滌期間保持抗體與親和配體之間的高親和力。可使用pH為約7.2的PBS作為洗滌緩衝液，然而熟悉該項技術者理解的是，pH在一定程度上可變。洗滌緩衝液和反應緩衝液可設計為保持抗體與親和配體之間的高親和力，同時保留反應酶的活性。洗滌緩衝液和反應緩衝液在約30°C至約40°C的溫度及其間的任何溫度使用。經常使用約37°C的溫度。抗體與蛋白質A、蛋白質G和蛋白質A/G的高親和力的最佳pH範圍係約6.0至約8.0。在該pH範圍內，緩衝液與可用於本發明方法的親和配體的最佳pH範圍重疊。該等包括但不限於TRIS緩衝液、BIS-TRIS緩衝液、MES緩衝液、BES緩衝液、MOPS緩衝液和HEPES緩衝液。
親和柱的洗滌條件將非特異性結合降至最低，從而對酶反應產生負面影響，從而對mAb修飾產生負面影響。洗滌條件如下：它們將不會破壞親和配體與靶標mAb之間的結合。
在示例性實施方式中，本發明之方法涉及增加由細胞培養物中的細胞產生的蛋白質的去岩藻糖基化水平。在示例性方面，相對於對照細胞培養物，重組糖基化蛋白的A1G0、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5中一或多個的水平增加。在示例性方面，相對於對照細胞培養物，重組糖基化蛋白的A1G1a、G0[H3N4]、G0[H4N4]、G0[H5N4]和FO-N[H3N3]中一或多個的水平增加。
在某些實施方式中，本文揭露的方法產生了去岩藻糖基化增加的糖蛋白，同時降低了高甘露糖百分比、半乳糖基化百分比和唾液酸化百分比中的一或多個。
如本文所用，術語「增加」和自其起源的詞語可以不是100%或完全增加。相反，存在熟悉該項技術者認為具有潛在益處的不同程度的增加。特別地，在糖基化蛋白的情況下，即使很小的變化也能對活性有顯著影響。在此方面，相對於對照細胞培養物，本文描述的方法可使去岩藻糖基化糖型水平增加到任何程度或水平。在示例性實施方式中，相對於對照細胞培養物，本發明之方法提供的增加為至少或約1%的增加（例如，至少或約2%的增加、至少或約3%的增加、至少或約4%的增加或至少或約5%的增加）。在示例性實施方式中，相對於對照細胞培養物，蛋白質的去岩藻糖基化糖型增加至少約1.5倍。在示例性實施方式中，相對於對照細胞培養物，蛋白質的去岩藻糖基化糖型增加至少約2倍。在示例性實施方式中，相對於對照細胞培養物，蛋白質的去岩藻糖基化糖型增加至少約3倍。在示例性實施方式中，相對於對照細胞培養物，蛋白質的去岩藻糖基化糖型增加至少約4倍或約5倍。
關於本文描述的方法，藉由此類方法實現的增加係相對於「對照」或「對照細胞培養物」。該等術語在本文中可互換使用。在示例性方面，對照係當不進行本發明方法的步驟時蛋白質之去岩藻糖基化糖型的水平。在示例性方面，對照係當進行已知的重組生產方法時蛋白質之去岩藻糖基化糖型的水平。如本文所用，術語「對照細胞培養物」係指在用岩藻糖苷酶處理之前，以與在其上執行本發明方法之步驟的細胞培養物相同的方式維持的細胞培養物（例如，本發明方法的細胞培養物）。
本領域已知多種用於評估存在於含有糖蛋白的組成物中的糖型或用於確定包含糖蛋白的特定樣本的糖型譜之方法。合適的方法包括陽離子MALDI-TOF分析、陰離子MALDI-TOF分析、弱陰離子交換（WAX）層析、正相層析（NP-HPLC）、外切糖苷酶消化、Bio-Gel P-4層析、陰離子交換層析和一維NMR光譜及其組合。參見，例如，Mattu等人, 1998, J Biol Chem [生物化學雜誌] 273: 2260-2272；Field等人, 1994, Biochem J [生物化學雜誌] 299(Pt 1): 261-275；Yoo等人, 2010, MAbs [單株抗體] 2(3): 320-334；Wuhrer等人, 2005, Journal of Chromatography B [層析學雜誌B], 825:124-133；Ruhaak, 2010, Anal Bioanal Chem [分析化學和分析生物化學], 397:3457-3481；及Geoffrey等人, 1996, Analytical Biochemistry [分析生物化學] 240:210-226。此外，本文所述之實例描述了用於評估存在於含有糖蛋白的組成物中的糖型之合適方法。 純化
在某些實施方式中，重組糖基化蛋白在與岩藻糖苷酶一起孵育之前進行純化。為純化例如藉由細胞培養方法產生的抗體或抗體片段，通常可採用不同層析步驟的組合。通常，在（蛋白質A）親和層析之後係一個或兩個另外的分離步驟。在一個實施方式中，另外的層析步驟係陽離子交換層析步驟和陰離子層析交換步驟，反之亦然。最終純化步驟係所謂的「精製步驟（polishing step）」，用於去除痕量雜質和污染物，如聚集的免疫球蛋白、殘餘HCP（宿主細胞蛋白質）、DNA（宿主細胞核酸）、病毒或內毒素。在本發明之方法中，與岩藻糖苷酶一起孵育可在該等層析/分離步驟中任一種個之後進行。經反應的去岩藻糖基化糖型水平增加的重組糖基化蛋白與岩藻糖苷酶的分離可在使用岩藻糖苷酶之後藉由多個步驟進行。例如，如果重組糖基化蛋白在蛋白質A層析和/或離子交換層析之後與岩藻糖苷酶反應，則隨後可將經反應的重組糖基化蛋白投入精製步驟。如果重組糖基化蛋白在與岩藻糖苷酶反應之前進行精製步驟，則岩藻糖苷酶可藉由滲濾/超濾分離或藉由任何其他已知的分離手段分離。
在某些實施方式中，重組糖基化蛋白由有糖基化能力的細胞生產獲得。在示例性方面，有糖基化能力的細胞係真核細胞，包括但不限於酵母細胞、絲狀真菌細胞、原生動物細胞、藻類細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。此類宿主細胞在本領域中有描述。參見，例如，Frenzel等人, 2013, Front Immunol[前沿免疫學] 4: 217。在示例性方面，真核細胞係哺乳動物細胞。在示例性方面，哺乳動物細胞係非人哺乳動物細胞。在一些方面中，細胞為中國卵巢（CHO）細胞及其衍生物（例如，CHO-K1、CHO pro-3）、小鼠骨髓瘤細胞（例如，NS0、GS-NS0、Sp2/0）、經工程化而缺乏二氫葉酸還原酶（DHFR）活性的細胞（例如，DUKX-X11、DG44）、人胚腎293（HEK293）細胞或其衍生物（例如，HEK293T、HEK293-EBNA）、非洲綠猴腎細胞（例如，COS細胞、VERO細胞）、人子宮頸癌細胞（例如，HeLa）、人骨骼骨肉瘤上皮細胞U2-OS、腺癌人肺泡基底上皮細胞A549、人纖維肉瘤細胞HT1080、小鼠腦腫瘤細胞CAD、胚胎癌瘤細胞P19、小鼠胚胎成纖維細胞NIH 3T3、小鼠 成纖維細胞L929、小鼠神經母細胞瘤細胞N2a、人乳癌細胞 MCF-7、視網膜母細胞瘤細胞Y79、人視網膜母細胞瘤細胞SO-Rb50、人肝癌細胞Hep G2、小鼠B骨髓瘤細胞J558L或幼倉鼠腎（BHK）細胞。參見，例如，Gaillet等人, 2007, Biotechnol Prog [生物技術進展] 23:200-209；和Khan, 2013, Adv Pharm Bull [高級藥物通報] 3(2): 257-263。
在示例性方面，有糖基化能力的細胞係真核細胞。在示例性方面，真核細胞係哺乳動物細胞。在一些方面中，哺乳動物細胞係非人哺乳動物細胞。在示例性方面，非人哺乳動物細胞選自以下群組，該群組由以下組成：CHO細胞、CHO衍生物（例如，CHO-K1、CHO pro-3）、小鼠骨髓瘤細胞（例如，NS0、GS-NS0、Sp2/0）、被工程化為缺乏二氫葉酸還原酶（DHFR）活性的細胞（例如，DUKX-X11、DG44）、綠色非洲猴腎細胞（例如，COS細胞、VERO細胞）、小鼠腦腫瘤細胞CAD、小鼠胚胎成纖維細胞NIH 3T3、小鼠成纖維細胞L929、小鼠神經母細胞瘤細胞N2a、人乳癌細胞MCF-7、視網膜母細胞瘤細胞Y79、人視網膜母細胞瘤細胞SO-Rb50、人肝癌細胞Hep G2、小鼠B骨髓瘤細胞J558L或幼倉鼠腎（BHK）細胞。沒有糖基化能力的細胞也可以例如藉由用編碼糖基化所必需的相關酶的基因轉染它們而轉化為有糖基化能力的細胞。示例性酶包括但不限於寡糖基轉移酶、糖苷酶、葡糖苷酶I、葡糖苷酶II、鈣連伴護蛋白/鈣網伴護蛋白、糖基轉移酶、甘露糖苷酶、GlcNAc轉移酶、半乳糖基轉移酶和唾液酸轉移酶。
本揭露還提供了製備組成物之方法，該組成物包含由細胞培養物中的細胞產生的糖基化蛋白的去岩藻糖基化增加的糖型。在示例性實施方式中，該方法包括：(i) 將細胞培養物在初始pH下維持初始細胞培養期，(ii) 擴增細胞培養物，(iii) 收集細胞培養物的上清液，其包含細胞產生的蛋白質，(iv) 將純化的糖基化蛋白與人廣泛特異性岩藻糖苷酶一起在適合岩藻糖苷酶活性的緩衝液中並且在適合增加糖基化蛋白的去岩藻糖基化的條件下孵育一段時間；和 (v) 將該去岩藻糖基化糖型水平增加的重組糖基化蛋白與該岩藻糖苷酶分離。在某些實施方式中，重組糖基化從不與糖基轉移酶或唾液酸轉移酶反應。
該方法可以包括從細胞培養物或其上清液中純化蛋白質以及較佳的是回收純化的蛋白質的一或多個步驟。在示例性方面，該方法包括一或多個層析步驟，例如親和層析（例如蛋白A親和層析）、離子交換層析、疏水性相互作用層析。在示例性方面，該方法包括使用蛋白A親和層析樹脂純化蛋白質。
在示例性實施方式中，該方法進一步包括用於配製純化的蛋白質等，從而獲得包含純化的蛋白質的配製物的步驟。此類步驟在以下中描述：Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing [配製物和製造製程開發策略], Jameel和Hershenson編, John Wiley & Sons, Inc.[約翰威利父子公司]（新澤西州霍博肯）, 2010。
該方法還可以在細胞培養步驟前包括一或多個上游步驟。在示例性實施方式中，該方法包括產生表現蛋白質的宿主細胞的步驟。例如，在一些示例中，該方法包括向宿主細胞中引入包含核酸的載體，該核酸包含編碼蛋白質的核苷酸序列。
細胞培養物可根據適合重組蛋白質生產的任一組條件維持。例如，可以將細胞培養物維持在特定細胞密度、培養體積、溶解氧水平、壓力、滲透壓等下。在示例性方面，將接種前的細胞培養物在CO 2培養箱中在標準加濕條件下在5% CO 2下振盪（例如，以70 rpm）。在示例性方面，在1.5 L培養基中以10 6個細胞/mL的接種密度接種細胞培養物。在示例性方面，該方法包括將滲透壓維持在約200 mOsm/kg至約500 mOsm/kg之間。在示例性方面，該方法包括將滲透壓維持在約225 mOsm/kg至約400 mOsm/kg或約225 mOsm/kg至約375 mOsm/kg之間。在示例性方面，該方法包括將滲透壓維持在約225 mOsm/kg至約350 mOsm/kg之間。在示例性方面，該方法包括在初始細胞培養期期間將細胞培養物的溶解氧（DO）水平維持在約20%至約60%氧飽和度下。在示例性情況下，該方法包括在初始細胞培養期期間將細胞培養物的DO水平維持在約30%至約50%（例如，約35%至約45%）氧飽和度下。在示例性示例中，該方法包括在初始細胞培養期期間將細胞培養物的DO水平維持在約20%、約30%、約40%、約50%或約60%氧飽和度下。
可以將細胞培養物維持在任何培養基中。在示例性方面，可以將細胞培養物維持在適於細胞生長的培養基中和/或可以為細胞培養物提供根據任何合適的進料方案的一或多種進料培養基。在示例性方面，該方法包括將細胞培養物維持在包含葡萄糖、乳酸鹽、胺、麩醯胺酸和/或麩胺酸鹽的培養基中。在示例性方面，該方法包括在初始細胞培養期期間將細胞培養物維持在包含濃度小於約1 µM的錳的培養基中。在示例性方面，該方法包括將細胞培養物維持在包含約0.25 µM至約1 µM錳的培養基中。在示例性方面，該方法包括將細胞培養物維持在包含可忽略量的錳的培養基中。在示例性方面，該方法包括在初始細胞培養期期間將細胞培養物維持在包含濃度低於或約50 ppb的銅的培養基中。在示例性方面，該方法包括在初始細胞培養期期間將細胞培養物維持在包含濃度低於或約40 ppb的銅的培養基中。在示例性方面，該方法包括在初始細胞培養期期間將細胞培養物維持在包含濃度低於或約30 ppb的銅的培養基中。在示例性方面，該方法包括在初始細胞培養期期間將細胞培養物維持在包含濃度低於或約20 ppb的銅的培養基中。在示例性方面，培養基包含濃度大於或約5 ppb或大於或約10 ppb的銅。
在示例性實施方式中，細胞培養的類型係補料分批培養或連續灌注培養。然而，本發明之方法有利地不限於任何特定類型的細胞培養。 重組蛋白
在示例性實施方式中，重組蛋白包含含有一或多個下式的N-糖基化共有序列的胺基酸序列： Asn-Xaa 1-Xaa 2其中Xaa 1係除Pro外的任何胺基酸，並且Xaa 2係Ser或Thr。
在示例性實施方式中，重組蛋白包含可結晶片段（Fc）多肽。如本文所用的術語「Fc多肽」包括衍生自抗體Fc區的天然和突變蛋白形式的多肽。還包括含有促進二聚化的鉸鏈區的截短形式的此類多肽。包含Fc部分（和由其形成的寡聚體）的融合蛋白提供了藉由蛋白A或蛋白G柱上的親和層析進行簡便純化優點。在示例性實施方式中，重組蛋白包含IgG（例如，人IgG）的Fc。在示例性方面，重組蛋白包含IgG1或IgG2的Fc。在示例性方面，重組蛋白係抗體、肽體（peptibody）或Fc融合蛋白。
在示例性方面，重組糖基化蛋白係抗體。如本文所用，術語「抗體」係指具有常規免疫球蛋白形式、包含重鏈及輕鏈且包含可變區及恒定區的蛋白質。例如，抗體可為IgG，其係兩對相同多肽鏈的「Y形」結構，每對具有一條「輕」鏈（典型地具有約25 kDa的分子量）和一條「重」鏈（通常具有約50-70 kDa的分子量）。抗體具有可變區和恒定區。在IgG形式中，可變區通常為約100個至110個或更多個胺基酸，包含三個互補決定區（CDR），主要負責抗原識別，並且與結合不同抗原的其他抗體差異很大。恒定區允許抗體募集免疫系統的細胞和分子。可變區由每條輕鏈和重鏈的N末端區域構成，而恒定區由每條重鏈和輕鏈的C末端部分構成。（Janeway等人, 「Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes」[抗體分子和免疫球蛋白基因的結構], Immunobiology: The Immune System in Health and Disease [免疫生物學：健康與疾病的免疫系統], 第4版. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing [愛思唯爾科學有限公司/加蘭出版社], (1999)）。
本領域已經描述了抗體CDR的一般結構和特性。簡言之，在抗體支架中，CDR嵌埋於重鏈及輕鏈可變區中的框架內，在這裡其構成主要負責抗原結合及識別的區域。可變區包含至少三個重鏈或輕鏈CDR（Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學關注的蛋白質序列], Public Health Service [美國公共衛生署] N.I.H., 貝塞斯達, 馬里蘭州；還參見Chothia和Lesk, 1987, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] 196:901-917；Chothia等人, 1989, Nature [自然] 342: 877-883），位於框架區內（由Kabat等人, 1991指定框架區1-4、FR1、FR2、FR3和FR4；還參見Chothia和Lesk, 1987, 同上）。
人類輕鏈分類為κ輕鏈及λ輕鏈。重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，並且將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干個亞類，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亞類，包括但不限於IgM1和IgM2。本發明之實施方式包括抗體的所有此類類別或同種型。輕鏈恒定區可為例如κ型或λ型輕鏈恒定區，例如人κ型或λ型輕鏈恒定區。重鏈恒定區可為例如α型、δ型、ε型、γ型或μ型重鏈恒定區，例如人α型、δ型、ε型、γ型或μ型重鏈恒定區。因此，在示例性實施方式中，該抗體為同種型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗體，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一種。
抗體可為單株抗體或多株抗體。在一些實施方式中，抗體包含與由哺乳動物（例如，小鼠、兔、山羊、馬、雞、倉鼠、人等）產生的天然存在的抗體基本上相似的序列。在這方面，抗體可以被認為是哺乳動物抗體，例如小鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、馬抗體、雞抗體、倉鼠抗體、人抗體等。在某些方面中，重組蛋白係人抗體。在某些方面中，重組蛋白質為嵌合抗體或人源化抗體。術語「嵌合抗體」在本文中用於指含有來自一個物種的恒定結構域和來自第二物種的可變結構域，或更一般而言，含有來自至少兩個物種的胺基酸序列區段的抗體。術語「人源化」在關於抗體使用時係指至少具有來自經工程化以具有比原始來源抗體更類似於真人抗體的結構和免疫學功能的非人來源CDR區的抗體。例如，人源化可涉及將來自非人抗體（例如小鼠抗體）的CDR接枝到人抗體中。人源化也可涉及選擇胺基酸取代以使非人類序列看起來更類似人類序列。
抗體可以藉由酶（例如像木瓜蛋白酶和胃蛋白酶）切割成片段。木瓜蛋白酶切割抗體以產生兩個Fab片段和單個Fc片段。胃蛋白酶使抗體切割，以產生F(ab’) 2片段和pFc’片段。在示例性方面，重組糖基化蛋白係保留至少一個糖基化位點的抗體片段，例如Fab、Fc、F(ab’) 2或pFc’。
抗體架構已經被用於產生越來越多的替代抗體形式，其跨越至少12–150 kDa的分子量範圍和從單體（n = 1）、二聚體（n = 2）和三聚體（n = 3）到四聚體（n = 4）並且可能更高的化合價（n）範圍；此類替代抗體形式在本文中稱為「抗體蛋白產物」。
抗體蛋白質產物包括基於保留完整的抗原結合能力的抗體片段（例如，scFv、Fab和VHH/VH）的那些。保留其完整抗原結合位點的最小抗原結合片段係Fv片段，後者完全由可變（V）區組成。使用可溶的柔性胺基酸肽連接子將V區連接至scFv（單鏈片段可變）片段以穩定分子，或者將恒定（C）結構域添加到V區以產生Fab片段。scFv和Fab都是可以在原核宿主中容易地產生的廣泛使用的片段。其他抗體蛋白產物包括經二硫鍵穩定的scFv（ds-scFv）、單鏈Fab（scFab）以及二聚體及多聚體抗體形式，如雙抗體、三抗體和四抗體，或包含由與寡聚結構域連接的scFv組成的不同形式的迷你抗體（miniAb）。最小的片段係駱駝重鏈Ab的VHH/VH以及單結構域Ab（sdAb）。最常用於建造新型抗體形式的構件為單鏈可變（V）結構域抗體片段（scFv），其包含由具有約15個胺基酸殘基的肽連接子連接的來自重鏈和輕鏈的V結構域（VH結構域和VL結構域）。肽體或肽-Fc融合物係另一種抗體蛋白產物。肽體的結構由嫁接到Fc結構域上的生物活性肽組成。本領域已充分描述了肽體。參見，例如，Shimamoto等人, mAbs [單株抗體] 4(5): 586-591 (2012)。
其他抗體蛋白產物包括單鏈抗體（SCA）、雙抗體、三抗體、四抗體、雙特異性或三特異性抗體等。雙特異性抗體可分成五個主要類別：BsIgG、附加IgG、BsAb片段、雙特異性融合蛋白以及BsAb軛合物。參見，例如，Spiess等人, Molecular Immunology [分子免疫學] 67(2) 部分A: 97/-106（2015）。
在示例性方面，重組蛋白包含該等抗體蛋白質產物中的任一種。在示例性方面，重組糖基化蛋白 graft以下中的任一種：scFv、Fab VHH/VH、Fv片段、ds-scFv、scFab、二聚體抗體、多聚體抗體（例如，雙抗體、三抗體、四抗體）、迷你抗體、肽體、駱駝重鏈抗體的VHH/VH、sdAb、雙抗體、三抗體、四抗體、雙特異性或三特異性抗體、BsIgG、附加IgG、BsAb片段、雙特異性融合蛋白和BsAb軛合物。
重組蛋白可為呈單體形式或者聚合體、寡聚體或多聚體形式的抗體蛋白質產物。在抗體包含兩種或更多種不同抗原結合區片段的某些實施方式中，抗體被視為雙特異性的、三特異性的或多特異性的，或者二價的、三價的或多價的，這取決於由抗體識別和結合的不同表位的數目。
抗體蛋白質產物可缺乏抗體的某些部分。然而，通常，片段將包含在真核細胞中翻譯後糖基化的抗體Fc區的至少一部分。
有利地，該等方法不限於抗體的抗原特異性。因此，抗體對幾乎任何抗原都具有任何結合特異性。在示例性方面，抗體與激素、生長因子、細胞介素、細胞表面受體或其任何配體結合。在示例性方面，抗體與在免疫細胞的細胞表面上表現的蛋白質結合。在示例性方面，抗體與選自以下群組的分化簇分子結合，該群組由以下組成：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11A、CD11B、CD11C、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31,CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD45RA、CD45RB、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD79α、CD79β、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CDw128、CD129、CD130、CDw131、CD132、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CD146、CD147、CD148、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166和CD182。
在示例性方面，抗體係以下所述之一：美國專利案號7947809和美國專利申請公開案號20090041784（升糖素受體）、美國專利案號7939070、美國專利案號7833527、美國專利案號7767206和美國專利案號7786284（IL-17受體A）、美國專利案號7872106和美國專利案號7592429（骨硬化蛋白）、美國專利案號7871611、美國專利案號7815907、美國專利案號7037498、美國專利案號7700742和美國專利申請公開案號20100255538（IGF-1受體）、美國專利案號7868140（B7RP1）、美國專利案號7807159和美國專利申請公開案號20110091455（肌生成抑制蛋白）、美國專利案號7736644、美國專利案號7628986、美國專利案號7524496和美國專利申請公開案號20100111979（表皮生長因子受體缺失突變體）、美國專利案號7728110（SARS冠狀病毒）、美國專利案號7718776和美國專利申請公開案號20100209435（OPGL）、美國專利案號7658924和美國專利案號7521053（血管生成素-2）、美國專利案號7601818、美國專利案號7795413、美國專利申請公開案號20090155274、美國專利申請公開案號20110040076（NGF）、美國專利案號7579186（TGF-β II型受體）、美國專利案號7541438（結締組織生長因子）、美國專利案號7438910（IL1-R1）、美國專利案號7423128（備解素）、美國專利案號7411057、美國專利案號7824679、美國專利案號7109003、美國專利案號6682736、美國專利案號7132281和美國專利案號7807797（CTLA-4）、美國專利案號7084257、美國專利案號7790859、美國專利案號7335743、美國專利案號7084257和美國專利申請公開案號20110045537（干擾素-γ）、美國專利案號7932372（MAdCAM）、美國專利案號7906625、美國專利申請公開案號20080292639和美國專利申請公開案號20110044986（澱粉樣蛋白）、美國專利案號7815907和美國專利案號7700742（胰島素樣生長因子I）、美國專利案號7566772和美國專利案號7964193（介白素-1β）、美國專利案號7563442、美國專利案號7288251、美國專利案號7338660、美國專利案號7626012、美國專利案號7618633和美國專利申請公開案號20100098694（CD40）、美國專利案號7498420（c-Met）、美國專利案號7326414、美國專利案號7592430和美國專利案號7728113（M-CSF）、美國專利案號6924360、美國專利案號7067131和美國專利案號7090844（MUC18）、美國專利案號6235883、美國專利案號7807798和美國專利申請公開案號20100305307（表皮生長因子受體）、美國專利案號6716587、美國專利案號7872113、美國專利案號7465450、美國專利案號7186809、美國專利案號7317090和美國專利案號7638606（介白素-4受體）、美國專利申請公開案號20110135657（BETA-KLOTHO）、美國專利案號7887799和美國專利案號7879323（成纖維細胞生長因子樣多肽）、美國專利案號7867494（IgE）、美國專利申請公開案號20100254975（α-4 β-7）、美國專利申請公開案號20100197005和美國專利案號7537762（激活素受體樣激酶-1）、美國專利案號7585500和美國專利申請公開案號20100047253（IL-13）、美國專利申請公開案號20090263383和美國專利案號7449555（CD148）、美國專利申請公開案號20090234106（激活素A）、美國專利申請公開案號20090226447（血管生成素-1和血管生成素-2）、美國專利申請公開案號20090191212（血管生成素-2）、美國專利申請公開案號20090155164（C-FMS）、美國專利案號7537762（激活素受體樣激酶-1）、美國專利案號7371381（甘丙肽）、美國專利申請公開案號20070196376（胰島素樣生長因子）、美國專利案號7267960和美國專利案號7741115（LDCAM）、US 7265212（CD45RB）、美國專利案號7709611、美國專利申請公開案號20060127393和美國專利申請公開案號20100040619（DKK1）、美國專利案號7807795、美國專利申請公開案號20030103978和美國專利案號7923008（骨保護素）、美國專利申請公開案號20090208489（OV064）、美國專利申請公開案號20080286284（PSMA）、美國專利案號7888482、美國專利申請公開案號20110165171和美國專利申請公開案號20110059063（PAR2）、美國專利申請公開案號20110150888（鐵調素）、美國專利案號7939640（B7L-1）、美國專利案號7915391（c-Kit）、美國專利案號7807796、美國專利案號7193058和美國專利案號7427669（ULBP）、美國專利案號7786271、美國專利案號7304144和美國專利申請公開案號20090238823（TSLP）、美國專利案號7767793（SIGIRR）、美國專利案號7705130（HER-3）、美國專利案號7704501（共濟失調蛋白-1樣多肽）、美國專利案號7695948和美國專利案號7199224（TNF-α轉化酶）、美國專利申請公開案號20090234106（激活素A）、美國專利申請公開案號20090214559和美國專利案號7438910（IL1-R1）、美國專利案號7579186（TGF-β II型受體）、美國專利案號7569387（TNF受體樣分子）、美國專利案號7541438,（結締組織生長因子）、美國專利案號7521048（TRAIL受體-2）、美國專利案號6319499、美國專利案號7081523和美國專利申請公開案號20080182976（促紅血球生成素受體）、美國專利申請公開案號20080166352和美國專利案號7435796（B7RP1）、美國專利案號7423128（備解素）、美國專利案號7422742和美國專利案號7141653（介白素-5）、美國專利案號6740522和美國專利案號7411050（RANKL）、美國專利案號7378091（碳酸酐酶IX（CA IX）腫瘤抗原）、美國專利案號7318925和美國專利案號7288253（甲狀旁腺激素）、美國專利案號7285269（TNF）、美國專利案號6692740和美國專利案號7270817（ACPL）、美國專利案號7202343（單核細胞趨化蛋白-1）、美國專利案號7144731（SCF）、美國專利案號6355779和美國專利案號7138500（4-1BB）、美國專利案號7135174（PDGFD）、美國專利案號6630143和美國專利案號7045128（Flt-3配體）、美國專利案號6849450（金屬蛋白酶抑制劑）、美國專利案號6596852（LERK-5）、美國專利案號6232447（LERK-6）、美國專利案號6500429（腦源性神經營養因子）、美國專利案號6184359（上皮源性T細胞介素）、美國專利案號6143874（神經營養因子NNT-1）、美國專利申請公開案號20110027287（前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶kexin 9型（PCSK9））、美國專利申請公開案號20110014201（IL-18受體）和美國專利申請公開案號20090155164（C-FMS）。出於其揭露可變結構域多肽、可變結構域編碼核酸、宿主細胞、載體、製備編碼所述可變結構域的多肽之方法、藥物組成物以及治療與含有可變結構域的抗原結合蛋白或抗體的相應靶標相關的疾病的方法之目的，將上述專利和公開的專利申請藉由引用以其全文併入本文。
在示例性實施方式中，抗體係以下之一：莫羅單抗-CD3（以商品名Orthoclone Okt3®上市的產品）、阿昔單抗（以商品名Reopro®上市的產品）、利妥昔單抗（以商品名MabThera®、Rituxan®上市的產品）、巴厘昔單抗（以商品名Simulect®上市的產品）、達利珠單抗（以商品名Zenapax®上市的產品）、帕立珠單抗（以商品名Synagis®上市的產品）、英利昔單抗（以商品名Remicade®上市的產品）、曲妥珠單抗（以商品名Herceptin®上市的產品）、阿侖單抗（以商品名MabCampath®、Campath-1H®上市的產品）、阿達木單抗（以商品名Humira®上市的產品）、托西莫單抗-I131（以商品名Bexxar®上市的產品）、依法珠單抗（以商品名Raptiva®上市的產品）、西妥昔單抗（以商品名Erbitux®上市的產品）、替伊莫單抗（以商品名Zevalin®上市的產品）、奧馬珠單抗（以商品名Xolair®上市的產品）、貝伐單抗（以商品名Avastin®上市的產品）、那他珠單抗（以商品名Tysabri®上市的產品）、蘭尼單抗（以商品名Lucentis®上市的產品）、帕尼單抗（以商品名Vectibix®上市的產品）、依庫麗單抗（以商品名Soliris®上市的產品）、培戈-瑟托利珠單抗（以商品名Cimzia®上市的產品）、戈利木單抗（以商品名Simponi®上市的產品）、康納單抗（以商品名Ilaris®上市的產品）、卡托索單抗（以商品名Removab®上市的產品）、優特克單抗（以商品名Stelara®上市的產品）、托珠單抗（以商品名RoActemra®、Actemra®上市的產品）、奧法木單抗（以商品名Arzerra®上市的產品）、地諾單抗（以商品名Prolia®上市的產品）、貝利單抗（以商品名Benlysta®上市的產品）、雷昔庫單抗、伊匹單抗（以商品名Yervoy®上市的產品）、帕妥珠單抗（以商品名Perjeta®上市的產品）。在示例性實施方式中，抗體係以下中之一：抗TNFα抗體，例如阿達木單抗、英利昔單抗、依那西普、戈利木單抗和培戈-瑟托利珠單抗；抗IL1.β.抗體，如康納單抗；抗IL12/23（p40）抗體，例如優特克單抗和布瑞吉努單抗；以及抗IL2R抗體，例如達利珠單抗。合適的抗癌抗體之實例包括但不限於抗BAFF抗體，例如貝利單抗；抗CD20抗體，例如利妥昔單抗；抗CD22抗體，例如依帕珠單抗；抗CD25抗體，例如達利珠單抗；抗CD30抗體，例如伊雷單抗；抗CD33抗體，例如吉妥珠單抗；抗CD52抗體例如阿侖單抗；抗CD152抗體，例如伊匹單抗；抗EGFR抗體，例如西妥昔單抗；抗HER2抗體，例如曲妥珠單抗和帕妥珠單抗；抗IL6抗體，例如司妥昔單抗；以及抗VEGF抗體，如貝伐單抗；抗IL6受體抗體，如托珠單抗。 組成物
本文提供了包含蛋白質的去岩藻糖基化糖型量增加的組成物。在示例性實施方式中，組成物藉由本文描述的本發明製備組成物的方法製備，該組成物包含與岩藻糖苷酶反應產生的蛋白質的去岩藻糖基化糖型。在示例性方面，組成物中至少約10%的蛋白質係去岩藻糖基化糖型。在示例性方面，組成物中至少約20%的蛋白質係去岩藻糖基化糖型。在示例性方面，組成物中至少約30%的蛋白質係去岩藻糖基化糖型。在示例性方面，組成物中至少約40%的蛋白質係去岩藻糖基化糖型。在示例性方面，組成物中至少約50%的蛋白質係去岩藻糖基化糖型。在示例性方面，組成物中至少約60%的蛋白質係去岩藻糖基化糖型。在示例性方面，組成物中至少約70%的蛋白質係去岩藻糖基化糖型。在示例性方面，組成物中至少約80%的蛋白質係去岩藻糖基化糖型。在示例性方面，組成物中至少約90%的蛋白質係去岩藻糖基化糖型。在示例性方面，組成物中大於約90%或大於約95%的蛋白質係去岩藻糖基化糖型。
在示例性方面，本揭露之方法使去糖基化糖型的百分比增加2%以上。在示例性方面，本發明之方法使去岩藻糖基化糖型的百分比增加5%以上。在示例性方面，本發明之方法使去岩藻糖基化糖型的百分比增加10%以上。
在示例性方面，本發明之組成物係藥物組成物。在示例性方面，藥物組成物包含藥學上可接受的載劑。如本文所用，術語「藥學上可接受的載劑」包括任何標準藥物載劑，例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳劑（例如油/水或水/油乳劑）和各種類型的潤濕劑。該術語還涵蓋經美國聯邦政府的管理機構批准或在美國藥典中列出的用於包括人類的動物的任一試劑。
藥物組成物可以包含任何藥學上可接受的成分，包括例如酸化劑、添加劑、吸附劑、氣溶膠推進劑、空氣置換劑、鹼化劑、抗結塊劑、抗凝血劑、抗微生物防腐劑、抗氧化劑、抗菌劑、鹼、黏合劑、緩衝劑、螯合劑、包衣劑、著色劑、乾燥劑、洗滌劑、稀釋劑、消毒劑、崩散劑、分散劑、溶解增強劑、染料、潤膚劑、乳化劑、乳化穩定劑、填充劑、成膜劑、增味劑、調味劑、流動增強劑、膠凝劑、製粒劑、保濕劑、潤滑劑、黏膜黏合劑、軟膏基質、軟膏、油質運載體、有機鹼、錠劑基質、顏料、增塑劑、拋光劑、防腐劑、多價螯合劑、皮膚滲透劑、增溶劑、溶劑、穩定劑、栓劑基質、界面活性劑（surface active agent，surfactant）、懸浮劑、甜味劑、治療劑、增稠劑、張力劑、毒性劑、黏度增加劑、吸水劑、水混溶性助溶劑、水軟化劑或潤濕劑。參見例如 Handbook of Pharmaceutical Excipients[藥物賦形劑手冊], 第三版, A. H. Kibbe（Pharmaceutical Press [醫藥出版社], London, UK [英國倫敦], 2000），將其藉由引用以其全文併入；以及 Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明頓藥物科學], 第十六版, E. W. Martin（Mack Publishing Co.[麥克出版公司], Easton, Pa.[賓夕法尼亞州伊斯頓], 1980），將其藉由引用以其全文併入。
在示例性方面，藥物組成物包含在所採用的劑量和濃度下對接受者無毒的配製物材料。在特定的實施方式中，藥物組成物包含治療有效量的蛋白質的去岩藻糖基化糖型和一或多種藥學上可接受的鹽；多元醇；界面活性劑；滲透平衡劑；張力劑；抗氧化劑；抗生素；抗黴菌劑；膨脹劑；凍乾保護劑；消泡劑；螯合劑；防腐劑；著色劑；止痛劑；或另外的藥物試劑。在示例性方面，視需要除一或多種賦形劑外，藥物組成物還包含一或多種多元醇和/或一或多種界面活性劑，該一或多種賦形劑包括但不限於藥學上可接受的鹽；滲透平衡劑（張力劑）；抗氧化劑；抗生素；抗黴菌劑；膨脹劑；凍乾保護劑；消泡劑；螯合劑；防腐劑；著色劑；和止痛劑。
在某些實施方式中，藥物組成物可含有配製物材料以調節、維持或保留例如組成物的pH、滲透性、黏度、澄明度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透。在此類實施方式中，合適的配製物材料包括但不限於胺基酸（例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸）；抗微生物劑；抗氧化劑（例如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉）；緩衝劑（例如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸）；膨脹劑（例如甘露糖醇或甘胺酸）；螯合劑（例如乙二胺四乙酸（EDTA））；錯合劑（例如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精）；填充劑；單糖；二糖；和其他碳水化合物（例如葡萄糖、甘露糖或糊精）；蛋白質（例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白）；著色劑、調味劑和稀釋劑；乳化劑；親水聚合物（例如聚乙烯吡咯啶酮）；低分子量多肽；成鹽抗衡離子（例如鈉）；防腐劑（例如苯紮氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫）；溶劑（例如甘油、丙二醇或聚乙二醇）；糖醇（例如甘露糖醇或山梨糖醇）；懸浮劑；界面活性劑或潤濕劑（如普朗尼克（pluronics）、PEG、脫水山梨聚糖、聚山梨醇酯（如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯）、氚核、胺丁三醇、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙星（tyloxapal））；穩定性增強劑（例如蔗糖或山梨糖醇）；張力增強劑（例如鹼金屬鹵化物，較佳的是氯化鈉或氯化鉀，甘露糖醇，山梨糖醇）；遞送運載體；稀釋劑；賦形劑和/或藥用輔助劑。參見REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明頓藥物科學], 第18版,（A. R. Genrmo編）, 1990, Mack Publishing Company [麥克出版公司]。
可以配製藥物組成物以達到生理學上相容的pH。在一些實施方式中，藥物組成物的pH可以例如在約4或約5與約8.0或者約4.5與約7.5或者約5.0至約7.5之間。在示例性實施方式中，藥物組成物的pH值在5.5與7.5之間。
給出以下實例僅用於說明本發明，而不以任何方式限制其範圍。 實例 實例1
研究了各種岩藻糖苷酶影響IgG1單株抗體上的去岩藻糖基化水平之能力。一家實驗室已報導，用廣泛特異性岩藻糖苷酶O成功去除了N-連接糖蛋白上的核心α1,6-岩藻糖和α1,3-連接的核心岩藻糖。參見Vainauskas等人, 2018, Nature [自然], 8:9504。除非另有說明，否則所有化學品、試劑和溶劑均來源於西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich）（密蘇里州聖路易斯）。
對三種不同的岩藻糖苷酶進行檢驗，以識別有能力從附接到mAb的未標記N-聚糖上去除核心岩藻糖的新型α1-6-岩藻糖苷酶：
Hfuc：使用重組微生物表現系統合成的α-(1-2,3,4,6)-L-岩藻糖苷酶（智人）係一種廣泛特異性岩藻糖苷酶，最佳pH為pH 4.0，並且最佳溫度為50°C（愛爾蘭佈雷的Megazyme公司；E-FUCHS）。參見Liu等人, 2009, Biochemistry [生物化學] 48:110-120。
BKF：在大腸桿菌中表現的牛腎α1-2,3,4,6岩藻糖苷酶（ BKF）係一種廣泛特異性外切糖苷酶，與其他鍵相比，該酶更有效地切割α1-2和α1-6岩藻糖殘基，並且對α1-3岩藻糖殘基有輕微活性（新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs），麻塞諸塞州伊普斯維奇；目錄號P0748S）。參見Vainauskas等人, 2018, Nature [自然], 8:9504。
FucO：α1-2,4,6岩藻糖苷酶O係一種從 Omnitrophica細菌選殖並在大腸桿菌中表現的廣泛特異性外切糖苷酶，其催化與α1-2、α1-4和α1-6連接的岩藻糖從寡糖上水解下來。與其他鍵相比，其更容易切割α1-6岩藻糖殘基。該酶的最佳反應溫度為50°C，其在pH 4.0-6.0非常活躍，最佳活性在pH 5.5。（新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs），麻塞諸塞州伊普斯維奇；目錄號：P07449S）。參見Vainauskas等人, 2018, Nature [自然], 8:9504。
人抗IL-12 IgG1 mAb來源於北卡羅來納州富士膠片Diosynch生物工程公司（FujiFilm Diosynth Bioprocesses）（FDBU）的2000 L大型設施。從FDBU收穫的細胞培養物通過親和層析柱處理，以清除殘餘的宿主細胞蛋白、DNA和細胞碎片。純化的mAb池在低pH下進行病毒滅活（VI）並且在接收之前在FDBU通過深層過濾處理。蛋白質池存儲在-70°C。蛋白質池和酶儲料在波利賽斯（Polyscience）AD285150-A11B加熱循環水浴中解凍。在使用之前，將蛋白質使用0.22 μm孔徑過濾器（Stericup ®，密理博西格瑪公司（Millipore Sigma））進行無菌過濾。
在根據生產商說明書的每種岩藻糖苷酶的最佳pH和36°C的溫度下，對完整的未標記mAb人抗IL12 IgG1抗體進行體外實驗。根據生產商的酶單位定義， FucO和 BKF在100,000 U/mmol mAb的酶水平下進行測試，並且 Hfuc在10,000 U/mmol mAb的酶水平下測試。對照條件在不存在任何酶的情況下測試。存在於VI池中的完整mAb包含α-1,6-岩藻糖基化核心聚糖結構（糖酶的底物），濃度在18 mg/mL至20 mg/mL mAb蛋白質範圍內。下表1示出了實驗設計總結。 [表1]：實驗設計
條件 岩藻糖苷酶 pH 岩藻糖苷酶水平（ U/mmol mAb ）
1 N/A 5.0 0（對照）
2 Hfuc 4.0 10,000
3 BKF 5.0 100,000
4 FucO 5.0 100,000
為開始研究，將約10 mL mAb1 VI池溫熱到室溫。隨後將該池等分為一個4 mL池和三個2 mL池。立即從條件1中取出2 mL樣本，並於-70°C冷凍。將合適量的根據表1的岩藻糖苷酶添加到剩餘條件中的每一個中。將岩藻糖苷酶根據表1用pH 5.0的100 mM醋酸鈉稀釋以確保添加準確量的岩藻糖苷酶。在添加酶之後，將所有條件均移動到36°C培養箱中。
在24小時時間點，從每種條件中取出2 mL樣本。每種樣本均在-70°C下冷凍，直到提交進行HILIC分析。一旦完成研究執行，從每種條件中提取一個1 mL樣本進行HILIC分析。
使用HILIC確定酶促釋放的N-連接聚糖的聚糖圖譜。使用PNG酶F蛋白在磷酸鈉緩衝液（pH 7.5）中於約37°C在BEH聚糖柱（2.1 x 150 mm，1.7 µm（沃特世公司（Waters），目錄#186004742））上酶促釋放mAb上的N-連接聚糖，持續約2小時。將聚糖用2-胺基苯甲酸（2-AA）和氰基硼氫化鈉標記，於約80°C孵育約75分鐘，並藉由帶有內嵌式螢光檢測器的HILIC（親水作用液相層析）分離。藉由整合各個聚糖峰，計算去岩藻糖基化物種、高甘露糖物種、唾液酸化物種和β-半乳糖基化物種的總聚糖百分比。
去岩藻糖基化的結果如圖1A所示。由於缺少岩藻糖苷酶，如所預期地，對照樣本在24小時後顯示去岩藻糖基化水平（%）無變化。相比之下， Hfuc樣本顯示去岩藻糖基化水平急劇增加，表明該酶成功地切割下了mAb上的α1-6連接的岩藻糖。令人驚訝的是，對於 BKF和 FucO樣本，去岩藻糖基化水平未顯示任何顯著變化。對於 FucO觀察到的小幅改變可與聚糖分析測定的可變性相關。當針對所測試的對照和岩藻糖苷酶繪製時，圖1B更明顯地展示出去岩藻糖基化的%變化（%）。與對照相比， Hfuc樣本展示了去岩藻糖基化水平（%）增加2.3%。
高甘露糖、半乳糖基化和唾液酸化的結果分別如圖2A、2B和2C所示。在孵育24小時之後，BKF和FucO對高甘露糖（HM）無任何作用（類似於對照），而 Hfuc使高甘露糖減少至7.9%而不是9.5%。這可能是因為缺少輔因子，例如Zn或Ca，其在用於 BKF和 FucO的緩衝液中但不在用於 Hfuc的緩衝液中。 Hfuc還使半乳糖基化百分比降低約4.5%且使唾液酸化百分比降低約1%，其中 BKF和 FucO對半乳糖基化和唾液酸化有最小化的作用。這表示 BKF和 FucO不與岩藻糖基化mAb反應。
該研究驗證了來自智人的 Hfuc岩藻糖苷酶顯示出操縱附接到mAb的N-聚糖上的核心α1-6-連接的岩藻糖的潛力。於pH 4.0和36°C溫度孵育24小時之後看到 Hfuc樣本的去岩藻糖基化水平增加2.3%。該酶對α1-6岩藻糖基化部分的特異性和功效可能與其在複雜的哺乳動物體內環境內的常見功能相關。
這提出了一種替代性酶法方案，該方案用於修改mAb上的聚糖水平，而沒有上游發育期間所涉及的複雜性。
本文所引用的所有參考文獻（包括出版物、專利申請和專利）均藉由引用特此併入，引用的程度如同每個參考文獻被個別地並且明確地指示藉由引用併入並且以其全文在本文闡述。
無
[圖1A-B]顯示了：(A) 去岩藻糖基化水平（%），或 (B) 去岩藻糖基化的變化百分比，繪製在y軸上。x軸顯示了24小時內的每種岩藻糖苷酶： Hfuc、 BKF和 FucO，與0小時和24小時的無任何岩藻糖苷酶的對照樣本相比。
[圖2A-C]顯示了岩藻糖苷酶對以下項的作用：(A) 高甘露糖水平（%）；(B) 半乳糖基化百分比；或 (C) 唾液酸化百分比，繪製在y軸上。x軸顯示了24小時內的每種岩藻糖苷酶： Hfuc、 BKF和 FucO，與0小時和24小時的無任何岩藻糖苷酶的對照樣本相比。
無

Claims (23)

  1. 一種用於獲得去岩藻糖基化糖型水平增加的重組糖基化蛋白之方法，該方法包括 1)     將純化的重組糖基化蛋白與人廣泛特異性岩藻糖苷酶在適合岩藻糖苷酶活性的緩衝液中並且在適合增加該重組糖基化蛋白的去岩藻糖基化的條件下孵育一段時間；和 2)     將該去岩藻糖基化糖型水平增加的重組糖基化蛋白與該岩藻糖苷酶分離； 其中該重組糖基化蛋白不與糖基轉移酶或唾液酸轉移酶反應。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該人岩藻糖苷酶為α-(1-2,3,4,6)-L-岩藻糖苷酶。
  3. 如請求項1或2所述之方法，其中該岩藻糖苷酶以1,000 U/mmol至100,000 U/mmol重組糖基化蛋白的水平存在。
  4. 如請求項3所述之方法，其中該岩藻糖苷酶以5,000 U/mmol至25,000 U/mmol重組糖基化蛋白的水平存在。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之方法，其中所述孵育持續1小時至24小時。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該緩衝液具有約4.0至約5.0的pH。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之方法，其中溫度選自30°C至40°C的溫度。
  8. 如請求項7所述之方法，其中溫度選自35°C至38°C的溫度。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之方法，其中該緩衝液為醋酸鈉、磷酸鹽緩衝鹽水或MES。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之方法，其中該純化的重組糖基化蛋白的量為至少10 g/L。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之方法，其中所述岩藻糖苷酶固定在固相上。
  12. 如請求項11所述之方法，其中該固相為蛋白質A層析樹脂。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之方法，其中該純化的重組糖基化蛋白已藉由一或多個層析步驟純化。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之方法，其中該重組糖基化蛋白的A1G0、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5中一或多個的水平增加。
  15. 如請求項1至13中任一項所述之方法，其中該重組糖基化蛋白的高甘露糖（HM）糖型的水平降低。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該重組糖基化蛋白的Man5、Man6、Man7、Man8和/或Man9中一或多個的水平降低。
  17. 如請求項1至13中任一項所述之方法，其中半乳糖基化百分比降低。
  18. 如請求項1至13中任一項所述之方法，其中唾液酸化百分比降低。
  19. 如請求項1至18中任一項所述之方法，其中使用一或多個純化步驟將該重組糖基化蛋白與該岩藻糖苷酶分離。
  20. 如請求項19所述之方法，其中該一或多個純化步驟選自滲濾、超濾和無菌過濾。
  21. 如請求項1至20中任一項所述之方法，其中該重組糖基化蛋白為抗體、肽體或Fc融合蛋白。
  22. 如請求項21所述之方法，其中該重組糖基化蛋白係與以下結合的抗體：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11A、CD11B、CD11C、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31,CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD45RA、CD45RB、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD79α、CD79β、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CD109、CD114、CD 115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CDw128、CD129、CD130、CDw131、CD132、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CD146、CD147、CD148、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD182、促紅血球生成素、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、G-CSF、IL-15、GM-CSF、OSM、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、TNFβ、LTβ、CD40配體、Fas配體、CD27配體、CD30配體、4-BBL、TGFβ、IL-1α、IL-1β、IL-1 RA、IL-10、IL-12、MIF、IL-16、IL-17、IL-18、升糖素受體、IL-17受體A、骨硬化蛋白、IGF-1受體、肌生成抑制蛋白、表皮生長因子受體、SARS冠狀病毒、OPGL、血管生成素-2、NGF、TGF-β II型受體、結締組織生長因子、備解素、CTLA-4、干擾素-γ、MAdCAM、澱粉樣蛋白、胰島素樣生長因子I、介白素-1β、c-Met、M-CSF、MUC18、介白素-4受體、成纖維細胞生長因子樣多肽、α-4 β-7、激活素受體樣激酶-1、激活素A、血管生成素-1、血管生成素-2、C-FMS、甘丙肽、胰島素樣生長因子、LDCAM、DKK1、骨保護素、OV064、PSMA、PAR2、鐵調素、B7L-1、c-Kit、ULBP、TSLP、SIGIRR、HER-3、共濟失調蛋白-1樣多肽、TNF-α轉化酶、IL1-R1、TGF-β II型受體、TNF受體樣分子、結締組織生長因子、TRAIL受體-2、促紅血球生成素受體、B7RP1、備解素、RANKL、碳酸酐酶IX（CA IX）腫瘤抗原、甲狀旁腺激素、ACPL、單核細胞趨化蛋白-1、SCF、4-1BB、PDGFD、Flt-3配體、金屬蛋白酶抑制劑、LERK-5、LERK-6、腦源性神經營養因子、上皮源性T細胞介素、神經營養因子NNT-1、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶kexin 9型（PCSK9）、IL-18受體或C-FMS。
  23. 如請求項21所述之方法，其中該重組蛋白係以下之一：莫羅單抗-CD3（以商品名Orthoclone Okt3®上市的產品）、阿昔單抗（以商品名Reopro®上市的產品）、利妥昔單抗（以商品名MabThera®、Rituxan®上市的產品）、巴厘昔單抗（以商品名Simulect®上市的產品）、達利珠單抗（以商品名Zenapax®上市的產品）、帕立珠單抗（以商品名Synagis®上市的產品）、英利昔單抗（以商品名Remicade®上市的產品）、曲妥珠單抗（以商品名Herceptin®上市的產品）、阿侖單抗（以商品名MabCampath®、Campath-1H®上市的產品）、阿達木單抗（以商品名Humira®上市的產品）、托西莫單抗-I131（以商品名Bexxar®上市的產品）、依法珠單抗（以商品名Raptiva®上市的產品）、西妥昔單抗（以商品名Erbitux®上市的產品）、替伊莫單抗（以商品名Zevalin®上市的產品）、奧馬珠單抗（以商品名Xolair®上市的產品）、貝伐單抗（以商品名Avastin®上市的產品）、那他珠單抗（以商品名Tysabri®上市的產品）、蘭尼單抗（以商品名Lucentis®上市的產品）、帕尼單抗（以商品名Vectibix®上市的產品）、依庫麗單抗（以商品名Soliris®上市的產品）、培戈-瑟托利珠單抗（以商品名Cimzia®上市的產品）、戈利木單抗（以商品名Simponi®上市的產品）、康納單抗（以商品名Ilaris®上市的產品）、卡托索單抗（以商品名Removab®上市的產品）、優特克單抗（以商品名Stelara®上市的產品）、托珠單抗（以商品名RoActemra®、Actemra®上市的產品）、奧法木單抗（以商品名Arzerra®上市的產品）、地諾單抗（以商品名Prolia®上市的產品）、貝利單抗（以商品名Benlysta®上市的產品）、雷昔庫單抗、伊匹單抗（以商品名Yervoy®上市的產品）、帕妥珠單抗（以商品名Perjeta®上市的產品）、阿達木單抗、英利昔單抗、依那西普、戈利木單抗、培戈-瑟托利珠單抗；康納單抗；優特克單抗、布瑞吉努單抗；達利珠單抗、貝利單抗；依帕珠單抗；達利珠單抗；伊雷單抗、吉妥珠單抗、阿侖單抗；伊匹單抗；西妥昔單抗；曲妥珠單抗、帕妥珠單抗；司妥昔單抗；貝伐單抗；以及托珠單抗。
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Family Cites Families (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU643427B2 (en) 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5714465A (en) 1989-05-19 1998-02-03 Amgen Inc. Method of inhibiting tumor cell dissemination with a metalloproteinase inhibitor
US7144731B2 (en) 1989-10-16 2006-12-05 Amgen Inc. SCF antibody compositions and methods of using the same
US5574138A (en) 1993-03-08 1996-11-12 Immunex Corporation Epithelium-derived T-cell factor
US7138500B1 (en) 1993-05-07 2006-11-21 Immunex Corporation Antibodies to human 4-1BB
US7211259B1 (en) 1993-05-07 2007-05-01 Immunex Corporation 4-1BB polypeptides and DNA encoding 4-1BB polypeptides
US6630143B1 (en) 1993-05-24 2003-10-07 Immunex Corporation Antibodies against flt3 ligand
US7045128B2 (en) 1993-05-24 2006-05-16 Immunex Corporation Antibodies against flt3-ligand
US6303769B1 (en) 1994-07-08 2001-10-16 Immunex Corporation Lerk-5 dna
US5885574A (en) 1994-07-26 1999-03-23 Amgen Inc. Antibodies which activate an erythropoietin receptor
US5919905A (en) 1994-10-05 1999-07-06 Immunex Corporation Cytokine designated LERK-6
US6406901B1 (en) 1995-06-08 2002-06-18 Immunex Corporation TNF-a converting enzyme
CZ399A3 (cs) 1996-07-19 1999-06-16 Amgen Inc. Polypeptidová analoga kationaktivních polypeptidů
CA2274987C (en) 1996-12-23 2012-01-24 Immunex Corporation Ligand for receptor activator of nf-kappa b, ligand is member of tnf superfamily
US5741772A (en) 1997-02-03 1998-04-21 Amgen Inc. Neurotrophic factor NNT-1
US6316408B1 (en) 1997-04-16 2001-11-13 Amgen Inc. Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors
EP0975754B2 (en) 1997-04-16 2016-01-06 Amgen Inc., Osteoprotegerin binding proteins and their receptors
US20020173629A1 (en) 1997-05-05 2002-11-21 Aya Jakobovits Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
WO1999031241A1 (en) 1997-12-17 1999-06-24 Immunex Corporation Cell surface glycoproteins associated with human b cell lymphomas - ulbp, dna and polypeptides
EP1042477A1 (en) 1997-12-23 2000-10-11 Immunex Corporation Sigirr dna and polypeptides
AU1682699A (en) 1997-12-25 1999-07-19 Japan Tobacco Inc. Monoclonal antibody against connective tissue growth factor and medicinal uses thereof
NZ505499A (en) 1998-01-23 2002-07-26 Immunex Corp Accessory protein-like DNA and polypeptides
IL140937A0 (en) 1998-08-07 2002-02-10 Immunex Corp Molecules designated ldcam
ES2315016T3 (es) 1998-08-07 2009-03-16 Immunex Corporation Moleculas llamadas b7l-1.
EP1129190B2 (en) 1998-11-13 2017-01-11 Immunex Corporation Human tslp dna and polypeptides
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
US7435796B1 (en) 1999-02-03 2008-10-14 Amgen Inc. Antibodies which bind B7RP1
EP2264166B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
JP2001206899A (ja) 1999-11-18 2001-07-31 Japan Tobacco Inc ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
US20030103978A1 (en) 2000-02-23 2003-06-05 Amgen Inc. Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
AU2001272925A1 (en) 2000-05-26 2001-12-11 Immunex Corporation Use of interleukin-4 antagonists and compositions thereof
CA2421588C (en) 2000-09-05 2010-01-26 Amgen Inc. Tnf receptor-like molecules and uses thereof
NZ569856A (en) 2001-01-05 2010-03-26 Pfizer Antibodies to insulin-like growth factor 1 receptor
US6887687B2 (en) 2001-07-30 2005-05-03 Immunex Corporation Nucleic acids encoding human ataxin-1-like polypeptide IMX97018
US7084257B2 (en) 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
ES2606537T3 (es) 2001-10-23 2017-03-24 Psma Development Company L.L.C. Anticuerpos contra PSMA
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
CA2467597A1 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Abgenix, Inc. Anti-cd45rb antibodies for use in treating autoimmune disease and transplant rejection
CA2467738A1 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Abgenix, Inc. Antibodies against carboxic anhydrase ix (ca ix) tumor antigen
ES2307824T3 (es) 2001-12-28 2008-12-01 Amgen Fremont Inc. Uso de anticuerpos contra el antigeno muc18.
AU2002361886A1 (en) 2001-12-28 2003-07-24 Abgenix, Inc. Antibodies against the muc18 antigen
JP2005516965A (ja) 2001-12-28 2005-06-09 アブジェニックス・インコーポレーテッド 抗ｍｕｃ１８抗体を使用する方法
US7135174B2 (en) 2002-01-07 2006-11-14 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to PDGFD and uses thereof
WO2003085089A2 (en) 2002-03-29 2003-10-16 Schering Corporation Human monoclonal antibodies to interleukin-5 and methods and compositions comprising same
AU2003243139B2 (en) 2002-04-05 2007-06-21 Amgen Inc. Human anti-OPGL neutralizing antibodies as selective OPGL pathway inhibitors
US7202343B2 (en) 2002-08-19 2007-04-10 Abgenix, Inc. Antibodies directed to monocyte chemo-attractant protein-1 (MCP-1) and uses thereof
ES2449578T3 (es) 2002-09-06 2014-03-20 Amgen Inc. Anticuerpo monoclonal anti-IL-1R1 humano terapéutico
AU2003285874A1 (en) 2002-10-16 2004-05-04 Amgen Inc. HUMAN ANTI-IFN-Gamma NEUTRALIZING ANTIBODIES AS SELECTIVE IFN-Gamma PATHWAY INHIBITORS
CN100434440C (zh) 2002-12-02 2008-11-19 阿布格尼克斯公司 针对肿瘤坏死因子的抗体及其用途
KR101531400B1 (ko) 2003-06-27 2015-06-26 암젠 프레몬트 인코포레이티드 상피 성장 인자 수용체의 결실 돌연변이체 지향 항체 및 그용도
TWI382031B (zh) 2003-07-15 2013-01-11 Amgen Inc 作為選擇性神經生長因子（ｎｇｆ）通道抑制劑之人類抗-ｎｇｆ中和抗體
US7267960B2 (en) 2003-07-25 2007-09-11 Amgen Inc. Antagonists and agonists of LDCAM and methods of use
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
US7318925B2 (en) 2003-08-08 2008-01-15 Amgen Fremont, Inc. Methods of use for antibodies against parathyroid hormone
CN1838968A (zh) 2003-08-08 2006-09-27 艾伯吉尼斯公司 针对甲状旁腺激素(pth)之抗体和其用途
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
AU2004290017B2 (en) 2003-11-07 2012-05-03 Immunex Corporation Antibodies that bind interleukin-4 receptor
WO2005058961A2 (en) 2003-12-12 2005-06-30 Amgen Inc. Antibodies specific for human galanin, and uses thereof
CA2552523C (en) 2004-01-09 2019-11-26 Pfizer Inc. Monoclonal antibodies to mucosal addressin cell adhesion molecule(madcam)
US20050287140A1 (en) 2004-04-23 2005-12-29 Amgen Inc. Antibodies to angiogenesis inhibiting domains of CD148
EA200601972A1 (ru) 2004-04-23 2007-08-31 Амджен Инк. Антитела к ингибирующим ангиогенез доменам cd148
WO2006015373A2 (en) 2004-08-04 2006-02-09 Amgen Inc Antibodies to dkk-1
US7423128B2 (en) 2004-11-03 2008-09-09 Amgen Fremont Inc. Anti-properdin antibodies, and methods for making and using same
JP2008520684A (ja) 2004-11-17 2008-06-19 アブジェニックス・インコーポレーテッド Ｉｌ−１３に対する完全ヒトモノクローナル抗体
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
CA2589860A1 (en) 2005-01-24 2006-08-03 Amgen Inc. Humanized anti-amyloid antibody
WO2006081139A2 (en) 2005-01-26 2006-08-03 Abgenix, Inc. Antibodies against interleukin-1 beta
EP3058955B1 (en) 2005-03-24 2019-05-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies that bind ov064 and methods of use therefor
PE20061395A1 (es) 2005-04-25 2007-01-15 Amgen Fremont Inc Anticuerpos contra miostatina
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
KR101263079B1 (ko) 2005-07-18 2013-05-09 암젠 인크 인간 항-ｂ7ｒｐ1 중화 항체
PE20071101A1 (es) 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
ES2546069T3 (es) 2005-09-07 2015-09-18 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos monoclonales humanos para quinasa-1 de tipo receptor de activina (ALK-1)
CA2633956C (en) 2005-12-13 2016-12-06 Olivia Raeber Binding proteins specific for insulin-like growth factors and uses thereof
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
US7888482B2 (en) 2006-02-10 2011-02-15 Amgen Inc. Antibodies that bind PAR-2
TWI395754B (zh) 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
CA2652728A1 (en) 2006-05-19 2008-05-22 Amgen Inc. Antibodies to sars coronavirus
CL2007002567A1 (es) 2006-09-08 2008-02-01 Amgen Inc Proteinas aisladas de enlace a activina a humana.
CL2007002668A1 (es) 2006-09-20 2008-05-09 Amgen Inc Proteina de union a antigeno que se une al receptor de glucagon humano; acido nucleico que la codifica; metodo de produccion; composicion farmaceutica que la comprende; y su uso para tratar o prevenir la diabetes tipo 2.
US7767206B2 (en) 2006-10-02 2010-08-03 Amgen Inc. Neutralizing determinants of IL-17 Receptor A and antibodies that bind thereto
WO2008123999A2 (en) 2007-04-02 2008-10-16 Amgen Fremont Inc. Anti-ige antibodies
CL2008001887A1 (es) 2007-06-29 2008-10-03 Amgen Inc Proteinas de union a antigeno que se unen al receptor activado por proteasas 2 (par-2); acido nucleico que las codifica; vector y celula huesped; metodo de produccion; y composicion que las comprende.
CA2692453C (en) 2007-07-12 2018-01-09 Trevor Collingwood Methods and compositions for inactivating alpha 1,6 fucosyltransferase (fut8) gene expression
CL2008002153A1 (es) 2007-07-24 2009-06-05 Amgen Inc Anticuerpo aislado o fragmanto de unión de antigeno del mismo que se une al receptor de il-18 (il-18r); molecula de ácido nucleico codificante; celula huesped que la comprende; composición farmaceutica; uso médico para tratar o prevenir una condición asociada con il-18r; método in vitro para inhibir la unión de il-18 al il-18r.
DK2188313T3 (en) 2007-08-21 2017-12-11 Amgen Inc HUMAN C-FMS ANTI-BINDING PROTEINS
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
US7982016B2 (en) 2007-09-10 2011-07-19 Amgen Inc. Antigen binding proteins capable of binding thymic stromal lymphopoietin
US8414893B2 (en) 2007-12-21 2013-04-09 Amgen Inc. Anti-amyloid antibodies and uses thereof
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
EP2294087B1 (en) 2008-05-01 2014-05-14 Amgen, Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
EA034783B1 (ru) 2009-03-20 2020-03-20 Эмджен Инк. Антитело-антагонист, специфичное для гетеродимера альфа4бета7
TWI513818B (zh) 2009-06-02 2015-12-21 Regeneron Pharma 岩藻糖基化（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）－缺乏之細胞
EP2480671B8 (en) 2009-09-22 2015-10-28 ProBioGen AG Process for producing molecules containing specialized glycan structures
DK2486141T3 (en) 2009-10-07 2018-04-23 Macrogenics Inc FC-REGION-CONTAINING POLYPEPTIDES THAT PROVIDE IMPROVED EFFECTOR FUNCTION BASED ON CHANGES OF THE SCOPE OF FUCOSYLATION AND PROCEDURES FOR THEIR USE
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
RU2625768C2 (ru) 2010-08-05 2017-07-18 Сиэтл Дженетикс, Инк. Способы ингибирования фукозилирования белков in vivo с использованием аналогов фукозы
IN2014DN06806A (zh) * 2012-02-10 2015-05-22 Univ Maryland
US20160237399A1 (en) 2015-02-18 2016-08-18 Biogen Ma Inc. Control of Protein Glycosylation by Culture Medium Supplementation and Cell Culture Process Parameters
TWI682033B (zh) 2014-03-17 2020-01-11 泉盛生物科技股份有限公司 製造具有經修飾的糖苷化作用之重組糖蛋白之方法
JP7093612B2 (ja) * 2014-05-27 2022-06-30 アカデミア シニカ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のフコシダーゼおよびそれを使用する方法
JP6796773B2 (ja) 2014-07-30 2020-12-09 ツムトー バイオロジクス、インコーポレイテッド 非フコシル化タンパク質および方法
WO2016075662A2 (en) 2014-11-15 2016-05-19 Zumutor Biologics, Inc. Dna-binding domain, non-fucosylated and partially fucosylated proteins, and methods thereof
PT3227454T (pt) 2014-12-01 2020-04-06 Amgen Inc Processo para a manipulação do nível do teor de glicano de uma glicoproteína
JP6587696B2 (ja) 2015-05-13 2019-10-09 ズムトール バイオロジクス、インコーポレイテッド アフコシル化タンパク質、前記タンパク質を発現する細胞、及び関連する方法
SG11201802773RA (en) 2015-11-02 2018-05-30 Genentech Inc Methods of making fucosylated and afucosylated forms of a protein
WO2018031734A1 (en) * 2016-08-10 2018-02-15 University Of Maryland, College Park DESIGNER α1,6-FUCOSIDASE MUTANTS ENABLE DIRECT CORE FUCOSYLATION OF INTACT N-GLYCOPEPTIDES AND N-GLYCOPROTEINS
JP6965350B2 (ja) 2016-08-24 2021-11-10 チョ ファルマ インクCho Pharma Inc 糖タンパク質再構築のためのエンドグリコシダーゼ変異体及びその使用方法
EP3339444A1 (en) 2016-12-20 2018-06-27 Mabxience Research, S.L. Method for obtaining a glycoprotein with an increased percentage of afucosylated glycans
US20200131518A1 (en) 2017-03-14 2020-04-30 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
US10260056B2 (en) * 2017-03-17 2019-04-16 New England Biolabs, Inc. Cleavage of fucose in N-glycans
CN107881160A (zh) 2017-08-11 2018-04-06 百奥泰生物科技(广州)有限公司 一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体及其制备方法
EP3775251A1 (en) 2018-03-26 2021-02-17 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
CN110373374B (zh) 2018-04-12 2023-07-07 上海颢哲信息科技有限公司 一种降低抗体核心岩藻糖基化的方法和组合物
WO2019224333A1 (en) 2018-05-24 2019-11-28 Ares Trading S.A. Method for controlling the afucosylation level of a glycoprotein composition
WO2019246383A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods of glycoengineering proteoglycans with distinct glycan structures
AR114548A1 (es) 2018-08-10 2020-09-16 Genentech Inc Estrategias de cultivo celular para modular la glicosilación de proteínas
US20210188994A1 (en) 2018-08-29 2021-06-24 United Biopharma Inc. Afucosylated antibodies and manufacture thereof
EP3818149A4 (en) 2018-08-29 2022-03-23 United Biopharma Inc AFUCOSYLATED ANTIBODIES AND THEIR PRODUCTION
HUP1800376A2 (hu) 2018-11-07 2020-05-28 Richter Gedeon Nyrt Sejttenyészetben elõállított rekombináns glikoprotein glikozilációs-mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer
CN114026229A (zh) * 2019-08-05 2022-02-08 醣基生医股份有限公司 用于重塑抗体醣型之融合蛋白

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