ES2623161T3 - Procedimiento para la preparación de L-valina utilizando corinebacterias recombinantes que contienen el operón ilvBN inducible por propionato - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la preparación de L-valina mediante fermentación de microorganismos del género Corynebacterium que contiene, en forma replicable, un polinucleótido con actividad de operador, cuya secuencia es idéntica en al menos 85% a la secuencia desde las posiciones 1 a 121 conforme a SEQ ID NO: 1, 2 ó 3, a la que se une el activador PprpR, y a las que están conectados a continuación de manera funcional en el extremo 3' un segundo polinucleótido con actividad de promotor, así como los genes ilvB e ilvN que codifican las subunidades de una acetolactato-sintasa y que regula la transcripción de los genes ilvBN en función de la adición del activador PprpR, en un medio al que, después de una primera fase, la fase de crecimiento, que tiene lugar sin inductor, se añade en una segunda fase como inductor propionato o 2-metilcitrato, tras lo cual se sintetiza L-valina, bajo condiciones en las que la L-valina se acumula en el medio y/o en las células.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la preparacion de L-valina utilizando corinebacterias recombinantes que contienen el operon ilvBN inducible por propionato

Objeto de la invencion es un procedimiento para la preparacion de L-valina utilizando microorganismos en los que un promotor inducible por propionato posibilita la expresion regulada de los genes ilvBN.

Estado de la tecnica

Los aminoacidos y cetoacidos encuentran aplicacion en la medicina humana, en la industria farmaceutica, en cosmetica, en la industria alimentaria y en la alimentacion para animales.

Numerosos de estos compuestos se preparan mediante fermentacion de cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia se trabaja constantemente en la mejora de los procedimientos de preparacion. Las mejoras de los procedimientos pueden afectar a condiciones tecnicas de la fermentacion tales como, por ejemplo, agitacion y suministro con oxfgeno, o a la composicion de los medios nutricios tales como, por ejemplo, la concentracion de azucar durante la fermentacion o el tratamiento para dar la forma de producto mediante, por ejemplo, cromatograffa de intercambio de iones o las propiedades intrmsecas de rendimiento del propio microorganismo.

Para mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se aplican metodos de mutagenesis, seleccion y eleccion de mutantes. De este modo se obtienen cepas que son resistentes frente a anti-metabolitos tales como, p. ej., el analogo de valina 2-tiazolalanina o el analogo de leucina 4-azaleucina o 5,5,5-trifluoroleucina y producen compuestos qmmicos, por ejemplo los L-aminoacidos L-valina o L-leucina.

Desde hace algunos anos se emplean asimismo metodos de la tecnica de ADN recombinante para la mejora de cepas productoras de L-aminoacidos de Corynebacterium glutamicum, reforzando o debilitando, por ejemplo, genes individuales de la biosmtesis de aminoacidos, p. ej., tambien con una regulacion en el tiempo de la expresion genica en el transcurso de la produccion, y se examina el efecto sobre la produccion del compuesto qmmico.

Exposiciones recopilantes con respecto a la biologfa, genetica y biotecnologfa de Corynebacterium glutamicum se pueden encontrar en “Handbook of Corynebacterium glutamicum” (Comps.: L. Eggeling y M. Bott, CRC Press, Taylor y Francis, 2005), en la edicion especial de Journal of Biotechnology (Editor Jefe: A. Puhler) con el tttulo “A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology” (Journal of Biotechnology 104/1-3; (2003)), y en el libro de T. Scheper (Director Editorial) “Microbial Production of L-Amino Acids” (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, editorial Springer, Berlin, Alemania, 2003).

La secuencia de nucleotidos del genoma de Corynebacterium glutamicum se describe en Ikeda y Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)), y en el documento EP 1 108 790 y en Kalinowski et al. (journal of Biotechnology 104/1-3, (2003)).

Las secuencias de nucleotidos del genoma de Corynebacterium glutamicum estan disponibles asimismo en el Banco de Datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, EE.UU), en el Banco de Datos de ADN de Japon (DDBJ, Mishima, Japon) o en el Banco de Datos de Secuencias de Nucleotidos de European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania o bien Cambridge, Reino Unido).

Basicamente, existen dos posibilidades de la expresion de genes. En el caso de la expresion continua, el gen es expresado de forma continua a traves de un promotor constitutivo y la correspondiente protema se acumula en la celula.

Por el contrario, en el caso de la expresion inducida se utiliza un promotor inducible. Mediante un inductor se induce la expresion del gen diana, es decir, se activa. Este metodo se utiliza cuando la (sobre)expresion tiene efectos negativos sobre el organismo de produccion. Motivos de ello pueden ser una elevada carga de las fuentes condicionadas por el metabolismo durante la fase de crecimiento. La consecuencia es un crecimiento mas lento y, con ello, tiempos de funcionamiento prolongados del biorreactor y, ligado a ello, un aumento de los costes en el caso de la produccion industrial. Tambien es ventajosa una expresion inducida en el caso de productos toxicos para las

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celulas. Aqu se produce, despues de la induccion de la expresion, un auto-envenenamiento y la muerte de la celula. En relacion con la rentabilidad de un proceso de produccion se intenta, por lo tanto, dividir el proceso en una fase de crecimiento y una fase de produccion. En la fase de crecimiento se genera una cantidad lo mas grande posible de biomasa y en la fase de produccion se produce entonces la protema diana mediante la induccion del promotor. De este modo, se puede obtener un rendimiento maximo, con lo cual el proceso es claramente mas rentable.

Para los promotores de Escherichia coli regulables lac, Lambda PL y trp ya pudo demostrarse que estos pueden emplearse en bacterias corineformes para la expresion regulada de diferentes genes (Tsuchiya y Morinaga, Bio/Technology 6 (1988) 428-431).

El caso ideal para un promotor inducible lo representa un promotor corineforme que es regulado por una sustancia valiosa facilmente disponible.

El documento EP 0530765 B1 (Kyowa Hakko) describe el uso de un promotor inducible a base de corinebacterias, en este caso del gen isocitratoliasa, para la preparacion de enzimas tales como [beta]-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa e ICL, asf como protemas fisiologicamente activas tales como insulina o [alfa]-, [beta]- o [gamma]- interferon. Este promotor conduce a la expresion de genes, siempre que en el medio se encuentre solo una fuente de carbono (fuente de C) diferente del azucar, en presencia de azucares es reprimido. Sin embargo, dado que en medios de fermentacion habituales el azucar se emplea como fuente de C, sena util obtener un promotor regulable que conduzca a la expresion de un gen tambien en presencia de azucares con un inductor economico.

El documento DE4440118 C1 (tal como US5965391, FZ Julich) reivindica el uso de un promotor inducible de corinebacterias, en este caso del gen maltosintasa aceB, para la preparacion de protemas; los inductores son aqu las fuentes de carbono lactato, piruvato o acetato.

El promotor del operon prpDBC2 de Corynebacterium glutamicum, cuyos genes son esenciales para el crecimiento sobre propionato como fuente principal de C y que codifican las enzimas 2-metilcitrato deshidratasa (PrpD2), 2- metilisocitrato liasa (PrpB2) y 2-metilcitrato sintasa (PrpC2) se describio por Plassmeier et al. (Journal of Biotechnology 159/1-2 (2012)). Analisis de construcciones de promotor-vector de ensayo condujeron a la identificacion de una region de operador de 121 pares de bases por encima del operon prpDBC2, la cual es necesaria para una transcripcion inducida por propionato a traves del activador PrpR. Estudios EMSA dieron como resultado que 2-metilcitrato actua posiblemente como co-activador del PrpR.

El documento PLASSMEIER, J. K. ET AL., “A propionate-inducible expression system based on the Corynebacterium glutamicum prpD2 promoter and PrpR activador and its application for the redirection of amino acid biosynthesis pathways” (JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, tomo 163, N° 2, 20 de enero de 2013, paginas 225-232) da a conocer un procedimiento para la preparacion de L-isoleucina mediante fermentacion de microorganismos del genero Corynebacterium, que contiene un polinucleotido con actividad de operador, cuya secuencia es al menos en un 85% identica con la secuencia de la posicion 1 a 121 conforme a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, a la que se une el activador PrpR y al que esta dispuesto a continuacion de forma funcional, en el extremo 3', un segundo polinucleotido con actividad de promotor, asf como el gen hom que codifica la homoserina deshidrogenasa, y regula la transcripcion del gen hom en funcion del almacenamiento del activador PrpR, en un medio al que se anade el inductor propionato, tras lo cual se sintetiza L-isoleucina bajo condiciones en las que la L-isoleucina se enriquece en el medio.

El documento EP 1 096 010 A1 (DEGUSSA AG; FORSCHUNGSZENTRUM JULICH GMBH, 2 de mayo de 2001) da a conocer un procedimiento para la preparacion de L-valina mediante fermentacion de microorganismos del genero Corynebacterium, que contiene un polinucleotido con actividad de promotor, asf como los genes ilvB e ilvN que codifican las subunidades de una acetolactato-sintasa, en un medio bajo condiciones en las que L-valina se acumula en el medio y/o en las celulas.

El documento DE 101 10 344 A1 (DEGUSSA AG, 16 de mayo de 2002) da a conocer el hecho de que para la produccion de L-valina se debena reforzar, entre otros, la expresion de los genes ilvB e ilvN que codifican las subunidades de una acetolactato-sintasa y/o del gen que codifica homoserina deshidrogenasa.

Mision de la invencion

La invencion tema por mision proporcionar un nuevo procedimiento para la preparacion del L-aminoacido L-valina de forma intracelular o en el medio, con un rendimiento preferiblemente mejorado y/o una concentracion final mayor del

producto. En este caso, debena presentarse una mejora del rendimiento espedfico (es decir, rendimiento de producto deseado en relacion con la fuente de carbono empleada).

El nuevo procedimiento debena posibilitar en este caso, preferiblemente, la produccion de L-valina, independientemente de la fuente principal de carbono del medio.

5 En el caso del nuevo procedimiento debena impedirse en la medida de lo posible, ademas, preferiblemente la formacion de productos secundarios indeseados, en particular la formacion del producto secundario indeseado alanina, dado que la separacion del producto secundario es muy compleja y costosa y repercute, ademas, negativamente sobre la pureza del producto del caldo y sobre el rendimiento de carbono.

El procedimiento empleado debena conducir, ademas, preferiblemente a un aumento de la estabilidad genetica de la 10 cepa empleada para la produccion y, con ello, posibilitar un elevado numero de generaciones en el proceso de fermentacion (etapas de cultivo y fermentador principal) sin disminucion de los datos de rendimiento.

Descripcion de la invencion

El problema de acuerdo con la invencion se resuelve mediante el uso de un operador, al que se une el activador PrpR, para la regulacion de la expresion de los genes ilvBN.

15 En el caso de ilvBN (EC-N° 4.1.3.18) se trata de los genes que codifican las subunidades de una acetolactato- sintasa.

Por lo tanto, objeto de la invencion es un procedimiento para la preparacion de L-valina mediante fermentacion de microorganismos del genero Corynebacterium que contiene, en forma replicable, un polinucleotido con actividad de operador, cuya secuencia es al menos un 85%, preferiblemente al menos un 90, 92, 94 o 96%, en particular al 20 menos un 97, 98 o 99%, de manera particularmente preferida un 100% identica con la secuencia de las posiciones 1 a 121 conforme a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, al que se une el activador PrpR y en el que en el extremo 3' estan dispuestos a continuacion de manera funcional un segundo polinucleotido con actividad de promotor, asf como los genes ilvB e ilvN que codifican las subunidades de una acetolactato-sintasa, y que regula la transcripcion de los genes ilvBN en funcion de la acumulacion del activador PrpR, el cual es activado mediante el co-activador 225 metilcitrato.

En un medio en el que, despues de una primera fase sin inductor, se anade en una segunda fase subsiguiente como inductor propionato o 2-metilcitrato, tras lo cual se expresan los genes ilvBN y, por consiguiente, se sintetiza el L- aminoacido o a-cetoacido deseado, bajo condiciones en las que el L-aminoacido o a-cetoacido deseado se acumula en el medio o en las celulas.

30 En el caso del polinucleotido con actividad de operador se trata de un operador que regula de forma natural la expresion de una 2-metilcitrato-deshidratasa en bacterias corineformes o de un polinucleotido derivado de un operador de este tipo.

El polinucleotido con actividad de operador comprende preferiblemente un polinucleotido, cuya secuencia es al menos un 90%, preferiblemente al menos un 92, 94 o 96%, en particular al menos un 97, 98 o 99%, de manera 35 particularmente preferida un 100% identica con la secuencia conforme a SEQ ID NO: 11 o con la secuencia de la posicion 22 hasta la posicion 49 conforme a SEQ ID NO: 1,2 o 3 (en lo que sigue denominada tambien “IR 1”), asf como un polinucleotido, cuya secuencia es al menos un 90%, preferiblemente al menos un 92, 94 o 96%, en particular al menos un 97, 98 o 99%, de manera particularmente preferida un 100% identica con la secuencia conforme a SEQ ID NO: 12 o con la secuencia de la posicion 77 hasta la posicion 105 conforme a SEQ ID NO: 1, 2 o 40 3 (en lo que sigue denominada tambien “IR 2”), La secuencia “IR 1” esta dispuesta en este caso, en una forma de

realizacion preferida, en el polinucleotido con actividad de operador en las posiciones 22 a 49, mientras que la secuencia “IR 2” esta dispuesta, en una forma de realizacion preferida, en las posiciones 77 a 105.

En una forma de realizacion preferida conforme a la invencion, el polinucleotido con actividad de operador es parte de un polinucleotido mas largo, preferiblemente de un polinucleotido con una identidad de la secuencia de al menos 45 90%, preferiblemente de al menos 92, 94 o 96%, en particular de al menos 97, 98 o 99%, de manera particularmente

preferida de 100% con respecto a la secuencia de las posiciones 1 a 177 conforme a SEQ ID NO: 1, 2 o 3.

En el caso del gen ilvB se trata preferiblemente de un polinucleotido que codifica un polipeptido con una secuencia de aminoacidos que presenta una identidad de al menos de al menos 90%, preferiblemente de al menos 92, 94 o

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96%, en particular de al menos 97, 98 o 99%, de manera particularmente preferida de 100% con respecto a la secuencia de aminoacidos de conforme a SEQ ID NO: 9.

De manera particularmente preferida, en este caso se trata de un polinucleotido, cuya secuencia presenta una identidad de al menos 90%, preferiblemente de al menos 92, 94 o 96%, en particular de al menos 97, 98 o 99%, de manera particularmente preferida de 100% identica con la secuencia de las posiciones 499 a 2379 conforme a SEQ ID NO: 8.

En el caso del gen ilvB se trata preferiblemente de un polinucleotido que codifica un polipeptido con una secuencia de aminoacidos que presenta una identidad de al menos de al menos 90%, preferiblemente de al menos 92, 94 o 96%, en particular de al menos 97, 98 o 99%, de manera particularmente preferida de 100% con respecto a la secuencia de aminoacidos conforme a SEQ ID NO: 10.

De manera particularmente preferida, en este caso se trata de un polinucleotido, cuya secuencia presenta una identidad de al menos 90%, preferiblemente de al menos 92, 94 o 96%, en particular de al menos 97, 98 o 99%, de manera particularmente preferida de 100% identica con la secuencia de las posiciones 2393 a 2911 conforme a SEQ ID NO: 8.

Los polipeptidos codificados por los genes ilvB e ilvN se reunen para formar una acetolactato-sintasa funcional.

Para la induccion de la expresion se utiliza preferiblemente propionato o bien acido propionico. A este respecto, tiene lugar una “induccion de propionato”. El propionato se transforma in vitro en el co-activador propiamente dicho, el 2- metilcitrato. Alternativamente, tambien 2-metilcitrato se puede utilizar directamente para la induccion, pero debido a la menor disponibilidad se emplea con menor preferencia. Conforme a la invencion, la expresion “induccion de propionato” comprende tambien la induccion con 2-metilcitrato.

Despues de finalizar la produccion, preferiblemente se afsla L-valina, permaneciendo o siendo separados por completo otros componentes del caldo de fermentacion y/o la biomasa en su totalidad o en parte (> 0 a 100%) en el producto aislado.

En el procedimiento de acuerdo con la invencion tiene lugar primeramente una fase de cultivo libre de induccion (fase de crecimiento, primera fase) para proporcionar la biomasa. En esta fase no se forma o apenas se forma preferiblemente L-valina (< 5 g/l). En la fase de produccion subsiguiente (fase de induccion, segunda fase) se induce la produccion mediante la induccion de los genes de la biosmtesis ilvBN mediante propionato o 2-metilcitrato. La fase de cultivo contiene todas las etapas de cultivo, comenzando por el modelo de referencia, a traves de preferiblemente etapas del matraz de agitacion hasta el fermentador de cultivo preferiblemente empleado. La fase de cultivo puede comprender tambien, ademas, la primera fase de la fermentacion principal. De preferencia, la fase de cultivo ha concluido a lo mas tardar despues de las primeras 3-15 horas, preferiblemente 5-10 horas de la fermentacion principal.

La fase de induccion comprende preferiblemente el tiempo de 0-20 horas despues de la inoculacion del fermentador principal hasta la finalizacion de la fermentacion principal. Una induccion en un momento anterior, es decir, en el fermentador de cultivo, puede ser ventajosa y representa una forma de realizacion particular del procedimiento de acuerdo con la invencion.

Una regulacion/dosificacion exacta de la concentracion de acido propionico en la fase de produccion es necesaria con el fin de mantener, por una parte, la induccion de la smtesis de aminoacidos o bien cetoacidos y, por otra parte, impedir el efecto toxico del propionato o bien de uno de sus productos intermedios de degradacion (propionil-CoA, 2- metilcitrato). La concentracion de acido propionico preferida en la fase de induccion se encuentra en el intervalo de 0,1 - 10 g/l. El acido propionico puede anadirse continuamente en forma de una alimentacion de acido propionico, o discontinuamente en forma de uno o varios pulsos de acido propionico en diferentes momentos durante la fase de induccion. La dosificacion unica del acido propionico como componente del medio principal de fermentacion es asimismo posible y representa una forma de realizacion particular del procedimiento de acuerdo con la invencion.

Un gran problema en la preparacion de L-valina lo representa, normalmente, la formacion de productos secundarios. Los productos secundarios formados reducen el rendimiento de carbono y, ademas, deben ser eventualmente separados, lo cual es muy complejo y costoso.

Un ejemplo para la formacion de un producto secundario lo representa la formacion del producto secundario alanina en la biosmtesis de valina. La formacion de alanina aumenta en el caso de los procesos de produccion habituales,

en los que habitualmente tiene lugar una expresion constitutiva, en funcion del numero de las generaciones de celulas.

Desde la muestra de referencia hasta la recoleccion del fermentador de produccion discurriran, en el caso de un procedimiento en tres etapas (matraz con agitacion, fermentador de cultivo, fermentador principal) aproximadamente 5 20-25 generaciones, en el caso de un procedimiento en cuatro etapas (matraz con agitacion, fermentador de pre-

siembra, fermentador de cultivo, fermentador principal) discurriran incluso mas de 30 generaciones. Al recorrer un numero tan elevado de generaciones, la formacion de productos secundarios y la formacion de biomasa esta normalmente fuertemente incrementada de manera correspondiente.

Por el contrario, conforme a la invencion, se comprobo una formacion de producto secundario y formacion de 10 biomasa muy fuertemente reducida. Ademas, se comprobo que la formacion de productos secundarios y la formacion de biomasa en el procedimiento de produccion de acuerdo con la invencion es independiente del numero de las generaciones discurridas. Esto permite concluir que la realizacion del procedimiento de acuerdo con la invencion conduce a una estabilidad genetica incrementada de la cepa empleada. La fase de cultivo puede prolongarse, por lo tanto, en principio, de forma arbitraria, lo cual es particularmente ventajoso para la realizacion del 15 procedimiento.

Un procedimiento particularmente preferido conforme a la invencion se caracteriza, por lo tanto, porque comprende al menos cuatro etapas, a saber al menos tres etapas de cultivo y una etapa de produccion. El cultivo comprende en este caso, preferiblemente, el cultivo en el matraz con agitacion, en el fermentador de pre-siembra asf como en el fermentador de siembra. La produccion tiene lugar preferiblemente en un fermentador de produccion.

20 Otro procedimiento particularmente preferido conforme a la invencion se caracteriza, por lo tanto, porque las bacterias empleadas durante la fase de cultivo, recorren al menos 16, preferiblemente al menos 24 generaciones y/o durante toda la fermentacion (incluido el cultivo y la produccion) recorren al menos 25, preferiblemente al menos 30 generaciones.

Se da a conocer tambien el uso de un polinucleotido con actividad de operador al que se une el activador PrpR, 25 poseyendo el polinucleotido una secuencia que es al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, preferiblemente al menos 97%, de manera particularmente preferida al menos 98%, de manera muy particularmente preferida al menos 99% y de manera muy extremadamente preferida 100% identica a la secuencia desde las posiciones 1 a 121 conforme a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, para la regulacion de la expresion de los genes ilvBN, preferiblemente en combinacion con un promotor antepuesto a los genes.

30 Se da a conocer tambien una casete de expresion, que comprende un polinucleotido con una actividad de operador cuya secuencia es al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, preferiblemente al menos 97%, de manera particularmente preferida al menos 98%, de manera muy particularmente preferida al menos 99% y de manera muy extremadamente preferida 100% identica a la secuencia desde las posiciones 1 a 121 conforme a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, un promotor dispuesto a continuacion asf como los genes ilvBN que codifican una acetolactato- 35 sintasa.

El polinucleotido con actividad de operador presenta en este caso preferiblemente siempre las propiedades destacadas precedentemente como preferidas, en particular las regiones conservadas “IR 1” e “Ir 2”.

En el caso del promotor antepuesto a los genes ilvBN o bien al promotor dispuesto a continuacion del operador puede tratarse de cualquier promotor arbitrario.

40 Ejemplos de promotores empleables de manera preferida conforme a la invencion en Corynebacterium glutamicum se describen, por ejemplo, en la Fig. 1 del artfculo sinoptico de Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311323 (2003)). De igual manera, pueden emplearse las variantes del promotor dapA, por ejemplo del promotor A25, descritas por Vasicova et al (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)). Ademas, puede utilizarse el promotor gap de Corynebacterium glutamicum (documento Ep 06007373). Finalmente, pueden utilizarse los promotores T3, 45 T7, SP6, M13, lac, tac y trc ampliamente conocidos y descritos por Amann et al. (Gene 69(2), 301-315 (1988) y

Amann y Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)).

En una forma de realizacion preferida, en el caso del promotor empleado conforme a la invencion se trata de un polinucleotido con una actividad de promotor, cuya secuencia es al menos 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, preferiblemente al menos 97%, de manera particularmente preferida al menos 98%, de manera muy

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particularmente preferida al menos 99% y de manera extremadamente preferida al menos 100% identica con la secuencia desde las posiciones 122 a 206 conforme a SEQ ID NO: 4.

En el caso de la casete de expresion se trata preferiblemente de una casete de expresion con una secuencia conforme a SEQ ID NO: 13.

Se da a conocer, ademas, un vector que contiene una casete de expresion divulgada conforme a la solicitud.

Kirchner y Tauch (Journal of Biotechnology 104:287-299 (2003)) describen una seleccion de los vectores a utilizar preferiblemente en Corynebacterium glutamicum.

La recombinacion homologa permite, utilizando los vectores divulgados conforme a la solicitud, el intercambio de segmentos de ADN en el cromosoma por casetes de expresion divulgadas conforme a la solicitud, que son transportadas por el vector a la celula. Para la recombinacion eficiente entre la molecula de ADN anular del vector y el ADN diana en el cromosoma, la region de ADN a intercambiar, que contiene una casete de expresion divulgada conforme a la solicitud, es provista en los extremos de secuencias de nucleotidos homologas al lugar diana, con lo cual se establece el lugar de la integracion del vector o bien del intercambio del ADN.

La incorporacion de la casete de expresion divulgada conforme a la solicitud puede tener lugar en este caso en el lugar del gen nativo de los genes ilvBN, reemplazandose en este caso, preferiblemente, los genes ilvBN nativos y, eventualmente, tambien el promotor nativo de los genes ilvBN por una casete de expresion divulgada conforme a la solicitud.

Alternativamente, una casete de expresion divulgada conforme a la solicitud puede integrarse tambien en una region intergenica en el cromosoma que no presenta funcion codificante alguna, o en otro lugar del gen, representando el otro lugar del gen, preferiblemente, una secuencia de nucleotidos en el cromosoma que no es esencial para el crecimiento de las celulas y la produccion del aminoacido o bien cetoacido.

La casete de expresion divulgada conforme a la solicitud puede incorporarse, conforme a la invencion, en una forma de realizacion preferida en el cromosoma tambien en multiples copias, asf como eventualmente en diferentes lugares del gen.

En lugar de incorporar en el cromosoma una casete de expresion divulgada conforme a la solicitud, puede incorporarse en el cromosoma alternativamente tambien el operador utilizador, divulgado conforme a la invencion, en combinacion con un promotor en el lugar del gen nativo de los genes ilvBN, siendo reemplazado preferiblemente el promotor nativo de los genes ilvBN por la construccion a base de operador y promotor.

En lugar de incorporar en el cromosoma la casete de expresion divulgada conforme a la solicitud, puede emplearse conforme a la invencion alternativamente, naturalmente, tambien un vector de replicacion extra-cromosomal, que contiene una casete de expresion divulgada conforme a la solicitud.

Otro objeto de la presente invencion es, asimismo, un microorganismo, preferiblemente un Corynebacterium, ante todo un Corynebacterium que produce L-valina, el cual contiene una casete de expresion divulgada conforme a la solicitud y/o un vector divulgado conforme a la solicitud.

Particularidades con respecto a la bioqmmica o bien estructura qmmica de polinucleotidos tal como se presentan en organismos vivos tales como, por ejemplo, microorganismos, se encuentran, entre otros, en el libro de texto “Biochemie” de Berg et al (Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg ■ Berlin, Alemania, 2003; ISBN 3-8274-13036).

Si el polinucleotido se compone de monomeros de desoxirribonucleotido con las nucleobases o bien bases adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T), entonces se habla de desoxirribopolinucleotidos o acido desoxirribonucleico (ADN). Si el polinucleotido a base de monomeros de ribonucleotidos con las nucleobases o bien bases adenina (A), guanina (G), citosina (C) y uracilo (U), entonces se habla de ribo-polinucleotidos o de acido ribonucleico (ARN). En los polinucleotidos mencionados, los monomeros estan unidos entre sf de forma covalente mediante un enlace 3' ^ 5'-fosfodiester.

Por un “polinucleotido con actividad de operador” o un “operador” se entiende un polinucleotido, preferiblemente un desoxirribo-polinucleotido o bien un acido nucleico, preferiblemente acido desoxirribonucleico (ADN) que, en enlace

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funcional y a traves de un polinucleotido con actividad de promotor con un polinucleotido a transcribir mediante interaccion con diferentes proternas reguladoras (activadores o bien represores que, de nuevo, interaction con ligandos o moleculas efectoras) conectan o desconectan la transcripcion de este polinucleotido.

Por un “polinucleotido con actividad de promotor” o un “promotor” se entiende un polinucleotido, preferiblemente un desoxirribo-polinucleotido o bien un acido nucleico, preferiblemente acido desoxirribonucleico (ADN) que, en enlace funcional que con polinucleotido a transcribir, establece el punto de inicio y la frecuencia de inicio de la transcripcion de este polinucleotido, con lo cual se puede influir sobre la intensidad de expresion del polinucleotido controlado.

En virtud de la estructura de doble cadena del ADN se da a conocer asimismo la cadena complementaria a la cadena del protocolo de secuencia en SEQ ID NO: 1, 2 o 3.

Por “transcripcion” se entiende el proceso mediante el cual, partiendo de una matriz de ADN, se prepara una molecula de ARN complementaria. En este proceso participan proternas tales como la ARN-polimerasa, los denominados factores sigma y proternas reguladoras transcripcionales. El ARN sintetizado (ARN mensajero, ARN- m) sirve entonces como matriz en el proceso de la traduccion que conduce entonces al polipeptido o bien a la proterna.

Un gen es, visto qmmicamente, un polinucleotido. Un polinucleotido, que codifica una proterna/polipeptido, se utiliza aqu de manera sinonima al termino “gen”. Segun ello, el termino “gen” y la expresion “region codificante” se utilizan de manera sinonima y de igual manera los dos terminos “proterna” y “polipeptido”.

Por una “conexion posterior o enlace funcional” se entiende a este respecto la disposicion secuencial de los polinucleotidos de acuerdo con la invencion con actividad de operador con un segundo polinucleotido con actividad de promotor y con otro oligonucleotido o polinucleotido que conduce una transcripcion del otro polinucleotido.

Si en el caso del otro polinucleotido se trata de un polinucleotido que codifica un polipeptido/proterna que se compone de la region codificadora de un polipeptido que comienza con un codon de iniciacion, incluido el codon de parada y, eventualmente, incluido un terminador de la tanscripcion, entonces “conexion posterior o enlace funcional” significa la disposicion secuencial que conduce a una transcripcion del otro polinucleotido y a la traduccion del ARN sintetizado.

El polinucleotido adicional codifica uno o varios polipeptidos. Un polinucleotido que codifica una proterna o proterna/polipeptido se compone esencialmente de un codon de iniciacion, elegido del grupo ATG, gTg y TTG, preferiblemente ATG o GTG, de manera particularmente preferida ATG, una secuencia codificante de proternas y uno o varios codones de terminacion elegidos del grupo TAA, TAG y TGA.

Si el polinucleotido adicional codifica varias proternas o proternas/polipeptidos, entonces delante de cada uno de los genes se puede encontrar un lugar de union al ribosoma. Detras del ultimo gen se encuentra eventualmente un terminador.

El polinucleotido adicional se compone, conforme a la invencion, de los genes ilvB e ilvN que codifican las subunidades de una acetolactato-sintasa (ilvBN, EC N°: 4.1.3.18).

Se divulga, ademas, el uso de la casete de expresion divulgada conforme a la solicitud o del vector divulgado conforme a la solicitud para la expresion de los genes ilvBN en microorganismos. La casete de expresion divulgada conforme a la solicitud garantiza la transcripcion y la traduccion del ARN sintetizado, preferiblemente ARNm, en polipeptidos, a saber, las dos subunidades de una acetolactato-sintasa.

Utilizando la casete de expresion divulgada conforme a la solicitud pueden expresarse o bien sobre-expresarse en un momento deseado los genes ilvBN en microorganismos.

Por sobre-expresion se entiende, en general, un aumento de la concentracion intracelular o actividad de un acido ribonucleico, de una proterna (polipeptido) o de una enzima en comparacion con la cepa de partida (cepa parental) o cepa de tipo salvaje, cuando esta sea la cepa de partida. Por una cepa de partida (cepa parental) se entiende la cepa en la que se llevo a cabo la medida que condujo a la sobre-expresion.

En el caso de la sobre-expresion se prefieren los metodos de la sobre-expresion recombinante. En ellos se reunen todos los metodos en los que un microorganismo se prepara utilizando una molecula de ADN proporcionada in-vitro.

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Moleculas de ADN de este tipo comprenden, por ejemplo, promotores, casetes de expresion, genes, alelos, regiones codificantes, etc. Estas se transfieren al microorganismo deseado por metodos de transformacion, conjugacion, transduccion o metodos similares.

Mediante las medidas de la sobre-expresion utilizando el operador a emplear conforme a la invencion y/o utilizando la casete de expresion divulgada conforme a la solicitud, la actividad o concentracion de la acetolactato-sintasa se aumenta, por lo general, preferiblemente al menos un 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, preferiblemente como maximo hasta 1000%, 2000%, 4000%, 10000% o 20000%, referido a la actividad o concentracion del polipeptido en la cepa antes de la medida que conduce a la sobre-expresion.

La magnitud de la expresion o bien de la sobre-expresion puede establecerse mediante la medicion de la cantidad del ARNm transcrito por el gen, mediante determinacion de la cantidad del polipeptido y mediante la determinacion de la actividad enzimatica.

Para la determinacion de la cantidad de ARNm pueden utilizarse, entre otros, el metodo de la “transferencia Northern” y de la RT-PCR cuantitativa. En el caso de la RT-PCR cuantitativa se antepone a la reaccion en cadena de la polimerasa una transcripcion inversa. Para ello, puede utilizarse el sistema LightCycler™ de la razon social Roche Diagnostics (Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) tal como se describe, por ejemplo, en Jungwirth et al. (FEMS Microbiology Letters 281, 180-197 (2008)). La concentracion de la protema puede determinarse a traves de una separacion en gel de protemas mono- y bi-dimensional y subsiguiente identificacion optica de la concentracion de protemas con el correspondiente software de evaluacion en el gel. Un metodo habitual para la preparacion de los geles de protemas en el caso de bacterias corineformes y para la identificacion de las protemas es el modo de proceder descrito por Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)). La concentracion de protemas puede determinarse asimismo mediante hibridacion mediante hibridacion por transferencia Western con un anticuerpo espedfico para la protema a detectar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) y subsiguiente evaluacion optica con el correspondiente software para la determinacion de la concentracion (Lohaus y Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)). La significancia estadfstica de los datos obtenidos se determina mediante un test T (Gosset, Biometrika 6(1): 1-25 (1908)).

La medida para la sobre-expresion de los genes ilvBN utilizando el operador a emplear conforme a la invencion puede combinarse de manera adecuada con otras medidas para la sobre-expresion.

Para conseguir una sobre-expresion se encuentran a disposicion en el estado de la tecnica una pluralidad de metodos. A ellos pertenecen, junto a la modificacion de las secuencias de nucleotidos, que regulan o bien controlan la expresion del gen, tambien el aumento del numero de copias.

El aumento del numero de copias puede tener lugar mediante plasmidos que replican en el citoplasma del microorganismo. A este respecto, en el estado de la tecnica se describe una pluralidad de plasmidos para los mas diversos grupos de microorganismos, con los cuales se puede ajustar el aumento deseado del numero de copias del gen. Plasmidos adecuados para el genero Corynebacterium se describen, por ejemplo, en Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 27-40, (2003)), o en Stansen et al. (Applied and Environmental Microbiology 71, 5920-5928 (2005)).

El aumento del numero de copias en al menos (1) copia puede tener lugar, ademas, mediante la incorporacion de copias adicionales en el cromosoma del microorganismo. Metodos adecuados para el genero Corynebacterium se describen, por ejemplo, en los documentos de patente WO 03/014330, WO 03/040373 y WO 04/069996.

El aumento de la expresion genica puede tener lugar, ademas, posicionando varios promotores delante del gen deseado o bien enlazandolos funcionalmente con el gen a expresar, y de este modo se accede a una expresion aumentada. Ejemplos de ello se describen en el documento de patente WO 2006/069711.

La velocidad de la elongacion se determina mediante el uso de codones, mediante el uso de codones para los ARNs-t (transferencia) que se presentan a menudo en la cepa de partida puede reforzarse la traduccion. Ademas de ello, el intercambio de un codon de iniciacion por el codon ATG que se presenta lo mas a menudo en muchos microorganismos (77% en Escherichia coli) pude mejorar considerablemente la traduccion, dado que en el plano del ARN el codon AUG es dos a tres veces mas efectivo que, por ejemplo, los codones GUG y UUG (Khudyakov et al., FEBS Letters 232(2): 369-71 (1988); Reddy et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17): 5656-60 (1985)). Tambien el entorno de la secuencia del codon de iniciacion puede optimizarse, dado que se

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describen efectos cooperantes entre el codon de iniciacion y las regiones flanqueantes (Stenstrom et al., Gene 273(2): 259-65 (2001); Hui et al., EMBO Journal 3(3): 623-9 (1984)).

Instrucciones con respecto al trato con ADN, digestion y ligamiento de ADN, transformacion y seleccion de transformantes se encuentran, entre otros, en el libro de texto conocido de Sambrook et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edicion (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

En una forma de realizacion preferida se emplean conforme a la invencion microorganismos en los que adicionalmente otros genes de la via de biosmtesis del L-aminoacido o del a-cetoacido deseado se presentan de manera reforzada, en particular sobre-expresados.

En relacion con la preparacion de L-valina pueden sobre-expresarse adicionalmente, de preferencia, uno o varios de los genes o bien polinucleotidos que codifican las enzimas de la biosmtesis de L-valina, elegidos del grupo:

a) Polinucleotido (gen ilvC) que codifica una isomerorreductasa (IlvC, EC N°: 1.1.1.86),

b) Polinucleotido (gen ilvD) que codifica una dihidroxi-acido deshidratasa (IlvD, EC N°: 4.2.1.9),

c) Polinucleotido (gen ilvE) que codifica una transaminasa (IlvE, EC N°: 2.6.1.42),

d) Polinucleotido (gen ilvA) que codifica una treonindeshidratasa (IlvA, EC N°: 4.3.1.19),

e) Polinucleotido (gen hom) que codifica una homoserindeshidrogenasa (Hom, EC-N°: 1.2.1.11),

f) Polinucleotido (gen thrB) que codifica una homoserinaquinasa (ThrB, EC-N°: 2.7.1.39),

g) Polinucleotido (gen thrC) que codifica una treoninasintasa (ThrC, EC-N°: 4.2.3.1),

h) Polinucleotido (gen leuA) que codifica una isopropilmalatosintasa (LeuA, EC-N°: 2.3.3.13),

i) Polinucleotido (gen LeuB) que codifica una isopropilmalatodeshidrogenasa (LeuB, EC-N°: 1.1.1.85),

j) Polinucleotido (gen LeuC) que codifica la subunidad grande de una isopropilmalatoisomerasa (LeuC, EC- N°: 4.2.1.33)

k) Polinucleotido (gen LeuD) que codifica la subunidad pequena de una isopropilmalatoisomerasa (LeuD, EC- N°: 4.2.1.33),

prefiriendose particularmente los genes hom, ilvA, ilvC, ilvD e ilvE para valina.

En una forma de realizacion preferida se emplean microorganismos en los que las vfas metabolicas estan al menos en parte debilitadas, que reducen la formacion de L-valina.

Dado que se prefiere la produccion de valina, pueden estar debilitadas las vfas metabolicas para isoleucina (para la formacion del precursor acido alfa-cetobutrnco: ilvA, thrB, thrC, hom) y/o para leucina (leuA, leuB, LeuCD).

El termino “debilitamiento” describe a este respecto la reduccion o desconexion de la actividad intracelular de una o varias enzimas (protemas) en una bacteria que son codificadas por el ADN correspondiente utilizando, por ejemplo, un promotor debil, utilizando un gen o bien alelo que codifica una enzima correspondiente con una baja actividad o bien que inactiva el gen o la enzima (protema) correspondiente y eventualmente combinando estas medidas. El debilitamiento completo o bien el parcial de distintos genes diana puede alcanzarse, p. ej., mediante una delecion completa o parcial de los genes o bien mediante la incorporacion de mutaciones puntuales en el gen estructural o bien en la region del promotor o en el lugar de union al ribosoma. Otro metodo para la reduccion espedfica de la expresion genica es la tecnica anti-sentido, llevando a las celulas diana oligodesoxinucleotidos cortos o vectores para la smtesis de ARN anti-sentido mas largo. El ARN anti-sentido puede unirse ailt a segmentos complementarios de ARNms espedficos y reducir su estabilidad o bloquear la capacidad de traduccion. Un ejemplo de ello lo encuentra el experto en la materia en Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology oct. 2000; 66 (10) : 4366 - 4371). La tecnica anti-sentido que se acaba de describir puede tener lugar tambien mediante el uso del operador/promotor conforme a la invencion, clonando a este en una orientacion “anti-sentido” detras del gen diana.

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Despues de la adicion del inductor propionato, se induce la formacion de un ARNm de la cadena contraria del gen diana a debilitar. Mediante la adicion de este ARNm anti-sentido al ARNm del gen diana se reduce la expresion del gen diana.

La expresion o sobre-expresion regulada de los genes ilvBN o bien la produccion de L-valina se lleva a cabo en microorganismos del genero Corynebacterium. Dentro del genero Corynebacterium se prefieren cepas que se basan en las siguientes especies: Corynebacterium efficiens, estando depositada la cepa tipo como DSM44549, Corynebacterium glutamicum, estando depositada la cepa tipo como ATCC13032, y Corynebacterium ammoniagenes, estando depositada la cepa tipo como ATCC6871. Se prefiere muy particularmente la especie Corynebacterium glutamicum.

Algunos representantes de la especie Corynebacterium glutamicum son conocidos en el estado de la tecnica tambien bajo otras denominaciones. A ellas pertenecen, por ejemplo: cepa ATCC13870 que se denomino Corynebacterium acetoacidophilum, la cepa DSM20137 que se denomino Corynebacterium lilium, la cepa ATCC17965 que se denomino Corynebacterium melassecola, la cepa ATCC14067 que se denomino Brevibacterium flavum, la cepa ATCC13869 que se denomino Brevibacterium lactofermentum y la cepa ATCC14020 que se denomino Brevibacterium divaricatum.

La expresion “Micrococcus glutamicus” para Corynebacterium glutamicum era asimismo habitual. Algunos representantes de la especie Corynebacterium efficiens se denominaron en el estado de la tecnica tambien Corynebacterium thermoaminogenes tal como, por ejemplo, la cepa FERM BP-1539.

Los microorganismos o bien cepas (cepas de partida) empleados para las medidas poseen preferiblemente ya la capacidad de precipitar L-valina al medio nutricio circundante y de acumularla alli. Para ello, en lo que sigue se utiliza el termino “producir”. En particular, las cepas empleadas conforme a la invencion poseen preferiblemente la capacidad de concentrarse o bien acumularse despues de la induccion > (al menos) 0,5 g/l*h, preferiblemente al menos 1,0 o 2,0 g/l*h de L-valina en la celula o en el medio nutricio. En el caso de las cepas de partida se trata preferiblemente de cepas que se prepararon mediante mutagenesis y seleccion, mediante tecnicas de ADN recombinantes o mediante una combinacion de ambos metodos.

Es comprensible para el experto en la materia que se puede acceder a un microorganismo adecuado para las medidas de la invencion tambien empleando en una cepa salvaje tal como, por ejemplo, en la cepa tipo de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 o en la cepa ATCC14067, primeramente un operador a utilizar conforme a la invencion para la expresion regulada de los genes deseados y, a continuacion, provocar mediante otras medidas geneticas descritas en el estado de la tecnica que el microorganismo produzca L-valina.

Representantes conocidos de cepas de bacterias corineformes productoras o bien segregantes de L-valina son, por ejemplo: Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 (descrita en el documento US 5.188.948); Brevibacterium lactofermentum FERM BP-3007 (descrita en el documento US 5.521.074); Corynebacterium glutamicum FERM BP- 3006 (descrita en el documento US 5.521.074); y Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764 (descrita en el documento US 5.188.948).

Microorganismos productores de L-valina poseen tipicamente una acetatolactato-sintasa resistente a la retroalimentacion o bien desensibilizada (AHAs, EC 4.1.3.18). Esta representa la primera enzima de las vfas metabolicas paralelas para la smtesis de isoleucina, valina, y leucina (Umbarger, H. E. 1987. Biosynthesis of the branched-chain amino acids, pags. 352-367. En F. C. Neidhardt, J. L. Ingraham, K. B. Low, B. Magasanik, M. Schaechter y H.E. Umbarger (comp.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology, Washington, D.C.). La holoenzima se compone siempre de 2 grandes subunidades y 2 pequenas subunidades. La subunidad AHAS grande forma el dominio catalttico y es codificada por ilvB, la subunidad pequena, que funciona como dominio regulador, es codificada por ilvN. Por acetolactato sintasas resistentes a la retroalimentacion se entienden acetolactato sintasas que en comparacion con la forma salvaje (tipo salvaje) presentan una menor sensibilidad con respecto a la inhibicion mediante los aminoacidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina o bien mezclas de estos. En el caso de las acetolactato-sintasas de la especie Corynebacterium glutamicum, las cepas ATCC13032, ATCC14067 (tambien conocida como Brevibacterium flavum) o ATCC13869 (tambien conocida como Brevibacterium lactofermentum) es el tipo salvaje adecuado.

Los genes ilvBN que codifican acetolactato-sintasa en Corynebacterium glutamicum se describen, por ejemplo, por Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology 175(17): 5595-603 (1993)) o en el documento EP1108790. El numero de acceso L09232 (GenBank, NCBI) representa la secuencia de los genes.

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Variantes enzimaticas de la AHAS, que ya no se someten a la inhibicion de retroalimentacion por parte de los aminoacidos de cadena ramificada (leucina, valina, isoleucina) se describen, por ejemplo, en Mendel et al. (Journal of Molecular Biology 325, 275-284 (2003)), Elisakova et al. (Applied and Environmental Microbiology 71, 207-213 (2005)), Wada et al. (Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 72 (11), 2959-2965, (2008)) y en el documento EP1491634. Se prefieren variantes de una acetolactato-sintasa resistente a la retroalimentacion que porten uno o varios de los siguientes intercambios de aminoacidos en la subunidad pequena codificada por ilvN, elegidos del grupo: en la posicion 20 de la secuencia de aminoacidos, acido L-aspartico en lugar de glicina, en la posicion 21 de la secuencia de aminoacidos, acido L-aspartico en lugar de L-isoleucina, en la posicion 22 de la secuencia de aminoacidos, L-fenilalanina en lugar de L-isoleucina, en la posicion 42 de cada uno de los aminoacidos proteinogenos, exceptuada L-alanina, preferiblemente L-valina, L-isoleucina y L-leucina, de manera particularmente preferida L-valina, y eventualmente en la posicion 47, L-leucina en lugar de L-histidina (descrita en el documento DE102011118019 A1).

La presente invencion proporciona un microorganismo que produce L-valina, posibilitando o bien presentando el microorganismo, mediante el uso del operador a emplear conforme a la invencion, una expresion regulada de los genes ilvBN que codifican la acetolactato-sintasa.

Ademas, la presente invencion proporciona un procedimiento para la preparacion fermentativa de L-valina, que comprende las etapas:

a) cultivo de un microorganismo del genero Corynebacterium de acuerdo con la invencion en un medio adecuado, obteniendose un caldo de fermentacion, y

b) acumulacion de L-valina en el caldo de fermentacion de a) y/o en las celulas del microorganismo.

En este caso se prefiere que a partir del caldo de fermentacion que contiene L-valina se obtenga L-valina o un producto lfquido o solido que contenga L-valina.

Los microorganismos producidos pueden cultivarse de forma continua - tal como, por ejemplo, se describe en el documento WO 05/021772 - o de forma discontinua en un procedimiento en tandas (cultivo por lotes o bien procedimiento por lotes) o en el procedimiento alimentado discontinuo (procedimiento de alimentacion) o alimentado discontinuo repetido (procedimiento de alimentacion repetitivo) con el fin de la produccion de L-valina. Una recopilacion de tipo general sobre metodos de cultivo conocidos esta disponible en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, (1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo o bien el medio de fermentacion a utilizar debe satisfacer de manera adecuada los requisitos de las cepas respectivas. Descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos estan contenidas en el libro de texto “Manual of Methods for General Bacteriology” de American Society for Bacteriology (Washington D.C., EE.UU., 1981). Las expresiones medio de cultivo y medio de fermentacion o bien el termino medio son intercambiables mutuamente.

Como fuente de carbono pueden utilizarse azucares e hidratos de carbono tales como, p. ej., glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, disoluciones con contenido en sacarosa procedentes del tratamiento de la remolacha azucarera o de la cana de azucar, almidon, hidrolizado de almidon y celulosa, aceites y grasas tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, acidos grasos tales como, por ejemplo, acido palmttico, acido estearico y acido linoleico, alcoholes tales como, por ejemplo, glicerol, metanol y etanol, y acidos organicos tales como, por ejemplo, acido acetico o acido lactico.

Como fuente de nitrogeno pueden utilizarse compuestos nitrogenados organicos tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de maceracion de mafz, harina de soja y urea o compuestos inorganicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrogeno pueden utilizarse por separado o en forma de mezcla.

Como fuente de fosforo pueden utilizarse acido fosforico, fosfato de amonio, dihidrogeno-fosfato de potasio o hidrogeno-fosfato de dipotasio, o las correspondientes sales con contenido en sodio.

El medio de cultivo debe contener, ademas, sales, por ejemplo en forma de cloruros o sulfatos de metales tales como, por ejemplo, sodio, potasio, magnesio, calcio y hierro tales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarios para el crecimiento. Finalmente, pueden emplearse sustancias de crecimiento

esenciales tales como aminoacidos, por ejemplo homoserina, y vitaminas, por ejemplo tiamina, biotina o acido pantotenico, adicionalmente a las sustancias arriba mencionadas.

Propionato se anade al medio preferiblemente en forma de sal, pero tambien puede anadirse en forma de acido propionico. Como sales del acido propionico entran en consideracion propionato de magnesio, propionato de sodio, 5 propionato de calcio, propionato de amonio, propionato de potasio. En el medio, el propionato se presenta en forma de acido libre o bien en forma de anion propionato.

Las sustancias de partida mencionadas pueden alimentarse al cultivo en forma de una tanda unica o alimentarse de manera adecuada durante el cultivo.

Para el control del pH del cultivo se anaden de manera adecuada compuestos de caracter basico tales como 10 hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, amomaco, hidroxido de amonio o bien agua amoniacal, o compuestos de caracter acido tales como acido fosforico o acido sulfurico. El pH se ajusta, por lo general, a un valor de 6,0 a 8,5, preferiblemente de 6,5 a 8. Para el control de la formacion de espuma pueden emplearse agentes antiespumantes tales como, por ejemplo, esteres poliglicolicos de acidos grasos. Para mantener la estabilidad de plasmidos pueden anadirse al medio sustancias adecuadas, de accion selectiva, tales como, por ejemplo, antibioticos. La fermentacion 15 se lleva a cabo preferiblemente en condiciones aerobias. Con el fin de mantener esta, se incorporan en el cultivo oxfgeno o mezclas gaseosas con contenido en oxfgeno tales como, por ejemplo, aire. Es asimismo posible el uso de lfquidos que estan enriquecidos con peroxido de hidrogeno. La fermentacion bajo condiciones limitantes de oxfgeno es otra forma de realizacion particular conforme a la invencion. Eventualmente, la fermentacion se realiza a sobrepresion, por ejemplo a una sobrepresion de 0,03 a 0,2 MPa. La temperatura del cultivo se encuentra 20 normalmente en 20°C a 45°C y preferiblemente a 25°C hasta 40°C, de manera particularmente preferida en 30° a 37°C. En el caso de procedimientos en tandas o en tandas alimentadas, el cultivo se prolonga preferiblemente hasta que se haya formado una cantidad suficiente para la medida de la obtencion de L-valina. Este objetivo se alcanza normalmente en el espacio de 10 horas hasta 160 horas. En el caso de procedimientos continuos, son posibles tiempos de cultivo mas prolongados. Mediante la actividad de los microorganismos se produce un enriquecimiento 25 (acumulacion) de L-valina en el medio de fermentacion y/o en las celulas de los microorganismos.

Ejemplos de medios de fermentacion adecuados se encuentran, entre otros, en los documentos de patente 5.770.409, US 5.990.350, US 5.275.940, WO 2007/012078, US 5.827.698, WO 2009/043803, US 5.756.345 o US 7.138.266.

El analisis de L-valina para la determinacion de la concentracion en uno o varios o momentos en el transcurso de la 30 fermentacion puede tener lugar mediante separacion de los L-aminoacidos mediante cromatograffa de intercambio de iones, preferiblemente cromatograffa de intercambio de cationes, con subsiguiente derivatizacion de la post- columna utilizando ninhidrina, tal como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). En lugar de ninhidrina puede emplearse tambien orto-ftadialdehndo para la derivatizacion en la post-columna. Un artfculo sinoptico para la cromatograffa de intercambio de iones se encuentra en Pickering (LC-GC (Magazine of 35 Choromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989)).

Es asimismo posible realizar una derivatizacion en la antecolumna, por ejemplo utilizando orto-ftadialdetndo o isotiocianato de fenilo y separar los derivados de valina resultantes mediante cromatograffa en fase reversa (RP), preferiblemente en forma de la cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC). Un metodo de este tipo se describe, por ejemplo, en Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).

40 La deteccion tiene lugar por fotometna (absorcion, fluorescencia).

Una representacion recopilatoria con respecto al analisis de aminoacidos se encuentra, entre otros, en el libro de texto “Bioanalytik” de Lottspeich y Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania (1998).

Los parametros de separacion eran como sigue: caudal 0,4 ml/min; volumen de inyeccion de la muestra 20 pl; temperatura 35°C; la deteccion tiene lugar por fotometna a 215 nm con UV. El tiempo de retencion del acido 45 propionico ascendio a 30,258 min. El intervalo medible oscilaba entre 0,09 y 7,514 g/l.

El rendimiento de los procedimientos o bien procesos de fermentacion conformes a la invencion en relacion con uno o varios de los parametros elegidos del grupo de la concentracion (compuesto formado por volumen), del rendimiento (compuesto formado por fuente de carbono consumida), de la formacion (compuesto formado por volumen y tiempo) y de la formacion espedfica (compuesto formado por masa celular en seco o bien biomasa en 50 seco y tiempo o compuesto formado por protema celular y tiempo) o tambien otros parametros del proceso y

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combinaciones de los mismos esta, conforme a la invencion, incrementada preferiblemente en al menos 0,5%, al menos 1%, al menos 1,5% o al menos 2% en comparacion con procedimientos o bien procesos de fermentacion con microorganismos en los que no se presenta la casete de expresion. Esto se ha de considerar como muy valioso en el marco de un proceso a gran escala.

Mediante las medidas de la fermentacion se obtiene un caldo de fermentacion que contiene L-valina.

A continuacion, tiene lugar la provision o bien preparacion u obtencion de un producto con contenido en L-valina en forma lfquida o solida.

Por un caldo de fermentacion se entiende un medio de fermentacion o bien medio nutricio en el que un microorganismo fue cultivado durante un tiempo determinado y a una determinada temperatura. El medio de fermentacion o bien los medios empleados durante la fermentacion contiene/contienen todas las sustancias o bien componentes que garantizan una produccion del compuesto deseado y, tfpicamente, la multiplicacion o bien viabilidad.

A la conclusion de la fermentacion, el caldo de fermentacion resultante contiene de manera correspondiente

a) la biomasa resultante como consecuencia de la multiplicacion de las celulas del microorganismo (masa celular) del microorganismo,

b) la L-valina formada en el transcurso de la fermentacion,

c) los productos secundarios organicos eventualmente formados en el transcurso de la fermentacion y

d) los componentes no consumidos por la fermentacion del medio de fermentacion empleado o bien de las sustancias de partida tales como, por ejemplo, vitaminas tales como biotina, o sales tales como sulfato de magnesio.

A los productos secundarios organicos pertenecen sustancias que son generadas por los microorganismos empleados en la fermentacion junto al compuesto deseado respectivo y eventualmente son segregadas.

El caldo de fermentacion se retira del recipiente de cultivo o bien del recipiente de fermentacion, eventualmente se acumula y se utiliza para proporcionar un producto con contenido en L-valina en forma Uquida o solida. Para ello se utiliza tambien la expresion “obtencion del producto con contenido en productos qrnmicos finos”. En el caso mas sencillo, el caldo de fermentacion propiamente dicho con contenido en productos qrnmicos finos retirado del recipiente de fermentacion representa el producto obtenido.

Mediante una o varias de las medidas elegidas del grupo

a) separacion del agua de parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o casi completa (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%),

b) separacion de la biomasa de parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o casi completa (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%), siendo esta habitualmente inactivada antes de la separacion,

c) separacion de parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o casi completa (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%, > 99,3%, > 99,7%) de los productos secundarios organicos formados en el transcurso

de la fermentacion y

d) separacion de parcial (> 0%) a completa (100%) o casi completa (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%, > 99,3%, > 99,7%) de los componentes no consumidos por la fermentacion del medio de

fermentacion empleado o bien de las sustancias de partida,

a partir del caldo de fermentacion se obtiene una concentracion o bien purificacion de la L-valina. De este modo se afslan productos que presentan un contenido deseado del compuesto.

La separacion de parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o casi completa (> 80% a < 100%) del agua (medida a)) se designa tambien como secado.

En una variante del procedimiento, mediante una separacion completa o casi completa del agua, de la biomasa, de los productos secundarios organicos y de los componentes no consumidos del medio de fermentacion empleado se accede a formas de producto de la L-valina puras ((> 80% en peso, > 90% en peso) o muy puras (> 95% en peso, > 97% en peso, > 99% en peso). Para las medidas conforme a a), b), c) o d) estan disponibles en el estado de la 5 tecnica un monton de instrucciones tecnicas.

En el caso de procedimientos para la preparacion de L-valina utilizando bacterias del genero Corynebacterium se prefieren aquellos procedimientos en los que se obtienen productos que no contienen componentes del caldo de fermentacion. Estos se utilizan, en particular, en la medicina humana, en la industria farmaceutica y en la industria alimentaria.

10 El procedimiento de acuerdo con la invencion sirve para la preparacion fermentativa de L-valina.

Objeto de la invencion es, finalmente, el uso del microorganismo de acuerdo con la invencion para la preparacion fermentativa de L-valina.

15

20

La presente invencion se explica a continuacion con mayor detalle con ayuda de ejemplos de realizacion.

Ejemplo 1: (No de acuerdo con la invencion)

Clonacion de la construccion de intercambio pK18mobsacB PprpD2-ilvB

Partiendo de la secuencia del genoma de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 se sintetizo un fragmento de ADN de un tamano de 1390 pb de la razon social Life Technologies GmbH (Darmstadt, Alemania). (Seq ID NO: 5), que se compone de los siguientes componentes:

• region de ADN homologa aguas arriba de ilvB

• promotor PprpD2 de C. glutamicum ATCC14067

• lugar de union al ribosoma del gen gap de C. glutamicum ATCC14067

• region homologa al gen ilvB que, en lugar del codon de iniciacion GTG porta un codon de iniciacion ATG.

El fragmento se clono a traves de los lugares de corte EcoRI y HindIII introducidos en posicion terminal mediante la 25 disociacion respectiva con las dos enzimas de restriccion mencionadas y subsiguiente ligamiento en el vector pK18mobsacB disociado analogamente con EcoRI y HindIII. El plasmido tiene la denominacion pK18mobsacB_PprpD2-ilvB. Permite la preparacion de un mutante en el que se suprime el promotor nativo del gen ilvB y se reemplaza por el promotor PprpD2 inducible. En este caso, se reemplaza ademas el codon de iniciacion nativo (GTG) por el codon de iniciacion ATG preferido por el ribosoma.

30 Ejemplo 2 (No de acuerdo con la invencion)

Formacion de la construccion de intercambio pK18mobsacB ilvN (M13)

Partiendo de la secuencia del genoma de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 se sintetizo un fragmento de ADN de 1421 pb de tamano de la razon social Life Technologies GmbH (Darmstadt, Alemania) (Seq ID NO: 14), que comprende una parte del gen ilvB, la region intergenica entre el gen ilvB y el gen ilvN, asf como una parte del gen 35 ilvN. En este caso, la secuencia nativa “GGAATCATT” en el gen ilvN (+58 a +66 pb aguas abajo del inicio del gen de ilvN, estando definido el inicio del gen como +1), se modifica en “GATCACTTT”. Con ello, se modifica la secuencia de aminoacidos de la protema ilvN en las posiciones 20, 21 y 22 de Gly (20), Ile (21), Ile(22) en Asp (20), Asp (21), Phe (22).

El fragmento se ligo a traves de los lugares de corte EcoRI y HindIII introducidos en posicion terminal mediante 40 disociacion respectiva con las dos enzimas de restriccion mencionadas y subsiguiente ligamiento en el vector pK18mobsacB disociado analogamente con EcoRI y HindIII. El plasmido tiene la denominacion pK18mobsacB_ilvN (M13). Permite la preparacion de un mutante en el que la secuencia del gen nativa “GGAATCATT” (+58 a +66 pb aguas abajo del inicio del gen de ilvN, estando definido el inicio del gen como +1), se modifica en “GATCACTTT”.

Ejemplo 3: (No de acuerdo con la invencion)

Construccion de los mutantes PprpD2-ilvBN de C. glutamicum ATCC14067, ilvN (M13) PprpD2-ilvBN de C. glutamicum ATCC14067 y PprpD2-ilvBN de C. glutamicum VPS.

El vector pK18mobsacB_PprpD2-ilvB mencionado en el Ejemplo 1 se transfirio mediante electroporacion segun un

5 protocolo de Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989) en la cepa Corynebacterium glutamicum

ATCC14067 y en las cepas de produccion de valina Corynebacterim glutamicum ATCC14067_ilvN (M13) (vease el Ejemplo 4) y la cepa de produccion de valina de Corynebacterium glutamicum C. glutamicum VPS. El vector pK18mobsacB o bien pK18mobsacB_PprpD2-ilvB no puede replicarse autonomamente en C. glutamicum ATCC14067, C. glutamicum ATCC14067_ilvN (M13) ni C. glutamicum VPS y solo se conserva entonces en la celula 10 cuando se haya integrado en el cromosoma como consecuencia de un suceso de recombinacion. La seleccion de clones con pK18mobsacB_PprpD2_ilvB integrado tiene lugar mediante sembrado de la tanda de conjugacion sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), que ha sido complementado con 15 mg/l de canamicina y 50 mg/ml de acido nalidixinico. Los clones desarrollados se frotan sobre placas de agar LB con 25 mg/l de canamicina y se incuban durante 16 horas a 33°C. Para la

15 seleccion de mutantes, en los que, como consecuencia de un segundo suceso de recombinacion, ha tenido lugar la

escision del plasmido, los clones se cultivan durante 20 horas de manera no selectiva en medio lfquido LB, a continuacion se extienden sobre agar LB con sacarosa al 10% y se cultivan durante 24 horas.

El plasmido pK18mobsacB_PprpD2-ilvB contiene, al igual que el plasmido de partida pK18mobsacB, junto al gen de resistencia a canamicina, una copia del gen sacB que codifica la levana-sacarasa de Bacillus subtilis. La expresion 20 inducible por sacarosa conduce a la formacion de la levana-sacarasa que cataliza la smtesis del producto levana toxico para C. glutamicum. Sobre agar LB con sacarosa crecen, por lo tanto, solo aquellos clones en los que se ha escindido de nuevo el pK18mobsacB_PprpD2-ilvB integrado. En la escision, junto con el plasmido puede escindirse la copia de tipo salvaje completa del gen ilvB, incluida la region de promotor de tipo salvaje, o la copia recombinante del gen ilvB con el promotor PprpD2.

25 Aproximadamente 40 a 50 colonias se examinaron en cuanto al fenotipo “crecimiento en presencia de sacarosa” y “no crecimiento en presencia de canamicina”. Con el fin de demostrar que el alelo PprpD2-ilvB recombinante ha permanecido en el cromosoma, se examinaron aproximadamente 20 colonias que presentan el fenotipo “crecimiento en presencia de sacarosa” y “no crecimiento en presencia de canamicina”, segun el metodo de pCr estandar de Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) con ayuda de la reaccion 30 en cadena de la polimerasa. En este caso, a partir del ADN cromosomico de las colonias se amplifico un fragmento de ADN que porta las regiones modificadas del alelo PprpD2-ilvB recombinante. Se eligieron los siguientes oligonucleotidos de cebadores para la PCR de deteccion:

Cebador de ensayo 1 (SEQ ID NO: 6)

5' -AAA GCC TGC ATC GCG GAG AC-3'

35 Cebador de ensayo 2 (SEQ ID NO: 7)

5' -TGG TGA TGC CGC GGA TAT CG-3'

Los cebadores posibilitan, en el caso de clones con un locus PprpD2-ilvBN recombinante, la amplificacion de un fragmento de aDn de aproximadamente 880 pb de tamano. En el caso de clones con un locus PilvBN-ilvBN de tipo salvaje, se amplifican fragmentos de ADN con un tamano de aprox. 1136 pb.

40 Los fragmentos de ADN amplificados son identificados mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. Con ello, pudo demostrarse que las cepas portan en el cromosoma un alelo PprpD2-ilvBN recombinante modificado. Las cepas se designaron Corynebacterium glutamicum ATCC14067_PprpD2-ilvBN, ATCC14067_ilvN (M13)_PprpD2- ilvBN y VPS_PprpD2-ilvBN.

Ejemplo 4 : (No de acuerdo con la invencion)

45 Construccion de la cepa C. glutamicum ATCC14067 ilvN (M13)

El vector pK18mobsacB_ilvN (M13) mencionado en el Ejemplo 2 se transfirio a la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC14067 mediante electroporacion, analogamente al metodo descrito en el Ejemplo 3. La seleccion de los clones tuvo lugar mediante las tecnicas de cultivo mencionadas en el Ejemplo 3. La deteccion de clones positivos tuvo lugar sobre la base de ADN cromosomico que habfa sido aislado de 20 clones, mediante amplificacion de un producto de 5 la PCR de 947 pb de longitud mediante reaccion en cadena de la polimerasa con los cebadores de ensayo 3 y 4.

Cebador de ensayo 3 (SEQ ID NO: 15)

5'- CCC AGT AGT CAT CGA CTT C -3'

Cebador de ensayo 4 (SEQ ID NO: 16)

5'- CAG CGT CAG CAT CAT AAA GC -3'

10 y subsiguiente secuenciacion del producto de la PCR.

Ejemplo 5:

Test de rendimiento con Corynebacterium glutamicum ATCC14067 PprpD2-ilvBN para la preparacion de L-valina

Para examinar su capacidad de producir L-valina se pre-cultivaron durante 16 h a 33°C cinco clones de la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC14067_PprpD2-ilvBN y como referencia la cepa Corynebacterium glutamicum 15 ATCC14067, en cada caso en 10 ml de medio de ensayo. Para el ensayo de produccion, con el cultivo previo

obtenido se inocularon en cada caso 10 ml de medio de ensayo de manera que la DO600 de inicio (densidad optica a 600 nm) ascendio a 0,1. Cada uno de los clones se examino en tres matraces con agitacion, de modo que la cepa de ejemplo esta representada por en total quince matraces de agitacion.

El medio de ensayo era identico al medio CgXIl descrito por Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 20 5593-5603), pero contema adicionalmente 7,5 g/l de extracto de levadura (Difco (Becton Dickinson GmbH),

Heidelberg). La composicion del medio de ensayo esta recopilada en la siguiente Tabla 1. El medio de ensayo para la induccion de la smtesis de valina contema adicionalmente propionato en una concentracion de 0,6 g/l (referido al acido libre).

Tabla 1

Componente

Contenido por l

(NH4)2SO4

20 g

Urea

5 g

KH2PO4

1 g

K2HPO4

1 g

MgSO4 x 7 H2O

0,25 g

Acido 3-morfolinopropanoico (MOPS)

42 g

CaCl2

0,01 g

FeSO4 x 7H2O

0,01 g

MnSO4 x H2O

0,01 g

ZnSO4 x 7 H2O

0,001 g

CuSO4

0,0002 g

NiChx 6H2O

0,00002 g

Biotina

0,0002 g

Acido protocatequico

0,03 g

Dextrosa

40 g

Extracto de levadura

7,5 g/l

pH (con NaOH)

7

El cultivo tuvo lugar a 33°C y 200 rpm en matraces con agitacion de 100 ml. La desviacion del agitador era de 5 cm. Despues de 24 y 48 horas se tomaron muestras de los cultivos y se determino la densidad optica, el contenido en dextrosa y el contenido en L-valina y las celulas se separaron brevemente por centrifugacion (centnfuga de mesa 5 tipo 5415D (Eppendorf) a 13000 rpm, 10 min, temperature ambiente).

La determinacion de la densidad optica tuvo lugar a una longitud de onda de 660 nm con un fotometro de placas de microtitulacion GENios (Tecan, Reading, Reino Unido). Las muestras se diluyeron con agua desmineralizada antes de la medicion en la relacion 1:100.

La determinacion de la dextrosa tuvo lugar con un ensayo enzimatico acoplado (hexoquinasa/glucosa-6- 10 fosfatodeshidrogenasa) a traves de la formacion de NADH.

La determinacion cuantitativa de las concentraciones de aminoacidos extracelulares a partir del residuo del cultivo tuvo lugar mediante HPLC de fase reversa (Lindroth et al., Analytical chemistry (1979) 51: 1167-1174). Se utilizo un aparato de HPLC de la serie HP1100 (Hewlett-Packard, Waldbronn, Alemania) con detector de fluorescencia conectado (G1321A); el control del sistema y la evaluacion de los datos tuvo lugar con una estacion HP-Chem 15 (Hewlett-Packard). 1 pL de la disolucion de aminoacidos a analizar se mezclo con 20 pL de reactivo acabado de orto-ftalaldehndo/2-mercaptoetanol (Pierce Europe BV, Oud-Beijerland, Holanda) en una derivatizacion de antecolumna automatica. Los isoindoles tio-sustituidos fluorescentes que resultan en este caso (Jones et al., Journal of Chromatography (1983) 266: 471-482) se separaron a traves de una antecolumna combinada (40 x 4 mm Hypersil ODS 5) y una columna principal (Hypersil ODS 5, ambas columnas de la razon social CS-Chromatographie Service 20 GmbH, Langerwehe, Alemania) con un programa de gradiente con una fase no polar creciente (metanol). El eluyente polar era acetato de sodio (0,1 M; pH 7,2); el caudal ascendio a 0,8 mL por minuto. La deteccion de fluorescencia de los aminoacidos derivatizados tuvo lugar a una longitud de onda de excitacion de 230 nm y una longitud de onda de emision de 450 nm. Las concentraciones de valina se calcularon mediante una comparacion con un patron externo.

Para el calculo del rendimiento, la cantidad de la L-valina formada se dividio por la cantidad de dextrosa consumida.

Los resultados estan representados en la Tabla 2 y demuestran que la cepa de ejemplo Corynebacterium glutamicum ATCC14067_PprpD2-ilvBN segrega de manera significativa en el medio, mientras que sin propionato no se diferencia de la cepa control Corynebacterium glutamicum ATCC14067 que bajo ninguna condicion produce valina significativa.

5 Tabla 2: Formacion de L-valina despues de incubacion durante 24 horas sin acido propionico en el medio (Tabla 2A) o bien con 0,6 g/l de acido propionico en el medio (Tabla 2B). Abreviaturas: *: ATCCl4067_PprpD2-ilvBN, Stabw: desviacion estandar.

Tabla 2A: Resultados sin acido propionico

Tiempo

24 horas

Cepa

Valina g/l (± Stabw) Rendimiento g/g (± Stabw) DO (± Stabw)

*_1

< 0,2 0 26,2 ± 0,8

* 2

< 0,2 0 26,2 ± 1,7

*_3

< 0,2 0 26, 9 ± 2,2

*_4

< 0,2 0 27,0 ± 0,5

*_5

< 0,2 0 26,3 ± 1,8

ATCC 14067

< 0,2 0 26, 6 ± 0,4

10 Tabla 2B: Resultados con acido propionico

Tiempo

24 horas

Cepa

Valina g/l (± Stabw) Rendimiento g/g (± Stabw) DO (± Stabw)

*_1

3,04 ± 0,13 0,07 ± 0,004 24,6 ± 0,3

* 2

3,06 ± 0,10 0,07 ± 0,003 27,5 ± 0,8

*_3

2,78 ± 0,06 0,07 ± 0,001 26,2 ± 0,4

*_4

2,93 ± 0,03 0,07 ± 0,001 27,1 ± 1,4

*_5

2,83 ± 0,04 0,07 ± 0,001 28,1 ± 0,1

ATCC 14067

< 0,2 0 26,2 ± 4,5

Ejemplo 6:

Test de rendimiento con las cepas de produccion de valina de Corynebacterium glutamicum

15 Analogamente al Ejemplo 5 se examinaron en el sistema de matraz con agitacion las cepas Corynebacterium glutamicum ATCCl4o67_ilvN (M13)_PprpD2-ilvBN y Corynebacterium glutamicum VPS_PprpD2-ilvBN.

Para examinar su capacidad de producir L-valina, la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC14067_ilvN (M13)_PprpD2-ilvBN y como referencia la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC14067_ilvN (M13) o bien la cepa Corynebacterium glutamicum VPS_PprpD2-ilvBN y como referencia la cepa Corynebacterium glutamicum VPS se 20 pre-cultivaron durante 16 h a 33°C en cada caso en 10 ml de medio de ensayo (Tabla 3). Para el ensayo de produccion, con el cultivo previo obtenido se inocularon en cada caso 10 ml del medio de ensayo, de modo que la DO600 (densidad optica a 600 nm) de inicio ascendio a 0,1. Cada uno de los clones se examino en tres matraces con agitacion, de modo que la cepa de ejemplo esta representada en total por quince matraces con agitacion.

Tabla 3: Como medio de ensayo se utilizo SK1039.

Concentracion (g/l)

Glucosa

40,0

(NH4)2SO4 (TDM al 100%)

8,5

MgSO4*7H2O

0,85

KH2PO4

0,2

Extracto de levadura

1,14

CSL

10,0

MOPS

20,0

D-(+)-Biotina al 2%

0,00425

Tiamina HCl

0,00119

Sulfato de Fe 7H2O

0,003

MnSO4 H2O

0,003

CaCo3

10,00

5

El medio de ensayo para la induccion de la smtesis de valina contema adicionalmente propionato en una concentracion de 0,6 g/l (referido al acido libre).

Las condiciones de cultivo, la determinacion de la biomasa, de la dextrosa y de la concentracion de valina tuvieron lugar analogamente a como se describe en el Ejemplo 5.

10 Los resultados estan representados en la Tabla 4 y demuestran que las cepas de produccion de valina, Corynebacterium glutamicum ATTCC14967_ilvN (M13)_PprpD2-ilvBN y VPS_PprpD1-ilvBN poseen, en presencia de propionato en el medio, un mayor rendimiento espedfico en valina en relacion con la fuente de carbono empleada que las respectivas cepas de partida no modificadas Corynebacterium glutamicum ATCC14067_ilvN (M13) o bien Corynebacterium glutamicum VPS.

15 Tabla 4: Rendimiento de L-valina despues de incubacion durante 24 horas sin acido propionico en el medio (Tabla 4A) o bien con 0,6 g/l de acido propionico en el medio (Tabla 4B); abreviaturas: Stabw = desviacion estandar.

Tabla 4A: Resultados sin acido propionico

Cepa

Rendimiento g/g (± Stabw)

ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN

0,02 ±0,00

ATCC14067_ilvN(M13)

0,35 ± 0,01

VPS_PprpD2-ilvBN

0,02 ± 0,00

VPS

0,40 ± 0,02

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 4B: Resultados con acido propionico

Cepa

Rendimiento g/g (± Stabw)

ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN

0,42 ± 0,02

ATCC14067_ilvN(M13)

0,36 ± 0,01

VPS_PprpD2-ilvBN

0,45 ± 0,02

VPS

0,41 ± 0,01

Ejemplo 7:

Ensayo de estabilidad de valina para las cepas VPS PprpD2-ilvBN y VPS

El ensayo de estabilidad se llevo a cabo con cultivos lfquidos de 10 ml (como en el Ejemplo 6).

Cultivo previo de las cepas VPS y VPS_PprpD2-ilvBN

10 ml de cultivo Uquido en un matraz con agitacion de 100 ml (con deflectores) se inocularon con en cada caso 50 pl de un cultivo permanente de glicerol y se incubaron durante 22 h (33°C, 200 rpm, 5 cm de amplitud).

Se midio la densidad optica de los cultivos, y 1,5 ml del cultivo se mezclaron con glicerol (concentracion final de glicerol 10%) y se congelaron como criocultivo a -80°C en un recipiente con tapa roscada.

Con 50 pl de los cultivos se inoculo en cada caso un nuevo cultivo lfquido de 10 ml, y este se incubo de nuevo durante 22 h a 33°C bajo sacudimiento.

Este proceso se repitio todavfa dos veces, de modo que cada uno de los cultivos de glicerol se cultivo en total en cuatro cultivos lfquidos sucesivos. Cada uno de los cultivos corresponde a aprox. 8 generaciones de celulas. Los cuatro pasajes en los cultivos lfquidos corresponden, por lo tanto, en total a mas de 30 (aprox. 32) generaciones de celulas.

Cultivo previo de las cepas VPS y VPS_PprpD2-1lvBN

De cada uno de los cultivos permanentes o bien criocultivos se inocularon cultivos en matraces con agitacion con en cada caso 10 ml de medio lfquido a una DO de partida de 0,1. Los cultivos se incubaron a continuacion durante 24 h. Cada uno de los cultivos se llevo a cabo en una determinacion doble. Al final de la incubacion (despues de 24 h) se tomaron muestras para el analisis de la densidad optica, del titulo de valina y de la concentracion de azucar residual. Los analisis se llevaron a cabo tal como se describe en el Ejemplo 5.

En el resultado del test de rendimiento (Tabla 5) se demuestra que con cada uno de los pasajes empeora o se reduce el tftulo de valina (indicado en modificacion relativa en porcentaje), la relacion valina/biomasa (indicada en valina/DO) y el rendimiento (g de producto formado/g de sustrato consumido) para la cepa VPS. Esto es una confirmacion de que en la poblacion se establecen mutaciones que son negativas para la formacion del producto y positivas para la formacion de biomasa. La cepa VPS muestra ya despues de dos etapas de cultivo (15,6 generaciones) una cafda de los datos de rendimiento en el cultivo de ensayo (resultados del cultivo principal). Con ello, en un procedimiento en 4 etapas (3 etapas de cultivo + 1 etapa de produccion) sena de esperar un intenso retroceso de los datos de rendimiento (titulo, rendimiento, formacion de producto espedfica para la biomasa). Para la cepa VPS_PprpD2-ilvBN de acuerdo con la invencion no se manifiesta, por el contrario, este efecto negativo, tampoco al recorrer las cuatro etapas de cultivo con mas de 30 generaciones. Al contrario de ello, la formacion de valina espedfica para la biomasa (valina/DO) aumenta incluso ligeramente. Con ello, se simula al menos un procedimiento de produccion en 4 etapas consistente en 3 etapas de cultivo y un cultivo principal o bien se supera incluso el requisito.

Tabla 5: Datos de rendimiento del test de estabilidad (rendimiento de L-valina, formacion de producto espedfico para la biomasa (valina/DO) y modificaciones relativas de la formacion de valina en funcion de las generaciones de celulas adicionales con respecto al control (=0) despues de incubacion durante 24 horas (valores medios).

Resultados del cultivo principal

Cepa

Generaciones adicionales de celulas en el carril de crecimiento en compracion con el control Variacion relativa de la formacion de valina en compracion con el control Valina/Densidad Optica (DO) Rendimiento Valina/Dextrosa Y (P/S) [g/g]

[%] [%]

VPS_PprpD2- ilvBN (= control)

0 0 1,8 54%

VPS PprpD2- ilvBN_1

9 -3 2,1 64%

VPS PprpD2- ilvBN_2

17 6 2,8 60%

VPS PprpD2- ilvBN_3

24 -5 2,3 60%

VPS PprpD2- ilvBN_4

32 3 2,4 63%

VPS (= control)

0 0 2,7 45%

VPS_1

7,7 2 2,9 42%

VPS_2

15,6 -58 2,5 48%

VPS_3

23,4 -78 1,5 44%

VPS_4

31,7 -85 1,0 30%

Figura 1: Mapa del plasmido pK18mobsacB_PprpD2-ilvB

Las abreviaturas y las referencias utilizadas tienen el siguiente significado.

oriV: origen similar a ColE1 de pMB1

10

sacB: el gen sacB que codifica la protema levana sacarosa

RP4mob: sitio de movilizacion RP4

Kan: gen de resistencia a canamicina

PprpD2: promotor inducible por propionato

ilvB: region 5' del gen ilvB

15

Hindlll: punto de corte de la enzima de restriccion Hindlll

EcoRI: punto de corte de la enzima de restriccion EcoRI

5

10

15

20

25

30

35

40

45

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Evonik Industries AG

<120> Proocedimiento optimizado para la preparation de producots qmmicos finos utilizando un promotor inducible por propionato

<130> 201100446 <160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 177 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> repetir_region <222> (22)..(49)

<223> IR1

<220>

<221> repetir_region <222> (77)..(105)

<223>IR2

<400> 1

ctccagcgtc cacgaatatg cccccgcgcg ccgggtgggg agcgaaggga aattggcgtt gaggtggcga ttttgcatgt tttactcaaa attactttgg attacacaac ttttacagtg acctagatcg ctttttaaag aattagcgtg

acccccaagg

60

tggtcacaaa

120

gtgtgca

177

<210>2 <211> 177 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> repetir_region <222> (22)..(49)

<223> IR1

<220>

<221> repetir_region <222> (77)..(105)

<223>IR2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

<400>2

ctccagcgtc caagaatatg cccccgcgcg ccgggtgggg agcgaaggga acccccaagg 60

aattggcgtt gaggtggtga ttttgcatgt tttactcaaa atcactttga tggtcacaaa 120

attacacaac ttttacagtg acctacattg ctttttaaag aattagtgtg gtgtgca 177

<210>3 <211> 177 <212>ADN

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> repetir_region <222> (22)..(49)

<223>IR1

<220>

<221> repetir_region <222> (77)..(105)

<223>IR2

<400> 3

ctccagcgtc caagaatatg cccccgcgcg ccgggtgggg agcgaaggga acccccaagg 60

aattggcgtt gaggtggcga ttttgcatgt tttactcaaa atcactgtga tggtcacaaa 120

attacacaac ttttacagtg acctagatcg ctttttaaag aattagcgtg gtgtgca 177

<210>4 <211> 902 <212>ADN

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> promotor <222> (1)..(177)

<223> PprpD2

<220>

<221> RBS <222> (178)..(206)

<223> hueco RBS

<220>

<221> caracteristica_miscelanea <222> (207)..(209)

<223> codon de iniciacion atg

<220>

<221> gen <222> (207)..(902)

<223>region 5’ de region de codificacion de ilvB

<400> 4

5

10

15

20

25

ctccagcgtc cacgaatatg cccccgcgcg ccgggtgggg agcgaaggga acccccaagg 60

aattggcgtt gaggtggcga ttttgcatgt tttactcaaa attactttgg tggtcacaaa 120

attacacaac ttttacagtg acctagatcg ctttttaaag aattagcgtg gtgtgcatgc 180

atatttatcg cgagaggaga cacaacatga atgtggcagc ttctcaacag cccactcccg 240

ccacggttgc aagccgtggt cgatccgccg cccctgagcg gatgacaggt gcacaggcaa 300

ttgttcgatc gctcgaggag cttaacgccg acatcgtgtt cggtattcct ggtggtgcgg 360

tgctaccggt gtatgacccg ctctattcct ccacaaaggt gcgccacgtc ctggtgcgcc 420

acgagcaggg cgcaggccac gcagcaaccg gctacgcgca ggttactgga cgcgttggcg 480

tctgcattgc aacctctggc ccaggcgcaa ccaacttggt taccccaatc gctgatgcaa 540

acttggactc cgttcccatg gttgccatca ccggccaggt cggaagtggc ctgctgggta 600

ccgatgcttt ccaggaagcc gatatccgcg gcatcaccat gccagtgacc aagcacaact 660

tcatggtcac cgaccccaac gacattccac aggcattggc tgaggcattc cacctcgcga 720

ttactggtcg ccctggccct gttctggtgg atattcctaa ggatgtccaa aacgctgaat 780

tggatttcgt ctggccacca aagatcgacc tgccaggcta ccgcccagtt tctactccgc 840

atgctcgaca gattgagcag gctgtcaaac tgatcggtga agccaaaaag ccagtccttt 900

ac 902

<210>5 <211> 1390 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> caracteristica_miscelanea <222> (494)..(521)

<223>IR1

<220>

<221> caracteristica_miscelanea <222> (549)..(577)

<223>IR2

<220>

<221> RBS <222> (665)..(678)

<223> hueco RBS

<220>

<221> gen <222> (679)..(1380)

<223> region ilvBN 5’

cgaattcgtg

tcgacaacga

gtcaggatga

gcagctgacg

atcgcggaga

gcgaacgcga

ataatacgca

gctacatcaa

tccacgaata

ttgaggtggc

acttttacag

cgcgagagga

gcaagccgtg

tcgctcgagg

gtgtatgacc

ggcgcaggcc

gcaacctctg

tccgttccca

ttccaggaag

accgacccca

cgccctggcc

gtctggccac

cagattgagc

ggcaagcttg

caatcgtgcg

tgccgttgcc

aaaatccggc

caatggttgc

cggcaagcat

gctggttctt

tggccagtcg

aaccggtatc

tgcccccgcg

gattttgcat

tgacctagat

gacacaacat

gtcgatccgc

agcttaacgc

cgctctattc

acgcagcaac

gcccaggcgc

tggttgccat

ccgatatccg

acgacattcc

ctgttctggt

caaagatcga

aggctgtcaa

aattttggtc

ctcaaaacgc

caagaagtcc

cggaatcgca

gaaaaacgcc

agtggtgtcc

gccgatacgt

gacaatccaa

cgccgggtgg

gttttactca

cgctttttaa

gaatgtggca

cgcccctgag

cgacatcgtg

ctccacaaag

cggctacgcg

aaccaacttg

caccggccag

cggcatcacc

acaggcattg

ggatattcct

cctgccaggc

actgatcggt

gcgcgcatgg

acccagtcac

gcaacaatcg

gcgcccgcga

acaatttgcg

gcatcggctg

ggaatcaaaa

ttccacaatg

ggagcgaagg

aaattacttt

agaattagcg

gcttctcaac

cggatgacag

ttcggtattc

gtgcgccacg

caggttactg

gttaccccaa

gtcggaagtg

atgccagtga

gctgaggcat

aaggatgtcc

taccgcccag

gaagccaaaa

tgatctcaat

ccacgccgaa

actgcgcacc

gagagaaacc

cgatataaac

cagactccac

acgccaagac

aatagagcaa

gaacccccaa

ggtggtcaca

tggtgtgcat

agcccactcc

gtgcacaggc

ctggtggtgc

tcctggtgcg

gacgcgttgg

tcgctgatgc

gcctgctggg

ccaagcacaa

tccacctcgc

aaaacgctga

tttctactcc

agccagtcct

gacggtgcct

ttgcttttcc

aaggccaatg

aaaagcctgc

gccaacgcca

tcgccgcttg

caggataatt

atctccagcg

ggaattggcg

aaattacaca

gcatatttat

cgccacggtt

aattgttcga

ggtgctaccg

ccacgagcag

cgtctgcatt

aaacttggac

taccgatgct

cttcatggtc

gattactggt

attggatttc

gcatgctcga

ttacattggc

* 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1390

<210>6 5 <211> 20

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

10 <221> caracteristica_miscelanea

<222> (1)..(20)

<223> cebador de ensayo 1

5

10

15

20

25

30

aaagcctgca tcgcggagac 20

<210>7 <211> 20 <212>ADN

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> caractenstica_miscelanea <222> (1)..(20)

<223> cebador de ensayo 2

<400>7

tggtgatgcc gcggatatcg 20

<210>8 <211 > 3411 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS <222> (500)..(2380)

<223> region codificante ilvB

<220>

<221> CDS <222> (2394)..(2912)

<223> region codificante ilvN

<400> 8

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la preparacion de L-valina mediante fermentacion de microorganismos del genera Corynebacterium que contiene, en forma replicable, un polinucleotido con actividad de operador, cuya secuencia es identica en al menos 85% a la secuencia desde las posiciones 1 a 121 conforme a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, a la que se une el activador PprpR, y a las que estan conectados a continuacion de manera funcional en el extremo 3' un segundo polinucleotido con actividad de promotor, asf como los genes ilvB e ilvN que codifican las subunidades de una acetolactato-sintasa y que regula la transcripcion de los genes ilvBN en funcion de la adicion del activador PprpR, en un medio al que, despues de una primera fase, la fase de crecimiento, que tiene lugar sin inductor, se anade en una segunda fase como inductor propionato o 2-metilcitrato, tras lo cual se sintetiza L-valina, bajo condiciones en las que la L-valina se acumula en el medio y/o en las celulas.
2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que el polinucleotido con actividad de operador comprende un polinucleotido (“IR 1”), cuya secuencia es al menos 90% identica con la secuencia conforme a la posicion 22 hasta la posicion 49 de acuerdo con SEQ ID NO: 1, 2, o 3, asf como un polinucleotido (“IR 2”), cuya secuencia es al menos 90% identica con la secuencia de la posicion 77 a la posicion 105 conforme a SEQ ID NO: 1, 2 o 3.
3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que en el caso del polinucleotido con actividad de operador se trata de un polinucleotido con una secuencia que es al menos 90% identica a la secuencias de las posiciones 1 a 121 conforme a SEQ ID NO: 1, 2 o 3.
4. 4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que en el caso del polinucleotido con actividad de promotor se trata de un polinucleotido con una secuencia que es al menos 90% identica a la secuencia de las posiciones 122 a 206 conforme a SEQ ID NO: 4.
5. 5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que en el caso del gen ilvB se trata de un polinucleotido que codifica un polipeptido, cuya secuencia es al menos 90% identica con la secuencia conforme a SEQ ID NO: 9 y por que en el caso del gen ilvN se trata de un polinucleotido que codifica un polipeptido cuya secuencia es al menos 90% identica a la secuencia conforme a SEQ ID NO: 10.
6. 6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que se emplean microorganismos en los que se presentan de manera reforzada adicionalmente otras enzimas de la via de biosmtesis de L-valina y/o en las que las vfas metabolicas estan al menos debilitadas en parte, que reducen la formacion de L-valina.
7. 7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que las corinebacterias empleadas recorren en la fase de crecimiento al menos 16 generaciones.
8. 8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la fermentacion comprende al menos cuatro etapas, consistentes en matraz con agitacion, fermentador de pre-siembra, fermentador de siembra y fermentador de produccion.
9. 9. Microorganismo que produce L-valina, que contiene en forma replicable una casete de expresion y/o un vector que contiene esta casete de expresion, comprendiendo la casete de expresion los siguientes elementos: un polinucleotido con actividad de operador, cuya secuencia es al menos 85% identica a la secuencia de las posiciones 1 a 121 conforme a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, un promotor dispuesto a continuacion, asf como los genes ilvBN que codifican una acetolactato-sintasa.
10. 10. Microorganismo segun la reivindicacion 9, caracterizado por que el promotor dispuesto a continuacion presenta una secuencia que es al menos 90% identica con la secuencia de las posiciones 122 a 206 conforme a SEQ ID NO: 4.
11. 11. Microorganismo segun la reivindicacion 9 o 10, caracterizado por que se trata de un microorganismo del genero Corynebacterium.
12. 12. Microorganismo segun la reivindicacion 11, caracterizado por que se trata de un microorganismo de la especie Corynebacterium glutamicum.
13. 13. Microorganismo segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la casete de expresion se integro en el cromosoma del microorganismo.
14. 14. Microorganismo segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que adicionalmente se presentan de manera reforzada otras enzimas de la via de biosmtesis de L-valina y/o las vfas de metabolismo que

    5 reducen la formacion de L-valina estan debilitadas al menos en parte.

    Figura 1: Plasmido pK18mobxacB_PprpD2-ilvB

    imagen1