ES2856755T3 - Promotores de Corynebacterium glutamicum - Google Patents

Abstract

Una escalera de promotores que comprende al menos tres secuencias polinucleotídicas promotoras seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 8, en el que dicha escalera de promotores comprende una pluralidad de promotores con niveles de actividad promotora que aumentan de forma incremental.

Description

d e s c r ip c ió n

Promotores de Corynebacterium glutamicum

ANTECEDENTES

Campo

La invención se refiere a promotores nativos que comprenden polinucleótidos aislados de Corynebacterium glutamicum, y a promotores mutantes derivados de los mismos, a células hospedantes y vectores recombinantes que comprenden los promotores, y a métodos para modificar la expresión de genes diana y producir biomoléculas que comprenden cultivar las células hospedantes.

Descripción de la técnica relacionada

Las cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum, desempeñan un papel importante en la producción de biomoléculas tales como aminoácidos, ácidos orgánicos, vitaminas, nucleósidos y nucleótidos, y se están realizando esfuerzos continuos para mejorar los procedimientos de producción. Dichos procedimientos pueden mejorarse con respecto a las medidas relacionadas con la fermentación, tales como, por ejemplo, la agitación y el suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutrientes, tales como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o el procesamiento en la forma del producto, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio iónico, o las características de comportamiento intrínsecas del propio microorganismo.

Las características de comportamiento pueden incluir, por ejemplo, rendimiento, título, productividad, eliminación de subproductos, tolerancia a las desviaciones del procedimiento, temperatura de crecimiento óptima, y tasa de crecimiento. Una forma de mejorar el comportamiento de una cepa microbiana es aumentar la expresión de genes que controlan la producción de un metabolito. El aumento de la expresión de un gen puede aumentar la actividad de una enzima codificada por ese gen. El aumento de la actividad enzimática puede aumentar la velocidad de síntesis de los productos metabólicos elaborados por la ruta a la que pertenece esa enzima. En algunos casos, aumentar la tasa de producción de un metabolito puede desequilibrar otros procesos celulares e inhibir el crecimiento de un cultivo microbiano. A veces, es importante reducir la actividad para mejorar el comportamiento de una cepa. Por ejemplo, redirigir el fundente lejos de los subproductos puede mejorar el rendimiento. En consecuencia, a menudo es necesario un ajuste fino de los niveles de expresión de los diversos componentes simultáneamente dentro de una ruta metabólica.

Los promotores regulan la velocidad a la que se transcriben los genes, y pueden influir en la transcripción de diversas formas. Los promotores constitutivos, por ejemplo, dirigen la transcripción de sus genes asociados a una velocidad constante independientemente de las condiciones celulares internas o externas, mientras que los promotores regulables aumentan o disminuyen la velocidad a la que se transcribe un gen dependiendo de las condiciones celulares internas y/o externas, por ejemplo, tasa de crecimiento, temperatura, respuestas a sustancias químicas ambientales específicas, y similares. Los promotores pueden aislarse de sus contextos celulares normales y manipularse para regular la expresión de prácticamente cualquier gen, lo que permite la modificación eficaz del crecimiento celular, el rendimiento del producto, y/u otros fenotipos de interés.

Está claro que existe la necesidad de una variedad más amplia de promotores de la especie Corynebacterium bien definidos que la que se ha descrito hasta ahora. Dichos promotores serían útiles en la expresión coordinada de genes en células corineformes. Por ejemplo, una colección de promotores de C. glutamicum facilitaría la producción a escala industrial de biomoléculas en células de C. glutamicum al mejorar la expresión de genes que codifican componentes de las rutas biosintéticas para las biomoléculas deseadas. Los promotores descritos aquí ayudan a satisfacer estas y otras necesidades.

BREVE SUMARIO

En resumen, la presente descripción se refiere a promotores nativos que comprenden polinucleótidos aislados de Corynebacterium glutamicum, y promotores mutantes derivados de los mismos, que pueden estar codificados cada uno por secuencias de ADN cortas, idealmente menos de 100 pares de bases, y que juntos representan una escalera de promotores constitutivos que tienen niveles de expresión que aumentan de manera incremental. Es posible que diversos genes se expresen ventajosamente bajo el control de dichos promotores.

Una realización de la presente invención se refiere a una escalera de promotores que comprende al menos tres secuencias polinucleotídicas promotoras seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 8, en la que dicha escalera promotora comprende una pluralidad de promotores con niveles de actividad promotora que aumentan de forma incremental.

Una realización de la presente invención se refiere a células hospedantes que comprenden las escaleras de promotores descritas aquí.

Una realización de la presente invención se refiere a métodos para modificar la expresión de uno o más genes diana, que comprenden cultivar una célula hospedante descrita aquí, en los que la modificación de cada gen diana se selecciona independientemente de: aumentándola y disminuyéndola. El gen diana codifica preferiblemente uno o más polipéptidos o proteínas de la ruta biosintética de biomoléculas, que incluyen, por ejemplo, aminoácidos, ácidos orgánicos, ácidos nucleicos, proteínas, y polímeros.

Otra realización de la presente invención se refiere a métodos para producir una biomolécula, que comprenden cultivar una célula hospedante descrita aquí, en condiciones adecuadas para producir la biomolécula. En algunas realizaciones, el gen diana está asociado con una ruta biosintética que produce una biomolécula seleccionada de: aminoácidos, ácidos orgánicos, sabores y fragancias, biocombustibles, proteínas y enzimas, polímeros/monómeros, y otros biomateriales, lípidos, ácidos nucleicos, sustancias terapéuticas de tipo molécula pequeña, sustancias terapéuticas proteicas o peptídicas, sustancias químicas finas, y nutracéuticos. En realizaciones preferidas, la biomolécula es un L-aminoácido. En realizaciones específicas, el L-aminoácido es lisina.

En algunas realizaciones, la célula hospedante pertenece al género Corynebacterium. En algunas realizaciones, la célula hospedante es Corynebacterium glutamicum.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra un gráfico de la longitud de 5’ UTR (eje x) frente a la relación de expresión en dos condiciones de crecimiento (eje y) para cada gen en el genoma de C. glutamicum de ATCC 13032. Los genes que tienen tanto una relación de expresión en las dos condiciones de crecimiento de entre 0,33 y 3 como una longitud de 5’ UTR de entre 26 y 40 pares de bases están representados por círculos negros. Los genes que no cumplieron con ambos criterios están representados por círculos grises.

La Figura 2 muestra un gráfico de la actividad normalizada (eje x) de ocho promotores candidatos (eje y) en un ensayo basado en proteína fluorescente amarilla. Cada réplica biológica de cada promotor candidato está representada por un círculo negro. El plásmido parental pK18rep actuó como control negativo.

La Figura 3 presenta un diagrama de la ruta genética y bioquímica para la biosíntesis del aminoácido L-lisina. Los genes que desvían intermedios en la ruta biosintética (por ejemplo, pck, odx, icd, y hom) están subrayados.

La Figura 4 presenta un gráfico de los resultados de realizaciones ejemplares de acuerdo con la presente memoria descriptiva de cambios en la producción de L-lisina en células hospedantes de C. glutamicum transformadas con moléculas de ácido nucleico recombinante que tienen secuencias polinucleotídicas promotoras seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 8 funcionalmente unidas a los genes diana heterólogos fbp, dapB, ptsG, lysA, pgi, y ppc, de C. glutamicum.

La Figura 5 presenta un gráfico de los resultados de realizaciones ejemplares de acuerdo con la presente memoria descriptiva de cambios en la producción de L-lisina en células hospedantes de C. glutamicum transformadas con moléculas de ácido nucleico recombinante que tienen secuencias polinucleotídicas promotoras seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 8 funcionalmente unidas a los genes diana heterólogos dapS, cg0931, DapB, y lysA, de C. glutamicum.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En la siguiente descripción, se establecen ciertos detalles específicos con el fin de proporcionar una comprensión completa de diversas realizaciones de la descripción. Sin embargo, un experto en la técnica comprenderá que la descripción se puede poner en práctica sin estos detalles.

A menos que el contexto requiera lo contrario, a lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, la palabra “comprender” y las variaciones de la misma, tales como “comprende” y “que comprende”, deben interpretarse en un sentido abierto, inclusivo, es decir, como “incluyendo, pero sin limitarse a”.

Como se usa aquí, la expresión “molécula de ácido nucleico recombinante” se refiere a una molécula de ADN recombinante o una molécula de ARN recombinante. Una molécula de ácido nucleico recombinante es cualquier molécula de ácido nucleico que contiene moléculas de ácido nucleico unidas de diferentes fuentes originales y que no están unidas entre sí de forma natural. Las moléculas de ARN recombinante incluyen moléculas de ARN transcritas a partir de moléculas de ADN recombinante. En particular, una molécula de ácido nucleico recombinante incluye una molécula de ácido nucleico que comprende un promotor de SEQ ID NOs: 1 a 8 funcionalmente unido a un gen diana heterólogo.

Como se usa aquí, la expresión “gen diana heterólogo” se refiere a cualquier gen o secuencia codificante que no está controlada en su estado natural (por ejemplo, dentro de una célula no modificada genéticamente) por el promotor al que está operativamente unido en un genoma particular. Como se proporciona aquí, todos los genes diana unidos funcionalmente a promotores no naturales se consideran “genes diana heterólogos”. Más específicamente, como las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1, 5 y 7 no se encuentran en la naturaleza, todas las secuencias de genes diana unidos funcionalmente son secuencias de “genes diana heterólogos” . Como se usa aquí, un gen diana heterólogo puede incluir uno o más genes diana que son parte de un operón. Es decir, el promotor endógeno de un operón se reemplaza con una secuencia polinucleotídica promotora que tiene una secuencia nucleica de SEQ ID NOs: 1 a 8. Como se usa aquí, la expresión “secuencia polinucleotídica promotora” se refiere a ácidos nucleicos que tienen una secuencia como se cita en la SEQ ID NO. asociada.

La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a “una realización” significa que un rasgo, estructura o característica particular descrita en relación con la realización está incluida en al menos una realización de la presente descripción. De este modo, las apariciones de la frase “en una realización” en diversos lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no se refieren necesariamente a la misma realización. Se aprecia que ciertas características de la invención, que, para mayor claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una única realización. A la inversa, diversas características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una única realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada.

Polinucleótidos que tienen actividad promotora

Se identificaron promotores de C. glutamicum nativos que satisfacen los dos criterios siguientes: 1) representan una escalera de promotores constitutivos, es decir, una pluralidad de promotores con niveles de actividad promotora que aumentan de forma incremental; y 2) están codificados por secuencias de ADN cortas, idealmente menos de 100 pares de bases. Para identificar genes que se expresaron constitutivamente en condiciones de crecimiento diferentes, se examinó un conjunto de datos publicados que describen los niveles de expresión génica global en C. glutamicum ATCC 13032 (Lee et al., Biotechnol Lett (2013) 35:709-717). Los genes cuyo nivel de expresión permaneció constante (definido como una relación de expresión entre 0,33 y 3) en dos condiciones de crecimiento, a saber, el crecimiento en quimiostato en medios mínimos con y sin la adición de peróxido de hidrógeno, cumplieron el primer criterio. Se examinó un conjunto de datos publicados que describe el transcriptoma de C. glutamicum ATCC 13032 (Pfeifer-Sancar et al., BMC Genomics 2013, 14:888) para encontrar genes con promotores compactos, es decir, aquellos que consisten en la región promotora del núcleo de 60 pares de bases y una región no traducida 5’ entre 26 y 40 pares de bases de longitud. Se hizo una referencia cruzada de los dos conjuntos de datos para identificar los promotores que cumplían ambos criterios. Véase la Figura 1. Se identificaron los siguientes cinco promotores de tipo salvaje (Tabla 1).

Tabla 1: Promotores de C glutamicum que tienen niveles crecientes de expresión y expresión constituyente en diferentes condiciones de crecimiento

Los promotores de tipo salvaje cg1860 y cg3121 no se describen en la bibliografía. El promotor de tipo salvaje cg0007-gyrB tampoco se describe en la bibliografía; sin embargo, Neumann y Quiñones, (J Basic Microbiol. 1997; 37(1):53-69) describen la regulación de la expresión del gen gyrB en E. coli. El promotor de tipo salvaje cg0755 es una parte conocida de la ruta de la biosíntesis de metionina (Suda et al., Appl Microbiol Biotechnol (2008) 81:505-513; y Rey et al., Journal of Biotechnology 103 (2003) 51-65). El promotor de tipo salvaje cg3381 es un homólogo de tatA. La ruta de tatA en Corynebacterium está descrita por Kikuchi et al., Applied and Environmental Microbiology, Nov. 2006, p.

7183-7192. Se escogió el promotor constitutivo fuerte Pcg0007 para la mutagénesis. Cuatro de seis posiciones en el elemento -10 predicho (TAAGAT) de Pcg0007 se aleatorizaron para generar variantes de promotores tanto más fuertes como atenuados (SEQ ID NOs 1,5 y 7),

Por consiguiente, una realización de la presente invención se refiere a promotores nativos que comprenden polinucleótidos aislados de C. glutamicum, y promotores mutantes derivados de los mismos que juntos representan una escalera de promotores constitutivos con niveles de actividad promotora incrementalmente crecientes. En algunas realizaciones, un promotor de C. glutamicum puede estar codificado por una secuencia de ADN corta. En algunas realizaciones, un promotor de C. glutamicum puede estar codificado por una secuencia de ADN de menos de 100 pares de bases.

Una realización de la presente invención se refiere a un polinucleótido promotor que comprende una secuencia seleccionada de: SEQ ID NO:1 (Pcg0007_lib_39), SEQ ID NO:2 (Pcg1860), SEQ ID NO:3 (Pcg0007), SEQ ID NO:4 (Pcg0755), SEQ ID NO:5 (Pcg0007_lib_265), SEQ ID NO:6 (Pcg3381), SEQ ID NO:7 (Pcg0007_lib_119), o SEQ ID NO:8 (Pcg3121). En otra realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, un polinucleótido promotor que comprende la SEQ ID NO: 1 funcionalmente unido a al menos un gen diana heterólogo. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, un polinucleótido promotor de SEQ ID NO: 2 funcionalmente unido a al menos un gen diana heterólogo. En otra realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, un polinucleótido promotor de SEQ ID NO: 3 funcionalmente unido a al menos un gen diana heterólogo. En otra realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, un polinucleótido promotor de SEQ ID NO: 4 funcionalmente unido a al menos un gen diana heterólogo. En otra realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, un polinucleótido promotor de SEQ ID NO: 5 funcionalmente unido a al menos un gen diana heterólogo. En otra realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, un polinucleótido promotor que comprende la SEQ ID NO: 5 funcionalmente unido a al menos un gen diana heterólogo. En otra realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, un polinucleótido promotor de SEQ ID NO: 7 funcionalmente unido a al menos un gen diana heterólogo. En otra realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, un polinucleótido promotor de SEQ ID NO: 8 funcionalmente unido a al menos un gen diana heterólogo.

Como se usa aquí, un “casete promotor” se refiere a las secuencias polinucleotídicas que comprenden un polinucleótido promotor de SEQ ID NOs: 1 a 8 funcionalmente unidas a al menos un gen diana heterólogo. En ciertas realizaciones de la presente descripción, un “casete promotor” puede incluir además uno o más de un polinucleótido enlazador, un terminador de la transcripción que sigue al gen heterólogo, un sitio de unión al ribosoma en dirección 5’ del codón de inicio del gen heterólogo, y combinaciones de cada uno. Una realización de la presente invención se refiere a un polinucleótido promotor que consiste en una secuencia seleccionada de: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:8. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 1. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 5. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 7. Como se usa aquí, un casete promotor puede describirse haciendo referencia al nombre del promotor seguido del nombre del gen diana heterólogo que está funcionalmente unido a él. Por ejemplo, el promotor de SEQ ID NO: 1, denominado Pcg1860, unido funcionalmente al gen zwf que codifica el gen de glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa se denomina Pcg1860-zwf. De manera similar, Pcg0007_39-lysA es el promotor 0007_39 de SEQ ID NO: 1 funcionalmente unido al gen diana lysA que codifica el polipéptido diaminopimelato descarboxilasa.

Una realización de la presente invención se refiere a combinaciones de los polinucleótidos promotores descritos aquí. En este contexto, la expresión “combinaciones de polinucleótidos promotores” se refiere a dos o más polinucleótidos que pueden estar presentes como secuencias aisladas separadas, como componentes de moléculas polinucleotídicas separadas, o como componentes de la misma molécula polinucleotídica, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de moléculas de polinucleótidos incluyen cromosomas y plásmidos.

La invención también se refiere a un polinucleótido promotor aislado, que consiste esencialmente en un polinucleótido que tiene la secuencia nucleotídica representada en SEQ ID NO:1, s Eq ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:8. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un polinucleótido promotor aislado de SEQ ID NO: 1. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un polinucleótido promotor aislado de SEQ ID NO: 5. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un polinucleótido promotor aislado de SEQ ID NO: 7.

El término “esencialmente”, en este contexto, significa que un polinucleótido de no más de 1.000, no más de 800, no más de 700, no más de 600, no más de 500, o no más de 400 nucleótidos de longitud, y un polinucleótido de no más de 15.000, no más de 10.000, no más de 7.500, no más de 5.000, no más de 2.500, no más de 1.000, no más de 800, no más de 700, no más de 600, no más de 500, o no más de 400 nucleótidos de longitud se han añadido al extremo 5’ y al extremo 3’, respectivamente, de los polinucleótidos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:8.

Cualquier combinación útil de las características de las dos listas anteriores de polinucleótidos añadidos al extremo 5’ y al extremo 3’, respectivamente, de los polinucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, está de acuerdo con la invención aquí. “Combinación útil” significa, por ejemplo, una combinación de características que da como resultado que se lleve a cabo una recombinación eficiente. El uso de adiciones de la misma longitud que flanquean una región de ADN a reemplazar facilita la transferencia de la región por recombinación homóloga en el procedimiento experimental. Las regiones homólogas flanqueantes relativamente largas son ventajosas para la recombinación eficiente entre moléculas de ADN circular, pero la clonación del vector de sustitución se hace más difícil al aumentar la longitud de los flancos (Wang et al., Molecular Biotechnology, 432:43-53 (2006)). La memoria descriptiva proporciona, e incluye, regiones homólogas que flanquean una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NOs: 1 a 8 funcionalmente unida a al menos un gen diana heterólogo (por ejemplo, el “casete promotor”) para dirigir la recombinación homóloga y el reemplazo de una secuencia de gen diana. En una realización, las regiones homólogas son regiones de repetición directa. En una realización, las regiones homólogas comprenden entre 500 pares de bases (pb) y 5000 pb cada una de la secuencia del gen diana que flanquea el casete promotor. En una realización, las regiones homólogas comprenden al menos 500 pb cada una de la secuencia del gen diana que flanquea el casete promotor. En una realización, las regiones homologas comprenden al menos 1000 pb (1 Kb) cada una de la secuencia del gen diana que flanquea el casete promotor. En una realización, las regiones homólogas comprenden al menos 2 Kb cada una de la secuencia del gen diana que flanquea el casete promotor. En una realización, las regiones homólogas comprenden al menos 5 Kb cada una de la secuencia del gen diana que flanquea el casete promotor.

La invención además se refiere a un polinucleótido promotor aislado, que consiste en la secuencia nucleotídica representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 8. En una realización, el polinucleótido promotor aislado consiste en la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 1. En una realización, el polinucleótido promotor aislado consiste en la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 5. En una realización, el polinucleótido promotor aislado consiste en la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 7.

Los detalles sobre la bioquímica y la estructura química de los polinucleótidos presentes en los seres vivos, tal como los microorganismos, por ejemplo, se pueden encontrar, entre otros, en el libro de texto “Biochemie” [Biochemistry] de Berg et al. (Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Berlín, Alemania, 2003; ISBN 3-8274-1303-6).

Los polinucleótidos que consisten en monómeros de desoxirribonucleótidos que contienen las nucleobases o bases adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T) se denominan desoxirribo-polinucleótidos o ácido desoxirribonucleico (ADN). Los polinucleótidos que consisten en monómeros de ribonucleótidos que contienen las nucleobases o bases adenina (A), guanina (G), citosina (C) y uracilo (U) se denominan ribopolinucleótidos o ácido ribonucleico (ARN). Los monómeros en dichos polinucleótidos están unidos covalentemente entre sí mediante un enlace 3’,5’-fosfodiéster.

Un “polinucleótido promotor” o un “promotor” o un “polinucleótido que tiene actividad promotora” significa un polinucleótido, preferiblemente desoxirribopolinucleótido, o un ácido nucleico, preferiblemente ácido desoxirribonucleico (ADN), que cuando se une funcionalmente a un polinucleótido a transcribir determina el punto y frecuencia de inicio de la transcripción del polinucleótido codificante, lo que permite influir en la fuerza de expresión del polinucleótido controlado. La expresión “escalera de promotores”, como se usa aquí, se refiere a una pluralidad de promotores con niveles de actividad promotora incrementalmente crecientes. La expresión “actividad promotora”, como se usa aquí, se refiere a la capacidad del promotor para iniciar la transcripción de una secuencia polinucleotídica en ARNm. Los métodos para evaluar la actividad promotora son bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, los métodos descritos en el Ejemplo 2 más abajo. La expresión “promotor constitutivo”, como se usa aquí, se refiere a un promotor que dirige la transcripción de sus genes asociados a una velocidad constante, independientemente de las condiciones celulares internas o externas.

Debido a la estructura de doble hebra del ADN, la hebra complementaria a la hebra en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 8 del listado de secuencias es igualmente un objeto de la invención.

Genes diana

Una realización de la presente invención se refiere a métodos para expresar un gen diana, que comprenden cultivar una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende un polinucleótido promotor como se describe aquí. Los genes diana son polinucleótidos cuya expresión está controlada por los promotores descritos aquí. Los genes diana pueden ser polinucleótidos codificantes que codifican uno o más polipéptidos, o polinucleótidos no codificantes tales como ARN no codificantes. Un polinucleótido que codifica una proteína/polipéptido consiste esencialmente en un codón de inicio seleccionado del grupo que consiste en ATG, GTG y TTG, preferiblemente ATG o GTG, particularmente de forma preferible ATG, una secuencia que codifica una proteína, y uno o más codones de parada seleccionados del grupo que consiste en TAA, TAG y TGA.

“Transcripción” significa el proceso mediante el cual se produce una molécula de ARN complementaria a partir de un molde de ADN. Este proceso implica proteínas tales como la ARN polimerasa, “factores sigma” y proteínas reguladoras de la transcripción. Cuando el gen diana es un polinucleótido codificante, el ARN sintetizado (ARN mensajero, ARNm) sirve entonces como molde en el proceso de traducción, que posteriormente produce el polipéptido o proteína.

“Funcionalmente unido” significa, en este contexto, la disposición secuencial del polinucleótido promotor según la invención con un oligo- o polinucleótido adicional, dando como resultado la transcripción de dicho polinucleótido adicional para producir un transcrito de ARN sentido.

Si el polinucleótido adicional es un gen diana que codifica un polipéptido/proteína y consiste en la región codificante de un polipéptido, que comienza con un codón de inicio, que incluye el codón de parada y, cuando sea apropiado, que incluye una secuencia de terminación de la transcripción, “funcionalmente unido” significa entonces la disposición secuencial del polinucleótido promotor de acuerdo con la invención con el gen diana, dando como resultado la transcripción de dicho gen diana y la traducción del ARN sintetizado.

Si el gen diana codifica una pluralidad de proteínas/polipéptidos, cada gen puede estar precedido por un sitio de unión al ribosoma. Cuando sea apropiado, una secuencia de terminación se ubica en dirección 3’ del último gen.

El gen diana codifica preferiblemente uno o más polipéptidos o proteínas de la ruta biosintética de biomoléculas, preferiblemente seleccionadas del grupo de aminoácidos proteinogénicos, aminoácidos no proteinogénicos, vitaminas, nucleósidos, nucleótidos, y ácidos orgánicos. El gen diana consiste preferiblemente en uno o más de los polinucleótidos enumerados en la Tabla 1 del documento EP 1108790 A2.

La presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden una secuencia polinucleotídica promotora seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 8 funcionalmente unidas a cualquiera de los genes diana heterólogos identificables en la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) como genes implicados en rutas metabólicas y biosintéticas. La base de datos de KEGG está disponible en Internet en genome.jp/kegg. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de lisina como se representa en el mapa de KEGG número 00300. En una realización, el uno o más genes diana se seleccionan de la ruta de la biosíntesis de lisina succinil-DAP, M00016. En una realización, el uno o más genes diana se seleccionan de la ruta de la biosíntesis de lisina acetil-DAP, M00525. En una realización, el uno o más genes diana se seleccionan de la ruta de la biosíntesis de lisina DAP deshidrogenasa, M00526. En una realización, el uno o más genes diana se seleccionan de la ruta de la biosíntesis de lisina DAP aminotransferasa, M00527. En una realización, el uno o más genes diana se seleccionan de la ruta de la biosíntesis de la ruta AAA, M00030. En una realización, el uno o más genes diana se seleccionan de la ruta de la biosíntesis de lisina de 2-oxoglutarato, M00433, o la ruta de la biosíntesis de lisina mediada por LysW, M00031.

La presente descripción proporciona, e incluye, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de serina, que comprende genes de entrada M00020. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de treonina que comprende genes de entrada de KEGG M00018. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de cisteína que comprende genes de entrada de KEGG M00021. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de cisteína que comprende genes de entrada de KEGG M00338. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de cisteína que comprende genes de entrada de KEGG M00609. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de metionina que comprende genes de entrada de KEGG M00017. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de valina/isoleucina que comprende genes de entrada de KEGG M00019. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de isoleucina que comprende genes de entrada de KEGG M00535. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de isoleucina que comprende genes de entrada de KEGG M00570. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de leucina que comprende genes de entrada de KEGG M00432. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de prolina que comprende genes de entrada de KEGG M00015. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de ornitina que comprende genes de entrada de KEGG M00028. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de ornitina que comprende genes de entrada de KEGG M00763. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de histidina que comprende genes de entrada de KEGG M00026. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de shikimato que comprende genes de entrada de KEGG M00022. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de triptófano que comprende genes de entrada M00023. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de fenilalanina que comprende genes de entrada de KEGG M00024. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de tirosina que comprende genes de entrada de KEGG M00025. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1 a 8 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de tirosina que comprende genes de entrada de KEGG M00040.

La presente descripción proporciona, e incluye, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1,5 o 7 funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de serina que comprende genes de entrada M00020. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de treonina que comprende genes de entrada de KEGG M00018. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1,5 o 7 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de cisteína que comprende genes de entrada de KEGG M00021. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de cisteína que comprende genes de entrada de KEGG M00338. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de cisteína que comprende genes de entrada de KEGG M00609. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de metionina que comprende genes de entrada de KEGG M00017. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1,5 o 7 están funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de valina/isoleucina que comprende genes de entrada de KEGG M00019. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1,5 o 7 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de isoleucina que comprende genes de entrada de KEGG M00535. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de isoleucina que comprende genes de entrada de KEGG M00570. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de leucina que comprende genes de entrada de KEGG M00432. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1,5 o 7 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de prolina que comprende genes de entrada de KEGG M00015. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de ornitina que comprende genes de entrada de KEGG M00028. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de las SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de ornitina que comprende genes de entrada de KEGG M00763. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de histidina que comprende genes de entrada de KEGG M00026. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de shikimato que comprende genes de entrada de KEGG M00022. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están unidas funcionalmente a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de triptófano que comprende genes de entrada M00023. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de fenilalanina que comprende genes de entrada de KEGG M00024. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de tirosina que comprende genes de entrada de KEGG M00025. En una realización, las secuencias polinucleotídicas promotoras de SEQ ID NOs: 1, 5 o 7 están funcionalmente unidas a uno o más genes diana de la ruta de la biosíntesis de tirosina que comprende genes de entrada de KEGG M00040.

La presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden una secuencia polinucleotídica promotora seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 8 funcionalmente unida a uno cualquiera de los genes diana heterólogos de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 proporcionados en la Tabla 2, o cualquier Corynebacterium glutamicum equivalente de los mismos. Las posiciones inicial y final de la secuencia corresponden al acceso nucleotídico genómico NC_003450.3. Los expertos en la técnica entenderán que los genes correspondientes existen en otras cepas de C. glutamicum, y pueden identificarse fácilmente a partir de la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 1 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 2 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 3 unida funcionalmente a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un polinucleótido promotor secuencia de SEQ ID NO: 4 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 5 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 6 unida funcionalmente a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 7 unida funcionalmente a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de s Eq ID NO: 8 unida funcionalmente a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2.

Tabla 2: Genes diana de Corynebacterium glutamicum según la presente memoria descriptiva

En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 1 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 2 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 3 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 4 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 5 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 6 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 7 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 8 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2.

En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 1 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 2 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 3 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 4 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 5 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 6 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 7 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 8 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 2. Como se usa aquí, una célula hospedante se refiere a un organismo descrito más abajo en la sección titulada “Expresión” que se ha transformado con uno o más de los casetes promotores. Como resultará evidente para un experto en la técnica, una célula hospedante puede comprender uno o más casetes promotores como se describe aquí.

En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 1 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 2 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 3 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 4 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 5 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 6 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 7 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 8 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. Como se usa aquí, una célula hospedante se refiere a un organismo descrito más abajo en la sección titulada “Expresión” que se ha transformado con uno o más de los casetes promotores. Como resultará evidente para un experto en la técnica, una célula hospedante puede comprender uno o más casetes promotores como se describe aquí.

Tabla 3: Ruta biosintética de L-lisina de C. glutamican

En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 1 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 2 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 3 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3 En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 4 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 5 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 6 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 7 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 8 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3.

En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 1 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 2 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 3 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 4 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 5 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 6 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 7 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 8 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 3. Como se usa aquí, una célula hospedante se refiere a un organismo descrito más abajo en la sección titulada “Expresión” que se ha transformado con uno o más de los casetes promotores. Como resultará evidente para un experto en la técnica, una célula hospedante puede comprender uno o más casetes promotores como se describe aquí.

La presente memoria descriptiva proporciona una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 8 funcionalmente unida a uno cualquiera de los genes diana heterólogos de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 proporcionados en la Tabla 4, o su equivalente de Corynebacterium glutamicum. Las posiciones inicial y final de la secuencia corresponden al acceso nucleotídico genómico NC_003450.3. Los expertos en la técnica entenderán que los genes correspondientes existen en otras cepas de C. glutamicum, y pueden identificarse fácilmente a partir de la Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 1 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 2 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 3 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 4 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 5 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en Tabla 4 En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 6 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 7 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 8 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en Tabla 4. Como se usa aquí, una célula hospedante se refiere a un organismo descrito más abajo en la sección titulada “Expresión” que se ha transformado con uno o más de los casetes promotores. Como resultará evidente para un experto en la técnica, una célula hospedante puede comprender uno o más casetes promotores como se describe aquí.

Tabla 4: Ruta biosintética de L-metionina de C. glutamican

En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 3 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 4 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 5 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 6 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 7 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona e incluye un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 8 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4.

En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 1 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 2 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 3 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 4 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 5 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 6 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 7 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4. En una realización, la presente memoria descriptiva proporciona, e incluye, una célula hospedante transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica promotora de SEQ ID NO: 8 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo mencionado en la Tabla 4.

En algunas realizaciones, el gen diana está asociado con una ruta biosintética que produce una biomolécula seleccionada de: aminoácidos, ácidos orgánicos, aromas y fragancias, biocombustibles, proteínas y enzimas, polímeros/monómeros y otros biomateriales, lípidos, ácidos nucleicos, sustancias terapéuticas de tipo molécula pequeña, sustancias terapéuticas de tipo proteína, sustancias químicas finas, y nutracéuticos.

En algunas realizaciones, el gen diana está asociado con una ruta biosintética que produce un metabolito secundario seleccionado de: antibióticos, alcaloides, terpenoides, y policétidos. En algunas realizaciones, el gen diana está asociado con una ruta metabólica que produce un metabolito primario seleccionado de: alcoholes, aminoácidos, nucleótidos, antioxidantes, ácidos orgánicos, polioles, vitaminas, y lípidos/ácidos grasos. En algunas realizaciones, el gen diana está asociado con una ruta biosintética que produce una macromolécula seleccionada de: proteínas, ácidos nucleicos, y polímeros.

Además, puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos potenciar, en particular sobreexpresar, una o más enzimas de la ruta de la biosíntesis respectiva, glicólisis, anaplerosis, ciclo del ácido cítrico, ciclo de la pentosa fosfato, exportación de aminoácidos, y opcionalmente proteínas reguladoras.

Así, por ejemplo, para la producción de L-aminoácidos, puede ser ventajoso que uno o más genes seleccionados del siguiente grupo se potencien, en particular se sobreexpresen: el gen dapA que codifica la dihidrodipicolinato sintasa (documento EP-B 0197335); el gen eno que codifica la enolasa (documento DE: 19947791.4); el gen gap que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086); el gen tpi que codifica la triosa-fosfato isomerasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086); el gen pgk que codifica la 3-fosfoglicerato cinasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086); el gen zwf que codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (documento JP-A-09224661); el gen pyc que codifica la piruvato carboxilasa (documento DE-A-198 31 609; Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086); el gen mqo que codifica la malato-quinona-oxidorreductasa (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)); el gen lysC que codifica una aspartato cinasa resistente a la retroalimentación (número de acceso P26512); el gen LysE que codifica la exportación de lisina (documento DE-A-19548222); el gen horn que codifica la homoserina deshidrogenasa (documento EP-A 0131171); el gen ilvA que codifica la treonina deshidratasa (Mockel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072)), o el alelo ilvA (Fbr) que codifica una treonina deshidratasa resistente a la retroalimentación (Mockel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842); el gen ilvBN que codifica la acetohidroxiácido sintasa (documento EP-B 0356739); el gen ilvD que codifica la dihidroxiácido deshidratasa (Sahm y Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979); y el gen zwa1 que codifica la proteína Zwa1 (documento DE: 19959328.0, DSM 13115).

Además, también puede resultar ventajoso para la producción de L-aminoácidos atenuar, en particular reducir, la expresión de uno o más genes seleccionados del grupo: el gen pck que codifica la fosfoenol piruvato carboxicinasa (documento DE 19950409.1; DSM 13047); el gen pgi que codifica la glucosa-6-fosfato isomerasa (patente U.S. n° 6.586.214; DSM 12969); el gen poxB que codifica la piruvato oxidasa (documento DE: 1995 1975.7; DSM 13114); y el gen zwa2 que codifica la proteína Zwa2 (documento DE: 19959327.2, DSM 13113).

Además, para la producción de aminoácidos, en particular L-lisina, puede resultar ventajoso eliminar las reacciones secundarias indeseables (Nakayama: “Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms”, en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

El promotor según la invención se puede usar así en cada caso para sobreexpresar o subexpresar el gen diana en C. glutamicum.

Enlazadores

El gen diana está situado en dirección 3’ del polinucleótido promotor según la invención, es decir, en el extremo 3’, de manera que ambos polinucleótidos estén funcionalmente unidos entre sí directamente o por medio de un oligonucleótido enlazador o polinucleótido enlazador. Se da preferencia a que el promotor y el gen diana estén unidos funcionalmente entre sí por medio de un oligonucleótido enlazador o polinucleótido enlazador. Dicho oligonucleótido enlazador o polinucleótido enlazador consiste en desoxirribonucleótidos.

En este contexto, la expresión “funcionalmente unidos entre sí directamente” significa que el nucleótido en el extremo 3’ de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:8 se une directamente al primer nucleótido del codón de inicio de un gen diana. Esto da como resultado ARNm “sin líder” que comienzan inmediatamente con el codón de inicio AUG del extremo 5’, y por lo tanto no tienen ninguna otra señal de inicio de la traducción.

En este contexto, la expresión “funcionalmente unidos entre sí por medio de un oligonucleótido enlazador” significa que el nucleótido en el extremo 3’ de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:8 está unido por un oligonucleótido de 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de longitud al primer nucleótido del codón de inicio de un gen diana.

En este contexto, la expresión “funcionalmente unidos entre sí por medio de un polinucleótido enlazador” significa que el nucleótido en el extremo 3' de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID

NO:6, SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:8 está unido por un polinucleótido de 6 a no más de 600 nucleótidos de longitud al primer nucleótido del codón de inicio de un gen diana.

En este contexto, la expresión “funcionalmente unidos entre sí” significa que el gen diana está unido al polinucleótido promotor según la invención de tal manera que se asegura la transcripción del gen diana y la traducción del ARN sintetizado.

Dependiendo del requisito técnico, el polinucleótido enlazador es:

6 - 600, 6 - 500, 6 - 400, 6 - 300, 6 - 200, 6 - 180, 6 -160, 6 - 140, 6 - 120, 6 - 100, 6 - 80, 6 - 60, 6 - 50, 6 - 40, 6 -30, 6 - 28, 6 - 27, 6 - 26, 6 - 25; o

8 - 600, 8 - 500, 8 - 400, 8 - 300, 8 - 200, 8 - 180, 8 -160, 8 - 140, 8 - 120, 8 - 100, 8 - 80, 8 - 60, 8 - 50, 8 - 40, 8 -30, 8 - 28, 8 - 27, 8 - 26, 8 - 25; o

10 - 600, 10 - 500, 10 - 400, 10 - 300, 10 - 200, 10 - 180, 10 - 160, 10 -

100, 10 - 80, 10 - 60 10 - 50, 10 - 40, 10 - 30, 10 - 28, 10 - 27, 10 - 26, 10 -25; o

12 - 600, 12 - 500, 12 - 400, 12 - 300, 12 - 200, 12 - 180, 12 - 160, 12 -

100, 12 - 80, 12 - 60 12 - 50, 12 - 40, 12 - 30, 12 - 28, 12 - 27, 12 - 26, 12 -25; o

14 - 600, 14 - 500, 14 - 400, 14 - 300, 14 - 200, 14 - 180, 14 - 160, 14 -

100, 14 - 80, 14 - 60 14 - 50, 14 - 40, 14 - 30, 14 - 28, 14 - 27, 14 - 26, 14 -20; o

16 - 600, 16 - 500, 16 - 400, 16 - 300, 16 - 200, 16 - 180, 16 - 160, 16 -

100, 16 - 80, 16 - 60 16 - 50, 16 - 40, 16 - 30, 16 - 28, 16 - 27, 16 - 26, 16 -25; o

18 - 600, 18 - 500, 18 - 400, 18 - 300, 18 - 200, 18 - 180, 18 - 160, 18 - 140, 18 - 120, 18 - 100, 18 - 80, 18 - 60,

18 - 50, 18 - 40, 18 - 30, 18 - 28, 18 - 27, 18 - 26, 18 - 25; o

20 - 600, 20 - 500, 20 - 400, 20 - 300, 20 - 200, 20 - 180, 20 - 160, 20 - 140, 20 - 120, 20 - 100, 20 - 80, 20 - 60, 20

- 50, 20 - 40, 20 - 30, 20 - 28, 20 - 27, 20 - 26, 20 - 25 nucleótidos de longitud.

En realizaciones particularmente preferidas, el polinucleótido enlazador tiene 20, 21, 22, 23, 24, o 25 nucleótidos de longitud, debido a que esto produce constructos preferiblemente funcionales.

La invención se refiere además en consecuencia a un polinucleótido promotor aislado, que consiste esencialmente en un polinucleótido de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID

NO:7, o SEQ ID NO:8, que, a través del nucleótido en su extremo 3', está funcionalmente unido, directamente o por medio de un polinucleótido enlazador que asegura la traducción del ARN, a un gen diana que contiene en su extremo

5' un codón de inicio ATG o GTG y codifica uno o más polipéptidos. Se da preferencia a que el promotor y el gen diana estén unidos funcionalmente entre sí por medio de un polinucleótido enlazador.

La invención también se refiere además a un polinucleótido aislado, que consiste esencialmente en un polinucleótido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ

ID NO: 8, que, a través del nucleótido en su extremo 3', está funcionalmente unido a un oligonucleótido enlazador.

Además, la invención se refiere adicionalmente a un polinucleótido aislado, que consiste esencialmente en un polinucleótido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID

NO: 7, o SEQ ID NO: 8, que, a través del nucleótido en su extremo 3', está funcionalmente unido a un polinucleótido enlazador que asegura la traducción del ARN.

En este contexto, el término “esencialmente” significa que se ha añadido un polinucleótido de no más de 1.000, no más de 800, no más de 700, no más de 600, no más de 500, o no más de 400 nucleótidos de longitud al extremo 5' del polinucleótido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ

ID NO: 7, o SEQ ID NO: 8, y se ha añadido un polinucleótido de no más de 1.000, no más de 800, no más de 700, no más de 600, no más de 500, o no más de 400 nucleótidos de longitud al extremo 3' del gen diana, o se ha añadido un polinucleótido de no más de 15.000, no más de 10.000, no más de 7.500, no más de 5.000, no más de 2.500, no más de 1.000, no más de 800, no más de 700, no más de 600, no más de 500, o no más de 400 nucleótidos de longitud al extremo 3' del oligo- o polinucleótido enlazador.

Cualquier combinación útil de las características de las tres listas precedentes de polinucleótidos está de acuerdo con la invención aquí. “Combinación útil” significa, por ejemplo, una combinación de características que da como resultado que se lleve a cabo una recombinación eficiente. El uso de adiciones de la misma longitud que flanquean una región

de ADN a reemplazar facilita la transferencia de la región por recombinación homologa en el procedimiento experimental. Las regiones homólogas flanqueantes relativamente largas son ventajosas para la recombinación eficiente entre moléculas de ADN circulares, pero la clonación del vector de sustitución se hace más difícil al aumentar la longitud de los flancos (Wang et al., Molecular Biotechnology 32:43-53 (2006)).

Además, el flanco en el extremo 3’ del oligo- o polinucleótido enlazador aumenta en longitud a no más de 15.000 nucleótidos cuando el extremo 3’ está funcionalmente unido a un gen diana que contiene en su extremo 5’ un codón de inicio ATG o GTG y codifica uno o más polipéptidos.

Estas realizaciones particularmente preferidas del polinucleótido enlazador aseguran la traducción de ARN de una manera ventajosa.

Para facilitar la unión química entre el polinucleótido según la invención que tiene la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 8, el polinucleótido enlazador que asegura la traducción del ARN, y el gen diana que codifica uno o más polipéptidos, que tiene un codón de inicio ATG o GTG en su extremo 5’, las secuencias nucleotídicas funcionales requeridas para la clonación pueden incorporarse en dichos polinucleótidos en sus extremos 5’ y 3’, y son retenidas al menos parcialmente incluso después de dicha clonación.

La expresión “secuencia nucleotídica funcional requerida para la clonación” representa aquí cualquier sitio de escisión de REII (endonucleasa de restricción de tipo II) presente, cuya secuencia normalmente consiste en 4 a 8 nucleótidos.

Además, debe mencionarse aquí que la mutagénesis específica de sitio mediante cebadores de mutagénesis o una síntesis génica de novo (por ejemplo GENEART AG (Regensburg, Alemania)) de las secuencias nucleotídicas para eliminar los sitios de escisión para las endonucleasas de restricción puede introducir mutaciones silenciosas en la secuencia para permitir que dichos sitios de escisión se utilicen ventajosamente para las etapas de clonación posteriores.

El polinucleótido resultante de que el promotor de acuerdo con la invención esté funcionalmente unido al polinucleótido enlazador que asegura la traducción del ARN también se denomina aquí a continuación unidad de expresión.

Expresión

La invención se refiere además al uso del promotor según la invención, o de la unidad de expresión según la invención, para la expresión de genes o polinucleótidos diana en microorganismos. El promotor según la invención, o la unidad de expresión según la invención, asegura la transcripción y traducción del ARN sintetizado, preferiblemente ARNm, en un polipéptido. Como se usa aquí, la expresión “célula hospedante” se refiere a una célula transformada de un microorganismo.

La presente descripción proporciona, e incluye, células hospedantes transformadas que comprenden los ácidos nucleicos recombinantes y los vectores recombinantes descritos en detalle anteriormente. La presente descripción proporciona además, e incluye, células hospedantes transformadas con dos ácidos nucleicos recombinantes. En una realización, las células hospedantes se transforman con tres ácidos nucleicos recombinantes. Como se proporcionó anteriormente, los ácidos nucleicos pueden seleccionarse de rutas biosintéticas basándose en el efecto general sobre el rendimiento del producto deseado. No existe un límite práctico en el número de ácidos nucleicos recombinantes que pueden incorporarse en las células hospedantes de la presente memoria descriptiva. La expresión se lleva a cabo preferentemente en microorganismos del género Corynebacterium. Se da preferencia a las cepas dentro del género Corynebacteriumque se basan en las siguientes especies: C. efficiens, siendo la cepa de tipo depositada DSM44549; C. glutamicum, siendo la cepa de tipo depositada ATCC13032; y C. ammoniagenes, siendo la cepa de tipo depositada ATCC6871. Se da preferencia muy particular a la especie C. glutamicum. De esta forma es posible expresar polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen una propiedad, preferiblemente actividad enzimática, que no están presentes o no son detectables en el hospedante correspondiente. Así, por ejemplo, Yukawa et al. describen la expresión de genes de Escherichia coli para usar D-xilosa en C. glutamicum R bajo el control del promotor constitutivo Ptrc (Applied Microbiology and Biotechnology 81,691-699 (2008)).

La presente memoria descriptiva proporciona e incluye C. glutamicum que tiene dos o más genes de una ruta biosintética bajo el control de las secuencias polinucleotídicas promotoras descritas anteriormente. En diversas realizaciones, uno o más genes diana se colocan bajo el control de una secuencia polinucleotídica promotora que tiene como secuencia SEQ ID NOs: 1 a 8 como se describe anteriormente. En otras realizaciones, uno o más genes diana se colocan bajo el control de una secuencia polinucleotídica promotora que tiene como secuencia SEQ ID NOs: 1,5 o 7 como se describió anteriormente.

En ciertas realizaciones de acuerdo con la presente memoria descriptiva, las células hospedantes de C. glutamicum tienen dos genes diana bajo el control de los promotores que tienen secuencias de SEQ ID NOs: 1 a 8. En ciertas otras realizaciones de acuerdo con la presente memoria descriptiva, las células hospedantes de C. glutamicum tienen dos genes diana bajo el control de los promotores que tienen secuencias de SEQ ID NOs: 1, 5 o 7. Usando recombinación homóloga, los promotores de la presente descripción reemplazan el promotor endógeno y la secuencia endógena para preparar un promotor funcionalmente unido a un gen heterólogo. Un experto en la técnica reconocería que la recombinación da como resultado un reemplazo del promotor endógeno, al tiempo que se retiene el gen en su locus nativo. A continuación se ilustran ejemplos no limitantes específicos en la Tabla 8. En el genoma de una célula hospedante se pueden incorporar fácilmente múltiples pares promotor-gen diana heterólogo (por ejemplo, casetes promotores). En una realización, los casetes promotores se pueden incorporar en las células hospedantes de forma secuencial. En ciertas realizaciones, los vectores recombinantes de la presente descripción proporcionan dos o más casetes promotores diferentes en un único constructo. La presente memoria descriptiva no proporciona un límite práctico al número de reemplazos de promotores que se pueden desarrollar usando los métodos descritos.

En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007-lysA y Pcg3121 -pgi. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg1860-pyc y Pcg0007-zwf. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007-lysA y Pcg0007-zwf. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3121-pck y Pcg0007-zwf. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007_39-ppc y Pcg0007-zwf. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3121-pck y Pcg3121 -pgi. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3381 -ddh y Pcg0007-zwf. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007_265-dapB y Pcg0007-zwf. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007-zwf y Pcg3121 -pgi. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3381-ddh y Pcg3121 -pgi. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3121 -pgi y Pcg1860-pyc. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg1860-pyc y Pcg0007_265-dapB. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg1860-pyc y Pcg0007-lysA. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg1860-asd y Pcg0007-zwf. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007_265-dapB y Pcg3121 -pgi. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg1860-pyc y Pcg1860-asd. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3381-aspB y Pcg1860-pyc. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3381-fbp y Pcg1860-pyc. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3381-ddh y Pcg3381-fbp. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0755-ptsG y Pcg3121 -pgi. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg1860-pyc y Pcg3121 -pck. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg1860-asd y Pcg3121-pgi. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg1860-asd y Pcg3381-fbp. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007_39-lysE y Pcg3381-fbp. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3381 -fbp y Pcg0007-lysA. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007_39-lysE y Pcg1860-pyc. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3121 -pgi y Pcg3381-fbp. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3121-pck y Pcg0007-lysA. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007-lysA y Pcg0007 _265-dapB. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007 265-dapB y Pcg1860-asd. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3121 -pgi y Pcg0007 _265-dapD. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007-lysA y Pcg3381-ddh. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3121-pck y Pcg1860-asd. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007-lysA y Pcg1860-asd. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3121-pck y Pcg0007_265-dapB. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3381-ddh y Pcg1860-asd. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007_39-ppc y Pcg1860-asd. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007_39-ppc y Pcg0007-lysA. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3381 -ddh y Pcg0007 _265-dapB. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007265-dapB y Pcg3381-fbp. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007_39-ppc y Pcg0007_265-dapB. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3381-aspB y Pcg3121-pck. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007 265-dapB y Pcg0007_265-dapD. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007_39-lysE y Pcg3381-aspB. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007_39-lysE y Pcg0007_265-dapD. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3381-aspB y Pcg0007_265-dapB. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcgl1860-asd y Pcg0007_265-dapD. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3381-aspB y Pcg0007-lysA. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg3381-aspB y Pcg3381-ddh. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0755-ptsG y Pcg1860-pyc. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0755-ptsG y Pcg3381-fbp. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0007-zwf y Pcg3381-fbp. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum transgénica que comprende los casetes promotores Pcg0755-ptsG y Pcg0007_265-dapD.

La presente descripción proporciona, e incluye, células hospedantes que tienen tres o más casetes promotores como se describió anteriormente. En una realización, la célula hospedante incluye los casetes promotores Pcg0007_39-zwf, Pcg0007_39-lysA y Pcg1860-pyc. En una realización, la célula hospedante es una célula hospedante de C. glutamicum.

El promotor según la invención, o la unidad de expresión según la invención, se utiliza además para mejorar las características de comportamiento de los microorganismos, que pueden incluir, por ejemplo, rendimiento, título, productividad, eliminación de subproductos, tolerancia a las desviaciones del procedimiento, temperatura de crecimiento y tasa de crecimiento óptimas. En algunas realizaciones, el promotor de acuerdo con la invención, o la unidad de expresión de acuerdo con la invención, se usa para aumentar un gen diana en un microorganismo (sobreexpresión). La sobreexpresión generalmente significa un aumento en la concentración o actividad intracelular de un ácido ribonucleico, una proteína (polipéptido) o una enzima, en comparación con la cepa de partida (cepa parental) o la cepa de tipo salvaje, si esta última es la cepa de partida. En algunas realizaciones, el promotor según la invención, o la unidad de expresión según la invención, se usa para disminuir un gen diana en un microorganismo (subexpresión). La subexpresión generalmente significa una disminución en la concentración o actividad intracelular de un ácido ribonucleico, una proteína (polipéptido) o una enzima, en comparación con la cepa de partida (cepa parental) o la cepa de tipo salvaje, si esta última es la cepa de partida. En algunas realizaciones, se usa una combinación de promotores y/o unidades de expresión de acuerdo con la invención para regular la expresión de más de un gen diana en un microorganismo, en el que cada gen diana está aumentado o disminuido. En algunas realizaciones, los genes diana aumentados o disminuidos por la combinación de promotores y/o unidades de expresión son parte de la misma ruta metabólica. En algunas realizaciones, los genes diana aumentados o disminuidos por la combinación de promotores y/o unidades de expresión no forman parte de la misma ruta metabólica.

Los promotores descritos aquí pueden usarse en combinación con otros métodos muy bien conocidos en la técnica para atenuar (reducir o eliminar) la actividad intracelular de una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo que son codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo usando un promotor débil o usando un gen, o alelo, que codifica una enzima correspondiente con una actividad baja, o inactiva el gen o enzima (proteína) correspondiente, y opcionalmente combinando estas medidas.

La reducción de la expresión génica puede tener lugar mediante un cultivo adecuado o mediante modificación genética (mutación) de las estructuras de señal de la expresión génica. Las estructuras de señal de la expresión génica son, por ejemplo, genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de unión a ribosomas, el codón de inicio, y terminadores. El experto puede encontrar información sobre esto, por ejemplo en la solicitud de patente WO 96/15246, en Boyd y Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), en Voskuil y Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), en Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), Vasicová et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)), y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tal como, por ejemplo, el libro de texto de (“Molekulare Genetik [Genética Molecular]”, 6a edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o el de Winnacker (“Gene und Klone [Genes y Clones]”, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990).

Las mutaciones que conducen a un cambio o reducción de las propiedades catalíticas de las proteínas enzimáticas se conocen desde la técnica anterior; ejemplos que pueden mencionarse son los trabajos de Qiu y Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611 -8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760­ 1762 (1997)) y Mockel (“Die Threonindehydrataseaus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms [Treonina deshidratasa de Corynebacterium glutamicum: Cancelación de la regulación alostérica y estructura de la enzima]”, Reports from the Jülich Research Centre, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Alemania, 1994). Se pueden encontrar descripciones completas en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tal como, por ejemplo, el de Hagemann (“Allgemeine Genetik [Genética General]”, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Las posibles mutaciones son transiciones, transversiones, inserciones y supresiones. Dependiendo del efecto del intercambio de aminoácidos sobre la actividad enzimática, se hace referencia a mutaciones de sentido erróneo o mutaciones sin sentido. Las inserciones o supresiones de al menos un par de bases en un gen conducen a mutaciones de cambio de marco, como consecuencia de las cuales se incorporan aminoácidos incorrectos o la traducción se interrumpe prematuramente. Las supresiones de varios codones conducen típicamente a una pérdida completa de la actividad enzimática. Las instrucciones sobre la generación de tales mutaciones son técnica anterior, y se pueden encontrar en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tal como, por ejemplo, el libro de texto de Knippers (“Molekulare Genetik [Genética Molecular]”, 6a edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker (“Gene und Klone [Genes y Clones]”, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann (“Allgemeine Genetik [Genética General]”, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986). Un método común de mutación de genes de C. glutamicum es el método de alteración y reemplazo de genes descrito por Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)).

En el método de alteración de genes, una parte central de la región codificante del gen de interés se clona en un vector plasmídico que puede replicarse en un hospedante (típicamente E. c o l) pero no en C. glutamicum. Los posibles vectores son, por ejemplo, pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1,784-791 (1983)), pK18mob o pK19mob (Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB o pK19mobsacB (Jager et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, Wis., USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; patente U.S. n° 5.487.993), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Holland; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) o pEMl (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516). El vector plasmídico que contiene la parte central de la región codificante del gen se transfiere entonces a la cepa deseada de C. glutamicum por conjugación o transformación. El método de conjugación se describe, por ejemplo, por Schafer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Los métodos para la transformación se describen, por ejemplo, por Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican y Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). Después de la recombinación homóloga mediante un evento de “entrecruzamiento”, la región codificante del gen en cuestión es interrumpida por la secuencia del vector y se obtienen dos alelos incompletos, uno sin el extremo 3’ y el otro sin el extremo 5’. Este método se ha utilizado, por ejemplo, por Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) para eliminar el gen recA de C. glutamicum.

En el método de reemplazo de genes, se crea in vitro una mutación, tal como, por ejemplo, una supresión, inserción o intercambio de bases, en el gen de interés. El alelo preparado se clona a su vez en un vector que no es replicativo para C. glutamicum, y entonces éste se transfiere al hospedante deseado de C. glutamicum por transformación o conjugación. Después de la recombinación homóloga por medio de un primer evento de “entrecruzamiento” que efectúa la integración, y un segundo evento de “entrecruzamiento” adecuado que efectúa la escisión en el gen diana o en la secuencia diana, se logra la incorporación de la mutación o del alelo. Este método se utilizó, por ejemplo, por Peters-Wendisch (Microbiology 144, 915-927 (1998)) para eliminar el gen pyc de C. glutamicum mediante una supresión.

Los promotores descritos aquí se pueden usar en combinación con otros métodos muy conocidos en la técnica para aumentar (mejorar) la actividad intracelular de una o más enzimas en un microorganismo que son codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo aumentando el número de copias del gen o genes, usando un promotor fuerte, o usando un gen que codifica una enzima correspondiente que tiene una actividad elevada, y opcionalmente combinando estas medidas.

Para lograr una sobreexpresión, se puede aumentar el número de copias de los genes correspondientes, o alternativamente, se puede mutar la región promotora y de regulación o el sitio de unión al ribosoma ubicado en dirección 5’ del gen de estructura. Los casetes de expresión que se incorporan en dirección 5’ del gen de estructura actúan de la misma manera. Mediante promotores inducibles, es posible además aumentar la expresión en el curso de la producción enzimática de aminoácidos. La expresión se mejora de manera similar mediante medidas destinadas a prolongar la vida útil del ARNm. Además, la actividad enzimática también se mejora al evitar la degradación de la proteína enzimática. Los genes o los constructos génicos pueden estar presentes en plásmidos que tienen diferentes números de copias, o pueden integrarse y amplificarse en el cromosoma. Alternativamente, se puede lograr además una sobreexpresión de los genes relevantes alterando la composición del medio y las condiciones de cultivo.

El experto en la técnica puede encontrar detalles sobre lo anterior en, entre otros, Martin et al. (Bio/Technology 5, 137­ 146 (1987)), en Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en la memoria descriptiva de Patente Europea 0472869, en la patente U.S. n° 4.601.893, en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la Solicitud de Patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), en la memoria descriptiva japonesa abierta al público JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), en Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)), y en libros de texto conocidos sobre genética y biología molecular.

Los genes se pueden sobreexpresar, por ejemplo, mediante plásmidos episomales. Los plásmidos adecuados son aquellos que se replican en bacterias corineformes. Numerosos vectores plasmídicos conocidos, tales como, por ejemplo, pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) o pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)) se basan en los plásmidos crípticos pHM1519, pBL1 o pGA1. Se puede usar de forma similar otros vectores plasmídicos, tales como, por ejemplo, los basados en pCG4 (patente U.S. n° 4.489.160), o pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), o pAG1 (patente U.S. n25.158.891).

Además, también son adecuados aquellos vectores plasmídicos con cuya ayuda se puede emplear el proceso de amplificación génica por integración en el cromosoma, tal como se ha descrito, por ejemplo, por Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para la duplicación y amplificación del operón hom-thrB. En este método, el gen completo se clona en un vector plásmido que puede replicarse en un hospedante (típicamente E. coli) pero no en C. glutamicum. Los vectores adecuados son, por ejemplo, pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob o pK19mob (Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wis., USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; patente U.S. n° 5.487.993), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Países Bajos; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534­ 541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516) o pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342). El vector plasmídico que contiene el gen que se va a amplificar se transfiere entonces por conjugación o transformación en la cepa deseada de C. glutamicum. El método de conjugación se describe, por ejemplo, en Schafer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Los métodos de transformación se describen, por ejemplo, en Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican y Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). Después de la recombinación homóloga mediante un evento de entrecruzamiento, la cepa resultante contiene al menos dos copias del gen relevante.

Los métodos para regular, es decir, aumentar o disminuir, la expresión génica incluyen métodos recombinantes en los que se produce un microorganismo usando una molécula de ADN proporcionada in vitro. Tales moléculas de ADN comprenden, por ejemplo, promotores, casetes de expresión, genes, alelos, regiones codificantes, etc. Se introducen en los microorganismos deseados mediante métodos de transformación, conjugación, transducción, o métodos similares.

En el caso de la presente invención, los promotores son preferiblemente un polinucleótido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 8, y los casetes de expresión son preferiblemente un polinucleótido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ^{S e Q} ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, ^{S e Q} ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 8 que, a través del nucleótido en su extremo 3’, están funcionalmente unidos a un polinucleótido enlazador que asegura la traducción del ARN.

Las medidas de sobreexpresión que utilizan el promotor según la invención o la unidad de expresión según la invención aumentan la actividad o concentración del polipéptido correspondiente habitualmente en al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, preferiblemente en no más de 1.000%, 2.000%, 4.000%, 10.000% o 20.000%, basado en la actividad o concentración de dicho polipéptido en la cepa antes de la medida que da como resultado sobreexpresión.

El grado de expresión o sobreexpresión puede establecerse midiendo la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen, determinando la cantidad de polipéptido, y determinando la actividad enzimática.

La cantidad de ARNm se puede determinar, entre otros, usando los métodos de “Transferencia Northern” y de RT-PCR cuantitativa. La RT-PCR cuantitativa implica la transcripción inversa que precede a la reacción en cadena de la polimerasa. Para ello, se puede usar el sistema LightCycler™ de Roche Diagnostics (Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania), como se describe, por ejemplo, en Jungwirth et al. (FEMS Microbiology Letters 281, 190-197 (2008)). La concentración de la proteína se puede determinar mediante fraccionamiento en gel de proteína en 1 y 2 dimensiones y la posterior identificación óptica de la concentración de proteína usando el software de evaluación apropiado, en el gel. Un método habitual para preparar geles de proteínas para bacterias corineformes y para identificar dichas proteínas es el procedimiento descrito por Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)). Asimismo, la concentración de proteína puede determinarse mediante hibridación por Transferencia Western usando un anticuerpo específico para la proteína a detectar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) y mediante evaluación óptica posterior usando el software apropiado para la determinación de la concentración (Lohaus y Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)). La significancia estadística de los datos recopilados se determina mediante una prueba de la T (Gosset, Biometrika 6(1): 1-25 (1908)).

La medida de sobreexpresión de genes diana usando el promotor según la invención puede combinarse de manera adecuada con otras medidas de sobreexpresión. La sobreexpresión se logra mediante una multiplicidad de métodos disponibles en la técnica anterior. Estos incluyen aumentar el número de copias, además de modificar las secuencias nucleotídicas que dirigen o controlan la expresión del gen. El número de copias se puede incrementar mediante plásmidos que se replican en el citoplasma del microorganismo. Para este fin, en el estado de la técnica se describen abundantes plásmidos para grupos de microorganismos muy diferentes, plásmidos que pueden usarse para establecer el aumento deseado en el número de copias del gen. Los plásmidos adecuados para el género Corynebacterium se describen, por ejemplo, en Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 27-40, (2003)), y en Stansen et al. (Applied and Environmental Microbiology 71,5920-5928 (2005)).

Además, el número de copias puede aumentarse en al menos una (1) copia introduciendo copias adicionales en el cromosoma del microorganismo. Métodos adecuados para el género Corynebacterium se describen, por ejemplo, en las patentes WO 03/014330, WO 03/040373 y WO 04/069996.

Además, la expresión génica puede aumentarse colocando una pluralidad de promotores en dirección 5’ del gen diana, o uniéndolos funcionalmente al gen que se va a expresar, y logrando de esta manera una mayor expresión. Ejemplos de esto se describen en la patente WO 2006/069711.

La transcripción de un gen está controlada, cuando sea apropiado, por proteínas que inhiben (proteínas represoras) o promueven (proteínas activadoras) la transcripción. Por consiguiente, la sobreexpresión también se puede lograr aumentando la expresión de las proteínas activadoras o reduciendo o desconectando la expresión de las proteínas represoras, o también eliminando los sitios de unión de las proteínas represoras. La tasa de elongación está influenciada por el uso de codones, siendo posible potenciar la traducción usando codones para los ARN de transferencia (ARNt) que son frecuentes en la cepa de partida. Además, la sustitución de un codón de inicio por el codón ATG más frecuente en muchos microorganismos (77% en E. coli) puede mejorar considerablemente la traducción, ya que, a nivel de ARN, el codón AUG es dos a tres veces más eficaz que los codones GUG y UUG, por ejemplo (Khudyakov et al., FEBS Letters 232(2):369-71 (1988); Reddy et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17):5656-60 (1985)). También es posible optimizar las secuencias que rodean el codón de inicio, debido a que se han descrito efectos sinérgicos entre el codón de inicio y las regiones flanqueantes (Stenstrom et al., Gene 273(2):259-65 (2001); Hui et al., EMBO Journal 3(3):623-9 (1984)).

Las instrucciones para manipular ADN, digerir y ligar el ADN, transformar y seleccionar transformantes, se pueden encontrar, entre otros, en el manual conocido de Sambrook et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

La invención también se refiere a vectores que comprenden los polinucleótidos según la invención.

Kirchner y Tauch (Journal of Biotechnology 104:287-299 (2003)) describen una selección de vectores que se usarán en C. glutamicum.

La recombinación homóloga usando los vectores de acuerdo con la invención permite que los segmentos de ADN en el cromosoma sean reemplazados por polinucleótidos de acuerdo con la invención que son transportados al interior de la célula por el vector. Para una recombinación eficiente entre la molécula de ADN circular del vector y el ADN diana en el cromosoma, la región de ADN a reemplazar por el polinucleótido de acuerdo con la invención se proporciona en los extremos con secuencias nucleotídicas homólogas al sitio diana que determinan el sitio de integración del vector y de reemplazo del ADN.

De este modo, el polinucleótido promotor de acuerdo con la invención puede: 1) reemplazarse por el promotor nativo en el locus genético nativo del gen diana en el cromosoma; o 2) integrarse con el gen diana en el locus genético nativo de este último, o en otro locus genético.

“Reemplazo del promotor nativo en el locus genético nativo del gen diana” significa el hecho de que se reemplaza el promotor natural del gen que habitualmente está presente de forma natural por medio de una sola copia en su locus genético en el tipo salvaje correspondiente u organismo de partida correspondiente en la forma de su secuencia nucleotídica.

“Otro locus genético” significa un locus genético cuya secuencia nucleotídica es diferente de la secuencia del gen diana. Dicho otro locus genético o la secuencia nucleotídica en dicho otro locus genético está situado preferiblemente dentro del cromosoma, y normalmente no es esencial para el crecimiento y para la producción de los compuestos químicos deseados. Además, es posible usar regiones intergénicas dentro del cromosoma, es decir, secuencias nucleotídicas sin función codificante.

La expresión o sobreexpresión se lleva a cabo preferiblemente en microorganismos del género Corynebacterium. Dentro del género Corynebacterium, se da preferencia a las cepas basadas en las siguientes especies: C. efficiens, siendo la cepa de tipo depositada DSM44549, C. glutamicum, siendo la cepa de tipo depositada ATCC 13032, y C. ammoniagenes, siendo la cepa de tipo depositada ATCC6871. Se da preferencia muy particular a la especie C. glutamicum.

Cepas adecuadas del género Corynebacterium, en particular de la especie Corynebacterium glutamicum, son, en particular, las cepas de tipo salvaje conocidas: Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, y Brevibacterium divaricatum ATCC 14020; y mutantes productores de L-aminoácidos, o cepas, preparadas a partir de ellos, tales como, por ejemplo, las cepas productoras de L-lisina: Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709, Brevibacterium flavum FERM-P 1708, Brevibacterium lactofermentum Fe Rm -P 1712, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464, Corynebacterium glutamicum DM58-1, Corynebacterium glutamicum DG52-5, Corynebacterium glutamicum DSM5714, y Corynebacterium glutamicum DSM12866.

La expresión "Micrococcus glutamicus” también se ha utilizado para C. glutamicum. Algunos representantes de la especie C. efficiens también han sido denominados como C. thermoaminogenes en la técnica anterior, tal como, por ejemplo, la cepa FERM BP-1539.

Los microorganismos o cepas (cepas de partida) empleados para las medidas de expresión o sobreexpresión de acuerdo con la invención preferiblemente ya poseen la capacidad de segregar una sustancia química fina deseada en el medio nutritivo circundante y acumularse allí. La expresión “producir” también se usa aquí para esto, más abajo. Más específicamente, las cepas empleadas para las medidas de sobreexpresión poseen la capacidad de acumular la sustancia química fina deseada en concentraciones de al menos 0,10 g/l, al menos 0,25 g/l, al menos 0,5 g/l, al menos 1,0 g/l, al menos 1,5 g/l, al menos 2,0 g/l, al menos 4,0 g/l, o al menos 10,0 g/l en no más de 120 horas, no más de 96 horas, no más de 48 horas, no más de 36 horas, no más de 24 horas, o no más de 12 horas en la célula o en el medio nutriente. Las cepas de partida son preferiblemente cepas preparadas mediante mutagénesis y selección, mediante tecnologías de ADN recombinante, o mediante una combinación de ambos métodos.

Un experto en la técnica entenderá que también se puede obtener un microorganismo adecuado para las medidas de la invención empleando en primer lugar el promotor según la invención de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID No : 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 8 para la sobreexpresión de los genes diana en una cepa salvaje tal como, por ejemplo, la cepa ATCC 13032 o la cepa ATCC 14067 de tipo C. glutamicum, y después, por medio de otras medidas genéticas descritas en la técnica anterior, haciendo que el microorganismo produzca la o las sustancias químicas finas deseadas.

El término “biomoléculas” significa, con respecto a las medidas de la invención, aminoácidos, ácidos orgánicos, vitaminas, nucleósidos, y nucleótidos. Se da preferencia particular a los aminoácidos proteinogénicos, los aminoácidos no proteinogénicos, las macromoléculas, y los ácidos orgánicos.

“Aminoácidos proteinogénicos” significa los aminoácidos que se encuentran en las proteínas naturales, es decir, en proteínas de microorganismos, plantas, animales, y seres humanos. Sirven como unidades estructurales para proteínas en las que están unidas entre sí mediante enlaces peptídicos.

Cuando se mencionen aquí más abajo L-aminoácidos o aminoácidos, se entenderá que significan uno o más aminoácidos, incluyendo sus sales, seleccionados del grupo L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, y L-arginina. Se prefiere especialmente la L-lisina. Los L-aminoácidos, en particular la lisina, se utilizan en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria, y muy particularmente en la alimentación animal. Por tanto, existe un interés general en proporcionar nuevos procedimientos mejorados para la preparación de aminoácidos, en particular L-lisina.

Los términos proteína y polipéptido son intercambiables.

La presente invención proporciona un microorganismo que produce una sustancia química fina, teniendo dicho microorganismo una expresión aumentada de uno o más genes, en comparación con la cepa de partida particular, mediante el uso del promotor de acuerdo con la invención de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 8.

Preparación fermentativa

La presente invención proporciona además un procedimiento para la preparación fermentativa de una sustancia química fina, que comprende las etapas de:

a) cultivar el microorganismo descrito anteriormente de acuerdo con la presente invención en un medio adecuado, dando como resultado un caldo de fermentación; y

b) concentrar la sustancia química fina en el caldo de fermentación de a) y/o en las células del microorganismo.

Se da preferencia aquí a obtener, a partir del caldo de fermentación que contiene la sustancia química fina, la sustancia química fina o un producto líquido o sólido que contiene la sustancia química fina. Los microorganismos producidos pueden cultivarse de forma continua - como se describe, por ejemplo, en el documento WO 05/021772 -, o de forma discontinua en un procedimiento por lotes (cultivo por lotes) o en un procedimiento de lote alimentado o de lote alimentado repetido, con el fin de producir el compuesto químico orgánico deseado. Un resumen de carácter general sobre métodos de cultivo conocidos está disponible en el libro de texto de Chmiel (Bioprozeptechnik. 1: Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren and periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo o medio de fermentación a usar debe satisfacer de manera adecuada las demandas de las cepas respectivas. Las descripciones de los medios de cultivo para diversos microorganismos están presentes en el “Manual of Methods for General Bacteriology” de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Las expresiones medio de cultivo y medio de fermentación son intercambiables.

Es posible usar, como fuente de carbono, azúcares e hidratos de carbono, tales como, por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, disoluciones que contienen sacarosa procedentes del procesamiento de la remolacha azucarera o de la caña de azúcar, almidón, hidrolizado de almidón, y celulosa; aceites y grasas tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete, y grasa de coco; ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico, y ácido linoleico; alcoholes tales como, por ejemplo, glicerol, metanol, y etanol; y ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido láctico.

Es posible usar, como fuente de nitrógeno, compuestos orgánicos que contienen nitrógeno tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz, harina de soja, y urea; o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio, y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden usar individualmente o como mezcla.

Es posible usar, como fuente de fósforo, ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio, o hidrogenofosfato de dipotasio, o las correspondientes sales que contienen sodio.

El medio de cultivo puede comprender adicionalmente sales, por ejemplo en forma de cloruros o sulfatos, de metales tales como, por ejemplo, sodio, potasio, magnesio, calcio, y hierro, tal como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarios para el crecimiento. Finalmente, se pueden emplear factores de crecimiento esenciales tales como aminoácidos, por ejemplo homoserina y vitaminas, por ejemplo tiamina, biotina o ácido pantoténico, además de las sustancias antes mencionadas.

Dichos materiales de partida pueden añadirse al cultivo en forma de un único lote, o pueden alimentarse durante el cultivo de manera adecuada.

El pH del cultivo se puede controlar empleando de una manera adecuada compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco, o amoniaco acuoso; o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. El pH se ajusta generalmente a un valor de 6,0 a 8,5, preferiblemente 6,5 a 8. Para controlar la formación de espuma, es posible emplear antiespumantes tales como, por ejemplo, ésteres de poliglicol con ácidos grasos. Para mantener la estabilidad de los plásmidos, es posible añadir al medio sustancias selectivas adecuadas tales como, por ejemplo, antibióticos. La fermentación se lleva a cabo preferiblemente en condiciones aerobias. Para mantener estas condiciones, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno tales como, por ejemplo, aire. Asimismo, es posible usar líquidos enriquecidos con peróxido de hidrógeno. La fermentación se lleva a cabo eventualmente a una presión elevada, por ejemplo a una presión elevada de 0,03 a 0,2 MPa. La temperatura del cultivo es normalmente de 20°C a 45°C, y preferiblemente de 25°C a 40°C, particularmente de forma preferible de 30°C a 37°C. En los procedimientos discontinuos o de lote alimentado, el cultivo se continúa preferiblemente hasta que se haya formado una cantidad del compuesto químico orgánico deseado suficiente para ser recuperado. Este objetivo se alcanza normalmente en 10 horas a 160 horas. En procedimientos continuos, son posibles tiempos de cultivo más largos. La actividad de los microorganismos da como resultado una concentración (acumulación) del compuesto químico orgánico en el medio de fermentación y/o en las células de dichos microorganismos.

Los ejemplos de medios de fermentación adecuados se pueden encontrar, entre otros, en las patentes US 5.770.409, US 5.990.350, US 5.275.940, WO 2007/012078, US 5.827.698, WO 2009/043803, US 5.756.345 y US 7.138.266.

El análisis de L-aminoácidos para determinar la concentración en uno o más momentos durante la fermentación puede tener lugar separando los L-aminoácidos mediante cromatografía de intercambio iónico, preferiblemente cromatografía de intercambio catiónico, con la posterior derivatización posterior a la columna usando ninhidrina, como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry 30:1190-1206 (1958)). También es posible emplear orfo-ftaldialdehído en lugar de ninhidrina para la derivatización posterior a la columna. Se puede encontrar un artículo general sobre cromatografía de intercambio iónico en Pickering (LC-GC Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989)).

Asimismo, es posible llevar a cabo una derivatización previa a la columna, por ejemplo usando orfo-ftaldialdehído o isotiocianato de fenilo, y fraccionar los derivados de aminoácidos resultantes mediante cromatografía de fase inversa (RP), preferiblemente en forma de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Un método de este tipo se describe, por ejemplo, en Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51:1167-1174 (1979)).

La detección se lleva a cabo fotométricamente (absorción, fluorescencia).

Una revisión sobre el análisis de aminoácidos se puede encontrar, entre otros, en el libro de texto “Bioanalytik” de Lottspeich y Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania 1998).

La determinación de la concentración de a-cetoácidos en uno o más puntos de tiempo en el transcurso de la fermentación puede llevarse a cabo separando los cetoácidos y otros productos segregados mediante cromatografía de intercambio iónico, preferiblemente cromatografía de intercambio catiónico, en un polímero de estirenodivinilbenceno sulfonado, en forma H+, por ejemplo mediante ácido sulfúrico 0,025 M, con detección UV posterior a 215 nm (alternativamente también a 230 o 275 nm). Preferiblemente, se puede emplear una columna REZEK RFQ - Fast Fruit H+ (Phenomenex), pero son factibles otros proveedores para la fase de separación (por ejemplo Aminex de BioRad). Los proveedores describen separaciones similares en ejemplos de aplicación.

El comportamiento de los procedimientos o los procedimientos de fermentación que contienen las variantes promotoras según la invención, en términos de uno o más de los parámetros seleccionados del grupo de concentración (compuesto formado por unidad de volumen), rendimiento (compuesto formado por unidad de fuente de carbono consumida), formación (compuesto formado por unidad de volumen y tiempo), y formación específica (compuesto formado por unidad de materia celular seca o biomasa seca y tiempo, o compuesto formado por unidad de proteína celular y tiempo), o también otros parámetros del procedimiento y sus combinaciones, se incrementa en al menos 0,5%, al menos 1%, al menos 1,5%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, o al menos 100% en base a los procedimientos o los procedimientos de fermentación usando microorganismos que no contengan las variantes promotoras según la invención. Esto se considera muy valioso en términos de un procedimiento industrial a gran escala.

Las medidas de fermentación dan como resultado un caldo de fermentación que contiene la sustancia química fina deseada, preferiblemente aminoácidos, ácidos orgánicos, vitaminas, nucleósidos, o nucleótidos.

Entonces, se proporciona o produce o recupera en forma líquida o sólida un producto que contiene la sustancia química fina.

Por caldo de fermentación se entiende un medio de fermentación o medio nutriente en el que se ha cultivado un microorganismo durante un tiempo determinado y a una temperatura determinada. El medio de fermentación o los medios empleados durante la fermentación comprenden todas las sustancias o componentes que aseguran la producción del compuesto deseado, y típicamente la propagación y viabilidad.

Cuando se completa la fermentación, el caldo de fermentación resultante comprende en consecuencia:

a) la biomasa (masa celular) del microorganismo, habiéndose producido dicha biomasa debido a la propagación de las células de dicho microorganismo;

b) la sustancia química fina deseada formada durante la fermentación;

c) los subproductos orgánicos posiblemente formados durante la fermentación; y

d) los constituyentes del medio de fermentación empleado o de los materiales de partida, tales como, por ejemplo, vitaminas tales como biotina o sales tales como sulfato de magnesio, que no se han consumido en la fermentación.

Los subproductos orgánicos incluyen sustancias que son producidas por los microorganismos empleados en la fermentación, además del compuesto deseado particular, y opcionalmente se segregan.

El caldo de fermentación se elimina del recipiente de cultivo o del tanque de fermentación, se recolecta cuando sea apropiado, y se usa para proporcionar un producto que contiene la sustancia química fina en forma líquida o sólida. La expresión “recuperar el producto que contiene la sustancia química fina” también se utiliza para esto. En el caso más simple, el propio caldo de fermentación que contiene la sustancia química fina, que se ha extraído del tanque de fermentación, constituye el producto recuperado.

Una o más de las medidas seleccionadas del grupo que consiste en

a) eliminación parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o virtualmente completa (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98% o > 99%) del agua;

b) eliminación parcial (>0% a <80%) a completa (100%) o virtualmente completa (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98% o > 99%) de la biomasa, opcionalmente inactivándose esta última antes de la eliminación;

c) eliminación parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o virtualmente completa (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%, > 99,3%, o > 99,7%) de los subproductos orgánicos formados durante la fermentación; y

d) eliminación parcial (> 0%) a completa (100%) o virtualmente completa (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%, > 99,3%, o > 99,7%) de los constituyentes del medio de fermentación empleado o de los materiales de partida, que no se han consumido en la fermentación, del caldo de fermentación logra la concentración o purificación del compuesto químico orgánico deseado. De esta forma se aíslan los productos que tienen un contenido deseado de dicho compuesto.

La eliminación parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o virtualmente completa (> 80% a < 100%) del agua (medida a)) también se denomina secado.

En una variante del procedimiento, la eliminación completa o virtualmente completa del agua, de la biomasa, de los subproductos orgánicos, y de los constituyentes no consumidos del medio de fermentación empleado da como resultado formas de producto puras (> 80% en peso, > 90% en peso) o de alta pureza (> 95% en peso, > 97% en peso, o > 99% en peso) del compuesto químico orgánico deseado. En la técnica anterior está disponible una gran cantidad de instrucciones técnicas para las medidas a), b), c) y d).

Dependiendo de las necesidades, la biomasa puede eliminarse total o parcialmente del caldo de fermentación mediante métodos de separación tales como, por ejemplo, centrifugación, filtración, decantación, o una combinación de los mismos, o puede dejarse completamente en él. Cuando sea apropiado, la biomasa o el caldo de fermentación que contiene biomasa se inactiva durante una etapa de procedimiento adecuada, por ejemplo mediante tratamiento térmico (calentamiento) o mediante la adición de ácido.

En un procedimiento, la biomasa se elimina de forma completa o virtualmente completa de modo que no (0%) o como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5%, como máximo 1%, o como máximo 0,1% de la biomasa permanece en el producto preparado. En un procedimiento adicional, la biomasa no se elimina, o se elimina solo en pequeñas proporciones, de modo que toda (100%) o más del 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 99,9% de la biomasa permanece en el producto preparado. Por consiguiente, en un procedimiento según la invención, la biomasa se elimina en proporciones de > 0% a < 100%.

Finalmente, el caldo de fermentación obtenido después de la fermentación se puede ajustar, antes o después de la eliminación completa o parcial de la biomasa, a un pH ácido con un ácido inorgánico tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, o ácido fosfórico; o ácido orgánico tal como, por ejemplo, ácido propiónico, para mejorar las propiedades de manipulación del producto final (documento GB 1.439.728 o EP 1331220). Asimismo, es posible acidificar el caldo de fermentación con el contenido completo de biomasa. Finalmente, el caldo también se puede estabilizar añadiendo bisulfito de sodio (NaHCO³ , documento GB 1.439.728) u otra sal, por ejemplo sal de amonio, metal alcalino, o metal alcalinotérreo de ácido sulfuroso.

Durante la eliminación de la biomasa, se eliminan parcial o completamente cualesquiera sólidos orgánicos o inorgánicos presentes en el caldo de fermentación. Los subproductos orgánicos disueltos en el caldo de fermentación, y los componentes no consumidos disueltos del medio de fermentación (materiales de partida), permanecen al menos en parte (> 0%), preferiblemente hasta un grado de al menos 25%, particularmente de forma preferible hasta un grado de al menos 50%, y de forma muy particularmente preferible hasta un grado de al menos 75% en el producto. Cuando sea apropiado, también permanecen completamente (100%) o virtualmente de forma completa, es decir, > 95% o > 98% o > 99%, en el producto. Si un producto en este sentido comprende al menos parte de los constituyentes del caldo de fermentación, esto también se describe con la expresión “producto a base de caldo de fermentación”.

Posteriormente, se elimina el agua del caldo, o dicho caldo se espesa o concentra, por métodos conocidos tales como, por ejemplo, usando un rotavapor, un evaporador de película delgada, un evaporador de película descendente, por ósmosis inversa, o por nanofiltración. A continuación, este caldo de fermentación concentrado se puede procesar hasta obtener productos que fluyen libremente, en particular hasta un polvo fino, o preferiblemente gránulos gruesos, mediante métodos de liofilización, secado por pulverización, granulación por pulverización, o mediante otros procedimientos, tales como en el lecho fluidizado circulante, como se describe, por ejemplo, según el documento PCT/EP2004/006655. El producto deseado se aísla, cuando sea apropiado, de los gránulos resultantes mediante tamizado o eliminación de polvo. Asimismo, es posible secar el caldo de fermentación directamente, es decir, sin concentración previa mediante secado por pulverización o granulación por pulverización.

“Que fluye libremente” significa polvos que, de una serie de vasijas con orificios de vidrio, con orificios de diferentes tamaños, fluyen sin obstáculos al menos fuera de la vasija con un orificio de 5 mm (Klein: Seifen, Ole, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).

“Fino” significa un polvo que tiene predominantemente (> 50%) un tamaño de partícula de un diámetro de 20 a 200 mm.

“Grueso” significa un producto predominantemente (> 50%) de un tamaño de partícula de un diámetro de 200 a 2000 mm.

La determinación del tamaño de partícula se puede llevar a cabo mediante métodos de espectrometría de difracción láser. Los métodos correspondientes se describen en el libro de texto “Teilchengrópenmessung in der Laborpraxis” de R. H. Müller y R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996), o en el libro de texto “Introduction to Particle Technology” de M. Rhodes, publicado por Wiley & Sons (1998).

El polvo fino que fluye libremente se puede convertir a su vez mediante procedimientos de compactación o granulación adecuados en un producto grueso, que fluye muy libremente, almacenable y sustancialmente libre de polvo.

La expresión “libre de polvo” significa que el producto comprende solo pequeñas proporciones (< 5%) de tamaños de partículas por debajo de 100 pm de diámetro.

“Almacenable”, en el sentido de esta invención, significa un producto que se puede almacenar durante al menos un (1) año o más, preferiblemente al menos 1,5 años o más, particularmente de forma preferible dos (2) años o más, en un lugar seco y fresco, sin que se produzca ninguna pérdida sustancial del compuesto químico orgánico respectivo. “Pérdida sustancial” significa una pérdida de >5%.

Es ventajoso emplear durante la granulación o compactación los auxiliares o vehículos orgánicos o inorgánicos habituales tales como almidón, gelatina, derivados de celulosa, o sustancias similares, que se utilizan normalmente en el procesamiento de productos alimenticios o piensos como aglutinantes, gelificantes o espesantes, u otras sustancias tales como, por ejemplo, sílices, silicatos (documento EP0743016A) y estearatos.

Es además ventajoso tratar la superficie de los gránulos resultantes con aceites o grasas como se describe en el documento WO04/054381. Los aceites que se pueden usar son aceites minerales, aceites vegetales, o mezclas de aceites vegetales. Ejemplos de tales aceites son aceite de soja, aceite de oliva, mezclas de aceite de soja/lecitina. Del mismo modo, también son adecuados los aceites de silicona, los polietilenglicoles, o la hidroxietilcelulosa. El tratamiento de las superficies de los gránulos con dichos aceites consigue una mayor resistencia a la abrasión del producto y una reducción del contenido de polvo. El contenido de aceite en el producto es 0,02 a 2,0% en peso, preferiblemente 0,02 a 1,0% en peso, y de forma muy particularmente preferible 0,2 a 1,0% en peso, basado en la cantidad total del aditivo alimentario.

Los productos preferidos tienen una proporción de > 97% en peso con un tamaño de partícula de 100 a 1800 pm, o una proporción de > 95% en peso con un tamaño de partícula de diámetro de 300 a 1800 pm. La proporción de polvo, es decir, las partículas con un tamaño de partícula < 100 pm, es preferiblemente > 0 a 1% en peso, de manera particularmente preferible que no exceda 0,5% en peso.

Sin embargo, alternativamente, el producto también se puede absorber sobre un portador orgánico o inorgánico conocido y habitual en el procesamiento de piensos, tales como, por ejemplo, sílices, silicatos, harinas, salvados, harinas, almidones, azúcares u otros, y/o se puede mezclar y estabilizar con los espesantes o aglutinantes habituales. En la bibliografía se describen ejemplos de uso y procedimientos para los mismos (Die Mühle Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, página 817).

e j e m p l o s

Ejemplo 1: identificación de promotores candidatos.

Se utilizó el siguiente procedimiento para identificar promotores nativos de C. glutamicum que cumplían con los dos criterios siguientes: 1) representaban una escalera de promotores constitutivos; y 2) podrían estar codificados por secuencias de ADN cortas, idealmente menos de 100 pares de bases. Un conjunto de datos publicados que describen los niveles de expresión génica global en C. glutamicum ATCC 13032 (Lee et al., Biotechnology Letters, 2013) se examinó para identificar genes que se expresaron constitutivamente en diferentes condiciones de crecimiento. Los genes cuyo nivel de expresión permaneció constante (definido como una relación de expresión entre 0,33 y 3) en dos condiciones de crecimiento, a saber, el crecimiento de quimiostato en medios mínimos con y sin la adición de peróxido de hidrógeno, cumplieron el primer criterio. Un conjunto de datos publicados que describe el transcriptoma de C. glutamicum ATCC 13032 (Pfeifer-Sancar et al., BMC Genomics 2013, 14:888) se examinó para encontrar genes con promotores compactos, es decir, los que consisten en una región promotora del núcleo de 60 pares de bases y una región sin traducir de 5’ entre 26 y 40 pares de bases de longitud. Los dos conjuntos de datos se cruzaron para identificar los promotores que cumplían con ambos criterios. Véase la Figura 1. Se seleccionaron cinco promotores candidatos (SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 6, y 8) para una evaluación posterior.

Ejemplo 2: Evaluación de la actividad de los promotores candidatos

Para evaluar la actividad de los promotores candidatos, se diseñó un conjunto de constructos informadores de fluorescencia basados en plásmidos. Brevemente, cada promotor se clonó frente a eyfp, un gen que codifica la proteína fluorescente amarilla en el vector lanzadera pK18rep. Estos plásmidos se transformaron en C. glutamicum NRRL B-11474, y la actividad promotora se evaluó midiendo la acumulación de proteína YFP por espectrometría.

El vector lanzadera pK18rep se construyó reemplazando el gen sacB en pK18mobSacB (ATCC 87087) por el origen de replicación pBL1 (GenBank: AF092037.1), dando como resultado un vector capaz de propagarse tanto en E. coli como en C. glutamicum. Brevemente, amplificamos por PCR una porción de pK18mobSacB que contiene el origen de replicación de E. coli y el gen de resistencia a kanamicina nptlI usando los cebadores pK18F (TCATGACCAAAATCCCTTAACGTG (SEQ ID NO:9)) y pK18R (GCGTACTCTTCGATGGTGAAAACATCTC (SEQ ID NO:10)), y amplificamos por PCR ADN sintético que codifica el origen de replicación pBLl con los cebadores pBLIF (GACCTAAAATGTGTAAAGGGCAAAGTGTATACaacaacaagacccatcatagtttgc (SEQ ID NO:11)) y pBL1R (CACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAcacatgcagtcatgtcgtgc (SEQ ID NO:12)). Los productos de PCR se trataron con Dpnl (New England Biolabs) cuando fue apropiado, se purificaron con DNA Clean & Concentrate-5 (Zymo Research), y se ensamblaron usando el método de Ensamblaje de Gibson con Gibson Assembly Master Mix (NEB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción de Ensamblaje de Gibson se transformó en células competentes NEB Turbo (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los transformantes se seleccionaron en agar LB más 25 mg/ml de kanamicina, y se verificaron mediante secuenciación de Sanger.

El constructo informador pK18rep-Psod-eyfp se construyó mediante digestión de restricción y ligación de pK18rep y un constructo de ADN sintético que consiste en una secuencia de ADN de 191 pares de bases que codifica el promotor de superóxido disumutasa (GenBank: BA000036.3) de C. glutamicum ATCC 13032 en dirección 5’ del gen eyfp, seguida de una secuencia de ADN de 77 pares de bases que codifica el terminador sod de C. glutamicum ATCC 13032 flanqueada por los sitios de restricción EcoRI y Sall. El vector parental y el inserto de ADN sintético se digirieron con EcoRI-HF y Sall-HF (New England Biolabs), y los productos resultantes se hicieron pasar en un gel de agarosa. El ADN se extrajo del gel, y se purificó usando el Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research) y se ligó con T4 DNA ligase (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción de ligación se transformó en células competentes NEB Turbo (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los transformantes se seleccionaron en agar LB más 25 mg/ml de kanamicina, y se verificaron mediante secuenciación de Sanger.

Se construyeron constructos informadores de promotores adicionales reemplazando el promotor de sod en pK18rep-Psod-eyfp. Amplificamos por PCR pK18rep-Psod-eyfp, excluyendo el promotor sod, con los cebadores pK18repR (gcttgcatgcctgcaggtcga (SEQ ID NO: 13)) e yfpF (ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC (SEQ ID NO: 14)). El producto de PCR se trató con DpnI (New England Biolabs), y se purificó con DNA Clean & Concentrate-5 (Zymo Research) y se ensambló con constructos de ADN sintético que codifican el promotor de interés más la secuencia de homología de 25 pares de bases al vector de destino usando el método de Ensamblaje de Gibson con Gibson Assembly Master Mix (NEB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción de Ensamblaje de Gibson se transformó en células competentes NEB Turbo (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los transformantes se seleccionaron en agar LB más 25 mg/ml de kanamicina, y se verificaron mediante secuenciación de Sanger.

Además, se escogió el promotor constitutivo fuerte Pcg0007 (SEQ ID NO: 2) para la mutagénesis. En C. glutamicum, se piensa que el elemento -10 desempeña un papel clave en la determinación de la actividad promotora (Pfeifer-Sancar et al., BMC Genomics 2013, 14:888); por lo tanto, cuatro de las seis posiciones en el elemento -10 predicho (TAAGAT) de Pc0007 se aleatorizaron para generar variantes promotoras tanto más fuertes como atenuadas (SEQ ID NOs 1, 5, y 7). Esta biblioteca se generó amplificando por PCR pK18rep-Pc0007-eyfp con Pcg0007Fwd (GGAAACGTCTGTATCGGATAAGTAG (SEQ ID NO: 15)) y Pc0007Rev (CTACTTATCCGATACAGACGTTTCCANNNNACACGCTTAGGTCCCCACGTAGTACCA (SEQ ID NO: 16)), se trató con DpnI (New England Biolabs) y se ensambló usando el método de Ensamblaje de Gibson con Gibson Assembly Master Mix (NEB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción de Ensamblaje de Gibson se transformó en células competentes NEB Turbo (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los transformantes se seleccionaron en agar LB más 25 mg/ml de kanamicina, y las colonias individuales se caracterizaron mediante secuenciación de Sanger. Las colonias se reunieron raspando el agar, y el ADN plasmídico purificado se aisló usando el Zyppy minipred kit (Zymo Research).

Los plásmidos de constructos informadores purificados se transformaron en C. glutamicum NRRL B-11474 por electroporación (Haynes et al., Journal of General Microbiology, 1990). Los transformantes se seleccionaron en agar BHI más 25 mg/ml de kanamicina. Para cada transformación, se recogieron e inocularon múltiples colonias individuales en pocillos individuales de un bloque de 96 pocillos de profundidad media que contenían 300 ml de medio BHI más 25 mg/ml de kanamicina. Las células se cultivaron hasta la saturación mediante incubación durante 48 h a 30°C, agitando a 1.000 rpm. Después de la incubación, los cultivos se centrifugaron durante 5 min a 3500 rpm, y el medio se eliminó por aspiración. Las células se lavaron una vez mediante resuspensión en 300 ml de PBS y centrifugación durante 5 min a 3500 rpm, seguido de aspiración del sobrenadante y una resuspensión final en 300 ml de PBS. Se transfirió una alícuota de 20 ml de esta mezcla a una placa de ensayo de fondo transparente negro de área completa de 96 pocillos que contenía 180 ml de PBS. La densidad óptica de las células a 600 nm se midió con el lector de microplacas SpectraMax M5, y la fluorescencia se midió con un lector de microplacas TECAN M1000 excitando a 514 nm y midiendo la emisión a 527 nm. Para cada pocillo se calculó una actividad de fluorescencia normalizada dividiendo la fluorescencia entre la densidad óptica. El plásmido parental pK18rep actuó como un control negativo. Se comparó la actividad de fluorescencia normalizada entre constructos informadores y entre réplicas biológicas (Figura 2). En la Tabla 5 a continuación se presenta un resumen numérico de la actividad promotora.

Tabla 5: C. glutamicum recombinante que expresa proteína fluorescente amarilla bajo el control de promotores

Ejemplo 3: Aplicación de promotores candidatos a la ruta biosintética de L-lisina

Los promotores de la presente descripción son útiles para procedimientos mejorados para la producción de biomoléculas en células hospedantes. Un ejemplo de la aplicación y uso del promotor de la presente descripción se dirige a la producción del aminoácido L-lisina. La Figura 3 presenta la ruta biosintética para la producción de L-lisina, e incluye los genes pck, odx, icd, y hom (por ejemplo, la ruta de la homoserina/treonina sintasa), que desvían intermedios de la ruta que conducen a reducciones en el rendimiento global de L-lisina. Los símbolos, nombres de genes, número de la Comisión de Enzimas (número CE), y posición en el mapa en la cepa de C. glutamicum ATCC 13032 se proporcionan a continuación en la Tabla 3.

Los vectores recombinantes que comprenden un promotor de SEQ ID NOs: 1 a 8 funcionalmente unido a un gen diana como se proporciona en la Tabla 3 se clonan en vectores de clonación de Corynebacterium usando técnicas de clonación por recombinación homóloga en levadura para ensamblar un vector en el que cada promotor estaba flanqueado por regiones de repetición directa para proporcionar recombinación homóloga en Corynebacterium glutamican en el locus genético diana. Tras la recombinación, el promotor endógeno es reemplazado por el promotor de SEQ ID NOs: 1 a 8 funcionalmente unido al gen diana respectivo en el locus de C. glutamican endógeno. Una variedad de vectores de direccionamiento que comprenden el promotor y el gen diana funcionalmente unido incluían un intervalo de longitudes de brazo de repetición directa de homología que oscilaban de 0,5 Kb, 1 Kb, 2 Kb, y 5 Kb. Cada inserto de ADN se produjo mediante amplificación por PCR de regiones homólogas usando oligos de origen comercial y el ADN genómico de la cepa hospedante descrito anteriormente como molde. El promotor a introducir en el genoma estaba codificado en las colas de los oligos. Los fragmentos de PCR se ensamblaron en el esqueleto del vector usando recombinación homóloga en levadura.

Los vectores se transforman inicialmente en E. coli usando técnicas estándar de transformación por choque térmico, y los clones ensamblados correctamente se identifican y validan. Las bacterias de E. coli transformadas se evalúan para comprobar el éxito del ensamblaje. Cuatro colonias de cada placa de transformación de E. coli se cultivan y evalúan para determinar el ensamblaje correcto mediante PCR. Los vectores se amplifican en los hospedantes de E. coli para proporcionar ADN de vector para la transformación en Corynebacterium.

Los clones validados se transforman en células hospedantes de Corynebacterium glutamicum mediante electroporación. Para cada transformación, el número de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por mg de ADN se determina como una función del tamaño del inserto. La integración en el genoma de Corynebacterium se analiza como una función de la longitud del brazo de homología. Los brazos más cortos tenían una menor eficiencia.

Cultivos de Corynebacterium identificados por tener integraciones exitosas del casete de inserto se cultivan en medios que contienen 5% de sacarosa para contraseleccionar bucles salientes del gen de selección sacb. La frecuencia de resistencia a la sacarosa para diversos brazos de repetición directa de homología no varía significativamente con la longitud del brazo. Estos resultados sugieren que las eficiencias de bucles salientes (“loopout’) permanecen estables a lo largo de las longitudes de brazos de homología de 0,5 kb a 5 kb.

Para validar adicionalmente los eventos de bucles salientes (“loop out’), las colonias que presentan resistencia a la sacarosa se cultivan y analizan mediante secuenciación. Los resultados de la secuenciación de las regiones genómicas del inserto se resumen a continuación en la Tabla 6.

Tabla 6: Frecuencia de validación de bucles salientes

Los resultados de la secuenciación muestran una eficiencia del 10 al 20% en la formación de bucles salientes. Sin estar limitado por ninguna teoría en particular, la formación de bucles salientes puede depender de la secuencia del inserto. Incluso si es correcto, escoger 10-20 colonias resistentes a sacarosa conduce a tasas de éxito elevadas.

Tras la integración, los vectores recombinantes reemplazan las secuencias promotoras endógenas por un promotor seleccionado del grupo que consiste en Pcg1860 (SEQ ID NO:2), Pcg0007 (SeQ ID NO:3), Pcg0755 (SEQ ID NO:4), Pcg0007_lib_265 (SEQ ID NO:5), Pcg3381 (SEQ ID NO:6), Pcg007_lib_119 (SEQ ID NO:7), y Pcg3121 (SEQ ID NO:8). En la Tabla 7, más abajo, se proporciona una lista de las cepas recombinantes resultantes.

Se recogen múltiples colonias individuales (N en la Tabla 7), se inoculan y se hacen crecer como un cultivo a pequeña escala. Cada cepa recién creada que comprende un promotor de ensayo se evalúa para determinar el rendimiento de lisina en cultivos a pequeña escala diseñados para evaluar el comportamiento del título del producto. Los cultivos a pequeña escala se llevan a cabo usando medios de cultivos a escala industrial. El título del producto se mide ópticamente con respecto al agotamiento del carbono (es decir, representativo del rendimiento de un solo lote) con un ensayo colorimétrico estándar. Brevemente, se prepara una mezcla de ensayo concentrada y se añade a las muestras de fermentación, de modo que las concentraciones finales de los reactivos sean amortiguadores de fosfato de sodio 160 mM, Amplex Red 0,2 mM, peroxidasa de rábano picante 0,2 U/ml, y 0,005 U/ml de lisina oxidasa. Las reacciones continúan hasta su finalización, y la densidad óptica se mide usando un espectrofotómetro de placa Tecan M1000 a una longitud de onda de 560 nm.

Como se muestra en la Tabla 7, el rendimiento de L-lisina aumenta en más del 24% (por ejemplo, cepa recombinante 7000007840) con respecto a la cepa no modificada. En otras realizaciones, el rendimiento de L-lisina se reduce en casi un 90% (por ejemplo, cepa recombinante 700000773). Como se proporciona en la Tabla 7, la sustitución del promotor por pgi y zwf da como resultado mejoras superiores al 10% en la producción de L-lisina.

En particular, la producción de L-lisina no es una simple dependencia de la incorporación de los promotores más activos. Como se ilustra en la Figura 4, el rendimiento de lisina se maximiza mediante un promotor relativamente débil (por ejemplo, pgi que tiene una expresión promotora relativa de 1, 7x o 48x, o dapB a una fuerza promotora relativa de 7x), o se maximiza por expresión intermedia (por ejemplo, lysA que tiene una expresión promotora relativa de 454x). En ciertos casos, la expresión es máxima cuando se maximiza la fuerza promotora relativa (por ejemplo, ppc). Como se ejemplifica en la Figura 5, la ubicación del gen en la ruta genética (Figura 3) no predice de manera confiable el aumento o la disminución relativa del rendimiento de L-lisina o la fuerza promotora óptima. Por ejemplo, la expresión de alto nivel de cg0931 da como resultado un rendimiento mejorado, mientras que los niveles más altos de dapD dan como resultado una falta de mejora o un rendimiento reducido.

Tabla 7: Cepas recombinantes de C. glutamicum que tienen expresión modificada de genes biosintéticos de L-lisina

Ejemplo 4: Manipulación de la ruta biosintétiea de L-lisina

El re n d im ie n to de L -lis in a se m o d ifica in te rca m b ia n d o pa res de p ro m o to re s p o r ge ne s d ia n a co m o se p ro p o rc io n a en la T a b la 8. Los co n s tru c to s de l E je m p lo 3 se u tilizan pa ra p re p a ra r o rg a n ism o s re co m b in a n te s co m o se p ro p o rc io n a en la T a b la 8. C o m o se m uestra , la co m b in a c ió n de P cg 0007 -lysA y P cg3121 -p g i p ro p o rc io n a los m ayo res re n d im ie n to s de L-lis ina .

T a b la 8 : In te rc a m b io de p ro m o to re s e m p a re ja d o s de ge ne s d ia n a en la ru ta b io s in té tica de L -lis in a

Claims (17)

r e iv in d ic a c io n e s

1. Una escalera de promotores que comprende al menos tres secuencias polinucleotídicas promotoras seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 8, en el que dicha escalera de promotores comprende una pluralidad de promotores con niveles de actividad promotora que aumentan de forma incremental.

2. La escalera de promotores según la reivindicación 1, en la que al menos una de dichas secuencias polinucleotídicas promotoras se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1,5 y 7.

3. La escalera de promotores según la reivindicación 1, en la que al menos una de dichas secuencias polinucleotídicas promotoras se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-2.

4. La escalera de promotores según la reivindicación 1, en la que al menos una de dichas secuencias polinucleotídicas promotoras se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5.

5. La escalera de promotores según la reivindicación 1, en la que al menos una de dichas secuencias polinucleotídicas promotoras se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 6-8.

6. La escalera de promotores según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que cada promotor de dicha escalera de promotores está funcionalmente unido a al menos un gen diana heterólogo.

7. La escalera de promotores según la reivindicación 6, en la que dicho al menos un gen diana heterólogo es un gen que es un componente de una ruta biosintética que produce una biomolécula seleccionada del grupo que consiste en aminoácidos, ácidos orgánicos, proteínas, y polímeros.

8. La escalera de promotores según la reivindicación 6 o 7, en la que dicho al menos un gen diana heterólogo es un gen que es un componente de una ruta biosintética de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

- la ruta de la biosíntesis de lisina que comprende genes de entrada M00016 de la Enciclopedia de Kyoto de Genes y Genomas (KEGG);

- la ruta de la biosíntesis de lisina que comprende genes de la entrada de KEGG M00525;

- la ruta de la biosíntesis de lisina que comprende genes de la entrada de KEGG M00526;

- la ruta de la biosíntesis de lisina que comprende genes de la entrada de KEGG M00527;

- la ruta de la biosíntesis de lisina que comprende genes de la entrada de KEGG M0030;

- la ruta de la biosíntesis de lisina que comprende genes de la entrada de KEGG M00433; y la ruta de la biosíntesis de lisina que comprende genes de la entrada M0031 de KEGG.

9. Un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia de polinucleotídica promotora seleccionada de la escalera de promotores de la reivindicación 1 funcionalmente unida a un gen diana heterólogo.

10. Una pluralidad de polinucleótidos recombinantes que comprenden la escalera de promotores de la reivindicación 1, en la que cada polinucleótido recombinante comprende un promotor de la escalera de promotores funcionalmente unido a un gen diana heterólogo.

11. Una pluralidad de vectores recombinantes que comprenden la escalera de promotores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el polinucleótido recombinante de la reivindicación 9, o la pluralidad de polinucleótidos recombinantes de la reivindicación 10, en los que cada vector comprende al menos un promotor de la escalera de promotores o al menos un polinucleótido recombinante.

12. Una pluralidad de células hospedantes que comprenden la escalera de promotores según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el polinucleótido recombinante de la reivindicación 9, la pluralidad de polinucleótidos recombinantes de la reivindicación 10, o la pluralidad de vectores recombinantes de la reivindicación 11, en las que cada célula hospedante comprende al menos un promotor de la escalera de promotores, al menos un polinucleótido recombinante, o al menos un vector.

13. La pluralidad de células hospedantes según la reivindicación 12, en la que las células hospedantes pertenecen al género Corynebacterium.

14. Células hospedantes transformadas que comprenden una combinación de al menos tres secuencias polinucleotídicas promotoras seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 1 a 8, cada una funcionalmente unida a al menos un gen diana heterólogo, en las que dicha combinación de polinucleótidos promotores comprende una pluralidad de promotores con niveles de actividad promotora que aumentan de forma incremental.

15. Las células hospedantes transformadas según la reivindicación 14, en las que dicho gen diana está asociado con una ruta biosintética que produce una biomolécula seleccionada de: aminoácidos, ácidos orgánicos, aromas y fragancias, biocombustibles, proteínas y enzimas, polímeros/monómeros y otros biomateriales, lípidos, ácidos nucleicos, sustancias terapéuticas de tipo molécula pequeña, sustancias terapéuticas proteicas, sustancias químicas finas, y nutracéuticos.

16. Las células hospedantes transformadas según la reivindicación 15, en las que dicho gen diana está asociado con una ruta biosintética que produce un metabolito secundario seleccionado de:

antibióticos, alcaloides, terpenoides, y policétidos.

17. Las células hospedantes transformadas según una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en las que cada polinucleótido promotor está funcionalmente unido a un gen diana heterólogo diferente.