DE10110344A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, bei dem man folgende Schritte durchführt: DOLLAR A a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das nadA- und/oder nadC-Gen abschwächt, DOLLAR A (b) Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und DOLLAR A c) Isolierung der L-Aminosäure, DOLLAR A und gegebenenfalls Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt, oder Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Valin und L-Lysin, unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen das nadA- und/oder nadC-Gen abgeschwächt ist.

Stand der Technik

L-Aminosäuren, insbesondere L-Valin und L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie zum Beispiel das Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder das Valin- Analogon 2-Thiazolyl-Alanin oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren produzieren.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure- Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L-Aminosäure-Produktion untersucht.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt sind L-Lysin und L-Valin.

Wenn im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern sind auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.

Wenn im Folgenden L-Valin oder Valin erwähnt werden, sind damit auch die Salze wie z. B. Valin-Monohydrochlorid oder Valin-Sulfat gemeint.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen man zumindest die für die Chinolinsäure-Synthetase A (Quinolinate-Synthetase A) kodierende Nucleotidsequenz (nadA-Gen) und/oder die für die Nicotinat-Nucleotid Pyrophosphorylase kodierende Nucleotidsequenz (nadC-Gen) abschwächt, insbesondere ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert.

Gegenstand dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren in dem folgende Schritte durchführt werden:

• a) Fermentation der L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen zumindest die für die Chinolinsäure-Synthetase kodierende Nucleotidsequenz (nadA) und/oder die für die kodierende Nucleotidsequenz (nadC), abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert wird;
• b) Anreicherung der L-Aminosäuren im Medium oder in den Zellen der Bakterien; und
• c) Isolierung der produzierten L-Aminosäuren.

Die eingesetzten Stämme produzieren bevorzugt bereits vor der Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens L-Aminosäuren, insbesondere L-Valin oder L-Lysin.

Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme
wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM 5714
oder wie beispielsweise die Valin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum DSM 12455
Corynebacterium glutamicum FERM-P 9325
Brevibacterium flavum FERM-P 512
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1845
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 9324 und
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 1763.

Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens in verbesserter Weise L-Aminosäuren produzieren.

Die Sequenzen der Gene nadA und nadC sind in der SEQ ID No. 1 und 3 dargestellt und können erfindungsgemäß verwendet werden. Die Aminosäuresequenzen der dazugehörigen Genprodukte sind in der SEQ ID No. 2 und 4 dargestellt. Weiterhin können Allele des nadA- und/ oder nadC-Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.

Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des nadA- und/oder nadC-Gens oder die katalytischen Eigenschaften der Genprodukte herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls werden beide Maßnahmen kombiniert.

Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung ("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene replacement").

Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"- Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'- Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.

Beispielhaft ist in Fig. 1 das Plasmid pCR2.1nadAint dargestellt mit Hilfe dessen das Verfahren der Unterbrechung des nadA-Gens durchgeführt werden kann. Plasmid pCR2.1nadAint enthält einen, als nadAint-Fragment bezeichneten, zentralen Teil des nadA-Gens, der in SEQ ID No. 5 dargestellt ist.

Beispielhaft ist weiterhin in Fig. 2 das Plasmid pCR2.1nadCint dargestellt mit Hilfe dessen das Verfahren der Unterbrechung des nadC-Gens durchgeführt werden kann. Plasmid pCR2.1nadCint enthält einen, als nadCint-Fragment bezeichneten, zentralen Teil des nadC-Gens, der in SEQ ID No. 6 dargestellt ist.

Bei der Methode des Genaustausches ("gene replacement") wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Ben in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten.

In das nadA- und/oder nadC-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.

Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens, eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat- Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.

Der Begriff "Verstärkung" bzw. "Verstärken" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw., der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

So kann für die Herstellung von L-Lysin neben der Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

• - das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512),
• - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
• - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
• - gleichzeitig das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A-198 31 609),
• - das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
• - das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),
• - gleichzeitig das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
• - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)
• - das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), und
• - das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

So kann für die Herstellung von L-Valin neben der Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

• - das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512),
• - das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP-A 0131171),
• - das für eine feed-back resistente Homoserin-Dehydrogenase kodierende Allel hom(Fbr) (Reinscheid et al. (1991) Journal of Bacteriology 173: 3228-3230),
• - das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072)), oder das für eine feed-back resistente Threonin- Dehydratase kodierende Allel ilvA(Fbr) (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842),
• - das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierenden Gen ilvBN (EP-B 0356739),
• - das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979),
• - das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),
• - gleichzeitig die für den Valin-Export kodierenden Gene brnF- und/oder brnE (DE: 199 51 708.8), und
• - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Valin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
• - das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396,478, DSM 12969),
• - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE: 199 51 975.7, DSM 13114),
• - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113)

abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.

Schließlich kann es für die Produktion von Aminosäuren, vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro­ organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff­ haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wird wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente werden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wird mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.

Anschließend wird die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wird mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4- DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no.27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wird anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt.

Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563-1575) werden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank werden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 100 mg/l Ampicillin ausplattiert werden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C werden rekombinante Einzelklone selektioniert.

Beispiel 2 Isolierung und Sequenzierung des nadA-Gens

Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wird mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27- 0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente werden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgt die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).

Die DNA des Sequenziervektors pZero-1, bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01), wird mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wird wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wird. Dieses Ligationsgemisch wird anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A., 87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Zeocin ausplattiert.

Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgt mit dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgt nach der Dideoxy- Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A., 74: 5463-5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wird der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgt in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29 : 1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).

Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten werden anschließend unter Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZerol-Derivate werden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte Kodierbereichsanalyse wird mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt.

Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergibt ein offenes Leseraster von 1287 Basenpaaren, welches als nadA- Gen bezeichnet wird. Das nadA-Gen kodiert für ein Protein von 428 Aminosäuren.

Beispiel 3 Isolierung und Sequenzierung des nadC-Gens

Die Isolierung und Sequenzierung des nadC-Gens wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.

Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 3 dargestellt. Die Analyse ergibt ein offenes Leseraster von 840 Basenpaaren, welches als nadC-Gen bezeichnet wird. Das nadC-Gen kodiert für ein Polypeptid von 279 Aminosäuren.

Beispiel 4 Herstellung eines Integrationsvektors für die Integrationsmutagenese des nadA-Gens

Aus dem Stamm ATCC 13032 wird nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C. glutamicum bekannten Sequenz des nadA-Gens werden die folgenden Oligonukleotide als Primer für die Polymerase Kettenreaktion ausgewählt:
nadAint1 (dargestellt in SEQ ID No. 7)
5' AAG CGA TTG TGT TCT GCG GT 3'
nadAint2 (dargestellt in SEQ ID No. 8)
5' TCG AGG CAG AAG ATG GTG TG 3'

Die dargestellten Primer werden von der Firma ARK, Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase der Firma Boehringer die PCR Reaktion durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wird ein 780 bp großes DNA- Fragment isoliert, welches ein internes Fragment des nadA- Gens ist. Es ist in der SEQ ID No. 5 dargestellt.

Das amplifizierte DNA Fragment wird mit dem TOPO TA Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9: 657-663) ligiert. Anschließend wird der E. coli Stamm DH5αmcr mit dem Ligationsansatz (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgt durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert wird. Plasmid-DNA wird aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel- Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wird pCR2.1nadAint genannt. Es ist in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 5 Herstellung eines Integrationsvektors für die Integrationsmutagenese des nadC-Gens

Wie in Beispiel 3 beschrieben wird aus dem Stamm ATCC 13032 nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 3 für C. glutamicum bekannten Sequenz des nadC-Gens werden die folgenden Oligonukleotide als Primer für die Polymerase Kettenreaktion ausgewählt:
nadCintl (dargestellt in SEQ ID No. 9)
5' AGC TGA GCG CCA AGG TTG TT 3'
nadCint2 (dargestellt in SEQ ID No. 10)
5' CGA TGA GCT GAT CAA TGG TG 3'

Die dargestellten Primer werden von der Firma ARK, Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase der Firma Boehringer die PCR Reaktion durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wird ein 582 bp großes DNA- Fragment isoliert, welches ein internes Fragment des nadC- Gens ist. Es ist in der SEQ ID No. 6 dargestellt.

Das amplifizierte DNA Fragment wird mit dem TOPO TA Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9: 657-663) ligiert. Anschließend wird der E. coli Stamm DH5αmcr mit dem Ligationsansatz (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgt durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert wird. Plasmid-DNA wird aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel- Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wird pCR2.1nadCint genannt. Es ist in Fig. 2 dargestellt.

Beispiel 6 Integrationsmutagenese des nadA-Gens in dem C. glutamicum Stamm DM678

Der in Beispiel 4 genannte Vektor pCR2.1nadAint wird nach der Elektroporationsmethode von Tauch et. al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DM678 elektroporiert.

Der Corynebacterium glutamicum Stamm DM678 wurde durch mehrfache Mutagenese und Selektion aus Stamm ATCC13032 hergestellt. Dieser Stamm ist Methionin-sensitiv. Eine Reinkultur des Stammes DM678 wurde am 15. Juni 1999 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM, Braunschweig, Deutschland) als DSM12866 hinterlegt.

Der Vektor pCR2.1nadAint kann in DM678 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom von DM678 integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom integriertem pCR2.1nadAint erfolgt durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), der mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert ist.

Für den Nachweis der Integration wird das nadAint-Fragment nach der Methode "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig- Hybridisierungskit der Firma Boehringer markiert. Chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wird nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen SalI, SacI und HindIII geschnitten. Die entstehenden Fragmente werden mit Agarosegel- Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig-Hybrisierungskit der Firma Boehringer bei 68°C hybridisiert. Das in Beispiel 4 genannte Plasmid pCR2.1nadAint hat innerhalb des chromosomalen nadA-Gens ins Chromosom von DM678 inseriert. Der Stamm wird als DM678::pCR2.1nadAint bezeichnet.

Beispiel 7 Herstellung von L-Valin mit Hilfe des Corynebacterium glutamicum Stammes DM678::pCR2.1nadAint

Der in Beispiel 6 erhaltene C.glutamicum Stamm DM678::pCR2.1nadAint wurde zunächst auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit 25 mg/l Kanamycin) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplatte wurde eine Vorkultur angeimpft (40 ml Medium im 500 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Medium SK65 verwendet.

Medium SK65

CSL (Corn Steep Liquor)	25 g/l
Glucose	23 g/l
Pepton aus Casein	20 g/l
Pepton aus Fleisch	20 g/l
Ammoniumsulfat	8 g/l
Harnstoff	3 g/l
AL=L<Salze:
KH2PO4	2,0 g/l
MgSO4.7 H2O	0,5 g/l
FeSO4.7 H2O	10 mg/l
CuSO4	1,0 mg/ml
ZnSO4	10 mg/l
Thiamin.HCl (sterilfiltriert)	0,5 mg/l
Biotin (sterilfiltriert)	0,2 mg/l
CaCO3	1,6 g/l

Die Vorkultur wurde 20 Stunden bei 33°C bei 170 rpm auf dem Schüttler inkubiert.

2,5 g dieser Vorkultur wurde in 831 g des Fermentationsmediums M1-457 angeimpft. Die Anzuchtfermentation wurde in 2 l Rührreaktor-Fermentern der Firma B. Braun (BBI, Deutschland, Melsungen, Modell Biostat MD) durchgeführt. Das Medium M1-457 enthielt die in Tabelle 1 aufgeführten Bestandteile. Der Fermenter wurde nach Befüllen mit dem Medium für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert. Lediglich Stärkehydrolysat, Ca-Pantothenat und Thiamin wurden sterilfiltriert nach dem autoklavieren zugegeben. Die Kultur wurde bei einer Temperatur von 32°C, einer Belüftung von 1 l/min., einer minimalen Rührergeschwindigkeit von 800 rpm und einem pH von 7,0 und einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung bis zum Verbrauch des vorgelegten Zuckers kultiviert. Die Kultur wurde anschließend für weitere 38 Stunden bei einer Temperatur von 34°C, einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung und einem pH-Wert von pH 7,0 bis zum Erreichen einer OD660 von 30,5 kultiviert. Während dieser Zeit wurden 273,6 g des Mediums M2-242 mit einer Glucose- Konzentration von 506,3 g/l, einer Ammoniumsulfatkonzentration von 35,7 g/l und einer KH₂PO₄ Konzentration von 1,342 g/l zugefüttert.

Anschließend wurden die optische Dichte (OD) mit einem Digitalphotometer vom Typ LP1W der Firma Dr. Bruno Lange GmbH (Berlin, Deutschland) bei einer Meßwellenlänge von 660 nm und die Konzentration an gebildetem L-Valin mittels ASA bestimmt.

In der Fermentationsendprobe wurde nach Ende der Fermentation eine L-Valin Konzentration von 160 mg/l festgestellt. In einer Parallelfermentation mit dem Kontrollstamm C. glutamicum DM678 konnte kein L-Valin nachgewiesen werden.

Zusammensetzung des Mediums M1-457

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Karte des Plasmides pCR2.1nadAint

Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung. Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.
Kam: Resistenzgen für Kanamycin
Amp: Resistenzgen für Ampicillin
ColEI ori: Replikationsursprung ColEI aus Escherichia coli
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
nadAint: internes Fragment des nadA-Gens

Fig. 2 Karte des Plasmides pCR2.1nadCint

Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung. Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.
Kam: Resistenzgen für Kanamycin
Amp: Resistenzgen für Ampicillin
ColEI ori: Replikationsursprung ColEI aus Escherichia coli
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
nadCint internes Fragment des nadC-Gens

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (9)

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Valin, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt,

• a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das nadA- und/oder nadC-Gen abschwächt,
• b) Anreicherung des gewünschten Produkts im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
• c) Isolierung der L-Aminosäure.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression des (der)Polynukleotides (e), das (die) für das nadA- und/oder nadC-Gen kodiert, verringert.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die regulatorischen/katalytischen Eigenschaften des Polypeptids (Enzymproteins) verringert, für das das Polynukleotid nadA und/oder nadC kodiert.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Herstellung von L-Lysin coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• 1. 6.1 das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
• 2. 6.2 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA,
• 3. 6.3 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap,
• 4. 6.4 das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc,
• 5. 6.5 das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende Gen mqo,
• 6. 6.6 das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
• 7. 6.7 gleichzeitig das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE,
• 8. 6.8 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1
• 9. 6.9 das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi, und
• 10. 6.10 das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk,

verstärkt insbesondere überexprimiert.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Herstellung von L-Valin coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• 1. 7.1 das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
• 2. 7.2 das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom,
• 3. 7.3 das für eine feed-back resistente Homoserin- Dehydrogenase kodierende Allel hom(Fbr),
• 4. 7.4 das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA, oder das für eine feed-back resistente Threonin- Dehydratase kodierende Allel ilvA(Fbr),
• 5. 7.5 das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierenden Gen ilvBN,
• 6. 7.6 das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD,
• 7. 7.7 das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
• 8. 7.8 gleichzeitig die für den Valin-Export kodierenden Gene brnF- und/oder brnE, und
• 9. 7.9 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 verstärkt, insbesondere überexprimiert.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• 1. 8.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen,
• 2. 8.2 das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi-Gen
• 3. 8.3 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB, oder
• 4. 8.4 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 abschwächt.

9. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.