CN102459621B - 制备2-酮羧酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备2-酮羧酸或其盐的方法，所述2-酮羧酸具有通式R1-CO-COOH，其中R1为具有3-7个碳原子的支链烷基，所述方法包括发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液。

Description

制备2-酮羧酸的方法
技术领域
本发明涉及一种利用发酵步骤来制备2-酮羧酸，特别是2-酮异戊酸、2-酮-4-甲基戊酸和/或2-酮-3-甲基戊酸的方法。
背景技术
2-酮羧酸是用于制药的化合物，并且用于合成除草剂和杀真菌剂。已知2-酮羧酸降低血浆中的LDL胆固醇、甘油三酯和自由基水平。特别地，2-酮异戊酸用作肾衰竭患者的食物补充剂。
本领域中已知通过化学合成来制备2-酮羧酸，例如2-酮异戊酸(盐)。例如，在以下两步骤中通过化学合成制备2-酮异戊酸盐：使用CrO3将各自的2-羟基异戊酸乙酯氧化，随后将该酯皂化以获得2-酮异戊酸盐。该方法存在使用高温、有毒的CrO3和各种对环境有危险的溶剂的缺点。
在生物合成中，2-酮羧酸是用于各自的氨基酸的直接前体：例如2-酮异戊酸是氨基酸缬氨酸的直接前体。在微生物中，2-酮异戊酸盐在细胞中产生并分泌至培养基中。在现有技术中描述了2-酮酸用作前体通过发酵来制备各自的氨基酸(GB 2,161,159；GB 2,147,579)。
尽管文献中已知微生物产生2-酮羧酸如2-酮异戊酸(盐)，但目前没有描述通过利用发酵以高纯度制备和分离2-酮羧酸的方法，而仅提及2-酮羧酸作为制备氨基酸的中间产物或离析物。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备2-酮羧酸，特别是2-酮异戊酸(盐)、2-酮-4-甲基戊酸和/或2-酮-3-甲基戊酸的方法，所述方法避免了化学合成的缺点。
这一问题通过制备2-酮羧酸或其盐的方法得到了解决，所述2-酮羧酸具有通式(I)R1-CO-COOH，其中R1为具有3-7个碳原子的支链烷基，所述方法包括以下步骤：
a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液(culture broth)；
b)将步骤a)中获得的发酵培养液进行选自离子交换、提取过程和蒸馏过程的一个或多个步骤。
在本发明的优选实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液；
b)将步骤a)中获得的发酵培养液进行离子交换；
c)优选地将步骤b)中获得的流出物进行选自离子交换、提取或蒸馏的一个或多个进一步的纯化步骤；
d)优选地将步骤c)中获得的产物进行进一步浓缩、沉淀或结晶步骤或者它们的组合并获得2-酮羧酸或其盐。
在本发明的优选实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液；
b)发酵培养液的初始pH变化(酸化至pH值为1)后，将步骤a)中获得的发酵培养液仅进行蒸馏过程(加入水进行蒸汽蒸馏直至蒸馏池完全蒸干(impoverishment))。
该实施方案避免使用离子交换处理。令人惊讶地发现，利用这一步骤可以从发酵培养液中完全选择性地除去酮酸，而其它有机酸则保留在蒸馏池中。
在优选的方法中，2-酮羧酸是具有通式R1-CO-COOH的化合物或其盐，其中R1是具有3、4或5个碳原子的支链烷基。
进一步优选地，R1选自异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、2-甲基-丁基、3-甲基丁基。甚至更优选地，R1选自异丙基、异丁基、仲丁基。
在特别优选的方法中，2-酮羧酸为2-酮异戊酸或其盐。
在本发明另一优选实施方案中，步骤a)中获得的培养液包含至少10g/l、优选至少15g/l、和更优选至少20g/l、并且最优选至少40g/l的2-酮羧酸或其盐，所述2-酮羧酸优选2-酮异戊酸。
进一步优选地，用于发酵步骤的微生物具有提高的产生通式(I)的化合物的能力，所述通式(I)的化合物优选为选自2-酮异戊酸、2-酮-4-甲基戊酸和2-酮-3-甲基戊酸的化合物或它们的混合物。
优选地，用于发酵步骤的微生物为棒杆菌(Corynebacterium)，其具有提高的产生2-酮异戊酸、2-酮-4-甲基戊酸和/或2-酮-3-甲基戊酸的能力，所述棒杆菌特别优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。使用一种或多种蛋白下调或缺陷的棒杆菌菌株是特别有用的，所述蛋白例如转氨酶B(E.C.2.6.1.42，由ilvE-基因编码)、缬氨酸-丙酮酸转氨酶AvtA(E.C.2.6.1.66，由avtA-基因编码)或丙氨酸转氨酶(E.C.2.6.1.2，由alaT-基因编码)。此外，使用一种或多种蛋白下调或缺陷的棒杆菌菌株是有用的，所述蛋白例如丙酮酸脱氢酶的E1亚基(E.C.1.2.4.1，由aceE基因编码)、丙酮酸醌氧化还原酶(E.C.1.2.2.2，由pqo基因编码)、葡糖磷酸异构酶(E.C.5.3.1.9，由pgi基因编码)。为了获得良好的产率，棒杆菌菌株在所提及的基因产物中的一些、所有或者所述基因产物的组合中是下调或缺陷的。aceE的基因产物催化丙酮酸向乙酰辅酶A的反应。ilvE的基因产物催化2-酮异戊酸转氨成氨基酸缬氨酸(每个转氨反应，其将1摩尔的谷氨酸转化成α-酮戊二酸)。avtA的基因产物催化2-酮异戊酸转氨成氨基酸缬氨酸(每个转氨反应，其将1摩尔的丙氨酸转化成丙酮酸)。alaT基因的基因产物催化从丙酮酸向丙氨酸的反应。pqo的基因产物催化从丙酮酸向乙酸的反应。pgi的基因产物催化从葡糖-6-磷酸向果糖-6-磷酸的反应。
此外，棒杆菌菌株可以过表达任意一种或多种或者所有下述优选内源基因：ilvBN(编码乙酰羟酸合酶的基因，E.C.4.1.3.18)、ilvC(编码乙酰羟酸还原异构酶的基因，E.C.1.1.1.86)和ilvD(编码二羟基酸脱水酶的基因，E.C.4.2.1.9)。ilvBN、ilvC和ilvD基因编码代表从丙酮酸向2-酮异戊酸的代谢途径的酶。对于酮甲基戊酸盐的产生，棒杆菌菌株还可以过表达任意一种或多种或者所有下述优选内源基因：ilvA(编码苏氨酸脱水酶的基因，E.C.4.2.1.16)、hom(编码高丝氨酸脱氢酶的基因，E.C.1.1.1.3)、thrB(编码高丝氨酸激酶的基因，E.C.2.7.1.39)、thrC(编码苏氨酸合酶的基因，E.C.4.2.3.1)、lysC(编码天冬氨酸激酶的基因，E.C.2.7.2.4)、天冬氨酸转氨酶(aat，E.C.2.6.1.1)、天冬氨酸半醛脱氢酶(aspartate semialdehyse dehydrogenase)(asd，E.C.1.2.1.11)、丙酮酸羧化酶(pyc，E.C.6.4.1.1)。对于酮异己酸盐的产生，棒杆菌菌株还可以过表达任意一种或多种或者所有下述优选内源基因：leuA(编码2-异丙基苹果酸合酶的基因(E.C.2.3.3.13)、leuB(3-异丙基苹果酸脱氢酶，E.C.1.1.1.85)、leuCD(3-异丙基苹果酸脱水酶，E.C.4.2.1.33)。
在特别优选的实施方案中，棒杆菌菌株的基因型为Δ-aceE、Δ-ilvE，并过表达基因ilvBN、ilvC和ilvD，并且用于制备2-酮异戊酸。
除棒杆菌之外，其它细菌菌株、酵母和真菌微生物能够用于本发明的发酵过程，所述微生物例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、短杆菌(Brevibacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、链霉菌(Streptomyces)。
在进一步优选的实施方案中，在将培养液进行离子交换步骤(b)之前，进行从所述培养液除去细胞和/或细胞碎片的额外步骤，其中所述除去步骤优选通过过滤、离心或沉降、或者所述方法的组合来进行。
重组技术是本领域技术人员已知的。下表包含所用基因的登录号。
  基因名称   基因ID   登录号(NCBI)
  aceE   3344029   NC_006958.1
  ilvE   3344782   NC_006958.1
  alaT   3342681   NC_006958.1
  avtA   3344823   NC_006958.1
  pqo(同义poxB)   3344335   NC_006958.1
  ilvB   3345149   NC_006958.1
  ilvN(同义ilvH)   3343142   NC_006958.1
  ilvC   3343961   NC_006958.1
  ilvD   3344114   NC_006958.1
  ilvA   3342699   NC_006958.1
  thrB   3345034   NC_006958.1
  thrC   3342939   NC_006958.1
  hom   3343957   NC_006958.1
  lysC   3345161   NC_006958.1
  aat(同义aspB)   3343262   NC_006958.1
  asd   3345564   NC_006958.1
  Pyc   3344537   NC_006958.1
  leuA   3344881   NC_006958.1
  leuC   3345229   NC_006958.1
  leuD   3345257   NC_006958.1
  leuB   3345533   NC_006958.1
表：基因登录号
此外，在从培养液除去细胞和/或细胞碎片之后和在步骤b)之前，可以使用离子交换树脂或活性炭进行预纯化。
在本发明方法的优选实施方案中，在步骤b)中，将阳离子树脂用于离子交换步骤。该步骤用于除去氨基酸和阳离子。优选地，阳离子树脂包含具有磺酸官能性的强酸***换树脂，即包含磺酸基团的树脂。
在进一步优选的实施方案中，在步骤c)中，将阴离子树脂用于离子交换。该步骤用于除去除了2-酮羧酸(2-氧代羧酸)以外的酸。优选地，阴离子树脂包含具有胺官能性的弱碱***换树脂。优选地，采用优选盐酸的强酸将期望的产物从阴离子树脂洗脱。进一步优选地，用于从阴离子树脂洗脱的所述酸的体积摩尔浓度为0.1N至4N，甚至更优选1N至3N，并且最优选2.5N至3N。
在替代性实施方案中，在步骤c)中进行蒸馏，优选蒸汽蒸馏。进一步优选地，在10-85℃、更优选20-75℃、甚至更优选25-70℃、并且特别优选35-65℃的温度下进行蒸馏。
在进一步优选的实施方案中，进行蒸馏的初始溶液的pH值为1-10，优选1-2。
优选地，在10-100mbar(毫巴)、更优选20-80mbar、甚至更优选20-65mbar、并且特别优选20-25mbar的压力下进行蒸馏。
在本发明进一步优选的方法中，在步骤d)的沉淀和结晶步骤中，以选自Ca2+、Mg2+、Na+、K+的盐的形式或者与氨基酸的盐的形式获得2-酮羧酸。特别优选通过添加CaCO3将溶液的pH值设置为5.0-6.0，优选5.5-6.0。然后，将溶液减压浓缩。
优选地，通过本发明的方法获得的2-酮羧酸或其盐的纯度为60重量％或更高，更优选80重量％或更高，最优选90重量％或更高。
进一步优选地，2-酮羧酸，优选2-酮异戊酸(盐)所实现的总收率达到至少50重量％。
在进一步优选的实施方案中，用于发酵的培养基包含可更新的原材料作为碳源，所述原材料优选自以下组：葡萄糖、蔗糖。
本发明还提供具有通式(I)R1-CO-COOH的2-酮羧酸或其盐(其中R1为具有3-7个碳原子的支链烷基)，优选提供2-酮异戊酸或其盐，其通过如上文所述本发明的方法所获得的纯度大于60重量％，优选大于80重量％，特别优选大于90重量％。
实施例
实施例1：2-酮异戊酸盐的制备((i)离子交换、(ii)蒸馏)
将谷氨酸棒杆菌菌株在装有LB培养基的摇瓶中培养直至达到稳定期，所述谷氨酸棒杆菌菌株的基因型为Δ-aceE、Δ-ilvE，并且过表达基因ilvBN、ilvC和ilvD。培养基含有碳源和氮源。将培养液离心以除去细胞和细胞碎片。培养液上清的pH值为6.7并且包含5g/l的2-酮异戊酸盐。
随后，将上清在强阳离子树脂(Amberlite FPC 22Na)上渗滤以除去氨基酸和阳离子(主要是Na+)。对于该步骤，每1000ml培养液(上清)使用350ml树脂体积。然后将树脂用1体积H2O洗涤，并收集流出物部分直至白利糖度(Brix)(通过折光计测量每一百份水溶液中所溶解的固体—作为糖—的浓度的量度)低于0.1。
在60℃的温度和20-25mbar的压力下，在Büchi蒸发仪上将白利糖度为7的流出物浓缩。收集所得产物(receipt)直至没有进一步的蒸馏发生并获得油状残留物。将H2O加入油状残留物中并继续浓缩直至不再有蒸馏发生。将该步骤重复多次直至相关的蒸馏产物的总白利糖度低于0.1。
随后，将所有来自蒸馏的产物混合(pool)，并加入CaCO3直至pH值达到5.5-6.0。利用每重量2-酮异戊酸盐2wt.-％的活性炭将溶液脱色1-5小时。然后将溶液通过0.45μm的膜过滤以除去活性炭。
在40-45℃的温度和20-25mbar的压力下，在Büchi蒸发仪上将滤液浓缩直至获得晶体的悬浮液。将悬浮液缓慢冷却至20℃，并在20℃下保持至少1小时后，将晶体在玻璃漏斗上过滤并用H2O洗涤。
于40-45℃的温度下，将湿饼真空干燥直至重量不变，随后以2-酮异戊酸的Ca2+盐进行分析。HPLC分析显示所述2-酮异戊酸盐的纯度大于90重量％(参见表1)。
表1：根据实施例1所获得的2-酮异戊酸盐的纯度
  化合物   量[按面积的％]
  2-酮异戊酸盐(KIV)   91.65
  α-酮-β-甲基-正戊酸盐(KMV)   6.91
  2-酮异己酸盐(KIC)   0.86
实施例2：2-酮异戊酸盐的制备((i)阳离子离子交换、(ii)阴离子离子交换)
将谷氨酸棒杆菌菌株在装有LB培养基的摇瓶中培养直至达到稳定期，所述谷氨酸棒杆菌菌株的基因型为Δ-aceE、Δ-ilvE，并且过表达基因ilvBN、ilvC和ilvD。培养基含有碳源和氮源。将培养液离心以除去细胞和细胞碎片。培养液上清的pH值为6.7并且包含5g/l的2-酮异戊酸盐。
随后，将上清在强阳离子树脂(Amberlite FPC 22Na)上渗滤以除去氨基酸和阳离子(主要是Na+)。对于该步骤，每1000ml培养液(上清)使用350ml树脂体积。然后将树脂用1体积H2O洗涤，并收集流出物部分直至白利糖度低于0.1。
将白利糖度为7的流出物在弱阴离子树脂(Amberlite IRA-67)上渗滤以除去碱性杂质。对于该步骤，每1000ml培养液(上清)使用750ml树脂体积。然后用2.7N的HCl将树脂洗脱，并收集流出物部分直至分析表明出现氯化物。
随后，将不含氯化物的部分混合，并加入CaCO3直至pH值达到5.5-6.0。利用每重量2-酮异戊酸盐2wt.-％的活性炭将溶液脱色1-5小时。然后将溶液通过0.45μm的膜过滤以除去活性炭。
在40-45℃的温度和20-25mbar的压力下，在Büchi蒸发仪上将滤液浓缩直至获得晶体的悬浮液。将悬浮液缓慢冷却至20℃，并在20℃下保持至少1小时后，将晶体在玻璃漏斗上过滤并用H2O洗涤。
于40-45℃的温度下，将湿饼真空干燥直至重量不变，随后以2-酮异戊酸的Ca2+盐进行分析。HPLC分析显示所述2-酮异戊酸盐的纯度按面积计大于85％(参见表2)。
表2：根据实施例2所获得的2-酮异戊酸盐的纯度
  化合物   量[按面积的％]
  2-酮异戊酸盐(KIV)   85.07
  α-酮-β-甲基-正戊酸盐(KMV)   0.70
  2-酮异己酸盐(KIC)   0.65
实施例3不进行离子交换处理的2-酮异戊酸盐的制备(DSP部分)
根据实施例1和2，使谷氨酸棒杆菌菌株发酵。完成发酵过程后，用8.2kg的50％NaOH将培养液上清(270L，pH 2.6，包含40g/l的2-酮异戊酸盐)调节至pH值为7.5，并将其浓缩(双套管反应器，在70℃，40-50mbar下)至白利糖度40(105g/l的2-酮异戊酸盐)；然后用29.7kg的30％H2SO4将其酸化至pH＜1.0。
在70℃的温度和40-50mbar的压力下，在双套管反应器上将酸化的溶液浓缩。收集所得产物直至没有进一步的蒸馏发生，并获得油状残留物。将10L H2O加入油状残留物中并继续浓缩直至不再有蒸馏发生。将该步骤重复多次直至相关的蒸馏产物的总白利糖度低于0.5。
随后，将所有来自蒸馏的产物(230L)混合，并加入3.5kg的CaCO3直至pH值达到4.5。利用每重量2-酮异戊酸盐2wt.-％的活性炭将溶液脱色1-5小时。然后将溶液通过压滤机过滤以除去活性炭。
在35-45℃的产物温度和40-50mbar的压力下，在双套管反应器上将滤液浓缩直至获得晶体的悬浮液。将悬浮液缓慢冷却至20℃，并在20℃下保持至少1小时后，将晶体离心并用H2O洗涤。
于40-45℃的温度下，将湿饼真空干燥直至重量不变(5.1kg)，随后以2-酮异戊酸的Ca2+盐进行分析。HPLC分析显示所述2-酮异戊酸盐的纯度按面积计大于99％(参见表1)。
表1：根据该实施例所获得的2-酮异戊酸盐的纯度
  化合物   量[按面积的％]
  2-酮异戊酸盐(KIV)   99.7
  α-酮-β-甲基-正戊酸盐(KMV)   0.2
  2-酮异己酸盐(KIC)   0.1

Claims (34)

1.一种制备2-酮羧酸或其盐的方法，所述2-酮羧酸具有通式(I)R1-CO-COOH，其中R1为具有3-7个碳原子的支链烷基，所述方法包括以下步骤：
a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液；
b)将步骤a)中获得的发酵培养液进行选自离子交换、提取过程和蒸馏过程的一个或多个步骤；
c)将步骤b)中获得的产物进行进一步浓缩、沉淀或结晶或者它们的组合并获得2-酮羧酸或其盐，
并且其中所述2-酮羧酸或其盐的纯度为60重量%或更高，
其中所述用于发酵步骤的微生物为棒杆菌(Corynebacterium)，以及
其中所述棒杆菌菌株在选自以下组中的任何一种或多种或者所有蛋白中是缺陷或下调的：转氨酶B(E.C.2.6.1.42，由ilvE-基因编码)、缬氨酸-丙酮酸转氨酶AvtA(E.C.2.6.1.66，由avtA-基因编码)、丙氨酸转氨酶AlaT(E.C.2.6.1.2，由alaT-基因编码)、丙酮酸脱氢酶的E1亚基(E.C.1.2.4.1，由aceE基因编码)、丙酮酸醌氧化还原酶(E.C.1.2.2.2，由pqo基因编码)和葡糖磷酸异构酶(E.C.5.3.1.9，由pgi基因编码)，并且
在所述棒杆菌菌株中，一种或多种选自以下组的基因是过表达的：乙酰羟酸合酶，E.C.4.1.3.18)、ilvC(编码乙酰羟酸还原异构酶的基因，E.C.1.1.1.86)和ilvD(编码二羟基酸脱水酶的基因，E.C.4.2.1.9)2-酮异戊酸，并产生2-酮异戊酸；或者
其中所述棒杆菌菌株在选自以下组中的任何一种或多种或者所有蛋白中是缺陷或下调的：转氨酶B(E.C.2.6.1.42，由ilvE-基因编码)、缬氨酸-丙酮酸转氨酶AvtA(E.C.2.6.1.66，由avtA-基因编码)、丙氨酸转氨酶AlaT(E.C.2.6.1.2，由alaT-基因编码)、丙酮酸脱氢酶的E1亚基(E.C.1.2.4.1，由aceE基因编码)、丙酮酸醌氧化还原酶(E.C.1.2.2.2，由pqo基因编码)和葡糖磷酸异构酶(E.C.5.3.1.9，由pgi基因编码)，并且
在所述棒杆菌菌株中，一种或多种选自以下组的基因是过表达的：ilvA(编码苏氨酸脱水酶的基因，E.C.4.2.1.16)、hom(编码高丝氨酸脱氢酶的基因，E.C.1.1.1.3)、thrB(编码高丝氨酸激酶的基因，E.C.2.7.1.39)、thrC(编码苏氨酸合酶的基因，E.C.4.2.3.1)、lysC(编码天冬氨酸激酶的基因，E.C.2.7.2.4)、天冬氨酸转氨酶(aat，E.C.2.6.1.1)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd，E.C.1.2.1.11)和丙酮酸羧化酶(pyc，E.C.6.4.1.1)，并产生酮甲基戊酸盐；或者
其中所述棒杆菌菌株在选自以下组中的任何一种或多种或者所有蛋白中是缺陷或下调的：转氨酶B(E.C.2.6.1.42，由ilvE-基因编码)、缬氨酸-丙酮酸转氨酶AvtA(E.C.2.6.1.66，由avtA-基因编码)、丙氨酸转氨酶AlaT(E.C.2.6.1.2，由alaT-基因编码)、丙酮酸脱氢酶的E1亚基(E.C.1.2.4.1，由aceE基因编码)、丙酮酸醌氧化还原酶(E.C.1.2.2.2，由pqo基因编码)和葡糖磷酸异构酶(E.C.5.3.1.9，由pgi基因编码)，并且
在所述棒杆菌菌株中，一种或多种选自包括以下基因的组的基因是过表达的：leuA(编码2-异丙基苹果酸合酶的基因(E.C.2.3.3.13)、leuB(3-异丙基苹果酸脱氢酶，E.C.1.1.1.85)和leuCD(3-异丙基苹果酸脱水酶，E.C.4.2.1.33)，并产生酮异已酸盐。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述用于发酵步骤的微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法包括以下步骤：
a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液；
b)将步骤a)中获得的发酵培养液进行蒸馏过程，其伴有所述发酵培养液的pH值变化。
4.如权利要求1或2所述的方法，所述方法包括以下步骤：
a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液；
b)将步骤a)中获得的发酵培养液进行离子交换。
5.如权利要求1、2或4所述的方法，其中将步骤b)中获得的流出物进行选自离子交换、提取或蒸馏的一个或多个进一步纯化步骤。
6.如权利要求1、2、4或5所述的方法，所述方法包括以下步骤：
a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液；
b)将步骤a)中获得的发酵培养液进行离子交换；和
c)将步骤b)中获得的流出物进行选自离子交换、提取或蒸馏的一个或多个进一步纯化步骤；以及
d)将步骤c)中获得的产物进行进一步浓缩、沉淀或结晶步骤或者它们的组合并获得2-酮羧酸或其盐。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中R1为具有3、4或5个碳原子的支链烷基。
8.如权利要求7所述的方法，其中R1选自异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、2-甲基-丁基、3-甲基丁基。
9.如权利要求8所述的方法，其中R1选自异丙基、异丁基、仲丁基。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述2-酮羧酸为2-酮异戊酸、2-酮-4-甲基戊酸或2-酮-3-甲基戊酸。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述2-酮羧酸或其盐的纯度为80重量%或更高。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述2-酮羧酸或其盐的纯度为90重量%或更高。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中在步骤a)中获得的培养液包含至少10g/l的2-酮羧酸或其盐。
14.如权利要求13所述的方法，其中在步骤a)中获得的培养液包含至少15g/l的2-酮羧酸或其盐。
15.如权利要求14所述的方法，其中在步骤a)中获得的培养液包含至少20g/l的2-酮羧酸或其盐。
16.如权利要求15所述的方法，其中在步骤a)中获得的培养液包含至少40g/l的2-酮羧酸或其盐。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述用于发酵步骤的微生物具有提高的产生通式(I)的化合物的能力。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述通式(I)的化合物选自2-酮异戊酸、2-酮-4-甲基戊酸和2-酮-3-甲基戊酸的化合物或它们的混合物。
19.如权利要求1-2和4-18中任一项所述的方法，其中在将所述培养液进行离子交换步骤(b)之前，进行从所述培养液除去细胞和/或细胞碎片的额外步骤。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述除去步骤通过过滤、离心或沉降、或者所述方法的组合来进行。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中在从所述培养液除去细胞和/或细胞碎片之后和在步骤b)之前，使用离子交换树脂或活性炭进行预纯化。
22.如权利要求1-2和4-21中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，使用阳离子树脂进行离子交换。
23.如权利要求1-2和4-22所述的方法，其中在步骤c)中，将阴离子树脂用于离子交换。
24.如权利要求1-2和4-22中任一项所述的方法，其中步骤c)的蒸馏为蒸汽蒸馏。
25.如权利要求23所述的方法，其中在10-100℃的温度下进行所述蒸馏。
26.如权利要求25所述的方法，其中在20-75℃的温度下进行所述蒸馏。
27.如权利要求26所述的方法，其中在25-70℃的温度下进行所述蒸馏。
28.如权利要求27所述的方法，其中在35-65℃的温度下进行所述蒸馏。
29.如权利要求24-28中任一项所述的方法，其中在10-100mbar的压力下进行所述蒸馏。
30.如权利要求29所述的方法，其中在20-80mbar的压力下进行所述蒸馏。
31.如权利要求30所述的方法，其中在20-65mbar的压力下进行所述蒸馏。
32.如权利要求31所述的方法，其中在20-25mbar的压力下进行所述蒸馏。
33.如权利要求1-2和6-28中任一项所述的方法，其中在步骤d)的沉淀和结晶步骤中，以选自Ca2+、Mg2+、Na+、K+的盐的形式或者与氨基酸的盐的形式获得所述2-酮羧酸。
34.通过权利要求1至33中任一项所述的方法获得的2-酮羧酸或其盐。
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