RU2675506C2 - Способ получения l-лейцина, l-валина, l-изолейцина, альфа-кетоизовалерата, альфа-кето-бета-метилвалерата или альфа-кетоизокапроата с использованием рекомбинантных коринебактерий, содержащих оперон ilvbn, который можно индуцировать пропионатом - Google Patents
Способ получения l-лейцина, l-валина, l-изолейцина, альфа-кетоизовалерата, альфа-кето-бета-метилвалерата или альфа-кетоизокапроата с использованием рекомбинантных коринебактерий, содержащих оперон ilvbn, который можно индуцировать пропионатом Download PDFInfo
- Publication number
- RU2675506C2 RU2675506C2 RU2015156852A RU2015156852A RU2675506C2 RU 2675506 C2 RU2675506 C2 RU 2675506C2 RU 2015156852 A RU2015156852 A RU 2015156852A RU 2015156852 A RU2015156852 A RU 2015156852A RU 2675506 C2 RU2675506 C2 RU 2675506C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sequence
- polynucleotide
- valine
- expression
- seq
- Prior art date
Links
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims abstract description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 68
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 title claims abstract description 22
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 title claims abstract description 17
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 title description 29
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 title description 23
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 14
- BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)C(O)=O BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 10
- JVQYSWDUAOAHFM-BYPYZUCNSA-N (S)-3-methyl-2-oxovaleric acid Chemical compound CC[C@H](C)C(=O)C(O)=O JVQYSWDUAOAHFM-BYPYZUCNSA-N 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 78
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 77
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 77
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims abstract description 65
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 53
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 53
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 46
- 101150033780 ilvB gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 101150060643 ilvN gene Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims abstract description 12
- YNOXCRMFGMSKIJ-NFNCENRGSA-N (2S,3S)-2-methylcitric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](C)[C@](O)(C(O)=O)CC(O)=O YNOXCRMFGMSKIJ-NFNCENRGSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 10
- 101150077793 ilvH gene Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract 5
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 49
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 43
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 claims description 16
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 5
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 10
- 239000000411 inducer Substances 0.000 abstract description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 abstract description 3
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 38
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 30
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 description 22
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 20
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 19
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 17
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 15
- -1 for example Chemical class 0.000 description 15
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 14
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 13
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 description 13
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 11
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 11
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- 241000807905 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 Species 0.000 description 10
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- GXOGLXKLKOVKEA-UHFFFAOYSA-N formyl pentanoate Chemical compound CCCCC(=O)OC=O GXOGLXKLKOVKEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QUKRTJQSGPLQKQ-UHFFFAOYSA-N 5-methylsulfonyl-3h-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC=C2OC(=O)NC2=C1 QUKRTJQSGPLQKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150090497 ilvC gene Proteins 0.000 description 4
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 101150025049 leuB gene Proteins 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- JVQYSWDUAOAHFM-BYPYZUCNSA-M (S)-3-methyl-2-oxovalerate Chemical compound CC[C@H](C)C(=O)C([O-])=O JVQYSWDUAOAHFM-BYPYZUCNSA-M 0.000 description 3
- 102100027328 2-hydroxyacyl-CoA lyase 2 Human genes 0.000 description 3
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JVQYSWDUAOAHFM-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxovaleric acid Chemical compound CCC(C)C(=O)C(O)=O JVQYSWDUAOAHFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710103719 Acetolactate synthase large subunit Proteins 0.000 description 3
- 101710182467 Acetolactate synthase large subunit IlvB1 Proteins 0.000 description 3
- 101710171176 Acetolactate synthase large subunit IlvG Proteins 0.000 description 3
- 101710176702 Acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 3
- 101710147947 Acetolactate synthase small subunit 1, chloroplastic Proteins 0.000 description 3
- 101710095712 Acetolactate synthase, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101710196435 Probable acetolactate synthase large subunit Proteins 0.000 description 3
- 101710181764 Probable acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 3
- 101710104000 Putative acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 3
- 101100125907 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) ilvC1 gene Proteins 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 150000005693 branched-chain amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 description 3
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 description 3
- 101150105723 ilvD1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 101150087199 leuA gene Proteins 0.000 description 3
- WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N leubethanol Natural products C1=C(C)C=C2[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@H](C)C2=C1O WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 description 3
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 108030005611 2-methylcitrate dehydratases Proteins 0.000 description 2
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 2-oxobutanoic acid Chemical compound CCC(=O)C(O)=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 2
- 102100034229 Citramalyl-CoA lyase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 2
- 101100387232 Escherichia coli (strain K12) asd gene Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 description 2
- 108020004687 Malate Synthase Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150099953 ilvE gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150081723 leuC gene Proteins 0.000 description 2
- 101150019665 leuD gene Proteins 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001121 post-column derivatisation Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C(C5=CC=C(OC)C=C5N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 101150000850 thrC gene Proteins 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical class C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010030844 2-methylcitrate synthase Proteins 0.000 description 1
- KEZRWUUMKVVUPT-UHFFFAOYSA-N 4-azaleucine Chemical compound CN(C)CC(N)C(O)=O KEZRWUUMKVVUPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFGVJLGVINCWDP-UHFFFAOYSA-N 5,5,5-trifluoroleucine Chemical compound FC(F)(F)C(C)CC(N)C(O)=O XFGVJLGVINCWDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 101710102786 ATP-dependent leucine adenylase Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 101000782236 Bothrops leucurus Thrombin-like enzyme leucurobin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BCZXFFBUYPCTSJ-UHFFFAOYSA-L Calcium propionate Chemical compound [Ca+2].CCC([O-])=O.CCC([O-])=O BCZXFFBUYPCTSJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000709520 Chlamydia trachomatis serovar L2 (strain 434/Bu / ATCC VR-902B) Atypical response regulator protein ChxR Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 1
- 241000133018 Corynebacterium melassecola Species 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700016168 Dihydroxy-acid dehydratases Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 101100175482 Glycine max CG-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241001562081 Ikeda Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108020003285 Isocitrate lyase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100123410 Methanosarcina acetivorans (strain ATCC 35395 / DSM 2834 / JCM 12185 / C2A) hacA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100123415 Methanosarcina acetivorans (strain ATCC 35395 / DSM 2834 / JCM 12185 / C2A) hacB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020000282 Methylisocitrate lyase Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 101100181662 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) leuC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100288829 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) leuD1 gene Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 description 1
- 102000006843 Threonine synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100033451 Thyroid hormone receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 101150036393 aceB gene Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- XJMWHXZUIGHOBA-UHFFFAOYSA-N azane;propanoic acid Chemical compound N.CCC(O)=O XJMWHXZUIGHOBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004330 calcium propionate Substances 0.000 description 1
- 235000010331 calcium propionate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013377 clone selection method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000003081 coactivator Effects 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011437 continuous method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 108010071598 homoserine kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000002518 isoindoles Chemical class 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N levan Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@](CO)(CO[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@](O)(CO)O2)O)O1 AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- CQQJGTPWCKCEOQ-UHFFFAOYSA-L magnesium dipropionate Chemical compound [Mg+2].CCC([O-])=O.CCC([O-])=O CQQJGTPWCKCEOQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001510 metal chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 1
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 229940117953 phenylisothiocyanate Drugs 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- BWILYWWHXDGKQA-UHFFFAOYSA-M potassium propanoate Chemical compound [K+].CCC([O-])=O BWILYWWHXDGKQA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004331 potassium propionate Substances 0.000 description 1
- 235000010332 potassium propionate Nutrition 0.000 description 1
- QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N propionyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N 0.000 description 1
- 229930182852 proteinogenic amino acid Natural products 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- JXKPEJDQGNYQSM-UHFFFAOYSA-M sodium propionate Chemical compound [Na+].CCC([O-])=O JXKPEJDQGNYQSM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004324 sodium propionate Substances 0.000 description 1
- 235000010334 sodium propionate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003212 sodium propionate Drugs 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- SPOMEWBVWWDQBC-UHFFFAOYSA-K tripotassium;dihydrogen phosphate;hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].OP(O)([O-])=O.OP([O-])([O-])=O SPOMEWBVWWDQBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 150000003680 valines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y202/00—Transferases transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
- C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
- C12Y202/01006—Acetolactate synthase (2.2.1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения L-валина путем ферментации микроорганизмов из рода Corynebacterium, содержащих в реплицируемой форме полинуклеотид с операторной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности от положения 1 до 121 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, с которым связывается активатор PrpR, и функционально ниже которого на 3’-конце находится второй полинуклеотид, характеризующийся промоторной активностью, а также гены ilvB и ilvN, и который регулирует транскрипцию генов ilvBN в зависимости от добавления активатора PrpR в среду, к которой после первой фазы (фазы роста), проходящей без индуктора, во второй фазе в качестве индуктора добавляют пропионат или 2-метилцитрат. Предложено применение указанного полинуклеотида с операторной активностью для регуляции экспрессии генов ilvBN. Предложена кассета экспрессии для использования в указанном способе, содержащая указанный полинуклеотид с операторной активностью, расположенный ниже промотор и гены ilvBN. Предложен вектор экспрессии, содержащий указанную кассету экспрессии. Предложено применение указанной кассеты экспрессии и вектора экспрессии для экспрессии генов ilvBN в микроорганизмах рода Corynebacterium. Предложен микроорганизм рода Corynebacterium для получения L-валина указанным способом, содержащий в реплицируемой форме указанную кассету экспрессии или указанный вектор экспрессии. Группа изобретений позволяет увеличить выход L-валина. 7 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 7 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к способу получения аминокислот и кетокислот с использованием микроорганизмов, в которых промотор, индуцируемый пропионатом, дает возможность регулировать экспрессию определенных генов.
Уровень техники
Аминокислоты и кетокислоты используют в медицине человека, в фармацевтической промышленности, в косметике, в пищевой промышленности и в кормлении животных.
Многие из этих соединений получают путем ферментации штаммов коринеформных бактерий, в частности, Corynebacterium glutamicum. Из-за большой важности постоянно проводится работа по усовершенствованию способа получения. Усовершенствования способа может включать в себя воздействия на технологию ферментации, такую как, например, перемешивание и подача кислорода, или воздействия на состав питательных сред, такой как, например, изменение концентрации сахара во время ферментации, или воздействие на форму продукта с помощью, например, ионообменной хроматографии или внутренних характеристик продуктивности самого микроорганизма.
Для усовершенствования характеристик продуктивности этих микроорганизмов используют способы мутагенеза, селекции и отбора мутантов. Таким образом, получают штаммы, устойчивые к антиметаболитам, таким как, например, аналог валина 2-тиазолаланин или аналог лейцина 4-азалейцин, или 5,5,5-трифторлейцин, и которые производят химические соединения, например, L-аминокислоты L-валин или L-лейцин.
В течение нескольких лет также использовались способы с методиками рекомбинантной ДНК для усовершенствования производящих L-аминокислоты штаммов Corynebacterium glutamicum, например, путем усиления или ослабления генов биосинтеза отдельных аминокислот, например, также с временной регуляцией экспрессии генов в ходе производства, и исследования влияния на получение химического соединения.
Обобщающие описания биологии, генетики и биотехнологии Corynebacterium glutamicum можно обнаружить в “Handbook of Corynebacterium glutamicum” (Ред.: L. Eggeling and M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis, 2005), в специальном издании Journal of Biotechnology (главный редактор: A. ) под названием “A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology” (Journal of Biotechnology 104/1-3, (2003)) и в книге T. Scheper (Ответственный редактор) “Microbial Production of L-Amino Acids” (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, Springer Verlag, Berlin, Germany 2003).
Нуклеотидная последовательность генома Corynebacterium glutamicum описана у Ikeda and Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)), в EP 1108790 и в Kalinowski et al. (Journal of Biotechnology 104/1-3, (2003)).
Нуклеотидные последовательности генома Corynebacterium glutamicum также доступны в базе данных Национального Центра Биотехнологической информации (NCBI) Национальной библиотеки медицины (Бетесда, Мэриленд, США), в Банке данных ДНК Японии (DDBJ, Мишима, Япония) или в базе данных нуклеотидных последовательностей Европейских лабораторий молекулярной биологии (EMBL, Хейдельберг, Германия и Кембридж, Соединенное Королевство).
По сути, существует две возможности для экспрессии генов. При непрерывной экспрессии ген непрерывно экспрессируют посредством конститутивного промотора и соответствующий белок накапливается в клетке.
С другой стороны, индуцибельный промотор используют при индуцированной экспрессии. Экспрессию гена-мишени индуцируют, то есть запускают, посредством индуктора. Этот способ используют, если (сверх)экспрессия имеет отрицательное воздействие на производящий организм. Причинами этого может быть высокая загрузка метаболических ресурсов во время фазы роста.Результатом является более медленный рост и, таким образом, удлиненный рабочий цикл биореактора и связанное с этим увеличение затрат в случае промышленного получения. Индуцированная экспрессия также является преимущественной в случае цитотоксических продуктов. При этом аутоинтоксикация и гибель клетки происходит после индукции экспрессии. В связи с экономикой способа получения существует, следовательно, попытка подразделить способ на фазу роста и фазу образования продукта. В фазе роста получают как можно большее количество биомассы и затем в фазе образования продукта получают целевой белок путем индукции промотора. Таким образом можно получить максимальный выход продукта, посредством чего процесс становится заметно более экономичным.
Для регулируемых промоторов из Escherichia coli, lac, lambda PL и trp, уже было показано, что их можно использовать в коринеформных бактериях для регулируемой экспрессии различных генов (Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6 (1988) 428-431).
Идеальным случаем для индуцибельного промотора является коринеформный промотор, который регулируется легкодоступным, недорогим веществом.
В ЕР 0530765 В1 (Kyowa Hakko) описано применение индуцибельного промотора из коринебактерий, в данном случае из гена изоцитратлиазы, для получения ферментов, таких как [бета]-галактозидаза, хлорамфениколацетилтрансфераза и ICL, а также физиологически активных белков, таких как инсулин или [альфа]-, [бета]- или [гамма]-интерферон. Этот промотор приводит к экспрессии генов так долго, пока источник углерода (источник С), отличный от сахара, находится в среде; в присутствии сахара он репрессирован. Поскольку, однако, сахара используют в качестве источника С в обычных ферментационных средах, было бы полезно получить регулируемый промотор, который даже в присутствии сахаров приводит к экспрессии гена с использованием недорогого индуктора.
В DE 4440118 C1 (таком как US 5965391, F.Z. ) заявлено применение индуцибельного промотора из коринебактерий, в данном случае из гена aceB малатсинтазы, для производства белков; индукторами при этом являются источники углерода лактат, пируват или ацетат.
Промотор оперона prpDBC2 из Corynebacterium glutamicum, гены которого необходимы в качестве основного источника С для роста на пропионате и кодируют ферменты 2-метилцитратдегидратазу (PrpD2), 2-метилизоцитратлиазу (PrpB2) и 2-метилцитратсинтазу (PrpC2), описан Plassmeier et al. (Journal of Biotechnology 159/1-2 (2012)). Анализ промоторных конструкций тестируемых векторов привел к идентификации операторного участка длиной 121 пара оснований выше оперона prpDBC2, который необходим для индуцируемой пропионатом транскрипции с помощью активатора PrpR. Исследования EMSA показали, что 2-метилцитрат вероятно функционирует в качестве коактиватора PrpR.
Цель настоящего изобретения
Настоящее изобретение основано на намерении сделать доступным новый способ получения L-аминокислот L-лейцина, L-валина или L-изолейцина, предпочтительно L-валина, или α-кетокислот α-кетоизовалерата, α-кетометилвалерата или α-кетоизокапроата с предпочтительно улучшенным выходом и/или более высокой конечной концентрацией продукта внутриклеточно и/или в среде. При этом предпочтительно должно присутствовать улучшение специфического выхода (т.е. выхода желаемого продукта относительно использованного источника углерода).
Новый способ предпочтительно должен делать возможной регуляцию получения L-аминокислот и/или α-кетокислот независимо от главного источника углерода в среде.
В новом способе образование нежелательных побочных продуктов, в частности, образование нежелательного побочного продукта аланина, должно, кроме того, предпочтительно быть подавлено, если это возможно, поскольку отделение побочного продукта является очень трудоемким и дорогостоящим и, кроме того, имеет отрицательное воздействие на чистоту продуктов бульона и выход углерода.
Используемый способ должен, кроме того, предпочтительно приводить к увеличению генетической стабильности штамма, используемого для получения, и тем самым обеспечивать большое количество поколений в ферментационном процессе (стадий культивирования и основной ферментер) без снижения параметров производительности.
Описание настоящего изобретения
Цели согласно настоящему изобретению достигают путем применения оператора, с которым связывается активатор PrpR для регуляции экспрессии гена ilvBN.
ilvBN (EC No. 4.1.3.18) представляет собой ген, кодирующий субъединицы ацетолактатсинтазы.
Объектом настоящего изобретения, таким образом, является способ получения L-аминокислоты, выбранной из L-лейцина, L-валина и L-изолейцина, предпочтительно L-валина, или α-кетокислоты, выбранной из кетоизовалерата, кетометилвалерата и кетоизокапроата путем ферментации микроорганизмов из рода Corynebacterium, содержащих в реплицируемой форме полинуклеотид с операторной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90, 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере на 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности от положения с 1 по 121 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, с которым связывается активатор PrpR и функционально ниже которого на 3'-конце находится второй полинуклеотид, имеющий промоторную активность, а также гены ilvB и ilvN, кодирующие субъединицы ацетолактатсинтазы, и который регулирует транскрипцию генов ilvBN в зависимости от добавления активатора PrpR, который активируют посредством коактиватора 2-метилцитрата в среде, к которой после первой фазы без индуктора добавляют пропионат или 2- метилцитрат в последующей второй фазе в качестве индуктора, после чего экспрессируют гены ilvBN и таким образом синтезируют желаемую L-аминокислоту или α-кетокислоту в условиях, при которых увеличивается содержание желаемой L-аминокислоты или α-кетокислоты в среде или клетках.
Полинуклеотид, характеризующийся операторной активностью, предпочтительно представляет собой оператор, который естественным образом регулирует экспрессию 2-метилцитратдегидратазы у коринеформных бактерий, или полинуклеотид, полученный из такого оператора.
Полинуклеотид с операторной активностью предпочтительно содержит полинуклеотид, последовательность которого по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере на 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности согласно SEQ ID NO: 11 или последовательности от положения 22 до положения 49 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3 (в дальнейшем также названная “IR 1”), а также полинуклеотид, последовательность которого по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере на 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности согласно SEQ ID NO: 12 или последовательности от положения 77 до положения 105 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3 (в дальнейшем также названная “IR 2”). Последовательность “IR 1” при этом расположена в положении с 22 по 49 в предпочтительном варианте осуществления в полинуклеотиде с операторной активностью, в то время как последовательность “IR 2” расположена в положении с 77 по 105 в предпочтительном варианте осуществления.
В предпочтительном варианте осуществления согласно настоящему изобретению полинуклеотид с операторной активностью является частью более длинного полинуклеотида, предпочтительно полинуклеотида, имеющего идентичность последовательности по меньшей мере 90%, предпочтительно, по меньшей мере 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно 100% с последовательностью от положения 1 до 177 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3.
Ген ilvB предпочтительно представляет собой полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, предпочтительно, по меньшей мере 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно 100% с аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO: 9.
Особенно предпочтительным при этом является полинуклеотид, последовательность которого по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере на 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности от положения 499 до 2379 согласно SEQ ID NO: 8.
Ген ilvN предпочтительно представляет собой полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, предпочтительно, по меньшей мере 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно 100% с аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO: 10.
Особенно предпочтительным при этом является полинуклеотид, последовательность которого по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере на 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности от положения 2393 до 2911 согласно SEQ ID NO: 8.
Полипептиды, кодируемые генами ilvB и ilvN, агломерируют друг с другом с получением функциональной ацетолактатсинтазы.
Пропионат или пропионовую кислоту предпочтительно используют для индукции экспрессии. В этом отношении имеет место "индукция пропионатом". Пропионат превращают in vitro в фактический коактиватор 2-метилцитрат. В качестве альтернативы, 2-метилцитрат также можно использовать непосредственно для индукции, но его применяют с меньшей предпочтительностью из-за более низкой доступности. Согласно настоящему изобретению выражение "индукция пропионатом" также включает индукцию 2-метилцитратом.
После завершения получения желаемую L-аминокислоту или α-кетокислоту предпочтительно выделяют, другие компоненты ферментационного бульона и/или биомассы необязательно остаются во всей их полноте или частично (> 0 до 100%) в выделенном продукте или полностью удаляются.
В способе согласно настоящему изобретению сначала имеет место фаза культивирования без индукции (фаза роста, первая фаза) для обеспечения биомассы. В этой фазе предпочтительно не образуют или почти не образуют никакую аминокислоту или кетокислоту (< 5 г/л). В последующей фазе получения (фаза индукции, вторая фаза) получение индуцируют путем индукции генов биосинтеза ilvBN с помощью пропионата или 2-метилцитрата. Фаза культивирования включает в себя все этапы культивирования, начиная с сохраненного образца, через предпочтительно используемые стадии встряхиваемого сосуда до предпочтительно используемого культурального ферментера. Фаза культивирования может также еще включать в себя первую фазу основной ферментации. Предпочтительно, фазу культивирования завершают не позднее, чем после первых 3-15 часов, предпочтительно 5-10 часов основной ферментации.
Фаза индукции предпочтительно включает в себя время от 0 до 20 часов после инокуляции основного ферментера вплоть до конца основной ферментации. Индукция в более ранний момент времени, то есть в культуральном ферментере, может быть преимущественной и представляет собой специфический вариант осуществления способа согласно настоящему изобретению.
Точная регуляция/замер концентрации пропионовой кислоты в фазе получения продукта необходим для того, чтобы, с одной стороны, поддерживать индукцию синтеза аминокислот или кетокислот, а с другой стороны, чтобы предотвратить токсическое действие пропионата или одного из промежуточных продуктов его разложения (пропионил-КоА, 2-метилцитрат). Предпочтительная концентрация пропионовой кислоты в фазе индукции лежит в диапазоне от 0,1 - 10 г/л. Пропионовую кислоту можно добавлять непрерывно в виде подкормки с пропионовой кислотой или периодически в виде одного или нескольких импульсов пропионовой кислоты в различные моменты времени в течение фазы индукции. Однократная доза пропионовой кислоты в качестве компонента среды в основной ферментационной среде также является возможной и представляет собой специфический вариант осуществления способа согласно настоящему изобретению.
Большой проблемой в производстве аминокислот и кетокислот является, как правило, образование побочных продуктов. Образованные побочные продукты снижают выход углерода и должны быть, кроме того, необязательно отделены, что является очень трудоемким и дорогостоящим.
Примером образования побочного продукта является образование побочного продукта аланина при биосинтезе валина. Образование аланина увеличивается в общепринятых способах получения, при которых обычно имеет место конститутивная экспрессия, в зависимости от числа клеточных поколений.
От архивных образцов до сбора урожая из ферментера для получения продукта в способе, состоящем из трех стадий (встряхиваемый сосуд, культуральный ферментер, основной ферментер), проходят приблизительно 20-25 поколений, способе, состоящем из четырех стадий (встряхиваемый сосуд, предпосевный ферментер, культуральный ферментер, основной ферментер), проходят даже более чем 30 поколений. При прохождении через такое большое количество поколений образование побочного продукта и образование биомассы, как правило, соответственно значительно увеличено.
Согласно настоящему изобретению, однако, обнаружено очень сильное снижение образования побочного продукта и образования биомассы. Более того, было обнаружено, что образование побочного продукта и образование биомассы в способах получения согласно настоящему изобретению не зависит от числа пройденных поколений. Это предполагает, что управление процессом согласно настоящему изобретению ведет к повышению генетической стабильности используемого штамма. Фазу культивирования можно поэтому, в принципе, расширить до любой продолжительности, что особенно выгодно для управления процессом.
Особенно предпочтительный способ согласно настоящему изобретению, таким образом, отличается тем, что он включает в себя по меньшей мере четыре стадии, а именно, по меньшей мере три стадии культивирования и стадию получения продукта. Культивирование при этом предпочтительно включает в себя культивирование во встряхиваемом сосуде, в предпосевном ферментере, а также в посевном ферментере. Производство предпочтительно имеет место в ферментере для получения продукта.
Дополнительный особенно предпочтительный способ согласно настоящему изобретению, таким образом, отличается тем, что бактерии, используемые в фазе культивирования, проходят по меньшей мере 16, предпочтительно, по меньшей мере 24 поколения и/или в течение всей ферментации (включая культивирование и получение) проходят по меньшей мере 25, предпочтительно, по меньшей мере 30 поколений.
Настоящее изобретение также относится к применению полинуклеотида, характеризующегося операторной активностью, с которым связывается активатор PrpR, при этом полинуклеотид обладает последовательностью, которая по меньшей мере на 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, предпочтительно, по меньшей мере на 97%, особенно предпочтительно, по меньшей мере на 98%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 99% и чрезвычайно предпочтительно, на 100% идентична последовательности от положения 1 до 121 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3 для регуляции экспрессии генов ilvBN, предпочтительно в комбинации с промотором, расположенным выше данных генов.
Настоящее изобретение также относится к кассете экспрессии, содержащей полинуклеотид, характеризующийся операторной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, предпочтительно, по меньшей мере на 97%, особенно предпочтительно, по меньшей мере на 98%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 99% и чрезвычайно предпочтительно, на 100% идентична последовательности от положения 1 до 121 согласно SEQ ID NO:1, 2 или 3, расположенный ниже промотор и гены ilvBN, кодирующие ацетолактатсинтазу.
Полинуклеотид, характеризующийся операторной активностью, при этом предпочтительно всегда имеет характеристики, выделенные ранее как предпочтительные, в частности, консервативные области “IR 1” и “IR 2”.
Промотор, расположенный выше генов ilvBN, или промотор, расположенный ниже оператора, может быть любым желательным промотором.
Примеры промоторов согласно настоящему изобретению, предпочтительно используемых в Corynebacterium glutamicum, описаны, например, на Фиг. 1 обзорной статьи Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003)). Таким же образом можно использовать варианты промотора dapA, например, промотор A25, описанный Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)). Кроме того, можно использовать промотор gap из Corynebacterium glutamicum (EP 06007373). Наконец, можно использовать хорошо известные промоторы T3, T7, SP6, M13, lac, tac и trc, описанные Amann et al. (Genes 69(2), 301-315 (1988)) и Amann and Brosius (Genes 40(2-3), 183-190 (1985)).
В предпочтительном варианте осуществления промотор, используемый согласно настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, имеющий промоторную активность, последовательность которого по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, предпочтительно, по меньшей мере на 97%, особенно предпочтительно, по меньшей мере на 98%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 99% и, чрезвычайно предпочтительно, на 100% идентична последовательности от положения 122 до 206 согласно SEQ ID NO: 4.
Кассета экспрессии согласно настоящему изобретению представляет собой предпочтительно кассету экспрессии, имеющую последовательность согласно SEQ ID NO: 13.
Дополнительным объектом настоящего изобретения является вектор, который содержит кассету экспрессии согласно настоящему изобретению.
Kirchner and Tauch (Journal of Biotechnology 104:287-299 (2003)) описывают выбор векторов, которые предпочтительно используют в Corynebacterium glutamicum.
Гомологичная рекомбинация с использованием векторов согласно настоящему изобретению позволяет заменить участки ДНК в хромосоме на кассеты экспрессии согласно настоящему изобретению, которые транспортируют в клетку с помощью вектора. Для эффективной рекомбинации между кольцевой молекулой ДНК вектора и ДНК-мишенью в хромосоме область ДНК, подлежащую замене, которая содержит кассету экспрессии согласно настоящему изобретению, обеспечивают с нуклеотидными последовательностями на концах, гомологичными целевому сайту, в результате чего точно определяют сайт интеграции вектора или замены ДНК.
Включение кассеты экспрессии согласно настоящему изобретению может иметь место при этом в сайте нативного гена в генах ilvBN, предпочтительно, нативных генов ilvBN и необязательно также нативного промотора генов ilvBN, заменяемого при этом кассетой экспрессии согласно настоящему изобретению.
Альтернативно, кассету экспрессии согласно настоящему изобретению можно также интегрировать в межгенную область в хромосоме, которая не имеет кодирующей функции, или в сайт другого гена, при этом сайт другого гена предпочтительно представляет собой нуклеотидную последовательность в хромосоме, которая не является необходимой для роста клеток и получения аминокислоты или кетокислоты.
Кассету экспрессии согласно настоящему изобретению можно также включить согласно настоящему изобретению в хромосому в предпочтительном варианте осуществления в нескольких копиях, а также необязательно в сайтах различных генов.
Вместо включения в хромосому кассеты экспрессии согласно настоящему изобретению, альтернативно можно также включить в хромосому оператор, используемый согласно настоящему изобретению, в комбинации с промотором по сайту нативного гена в генах ilvBN, где предпочтительно нативный промотор генов ilvBN заменяют конструкцией оператора и промотора.
Вместо включения кассеты экспрессии согласно настоящему изобретению в хромосому, согласно настоящему изобретению альтернативно также можно конечно использовать внехромосомно реплицирующийся вектор, который содержит кассету экспрессии согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также дополнительно относится к микроорганизму, предпочтительно к Corynebacterium, особенно Corynebacterium, которая производит L-аминокислоту, выбранную из L-лейцина, L-валина и L-изолейцина, или α-кетокислоту, выбранную из кетоизовалерата, кетометилвалерата и кетоизокапроата, которая содержит кассету экспрессии согласно настоящему изобретению и/или вектор согласно настоящему изобретению.
Детали биохимии и химической структуры полинуклеотидов, таких какие встречаются в живых организмах, таких как, например, микроорганизмы, можно найти, помимо прочего, в учебнике “Biochemie” [Biochemistry] Berg et al. (Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Berlin, 2003; ISBN 3-8274-1303-6).
Если полинуклеотид состоит из дезоксирибонуклеотидных мономеров, содержащих нуклеиновые основания или основания аденин (A), гуанин(G), цитозин(C) и тимин (T), говорят о дезоксирибополинуклеотидах или дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК). Если полинуклеотид состоит из рибонуклеотидных мономеров, содержащих нуклеиновые основания или основания аденин (A), гуанин(G), цитозин(C) и урацил (U), говорят о рибополинуклеотидах или рибонуклеиновой кислоте (РНК). В упомянутых полинуклеотидах мономеры соединены ковалентно друг с другом при помощи сложной 3'→ 5'-фосфодиэфирной связи.
Выражение "полинуклеотид с операторной активностью" или "оператор" следует понимать как полинуклеотид, предпочтительно дезоксирибополинуклеотид, или нуклеиновую кислоту, предпочтительно дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), которая функционально связана с помощью полинуклеотида с промоторной активностью с полинуклеотидом, подлежащим транскрибированию, включает или выключает транскрипцию этого полинуклеотида посредством взаимодействия с различными регуляторными белками (активаторами или репрессорами, которые в свою очередь взаимодействуют с лигандами или эффекторными молекулами).
Выражение "полинуклеотид с промоторной активностью" или "промотор" следует понимать как полинуклеотид, предпочтительно дезоксирибополинуклеотид, или нуклеиновую кислоту, предпочтительно дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), которая функционально связана с полинуклеотидом, подлежащим транскрибированию, определяющий точку инициации и частоту инициации транскрипции этого полинуклеотида, посредством чего можно влиять на уровень экспрессии контролируемого полинуклеотида.
Вследствие двухцепочечной структуры ДНК настоящее изобретение также относится к комплементарной цепи цепи последовательности, перечисленной в SEQ ID NO: 1, 2 или 3.
Выражение "транскрипция" следует понимать как способ, посредством которого, начиная с матрицы ДНК, получают комплементарную молекулу РНК. Белки, такие как РНК-полимеразы, "сигма-факторы" и белки-регуляторы транскрипции участвуют в этом способе. Затем синтезированная РНК (информационная РНК, м-РНК) служит в качестве матрицы в процессе трансляции, который затем ведет к полипептиду или белку.
Ген, рассматриваемый с химической точки зрения, является полинуклеотидом. Полинуклеотид, который кодирует белок/полипептид, используют при этом синонимично выражению "ген". Соответственно, эти два выражения "ген" и "кодирующая область" используют синонимично, как и два выражения "белок" и "полипептид".
Выражение "ниже расположенное функциональное соединение или связь" следует понимать в этой связи как означающее последовательное расположение полинуклеотида, характеризующегося операторной активностью согласно настоящему изобретению, со вторым полинуклеотидом, имеющим промоторную активность, и с дополнительным олиго- или полинуклеотидом, которое ведет к транскрипции этого дополнительного полинуклеотида.
Если дополнительный полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, который кодирует полипептид/белок, состоящий из кодирующей области для полипептида, начиная с инициирующего кодона, в том числе стоп-кодон и необязательно в том числе терминатор транскрипции, выражение "ниже расположенное функциональное соединение или связь" означает последовательное расположение, которое ведет к транскрипции дополнительного полинуклеотида и трансляции синтезированной РНК.
Дополнительый полинуклеотид кодирует один или более полипептид(полипептиды). Полинуклеотид, кодирующий белок/полипептид, в целом состоит из инициирующего кодона, выбранного из группы, состоящей из ATG, GTG и TTG, предпочтительно ATG или GTG, особенно предпочтительно ATG, из кодирующей белок последовательности и одного или более стоп-кодона(кодонов), выбранного из группы, состоящей из TAA, TAG и TGA.
Если дополнительный полинуклеотид кодирует ряд белков/полипептидов, сайт связывания рибосомы может быть расположен перед каждым геном. После последнего гена необязательно расположен терминатор.
Дополнительный полинуклеотид состоит согласно настоящему изобретению из генов ilvB и ilvN, которые кодируют субъединицы ацетолактатсинтазы (IlvBN, EC No.: 4.1.3.18).
Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению кассеты экспрессии согласно настоящему изобретению или вектора согласно настоящему изобретению для экспрессии генов ilvBN в микроорганизмах. Кассета экспрессии согласно настоящему изобретению гарантирует транскрипцию и трансляцию синтезированной РНК, предпочтительно мРНК, в полипептиды, а именно, в две субъединицы ацетолактатсинтазы.
С использованием кассеты экспрессии согласно настоящему изобретению гены ilvBN в микроорганизмах можно экспрессировать или сверхэкспрессировать в желаемый момент времени.
Сверхэкспрессию обычно следует понимать как увеличение внутриклеточной концентрации или активности рибонуклеиновой кислоты, белка (полипептида) или фермента по сравнению с исходным штаммом (родительским штаммом) или штаммом дикого типа, если он является исходным штаммом. Исходный штамм (родительский штамм) следует понимать как штамм, на который производят воздействие, ведущее к сверхэкспрессии.
В случае сверхэкспрессии предпочтительными являются способы рекомбинантной сверхэкспрессии. Среди них сгруппированы все способы, в которых микроорганизм получают с использованием молекулы ДНК, полученной in vitro. Такие молекулы ДНК включают в себя, например, промоторы, кассеты экспрессии, гены, аллели, кодирующие области и т.д. Их превращают способами трансформации, конъюгации, трансдукции или аналогичными способами в желаемый микроорганизм.
С помощью воздействия сверхэкспрессии с использованием оператора, подлежащего использованию согласно настоящему изобретению, и/или с использованием кассеты экспрессии согласно настоящему изобретению активность или концентрацию ацетолактатсинтазы в целом предпочтительно повышают по меньшей мере на 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% или 500%, предпочтительно, максимально до 1000%, 2000%, 4000%, 10000% или 20000% на основании активности или концентрации полипептида в штамме до воздействия, ведущего к сверхэкспрессии.
Степень экспрессии или сверхэкспрессии можно определить путем измерения количества мРНК, транскрибированной с гена, путем определения количества полипептида и путем определения активности фермента.
Для определения количества мРНК, помимо прочего, используют способ "нозерн-блоттинга" и количественную RT-PCR (ПЦР с обратной транскрипцией). При количественной RT-PCR полимеразной цепной реакции предшествует обратная транскрипция. Для этой цели можно использовать LightCyclerTM System от компании Roche Diagnostics (Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Маннхейм, Германия), как описано, например, в Jungwirth et al. (FEMS Microbiology Letters 281, 190-197 (2008)). Концентрацию белка в геле можно определить с помощью 1- и 2-мерного гель-разделения белков и последующей оптической идентификации концентрации белка с использованием соответствующего аналитического программного обеспечения. Общепринятым способом для получения белковых гелей в случае коринеформных бактерий и для идентификации белков является процедура, описанная Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)). Концентрацию белка также можно определить с помощью вестерн-блот-гибридизации с использованием антитела, специфичного для белка, подлежащего обнаружению (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) и последующей оптической оценки с использованием соответствующего программного обеспечения для определения концентрации (Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)). Статистическую значимость собранных данных определяют с использованием Т-теста (Gosset, Biometrika 6(1): 1-25 (1908)).
Воздействие для сверхэкспрессии генов ilvBN с использованием оператора, подлежащего использованию согласно настоящему изобретению, можно комбинировать подходящим образом с дополнительными воздействиями для сверхэкспрессии.
В уровне техники доступно множество способов для достижения сверхэкспрессии. В дополнение к модификации нуклеотидных последовательностей, которые регулируют или контролируют экспрессию гена, они также включают увеличение числа копий.
Увеличение числа копий может иметь место посредством плазмид, которые реплицируются в цитоплазме микроорганизма. Для этой цели в уровне техники описано множество плазмид для различных групп микроорганизмов, с помощью которых можно регулировать желаемое увеличение числа копий гена. Подходящие плазмиды для рода Corynebacterium описаны, например, в Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 27-40, (2003)) или в Stansen et al. (Applied and Environmental Microbiology 71, 5920-5928 (2005)).
Увеличение числа копий на по меньшей мере одну (1) копию может, кроме того, иметь место посредством вставки дополнительных копий в хромосому микроорганизма. Подходящие способы для рода Corynebacterium описаны, например, в описаниях изобретения к патентам WO 03/014330, WO 03/040373 и WO 04/069996.
Увеличение экспрессии гена может, кроме того, иметь место тогда, когда ряд промоторов располагают перед желаемым геном или функционально связывают с геном, подлежащим экспрессии, и таким образом достигают повышенной экспрессии. Примеры этого описаны в описании изобретения к патенту WO 2006/069711.
Степень продления зависит от использования кодона; при применении кодонов для т(транспортных) РНК, часто встречающихся в исходных штаммах, трансляцию можно увеличить. Кроме того, замена инициирующего кодона на кодон ATG, наиболее часто возникающая во многих микроорганизмах (77% в Escherichia coli), может значительно улучшить трансляцию, поскольку на уровне РНК кодон AUG является от двух до трех раз более эффективным, чем, например, кодоны GUG и UUG (Khudyakov et al., FEBS Letters 232(2):369-71 (1988); Reddy et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17):5656-60 (1985)). Окружение последовательности инициирующего кодона также можно оптимизировать, поскольку описаны эффекты взаимодействия между инициирующим кодоном и фланкирующими областями (Stenstrom et al., Gene 273(2):259-65 (2001); Hui et al., EMBO Journal 3(3):623-9 (1984)).
Инструкции для обработки ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации и селекции трансформантов находятся, помимо прочего, в известном Справочнике Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
В предпочтительном варианте осуществления согласно настоящему изобретению используют микроорганизмы, в которых дополнительные гены биосинтетического пути желаемой L-аминокислоты или α-кетокислоты дополнительно присутствуют в амплифицированной форме, в частности, сверхэкспрессированы.
В связи с получением L-валина, L-изолейцина, α-кетоизовалериановой кислоты, α-кето-β-метилвалериановой кислоты или α-кетоизокапроновой кислоты, предпочтительно один или более генов или полинуклеотидов, которые кодируют ферменты биосинтеза L-валина, L-изолейцина, α-кетоизовалериановой кислоты, α-кето-β-метилвалериановой кислоты или α-кетоизокапроновой кислоты, выбранные из группы:
a) полинуклеотид (ген ilvC), который кодирует изомероредуктазу (IlvC, EC No.: 1.1.1.86),
b) полинуклеотид (ген ilvD), который кодирует дигидроксиациддегидратазу (IlvD, EC No.: 4.2.1.9),
c) полинуклеотид (ген ilvE), который кодирует трансаминазу (IlvE, EC No.: 2.6.1.42),
d) полинуклеотид (ген ilvA), который кодирует треониндегидратазу (IlvA, EC No.: 4.3.1.19),
e) полинуклеотид (ген hom), который кодирует гомосериндегидрогеназу (Hom, EC No.: 1.2.1.11),
f) полинуклеотид (ген thrB), который кодирует гомосеринкиназу (ThrB, EC No.: 2.7.1.39),
g) полинуклеотид (ген thrC), который кодирует треонинсинтазу (ThrC, EC No.: 4.2.3.1),
h) полинуклеотид (ген leuA), который кодирует изопропилмалатсинтазу (LeuA, EC No.: 2.3.3.13),
i) полинуклеотид (ген leuB), который кодирует изопропилмалатдегидрогеназу (LeuB, EC No.: 1.1.1.85),
j) полинуклеотид (ген leuC), который кодирует большую субъединицу изопропилмалатизомеразы (LeuC, EC No.: 4.2.1.33),
k) полинуклеотид (ген leuD), который кодирует малую субъединицу изопропилмалатизомеразы (LeuD, EC No.: 4.2.1.33),
можно дополнительно сверхэкспрессировать, при этом гены hom, ilvA, ilvC, ilvD и ilvE являются особенно предпочтительными для изолейцина и валина, гены ilvC и ilvD являются особенно предпочтительными для α-кетоизовалериановой кислоты (KIV) и α-кето-β-метилвалериановой кислоты (KMV) и гены ilvC, ilvD, leuA, leuB, leuC и leuD являются особенно предпочтительными для α-кетоизокапроновой кислоты (KIC).
В предпочтительном варианте осуществления используют микроорганизмы, в которых метаболические пути, которые снижают образование желаемой L-аминокислоты или α-кетокислоты, по меньшей мере частично ослаблены.
Если предпочтительным является получение валина или кетоизовалерата, тогда метаболические пути для изолейцина (для образования предшественника - альфа-кетомасляной кислоты: ilvA, thrB, thrC, hom) и/или для лейцина (leuA, leuB, leuCD) могут быть ослаблены. Если предпочтительным является получение изолейцина или кетометилвалерата, то биосинтетический путь лейцина может быть ослаблен. Если предпочтительным является производство лейцина или кетоизокапроата, тогда биосинтетический путь изолейцина (или предшественника - альфа-кетомасляной кислоты) может быть ослаблен.
Выражение "ослабление" в этой связи описывает снижение или выключение внутриклеточной активности одного или нескольких ферментов (белков) в бактерии, которые кодируются соответствующей ДНК, посредством, например, использования слабого промотора или с использованием гена или аллеля, который кодирует соответствующий фермент, имеющий низкую активность, или инактивирует соответствующий ген или фермент (белок) и необязательно сочетает в себе эти воздействия. Полного или частичного ослабления индивидуальных генов-мишеней можно достичь, например, посредством полной или частичной делеции генов или посредством вставки точечных мутаций в структурный ген или в промоторный участок или в сайт связывания рибосомы. Дополнительным способом для специфического снижения экспрессии гена является антисмысловая техника, когда короткие олигодезоксирибонуклеотиды или векторы для синтеза более длинной антисмысловой РНК вводят в клетки-мишени. Антисмысловая РНК может связываться там с комплементарными участками специфических мРНК и снижать их стабильность или блокировать способность к трансляции. Специалист в данной области найдет пример этого в Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10): 4366 – 4371). Только что описанную антисмысловую технику можно также выполнять путем применения операторов/промотора согласно настоящему изобретению, в котором их клонируют в "антисмысловой" ориентации после гена-мишени. После добавления индуктора - пропионата индуцируют образование мРНК комплементарной цепи гена-мишени, подлежащего ослаблению. Путем добавления этой антисмысловой мРНК к мРНК гена-мишени уменьшают экспрессию гена-мишени. Регулируемую экспрессию или сверхэкспрессию генов ilvBN или получение L-аминокислот или α-кетокислот предпочтительно проводят в микроорганизмах из рода Corynebacterium. В роде Corynebacterium предпочтительными штаммами являются те, которые основаны на следующих видах: Corynebacterium efficiens, типовой штамм, размещенный как DSM44549, Corynebacterium glutamicum, типовой штамм, размещенный как ATCC13032, и Corynebacterium ammoniagenes, типовой штамм, размещенный как ATCC6871. Вид Corynebacterium glutamicum является наиболее предпочтительным.
Некоторые представители вида Corynebacterium glutamicum также известны из уровня техники под другими названиями. Они включают в себя, например: штамм ATCC13870, который обозначили как Corynebacterium acetoacidophilum, штамм DSM20137, который обозначили как Corynebacterium lilium, штамм ATCC17965, который обозначили как Corynebacterium melassecola, штамм ATCC14067, который обозначили как Brevibacterium flavum, штамм ATCC13869, который обозначили как Brevibacterium lactofermentum, и штамм ATCC14020, который обозначили как Brevibacterium divaricatum.
Также для Corynebacterium glutamicum было распространено выражение "Micrococcus glutamicus". Некоторые представители вида Corynebacterium efficiens были также обозначены в уровне техники как Corynebacterium thermoaminogenes, такие, например, как штамм FERM BP-1539.
Микроорганизмы или штаммы (исходные штаммы), используемые для воздействий согласно настоящему изобретению, предпочтительно уже имеют способность секретировать желаемую L-аминокислоту или α-кетокислоту в питательную среду, окружающую их, и накапливать ее там. В дальнейшем для этого также используется выражение "производить". В частности, штаммы, используемые согласно настоящему изобретению, предпочтительно имеют способность после индукции увеличивать содержание или накапливать ≥ (по меньшей мере) 0,5 г/л*ч, предпочтительно, по меньшей мере 1,0 или 2,0 г/л*ч, желаемой аминокислоты или кетокислоты в клетке или в питательной среде. Исходные штаммы предпочтительно представляют собой штаммы, которые были получены путем мутагенеза и селекции, с помощью методов рекомбинантной ДНК или путем комбинации обоих способов.
Специалисту в данной области понятно, что также можно получить микроорганизм, пригодный для воздействий согласно настоящему изобретению, путем первоначального использования в диком штамме, таком как, например, типовой штамм Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 или штамм АТСС 14067, оператора, подлежащего использованию согласно настоящему изобретению, для регулируемой экспрессии желаемых генов, а затем путем индукции микроорганизма для получения аминокислоты или кетокислоты путем дополнительных генетических воздействий, описанных в уровне техники.
Известными представителями штаммов коринеформных бактерий, производящих или секретирующих L-валин, являются, например: Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 (описан в US 5188948); Brevibacterium lactofermentum FERM BP-3007 (описан в US 5521074); Corynebacterium glutamicum FERM BP-3006 (описан в US 5521074) и Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764 (описан в US 5188948).
Микроорганизмы, производящие L-валин, как правило, имеют устойчивую к торможению по механизму обратной связи или десенсибилизированную ацетолактатсинтазу (AHAS, EC 4.1.3.18). Она представляет собой первый фермент параллельных метаболических путей для синтеза изолейцина, валина и лейцина (Umbarger, H. E. 1987, Biosynthesis of the branched-chain amino acids, pp. 352-367, в F. C. Neidhardt, J. L. Ingraham, K. B. Low, B. Magasanik, M. Schaechter and H.E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, American Society for Microbiology, Washington, D.C.). Холофермент всегда состоит из 2 больших субъединиц и 2 малых субъединиц. Большая субъединица AHAS образует каталитический домен и кодируется ilvB; малая субъединица, которая функционирует как регуляторный домен, кодируется ilvN. Под устойчивыми к торможению по механизму обратной связи ацетолактатсинтазами подразумевают ацетолактатсинтазы, которые по сравнению с дикой формой (диким типом) имеют более низкую чувствительность к ингибированию аминокислотами с разветвленной цепью валином, изолейцином и лейцином или их смесями. В случае ацетолактатсинтаз из видов Corynebacterium glutamicum, штаммы ATCC13032, ATCC14067 (также известного как Brevibacterium flavum) или ATCC13869 (также известного как Brevibacterium lactofermentum) представляют собой подходящий дикий тип.
Гены ilvBN в Corynebacterium glutamicum, кодирующие ацетолактатсинтазу, описаны, например, Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology 175(17):5595-603 (1993)) или в EP1108790. По номеру доступа L09232 (GenBank, NCBI) показана последовательность данных генов.
Варианты фермента AHAS, которые больше не подвержены ингибированию по механизму обратной связи аминокислотами с разветвленной цепью (лейцин, валин, изолейцин), описаны, например, в Mendel et al. (Journal of Molecular Biology 325, 275-284 (2003)), Elisakova et al. (Applied and Environmental Microbiology 71, 207-213 (2005)), Wada et al. (Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 72 (11), 2959-2965, (2008)) и в EP 1491634. Предпочтительными являются такие варианты устойчивой к торможению по механизму обратной связи ацетолактатсинтазы, которые несут одну или более из следующих аминокислотных замен в малой субъединице, кодируемой ilvN, выбранных из группы: в положении 20 аминокислотной последовательности L-аспарагиновая кислота вместо глицина, в положении 21 аминокислотной последовательности L-аспарагиновая кислота вместо L-изолейцина, в положении 22 аминокислотной последовательности L-фенилаланин вместо L-изолейцина, в положении 42 любая протеиногенная аминокислота за исключением L-аланина, предпочтительно L-валин, L-изолейцин и L-лейцин, особенно предпочтительно L-валин, и необязательно в положении 47 L-лейцин вместо L-гистидина (описано в DE 102011118019 А1).
Известными представителями L-изолейцин-производящих или секретирующих штаммов коринеформных бактерий являются, например, Brevibacterium flavum FERM BP-760 (описан в US 4656135); Brevibacterium flavum FERM BP-2215 (описан в US 5294547) и Corynebacterium glutamicum FERM BP-758 (описан в US 4656135).
Секретирующие или производящие α-кетокислоту штаммы основаны, например, на: Corynebacterium glutamicum, штамм ATCC13032; Brevibacterium flavum, штамм ATCC 14067 и Brevibacterium lactofermentum, штамм ATCC 13869.
Настоящее изобретение обеспечивает микроорганизм, который производит L-аминокислоту, выбранную из L-лейцина, L-валина и L-изолейцина, или α-кетокислоту, выбранную из α-кетоизовалерата, α-кетометилвалерата и α-кетоизокапроата, при этом микроорганизм делает возможным или имеет при применении оператора, подлежащего использованию согласно настоящему изобретению, регулируемую экспрессию генов ilvBN, кодирующих ацетолактатсинтазу.
Кроме того, настоящее изобретение делает доступным способ ферментативного получения L-аминокислоты, выбранной из L-лейцина, L-валина и L-изолейцина, или α-кетокислоты, выбранной из α-кетоизовалерата, α-кетометилвалерата и α-кетоизокапроата, включающий следующие этапы:
a) культивирование микроорганизма согласно настоящему изобретению в подходящей среде с получением ферментационного бульона и
b) увеличение содержания L-аминокислоты или α-кетокислоты в данном ферментационном бульоне a) и/или в клетках данного микроорганизма.
При этом предпочтительно, что L-аминокислоту или α-кетокислоту или жидкий или твердый продукт, который содержит L-аминокислоту или α-кетокислоту, получают из ферментационного бульона, содержащего L-аминокислоту или α-кетокислоту.
Полученные микроорганизмы можно культивировать непрерывно - как описано, например, в WO 05/021772 - или по партиям в периодическом способе (периодическое культивирование или периодический способ) или в периодическом с подпиткой (способ с подкормкой) или периодическом способе с повторной подпиткой (способ с повторяющейся подкормкой) с целью получения желаемого органического химического соединения. Общий обзор известных способов культивирования доступен в учебнике Chmiel (Bioprozesstechnik 1, in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1, Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Штуттгарт, 1991)) или в учебнике Storhas (Bioreaktoren and periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Devices] (Vieweg Verlag, Брауншвейг/Висбаден, 1994)).
Культуральная среда или ферментационная среда, которая будет использоваться, должна удовлетворять требованиям соответствующих штаммов подходящим образом. Описания культуральных сред для различных микроорганизмов содержатся в справочнике “Manual of Methods for General Bacteriology” от Американского общества по бактериологии (Вашингтон, округ Колумбия, США, 1981). Выражения культуральная среда или ферментационная среда являются взаимозаменяемыми.
Используемым источником углерода могут быть сахара и углеводы, такие как, например, глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, меласса, содержащие сахарозу растворы от переработки сахарной свеклы или сахарного тростника, крахмал, гидролизат крахмала и целлюлоза, масла и жиры, такие как, например, соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло, жирные кислоты, такие как, например, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, такие как, например, глицерин, метанол и этанол, и органические кислоты, такие как, например, уксусная кислота или молочная кислота.
Используемым источником азота могут быть органические азот-содержащие соединения, такие как пептоны, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевая мука и мочевина, или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота можно использовать по отдельности или в виде смеси.
Используемым источником фосфора может быть фосфорная кислота, фосфат аммония, дигидрофосфат калия или гидроортофосфат калия или соответствующие натрий-содержащие соли.
Культуральная среда должна, кроме того, содержать соли, например, в виде хлоридов или сульфатов металлов, таких как, например, натрий, калий, магний, кальций и железо, такие как, например, сульфат магния или сульфат железа, которые необходимы для роста. Наконец, незаменимые ростовые вещества, такие как аминокислоты, например гомосерин, и витамины, например тиамин, биотин или пантотеновую кислоту, можно использовать дополнительно к вышеупомянутым веществам.
Пропионат предпочтительно добавляют в среду в виде соли, но можно также добавить в виде пропионовой кислоты. Подходящими солями пропионовой кислоты являются пропионат магния, пропионат натрия, пропионат кальция, пропионат аммония и пропионат калия. Пропионат присутствует в среде растворенным в виде свободной кислоты или в виде аниона пропионата.
Упомянутое сырье можно добавить к культуре в виде одной партии или подходящим образом во время культивирования.
Для контроля рН культуры подходящими для использования являются основные соединения, такие как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак, гидроксид аммония или аммиачную воду, или кислотные соединения, такие как фосфорная кислота или серная кислота. pH обычно доводят до значения от 6,0 до 8,5, предпочтительно от 6,5 до 8. Для контроля образования пены можно использовать противовспенивающие средства, такие как, например, полигликолевые эфиры жирных кислот. Для поддержания стабильности плазмид можно добавить в среду пригодные избирательно действующие вещества, такие как, например, антибиотики. Ферментацию предпочтительно проводят в аэробных условиях. Для поддержания этого в культуру добавляют кислород или кислород-содержащие смеси газов, такие как, например, воздух. Также возможно применение жидкостей, которые обогащены перекисью водорода. Ферментация в условиях ограниченного содержания кислорода представляет собой дополнительный специфический вариант осуществления согласно настоящему изобретению. Необязательно ферментацию проводят при избыточном давлении, например, при избыточном давлении от 0,03 до 0,2 МПа. Температура культуры обычно составляет от 20°C до 45°C и предпочтительно от 25°C до 40°C, особенно предпочтительно, от 30° до 37°C. В периодическом или периодическом с подпиткой способах культивирование предпочтительно продолжается до тех пор, пока не получено количество, достаточное для измерения извлечения желаемого органического химического соединения. Эта цель обычно достигается в пределах от 10 часов до 160 часов. При непрерывных способах возможны более длительные сроки культивирования. Благодаря активности микроорганизмов происходит увеличение содержания (накопление) органического химического соединения в ферментационной среде и/или в клетках микроорганизмов.
Примеры подходящих ферментационных сред находятся, помимо прочего, в патентных описаниях US 5770409, US 5990350, US 5275940, WO 2007/012078, US 5827698, WO 2009/043803, US 5756345, US 7138266.
Анализ L-аминокислот для определения концентрации в один или более момент(моменты) времени в ходе ферментации можно выполнить путем разделения L-аминокислот с помощью ионообменной хроматографии, предпочтительно катионообменной хроматографии, с последующей пост-колоночным получением производных с использованием нингидрина, как описано в Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). Вместо нингидрина для пост-колоночного получения производных также можно использовать ортофталевый диальдегид. Обзорная статья по ионообменной хроматографии находится в Pickering (LC⋅GC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989)).
Также можно выполнить пред-колоночное получение производных, например, с помощью ортофталевого диальдегида или фенилизотиоцианата, и отделить полученные аминокислотные производные с помощью обращенно-фазовой хроматографии (RPC), предпочтительно в форме высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Такой способ описан, например, в Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).
Детекцию выполняют фотометрически (поглощение, флуоресценция).
Всеобъемлющее представление об аминокислотном анализе можно получить, помимо прочего, из учебника “Bioanalytik” от Lottspeich and Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany 1998).
Анализ α-кетокислот для определения концентрации в один или более момент(моменты) времени в ходе ферментации можно выполнить путем разделения кетокислот и других продуктов экскреции с помощью ионообменной хроматографии, предпочтительно катионообменной хроматографии, на сульфонированном стирол/дивинилбензольном полимере в H+-форме, например, с использованием 0,025 н серной кислоты, с последующей УФ-детекцией при 215 нм (альтернативно, также при 230 или 275 нм). Предпочтительно, можно использовать колонку REZEX RFQ - Fast Fruit H+ (Phenomenex); возможны другие поставщики для разделительной фазы (например, Aminex от BioRad). Аналогичные разделения описаны в соответствующих примерах применения от поставщика.
Анализ пропионовой кислоты для определения концентрации в один или более момент(моменты) времени в ходе ферментации можно осуществить путем разделения органических кислот с помощью HPLC. В качестве колонки использовали VARIAN MetaCarb H+ 300 x 7,8 мм A5215 (длина 300 мм, диаметр 7,8 мм). Смесь серной кислоты и ацетонитрила (215 мл 0,5 М серной кислоты, 50 мл ацетонитрила, 5 л дистиллированной воды) служила в качестве элюента. 0,005 М серная кислота служила в качестве растворителя для подвижных образцов. При этом бесклеточные подвижные образцы развели 1:20.
Параметры разделения были следующими: скорость потока 0,4 мл/мин; объем инъекции образца 20 мкл; температура 35°C. Детекция происходит фотометрически при 215 нм с помощью УФ. Время удержания пропионовой кислоты составило 30,258 мин. Измеряемый диапазон находился между 0,09 и 7,514 г/л.
Продуктивность способов или ферментационных способов согласно настоящему изобретению по отношению к одному или нескольким параметрам, выбранным из группы, состоящей из концентрации (соединение, образованное на единицу объема), выхода (соединение, образованное на единицу потребляемого источника углерода), образования (соединение, образованное на единицу объема и времени), специфического образования (соединение, образованное на единицу сухой массы клеток или единицу биологической сухой массы и времени, или соединение, образованное на единицу белка клеток и времени), или также другим параметрам способа и их комбинациям, предпочтительно повышена согласно настоящему изобретению по меньшей мере на 0,5%, по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 1,5% или по меньшей мере на 2% по сравнению со способами или ферментационными способами с использованием микроорганизмов, в которых не присутствует кассета экспрессии согласно настоящему изобретению. Это следует рассматривать как очень значимое в контексте крупномасштабного способа.
С помощью данных воздействий на ферментацию получают ферментационный бульон, который содержит желаемую аминокислоту или кетокислоту.
Впоследствии происходит запасание или получение или извлечение продукта, содержащего аминокислоту или кетокислоту, в жидком или твердом виде.
Ферментационный бульон следует понимать как ферментационную среду или питательную среду, в которой микроорганизм культивировали в течение определенного времени и при определенной температуре. Ферментационная среда или среды, используемые в ходе ферментации, содержат/содержит все вещества или компоненты, которые обеспечивают получение желаемого соединения и, как правило, репликацию и жизнеспособность.
По завершении ферментации полученный ферментационный бульон, соответственно, содержит
a) биомассу (клеточную массу) микроорганизма, образованную в результате размножения клеток микроорганизма,
b) желаемую аминокислоту или кетокислоту, образованную в ходе ферментации,
c) органические побочные продукты, необязательно образованные в ходе ферментации, и
d) компоненты использованной ферментационной среды или сырья, такие как, например, витамины, такие как биотин, или соли, такие как сульфат магния, не поглощенные при ферментации.
Органические побочные продукты включают вещества, которые произведены использованными микроорганизмами при ферментации в дополнение к соответствующему желаемому соединению и необязательно выделены.
Ферментационный бульон удаляют из культурального сосуда или ферментационного контейнера, необязательно собирают и используют для подготовки продукта, содержащего аминокислоту или кетокислоту в жидком или твердом виде. Для этого также используют выражение «получение содержащего чистое химическое вещество продукта». В простейшем случае содержащий чистое химическое вещество ферментационный бульон, удаленный из ферментационного контейнера, сам по себе является полученным продуктом.
С помощью одного или нескольких воздействий, выбранных из группы, состоящей из
a) частичного (от > 0% до < 80%) до полного (100%) или практически полного (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%) удаления воды,
b) частичного (от > 0% до < 80%) до полного (100%) или практически полного (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%) удаления биомассы, которую необязательно инактивируют перед удалением,
c) частичного (от > 0% до < 80%) до полного (100%) или практически полного (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%, ≥ 99,3%, ≥ 99,7%) удаления органических побочных продуктов, образованных в ходе ферментации, и
d) частичного (> 0%) до полного (100%) или практически полного (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%, ≥ 99,3%, ≥ 99,7%) удаления компонентов использованной ферментационной среды или сырья - тех компонентов, которые не были поглощены при ферментации,
проводят концентрирование или очистку желаемого органического химического соединения от ферментационного бульона. Таким образом выделяют продукты, которые имеют желаемое содержание соединения.
Частичное (от > 0% до < 80%) до полного (100%) или практически полное(≥ от 80% до < 100%) удаление воды (воздействие a) также обозначено как высушивание.
В одном варианте настоящего способа чистые (≥ 80% по весу, ≥ 90% по весу) или высокочистые (≥ 95% по весу, ≥ 97% по весу, ≥ 99% по весу) формы продукта желаемого органического химического соединения, предпочтительно L-аминокислоты, получают посредством полного или практически полного удаления воды, биомассы, органических побочных продуктов и непоглощенных компонентов использованной ферментационной среды. Для воздействий согласно a), b), c) или d) в уровне техники доступно множество технических инструкций.
В случае способов получения L-аминокислот L-лейцина, L-валина или L-изолейцина или α-кетокислот кетоизовалерата, кетометилвалерата или кетоизокапроата с использованием бактерий из рода Corynebacterium предпочтительными являются такие способы, в которых получают продукты, не содержащие компоненты ферментационного бульона. Их используют, в частности, в медицине человека, в фармацевтической промышленности и в пищевой промышленности.
Способ согласно настоящему изобретению служит для ферментативного получения L-аминокислот L-лейцина, L-валина или L-изолейцина или α-кетокислот кетоизовалерата, кетометилвалерата или кетоизокапроата.
Настоящее изобретение в конечном итоге относится к применению микроорганизма согласно настоящему изобретению для ферментативного получения L-аминокислот L-лейцина, L-валина или L-изолейцина или α-кетокислот кетоизовалерата, кетометилвалерата или кетоизокапроата.
Настоящее изобретение объяснено более подробно ниже с помощью иллюстративных вариантов осуществления.
Пример 1. Клонирование замещающей конструкции pK18mobsacB_PprpD2-ilvB
Исходя из геномной последовательности Corynebacterium glutamicum ATCC14067 в компании Life Technologies GmbH (Дармштадт, Германия) синтезировали фрагмент ДНК размером 1390 п.о. (SEQ ID NO: 5), который состоит из следующих компонентов:
• гомологичного участка ДНК выше ilvB
• промотора PprpD2 из C. glutamicum ATCC14067
• сайта связывания рибосомы гена gap из C. glutamicum ATCC14067
• гомологичного участка гена ilvB, который вместо инициирующего кодона GTG несет инициирующий кодон ATG.
Фрагмент клонировали при помощи терминально введенных сайтов расщепления EcoRI и HindIII посредством соответствующего расщепления с помощью двух упомянутых ферментов рестрикции и последующего лигирования в вектор pK18mobsacB, аналогично расщепленный с помощью EcoRI и HindIII. Плазмида имеет обозначение pK18mobsacB_PprpD2-ilvB. Она позволяет получить мутанта, в котором нативный промотор гена ilvB удален и заменен индуцибельным промотором PprpD2. В нем нативный инициирующий кодон (GTG), кроме того, заменен инициирующим кодоном ATG, предпочтительным для рибосомы.
Пример 2. Конструирование замещающей конструкции pK18mobsacB_ilvN(M13)
Исходя из геномной последовательности Corynebacterium glutamicum ATCC14067 в компании Life Technologies GmbH (Дармштадт, Германия) синтезировали фрагмент ДНК размером 1421 п.о. (SEQ ID NO: 14), который содержит часть гена ilvB, межгенную область между геном ilvB и геном ilvN, а также часть гена ilvN. В нем нативную последовательность “GGAATCATT” в гене ilvN (от +58 до +66 п.о. ниже начала гена ilvN, при этом начало гена определяется как +1) заменили на „GATGACTTT“. Таким образом, аминокислотную последовательность белка IlvN в положениях 20, 21 и 22 меняют с Gly (20), Ile(21), Ile(22) на Asp(20), Asp(21), Phe(22).
Фрагмент лигировали при помощи терминально введенных сайтов расщепления EcoRI и HindIII посредством соответствующего расщепления с помощью двух упомянутых ферментов рестрикции и последующего лигирования в вектор pK18mobsacB, аналогично расщепленный с помощью EcoRI и HindIII. Плазмида имеет обозначение pK18mobsacB_ilvN(M13). Она позволяет получить мутанта, в котором нативную последовательность гена “GGAATCATT” (от +58 до +66 п.о. ниже начала гена ilvN, при этом начало гена определяется как +1) заменили на “GATGACTTT”.
Пример 3. Конструирование мутантов C. glutamicum ATCC14067_PprpD2-ilvBN, C. glutamicum ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN и C. glutamicum VPS_PprpD2-ilvBN.
Вектор pK18mobsacB_PprpD2-ilvB, упомянутый в примере 1, перенесли с помощью электропорации согласно протоколу Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)) в штамм Corynebacterium glutamicum ATCC14067 и в производящие валин штаммы Corynebacterium glutamicum ATCC14067_ilvN(M13) (см. пример 4) и штамм Corynebacterium glutamicum, производящий валин, C. glutamicum VPS. Вектор pK18mobsacB или pK18mobsacB_PprpD2-ilvB не способен независимо реплицироваться в C. glutamicum ATCC14067, C. glutamicum ATCC14067_ilvN(M13) и C. glutamicum VPS, и сохраняется в клетках, только если был интегрирован в хромосому в результате акта рекомбинации. Селекцию клонов, содержащих интегрированный pK18mobsacB_PprpD2_ilvB, выполняют путем осаждения конъюгационной серии на агар LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Habor, Нью-Йорк, 1989), который был дополнен 15 мг/л канамицина и 50 мг/мл налидиксовой кислоты. Наросшие клоны наносят штрихом на чашки с агаром LB, содержащим 25 мг/л канамицина, и инкубируют при 33°C в течение 16 часов. Для селекции мутантов, в которых в результате второго акта рекомбинации имело место вырезание плазмиды, клоны культивируют неселективно в жидкой среде LB в течение 20 часов, затем наносят штрихом на агар LB, содержащий 10% сахарозу, и инкубируют в течение 24 часов.
Плазмида pK18mobsacB_PprpD2-ilvB, а также исходная плазмида pK18mobsacB, содержит в дополнение к гену устойчивости к канамицину копию гена sacB, кодирующего левансахаразу из Bacillus subtilis. Экспрессия, индуцированная сахарозой, ведет к образованию левансахаразы, которая катализирует синтез продукта левана, токсичного для C. glutamicum. На LB-агаре, содержащем сахарозу, следовательно, растут только те клоны, в которых интегрированная pK18mobsacB_PprpD2-ilvB в свою очередь была вырезана. В случае вырезания вместе с плазмидой может быть вырезана либо полная копия гена ilvB дикого типа, включая промоторный участок дикого типа, либо рекомбинантная копия гена ilvB, содержащая промотор PprpD2.
Приблизительно от 40 до 50 колоний протестировали на фенотип "рост в присутствии сахарозы" и "отсутствие роста в присутствии канамицина". Для того, чтобы доказать, что рекомбинантный аллель PprpD2-ilvB остался в хромосоме, приблизительно 20 колоний, которые содержали фенотип "рост в присутствии сахарозы" и "отсутствие роста в присутствии канамицина", исследовали с помощью полимеразной цепной реакции согласно стандартному способу PCR по Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press). В связи с этим фрагмент ДНК, который несет модифицированные участки рекомбинантного аллеля PprpD2-ilvB, амплифицировали из хромосомной ДНК колоний. Следующие праймеры-олигонуклеотиды выбирали для проверочной PCR.
Контрольный праймер 1 (SEQ ID NO: 6)
5'-AAA GCC TGC ATC GCG GAG AC-3'
Контрольный праймер 2 (SEQ ID NO: 7)
5'-TGG TGA TGC CGC GGA TAT CG-3'
Праймеры делают возможной амплификацию фрагмента ДНК размером приблизительно 880 п.о. в клонах, содержащих рекомбинантный локус PprpD2-ilvBN. В клонах, содержащих локус PilvBN-ilvBN дикого типа, амплифицируются фрагменты ДНК, имеющие размер приблизительно 1136 п.о.
Амплифицированные фрагменты ДНК идентифицировали с помощью электрофореза в агарозном геле с концентрацией 0,8%. Таким образом можно было показать, что штаммы несут в хромосоме модифицированный рекомбинантный аллель PprpD2-ilvBN. Штаммы обозначили как Corynebacterium glutamicum ATCC14067_PprpD2-ilvBN, ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN и VPS_PprpD2-ilvBN.
Пример 4. Конструирование штамма C. glutamicum ATCC14067_ilvN(M13)
Вектор pK18mobsacB_ilvN(M13), упомянутый в примере 2, перенесли в штамм Corynebacterium glutamicum ATCC14067 с помощью электропорации аналогично способу, описанному в примере 3. Селекцию клонов выполняли с помощью методов культивирования, упомянутых в примере 3. Детекцию позитивных клонов провели на основе хромосомной ДНК, которая была выделена из 20 клонов, путем амплификации продукта длиной 947 п.о. с помощью полимеразной цепной реакции с использованием контрольных праймеров 3 и 4
Контрольный праймер 3 (SEQ ID NO: 15)
5'- CCC AGT AGT CAT CGA CTT C -3'
Контрольный праймер 4 (SEQ ID NO: 16)
5'- CAG CGT CAG CAT CAT AAA GC -3'
и последующего секвенирования продукта PCR.
Пример 5. Тест на продуктивность Corynebacterium glutamicum ATCC14067_PprpD2-ilvBN применительно к получению L-валина
Для исследования способности производить L-валин пять клонов штамма Corynebacterium glutamicum ATCC14067_PprpD2-ilvBN и в качестве эталона штамм Corynebacterium glutamicum ATCC14067 предварительно культивировали в 10 мл контрольной среды в каждом случае в течение 16 ч при 33°С. Для теста на продуктивность каждые 10 мл контрольной среды инокулировали полученной предварительной культурой, так что начальная OD 600 (оптическая плотность при 600 нм) составляла 0,1. Каждый клон тестировали в трех встряхиваемых сосудах, так что иллюстративный штамм представлен в общей сложности пятнадцатью встряхиваемыми сосудами.
Контрольная среда была идентична среде CgXII, описанной в Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), но дополнительно содержала 7,5 г/л дрожжевого экстракта (Difco (Becton Dickinson GmbH), Гейдельберг). Состав контрольной среды обобщен в нижеследующей таблице 1. Контрольная среда для индуцирования синтеза валина дополнительно содержала пропионат в концентрации 0,6 г/л (в пересчете на свободную кислоту).
Таблица 1
Компонент | Содержание на л |
(NH4)2SO4 | |
Мочевина | |
KH2PO4 | |
K2HPO4 | |
MgSO4 × 7 H2O | |
3-морфолинопропансульфоновая кислота (MOPS) | |
CaCl2 | |
FeSO4 × 7H2O | |
MnSO4 × H2O | |
ZnSO4 × 7 H2O | |
CuSO4 | |
NiCl2 × 6H2O | |
Биотин | |
Протокатеховая кислота | |
Декстроза | |
Дрожжевой экстракт | 7,5 г/л |
pH (при использовании NaOH) | 7 |
Культивирование выполняли при 33°C и 200 об./мин. во встряхиваемых сосудах на 100 мл. Смещение шейкера составило 5 см. Через 24 и 48 часов образцы извлекали из культур, определяли оптическую плотность содержания декстрозы и содержания L-валина и клетки короткое время центрифугировали (центрифуга настольного типа 5415D (Eppendorf), 13000 об./мин., 10 мин при комнатной температуре).
Оптическую плотность определяли при длине волны 660 нм с использованием фотометра для микротитровальных планшетов GENios (Tecan, Рединг, Соединенное Королевство). Образцы перед измерением разводили 1:100 деминерализованной водой.
Декстрозу определяли с помощью теста с сопряженными ферментами (гексокиназа/глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа) посредством образования NADH.
Концентрации внеклеточных аминокислот определяли количественно в культуральном супернатанте с использованием HPLC с обращенной фазой (Lindroth et al., Analytical chemistry (1979) 51: 1167-1174). Использовали прибор HPLC серии HP1100 (Hewlett-Packard, Вальдброн, Германия) с присоединенным детектором флуоресценции (G1321A); управление системой и анализ данных выполняли с помощью HP Chem-Station (Hewlett-Packard). 1 мкл раствора аминокислоты, подлежащей анализу, смешивали в автоматическом предколоночном получении производных с 20 мкл готового реагента - ортофталевого альдегида/2-меркаптоэтанола (Pierce Europe BV, Ауд-Бейерланд, Нидерланды). Флуоресцирующие тиозамещенные изоиндолы, полученные при этом (Jones et al., Journal of Chromatography (1983) 266: 471-482), разделяли с использованием комбинированной предколонки (40x4 мм Hypersil ODS 5) и основной колонки (Hypersil ODS 5, обе колонки от компании CS-Chromatographie Service GmbH, Лангервее, Германия) с помощью градиентной программы с увеличением неполярной фазы (метанол). Полярным элюентом был ацетат натрия (0,1 M; pH 7,2); скорость потока составила 0,8 мл в минуту. Детекцию флуоресценции производных аминокислот проводили при длине волны возбуждения 230 нм и длине волны излучения 450 нм. Концентрации валина рассчитывали путем сравнения с внешним стандартом.
Для расчета выхода количество образованного L-валина делили на количество поглощенной декстрозы.
Результаты представлены в таблице 2 и показывают, что иллюстративный штамм Corynebacterium glutamicum ATCC14067_PprpD2-ilvBN значительно выделяет валин в среду в присутствии пропионата, в то время как без пропионата он не отличается от контрольного штамма Corynebacterium glutamicum ATCC14067, который незначительно производит валин при любых условиях.
Таблица 2. Образование L-валина после инкубирования в течение 24 часов без пропионовой кислоты в среде (таблица 2A) или с 0,6 г/л пропионовой кислоты в среде (таблица 2B). Сокращения: *: ATCC 14067_PprpD2-ilvBN, станд. откл.: стандартное отклонение.
Таблица 2A. Результаты без пропионовой кислоты
Время | 24 часа | ||
Штамм | Валин г/л (± станд. откл.) |
Выход г/г (± станд. откл.) |
OD (± станд. откл.) |
*_1 | <0,2 | 0 | 26,2 ± 0,8 |
*_2 | <0,2 | 0 | 26,2 ± 1,7 |
*_3 | <0,2 | 0 | 26,9 ± 2,2 |
*_4 | <0,2 | 0 | 27,0 ± 0,5 |
*_5 | <0,2 | 0 | 26,3 ± 1,8 |
ATCC 14067 | <0,2 | 0 | 26,6 ± 0,4 |
Таблица 2B. Результаты с пропионовой кислотой
Время | 24 часа | ||
Штамм | Валин г/л (± станд. откл.) |
Выход г/г (± станд. откл.) |
OD (± станд. откл.) |
*_1 | 3,04 ± 0,13 | 0,07 ± 0,004 | 24,6 ± 0,3 |
*_2 | 3,06 ± 0,10 | 0,07 ± 0,003 | 27,5 ± 0,8 |
*_3 | 2,78 ± 0,06 | 0,07 ± 0,001 | 26,2 ± 0,4 |
*_4 | 2,93 ± 0,03 | 0,07 ± 0,001 | 27,1 ± 1,4 |
*_5 | 2,83 ± 0,04 | 0,07 ± 0,001 | 28,1 ± 0,1 |
ATCC 14067 | <0,2 | 0 | 26,2 ± 4,5 |
Пример 6. Тест на продуктивность с использованием производящих валин штаммов Corynebacterium glutamicum
Аналогично примеру 5, штаммы Corynebacterium glutamicum ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN и Corynebacterium glutamicum VPS_PprpD2-ilvBN исследовали в системе встряхиваемых сосудов.
Для исследования способности производить L-валин штамм Corynebacterium glutamicum ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN и в качестве эталона штамм Corynebacterium glutamicum ATCC14067_ilvN(M13), или штамм Corynebacterium glutamicum VPS_PprpD2-ilvBN и в качестве эталона штамм Corynebacterium glutamicum VPS, в каждом случае 10 мл контрольной среды (таблица 3), предварительно культивировали при 33°С в течение 16 ч. Для теста на продуктивность каждые 10 мл контрольной среды инокулировали полученной предварительной культурой, так что начальная OD600 (оптическая плотность при 600 нм) составляла 0,1. Каждый клон тестировали в трех встряхиваемых сосудах, так что иллюстративный штамм представлен в общей сложности 15 встряхиваемыми сосудами.
Таблица 3. SK1039 использовали в качестве контрольной среды
Концентрация (г/л) | |
Глюкоза | 40,0 |
(NH4)2SO4 (100% TDM) | 8,5 |
MgSO4⋅7H2O | 0,85 |
KH2PO4 | 0,2 |
Дрожжевой экстракт | 1,14 |
CSL | 10,0 |
MOPS | 20,0 |
D-(+)-Биотин 2% | 0,00425 |
Тиамин HCl | 0,00119 |
Fe сульфат 7H2O | 0,003 |
MnSO4 H2O | 0,003 |
CaCo3 | 10,00 |
Контрольная среда для индуцирования синтеза валина дополнительно содержала пропионат в концентрации 0,6 г/л (в пересчете на свободную кислоту).
Условия культивирования и определение концентрации биомассы, декстрозы и валина выполняли аналогично тому, как описано в примере 5.
Результаты представлены в таблице 4 и показывают, что производящие валин штаммы Corynebacterium glutamicum ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN и VPS_PprpD2-ilvBN при присутствии пропионата в среде имеют более высокий специфический выход валина относительно использованного источника углерода, чем в каждом из случаев немодифицированных исходных штаммов Corynebacterium glutamicum ATCC14067_ilvN(M13) и Corynebacterium glutamicum VPS.
Таблица 4. Выход L-валина после инкубирования в течение 24 часов без пропионовой кислоты в среде (таблица 4A) или с 0,6 г/л пропионовой кислоты в среде (таблица 4B); сокращения: станд. откл. = стандартное отклонение.
Таблица 4A. Результаты без пропионовой кислоты
Штамм | Выход г/г (± станд. откл.) |
ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN | 0,02 ± 0,00 |
ATCC14067_ilvN(M13) | 0,35 ± 0,01 |
VPS_PprpD2-ilvBN | 0,02 ± 0,00 |
VPS | 0,40 ± 0,02 |
Таблица 4B. Результаты с пропионовой кислотой
Штамм | Выход г/г (± станд. откл.) |
ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN | 0,42 ± 0,02 |
ATCC14067_ilvN(M13) | 0,36 ± 0,01 |
VPS_PprpD2-ilvBN | 0,45 ± 0,02 |
VPS | 0,41 ± 0,01 |
Пример 7. Тест на стабильность валина для штаммов VPS_PprpD2-ilvBN и VPS
Тест на стабильность проводили в 10 мл жидких культур (как в примере 6).
Предварительное культивирование штаммов VPS и VPS_PprpD2-ilvBN
В 10 мл жидкой культуры во встряхиваемом сосуде на 100 мл (с перегородками) инокулировали по 50 мкл каждой непрерывной глицериновой культуры и инкубировали в течение 22 ч (33°C, 200 об./мин., амплитуда 5 см).
Оптическую плотность культуры измеряли и 1,5 мл культуры обрабатывали глицерином (10% глицерин в конечной концентрации) и замораживали в качестве криокультуры при -80°C в сосуде с завинчивающейся крышкой.
В следующие 10 мл жидкой культуры инокулировали по 50 мкл культур в каждую и инкубировали снова при 33°C в течение 22 ч со встряхиванием.
Эту процедуру повторяли дополнительно дважды, так что каждую глицериновую культуру культивировали в общей сложности в четырех последовательных жидких культурах. Каждое культивирование соответствует приблизительно 8 клеточным поколениям. Четыре пассажа в жидких культурах, таким образом, соответствовали в общей сложности более чем 30 (приблизительно 32) клеточным поколениям.
Основное культивирование штаммов VPS и VPS_PprpD2-ilvBN
В культуры во встряхиваемых сосудах каждой непрерывной культуры или криокультуры инокулировали по 10 мл жидкой культуры с начальной OD 0,1. Затем культуры инкубировали в течение 24 ч. Каждое культивирование выполняли в двойном определении. В конце инкубирования (через 24 ч) образцы брали для анализа оптической плотности, титра валина и остаточной концентрации сахаров. Анализы выполняли, как описано в примере 5.
Результаты основного культивирования | ||||
Штамм | Дополнительные клеточные поколения в ходе культивирования по сравнению с контролем | Относительное изменение образования валина по сравнению с контролем | Валин/ оптическая плотность (OD) |
Выход валин/декстроза Y (P/S) [г/г] |
[%] | [%] | |||
VPS_PprpD2-ilvBN (= контроль) | 0 | 0 | 1,8 | 54% |
VPS_PprpD2-ilvBN_1 | 9 | -3 | 2,1 | 64% |
VPS_PprpD2-ilvBN_2 | 17 | 6 | 2,8 | 60% |
VPS_PprpD2-ilvBN_3 | 24 | -5 | 2,3 | 60% |
VPS_PprpD2-ilvBN_4 | 32 | 3 | 2,4 | 63% |
VPS (= контроль) | 0 | 0 | 2,7 | 45% |
VPS_1 | 7,7 | 2 | 2,9 | 42% |
VPS_2 | 15,6 | -58 | 2,5 | 48% |
VPS_3 | 23,4 | -78 | 1,5 | 44% |
VPS_4 | 31,7 | -85 | 1,0 | 30% |
Результат теста на продуктивность (таб. 5) показал, что с каждым пассажем титр валина (указанный в относительном изменении процента), отношение валин/биомасса (указанное в валин/OD) и выход (г образованного продукта/г поглощенного субстрата) для штамма VPS становился слабее или ниже. Это является свидетельством того факта, что в популяции закрепляются мутации, которые являются негативными для образования продукта и позитивными для образования биомассы. После двух стадий культивирования (15,6 поколений) штамм VPS уже показывает спад в данных продуктивности в контрольном культивировании (результаты основного культивирования). Таким образом, в 4-стадийном процессе (3 стадии культивирования + 1 стадия получения продукта) можно ожидать выраженное снижение данных продуктивности (титр, выход, специфичное для биомассы образование продукта). Однако для штамма VPS_PprpD2-ilvBN согласно настоящему изобретению данный негативный эффект не наблюдался даже при пересеве в четырех стадиях культивирования с более чем 30 поколениями. В отличие от этого специфичное для биомассы образование валина (валин/OD) даже несколько увеличивается. Таким образом, по меньшей мере 4-стадийный способ получения, состоящий из 3 стадий культивирования и основного культивирования, воспроизведен или необходимое условие даже превзойдено.
Таблица 5. Данные продуктивности в тесте на стабильность (выход L-валина, специфичное для биомассы образование продукта (валин/OD) и относительные изменения образования валина в зависимости от дополнительных клеточных поколений относительно контроля (=0) после инкубирования в течение 24 часов (средние значения))
Использованные сокращения и обозначения имеют следующие значения.
oriV: ColE1-подобная точка начала репликации pMB1
sacB: ген sacB, кодирующий белок левансахаразы
RP4mob: сайт мобилизации RP4
Kan: ген устойчивости к канамицину
PprpD2: индуцируемый пропионатом промотор
'ilvB: 5'-область гена ilvB
HindIII: сайт расщепления фермента рестрикции HindIII
EcoRI: сайт расщепления фермента рестрикции EcoRI
Claims (17)
1. Способ получения L-валина путем ферментации микроорганизмов из рода Corynebacterium, содержащих в реплицируемой форме полинуклеотид с операторной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности от положения 1 до 121 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, с которым связывается активатор PrpR, и функционально ниже которого на 3'-конце находится второй полинуклеотид, характеризующийся промоторной активностью, а также гены ilvB и ilvN, кодирующие субъединицы ацетолактатсинтазы, и который регулирует транскрипцию генов ilvBN в зависимости от добавления активатора PrpR в среду, к которой после первой фазы (фазы роста), проходящей без индуктора, во второй фазе в качестве индуктора добавляют пропионат или 2-метилцитрат, после чего синтезируют L-валин в условиях, при которых увеличивается содержание L-валина в среде и/или в клетках.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полинуклеотид с операторной активностью предусматривает полинуклеотид ("IR 1"), последовательность которого по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 92, 94 или 96%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности от положения 22 до положения 49 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, а также полинуклеотид ("IR 2"), последовательность которого по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 92, 94 или 96%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности от положения 77 до положения 105 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, при этом полинуклеотид с операторной активностью предпочтительно представляет собой полинуклеотид с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 92, 94 или 96%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности от положения 1 до 121 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что полинуклеотид с промоторной активностью представляет собой полинуклеотид, характеризующийся последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере на 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности от положения 122 до 206 согласно SEQ ID NO: 4.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что ген ilvB является полинуклеотидом, который кодирует полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 90, 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере на 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности согласно SEQ ID NO: 9, и ген ilvN является полинуклеотидом, который кодирует полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 90, 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере на 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности согласно SEQ ID NO: 10.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют микроорганизмы, в которых присутствующие дополнительные ферменты биосинтетического пути L-валина дополнительно амплифицированы, в частности сверхэкспрессированы, и/или в которых по меньшей мере частично ослаблены метаболические пути, которые снижают образование L-валина.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что коринебактерии, используемые в фазе культивирования, проходят по меньшей мере 16, предпочтительно по меньшей мере 24 поколения, и ферментация предпочтительно включает по меньшей мере четыре стадии, предпочтительно предусматривающие встряхиваемый сосуд, предпосевной ферментер, посевной ферментер и ферментер для получения продукта.
7. Применение полинуклеотида, характеризующегося операторной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности от положения 1 до 121 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, для регуляции экспрессии генов ilvBN, кодирующих ацетолактатсинтазу.
8. Применение по п.7, где указанный полинуклеотид применяют в комбинации с промотором, расположенным выше генов.
9. Кассета экспрессии для использования в способе по любому из пп.1-6, содержащая полинуклеотид, характеризующийся операторной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности от положения 1 до 121 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, расположенный ниже промотор, а также гены ilvBN, кодирующие ацетолактатсинтазу.
10. Кассета экспрессии по п.9, где указанный промотор характеризуется последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности от положения 122 до 206 согласно SEQ ID NO: 4.
11. Вектор экспрессии, содержащий кассету экспрессии по п.9 или 10.
12. Применение кассеты экспрессии по п.9 или 10 для экспрессии генов ilvBN в микроорганизмах из рода Corynebacterium.
13. Применение вектора по п.11 для экспрессии генов ilvBN в микроорганизмах из рода Corynebacterium.
14. Микроорганизм из рода Corynebacterium для получения L-валина для осуществления способа по любому из пп.1-6, содержащий в реплицируемой форме кассету экспрессии по п.9 или 10 или вектор экспрессии по п.11.
15. Микроорганизм по п.14, отличающийся тем, что является микроорганизмом из вида Corynebacterium glutamicum.
16. Микроорганизм по п.14 или 15, отличающийся тем, что кассета экспрессии была интегрирована в хромосому микроорганизма.
17. Микроорганизм по любому из пп.14-16, отличающийся тем, что он производит L-валин, и в котором предпочтительно в повышенном содержании дополнительно присутствуют дополнительные ферменты биосинтетического пути L-валина, в частности сверхэкспрессированые, и/или в котором метаболические пути, которые снижают образование L-валина, по меньшей мере частично ослаблены.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13170248.2 | 2013-06-03 | ||
EP13170248.2A EP2811028B1 (de) | 2013-06-03 | 2013-06-03 | Verfahren zur Herstellung von L-Valin unter Verwendung rekombinanter Corynebakterien enthaltend das durch Propionat induzierbare ilvBN-Operon |
PCT/EP2014/060680 WO2014195154A1 (de) | 2013-06-03 | 2014-05-23 | Verfahren zur herstellung von l-leucin, l-valin, l-isoleucin, alpha-ketoisovalerat, alpha-keto-beta-methylvalerat oder alpha-ketoisocaproat unter verwendung rekombinanter corynebakterien enthaltend das durch propionat induzierbare ilvbn-operon |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015156852A RU2015156852A (ru) | 2017-07-17 |
RU2015156852A3 RU2015156852A3 (ru) | 2018-04-02 |
RU2675506C2 true RU2675506C2 (ru) | 2018-12-20 |
Family
ID=48537853
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015156852A RU2675506C2 (ru) | 2013-06-03 | 2014-05-23 | Способ получения l-лейцина, l-валина, l-изолейцина, альфа-кетоизовалерата, альфа-кето-бета-метилвалерата или альфа-кетоизокапроата с использованием рекомбинантных коринебактерий, содержащих оперон ilvbn, который можно индуцировать пропионатом |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10113190B2 (ru) |
EP (1) | EP2811028B1 (ru) |
JP (1) | JP2016519949A (ru) |
KR (1) | KR20160015298A (ru) |
CN (1) | CN105492616A (ru) |
BR (1) | BR112015029985A2 (ru) |
DK (1) | DK2811028T3 (ru) |
ES (1) | ES2623161T3 (ru) |
HU (1) | HUE032752T2 (ru) |
PL (1) | PL2811028T3 (ru) |
RU (1) | RU2675506C2 (ru) |
WO (1) | WO2014195154A1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2753996C1 (ru) * | 2020-10-05 | 2021-08-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Бактерия Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать L-валин и способ получения L-валина с использованием этой бактерии |
RU2793440C1 (ru) * | 2021-01-28 | 2023-04-03 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Новый вариант белка и способ получения L-валина с его применением |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106701853B (zh) | 2016-12-02 | 2019-09-20 | 武汉远大弘元股份有限公司 | 一种产l-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养基及培养方法 |
EP3415622A1 (en) | 2017-06-14 | 2018-12-19 | Evonik Degussa GmbH | Method for production of fine chemicals using a corynebacterium secreting modified alpha-1,6-glucosidases |
US11021697B2 (en) * | 2017-07-11 | 2021-06-01 | Cj Cheiljedang Corporation | Acetohydroxy acid synthase variant, microorganism comprising the same, and method of producing L-branched-chain amino acid using the same |
KR101996129B1 (ko) | 2017-07-11 | 2019-07-04 | 씨제이제일제당 (주) | 아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 또는 이를 이용하는 l-분지쇄 아미노산 생산 방법 |
EP3456833A1 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-20 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-amino acids |
BR112020006001A2 (pt) * | 2017-10-02 | 2020-10-13 | Metabolic Explorer | método para produção de sais de ácido orgânico a partir de caldo de fermentação |
EP3467099A1 (en) | 2017-10-05 | 2019-04-10 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-amino acids |
CN108753810B (zh) * | 2018-05-22 | 2021-06-18 | 昆明理工大学 | 一种转录调节蛋白基因orf2的用途 |
KR102134418B1 (ko) * | 2019-06-17 | 2020-07-16 | 씨제이제일제당 주식회사 | L-타이로신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-타이로신 생산 방법 |
WO2021037190A1 (zh) * | 2019-08-29 | 2021-03-04 | 天津科技大学 | 一种2-异丙基苹果酸合成酶及其工程菌与应用 |
KR102153534B1 (ko) * | 2019-09-02 | 2020-09-09 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 프로모터 및 이를 이용한 아미노산 생산 방법 |
CN110551772B (zh) * | 2019-09-21 | 2023-03-28 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种提高l-异亮氨酸产量的方法 |
KR102147381B1 (ko) * | 2019-11-22 | 2020-08-24 | 씨제이제일제당 주식회사 | 아세토하이드록시산 신타제 신규 변이체 및 이를 포함하는 미생물 |
CN111607623B (zh) * | 2020-05-29 | 2022-02-11 | 江南大学 | 一种代谢工程改造大肠杆菌制备α-酮异戊酸的方法 |
KR102470602B1 (ko) | 2020-12-11 | 2022-11-25 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법 |
KR102464883B1 (ko) | 2020-12-11 | 2022-11-09 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 감마-아미노부티르산 퍼미에이즈 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법 |
CN113683666A (zh) * | 2021-08-23 | 2021-11-23 | 黑龙江伊品生物科技有限公司 | Yh66-rs07020基因改造得到的工程菌及其在制备缬氨酸中的应用 |
KR20230045990A (ko) | 2021-09-29 | 2023-04-05 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법 |
KR102673796B1 (ko) | 2021-09-29 | 2024-06-10 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1096010A1 (de) * | 1999-10-27 | 2001-05-02 | Degussa AG | Für den Export verzweigtkettiger Aminosäuren kodierende Nukleotidsequenzen, Verfahren zu deren Isolierung und ihre Verwendung |
RU2247778C2 (ru) * | 1999-02-20 | 2005-03-10 | Дегусса Аг | Способ ферментативного получения l-аминокислоты с использованием коринеформных бактерий |
RU2307165C2 (ru) * | 2002-03-27 | 2007-09-27 | Адзиномото Ко., Инк. | Способ получения l-аминокислоты |
DE102011118019A1 (de) * | 2011-06-28 | 2013-01-03 | Evonik Degussa Gmbh | Varianten des Promotors des für die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden gap-Gens |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0167132B1 (en) | 1984-06-29 | 1992-01-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-isoleucine by fermentation |
US5188948A (en) | 1987-04-16 | 1993-02-23 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing L-valine by fermentation |
US5976843A (en) | 1992-04-22 | 1999-11-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacterial strain of Escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine |
JP2817157B2 (ja) | 1989-01-13 | 1998-10-27 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl‐アミノ酸の製造法 |
JP3023615B2 (ja) | 1990-08-30 | 2000-03-21 | 協和醗酵工業株式会社 | 発酵法によるl―トリプトファンの製造法 |
KR950005133B1 (ko) | 1990-09-18 | 1995-05-18 | 교와학꼬고오교오 가부시끼가이샤 | L-발린의 제조방법 |
JP3036912B2 (ja) | 1991-09-02 | 2000-04-24 | 協和醗酵工業株式会社 | 遺伝子発現調節dna |
DE4130867A1 (de) | 1991-09-17 | 1993-03-18 | Degussa | Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeuren |
KR100292038B1 (ko) | 1992-12-04 | 2001-06-01 | 이데이 노부유끼 | 디스크장치 |
DE4440118C1 (de) | 1994-11-11 | 1995-11-09 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Die Genexpression in coryneformen Bakterien regulierende DNA |
JP3692538B2 (ja) | 1994-12-09 | 2005-09-07 | 味の素株式会社 | 新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子及びl−リジンの製造法 |
GB2304718B (en) | 1995-09-05 | 2000-01-19 | Degussa | The production of tryptophan by the bacterium escherichia coli |
US5990350A (en) | 1997-12-16 | 1999-11-23 | Archer Midland Company | Process for making granular L-lysine |
JP4623825B2 (ja) | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
DE10110344A1 (de) * | 2000-11-10 | 2002-05-16 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien |
DE10128510A1 (de) * | 2001-06-13 | 2002-12-19 | Degussa | Methode zur Fermentationskontrolle |
US7160711B2 (en) | 2001-08-06 | 2007-01-09 | Degussa Ag | Coryneform bacteria which produce chemical compounds I |
CN100554426C (zh) | 2001-08-06 | 2009-10-28 | 德古萨股份公司 | 用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌生产l-赖氨酸 |
AU2002355462A1 (en) | 2001-08-06 | 2003-02-24 | Degussa Ag | Coryneform bacteria which produce chemical compounds ii |
EP1491634A1 (en) | 2003-06-26 | 2004-12-29 | Degussa AG | Feedback resistant acetohydroxy acid synthetase mutants |
WO2005021772A1 (en) | 2003-08-29 | 2005-03-10 | Degussa Ag | Process for the preparation of l-lysine |
DE102004061846A1 (de) | 2004-12-22 | 2006-07-13 | Basf Ag | Mehrfachpromotoren |
AU2006269864A1 (en) | 2005-07-18 | 2007-01-25 | Evonik Degussa Gmbh | Methionine producing recombinant microorganisms |
WO2009043372A1 (en) | 2007-10-02 | 2009-04-09 | Metabolic Explorer | Increasing methionine yield |
CN102459621B (zh) | 2009-06-05 | 2015-01-28 | 赢创德固赛有限公司 | 制备2-酮羧酸的方法 |
DE102010003419B4 (de) | 2010-03-30 | 2019-09-12 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Ornithin |
WO2013160124A1 (en) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | Evonik Industries Ag | Feedback-resistant alpha-isopropylmalate synthases |
-
2013
- 2013-06-03 ES ES13170248.2T patent/ES2623161T3/es active Active
- 2013-06-03 DK DK13170248.2T patent/DK2811028T3/en active
- 2013-06-03 EP EP13170248.2A patent/EP2811028B1/de not_active Not-in-force
- 2013-06-03 HU HUE13170248A patent/HUE032752T2/en unknown
- 2013-06-03 PL PL13170248T patent/PL2811028T3/pl unknown
-
2014
- 2014-05-23 RU RU2015156852A patent/RU2675506C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-05-23 US US14/894,513 patent/US10113190B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2014-05-23 KR KR1020157036963A patent/KR20160015298A/ko active IP Right Grant
- 2014-05-23 CN CN201480043905.5A patent/CN105492616A/zh active Pending
- 2014-05-23 BR BR112015029985A patent/BR112015029985A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2014-05-23 JP JP2016515744A patent/JP2016519949A/ja active Pending
- 2014-05-23 WO PCT/EP2014/060680 patent/WO2014195154A1/de active Application Filing
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2247778C2 (ru) * | 1999-02-20 | 2005-03-10 | Дегусса Аг | Способ ферментативного получения l-аминокислоты с использованием коринеформных бактерий |
EP1096010A1 (de) * | 1999-10-27 | 2001-05-02 | Degussa AG | Für den Export verzweigtkettiger Aminosäuren kodierende Nukleotidsequenzen, Verfahren zu deren Isolierung und ihre Verwendung |
RU2307165C2 (ru) * | 2002-03-27 | 2007-09-27 | Адзиномото Ко., Инк. | Способ получения l-аминокислоты |
DE102011118019A1 (de) * | 2011-06-28 | 2013-01-03 | Evonik Degussa Gmbh | Varianten des Promotors des für die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden gap-Gens |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
PLASSMEIER J. et al., Molecular characterization of PrpR, the transcriptional activator of propionate catabolism in Corynebacterium glutamicum, Journal of Biotechnology Vol. 159, Issues 1-2, pp. 1-11, 2012. DATABASE EMBL, accession no. AF434799, Corynebacterium glutamicum prpDBC2 gene cluster, complete sequence, 15.04.2005; Найдено в Интернет 30.03.2018 по адресу: www.ebi.ac.uk/ena/data/view/AF434799. * |
PLASSMEIER J.K. et al., A propionate-inducible expression system based on the Corynebacterium glutamicum prpD2 promoter and PrpR activator and its application for the redirection of amino acid biosynthesis pathways, Journal of Biotechnology Vol. 163, Issue 2, pp. 225-232, 20.01.2013. * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2753996C1 (ru) * | 2020-10-05 | 2021-08-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Бактерия Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать L-валин и способ получения L-валина с использованием этой бактерии |
RU2793468C1 (ru) * | 2021-01-26 | 2023-04-04 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Новый вариант тетрагидродипиколинат-n-сукцинилтрансферазы и способ получения l-валина с его применением |
RU2795067C1 (ru) * | 2021-01-26 | 2023-04-28 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Новый вариант пролиндегидрогеназы и способ получения L-валина с его применением |
RU2795789C1 (ru) * | 2021-01-26 | 2023-05-11 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Новый вариант вспомогательного белка уреазы и способ получения L-валина с его применением |
RU2793440C1 (ru) * | 2021-01-28 | 2023-04-03 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Новый вариант белка и способ получения L-валина с его применением |
RU2794279C1 (ru) * | 2021-04-07 | 2023-04-14 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Новый вариант 2-изопропилмалатсинтазы и способ получения L-валина с его применением |
RU2795162C1 (ru) * | 2021-04-07 | 2023-04-28 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Новый вариант регулятора транскрипции WHCA семейства WHIB и способ получения L-валина с его применением |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105492616A (zh) | 2016-04-13 |
DK2811028T3 (en) | 2017-05-01 |
WO2014195154A1 (de) | 2014-12-11 |
RU2015156852A (ru) | 2017-07-17 |
JP2016519949A (ja) | 2016-07-11 |
US20160115506A1 (en) | 2016-04-28 |
RU2015156852A3 (ru) | 2018-04-02 |
BR112015029985A2 (pt) | 2017-09-26 |
EP2811028B1 (de) | 2017-02-01 |
US10113190B2 (en) | 2018-10-30 |
HUE032752T2 (en) | 2017-10-30 |
EP2811028A1 (de) | 2014-12-10 |
ES2623161T3 (es) | 2017-07-10 |
PL2811028T3 (pl) | 2017-07-31 |
KR20160015298A (ko) | 2016-02-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2675506C2 (ru) | Способ получения l-лейцина, l-валина, l-изолейцина, альфа-кетоизовалерата, альфа-кето-бета-метилвалерата или альфа-кетоизокапроата с использованием рекомбинантных коринебактерий, содержащих оперон ilvbn, который можно индуцировать пропионатом | |
US9074229B2 (en) | Variants of the promoter of the gap gene coding for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase | |
JP6821598B2 (ja) | Corynebacterium glutamicum由来のプロモーター | |
CA2869683C (en) | Feedback-resistant .alpha.-isopropylmalate synthases | |
RU2571932C2 (ru) | Способ получения l-орнитина с использованием бактерий, сверхэкспрессирующих lyse | |
US20200239897A1 (en) | Promoters from corynebacterium glutamicum and uses thereof in regulating ancillary gene expression | |
JP2018530991A6 (ja) | Corynebacterium glutamicum由来のプロモーター | |
EP3387135B1 (en) | Promoters from corynebacterium glutamicum | |
EP2446039B1 (en) | Method for fermentatively preparing l-amino acids |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200524 |