KR20160015298A - 프로피오네이트에 의해 유도될 수 있는 ilvbn 오페론을 함유하는 재조합 코리네박테리움을 사용하는 l-류신, l-발린, l-이소류신, 알파-케토이소발레레이트, 알파-케토-베타-메틸발레레이트, 또는 알파-케토이소카프로에이트의 생산 방법 - Google Patents
프로피오네이트에 의해 유도될 수 있는 ilvbn 오페론을 함유하는 재조합 코리네박테리움을 사용하는 l-류신, l-발린, l-이소류신, 알파-케토이소발레레이트, 알파-케토-베타-메틸발레레이트, 또는 알파-케토이소카프로에이트의 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 프로피오네이트에 의해 유도가능한 프로모터가 특정 유전자의 조절되는 발현을 가능하게 해주는, 미생물을 사용하는 아미노산 및 케토산의 생산 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 프로피오네이트에 의해 유도가능한 프로모터가 특정 유전자의 조절되는 발현을 가능하게 하는, 미생물을 사용하는 아미노산 및 케토산의 생산 방법에 관한 것이다.
아미노산 및 케토산은 인간 의약, 제약 산업, 화장품, 식품 산업 및 동물 영양에서 사용된다.
이들 화합물 중 다수가 코리네형 박테리아, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균주의 발효에 의해 생산된다. 큰 중요성 때문에, 생산 공정을 개선하는 작업이 끊임없이 수행되고 있다. 공정 개선은, 예를 들어, 교반 및 산소 공급과 같은 발효 기술 조치, 또는, 예를 들어, 발효 동안 당 농도와 같은 영양소 배지의 조성, 또는, 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피에 의한 생산물 형태까지의 작업 또는 미생물 자체의 고유 성능 특징을 수반할 수 있다.
이들 미생물의 성능 특징을 개선하기 위해, 돌연변이생성, 선별 및 돌연변이체 선별 방법이 사용된다. 이런 방식으로, 예를 들어, 발린 유사체 2-티아졸알라닌 또는 류신 유사체 4-아자류신 또는 5,5,5-트리플루오로류신과 같은 항대사물질에 저항성이고, 화학적 화합물, 예를 들어 L-아미노산 L-발린 또는 L-류신을 생산하는 균주가 수득된다.
수년 간, 예를 들어, 개별 아미노산 생합성 유전자의 증폭 또는 약화와 함께, 예를 들어, 또한 생산 과정에서 유전자 발현의 일시적 조절에 의한, 코리네박테리움 글루타미쿰의 L-아미노산-생산 균주의 균주 개선, 및 화학적 화합물의 생산에 대한 효과의 조사에 재조합 DNA 기술 방법이 또한 이용되어 왔다.
코리네박테리움 글루타미쿰의 생물학, 유전학 및 생명공학의 요약 설명은 "Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Eds.: L. Eggeling and M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis, 2005), 제목이 "A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" 인 Journal of Biotechnology 의 특별판 (Chief Editor: A. Phler) (Journal of Biotechnology 104/1-3, (2003)) 및 T. Scheper (Managing Editor) 에 의한 서적 "Microbial Production of L-Amino Acids" (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, Springer Verlag, Berlin, Germany, 2003) 에서 찾을 수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 Ikeda 및 Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)), EP 1 108 790 및 Kalinowski 등 (Journal of Biotechnology 104/1-3, (2003)) 에 의해 기재되어 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 또한 National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) 의 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 의 데이타베이스, 일본의 DNA Data Bank (DDBJ, Mishima, Japan) 또는 European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany and Cambridge, UK) 의 뉴클레오티드 서열 데이타베이스에서 입수가능하다.
기본적으로, 유전자의 발현에 대해 2 가지 가능성이 있다. 지속적 발현에서, 유전자는 구성적 프로모터에 의해 지속적으로 발현되고, 상응하는 단백질이 세포에 축적된다.
다른 한편으로는, 유도되는 발현에서 유도성 프로모터가 사용된다. 표적 유전자의 발현이 유도되며, 이것은 유도인자에 의해 가능하게 된다. 이 방법은 (과)발현이 생산 유기체에 대해 음성 효과를 갖는 경우에 사용된다. 이것의 이유는 성장 시기 동안 대사 자원의 높은 부하일 수 있다. 결과는 더 느린 성장 및 그에 따른 연장된 생물반응기 가동시간 및 그와 연관된 산업적 생산의 경우의 비용 증가이다. 유도되는 발현은 또한 세포독성 생산물의 경우에 유리하다. 이 경우에, 발현의 유도 후에 자가중독 및 세포 사망이 일어난다. 그러므로 생산 공정의 경제와 관련하여, 공정을 성장 시기 및 생산 시기로 세분화하는 것이 시도된다. 성장 시기에 가능한 한 많은 양의 바이오매스가 생산되고, 그 후 생산 시기에 프로모터의 유도에 의해 표적 단백질이 생산된다. 이런 방식으로, 최대 산출률이 얻어질 수 있고, 그에 따라 공정이 현저히 더욱 경제적으로 된다.
조절가능한 대장균 프로모터 lac, 람다 PL 및 trp 에 관하여, 그들이 코리네형 박테리아에서 다양한 유전자의 조절되는 발현에 이용될 수 있다는 것이 이미 밝혀졌다 (Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6 (1988) 428-431).
유도성 프로모터에 관한 이상적 경우는 코리네형 프로모터이며, 이것은 쉽게 입수가능한, 비싸지 않은 물질에 의해 조절된다.
EP 0530765 B1 (Kyowa Hakko) 은 [베타]-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 및 ICL 과 같은 효소 뿐만 아니라 인슐린 또는 [알파]-, [베타]- 또는 [감마]-인터페론과 같은 생리 활성 단백질의 생산을 위한, 여기에서 이소시트레이트 리아제 유전자의, 코리네박테리움으로부터의 유도성 프로모터의 용도를 기재한다. 이 프로모터는 당과 상이한 탄소 공급원 (C 공급원) 이 배지에 위치하는 경우에만 유전자의 발현을 초래한다; 당이 존재하는 경우에는 유전자의 발현이 억제된다. 그러나, 보통의 발효 배지에서는 C 공급원으로서 당이 이용되므로, 당이 존재하는 경우에도 비싸지 않은 유도인자를 사용하여 유전자의 발현을 초래하는 조절가능한 프로모터를 얻는 것이 유용할 것이다.
DE 4440118 C1 (예컨대 US 5965391, FZ Jlich) 은 단백질의 생산을 위한, 여기에서 말레이트 신타아제 유전자 aceB 의, 코리네박테리움으로부터의 유도성 프로모터의 용도를 청구한다; 여기에서 유도인자는 탄소 공급원 락테이트, 피루베이트 또는 아세테이트이다.
유전자가 프로피오네이트를 이용하는 성장의 주된 C 공급원으로서 본질적이고, 효소 2-메틸시트레이트 디히드라타아제 (PrpD2), 2-메틸이소시트레이트 리아제 (PrpB2) 및 2-메틸시트레이트 신타아제 (PrpC2) 에 대해 코딩하는, 코리네박테리움 글루타미쿰의 prpDBC2 오페론의 프로모터가 Plassmeier 등 (Journal of Biotechnology 159/1-2 (2012)) 에 의해 기재되었다. 프로모터 시험 벡터 구축물의 분석은 활성화인자 PrpR 에 의한 프로피오네이트-유도되는 전사에 필수적인 prpDBC2 오페론 위의 121 염기쌍 길이의 작동자 영역의 확인을 초래했다. EMSA 연구는 2-메틸시트레이트가 아마도 PrpR 의 공활성화인자로서 기능할 것임을 밝혔다.
발명의 목적
본 발명은 바람직하게 개선된 산출률 및/또는 세포내 및/또는 배지내 생산물의 더 높은 최종 농도를 제공하는, L-아미노산 L-류신, L-발린 또는 L-이소류신, 바람직하게는 L-발린, 또는 α-케토산 α-케토이소발레레이트, α-케토메틸발레레이트 또는 α-케토이소카프로에이트의 신규한 생산 방법을 이용가능하게 만드는 목적에 기초했다. 여기에서, 비산출률 (specific yield) (즉, 이용되는 탄소 공급원에 상대적인 원하는 생산물의 산출률) 의 개선이 바람직하게는 존재할 것이다.
신규한 공정은 바람직하게는 배지의 주된 탄소 공급원에 독립적으로 L-아미노산 및/또는 α-케토산의 생산을 조절하는 것을 가능하게 해줄 것이다.
부산물의 분리는 매우 힘들고 비용이 많이 들고 더욱이 브로쓰의 생산물 순도 및 탄소 산출률에 대해 음성 효과를 가지므로, 신규한 공정에서 더욱 바람직하게는 원치 않는 부산물의 형성, 특히 원치 않는 부산물 알라닌의 형성이 (가능하다면) 억제될 것이다.
이용되는 공정은 더욱 바람직하게는 생산에 이용되는 균주의 유전적 안정성의 증가를 초래하여, 발효 공정 (배양 시기 및 주 발효조) 에서 생산량 데이타의 감소 없이 높은 수의 세대를 가능하게 해줄 것이다.
발명의 설명
발명에 따른 목적은 유전자 ilvBN 의 발현의 조절을 위한 작동자 (여기에 활성화인자 PrpR 가 결합함) 를 사용하여 달성된다.
ilvBN (EC No. 4.1.3.18) 은 아세토락테이트 신타아제의 서브유닛에 관해 코딩하는 유전자이다.
그러므로 발명의 주제는 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 에 따른 위치 1 내지 121 의 서열과 서열이 85% 이상, 바람직하게는 90, 92, 94 또는 96% 이상, 특히 97, 98 또는 99% 이상, 특히 바람직하게는 100% 동일하고, 활성화인자 PrpR 가 결합하고, 3'-말단에서 기능적으로 하류에 프로모터 활성을 갖는 제 2 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 아세토락테이트 신타아제의 서브유닛에 관해 코딩하는 유전자 ilvB 및 ilvN 가 존재하고, 공-활성화인자 2-메틸시트레이트에 의해 활성화되는 활성화인자 PrpR 의 부가의 작용으로서 유전자 ilvBN 의 전사를 조절하는, 작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 복제가능한 형태로 함유하는, 코리네박테리움 속의 미생물의 발효에 의한 L-류신, L-발린 및 L-이소류신으로부터 선택되는 L-아미노산, 바람직하게는 L-발린, 또는 케토이소발레레이트, 케토메틸발레레이트 및 케토이소카프로에이트로부터 선택되는 α-케토산의 생산 방법으로서,
배지에, 유도인자 없는 제 1 시기 후에, 후속적인 제 2 시기에 유도인자로서 프로피오네이트 또는 2-메틸시트레이트가 첨가되고, 그 결과 ilvBN 유전자가 발현되고 그에 따라 요망되는 L-아미노산 또는 α-케토산이 배지에서 또는 세포에서 농화 (enrich) 되는 조건 하에 요망되는 L-아미노산 또는 α-케토산이 합성되는 방법이다.
도 1: 플라스미드 pK18mobsacB_PprpD2-ilvB 의 지도
사용되는 약어 및 명칭은 하기 의미를 갖는다.
oriV: pMB1 의 ColE1-유사 원점
sacB: 단백질 레반 수크로스에 관해 코딩하는 sacB 유전자
RP4mob: RP4 동원 자리
Kan: 카나마이신에 대한 저항성 유전자
PprpD2: 프로피오네이트 유도성 프로모터
'ilvB: ilvB 유전자의 5'-영역
HindIII: 제한 효소 HindIII 의 절단 자리
EcoRI: 제한 효소 EcoRI 의 절단 자리
사용되는 약어 및 명칭은 하기 의미를 갖는다.
oriV: pMB1 의 ColE1-유사 원점
sacB: 단백질 레반 수크로스에 관해 코딩하는 sacB 유전자
RP4mob: RP4 동원 자리
Kan: 카나마이신에 대한 저항성 유전자
PprpD2: 프로피오네이트 유도성 프로모터
'ilvB: ilvB 유전자의 5'-영역
HindIII: 제한 효소 HindIII 의 절단 자리
EcoRI: 제한 효소 EcoRI 의 절단 자리
작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 코리네형 박테리아에서 2-메틸시트레이트 디히드라타아제의 발현을 자연적으로 조절하는 작동자 또는 그러한 작동자로부터 유래되는 폴리뉴클레오티드이다.
작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 11 에 따른 서열 또는 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 에 따른 위치 22 내지 위치 49 로부터의 서열과 서열이 90% 이상, 바람직하게는 92, 94 또는 96% 이상, 특히 97, 98 또는 99% 이상, 특히 바람직하게는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 (하기에서 또한 "IR 1" 로 호칭됨) 및 또한 SEQ ID NO: 12 에 따른 서열 또는 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 에 따른 위치 77 내지 위치 105 로부터의 서열과 서열이 90% 이상, 바람직하게는 92, 94 또는 96% 이상, 특히 97, 98 또는 99% 이상, 특히 바람직하게는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 (하기에서 또한 "IR 2" 로 호칭됨) 를 포함한다. 여기에서 작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드에서 서열 "IR 1" 은 바람직한 구현예에서 위치 22 내지 49 에 배열되고, 한편 서열 "IR 2" 은 바람직한 구현예에서 위치 77 내지 105 에 배열된다.
발명에 따른 바람직한 구현예에서, 작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 더 긴 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 에 따른 위치 1 내지 177 의 서열과 90% 이상, 바람직하게는 92, 94 또는 96% 이상, 특히 97, 98 또는 99% 이상, 특히 바람직하게는 100% 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드의 일부이다.
유전자 ilvB 는 바람직하게는 SEQ ID NO: 9 에 따른 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 92, 94 또는 96% 이상, 특히 97, 98 또는 99% 이상, 특히 바람직하게는 100% 의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
특히 바람직하게는, 그것은 여기에서 SEQ ID NO: 8 에 따른 위치 499 내지 2379 의 서열과 서열이 90% 이상, 바람직하게는 92, 94 또는 96% 이상, 특히 97, 98 또는 99% 이상, 특히 바람직하게는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드이다.
유전자 ilvN 는 바람직하게는 SEQ ID NO: 10 에 따른 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 92, 94 또는 96% 이상, 특히 97, 98 또는 99% 이상, 특히 바람직하게는 100% 의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
특히 바람직하게는, 그것은 여기에서 SEQ ID NO: 8 에 따른 위치 2393 내지 2911 의 서열과 서열이 90% 이상, 바람직하게는 92, 94 또는 96% 이상, 특히 97, 98 또는 99% 이상, 특히 바람직하게는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드이다.
유전자 ilvB 및 ilvN 에 의해 인코딩되는 폴리펩티드는 함께 응집하여 기능적 아세토락테이트 신타아제를 제공한다.
프로피오네이트 또는 프로피온산이 바람직하게는 발현의 유도에 사용된다. 이와 관련하여, "프로피오네이트 유도" 가 일어난다. 프로피오네이트는 시험관 내에서 실제 공-활성화인자, 2-메틸시트레이트로 전환된다. 대안적으로, 2-메틸시트레이트가 또한 유도에 직접 사용될 수 있으나, 더 낮은 이용가능성 때문에 덜 바람직하게 이용된다. 발명에 따르면, 용어 "프로피오네이트 유도" 는 또한 2-메틸시트레이트에 의한 유도를 포함한다.
생산의 완료 후에, 요망되는 L-아미노산 또는 α-케토산이 바람직하게는 단리되고, 발효 브로쓰 및/또는 바이오매스의 기타 구성성분은 임의로 단리된 생산물에 전부 또는 일부 (0 초과 내지 100%) 남거나 완전히 제거된다.
발명에 따른 공정에서, 바이오매스의 제공을 위한 유도-없는 배양 시기 (성장 시기, 제 1 시기) 가 첫째로 존재한다. 이 시기에서, 아미노산 또는 케토산이 바람직하게는 전혀 또는 거의 형성되지 않는다 (5 g/ℓ 미만). 후속적 생산 시기 (유도 시기, 제 2 시기) 에서, 프로피오네이트 또는 2-메틸시트레이트에 의한 생합성 유전자 ilvBN 의 유도에 의해 생산이 유도된다. 배양 시기는, 보유되는 샘플로부터 출발하여, 바람직하게는 이용되는 셰이커 플라스크 단계를 통하여 바람직하게는 이용되는 배양 발효조까지의 모든 배양 단계를 포함한다. 배양 시기는 또한 여전히 주 발효의 제 1 시기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 배양 시기는 늦어도 주 발효의 첫번째 3-15 시간, 바람직하게는 5-10 시간 후에 완료된다.
유도 시기는 바람직하게는 주 발효조의 접종 후 0-20 시간으로부터 주 발효의 마지막까지의 시간을 포함한다. 더 이른 시점에서, 즉 배양 발효조에서의 유도가 유리할 수 있고, 발명에 따른 공정의 특별한 구현예이다.
한편으로는 아미노산 또는 케토산 합성의 유도를 유지하고 다른 한편으로는 프로피오네이트 또는 그것의 붕괴 중간체 중 하나 (프로피오닐-CoA, 2-메틸-시트레이트) 의 독성 작용을 방지하기 위해 생산 시기에서 프로피온산 농도의 정확한 조절/계량이 필수적이다. 유도 시기에서 바람직한 프로피온산 농도는 0.1 - 10 g/ℓ 범위이다. 프로피온산은 프로피온산 공급물 형태로 연속적으로 또는 유도 시기 동안 상이한 시점에 하나 이상의 프로피온산 펄스 형태로 뱃치식으로 첨가될 수 있다. 주 발효 배지의 배지 구성성분으로서 프로피온산의 단일 투여가 또한 가능하고, 발명에 따른 공정의 특별한 구현예이다.
아미노산 및 케토산의 생산에서 큰 문제는 보통 부산물의 형성이다. 형성되는 부산물은 탄소 산출률을 감소시키고, 더욱이 임의로 분리되어야 하는데, 분리 과정은 매우 힘들고 비용이 많이 든다.
부산물의 형성의 예는 발린 생합성에서 부산물 알라닌의 형성이다. 구성적 발현이 통상 일어나는 관습적 생산 공정에서 알라닌의 형성은 세포 세대의 수에 따라 증가한다.
보유 샘플로부터 생산 발효조의 수확까지, 3-시기 공정 (셰이커 플라스크, 배양 발효조, 주 발효조) 에서는 대략 20-25 세대가 계대하고, 4-시기 공정 (셰이커 플라스크, PreSeed 발효조, 배양 발효조, 주 발효조) 에서는 심지어 30 초과의 세대가 계대한다. 이렇게 많은 세대의 계대에서는, 보통 그에 상응하여 부산물 형성 및 바이오매스 형성이 크게 증가된다.
그러나, 발명에 따라서, 매우 크게 감소된 부산물 형성 및 바이오매스 형성이 발견되었다. 더욱이, 발명에 따른 생산 공정에서 부산물 형성 및 바이오매스 형성이 계대하는 세대의 수에 독립적이라는 것이 발견되었다. 이것은 발명에 따른 공정 관리가 이용하는 균주의 증가된 유전적 안정성을 초래한다는 것을 시사할 것이다. 그러므로 배양 시기는 원칙적으로 공정 관리에 특히 유리한 임의의 길이로 연장될 수 있다.
그러므로 발명에 따른 특히 바람직한 공정은 넷 이상의 시기, 즉 셋 이상의 배양 시기 및 생산 시기를 포함한다는 점에서 구별된다. 여기에서 배양은 바람직하게는 셰이커 플라스크, PreSeed 발효조 뿐만 아니라 종균 발효조에서의 배양을 포함한다. 생산은 바람직하게는 생산 발효조에서 일어난다.
그러므로 발명에 따른 추가의 특히 바람직한 공정은 이용되는 박테리아가 배양 시기 동안 16 이상, 바람직하게는 24 이상의 세대를 통해 계대하고/거나 전체 발효 (배양 및 생산을 포함함) 동안 25 이상, 바람직하게는 30 이상의 세대를 통해 계대한다는 점에서 구별된다.
본 발명은 또한 유전자 ilvBN 의 발현을, 바람직하게는 유전자의 상류에 있는 프로모터와 조합하여, 조절하기 위한, 작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드의 용도로서, 활성화인자 PrpR 가 결합하고, SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 에 따른 위치 1 내지 121 의 서열과 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%, 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상, 매우 특히 바람직하게는 99% 이상, 극히 바람직하게는 100% 동일한 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 에 따른 위치 1 내지 121 의 서열과 서열이 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%, 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상, 매우 특히 바람직하게는 99% 이상, 극히 바람직하게는 100% 동일한, 작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 하류 프로모터 및 아세토락테이트 신타아제에 관해 코딩하는 유전자 ilvBN 를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.
여기에서 작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 이전에 바람직하다고 강조된 특징, 특히 보존부 "IR 1" 및 "IR 2" 를 항상 갖는다.
ilvBN 유전자의 상류에 있는 프로모터 또는 작동자의 하류에 있는 프로모터는 임의의 원하는 프로모터일 수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰에서 바람직하게 이용가능한 발명에 따른 프로모터의 예는, 예를 들어, Patek 등의 리뷰 논문 (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003)) 의 도 1 에 나타나 있다. 동일한 방식으로, dapA 프로모터의 변이체, 예를 들어 Vasicova 등 (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)) 에 의해 기재된 프로모터 A25 가 이용될 수 있다. 게다가, 코리네박테리움 글루타미쿰의 gap 프로모터 (EP 06007373) 가 사용될 수 있다. 마지막으로, Amann 등 (Genes 69(2), 301-315 (1988)) 및 Amann 및 Brosius (Genes 40(2-3), 183-190 (1985)) 에 의해 기재된 잘 알려진 프로모터 T3, T7, SP6, M13, lac, tac 및 trc 가 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 발명에 따라 이용되는 프로모터는 SEQ ID NO: 4 에 따른 위치 122 내지 206 의 서열과 서열이 90% 이상, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상, 매우 특히 바람직하게는 99% 이상, 극히 바람직하게는 100% 동일한, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드이다.
발명에 따른 발현 카세트는 바람직하게는 SEQ ID NO: 13 에 따른 서열을 갖는 발현 카세트이다.
본 발명의 추가의 주제는 발명에 따른 발현 카세트를 함유하는 벡터이다.
Kirchner 및 Tauch (Journal of Biotechnology 104:287-299 (2003)) 는 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 사용되는 벡터의 선별을 기재한다.
발명에 따른 벡터를 사용하는 상동 재조합은 벡터에 의해 세포 내로 수송되는 발명에 따른 발현 카세트로 염색체 상의 DNA 부분을 교환하는 것을 허용한다. 벡터의 고리모양 DNA 분자와 염색체 상의 표적 DNA 간의 효율적 재조합을 위해, 발명에 따른 발현 카세트를 함유하는 교환될 DNA 영역의 말단에 표적 자리에 상동인 뉴클레오티드 서열이 제공되어, 벡터 통합 또는 DNA 교환 자리가 지정된다.
여기에서 발명에 따른 발현 카세트의 통합은 ilvBN 유전자의 선천 유전자 자리에서 일어날 수 있으며, 바람직하게는 선천 ilvBN 유전자 및 임의로 또한 ilvBN 유전자의 선천 프로모터가 여기에서 발명에 따른 발현 카세트에 의해 대체된다.
대안적으로, 발명에 따른 발현 카세트는 또한 염색체 내의 암호화 기능을 갖지 않는 유전자간 영역에, 또는 바람직하게는 염색체 상의 세포 성장 및 아미노산 또는 케토산 생산에 본질적이지 않은 뉴클레오티드 서열인 또다른 유전자 자리에 통합될 수 있다.
발명에 따른 바람직한 구현예에서 발명에 따른 발현 카세트는 또한 염색체 내로 복수의 카피로 및 또한 임의로 상이한 유전자 자리에서 통합될 수 있다.
발명에 따른 발현 카세트를 염색체 내로 통합하는 대신, 대안적으로 발명에 따라 사용되는 작동자는 또한 ilvBN 유전자의 선천 유전자 자리에 프로모터와 조합하여 염색체 내로 통합될 수 있으며, 이 경우에 바람직하게는 ilvBN 유전자의 선천 프로모터가 작동자 및 프로모터의 구축물에 의해 대체된다.
발명에 따른 발현 카세트를 염색체 내로 통합하는 대신, 발명에 따라 대안적으로 발명에 따른 발현 카세트를 함유하는, 염색체 외에서 복제하는 벡터가 물론 또한 이용될 수 있다.
본 발명은 마찬가지로 또한 발명에 따른 발현 카세트 및/또는 발명에 따른 벡터를 함유하는 미생물, 바람직하게는 코리네박테리움, 특히 L-류신, L-발린 및 L-이소류신으로부터 선택되는 L-아미노산 또는 케토이소발레레이트, 케토메틸발레레이트 및 케토이소카프로에이트로부터 선택되는 α-케토산을 생산하는 코리네박테리움에 관한 것이다.
예를 들어, 미생물과 같은 생물에 존재하는, 폴리뉴클레오티드의 생화학 및 화학 구조의 세부사항은 특히 Berg 등의 교과서 "Biochemie" [Biochemistry] (Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg.Berlin, Germany, 2003; ISBN 3-8274-1303-6) 에 기재되어 있다.
폴리뉴클레오티드가 핵염기 또는 염기 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 및 티민 (T) 을 함유하는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체로 이루어지는 경우에, 데옥시리보-폴리뉴클레오티드 또는 데옥시리보핵산 (DNA) 으로 호칭된다. 폴리뉴클레오티드가 핵염기 또는 염기 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 및 우라실 (U) 을 함유하는 리보뉴클레오티드 단량체로 이루어지는 경우에, 리보-폴리뉴클레오티드 또는 리보핵산 (RNA) 으로 호칭된다. 언급된 폴리뉴클레오티드에서, 단량체는 3'→5'-인산디에스테르 결합에 의해 서로 공유적으로 연결되어 있다.
"작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드" 또는 "작동자" 는 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 통해 전사될 폴리뉴클레오티드에 기능적으로 연결되어 이러한 폴리뉴클레오티드의 전사를 다양한 조절 단백질 (활성화인자 또는 억제인자, 이들은 결국 리간드 또는 효과기 분자와 상호작용함) 과의 상호작용에 의해 스위치 온 또는 스위치 오프하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 데옥시리보폴리뉴클레오티드, 또는 핵산, 바람직하게는 데옥시리보핵산 (DNA) 을 의미하는 것으로 이해된다.
"프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드" 또는 "프로모터" 는 전사될 폴리뉴클레오티드에 기능적으로 연결되어 이러한 폴리뉴클레오티드의 전사의 개시 지점 및 개시 빈도를 지정하여, 제어되는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준에 영향을 미칠 수 있는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 데옥시리보폴리뉴클레오티드, 또는 핵산, 바람직하게는 데옥시리보핵산 (DNA) 을 의미하는 것으로 이해된다.
DNA 의 이중-가닥 구조 때문에, 발명은 또한 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 의 서열 목록의 가닥에 상보적인 가닥에 관한 것이다.
"전사" 는 DNA 매트릭스로부터 출발하여, 상보적 RNA 분자가 생산되는 과정을 의미하는 것으로 이해된다. 단백질, 예컨대 RNA 폴리머라제, "시그마 인자" 및 전사 조절인자 단백질이 이 과정에 관여한다. 합성된 RNA (메신저 RNA, m-RNA) 는 그 후 해독 과정에서 매트릭스로서의 역할을 하여, 폴리펩티드 또는 단백질을 초래한다.
유전자는, 화학적 관점에서 보면, 폴리뉴클레오티드이다. 단백질/폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본원에서 용어 "유전자" 와 동의어로 사용된다. 따라서, 2 개의 용어 "유전자" 및 "코딩 영역" 은 동의어로 사용되고, 마찬가지로 2 개의 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드" 는 동의어로 사용된다.
이와 관련하여 "기능적 하류 연결 또는 연관" 은 추가의 폴리뉴클레오티드의 전사를 초래하는 발명에 따른 작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 프로모터 활성을 갖는 제 2 폴리뉴클레오티드 및 추가의 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드의 순차적 배열을 의미하는 것으로 이해된다.
추가의 폴리뉴클레오티드가 시작 코돈으로 출발하여, 정지 코돈을 포함하고 임의로 전사 종결인자를 포함하는, 폴리펩티드의 코딩 영역으로 이루어지는 폴리펩티드/단백질에 관해 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 경우에 "기능적 하류 연결 또는 연관" 은 추가의 폴리뉴클레오티드의 전사 및 합성된 RNA 의 해독을 초래하는 순차적 배열을 의미한다.
추가의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 폴리펩티드(들)에 관해 코딩한다. 단백질/폴리펩티드에 관해 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ATG, GTG 및 TTG 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시작 코돈, 바람직하게는 ATG 또는 GTG, 특히 바람직하게는 ATG, 단백질-인코딩 서열 및 TAA, TAG 및 TGA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 정지 코돈(들)로 본질적으로 이루어진다.
추가의 폴리뉴클레오티드가 다수의 단백질/폴리펩티드에 관해 코딩하는 경우에, 리보솜 결합 자리가 각각의 유전자 앞에 위치할 수 있다. 마지막 유전자 뒤에 종결인자가 임의로 위치한다.
추가의 폴리뉴클레오티드는 발명에 따르면 아세토락테이트 신타아제의 서브유닛에 관해 코딩하는 유전자 ilvB 및 ilvN (IlvBN, EC No.: 4.1.3.18) 으로 이루어진다.
본 발명은 또한 미생물에서의 ilvBN 유전자의 발현을 위한 발명에 따른 발현 카세트 또는 발명에 따른 벡터의 용도에 관한 것이다. 발명에 따른 발현 카세트는 합성된 RNA, 바람직하게는 mRNA 가 폴리펩티드, 즉 아세토락테이트 신타아제의 2 개의 서브유닛으로 전사 및 해독되는 것을 보장한다.
발명에 따른 발현 카세트를 사용하여, 미생물에서 원하는 시점에 유전자 ilvBN 가 발현 또는 과발현될 수 있다.
과발현은 일반적으로 출발 균주 (부모 균주) 또는 야생형 균주 (이것이 출발 균주인 경우에) 에 비해 리보핵산, 단백질 (폴리펩티드) 또는 효소의 세포내 농도 또는 활성의 증가를 의미하는 것으로 이해된다. 출발 균주 (부모 균주) 는 과발현을 초래하는 조치가 수행된 균주를 의미하는 것으로 이해된다.
과발현의 경우에 재조합 과발현 방법이 바람직하다. 이들 중에서 시험관 내에서 생산된 DNA 분자를 사용하여 미생물이 생산되는 모든 방법이 그룹으로 분류된다. 그러한 DNA 분자는, 예를 들어, 프로모터, 발현 카세트, 유전자, 대립유전자, 코딩 영역 등을 포함한다. 이들은 형질전환, 접합, 형질도입 방법 또는 유사한 방법에 의해 요망되는 미생물로 전환된다.
발명에 따라 이용되는 작동자를 사용하고/거나 발명에 따른 발현 카세트를 사용하는 과발현 조치를 통해, 아세토락테이트 신타아제의 활성 또는 농도는 과발현을 초래하는 조치 전의 균주 내의 폴리펩티드의 활성 또는 농도에 기초하여 일반적으로 바람직하게는 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 이상 만큼, 바람직하게는 최대 1000%, 2000%, 4000%, 10000% 또는 20000% 까지 증가된다.
발현 또는 과발현의 정도는 유전자에 의해 전사되는 mRNA 의 양의 측정에 의해, 폴리펩티드의 양의 확인에 의해 및 효소 활성의 확인에 의해 확인될 수 있다.
mRNA 의 양의 확인을 위해, 특히 "노던 블롯팅" 방법 및 정량적 RT-PCR 이 사용될 수 있다. 정량적 RT-PCR 에서, 폴리머라제 연쇄 반응은 역전사에 선행한다. 이 목적을 위해, 예를 들어 Jungwirth 둥 (FEMS Microbiology Letters 281, 190-197 (2008)) 에 의해 기재된 바와 같이, Roche Diagnostics 사 (Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) 의 LightCycler™ System 이 사용될 수 있다. 겔 내의 단백질의 농도는 1- 및 2-차원 단백질 겔 분리 및 후속적으로 적당한 분석 소프트웨어를 사용하는 단백질 농도의 광학적 확인을 통해 확인될 수 있다. 코리네형 박테리아의 경우에 단백질 겔의 제조 및 단백질의 확인을 위한 통상적 방법은 Hermann 등 (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)) 에 의해 기재된 절차이다. 단백질 농도는 또한 탐지될 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 혼성화 (Sambrook 등, Molecular cloning: laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) 및 후속적으로 농도 확인을 위한 적당한 소프트웨어를 사용하는 광학적 평가 (Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)) 에 의해 확인될 수 있다. 수집된 데이타의 통계적 유의성은 T 시험 (Gosset, Biometrika 6(1): 1-25 (1908)) 을 통해 확인된다.
발명에 따라 이용되는 작동자를 사용하는 ilvBN 유전자의 과발현 조치는 추가의 과발현 조치와 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
과발현을 달성하기 위해, 선행 기술의 다수의 방법이 이용가능하다. 이들은, 유전자 발현을 지배 또는 제어하는 뉴클레오티드 서열의 수식 외에도, 카피 수의 증가를 또한 포함한다.
카피 수의 증가는 미생물의 세포질에서 복제하는 플라스미드를 통해 일어날 수 있다. 이러한 목적을 위해, 선행 기술에서 여러가지 미생물 군에 관해 유전자의 카피 수의 요망되는 증가를 조정할 수 있는 플라스미드의 과잉이 기재된다. 코리네박테리움 속에 적합한 플라스미드가, 예를 들어, Tauch 등 (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 27-40, (2003)), 또는 Stansen 등 (Applied and Environmental Microbiology 71, 5920-5928 (2005)) 에 의해 기재된다.
하나 (1) 이상의 카피 만큼의 카피 수의 증가는 또한 미생물의 염색체 내로 추가의 카피의 삽입에 의해 일어날 수 있다. 코리네박테리움 속에 적합한 방법은, 예를 들어, 특허 명세서 WO 03/014330, WO 03/040373 및 WO 04/069996 에 기재되어 있다.
유전자 발현의 증가는 또한 다수의 프로모터가 요망되는 유전자 앞에 위치하거나 발현된 유전자에 기능적으로 연관되는 경우에 일어날 수 있고, 이런 방식으로 증가된 발현이 달성된다. 이의 예는 특허 명세서 WO 2006/069711 에 기재되어 있다.
연장 속도는 코돈 사용법에 의해 영향을 받는다; 출발 균주에 빈번히 존재하는 t(전달) RNA 에 관한 코돈을 사용하여 해독이 증가될 수 있다. 게다가, 많은 미생물에서 가장 빈번히 존재하는 (대장균에서 77%) 시작 코돈을 코돈 ATG 로 교환하는 경우에 해독이 상당히 개선될 수 있으며, 그 이유는 RNA 수준에서 코돈 AUG 은, 예를 들어, 코돈 GUG 및 UUG 보다 2 내지 3 배 더 효과적이기 때문이다 (Khudyakov 등, FEBS Letters 232(2):369-71 (1988); Reddy 등, Proceedings of National Academy of Sciences of USA 82(17):5656-60 (1985)). 시작 코돈의 서열 환경이 또한 최적화될 수 있으며, 시작 코돈과 인접 영역 사이의 상호작용 효과가 기재되어 있다 (Stenstrom 등, Gene 273(2):259-65 (2001); Hui 등, EMBO Journal 3(3):623-9 (1984)).
DNA 취급, DNA 소화 및 결찰, 형질전환 및 형질전환체 선별에 관한 지침이 특히 Sambrook 등의 공지된 핸드북 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 에 기재되어 있다.
발명에 따른 바람직한 구현예에서, 요망되는 L-아미노산 또는 α-케토산의 생합성 경로의 추가의 유전자가부가적으로 증폭된 형태로 존재하는, 특히 과발현되는 미생물이 이용된다.
L-발린, L-이소류신, α-케토이소발레르산, α-케토-β-메틸발레르산 또는 α-케토이소카프로산의 생산과 관련하여, 바람직하게는 L-발린, L-이소류신, α-케토이소발레르산, α-케토-β-메틸발레르산 또는 α-케토이소카프로산의 생합성 효소에 관해 코딩하는 하기로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드:
a)
아이소메로리덕타제 (isomeroreductase) (IlvC, EC No.: 1.1.1.86) 에 관해 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 (ilvC 유전자),
b)
디히드록시 산 디히드라타아제 (IlvD, EC No.: 4.2.1.9) 에 관해 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 (ilvD 유전자),
c)
트랜스아미나아제 (IlvE, EC No.: 2.6.1.42) 에 관해 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 (ilvE 유전자),
d)
트레오닌 디히드라타아제 (IlvA, EC No.: 4.3.1.19) 에 관해 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 (ilvA 유전자),
e)
호모세린 디히드로게나아제 (Hom, EC No.: 1.2.1.11) 에 관해 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 (hom 유전자),
f)
호모세린 키나아제 (ThrB, EC No.: 2.7.1.39) 에 관해 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 (thrB 유전자),
g)
트레오닌 신타아제 (ThrC, EC No.: 4.2.3.1) 에 관해 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 (thrC 유전자),
h)
이소프로필말레이트 신타아제 (LeuA, EC No.: 2.3.3.13) 에 관해 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 (leuA 유전자),
i)
이소프로필말레이트 디히드로게나아제 (LeuB, EC No.: 1.1.1.85) 에 관해 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 (leuB 유전자),
j)
이소프로필말레이트 이성화효소 (LeuC, EC No.: 4.2.1.33) 의 큰 서브유닛에 관해 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 (leuC 유전자),
k)
이소프로필말레이트 이성화효소 (LeuD, EC No.: 4.2.1.33) 의 작은 서브유닛에 관해 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 (leuD 유전자)
가 부가적으로 과발현될 수 있고, 유전자 hom, ilvA, ilvC, ilvD 및 ilvE 가 이소류신 및 발린에 특히 바람직하고, 유전자 ilvC 및 ilvD 가 α-케토이소발레르산 (KIV) 및 α-케토-β-메틸발레르산 (KMV) 에 특히 바람직하고, 유전자 ilvC, ilvD, leuA, leuB, leuC 및 leuD 가 α-케토이소카프로산 (KIC) 에 특히 바람직하다.
바람직한 구현예에서, 요망되는 L-아미노산 또는 α-케토산의 형성을 감소시키는 대사 경로가 일부 이상 약화되어 있는 미생물이 이용된다.
발린 또는 케토이소발레레이트의 생산이 바람직한 경우에, 이소류신 (또는 전구체 알파-케토부티르산: ilvA, thrB, thrC, hom) 및/또는 류신 (leuA, leuB, leuCD) 에 관한 대사 경로가 약화될 수 있다. 이소류신 또는 케토메틸 발레레이트의 생산이 바람직한 경우에, 류신의 생합성 경로가 약화될 수 있다. 류신 또는 케토이소카프로에이트의 생산이 바람직한 경우에, 이소류신 (또는 전구체 알파-케토부티르산) 의 생합성 경로가 약화될 수 있다.
이와 관련하여 용어 "약화" 는, 예를 들어, 약한 프로모터를 사용하여, 또는 낮은 활성을 갖는 적당한 효소에 관해 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 사용하여, 또는 적당한 유전자 또는 효소 (단백질) 를 불활성화시켜, 그리고 임의로 이들 조치를 조합하여, 적당한 DNA 에 의해 인코딩되는 박테리아 내의 하나 이상의 효소 (단백질) 의 세포내 활성을 감소시키거나 스위치 오프하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 유전자의 완전한 또는 부분적인 결실에 의해 또는 구조 유전자 또는 프로모터 영역 또는 리보솜 결합 자리에서의 점 돌연변이의 삽입에 의해, 개별 표적 유전자의 완전한 또는 부분적인 약화가 달성될 수 있다. 유전자 발현의 특이적 감소를 위한 추가의 방법은 안티센스 기술이며, 이 경우에 더 긴 안티센스 RNA 의 합성을 위한 짧은 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 벡터가 표적 세포와 접촉된다. 안티센스 RNA 는 거기에서 특정 mRNA 의 상보적 부분에 결합하여 그들의 안정성을 감소시키거나 또는 해독가능성을 차단할 수 있다. 통상의 기술자는 이의 예를 Srivastava 등 (Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10): 4366 - 4371) 에서 찾을 수 있다. 방금 기재한 안티센스 기술은 또한 발명에 따른 작동자/프로모터를 표적 유전자 뒤에 "안티센스" 방향으로 클로닝하여 수행될 수 있다. 유도인자 프로피오네이트의 첨가 후에, 약화될 표적 유전자의 상보적 가닥의 mRNA 의 형성이 유도된다. 이러한 안티센스 mRNA 를 표적 유전자의 mRNA 에 부가하여, 표적 유전자의 발현이 감소된다. 유전자 ilvBN 의 조절된 발현 또는 과발현 또는 L-아미노산 또는 α-케토산의 생산은 바람직하게는 코리네박테리움 속의 미생물에서 수행된다. 코리네박테리움 속 중에서, 바람직한 균주는 하기 종에 기초하는 것들이다: 코리네박테리움 에피시엔스 (Corynebacterium efficiens) (DSM44549 로서 기탁된 기준주 (type strain)), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) (ATCC13032 로서 기탁된 기준주), 및 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) (ATCC6871 로서 기탁된 기준주). 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 매우 특히 바람직하다.
코리네박테리움 글루타미쿰 종의 일부 대표가 또한 선행 기술에서 다른 이름으로 알려져 있다. 이들은, 예를 들어, 하기를 포함한다: 균주 ATCC13870 (코리네박테리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum) 으로서 명명됨), 균주 DSM20137 (코리네박테리움 릴리움 (Corynebacterium lilium) 으로서 명명됨), 균주 ATCC17965 (코리네박테리움 멜라세콜라 (Corynebacterium melassecola) 로서 명명됨), 균주 ATCC14067 (브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) 으로서 명명됨), 균주 ATCC13869 (브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) 으로서 명명됨), 및 균주 ATCC14020 (브레비박테리움 디바리카툼 (Brevibacterium divaricatum) 으로서 명명됨).
코리네박테리움 글루타미쿰에 관한 용어 "마이크로코쿠스 글루타미쿠스 (Micrococcus glutamicus)" 도 마찬가지로 흔했다. 코리네박테리움 에피시엔스 종의 일부 대표는 또한 선행 기술에서 코리네박테리움 테르모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 예컨대, 예를 들어, 균주 FERM BP-1539 로서 명명되었다.
발명에 따른 조치에 이용되는 미생물 또는 균주 (출발 균주) 는 바람직하게는 요망되는 L-아미노산 또는 α-케토산을 그들을 둘러싸고 있는 영양소 배지 내로 분비하여 축적하는 능력을 이미 갖는다. 하기에서, 표현 "생산한다" 가 또한 이것에 사용된다. 특히, 발명에 따라 이용되는 균주는 바람직하게는 유도 후에 0.5 g/ℓ*h 이상, 바람직하게는 1.0 또는 2.0 g/ℓ*h 이상의 요망되는 아미노산 또는 케토산을 세포에 또는 영양소 배지에 농화 또는 축적하는 능력을 갖는다. 출발 균주는 바람직하게는 돌연변이생성 및 선별에 의해, 재조합 DNA 기술에 의해 또는 두 가지 방법의 조합에 의해 생산된 균주이다.
첫째로, 야생 균주에서, 예컨대, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 기준주 ATCC 13032 에서 또는 균주 ATCC 14067 에서, 발명에 따라 사용되는 작동자를 요망되는 유전자의 조절되는 발현에 이용하고, 후속적으로 선행 기술에 기재된 추가의 유전적 조치에 의해 미생물이 아미노산 또는 케토산을 생산하도록 유도함으로써, 발명의 조치에 적합한 미생물에 도달하는 것이 또한 가능하다는 것을 통상의 기술자는 이해할 수 있다.
L-발린을 생산 또는 분비하는 코리네형 박테리아 균주의 알려진 대표는, 예를 들어, 하기이다: 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM BP-1763 (US 5,188,948 에 기재됨); 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM BP-3007 (US 5,521,074 에 기재됨); 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM BP-3006 (US 5,521,074 에 기재됨); 및 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM BP-1764 (US 5,188,948 에 기재됨).
L-발린을 생산하는 미생물은 전형적으로 피드백-저항성 또는 탈민감화된 아세토락테이트 신타아제 (AHAS, EC 4.1.3.18) 를 갖는다. 그것은 이소류신, 발린 및 류신의 합성에 관한 평행 대사 경로의 제 1 효소에 해당한다 (Umbarger, H. E. 1987, Biosynthesis of the branched-chain amino acids, pp. 352-367, in F. C. Neidhardt, J. L. Ingraham, K. B. Low, B. Magasanik, M. Schaechter, and H.E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, American Society for Microbiology, Washington, D.C.). 홀로효소는 항상 2 개의 큰 서브유닛 및 2 개의 작은 서브유닛으로 이루어진다. 큰 AHAS 서브유닛은 촉매성 도메인을 형성하고, ilvB 에 의해 인코딩된다; 작은 서브유닛은 조절성 도메인으로서 기능하고, ilvN 에 의해 인코딩된다. 피드백-저항성 아세토락테이트 신타아제는 야생 형태 (야생형) 에 비해 분지쇄 아미노산 발린, 류신 및 이소류신 또는 이들의 혼합물에 의한 저해에 더 적은 민감성을 갖는 아세토락테이트 신타아제를 의미하는 것으로 이해된다. 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 아세토락테이트 신타아제의 경우에, 균주 ATCC13032, ATCC14067 (또한 브레비박테리움 플라붐으로서 알려짐) 또는 ATCC13869 (또한 브레비박테리움 락토페르멘툼으로서 알려짐) 가 적합한 야생형이다.
코리네박테리움 글루타미쿰에서 아세토락테이트 신타아제에 관해 코딩하는 유전자 ilvBN 은, 예를 들어, Keilhauer 등 (Journal of Bacteriology 175(17):5595-603 (1993)) 에 의해 또는 EP1108790 에 기재되어 있다. 접근 번호 L09232 (GenBank, NCBI) 는 유전자의 서열을 보여준다.
분지쇄 아미노산 (류신, 발린, 이소류신) 에 의한 피드백 저해를 더이상 받지 않는 AHAS 의 효소 변이체는, 예를 들어, Mendel 등 (Journal of Molecular Biology 325, 275-284 (2003)), Elisakova 등 (Applied and Environmental Microbiology 71, 207-213 (2005)), Wada 등 (Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 72 (11), 2959-2965, (2008)) 및 EP1491634 에 기재되어 있다. ilvN 에 의해 인코딩되는 작은 서브유닛에서 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 하기 아미노산 대체를 보유하는 피드백-저항성 아세토락테이트 신타아제의 변이체가 바람직하다: 아미노산 서열의 위치 20 에서 글라이신 대신 L-아스파르트산, 아미노산 서열의 위치 21 에서 L-이소류신 대신 L-아스파르트산, 아미노산 서열의 위치 22 에서 L-이소류신 대신 L-페닐알라닌, L-알라닌을 제외한 각각의 단백질생성 아미노산의 위치 42 에서, 바람직하게는 L-발린, L-이소류신 및 L-류신, 특히 바람직하게는 L-발린 및 임의로 위치 47 에서 L-히스티딘 대신 L-류신 (DE 102011118019 A1 에 기재됨).
코리네형 박테리아의 L-이소류신-생산 또는 분비 균주의 알려진 대표는, 예를 들어 하기이다: 브레비박테리움 플라붐 FERM BP-760 (US 4,656,135 에 기재됨); 브레비박테리움 플라붐 FERM BP-2215 (US 5,294,547 에 기재됨); 및 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM BP-758 (US 4,656,135 에 기재됨).
α-케토산-분비 또는 -생산 균주는, 예를 들어, 하기에 기초한다: 코리네박테리움 글루타미쿰, 균주 ATCC13032; 브레비박테리움 플라붐, 균주 ATCC 14067; 및 브레비박테리움 락토페르멘툼, 균주 ATCC 13869.
본 발명은 L-류신, L-발린 및 L-이소류신으로부터 선택되는 L-아미노산 또는 α-케토이소발레레이트, α-케토메틸발레레이트 및 α-케토이소카프로에이트로부터 선택되는 α-케토산을 생산하는 미생물로서, 발명에 따라 이용되는 작동자를 사용하여 아세토락테이트 신타아제에 관해 코딩하는 유전자 ilvBN 의 조절되는 발현을 갖거나 이를 가능하게 만드는 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, L-류신, L-발린 및 L-이소류신으로부터 선택되는 L-아미노산 또는 α-케토이소발레레이트, α-케토메틸발레레이트 및 α-케토이소카프로에이트로부터 선택되는 α-케토산의 발효적 생산 방법을 이용가능하게 해준다:
a)
발명에 따른 미생물을 적합한 배지에서 배양하여, 발효 브로쓰를 수득하는 단계, 및
b) a) 로부터의 발효 브로쓰에서 및/또는 미생물의 세포에서 L-아미노산 또는 α-케토산을 농화하는 단계.
바람직하게는 여기에서 L-아미노산 또는 α-케토산 또는 L-아미노산 또는 α-케토산을 함유하는 액체 또는 고체 생산물이 L-아미노산 또는 α-케토산을 함유하는 발효 브로쓰로부터 수득된다.
생산되는 미생물은 연속적으로 - 예를 들어, WO 05/021772 에 기재된 바와 같이 - 또는 뱃치식으로 뱃치 공정 (뱃치 배양 또는 뱃치 공정) 에서 또는 페드 뱃치 (fed batch) (피드 공정) 또는 반복되는 페드 뱃치 공정 (반복적 피드 공정) 에서 요망되는 유기 화학적 화합물의 생산을 목적으로 배양될 수 있다. 알려진 배양 방법의 일반적 요약이 Chmiel 의 교과서 (Bioprozesstechnik 1, Einfhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1, Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 또는 Storhas 의 교과서 (Bioreaktoren and periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Devices] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) 에서 입수가능하다.
사용되는 배양 배지 또는 발효 배지는 각각의 균주의 요구를 적합한 방식으로 만족시켜야 한다. 다양한 미생물에 관한 배양 배지의 설명이 American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) 의 핸드북 "Manual of Methods for General Bacteriology" 에 포함되어 있다. 용어 배양 배지 및 발효 배지 또는 배지는 상호 호환된다.
사용되는 탄소 공급원은 당 및 탄수화물 예컨대, 예를 들어, 글루코스, 수크로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 몰라세스, 사탕무 또는 사탕수수 가공으로부터의 수크로스-함유 용액, 전분, 전분 가수분해물 및 셀룰로스, 오일 및 지방, 예컨대, 예를 들어, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 오일, 지방산, 예컨대, 예를 들어, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산, 알코올, 예컨대, 예를 들어, 글리세롤, 메탄올 및 에탄올 및 유기 산, 예컨대, 예를 들어, 아세트산 또는 락트산일 수 있다.
사용되는 질소 공급원은 유기 질소-함유 화합물 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 콩 음식 및 요소 또는 무기 화합물 예컨대 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카르보네이트 및 암모늄 니트레이트일 수 있다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용되는 인 공급원은 인산, 암모늄 포스페이트, 칼륨 이수소포스페이트 또는 이칼륨 수소포스페이트 또는 상응하는 나트륨-함유 염일 수 있다.
배양 배지는 성장에 필수적인 염을, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 철과 같은 금속의 클로라이드 또는 설페이트 형태로, 예를 들어, 마그네슘 설페이트 또는 철 설페이트를 추가로 함유해야 한다. 마지막으로, 위에 언급된 물질에 부가적으로 필수적 성장 물질, 예컨대 아미노산, 예를 들어, 호모세린 및 비타민, 예를 들어 티아민, 비오틴 또는 판토텐산이 이용될 수 있다.
프로피오네이트는 바람직하게는 배지에 염으로서 첨가되나, 또한 프로피온산으로서 첨가될 수 있다. 프로피온산의 적합한 염은 마그네슘 프로피오네이트, 나트륨 프로피오네이트, 칼슘 프로피오네이트, 암모늄 프로피오네이트 및 칼륨 프로피오네이트이다. 프로피오네이트는 배지에 자유 산으로서 또는 프로피오네이트 음이온으로서 용해된 상태로 존재한다.
언급된 공급원료는 배양물에 단일 뱃치 형태로 또는 적합한 방식으로 배양 동안 첨가될 수 있다.
배양물의 pH 조절을 위해, 염기성 화합물 예컨대 나트륨 히드록시드, 칼륨 히드록시드, 암모니아, 암모늄 히드록시드 또는 암모니아 물 또는 산성 화합물 예컨대 인산 또는 황산이 적합하게 이용된다. pH 는 일반적으로 6.0 내지 8.5, 바람직하게는 6.5 내지 8 의 값으로 조정된다. 거품 발생의 조절을 위해, 소포제, 예컨대, 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스테르가 이용될 수 있다. 플라스미드의 안정성 유지를 위해, 적합한 선택적 작용 물질, 예컨대, 예를 들어, 항생제가 배지에 첨가될 수 있다. 발효는 바람직하게는 호기성 조건 하에 수행된다. 이를 유지하기 위해, 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물, 예컨대, 예를 들어, 공기가 배양물에 첨가된다. 과산화수소가 농화된 액체가 마찬가지로 가능하다. 산소-제한 조건 하의 발효는 발명에 따른 추가의 특별한 구현예이다. 임의로, 발효는 과압에서, 예를 들어 0.03 내지 0.2 ㎫ 의 과압에서 실시된다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 특히 바람직하게는 30℃ 내지 37℃ 이다. 뱃치- 또는 페드-뱃치 공정에서 배양은 바람직하게는 요망되는 유기 화학적 화합물의 회수 조치에 충분한 양이 형성될 때까지 지속된다. 이러한 목표는 보통 10 시간 내지 160 시간 내에 달성된다. 연속 공정에서, 더 긴 배양 시간이 가능하다. 미생물의 활성 덕분에, 발효 배지에서 및/또는 미생물의 세포에서 유기 화학적 화합물의 농화 (축적) 가 일어난다.
적합한 발효 배지의 예가 특히 특허 명세서 5,770,409, US 5,990,350, US 5,275,940, WO 2007/012078, US 5,827,698, WO 2009/043803, US 5,756,345 또는 US 7,138,266 에 기재되어 있다.
발효 과정에서 하나 이상의 시점(들)에서 농도의 확인을 위한 L-아미노산의 분석은 Spackman 등 (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)) 에 기재된 바와 같이, 이온-교환 크로마토그래피, 바람직하게는 양이온-교환 크로마토그래피를 통한 L-아미노산의 분리 및 후속적으로 닌히드린을 사용하는 포스트-칼럼 (post-column) 유도체화에 의해 수행될 수 있다. 닌히드린 대신, 오르토-프탈디알데히드가 또한 포스트-칼럼 유도체화 이용될 수 있다. 이온-교환 크로마토그래피에 대한 리뷰 논문이 Pickering (LCㆍGC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989)) 에 기재되어 있다.
마찬가지로, 예를 들어, 오르토-프탈디알데히드 또는 페닐 이소티오시아네이트를 사용하여, 프리-칼럼 (pre-column) 유도체화를 수행하고, 결과적인 아미노산 유도체를, 바람직하게는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 형태의, 역상 크로마토그래피 (RPC) 에 의해, 분리하는 것이 가능하다. 그러한 방법은, 예를 들어, Lindroth 등 (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)) 에 기재되어 있다.
탐지는 광도측정으로 수행된다 (흡수, 형광).
아미노산 분석에 대한 포괄적 설명이 특히 Lottspeich 및 Zorbas 의 교과서 "Bioanalytik" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany 1998) 에 기재되어 있다.
발효 과정에서 하나 이상의 시점(들)에서 농도의 확인을 위한 α-케토산의 분석은, 예를 들어 0.025 N 황산을 이용하는, H+ 형태의 술포네이트화된 스티렌/디비닐벤젠 중합체에 대한 이온-교환 크로마토그래피, 바람직하게는 양이온-교환 크로마토그래피를 통한 케토산 및 기타 분비 산물의 분리 및 후속적으로 215 ㎚ 에서 (대안적으로 또한 230 또는 275 ㎚ 에서) UV 탐지에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, REZEX RFQ - Fast Fruit H+ 칼럼 (Phenomenex) 이 이용될 수 있다; 분리 시기를 위한 기타 공급자 (예를 들어 BioRad 의 Aminex) 가 가능하다. 유사한 분리가 공급자의 적당한 적용예에 기재되어 있다.
발효 과정에서 하나 이상의 시점(들)에서 농도의 확인을 위한 프로피온산의 분석은 HPLC 를 통한 유기 산의 분리에 의해 달성될 수 있다. VARIAN MetaCarb H+ 300 x 7.8 ㎜ A5215 (300 ㎜ 길이, 7.8 ㎜ 직경) 가 칼럼으로서 사용되었다. 황산 및 아세토니트릴의 혼합물 (215 ㎖ 의 0.5 M 황산, 50 ㎖ 의 아세토니트릴, 5 ℓ 까지 증류수로) 이 용출액으로서의 역할을 했다. 0.005 M 황산이 러닝 (running) 샘플에 대한 용매로서의 역할을 했다. 여기에서 세포-비함유 러닝 샘플이 1:20 로 희석되었다.
분리 파라미터는 다음과 같았다: 유속 0.4 ㎖/분; 샘플 주입 부피 20 ㎕; 온도 35℃. 탐지는 215 ㎚ 에서 UV 에 의해 광도측정으로 수행했다. 프로피온산의 체류 시간은 30.258 분 였다. 측정가능한 범위는 0.09 내지 7.514 g/ℓ 였다.
농도 (부피 당 형성되는 화합물), 산출률 (소비되는 탄소 공급원 당 형성되는 화합물), 형성 (부피 및 시간 당 형성되는 화합물) 및 특이적 형성 (세포 건조 질량 또는 바이오 건조 질량 및 시간 당 형성되는 화합물 또는 세포 단백질 및 시간 당 형성되는 화합물) 또는 또한 기타 공정 파라미터 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 파라미터에 관한 발명에 따른 공정 또는 발효 공정의 성능은 바람직하게는 발명에 따르면 발명에 따른 발현 카세트가 존재하지 않는 미생물을 사용하는 공정 또는 발효 공정에 비해 0.5 % 이상, 1 % 이상, 1.5 % 이상 또는 2 % 이상 증가된다. 이는 대규모 공정의 맥락에서 매우 귀중한 것으로 여겨진다.
발효 조치를 통해, 요망되는 아미노산 또는 케토산을 함유하는 발효 브로쓰가 수득된다.
후속적으로, 액체 또는 고체 형태의 아미노산 또는 케토산을 함유하는 생산물의 제공 또는 생산 또는 추출이 실시된다.
발효 브로쓰는 미생물이 특정 시간 동안 특정 온도에서 배양된 발효 배지 또는 영양소 배지를 의미하는 것으로 이해된다. 발효 배지 또는 발효 동안 이용되는 배지는 요망되는 화합물의 생산 및 전형적으로 복제 또는 생활력을 보장하는 모든 물질 또는 성분을 함유한다.
발효 완료시, 결과적인 발효 브로쓰는 하기를 함유한다:
a)
미생물의 세포의 복제 결과 형성되는 미생물의 바이오매스 (세포 질량),
b)
발효 과정에서 형성되는 요망되는 아미노산 또는 케토산,
c)
발효 과정에서 임의로 형성되는 유기 부산물, 및
d)
발효에 의해 소비되지 않은 이용되는 발효 배지 또는 공급원료의 구성성분 예컨대, 예를 들어, 비오틴과 같은 비타민 또는 마그네슘 설페이트와 같은 염.
유기 부산물은 각각의 요망되는 화합물에 더하여 발효에서 이용되는 미생물에 의해 생산되고 임의로 분비되는 물질을 포함한다.
발효 브로쓰가 배양물 용기 또는 발효 그릇으로부터 제거되고, 임의로 수집되고, 액체 또는 고체 형태의 아미노산 또는 케토산을 함유하는 생산물을 제조하는데 사용된다. 이를 위해, 표현 "정제 화학제품-함유 생산물의 획득" 이 또한 사용된다. 가장 단순한 경우에, 발효 용기로부터 제거된 정제 화학제품-함유 발효 브로쓰가 그 자체로 수득된 생산물이다.
a)
물의 일부 (0% 초과 내지 80% 미만) 내지 전부 (100%) 또는 거의 전부 (80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상) 제거,
b)
제거 전에 임의로 불활성화되는, 바이오매스의 일부 (0% 초과 내지 80% 미만) 내지 전부 (100%) 또는 거의 전부 (80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상) 제거,
c)
발효 과정에서 형성되는 유기 부산물의 일부 (0% 초과 내지 80% 미만) 내지 전부 (100%) 또는 거의 전부 (80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.3% 이상, 99.7% 이상) 제거, 및
d)
발효에 의해 제거되지 않은 이용되는 발효 배지 또는 공급원료의 구성성분의 일부 (0% 초과) 내지 전부 (100%) 또는 거의 전부 (80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.3% 이상, 99.7% 이상) 제거
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조치를 통해 발효 브로쓰로부터 요망되는 유기 화학적 화합물의 농축 또는 정제가 달성된다. 이런 방식으로, 요망되는 함량의 화합물을 갖는 생산물이 단리된다.
물의 일부 (0% 초과 내지 80% 미만) 내지 전부 (100%) 또는 거의 전부 (이상 80% 내지 100% 미만) 제거 (조치 a)) 는 또한 건조로서 호칭될 수 있다.
공정의 하나의 변형예에서, 요망되는 유기 화학적 화합물, 바람직하게는 L-아미노산의 순수한 (80 wt.% 이상, 90 wt.% 이상) 또는 고도로 순수한 (95 wt.% 이상, 97 wt.% 이상, 99 wt.% 이상) 생산물 형태는 물, 바이오매스, 유기 부산물 및 이용되는 발효 배지의 소비되지 않은 구성성분의 전부 또는 거의 전부 제거에 의해 달성된다. a), b), c) 또는 d) 에 따른 조치에 관해, 여러가지 기술적 지침이 선행 기술에서 입수가능하다.
코리네박테리움 속의 박테리아를 사용하는 L-아미노산 L-류신, L-발린 또는 L-이소류신 또는 α-케토산 케토이소발레레이트, 케토메틸발레레이트 또는 케토이소카프로에이트의 생산 공정의 경우에, 발효 브로쓰의 구성성분을 함유하지 않는 생산물이 수득되는 공정이 바람직하다. 이들은 특히 인간 의약, 제약 산업 및 식품 산업에서 사용된다.
발명에 따른 공정은 L-아미노산 L-류신, L-발린 또는 L-이소류신 또는 α-케토산 케토이소발레레이트, 케토메틸발레레이트 또는 케토이소카프로에이트의 발효적 생산에 사용된다.
본 발명은 마지막으로 L-아미노산 L-류신, L-발린 또는 L-이소류신 또는 α-케토산 케토이소발레레이트, 케토메틸발레레이트 또는 케토이소카프로에이트의 발효적 생산을 위한 발명에 따른 미생물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 아래에서 예시적 구현예를 사용하여 더욱 상세히 설명된다.
실시예 1:
대체 구축물 pK18mobsacB_PprpD2-ilvB 의 클로닝
Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 사에서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 의 게놈 서열에서 출발하여, 하기 성분으로 이루어지는 1390 bp 크기의 DNA 조각을 합성했다 (Seq ID NO: 5):
ㆍ ilvB 의 상류에 있는 상동 DNA 영역,
ㆍ 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 으로부터의 PprpD2 프로모터,
ㆍ 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 으로부터의 gap 유전자의 리보솜 결합 자리,
ㆍ GTG 시작 코돈 대신 ATG 시작 코돈을 보유하는 ilvB 유전자에 대한 상동 영역.
언급된 2 가지 제한 효소를 사용하는 각각의 절단 및 후속적으로 EcoRI 및 HindIII 을 사용하여 유사하게 절단된 벡터 pK18mobsacB 내의 결찰에 의해 말단에 도입된 절단 자리 EcoRI 및 HindIII 을 통해 조각을 클로닝했다. 플라스미드는 명칭 pK18mobsacB_PprpD2-ilvB 을 갖는다. 플라스미드는 ilvB 유전자의 선천 프로모터가 결실되고 유도성 프로모터 PprpD2 에 의해 대체된 돌연변이체의 생산을 가능하게 한다. 이것에서, 선천 시작 코돈 (GTG) 은 게다가 리보솜에 의해 선호되는 시작 코돈 ATG 에 의해 대체되어 있다.
실시예 2
대체 구축물 pK18mobsacB_ilvN(M13) 의 구축
Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 사에서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 의 게놈 서열으로부터 출발하여, ilvB 유전자의 부분, ilvB 유전자와 ilvN 유전자 사이의 유전자간 영역, 및 또한 ilvN 유전자의 부분을 포함하는 1421 bp 크기의 DNA 조각을 합성했다 (Seq ID NO: 14). 이것에서, ilvN 유전자에서 선천 서열 "GGAATCATT" (ilvN 의 유전자 시작의 +58 내지 +66 bp 하류에서, 유전자 시작은 +1 로서 정의됨) 을 "GATGACTTT" 로 변화시켰다. 그에 의해, 위치 20, 21 및 22 에서 IlvN 단백질의 아미노산 서열을 Gly (20), Ile(21), Ile(22) 로부터 Asp(20), Asp(21), Phe(22) 로 변화시켰다.
언급된 2 가지 제한 효소를 사용하는 각각의 절단 및 후속적으로 EcoRI 및 HindIII 을 사용하여 유사하게 절단된 벡터 pK18mobsacB 내의 결찰에 의해 말단에 도입된 절단 자리 EcoRI 및 HindIII 을 통해 조각을 결찰했다. 플라스미드는 명칭 pK18mobsacB_ilvN(M13) 을 갖는다. 플라스미드는 선천 유전자 서열 "GGAATCATT" (ilvN 의 유전자 시작의 +58 내지 +66 bp 하류에서, 유전자 시작은 +1 로서 정의됨) 이 "GATGACTTT" 로 변화된 돌연변이체의 생산을 가능하게 한다.
실시예 3:
돌연변이체 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_PprpD2-ilvBN, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN 및 코리네박테리움 글루타미쿰 VPS_PprpD2-ilvBN 의 구축
실시예 1 에서 언급된 벡터 pK18mobsacB_PprpD2-ilvB 를 Liebl 등 (FEMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)) 의 프로토콜에 따른 전기천공을 통해 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 및 발린 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_ilvN(M13) (실시예 4 참고) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 발린 생산 균주, 코리네박테리움 글루타미쿰 VPS 에 전달했다. 벡터 pK18mobsacB 또는 pK18mobsacB_PprpD2-ilvB 는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_ilvN(M13) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 VPS 에서 독립적으로 복제할 수 없고, 재조합 사건의 결과 그것이 염색체 내로 통합된 경우에만 세포 내에 유지된다. 통합된 pK18mobsacB_PprpD2_ilvB 를 함유하는 클론의 선별을 15 ㎎/ℓ 의 카나마이신 및 50 ㎎/㎖ 의 날리딕스산으로 보충된 LB 아가 (Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Habor, New York, 1989) 에서 접합 뱃치를 플레이트 아웃 (plate out) 하여 수행했다. 부착된 클론을 25 ㎎/ℓ 의 카나마이신을 함유하는 LB 아가 플레이트에 도말하고, 33℃ 에서 16 시간 동안 인큐베이션했다. 제 2 재조합 사건의 결과 플라스미드의 절제가 일어난 돌연변이체의 선별을 위해, 클론을 LB 액체 배지에서 20 시간 동안 비-선택적으로 배양하고, 그 후 10% 수크로스를 함유하는 LB 아가에 도말하고, 24 시간 동안 인큐베이션했다.
플라스미드 pK18mobsacB_PprpD2-ilvB 뿐만 아니라 시작 플라스미드 pK18mobsacB 는, 카나마이신 저항성 유전자 외에도, 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 로부터의 레반 수크라제에 관해 코딩하는 sacB 유전자의 카피를 함유한다. 수크로스에 의해 유도가능한 발현은 코리네박테리움 글루타미쿰에 독성인 생산물 레반의 합성을 촉매작용하는 레반 수크라제의 형성을 초래한다. 그러므로, 수크로스를 함유하는 LB-아가에서, 통합된 pK18mobsacB_PprpD2-ilvB 가 결국 절제된 클론만 성장한다. 절제의 경우에, 플라스미드와 함께 either 야생형 프로모터 영역을 포함하는 ilvB 유전자의 완전 야생형 카피 또는 PprpD2 프로모터를 함유하는 ilvB 유전자의 재조합 카피가 절제될 수 있다.
대략 40 내지 50 콜로니를 표현형 "수크로스의 존재 하의 성장" 및 "카나마이신의 존재 하의 비-성장" 에 대해 시험했다. 재조합 PprpD2-ilvB 대립유전자가 염색체 내에 남았는지를 입증하기 위해, Innis 등 (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) 의 표준 PCR 방법에 따른 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 표현형 "수크로스의 존재 하의 성장" 및 "카나마이신의 존재 하의 비-성장" 을 함유하는 대략 20 개의 콜로니를 조사했다. 이와 관련하여, 재조합 PprpD2-ilvB 대립유전자의 수식된 영역을 보유하는 DNA 조각을 콜로니의 염색체 DNA 로부터 증폭시켰다. 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드
시험 프라이머 1 (SEQ ID NO: 6)
5'-AAA GCC TGC ATC GCG GAG AC-3'
시험 프라이머 2 (SEQ ID NO: 7)
5'-TGG TGA TGC CGC GGA TAT CG-3'
를 증명 PCR (proof PCR) 을 위해 선별했다.
상기 프라이머는 재조합 PprpD2-ilvBN 유전자좌를 함유하는 클론에서 약 880 bp 크기의 DNA 조각의 증폭을 가능하게 한다. 야생형 PilvBN-ilvBN 유전자좌를 함유하는 클론에서, 약 1136 bp 크기의 DNA 조각이 증폭된다.
증폭된 DNA 조각을 0.8% 강도 아가로스 겔에서 전기영동을 통해 확인한다. 그에 의해 균주가 염색체에 수식된, 재조합 PprpD2-ilvBN 대립유전자를 보유한다는 것을 밝힐 수 있었다. 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_PprpD2-ilvBN, ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN 및 VPS_PprpD2-ilvBN 으로서 명명했다.
실시예 4
균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_ilvN(M13) 의 구축
실시예 2 에서 언급된 벡터 pK18mobsacB_ilvN(M13) 를 실시예 3 에 기재된 방법과 유사하게 전기천공에 의해 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 에 전달했다. 클론의 선별을 실시예 3 에 언급된 배양 기술에 의해 수행했다. 양성 클론의 탐지를 20 개의 클론으로부터 단리된 염색체 DNA 에 기초하여 하기 시험 프라이머 3 및 4
시험 프라이머 3 (SEQ ID NO: 15)
5'- CCC AGT AGT CAT CGA CTT C -3'
시험 프라이머 4 (SEQ ID NO: 16)
5'- CAG CGT CAG CAT CAT AAA GC -3'
를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 947 bp-길이 생산물의 증폭 및 후속적인 PCR 생산물의 서열분석에 의해 수행했다.
실시예 5:
L-발린의 생산을 위한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_PprpD2-ilvBN 의 성능 시험
L-발린 생산 능력의 조사를 위해, 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_PprpD2-ilvBN 및, 기준으로서, 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 의 5 개의 클론을 10 ㎖ 의 시험 배지에서 각각의 경우에 16 h 동안 33℃ 에서 예비-배양했다. 생산 시험을 위해, 각각 10 ㎖ 의 시험 배지에 수득된 예비-배양물을 접종하여, 시작 OD600 (600 ㎚ 에서의 광학 밀도) 가 0.1 이 되게 했다. 각각의 클론을 3 개의 셰이커 플라스크에서 시험하여, 예시적 균주를 총 15 개의 셰이커 플라스크에 의해 표시했다.
시험 배지는 Keilhauer 등 (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603) 에 기재된 CgXII 배지와 동일했으나, 7.5 g/ℓ 의 효모 추출물 (Difco (Becton Dickinson GmbH), Heidelberg) 을 부가적으로 함유했다. 시험 배지의 조성이 하기 표 1 에 요약되어 있다. 발린 합성의 유도를 위한 시험 배지는 프로피오네이트를 0.6 g/ℓ (자유 산에 기초하여) 의 농도로 부가적으로 함유했다.
표 1
배양을 33℃ 및 200 rpm 에서 100 ㎖ 셰이커 플라스크에서 수행했다. 셰이커의 이동은 5 ㎝ 였다. 24 및 48 시간 후에, 샘플을 배양물로부터 제거하고, 덱스트로스의 내용물 및 L-발린의 내용물의 광학 밀도를 확인하고, 세포를 잠시 원심분리했다 (벤치 원심분리 유형 5415D (Eppendorf), 13000 rpm, 10 분, 실온에서).
광학 밀도를 GENios 미세역가 플레이트 광도계 (Tecan, Reading UK) 를 사용하여 660 ㎚ 의 파장에서 확인했다. 측정 전에 샘플을 탈염수로 1:100 희석했다.
덱스트로스를 결합 효소 시험 (헥소키나제/글루코스 6-포스페이트 디히드로게나아제) 을 사용하여 NADH 형성을 통해 확인했다.
세포외 아미노산 농도를 배양물 상청액으로부터 역상 HPLC (Lindroth 등, Analytical chemistry (1979) 51: 1167-1174) 를 통해 정량적으로 확인했다. 형광 탐지기 (G1321A) 가 부착된 시리즈 HP1100 (Hewlett-Packard, Waldbronn, Germany) 의 HPLC 장비를 사용했다; 시스템 제어 및 데이타의 분석을 HP Chem-Station (Hewlett-Packard) 을 사용하여 수행했다. 분석할 아미노산 용액 1 ㎕ 를 자동 프리-칼럼 유도체화 장비에서 20 ㎕ 의 오르토-프탈알데히드/2-메르캅토에탄올 바로 사용가능한 (ready-to-use) 시약 (Pierce Europe BV, Oud-Beijerland, Netherlands) 과 혼합했다. 여기에서 초래되는 형광, 티오-치환된 이소인돌 (Jones 등, Journal of Chromatography (1983) 266: 471-482) 을 조합된 프리-칼럼 (40x4 ㎜ Hypersil ODS 5) 및 메인 칼럼 (Hypersil ODS 5, 2 가지 칼럼은 CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Germany 사로부터 입수함) 을 이용하여 비-극성 상 (메탄올) 을 증가시키면서 기울기 프로그램을 사용하여 분리했다. 극성 용출액은 나트륨 아세테이트 (0.1 M; pH 7.2) 이었다; 유속은 0.8 ㎖/분 이었다. 유도체화된 아미노산의 형광 탐지를 230 ㎚ 의 여기 파장 및 450 ㎚ 의 방출 파장에서 수행했다. 발린 농도를 외부 표준과 비교하여 계산했다.
산출률의 계산을 위해, 형성된 L-발린의 양을 소비된 덱스트로스의 양으로 나누었다.
결과가 표 2 에 제시되어 있고, 예시적 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_PprpD2-ilvBN 은 배지 중에 프로피오네이트의 존재 하에 발린을 유의하게 분비하지만, 프로피오네이트의 부재 하에 그것은 어떠한 조건 하에서도 발린을 유의하게 생산하지 않는 대조군 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 과 다르지 않다는 것을 보여준다.
표 2: 배지 중 프로피온산의 부재 하에 (표 2A) 또는 배지 중 0.6 g/ℓ 의 프로피온산의 존재 하에 (표 2B) 24 시간 동안 인큐베이션 후에 L-발린 형성. 약어: *: ATCC 14067_PprpD2-ilvBN, std. dev.: 표준 편차.
표 2A: 프로피온산의 부재 하의 결과
표 2B: 프로피온산의 존재 하의 결과
실시예 6:
코리네박테리움 글루타미쿰-발린 생산 균주를 사용하는 성능 시험
실시예 5 와 유사하게, 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN 및 코리네박테리움 글루타미쿰 VPS_PprpD2-ilvBN 을 셰이커 플라스크 시스템에서 조사했다.
그들의 L-발린 생산 능력을 조사하기 위해, 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN 및 기준 균주로서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_ilvN(M13), 또는 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 VPS_PprpD2-ilvBN 및 기준 균주로서 코리네박테리움 글루타미쿰 VPS 을, 각각의 경우에 10 ㎖ 의 시험 배지 (표 3) 에서, 33℃ 에서 16 h 동안 예비-배양했다. 생산 시험을 위해, 각각 10 ㎖ 의 시험 배지에 수득된 예비-배양물을 접종하여 시작 OD600 (600 ㎚ 에서의 광학 밀도) 가 0.1 이 되도록 했다. 각각의 클론을 3 개의 셰이커 플라스크에서 시험하여, 예시적 균주를 총 15 개의 셰이커 플라스크에 의해 나타냈다.
표 3: 시험 배지로서 사용한 SK1039
발린 합성의 유도를 위한 시험 배지는 프로피오네이트를 0.6 g/ℓ (자유 산에 기초하여) 의 농도로 부가적으로 함유했다.
배양 조건, 및 바이오매스, 덱스트로스 및 발린 농도의 확인을 실시예 5 에 기재된 바와 유사하게 수행했다.
결과가 표 4 에 제시되어 있고, 배지 중에 프로피오네이트의 존재시에 발린 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN 및 VPS_PprpD2-ilvBN 은 각각의 경우에 미변형 출발 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067_ilvN(M13) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 VPS 보다 이용되는 탄소 공급원에 대한 발린의 더 높은 비산출률을 갖는다는 것을 보여준다.
표 4: 배지 중 프로피온산의 부재 하에 (표 4A) 및 배지 중 0.6 g/ℓ 의 프로피온산의 존재 하에 (표 4B) 24 시간 동안 인큐베이션 후에 L-발린 산출률; 약어: std. dev. = 표준 편차.
표 4A: 프로피온산의 부재 하의 결과
표 4B: 프로피온산의 존재 하의 결과
실시예 7:
균주 VPS_PprpD2-ilvBN 및 VPS 에 관한 발린 안정성 시험
안정성 시험을 10 ㎖ 액체 배양물 (실시예 6 에서와 같음) 에서 수행했다.
균주 VPS 및 VPS_PprpD2-ilvBN 의 예비배양
100 ㎖ 셰이커 플라스크 (배플 (baffles) 이 있음) 내의 10 ㎖ 의 액체 배양물에 각각 50 ㎕ 의 글리세롤 연속 배양물을 접종하고, 22 h 동안 인큐베이션했다 (33℃, 200 rpm, 5 ㎝ 진폭).
배양물의 광학 밀도를 측정하고, 1.5 ㎖ 의 배양물을 글리세롤 (10% 글리세롤 최종 농도) 로 처리하고, 스크루 캡 용기 내에서 -80℃ 에서 냉동배양물 (cryoculture) 로서 얼렸다.
각각 새로운 10 ㎖ 액체 배양물에 50 ㎕ 의 배양물을 접종하고, 이것을 다시 흔들면서 22 h 동안 33℃ 에서 인큐베이션했다.
이 절차를 추가로 2 회 반복하여, 각각의 글리세롤 배양물을 총 4 연속적 액체 배양물에서 배양했다. 각각의 배양은 약 8 세포 세대에 해당한다. 따라서 액체 배양물에서 4 계대는 총 30 초과 (약 32) 의 세포 세대에 해당한다.
균주 VPS 및 VPS_PprpD2-ilvBN 의 주 배양
각각의 연속 배양물 또는 냉동배양물의 셰이커 플라스크 배양물에 각각 10 ㎖ 의 액체 배지 (시작 OD: 0.1) 를 접종했다. 배양물을 후속적으로 24 h 동안 인큐베이션했다. 각각의 배양을 듀플리케이트 (duplicate) 확인으로 수행했다. 인큐베이션의 끝에 (24 h 후에), 광학 밀도, 발린 역가 및 잔류 당 농도의 분석을 위해 샘플을 취했다. 분석을 실시예 5 에 기재된 바와 같이 수행했다.
성능 시험의 결과 (표 5) 로서, 균주 VPS 에 관한 각각의 계대 발린 역가 (상대 변화 % 로 나타냄), 발린/바이오매스 비율 (발린/OD 로 나타냄) 및 산출률 (형성된 생산물의 g / 소비된 기질의 g) 은 더 불량해지거나 더 낮아진 것으로 보인다. 이것은 집단 내에서 생산물 형성에 관해 음성이고 바이오매스 형성에 관해 양성인 돌연변이가 확립되었다는 사실의 증거이다. 2 배양 시기 (15.6 세대) 후에, 균주 VPS 는 시험 배양 (주 배양 결과) 에서 이미 성능 데이타의 하락을 보인다. 따라서 4-시기 공정 (3 배양 시기 + 1 생산 시기) 에서 성능 데이타 (역가, 산출률, 바이오매스-특이적 생산물 형성) 의 심각한 감소가 예상될 것이다. 발명에 따른 VPS_PprpD2-ilvBN 균주의 경우에는, 심지어는 4 배양 시기를 통과하여 30 세대를 초과한 후에도 이러한 음성 효과가 보이지 않는다. 이와 대조적으로, 바이오매스-특이적 발린 형성 (발린/OD) 은 심지어 약간 증가한다. 따라서 3 배양 시기 및 주 배양으로 이루어지는 4-시기 이상의 생산 공정이 시뮬레이션되거나 요건이 심지어는 능가된다.
표 5: 안정성 시험의 성능 데이타 (24 시간 동안 인큐베이션 후에 대조군 (=0) 과 비교되는 부가적 세포 세대의 함수로서의 L-발린 산출률, 바이오매스-특이적 생산물 형성 (발린/OD) 및 발린 형성의 상대 변화 (평균 값))
SEQUENCE LISTING
<110> Evonik Industries AG
<120> Method for producing l-leucine, l-valine, l-isoleucine, alpha-ketoisovalerate, alpha-keto-beta-methylvalerate, or alpha-ketoisocaproate using recombinant corynebacteria that contain the ilvbn operon which can be induced by propionate
<130> 201100446
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 177
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> repeat_region
<222> (22)..(49)
<223> IR1
<220>
<221> repeat_region
<222> (77)..(105)
<223> IR2
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ctccagcgtc cacgaatatg cccccgcgcg ccgggtgggg agcgaaggga acccccaagg 60
aattggcgtt gaggtggcga ttttgcatgt tttactcaaa attactttgg tggtcacaaa 120
attacacaac ttttacagtg acctagatcg ctttttaaag aattagcgtg gtgtgca 177
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<211> 177
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> repeat_region
<222> (22)..(49)
<223> IR1
<220>
<221> repeat_region
<222> (77)..(105)
<223> IR2
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<212> DNA
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<222> (22)..(49)
<223> IR1
<220>
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<222> (77)..(105)
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<211> 902
<212> DNA
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<221> promoter
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<220>
<221> RBS
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<223> gap RBS
<220>
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<223> atg-Start codon
<220>
<221> gene
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atatttatcg cgagaggaga cacaacatga atgtggcagc ttctcaacag cccactcccg 240
ccacggttgc aagccgtggt cgatccgccg cccctgagcg gatgacaggt gcacaggcaa 300
ttgttcgatc gctcgaggag cttaacgccg acatcgtgtt cggtattcct ggtggtgcgg 360
tgctaccggt gtatgacccg ctctattcct ccacaaaggt gcgccacgtc ctggtgcgcc 420
acgagcaggg cgcaggccac gcagcaaccg gctacgcgca ggttactgga cgcgttggcg 480
tctgcattgc aacctctggc ccaggcgcaa ccaacttggt taccccaatc gctgatgcaa 540
acttggactc cgttcccatg gttgccatca ccggccaggt cggaagtggc ctgctgggta 600
ccgatgcttt ccaggaagcc gatatccgcg gcatcaccat gccagtgacc aagcacaact 660
tcatggtcac cgaccccaac gacattccac aggcattggc tgaggcattc cacctcgcga 720
ttactggtcg ccctggccct gttctggtgg atattcctaa ggatgtccaa aacgctgaat 780
tggatttcgt ctggccacca aagatcgacc tgccaggcta ccgcccagtt tctactccgc 840
atgctcgaca gattgagcag gctgtcaaac tgatcggtga agccaaaaag ccagtccttt 900
ac 902
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<211> 1390
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<223> RBS gap
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gcagctgacg caatggttgc cggaatcgca gcgcccgcga gagagaaacc aaaagcctgc 240
atcgcggaga cggcaagcat gaaaaacgcc acaatttgcg cgatataaac gccaacgcca 300
gcgaacgcga gctggttctt agtggtgtcc gcatcggctg cagactccac tcgccgcttg 360
ataatacgca tggccagtcg gccgatacgt ggaatcaaaa acgccaagac caggataatt 420
gctacatcaa aaccggtatc gacaatccaa ttccacaatg aatagagcaa atctccagcg 480
tccacgaata tgcccccgcg cgccgggtgg ggagcgaagg gaacccccaa ggaattggcg 540
ttgaggtggc gattttgcat gttttactca aaattacttt ggtggtcaca aaattacaca 600
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gtgtatgacc cgctctattc ctccacaaag gtgcgccacg tcctggtgcg ccacgagcag 900
ggcgcaggcc acgcagcaac cggctacgcg caggttactg gacgcgttgg cgtctgcatt 960
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> misc_feature
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<223> test primer 1
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<211> 20
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> test primer 2
<400> 7
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<211> 3411
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
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<220>
<221> CDS
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atgagccaag attagcgctg aaaagtagcg ggagcctgcc tgaactttgt gagaatcctg 120
attccttaac cgaagtgggg gagttttggg ggtgggaatt ttcgtgcgtt gtggaattgg 180
aaactcgatg tgtgtagcat gacacaccat gaccattatt cgacttgtag tagtaaccgc 240
gcggcgcctg ccgtaacggc cttccaagtc gtctcgtcaa gcgccctcga caacactcac 300
cacagtgttg gaacgagggc tttcttgttg gttatgaccc aagtagccaa ctttgcaaca 360
gacatctgtc gcactgcgtg cacacgcatc cgcgtcggaa caattttaaa tgagggcttt 420
gtctttaggc tgagttgaaa tcggcttggc ttggacgggt cctgtgaaaa tccttattta 480
gtaaaggagc cagaaagtc gtg aat gtg gca gct tct caa cag ccc act ccc 532
Val Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro
1 5 10
gcc acg gtt gca agc cgt ggt cga tcc gcc gcc cct gag cgg atg aca 580
Ala Thr Val Ala Ser Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr
15 20 25
ggt gca aag gca att gtt cga tcg ctc gag gag ctt aac gcc gac atc 628
Gly Ala Lys Ala Ile Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile
30 35 40
gtg ttc ggt att cct ggt ggt gcg gtg cta ccg gtg tat gac ccg ctc 676
Val Phe Gly Ile Pro Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu
45 50 55
tat tcc tcc aca aag gtg cgc cac gtc ttg gtg cgc cac gag cag ggc 724
Tyr Ser Ser Thr Lys Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly
60 65 70 75
gca ggc cac gca gca acc ggc tac gcg cag gtt act gga cgc gtt ggc 772
Ala Gly His Ala Ala Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly
80 85 90
gtc tgc att gca acc tct ggc cca gga gca acc aac ttg gtt acc cca 820
Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro
95 100 105
atc gct gat gca aac ttg gac tcc gtt ccc atg gtt gcc atc acc ggc 868
Ile Ala Asp Ala Asn Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly
110 115 120
cag gtc gga agt ggc ctg ctg ggt acc gac gct ttc cag gaa gcc gat 916
Gln Val Gly Ser Gly Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp
125 130 135
atc cgc ggc atc acc atg cca gtg acc aag cac aac ttc atg gtc acc 964
Ile Arg Gly Ile Thr Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr
140 145 150 155
aac cct aac gac att cca cag gca ttg gct gag gca ttc cac ctc gcg 1012
Asn Pro Asn Asp Ile Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala
160 165 170
att act ggt cgc cct ggc cct gtt ctg gtg gat att cct aag gat gtc 1060
Ile Thr Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val
175 180 185
cag aac gct gaa ttg gat ttc gtc tgg cca cca aag atc gac ctg cca 1108
Gln Asn Ala Glu Leu Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro
190 195 200
ggc tac cgc cca gtt tca aca cca cat gct cgc cag atc gag cag gca 1156
Gly Tyr Arg Pro Val Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala
205 210 215
gtc aag ctg atc ggt gag gcc aag aag ccc gtc ctt tac gtt ggt ggt 1204
Val Lys Leu Ile Gly Glu Ala Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly
220 225 230 235
ggc gta atc aag gct gac gca cac gaa gag ctt cgt gcg ttc gct gag 1252
Gly Val Ile Lys Ala Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu
240 245 250
tac acc ggc atc cca gtt gtc acc acc ttg atg gct ttg ggt act ttc 1300
Tyr Thr Gly Ile Pro Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe
255 260 265
cca gag tct cac gag ctg cac atg ggt atg cca ggc atg cat ggc act 1348
Pro Glu Ser His Glu Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr
270 275 280
gtg tcc gct gtt ggt gca ctg cag cgc agc gac ctg ctg att gct atc 1396
Val Ser Ala Val Gly Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile
285 290 295
ggc tcc cgc ttt gat gac cgc gtc acc ggt gac gtt gac acc ttc gcg 1444
Gly Ser Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala
300 305 310 315
cct gac gcc aag atc att cac gcc gac att gat cct gcc gaa atc ggc 1492
Pro Asp Ala Lys Ile Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly
320 325 330
aag atc aag cag gtt gag gtt cca atc gtg ggc gat gcc cgc gaa gtt 1540
Lys Ile Lys Gln Val Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val
335 340 345
ctt gct cgt ctg ctg gaa acc acc aag gca agc aag gca gag acc gag 1588
Leu Ala Arg Leu Leu Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Thr Glu
350 355 360
gac atc tcc gag tgg gtt gac tac ctc aag ggc ctc aag gca cgt ttc 1636
Asp Ile Ser Glu Trp Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe
365 370 375
ccg cgt ggc tac gac gag cag cca ggc gat ctg ctg gca cca cag ttt 1684
Pro Arg Gly Tyr Asp Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe
380 385 390 395
gtc att gaa acc ctg tcc aag gaa gtt ggc ccc gac gca att tac tgc 1732
Val Ile Glu Thr Leu Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala Ile Tyr Cys
400 405 410
gcc ggc gtt ggc cag cac caa atg tgg gca gct cag ttc gtt gac ttt 1780
Ala Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe
415 420 425
gaa aag cca cgc acc tgg ctc aac tcc ggt gga ctg ggc acc atg ggc 1828
Glu Lys Pro Arg Thr Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly
430 435 440
tac gca gtt cct gcg gcc ctt gga gca aag gct ggc gca cct gac aag 1876
Tyr Ala Val Pro Ala Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys
445 450 455
gaa gtc tgg gct atc gac ggc gac ggc tgt ttc cag atg acc aac cag 1924
Glu Val Trp Ala Ile Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln
460 465 470 475
gaa ctc acc acc gcc gca gtt gaa ggt ttc ccc att aag atc gca cta 1972
Glu Leu Thr Thr Ala Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu
480 485 490
atc aac aac gga aac ctg ggc atg gtt cgc caa tgg cag acc cta ttc 2020
Ile Asn Asn Gly Asn Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe
495 500 505
tat gaa gga cgg tac tca aat act aaa ctt cgt aac cag ggc gag tac 2068
Tyr Glu Gly Arg Tyr Ser Asn Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr
510 515 520
atg ccc gac ttt gtt acc ctt tct gag gga ctt ggc tgt gtt gcc atc 2116
Met Pro Asp Phe Val Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala Ile
525 530 535
cgc gtc acc aaa gcg gag gaa gta ctg cca gcc atc caa aag gct cga 2164
Arg Val Thr Lys Ala Glu Glu Val Leu Pro Ala Ile Gln Lys Ala Arg
540 545 550 555
gag atc aac gac cgc cca gta gtc atc gac ttc atc gtc ggt gaa gac 2212
Glu Ile Asn Asp Arg Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp
560 565 570
gca cag gta tgg cca atg gtg tct gct gga tca tcc aac tcc gat atc 2260
Ala Gln Val Trp Pro Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile
575 580 585
cag tac gca ctc gga ttg cgc cca ttc ttt gat ggt gat gaa tct gca 2308
Gln Tyr Ala Leu Gly Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala
590 595 600
gca gaa gat cct gcc gac att cac gaa gcc gtc agc gac att gat gcc 2356
Ala Glu Asp Pro Ala Asp Ile His Glu Ala Val Ser Asp Ile Asp Ala
605 610 615
gcc gtt gaa tcg acc gag gca taa ggagagaccc aag atg gct aat tct 2405
Ala Val Glu Ser Thr Glu Ala Met Ala Asn Ser
620 625 630
gac gtc acc cgc cac atc ctg tcc gta ctc gtt cag gac gta gac gga 2453
Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln Asp Val Asp Gly
635 640 645
atc att tcc cgc gta tca ggt atg ttc acc cga cgc gca ttc aac ctc 2501
Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg Ala Phe Asn Leu
650 655 660
gtg tcc ctc gtg tct gca aag acc gaa aca cac ggc atc aac cgc atc 2549
Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr His Gly Ile Asn Arg Ile
665 670 675
acg gtt gtt gtc gac gcc gac gag ctc aac att gag cag atc acc aag 2597
Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu Gln Ile Thr Lys
680 685 690
cag ctc aac aag ctg atc ccc gtg ctc aaa gtc gtg cga ctt gat gaa 2645
Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val Arg Leu Asp Glu
695 700 705 710
gag acc act atc gcc cgc gca atc atg ctg gtt aag gtc tct gcg gac 2693
Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys Val Ser Ala Asp
715 720 725
agc acc aac cgt ccg cag atc gtc gac gcc gcg aac atc ttc cgc gcc 2741
Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn Ile Phe Arg Ala
730 735 740
cga gtc gtc gac gtg gct cca gac tct gtg gtt att gaa tcc aca ggc 2789
Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile Glu Ser Thr Gly
745 750 755
acc cca ggc aag ctc cgc gca ctg ctt gac gtg atg gaa cca ttc gga 2837
Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met Glu Pro Phe Gly
760 765 770
atc cgc gaa ctg atc caa tcc gga cag att gca ctc aac cgc ggt ccg 2885
Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu Asn Arg Gly Pro
775 780 785 790
aag acc atg gct ccg gcc aag atc taa acagcaatta atctgattgc 2932
Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile
795
acctgctgca taaatgtgac tagtcaaaca ccgtctaatt acatgtgtgt ggtagaacaa 2992
taatgtagtt gtctgcccaa gcgagttaaa ctcccacgat ttacagtggg gggcagacat 3052
cttttcacca aaatttttac gaaaggcgag attttctccc atggctattg aactgcttta 3112
tgatgctgac gctgacctct ccttgatcca gggccgtaag gttgccatcg ttggctacgg 3172
ctcccagggc cacgcacact cccagaacct ccgcgattct ggcgttgagg ttgtcattgg 3232
tctgcgcgag ggctccaagt ccgcagagaa ggcaaaggaa gcaggcttcg aggtcaagac 3292
caccgctgag gctgcagctt gggctgacgt catcatgctc ctggctccag acacctccca 3352
ggcagaaatc ttcaccaacg acatcgagcc aaacctgaac gcaggcgacg cactgctgt 3411
<210> 9
<211> 626
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 9
Val Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser
1 5 10 15
Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Lys Ala Ile
20 25 30
Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe Gly Ile Pro
35 40 45
Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys
50 55 60
Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala
65 70 75 80
Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn
100 105 110
Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Gly
115 120 125
Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Ile Arg Gly Ile Thr
130 135 140
Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp Ile
145 150 155 160
Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro
165 170 175
Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu
180 185 190
Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val
195 200 205
Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala Val Lys Leu Ile Gly
210 215 220
Glu Ala Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val Ile Lys Ala
225 230 235 240
Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu Tyr Thr Gly Ile Pro
245 250 255
Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu
260 265 270
Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly
275 280 285
Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile Gly Ser Arg Phe Asp
290 295 300
Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys Ile
305 310 315 320
Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Ile Lys Gln Val
325 330 335
Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu
340 345 350
Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Thr Glu Asp Ile Ser Glu Trp
355 360 365
Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp
370 375 380
Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val Ile Glu Thr Leu
385 390 395 400
Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala Ile Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln
405 410 415
His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe Glu Lys Pro Arg Thr
420 425 430
Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala
435 440 445
Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala Ile
450 455 460
Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala
465 470 475 480
Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Asn Asn Gly Asn
485 490 495
Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly Arg Tyr
500 505 510
Ser Asn Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr Met Pro Asp Phe Val
515 520 525
Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala Ile Arg Val Thr Lys Ala
530 535 540
Glu Glu Val Leu Pro Ala Ile Gln Lys Ala Arg Glu Ile Asn Asp Arg
545 550 555 560
Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro
565 570 575
Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile Gln Tyr Ala Leu Gly
580 585 590
Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala
595 600 605
Asp Ile His Glu Ala Val Ser Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr
610 615 620
Glu Ala
625
<210> 10
<211> 172
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 10
Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln
1 5 10 15
Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg
20 25 30
Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr His Gly
35 40 45
Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu
50 55 60
Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val
65 70 75 80
Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys
85 90 95
Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn
100 105 110
Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile
115 120 125
Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met
130 135 140
Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu
145 150 155 160
Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile
165 170
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> repeat_region
<222> (1)..(28)
<223> IR1
<400> 11
ccccgcgcgc cgggtgggga gcgaaggg 28
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> repeat_region
<222> (1)..(29)
<223> IR2
<400> 12
gcgattttgc atgttttact caaaattac 29
<210> 13
<211> 2619
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(177)
<223> PprpD2
<220>
<221> RBS
<222> (178)..(206)
<223> RBS gap
<220>
<221> misc_feature
<222> (207)..(209)
<223> atg-start codon
<220>
<221> gene
<222> (207)..(2087)
<223> coding region ilvB
<220>
<221> gene
<222> (2101)..(2619)
<223> coding region ilvN
<400> 13
ctccagcgtc cacgaatatg cccccgcgcg ccgggtgggg agcgaaggga acccccaagg 60
aattggcgtt gaggtggcga ttttgcatgt tttactcaaa attactttgg tggtcacaaa 120
attacacaac ttttacagtg acctagatcg ctttttaaag aattagcgtg gtgtgcatgc 180
atatttatcg cgagaggaga cacaacatga atgtggcagc ttctcaacag cccactcccg 240
ccacggttgc aagccgtggt cgatccgccg cccctgagcg gatgacaggt gcacaggcaa 300
ttgttcgatc gctcgaggag cttaacgccg acatcgtgtt cggtattcct ggtggtgcgg 360
tgctaccggt gtatgacccg ctctattcct ccacaaaggt gcgccacgtc ctggtgcgcc 420
acgagcaggg cgcaggccac gcagcaaccg gctacgcgca ggttactgga cgcgttggcg 480
tctgcattgc aacctctggc ccaggcgcaa ccaacttggt taccccaatc gctgatgcaa 540
acttggactc cgttcccatg gttgccatca ccggccaggt cggaagtggc ctgctgggta 600
ccgatgcttt ccaggaagcc gatatccgcg gcatcaccat gccagtgacc aagcacaact 660
tcatggtcac cgaccccaac gacattccac aggcattggc tgaggcattc cacctcgcga 720
ttactggtcg ccctggccct gttctggtgg atattcctaa ggatgtccaa aacgctgaat 780
tggatttcgt ctggccacca aagatcgacc tgccaggcta ccgcccagtt tctactccgc 840
atgctcgaca gattgagcag gctgtcaaac tgatcggtga agccaaaaag ccagtccttt 900
acgttggtgg tggcgtaatc aaggctgacg cacacgaaga gcttcgtgcg ttcgctgagt 960
acaccggcat cccagttgtc accaccttga tggctttggg tactttccca gagtctcacg 1020
agctgcacat gggtatgcca ggcatgcatg gcactgtgtc cgctgttggt gcactgcagc 1080
gcagcgacct gctgattgct atcggctccc gctttgatga ccgcgtcacc ggtgacgttg 1140
acaccttcgc gcctgacgcc aagatcattc acgccgacat tgatcctgcc gaaatcggca 1200
agatcaagca ggttgaggtt ccaatcgtgg gcgatgcccg cgaagttctt gctcgtctgc 1260
tggaaaccac caaggcaagc aaggcagaga ccgaggacat ctccgagtgg gttgactacc 1320
tcaagggcct caaggcacgt ttcccgcgtg gctacgacga gcagccaggc gatctgctgg 1380
caccacagtt tgtcattgaa accctgtcca aggaagttgg ccccgacgca atttactgcg 1440
ccggcgttgg ccagcaccaa atgtgggcag ctcagttcgt tgactttgaa aagccacgca 1500
cctggctcaa ctccggtgga ctgggcacca tgggctacgc agttcctgcg gcccttggag 1560
caaaggctgg cgcacctgac aaggaagtct gggctatcga cggcgacggc tgtttccaga 1620
tgaccaacca ggaactcacc accgccgcag ttgaaggttt ccccattaag atcgcactaa 1680
tcaacaacgg aaacctgggc atggttcgcc aatggcagac cctattctat gaaggacggt 1740
actcaaatac taaacttcgt aaccagggcg agtacatgcc cgactttgtt accctttctg 1800
agggacttgg ctgtgttgcc atccgcgtca ccaaagcgga ggaagtactg ccagccatcc 1860
aaaaggctcg agagatcaac gaccgcccag tagtcatcga cttcatcgtc ggtgaagacg 1920
cacaggtatg gccaatggtg tctgctggat catccaactc cgatatccag tacgcactcg 1980
gattgcgccc attctttgat ggtgatgaat ctgcagcaga agatcctgcc gacattcacg 2040
aagccgtcag cgacattgat gccgccgttg aatcgaccga ggcataagga gagacccaag 2100
atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcagga cgtagacgga 2160
atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 2220
tctgcaaaga ccgaaacaca cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 2280
ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 2340
cgacttgatg aagagaccac tatcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggac 2400
agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 2460
gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagct ccgcgcactg 2520
cttgacgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 2580
aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaa 2619
<210> 14
<211> 1421
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> gene
<222> (7)..(636)
<223> 3‘-region of the iLvB-gene
<220>
<221> gene
<222> (650)..(1168)
<223> ilvN gene
<220>
<221> misc_feature
<222> (707)..(715)
<223> mutated gene section
<400> 14
gaattccaga tgtgggcagc tcagttcgtt gactttgaaa agccacgcac ctggctcaac 60
tctggcggcc tgggcaccat gggctacgca gttcctgcgg ctcttggagc aaaggctggc 120
gcacctgaca aggaagtctg ggctatcgac ggcgacggct gtttccagat gaccaaccag 180
gaactcacca ccgccgcagt tgaaggtttc cccattaaga tcgcactaat caacaacgga 240
aacctgggca tggttcgcca atggcagacc ctattctatg aaggacggta ctcaaatact 300
aaacttcgta accagggcga gtacatgccc gactttgtta ccctttctga gggacttggc 360
tgtgttgcca tccgcgtcac caaagcggag gaagtactgc cagccatcca aaaggctcga 420
gagatcaacg accgcccagt agtcatcgac ttcatcgtcg gtgaagacgc acaggtatgg 480
ccaatggtgt ctgctggatc atccaactcc gatatccagt acgcactcgg attgcgccca 540
ttctttgatg gtgatgaatc tgcagcagaa gatcctgccg acattcacga agccgtcagc 600
gacattgatg ccgccgttga atcgaccgag gcataaggag agacccaaga tggctaattc 660
tgacgtcacc cgccacatcc tgtccgtact cgttcaggac gtagacgatg acttttcccg 720
cgtatcaggt atgttcaccc gacgcgcatt caacctcgtg tccctcgtgt ctgcaaagac 780
cgaaacactc ggcatcaacc gcatcacggt tgttgtcgac gccgacgagc tcaacattga 840
gcagatcacc aagcagctca acaagctgat ccccgtgctc aaagtcgtgc gacttgatga 900
agagaccacc atcgcccgcg caatcatgct ggttaaggtc tctgcggata gcaccaaccg 960
tccgcagatc gtcgacgccg cgaacatctt ccgcgcccga gtcgtcgacg tggctccaga 1020
ctctgtggtt attgaatcca caggcacccc aggcaagctc cgcgcactgc ttgatgtgat 1080
ggaaccattc ggaatccgcg aactgatcca atccggacag attgcactca accgcggtcc 1140
gaagaccatg gctccggcca agatctaaac agcaattaat ctgattgcac ctgctgcata 1200
aatgtgacta gtcaaacacc gtctaattgc atgtgtgtgg tagaacaata atgtagttgt 1260
ctgcccaagc gagtttaact cccacgattt acagtggggg cagacatctt ttcaccaaaa 1320
tttttacgaa aggcgagatt ttctcccatg gctattgaac tgctttatga tgctgacgct 1380
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<212> DNA
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<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> test primer 4
<400> 16
cagcgtcagc atcataaagc 20
Claims (15)
- SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 에 따른 위치 1 내지 121 의 서열과 서열이 85% 이상 동일하고, 활성화인자 PrpR 가 결합하고, 3'-말단에서 기능적으로 하류에 프로모터 활성을 갖는 제 2 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 아세토락테이트 신타아제의 서브유닛에 관해 코딩하는 유전자 ilvB 및 ilvN 가 존재하고, 활성화인자 PrpR 의 부가의 작용으로서 유전자 ilvBN 의 전사를 조절하는, 작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 복제가능한 형태로 함유하는, 코리네박테리움 속의 미생물의 발효에 의한 L-류신, L-발린 및 L-이소류신으로부터 선택되는 L-아미노산 또는 α-케토이소발레레이트, α-케토메틸발레레이트 및 α-케토이소카프로에이트로부터 생산되는 α-케토산의 생산 방법으로서,
배지에, 유도인자 없이 일어나는, 제 1 시기 (성장 시기) 후에, 제 2 시기에 유도인자로서 프로피오네이트 또는 2-메틸시트레이트가 첨가되고, 그 결과 요망되는 L-아미노산 또는 α-케토산이 배지에서 및/또는 세포에서 농화되는 조건 하에 요망되는 L-아미노산 또는 α-케토산이 합성되는 방법. - 제 1 항에 있어서, 작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 에 따른 위치 22 내지 위치 49 에 따른 서열과 서열이 90% 이상, 바람직하게는 92, 94 또는 96% 이상, 특히 바람직하게는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 ("IR 1"), 및 또한 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 에 따른 위치 77 내지 위치 105 의 서열과 서열이 90% 이상, 바람직하게는 92, 94 또는 96% 이상, 특히 바람직하게는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 ("IR 2") 를 포함하고, 작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 바람직하게는 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 에 따른 위치 1 내지 121 의 서열과 90, 92, 94 또는 96% 이상, 특히 바람직하게는 100% 동일한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 4 에 따른 위치 122 내지 206 의 서열과 90, 92, 94 또는 96% 이상, 특히 97, 98 또는 99% 이상, 특히 바람직하게는 100% 동일한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 ilvB 가 SEQ ID NO: 9 에 따른 서열과 서열이 90, 92, 94 또는 96% 이상, 특히 97, 98 또는 99% 이상, 특히 바람직하게는 100% 동일한 폴리펩티드에 관해 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 유전자 ilvN 가 SEQ ID NO: 10 에 따른 서열과 서열이 90, 92, 94 또는 96% 이상, 특히 97, 98 또는 99% 이상, 특히 바람직하게는 100% 동일한 폴리펩티드에 관해 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 부가적으로 요망되는 L-아미노산 또는 α-케토산의 생합성 경로의 추가의 효소가 증폭된 상태로 존재하고, 특히 과발현되고/거나, 요망되는 L-아미노산 또는 α-케토산의 형성을 감소시키는 대사 경로가 일부 이상 약화되는 미생물이 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, L-발린이 합성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 시기에 이용되는 코리네박테리움이 16 이상, 바람직하게는 24 이상의 세대를 통해 계대하고, 바람직하게는 발효가, 바람직하게는 셰이커 플라스크, PreSeed 발효조, 종균 발효조 및 생산 발효조로 이루어지는, 넷 이상의 시기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 아세토락테이트 신타아제에 관해 코딩하는 유전자 ilvBN 의 발현을, 바람직하게는 유전자의 상류에 있는 프로모터와 조합하여, 조절하기 위한, SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 에 따른 위치 1 내지 121 의 서열과 서열이 85% 이상 동일한, 작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드의 용도.
- SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 에 따른 위치 1 내지 121 의 서열과 서열이 85% 이상 동일한 작동자 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 4 에 따른 위치 122 내지 206 의 서열과 90% 이상 동일한 서열을 갖는 하류 프로모터, 및 또한 아세토락테이트 신타아제에 관해 코딩하는 유전자 ilvBN 를 포함하는 발현 카세트.
- 제 9 항에 따른 발현 카세트를 함유하는 벡터.
- 바람직하게는 코리네박테리움 속의, 미생물에서 ilvBN 유전자의 발현을 위한, 제 9 항에 따른 발현 카세트 또는 제 10 항에 따른 벡터의 용도.
- 제 9 항에 따른 발현 카세트 또는 제 10 항에 따른 벡터를 복제가능한 형태로 함유하는, 바람직하게는 코리네박테리움 속의, 특히 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 종의, 미생물.
- 제 12 항에 있어서, 발현 카세트가 미생물의 염색체 내로 통합된 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, L-류신, L-발린 및 L-이소류신으로부터 선택되는 L-아미노산, 바람직하게는 L-발린, 또는 케토이소발레레이트, 케토메틸발레레이트 및 케토이소카프로에이트로부터 선택되는 α-케토산을 생산하는 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제 14 항에 있어서, L-발린을 생산하고, 바람직하게는 부가적으로 L-발린의 생합성 경로의 추가의 효소가 증가된 형태로 존재하고, 특히 과발현되고/거나, L-발린의 형성을 저하시키는 대사 경로가 일부 이상 약화되는 것을 특징으로 하는 미생물.
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