ES2595031T3

ES2595031T3 - Composiciones y métodos para la detección de aberraciones cromosómicas con tampones de hibridación novedosos

Info

Publication number: ES2595031T3
Application number: ES13164094.8T
Authority: ES
Inventors: Sten Hauge Matthiesen; Kenneth H. Petersen; Tim Svenstrup Poulsen
Original assignee: Dako Denmark ApS
Current assignee: Dako Denmark ApS
Priority date: 2008-05-27
Filing date: 2009-05-27
Publication date: 2016-12-27
Anticipated expiration: 2029-05-27
Also published as: RU2010151495A; US20110229975A1; EP2636756A1; ES2613481T5; EP3138925B1; RU2618868C2; WO2009147537A2; BRPI0912046A2; EP2285982B1; CN102046808A; CA2724552A1; JP2011522531A; ES2610588T3; JP5588970B2; EP3733871A1; EP2285979A1; EP3219812A1; ES2668555T3; EP3360973A1; EP2636756B2

Abstract

Composición acuosa para la hibridación de secuencias de ácido nucleico, que comprende: (a) al menos un disolvente aprótico polar en una concentración de desde el 1% (v/v) hasta el 30% (v/v), preferiblemente de desde el 10% (v/v) hasta el 20% (v/v); y (b) una disolución de hibridación que comprende sulfato de dextrano a una concentración del 10% al 30%, está presente cloruro de sodio a una concentración de 300 mM a 1200 mM y/o está presente fosfato de sodio a una concentración de 5 mM a 20 mM; en la que la secuencia de ácido nucleico se asocia con una aberración cromosómica; y en la que el disolvente aprótico polar tiene funcionalidad lactona, sulfona, sulfito, nitrilo y/o carbonato.

Description

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Según un aspecto de la presente invención, los disolventes apróticos polares adecuados para su uso en la invención son compuestos cíclicos. Un compuesto cíclico tiene una estructura de base cíclica. Los ejemplos incluyen los compuestos cíclicos dados a conocer en el presente documento. En otras realizaciones, el disolvente aprótico polar puede elegirse de las fórmulas 1-4 a continuación:

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en las que X es O y R1 es alquildiilo.

Según otro aspecto de la invención, los disolventes apróticos polares adecuados para su uso en la invención pueden elegirse de la fórmula 5 a continuación:

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en la que X es opcional y si está presente, se elige de O o S;

en la que Z es opcional y si está presente, se elige de O o S;

en la que A y B son independientemente O o N o S o parte del alquildiilo o una amina primaria; 15 en la que R es alquildiilo; y

en laqueYes O o S o C.

Se proporcionan ejemplos de los disolventes apróticos polares adecuados según la fórmula 5 en las fórmulas 6-9 a

continuación: Fórmula 6 Fórmula 7 Fórmula 8 Fórmula 9

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en la que: en la que: en la que: en la que: X no existe; Z y X son O; X no existe; X no existe; A, B y Z son O; A y B forman parte del A forma parte del A forma parte del Y es C; y alquildiilo; alquildiilo; alquildiilo; R es etano-1,2-diilo Y es S; y Y es C; Y es C;

R es butano-1,4-diilo B y Z son O; y B es metilamina; R es propano-1,3-diilo Z es O; y R es propano-1,3-diilo

El disolvente aprótico polar de la invención tiene funcionalidad lactona, sulfona, nitrilo, sulfito o carbonato. Tales 20 compuestos se distinguen por sus constantes dieléctricas relativamente altas, altos momentos dipolares y solubilidad en agua.

Según otro aspecto de la invención el disolvente aprótico polar que tiene funcionalidad lactona es γ-butirolactona (GBL), el disolvente aprótico polar que tiene funcionalidad sulfona es sulfolano (SL), el disolvente aprótico polar que tiene funcionalidad nitrilo es acetonitrilo (AN), el disolvente aprótico polar que tiene funcionalidad sulfito es sulfito de

25 glicol/sulfito de etileno (GS), y el disolvente aprótico polar que tiene funcionalidad carbonato es carbonato de etileno (EC), carbonato de propileno (PC) o tiocarbonato de etileno (ETC).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa un transcurso temporal típico para la detección de un solo locus con sondas de FISH

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Disolvente: D P H

Acetanilida: 20,6 13,3 12,4

N-Acetil-pirrrolidona: 17,8 13,1 8,3

4-Aminopiridina: 20,4 16,1 12,9

Benzamida: 21,2 14,7 11,2

Bencimidazol: 20,6 14,9 11,0

1,2,3-Benzotriazol: 18,7 15,6 12,4

Dióxido de butadieno: 18,3 14,4 6,2

Carbonato de 2,3-butileno: 18,0 16,8 3,1

Caprolactona (épsilon): 19,7 15,0 7,4

Anhídrido cloromaleico: 20,4 17,3 11,5

2-Clorociclohexanona: 18,5 13,0 5,1

Cloronitrometano: 17,4 13,5 5,5

Anhídrido citracónico: 19,2 17,0 11,2

Crotonolactona: 19,0 19,8 9,6

Ciclopropilnitrilo: 18,6 16,2 5,7

Sulfato de dimetilo: 17,7 17,0 9,7

Dimetilsulfona: 19,0 19,4 12,3

Dimetilsulfóxido: 18,4 16,4 10,2

1,2-Dinitrobenceno: 20,6 22,7 5,4

2,4-Dinitrotolueno: 20,0 13,1 4,9

Difenilsulfona: 21,1 14,4 3,4

1,2-Dinitrobenceno: 20,6 22,7 5,4

2,4-Dinitrotolueno: 20,0 13,1 4,9

Difenilsulfona: 21,1 14,4 3,4

Épsilon-caprolactama: 19,4 13,8 3,9

Cloruro de etanosulfonilo: 17,7 14,9 6,8

Furfural: 18,6 14,9 5,1

2-Furonitrilo: 18,4 15,0 8,2

Isoxazol: 18,8 13,4 11,2

Anhídrido maleico: 20,2 18,1 12,6

Malononitrilo: 17,7 18,4 6,7

4-Metoxibenzonitrilo: 19,4 16,7 5,4

1-Metoxi-2-nitrobenceno: 19,6 16,3 5,5

1-Metil-imidazol: 19,7 15,6 11,2

3-Metil-isoxazol: 19,4 14,8 11,8

N-Óxido de N-metil-morfolina: 19,0 16,1 10,2

Metil-fenilo-sulfona: 20,0 16,9 7,8

Metil-sulfolano: 19,4 17,4 5,3

4-Toluenosulfonato de metilo: 19,6 15,3 3,8

3-Nitroanilina: 21,2 18,7 10,3

2-Nitrotiofeno: 19,7 16,2 8,2

9,10-Fenantrenoquinona: 20,3 17,1 4,8

Anhídrido ftálico: 20,6 20,1 10,1

1,3-Propanosultona: 18,4 16,0 9,0

beta-Propiolactona: 19,7 18,2 10,3

2-Pirrolidona: 19,4 17,4 11,3

Sacarina: 21,0 13,9 8,8

Succinonitrilo: 17,9 16,2 7,9

Sulfanilamida: 20,0 19,5 10,7

Sulfolano: 20,3 18,2 10,9

2,2,6,6-Tetraclorociclohexanona: 19,5 14,0 6,3

Tiazol: 20,5 18,8 10,8

3,3,3-Tricloropropeno: 17,7 15,5 3,4

1,1,2-Tricloropropeno: 17,7 15,7 3,4

1,2,3-Tricloropropeno: 17,8 15,7 3,4

La tabla 2 expone una lista a modo de ejemplo de posibles productos químicos para su uso en las composiciones y los métodos de la invención basándose en sus parámetros de solubilidad de Hansen. Otros compuestos, naturalmente, también pueden satisfacer estos requisitos. Algunos de estos productos químicos se han usado en disoluciones en hibridación y/o PCR en la técnica anterior (por ejemplo, se ha usado dimetilsulfóxido (DMSO) en disoluciones de hibridación y PCR, y se ha usado sulfolano (SL) en disoluciones de PCR), pero la mayor parte no. Sin embargo, la técnica anterior no reconocía que estos compuestos puedan usarse ventajosamente para disminuir

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los tiempos y/o las temperaturas de hibridación, tal como se dan a conocer en esta solicitud. Tabla 3

Producto químico (momento dipolar): RED Punto de fusión, ºC

Carbonato de cloroetileno (4,02): 0,92 -

2-Oxazolidinona (5,07): 0,48 86-89

2-Imidazol: 1,49 90-91

1,5-Dimetil-tetrazol (5,3): ∼1,5 70-72

N-Etil-tetrazol (5,46): ∼1,5

Dióxido-sulfuro de trimetileno (4,49): - -

Sulfuro de trimetileno (3,63): - -

1,3-Dimetil-5-tetrazol (4,02): - -

Piridazina (3,97): 1,16 -8

2-Tiouracilo (4,21): - -

N-Metil-imidazol (6,2): 1,28 -

1-Nitroso-2-pirolidinona: ∼1,37 -

Etilfosfinato de etilo (3,51): - -

5-ciano-2-Tiouracilo (5,19): - -

4H-Piran-4-tiona (4,08): 1,35 32-34

4H-Piran-4-ona = gamma-pirona (4,08): 1,49 Punto de ebullición (P.E.) 80

2-Nitrofurano (4,41): 1,14 29

Alfa-Bromotetronato de metilo (6,24): - -

Óxido de tetrahidrotiapirano (4,19): 1,75 60-64

Picolinonitrilo (2-cianopiridina) (5,23): 0,40 26-28 (P.E. 212-215)

Nitrobencimidazol (6,0): 0,52 207-209

Isatina (5,76): - 193-195

N-fenil-sidnona (6,55): - -

Sulfato de glicol (etilenglicol) Nota: no es soluble al 40%: - 99ºC

No todos los productos químicos enumerados en las tablas 2 y 3 son adecuados para su uso en las composiciones y los métodos de la invención. Por ejemplo, aunque se enumera el DMSO en la tabla 2 debido a que sus parámetros 5 de solubilidad de Hansen (HSP) se encuentran dentro de los intervalos citados anteriormente, el DMSO no funciona disminuyendo los tiempos y/o las temperaturas de hibridación en las composiciones y los métodos de la invención. La composición acuosa no contiene DMSO como disolvente aprótico polar. Sin embargo, está muy dentro de los conocimientos del experto habitual examinar compuestos adecuados usando la orientación proporcionada en el presente documento incluyendo someter a prueba un compuesto en uno de los ejemplos proporcionados. Por

10 ejemplo, en algunas realizaciones, los disolventes apróticos polares adecuados tendrán HSP dentro de los intervalos citados anteriormente y una estructura mostrada en las fórmulas 1-9 anteriores.

(2) Composiciones, tampones y disoluciones

(a) Disoluciones de hibridación

Se conocen en la técnica disoluciones de hibridación tradicionales. Tales disoluciones pueden comprender, por 15 ejemplo, agentes tamponantes, agentes acelerantes, agentes quelantes, sales, detergentes y agentes de bloqueo.

Por ejemplo, los agentes tamponantes pueden incluir SSC, HEPES, SSPE, PIPES, TMAC, TRIS, SET, fosfato de potasio, ácido cítrico, pirofosfato de sodio, etc. Los agentes tamponantes pueden estar presentes a concentraciones de desde 0,5x hasta 50x. Normalmente, los agentes tamponantes están presentes a concentraciones de desde 2x hasta 10x.

20 Los agentes acelerantes pueden incluir polímeros tales como FICOLL, PVP, heparina, sulfato de dextrano, proteínas tales como BSA, glicoles tales como etilenglicol, glicerol, 1,3-propanodiol, glicerol, propilenglicol o dietilenglicol, combinaciones de los mismos tales como disolución de Dernhardt y BLOTTO, y disolventes orgánicos tales como formamida, dimetilformamida, DMSO, etc. El agente acelerante puede estar presente a concentraciones de desde el 1% hasta el 80% o de 0,1x a 10x. Normalmente, está presente formamida a concentraciones de desde el 25% hasta

25 el 75%, mientras que están presentes DMSO, sulfato de dextrano y glicol a concentraciones de desde el 5% hasta el 10%.

Los agentes quelantes pueden incluir EDTA, EGTA, etc. Los agentes quelantes pueden estar presentes a concentraciones de desde 0,1 mM hasta 10 mM. Normalmente, los agentes quelantes están presentes a concentraciones de desde 0,5 mM hasta 5 mM.

30 Las sales pueden incluir cloruro de sodio, fosfato de sodio, fosfato de magnesio, etc. Las sales pueden estar

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composición. En términos generales, la disminución de la concentración de sulfato de dextrano (la concentración tradicional es del 10%) y/o la concentración de sal puede reducir el número de fases. Sin embargo, dependiendo del disolvente aprótico polar particular y su concentración en la composición, pueden producirse monofases incluso con mayores concentraciones de sal y sulfato de dextrano. Por ejemplo, una composición que comprende bajas cantidades de EC (por ejemplo, el 15%, el 10%, el 5%) pueden funcionar bien aumentando las concentraciones de sulfato de dextrano y sal, al tiempo que mantiene todavía un sistema monofásico. En una realización particular, las composiciones que comprenden una sonda de ADN de gen HER2, una sonda de PNA de CEN7, EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%, NaCl 600 mM y tampón fosfato 10 mM existen como una fase incluso a -20ºC. En otras realizaciones, las composiciones son líquidas a -20ºC.

Algunos disolventes apróticos polares pueden producir señales más intensas en una fase u otra. Por ejemplo, el sulfito de glicol al 40% produce señales intensas en la fase inferior y no produce señales en la fase superior. De manera similar, determinados tipos de sondas pueden producir señales más intensas en una fase u otra. Por ejemplo, las sondas de PNA tienden a mostrar señales más intensas en la fase inferior fase que en la fase superior.

Por consiguiente, los sistemas multifásicos de la invención pueden usarse para examinar convenientemente diferentes aspectos de una muestra. Por ejemplo, podría usarse un sistema bifásico para separar muestras marcadas con sondas de PNA de muestras marcadas con sondas de ADN. Otros usos incluyen el aislamiento de una fase específica que presenta, por ejemplo, determinadas ventajas en la hibridación de manera que puede usarse la fase aislada como sistema monofásico. La sonda y/o muestra puede añadirse antes de, o después del aislamiento de una fase particular.

Pueden realizarse hibridaciones con una composición monofásica de la invención, con fases individuales de las composiciones multifásicas de la invención, o con mezclas de una cualquiera o más de las fases en una composición multifásica de la invención. Por ejemplo, en un sistema monofásico, puede extraerse un volumen de la muestra para su uso en la hibridación. En un sistema multifásico, puede extraerse un volumen de muestra de la fase de interés (por ejemplo, la fase superior, inferior o central) para usarse en la hibridación. Alternativamente, las fases en un sistema multifásico pueden mezclarse antes de extraerse un volumen de la muestra mixta para su uso en la hibridación. Sin embargo, el sistema multifásico puede producir una tinción de fondo local intensa e irregular dependiendo de la composición. Aunque la adición de bajas cantidades de formamida reducirán el fondo en un sistema monofásico, tiene poco efecto sobre un sistema multifásico con altas concentraciones (por ejemplo, el 40%) de un disolvente aprótico polar. Además, a medida que aumenta la concentración de formamida, se requieren mayores concentraciones de sonda y/o tiempos de hibridación más largos para mantener una fuerte intensidad de señal.

(c) Optimización para aplicaciones particulares

Las composiciones de la invención pueden variarse para optimizar los resultados para una aplicación particular. Por ejemplo, la concentración de disolvente aprótico polar, sal, agente acelerante, agente de bloque e iones de hidrógeno (es decir pH) pueden variarse para mejorar los resultados para una aplicación particular.

Por ejemplo, la concentración de disolvente aprótico polar puede variarse para mejorar la intensidad de señal y la tinción de fondo. Generalmente, a medida que aumenta la concentración de disolvente aprótico polar, disminuye la intensidad de señal y disminuye la tinción de fondo. Por ejemplo, las composiciones que comprenden EC al 15% tienden a mostrar señales más intensas y menos fondo que las composiciones que comprenden EC al 5%. Sin embargo, puede mejorarse la intensidad de señal para composiciones que tienen bajas concentraciones de disolvente aprótico polar (por ejemplo, del 0% al 20%) si se aumentan las concentraciones de sal y/o sulfato de dextrano. Por ejemplo, pueden observarse señales intensas con EC a del 5% al 10% cuando la concentración de sal se eleva aproximadamente de 8 a 16 veces las concentraciones de sal tradicionales (es decir, aproximadamente NaCl 1200 mM, tampón fosfato 20 mM). Asimismo, a medida que se usan menores concentraciones de disolvente aprótico polar, generalmente se requieren mayores concentraciones de sulfato de dextrano para mantener buena intensidad de señal y fondo.

Por consiguiente, las concentraciones de sal y sulfato de dextrano también pueden variarse para mejorar la intensidad de señal y la tinción de fondo. Generalmente, a medida que aumentan las concentraciones de sal y sulfato de dextrano, aumenta la intensidad de señal y disminuye el fondo. Por ejemplo, concentraciones de sal que son aproximadamente de dos a cuatro veces las concentraciones tradicionales (es decir, NaCl 300 mM, tampón fosfato 5 mM) producen señales más intensas y bajo fondo. Sin embargo, sorprendentemente se produce hibridación usando las composiciones de la invención incluso en ausencia completa de sal. Pueden mejorarse las intensidades de señal en condiciones sin sal aumentando las concentraciones de agente acelerante y/o disolvente aprótico polar.

Asimismo, la intensidad de señal aumenta a medida que aumenta la concentración de sulfato de dextrano desde el 0% hasta el 20%. Sin embargo, pueden observarse buenas señales incluso a concentraciones de sulfato del 0%. Puede mejorarse la intensidad de señal en condiciones de baja concentración de sulfato de dextrano aumentando las concentraciones de disolvente aprótico polar y/o sal.

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Además, las sondas tipo usadas en las composiciones de la invención pueden variarse para mejorar los resultados. Por ejemplo, en algunos aspectos de la invención, combinaciones de sondas de ADN/ADN pueden mostrar menos fondo que combinaciones de ADN/sondas de PNA en las composiciones de la invención o viceversa. Por otra parte, las sondas de PNA tienden a mostrar señales más intensas que las sondas de ADN a bajas concentraciones de sal

5 y/o bajas concentraciones de disolvente aprótico polar. De hecho, las sondas de PNA también muestran señales cuando no está presente disolvente aprótico polar, mientras que las sondas de ADN muestran señales débiles o no muestran señales sin disolvente aprótico polar.

II. Kits

La presente invención también proporciona kits que comprenden composiciones de la invención. Por tanto, un kit

10 puede comprender una o más sondas moleculares (tal como se desarrolló anteriormente) y una composición acuosa (tal como se desarrolló anteriormente). En una realización, la sonda no se visualiza fácilmente (por ejemplo, porque no está marcada con un fluoróforo o cromóforo), y el kit comprende además un reactivo de visualización, tal como, por ejemplo, un anticuerpo (que puede ser monoclonal, y que puede estar marcado con un marcador detectable), un sustrato enzimático fluorogénico o cromogénico, un conjugado de estreptavidina, o cualquier otro reactivo de

15 visualización adecuado conocido por el experto en la técnica.

En una realización, el kit comprende además otros reactivos y/o composiciones que pueden usarse para detectar una aberración cromosómica. En una realización, un kit puede comprender además una proteasa, tal como, por ejemplo, pepsina o proteinasa K. En una realización, un kit puede comprender además una o más de una disolución de pretratamiento, proteasa, tampón de lavado de rigurosidad, medio de montaje para fluorescencia, tampón de 20 lavado, disolución de amplificación de señales y sellador de cubreobjetos. Por ejemplo, en una realización, un kit de FISH para citología puede comprender además uno o más de tampón de lavado, tampón de rigurosidad, medio de montaje para fluorescencia y sellador de cubreobjetos. En una realización, un kit de FISH para histología puede comprender además uno o más de disolución de pretratamiento, pepsina, tampón de lavado, tampón de rigurosidad, medio de montaje para fluorescencia y sellador de cubreobjetos. En una realización, un kit de CISH puede

25 comprender además bloqueo de peroxidasa, mezcla de anticuerpos para CISH, un tampón de sustrato rojo, un tampón de sustrato azul, un cromógeno rojo y un cromógeno azul. En otra realización, un kit puede comprender además instrucciones.

III. Aplicaciones, métodos y usos

La invención proporciona además métodos de uso de las composiciones y los kits descritos anteriormente para la

30 detección de aberraciones cromosómicas, el diagnóstico de una enfermedad, la monitorización del progreso del tratamiento terapéutico, la monitorización de un paciente que ha completado el tratamiento para detectar la reaparición de una enfermedad. En general, tales métodos usan una o más de las condiciones de hibridación descritas a continuación.

Por ejemplo, la invención proporciona un método de detección de una aberración cromosómica usando

35 composiciones de la invención. La detección puede ser relevante para el diagnóstico, la selección de un tratamiento apropiado y/o la monitorización de una paciente para detectar la reaparición de una enfermedad.

Específicamente, la invención proporciona un método de determinación de la presencia de una aberración cromosómica en una secuencia de ácido nucleico, comprendiendo el método:

-proporcionar al menos una sonda molecular,

40 -proporcionar la secuencia de ácido nucleico,

-proporcionar una composición acuosa que comprende

sulfato de dextrano a una concentración del 10% al 30%,

cloruro de sodio a una concentración de 300 mM a 1200 mM y/o

fosfato de sodio a una concentración de 5 mM a 20 mM, y

45 al menos un disolvente aprótico polar en una concentración de desde el 1% (v/v) hasta el 30% (v/v), preferiblemente de desde el 10% (v/v) hasta el 20% (v/v), en el que el disolvente aprótico polar tiene funcionalidad lactona, sulfona, sulfito, nitrilo y/o carbonato,

-combinar la sonda molecular y la secuencia de ácido nucleico y la composición acuosa al menos durante un periodo de tiempo suficiente para hibridar la sonda molecular y la secuencia de ácido nucleico, y

50 -detectar la al menos una sonda molecular, y

-determinar la presencia de la aberración cromosómica.

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I) etilenglicol al 1% (1.09621, Merck) J) glicerol al 1% (1.04095, Merck) K) 1,3-propanodiol al 1% (533734, Aldrich) L) H2O al 1% (control) Estaban presentes todas las muestras como monofase. Se incubaron las sondas a 82ºC durante 5 minutos y luego a 45ºC con secciones tisulares FFPE durante 60 y 120 minutos. Resultados:

Bloqueo del fondo: Hibridación/min Fondo Intensidad de señal ADN PNA

PNA de bloqueo: 60 +1 3 2,5

PNA de bloqueo: 120 +1-1,5 3 2,5

COT-1: 60 +0,5 3 2,5

COT-1: 120 +0-0,5 3 2,5

THD: 60 +0 3 3

THD: 120 +0,5 3 2,5

ADN de esperma de salmón: 60 +0 3 3

ADN de esperma de salmón: 120 +0 3 3

ADN de timo de ternero: 60 +0 2,5 3

ADN de timo de ternero: 120 +0,5 3 2,5

ADN de esperma de arenque: 60 +0 3 3

ADN de esperma de arenque: 120 +0,5 2,5 3

Formamida al 0,5%: 60 +0 2,5 3

Formamida al 0,5%: 120 +0 3 3

Formamida al 2%: 60 +0,5 2,5 3

Formamida al 2%: 120 +0,5 3 3

Etilenglicol al 1%: 60 +0,5 2,5 3

Etilenglicol al 1%: 120 +1,5 3 2,5

Glicerol al 1%: 60 +0,5 0,5 3

Glicerol al 1%: 120 +1 3 2,5

1,3-Propanodiol al 1%: 60 +0 3 2,5

1,3-Propanodiol al 1%: 120 +1 3 2,5

Nada: 60 +1 2,5 2,5

Nada: 120 +1,5 3 2,5

NOTA: todos los agentes de reducción del fondo, excepto PNA de bloqueo, mostraron un efecto en la reducción del fondo. Por tanto, no se requiere un bloqueo específico contra secuencias de ADN repetitivas.

10 Ejemplo 17

Este experimento compara la intensidad de señal de las fases superior e inferior usando dos disolventes apróticos polares diferentes.

Composición de la sonda para FISH I: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampón fosfato 5 mM, tritiocarbonato de etileno (ET) al 40% (E27750, Aldrich), PNA de bloqueo 5 µM, sonda de ADN del gen CCND1

15 marcada con Texas Red 10 ng/µl.

Composición de la sonda para FISH II: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampón fosfato 5 mM, sulfito de glicol (GS) al 40% (G7208, Aldrich), PNA de bloqueo 5 µM, sonda de ADN del gen CCND1 marcada con Texas Red 10 ng/µl.

Se incubaron las sondas para FISH a 82ºC durante 5 min y luego a 45ºC durante 60 minutos.

20 Resultados:

Intensidad de señal

I (ET): II (GS)

Fase superior: 1,5 0

Fase inferior: 0 3 5

Mezcla de fases superior e inferior: 2,5 3

Ejemplo 18.

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Este experimento examina la capacidad de diversos disolventes apróticos polares para formar un sistema

monofásico. Todas las composiciones contenían: sulfato de dextrano al 20%, NaCl 600 mM, tampón fosfato 10 mM, y o bien el 10, el 15, el 20 o bien el 25% de uno de los siguientes disolventes apróticos polares:

sulfolano γ-butirolactona tritiocarbonato de etileno sulfito de glicol carbonato de propileno Resultados: Todos los disolventes apróticos polares a todas las concentraciones examinadas produjeron al menos

un sistema bifásico en las composiciones usadas. Sin embargo, esto no excluye que estos compuestos puedan producir un sistema monofásico en las condiciones de otras composiciones.

Ejemplo 19 Este experimento examina el uso de las composiciones de la invención en el análisis de hibridación in situ cromogénica (CISH) en múltiples secciones tisulares FFPE.

Composición de la sonda para FISH I: sonda de ADN del gen TCRAD marcada con FITC 4,5 ng/µl (1/4 de la concentración convencional) (RP11-654A2, RP11-246A2, CTP-2355L21, RP11-158G6, RP11-780M2, RP11481C14; tamaño de 1018 kb); EC al 15%; sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampón citrato 10 mM, pH 6,0.

Composición de la sonda para FISH II: sonda de ADN del gen TCRAD marcada con FITC 4,5 ng/µl (1/4 de la concentración convencional) (tamaño de 1018 kb); EC al 15%; sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampón citrato 10 mM, pH 6,0; ADN de esperma de salmón fragmentado 0,1 ug/ul.

Composición de la sonda para FISH III: 300 nM de cada sonda de PMA de CEN17 marcada con FITC individual (1/2 de la concentración convencional); EC al 15%; sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampón citrato 10 mM, pH 6,0.

Se analizaron todas las muestras usando el protocolo DuoCISH de Dako (SK108) y composiciones para sondas divididas con la excepción de que el lavado de rigurosidad se realizó durante 20 minutos en lugar de 10 minutos, y sin el uso de la etapa con cromógeno rojo de DuoCISH.

Resultados: NOTA: Las intensidades de la señal eran muy intensas. Debido a los altos niveles de fondo, no fue posible discriminar si la adición de ADN de esperma de salmón en la composición II reducía el fondo. Las señales eran claramente visibles usando un objetivo de 10x por ejemplo en amígdalas, que en general tenían menos fondo. Si los tejidos presentaban alto fondo, las señales eran claramente visibles usando un objetivo de 20x.

Intensidad de la señal

Composición: FITC ADN FITC PNA

I: 3 -

II: 3 -

III: - 3

Ejemplo 20

Este ejemplo compara la intensidad de señal y el fondo de secciones tisulares FFPE tratadas con las composiciones de la invención con dos sondas de ADN.

Composición de la sonda para FISH I: sonda de ADN del gen IGH marcada con FITC 9 ng/µl (RP11-151B17, RP11112H5, RP11-101G24, RP11-12F16, RP11-47P23, CTP-3087C18; tamaño de 612 kb); sonda de ADN de MYC marcada con Texas Red 6,4 ng/µl (CTD-2106F24, CTD-2151C21, CTD-2267H22; tamaño de 418 kb); EC al 15%; sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampón citrato 10 mM, pH 6,0.

Composición de la sonda para FISH II: sonda de ADN del gen IGH marcada con FITC 9 ng/µl; sonda de ADN de MYC marcada con Texas Red 6,4 ng/µl; EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampón citrato 10 mM, pH 6,0; ADN de esperma de salmón fragmentado 0,1 ug/ul.

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Claims

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