JP2001501825A - マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の検出のための新規プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 試料中に随時存在する１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配列を検出するための、新規なハイブリダイゼーション測定プローブおよびそのようなプローブの混合物。このプローブは、好ましくはマイコバクテリアｒＤＮＡ、前駆体ｒＲＮＡ、またはｒＲＮＡの標的配列に向けられ、該プローブは検出可能なハイブリッドを形成することができる。このプローブは、喀痰、喉頭ぬぐい液、胃洗浄液、気管支洗浄液、生検試料、吸引液、唾液、体液（脊髄液、胸水、心膜液、関節液、血液、膿、骨髄液）、尿、組織切片、ならびに食物試料、土壌、空気、および水試料、およびこれらの培養物のような試料中の生物を検出するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 マイコバクテリア（Mycobacteria）の検出のための新規プローブ 本発明は、１つまたはそれ以上のマイコバクテリア（Mycobacteria）の標的配 列を検出するための新規プローブおよびこのようなプローブの混合物、ならびに このような新規プローブまたはその混合物の設計、作成および使用に関し、この プローブは、検体、例えば、喀痰、喉頭ぬぐい液、胃洗浄液、気管支洗浄液、生 検試料、吸引液、唾液、体液（脊髄液、胸水、心膜液、関節液、血液、膿、骨髄 液）、尿、組織切片、ならびに食物試料、土壌、空気、および水試料およびこれ らの培養物中に随時存在するこのような生物を検出することができる。本発明は 特に、結核菌複合体（Mycobacterium tuberculosis Complex）（ＭＴＣ）の１つ またはそれ以上のマイコバクテリアの有無の検出、および、結核菌複合体のマイ コバクテリア以外の１つまたはそれ以上のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）の有無 の検出のための、新規プローブおよびその混合物に関する。本発明はさらに、１ つまたはそれ以上のこのようなプローブを含む診断キットに関する。本発明のプ ローブは驚くべきことに、マイコバクテリアの細胞壁を通過することができ、従 って迅速で実施の容易なｉｎ ｓｉｔｕプロトコールの開発を可能にする。 発明の背景 結核は、結核菌の感染により引き起こされる、生命を脅かすかつ流行性の疾患 である。結核は現在世界的に、発病と死亡の主要な感染性の原因であり、毎年約 ３００万人の死亡を引き起こしていると予測されている。ＷＨＯの推定では、結 核の１年間の新しい症例数は１９９０年の７５０万から２０００年の１０２０万 に増加すると予測し、これはこの１０年間に約９０００万の新しい症例が発生す ることを意味する。さらに１９９０年代に３０００万人が結核により死亡すると 予測され、これは成人の予防可能な死亡数の４分の１に等しい。 これまで結核の流行は、アジア、アフリカおよび南アメリカのような世界の貧 乏な国で高かったが、近年は文明国でも増加している。これは、人口の移動パタ ーン、結核プログラムや栄養プログラムが整備されていないことなどの種々の要 因が相互に影響しているためと考えられる。さらに、薬剤耐性またはさらに悪い ことには多剤耐性である新しい株の出現により、深刻な脅威が発生するであろう 。 マイコバクテリアはしばしば、結核菌マイコバクテリアすなわち結核菌複合体 （Mycobacterium tuberculosis Complex）のマイコバクテリア（ＭＴＣ）と、結 核菌複合体（Mycobacterium tuberculosis Complex）のマイコバクテリア以外の マイコバクテリア（ＭＯＴＴ）に分類される。ＭＴＣ群は、結核菌（M．tubercu losis）以外に、マイコバクテリウム・ボビス（M．bovis）、マイコバクテリウ ム・アフリカヌム（M．africanum）、およびマイコバクテリウム・ミクロチ（M ．microti）を含む。ＭＯＴＴ群のマイコバクテリアは、健常人にとっては通常 病原性はないが、免疫力の低下した人（例えば、ＨＩＶに感染した人）では疾患 を引き起こすことがある。ＭＯＴＴ群の臨床的に関係のあるマイコバクテリアは 、特にマイコバクテリウム・アビウム（M．avium）、マイコバクテリウム・イン トラセルラレ（M．intracellulare）、マイコバクテリウム・カンサシイ（M．ka nsasii）、およびマイコバクテリウム・ゴルドナエ（M．gordonae）だけでなく 、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（M．scrofulaceum）、マイコバクテ リウム・ゼノピ（M．xenopi）、およびマイコバクテリウム・ホルツイツム（M． fortuitum）がある。 マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）とマイコバクテリウム・イントラ セルラレ（M．intracellulare）はマイコバクテリウム・パラツベルクロシス（M ．paratuberculosis）およびマイコバクテリウム・レプラエムリウム（M．lepra emurium）とともに、マイコバクテリウム・アビウム複合体（Mycobacterium avi um Comples）（ＭＡＣ）を構成する。マイコバクテリウム・スクロフラセウム（ M．scrofulaceum）で拡張すると、複合体（Mycobacterium avium-intracellular e-scrofulaceum Complex）この群は、マイコバクテリウム・アビウム−イントラ セルラレ−スクロフラセウム（ＭＡＩＳ）と呼ばれる。 マイコバクテリア感染を抗体で治療すると、薬剤耐性株が現れることはよく知 られている。多くの抗生物質は、タンパク質合成または転写を妨害することによ りその作用を示す。臨床的マイコバクテリア分離株のいくつかの薬剤耐性表現型 の背後にある分子的機構の研究は、ｒＲＮＡ遺伝子の突然変異を明らかにした。 増殖の遅いマイコバクテリアはｒＲＮＡオペロンを１つしか持たないため、ｒＲ ＮＡ遺伝子中に位置する突然変異による耐性が出現しやすい。すべてのマイコバ クテリア集団は、自発的突然変異により発生した少数の薬剤耐性突然変異体を含 む。これらの突然変異マイコバクテリアは、通常はよく生存できないが、治療薬 として単一の薬剤治療法が行われると、薬剤に耐性の細菌が死滅し、耐性変異体 のみが生き残り増殖して、ある時点でマイコバクテリア集団の大部分を構成する ようになる。不十分な薬剤治療法による薬剤耐性細菌の淘汰は、いわゆる「獲得 性（acquired）薬剤耐性」の状態を引き起こす。これに対して「一次（primary ）薬剤耐性」は、それまでマイコバクテリア感染の治療を受けたことがない患者 から薬剤耐性マイコバクテリアを単離することができ、獲得性薬剤耐性細菌に感 染している患者の薬剤耐性マイコバクテリアで感染されるようになった状態を示 すのに使用される。 今日薬剤耐性は、主に臨床試料を培養して表現型により測定され、ここで個々 の薬剤の存在下でマイコバクテリアの存在が証明される。しかしこれは、薬剤耐 性試験の結果がマイコバクテリア（これは増殖が遅いことが知られている）の増 殖速度に依存するため、残念ながら非常に遅く時間のかかる方法である。すなわ ち、結果は数週間後まで入手できない。 薬剤耐性の頻度は、少なくともいまのところそれほど頻繁ではないが、耐性株 が同定され撲滅されることが非常に重要である。従って、薬剤耐性を診断するた めの信頼できかつ迅速に実施できる方法を見いだすことが非常に重要である。 現在顕微鏡を用いるマイコバクテリアの検出が、診断のための最も普及してい る方法である。試料（例えば、唾液）を、例えばチールニールゼン染色法（Zieh l-Neelsen staining）により染色して抗酸菌の存在について調べる。しかし抗酸 菌の染色は、感染の型について必要な情報を提供せず、試料中に抗酸菌が存在す るかどうかを示すのみであり、これ自身は診断を確立するのには充分な情報では ない。抗酸菌について陽性の試料は次に、培養して種を同定してもよい。 チールニールゼン染色では、感染がＭＴＣ群のマイコバクテリアにより引き起 こされたのかまたはＭＴＣ群のマイコバクテリア以外のマイコバクテリアにより 引き起こされたのか決定するために使用できないため、染色結果が陽性の場合は 、 結核菌（M．tuberculosis）感染が疑われるすべての患者の非常に費用のかかる 隔離と、患者が応答しないかも知れない薬剤による治療が行われる。 抗酸性染色の感度は、塗抹試料mlあたりわずかに約１０⁴−１０⁵であるため、 陰性試料はまた、より好感度で試料あたり１０〜１００個の微生物を検出するこ とができる培養ベースの試験のために、培養しなければならない。しかし結果は ８週間の培養後まで入手できない。同様に薬剤感受性についての情報は、１〜３ 週間のさらなる試験後でないと入手できない。 マイコバクテリア含有試料の培養には、異なる固体または液体培地（ロウエン スタイン・ジェンセン斜面培地（Loewenstein Jensen slants）およびデュボス 液体培地（Dubos broth））が伝統的に使用されている。より新しい培地には、 ＥＳＰマイコカルチャーシステム（ESP Myco Culture System）（ディフコ（Dif co））、エムビー・バクト（ＭＢ／ＢａｃＴ）（オルガノン・テクニカ（Organo n Teknika））、バクテック（ＢａｃＴｅｃ）（ベクトンディッキンソン（Becto n Dickinson））およびエムジーアイティー（ＭＧＩＴ）（ベクトンディッキン ソン（Becton Dickinson））がある。これらの検査培地は、マイコバクテリアの 代謝により産生される二酸化炭素または酸素の比色的または蛍光的検出に基づき 、大規模検査のための自動化システムに適合している。 種の同定は現在、伝統的な生化学的方法またはプローブハイブリダイゼーショ ン測定法（例えば、ジーンプローブ社（Gene-Probe Inc.）（米国）のアキュプ ローブ（AccuProbe））を使用して培養することにより行われている。従って、 ＭＴＣ群のマイコバクテリアとＭＴＣ群以外のマイコバクテリアの間のより迅速 な区別を可能にし、特にＭＴＣ群のマイコバクテリア以外のマイコバクテリアの 種のさらなる同定を可能にする手段に対するニーズが増加している。 培養ベースの方法に変わる新しい方法の多くは、分子的増幅技術に依存してい る。いくつかの方法が出現しており、中でもポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ ）、リガーゼチェイン反応および転写介在増幅がある。増幅方法の基本的原理は 、マイコバクテリアの特異的核酸配列を増幅して、アンプリコオンが検出できる レベルまで特異的配列のコピー数を増加させることである。原理的には、この方 法は、１つのみの標的配列を検出する可能性を与え、従って原理的には、低レ ベルで存在するマイコバクテリアの検出を可能にする。しかし標的増幅法では、 抗酸菌（ＡＦＢ）染色により陽性の試料のみしか満足できる感度を与えないため 、この方法は培養ベースの方法に取って代わることができないことが明らかにな った。さらに各方法には具体的な問題が存在する。ＰＣＲ法は、ヘモグロビンの ようなインヒビターの存在のために偽陰性の結果を与えることがある。もう１つ の問題は、検査室環境での陰性の検体および／または試薬と増幅された核酸との 交差汚染から生じ、これは偽陽性の結果につながる。欠点は、これらの検査の実 施には高価な試薬が必要であることである。さらに特殊な装置が必要であり、こ れらの検査は主に大きな特殊検査室で有用であり、より小さな臨床検査室には応 用できない。 マイコバクテリアのｒＲＮＡを検出するための核酸プローブは、例えばＵＳ５ ５４７８４２号、ＥＰ−Ａ０５７２１２０号、およびＵＳ５４２２２４２号に記 載されている。 この疾患の将来と影響を考えると、迅速で好ましくは実施が容易なかつさらに 経済的に実施可能な診断検出検査の開発は非常に重要であり、結核の流行に対す る戦いにおいて有用な手段となるであろう。 ペプチド核酸は、ＤＮＡ結合能を有する偽ペプチドである。この化合物は、最 初、配列特異的にＤＮＡおよびＲＮΛにハイブリダイズすることができるヌクレ オチド類似体を設計しようという一連の試みの中で、１９９０年代初期に報告さ れた（ＷＯ９２／２０７０２号を参照）。 ＤＮＡおよびＲＮＡへのペプチド核酸プローブのハイブリダイゼーションは、 ワトソン−クリック塩基対合則に従うことが証明されており、ペプチド核酸プロ ーブは、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的に、対応する核酸よりも強い親和性と特異性で ハイブリダイズすることが見いだされている。これらの性質は、それぞれペプチ ド核酸およびＤＮＡまたはＲＮＡ骨格の（荷電構造ではなく）非荷電構造に帰因 し、かつペプチド核酸分子のコンフォメーションの高い柔軟性に帰因する。これ らの特徴は、（通常ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を分解する天然に存在する 種々のヌクレアーゼやプロテアーゼに対するペプチド核酸の、報告されている安 定性とともに）アンチセンス治療用物質としてのペプチド核酸プローブの使用を 招来し、診断薬における重要な応用の可能性を開く。 発明の概要 本発明は、試料中に随時存在する１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標 的配列を検出するための新規なペプチド核酸プローブおよびこのようなプローブ の混合物に関する。請求の範囲第１項において、プローブは、マイコバクテリア ｒＲＮＡ、該ｒＲＮＡ（ｒＤＮＡ）に対応するゲノム配列、および前駆体ｒＲＮ Ａの標的配列に向けられている。ｒＲＮＡは抽出物細胞中に多数のコピーが存在 し、従って充分適した標的である。プローブは請求の範囲第２項に定義されるよ うに、マイコバクテリアｒＤＮＡ、前駆体ｒＲＮＡ、または２３Ｓ、１６Ｓもし くは５Ｓ ｒＲＮＡの標的配列に向けられている。 すなわち第１の面において本発明は、請求の範囲第１項および第２項の１つま たはそれ以上のマイコバクテリアの標的配列を検出するための、ハイブリダイゼ ーション測定プローブおよびこのようなプローブの混合物を特徴とする。適切な 厳密性条件下でこのようなプローブは、試料中に存在する他の関係のない微生物 （特に、他のマイコバクテリア）からのリボゾーム核酸と、有意な程度に交差反 応してはならない。試料中に存在する可能性のない微生物に対する交差反応は、 重要ではない。顕微鏡による観察を含むｉｎ ｓｉｔｕ測定法ではさらに、これ らの桿菌の形態に基づいて、マイコバクテリアを他の細菌から区別することがで きる。 本発明はまた、標的配列を得るための請求の範囲第３項の、およびプローブを 得るための請求の範囲第４項のペプチド核酸プローブに関する。 別の面において本発明は、ＭＴＣ群の１つまたはそれ以上のマイコバクテリア 、およびＭＴＣ群のマイコバクテリア以外の１つまたはそれ以上のマイコバクテ リアの標的配列を検出するための新規なペプチド核酸プローブに関し、このプロ ーブは、６〜３０個の重合したペプチド核酸残基を含む（請求の範囲第５項）。 式（Ｉ）の適切なプローブは、請求の範囲第６項で特許請求される。 請求の範囲第７〜１０項および１５〜２４項は、ＭＴＣ群の１つまたはそれ以 上のマイコバクテリアの標的配列を検出するためのプローブまたはそのようなプ ローブの混合物に関する。請求の範囲第１１〜１３項および第１５〜２４項は、 ＭＴＣ群のマイコバクテリア以外の１つまたはそれ以上のマイコバクテリア（Ｍ ＯＴＴ群）の標的配列を検出するためのプローブまたはそのようなプローブの混 合物に関する。請求の範囲第１４項は特に、薬剤耐性マイコバクテリアを検出す るためのプローブに関する。請求の範囲第２５〜２７項は、そのようなプローブ またはその混合物の使用に関する。 請求の範囲第２８〜３４項において、本発明はまた、マイコバクテリアの存在 を検出するための方法に関する。 さらに別の面において本発明は、請求の範囲第１〜第２４項に定義される少な くとも１つのペプチド核酸プローブを含むキット（請求の範囲第３５および３６ 項）に関する。 マイコバクテリアは、ミオリック酸（myolic acids）、複合ロウ、およびユニ ークな糖脂質を含有する、複雑な細胞壁を特徴とする。この細胞壁は、他の細菌 と比較してマイコバクテリアに、化学的および物理的ストレスに対する極度の耐 性を与え、従ってこれらを貫通し溶解することを非常に困難にしていることは、 当業者に一般的に認められている。細胞壁の低透過性は、結核や他のマイコバク テリア感染の治療において有効な薬剤が非常に少ないという事実の大きな理由で ある。ＵＳ５５８２９８５号に記載のように、細胞壁は、核酸プローブによる貫 通をさらに防止するようである。短いプローブ（３０核酸より短い）でさえ、特 異的染色は低いかまたはしばしば存在しない。マイコバクテリア種へのｉｎ ｓ ｉｔｕハイブリダイゼーションにＤＮＡプローブを使用することを可能にするプ ロトコールは、ＵＳ５５８２９８５号に記載されている。しかしこれらのプロト コールは、マイコバクテリアの細胞壁をＤＮＡプローブに対して透過性にするた めに、ハイブリダイゼーション工程の前に、キシレンによるマイコバクテリア細 胞壁の脱ロウと酵素処理を必要とする。 驚くべきことに上記の問題は、ペプチド核酸プローブを使用することにより完 全に解決される。驚くべきことに、ペプチド核酸プローブはマイコバクテリアの 細胞壁を貫通することができ、さらにこれは迅速に起きることがわかった。当業 者は、ハイブリダイゼーションを実施する前にマイコバクテリアを充分に処理す ることが必要であるという結論に達していたであろう。すなわち入手できる先行 技術に基づくと、マイコバクテリアの細胞壁をあらかじめ破壊しないでハイブリ ダイゼーションを実施することは好ましくないという強い偏見がある。本発明は 、これが確実にかつ予想外に可能であることを証明している。本発明のプローブ は、マイコバクテリア細胞にきびしい処理をすることなく、マイコバクテリアの 前駆体ｒＲＮＡおよびｒＲＮＡにハイブリダイゼーションすることができ、従っ て細胞の形態を妨害するリスクを避けることができることを証明した。本発明の 方法を使用して、具体的かつ容易な検出、従って結核および他のマイコバクテリ ア感染症の診断が可能である。 図面の簡単な説明 ２３Ｓ、１６Ｓおよび／または５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子について、結核菌（M．t uberculosis）（ＭＴＣ群の代表として）およびこれに密接に関連する重要な種 （マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）（ＭＴＣ群のマイコバクテリア以 外のマイコバクテリアの代表として）およびこれに密接に関連する重要な種を含 む）のｒＤＮＡの整列が、作成されている（図１Ａ〜１Ｊ、２Ａ〜２Ｄ、３、４ Ａ〜４Ｌ、および５Ａ−Ｂ）。マイコバクテリウム・ボビス（M．bovis）とマイ コバクテリウム・イントラセルラレ（M．intracellulare）の整列は、一部は公 表されている配列に基づき、一部はダコ社（DAKO A/S）で行われた配列決定によ り得られた配列に基づく。 ＭＴＣ群（２３Ｓ ｒＤＮＡ）の整列 図１Ａ〜１Ｊは、結核菌（M．tuberculosis）（ジーンバンク（GenBank）エン トリーＧＢ：ＭＴＣＹ１３０、受け入れ番号Ｚ７３９０２）、マイコバクテリウ ム・アビウム（M．avium）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＡ２ ３ＳＲＮＡ、受け入れ番号Ｘ７４４９４）、マイコバクテリウム・パラツベルク ロシス（M．paratuberculosis）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：Ｍ ＰＡＲＲＮＡ、受け入れ番号Ｘ７４４９５）、マイコバクテリウム・フレイ（M ．phlei）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＰ２３ＳＲＮＡ、受け 入れ番号Ｘ７４４９３）、マイコバクテリウム・レプラエ（M．leprae）（ジー ンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＬ５Ｓ２３Ｓ、受け入れ番号Ｘ５６６ ５７）、マイコバクテリウム・ガストリ（M．gastri）（ジーンバンク（GenBank ） エントリーＧＢ：ＭＧ２３ＳＲＲＮＡ、受け入れ番号Ｚ１７２１１）、マイコバ クテリウム・カンサシイ（M．kansasii）（ジーンバンク（GenBank）エントリー ＧＢ：ＭＫ２３ＳＲＲＮＡ、受け入れ番号Ｚ１７２１２）、およびマイコバクテ リウム・スメグマチス（M．smegmatis）（ＧＢ：ＭＳ１６Ｓ２３Ｓ５、受け入れ 番号Ｙ０８４５３）の２３Ｓ ｒＤＮＡ配列の整列を示す。好適なペプチド核酸 プローブは、整列の１４９〜１５８、２２０〜２２１、３２８〜３６１、４５３ 〜４５５、４９０〜５０１、６３７〜６６０、７０６〜７１２、７６２〜７８９ 、９８９、１０６８〜１０７２、１１４８、１３１１〜１３２９、１３６１〜１ ３６４、１４１８、１５６３〜１５７０、１６２７〜１６３８、１６７５〜１６ ７７、１７１８、１７３４〜１７４０、１９６７〜１９７６、２４０３〜２４２ ０、２４５７〜２４８８、２９５２〜２９５６、２９６６〜２９６９、３０００ 〜３００３、および３０９７〜３１０６位（太線の枠で示す）内の、結核菌（M ．tuberculosis）２３Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオ塩基に相補的な少なくとも１つの ヌクレオ塩基を包含する。整列内のマイコバクテリウム・アビウム（M．avium） 、マイコバクテリウム・レプラエ（M．leprae）、マイコバクテリウム・パラツ ベルクロシス（M．paratuberculosis）、マイコバクテリウム・ガストリ（M．ga stri）、およびマイコバクテリウム・カンサシイ（M．kansasii）の配列と、結 核菌（M．tuberculosis）の配列との差を、細線の枠で示す。 ＭＴＣ群（１６Ｓ ｒＤＮＡ）の整列 図２Ａ〜２Ｄは、結核菌（M．tuberculosis）（ジーンバンク（GenBank）エン トリーＧＢ：ＭＴＵ１６ＳＲＮ、受け入れ番号Ｘ５２９１７）、マイコバクテリ ウム・ボビス（M．bovis）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＳＧ ＴＧＤＡ、受け入れ番号Ｍ２０９４０）、マイコバクテリウム・アビウム（M．a vium）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＳＧＲＲＤＡ、受け入れ 番号Ｍ６１６７３）、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（M．intracellul are）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＩＮ１６ＳＲＮ、受け入れ 番号Ｘ５２９２７）、マイコバクテリウム・パラツベルクロシス（M．paratuber culosis）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＳＧＲＲＤＨ、受け入 れ番号Ｍ６１６８０）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム （M．scrofulaceum）（ジーンバンク（Gen Bank）エントリーＧＢ：ＭＳＣ１６ ＳＲＮ、受け入れ番号Ｘ５２９２４）、マイコバクテリウム・レプラエ（M．lep rae）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＬＥＰ１６Ｓ１、受け入れ 番号Ｘ５５５８７）、マイコバクテリウム・カンサシイ（M．kansasii）（ジー ンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＫＲＲＮ１６、受け入れ番号Ｘ１５９ １６）マイコバクテリウム・ガストリ（M．gastri）（ジーンバンク（GenBank） エントリーＧＢ：ＭＧＡ１６ＳＲＮ、受け入れ番号Ｘ５２９１９）、マイコバク テリウム・ゴルドナエ（M．gordonae）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧ Ｂ：ＭＳＧＲＲ１６Ｓ１、受け入れ番号Ｍ２９５６３）、およびマイコバクテリ ウム・マリヌム（M．marinum）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：Ｍ ＭＡ１６ＳＲＮ、受け入れ番号Ｘ５２９２０）の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の整列を 示す。好適なペプチド核酸プローブは、整列の７６〜７９、９８〜１０１、１３ ５〜１３６、１９４〜２０１、２２２〜２２９、２４２、４７４、１１３６〜１ １４５、１２７１〜１２７２、１２８７〜１２９２、１３１３および１３３４位 （太線の枠で示す）内の、結核菌（M．tuberculosis）１６Ｓ ｒＲＮＡのヌク レオ塩基に相補的な少なくとも１つのヌクレオ塩基を包含する。整列内のマイコ バクテリウム・ボビス（M．bovis）、マイコバクテリウム・アビウム（M．avium ）、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（M．intracellulare）、マイコバ クテリウム・パラツベルクロシス（M．paratuberculosis）、マイコバクテリウ ム・スクロフラセウム（M．scrofulaceum）、マイコバクテリウム・レプラエ（M ．leprae）、マイコバクテリウム・カンサシイ（M．kansasii）、マイコバクテ リウム・ガストリ（M．gastri）、マイコバクテリウム・ゴルドナエ（M．gordon ae）、およびマイコバクテリウム・マリヌム（M．marinum）の配列と、結核菌（ M．tuberculosis）の配列との差を、細線の枠で示す。 ＭＴＣ群（５Ｓ ｒＤＮＡ）の整列 図３は、結核菌（M．tuberculosis）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧ Ｂ：ＭＴＤＮＡ１６Ｓ、受け入れ番号Ｘ７５６０１）、マイコバクテリウム・ボ ビス（M．bovis）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＢＲＲＮ５Ｓ 、受け入れ番号Ｘ０５５２６）、マイコバクテリウム・フレイ（M．phlei）（ジ ー ンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＰ５ＳＲＲＮＡ、受け入れ番号Ｘ５５ ２５９）、マイコバクテリウム・レプラエ（M．leprae）（ジーンバンク（GenBa nk）エントリーＧＢ：ＭＬ５Ｓ２３Ｓ、受け入れ番号Ｘ５６６５７）、およびマ イコバクテリウム・スメグマチス（M．smegmatis）（ジーンバンク（GenBank） エントリーＧＢ：ＭＳ１６Ｓ２３Ｓ５、受け入れ番号Ｙ０８４５３）の５Ｓ ｒ ＤＮＡ配列の整列を示す。好適なペプチド核酸プローブは、整列の８６〜９０位 （太線の枠で示す）内の、結核菌（M．tuberculosis）５Ｓ ｒＲＮＡのヌクレ オ塩基に相補的な少なくとも１つのヌクレオ塩基を包含する。整列内のマイコバ クテリウム・ボビス（M．bovis）、マイコバクテリウム・フレイ（M．phlei）、 マイコバクテリウム・レプラエ（M．leprae）、マイコバクテリウム・スメグマ チス（M．smegmatis）、およびマイコバクテリウム・ルテウス（M．luteus）の 配列と、結核菌（M．tuberculosis）の配列との差を、細線の枠で示す。 ＭＴＣ群のマイコバクテリア以外のマイコバクテリア（２３Ｓ ｒＤＮＡ）の整 列 図４Ａ〜４Ｌは、マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）（ジーンバンク （GenBank）エントリーＧＢ：ＭＡ２３ＳＲＮＡ、受け入れ番号Ｘ７４４９４） 、マイコバクテリウム・パラツベルクロシス（M．paratuberculosis）（ジーン バンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＰＡＲＲＮＡ、受け入れ番号Ｘ７４４９ ５）、結核菌（M．tuberculosis）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ： ＭＴＣＹ１３０、受け入れ番号Ｚ７３９０２）、マイコバクテリウム・フレイ（ M．phlei）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＰ２３ＳＲＮＡ、受 け入れ番号Ｘ７４４９３）、マイコバクテリウム・レプラエ（M．leprae）（ジ ーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＬ５Ｓ２３Ｓ、受け入れ番号Ｘ５６ ６５７）、マイコバクテリウム・ガストリ（M．gastri）（ジーンバンク（GenBa nk）エントリーＧＢ：ＭＧ２３ＳＲＲＮＡ、受け入れ番号Ｚ１７２１１）、マイ コバクテリウム・カンサシイ（M．kansasii）（ジーンバンク（GenBank）エント リーＧＢ：ＭＫ２３ＳＲＲＮＡ、受け入れ番号Ｚ１７２１２）、およびマイコバ クテリウム・スメグマチス（M．smegmatis）（ＧＢ：ＭＳ １６Ｓ２３Ｓ５、受け入れ番号Ｙ０８４５３、の２３Ｓ ｒＤＮＡ配列の整列を 示す。好適なペプチド核酸プローブは、整列の９９〜１０１、１８３、２６１〜 ２７１、２８１〜２８４、２９０〜２９３、３２７〜３３５、３４３〜３５７、 ４００〜４０５、４５３〜４６２、５８７〜５９９、６３７〜６６０、７０４〜 ７１２、７６３〜７８９、１０６０〜１０７４、１１７７〜１１８５、１２５９ 〜１２６５、１３１１〜１３２７、１３４５〜１３４８、１３６１〜１３６４、 １５５６〜１５７０、１６０８〜１６１３、１６２６〜１６３８、１６５１〜１ ６５９、１６７５〜１６７７、１７３４〜１７４１、１８４７〜１８５３、１９ ６７〜１９７６、２００６〜２０１０、２０２５〜２０２７、２１３１〜２２３ ２、２２５２〜２２５５、２３９６〜２４０５、２４１６〜２４２０、２４７４ 〜２４７８、２６８７、２７１９、２８０９、３０６２〜３０６８、および３０ ９７〜３１０６位（太線の枠で示す）内の、マイコバクテリウム・アビウム（M. avium）２３Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオ塩基に相補的な少なくとも１つのヌクレオ 塩基を包含する。整列内のマイコバクテリウム・パラツベルクロシス（M.paratu berculosis）、結核菌（M．tuberculosis）、マイコバクテリウム・フレイ（M． phlei）、マイコバクテリウム・レプラエ（M．leprae）、マイコバクテリウム・ ガストリ（M．gastri）、マイコバクテリウム・カンサシイ（M.kansasii）、お よびマイコバクテリウム・スメグマチス（M．smegmatis）の配列と、マイコバク テリウム・アビウム（M．avium）の配列との差を、細線の枠で示す。 ＭＴＣ群のマイコバクテリア以外のマイコバクテリア（１６Ｓ ｒＤＮＡ）の整 列 図５Ａ〜５Ｂは、マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）（ジーンバンク （GenBank）エントリーＧＢ：ＭＳＧＲＲＤＡ、受け入れ番号Ｍ６１６７３）、 マイコバクテリウム・イントラセルラレ（M．intracellulare）（ジーンバンク （GenBank）エントリーＧＢ：ＭＩＮ１６ＳＲＮ、受け入れ番号Ｘ５２９２７） 、マイコバクテリウム・パラツベルクロシス（M．paratuberculosis）（ジーン バンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＳＧＲＲＤＨ、受け入れ番号Ｍ６１６８ Ｏ）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（M．scrofulaceum）（ジーンバ ンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＳＣ１６ＳＲＮ、受け入れ番号Ｘ５２９２ ４）、結核菌（M．tuberculosis）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ： ＭＴＵ１６ＳＲＮ、受け入れ番号Ｘ５２９１７）、マイコバクテリウム・ボビス （M．bovis）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＳＧＴＧＤＡ、受 け入れ番号Ｍ：２０９４０）、マイコバクテリウム・レプラエ（M．leprae）（ ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＬＥＰ１６Ｓ１、受け入れ番号Ｘ ５５５８７）、マイコバクテリウム・カンサシイ（M．kansasii）（ジーンバン ク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＫＲＲＮ１６、受け入れ番号Ｘ１５９１６） 、マイコバクテリウム・ガストリ（M．gastri）（ジーンバンク（GenBank）エン トリーＧＢ：ＭＧＡ１６ＳＲＮ、受け入れ番号Ｘ５２９１９）、マイコバクテリ ウム・ゴルドナエ（M．gordonae）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ： ＭＳＧＲＲ１６Ｓ１、受け入れ番号Ｍ２９５６３）、およびマイコバクテリウム ・マリヌム（M．marinum）（ジーンバンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＭＡ １６ＳＲＮ、受け入れ番号Ｘ５２９２０）の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の整列を示す 。好適なペプチド核酸プローブは、整列の１３５〜１３６、４７２〜４７５、１ １３６〜１１４４、１２８７〜１２９２、１３１３および１３３４位（太線の枠 で示す）内の、マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）１６Ｓ ｒＲＮＡの ヌクレオ塩基に相補的な少なくとも１つのヌクレオ塩基を包含する。整列内のマ イコバクテリウム・イントラセルラレ（M．intracellulare）、マイコバクテリ ウム・パラツベルクロシス（M．paratuberculosis）、マイコバクテリウム・ス クロフラセウム（M．scrofulaceum）、結核菌（M．tuberculosis）、マイコバク テリウム・ボビス（M．bovis）、マイコバクテリウム・レプラエ（M．leprae） 、マイコバクテリウム・カンサシイ（M．kansasii）、およびマイコバクテリウ ム・ガストリ（M．gastri）の配列と、マイコバクテリウム・アビウム（M.avium ）の配列との差を、細線の枠で示す。 薬剤耐性 図６は、ジーンバンク（GenBank）エントリーＸ７４４９４の２５５０〜２５ ８９位を含む部分的なマイコバクテリウム・アビウム（M．avium）２３Ｓ ｒＤ ＮＡ配列を示す。野生型配列からのずれがマクロライド剤耐性と相関付けられて いる位置を枠で示す。図の２５６８と２５６９位は、大腸菌（E．coli）２３Ｓ ｒＲＮＡのそれぞれ２０５８と２０５９位に対応する。 図７は、ジーンバンク（GenBank）エントリーＸ５２９１７の４４１〜４９１ 位および８４３〜８８３位を含む部分的な結核菌（M．tuberculosis）１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を示す。野生型配列からのずれがストレプトマイシン耐性と相関付 けられている位置を枠で示す。図の４５２、４７３、４７４、４７７、８６５、 および８６６位は、大腸菌（E．coli）１６Ｓ ｒＲＮＡのそれぞれ５０１、５ ２２、５２３、５２６、９１２、および９１３位に対応する。 具体的説明 本発明は、マイコバクテリアｒＤＮＡ、前駆体ｒＲＮＡ、または２３Ｓ、１６ Ｓ、もしくは５Ｓ ｒＲＮＡ中に位置する、１つまたはそれ以上のマイコバクテ リアの標的配列を検出するための、迅速かつ特異的な高感度のハイブリダイゼー ションベースの測定法で使用される新規プローブを提供する。本発明において使 用されるプローブは、ペプチド核酸プローブである。ペプチド核酸は、核酸（Ｄ ＮＡおよびＲＮＡ）に結合することができる天然には存在しないポリアミドまた はポリチオオアミドである。このような化合物は、例えばＷＯ９２／２０７０２ 号に記載されている。 我々は、一般的に入手できるｒＤＮＡ配列と上記配列決定により得られる配列 との比較分析により、標的核酸の適切な可変領域を同定した。本明細書に開示の 目的のために使用されるコンピューターおよびコンピュータープログラムは、市 販されている。このような整列から、おそらく適切なプローブを同定することが できる。従って整列は、所望の特徴を有するプローブの設計のための有用な指針 である。 プローブを設計する場合、プローブが使用される測定条件を充分考慮する必要 がある。厳密性は、標的核酸を用いて形成されるハイブリッドと非標的核酸を用 いて形成されるハイブリッドとの間の安定性の差を最大にするように、選択され る。典型的には、特異性が、非標的配列に対して１つだけのミスマッチに依存す るプローブについては、高厳密性条件を選択することが必要であろう。非標的配 列に対してミスマッチが多いほど、高厳密性条件に対する要求は緩くなる。 さらに、プローブは、プローブ−非標的核酸ハイブリッドの安定性を最小にす るように、設計される。これは、非標的核酸に対する相補性の程度を最小にする こと、すなわちプローブができるだけ多くの不安定性ミスマッチをカバーし、お よび／または標的配列に対してできるだけ多くの付加／欠失を含むように設計す ること、により達成される。特定のマイコバクテリア種を検出するのにプローブ が有用であるかどうかは、ある程度プローブ−標的ハイブリッドおよびプローブ ：非標的ハイブリッドの熱安定性の差に依存する。しかしｒＲＮＡ標的について は、標的配列が位置するｒＲＮＡ分子の領域の２次構造も重要なことがある。プ ローブの２次構造も考慮する必要がある。プローブは、２つまたはそれ以上のプ ローブが使用される時、ヘアピン、セルフダイマーおよびペアダイマーを形成す る傾向を最小にするように設計する必要がある。 ペプチド核酸プローブと核酸の間で形成されるハイブリッド中のミスマッチし ている塩基は、同じ配列の核酸２本鎖中のミスマッチしている塩基より熱不安定 性が大きくなる。すなわち、ペプチド核酸プローブは、古典的な核酸プローブよ り一定の標的核酸配列に対する特異性が高くなり、これはプローブ−標的ハイブ リッドとプローブ−非標的ハイブリッドについてのＴｍ値の大きな差としてみら れる。ペプチド核酸プローブの感度と特異性はまた、使用されるハイブリダイゼ ーション条件に依存するであろう。 ペプチド核酸プローブの長さに関する大きな関心事項は、保証された特異性、 すなわち特定の応用についてどの長さが充分な特異性を提供するかということで ある。例えばマイコバクテリアｒＲＮＡの選択された領域の中で塩基組成に差を 有する特定の部位を含むペプチド核酸プローブの最適な長さは、長いプローブほ ど特異性が高いという一般的なパターンと、短いプローブは塩基組成中の不安定 化の差がプローブの大部分を構成するということ、との妥協の産物である。また 、プローブが使用される条件を充分考慮する必要がある。 ペプチド核酸配列は、配列のＮ−末端からＣ−末端の方向に書かれる。遊離の （置換されていない）Ｎ−末端またはアミノ酸で終わるＮ−末端はＨで示し、遊 離Ｃ−末端はＮＨ₂（カルボキサミド基）で示す。ペプチド核酸は２つの配向で 、すなわち反平行配向および平行配向で、核酸配列にハイブリダイズすることが で きる。ペプチド核酸は、ペプチド核酸のＮ−末端が核酸配列の３’末端に面して いる時、反平行配向ハイブリダイズし、ペプチド核酸のＣ−末端が核酸配列の５ ’末端に面している時、平行配向でハイブリダイズすると言われている。ほとん どの場合、平行配向のハイブリダイゼーションが進行が遅く、生成した２本鎖は 、反平行鎖を有する２本鎖ほど安定ではないため、反平行配向が好ましい。ペプ チド核酸のピリミジン含量が多いなら、２つのペプチド核酸鎖と１つの核酸鎖の 化学量論による３本鎖形成が起きることがある。このような３本鎖は非常に安定 であり、従って３本鎖を形成することができるプローブは、いくつかの応用に適 している。 主に、ペプチド核酸鎖は変化していないという理由により、ペプチド核酸−核 酸２本鎖は、対応する核酸−核酸２本鎖より高いＴｍを有するであろう。典型的 には、配列に依存して１００mMのＮａＣｌで１塩基対あたり約１℃のＴｍの上昇 があるであろう（エグホルム（Egholm）ら、（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ ３６ ５，５６６−５６８）。 ＤＮＡ−ＤＮＡ２本鎖形成に比較すると、ペプチド核酸−ＤＮＡまたはペプチ ド核酸−ＲＮＡ２本鎖の形成を促進および安定化するために塩は必要ではない。 ペプチド核酸−ＤＮＡ２本鎖のＴｍは、イオン強度が上昇してもほとんど変化し ない。典型的に１５量体については、塩濃度を１０mMのＮａＣｌから１ＭのＮａ Ｃｌまで上げてもＴｍはわずかに５℃しか低下しない。低イオン強度（例えば、 塩の添加の無い１０mMのリン酸緩衝液）では、ペプチド核酸と標的配列とのハイ ブリダイゼーションは、ＤＮＡ−ＤＮＡ２本鎖の形成が起きない条件下でも可能 である。さらにそのような条件下では核酸の２次および３次構造は不安定化され るため、通常は利用できない部位が、低い塩濃度でペプチド核酸プローブとのハ イブリダイゼーションのために容易に利用できるようになる。ペプチド核酸プロ ーブを使用すると、別の不安定化工程または不安定化プローブの使用が不要かも 知れない。 リボゾームの正しい機能のために従ってタンパク質の合成のために、ｒＲＮＡ は必須である。ｒＲＮＡをコードする遺伝子は、真正細菌でオペロン中にあり、 ここで小さいサブユニットＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）はオペロン の５’末端の最も近傍にあり、大きいサブユニットＲＮＡの遺伝子（２３Ｓ ｒ ＲＮＡ遺伝子）は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とは離れたところに位置し、５Ｓ ｒ ＲＮＡ遺伝子はオペロンの３’末端の最も近傍に位置する。この３つの遺伝子は 、その中にｔＲＮＡ遺伝子が存在する可能性のあるスペーサー領域により分離さ れるが、結核菌（M．tuberculosis）中には存在しない。真正細菌ｒＲＮＡオペ ロンの１次転写体は、ＲＮａｓｅIIIにより切断される。この切断により、１６ Ｓ ｒＲＮＡ、２３Ｓ ｒＲＮＡ、および５Ｓ ｒＲＮＡが前駆体ｒＲＮＡ分子 （プレ−ｒＲＮＡ分子）に分離され、これはｒＲＮＡ種以外に、リーダー配列お よびテイル配列も含有する。一次ＲＮａｓｅIII切断は、通常迅速なプロセスで あるが、以後の成熟は実質的に遅い。前駆体ｒＲＮＡは典型的には、より強く発 現されるｍＲＮＡ分子種より豊富である。すなわちいくつかの応用において、前 駆体ｒＲＮＡは魅力的な診断標的である。前駆体ｒＲＮＡを特異的に検出するた めに、標的プローブは、リーダー配列またはテイル配列の少なくとも一部を含む 配列に向けられる。標的プローブはさらに、リーダー／テイルの一部と成熟ｒＲ ＮＡ配列の両方が成分である、配列に向けられる。 通常、マイコバクテリア感染症にかかっている患者は、喀痰中にマイコバクテ リアが見つからなくなるまで薬剤で治療される。培養法以外では、現在利用可能 な方法では、生きているマイコバクテリアと死んでいるマイコバクテリアの明確 な区別は不可能である。これは、患者が、しばしば実際に必要な期間より長く薬 剤で治療されることを意味する。治療の進行を測定する方法は、結核や他のマイ コバクテリア疾患との戦いにおいて非常に有用な手段であろう。 ｒＲＮＡの転写と成熟は生存度の尺度であり、前駆体ｒＲＮＡの検出は、細菌 の生存度の適切かつ直接的な尺度である。さらに前駆体ｒＲＮＡは、ｒＲＮＡ転 写を低下または阻害する抗生物質の同定のために使用してもよい。そのような例 の１つはリファンピシンである。感受性細菌において転写インヒビターは、ｒＲ ＮＡの新しい合成を排除し、従って前駆体ｒＲＮＡのプールが枯渇する。しかし 耐性細胞においては、１次転写体ならびに前駆体ｒＲＮＡが産生し続ける。 ｒＲＮＡの特異的配列を標的とするペプチド核酸プローブを使用することが好 ましいが、ｒＲＮＡターゲティングプローブに相補的なペプチド核酸プローブは 、 該配列特異的ｒＲＮＡ（ｒＤＮＡ）をコードする遺伝子の検出のために有用であ り、従ってｒＤＮＡを検出するためのペプチド核酸プローブは本発明に包含され ることは、容易に理解されるであろう。プローブが反平行配向で標的配列にハイ ブリダイズすることができるように、プローブの配列を選択することが好ましい が、平行配向でハイブリダイズすることができるプローブが、同じ情報から作成 することができることを理解されたい。本発明は、両方タイプのプローブをカバ ーする。 広い意味において本発明は、検体中に随時存在する１つまたはそれ以上のマイ コバクテリアの標的配列を検出するためのペプチド核酸プローブに関し、該プロ ーブはマイコバクテリアｒＤＮＡ、前駆体ｒＲＮＡまたはｒＲＮＡの標的配列に ハイブリダイズすることができる（請求の範囲第１項）。 本発明のプローブは、ｒＤＮΛ、前駆体ｒＲＮＡ、または２３Ｓ、１６Ｓ、も しくは５Ｓ ｒＲＮＡに向けられることが好ましい。 請求の範囲第３項に従って、ペプチド核酸プローブがハイブリダイズすること ができる標的配列は、 （ａ）検出すべき１つまたはそれ以上のマイコバクテリアのマイコバクテリア性 ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのヌクレオ塩基配列を、そこから１つまたはそれ以上の マイコバクテリアが区別される生物、特に特定の他のマイコバクテリアの対応す るヌクレオ塩基配列と比較して、 （ｂ）そこから１つまたはそれ以上のマイコバクテリアが区別される生物、特に 特定の他のマイコバクテリアの対応するヌクレオ塩基とは異なる、少なくとも１ つのヌクレオ塩基を含む、ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの標的配列を選択し、そして （ｃ）選択される標的配列にハイブリダイズして検出可能なハイブリッドを形成 する上記プローブの能力を測定する、 ことにより得られる。 請求の範囲第４項に従ってペプチド核酸プローブは、 （ａ）検出すべき１つまたはそれ以上のマイコバクテリアのマイコバクテリア性 ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのヌクレオ塩基配列を、そこから１つまたはそれ以上の マイコバクテリアが区別される生物、特に特定の他のマイコバクテリアの対応す るヌクレオ塩基配列と比較して、 （ｂ）そこから１つまたはそれ以上のマイコバクテリアが区別される生物、特に 特定の他のマイコバクテリアの対応するヌクレオ塩基とは異なる、少なくとも１ つのヌクレオ塩基を含む、ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの標的配列を選択し、 （ｃ）上記プローブを合成し、そして （４）選択される標的配列にハイブリダイズして検出可能なハイブリッドを形成 する上記プローブの能力を測定する、 ことにより得られる。 プローブは、試料中に随時存在する、結核菌複合体（ＭＴＣ）の１つまたはそ れ以上のマイコバクテリアの標的配列を検出するのに、または結核菌複合体のマ イコバクテリア以外の１つまたはそれ以上のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）の標 的配列を検出するのに、特に適しており、プローブは、６〜３０個の重合ペプチ ド核酸残基を含み、プローブは、マイコバクテリアｒＤＮＡ、前駆体ｒＲＮＡ、 または２３Ｓ、１６Ｓ、もしくは５Ｓ ｒＲＮＡの標的配列にハイブリダイズし て検出可能なハイブリッドを形成することができる（請求の範囲第５項）。請求 の範囲第６項に従って、このようなプローブは、式（Ｉ） （式中、各ＸとＹは、独立にＯまたはＳであり、 各Ｚは、独立にＯ、Ｓ、ＮＲ¹、またはＣ（Ｒ¹）₂であり、ここで各Ｒ¹は独立 にＨ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルケニル、Ｃ_1-6アルキニルであり、 各Ｒ²、Ｒ³、およびＲ⁴は、独立にＨ、天然に存在するアミノ酸の側鎖、天然 には存在しないアミノ酸の側鎖、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルケニル、もしくはＣ_1-4 アルキニル、または官能基であり、各Ｑは、独立に天然に存在するヌ クレオ塩基、天然には存在しないヌクレオ塩基、挿入物質（intercalator）、ヌ クレオ塩基結合基、標識物またはＨであり、 そして請求の範囲第６項に記載の条件付きである） のペプチド核酸残基を含んでよい。 プローブは、種特異的マイコバクテリア標的配列、またはＭＴＣ、ＭＯＴＴ、 ＭＡＣもしくはＭＡＩＳのようなマイコバクテリアの群の標的配列を検出するた めの使用に適している。プローブは、１つまたはそれ以上の薬剤耐性マイコバク テリアにあるいはこれに対応する野生型にハイブリダイズすることができるよう に、さらに設計される。プローブの設計において、異なるマイコバクテリア（１ つまたはそれ以上）の間の配列が、他の関連するかまたは関連しない生物（１つ またはそれ以上）からの配列と同様に、考慮される。 前記したように薬剤耐性は、マイコバクテリア感染症に対する戦いに対して脅 威を増している。クラリスロマイシン（clarithromycin）やアジスロマイシン（ azithromycin）のようなマクロライド剤による単独治療は、しばしば臨床的に重 要な薬剤耐性を引き起こす。クラリスロマイシンやアジスロマイシンは、特にマ イコバクテリウム・アビウム（M．avium）による感染症の治療において重要な薬 剤である。クラリスロマイシンやアジスロマイシンに対する獲得耐性を有するマ イコバクテリウム・アビウム（M．avium）とマイコバクテリウム・イントラセル ラレ（M．intracellulare）の分離株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列と、非耐性株から の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列との比較により、耐性株の大多数は、大腸菌（E.coli） ２３Ｓ ｒＲＮＡ中の２０５８および２０５９に対応する位置に２３Ｓ ｒＲＮ Ａの単一の点突然変異を有することが明らかになった。マイコバクテリウム・ア ビウム（M．avium）２３Ｓ ｒＲＮＡ配列（ジーンバンク（GenBank）受け入れ 番号Ｘ７４４９４）では、図６に示すように対応する塩基は、それぞれ２５６８ と２５６９位にある。多くの感受性株はこれらの位置の１つにＡ残基を有するが 、耐性株は、２０５８位（ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号Ｘ７４４９４ のマイコバクテリウム・アビウム（M．avium）中の２５６８に対応する大腸菌（ E．coli）の番号）にＣ、ＧまたはＴを有するか、または２０５９位（ジーンバ ンク（GenBank）受け入れ番号Ｘ７４４９４のマイコバクテリウム・ アビウム（M．avium）中の２５６９に対応する大腸菌（E．coli）の番号）にＧ またはＣを有する。 ｒＲＮＡ中の単一点突然変異も、ストレプトマイシン耐性にある程度寄与して いるようである。結核に対して最初の成功した抗生物質であるストレプトマイシ ンは、リボゾームレベルでタンパク質合成をかき乱すアミノシクリトール（amin ocyclitol）グリコシドである。ストレプトマイシン耐性の遺伝子的基礎は、ま だ完全には解明されていない。しかし結核菌（M．tuberculosis）の一部のスト レプトマイシン耐性株は、１６Ｓ ｒＲＮＡ中に単一点突然変異を有する。これ らの突然変異は、大腸菌（E．coli）１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基５０１、５２２、 ５２３、５２６、９１２および９１３に対応する位置にあり、これは図７に示す ように、結核菌（M．tuberculosis）１６Ｓ ｒＲＮＡ（ジーンバンク（GenBank ）受け入れ番号Ｘ５２９１７）のそれぞれ４５２、４７３、４７４、４７７、８ ６５、および８６６の塩基に対応する。これらの突然変異ヌクレオチドのほとん どは、全１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の最も保存された領域の１つである、１６Ｓ ｒＲＮＡの５３０ループ内の構造的相互作用に関与する。 ＲＮＡポリメラーゼのベータサブユニットをコードする遺伝子（ｒｐｏＢ）の ８１塩基対領域中の突然変異が、結核菌（M．tuberculosis）やマイコバクテリ ウム・レプラエ（M．leprae）中のリファンピシン耐性症例の９６％の原因であ る。ｒＲＮＡ前駆体分子は、前駆体ｒＲＮＡプロセシングの後期工程で除去され て成熟ｒＲＮＡ分子を与える末端ドメイン（テイル）を有する。リファンピシン のような転写インヒビターは、前駆体ｒＲＮＡの新規合成を阻害し一方成熟を進 行させることにより、感受性細胞中の前駆体ｒＲＮＡを枯渇させることができる 。すなわち、細胞を培養中にリファンピシンに暴露させると、感受性マイコバク テリウム細胞では前駆体ｒＲＮＡが枯渇するが、耐性マイコバクテリウム細胞で は産生され続ける。 結核菌複合体の１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配列を検出する ためのペプチド核酸プローブは、請求の範囲第７〜１０項で定義される。結核菌 複合体のマイコバクテリア以外の１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的 配列を検出するためのペプチド核酸プローブは、請求の範囲第１１〜１３項で定 義される。結核菌複合体の１つまたはそれ以上の薬剤耐性マイコバクテリアまた は結核菌複合体のマイコバクテリア以外の１つまたはそれ以上の薬剤耐性マイコ バクテリアの標的配列を検出するためのペプチド核酸プローブは、請求の範囲第 １４項で定義される。 本発明の背景と請求の範囲において、「天然に存在するヌクレオ塩基」という 用語は、４つの主要なＤＮＡ塩基（すなわち、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、 アデニン（Ａ）、およびグアニン（Ｇ））ならびに他の天然に存在するヌクレオ 塩基（例えば、ウラシル（Ｕ）とヒポキサンチン）を含む。 「天然には存在しないヌクレオ塩基」という用語は、修飾された天然に存在す るヌクレオ塩基を含む。そのような天然には存在しないヌクレオ塩基は、１つま たはそれ以上のＣ_1-8アルキル、Ｃ_1-8アルケニル、またはＣ_1-8アルキニル基ま たは標識物による置換により修飾されてもよい。天然には存在しないヌクレオ塩 基の例は、プリン、２，６−ジアミノプリン、５−プロピニルシトシン（Ｃプロ ピニル）、イソシトシン（イソ−Ｃ）、５−メチル−イソシトシン（イソ^MeＣ） （例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ 第３６巻、１２号、２０ ３３−２０３６（１９９５）、またはＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ 第３６巻、２１号、３６０１−３６０４（１９９５）を参照）、７−デアザア デニン、７−デアザグアニン、Ｎ⁴−エタノシトシン、Ｎ⁵−エタノ−２，６−ジ アミノプリン、５−（Ｃ_3-6）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ_3-6）−アルキニ ルシトシン、５−フルオロウラシルおよびシュードシトシンがある。 有用な挿入物質の例は、例えばアクリジン、アントラキノン、ソラレン、およ びピレンがある。 有用なヌクレオ塩基結合基の例は、例えば環または複素環を含有する基がある 。非限定例は、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールがある。 アルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、分岐していてもしていなくても 、環状でも環状でなくても、かつさらに１つまたはそれ以上のヘテロ原子が割り 込んでいてもいなくても、または１つまたはそれ以上の官能基により置換されて もされていなくても、もしくはこれを含有してもしなくてもよい。このような官 能 基の非限定例は、アセチル基、アシル基、アミノ基、カルバミド基、カルバモイ ル基、カルバミル基、カルボニル基、カルボキシル基、シアノ基、ジチオ基、ホ ルミル基、グアニジノ基、ハロゲン、ヒドラジノ基、ヒドラゾ基、ヒドロキシア ミノ基、ヒドロキシ基、ケト基、メルカプト基、ニトロ基、ホスホ基、ホスホノ 基、ホスホエステル基、スルホ基、チオシアナト基、環状、芳香族および複素環 基がある。 Ｃ_1-4基は、１〜４個の炭素原子を含有する。Ｃ_1-6基は１〜６個の炭素原子を 含有し、Ｃ_1-15基は１〜１５個の炭素原子を含有し、随時の置換基、ヘテロ原子 および／または官能基を含まない。そのような基の非限定例は、−ＣＨ₃、−Ｃ Ｆ₃、−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂ＣＨ₃−、−ＣＨ₂ＣＨ₂−、−ＣＨ（ＣＨ₃）₂−、−Ｏ ＣＨ₃、−ＯＣＨ₂−、−ＯＣＨ₂ＣＨ₃、−ＯＣＨ₂ＣＨ₂−、−ＯＣＨ（ＣＨ₃）₂ 、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ₃、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ₂−、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−、− Ｃ（Ｏ）ＣＨ₃、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ₂ＮＨ₂、−ＣＨ₂ＮＨ −、−ＣＨ₂ＯＣＨ₃、−ＣＨ₂ＯＣＨ₂−、−ＣＨ₂ＯＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ₂ＯＣ （Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）ＣＨ₃、−ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）ＣＨ₂−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂ 、−ＣＨ＝ＣＨ₂、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂Ｃ（Ｏ）ＯＨ，−ＣＨ ＝ＣＨＣＨ₂Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＨ₂Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨ₂ Ｃ≡Ｃ−、−ＣＨ₂Ｃ≡ＣＣＨ₃、−ＯＣＨ₂Ｃ≡ＣＨ、−ＯＣＨ₂Ｃ≡Ｃ−、− ＯＣＨ₂Ｃ≡ＣＣＨ₃、−ＮＨＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−、 −ＮＨ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₂ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−、およびＨＯ（Ｏ）ＣＣＨ₂Ｃ（Ｏ） （ＮＨ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₂ＣＨ₂Ｃ（Ｏ））₂−、フェニル、ベンジル、、ナフ チル、オキサゾリル、ビリジニル、チアジアゾリル、トリアゾリル、およびチエ ニルがある。 本発明において「天然に存在するアミノ酸」という用語は、通常天然に存在す るＤ−型およびＬ−型のアミノ酸、例えばＡｌａ（アラニン）、Ａｒｇ（アルギ ニン）、Ａｓｎ（アスパラギン）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｃｙｓ（システ イン）、Ｇｌｎ（グルタミン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｈｉｓ（ヒスチジン ）、ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｌｅｕ（ロイシン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｍｅｔ （メチオニン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｐｒｏ（プロリン）、Ｓｅｒ（ セリン）、Ｔｈｒ（スレオニン）、Ｔｒｐ（トリプトファン）、Ｔｙｒ（チロシ ン）、およびＶａｌ（バリン）のＤ−型およびＬ−型である。 本発明において「天然には存在しないアミノ酸」という用語は、通常天然に存 在するアミノ酸以外のＤ−型およびＬ−型のアミノ酸ならびに天然に存在するア ミノ酸を修飾１−たものを包含する。有用な天然には存在しないアミノ酸の例は 、β−Ａｌａ（β−アラニン）、Ｃｈａ（シクロヘキシルアラニン）、Ｃｉｔ（ シトルリン）、Ｈｃｉ（ホモシトルリン）、ＨｏｍｏＣｙｓ（ホモシステイン） 、Ｈｓｅ（ホモセリン）、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、Ｎｖａ（ノルバリン）、Ｏ ｒｎ（オルニチン）、Ｓａｒ（サルコシン）およびＴｈｉ（チエニルアラニン） Ｄ−型およびＬ−型である。 本発明において「試料」という用語は、本発明の目的に適したすべての型の試 料をカバーする。そのような試料濃縮例は、喀痰、喉頭ぬぐい液、胃洗浄液、気 管支洗浄液、生検試料、吸引液、唾液、体液（脊髄液、胸水、心膜液、関節液、 血液、膿、骨髄液）、尿、組織切片、ならびに食物試料、土壌、空気、および水 試料がある。上記試料に由来する試料（例えば、培養物および処理した試料）の 分析も、本発明の範囲に包含される。 本発明において「ハイブリッド」という用語は、プローブと測定される核酸と の間の複合体を包含することを企図する。そのようなハイブリッドは、２つまた はそれ以上の鎖から作成されてもよい。 プローブと標的核酸配列の間の結合の強さは、リガンドＱにより影響を受ける 。Ｑがヌクレオ塩基である時、フッグスティーン（Hoogsteen）および／または ワトソン−クリック（Watson-Crick）塩基対合が、検出すべき核酸配列とプロー ブとの間のハイブリッドの形成を助ける。１つまたはそれ以上のリガンドは、核 酸の結合にはほとんどまたは全く寄与しない基（例えば、水素）でもよい。使用 される適切なプローブは、２５重量％未満のペプチド核酸残基を含み、Ｑはその ような基である。１つまたはそれ以上のリガンドＱは、ヌクレオ塩基の積み重ね を 安定化させる基、例えば挿入物質またはヌクレオ塩基結合基でもよい。 上記プローブにおいて、１つまたはそれ以上のＱ基は標識物でもよい。適切な 標識物の例は後述する。Ｑが標識物である残基は、好ましくはプローブの１つま たは両方の末端残基中に存在する。しかしＱが標識物である残基は、内部に存在 してもよい。 ペプチド核酸プローブは、すべてのＸ基がＯ（ポリアミド）であるか、または すべてのＸ基がＳ（ポリチオアミド）である残基を含有してもよい。プローブは また、混合残基（アミドとチオアミド残基の両方を含む）を含有してもよいこと を理解されたい。 別の面において本発明は、請求の範囲第１５項で定義される式（II）、（III ）および（IV）のペプチド核酸プローブならびにそのようなプローブの混合物に 関する。 好適な実施態様において本発明のペプチド核酸プローブまたはその混合物は、 請求の範囲第１６項で定義される式（Ｉ）〜（IV）のものであり、ここでＺは、 ＮＨ、ＮＣＨ₃またはＯであり、各Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は、独立にＨまたは天然に 存在するアミノ酸の側鎖、天然には存在しないアミノ酸の側鎖、またはＣ_1-4ア ルキルであり、そして各Ｑは天然に存在するヌクレオ塩基または天然には存在し ないヌクレオ塩基であるが、但し請求の範囲第６項〜１４項で定義される条件が 付く。 本発明のペプチド核酸プローブまたはそのようなプローブの混合物は、好まし くは請求の範囲第１７項で定義される式（Ｉ）〜（IV）のものであり、ここでＺ は、ＮＨまたはＯであり、Ｒ²は、Ｈ、またはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ 、Ｈｉｓ、ＨｏｍｏＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＳｅｒもしくはＴｈｒの側鎖であ り、そしてＱはチミン、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、イソ−Ｃ、 および２，６−ジアミノプリンから選択されるヌクレオ塩基であるが、但し請求 の範囲第６項〜１４項で定義される条件が付く。 ＭＴＣ群のマイコバクテリアまたはＭＴＣ群のマイコバクテリア以外の１つま たはそれ以上のマイコバクテリアを検出するのに大きく関係する、ペプチド核酸 プローブまたはその混合物は、請求の範囲第１８項記載の式（Ｖ）のプローブで あり、ここでＲ⁴は、Ｈ、またはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｈ ｏｍｏＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＳｅｒもしくはＴｈｒの側鎖であり、そしてＱ は請求の範囲第１７項に記載される通りであるが、但し請求の範囲第６項〜１４ 項に記載される条件が付く。 ペプチド核酸プローブは、上記および請求の範囲で定義される重合残基を含む 。式から、プローブは、その構造が互いに異なるかまたは同じである重合残基を を含有してもよいことを理解されたい。ある場合には、プローブの少なくとも１ つの残基、好ましくはプローブの末端の残基の１つまたは両方は、異なる構造を 有する。そのような末端残基は、式（VI） （式中、Ｑは上記で定義したものである）の残基であることが好ましい。このよ うな残基は、アミド結合を介してペプチド核酸残基に連結されることが好ましい 。 本発明のペプチド核酸プローブは、式（Ｉ）〜（Ｖ）の６〜３０個の重合残基 、かつさらに随時、上記で定義した式（VI）の１つまたは２つの末端残基を有す る。プローブの好適な長さは、試料物質に依存し、かつ標識プローブが使用され るかどうかに依存する。特に関係のあるプローブは、式（Ｉ）〜（Ｖ）の１０〜 ３０個の重合残基と、かつさらに随時、上記で定義した式（VI）の１つまたは２ つの末端残基を有する。本発明のプローブは、好ましくは式（Ｉ）〜（Ｖ）の１ ２〜２５個の重合残基、より好ましくは式（Ｉ）〜（Ｖ）の１４〜２２個の重合 残基、最も好ましくは式（Ｉ）〜（Ｖ）の１５〜２０個の重合残基を含有し、か つさらに随時、式（VI）の１つまたは２つの末端残基を有する。 前述のようにプローブの重合残基は互いに異なるかまたは同じであってもよい 。ある実施態様において、式（Ｖ）の重合残基は少なくとも７５重量％の（標識 物とリンカーを除いて計算した）、好ましくは少なくとも８０重量％、および最 も 好ましくは少なくとも９０重量％のプローブをを構成する。 プローブの末端残基上の末端は、以後「リンカー」と呼ぶ適切な置換基で置換 されてよい。末端は好ましくは、１〜５個のリンカー、より好ましくは１〜３個 のリンカーで置換される。このようなリンカーは好ましくは、上記で定義したＣ_1-15 アルキル、Ｃ_1-15アルケニルおよびＣ_1-15アルキニル基から選択される。リ ンカーは、置換されてもされなくても、分岐していてもしていなくても、または ヘテロ原子が割り込んでもよく、または上記で定義した官能基で置換されるかま たはこれを含有してもよい。これは末端残基の化学的性質（すなわち、残基の末 端が炭素、酸素または窒素原子であるかどうか）に依存する。末端または末端上 のリンカーはさらに、非分岐標識末端を形成するように、末端対末端で取り込ま れるか、または分岐標識末端（「ジッパー」）を形成するように取り込まれる、 １つまたはそれ以上の標識物で置換されてもよい。リンカーは、末端に直接結合 しているか、標識物もしくは末端上の標識物に結合しているか、または標識物が 末端に結合する前に末端に結合してもよい。２つの末端は、異なるかまたは同じ 置換基、リンカーおよび／または標識物を有してよいことを理解されたい。さら に、「標識物」という用語は、１つまたはそれ以上の標識物を含み、「リンカー 」という用語は、１つまたはそれ以上のリンカーを含むことを理解されたい。あ る応用のために、ペプチド核酸残基の間に１つまたはそれ以上のリンカーが取り 込まれることが有利なことがある。このような応用は、特に３本鎖形成に基づく ものである。 適切なリンカーの例は、−ＮＨ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_nＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−、 −ＮＨ（ＣＨＯＨ）_nＣ（Ｏ）−、 −（Ｏ）Ｃ（ＣＨ₂ＯＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）−および−ＮＨ（ＣＨ₂）ｎＣ（Ｏ）−、 ＮＨ₂（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_nＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−、 ＮＨ₂（ＣＨＯＨ）_nＣ（Ｏ）−、 ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ₂ＯＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）−、 ＮＨ₂（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）−、 −ＮＨ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_nＣＨ₂Ｃ（Ｏ）ＯＨ、 −ＮＨ（ＣＨＯＨ）_nＣ（Ｏ）ＯＨ、 −（Ｏ）Ｃ（ＣＨ₂ＯＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＯＨ、および −ＮＨ（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＯＨ（式中、ｎは０または１〜８までの整数であり、 好ましくは１〜３までの整数である）がある。非常に関係のあるリンカーの例は 、−ＮＨＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−、ＮＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−、 ＮＨ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₂ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−、および ＨＯ（Ｏ）ＣＣＨ₂ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）（ＮＨ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₂ＣＨ₂Ｃ（Ｏ））₂− がある。 本発明において「標識物」という用語は、検出または視覚化に有用な置換基を 意味する。適切な標識物は、蛍光物質、ビオチン、ジニトロ安息香酸、ジゴキシ ゲニン、ラジオアイソトープ標識物、ペプチドもしくは酵素標識物、化学発光標 識物、蛍光粒子、ハプテン、抗原もしくは抗体標識物を含む。 「ペプチド標識物」という用語は、非分岐型または分岐型（「ジッパー」）で 末端と末端で結合した、１〜２０の天然に存在するかまたは天然には存在しない アミノ酸、好ましくは１〜１０の天然に存在するかまたは天然には存在しないア ミノ酸、より好ましくは１〜８の天然に存在するかまたは天然には存在しないア ミノ酸、最も好ましくは１〜４の天然に存在するかまたは天然には存在しないア ミノ酸を含む標識物を意味する。このようなペプチド標識物は、互いに同一かま たは異なるアミノ酸から構成されてもよい。好適な実施態様においてこのような 非分岐または分岐末端は、１つまたはそれ以上、好ましくは１〜８の標識物、よ り好ましくは１〜４、最も好ましくは１または２のさらなる標識物を、ペプチド 標識物以外に含んでよい。このような標識物は、好ましくは非分岐末端または分 岐末端を終止させてもよい。１つまたはそれ以上のリンカーは、好ましくはペプ チド標識物および／またはさらなる標識が結合する前に、末端に結合する。この ようなリンカー単位はまた、ペプチド標識物とさらなる標識物の間に結合される 。さらにこのようなペプチド標識物は、ペプチド核酸残基の間に取り込まれても よい。 このようなプローブはまた、１〜８、好ましくは１〜４、最も好ましくは１ま たは２の標識物のような１つまたはそれ以上の標識物、および／または１つまた はそれ以上のリンカー単位を含み、これは内部に結合、すなわちプローブの骨格 に結合してもよい。リンカー単位および標識物は、前述のように互いに結合して もよい。 特定の関係のある標識物の例は、ビオチン、フルオレセイン標識物（例えば、 ５−（および６）−カルボキシ−フルオレセイン、５−、または６−カルボキシ フルオレセイン、６−（フルオレセイン）−５−（および６）−カルボキサミド ヘキサン酸およびフルオレセインイソチオシアネート）、１〜２０の天然に存在 するアミノ酸または天然には存在しないアミノ酸からなるペプチド標識物、ペル オキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、アルカリ性 ホスファターゼ、および大豆ペルオキシダーゼのような酵素標識物、ジニトロ安 息香酸、ローダミン、テトラメチルローダミン、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２ 、Ｃｙ３、およびＣｙ５）、クマリン、Ｒ−フィコエリスリン（ＲＰＥ）、アロ フィコエリスリン、テキサスレッド、プリンストンレッド、およびオレゴングリ ーン、ならびにＲ−フィコエリスリンと例えばＣｙ５またはテキサスレッドとの 結合体がある。 好適な標識物の例は、ビオチン、蛍光標識物、ペプチド標識物、酵素標識物お よびジニトロ安息香酸である。ペプチド標識物は、好ましくは１〜１０、より好 ましくは１〜８、最も好ましくは１〜４の天然に存在するまたは天然には存在し ないアミノ酸から構成される。１つまたはそれ以上の他の標識物、ならびにペプ チド標識物（例えば、１〜８、または１〜４の他の標識物、好ましくは１または ２の他の標識物）を取り込むことが特に有利である。 適切なペプチド標識物は、好ましくはシステイン、グリシン、リジンまたはオ ルニチンから構成される。 さらなる実施態様において、上記で定義されたＱ置換基は標識されてもよい。 適切な標識物は上記で定義したようなものである。Ｑとそのような標識物の間に 、上記で定義したようなリンカーを取り込んでもよい。そのような標識リガンド Ｑは、５位のチミンおよびウラシル標識、および７位の７−デアザグアニンおよ び７−デアザアデニン標識から選択される。 ペプチド核酸プローブの混合物はまた、本発明の一部である。そのような混合 物は、２３Ｓ ｒＲＮＡとハイブリダイズすることができる２つ以上のプローブ 、および／または１６Ｓ ｒＲＮＡとハイブリダイズすることができる２つ以上 のプローブ、および／または５Ｓ ｒＲＮＡとハイブリダイズすることができる ２つ以上のプローブを含んでもよい。プローブの混合物はさらに、前駆体ｒＲＮ Ａおよび／またはｒＤＮＡに向けられたプローブを含んでもよい。混合物はまた 、同じ測定法で２つ以上のマイコバクテリアを検出するためのペプチド核酸を含 んでもよい。 好適な実施態様においてペプチド核酸プローブのヌクレオ塩基配列は、問題の 標的配列のヌクレオ塩基配列と実質的に相補的であるように選択される。特に好 適な実施態様においてペプチド核酸プローブのヌクレオ塩基配列は、問題の標的 配列のヌクレオ塩基配列に相補的であるように選択される。「相補的」とは、プ ローブのヌクレオチド塩基と標的のヌクレオ塩基の間で完全な一致（すなわち、 Ａ対ＴまたはＧ対Ｃ）を可能にするように、ヌクレオ塩基が選択されることを意 味する。実質的に相補的であるとは、ペプチド核酸プローブは標的配列とハイブ リダイズすることができるが、プローブは必ずしも完全に標的と相補的ではない ことを意味する。例えば、標的配列および非標的配列と相補的でない１つまたは それ以上の塩基（特にプローブの末端に位置する塩基）を含むプローブ（ここで 、プローブ−標的核酸ハイブリッドの安定性に対する影響は小さい）。別の例は 、他の天然に存在する塩基を含むプローブである。従って、プローブが標的配列 にハイブリダイズすることができるなら、標的配列と非標的配列とのヌクレオ塩 基の差は、プローブ−非標的核酸ハイブリッドの安定性は、プローブ−標的核酸 ハイブリッドの安定性より低く、従ってそのような実質的に相補的なプローブが マイコバクテリアの検出に適することを確実にする。 プローブはミリポア社（Millopore Corporation）（ベッドフォード、マサチ ューセッツ州、アメリカ合衆国）から得られる「ＰＮＡ情報パッケージ」（ＰＮ ＡInformation Package）に記載の方法に従って合成されるか、またはエクペダ イト核酸合成システム（Expedite Nucleic Acid Synthesis System）（パーセプ チブバイオシステムズ（PerSeptive Bio Systems）、アメリカ合衆国）で合成さ れる。 リンカーまたはアミノ酸でプローブを延長するためにＦｍｏｃ法を使用するな ら、ＢｏｃまたはＭｔｔ基のような酸感受性保護基で保護された側鎖アミノ基を 保持することが可能である。この方法は、いくつかのＢｏｃ保護されたアミノ基 （これはすべて切断され、同じ合成サイクルで標識することができる）を含有す るリンカーを導入することを可能にする。 プローブを標識する１つの方法は、蛍光標識物、例えば５−（および６）−カ ルボキシフルオレセイン、５−または６−カルボキシフルオレセイン、または６ −（フルオレセイン）−５−（および６）−カルボキサミドヘキサン酸を使用す ることである。酸性基は、ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１− イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート ）またはＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３ ，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）で活性化され、ペ プチド核酸のＮ−末端アミノ基と反応させることができる。酸性官能基を含有す る他の標識基に同じ技術を適用することができる。あるいは、上記した標識物の スクシニミジルエステル標識物を使用するか、またはフルオレセインイソチオシ アネートを直接使用することが好ましい。 合成後プローブは、ミリポア社（Millopore Corporation）またはパーセプチ ブバイオシステムズ（PerSeptive BioSystems）により記載された標準的方法を 使用して樹脂から切断することができる。次にプローブを精製し、５０℃で逆相 ＨＰＬＣ法を使用して、フライトマススペクトル法（flight massspectrometry ）のマトリックスアシスチレーザー脱着／イオン化時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭ Ｓ）、プラズマ脱着質量スペクトル法（ＰＤＭＳ）、電子噴霧質量スペクトル法 （ＥＳＭＳ）、または高速原子衝撃法（ＦＡＢ−ＭＳ）により性状解析される。 一般的に式（IV）および（Ｖ）の重合残基を含むプローブのようなプローブは また、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、インターナショナル版（英語）、 ３５、１９３９−１９４２（１９９６）およびＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅ ｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４巻、８号、１０７７− １０８０（１９９４）に記載のように調製される。いくつかのプローブの化 学的性質は、例えばＮａｔｕｒｅ、３６５、５６６−５６８（１９９３）に記載 されている。 特許請求されている方法は、試料中に随時存在する１つまたはそれ以上のマイ コバクテリアの標的配列の検出のために使用することができる。この方法および プローブは、そのような標的配列の存在について試料を分析するための貴重な手 段を提供し、従って診断を確立するための情報を提供する。 本発明の測定法において、マイコバクテリアの存在について分析される試料は 、プローブとマイコバクテリアに由来する任意の試料ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡと の間のハイブリグイゼーションが起きる条件下で、本発明の１つまたはそれ以上 のプローブまたはそのようなプローブの混合物と接触させられ、もしハイブリッ ドが形成されれば、これは観察されるかまたは測定され、観察結果または測定値 は１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配列の存在に関係する。観察ま たは測定は、視覚的にまたは装置を使用して行われる。 本発明のプローブに接触する前に、試料は、種々のタイプの試料処理（精製、 汚染除去、および／または濃縮を含む）を受けてもよい。試料は、好ましくは次 亜塩素酸ナトリウムで処理して汚染除去し、次に遠心分離してマイコバクテリア を濃縮する。試料（例えば、喀痰試料）は、試料の粘度を低下させるＮ−アセチ ル−Ｌ−システインのようなムコ多糖分解剤、ならびに試料の汚染を除去する水 酸化ナトリウムで処理し、次に遠心分離してもよい。他の公知の汚染除去および 濃縮法には、ゼフィラン−トリソディウムホスフェート（Zephiran-trisodiumph osphate）法、ペトロフ（Petroff）の水酸化ナトリウム法、シュウ酸法ならびに 塩化セチルピリジニウム−塩化ナトリウム法がある。試料はまた、試料調製法（ 例えば、ろ過、免疫捕捉、２相分離を単独または組合せ）を応用して精製し濃縮 してもよい。試料調製法はまた、上記の遠心分離および汚染除去法とともに使用 してもよい。 試料は、直接にまたは１つまたはそれ以上の処理工程を受けた後に、主に２つ の主要な種類の測定法（ｉｎ ｓｉｔｕベースの測定法とインビトロベースの測 定法）で分析される。この意味においてｉｎ ｓｉｔｕベースの測定法は、標的 核酸がハイブリダイゼーションプロセスの間、細菌細胞内に留まる測定法として 理解される。例としては、塗抹試料や生検試料についてのｉｎ ｓｉｔｕハイブ リダイゼーション（ＩＳＨ）、ならびに懸濁液中の全細胞へのハイブリダイゼー ションがあり、これは次に、細菌を粒子（同じまたは異なるタイプとサイズ）上 に捕捉した後にフローサイトメトリーで分析されるか、または細菌を固体培地、 フィルターメンブランまたは他の実質的に平面な表面に広げた後に画像解析によ り分析される。 インビトロベースの測定法は、ハイブリダイゼーションの前に標的核酸が細菌 細胞から放出される測定法として理解される。そのような測定法の例には、マイ クロタイタープレートベースの測定法がある。何らかの方法で、放出された標的 核酸が固相に捕捉され、次に検出プローブにより分析される、多くの他のタイプ の測定法は実施可能であり、本発明の範囲にあると考えられる。さらにインビト ロベースの測定法は、標的核酸は固相上に捕捉されないがハイブリダイゼーショ ンとシグナル生成は完全に溶液中で起きる測定法を含む。 ｉｎ ｓｉｔｕベースの測定法の試料は、好ましくは支持体に適用され、随時 固定化される。試料を固体支持体に適用する方法は、問題の試料の型に依存し、 液体または液体試料について塗抹試料法および細胞遠心分離法があり、生検材料 については組織の切片化がある。固体支持体は、当該分野で公知の広範囲の種々 の形（例えば、顕微鏡スライド、フィルターメンブラン、ポリマー膜または種々 の材料のプレート）をとってよい。 インビトロベースの測定法では標的核酸は、マイコバクテリア細胞から種々の 方法で放出される。核酸を放出するための多くの方法は、細胞壁を破裂（溶解） させ、次に核酸を緩衝化溶液中に抽出する。マイコバクテリアは、共有結合した ペプチドグリカン、アラビノガラクタン、および特にミコール酸を含有する複雑 な細胞壁を有するため、これらは、他の細菌の迅速な溶解に使用される標準的方 法によっては容易に破砕することができない。マイコバクテリア細胞壁をうまく 溶解することが知られている可能な方法は、有機溶媒を用いる処理、強いカオト ロピック試薬（例えば、高濃度のチオシアン酸グアニジン）を用いる処理、酵素 処理、ビーズビーティング（bead beating）、熱処理、超音波処理および／また はフレンチプレスの適用がある。 ｉｎ ｓｉｔｕ測定法により分析される試料は、ハイブリダイゼーション前に 固定されてよい。当業者は、適切な方法は、試験される試料の型に依存すること は容易に理解するであろう。固定および／または固定化は、好ましくは細胞マト リックスおよび核酸の形態的完全性を保存するものである。固定法の例は、炎光 固定、熱固定、化学的固定および凍結がある。炎光固定は、スライドをブンゼン バーナーの青い炎心中を３回または４回通過させることにより行われる。熱固定 は、試料を８０℃に２時間加熱することにより行われる。化学的固定は、試料を 固定剤（例えば、ホルムアミド、メタノールまたはエタノール）中に浸漬するこ とにより行われる。凍結は特に生検および組織切片に関し、通常液体窒素中で行 われる。 １つのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション測定法の例では、分析される試 料は、実質的に平面の固体支持体（顕微鏡スライド、フィルターメンブラン、ポ リマー膜、または平面の表面を有する他の型の固体支持体）上に塗抹される。好 適な固体支持体は、顕微鏡スライドである。塗抹試料が調製された後、これは随 時さらに、殺菌剤による処理または例えばエタノールへの浸漬によるさらなる固 定のような前処理を受ける。試料はまた、主要な機能として細胞を透過性にし、 および／または試料の粘度を低下させる酵素で前処理される。非特異結合を引き 起こす可能性のある部位をブロックするために、プレハイブリダイゼーション工 程を行うことが、さらに有利である。この目的のために、スキムミルクや非標的 プローブのようなブロッキング剤の使用が適している。プレハイブリダイゼーシ ョン混合物の成分は、プローブに非特異的に結合する可能性のある試料中の部位 を有効に飽和するように選択される。プレハイブリダイゼーション緩衝液は、適 切な緩衝液、ブロッキング剤、および界面活性剤を含むことが好適である。 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの間、本発明の１つまたはそれ以上の プローブは、適切な厳密性条件下でハイブリダイゼーション溶液中で細胞内の標 的ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡと接触させられる。適用されるプローブの濃度は、プ ローブの化学的性質およびハイブリダイゼーションが行われる条件に依存して、 変動する。典型的には１nM〜１μＭのプローブ濃度が適している。ハイブリダイ ゼーション溶液は、変性剤が無い場合より低温でハイブリダイゼーションが起き ることを可能にする変性剤を含んでよい。変性剤は、特異的結合と非特異結合の 比を増加させるのに有効な量で存在する。変性剤の有効量は、使用される種類お よびプローブまたはプローブの組合せに依存する。変性剤の例には、ホルムアミ ド、エチレングリコール、およびグリセロールがあり、これらは好ましくは１０ ％より高く７０％より低い濃度で使用される。好適な変性剤はホルムアミドであ り、これはより好ましくは２０％〜６０％で使用され、最も好ましくは３０％〜 ５０％で使用される。いくつかの例においては、変性剤を含むことが必要でない かまたは有利でないことがある。 ハイブリダイゼーションの前またはハイブリダイゼーションの間、ランダムプ ローブ（随時異なる長さを有するランダムな選択されていない配列を有するプロ ーブ）の混合物を、非特異結合を低下させるために過剰に加えられてよい。また １つまたはそれ以上の非センスプローブ（規定されたヌクレオ塩基配列を有し、 標的配列のヌクレオ塩基配列とは異なる長さを有するプローブ）を、非特異結合 を低下させるために過剰に加えてよい。また１つまたはそれ以上の非標的核酸配 列への検出可能なプローブの非特異結合は、１つまたはそれ以上の非標識または 独立に検出可能なプローブを添加することにより抑制され、このプローブは非標 的配列に対して相補的である配列を有する。非標的配列が１つだけのミスマッチ により標的配列と異なる時、そのようなブロッキングプローブを加えることが特 に有利である。 ハイブリダイゼーション溶液中のプローブの有効濃度を上昇させると考えられ ている不活性ポリマーを含むことが有利なことがある。そのような巨大分子の１ つは、デキストラン硫酸であり、これは２．５％〜１５％の濃度で使用される。 デキストラン硫酸の場合、好適な濃度範囲は、８％〜１２％である。他の有用な 巨大分子は、ポリビニルピロリドンとフィコールであり、これらは典型的にはよ り低い濃度（例えば、０．２％）で使用される。ペプチド核酸プローブの非特異 結合の程度を低下させる１つまたはそれ以上の界面活性剤を加えることが、さら に有利である。有用な界面活性剤の例には、ドデシル硫酸ナトリウム、ツイーン ２０（登録商標）またはトリトンＸ−１００（登録商標）がある。界面活性剤は 、通常０．０５％〜１．０％、好ましくは０．０５％〜０．２５％の濃度で使用 さ れる。ハイブリダイゼーション溶液はさらに、塩を含有してもよい。正しいハイ ブリダイゼーションを得るために塩を含めることは必要ではないが、２〜５００ mM、好ましくは５〜１００mMの塩を含むことが有利であり得る。 ハイブリダイゼーションの間、他の重要なパラメータは、ハイブリダイゼーシ ョン温度、プローブの濃度、およびハイブリダイゼーション時間である。当業者 は、具体的な状況（例えば、プローブの選択、ハイブリダイゼーション緩衝液の 成分の種類と濃度、特に界面活性剤の濃度）に従って、上記パラメータのそれぞ れについて最適条件を決定することが必要であることを容易に理解するであろう 。容量排除物質（volume excluder）の存在も影響を与え得る。 ハイブリダイゼーション後、試料を洗浄して、結合していないプローブおよび 非特異結合しているプローブを除去し、次に適切な厳密性条件が使用される。厳 密性（stringency）とは、反応条件が、形成されたハイブリッドの溶解を促進す る程度を意味する。厳密性は、典型的には洗浄温度および／または洗浄時間を上 げることにより上昇される。典型的には５〜４０分の洗浄時間が充分である。よ り短い２回またはそれ以上の洗浄は、良好な結果を与え得る。生理学的緩衝液、 リン酸緩衝液、および標準的クエン酸緩衝液を含む、ある範囲の緩衝液が使用さ れる。塩濃度に対する応答の差のために、緩衝液中の低塩濃度に対する要求は、 ＤＮＡプローブ測定法ほど直接関係はない。ある場合には、洗浄緩衝液のｐＨの 上昇は、シグナル対ノイズ比を与えることがあるため、有利である（ＷＯ９７／ １８３２５号を参照）。これはおそらく、非特異結合が大幅に低下するためであ ろう。すなわち、ｐＨ範囲が８〜０．５、好ましくは９〜１０の洗浄溶液を使用 することが有利である。 結合したプローブの視覚化は、選択された標識物の種類を考慮して行わなけれ ばならない。広範囲の有用なプローブ標識物、特に種々の蛍光標識物（例えば、 フルオレセイン、ローダミン、およびこれらの誘導体）がある。さらに酵素（例 えば、ペルオキシダーゼおよびホスファターゼ）やハプテン（例えば、ビオチン 、ジゴキシゲニン、ジニトロ安息香酸）のような標識物の利用が適している。蛍 光標識物の場合は、形成されるハイブリッドは、少なくとも×２５０、好ましく は×１０００の倍率の顕微鏡を使用して視覚化される。視覚化はさらに、随時コ ン ピューターにより制御されたＣＣＤ（電荷結合素子）カメラを使用して行われる 。ハプテンが標識物として使用される時、ハイブリッドは酵素と結合した抗体を 使用して検出される。これらの場合に、検出工程は、比色法、蛍光法または発光 法に基づく。 あるいはプローブは、粒子中に埋め込まれたか（例えば、エスタポール（Esta por）Ｋ着色ミクロスフェア）、粒子の表面上に存在するか、および／または粒 子の表面に結合した、蛍光標識物を有する蛍光粒子で標識される。すべての粒子 は、細胞内で標的核酸と接触しなければならないため、蛍光粒子の使用は、細菌 の前処理を必要とする。比較的小さな粒子（例えば、約２０nm）の使用が好適で ある。 別のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、凍結組織または生検試 料は薄い切片に切断され、実質的に平面の表面（好ましくは顕微鏡スライド）に 移される。ハイブリダイゼーションの前に、組織または生検試料は、固定剤（好 ましくはアセトンのような沈殿性固定剤）により処理されるか、または試料は、 緩衝化ホルムアルデヒドの溶液中でインキュベートされる。あるいは生検または 組織切片は、固定剤（例えば、緩衝化ホルムアルデヒド）に１２〜２４時間移さ れ、固定後、組織はパラフィン中に包埋され、そこからブロックを形成し、これ を薄い切片に切断する。ハイブリダイゼーションの前に、組織切片のロウを除去 し、標準的方法を使用して水和する。透過性化（例えば、プロテアーゼ、希酸、 界面活性剤、アルコールおよび／または熱、による処理）は、ある場合に有効で ある。透過性化のために選択される方法は、いくつかの要因（例えば、使用され る固定剤、固定の程度、試料の種類とサイズ、および適用されるプローブ）に依 存する。これらの種類の試料、試料処理、プレハイブリダイゼーション、ハイブ リダイゼーション、洗浄および視覚化は、同じかまたは前記の調整された条件を 使用して行われる。 ｉｎ ｓｉｔｕ測定法のさらなる実施態様において、細菌細胞は、上記条件と 同じであるかまたは類似の条件を使用して行われ、固定、プレハイブリダイゼー ション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の間、懸濁液中に維持される。この 実施態様の標識物の好適な種類は、蛍光標識物である。これは、細胞あたりの蛍 光の強度を記録して、フローサイトメトリーによるハイブリダイゼーションした 細胞の検出を可能にする。懸濁液中の細菌細胞は、粒子好ましくは２０nm〜１０ μｍのサイズの粒子に結合される。粒子は、ラテックス、デキストラン、セルロ ースおよび／またはアガロースのような当該分野で公知の材料から構成されてよ く、随時常磁性であるかまたは蛍光標識物を含有してもよい。通常細菌細胞は、 標的細菌に対する抗体を使用して粒子に結合されるが、分子インプリンティング のような他の手段も使用される。粒子への細菌細胞の結合は、試料処理および／ または検出において有効である。 上記ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの実施態様において、本発明のプ ローブは、１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配列を検出するために 使用される。好適な実施態様において、プローブは、結核菌複合体（ＭＴＣ）の マイコバクテリア、結核菌複合体以外のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）、または マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）複合体のマイコバクテ リア（ＭＡＣ）の標的配列を検出するのに適している。プローブはさらに、同じ マイコバクテリアに由来する異なる標的配列を同時に検出するのに適している。 インビトロベースの測定法を使用して分析される試料は、細菌細胞から核酸が 放出される処理を受ける必要がある。核酸は有機溶媒、強いカオトロピック試薬 （例えば、高濃度のチオシアン酸グアニジン）、酵素、ビーズビーティング（be ad beating）、熱処理、超音波処理および／またはフレンチプレスを使用して放 出される。得られた核酸は、ハイブリダイゼーションの前に追加の精製を受けて もよい。 １つのインビトロハイブリダイゼーション実施態様において、標的核酸を含む 試料は、固定化捕捉プローブおよび検出プローブとして機能するように標識され た１つまたはそれ以上のプローブを含む容器に加えられる。ハイブリダイゼーシ ョンは、適切な厳密性条件下で行われる。ハイブリダイゼーション溶液はさらに 、ｉｎ ｓｉｔｕ型の測定法について記載したように、変性剤、ブロッキングプ ローブ、不活性ポリマー、界面活性剤および塩を含んでよい。同様に、ハイブリ ダイゼーション温度、プローブ濃度およびハイブリダイゼーション時間は重要な パラメータであり、測定法の具体的な条件（例えば、ペプチド核酸プローブの選 択、 およびハイブリダイゼーション緩衝液の成分の一部の濃度）に従って調節する必 要がある。標的核酸と捕捉プローブおよび検出プローブとのハイブリダイゼーシ ョンは、２つの別個の工程で行なってもよい。ｉｎ ｓｉｔｕ測定法では、ハイ ブリダイゼーションがよりよく調節され、洗浄がより効率的に行われるため、捕 捉プローブの濃度はより高くてもよい。 捕捉プローブは、任意の手段（例えば、リンカー上のカルボン酸とアミノ誘導 体化支持体との結合反応）により固体支持体に固定化される。捕捉プローブはさ らに、光化学活性化の前に固体支持体に吸着的に結合した光活性化基の光活性化 により、固体支持体上に結合されてよい。このような光活性化基は、ＵＳ５３１ ６７８４Ａ号に記載されている。捕捉プローブはさらに、固体支持体への親和性 ベースの固定化を可能にするハプテンに結合してもよい。このような例の１つは 、プローブへのビオチンの結合、およびストレプトアビジン被覆表面への結合を 介する固定化である。 固体支持体は、当該分野で公知の種々の型（例えば、１つまたはそれ以上のウ ェルを有するマイクロタイタープレート、フィルターメンブラン、ポリマー膜、 試験管、ディップスティック、ストリップおよび粒子）を取ることができる。フ ィルターメンブランは、セルロース、酢酸セルロース、ポリビニリデンフルオリ ドまたは当該分野で公知の任意の他の物質から作成されてよい。ポリマー膜は、 ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、または当該分野で公知の任意の他の 物質から作成されてよい。粒子は、常磁性ビーズ、ポリスチレン、ポリプロピレ ン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミロース、セルロース、ポリア クリルアミドおよびアガロースから作成されるビーズでもよい。固体支持体がフ ィルター、膜、ストリップまたはビーズの型を取る時、これは単回使用装置に取 り込まれてもよい。 検出プローブの標識物の選択は、具体的な測定フォーマットおよび可能性のあ る装置に依存する。ビオチン標識プローブが使用される時、ハイブリッドはスト レプトアビジンまたはビオチン標識物に対する抗体を使用して検出され、この抗 体またはストレプトアビジンは、酵素に結合しており、実際の検出は、具体的な 酵素（好ましくはホスファターゼまたはペルオキシダーゼ）および選択された酵 素の基質の選択に依存する。シグナルはある場合には、ビオチニレートプローブ のための触媒シグナル増幅系（ダコ（DAKO）によるＣＳＡ）のような市販の増幅 系を使用して増強される。種々のポリマーベースの増強系を使用することもでき る。１つの例は、ハプテン特異的抗体および酵素が結合しているデキストランポ リマーである。検出プローブはさらに、他のハプテン（例えば、ジゴキシゲニン 、ジニトロ安息香酸およびフルオレセイン）で標識され、この場合ハイブリッド は、ハプテンに対する抗体であって酵素が結合してもよい抗体を使用して検出さ れる。プローブ上に直接結合した酵素を有する検出プローブを利用することも可 能である。比色（基質、例えばｐ−ニトロ−フェニルリン酸またはテトラ−メチ ル−ベンジジン）、蛍光（基質、例えば４−メチルウンベリフェリルホスフェー ト）、または化学発光（基質、例えば１，２−ジオキセタン）検出を可能にする 酵素基質の選択の、広範囲の可能性がある。 検出プローブはさらに、種々の蛍光標識物（好ましくは、フルオレセインまた はローダミン）で標識されてよく、この場合ハイブリッドは、蛍光を測定するこ とにより検出される。 検出プローブは典型的には、捕捉プローブとは異なり、従って２重の分子種特 異性を確保する。２重特異性は、ほとんどの場合プローブの少なくとも１つは短 い（例えば、１０量体プローブ）であることを可能にするであろう。 さらにプリンの多い配列の捕捉は、捕捉プローブとしてビス−ペプチド核酸を 使用することにより改善される。このようなビス−ペプチド核酸は、ＷＯ９６／ ０２５５８号に記載されている。ビス−ペプチド核酸は、標的核酸に平行にハイ ブリダイズすることができる第１のペプチド核酸鎖と、捕捉される核酸のプリン の多い配列に反平行にハイブリダイズすることができる第２のペプチド核酸鎖を 含む。２つのペプチド核酸鎖はリンカーで連結され、こうしてプリンの多い配列 核酸を有する３本鎖構造を形成することができる。各リンカーで分離されたペプ チド核酸の重合残基の数は、非ビス−ペプチド核酸についてすでに定義したもの である。しかし形成される３本鎖の高い安定性のために、短い第１のおよび第２ の鎖を有するビス−ペプチド核酸は、ピリミジンの多いプローブの設計をより容 易にするように使用される。 検出プローブを使用する代わりに、捕捉プローブ：核酸複合体が、ペプチド核 酸と核酸の間で形成される複合体と特異的に反応する抗体に基づく検出系（ＷＯ ９５／１７４３０号に記載のようなもの）を使用して検出され、この検出系では 、一次抗体は標識物を含むか、または検出系は標識された２次抗体を含み、これ は一次抗体に特異的に結合する。具体的な検出はまた、選択される基質（これは 、前記した任意の種類のもの）に依存する。 具体的な測定フォーマット、標識および検出原理に依存して、種々のタイプの 装置（マイクロタイタープレートリーダー、ルミノメーターおよびフローサイト メーターを含む）が利用される。適切な装置の利用は、測定の自動化を可能にす る。 この実施態様の例において、本発明の捕捉プローブは、アントラキノン標識捕 捉プローブとマイクロウェルのポリスチレンの間の光化学反応により、マイクロ タイタープレートに結合している。標的ｒＲＮＡはマイクロウェルに添加され、 厳密性条件下でインキュベートされる。結合しないｒＲＮＡは洗浄により除去さ れ、マイクロウェルは、厳密性条件下でハプテン標識検出プローブとインキュベ ートされる。ハプテンに対する酵素標識抗体を使用して視覚化が行われ、これは 非結合抗体の除去後、化学発光基質を使用して検出される。 この実施態様の別の例では、捕捉プローブがラテックス粒子に結合し、ハイブ リダイゼーションは、適切な条件下で例えばフルオレセイン標識検出プローブの 存在下で行われる。ハイブリダイゼーションと随時洗浄の後、ハイブリッドはフ ローサイトメトリーにより検出される。一連の異なるビーズ（例えば、サイズま たは色により）は、異なる標的のための異なる捕捉プローブを有し、多重検出系 を可能にする。 インビトロ測定フォーマットのさらなる実施態様において、捕捉プローブ、標 的核酸および検出プローブは溶液中でハイブリダイズし、次に捕捉プローブは固 相に結合してもよい。固相、ハイブリダイゼーション条件および検出手段は、上 記の具体的な方法に従って選択される。 インビトロ測定法のさらなる実施態様において、標的核酸は、フィルターまた はポリマー膜または当該分野で公知の他のタイプの固相上に固定化される。ハイ ブリダイゼーション条件および検出手段は、上記の具体的な方法に従って選択さ れる。 インビトロ測定法のさらなる実施態様において、異なる標的配列に向けられた 最大１００のまたはそれ以上の異なるプローブのアレイが固体表面に固定化され 、同時にすべてのプローブへの標的配列のハイブリダイゼーションが行われる。 固相、ハイブリダイゼーション条件および検出手段は、上記したものでよい。こ れは、一連のパラメータ（すなわち、分子種同定および耐性パターン）の同時検 出または同定を可能にする。 本発明はさらに、マイコバクテリアによる感染症を診断する方法、および感染 のステージを測定する方法、および本発明の１つまたはそれ以上の随時標識され たプローブが患者試料と接触させられる方法による適切な処理を提供し、処理の タイプおよび／または処理の効果が評価される。 上記で定義した少なくとも１つのペプチド核酸プローブを含むキットはまた、 本発明の一部である。このようなキットは、少なくとも１つの検出試薬および／ または固相捕捉システムを有する検出系を含んでよい。 具体的な実施態様の説明 隣接残基の適切なＱの例を以下に示す。このようなＱを含むペプチド核酸プロ ーブは、マイコバクテリア、特にＭＴＣ群のマイコバクテリアまたはＭＴＣ群の マイコバクテリア以外のマイコバクテリアの検出に適している。プローブは、Ｎ −末端からＣ−末端に対応して左から右へ書かれる。ＭＴＣ群の２３Ｓおよび１ ６Ｓ ｒＲＮＡならびに５Ｓ ｒＲＮＡを検出するための適切なＱのサブ配列を 以下に示す。ＭＴＣ群のマイコバクテリア以外のマイコバクテリアの２３Ｓおよ び１６Ｓ ｒＲＮＡを検出するための適切なＱのサブ配列を以下に示す。Ｑサブ 配列は、カッコに示す位置から選択されるヌクレオ塩基に相補的な少なくとも１ つのヌクレオ塩基を含む。Ｑサブ配列は、適切なプローブヌクレオ塩基配列の作 成の非限定例として示す。プローブは、記載のものより少ないかまたは多いペプ チド核酸残基を含有してもよいことを理解されたい。 適切なＱサブ配列のその他の例は以下に示される。 マイコバクテリウム・ゴルドナエ（M．gordonae）１６Ｓ ｒＲＮＡ（ジーン バンク（GenBank）エントリーＧＢ：ＭＳＧＲＲ１６ＳＩ、受け入れ番号Ｍ２９ ５６３の、それぞれ174〜188および452〜466位）に相補的であるように選択され る、 および これらの位置は、図２と５に示される整列の、それぞれ192〜206および473〜487 位に対応する。この配列または類似のヌクレオ塩基配列を有するプローブは、マ イコバクテリウム・ゴルドナエ（M．gordonae）を検出するのに適している。 マイコバクテリウム・カンサシイ（M．kansasii）２３Ｓ ｒＲＮＡ（ジーン バンク（GenBank）エントリーＭＫ２３ＳＲＲＮＡ、受け入れ番号Ｚ１７２１２ ）の、それぞれ781〜795および2369〜2383位に相補的であるように選択される、および これらの位置は、図１と４に示される整列の、それぞれ774〜794および2398〜24 12位に対応する。この配列または類似のヌクレオ塩基配列を有するプローブは、 マイコバクテリウム・カンサシイ（M．kansasii）を検出するのに適している。 前駆体ｒＲＮＡ 上記ヌクレオ塩基配列を有するペプチド核酸プローブは、結核菌（M．tubercu losis）前駆体ｒＲＮＡに向けられている。このプローブはジーンバンク（GenBa nk）受け入れ番号Ｘ５８８９０の６０２〜６１６位に相補的である。 特に配列認識番号である配列番号６２、７９および８０を有するヌクレオ塩基 配列に基づくプローブ（および、図１Ｆの１３６１〜１３６４位、図４Ｋの２７ １９位、および図４Ｌの２８０９位から選択される他のプローブ）は、マイコバ クテリウム・アビウム（M．avium）を検出するのに適している。配列認識番号で ある配列番号５５を有するヌクレオ塩基配列に基づくプローブ（および、図４Ｅ の７６３〜７８９位から選択される他のプローブ）は、マイコバクテリウム・ア ビウム（M．avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（M．intracellul are）、およびマイコバクテリウム・スクロフラセウム（M．scrofulaceum）を群 （マイコバクテリアのＭＡＩＳ群と呼ばれる生物）として検出するのに適してい る。さらに、配列認識番号である配列番号７７と８１を有するヌクレオ塩基配列 に基づくプローブは、マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）、マイコバク テリウム・イントラセルラレ（M．intracellulare）、およびマイコバクテリウ ム・パラツベルクロシス（M．paratuberculosis）を群として検出するのに適し ている。 本発明をさらに以下の非限定例により例示する。 例 例１ マイコバクテリア種（マイコバクテリウム・ボビス（M．bovis）とマイコバク テリウム・イントラセルラレ（M．intracellulare））２３Ｓ ｒＤＮＡをＰＣ Ｒにより部分的に増幅し、ＰＣＲ産物をＣｙ５標識オリゴヌクレオチドプライマ ー（ディーエヌエーテクノロジー（DNA Technology）、アールス（Aarhus）、デ ンマーク）とアマシャム（Amersham）（リトルチャルフォント（Litte Charlfor nt）、イングランド）からの７−デアザ−ｄＧＴＰサーモシーケナーゼサイクル 配列決定キット（Thermo Sequenase cycle sequencing kit）を使用して配列決 定した。配列は、ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech）（ウプサラ、 スエーデン）のアルフェックスプレス（ALFexpress）自動シーケンサーとアルフ ウィン（ALFwin）（バージョン１．１０）ソフトウェアを使用して呼んだ。マイ コバクテリウム・ボビス（M．bovis）とマイコバクテリウム・イントラセルラレ （M．intracellulare）の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を、２３Ｓ ｒＤＮＡ配列整列 の以下の位置に含める：６８１〜７２９位（図ＩＣと４Ｄ）、７６１〜８００位 （図１Ｄと４Ｅ）、２４０１〜２４４０位（図１Ｈと４Ｋ）、２４４１〜２４８ ０位（図１ｌと４Ｋ）、２４８１〜２５２０位（図１ｌ）、３０４１〜３０８０ 位（図４Ｌ）、および３０８１〜３１２０位（図１Ｊと４Ｌ）。 例２ ディーエヌエースター（DNASTAR）（マジソン、ウィスコンシン州、米国）の メガリン（Megalign）（バージョン３．１２）整列ツールを使用して、ＭＴＣ群 のマイコバクテリアの２３Ｓ、１６Ｓ、および５Ｓ ｒＤＮＡと、ＭＴＣ群のマ イコバクテリア以外（ＭＯＴＴ）のマイコバクテリアの２３Ｓおよび１６Ｓ ｒ ＤＮＡの配列整列を行なった（図１〜５を参照）。一度に最大１００配列が整列 された。 ディーエヌエースター（DNASTAR）のプライマーセレクト（PrimerSelect）プ ログラム（バージョン３．０４）を使用して、２次構造を考慮して、ヌクレオ塩 基配列が、特徴的なマイコバクテリアｒＲＮＡに相補的な、ペプチド核酸プロー ブを設計した。次に、配列特異性の対照として、ナショナルセンターフォーバイ オテクノロジーインフォメーション（Natlonal Center for Biotechnology Info rmation）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）でブラスト（BLAST）配列類似性検 索を使用して、ジーンバンク（GenBank）およびイーエムビーエル（EMBL） データベースに一致させた。 例えば、以下の配列を選択した： 例３ パーセプチブバイオシステムズ（PerSeptive BioSystems）（フラミンガム、 アメリカ合衆国）から購入したエクペダイト８９０９核酸合成システム（Expedi te 8909 Nucleic Acid Synthesis System）を使用して、ペプチド核酸プローブ を合成した。ペプチド核酸プローブは、２つのβ−アラニン分子または１つもし くは２つのリジン分子で停止させ、樹脂から切断する前に、アラニン（ペプチド 標識）のβ−アミノ基またはリジン（ペプチド標識）のε−アミノ基で、それぞ れ５−（または６）−カルボキシフルオレセイン（Ｆｌｕ）またはローダミン（ Ｒｈｏ）で標識した。プローブは、逆相ＨＰＬＣを使用して５０℃で精製し、Ｇ ２０２５Ａ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ装置（ヒューレットパッカード（Hewlet t Packard）、サンフェルナンド（San Fernando）、カリホルニア州、米国）を 使用して性状解析した。測定した分子量は、計算された分子量の０．１％以内で あった。 以下の標識ペプチド核酸プローブを合成した： 例４ まずマイコバクテリアｒＲＮＡの標的配列に反応するペプチド核酸プローブの 能力を、マイコバクテリウム・ボビス（M．bovis）ＢＣＧ、マイコバクテリウム ・アビウム（M．avium）および大腸菌（E．coli）を用いて、ドットブロットに より試験した。 マイコバクテリウム・ボビス（M．bovis）ＢＣＧ（スタテンスシーラムインス ティテュート（Statens Serum Institut）、デンマーク）とマイコバクテリウム ・イントラセルラレ（M．intracellulare）（スタテンスシーラムインスティテ ュート（Statens Serum Institut）から供与された）を、ヅボス（Dubos）ブロ ス（スタテンスシーラムインスティテュート（Statens Serum Institut））また で増殖させた。ＴＲＩ試薬（シグマ（Sigma））を製造業者の説明書に従って使 用して、細菌細胞からＲＮＡを単離した。大腸菌（E．coli）ｒＲＮＡは、ベー リンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim）（ドイツ）から購入した。 ２００ngのマイコバクテリウム・ボビス（M．bovis）ＲＮＡ、マイコバクテリ ウム・イントラセルラレ（M．intracellulare）ＲＮＡおよび大腸菌（E．coli） Ｙ１３Ｎ）にドットし、膜を乾燥させ、紫外線下で２分間固定した。 ドットブロット測定法のプロトコール 各プローブ（ハイブリダイゼーション溶液（５０mMトリス、１０mM ＮａＣｌ 、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５mM ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）ピロリン酸ナトリウム、０．２％（ｗ／ｖ）ポリ ビニルピロリドン、０．２％（ｗ／ｖ）フィコール、ｐＨ７．６）中７０nMのプ ローブ）を膜の上にスポットした。それぞれ５５℃または６５℃で１．５時間ハ イブリダイゼーションを続けた。０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＰＥ緩衝液 （１×ＳＳＰＥ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０mMリン酸ナトリウム、１mM ＥＤ ＴＡ、ｐＨ７．４）中で膜を１５分間２回洗浄し、次に０．１％ＳＤＳを含有す る０．１×ＳＳＰＥ緩衝液中で、５５または６５℃で１５分間２回洗浄した（表 １を参照）。膜を、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ トリス／塩酸（ｐＨ９． ０）に溶解した０．５％（ｗ／ｖ）カゼインでブロッキングした。次に、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ トリス／塩酸（ｐＨ９．０）に溶解した０．５％（ ｗ／ｖ）カゼインで１：２０００希釈したアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）（ ダコ（DAKO）Ｋ００４６バイアルＡ）で標識したウサギ抗ＦＩＴＣ抗体で、１時 間インキュベートした。インキュベーション後、周囲温度でＴＳＴ緩衝液（０． ０５Ｍトリス、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％（ｗ／ｖ）ツイーン２０（登録商 標）、ｐＨ９）で、膜を５分間３回洗浄した。結合したプローブを、ＢＣＩＰ／ ＮＢＰを使用する標準法で視覚化し、１０mM ＥＤＴΛで１０分間インキュベー トして視覚化を停止させた。ブロットを５０℃で乾燥させた。 結果を以下の表１に示す。 結果は、すべての５つのペプチド核酸プローブが、マイコバクテリウム・ボビ ス（M．bovis）ＢＣＧ ｒＲＮＡ（ＭＴＣ群の代表として）の標的配列にハイブ リダイズすることができ、一方大腸菌（E．coli）ｒＲＮＡ（マイコバクテリア 以外の微生物の代表として）へのハイブリダイゼーションや、そしてマイコバク テリウム・イントラセルラレ（M．intracellulare）ｒＲＮＡ（ＭＯＴＴ群の代 表として）への検出可能なハイブリダイゼーションは観察されなかったことを示 す。 例５ 本例は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）では、マイ コバクテリア細胞壁を貫通し、従ってＭＴＣ群のマイコバクテリアの標的配列に ハイブリダイズするが、ＭＯＴＴ群（特に、ＭＡＣ群のマイコバクテリアではな い）または淋菌（Neisseria gonorrhoeae）へはハイブリダイズしない、ペプチ ド核酸プローブの能力を例示する。 細菌スライドの調製 マイコバクテリウム・ボビス（M．bovis）ＢＣＧ（スタテンスシーラムインス テイテュート（Statens Serum Institut）、デンマーク）、マイコバクテリウム ・アビウム（M．avium）（スタテンスシーラムインスティテュート（Statens Se rum Institut）から供与された）、およびマイコバクテリウム・イントラセルラ レ（M．intracellulare）（スタテンスシーラムインスティテュート（StatensSe rum Institut）から供与された）を、ヅボス（Dubos）ブロス（スタテンスシー ラムインスティテュート（Statens Serum Institut））またはレーウェンスタ ティテュート（Statens Serum Institut））中で３７℃で増殖させた。淋菌（N ．gonorrhoeae）を、チョコレート寒天（スタテンスシーラムインステイテュー ト（Statens Serum Institut））上で、３７℃でさらに５％二酸化炭素を用いて 増殖させた。 培養物を顕微鏡スライドに塗抹し、標準法に従って固定した。ハイブリダイゼ ーションの前に、塗抹試料を８０％エタノールに１５分間浸漬し、次に水で洗浄 し、空気乾燥した。この工程は以下のハイブリダイゼーション工程にとって必須 ではないが、これはスライド上の生存マイコバクテリアを死滅させ、さらに追加 の固定工程として作用する可能性がある。 蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のプロトコール １．細菌スライドを、問題のプローブを含有するハイブリダイゼーション溶液で カバーした。 ２．スライドを、加湿インキュベーションチャンバー中で４５℃または５５℃で ９０分間インキュベートした。 ３．スライドを、あらかじめ暖めた洗浄溶液（５mMトリス、１４５mM ＮａＣｌ 、ｐＨ１０）中で４５℃または５５℃で２５分間洗浄し、次に水で３０秒間洗浄 した。 ４．スライドを乾燥し、イマゲンマウンティング液（IMGAGEN Mounting Fluid） （ダコ（DAKO）、コペンハーゲン、デンマーク）でマウントした。 ハイブリダイゼーション溶液は、５０mMトリス、１０mM ＮａＣｌ、１０％（ ｗ／ｖ）デキストラン硫酸、３０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｖ／ｖ ）トリトンＸ−１００（登録商標）、５mM ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）ピロ リン酸ナトリウム、０．２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．２％（ｗ／ ｖ）フィコー−ル（ｐＨ７．６）を含有した。 可能な場合は、ヌクレアーゼを不活性化するために、使用した装置は熱処理し 、溶液は、１μｌ/mlジエチルピロカーボネート（シグマケミカル社（Sigma Che mical Co.）に暴露した。 顕微鏡観察は、１００×／１．２０水対物レンズ、ＨＢＯ １００Ｗランプお よびＦＩＴＣフィルターセットを取り付けた蛍光顕微鏡（ライカ（Leica）、ウ ェツラー（Wetzlar）、ドイツ）を使用して行なった。マイコバクテリアは、蛍 光性の１〜１０μｍの細い桿状の菌として同定された。 ＭＴＣ群のマイコバクテリア（ＯＫ３０６、ＯＫ３０９、ＯＫ４４６、ＯＫ４ ４９）の２３Ｓ ｒＲＮＡ、ＭＴＣ群のマイコバクテリア（ＯＫ３１０）の１６ Ｓ ｒＲＮＡをターゲティングするフルオレセイン標識ペプチド核酸プローブを 試験した。各プローブ濃度とインキュベーション温度を、表２と３に結果ととも に示す。 プローブは、マイコバクテリア培養物のマイコバクテリア細胞壁を貫通するこ とができ、従って標的ｒＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができると結論で きる。これは、マイコバクテリアの特異的検出のための、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハ イブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プロトコールの開発を可能にする。 例６ 喀痰の臨床塗抹試料上のプローブの検査 臨床試料中のＭＴＣ群のマイコバクテリアの細胞壁を貫通するペプチド核酸の 能力を、結核が疑わしい症例からの喀痰の塗抹試料（ラマチボジ（Ramathibodi ）病院の微生物学部門（Division of Microbiology）から供与された、バンコク 、タイ）について蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）で試 験した。同じ患者の塗抹試料はチール−ニールセン（Ziehl- Neelsen）染色により陽性であることが評価され、これはＭＴＣ群のマイコバク テリアがいるかどうかではなく、抗酸菌の存在のみを示している。 ＭＴＣ群のマイコバクテリア（ＯＫ３０６、ＯＫ４４６、ＯＫ４４９）の２３ Ｓ ｒＲＮＡとＭＴＣ群のマイコバクテリア（ＯＫ３１０）の１６Ｓ ｒＲＮＡ をターゲティングするフルオレセイン標識ペプチド核酸プローブを使用した。さ らに、シグナル対ノイズ比を上昇させるために、ハイブリダイゼーション溶液に 、ランダムペプチド核酸プローブ（各位置がＡ、Ｔ、ＣまたはＧである１５量体 （ミリポア社（Millipore Corporation）、ベッドフォード、マサチューセッツ 州、米国、から得た）を加えた。 ＦＩＳＨを、例５に記載のように５５℃で行なった。使用したプローブ濃度は 、表４と５に結果とともに示す。 チール−ニールセン（Ziehl-Neelsen）染色で染色した塗抹試料は、１００× 対物レンズで観察し、以下の方法に従ってスコアを付けた：−：稈菌が０、＋／ −：３００視野当たり１〜２００、２＋：１０視野当たり１〜９、３＋：１視野 当たり１〜９、４＋：１視野当たり＞９。 陽性：塗抹試料中にいくつかのマイコバクテリアが同定された。陰性：塗抹試 料中に蛍光性マイコバクテリアは同定されなかった。Ｅｑ：塗抹試料中にわずか の（１〜３）蛍光性マイコバクテリアが同定された。 表から、ペプチド核酸プローブは貫通することができ、従ってＡＦＢ陽性喀痰 塗抹試料中のＭＴＣ群のマイコバクテリアの標的配列にハイブリダイズするよう である。使用したプローブでは必ずしもすべてのＡＦＢ陽性喀痰塗抹試料が陽性 にならないという事実は、必ずしもすべてのＡＦＢ陽性喀痰塗抹試料が、ＭＴＣ 群のマイコバクテリアを含有するものではないことを示している。 例７ ＭＴＣ群のマイコバクテリアを検出するための選択されたペプチド核酸プロー ブならびにＭＯＴＴ群のマイコバクテリアを検出するためのプローブの反応性と 特異性を、異なるマイコバクテリア種の培養物から調製した対照塗抹試料上の蛍 光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により評価した。マイコ バクテリア種は、マイコバクテリア属を代表するように、ならびに臨床的に関係 する種を含むように、選択した。 結核菌（M．tuberculosis）（ＡＴＣＣ ２５１７７）、マイコバクテリウム ・ボビス（M．bovis）ＢＣＧ（ＡＴＣＣ ３５７３４）、マイコバクテリウム・ イントラセルラレ（M．intracellulare）（ＡＴＣＣ １３９５０）、マイコバ クテリウム・アビウム（M．avium）（ＡＴＣＣ ２５２９２）、マイコバクテリ ウム・カンサシイ（M．kansasii）（ＡＴＣＣ １２４７９）、マイコバクテリ ウム・ゴルドナエ（M．gordonae）（ＡＴＣＣ １４４７０）、マイコバクテリ ウム・スクロフラセウム（M．scrofulaceum）（ＡＴＣＣ １９９８１）、マイ コバクテリウム・アブセスス（M．abscessus）（ＡＴＣＣ １９９７７）、マイ コバクテリウム・マリヌム（M．marinum）（ＡＴＣＣ ９２７）、マイコバクテ リウム・シミアエ（M．simiae）（ＡＴＣＣ ２５５７５）、マイコバクテリウ ム・スズルガイ（M．szulgai）（ＡＴＣＣ ３５７９９）、マイコバクテリウム ・フラベスセンス（M．flavescens）（ＡＴＣＣ ２３０３３）、マイコバクテ リウム・ホルツイツム（M．fortuitum）（ＡＴＣＣ ４３２６６）、およびマイ コバクテリウム・ゼノピ（M．xenopi）（ＡＴＣＣ １９２５０）を、デュボス 液体培地（Dubos broth）スタテンスシーラムインスティテュート（Statens Ser um Institut））で３７℃で増殖させたが、マイコバクテリウム・マリヌム（M． marinum）は３２℃で増殖させた。 例５に記載のように塗抹試料を調製した。下記のようにＦＩＳＨを行なった。 蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のプロトコール １．細菌スライドを、問題のプローブを含有するハイブリダイゼーション溶液で カバーした。 ２．スライドを、加湿インキュベーションチャンバー中で５５℃で９０分間イン キュベートした。 ３．スライドを、あらかじめ暖めた洗浄溶液（５mMトリス、１５mM ＮａＣｌ、 ０．１％（ｖ／ｖ）、トリトンＸ−１００（登録商標）、ｐＨ１０）中で５５℃ で３０分間洗浄し、次に水で３０秒間洗浄した。 ４．スライドを乾燥し、イマゲンマウンティング液（IMGAGEN Mounting Fluid） （ダコ（DAKO）、コペンハーゲン、デンマーク）でマウントした。 ハイブリダイゼーション溶液は、５０mMトリス、１０mM ＮａＣｌ、１０％（ ｗ／ｖ）デキストラン硫酸、３０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｖ／ ｖ）トリトンＸ−１００（登録商標）、５mM ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）ピ ロリン酸ナトリウム、０．２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、および０．２ ％（ｗ／ｖ）フィコール（ｐＨ７．６）を含有した。標識ペプチド核酸プローブ の非特異結合を避けるために、１〜５μＭの非標識ナンセンスペプチド核酸プロ ーブを、ハイブリダイゼーション溶液（ＯＫ５０７／修飾配列番号１２１および ／またはＯＫ７１４／修飾配列番号１２２）に加えた。 可能な場合は、ヌクレアーゼを不活性化するために、使用した装置は熱処理し 、溶液は、１μｌ/mlジエチルピロカーボネート（シグマケミカル社（Sigma Che mical Co.）に暴露した。 顕微鏡観察は、１００×／１．３０水対物レンズ、ＨＢＯ １００Ｗランプお よびＦＩＴＣ／ＴＲＩＴＣ２重バンドフィルターセットを取り付けた蛍光顕微鏡 （ライカ（Leica）、ウェツラー（Wetzlar）、ドイツ）を使用して行なった。マ イコバクテリアは、蛍光（強い、中程度、弱い、無し）と形態（１〜１０μｍの 細い桿状の菌。ＭＯＴＴ群のマイコバクテリアは、多態性で、長い桿状〜球状の 型で現れる）の両方に基づいて同定した。 プローブ濃度を、表６と７（ＭＴＣ群のマイコバクテリアをターゲティングす るプローブ）と表８（ＭＯＴＴ群のマイコバクテリアをターゲティングするプロ ーブ）に結果とともに示す。 表６、７、および８に記載の各プローブを、他のふつうの呼吸系細菌、すなわ ちコリネバクテリウム（Corynebacterium）種、フソバクテリウム・ヌクレアツ ム（Fusobacterium nucleatum）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）、クレブシエラ・ニューモニー（Klebsiella pneumoniae）、緑膿 菌（Pseudomonas aeruginosa）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Propioni bacterium acnes）、ストレプトコッカス・ニューモニー（Streptococcuc pneum oniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、ブラハメラ・カタラハリ ス（Brahamella catarrahalis）、大腸菌（Escherichia coli）、ナイセリア種 （Neisseria spp.）、アクチノバクター・カルコアセチク ス（Actinobacter calcoaceticus）、アクチノミセス種（Actinomyces spp.）、 エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、プロテウス・ミ ラビリス（Proteus mirabilis）、シュードモナス・マルトフィリア（Pseudomon as maltophilia）、ストレプトコッカス・ビリダンス（Streptocussuc viridans ）、およびノルカルジア・アステロイデス（Norcardia asteroides）、へのハイ ブリダイゼーションについてさらに調べた。ＯＫ６８２、ＯＫ６５４、ＯＫ６５ ５、ＯＫ６８８、ＯＫ６６０、ＯＫ６１２、ＯＫ６２４およびＯＫ６２３の場合 は、これらの細菌のいずれかへの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに より、交差ハイブリダイゼーションは観察されなかつた。ＯＫ４４６（プロピオ ニバクテリウム・アクネス（P．acnes）に対して）、ＯＫ４４８（プロピオニバ クテリウム・アクネス（P．acnes）、およびにブラハメラ・カタラハリス（B．c atarrahalis）対して）、およびＯＫ４５０（プロピオニバクテリウム・アクネ ス（P．acnes）、およびにブラハメラ・カタラハリス（B．catarrahalis）対し て）で、若干の交差反応性が観察された。 表６と７は、ＭＴＣプローブのいずれもマイコバクテリウム・イントラセルラ レ（M．intracellulare）および／またはマイコバクテリウム・アビウム（M.avi um）と交差反応しないが、結核菌（M．tuberculosis）およびマイコバクテリウ ム・ボビス（M．bovis）ＢＣＧとは強く反応することを証明している。表８に示 すように、ＯＫ６２４とＯＫ６２３の両方とも、ＭＡＣ群のメンバーであるマイ コバクテリウム・イントラセルラレ（M．intracellulare）とマイコバクテリウ ム・アビウム（M．avium）にハイブリダイズするが、いずれも結核菌（M．tuber culosis）またはマイコバクテリウム・ボビス（M．bovis）ＢＣＧにはハイブリ ダイズしない。ＯＫ６１２は、マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）にの みハイブリダイズする。マイコバクテリウム・イントラセルラレ（M．intracell ulare）の整列した配列は、マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）の標的 配列に対して１つだけのヌクレオ塩基の差を有することに注意されたい（図４Ｋ を参照）。 このデータは、請求の範囲第３項および４項に記載の方法の使用を支持し、１ つまたはそれ以上のマイコバクテリア種の標的配列にハイブリダイズすることが でき、標的配列に対して少なくとも１つのヌクレオ塩基の差を有する他のマイコ バクテリア種にはハイブリダイズしないペプチド核酸プローブの設計について例 ２に例示する。 例８ ＭＴＣ群のマイコバクテリアとＭＯＴＴ群のマイコバクテリアとの区別におい てペプチド核酸プローブの有用性を試験するために、結核または他のマイコバク テリア感染症が疑われる患者の３４＋２８臨床試料（喀痰試料、他の呼吸系平滑 筋および肺外試料）（スタテンスシーラムインスティテュート（Statens Serum Institut）のマイコバクテリア部門（Mycobacterium Department）、デンマーク 、から供与された）から調製したマイコバクテリア陽性培養物の塗抹試料につい てプローブを試験した。各試料について、ジーンプローブ社（Gne-Probe Inc.） 、米国）のアキュプローブ（AccuProbe）検査で得られた複合体／種同定データ が入手できた。 表９は、ＭＴＣ群のマイコバクテリア（ＯＫ６８２、ＯＫ６６０、ＯＫ６８８ およびＯＫ６８９）をターゲティングする４つの異なるペプチド核酸プローブ、 およびＭＯＴＴ群のマイコバクテリア（ＯＫ６２３）をターゲティングする１つ のプローブで得られた結果を示し、表１０は、ＭＯＴＴ群のマイコバクテリア（ ＯＫ６２３とＯＫ６１２）をターゲティングする２つのペプチド核酸プローブ、 およびＭＴＣ群のマイコバクテリア（ＯＫ６８８とＯＫ６８９）をターゲティン グする２つのプローブの混合物で得られた結果を示す。データは、アキュプロー ブ（AccuProbe）検査で得られた結果に従って並べた。試料調製、ハイブリダイ ゼーションおよび視覚化は例７に記載のように行なった。＊「未知」という用語は、試料はアキュプローブ（AccuProbe）検査ではＭＴＣ 群のマイコバクテリアまたはＭＡＣ群のマイコバクテリアを含有しないが、さら なる種の同定は行なわなかったことを意味する。 ＊「未知」という用語は、試料はアキュプローブ（AccuProbe）検査ではＭＴＣ 群のマイコバクテリアまたはＭＡＣ群のマイコバクテリアを含有しないが、さら なる種の同定は行なわなかったことを意味する。 表９の結果は、アキュプローブ（AccuProbe）で行なった複合体／種同定と一 致し、従って、ある感染がＭＴＣ群のマイコバクテリアにより引き起こされたか またはＭＯＴＴ群のマイコバクテリアにより引き起こされたかを決定するのに使 用することができることを確認している。 表１０の結果から、アキュプローブ（AccuProbe）検査で得られた結果と比較 して１００％の特異性と９１〜９４％の感度で、ＭＴＣ群のマイコバクテリアと ＭＯＴＴ群のマイコバクテリアを区別することができることがわかる。さらにＯ Ｋ６１２は、マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）の場合は陽性であり、 ＭＯＴＴ群のマイコバクテリアの他の場合は陰性であるため、これはＭＯＴＴ群 のマイコバクテリアで陽性のものの中でマイコバクテリウム・アビウム（M．avi um）の特異的な同定に非常に適している。 例９ 喀痰の臨床試料中のマイコバクテリアの直接検出 この例は、結核の疑われる症例（ラマチボジ（Ramathibodi）病院の微生物学 部門（Division of Microbiology）、バンコク、タイ、から供与された）と他の マイコバクテリア感染症の疑われる症例（臨床微生物学部門（Clinical Microbi ology Dept.）、リグショスピタレット（Rigshospitalet）、コペンハーゲン、 デンマーク、から供与された）からのＦＩＳＨによるＡＦＢ陽性喀痰試料中で、 マイコバクテリアを直接検出し同定できるペプチド核酸の能力を証明している。 臨床塗抹試料は、例５に記載の方法に従って調製し、ＦＩＳＨは、例７に記載 のように行なった。結果を表１１に示す。 表１１の例から、使用したプローブにより、ＡＦＢ陽性喀痰塗抹試料は、ＭＴ Ｃ群のマイコバクテリア（試料番号１、１７５、および２６８）について陽性で あり、ＭＯＴＴ群のマイコバクテリア（試料番号３７２６７）について陽性であ り、マイコバクテリア（試料番号４５９と１６６）について陰性であると評価さ れるようである。すなわち、ＰＮＡプローブは、喀痰塗抹試料中のマイコバクテ リアを直接、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより特異的に同定す るのに有用な試薬である。すべてのプローブで陰性であるＡＦＢ陽性喀痰試料は 、３つの方法で説明される：ａ）試料はこれらのプローブで検出されないマイコ バクテリア（例えば、マイコバクテリウム・ホルツイツム（M．fortultum））を 含むかも知れない、ｂ）試料は、マイコバクテリア以外の抗酸菌を含むかも知れ ない、またはｃ）試料中のマイコバクテリアは、例えば抗生物質処理により、ｒ ＲＮＡが欠失しているがまたは大幅に低下している。 結論として、塗抹陽性の喀痰試料中のマイコバクテリアのペプチド核酸ベース の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる直接同定は、この染色法の 簡便性と形態的利点を同時の種同定と組合せたものであり、従って臨床微生物学 検査室は、治療と患者の管理に関して決定的に重要な情報を提供する分子学的 方法により与えられる利点を享受することが可能になる。 例１０ 本例は、ＭＴＣ群のマイコバクテリアとＭＯＴＴ群のマイコバクテリアをター ゲティングするようにそれぞれ異なって標識されたプローブを使用して、蛍光ｉ ｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、それぞれＭＴＣ群のマイコバクテ リアとＭＯＴＴ群のマイコバクテリアの同時検出と同定を証明する。 異なるマイコバクテリア種の対照塗抹試料を、例５に記載のように調製した。 さらに結核菌（M．tuberculosis）とマイコバクテリウム・アビウム（M．avium ）の混合物を含有する塗抹試料を調製した（表８、最後の列）。ＦＩＳＨは例７ に記載のように行なった。 ＭＴＣ群のマイコバクテリア（ＯＫ７０２）の１６Ｓ ｒＲＮＡをターゲティ ングする、ローダミン標識ペプチド核酸プローブと、ＭＯＴＴ群のマイコバクテ リア（ＯＫ６２３）の１６Ｓ ｒＲＮＡをターゲティングするフルオレセイン標 識ペプチド核酸プローブを、表１２に結果とともに示す濃度で、同時に適用した 。 ＭＴＣ群のマイコバクテリア（すなわち、結核菌（M．tuberculosis）とマイ コバクテリウム・ボビス（M．bovis））は、緑色の蛍光性マイコバクテリアとし て観察され、ＭＯＴＴ群のマイコバクテリア（すなわち、マイコバクテリウム・ アビウム（M．avium)、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（M．intracellu lare）およびマイコバクテリウム・カンサシイ（M．kansasii））は、赤色の蛍 光性マイコバクテリアとして観察された。マイコバクテリウム・アビウム（M．a vium）／結核菌（M．tuberculosis）混合物中のマイコバクテリアは、緑色の蛍 光性マイコバクテリアと赤色の蛍光性マイコバクテリアの混合物により同定され た。 結果は、異なって標識したプローブの混合物を使用することにより、１つの塗 抹試料中の異なるマイコバクテリア種を区別することができることを証明してい る。マイコバクテリアのこのような同時検出と同定は、３つまたはそれ以上の異 なって標識されたペプチド核酸プローブを含むように拡張することができるかも 知れない。 例１１ 前駆体ｒＲＮＡにハイブリダイズし、さらに結核菌（M．tuberculosis）の前 駆体ｒＲＮＡとマイコバクテリウム・アビウム（M．avium）の前駆体ｒＲＮＡを 区別する、ペプチド核酸プローブの能力を、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ ーションにより試験した。 例５に記載のように塗抹試料を調製し、結核菌（M．tuberculosis）（ＯＫ７ ４９）の前駆体ｒＲＮＡをターゲティングするフルオレセイン標識プローブを使 用して、例７に記載のようにＦＩＳＨを行なった。結果を表１３に示す。 結果から、前駆体ｒＲＮＡを検出することが可能であり、かつさらに異なるマ イコバクテリア種からの前駆体ｒＲＮＡを区別することが可能であると結論でき る。前駆体ｒＲＮＡをターゲティングするペプチド核酸の応用は、マイコバクテ リアの増殖を測定するのに特に有用であり、従ってマイコバクテリアの生存活性 の指標である。これは、結核の治療と薬剤感受性試験に関連して、抗生物質の作 用を追跡するために特に重要である。 例１２ 薬剤感受性および薬剤耐性マイコバクテリアを区別するためのペプチド核酸プ ローブの能力を、マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）とマイコバクテリ ウム・イントラセルラレ（M．intracellulare）のマクロライド剤耐性に関連す る単一点突然変異をターゲティングするローダミン標識プローブとともに、マイ コバクテリウム・アビウム（M．avium）とマイコバクテリウム・イントラセルラ レ（M．intracellulare）の２３Ｓ ｒＲＮＡの野生型配列をターゲティングす るフルオレセイン標識プローブを使用して、評価した。 マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）（ＡＴＣＣ ２５２９２）とマイ コバクテリウム・イントラセルラレ（M．intracellulare）（ＡＴＣＣ １３９ ５０）の培養物から、例５に記載のように塗抹試料を調製した。これらの株は、 ｒＲＮＡの野生型配列を含有すると予想される。マクロライド剤耐性変種は入手 できなかった。野生型２３Ｓ ｒＲＮＡ（ＯＫ７４５）をターゲティングするフ ルオレセイン標識ペプチド核酸プローブと、ジーンバンク（GenBank）エントリ −Ｘ５２９１７（図６を参照）のマイコバクテリウム・アビウム（M．avium）２ ３Ｓ ｒＤＮＡの２５６８位（ＯＫ７４６）と２５６９位（ＯＫ７４７）で３つ の可能な突然変異をターゲティングするローダミン標識ペプチド核酸プローブの 混合物とを使用して、例７に記載のようにＦＩＳＨを行なった。結果を表１４に 示す。 ＯＫ７４６とＯＫ７４７は、それぞれ３つの単一点突然変異プローブの混合物 である。 表１４の結果は、マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）とマイコバクテ リウム・イントラセルラレ（M．intracellulare）は、マイコバクテリウム・ア ビウム（M．avium）とマイコバクテリウム・イントラセルラレ（M．intracellul are）野生型をターゲティングするフルオレセイン標識プローブ（ＯＫ７４５） により検出されるが、マクロライド剤耐性に関する単一点突然変異をターゲティ ングするローダミン標識プローブ（ＯＫ７４６とＯＫ７４７）の混合物では検出 できないことを示す。それぞれ野生型と薬剤耐性変種をターゲティングするこの ようなペプチド核酸プローブは、効率的な治療法の予測ならびに治療の効果の追 跡のための重要な手段になる可能性がある。 例１３ ペプチド核酸プローブがマイコバクテリア細胞壁を貫通し次に標的配列にハイ ブリダイズする速度を示すために、例７に記載のプロトコールを修飾してハイブ リダイゼーション時間を１５分間とし、９０分間のハイブリダイゼーション時間 の結果と比較した。塗抹試料は例５に記載のように調製した。結果を表１５に示 す。 表１５に示す結果は、マイコバクテリア細胞内のペプチド核酸プローブによる ハイブリダイゼーションは、非常に短時間で達成され、わずかに１５分間のイン キュベーション後にシグナルが検出されることを示す。すなわち、ペプチド核酸 プローブの使用は、非常に迅速な蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプ ロトコールの開発を可能にする。 例１４ 非常に短いペプチド核酸プローブが標的配列にハイブリダイズする能力を説明 するために、フルオレセインで標識した１２量体のペプチド核酸プローブ（ＯＫ ５７５）を蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により試験 した。 塗抹試料は例５に記載のように調製し、例７に記載のようにＦＩＳＨを行なっ た。結果を表１６に示す。 表１７の結果は、１２量体ペプチド核酸プローブは、１５量体と同じ厳密性条 件下で標的配列に特異的にハイブリダイズすることができることを証明する。１ ２量体ペプチド核酸プローブのＴｍは１５量体ペプチド核酸プローブのＴｍより 低いため、より弱い蛍光強度が得られる。 このデータは、厳密性条件を下げる（例えば、ハイブリダイゼーション／洗浄 温度および／またはホルムアミドの濃度を下げる）ことにより、特異的配列が設 計できるなら、マイコバクテリアの検出のためにより短いプローブが利用できる ことを明らかに示唆する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０５１２／９７ (32)優先日 平成９年５月５日(1997．5．5) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ， ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 モレルプ，チナ，アンドレセン デンマーク国 デイケイ―4320 レイレ, アレルスレブ，レイレベユ 14

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．マイコバクテリアｒＤＮＡ、前駆体ｒＲＮＡ、またはｒＲＮＡ形成性の検 出可能なハイブリッドの標的配列にハイブリダイズすることができる、試料中に 随時存在する１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配列を検出するため のペプチド核酸プローブ、およびそのようなプローブの混合物。 ２．マイコバクテリアｒＤＮＡ、前駆体ｒＲＮＡ、または２３Ｓ、１６Ｓ、も しくは５Ｓ ｒＲＮＡ形成性の検出可能なハイブリッドの標的配列にハイブリダ イズすることができる、請求の範囲第１項に記載のペプチド核酸プローブ、およ びそのようなプローブの混合物。 ３．マイコバクテリアｒＤＮＡ、前駆体ｒＲＮＡ、または２３Ｓ、１６Ｓ、も しくは５Ｓ ｒＲＮＡ形成性の検出可能なハイブリッドの標的配列にハイブリダ イズすることができる、請求の範囲第１項または第２項に記載のペプチド核酸プ ローブであって、標的配列は、 （ａ）検出すべき１つまたはそれ以上のマイコバクテリアのマイコバクテリア性 ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのヌクレオ塩基配列を、そこから１つまたはそれ以上の マイコバクテリアが区別される生物、特に特定の他のマイコバクテリアの対応す るヌクレオ塩基配列と比較して、 （ｂ）そこから１つまたはそれ以上のマイコバクテリアが区別される生物、特に 特定の他のマイコバクテリアの対応するヌクレオ塩基とは異なる、少なくとも１ つのヌクレオ塩基を含む、ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの標的配列を選択し、そして （ｃ）選択される標的配列にハイブリダイズして検出可能なハイブリッドを形成 する上記プローブの能力を測定する、 ことにより得られる上記プローブ、およびそのようなプローブの混合物。 ４．マイコバクテリアｒＤＮＡ、前駆体ｒＲＮＡ、または２３Ｓ、１６Ｓ、も しくは５Ｓ ｒＲＮＡ形成性の検出可能なハイブリッドの標的配列にハイブリダ イズすることができる、請求の範囲第１項または第２項に記載のペプチド核酸プ ローブであって、該プローブは、 （ａ）検出すべき１つまたはそれ以上のマイコバクテリアのマイコバクテリア性 ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのヌクレオ塩基配列を、そこから１つまたはそれ以上の マイコバクテリアが区別される生物、特に特定の他のマイコバクテリアの対応す るヌクレオ塩基配列と比較して、 （ｂ）そこから１つまたはそれ以上のマイコバクテリアが区別される生物、特に 特定の他のマイコバクテリアの対応するヌクレオ塩基とは異なる、少なくとも１ つのヌクレオ塩基を含む、ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの標的配列を選択し、 （ｃ）上記プローブを合成し、そして （ｄ）選択される標的配列にハイブリダイズして検出可能なハイブリッドを形成 する上記プローブの能力を測定する、 ことにより得られる上記プローブ、およびそのようなプローブの混合物。 ５．試料中に随時存在する、結核菌複合体（ＭＴＣ）の１つまたはそれ以上の マイコバクテリアの標的配列を検出するための、または結核菌複合体のマイコバ クテリア以外の１つまたはそれ以上のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）の標的配列 を検出するための、請求の範囲第１項〜４項のいずれか１項に記載のペプチド核 酸プローブであって、プローブは６〜３０個の重合ペプチド核酸残基を含み、マ イコバクテリアｒＤＮＡ、前駆体ｒＲＮＡ、または２３Ｓ、１６Ｓ、もしくは５ Ｓ ｒＲＮＡ形成性の検出可能なハイブリッドの標的配列にハイブリダイズする ことができる、上記プローブ、およびそのようなプローブの混合物。 ６．試料中に随時存在する、結核菌複合体（ＭＴＣ）の１つまたはそれ以上の マイコバクテリアのｒＤＮＡ、前駆体ｒＲＮＡ、または２３Ｓ、１６Ｓ、もしく は５Ｓ ｒＲＮＡの標的配列を検出するための、または結核菌複合体のマイコバ クテリア以外の１つまたはそれ以上のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）のｒＤＮＡ 、前駆体ｒＲＮＡ、または２３Ｓ、１６Ｓ、もしくは５Ｓ ｒＲＮＡの標的配列 を検出するための、請求の範囲第１項〜５項のいずれか１項に記載のペプチド核 酸プローブであって、プローブは、式（Ｉ）（式中、各ＸとＹは、独立にＯまたはＳであり、 各Ｚは、独立にＯ、Ｓ、ＮＲ¹、またはＣ（Ｒ¹）₂であり、ここで各Ｒ¹は独立 にＨ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルケニル、Ｃ_1-6アルキニルであり、 各Ｒ²、Ｒ³、およびＲ⁴は、独立にＨ，天然に存在するアミノ酸の側鎖、天然 には存在しないアミノ酸の側鎖、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルケニル、もしくはＣ_1-4 アルキニル、または官能基であり、各Ｑは、独立に天然に存在するヌクレオ 塩基、天然には存在しないヌクレオ塩基、挿入物質（intercalator）、ヌクレオ 塩基結合基、標識物またはＨである）の１０〜３０個の重合残基を含むプローブ （但し、そのようなサブ配列を含むプローブは、マイコバクテリアｒＤＮＡ、前 駆体ｒＲＮＡ、または２３Ｓ、１６Ｓ、もしくは５Ｓ ｒＲＮＡの標的配列と、 検出可能なハイブリッドを形成することができる）、 およびそのようなプローブの混合物。 ７．試料中に随時存在する、結核菌複合体（ＭＴＣ）の１つまたはそれ以上の マイコバクテリアの２３Ｓ ｒＲＮＡの標的配列を検出するための請求の範囲第 １項〜６項のいずれか１項に記載のペプチド核酸プローブであって、該プローブ は請求の範囲第６項で定義した式（Ｉ）の１０〜３０個の重合残基を含むが、 但し、隣接残基のＱは、そのサブ配列が、以下のドメイン 図１Ａの149〜158位、 図１Ａの220〜221位、 図１Ａと図１Ｂの328〜361位、 図１Ｂの453〜455位、 図１Ｂの490〜501位、 図１Ｃの637〜660位、 図１Ｄの706〜712位、 図１Ｄの762〜789位、 図１Ｄの989位、 図１Ｄの1068〜1072位、 図１Ｅの1148位、 図１Ｅの1311〜1329位、 図１Ｆの1361〜1364位、 図１Ｆの1418位、 図１Ｆの1563〜1570位、 図１Ｇの1627〜1638位、 図１Ｇの1675〜1677位、 図１Ｇの1718位、 図１Ｈの1734〜1740位、 図１Ｈの1967〜1976位、 図１Ｈの2403〜2420位、 図１Ｉの2457〜2488位、 図１Ｉの2952〜2956位、 図１Ｊの2966〜2969位、 図１Ｊの3000〜3003位、または 図１Ｊの3097〜3106位、 内に位置する少なくともマイコバクテリウム・アビウム（M．avium）の対応する ヌクレオ塩基とは異なる、結核菌（M．tuberculosis）の２３Ｓ ｒＲＮＡのヌ クレオ塩基に相補的な少なくとも１つのヌクレオ塩基を含む、配列を形成するよ うに選択され、 さらに但し、そのようなサブ配列を含むプローブは、該マイコバクテリア２３ Ｓ ｒＲＮＡの標的配列と、検出可能なハイブリッドを形成することができる、 上記プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 ８．試料中に随時存在する、結核菌複合体（ＭＴＣ）の１つまたはそれ以上の マイコバクテリアの１６Ｓ ｒＲＮＡの標的配列を検出するための請求の範囲第 １項〜６項のいずれか１項に記載のペプチド核酸プローブであって、該プローブ は請求の範囲第６項で定義した式（Ｉ）の１０〜３０個の重合残基を含むが、 但し、隣接残基のＱは、そのサブ配列が、以下のドメイン 図２Ａの76〜79位、 図２Ａの98〜101位、 図２Ａの135〜136位、 図２Ｂの194〜201位、 図２Ｂの222〜229位、 図２Ｂの242位、 図２Ｃの474位、 図２Ｃの1136〜1145位、 図２Ｃの1271〜1272位、 図２Ｄの1287〜1292位、 図２Ｄの1313位、または 図２Ｄの1334位、 内に位置する少なくともマイコバクテリウム・アビウム（M．avium）の対応する ヌクレオ塩基とは異なる、結核菌（M．tuberculosis）の１６Ｓ ｒＲＮＡのヌ クレオ塩基に相補的な少なくとも１つのヌクレオ塩基を含む、配列を形成するよ うに選択され、 さらに但し、そのようなサブ配列を含むプローブは、該マイコバクテリア１６ Ｓ ｒＲＮＡの標的配列と、検出可能なハイブリッドを形成することができる、 上記プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 ９．試料中に随時存在する、結核菌複合体（ＭＴＣ）の１つまたはそれ以上の マイコバクテリアの５Ｓ ｒＲＮＡの標的配列を検出するための請求の範囲第１ 項〜６項のいずれが１項に記載のペプチド核酸プローブであって、該プローブは 請求の範囲第６項で定義した式（Ｉ）の１０〜３０個の重合残基を含むが、 但し、隣接残基のＱは、そのサブ配列が、以下のドメイン 図３の86〜90位 内に位置する少なくともマイコバクテリウム・アビウム（M．avium）の対応する ヌクレオ塩基とは異なる、結核菌（M．tuberculosis）の５Ｓ ｒＲＮＡのヌク レオ塩基に相補的な少なくとも１つのヌクレオ塩基を含む、配列を形成するよう に選択され、 さらに但し、そのようなサブ配列を含むプローブは、該マイコバクテリア５Ｓ ｒＲＮＡの標的配列と、検出可能なハイブリッドを形成することができる、上 記プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 １０．試料中に随時存在する、結核菌複合体（ＭＴＣ）の１つまたはそれ以上 のマイコバクテリアの２３Ｓまたは１６Ｓ ｒＲＮＡの標的配列を検出するため の請求の範囲第１項〜８項のいずれか１項に記載のペプチド核酸プローブであっ て、該プローブは請求の範囲第６項で定義した式（Ｉ）の１０〜３０個の重合残 基を含むが、 但し、隣接残基のＱは、そのサブ配列が、以下のドメイン 図１Ａの149〜158位、 図１Ａと図１Ｂの328〜361位、 図１Ｂの490〜501位、 図１Ｃの637〜660位、 図１Ｄの762〜789位、 図１Ｄの1068〜1072位、 図１Ｅの1311〜1329位、 図１Ｆの1361〜1364位、 図１Ｆの1563〜1570位、 図１Ｇの1627〜1638位、 図１Ｈの1734〜1740位、 図１Ｉの2457〜2488位、 図１Ｉの2952〜2956位、 図１Ｊの3097〜3106位、 図２Ａの135〜136位、または 図２Ｄの1287〜1292位、 内に位置する少なくともマイコバクテリウム・アビウム（M．avium）の対応する ヌクレオ塩基とは異なる、結核菌（M．tuberculosis）の２３Ｓまたは１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオ塩基に相補的な少なくとも１つのヌクレオ塩基を含む、配列 を形成するように選択され、 さらに但し、そのようなサブ配列を含むプローブは、該マイコバクテリア２３ Ｓまたは１６Ｓ ｒＲＮＡの標的配列と、検出可能なハイブリッドを形成するこ とができる、上記プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 １１．試料中に随時存在する、結核菌複合体のマイコバクテリア以外の１つま たはそれ以上のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）の２３Ｓ ｒＲＮＡの標的配列を 検出するための請求の範囲第１項〜６項のいずれか１項に記載のペプチド核酸プ ローブであって、該プローブは請求の範囲第６項で定義した式（Ｉ）の１０〜３ ０個の重合残基を含むが、 但し、隣接残基のＱは、そのサブ配列が、以下のドメイン 図４Ａの99〜101位、 図４Ａの183位、 図４Ａの261〜271位、 図４Ｂの281〜284位、 図４Ｂの290〜293位、 図４Ｂの327〜335位、 図４Ｂの343〜357位、 図４Ｂと図４Ｃの400〜405位、 図４Ｃの453〜462位、 図４Ｃの587〜599位、 図４Ｄの637〜660位、 図４Ｄの704〜712位、 図４Ｅの763〜789位、 図４Ｅの1060〜1074位、 図４Ｅの1177〜1185位、 図４Ｆの1259〜1265位、 図４Ｆの1311〜1327位、 図４Ｆの1345〜1348位、 図４Ｇの1361〜1364位、 図４Ｇの1556〜1570位、 図４Ｈの1608〜1613位、 図４Ｈの1626〜1638位、 図４Ｈの1651〜1659位、 図４Ｈの1675〜1677位、 図４Ｈの1734〜1741位、 図４Ｉの1847〜1853位、 図４Ｉの1967〜1976位、 図４Ｉの2006〜2010位、 図４Ｉの2025〜2027位、 図４Ｊの2131〜2132位、 図４Ｊの2252〜2255位、 図４Ｊと図４Ｋの2396〜2405位、 図４Ｋの2416〜2420位、 図４Ｋの2474〜2478位、 図４Ｋの2687位、 図４Ｋの2719位、 図４Ｌの2809位、 図４Ｌの3062〜3068位、または 図４Ｌの3097〜3106位、 内に位置する少なくとも結核菌（M．tuberculosis）の対応するヌクレオ塩基と は異なる、マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）の２３Ｓ ｒＲＮＡのヌ クレオ塩基に相補的な少なくとも１つのヌクレオ塩基を含む、配列を形成するよ うに選択され、 さらに但し、そのようなサブ配列を含むプローブは、該マイコバクテリア２３ Ｓ ｒＲＮＡの標的配列と、検出可能なハイブリッドを形成することができる、 上記プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 １２．試料中に随時存在する、結核菌複合体のマイコバクテリア以外の１つま たはそれ以上のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）の１６Ｓ ｒＲＮＡの標的配列を 検出するための請求の範囲第１項〜６項のいずれか１項に記載のペプチド核酸プ ローブであって、該プローブは請求の範囲第６項で定義した式（Ｉ）の１０〜３ ０個の重合残基を含むが、 但し、隣接残基のＱは、そのサブ配列が、以下のドメイン 図５Ａの135〜136位、 図５Ａの472〜475位、 図５Ａの1136〜1144位、 図５Ｂの1287〜1292位、 図５Ｂの1313位、または 図５Ｂの1334位 内に位置する少なくとも結核菌（M．tuberculosis）の対応するヌクレオ塩基と は異なる、マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）の１６Ｓ ｒＲＮＡのヌ クレオ塩基に相補的な少なくとも１つのヌクレオ塩基を含む、配列を形成するよ うに選択され、 さらに但し、そのようなサブ配列を含むプローブは、該マイコバクテリア１６ Ｓ ｒＲＮＡの標的配列と、検出可能なハイブリッドを形成することができる、 上記プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 １３．試料中に随時存在する、結核菌複合体のマイコバクテリア以外の１つま たはそれ以上のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）の２３Ｓまたは１６Ｓ ｒＲＮＡ の標的配列を検出するための請求の範囲第１項〜６項、１１項および１２項のい ずれか１項に記載のペプチド核酸プローブであって、該プローブは請求の範囲第 ６項で定義した式（Ｉ）の１０〜３０個の重合残基を含むが、 但し、隣接残基のＱは、そのサブ配列が、以下のドメイン 図４Ａの99〜101位、 図４Ｂの290〜293位、 図４Ｂと図４Ｃの400〜405位、 図４Ｃの453〜462位、 図４Ｄの637〜660位、 図４Ｅの763〜789位、 図４Ｆの1311〜1327位、 図４Ｇの1361〜1364位、 図４Ｈの1734〜1741位、 図４Ｉの2025〜2027位、 図４Ｋの2474〜2478位、 図４Ｌの3062〜3068位、または 図５Ｂの1287〜1292位、 内に位置する少なくとも結核菌（M．tuberculosis）の対応するヌクレオ塩基と は異なる、マイコバクテリウム・アビウム（M．avium）の２３Ｓまたは１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオ塩基に相補的な少なくとも１つのヌクレオ塩基を含む、配列 を形成するように選択され、 さらに但し、そのようなサブ配列を含むプローブは、該マイコバクテリア２３ Ｓまたは１６Ｓ ｒＲＮＡの標的配列と、検出可能なハイブリッドを形成するこ とができる、上記プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 １４．試料中に随時存在する、結核菌複合体（ＭＴＣ）の１つまたはそれ以上 のマイコバクテリアの２３Ｓ、１６Ｓまたは５Ｓ ｒＲＮＡの標的配列を検出す るための、または結核菌複合体のマイコバクテリア以外の１つまたはそれ以上の マイコバクテリア（ＭＯＴＴ）の２３Ｓ，１６Ｓまたは５Ｓ ｒＲＮＡの標的配 列を検出するための請求の範囲第１項〜６項のいずれか１項に記載のペプチド核 酸プローブであって、該プローブは請求の範囲第６項で定義した式（Ｉ）の１０ 〜３０個の重合残基を含むが、 但し、隣接残基のＱは、そのサブ配列が、以下のドメイン 図６の2568〜2569位 図７の452位 図７の473〜477位、または 図７の865〜866位 内に位置する１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの２３Ｓ、１６Ｓ、もしく は５Ｓ ｒＲＮＡの対応するヌクレオ塩基とは異なるヌクレオ塩基に相補的な少 なくとも１つのヌクレオ塩基を含む、配列を形成するように選択され、 さらに但し、そのようなサブ配列を含むプローブは、該マイコバクテリア２３ Ｓ、１６Ｓ、もしくは５Ｓ ｒＲＮＡの標的配列と、検出可能なハイブリッドを 形成することができる、上記プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 １５．式（II）、（III）または（IV） （式中、Ｚ、Ｒ²、Ｒ³、およびＲ⁴、およびＱは、請求の範囲第６項で定義した ものであるが、請求の範囲第６〜１４項で定義される条件が付く）の請求の範囲 第１項〜１４項までのいずれか１項に記載のペプチド核酸プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 １６．請求の範囲第１項〜１５項までのいずれか１項に記載のペプチド核酸プ ローブであって、ＺはＮＨ、ＮＣＨ₃、またはＯであり、各Ｒ²、Ｒ³、およびＲ⁴ は、独立にＨ，天然に存在するアミノ酸の側鎖、天然には存在しないアミノ酸の 側鎖、Ｃ_1-4アルキルであり、各Ｑは、天然に存在するヌクレオ塩基、または天 然には存在しないヌクレオ塩基であるが、但し請求の範囲第６項〜１４項に記載 の条件が付く、上記プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 １７．請求の範囲第１項〜１６項までのいずれか１項に記載のペプチド核酸プ ローブであって、ＺはＮＨまたはＯであり、Ｒ²はＨ、またはＡｌａ、Ａｓｐ、 Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、ＨｏｍｏＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＳｅｒもしくはＴ ｈｒの側鎖であり、そしてＱはチミン、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシ ル、イソ−Ｃ、および２，６−ジアミノプリンから選択されるヌクレオ塩基であ るが、請求の範囲第６項〜１４項で定義される条件が付く、上記プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 １８．式（Ｖ） （式中、Ｒ⁴は、Ｈ、またはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｈｏｍ ｏＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＳｅｒもしくはＴｈｒの側鎖であり、そしてＱは請 求の範囲第１７項に定義したものであるが、請求の範囲第６項〜１４項で定義さ れる条件が付く）の請求の範囲第１項〜１７項までのいずれか１項に記載 のペプチド核酸プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 １９．さらに１つまたはそれ以上の標識物を含む請求の範囲第１項〜１８項ま でのいずれか１項に記載のペプチド核酸プローブであって、標識物は互いに同一 であるか、または異なり、プローブは随時１つまたはそれ以上のリンカーを含有 し、該プローブは互いに同一であるかまたは異なるが、請求の範囲第６項〜１４ 項で定義される条件が付く、上記ペプチド核酸プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 ２０．１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配列を検出するための、 請求の範囲第１項〜１９項までのいずれか１項に記載のペプチド核酸プローブで あって、該プローブのヌクレオ塩基配列は、該標的配列のヌクレオ塩基配列に実 質的に相補的である、上記プローブ。 ２１．１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配列を検出するための、 請求の範囲第１項〜２０項までのいずれか１項に記載のペプチド核酸プローブで あって、該プローブのヌクレオ塩基配列は、該標的配列のヌクレオ塩基配列に相 補的である、上記プローブ。 ２２．請求の範囲第１項〜２１項までのいずれか１項に記載のペプチド核酸プ ローブであって、隣接残基のＱは、以下のサブ配列 およびを形成するように選択される、上記プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 ２３．請求の範囲第２２項に記載のペプチド核酸プローブであって、隣接残基 のＱは、以下のサブ配列 を形成するように選択される、上記プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 ２４．請求の範囲第２２項または２３項に記載のペプチド核酸プローブであっ て、 （式中、Ｆｌｕは、５−（および６）−カルボキシフルオレセイン標識物であり 、Ｒｈｏはローダミン標識物を意味する） から選択される上記プローブ、 およびそのようなプローブの混合物。 ２５．試料中に随時存在する１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配 列を検出するための、請求の範囲第１項〜２４項までのいずれか１項に記載のペ プチド核酸プローブまたはその混合物の使用。 ２６．結核菌複合体（ＭＴＣ）の１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標 的配列、特に結核菌（M．tuberculosis）の標的配列を検出するための、請求の 範囲第２５項に記載のペプチド核酸プローブまたはその混合物の使用。 ２７．結核菌複合体のマイコバクテリア以外の１つまたはそれ以上のマイコバ クテリアの標的配列、特にマイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium aviu m）複合体の１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配列を検出するため の、請求の範囲第２５項に記載のペプチド核酸プローブまたはその混合物の使用 。 ２８．試料中に随時存在する１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配 列を検出するための方法であって、 （１）プローブとｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡとの間でハイブリダイゼーションが 起きる条件下で、試料中に存在するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを、請求の範囲第１ 項〜２４項までのいずれか１項に記載の１つまたはそれ以上のペプチド核酸プロ ーブまたはその混合物と、接触させ、そして （２）形成された検出可能なハイブリッドを観察または測定し、該観察または測 定値を、試料中の１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配列の存在と関 連付ける、 ことを含んでなる上記方法。 ２９．結核菌複合体（ＭＴＣ）の１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標 的配列、特に結核菌（M．tuberculosis）の標的配列を検出するための、請求の 範囲第２８項に記載の方法。 ３０．結核菌複合体のマイコバクテリア以外の１つまたはそれ以上のマイコバ クテリアの標的配列を検出するための、請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３１．ハイブリダイゼーションはｉｎ ｓｉｔｕで起きる、請求の範囲第２８ 項〜３０項のいずれか１項に記載の方法。 ３２．ハイブリダイゼーションはインビトロで起きる、請求の範囲第２８項〜 ３０項のいずれか１項に記載の方法。 ３３．生じるハイブリダイゼーションを測定するために、シグナル増幅系が使 用される、請求の範囲第２８項〜３２項のいずれか１項に記載の方法。 ３４．試料は喀痰試料である、請求の範囲第２８項〜３３項のいずれか１項に 記載の方法。 ３５．１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配列、特に結核菌複合体 （ＭＴＣ）の１つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配列、特に結核菌（ M．tuberculosis）の標的配列を検出するための、および／またはＭＴＣのマイ コバクテリア以外の１つまたはそれ以上のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）の標的 配列、特にマイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）複合体の１ つまたはそれ以上のマイコバクテリアの標的配列を検出するための、キットであ って、 キットは、請求の範囲第１項〜２４項までのいずれか１項に記載の少なくとも １つのペプチド核酸プローブを含有し、かつ随時少なくとも１つの検出系を含有 することを特徴とする、上記キット。 ３６．さらに固相捕捉系を含有することを特徴とする、請求の範囲第３５項に 記載のキット。