ES2707970T3 - Ensayo múltiple de detección simultánea de gen-proteína de TP53/CEN17/linfocito B y sondas excepcionalmente específicas para 19q12, INSR, ATM, DLEU2, TP53 y 13q12 - Google Patents

Ensayo múltiple de detección simultánea de gen-proteína de TP53/CEN17/linfocito B y sondas excepcionalmente específicas para 19q12, INSR, ATM, DLEU2, TP53 y 13q12 Download PDF

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Abstract

Un procedimiento múltiple para detectar simultáneamente la proteína CD79a, ADN genómico de TP53 y ADN centromérico del cromosoma 17 en una muestra en un único portaobjetos, comprendiendo dicho procedimiento: teñir la proteína CD79a poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo específico de proteína CD79a y poniendo en contacto la muestra con un primer componente cromógeno para el anticuerpo específico de proteína CD79a, el primer componente cromógeno se adapta para emitir o hacer visible un primer color, en el que la presencia del primer color indica la presencia de la proteína CD79a; y teñir el ADN genómico de TP53 y teñir el ADN centromérico del cromosoma 17 poniendo en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico específica de ADN genómico de TP53, y con una sonda de ácido nucleico específica del ADN centromérico del cromosoma 17, y poner en contacto la muestra con un segundo componente de cromógeno para la sonda de ácido nucleico específica de ADN genómico de TP53 y con un tercer componente cromógeno para la sonda de ácido nucleico específica de ADN centromérico del cromosoma 17, el segundo componente cromógeno se adapta para emitir o hacer visible un segundo color y el tercer componente cromógeno se adapta para emitir o hacer visible un tercer color, en el que la presencia del segundo color indica la presencia de ADN genómico de TP53 y la presencia del tercer color indica la presencia de ADN centromérico del cromosoma 17.

Description

DESCRIPCION
Ensayo multiple de deteccion simultanea de gen-protefna de TP53/CEN17/linfocito B y sondas excepcionalmente especfficas para 19q12, INSR, ATM, DLEU2, TP53 y 13q12
Antecedentes de la invencion
Campo
Esta divulgacion se refiere a inmunohistoqufmica e hibridacion in situ, en particular a la deteccion de protefna CD79a, acido nucleico de TP53 y ADN centromerico del cromosoma 17 en una unica muestra.
Antecedentes
Muchos canceres se caracterizan por cambios geneticos que dan lugar a un control anomalo de procesos celulares, o al crecimiento y proliferacion descontrolados de celulas. Estos cambios geneticos incluyen ganancia o perdida de funcion (por ejemplo, incluyendo amplificacion o delecion de todo o una porcion de un gen), reordenamiento genetico y cambios en la secuencia (por ejemplo, sustitucion, adicion o delecion o una o mas bases). Se sabe que dichos cambios se producen en las regiones geneticas tales como 19q12 y con regiones asociadas con diversos genes, incluyendo los genes ATM, DLEU2 y TP53. Ademas de su aplicabilidad bien conocida a anomalfas geneticas asociadas con cancer, las anomalfas en estas regiones, y otras tales como 13q 12 e INSR, se han asociado con trastornos del espectro autista, metabolismo, especificacion de motoneuronas y cardiovasculopatfa. La deteccion de cambios geneticos en estas regiones puede proporcionar informacion diagnostica y de pronostico para pacientes y, en algunos casos, fundamentar las decisiones de tratamiento.
La leucemia linfocftica cronica ("CLL") es una enfermedad poco activa de la medula osea, que comienza a producir demasiados linfocitos (globulos blancos). Es la leucemia mas comun en los pafses industrializados, con aproximadamente 25.000 (aproximadamente 13 casos por cada 100.000 personas mayores de 65 anos) nuevos casos diagnosticados por ano en los pafses industrializados. Los pacientes tienen cursos variables, desde enfermedad poco activa hasta progresion rapida con respuesta limitada al tratamiento y los estudios clfnicos han descrito la c Ll como una enfermedad clfnicamente heterogenea. Debido a que no todos los pacientes se benefician del tratamiento de referencia actual, ha habido un creciente interes en investigacion para identificar los subgrupos moleculares con indicaciones predictivas con tratamiento potencial y pronostico dentro de un estadio clfnico especffico de progresion de CLL. Se encuentran citogeneticas anomalas en la mayorfa de los pacientes con CLL, y cada subtipo se asocia con frecuencia, consecuencia y tratamientos propuestos diferenciados.
Del 17p se asocia con una evolucion clfnica agresiva y una SG corta. Algunos pacientes con CLL solo presentan originalmente una anomalfa de 13q, pero despues progresan con el tiempo y anos de tratamientos hasta portar las anomalfas mas agresivas. Hasta hace poco, se evaluaron pacientes sometiendo a prueba 17p-delecionado para obtener agentes novedosos o trasplantes de celulas madre, con resultados limitados. Sin embargo, en el ultimo ano, se han aprobado por la FDA 4 tratamientos novedosos para el tratamiento de pacientes con CLL, y otros ensayos aun estan a la espera de los resultados finales. Obinutuzumab ha mostrado una mejora en los resultados en comparacion con los tratamientos estandar con CD20 en todos los subtipos, e idelalisib ha demostrado ser eficaz para pacientes con tratamiento previo fallido (muchos de estos pacientes progresan hasta albergar anomalfas mas agresivas despues del tratamiento). Ibrutinib recibio una aprobacion actualizada especfficamente para pacientes con 17p, y cada ensayo clfnico de CLL debera mostrar eficacia especfficamente en este subtipo mas agresivo. Estos nuevos tipos de tratamientos altamente especfficos cumplen una necesidad medica no cubierta al dirigirse a estos pacientes con CLL especfficos con una evolucion clfnica mas desalentadora.
El tratamiento de referencia actual para diagnosticar y determinar el subtipo con exactitud de estos pacientes es una prueba con panel de hibridacion in situ con fluorescencia (FISH) para las 4 anomalfas (13q, trisomfa 12, 17p y 11q). Algunos laboratorios han comenzado a incorporar tecnologfa de pruebas de micromatrices de CGH o secuenciacion de proxima generacion para analizar estos subtipos de CLL, pero todas estas opciones de tecnologfa de diagnostico son muy costosas, requieren una gran inversion de capital en plataformas y requisitos especfficos de laboratorio. Como resultado, las pruebas de FISH estandar se centralizan tfpicamente entre unos pocos laboratorios academicos o de referencia especfficos de Heme por region, y los tiempos de obtencion de resultados pueden ser de hasta 3 semanas. Ademas, FISH no incorpora el contexto de tejido para el lector/puntuador.
Los investigadores en el campo no crefan que fuera posible realizar un ensayo de gen-protefna para detectar simultaneamente TP53, cromosoma 17 y un marcador de linfocitos B (por ejemplo, CD79a, etc.) usando microscopfa de campo claro. Uno de los motivos es porque se crefa que no era posible puntuar una entidad delecionada (por ejemplo, 17p) usando tincion de campo claro o que, como maximo, darfa como resultado puntuaciones inexactas. Otro motivo por el que se penso que no era posible realizar un ensayo de gen-protefna de este tipo era porque se crefa que el tratamiento con proteasa usado en hibridacion in situ destruye la morfologfa del tejido y, por tanto, tambien destruye la tincion de los linfocitos B. En otras palabras, el proceso in situ afectarfa la lectura apropiada del portaobjetos.
El documento US 2008/299555 A1 divulga un protocolo de tincion triple para la deteccion simultanea in situ del gen HER2, ADN centromerico del cromosoma 17 y protefna HER2 en una muestra de tejido.
Shao et al. (Mod Pathol. Nov 2011; 24(11):1421-32) se refiere al analisis morfologico, molecular y citogenetico de leucemia linfocftica cronica/linfoma linfocftico de celulas pequenas (CLL/SLL) asociado con sarcomas de celulas histiocfticas y dendrfticas. Se tineron muestras de tejido por separado para determinar diversos marcadores de protefnas en ensayos de inmunohistoqufmica (IHQ) cromogenicos, siendo los marcadores, entre otros, CD79a, CD5, CD23 y CD163. Ademas, se analizaron reordenamientos genomicos en ensayos de hibridacion in situ con fluorescencia (FISH) usando una sonda de FISH para p53 y una sonda de control para el centromero del cromosoma 17. Todos los demas marcadores (de protefnas), incluyendo CD79a, se detectaron cada uno por separado en un ensayo IHQ cromogenico de marcador unico.
El “Chromoprobe Multiprobe-System CLL Panel” (http://www.genycell.es/images/productos/protocolos/pmp_.pdf) analiza un panel de diversas sondas que se pueden aplicar simultaneamente a una muestra de paciente en una unica reaccion de FISH. Entre otros, se divulga una sonda que porta un marcador de fluorescencia para detectar deleciones en el gen TP53.
Almond et al. (J Med Genet. Sep 2005; S82) resume el analisis de anomalfas cromosomicas en muestras de pacientes que tienen fenotipos agresivos de leucemia linfocftica cronica (CLL). Las anomalfas se detectaron en ensayos de FISH de marcador unico usando un dispositivo basado en portaobjetos disenado para detectar ocho anomalfas cromosomicas incluyendo, entre otras, deleciones en el ADN genomico de p53.
Liu et al. (Br J Haematol. Abr 2012;157(1):136-9) divulga un analisis de rasgos morfologicos, inmunofenotfpicos y geneticos en muestras de casos de pacientes que tienen linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL) y leucemia linfocftica cronica (CLL). CD79a es uno de los varios marcadores de linfocitos B con una expresion que se muestra en un ensayo IHQ cromogenico de marcador unico con una muestra de tejido tenido con H&E de una biopsia de medula osea. Tambien se divulga el analisis de la expresion de protefna TP53 en base a los hallazgos en un ensayo IHQ cromogenico separado.
El documento EP 2636 757 A1 se refiere a composiciones y procedimientos para la deteccion de secuencias de acido nucleico asociadas con anomalfas cromosomicas. Se mencionan diversas dianas para sondas nucleicas, incluyendo, entre otras, TP53 y determinadas secciones del cromosoma 17.
Como tal, antes de la presente invencion, los investigadores en el campo crefan que un ensayo multiple para tenir simultaneamente un marcador de protefna de linfocitos B (por ejemplo, protefna CD79a), ADN de TP53 y ADN centromerico de cromosoma 17 no serfa posible y, como maximo, no darfa como resultado una puntuacion exacta.
Sumario
En un aspecto de la presente divulgacion, esta un procedimiento multiple para detectar simultaneamente la protefna CD79a, ADN genomico de TP53 y ADN centromerico del cromosoma 17 en una muestra en un unico portaobjetos, comprendiendo dicho procedimiento tenir la protefna CD79a poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo especffico de protefna CD79a y poniendo en contacto la muestra con un primer componente cromogeno para el anticuerpo especffico de protefna CD79a, el primer componente cromogeno se adapta para emitir o hacer visible un primer color, en el que la presencia del primer color indica la presencia de la protefna CD79a; y tenir el ADN genomico de TP53 y tenir el ADN centromerico del cromosoma 17 poniendo en contacto la muestra con una sonda de acido nucleico especffica de ADN genomico de TP53, y con una sonda de acido nucleico especffica del ADN centromerico del cromosoma 17, y poner en contacto la muestra con un segundo componente cromogeno para la sonda de acido nucleico especffica de ADN genomico de TP53 y con un tercer componente cromogeno para la sonda de acido nucleico especffica de ADN centromerico del cromosoma 17, el segundo componente cromogeno se adapta para emitir o hacer visible un segundo color y el tercer componente cromogeno se adapta para emitir o hacer visible un tercer color, en el que la presencia del segundo color indica la presencia de ADN genomico de TP53 y la presencia del tercer color indica la presencia de ADN centromerico del cromosoma 17. En algunos modos de realizacion, la muestra es una muestra de sangre. En algunos modos de realizacion, el primer componente cromogeno comprende Fast Red, el segundo componente cromogeno comprende plata, y el tercer componente cromogeno comprende un componente cromogeno verde. En algunos modos de realizacion, el procedimiento comprende ademas visualizar los colores usando microscopfa de campo claro. En algunos modos de realizacion, el procedimiento es automatizado. En algunos modos de realizacion, la etapa de tenir la protefna CD79a se realiza antes de la etapa de tenir el ADN genomico de TP53 y tenir el ADN centromerico del cromosoma 17. En algunos modos de realizacion, la muestra se somete a un tratamiento con proteasa con proteinasa K, pepsina, colagenasa, dispasa o una combinacion de las mismas despues de la etapa de tenir la protefna CD79a pero antes de la etapa de tenir el ADN genomico de TP53 y tenir el ADN centromerico del cromosoma 17, opcionalmente, en el que la muestra se somete a un tratamiento termico despues de la etapa de tenir la protefna CD79a pero antes del tratamiento con proteasa. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo especffico de protefna CD79a es un anticuerpo monoclonal de conejo SP18 anti-CD79a. En algunos modos de realizacion, el anticuerpo especffico de protefna CD79a comprende un primer marcador que comprende una enzima, y el primer componente cromogeno comprende un componente inductor que comprende un sustrato para la enzima del primer marcador para inducir que el primer marcador emita el primer color, opcionalmente en el que el primer marcador comprende biotina y el componente inductor comprende estreptavidina conjugada con una enzima. En algunos modos de realizacion, el primer componente cromogeno comprende un anticuerpo secundario marcado de forma detectable que se une especfficamente al anticuerpo especffico de protefna CD79a, y el anticuerpo secundario marcado de forma detectable comprende fosfatasa alcalina y el primer componente cromogeno comprende ademas Fast Red. En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende una molecula de acido nucleico que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60; o una molecula de acido nucleico que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con al menos 250 nucleotidos contiguos de una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60; o una molecula de acido nucleico que consiste en la secuencia de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60; o una molecula de acido nucleico que consiste en al menos 250 nucleotidos contiguos de una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60. En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende dos o mas porciones, en la que la primera porcion comprende al menos 250 nucleotidos contiguos de una secuencia de acido nucleico con al menos un 90 % de identidad de secuencia con una de SEQ ID NO: 51-60; y la segunda porcion comprende al menos 250 nucleotidos contiguos de un acido nucleico con al menos un 90 % de identidad de secuencia con una de SEQ ID NO: 51-60, en la que la primera y segunda porciones son diferentes entre si, y en la que la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 tiene al menos 500, al menos 1000 o al menos 5000 nucleotidos de longitud. En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende al menos dos de las sondas. En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende un marcador detectable, y en la que el segundo componente cromogeno comprende un anticuerpo primario que se une especfficamente al marcador detectable y un anticuerpo secundario que se une especfficamente al anticuerpo primario, en la que el anticuerpo secundario se conjuga con peroxidasa de rabano picante y el segundo componente cromogeno comprende ademas peroxido de hidrogeno y plata. En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN centromerico del cromosoma 17 comprende un conjunto de dos o mas sondas de control oligonucleotfdicas monocatenarias especfficas para X monomeros distintos de una region de control de satelite alfa del cromosoma 17, en la que X = 2-14, en la que cada sonda de control comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 61-74; o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una version truncada de SEQ ID NO: 61-74, siendo la version truncada al menos 40 pb contiguos de dichas SEQ ID NO:61-74; o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una secuencia que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una de SEQ ID NO: 61-74, o complementos de las mismas. En algunos modos de realizacion, la etapa de poner en contacto la muestra con la sonda de acido nucleico especffica de ADN centromerico del cromosoma 17 comprende hibridar la sonda en condiciones durante un perfodo de tiempo menor de aproximadamente 3 horas. En algunos modos de realizacion, las dos o mas sondas de control oligonucleotfdicas monocatenarias comprenden cada una entre 50 a 100 nucleotidos. En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN centromerico del cromosoma 17 comprende un hapteno, y el hapteno comprende dinitrofenilo, digoxigenina, biotina o fluorescefna, y en la que el tercer componente cromogeno comprende un anticuerpo primario que se une especfficamente al hapteno, y un anticuerpo secundario que se une especfficamente al anticuerpo primario, en la que el anticuerpo secundario se conjuga con peroxidasa de rabano picante y el tercer componente cromogeno comprende ademas un componente cromogeno verde como sustrato para la peroxidasa de rabano picante.
En otro aspecto de la presente divulgacion es un unico portaobjetos que comprende una muestra de celulas tenidas cromogenicamente para detectar la protefna CD79a, ADN de TP53 y ADN del cromosoma 17. En algunos modos de realizacion, la protefna CD79a se tine con un primer cromogeno, el ADN de TP53 se tine con un segundo cromogeno y el cromosoma 17 se tine con un tercer cromogeno. En algunos modos de realizacion, el primer cromogeno comprende Fast Red, el segundo cromogeno comprende plata y el tercer cromogeno comprende un componente cromogeno verde. En algunos modos de realizacion, mas de un 50 % de los nucleos tienen senales enumerables para el cromosoma 17, y en las que cada senal enumerable es una conformacion en general redonda, una conformacion redonda es una conformacion definida por una curva cerrada simple que se ajusta dentro de una primera region, la primera region es un area en y entre un cfrculo concentrico interno y un cfrculo concentrico externo, teniendo el cfrculo concentrico interno un radio interno (Rin) y teniendo el cfrculo concentrico externo un radio externo (Rex) en el que Rin es > 50 % de Rex, y la curva cerrada simple tiene un radio Rsimple en el que Rin — Rsimple — Rex.
Las anteriores y otras caracterfsticas de la divulgacion seran mas evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada, que procede con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripcion de los dibujos
Las FIGS. 1 y 2 muestran ensayos de ISH dobles para 17p- (TP53/Chr17), 13q- (DLEU/13q), trisomfa 12, y 11q-(ATM/Chr11). Los ovalos indican celulas tenidas ejemplares. Las flechas discontinuas indican puntos rojos, que corresponden a las sondas Chr17, 13q, Chr12 y 11q marcadas con DIG. Las flechas continuas indican puntos negros, que se corresponden con las sondas TP53, DLEU y ATM marcadas con DNP.
La FIG. 3 es un ensayo de ISH cromogenico doble de 17p de frotis de sangre total. Las flechas solidas indican puntos negros, que son sondas de acido nucleico de TP53 marcadas con DNP. Las flechas discontinuas indican puntos rojos, que son sondas de acido nucleico de Chr15 marcadas con DIG.
La FIG. 4 muestra un ensayo de ISH cromogenico doble de 19q12. Los ovalos indican celulas tenidas ejemplares. Las flechas discontinuas indican puntos rojos, que corresponden a las sondas Chr17, 13q, Chr12 y 11q marcadas con DIG. Las flechas solidas indican puntos negros, que se corresponden con sondas de acido nucleico de 19q12 marcadas con DNP. Las flechas discontinuas indican manchas rojas, que se corresponden con sondas de acido nucleico de INSR marcadas con DIG.
La FIG. 5 muestra una conformacion redonda definida por una curva cerrada simple que se ajusta dentro de una primera region. La primera region es un area en y entre un cfrculo concentrico interno y un cfrculo concentrico externo. El cfrculo concentrico interno tiene un radio interno (Rin) y el cfrculo concentrico externo tiene un radio externo (Rex). Rin es > 50 % de Rex. La curva cerrada simple tiene un radio Rsimple en el que Rin ^ Rsimple ^ Rex.
La FIG. 6 muestra una representacion esquematica de diversas etapas usadas para tenir CD79a, ADN de TP53 y ADN centromerico del 17. La presente invencion no se limita a los marcadores, reactivos, etapas u orden de etapas mostrados en la FIG. 6.
La FIG. 7 muestra un ensayo de gen-protefna en tincion de medula osea normal para CD79a (flechas que apuntan a regiones de tincion roja), TP53 (flechas que apuntan a puntos negros) y ADN del cromosoma 17 (flechas que apuntan a puntos azules/verdes difusos).
La FIG. 8 muestra un ensayo de gen-protefna en una tincion de frotis de sangre periferica para CD79a (flecha continua, que apunta a la region de tincion roja), TP53 (flechas discontinuas que apuntan a puntos negros), y ADN del cromosoma 17 (flechas punteadas que apuntan a puntos azules/verdes difusos). Esta muestra tiene una delecion de 17p homocigotica.
Secuencias
Las secuencias de acido nucleico proporcionadas en el presente documento se muestran usando abreviaturas de letras estandar para bases de nucleotidos. Solo se muestra una hebra de cada secuencia de acido nucleico, pero se entiende que la hebra complementaria esta incluida por cualquier referencia a la hebra presentada. En las secuencias proporcionadas:
Las SEQ ID NO: 1-10 son secuencias de acido nucleico de sondas que incluyen segmentos de acido nucleico excepcionalmente especfficos unidos complementarios a la region 19q12 del genoma humano.
Las SEQ ID NO: 11-20 son secuencias de acido nucleico de sondas que incluyen segmentos de acido nucleico excepcionalmente especfficos unidos complementarios a la region 13q12 del genoma humano.
Las SEQ ID NO: 21-30 son secuencias de acido nucleico de sondas que incluyen segmentos de acido nucleico excepcionalmente especfficos unidos complementarios al gen ATM humano.
Las SEQ ID NO: 31-40 son secuencias de acido nucleico de sondas que incluyen segmentos de acido nucleico excepcionalmente especfficos unidos complementarios al gen DLEU2 humano.
Las SEQ ID NO: 41-50 son secuencias de acido nucleico de sondas que incluyen segmentos de acido nucleico excepcionalmente especfficos unidos complementarios al gen INSR humano.
Las SEQ ID NO: 51-60 son secuencias de acido nucleico de sondas que incluyen segmentos de acido nucleico excepcionalmente especfficos unidos complementarios al gen TP53 humano.
Las SEQ ID NO: 61-74 son secuencias de acido nucleico de sondas para el ADN centromerico del cromosoma 17 humano.
Descripcion detallada
I. Abreviaturas
aCGH hibridacion genomica comparativa de micromatriz
ATM ataxia telangiectasia mutada
AP fosfatasa alcalina
CGH hibridacion genomica comparativa
CISH hibridacion in situ cromogenica
DLEU2 delecionado en leucemia linfocftica 2 (codificacion no proteica)
DNP 2,4-dinitrofenilo
FISH hibridacion in situ con fluorescencia
HRP peroxidasa de rabano picante
INSR receptor de insulina
ISH hibridacion in situ
SISH hibridacion in situ con plata
TP53 protefna tumoral p53
II. Terminos
A menos que se explique de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comunmente por un experto en la tecnica a la que pertenece una invencion divulgada. Los terminos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. De forma similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. "Que comprende" quiere decir "que incluye". Por tanto, "que comprende A o B" quiere decir "que incluye A" o "que incluye B" o "que incluye A y B".
Los procedimientos y materiales adecuados para la practica y/o las pruebas de los modos de realizacion de la divulgacion se describen a continuacion. Dichos procedimientos y materiales son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. Se pueden usar otros procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento. Por ejemplo, los procedimientos convencionales bien conocidos en la tecnica a los que pertenece la divulgacion se describen en diversas referencias generales y mas especfficas que incluyen, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (y suplementos hasta 2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4.a ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; y Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
En caso de conflicto, dominara la presente memoria descriptiva, incluyendo las explicaciones de los terminos.
Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento para practicar o probar la tecnologfa divulgada, se describen a continuacion procedimientos y materiales adecuados. Los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Para facilitar la revision de los diversos modos de realizacion de la divulgacion, se proporcionan las siguientes explicaciones de terminos especfficos:
Anticuerpo: un polipeptido que incluye al menos una region variable de inmunoglobulina de cadena ligera o cadena pesada y se une especfficamente a un epftopo de un antfgeno (tal como protefna CD79a). Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales o fragmentos de anticuerpos. Un anticuerpo se puede conjugar o marcar de otro modo con un marcador detectable, tal como una enzima, hapteno o fluoroforo.
Marcador detectable: un compuesto o composicion que se conjuga directa o indirectamente con otra molecula (tal como una sonda de acido nucleico) para facilitar la deteccion de esa molecula. Los ejemplos no limitantes especfficos de marcadores incluyen restos fluorescentes y fluorogenicos, restos cromogenicos, haptenos, marcas de afinidad e isotopos radiactivos. El marcador puede ser detectable directamente (por ejemplo, detectable opticamente) o detectable indirectamente (por ejemplo, por medio de interaccion con una o mas moleculas adicionales que a su vez son detectables). Los marcadores ejemplares en el contexto de las sondas divulgadas en el presente documento se describen a continuacion. Los procedimientos para marcar acidos nucleicos y las indicaciones para la eleccion de marcadores utiles para diversos propositos se analizan, por ejemplo, en Sambrook y Russell, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) y Ausubel et al., en Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987, e incluyendo actualizaciones).
Los marcadores detectables pueden incluir moleculas cromogenicas, fluorescentes, fosforescentes y/o luminiscentes, catalizadores (tales como enzimas) que convierten una sustancia en otra sustancia para proporcionar una senal detectable (tal como convirtiendo una sustancia incolora en una sustancia coloreada o viceversa, o produciendo un precipitado o incrementando la turbidez de la muestra), haptenos que se pueden detectar a traves de interacciones de union anticuerpo-hapteno usando conjugados de anticuerpos marcados de forma detectable adicionales, y moleculas o materiales paramagneticos y magneticos. Los ejemplos particulares de marcadores detectables incluyen: enzimas, tales como peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, fosfatasa acida, glucosa oxidasa, p-galactosidasa o p-glucuronidasa; fluoroforos, tales como fluorescefnas, luminoforos, cumarinas, tintes BODIPY, resorufinas y rodaminas (muchos ejemplos adicionales de moleculas fluorescentes se pueden encontrar en The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies, Molecular Probes, Eugene, OR); nanopartfculas, tales como puntos cuanticos (patentes de EE. UU. n.° 6.815.064, 6.682.596 y 6.649.138); quelatos metalicos, tales como los quelatos DOTA y DPTA de iones metalicos radiactivos o paramagneticos como Gd3+; y liposomas, por ejemplo, liposomas que contienen moleculas fluorescentes atrapadas. Cuando el marcador detectable incluye una enzima, se usa un sustrato detectable tal como un cromogeno, un compuesto fluorogenico o un compuesto luminogenico en combinacion con la enzima para generar una senal detectable (una amplia variedad de dichos compuestos estan disponibles comercialmente, por ejemplo, de Life Technologies, Carlsbad, CA).
De forma alternativa, se puede usar una enzima en un esquema de deteccion metalografica. En algunos ejemplos, los procedimientos de deteccion metalografica incluyen el uso de una enzima, tal como la fosfatasa alcalina, en combinacion con un ion metalico soluble en agua y un sustrato inactivo de oxidorreduccion de la enzima. El sustrato se convierte en un agente activo de oxidorreduccion por la enzima, y el agente activo de oxidorreduccion reduce el ion metalico, provocando que forme un precipitado detectable (veanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 7.642.064; 7.632.652). En otros ejemplos, los procedimientos de deteccion metalografica incluyen el uso de una enzima oxidorreductasa (tal como peroxidasa de rabano picante) junto con un ion metalico soluble en agua, un agente oxidante y un agente reductor, de nuevo para formar un precipitado detectable (vease, por ejemplo, la patente de EE. u U. n.° 6.670.113). Los haptenos son pequenas moleculas que pueden estar unidas por anticuerpos. Los haptenos ejemplares incluyen dinitrofenilo (DNP), biotina, digoxigenina (DIG) y fluorescefna. Los haptenos adicionales incluyen haptenos oxazol, pirazol, tiazol, nitroarilo, benzofurano, triperpeno, urea, tiourea, rotenoide, cumarina y ciclolignano, tales como los divulgados en la patente de EE. UU. n.° 7.695.929.
Hibridacion: formar pares de bases entre regiones complementarias de dos hebras de ADN, ARN, o entre ADN y ARN, formando de este modo una molecula bicatenaria. Las condiciones de hibridacion que dan como resultado grados particulares de restriccion variaran dependiendo de la naturaleza del procedimiento de hibridacion y la composicion y longitud de las secuencias de acido nucleico que hibridan. En general, la temperatura de hibridacion y la fuerza ionica (tal como la concentracion de Na+) del tampon de hibridacion determinaran la restriccion de la hibridacion. La presencia de un producto qufmico que disminuye la hibridacion (tal como formamida) en el tampon de hibridacion tambien determinara la restriccion (Sadhu et al., J. Biosci., 6: 817-821, 1984). Los calculos con respecto a las condiciones de hibridacion para lograr grados particulares de restriccion se analizan en Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (capftulos 9 y 11). Las condiciones de hibridacion para ISH tambien se analizan en Landegent et al., Hum. Genet. 77:366-370, 1987; Lichter et al., Hum. Genet. 80:224-234, 1988; y Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9138-9142, 1988.
Inmunohistoqufmica (IHQ): un procedimiento de determinacion de la presencia o distribucion de un antfgeno en una muestra detectando la interaccion del antfgeno con un agente de union especffica, tal como un anticuerpo. Una muestra se pone en contacto con un anticuerpo en condiciones que permiten la union de anticuerpo-antfgeno. La union anticuerpo-antfgeno se puede detectar por medio de un marcador detectable conjugado con el anticuerpo (deteccion directa) o por medio de un marcador detectable conjugado con un anticuerpo secundario, que se une especfficamente al anticuerpo primario (por ejemplo, deteccion indirecta).
Hibridacion in situ (ISH): un procedimiento de determinacion de la presencia o distribucion de un acido nucleico en una muestra usando hibridacion de una sonda de acido nucleico marcada para localizar una secuencia de ADN o ARN especffica en una porcion o corte de tejido (in situ) o, si el tejido es suficientemente pequeno (por ejemplo, semillas de vegetales, embriones de Drosophila), en todo el tejido (ISH de preparacion completa). Se puede usar ISH de ADN para determinar la estructura de los cromosomas, tal como para su uso en diagnosticos medicos para evaluar la integridad cromosomica y/o determinar el numero de copias genicas en una muestra. La ISH de ARN mide y localiza los ARNm y otros transcritos dentro de cortes histologicos o preparaciones completas.
Para ISH, las celulas y tejidos de muestra se tratan normalmente para fijar los acidos nucleicos diana en su lugar y para incrementar el acceso de la sonda a la molecula diana. La sonda marcada de forma detectable se hibrida con la secuencia diana a temperatura elevada, y a continuacion la sonda en exceso se elimina por lavado. Los parametros de solucion, tales como temperatura, concentracion salina y/o de detergente, se pueden manipular para retirar cualquier interaccion no identica (por ejemplo, de modo que solo permanezcan unidos emparejamientos de secuencias exactas). A continuacion, la sonda marcada se localiza y se cuantifica potencialmente en el tejido usando autorradiograffa, microscopfa de fluorescencia o bien inmunohistoqufmica, respectivamente. La ISH tambien puede usar dos o mas sondas, que tfpicamente se marcan de manera diferente para detectar simultaneamente dos o mas acidos nucleicos.
Intron: un intron es cualquier region o secuencia nucleotfdica dentro de un gen que se retira por empalme de ARN durante la generacion de un producto de ARN maduro final de un gen. El termino intron se puede referir tanto a la secuencia de ADN dentro de un gen como a la secuencia correspondiente en los transcritos de ARN sin procesar. Los intrones se encuentran en los genes de la mayorfa de los organismos y se pueden localizar en una amplia gama de genes, incluyendo los que generan protefnas, ARN ribosomico (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt). Cuando las protefnas se generan a partir de genes que contienen intrones, el empalme de ARN tiene lugar como parte de la via de procesamiento de a Rn que sigue a la transcripcion y precede a la traduccion. La longitud de las secuencias de intrones es altamente variable, varfa de menos de 100 pares de bases a decenas de miles o incluso cientos de miles de pares de bases.
Aislado: un componente biologico "aislado" (tal como una molecula de acido nucleico, protefna o celula) se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biologicos en una preparacion, una celula de un organismo o el propio organismo en el que se produce el componente, tal como otros ARN y ADN cromosomicos y extracromosomicos, protefnas y celulas. Las moleculas de acido nucleico y protefnas que se han "aislado" incluyen moleculas de acido nucleico y protefnas purificadas por procedimientos de purificacion estandar. El termino tambien abarca moleculas de acido nucleico y protefnas preparadas por expresion recombinante en una celula huesped asf como moleculas de acido nucleico y protefnas qufmicamente sintetizadas. En algunos ejemplos, las sondas de acido nucleico divulgadas en el presente documento son sondas de acido nucleico aisladas.
Protefna tumoral p53 TP53
La protefna codificada por este gen es una protefna supresora de tumores que contiene activacion transcripcional, union a ADN y dominios de oligomerizacion. Responde al estres celular y regula la expresion de genes diana con el efecto de inducir la detencion del ciclo celular, apoptosis, senescencia, reparacion de ADN o cambios en el metabolismo. Una variedad de canceres humanos se asocian con mutaciones en este gen. Se puede usar una sonda de TP53 con una sonda centromerica del cromosoma 17.
Gen de ataxia-telangiectasia mutada ATM
La protefna codificada por este gen es un miembro de la familia de fosfatidilinositol 3-cinasas. Estas protefnas responden al dano del ADN fosforilando sustratos implicados en la reparacion de ADN y/o control del ciclo celular. Se hace referencia a Savitsky et al. (Science 268:1749-1753, 1995) que sugirieron que un incremento en el riesgo de cancer puede estar asociado con anomalfas en este gen.
DLEU2 delecionado en leucemia linfocftica 1 (codificacion no proteica)
El gen DLEU2 se localiza en la region 13q14 y es una region no codificante identificada originalmente como gen supresor de tumores potencial y que puede delecionar en pacientes con leucemia linfocftica cronica de linfocitos B.
Receptor de insulina INSR
El gen INSR codifica un receptor de insulina que comprende un tetramero de dos subunidades alfa y dos beta. El receptor de insulina es un receptor transmembranario que se activa por insulina, IGF-I, IGF-II. El receptor de insulina desempena un papel clave en la regulacion de la homeostasis de la glucosa, un proceso funcional que en condiciones degeneradas puede dar como resultado una variedad de manifestaciones clfnicas incluyendo diabetes y cancer.
Amplicon 19q12
El locus 19q 12 se amplifica en muchos tipos de cancer incluyendo ovario, mama y colon. Varios genes se codifican dentro de la region incluyendo CCNE1 y URI, que se han implicado como "conductores" potenciales de la supervivencia de celulas cancerosas. Cada una de estas dianas puede proporcionar informacion predictiva/pronostica valiosa para el cuidado del paciente.
Region 13q12
La region 13q12 se selecciono como una region altamente conservada y excepcionalmente distinta del cromosoma 13 que puede servir como sustituto para una sonda centromerica para el cromosoma 13. Se sabe que el cromosoma 13 es altamente repetitivo con otros centromeres y, por tanto, es deseable una sonda especffica para una region tfpicamente no amplificada cerca del centromere del cromosoma 13.
Sonda: una molecula de acido nucleico que se puede hibridar con una molecula de acido nucleico diana (por ejemplo, molecula de acido nucleico diana genomica) y, cuando se hibrida con la diana, se puede detectar directa o bien indirectamente. Por tanto, las sondas permiten la deteccion, y en algunos ejemplos la cuantificacion, de una molecula de acido nucleico diana. En ejemplos particulares, una sonda incluye al menos dos segmentos complementarios de secuencias de acido nucleico excepcionalmente especfficas de una molecula de acido nucleico diana y, por tanto, se pueden hibridar especfficamente con al menos una porcion de la molecula de acido nucleico diana. En general, una vez que al menos un segmento o porcion de un segmento se ha (y permanece) hibridado con la molecula de acido nucleico diana, otras porciones de la sonda pueden (pero no necesitan) estar ffsicamente limitadas para hibridarse con los sitios de union analogos de esas otras porciones en la diana (por ejemplo, dichas otras porciones estan demasiado lejos de sus sitios de union analogos); sin embargo, otras moleculas de acido nucleico presentes en la sonda se pueden unir entre si, amplificando asf la senal de la sonda. Una sonda se puede denominar una "sonda de acido nucleico marcada", lo que indica que la sonda se acopla directa o indirectamente con un resto o "marcador" detectable, lo que hace que la sonda sea detectable.
Muestra: un especimen que contiene ADN (por ejemplo, ADN genomico), ARN (incluyendo ARNm), protefna o combinaciones de los mismos, obtenido de un sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, preparaciones cromosomicas, sangre periferica, orina, saliva, biopsia de tejido, aspirado con aguja fina, especimen quirurgico, medula osea, muestras de amniocentesis y material de necropsia. En un ejemplo, una muestra incluye ADN genomico. En algunos ejemplos, la muestra es una preparacion citogenetica, por ejemplo, que se puede disponer en portaobjetos de microscopio. En ejemplos particulares, las muestras se usan directamente, o se pueden manipular antes de su uso, por ejemplo, por fijacion (por ejemplo, usando formol).
Identidad de secuencia: la identidad (o similitud) entre dos o mas secuencias de acido nucleico se expresa en terminos de la identidad o similitud entre las secuencias. La identidad de secuencia se puede medir en terminos de porcentaje de identidad; cuanto mayor sea el porcentaje, mas identicas seran las secuencias. La similitud de secuencia se puede medir en terminos de porcentaje de similitud (que tiene en cuenta sustituciones aminoacfdicas conservadoras); cuanto mayor sea el porcentaje, mas similares seran las secuencias.
Los procedimientos de alineacion de secuencias para su comparacion son bien conocidos en la tecnica. Diversos programas y algoritmos de alineacion se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. uSA 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8:155-65, 1992; y Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-10, 1990, presentan una consideracion detallada de procedimientos de alineacion de secuencia y calculos de homologfa.
La herramienta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) del NCBI (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990) esta disponible de varias fuentes, incluyendo el Centro Nacional de Biotecnologfa y en Internet, para su uso en conexion con los programas de analisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se puede encontrar informacion adicional en el sitio web del NCBI.
Se puede usar BLASTN para comparar secuencias de acidos nucleicos, mientras que se puede usar BLASTP para comparar secuencias de aminoacidos. Si las dos secuencias comparadas comparten homologfa, entonces el archivo de salida designado presentara esas regiones de homologfa como secuencias alineadas. Si las dos secuencias comparadas no comparten homologfa, entonces el archivo de salida designado no presentara secuencias alineadas.
Tambien se puede usar la herramienta de alineacion de tipo BLAST (BLAT) para comparar secuencias de acidos nucleicos (Kent, Genome Res. 12: 656-664, 2002). BLAT esta disponible en varias fuentes, incluyendo Kent Informatics (Santa Cruz, CA) y en Internet (genome.ucsc.edu).
Una vez alineadas, el numero de emparejamientos se determina contando el numero de posiciones donde se presenta un residuo aminoacfdico o nucleotfdico identico en ambas secuencias. El porcentaje de identidad de secuencia se determina dividiendo el numero de emparejamientos entre la longitud de la secuencia expuesta en la secuencia identificada, o bien entre una longitud articulada (tal como 100 residuos aminoacfdicos o nucleotfdicos consecutivos de una secuencia expuesta en una secuencia identificada), seguido de multiplicar el valor resultante por 100. Por ejemplo, una secuencia de acido nucleico que tiene 1166 emparejamientos cuando se alinea con una secuencia de prueba que tiene 1554 nucleotidos es un 75,0 por ciento identica a la secuencia de prueba ((1166/1554)*100=75,0). El valor del porcentaje de identidad de secuencia se redondea a la decima mas cercana. Por ejemplo, 75,11, 75,12, 75,13 y 75,14 se redondean a 75,1, mientras que 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 y 75,19 se redondean a 75,2. El valor de longitud siempre sera un numero entero. En otro ejemplo, una secuencia diana que contiene una region de 20 nucleotidos que se alinea con 15 nucleotidos consecutivos de una secuencia identificada como sigue contiene una region que comparte una identidad de secuencia de un 75 por ciento con esa secuencia identificada (es decir, (15/20)*100=75).
Sujeto: cualquier organismo vertebrado multicelular, tal como mamfferos humanos o no humanos (por ejemplo, sujetos de veterinaria).
Secuencia o molecula de acido nucleico diana: una region definida o porcion particular de una molecula de acido nucleico, por ejemplo, una porcion de un genoma (tal como un gen o una region de ADN genomico de mairnfero que contiene un gen de interes). En un ejemplo donde la secuencia de acido nucleico diana es una secuencia genomica diana, una diana de este tipo se puede definir por su posicion en un cromosoma (por ejemplo, en una celula normal), por ejemplo, de acuerdo con la nomenclatura citogenetica por referencia a una localizacion particular en un cromosoma; por referencia a su localizacion en un mapa genetico; por referencia a un contigo hipotetico o ensamblado; por su secuencia o funcion espedfica; por su denominacion de gen o protema; o por cualquier otro medio que lo identifique excepcionalmente entre otras secuencias geneticas de un genoma. En algunos ejemplos, la secuencia de acido nucleico diana es una secuencia genomica de m ai^ero (por ejemplo, secuencia genomica humana).
En algunos ejemplos, las alteraciones de una secuencia de acido nucleico diana (por ejemplo, secuencia de acido nucleico genomico) estan "asociadas con" una enfermedad o afeccion. En algunos ejemplos, la deteccion de la secuencia de acido nucleico diana se puede usar para deducir el estado de una muestra con respecto a la enfermedad o afeccion. Por ejemplo, la secuencia de acido nucleico diana puede existir en dos (o mas) formas distinguibles, de modo que una primera forma se correlaciona con la ausencia de una enfermedad o afeccion y una segunda (o diferente) forma se correlaciona con la presencia de la enfermedad o afeccion. Las dos formas diferentes pueden ser distinguibles cualitativamente, tal como por polimorfismos polinucleotidicos, y/o las dos formas diferentes pueden ser distinguibles cuantitativamente, tal como por el numero de copias de la secuencia de acido nucleico diana que estan presentes en una celula.
Topoisomerasa II alfa (TOP2A): las topoisomerasas de ADN (EC 5.99.1.3) son enzimas que controlan y alteran los estados topologicos del ADN tanto en procariotas como eucariotas. La topoisomerasa II de celulas eucariotas cataliza la relajacion de las moleculas de ADN superhelicoidal, concatenacion, desconcatenacion, anudacion y desanudacion de ADN circular. La reaccion catalizada por la topoisomerasa II probablemente implica el cruce de dos segmentos de ADN. El gen que codifica la topoisomerasa II en seres humanos esta presente en la localizacion citogenetica: 17q21.2 y tiene las coordenadas genomicas (GRCh37): 17:38.544.772 - 38.574.201. Tsai-Pflugfelder et al. determinaron la secuencia codificante completa del gen TOP2 humano ya en 1988 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7177-7181, 1988). Lang et al. informaron de las estructuras completas de los genes INSR y TOP2B humanos en 1998 (Gene 221:255-266, 1998). El gen INSR humano abarca aproximadamente 30 kb y contiene 35 exones.
Secuencia excepcionalmente especffica: una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, una secuencia de al menos 20 pb (tal como al menos 20 pb, 30 pb, 40 pb, 50 pb, 60 pb, 70 pb, 80 pb, 90 pb, 100 pb o mas) que esta presente solo una vez en un genoma haploide de un organismo. En un ejemplo particular, una secuencia de acido nucleico excepcionalmente especffica es una secuencia de acido nucleico de un acido nucleico diana que tiene un 100 % de identidad de secuencia con el acido nucleico diana y no tiene identidad significativa con cualquier otra secuencia de acido nucleico presente en el genoma haploide espedfico que incluye el acido nucleico diana.
Vector: cualquier acido nucleico que actua como portador para otras secuencias de acido nucleico ("exogenas") que no son naturales del vector. Cuando se introduce en una celula huesped apropiada, un vector se puede autorreplicar (y, de este modo, la secuencia de acido nucleico exogena) o expresar al menos una porcion de la secuencia de acido nucleico exogena. En un contexto, un vector es un acido nucleico lineal o circular en el que se introduce una secuencia de acido nucleico de interes (por ejemplo, se clona) con el proposito de replicacion (por ejemplo, produccion) y/o manipulacion usando tecnicas de acido nucleico recombinante estandar (por ejemplo, digestion de restriccion). Un vector puede incluir secuencias de acido nucleico que le permiten replicarse en una celula huesped, tal como un origen de replicacion. Un vector tambien puede incluir uno o mas genes marcadores seleccionables y otros elementos geneticos conocidos en la tecnica. Los vectores comunes incluyen, por ejemplo, plasmidos, cosmidos, fagos, fagomidos, cromosomas artificiales (por ejemplo, BAC, PAC, HAC, YAC) e tubridos que incorporan caractensticas de mas de uno de estos tipos de vectores. Tfpicamente, un vector incluye uno o mas sitios de restriccion unicos (y, en algunos casos, un sitio de clonacion multiple) para facilitar la insercion de una secuencia de acido nucleico diana.
III. Ensayos de gen-protefna multiples
En el presente documento se divulgan procedimientos para detectar simultaneamente multiples moleculas diana, tales como al menos un gen y al menos una protema (por ejemplo, una protema y dos genes, etc.), en una unica muestra. En modos de realizacion particulares, los procedimientos de la presente invencion divulgan ensayos de gen-protema multiples para detectar la protema CD79a, ADN genomico de TP53 y ADN centromerico del cromosoma 17.
En algunos modos de realizacion de los procedimientos, una muestra se tine para detectar la protema CD79a poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo espedfico de protema CD79a, y a continuacion la muestra se pone en contacto con un medio (por ejemplo, un primer componente cromogeno) para detectar el anticuerpo espedfico de protema CD79a. En un modo de realizacion, la muestra se tine para detectar la protema CD79a poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo espedfico para CD79a, y a continuacion la muestra se pone en contacto con un primer componente cromogeno para visualizar la protema CD79a, por ejemplo, el primer componente cromogeno se adapta para emitir o hacer visible un primer color correspondiente a la protefna CD79a. En algunos modos de realizacion de los procedimientos, la muestra se tine para detectar el ADN de TP53 y ADN del cromosoma 17 poniendo en contacto la muestra con una sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 y una sonda de acido nucleico especffica de ADN del cromosoma 17 (por ejemplo, sonda centromerica del cromosoma 17). A continuacion la muestra se puede poner en contacto con un segundo componente cromogeno para visualizar el ADN de TP53 y un tercer componente cromogeno para visualizar el ADN del cromosoma 17. Por ejemplo, el segundo componente cromogeno se adapta para emitir o hacer visible un segundo color correspondiente al ADN de TP53, y el tercer componente cromogeno se adapta para emitir o hacer visible un tercer color correspondiente al ADN del cromosoma 17.
La FIG. 7 muestra un ensayo de gen-protefna de una muestra de medula osea normal tenida para detectar CD79a (rojo), TP53 (negro) y cromosoma 17 (azul/verde). La FIG. 8 muestra un ensayo de gen-protefna de una muestra de sangre tenida para detectar CD79a (rojo), TP53 (negro) y cromosoma 17 (azul/verde). Esa muestra muestra una delecion de 17p homocigotica.
Las muestras pueden ser muestras de sangre, sin embargo, las muestras no se limitan a la sangre. En algunos ejemplos, la muestra comprende tejido, medula osea o cualquier otro material de muestra apropiado. Las muestras se analizan ademas a continuacion.
Los procedimientos pueden utilizar diferentes marcadores detectables y/o sistemas de deteccion para cada una de las dianas de modo que cada una se pueda detectar individualmente en una unica muestra. Por ejemplo, en algunos modos de realizacion, la protefna CD79a se tine con un primer cromogeno (produciendo un primer color), TP53 se tine con un segundo cromogeno (produciendo un segundo color) y el cromosoma 17 se tine con un tercer cromogeno (produciendo un tercer color). Las protefnas/ADN se pueden detectar por los cromogenos usando reactivos adicionales tales como anticuerpos secundarios especfficos para los anticuerpos primarios. El primer color es lo suficientemente transparente como para permitir la visualizacion del segundo color y/o tercer color. En algunos ejemplos, el primer color bloquea no mas de un 50 %, no mas de un 40 %, no mas de un 30 %, no mas de un 20 %, no mas de un 10 %, no mas de un 8 %, no mas de un 6 %, no mas de un 4 %, no mas de un 2 %, o nada de la intensidad del segundo color y/o tercer color. La deteccion incluye, pero no se limita a, microscopfa de campo claro.
En un modo de realizacion, el primer componente cromogeno comprende Fast Red, el segundo componente cromogeno comprende plata, y el tercer componente cromogeno comprende un componente cromogeno verde.
En algunos modos de realizacion, la etapa de tenir la protefna CD79a se realiza antes de la etapa de tenir el ADN. Por ejemplo, la etapa de tenir la protefna CD79a se realiza antes de la etapa de tenir el ADN genomico de TP53 y tenir el a Dn centromerico del cromosoma 17.
Los anticuerpos para CD79a son conocidos en la tecnica y estan disponibles comercialmente. En un ejemplo, la muestra se pone en contacto con un anticuerpo monoclonal de conejo anti-CD79a, tal como anticuerpo monoclonal de conejo SP18 anti-CD79a (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, por ejemplo, numero de catalogo 790­ 4432). En algunos modos de realizacion, el anticuerpo especffico para CD79a se marca de forma detectable (el marcador se puede denominar como primer componente cromogeno), lo que permite la deteccion de la protefna CD79a en la muestra. En algunos modos de realizacion, despues de poner en contacto la muestra con el anticuerpo especffico de CD79a (el anticuerpo primario), la muestra se pone en contacto con un anticuerpo secundario marcado de forma detectable contra el anticuerpo primario, tal como un anticuerpo secundario conjugado con una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de rabano picante (HRP), etc.) o un anticuerpo secundario conjugado con un hapteno que se puede detectar con otro reactivo conjugado con una enzima. La presencia de la protefna CD79a se detecta poniendo en contacto la enzima con una composicion de sustrato y/o cromogeno, lo que produjo un precipitado coloreado (primer color) en la proximidad del anticuerpo especffico de CD79a.
En algunos ejemplos, la muestra se pone en contacto con un anticuerpo especffico de CD79a; a continuacion la muestra se pone en contacto con un anticuerpo secundario conjugado con AP que se une especfficamente al anticuerpo primario, por ejemplo en condiciones suficientes para que el anticuerpo secundario se una especfficamente al anticuerpo primario. A continuacion, la muestra se pone en contacto con un fosfato de naftol y cromogeno Fast Red, lo que produce un precipitado rojo cerca del anticuerpo anti-CD79a (y la protefna CD79a) que se puede detectar visualmente por microscopfa optica. En un ejemplo, los reactivos (excepto para el anticuerpo anti-CD79a) se incluyen en un kit, tal como el kit ULTRAVIEW Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, numero de catalogo 760-501). Un experto en la tecnica puede seleccionar reactivos de deteccion alternativos (tales como anticuerpos secundarios, enzimas, sustratos y/o cromogenoss alternativos) incluyendo los que producen un precipitado de color diferente para la deteccion de la CD79a.
En algunos ejemplos de los procedimientos divulgados, la muestra se pone en contacto con una sonda de acido nucleico que se une especfficamente al ADN genomico de TP53. Los procedimientos de construccion de sondas de acido nucleico especfficas de TP53 son conocidos para un experto en la tecnica, y las sondas de acido nucleico especfficas de TP53 se divulgan en el presente documento (a continuacion). En un ejemplo, la muestra se pone en contacto con una sonda de acido nucleico de TP53 marcada con hapteno, por ejemplo en condiciones especfficas para que la sonda se una especfficamente a (hibride con) el ADN genomico de TP53 en la muestra. La muestra a continuacion se pone en contacto con un anticuerpo que se une especfficamente al hapteno, por ejemplo, en condiciones suficientes para que el anticuerpo se una especfficamente al hapteno. El anticuerpo se puede conjugar con una enzima (tal como AP o HRP) o de forma alternativa, la muestra se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo que se une especfficamente al anticuerpo antihapteno, donde el segundo anticuerpo se conjuga con una enzima. La presencia de ADN genomico de TP53 se detecta poniendo en contacto la enzima con una composicion de cromogeno y/o sustrato para producir un precipitado coloreado en las proximidades de la sonda de acido nucleico de TP53. En algunos ejemplos, el numero de copias de ADN de TP53 en la muestra se puntua por un lector de portaobjetos contando el numero de areas de precipitado ("manchas") en los nucleos de las celulas tumorales.
En un ejemplo particular, el procedimiento incluye poner en contacto la muestra con una sonda de ADN genomico de TP53 conjugada con dinitrofenilo (DNP), por ejemplo en condiciones suficientes para que la sonda de TP53 se una especfficamente al ADN genomico de TP53 en la muestra. A continuacion la muestra se pone en contacto con un anticuerpo anti-hapteno que se une especfficamente a DNP, por ejemplo en condiciones suficientes para que el anticuerpo anti-hapteno se una especfficamente al DNP. A continuacion la muestra se pone en contacto con un anticuerpo secundario conjugado con HRP que se une especfficamente al anticuerpo anti-hapteno, por ejemplo en condiciones suficientes para que el anticuerpo secundario se una especfficamente al anticuerpo anti-DNP. A continuacion la muestra se pone en contacto con acetato de plata, hidroquinona y peroxido de hidrogeno. Los iones de plata se reducen por hidroquinona a iones de plata metalicos, que se pueden detectar visualmente por microscopfa optica como manchas negras. En un ejemplo, los reactivos (excepto para la sonda de TP53) se incluyen en un kit, tal como el kit ULTRAVIEW SISH DNP Detection Kit (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, numero de catalogo 760-098). Un experto en la tecnica puede seleccionar reactivos de deteccion alternativos (tales como haptenos, anticuerpos, enzimas, sustratos y/o cromogenos alternativos) incluyendo los que producen un precipitado de color diferente para la deteccion de ADN genomico de TP53.
Los ejemplos de sondas de TP53 se divulgan en el presente documento (vease a continuacion). En resumen, en algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende una molecula de acido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de acuerdo con una cualquiera de s Eq ID NO: 51-60; o una molecula de acido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con al menos 250 nucleotidos contiguos de una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60. En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende una molecula de acido nucleico que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60; o una molecula de acido nucleico que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con al menos 250 nucleotidos contiguos de una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60. En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende una molecula de acido nucleico que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60; o una molecula de acido nucleico que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con al menos 250 nucleotidos contiguos de una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60. En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende una molecula de acido nucleico que consiste en la secuencia de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60; o una molecula de acido nucleico que consiste en al menos 250 nucleotidos contiguos de una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60. En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende una molecula de acido nucleico con al menos un 90 % de identidad de secuencia con al menos 400 nucleotidos contiguos de una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60, al menos 500 nucleotidos contiguos de una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60, al menos 1000 nucleotidos contiguos de una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60, al menos 2500 nucleotidos contiguos de una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60, etc. En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende dos o mas porciones, en la que la primera porcion comprende al menos 250 nucleotidos contiguos de una secuencia de acido nucleico con al menos un 90 % de identidad de secuencia con una de SEQ ID NO: 51-60; y la segunda porcion comprende al menos 250 nucleotidos contiguos de un acido nucleico con al menos un 90 % de identidad de secuencia con una de SEQ ID NO: 51-60, en la que la primera y segunda porciones son diferentes entre sf. En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 tiene al menos 500 nucleotidos de longitud, al menos 1000 nucleotidos de longitud, al menos 5000 nucleotidos de longitud, etc. En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende al menos dos de las sondas divulgadas en el presente documento.
En algunos ejemplos de los procedimientos divulgados, la muestra se pone en contacto con una sonda de acido nucleico que se une especfficamente al ADN centromerico del cromosoma 17. Los procedimientos de construccion de sondas de acido nucleico especfficas de centromero del cromosoma 17 son conocidos por un experto en la tecnica. Ademas, las sondas de acido nucleico centromericas del cromosoma 17 tambien pueden estar disponibles comercialmente. Por ejemplo, una sonda centromerica del cromosoma 17 adecuada para su uso en los procedimientos divulgados incluye la sonda centromerica del cromosoma 17 incluida en el coctel de sondas de ISH doble de HER2 INFORM (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, numero de catalogo 780-4422). En un ejemplo, la muestra se pone en contacto con una sonda de acido nucleico centromerica del cromosoma 17 marcada con hapteno, por ejemplo en condiciones especfficas para que la sonda se una especfficamente a (hibride con) el ADN genomico centromerico del cromosoma 17 en la muestra. La muestra a continuacion se pone en contacto con un anticuerpo que se une especfficamente al hapteno, por ejemplo, en condiciones suficientes para que el anticuerpo se una especfficamente al hapteno. El anticuerpo se puede conjugar con una enzima (tal como AP o HRP) o de forma alternativa, la muestra se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo que se une especfficamente al anticuerpo antihapteno, donde el segundo anticuerpo se conjuga con una enzima. La presencia del ADN genomico centromerico del cromosoma 17 se detecta poniendo en contacto la enzima con una composicion de sustrato y/o cromogeno para producir un precipitado coloreado (tercer color) en la proximidad de la sonda de acido nucleico centromerica del cromosoma 17. En algunos ejemplos, el numero de copias genicas de ADN centromerico del cromosoma 17 en la muestra se puntua por un lector de portaobjetos contando el numero de areas de precipitado ("manchas") en los nucleos de las celulas tumorales.
En un ejemplo particular, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra con una sonda de ADN centromerico del cromosoma 17 conjugada con digoxigenina (DIG), por ejemplo en condiciones suficientes para que la sonda centromerica del cromosoma 17 se una especfficamente al ADN centromerico del cromosoma 17 en la muestra. La muestra a continuacion se pone en contacto con un anticuerpo antihapteno que se une especfficamente a DIG, por ejemplo en condiciones suficientes para que el anticuerpo anti-DIG se una especfficamente a la DIG. A continuacion la muestra se pone en contacto con un anticuerpo secundario conjugado con HRP que se une especfficamente al anticuerpo anti-DIG, por ejemplo en condiciones suficientes para que el anticuerpo secundario se una especfficamente al anticuerpo anti-DIG. A continuacion la muestra se pone en contacto con un componente cromogeno verde, produciendo un precipitado verde/azul que se deposita en los nucleos cerca de la sonda centromerica del cromosoma 17 (y el ADN centromerico del cromosoma 17) y se puede detectar visualmente por microscopfa optica como manchas verdes/azules. En un ejemplo, el componente cromogeno verde es HRP-Green (42 Lifescience, Bremerhaven, Alemania, numero de catalogo S-99056). Un experto en la tecnica puede seleccionar reactivos de deteccion alternativos (tales como haptenos, anticuerpos, enzimas, sustratos y/o cromogenos alternativos) incluyendo los que producen un precipitado de color diferente para la deteccion de a Dn centromerico del cromosoma 17.
En algunos modos de realizacion, la sonda de acido nucleico especffica de centromero del cromosoma 17 comprende un conjunto de dos o mas sondas de control oligonucleotfdicas monocatenarias. Las sondas de control oligonucleotfdicas del cromosoma 17 son especfficas para dos o mas (entre 2 y 14, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, > 4, > 6, > 8, etc.) monomeros distintos de la region de control de satelite alfa del cromosoma 17. En algunos modos de realizacion, las sondas oligonucleotfdicas del cromosoma 17 (sondas de control) comprenden cada una entre 50 a 100 nucleotidos.
En algunos modos de realizacion, las sondas de control oligonucleotfdicas del cromosoma 17 (cada sonda de control) pueden comprender una de SEQ ID NO: 61-74 (o complementos de las mismas) (vease a continuacion en la tabla 1). En algunos modos de realizacion, las sondas de control oligonucleotfdicas del cromosoma 17 (cada sonda de control) pueden comprender una version truncada de una de SEQ ID NO: 61-74 (o complementos de las mismas). La version truncada puede ser de al menos 30 pares de bases contiguas de dicha secuencia, al menos 40 pares de bases contiguas de dicha secuencia, o al menos 50 pares de bases contiguas de dicha secuencia. En algunos modos de realizacion, las sondas de control oligonucleotfdicas del cromosoma 17 (cada sonda de control) pueden comprender una secuencia que tenga al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia con una de SEQ ID NO: 61-74 (o complementos de las mismas).
Tabla 1 - Sondas oligonucleotfdicas monocatenarias para el cromosoma 17
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Las sondas oligonucleotfdicas centromericas del cromosoma 17 (sondas de control) pueden lograr una senal enumerable cuando se hibridan con su diana de ADN. Una senal enumerable tiene una conformacion en general redonda. En algunos ejemplos, una conformacion redonda es una conformacion definida por una curva cerrada simple (vease la FIG. 5) que se ajusta dentro de una primera region. La primera region es un area en y entre un cfrculo concentrico interno y un cfrculo concentrico externo. El cfrculo concentrico interno tiene un radio interno (Rin) y el cfrculo concentrico externo tiene un radio externo (Rex). Rin es > 50 % de Rex, y la curva cerrada simple tiene un radio Rsimple en el que Rin < Rsimple < Rex.
Las sondas de control oligonucleotfdicas del cromosoma 17 se pueden hibridar en condiciones durante un perfodo de tiempo menor de aproximadamente 3 horas, menor de aproximadamente 2 horas, 1 hora o menor de aproximadamente una hora. Las sondas oligonucleotfdicas centromericas del cromosoma 17 (sondas de control) pueden lograr al menos dos senales enumerables por celula, por ejemplo, con una intensidad de tincion de >2 y una cobertura de tincion de >50 % del numero de nucleos totales en 3 horas de la hibridacion (o en 2 horas de hibridacion, o en 1 hora de hibridacion). Las sondas oligonucleotfdicas centromericas del cromosoma 17 se pueden configurar para hibridar de manera excepcional y especffica con una porcion de la region de control del cromosoma 17 humano de modo que otros cromosomas o porciones de los mismos no se marquen de forma evidente sin la influencia del ADN bloqueante. En algunos ejemplos, las sondas de control oligonucleotfdicas del cromosoma 17 comprenden cada una entre 50 a 100 nucleotidos.
Las sondas de control oligonucleotfdicas del cromosoma 17 pueden comprender cada una un marcador detectable, por ejemplo, un hapteno (por ejemplo, dinitrofenilo, digoxigenina, biotina o fluorescefna, etc.). Las sondas oligonucleotfdicas del cromosoma 17 marcadas se pueden detectar como se describe previamente, por ejemplo, con un anticuerpo secundario dirigido al hapteno y/o con otros componentes y reactivos de deteccion. Por ejemplo, en un ejemplo particular, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra con sondas de control oligonucleotfdicas del cromosoma 17 conjugadas con digoxigenina (DIG), por ejemplo en condiciones suficientes para que las sondas de control oligonucleotfdicas del cromosoma 17 se unan especfficamente al ADN centromerico del cromosoma 17 en la muestra. La muestra a continuacion se pone en contacto con un anticuerpo antihapteno que se une especfficamente a DIG, por ejemplo en condiciones suficientes para que el anticuerpo anti-DIG se una especfficamente a la DIG. A continuacion la muestra se pone en contacto con un anticuerpo secundario conjugado con HRP que se une especfficamente al anticuerpo anti-DIG, por ejemplo en condiciones suficientes para que el anticuerpo secundario se una especfficamente al anticuerpo anti-DIG. A continuacion la muestra se pone en contacto con un componente cromogeno verde, produciendo un precipitado verde/azul que se deposita en los nucleos cerca de las sondas de control oligonucleotfdicas del cromosoma 17 (y el ADN centromerico del cromosoma 17) y se pueden detectar visualmente por microscopfa optica como manchas verdes/azules. En un ejemplo, el componente cromogeno verde comprende HRP-Green (42 Lifescience, Bremerhaven, Alemania, numero de catalogo S-99056). Un experto en la tecnica puede seleccionar reactivos de deteccion alternativos (tales como haptenos, anticuerpos, enzimas, sustratos y/o cromogenos alternativos) incluyendo los que producen un precipitado de color diferente para la deteccion de ADN centromerico del cromosoma 17.
Los procedimientos divulgados se dirigen a la deteccion de multiples dianas de acidos nucleicos y/o protefnas en una unica muestra. Como resultado, la senal detectable para cada miembro del ensayo debe ser individualmente distinguible. Por lo tanto, en algunos ejemplos, la senal visual generada por el ensayo de deteccion para cada miembro del ensayo es de un color diferente. En un ejemplo especffico, los procedimientos dan como resultado una tincion roja para protefna CD79a, tincion negra para ADN de TP53 (por ejemplo, manchas negras en el nucleo, tales como manchas negras individualmente distinguibles o grupos de manchas negras) y tincion verde/azul para ADN centromerico del cromosoma 17 (por ejemplo, manchas verdes/azules en el nucleo, tales como manchas verdes/azules distinguibles individualmente o grupos de manchas verdes/azules). Sin embargo, se pueden usar otras combinaciones.
Los procedimientos divulgados en el presente documento tambien pueden incluir etapas para el pretratamiento de muestras (por ejemplo, muestras de sangre) antes de o entre las etapas que incluyen poner en contacto la muestra con un anticuerpo especffico de CD79a, una sonda de acido nucleico especffica de TP53 y una sonda de acido nucleico especffica de centromero del cromosoma 17. Estas etapas son conocidas por un experto en la tecnica y pueden incluir la desparafinacion de una muestra (tal como una muestra de FFPE), acondicionamiento celular, lavados, etc. Un experto en la tecnica puede realizar ajustes a estas condiciones (por ejemplo, ajustes secundarios a tiempos y/o temperaturas de incubaciones, etapas de lavado, etc.).
En algunos modos de realizacion, la muestra se somete a un tratamiento con proteasa (proteinasa K, pepsina, colagenasa, dispasa, una combinacion de las mismas, etc.) despues de la etapa de tincion de protefna CD79a pero antes de la etapa de tincion de ADN genomico de TP53 y tincion de ADN centromerico del cromosoma 17. El tratamiento con proteasa es eficaz para permitir la hibridacion de las sondas de acido nucleico con sus dianas de ADN respectivas. El tratamiento con proteasa no elimina el primer color y la morfologfa del tejido se mantiene suficientemente para permitir la deteccion del primer color. La muestra se puede someter a un tratamiento termico despues de la etapa de tincion del marcador de linfocitos B pero antes del tratamiento con proteasa.
La presente invencion tambien presenta un portaobjetos (unico portaobjetos) que comprende una muestra de celulas tenidas cromogenicamente para detectar la protefna CD79a, ADN de TP53 y ADN del cromosoma 17. Los marcadores se pueden tenir cada uno con un cromogeno diferente, por ejemplo, la protefna CD79a se tine con un primer cromogeno, el ADN de TP53 se tine con un segundo cromogeno y el cromosoma 17 se tine con un tercer cromogeno. En algunos modos de realizacion, el primer cromogeno comprende Fast Red, el segundo cromogeno comprende plata y el tercer cromogeno comprende un componente cromogeno verde. En algunos modos de realizacion, mas de un 50 % de los nucleos tienen senales enumerables para el cromosoma 17. Una senal enumerable puede tener una conformacion en general redonda. En algunos modos de realizacion, una conformacion redonda es una conformacion definida por una curva cerrada simple que se ajusta dentro de una primera region. La primera region es un area en y entre un cfrculo concentrico interno y un cfrculo concentrico externo. El cfrculo concentrico interno tiene un radio interno (Rin) y el cfrculo concentrico externo tiene un radio externo (Rex). Rin es > 50 % de Rex, y la curva cerrada simple tiene un radio Rsimple en el que Rin ^ Rsimple ^ Rex.
Los procedimientos divulgados se pueden automatizar. Los sistemas para IHQ y/o ISH automatizadas estan disponibles comercialmente, tales como el sistema de tincion de portaobjetos BENCHMARK ULTRA, el sistema de tincion de portaobjetos BENCHMARK XT y el sistema de tincion de portaobjetos DISCOVERY XT (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), las estaciones de tincion de portaobjetos BOND-MAX y BOND-III (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL) y la estacion de tincion de portaobjetos IQ Kinetic (Biocare Medical, Concord, CA). Ventana Medical Systems, Inc. es el cesionario de una serie de patentes de Estados Unidos que divulgan sistemas y procedimientos para realizar analisis automatizados, incluyendo las patentes de EE. UU. n.° 5.650.327; 5.654.200; 6.296.809; 6.352.861; 6.582.962; 6.827.901 y 6.943.029.
Los ejemplos no limitantes de cromogenos que se pueden usar en los procedimientos divulgados incluyen (pero no se limitan a) los mostrados en la tabla 2. Aunque no es exhaustiva, la tabla 2 proporciona informacion sobre las variedades de cromogenos actualmente disponibles. Otros cromogenos ilustrativos incluyen los descritos en la publicacion de patente de EE. UU. 2013/0260379 y la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/831.552, presentada el 5 de junio de 2013.
Tabla 2 - Ejemplos de sistemas de cromogeno/sustrato disponibles comercialmente
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fPublicacion de patente internacional n.° WO 2012/024185
IV. Muestras
Las muestras ejemplares incluyen, sin limitacion, frotis de sangre, preparaciones de citocentrifugadora, frotis de citologfa, biopsias con aguja gruesa y/o biopsias con aguja fina. En algunos ejemplos, las muestras incluyen cortes histologicos (por ejemplo, cortes histologicos criostaticos y/o cortes histologicos incluidos en parafina). En modos de realizacion particulares, las muestras incluyen celulas tumorales, tales como celulas tumorales de mama o celulas tumorales de ovario. Los procedimientos de obtencion de una muestra biologica de un sujeto son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los procedimientos de obtencion de tejido de mama o celulas de mama son rutinarios. Las muestras biologicas ejemplares se pueden aislar a partir de celulas o tejidos normales, o a partir de celulas o tejidos neoplasicos. Un soporte solido puede contener la muestra biologica y permitir la deteccion comoda de componentes (por ejemplo, protefnas y/o moleculas de acido nucleico) en la muestra. Los soportes ejemplares incluyen portaobjetos de microscopio (por ejemplo, portaobjetos de microscopio de vidrio o portaobjetos de microscopio de plastico), cubreobjetos (por ejemplo, cubreobjetos de vidrio o cubreobjetos de plastico), placas de cultivo hfstico, placas de multiples pocillos, membranas (por ejemplo, nitrocelulosa o poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF)) o chips BIACORE™.
Las muestras descritas en el presente documento se pueden preparar usando cualquier procedimiento conocido ahora o desarrollado a partir de ahora en la tecnica. En general, las muestras de tejido se preparan fijando e incluyendo el tejido en un medio. En otros ejemplos, las muestras incluyen una suspension celular que se prepara como una monocapa sobre un soporte solido (tal como un portaobjetos de vidrio), por ejemplo extendiendo o centrifugando celulas sobre el soporte solido. En otros ejemplos, se pueden usar cortes histologicos recien congelados (por ejemplo, no fijados) en los procedimientos divulgados en el presente documento.
El procedimiento de fijacion de una muestra puede variar. La fijacion de una muestra de tejido conserva las celulas y los componentes tisulares lo mas cercano posible a un estado vital y les permite someterse a procedimientos preparatorios sin cambios significativos. La fijacion detiene la autolisis y los procesos de descomposicion bacteriana que comienzan tras la muerte celular, y estabiliza los componentes celulares y tisulares para que resistan las etapas posteriores del procesamiento del tejido, tales como para ISH o IHQ.
Los tejidos se pueden fijar por cualquier procedimiento adecuado, incluyendo perfusion o por inmersion en un fijador. Los fijadores se pueden clasificar como agentes de reticulacion (tales como aldehfdos, por ejemplo, formaldehfdo, paraformaldehfdo y glutaraldehfdo, asf como agentes de reticulacion no aldehfdicos), agentes oxidantes (por ejemplo, iones metalicos y complejos, tales como tetroxido de osmio y acido cromico), agentes desnaturalizantes de protefnas (por ejemplo, acido acetico, metanol y etanol), fijadores de mecanismo desconocido (por ejemplo, cloruro mercurico, acetona y acido pfcrico), reactivos de combinacion (por ejemplo, fijador de Carnoy, methacarn, lfquido de Bouin, fijador B5, lfquido de Rossman y lfquido de Gendre), microondas y fijadores diversos (por ejemplo, fijacion con volumen excluido y fijacion con vapor). Tambien se pueden incluir aditivos en el fijador, tales como tampones, detergentes, acido tanico, fenol, sales metalicas (tales como cloruro de cinc, sulfato de cinc y sales de litio) y lantano.
El fijador mas comunmente usado en la preparacion de muestras es el formaldehfdo, en general en forma de una solucion de formol (formaldehfdo al 4 % en una solucion tampon, denominado formol tamponado al 10 %). En un ejemplo, el fijador es formol tamponado neutro al 10 %.
En algunos ejemplos, se usa un medio de inclusion. Un medio de inclusion es un material inerte en el que se incluyen tejidos y/o celulas para ayudar a conservarlos para analisis futuros. La inclusion tambien permite cortar las muestras de tejido en cortes finos. Los medios de inclusion incluyen parafina, celoidina, compuesto OCT™, agar, plasticos o acrflicos. Muchos medios de inclusion son hidrofobos; por lo tanto, puede ser necesario retirar el material inerte antes del analisis histologico o citologico, que utiliza principalmente reactivos hidrofilos. El termino desparafinacion o desparafinado se usa ampliamente en el presente documento para referirse a la retirada parcial o completa de cualquier tipo de medio de inclusion de una muestra biologica. Por ejemplo, los cortes histologicos incluidos en parafina se desparafinan por paso a traves de disolventes organicos, tales como tolueno, xileno, limoneno u otros disolventes adecuados.
V. Marcadores detectables y procedimientos de marcado
Las sondas de acido nucleico divulgadas en el presente documento pueden incluir uno o mas marcadores, por ejemplo para permitir la deteccion de una molecula de acido nucleico diana. En diversas aplicaciones, tales como los procedimientos de hibridacion in situ, una sonda de acido nucleico incluye un marcador (por ejemplo, un marcador detectable). Un "marcador detectable" es una molecula o material que se puede usar para producir una senal detectable que indica la presencia o concentracion de la sonda (en particular la sonda unida o hibridada) en una muestra. Por tanto, una molecula de acido nucleico marcada proporciona un indicador de la presencia o cantidad (por ejemplo, numero de copias genicas) de un acido nucleico diana (al que la molecula de acido nucleico excepcionalmente especffica marcada se une o hibrida) en una muestra. La divulgacion no se limita al uso de marcadores particulares, aunque se proporcionan ejemplos.
Un marcador asociado con una o mas moleculas de acido nucleico (tales como las sondas divulgadas) se puede detectar directa o bien indirectamente. Un marcador se puede detectar por cualquier mecanismo conocido o aun por descubrir, incluyendo la absorcion, emision y/o dispersion de un foton (incluyendo fotones de radiofrecuencia, frecuencia de microondas, frecuencia infrarroja, frecuencia visible y frecuencia ultravioleta). Los marcadores detectables incluyen moleculas y materiales coloreados, fluorescentes, fosforescentes y luminiscentes, catalizadores (tales como enzimas) que convierten una sustancia en otra sustancia para proporcionar una diferencia detectable (tal como convirtiendo una sustancia incolora en una sustancia coloreada o viceversa, o produciendo un precipitado o incrementando la turbidez de la muestra), haptenos que se pueden detectar por interacciones de union a anticuerpos, y moleculas o materiales paramagneticos y magneticos.
Los ejemplos particulares de marcadores detectables incluyen moleculas fluorescentes (o fluorocromos). Numerosos fluorocromos son conocidos por los expertos en la tecnica, y se pueden seleccionar, por ejemplo, de Life Technologies, por ejemplo, vease The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. Se proporcionan ejemplos de fluoroforos particulares que se pueden unir (por ejemplo, conjugar qufmicamente) con una molecula de acido nucleico (tal como una region de union excepcionalmente especffica) en la patente de EE. UU. n.° 5.866.366 de Nazarenko et al., tales como acido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfonico, acridina y derivados tales como acridina e isotiocianato de acridina, acido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfonico (EDANS), 3,5-disulfonato de 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida (Lucifer Yellow VS), N-(4-anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, Brilliant Yellow, cumarina y derivados tales como cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, cumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilcumarina (cumarina 151); cianosina; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5',5''-dibromopirogalolsulfonaftalefna (rojo de bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentaacetato de dietilentriamina; acido 4,4'-diisotiocianatodihidroestilbeno-2,2'-disulfonico; acido 4,4-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfonico; cloruro de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo); acido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL); 4'-isotiocianato de 4-dimetilaminofenilazofenilo (DABITC); eosina y derivados tales como eosina e isotiocianato de eosina; eritrosina y derivados tales como eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etidio; fluorescefna y derivados tales como 5-carboxifluorescefna (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluorescefna (DTAF), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluorescefna (JOE), fluorescefna, isotiocianato de fluorescefna (FlTc) y QFITC (XRITC); 2',7'-difluorofluorescefna (o Re g On GREEN®); fluorescamina; IR144; IR1446; isotiocianato de verde malaquita; 4-metilumbeliferona; orto-cresolftalefna; nitrotirosina; pararosanilina; Phenol Red; B-ficoeritrina; o-ftaldialdehfdo; pireno y derivados tales como pireno, butirato de pireno y butirato de succinimidil-1-pireno; Reactive Red 4 (Cibacron Billiant Red 3B-A); rodamina y derivados tales como 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), cloruro de sulfonilo de lisamina y rodamina B, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, Rhodamine Green, sulforrodamina B, sulforrodamina 101 y derivado de cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101 (Texas Red); N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA); tetrametilrrodamina; isotiocianato de tetrametilrrodamina (TRITC); riboflavina; acido rosolico y derivados de quelato de terbio.
Otros fluoroforos adecuados incluyen quelatos de europio reactivos con tiol que emiten a aproximadamente 617 nm (Heyduk y Heyduk, Analyt. Biochem., 248:216-27, 1997; J Biol. Chem., 274:3315-22, 1999), asf como GFP, Lissamine™, dietilaminocumarina, clorotriazinilo de fluorescefna, naftofluorescema, 4,7-diclororrodamina y xanteno (como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.800.996 de Lee et al.) y derivados de los mismos. Tambien se pueden usar otros fluoroforos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, los disponibles de Life Technologies (Carlsbad, CA) y que incluyen la serie de tintes ALEXA FLUOR® (por ejemplo, como se describe en las patentes de EE. UU. n.° 5.696.157, 6.130.101 y 6.716.979), la serie de tintes BODIPY (tintes de difluoruro de dipirrometenoboro, por ejemplo, como se describe en las patentes de EE. UU. n.° 4.774.339, 5.187.288, 5.248.782, 5.274.113, 5.338.854, 5.451.663 y 5.433.896), Cascade Blue (un derivado reactivo de amina del pireno sulfonado descrito en la patente de EE. UU. n.° 5.132.432) y Marina Blue (patente de EE. UU. n.° 5.830.912).
Ademas de los fluorocromos descritos anteriormente, un marcador fluorescente puede ser una nanopartfcula fluorescente, tal como un nanocristal semiconductor, por ejemplo, un punto cuantico (obtenido, por ejemplo, de Life Technologies); veanse tambien las patentes de EE. Uu . n.° 6.815.064; 6.682.596; y 6.649.138). Los nanocristales semiconductores son partfculas microscopicas que tienen propiedades opticas y/o electricas dependientes del tamano. Cuando los nanocristales semiconductores se iluminan con una fuente de energfa primaria, se produce una emision secundaria de energfa de una frecuencia que se corresponde con el intervalo de banda del material semiconductor usado en el nanocristal semiconductor. Esta emision se puede detectar como luz coloreada de una fluorescencia o longitud de onda especffica. Los nanocristales semiconductores con diferentes caracterfsticas espectrales se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 6.602.671. Los nanocristales semiconductores que se pueden acoplar a una variedad de moleculas biologicas (incluyendo dNTP y/o acidos nucleicos) o sustratos por tecnicas descritas, por ejemplo, en Bruchez et al., Science 281:2013-2016,1998; Chan et al., Science 281:2016­ 2018, 1998; y la patente de EE. UU. n.° 6.274.323.
La formacion de nanocristales semiconductores de diversas composiciones se divulgan, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 6.927.069; 6.914.256; 6.855.202; 6.709.929; 6.689.338; 6.500.622; 6.306.736; 6.225.198; 6.207.392; 6.114.038; 6.048.616; 5.990.479; 5.690.807; 5.571.018; 5.505.928; 5.262.357 y en la publicacion de patente de EE. UU. n.° 2003/0165951 asf como la publicacion PCT n.° WO 99/26299. Se pueden producir poblaciones separadas de nanocristales semiconductores que son identificables en base a sus diferentes caracterfsticas espectrales. Por ejemplo, se pueden producir nanocristales semiconductores que emiten luz de diferentes colores en base a su composicion, tamano o tamano y composicion. Por ejemplo, los puntos cuanticos que emiten luz a diferentes longitudes de onda en base al tamano (longitudes de onda de emision de 565 nm, 655 nm, 705 nm u 800 nm), que son adecuados como marcadores fluorescentes en las sondas divulgadas en el presente documento, estan disponibles de Life Technologies (Carlsbad, CA).
Los marcadores adicionales incluyen, por ejemplo, radioisotopos (tales como 3H), quelatos metalicos tales como quelatos DOTA y DPTA de iones metalicos radiactivos o paramagneticos como Gd3+, y liposomas.
Los marcadores detectables que se pueden usar con moleculas de acido nucleico (tales como las sondas divulgadas) tambien incluyen enzimas, por ejemplo, peroxidasa de rabano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP), fosfatasa acida, glucosa oxidasa, p-galactosidasa, p-glucuronidasa o p-lactamasa. Cuando el marcador detectable incluye una enzima, se puede usar un cromogeno, compuesto fluorogenico o luminogenico en combinacion con la enzima para generar una senal detectable (muchos de dichos compuestos estan disponibles comercialmente, por ejemplo, de Life Technologies). Los ejemplos particulares de compuestos cromogenicos incluyen diaminobencidina (DAB), fosfato de 4-nitrofenilo (pNPP), Fast Red, Fast Blue, fosfato de bromocloroindolilo (BCIP), nitroazul de tetrazolio (NBT), BCIP/NBT, AP Orange, AP Blue, tetrametilbencidina (TMB), 2,2'-azino-di-[sulfonato de 3-etilbenzotiazolina] (ABTS), o-dianisidina, 4-cloronaftol (4-CN), nitrofenil-p-D-galactopiranosido (ONPG), ofenilendiamina (OPD), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-galactopiranosido (X-Gal), metilumbeliferil-p-D-galactopiranosido (MU-Gal), p-nitrofenil-a-D-galactopiranosido (PNP), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucuronido (X-Gluc), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), fucsina, yodonitrotetrazolio (INT), azul de tetrazolio y violeta de tetrazolio.
De forma alternativa, se puede usar una enzima en un esquema de deteccion metalografica. Por ejemplo, los procedimientos de hibridacion in situ con plata (SISH) implican esquemas de deteccion metalograficos para la identificacion y localizacion de una secuencia de acido nucleico diana genomica hibridada. Los procedimientos de deteccion metalografica incluyen el uso de una enzima, tal como fosfatasa alcalina, en combinacion con un ion metalico soluble en agua y un sustrato inactivo de oxidorreduccion de la enzima. El sustrato se convierte en un agente activo de oxidorreduccion por la enzima, y el agente activo de oxidorreduccion reduce el ion metalico, provocando que forme un precipitado detectable. (Veanse, por ejemplo, la publicacion de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2005/0100976, publicacion PCT n.° 2005/003777 y publicacion de solicitud de patente de Ee . UU. n.° 2004/0265922). Los procedimientos de deteccion metalografica tambien incluyen el uso de una enzima oxidorreductasa (tal como la peroxidasa de rabano picante) junto con un ion metalico soluble en agua, un agente oxidante y un agente reductor, de nuevo para formar un precipitado detectable. (Vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.670.113).
En ejemplos no limitantes, las sondas de acido nucleico divulgadas se marcan con dNTP unidos covalentemente a moleculas de hapteno (tales como un compuesto nitroaromatico (por ejemplo, 2,4-dinitrofenilo (DNP)), biotina, fluorescefna, digoxigenina, etc.). Los haptenos adicionales adecuados para marcar las sondas divulgadas incluyen haptenos de nitropirazol, 3-hidroxiquinoxalina, tiazolsulfonamida, acido nitrocinamico, rotenona, acido 7-(dietilamino)cumarin-3-carboxflico, benzodiacepina o benzofurano (vease, por ejemplo, la publicacion de patente internacional n.° WO 2012/003476). Los procedimientos para conjugar haptenos y otros marcadores a dNTP (por ejemplo, para facilitar la incorporacion en sondas marcadas) son bien conocidos en la tecnica. Para ejemplos de procedimientos, veanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.258.507, 4.772.691, 5.328.824 y 4.711.955. De hecho, numerosos dNTP marcados estan disponibles comercialmente, por ejemplo, de Life Technologies (Carlsbad, CA). Un marcador se puede unir directa o indirectamente a un dNTP en cualquier localizacion del dNTP, tal como un fosfato (por ejemplo, fosfato a, p o y) o un azucar.
La deteccion de moleculas de acido nucleico marcadas se puede lograr poniendo en contacto las moleculas de acido nucleico marcadas con hapteno unidas al acido nucleico diana genomico con un anticuerpo antihapteno primario. En un ejemplo, el anticuerpo antihapteno primario (tal como un anticuerpo antihapteno de raton) se marca directamente con una enzima. En otro ejemplo, se usa un antianticuerpo secundario (tal como un anticuerpo anti-IgG de raton caprino) conjugado con una enzima para amplificacion de senal. En CISH, se anade un sustrato cromogenico, para SISH, se anaden iones de plata y otros reactivos como se explica en las patentes/solicitudes a las que se hace referencia.
En algunos ejemplos, una sonda se marca incorporando uno o mas dNTP marcados usando una reaccion enzimatica (polimerizacion). Por ejemplo, las sondas de acido nucleico divulgadas (por ejemplo, incorporadas en un vector plasmfdico) se pueden marcar por desplazamiento de mella (usando, por ejemplo, biotina, DNP, digoxigenina, etc.) o mediante extension de cebador aleatorio con transferasa terminal (por ejemplo, elongacion de extremo 3'). En algunos ejemplos, la sonda nucleica se marca por una reaccion de desplazamiento de mella modificada donde la proporcion de ADN polimerasa I con respecto a desoxirribonucleasa I (DNasa I) se modifica para producir mas de un 100 % del material de partida. En ejemplos particulares, la reaccion de desplazamiento de mella incluye ADN polimerasa I con respecto a ADNasa I en una proporcion de al menos aproximadamente 800:1, tal como al menos 2000:1, al menos 4000:1, al menos 8000:1, al menos 10.000:1, al menos 12.000:1, al menos 16.000:1, tal como aproximadamente de 800:1 a 24.000:1, y la reaccion se lleva a cabo durante la noche (por ejemplo, durante aproximadamente 16-22 horas) a una temperatura sustancialmente isotermica, por ejemplo, a aproximadamente de 16 °C a 25 °C (tal como temperatura ambiente). Si la sonda se incluye en un conjunto de sondas (por ejemplo, multiples plasmidos, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas plasmidos), los plasmidos se pueden mezclar en una proporcion molar igual antes de realizar la reaccion de marcado (tal como desplazamiento de mella o desplazamiento de mella modificado).
En otros ejemplos, tambien se pueden emplear procedimientos de marcado qufmico. Numerosos reactivos (incluyendo hapteno, fluoroforo y otros nucleotidos marcados) y otros kits estan disponibles comercialmente para el marcado enzimatico de acidos nucleicos, incluyendo las sondas de acido nucleico divulgadas. Como sera evidente para los expertos en la tecnica, cualquiera de los marcadores y procedimientos de deteccion divulgados anteriormente son aplicables en el contexto del marcado de una sonda, por ejemplo, para su uso en reacciones de hibridacion in situ. Por ejemplo, el sistema de marcado de ADN MULTIPRIME® de Amersham, diversos reactivos y kits especfficos disponibles de Molecular Probes/Life Technologies, o cualquier otro reactivo o kit similar se pueden usar para marcar los acidos nucleicos divulgados en el presente documento. En ejemplos particulares, las sondas divulgadas se pueden marcar directa o indirectamente con un hapteno, un ligando, un resto fluorescente (por ejemplo, un fluoroforo o un nanocristal semiconductor), un resto cromogenico o un radioisotopo. Por ejemplo, para el marcado indirecto, el marcador se puede unir a moleculas de acido nucleico por medio de un conector (por ejemplo, PEG o biotina). Los procedimientos adicionales que se pueden usar para marcar moleculas de acido nucleico de sonda se proporcionan en la publicacion de solicitud de EE. UU. n.° 2005/0158770.
VI. Hibridacion in situ
La hibridacion in situ (ISH) implica poner en contacto una muestra que contiene un acido nucleico diana (por ejemplo, un acido nucleico diana genomico) en el contexto de una preparacion de cromosomas metafasicos o interfasicos (tal como una muestra de celulas o tejido montada en un portaobjetos) con una sonda marcada especfficamente hibridable o especffica para el acido nucleico diana (por ejemplo, una o mas de las sondas divulgadas en el presente documento). Los portaobjetos se pretratan opcionalmente, por ejemplo, para retirar parafina u otros materiales que puedan interferir en una hibridacion uniforme. La muestra cromosomica y la sonda se tratan ambas, por ejemplo, calentando hasta desnaturalizar los acidos nucleicos bicatenarios. La sonda (formulada en un tampon de hibridacion adecuado) y la muestra se combinan, en condiciones y durante tiempo suficiente para permitir que se produzca la hibridacion (tfpicamente para alcanzar el equilibrio). La preparacion cromosomica se lava para retirar el exceso de sonda, y la deteccion del marcado especffico de la diana se realiza usando tecnicas estandar.
Por ejemplo, una sonda biotinilada se puede detectar usando avidina marcada con fluorescefna o fosfatasa alcalina con avidina. Para la deteccion de fluorocromo, el fluorocromo se puede detectar directamente, o las muestras se pueden incubar, por ejemplo, con avidina conjugada con isotiocianato de fluorescefna (FITC). La amplificacion de la senal de FITC se puede efectuar, si es necesario, por incubacion con anticuerpos antiavidina de cabra conjugados con biotina, lavado y una segunda incubacion con avidina conjugada con FITC. Para la deteccion por actividad enzimatica, las muestras se pueden incubar, por ejemplo, con estreptavidina, lavar, incubar con fosfatasa alcalina conjugada con biotina, lavar de nuevo y preequilibrar (por ejemplo, en tampon de fosfatasa alcalina (AP)). La reaccion enzimatica se puede realizar, por ejemplo, en tampon AP que contiene NBT/BCIP y detener por incubacion en 2X SSC. Para una descripcion general de los procedimientos de hibridacion in situ, vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.888.278.
Numerosos procedimientos para FISH, CISH y SISH son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los procedimientos para realizar FISH se describen en las patentes de EE. UU. n.° 5.447.841; 5.472.842; y 5.427.932; y por ejemplo, en Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2934-2938, 1986; Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9138-9142, 1988; y Lichter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9664-9668, 1988. CISH se describe, por ejemplo, en Tanner et al., Am. J. Pathol. 157:1467-1472, 2000 y la patente de EE. UU. n.° 6.942.970. Se proporcionan procedimientos de deteccion adicionales en la patente de EE. UU. n.° 6.280.929.
Se pueden emplear numerosos reactivos y esquemas de deteccion junto con los procedimientos de FISH, CISH y SISH para mejorar la sensibilidad, resolucion u otras propiedades deseables. Como se analiza anteriormente, las sondas marcadas con fluoroforos (incluyendo tintes fluorescentes y puntos cuanticos) se pueden detectar opticamente de forma directa al realizar la FISH. De forma alternativa, la sonda se puede marcar con una molecula no fluorescente, tal como un hapteno (tal como los siguientes ejemplos no limitantes: biotina, digoxigenina, DNP y diversos oxazoles, pirrazoles, tiazoles, nitroarilos, benzofurazanos, triterpenos, ureas, tioureas, rotenonas, cumarina, compuestos basados en cumarina, podofilotoxina, compuestos basados en podofilotoxina y combinaciones de los mismos), ligando u otro resto detectable indirectamente. Las sondas marcadas con dichas moleculas no fluorescentes (y las secuencias de acido nucleico diana a las que se unen) se pueden detectar a continuacion poniendo en contacto la muestra (por ejemplo, la muestra de celulas o tejido a la que se une la sonda) con un reactivo de deteccion marcado, tal como un anticuerpo (o receptor u otro companero de union especffico) especffico para el hapteno o ligando elegido. El reactivo de deteccion se puede marcar con un fluoroforo (por ejemplo, punto cuantico) o con otro resto detectable indirectamente, o se puede poner en contacto con uno o mas agentes de union especffica adicionales (por ejemplo, anticuerpos secundarios o especfficos), que a su vez se pueden marcar con un fluoroforo. Opcionalmente, el marcador detectable se une directamente al anticuerpo, receptor (u otro agente de union especffica). De forma alternativa, el marcador detectable se une con el agente de union por medio de un conector, tal como un conector de hidrazida-tiol, un conector de polietilenglicol o cualquier otro resto de union flexible con reactividades comparables. Por ejemplo, un agente de union especffica, tal como un anticuerpo, un receptor (u otro antiligando), avidina o similares, se puede modificar covalentemente con un fluoroforo (u otro marcador) por medio de un conector de polialquilenglicol heterobifuncional tal como un conector de polietilenglicol (PEG) heterobifuncional. Un conector heterobifuncional combina dos grupos reactivos diferentes seleccionados, por ejemplo, de un grupo reactivo con carbonilo, un grupo reactivo con amina, un grupo reactivo con tiol y un grupo fotorreactivo, de los que el primero se une al marcador y de los que el segundo se une al agente de union especffica.
En otros ejemplos, la sonda, o agente de union especffica (tal como un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo primario, receptor u otro agente de union) se marca con una enzima que puede convertir una composicion fluorogenica o cromogenica en una senal detectable fluorescente, coloreada o detectable de otro modo (por ejemplo, como en el deposito de partfculas metalicas detectables en SISH). Como se indica anteriormente, la enzima se puede unir directa o indirectamente por medio de un conector a la sonda o reactivo de deteccion relevante. Los ejemplos de reactivos (por ejemplo, reactivos de union) y productos qufmicos adecuados (por ejemplo, productos qufmicos de union y conectores) se describen en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2006/0246524; 2006/0246523 y 2007/0117153.
En otros ejemplos, se utiliza un procedimiento de amplificacion de senal, por ejemplo, para incrementar la sensibilidad de la sonda. Por ejemplo, se puede utilizar Catalyzed Reporter Deposition (Ca r D), tambien conocido como Tyramide Signal Amplification (TSA™). En una variacion de este procedimiento, una sonda de acido nucleico biotinilada detecta la presencia de una diana uniendose a la misma. A continuacion, se anade un conjugado estreptavidina-peroxidasa. La estreptavidina se une a la biotina. Se usa un sustrato de tiramida biotinilada (tiramina es 4-(2-aminoetil)fenol), que presumiblemente se convierte en un radical libre cuando interactua con la enzima peroxidasa. A continuacion, el radical fenolico reacciona rapidamente con el material circundante, depositando o fijando asf la biotina en las proximidades. Este procedimiento se repite proporcionando mas sustrato (tiramida biotinilada) y acumulando biotina mas localizada. Finalmente, se detecta el deposito de biotina "amplificado" con estreptavidina unida a una molecula fluorescente. De forma alternativa, el deposito de biotina amplificado se puede detectar con complejo avidina-peroxidasa, que a continuacion se alimenta con 3,3'-diaminobenzidina para producir un color marron. Se ha descubierto que la tiramida unida a moleculas fluorescentes tambien sirve como sustrato para la enzima, simplificando asf el procedimiento al eliminar etapas.
En otros ejemplos, el procedimiento de amplificacion de senal utiliza una amplificacion de senal de ADN ramificado (ADNr). En algunos ejemplos, los oligonucleotidos especfficos de diana (extensores de marcador y extensores de captura) se hibridan con alta restriccion con el acido nucleico diana. Se disenan extensores de captura para hibridarse con la diana y capturar sondas, que se unen a una placa de micropocillos. Se disenan extensores de marcador para hibridarse con regiones contiguas en la diana y proporcionar secuencias para la hibridacion de un oligonucleotido preamplificador. La amplificacion de senal comienza a continuacion con sondas de preamplificador que se hibridan con extensores de marcador. El preamplificador forma un hfbrido estable solo si se hibrida con dos extensores de marcador adyacentes. Se disenan otras regiones en el preamplificador para hibridarse con multiples moleculas amplificadoras de ADNr que crean una estructura ramificada. Finalmente, los oligonucleotidos marcados con fosfatasa alcalina (AP), que son complementarios de las secuencias amplificadoras de ADNr, se unen a la molecula de ADNr por hibridacion. La senal del ADNr es el producto quimioluminiscente de la reaccion con AP. Vease, por ejemplo, Tsongalis, Microbiol, Inf. Dis., 126:448-453, 2006; patente de EE. UU. n.° 7.033.758.
En otros ejemplos, el procedimiento de amplificacion de senal utiliza anticuerpos polimerizados. En algunos ejemplos, la sonda marcada se detecta usando un anticuerpo primario para el marcador (tal como un anticuerpo anti-DlG o anti-DNP). El anticuerpo primario se detecta por un anticuerpo secundario polimerizado (tal como un anticuerpo secundario conjugado con HRP polimerizado o un anticuerpo secundario conjugado con AP). La reaccion enzimatica de AP o HRP da lugar a la formacion de senales potentes que se pueden visualizar.
Se apreciara por los expertos en la tecnica que, seleccionando apropiadamente pares de sonda marcada-agente de union especffica, se pueden producir esquemas de deteccion multiples para facilitar la deteccion de multiples acidos nucleicos diana (por ejemplo, acidos nucleicos diana genomicos) en un unico ensayo (por ejemplo, en una unica muestra de celulas o tejido o en mas de una muestra de celulas o tejido). Por ejemplo, una primera sonda que corresponde a un primer acido nucleico diana se puede marcar con un primer hapteno, tal como biotina, mientras que una segunda sonda que corresponde a un segundo acido nucleico diana se puede marcar con un segundo hapteno, tal como DNP. Despues de la exposicion de la muestra a las sondas, las sondas unidas se pueden detectar poniendo en contacto la muestra con un primer agente de union especffica (en este caso, avidina marcada con un primer fluoroforo, por ejemplo, un primer punto cuantico espectralmente distinto, por ejemplo, que emite a 585 nm) y un segundo agente de union especffica (en este caso, un anticuerpo anti-DNP, o fragmento de anticuerpo, marcado con un segundo fluoroforo (por ejemplo, un segundo punto cuantico espectralmente distinto, por ejemplo, que emite a 705 nm). Se pueden anadir pares de sondas/agentes de union adicionales al esquema de deteccion multiple usando otros fluoroforos espectralmente distintos. Se pueden prever numerosas variaciones de directo e indirecto (una etapa, dos etapas o mas), de las que todas son adecuadas en el contexto de las sondas y ensayos divulgados. Se pueden encontrar detalles adicionales con respecto a determinados procedimientos de deteccion, por ejemplo, como se utilizan en procedimientos de CISH y SlSH, en Bourne, The Handbook of Immunoperoxidase Staining Methods, publicado por Dako Corporation, Santa Barbara, CA.
VII. ADN bloqueante
El ADN bloqueante especffico del genoma (tal como ADN humano, por ejemplo, ADN placentario humano total o ADN Cot-1™) se incluye normalmente en una solucion de hibridacion (tal como para hibridacion in situ) para suprimir la hibridacion de sonda con secuencias de ADN repetitivas o para contrarrestar la hibridacion de sonda con secuencias inespecfficas altamente homologas (con frecuencia identica) cuando se utiliza una sonda complementaria de un acido nucleico diana genomico humano. En la hibridacion con sondas estandar, en ausencia de ADN bloqueante especffico del genoma, normalmente esta presente un nivel inaceptablemente alto de tincion de fondo (por ejemplo, union inespecffica, tal como hibridacion con una secuencia de acido nucleico no diana), incluso cuando se usa una sonda "libre de repeticiones". Las sondas de acido nucleico divulgadas presentan una tincion de fondo reducida, incluso en ausencia de ADN bloqueante. En ejemplos particulares, la solucion de hibridacion que incluye las sondas divulgadas no incluye ADN bloqueante especffico del genoma (por ejemplo, ADN placentario humano total o ADN Cot-1™, si la sonda es complementaria para un acido nucleico diana genomico humano). Esta ventaja se deriva de la naturaleza excepcionalmente especffica de las secuencias diana incluidas en la sonda de acido nucleico; cada secuencia de sonda marcada se une solo a la secuencia genomica excepcionalmente especffica analoga. Esto da como resultado incrementos drasticos en las proporciones de senal a ruido para las tecnicas de ISH.
En algunos ejemplos, la solucion de hibridacion puede contener ADN transportador de un organismo diferente (por ejemplo, ADN de esperma de salmon o ADN de esperma de arenque, si el acido nucleico diana genomico es un acido nucleico diana genomico humano) para reducir la union inespecffica de la sonda a materiales distintos de ADN (por ejemplo, a recipientes de reaccion o portaobjetos) con alta carga positiva neta que se pueden unir de forma no especffica al ADN de sonda cargada negativamente.
La divulgacion se ilustra ademas por los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar determinadas caracterfsticas especfficas de modos de realizacion de trabajo y protocolos generales. El alcance de la presente invencion no esta limitado a las caracterfsticas ejemplificadas por los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1: Analisis de CLL
Se encuentran citogeneticas anomalas en la mayorfa de los pacientes con CLL, y cada subtipo se asocia con frecuencia, consecuencia y tratamientos propuestos diferenciados (vease la tabla 3).
Tabla 3
Anomalfa Incidencia Pronostico SG Tratamientos 13q ~30 % El mejor 15-7 anos Seguimiento
o Tratamientos dirigidos a CD20 Trisomfa 12 ~20 % Intermedio 9-10 anos
NUEVO: obinutuzumab/ 11q ~15 % Malo 3-6 anos clorambucil, ofatumumab, idelalisib (Pi3K) NUEVO: Ibrutinib (BTK) 17p ~7 % Muy malo 1-2 anos Ensayos: Syk, bCl2, inmunomoduladores El ejemplo 1 demuestra que las sondas de la presente divulgacion pueden detectar dichas anomalfas por medio de hibridacion in situ (ISH) en muestras de trefina/medula osea incluidas en parafina fijadas con formol.
A. Preparacion de reactivos: Se marcaron sondas de ADN con DNP o bien DIG usando condiciones de reaccion estandar. Se verifico la especificidad de cada sonda usando la expansion metafasica diana de CGH (CGH Target Metaphase spread). Se determino la funcionalidad de cada sonda por ISH doble estandar usando el procedimiento de U Dual Color ISH Open Probe en tejidos de cancer estandar suministrados por Ventana Medical Systems, Inc. B. Reactivos (si estan disponibles comercialmente de Ventana Medical Systems Inc., los reactivos se enumeran con el numero de parte asociado).
• TP53/Chr17:
o TP53-DNP [30 ug/ml] (mezcla de 10 sondas de acuerdo con SEQ ID NO: 51-60);
o ASR CEN-17-DIG [1,25 ug/ml] (Ventana Medical Systems, Inc., cat. n.° 760-1224);
• DLEU/13q12.11:
o DLEU-DNP [30 ug/ml], (mezcla de 10 sondas de acuerdo con SEQ ID NO: 31-40);
o 13q 12.11 -DIG [30 ug/ml], (mezcla de 10 sondas de acuerdo con SEQ ID NO: 11-20);
o 1 mg/ml ADNcc sonicado;
• ATM/13q12.11:
o ATM-DNP [30 ug/ml], (mezcla de 10 sondas de acuerdo con SEQ ID NO: 21-30)
o CEN11-DIG [4 ug/ml], 1 mg/ml ADN placentario
• Trisomfa 12:
o ASR CEN-12-DNP [0,75 ug/ml] (Ventana Medical Systems, Inc., cat. n.° 760-1221);
o Tarjeta dispensadora de sondas de ISH
C. Reactivos de deteccion
• Proteasa 2 de ISH (780-4148)
• Proteasa 3 de ISH (780-4149)
• HYB READY (780-4409)
• Kit de deteccion ULTRAVIEW SISH DNP (760-098)
• Kit de deteccion ULTRAVIEW Red ISH DIG (760-505)
• Hematoxilina II (790-2208)
• Bluing Reagent (760-2037)
D. Reactivos a granel
• Concentrado EZ PREP (950-102)
• Ultra LSC (650-210)
• Concentrado de SSC (950-110)
• Tampon de reaccion (950-300)
• Ultra CC1 (950-224)
• Ultra CC2 (950-223)
• ULTRAVIEW SilverWash II (780-003)
E. Tejido - protocolos propuestos
Los siguientes protocolos de tincion se realizaron en muestras de trefina-medula osea incluidas en parafina fijadas con formol y coagulo sangufneo usando una plataforma de tincion de portaobjetos automatizada BenchMark XT o BenchMark ULTRA:
17p- (TP53/CHR17) - Tabla 4
Figure imgf000023_0001
3q- (DLEU/13q12.11) - Tabla 5
Figure imgf000024_0001
1p- (ATM/CEN11) - Tabla 6
Figure imgf000024_0002
Trisomfa 12 (CEN12) - Tabla 7
Figure imgf000025_0001
Los portaobjetos tenidos ejemplares se ilustran en la fig. 1 (muestras de medula osea/trefina) y fig. 2 (coagulo sangufneo). Los ovalos indican una celula ejemplar. Las flechas discontinuas indican la tincion correspondiente a la sonda especffica de centromero/cromosoma, que es roja en las imagenes en color. Las flechas continuas indican la tincion correspondiente a la sonda especffica del gen, que es negra en las imagenes en color.
F. Sangre - protocolos propuestos
Los siguientes protocolos de tincion se realizaron en frotis de sangre completa fijados con formol usando una plataforma de tincion de portaobjetos automatizada BenchMark XT o BenchMark ULTRA:
17p- (TP53/CHR17) - Tabla 8
Figure imgf000025_0002
Bluing Reagent, 8 min 13q- (DLEU/13q12.11) - Tabla 9
Figure imgf000026_0001
11p- (ATM/CEN11) - Tabla 10
Figure imgf000026_0002
Trisomfa 12 (CEN12) - Tabla 11
Figure imgf000027_0001
Un portaobjetos ejemplar tenido para TP53 y cromosoma 17 se ilustra en la fig. 3. Las flechas discontinuas indican la tincion correspondiente a la sonda especffica del cromosoma 17, que es roja en las imagenes en color. Las flechas continuas indican la tincion correspondiente a la sonda especffica de TP53, que es negra en las imagenes en color.
G. Procedimiento de fijacion celular para preparacion celular
• Preparar la muestra de sangre como se desee (frotis de sangre completa/Cytospin/etc.)
• Secar al aire.
• Sumergir los portaobjetos en NBF al 10 % (formol tamponado neutro); incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
• Aclarar los portaobjetos 3 veces en PBS a temperatura ambiente.
• Aclarar los portaobjetos en ddH2O a temperatura ambiente.
• Secar al aire.
• Almacenar los portaobjetos en congelador a -20 °C en un recipiente hermetico.
H. Examinar la amplificacion de 19q12 usando ISH cromogenica
Preparacion de materiales: Se marcaron sondas de ADN con DNP o bien DIG por Ventana Pilot Plant usando condiciones de reaccion estandar segun Genomics Technology and Applied Research (GTAR). Se verifico la especificidad de las sondas CCNE1-DNP e INSR-DIG usando la expansion metafasica diana de CGH. Se determino la funcionalidad de cada sonda por ISH doble estandar usando el procedimiento de Dual Color ISH Open Probe en tejidos de cancer estandar suministrados por Ventana TSM. Estos protocolos son suficientes para las senales de DNP y DIG pero no se consideran "consistentes".
I. Criterios de puntuacion de ISH doble
Tabla 12
Figure imgf000028_0001
Para una explicacion mas detallada de la puntuacion, consultar la gufa de interpretacion INFORM HER2 DuallSH PMA ULTRA).
Revisar toda la seccion/especimen en busca de regiones tumorales con buena tincion (tanto roja como negra) que tengan el mayor numero de senales.
Seleccionar un area de interes y contar 17 celulas y clasificar las senales con la mayor cantidad de informacion (senales mas altas).
Seleccionar una segunda area de interes y contar 17 celulas con la mayor cantidad de informacion (senales mas altas).
Seleccionar una tercera area de interes y contar 16 celulas con la mayor cantidad de informacion (senales mas altas).
Numero total de celulas = 50
Ejemplo 2 - ensayo de gen-protefna multiple para CD79a/TP53/CEN 17
Este ejemplo describe un ensayo de gen-protefna multiple para la deteccion de protefna CD79a, ADN de TP53 y ADN centromerico del cromosoma 17 en una unica muestra. La estrategia de tincion consiste esencialmente en tres etapas de tincion: (1) protefna CD79a; (2) gen TP53; y (3) CEN17. Una vision general de la estrategia de tincion se ilustra en la fig. 6.
En la primera deteccion, un anticuerpo especffico para CD79a 1 se pone en contacto con la muestra. Un anticuerpo secundario especffico de especie 2 conjugado con un primer grupo reactivo con anticuerpo (tal como un hapteno) se aplica a continuacion a la muestra, que se une al anticuerpo primario 1. A continuacion un anticuerpo terciario 3 se aplica a la muestra. El anticuerpo terciario 3 es especffico para la subunidad reactiva con anticuerpo del anticuerpo secundario 2. El anticuerpo terciario 3 tambien se marca con un marcador detectable. Despues de la reaccion para visualizar el marcador detectable, las regiones a las que se ha unido el anticuerpo primario aparecen como un primer color. En el ejemplo ilustrado en la fig. 6, el marcador detectable es fosfatasa alcalina (AP), y el primer color es rojo. En la segunda deteccion, una sonda de acido nucleico especffica para el gen TP53 (sonda TP53) 4 se hibrida con la muestra. La sonda TP534 se modifica para contener un segundo grupo reactivo con anticuerpo que es distinto del primer grupo reactivo con anticuerpo (tal como un hapteno diferente). La sonda TP534 se puede hibridar por sf misma, o se puede hibridar simultaneamente con la muestra con una sonda especffica para la region centromerica del cromosoma 17 (sonda CEN17) 5 que se modifica para contener un tercer grupo reactivo con anticuerpo que es distinto del primer y segundo grupos reactivos con anticuerpos (tal como un hapteno diferente). La fig. 6 ilustra una reaccion de hibridacion simultanea. Un anticuerpo primario especffico para el segundo grupo reactivo con anticuerpo 6 se hace reaccionar a continuacion con la muestra, que se une al segundo grupo reactivo con anticuerpo. Un anticuerpo secundario especffico de especie 7 se hace reaccionar a continuacion con la muestra, que se une al anticuerpo primario 6. El anticuerpo secundario 7 se conjuga con un marcador detectable. Despues de la reaccion para visualizar el marcador detectable, las regiones en las que se ha unido el anticuerpo primario aparecen como un segundo color que es visualmente distinto del primer color. En el ejemplo ilustrado en la fig. 6, el marcador detectable es peroxidasa de rabano picante (HRP), y el segundo color es plateado/negro.
En la tercera deteccion, una sonda de acido nucleico especffica para la sonda CEN17 5 como se describe anteriormente se aplica (si se usa hibridacion secuencial) y/o se detecta. La fig. 6 ilustra una reaccion de hibridacion simultanea, de modo que no es necesaria una etapa de hibridacion separada en ese ejemplo especffico. Un anticuerpo primario especffico para el tercer grupo reactivo con anticuerpo 8 se hace reaccionar a continuacion con la muestra, que se une al tercer grupo reactivo con anticuerpo. Un anticuerpo secundario especffico de especie 9 se hace reaccionar a continuacion con la muestra, que se une al anticuerpo primario 8. El anticuerpo secundario 7 se conjuga con un marcador detectable. Despues de la reaccion para visualizar el marcador detectable, las regiones en las que se ha unido el anticuerpo primario aparecen como un tercer color que es visualmente distinto del primer y segundo colores. En el ejemplo ilustrado en la fig. 6, el marcador detectable es peroxidasa de rabano picante (HRP), y el tercer color es verde.
Un ejemplo de este esquema de reaccion se realizo en portaobjetos de vidrio con frotis de sangre. Los portaobjetos de vidrio con frotis de sangre se volvieron a fijar en formol tamponado neutro a temperatura ambiente durante la noche. Despues de la fijacion, los portaobjetos de vidrio se aclararon en agua destilada varias veces y se secaron al aire por completo. Antes del protocolo de tincion, los portaobjetos de vidrio se empaparon en leche en polvo desnatada al 10 % (Carnation) en tampon de reaccion (Ventana) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos de vidrio con frotis de sangre se dispusieron en la estacion de tincion de portaobjetos automatizada VENTANA BenchMark XT para un ensayo de gen-protefna TP53. Las muestras de sangre se pretrataron con calor con acondicionador celular 1 (CC1, Ventana) durante 48 minutos a 95 °C. A continuacion, despues de aclarar los portaobjetos con tampon de reaccion (Ventana), se aplico el anticuerpo primario monoclonal de conejo anti-CD79a CONFIRM (SP18) (Ventana, catalogo n.° 790-4432) durante 28 minutos a 37 °C seguido de etapas de lavado de tampon de reaccion. Se uso un cromogeno rojo para detectar la protefna CD79a como tincion roja. Las muestras de sangre se pretrataron con calor con acondicionamiento celular 2 (CC2) diluido con EZ Prep (Ventana) durante dos ciclos de una incubacion de 8 minutos a 82 °C. A continuacion, las muestras se digirieron con ISH-proteasa 3 (Ventana) durante 20 minutos a 37 °C para completar el pretratamiento de la parte del ensayo de ISH del ensayo de gen-protefna. Se aplico un coctel de sondas CEN17 marcadas con DIG y TP53 marcadas con DNP sobre portaobjetos de vidrio con solucion HybReady diluida con SSC (Ventana). Despues de la etapa de desnaturalizacion durante 8 minutos a 80 °C, la etapa de hibridacion se realizo durante 6 horas. Se realizo una etapa de lavado de restriccion y deteccion de ISH secuenciales para la visualizacion de la senal de CEN17 y del gen TP53. Para la primera restriccion y deteccion de ISH de TP53, se realizaron tres ciclos de etapas de lavado de restriccion a 68 °C usando SSC seguido del kit de deteccion ultraView SISH DNP (Ventana, catalogo n.° 760-098) y la senal del gen TP53 se visualizo como puntos negros. Para la segunda restriccion y deteccion de ISH de CEN17, se realizaron tres ciclos de etapas de lavado de restriccion a 76 °C usando SSC y se aplico un protocolo de deteccion de senal HRP-Green para la visualizacion de la senal de ISH de CEN17. Se aplico anticuerpo anti-DIG (de UltraView Red ISH DIG Detection Kit, Ventana, catalogo n.° 760-505) a portaobjetos de vidrio durante 12 minutos a 37 °C seguido de incubacion con anticuerpo anti-IgG de raton conjugado con HRP (UltraMap, Ventana, catalogo n.° 760-4313) durante 12 minutos a 37 °C. La deteccion de ISH de CEN17 se completo con la deteccion de HRP-Green (42 Lifescience). Finalmente, los portaobjetos de vidrio se contratineron con hematoxilina de Mayer diluida (1:4 en agua) durante 4 minutos. Los portaobjetos de vidrio se lavaron y se secaron al aire seguido del cubreobjetos.
Como se ilustra en la fig. 7 y fig. 8, el protocolo da como resultado la tincion roja de protefna CD79a, tincion negra de ADN genomico de TP53 (que aparece como puntos negros oscuros en la imagen en escala de grises de las fig. 7 y 8) y tincion verde/azul de ADN centromerico del cromosoma 17 (que aparece como puntos mas difusos y mas claros en la imagen en escala de grises de las fig. 7 y 8). La figura 8 ilustra un ejemplo que tiene una delecion homocigotica pi 7. La tincion de protefna CD79a se ilustra con flechas continuas, la tincion de gen TP53 con flechas discontinuas y la tincion de CEN17 con flechas punteadas. Todas las etapas se realizaron en un instrumento de tincion de IHQ/ISH automatizado BENCHMARK XT (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, n.° de catalogo: N750-BMKXT-FS).
En vista de los muchos modos de realizacion posibles a los que se pueden aplicar los principios de la divulgacion, se debe reconocer que los modos de realizacion ilustrados son solo ejemplos y no se deben tomar como limitantes del alcance de la invencion. Mas bien, el alcance de la invencion se define por las siguientes reivindicaciones.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento multiple para detectar simultaneamente la protefna CD79a, ADN genomico de TP53 y ADN centromerico del cromosoma 17 en una muestra en un unico portaobjetos, comprendiendo dicho procedimiento:
tenir la protefna CD79a poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo especffico de protefna CD79a y poniendo en contacto la muestra con un primer componente cromogeno para el anticuerpo especffico de protefna CD79a, el primer componente cromogeno se adapta para emitir o hacer visible un primer color, en el que la presencia del primer color indica la presencia de la protefna CD79a; y
tenir el ADN genomico de TP53 y tenir el ADN centromerico del cromosoma 17 poniendo en contacto la muestra con una sonda de acido nucleico especffica de ADN genomico de TP53, y con una sonda de acido nucleico especffica del ADN centromerico del cromosoma 17, y poner en contacto la muestra con un segundo componente de cromogeno para la sonda de acido nucleico especffica de ADN genomico de TP53 y con un tercer componente cromogeno para la sonda de acido nucleico especffica de ADN centromerico del cromosoma 17, el segundo componente cromogeno se adapta para emitir o hacer visible un segundo color y el tercer componente cromogeno se adapta para emitir o hacer visible un tercer color, en el que la presencia del segundo color indica la presencia de ADN genomico de TP53 y la presencia del tercer color indica la presencia de ADN centromerico del cromosoma 17.
2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la muestra es una muestra de sangre.
3. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que el primer componente cromogeno comprende Fast Red, el segundo componente cromogeno comprende plata y el tercer componente cromogeno comprende un componente cromogeno verde.
4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende ademas visualizar los colores usando microscopfa de campo claro.
5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el procedimiento es automatizado.
6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa de tenir la protefna CD79a se realiza antes de la etapa de tenir el ADN genomico de TP53 y tenir el ADN centromerico del cromosoma 17.
7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra se somete a un tratamiento con proteasa con proteinasa K, pepsina, colagenasa, dispasa o una combinacion de las mismas despues de la etapa de tenir la protefna CD79a pero antes de la etapa de tenir el ADN genomico de TP53 y tenir el ADN centromerico del cromosoma 17, opcionalmente, en el que la muestra se somete a un tratamiento termico despues de la etapa de tenir la protefna CD79a pero antes del tratamiento de proteasa.
8. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo especffico de protefna CD79a es un anticuerpo monoclonal de conejo SP18 anti-CD79a.
9. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo especffico de protefna CD79a comprende un primer marcador que comprende una enzima, y el primer componente cromogeno comprende un componente inductor que comprende un sustrato para la enzima del primer marcador para inducir que el primer marcador emita el primer color, opcionalmente en el que el primer marcador comprende biotina y el componente inductor comprende estreptavidina conjugada con una enzima.
10. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el primer componente cromogeno comprende un anticuerpo secundario marcado de forma detectable que se une especfficamente al anticuerpo especffico de protefna CD79a, y el anticuerpo secundario marcado de forma detectable comprende fosfatasa alcalina y el primer componente cromogeno comprende ademas Fast Red.
11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende:
(a) una molecula de acido nucleico que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60; o
(b) una molecula de acido nucleico que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con al menos 250 nucleotidos contiguos de una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60; o (c) una molecula de acido nucleico que consiste en la secuencia de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60; o
(d) una molecula de acido nucleico que consiste en al menos 250 nucleotidos contiguos de una cualquiera de SEQ ID NO: 51-60.
12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende dos o mas porciones, en el que:
la primera porcion comprende al menos 250 nucleotidos contiguos de una secuencia de acido nucleico con al menos un 90 % de identidad de secuencia con una de SEQ ID NO: 51-60; y
la segunda porcion comprende al menos 250 nucleotidos contiguos de un acido nucleico con al menos un 90 % de identidad de secuencia con una de SEQ ID NO: 51-60, en el que la primera y segunda porciones son diferentes entre si, y en el que la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 tiene al menos 500, al menos 1000, o al menos 5000 nucleotidos de longitud.
13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende al menos dos de las sondas de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la sonda de acido nucleico especffica de ADN de TP53 comprende un marcador detectable, y en la que el segundo componente cromogeno comprende un anticuerpo primario que se une especfficamente al marcador detectable y un anticuerpo secundario que se une especfficamente al anticuerpo primario, en la que el anticuerpo secundario se conjuga con peroxidasa de rabano picante y el segundo componente cromogeno comprende ademas peroxido de hidrogeno y plata.
15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la sonda de acido nucleico especffica de ADN centromerico del cromosoma 17 comprende un conjunto de dos o mas sondas de control oligonucleotfdicas monocatenarias especfficas para X monomeros distintos de una region de control de satelite alfa del cromosoma 17, en el que X = 2-14, en el que cada sonda de control comprende:
■ una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 61-74; o
■ una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una version truncada de SEQ ID NO: 61-74, siendo la version truncada al menos 40 pb contiguos de dichas SEQ ID NO: 61-74; o
■ una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una secuencia que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una de SEQ ID NO: 61-74, o
■ complementos de la misma.
16. El procedimiento de cualquiera de la reivindicacion 15, en el que la etapa de poner en contacto la muestra con la sonda de acido nucleico especffica de ADN centromerico del cromosoma 17 comprende hibridar la sonda en condiciones durante un perfodo de tiempo menor de aproximadamente 3 horas.
17. El procedimiento de la reivindicacion 15, en el que las dos o mas sondas de control oligonucleotfdicas monocatenarias comprenden cada una entre 50 a 100 nucleotidos.
18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la sonda de acido nucleico especffica de ADN centromerico del cromosoma 17 comprende un hapteno, y el hapteno comprende dinitrofenilo, digoxigenina, biotina o fluorescefna, y en la que el tercer componente cromogeno comprende un anticuerpo primario que se une especfficamente al hapteno, y un anticuerpo secundario que se une especfficamente al anticuerpo primario, en la que el anticuerpo secundario se conjuga con peroxidasa de rabano picante y el tercer componente cromogeno comprende ademas un componente cromogeno verde como sustrato para la peroxidasa de rabano picante.
19. Un unico portaobjetos que comprende una muestra de celulas tenidas cromogenicamente para detectar la protefna CD79a, Ad N de TP53 y ADN del cromosoma 17.
20. El portaobjetos de la reivindicacion 19, en el que la protefna CD79a se tine con un primer cromogeno, el ADN de TP53 se tine con un segundo cromogeno y el cromosoma 17 se tine con un tercer cromogeno.
21. El portaobjetos de la reivindicacion 20, en el que el primer cromogeno comprende Fast Red, el segundo cromogeno comprende plata y el tercer cromogeno comprende un componente cromogeno verde.
22. El portaobjetos de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que mas de un 50 % de los nucleos tienen senales enumerables para el cromosoma 17, y en las que cada senal enumerable es una conformacion en general redonda, una conformacion redonda es una conformacion definida por una curva cerrada simple que se ajusta dentro de una primera region, la primera region es un area en y entre un cfrculo concentrico interno y un cfrculo concentrico externo, teniendo el cfrculo concentrico interno un radio interno (Rin) y teniendo el cfrculo concentrico externo un radio externo (Rex) en el que Rin es > 50 % de Rex, y la curva cerrada simple tiene un radio Rsimple en el que Rin ^ Rsimple ^ Rex.
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