CN110257483B - 用于原位杂交的杂交液、其制备方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于原位杂交的杂交液、其制备方法及原位杂交检测试剂盒。该用于原位杂交的杂交液，包括以下终浓度的组分：体积百分浓度不超过2％的甲酰胺、重量体积百分浓度为0.1‑10％的氟化物、2‑4倍浓度的SSC、1‑10mM的EDTA、1‑5倍浓度的Denhardts溶液、重量体积百分浓度为5‑10％的硫酸葡聚糖、0.1‑1mg/mL的鲑鱼精DNA、以及50‑100mM且pH为7.0的磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液或Tris‑HCl缓冲液。本发明的用于原位杂交的杂交液可在保证杂交信号的情况下，提高杂交效率，缩短杂交时间。
Description
技术领域
本发明涉及原位杂交技术，特别涉及一种用于原位杂交的杂交液、其制备方法及原位杂交检测试剂盒。
背景技术
1969年Gall和Pardue首次利用同位素标记的探针在完整细胞内测定核酸序列，原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)得到快速发展。免疫组织化学染色方法的出现，又促进了非同位素标记的核酸探针的发展，使得对常规***固定、石蜡包埋的组织中的DNA和RNA的检测成为可能。在经过***固定的组织中，甲醛渗透于核酸和蛋白质之间，可以导致DNA-DNA、DNA-蛋白质的交联，保存抗原于原位。原位杂交是将分子杂交与组织学相结合的一项技术，通过采用生物素、地高辛等标记探针，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA杂交双链，进一步采用信号放大***对杂交探针进行放大，显色***显色，最后在显微镜下观察杂交信号。信号放大***和显色***与免疫组织化学抗原抗体反应相同。原位杂交包括显色原位杂交(Chromogenic in situhybridization,CISH)和荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)。显色原位杂交应用非荧光标记物标记探针，如地高辛、生物素等，因此需要相关检测***将信号进行放大，如果用DAB显色后的杂交信号能够永久保存。荧光原位杂交用荧光标记物标记探针，不需要信号放大过程，具有灵敏度高、可同时使用多个探针的优点。原位杂交技术可在细胞中原位检测核酸水平的信息，如感染性疾病、细胞遗传性疾病和肿瘤相关染色体异常，与免疫组化在应用上可以相互补充，已成为许多医院病理科的常规检测项目。
显色原位杂交整个实验操作过程包括：脱蜡、水化、内源性酶阻断、清洗、蛋白酶消化、清洗、探针杂交、清洗、一抗孵育、清洗、二抗孵育、清洗、显色、清洗、衬染、清洗、脱水、封片等步骤。荧光原位杂交整个实验操作过程包括：脱蜡、水化、热修复、清洗、蛋白酶消化、清洗、脱水、探针杂交、清洗、脱水、复染等步骤。探针杂交过程分为变性和退火。变性是指双螺旋DNA分子在碱性条件下加热至92℃(90℃-98℃)或加变性剂时，其双链间互补碱基的氢链解开而成为单链的过程。退火是指在一定离子浓度和逐渐降温时，其互补碱基间的氢键又连接成双链核酸分子(探针)的过程。退火过程中，加入外源且序列互补的单链DNA或RNA片段，也可与原来解开的一条单链互补连接形成异质双链核酸分子，该过程称为核酸杂交。探针杂交的效果取决于信号强度和杂交背景，这又与蛋白酶消化、杂交温度、探针序列及稀释探针的杂交液等因素相关。
目前市面上的原位杂交产品的探针杂交时长大部分为4到16个小时，但杂交时间越短，杂交越不充分，杂交信号强度更弱以及非特异性背景高，在这种情况下，快速杂交4个小时将可能会降低原位杂交的灵敏度，影响临床鉴别诊断。因此，如何在保证杂交信号强度的情况下，提高杂交效率，缩短杂交时间，提高病理科的工作效率，尤为关键。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种用于原位杂交的杂交液，可在保证杂交信号的情况下，提高杂交效率，缩短杂交时间；
进一步的，本发明还提供上述用于原位杂交的杂交液的制备方法；以及一种基于上述用于原位杂交的杂交液的原位杂交检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种用于原位杂交的杂交液，所述杂交液包括以下终浓度的组分：体积百分浓度不超过2％的甲酰胺、重量体积百分浓度为0.1-10％的氟化物、2-4倍浓度的SSC、1-10mM的EDTA、1-5倍浓度的Denhardts溶液、重量体积百分浓度为5-10％的硫酸葡聚糖、0.1-1mg/mL的鲑鱼精DNA、以及50-100mM且pH为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
一种原位杂交检测试剂盒，包括原位杂交检测探针、水和上述的用于原位杂交的杂交液。
一种上述的用于原位杂交的杂交液的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1.25g的氟化钠、2.5mL且1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、5mL且20倍浓度的SSC溶液、0.1mL且0.5M的EDTA溶液、1mL且50倍浓度的Denhardts溶液和2.5g的硫酸葡聚糖混合，所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH为7.0；
(2)将步骤(1)获得的混合液进行离心处理；
(3)加入终浓度为0.1mg/mL的鲑鱼精DNA，然后加入超纯水进行定容至50mL。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明于杂交液组分设计中，采用氟化物以替代或降低甲酰胺的浓度(可从现有20％降低至2％以下，甚至为0)，因甲酰胺为有毒物质，该发明可以减少甚至不使用甲酰胺，具有更加环保的优点；
(2)可以降低变性温度10～26℃，在比较低的温度下进行变性，有利于更好保持组织形态以及提高DNA的稳定性，减少对DNA的破坏；同时，由于探针的浓度通常远远高于目标DNA的浓度，在氟离子存在的情况下，提高杂交温度10～26℃，仍然不影响探针与核酸形成的稳定的双股链；由此，杂交液应用于杂交工艺时，可提高杂交温度，进而可以加快杂交速度，也能提高杂交的特异性，降低背景，使得原位杂交能够更加快速进行，信号和背景比更加清晰；
(3)本发明的杂交液可以适用于包括DNA和RNA等不同探针的杂交，使用该杂交液配方可以有效地缩短杂交时间，优化杂交效果，减少背景。
附图说明
图1为本发明实施例的用于原位杂交的杂交液于50℃杂交90分钟条件下的Kappa原位杂交结果图；
图2为本发明实施例的用于原位杂交的杂交液于37℃杂交过夜条件下的Kappa原位杂交结果图；
图3为本发明实施例的用于原位杂交的杂交液于50℃杂交90分钟条件下的Lambda原位杂交结果图；
图4为本发明实施例的用于原位杂交的杂交液于37℃杂交过夜条件下的Lambda原位杂交结果图；
图5为本发明实施例的用于原位杂交的杂交液于66℃杂交2小时条件下的HER2荧光原位杂交结果图；
图6为本发明实施例的用于原位杂交的杂交液于50℃杂交过夜条件下的HER2荧光原位杂交结果图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：杂交液组分中增加了氟化物这个组分以减少或取代甲酰胺组分。
请参照图1-6，一种用于原位杂交的杂交液，所述杂交液包括以下终浓度的组分：体积百分浓度不超过2％的甲酰胺、重量体积百分浓度为0.1-10％的氟化物、2-4倍浓度的SSC、1-10mM的EDTA、1-5倍浓度的Denhardts溶液、重量体积百分浓度为5-10％的硫酸葡聚糖、0.1-1mg/mL的鲑鱼精DNA、以及50-100mM且pH为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
一种原位杂交检测试剂盒，包括原位杂交检测探针、水和上述的用于原位杂交的杂交液。
一种上述的用于原位杂交的杂交液的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1.25g的氟化钠、2.5mL且1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、5mL且20倍浓度的SSC溶液、0.1mL且0.5M的EDTA溶液、1mL且50倍浓度的Denhardts溶液和2.5g的硫酸葡聚糖混合，所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH为7.0；
(2)将步骤(1)获得的混合液进行离心处理；
(3)加入终浓度为0.1mg/mL的鲑鱼精DNA，然后加入超纯水进行定容至50mL。
现对本发明的用于原位杂交的杂交液的主要作用机理进行说明：
本发明原位杂交的杂交液与常规杂交液相比，增加了氟化物这个组分以减少或取代甲酰胺组份。
氟原子和氧、氮、氯等原子一样，能够与氢原子形成稳定的氢键，氢键是维系DNA双螺旋结构稳定性的首要因素。其中氟的原子半径与氢原子大小最接近，能够形成比其他任何原子(氧、氮、氯、硫、磷)等原子更强的氢键。在杂交溶液添加氟离子，可有效防止打开了的DNA双股链，恢复原本的双股链结构，使变性后的DNA保持在双股链分离的状态，给探针介入杂交提供更高的概率。同时氟离子也促进DNA双股链的解离，使得原位杂交过程中DNA的变性温度可以在较低的温度下进行，有利于DNA和探针的稳定性，同时保持组织形态。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：
(1)本发明于杂交液组分设计中，采用氟化物以替代或降低甲酰胺的浓度(可从现有20％降低至2％以下，甚至为0)，因甲酰胺为有毒物质，该发明可以减少甚至不使用甲酰胺，具有更加环保的优点；
(2)可以降低变性温度10～26℃，在比较低的温度下进行变性，有利于更好保持组织形态以及提高DNA的稳定性，减少对DNA的破坏；同时，由于探针的浓度通常远远高于目标DNA的浓度，在氟离子存在的情况下，提高杂交温度10～26℃，仍然不影响探针与核酸形成的稳定的双股链；由此，杂交液应用于杂交工艺时，可提高杂交温度，进而可以加快杂交速度，也能提高杂交的特异性，降低背景，使得原位杂交能够更加快速进行，信号和背景比更加清晰；
(3)本发明的杂交液可以适用于包括DNA和RNA等不同探针的杂交，使用该杂交液配方可以有效地缩短杂交时间，优化杂交效果，减少背景。
本发明的杂交液适用于不同原位杂交探针，例如DNA原位杂交探针、RNA原位杂交探针和荧光原位杂交探针的配制。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一：Kappa和Lambda原位杂交检测试剂盒
1、杂交液制备(50mL)：
(1)称取1.25g氟化钠加入50mL离心管；
(2)取2.5mL的1M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液pH7.0溶液加入50mL离心管；
(3)取5mL 20x SSC溶液加入50mL离心管；
(4)取0.1mL的0.5M EDTA溶液加入50mL离心管；
(5)取1mL的50x Denhardts溶液加入50mL离心管；
(6)称取2.5g硫酸葡聚糖加入50mL离心管充分震荡混匀，1000rpm离心5分钟；
(7)加入终浓度为0.1mg/mL鲑鱼精DNA；
(8)加超纯水定容于50mL。
最后，用该杂交液分别对Kappa和Lambda探针稀释成终浓度1ng/uL。
2、实验方法
2.1切片处理：将组织切片于60-65℃烘烤60分钟以上(建议每次实验同时附加阳性、阴性对照片)。
2.2脱蜡及水化：将组织切片置于脱蜡液浸泡5分钟，重复3次；100％酒精浸泡2分钟，重复1次；PBS清洗液浸泡2分钟。
2.3每张切片滴加适量阻断剂工作液，以可覆盖整个组织的量为宜，室温孵育5分钟。纯水冲洗30秒。
2.4消化酶消化：甩干切片，再用吸水纸吸干组织块边缘的液体，用免疫组化笔沿组织切片边缘划出阻水区域。切片置于湿盒中，滴加消化酶(约50μL，根据组织大小增减)，置于37℃恒温箱孵育5ˉ15分钟(建议10分钟，具体时间与组织类型和切片厚度有关)。PBS清洗液浸泡2分钟。
2.5每张切片滴加适量Kappa或Lambda链探针(约10μL，根据组织大小增减)，并加盖玻片(滴加探针前，切片可用100％酒精脱水，空气干燥)。
2.6切片放入湿盒中，将湿盒放入50℃恒温箱里90分钟进行变性和杂交；或者37℃变性和杂交过夜。
2.7PBS室温浸泡切片，小心移去盖玻片，继续浸泡4×3分钟。
2.8甩去清洗液，滴加适量一抗(约50μL，根据组织大小增减)，室温孵育30分钟，PBS浸泡3×3分钟。
2.9甩去清洗液，滴加适量免疫显色试剂-A液(阻断剂，约50μL，根据组织大小增减)，室温孵育20分钟，PBS浸泡3×3分钟。
2.10甩去清洗液，滴加适量免疫显色试剂-B液(聚合物，约50μL，根据组织大小增减)，室温孵育20分钟，PBS浸泡3×3分钟。
2.11甩去清洗液，滴加适量DAB显色液使之完全覆盖标本，室温下染色5分钟(可在显微镜下观察显色情况以适当调整染色时间)。
2.12复染：纯水冲洗30秒，甩干，滴加适量苏木素染色液使之完全覆盖标本，室温下染色3分钟。
2.13用分化液(盐酸酒精溶液)洗20ˉ30秒去除多余苏木素，纯水冲洗30秒，PBS浸泡3分钟返蓝。
2.14脱水、透明、封片：切片依次在梯度酒精(浓度由低到高75％、95％、100％、100％)中各浸泡2分钟；使用香味封片剂进行封片，封片后的切片置于晾片板中。
3、应用实例一
应用实例一显示在该含氟离子杂交液中，不含甲酰胺，加入了2.5％的氟化钠。用该杂交液配制的Kappa探针用于原位杂交时，杂交与变性均使用一个温度，其快速杂交50℃下90分钟的信号强度参见图1所示，其37℃过夜杂交的信号强度参见图2所示。用该杂交液配制的Lambda探针用于原位杂交时，杂交与变性均使用一个温度，其快速杂交50℃下90分钟的信号强度参见图3所示，其37℃过夜杂交的信号强度参见图4所示。根据图1-4可知，用该杂交液配制的Kappa和Lambda探针用于原位杂交时，杂交与变性均使用一个温度，快速杂交50℃下90分钟即可达到37℃过夜杂交的信号强度。因此，本发明的杂交液的优越性在于降低了变性温度同时又提高了杂交温度，使得整个过程只需要一个温度便可以快速达到应有的灵敏度。
实施例二：HER2荧光原位杂交
1、杂交液制备(50mL)：
(1)称取1.25g氟化钠加入50mL离心管；
(2)取2.5mL的1M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液pH7.0溶液加入50mL离心管；
(3)取5mL 20x SSC溶液加入50mL离心管；
(4)取0.1mL的0.5M EDTA溶液加入50mL离心管；
(5)取1mL的50x Denhardts溶液加入50mL离心管；
(6)称取5g硫酸葡聚糖加入50mL离心管充分震荡混匀，1000rpm离心5分钟；
(7)加入终浓度为0.2mg/mL鲑鱼精DNA；
(8)加超纯水定容于50mL。
最后，用杂交液配制HER2探针，包括终浓度10ng/uL HER2绿色荧光探针、终浓度1.5ng/uL CEN17橙色荧光探针、终浓度1mg/mL人类Cot-1DNA。
2、实验方法
2.1将玻片放入二甲苯(或脱蜡液)中浸泡3×10分钟。
2.2将玻片放入100％，100％，95％，75％酒精各浸泡5分钟，纯水洗涤2×2分钟。
2.3提前预热柠檬酸修复液至80±2℃，将玻片放入柠檬酸修复液中孵育30分钟。
2.4将玻片浸没在纯水中2×2分钟，从纯水中拿出玻片，擦拭玻片上多余的水分。
2.5切片置于湿盒中，滴加消化酶溶液，置于37℃恒温箱孵育15分钟。清洗液(2×SSC)浸泡5分钟。去离子水冲洗1分钟。
2.6脱水：75％，95％，100％乙醇溶液中依次放置1分钟，空气干燥切片。
2.7将HER2探针从冰箱取出，放于室温(18-25℃)，避光。开盖前，瞬时离心。用移液器吸10μL探针至各个样本。确保玻片上没有气泡后盖上盖玻片。用橡胶粘合剂密封盖玻片。
2.8将玻片放入杂交仪中，在66℃下变性和杂交2～3小时，或者50℃下变性和杂交过夜。
2.9小心除去橡胶密封条。将玻片放入37℃预热的洗涤缓冲液(2×SSC，含有0.1％NP-40)，浸泡1ˉ3分钟，小心移去盖玻片。
2.10再将玻片用37℃预热的洗涤缓冲液洗涤2×5分钟。
2.11将玻片依次放入75％，95％，100％乙醇溶液中各1分钟，避光晾干样本。
2.12滴25μL DAPI复染液到切片组织上，盖上盖玻片避免气泡，暗处孵育15分钟。荧光显微镜下观察。
3、应用实例二
应用实例二显示该含氟离子的杂交液中，不含甲酰胺，加入了2.5％的氟化钠。用该杂交液配制的HER2荧光原位杂交探针用于原位杂交时，杂交与变性均使用一个温度，其快速杂交66℃下2个小时的信号强度参见图5所示，其50℃杂交过夜的信号强度参见图6所示。根据图5-6可知，用该杂交液配制的HER2荧光原位杂交探针用于原位杂交时，杂交与变性均使用一个温度，66℃下快速杂交2个小时和50℃下杂交过夜的信号强度都非常清晰明显，没有非特异性背景。因此，本发明的杂交液的优越性在于降低了变性温度同时又提高了杂交温度，使得整个过程只需要一个温度便可以快速达到应有的灵敏度。
综上所述，本发明提供的用于原位杂交的杂交液DNA原位杂交探针、RNA原位杂交探针和荧光原位杂交探针的配制，其可在降低了变性温度同时又提高了杂交温度，使得整个过程只需要一个温度便可以快速达到应有的灵敏度。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.一种用于原位杂交的杂交液，其特征在于，所述杂交液由以下终浓度的组分组成：体积百分浓度不超过2％的甲酰胺、重量体积百分浓度为2.5％的氟化物、2-4倍浓度的SSC、1-10mM的EDTA、1-5倍浓度的Denhardts溶液、重量体积百分浓度为5-10％的硫酸葡聚糖、0.1-1mg/mL的鲑鱼精DNA、以及50-100mM且pH为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或Tris-HCl缓冲液和超纯水。
2.根据权利要求1所述的用于原位杂交的杂交液，其特征在于，所述氟化物为氟化钠、氟化钾和氟化铵中的至少一种。
3.一种原位杂交检测试剂盒，其特征在于，包括原位杂交检测探针、水和权利要求1-2任意一项所述的用于原位杂交的杂交液。
4.根据权利要求3所述的原位杂交检测试剂盒，其特征在于，所述原位杂交检测探针的终浓度为1ng/μL。
5.一种权利要求1-2任意一项所述的用于原位杂交的杂交液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将1.25g的氟化钠、2.5mL且1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、5mL且20倍浓度的SSC溶液、0.1mL且0.5M的EDTA溶液、1mL且50倍浓度的Denhardts溶液和2.5g的硫酸葡聚糖混合，所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH为7.0；
(2)将步骤(1)获得的混合液进行离心处理；
(3)加入终浓度为0.1mg/mL的鲑鱼精DNA，然后加入超纯水进行定容至50mL。
6.根据权利要求5所述的用于原位杂交的杂交液的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的离心处理具体为：于1000rpm条件下离心5分钟。
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