CN117887813B - 一种杂交缓冲液与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子检测领域,具体涉及一种杂交缓冲液与应用。其中,一种杂交缓冲液包括有机溶剂,所述有机溶剂具有式(Ⅰ)所示结构,其中,R1和R3为烷基,R2为烷基或氢基中的至少一种,n为小于等于6的自然数。所述有机溶剂为二甘醇二甲醚,三甘醇二甲醚,四甘醇二甲醚,六乙二醇二甲醚,二甘醇乙基甲基醚,二甘醇二***或二丙二醇二甲醚中的至少一种。含有式(Ⅰ)结构的有机溶剂的杂交缓冲液能够降低体积排阻剂和甲酰胺的含量,降低了杂交缓冲液的粘度,缩短了变性时间和洗涤时间,减少了对样本细胞形态学的破坏,增强了信号强度,减少背景信号,改善杂交产生的特异性。
Description
技术领域
本发明涉及分子检测领域,具体涉及一种杂交缓冲液与应用。
背景技术
基于核酸杂交原理的技术,例如,原位杂交技术和靶向富集捕获测序技术等被广泛用于遗传变异检测和基因表达调控研究,能够提供PCR和NGS等现有技术力所不及的关键信息,因此成为许多种类的遗传变异和癌症诊断的金标准。
杂交缓冲液为探针提供适宜杂交的溶液环境,其能够在一定温度下使细胞内DNA双链充分变性。目前广泛使用的杂交缓冲液均包含有高浓度的甲酰胺,典型的杂交缓冲液可以由50%-65%(v/v)的甲酰胺、2×SSC(Saline Sodium Citrate)缓冲液、10%(w/v)硫酸葡聚糖、100μg/mL鲑鱼***DNA或0.3μg/μL COT-1DNA等组成。其中,甲酰胺能有效地实现细胞核内复杂环境条件下的DNA双链变性,但也正因其作用于碱基对结合位点、干扰氢键结合的机制,在后续退火(即杂交)步骤中显著减缓了探针与靶序列的复性,延长了杂交时间。同时,高浓度的甲酰胺会对细胞形态、细胞核结构或染色体结构的形态学产生破坏,导致检测结果不准确。除此之外,甲酰胺是一种对人体有害的化合物,在操作过程中,存在一定的危险性。而作为杂交缓冲液中另一个主要成分硫酸葡聚糖,其大量的添加导致杂交缓冲液粘度高,高粘度在原位杂交中对探针分子的扩散具有重大影响。原位杂交的限速步骤,在于探针分子在缓冲液中从细胞外扩散进入细胞核内,硫酸葡聚糖对探针分子在缓冲液中扩散系数的负面影响,这就造成了探针分子扩散过程缓慢,导致杂交时间过长。
现有技术公开了一种使用较低浓度甲酰胺的杂交组合物及其方法,通过提高杂交缓冲液中盐离子浓度和促进剂浓度,降低甲酰胺的浓度,实现了缩短杂交时间、减少细胞形态破坏的目的,但由于促进剂即硫酸葡聚糖浓度的增加,导致杂交缓冲液的粘性升高,高粘度的杂交缓冲液会使处理的样品更容易保留微小气泡,从而在样本与气泡接触的地方产生无信号的区域,不仅降低了信号强度,还延长了杂交后的洗涤时间。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的杂交缓冲液粘性高缺陷,从而提供一种杂交缓冲液与应用,能够缩短杂交时间,提高特异性、降低背景信号,同时降低杂交缓冲液的粘度,缩短杂交后洗涤时间。
一方面,本发明提供一种杂交缓冲液,包括有机溶剂,所述有机溶剂具有式(Ⅰ)所示结构:
其中,R1和R3为烷基,R2为烷基或氢基中的至少一种,n为小于等于6的自然数。
所述有机溶剂为二甘醇二甲醚,三甘醇二甲醚,四甘醇二甲醚,六乙二醇二甲醚,二甘醇乙基甲基醚,二甘醇二***或二丙二醇二甲醚中的至少一种。
所述杂交缓冲液中的有机溶剂的体积浓度为1-40%。优选的,所述杂交缓冲液中的有机溶剂的体积浓度为20-30%。更优选的,所述杂交缓冲液中体积排阻剂的质量浓度为0.05%-5%。
还包括杂交促进剂、缓冲剂、盐溶液。
所述杂交促进剂包括体积排阻剂、Denhardt溶液、甲酰胺或DMSO中的至少一种。
优选的,所述体积排阻剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖、聚乙二醇或硫酸葡聚糖中的至少一种。
更优选的,所述杂交缓冲液的体积排阻剂为硫酸葡聚糖。
所述缓冲剂为柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、4-羟乙基哌嗪乙磺酸中的至少一种。所述缓冲剂的浓度为1-50mM,pH值为5-8。
所述盐溶液为氯化钠溶液、氯化钾、氯化镁中的至少一种。所述盐溶液的浓度为300-1200mM。
优选的,所述杂交促进剂包括所述甲酰胺,甲酰胺的体积浓度为0-50%。更优选的,所述甲酰胺溶液体积浓度为5-20%
本发明提供的所述杂交缓冲液的pH值为3-10。
所述杂交缓冲液还包括螯合剂、去污剂和封闭剂。
所述螯合剂为EDTA或EGTA中的至少一种。通过向上述杂交缓冲液中加入1mM的螯合剂,尤其是EDTA可以减轻背景信号的影响。
所述去污剂为十二烷基硫酸钠、Tween-20、Triton X-100中的至少一种。
所述封闭剂为鲑鱼***DNA、Human COT1 DNA中的至少一种。
另一方面,本发明提供的杂交缓冲液能够应用于原位杂交技术、靶向富集捕获测序技术。
所述原位杂交技术和/或所述靶向测序富集捕获技术的步骤包括,采用含有DNA探针的所述杂交缓冲液对待检测物变性,杂交。所述变性的温度为73-95℃,变性时间为2-10min。所述杂交的温度为37-45℃,杂交时间为0.5-16h。所述杂交缓冲液中DNA探针的浓度为0.1-100ng/μL。
本发明技术方案,具有如下优点:
1.本发明提供的杂交缓冲液,包括有机溶剂,所述有机溶剂结构中R1和R3为烷基,R2为烷基或氢基中的至少一种,n为小于等于6的自然数。含有本发明有机溶剂的杂交缓冲液能够降低甲酰胺和体积排阻剂的含量,减少了对氢键配对的阻碍,提高了扩散系数,从而缩短了杂交时间和洗涤时间,减少了对样本细胞形态学的破坏,增强了信号强度,降低了杂交缓冲液的粘度,减少背景信号,改善杂交产生的特异性。
2.本发明提供的杂交缓冲液,其中,有机溶剂的体积浓度为1-40%,体积排阻剂的质量浓度为0.05%-5%。本发明降低杂交缓冲液中体积排阻剂的含量,使得杂交缓冲液的粘性降低,有利于探针分子在杂交缓冲液和细胞内环境中的扩散,改善杂交反应动力学。此外,杂交缓冲液的低粘度还有利于杂交缓冲液本身在组织和细胞内的渗透和扩散,并很难产生或保留微小气泡,避免了留下因无法与杂交缓冲液接触而不能变性和杂交的区域。同时,杂交缓冲液的低粘度提高了杂交后洗涤的效率,缩短了洗涤时间。
3.本发明提供的杂交缓冲液,还包括,杂交促进剂、缓冲剂、盐溶液,所述杂交促进剂包括甲酰胺,其中,盐溶液的浓度为300-1200mM,甲酰胺体积浓度为0-50%。本发明优化了杂交缓冲液中各成分的含量,增强信号强度,提高特异性,减少背景信号。
4.本发明提供的杂交缓冲液,降低了甲酰胺的含量或不使用甲酰胺,仍可以增强信号强度,提高特异性,减少背景信号,同时能够避免甲酰胺对使用者造成的危害。
5.本发明提供的杂交缓冲液应用于原位杂交技术、靶向富集捕获测序技术中,能够大幅度的降低探针的用量,同时能够提高变性温度、缩短变性时间,实现对样本更充分的变性,但不破坏细胞染色体结构。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1-3和对比例1-2制得的FISH探针试剂处理样本的荧光显微镜下图像,其中,A1为对比例1制得的FISH探针试剂处理样本在DAPI滤光片下图像,B1为对比例1制得的FISH探针试剂处理样本在Spectrum Orange滤光片下图像,A2为对比例2制得的FISH探针试剂处理样本在DAPI滤光片下图像,B2为对比例2制得的FISH探针试剂处理样本在Spectrum Orange滤光片下图像,A3为实施例1制得的FISH探针试剂处理样本在DAPI滤光片下图像,B3为实施例1制得的FISH探针试剂处理样本在Spectrum Orange滤光片下图像,A4为实施例2制得的FISH探针试剂处理样本在DAPI滤光片下图像,B4为实施例2制得的FISH探针试剂处理样本在Spectrum Orange滤光片下图像,A5为实施例3制得的FISH探针试剂处理样本在DAPI滤光片下图像,B5为实施例3制得的FISH探针试剂处理样本在SpectrumOrange滤光片下图像;
图2是本发明实施例3和对比例1制得的FISH探针试剂在不同温度下处理样本的荧光显微镜下图像;
图3是本发明实施例8和对比例3制得的FISH探针试剂处理样本的荧光显微镜下图像,其中,a1为对比例3制得的FISH探针试剂处理样本在DAPI滤光片下图像,b1为对比例3制得的FISH探针试剂处理样本在Spectrum Orange滤光片下图像,a2为实施例8制得的FISH探针试剂处理样本在DAPI滤光片下图像,b2为实施例8制得的FISH探针试剂处理样本在Spectrum Orange滤光片下图像。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明实施例、对比例和实验例中:硫酸葡聚糖(D8906)、甲酰胺(F9037)、柠檬酸钠(S4641)、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、聚乙二醇、三甘醇二甲醚、六乙二醇二甲醚、二甘醇二***、二丙二醇二甲醚、二甘醇二甲醚、磷酸氢二钠、柠檬酸、磷酸二氢钾、4-羟乙基哌嗪乙磺酸购自Sigma-Aldrich公司;二甘醇乙基甲基醚、四甘醇二甲醚(T819541)、二甘醇二***(E808613)购自麦克林公司;VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(H1200)来自Vector Laboratories公司。为了验证本发明杂交缓冲液能够适用于各种探针,本发明选用了多种探针进行验证,其中,实施例1-5中的DNA探针为CEP X/Y,即用型,浓度为14ng/μL,购自Abbott Molecular,编码为07J20-050;实施例6-11中的DNA探针为CEP 8,即用型,浓度为5ng/μL,购自Abbott Molecular,编码为07J22-008。实施例12-18中的DNA探针为RET(10q11),购自安必平,代码为F.01104-01。
实施例1
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为10%的甲酰胺,体积浓度20%的三甘醇二甲醚,质量浓度1%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的柠檬酸钠,制得的杂交缓冲液pH值调整为6.5。
按照终浓度为1.17ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP X/Y加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例2
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为10%的甲酰胺,体积浓度25%的三甘醇二甲醚,质量浓度1%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的柠檬酸钠,制得的杂交缓冲液pH值调整为6.5。
按照终浓度为1.17ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP X/Y加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例3
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为10%的甲酰胺,体积浓度30%的三甘醇二甲醚,质量浓度1%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的柠檬酸钠,制得的杂交缓冲液pH值调整为6.5。
按照终浓度为1.17ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP X/Y加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例4
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量与实施例2相同,不同之处在于,将杂交缓冲液在室温环境下放置20个月。
按照终浓度为1.17ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP X/Y加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例5
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量与实施例3相同,不同之处在于,将杂交缓冲液在室温环境下放置20个月。
按照终浓度为1.17ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP X/Y加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例6
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度30%的三甘醇二甲醚,质量浓度1%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的柠檬酸钠,制得的杂交缓冲液pH值调整为6.5。
按照终浓度为0.42ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP 8加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例7
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为5%的甲酰胺,体积浓度30%的三甘醇二甲醚,质量浓度1%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的柠檬酸钠,制得的杂交缓冲液pH值调整为6.5。
按照终浓度为0.42ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP 8加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例8
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为10%的甲酰胺,体积浓度30%的三甘醇二甲醚,质量浓度1%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的柠檬酸钠,制得的杂交缓冲液pH值调整为6.5。
按照终浓度为0.42ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP 8加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例9
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为20%的甲酰胺,体积浓度30%的三甘醇二甲醚,质量浓度1%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的柠檬酸钠,制得的杂交缓冲液pH值调整为6.5。
按照终浓度为0.42ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP 8加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例10
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为10%的甲酰胺,体积浓度30%的三甘醇二甲醚,质量浓度1%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为600mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的柠檬酸钠,制得的杂交缓冲液pH值调整为6.5。
按照终浓度为0.42ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP 8加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例11
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为10%的甲酰胺,体积浓度30%的三甘醇二甲醚,质量浓度1%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为1200mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的柠檬酸钠,制得的杂交缓冲液pH值调整为6.5。
按照终浓度为0.42ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP 8加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例12
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为45%的甲酰胺,体积浓度5%的三甘醇二甲醚,质量浓度5%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的柠檬酸钠,制得的杂交缓冲液pH值调整为6.5。
按照终浓度为0.4ng/μL将DNA探针RET(10q11)加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例13
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为10%的甲酰胺,体积浓度20%的四甘醇二甲醚,质量浓度1%的聚乙二醇,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的磷酸氢二钠,制得的杂交缓冲液pH值调整为8。
按照终浓度为0.1ng/μL将DNA探针RET(10q11)加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例14
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为10%的甲酰胺,体积浓度20%的二甘醇二甲醚,质量浓度5%的聚蔗糖,摩尔浓度为300mM的氯化镁,摩尔浓度为50mM的磷酸氢二钠,制得的杂交缓冲液pH值调整为10。
按照终浓度为0.1ng/μL将DNA探针RET(10q11)加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例15
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为10%的甲酰胺,体积浓度20%的二甘醇乙基甲基醚,质量浓度5%的聚乙烯吡咯烷酮,摩尔浓度为900mM的氯化钾,摩尔浓度为20mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸,制得的杂交缓冲液pH值调整为7.5。
按照终浓度为5ng/μL将DNA探针RET(10q11)加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例16
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为10%的甲酰胺,体积浓度20%的二甘醇二***,质量浓度0.05%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为25mM的磷酸二氢钾,制得的杂交缓冲液pH值调整为3。
按照终浓度为10ng/μL将DNA探针RET(10q11)加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例17
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为50%的甲酰胺,体积浓度1%的二丙二醇二甲醚,质量浓度0.25%的聚乙烯吡咯烷酮,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为15mM的磷酸二氢钾,制得的杂交缓冲液pH值调整为5.5。
按照终浓度为20ng/μL将DNA探针RET(10q11)加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
实施例18
本实施例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为10%的甲酰胺,体积浓度40%的六乙二醇二甲醚,质量浓度0.25%的聚乙烯吡咯烷酮,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为15mM的磷酸二氢钾,制得的杂交缓冲液pH值调整为5.5。
按照终浓度为20ng/μL将DNA探针RET(10q11)加入到本实施例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
对比例1
本对比例提供一种杂交缓冲液,作为常规甲酰胺杂交缓冲液的一种典型形式,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为50%的甲酰胺,质量浓度为10%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为300mM的NaCl,摩尔浓度为30mM的柠檬酸钠,100μg/mL鲑鱼***DNA。
按照终浓度为1.17ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP X/Y加入到本对比例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
对比例2
本对比例提供一种杂交缓冲液,具体组成成分和含量与实施例1相同,唯一不同在于,本对比例不含有机溶剂三甘醇二甲醚,即杂交缓冲液为以终浓度计,体积浓度为10%的甲酰胺,质量浓度1%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的柠檬酸钠。
按照终浓度为1.17ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP X/Y加入到本对比例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
对比例3
本对比例提供一种杂交缓冲液,作为已公开的甲酰胺杂交缓冲液的一种形式,具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使其含有,体积浓度为15%的甲酰胺,质量浓度20%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为600mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的柠檬酸钠,pH调整为6.2。
按照终浓度为0.42ng/μL(为原始浓度的1/12)将DNA探针CEP 8加入到本对比例的杂交缓冲液中,制得FISH探针试剂。
应用例1
将有丝***中期的外周血细胞的载玻片,在室温下,采用2×SSC缓冲液洗涤2次,每次3分钟,洗涤后,将洗涤后的载玻片依次在70%、85%、100%乙醇中分别脱水1min,晾干;
将上述处理后的样本分别与10μL实施例1-5和对比例1-2制得的FISH探针试剂在73℃下变性处理10min后,在37℃下杂交16h,将孵育后的样品在65℃2×SSC中洗涤10min后,在室温2×SSC中再洗涤3分钟,将洗涤后的样品在70%、85%、100%乙醇中依次脱水1min,晾干,将载玻片用10μL含DAPI的抗荧光淬灭封固剂封固,制得FISH载玻片。
应用例2
将有丝***中期的外周血细胞的载玻片,在室温下,采用2×SSC缓冲液洗涤2次,每次3分钟,洗涤后,将洗涤后的载玻片依次在70%、85%、100%乙醇中分别脱水1min,晾干;
将上述处理后的样本分别与10μL实施例6-18制得的FISH探针试剂在95℃下变性处理2min后,在45℃下杂交2h,将孵育后的样品在65℃2×SSC中洗涤10min后,在室温2×SSC中再洗涤3分钟,将洗涤后的样品在70%、85%、100%乙醇中依次脱水1min,晾干,将载玻片用10μL含DAPI的抗荧光淬灭封固剂封固,制得FISH载玻片。
应用例3
将有丝***中期的外周血细胞的载玻片,在室温下,采用2×SSC缓冲液洗涤2次,每次3分钟,将洗涤后的载玻片依次在70%、85%、100%乙醇中分别脱水1min,晾干;
将上述处理后的样本分别与10μL对比例1和实施例3制得的FISH探针试剂分别在73℃、78℃和82℃下变性处理10min后,在37℃下杂交16h,将孵育后的样品在65℃2×SSC中洗涤10min后,在室温2×SSC中再洗涤3分钟,将洗涤后的样品在70%、85%、100%乙醇中依次脱水1min,晾干,将载玻片用10μL含DAPI的抗荧光淬灭封固剂封固,制得FISH载玻片。
应用例4
将有丝***中期的外周血细胞的载玻片,在室温下,采用2×SSC缓冲液洗涤2次,每次3分钟,将洗涤后的载玻片依次在70%、85%、100%乙醇中分别脱水1min,晾干;
将上述处理后的样本分别与10μL对比例3和实施例8制得的FISH探针试剂分别在82℃下变性处理10min后,在37℃下杂交16h,将孵育后的样品在65℃2×SSC中洗涤10min后,在室温2×SSC中再洗涤3分钟,将洗涤后的样品在70%、85%、100%乙醇中依次脱水1min,晾干,将载玻片用10μL含DAPI的抗荧光淬灭封固剂封固,制得FISH载玻片。
实验例1
在染色后的两天内,使用装有DAPI、FITC、Cy3单滤色镜的Zeiss Axiovert200荧光显微镜,在63×油镜下对应用例1和应用例2制得的FISH载玻片进行观察。两名受过培训的观察人员评价荧光信号强度、特异性和背景信号,按照细胞/组织切片评分指南所述进行评分。结果见表1-3。
细胞/组织切片评分指南:在0-5级量表上评价信号强度,其中0表示无信号,5表示强烈信号。在0-5级量表上信号特异性,其中0表示无法区分特异性信号与非特异性信号,5表示没有非特异性信号。在0和5评分之间,可以存在1/2级,即,介于相邻评分之间的分级以1/2计。
根据0-5级量表上的分级定义,对信号强度进行评分:
0 表示无可见信号;
1 表示信号微弱;
2 表示信号微弱但能识别;
3 表示信号清晰;
4 表示信号强烈;
5 表示信号非常强烈;
信号强度评分***允许使用1/2级。
根据0-5级量表上的分级定义,对信号特异性进行评分:0表示特异性信号完全不能从强度上与非特异性信号区分;1表示与非特异性信号相比,特异性信号不容易被识别;2表示与非特异性信号相比,特异性信号能够被识别;
3表示与非特异性信号相比,特异性信号容易被识别;
4表示非特异性信号比特异性信号微弱得多;
5表示没有可识别的非特异性信号;
信号特异性评分***允许使用1/2级。
根据0-5级量表上的分级定义,对背景信号进行评分:
0 表示无背景信号可见;
1 表示有一点背景信号;
2表示有一些背景信号;
3表示有中等背景信号;
4表示有较高的背景信号;
5表示有很高的背景信号;
背景信号评分***允许使用1/2级。
表1实施例1-5和对比例1-2提供的杂交缓冲液制得的FISH载玻片荧光信号强度、特异性和背景信号评分
组别 | 平均信号强度 | 平均特异性 | 平均背景信号 |
实施例1 | 2 1/2 | 2 1/2 | 2 1/2 |
实施例2 | 3 | 3 | 2 |
实施例3 | 3 1/2 | 3 | 1 1/2 |
实施例4 | 2 1/2 | 2 | 21/2 |
实施例5 | 3 | 2 1/2 | 2 |
对比例1 | 2 | 2 | 2 1/2 |
对比例2 | 1/2 | 0 | 3 1/2 |
可知,对比例1与实施例3相比较,实施例3无论是在平均信号强度、平均特异性或平均背景信号上均有较好的表现,证明了,本发明实施例较现行常规的以甲酰胺缓冲液为杂交缓冲液表现效果好,对比例2和实施例1相比较,对比例2无法产生可识别的信号,且背景信号较高,证明了低含量的甲酰胺,低含量的硫酸葡聚糖,如不加有机溶剂则无法实现技术效果。
参阅图1所示,对比例1的杂交结果为每个细胞核内有1个强度较高的目的信号和4个强度较弱的非特异信号,非特异信号对观察人员识别目的信号存在一定干扰。实施例3的杂交结果中,目的信号强度较高,而非特异信号强度极低,不干扰识别。
根据表1中实施例4与实施例2数据相比较,实施例5和实施例3数据相比较,可知,本发明提供的杂交缓冲液在室温放置20个月仍能保持较高的信号强度。
表2实施例6-11提供的杂交缓冲液制得的FISH载玻片荧光信号强度、特异性和背景信号评分
组别 | 平均信号强度 | 平均特异性 | 平均背景信号 |
实施例6 | 2 | 2 | 3 |
实施例7 | 3 | 3 | 2 |
实施例8 | 3 1/2 | 3 1/2 | 1 1/2 |
实施例9 | 3 1/2 | 3 | 1 1/2 |
实施例10 | 2 1/2 | 2 1/2 | 2 |
实施例11 | 3 1/2 | 3 1/2 | 1 1/2 |
可知,根据实施例6-9的数据可知,随着甲酰胺浓度在一定范围内的增加,杂交缓冲液的信号特异性有所提高,背景信号有所下降。根据实施例8、10-11的数据可知,随着盐浓度在一定范围内的提高,杂交缓冲液产生的荧光强度逐渐增强,背景信号逐渐降低。
表3实施例12-18提供的杂交缓冲液制得的FISH载玻片荧光信号强度、特异性和背景信号评分
可知,本发明提供的多种杂交缓冲液制得的DNA探针为RET(10q11)的FISH探针试剂在平均信号强度和平均特异性上表现较优,平均背景信号有所降低。
通过实施例1-18的制得的杂交缓冲液制得的FISH载玻片荧光信号强度、特异性和背景信号评分相关数据证明,本发明提供的杂交缓冲液能够适用于各种探针。
实验例2
在染色后的两天内,使用装有DAPI、FITC、Cy3单滤色镜的Zeiss Axiovert200荧光显微镜,在63×油镜下对应用例3制得的FISH载玻片进行观察。FISH载玻片中染色质结构结果见表4和图2。
表4应用例3制得的FISH载玻片在不同变性条件下染色体结构
参阅图2可知,对比例1提供的杂交缓冲液制得的FISH载玻片中样本细胞在78℃及82℃的变性条件下,染色体结构形态异常,表现为“毛边”状和“空泡”状缺陷,显微镜观察时对焦困难。因此,对于FFPE、羊水细胞等难杂交样本在常规变性温度(73℃等)下常常出现杂交效果较差的情况,原因之一在于靶序列变性不充分。提高变性温度或延长变性时间是改善此类样本变性不足的方法之一。但传统的杂交缓冲液,类似于对比例1的缓冲液含有高浓度甲酰胺,不能承受较高温度的变性,在高于73℃时,甲酰胺对染色质结构产生破坏,损害荧光信号的形状,暴露出其不适用性。而实施例3提供的杂交缓冲液制得的FISH载玻片在不同温度下染色质完整,证明提高变性温度对本实施例杂交缓冲液不会产生较大的影响。
实验例3
与实验例1的步骤和方法相同,唯一不同之处在于样本为应用例4制得的FISH载玻片,荧光信号强度、特异性和背景信号的评价结果见图3和表5。
表5应用例4制得的FISH载玻片荧光信号强度、特异性和背景信号评分
组别 | 平均信号强度 | 平均特异性 | 平均背景信号 |
实施例8 | 3 1/2 | 3 | 1 1/2 |
对比例3 | 3 | 2 | 2 |
参见图3和表5可知,在82℃的变性温度下,本发明实施例8制得的杂交缓冲液能够使载玻片表现出比对比例3更高的信号强度、更高的特异性和更低的背景。
实验例4
对实施例8、对比例3制得的杂交缓冲液使用微量粘度计检测粘度,并代入Stokes-Einstein公式计算扩散系数,扩散系数的计算方法参阅Joana Lima等在Biotechnologyand Bioengineering.2020;117:3212–3223中的计算方法。
经过检测并结合表5的数据,得到实施例8的杂交缓冲液粘度为3.89mPa·s,计算40bp长度的双链DNA探针在杂交缓冲液中的扩散系数为5.38×10-11m2/s,平均信号强度3.5、平均特异性3、平均背景信号1.5;对比例3杂交缓冲液粘度为64.2mPa·s,计算40bp长度的双链DNA探针在杂交缓冲液中的扩散系数为3.26×10-12m2/s,平均信号强度3、平均特异性2、平均背景信号2。可知,通过使用有机溶剂三甘醇二甲醚能够降低硫酸葡聚糖的使用量,实现了降低杂交缓冲液的粘度,从而提高探针在杂交缓冲液中的扩散系数的目的,且即使降低了硫酸葡聚糖的含量,也并未导致信号强度、特异性的降低,也未提高背景信号。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (1)
1.一种杂交缓冲液在制备荧光原位杂交的检测试剂中的应用,其特征在于,所述杂交缓冲液的具体组成成分和含量如下:
混合以下物质,以终浓度计算使杂交缓冲液含有:体积浓度为10%的甲酰胺,体积浓度为30%的三甘醇二甲醚,质量浓度为1%的硫酸葡聚糖,摩尔浓度为900mM的NaCl,摩尔浓度为10mM的柠檬酸钠,制得的杂交缓冲液pH值调整为6.5。
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