JP2002112777A - 新規精巣特異的遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 精巣の半数体細胞で特異的に発現する新規遺
伝子を提供する。 【解決手段】 哺乳動物のX染色体上に座位し、精巣の
半数体細胞で特異的に発現する遺伝子であって、ショウ
ジョウバエのgcl遺伝子とそのコードするアミノ酸配列
の相同性が２５％以上であり、配列番号１に示す塩基配
列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするＤＮＡ配列を有する遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規精巣特異的遺
伝子に関し、特にX染色体上に座位し、精巣の半数体細
胞で特異的に発現する遺伝子とその使用に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】精巣の半数体細胞で特異的に発現する遺
伝子には、プロタミンをはじめ既に数種の遺伝子が報告
されている。しかし、その遺伝子がX染色体上に座位
し、精巣の半数体細胞で特異的に発現する遺伝子は、fs
c1が唯一であり、他には知られていない。

【０００３】精巣での遺伝子発現を人為的に操作し、又
は半数体細胞で特異的に発現する遺伝子又はその組替え
体を導入し、家畜の産み分け、又は***形成異常にもと
づく不妊などの遺伝子診断、又は遺伝子治療などを実施
するためには、性染色体上に座位し、精巣の半数体細胞
で特異的に発現する遺伝子の単離と使用が不可欠であ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、精巣の半数
体細胞で特異的に発現する新規遺伝子を提供するもので
ある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、哺乳動物のX
染色体上に座位し、精巣の半数体細胞で特異的に発現す
る遺伝子であって、ショウジョウバエのgcl遺伝子とそ
のコードするアミノ酸配列の相同性が２５％以上である
ことを特徴とする遺伝子を提供する。上記哺乳動物は、
マウス、ヒト、及びウシからなる群より選ばれることが
できる。また本発明は、配列番号１に示す塩基配列から
なるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡ、又は配列番号２に示すアミノ酸配列にお
いて１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／ま
たは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコー
ドするＤＮＡを提供する。さらに本発明は、配列番号２
に示すアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１
もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付
加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、及び上記Ｄ
ＮＡの転写産物であるＲＮＡも提供する。

【０００６】

【発明の実施の形態】ショウジョウバエの生殖細胞は、
受精卵の後極側に局在する極細胞質を取り込んだ極細胞
と呼ばれる特殊な細胞の形成に始まる。gcl遺伝子は、
この極細胞形成に必須の遺伝子で、その転写散物である
gcl−mRNAは極細胞質に局在し、gclタンパク質の生合成
を抑えると、生殖細胞形成が著しく阻害されることが知
られている。ショウジョウバエのgcl遺伝子の塩基配列
及び該遺伝子がコードするアミノ酸配列は、Jongenら、
The germ cell-less gene product: a posteriorly loc
alized component necessary for germ cell developme
nt in Drosophila: Cell70, 569-584(1992)において明
らかにされている。本発明の遺伝子は、哺乳動物由来の
ショウジョウバエのgcl遺伝子ホモローグであり、X染色
体上に座位し、生殖細胞である精巣の半数体細胞で特異
的に発現することを特徴とする。本発明の遺伝子は、シ
ョウジョウバエのgcl（germ cellless）遺伝子とそのコ
ードするアミノ酸配列の相同性が２５％以上である。本
発明において、哺乳動物とは、その種類は特に限定され
ないず、哺乳類に属する全ての種を意味する。特に、家
畜として有用であるものとしては、ウシ、ウマ、ヒツ
ジ、ヤギ、ウサギ、ブタなどが挙げられる。

【０００７】本発明の遺伝子又はそのホモローグは、配
列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとして、例え
ば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual (New York : Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, 1989)に記載されているような選択されたプローブ
でのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニン
グ標準法を使用して取得することができる。また、Dief
fenbachら, PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, 1995)]に記載されたよ
うなＰＣＲ法を用いて取得することができる。

【０００８】アミノ酸相同性を測定するには、例えばBL
AST,ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアーのよ
うな公衆に利用可能であるコンピューターソフトウェア
ーを使用して、当業者に周知の各種の方法で達成され
る。好ましいソフトウェアー整列プログラムは、BLAST
である。当業者は、比較される配列の全長に亘る最大の
整列を得るために必要とされるいずれかのアルゴリズム
を含む整列の測定のための適切なパラメーターを決定で
きる。

【０００９】「ストリンジェントな条件」は、（１）例
えば５０℃で０．０１５塩化ナトリウム／０．００１５
Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウ
ムといった、低イオン強度および高温での洗浄を使用
し、または（２）例えば４２℃で０．１％ウシ血清アル
ブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌ／０．１％ポリビニルピロ
リドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸
ナトリウムを含む５０ｎＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．
５を含む５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミドといっ
た、ホルムアミドのような変性試薬をハイブリダイゼー
ションの間に使用する。もう一つの例としては、４２℃
で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ６／８）、０．１％ピロリン酸ナ
トリウム、５×デンハルト溶液、ソニケートされたサケ
***ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、およ
び１０％硫酸デキストランを使用し、４２℃で０．２×
ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。またもう一
つの例は、５５℃で１０％硫酸デキストラン、２×ＳＳ
Ｃ（塩酸ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０
％ホルムアミドを使用してハイブリダイゼーションし、
引き続き５５℃でＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣより成
る強ストリンジェント洗浄を実施する。

【００１０】また、場合によってはより穏やかなストリ
ンジェントな条件を選択することもでき（上記Sambrook
らの文献参照）、例えば、２０％ホルムアミド、５×Ｓ
ＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナト
リウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、
５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２
０ｍｇ／ｍＬ変性剪断サケ***ＤＮＡを含む溶液中で、
３７℃での一晩のインキュベーション、引き続き３７−
５０℃で１×ＳＳＣでのフィルターの洗浄のような条件
である。

【００１１】本発明のタンパク質は、配列番号２に示す
アミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１もしく
は数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加され
たアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明のタ
ンパク質は、天然からの単離・合成、若しくは配列番号
１の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、通常の組換え法
（上記Sambrookらの文献参照）により生産できる。

【００１２】X染色体上に座位し、精巣の半数体細胞で
特異的に発現する遺伝子の単離及び遺伝子の構造と機能
の詳細について、以下に実施例を示し、本発明をさらに
詳しく説明する。但し、上記塩基配列又はアミノ酸配列
で示した本発明のmgclh遺伝子、遺伝子ホモローグ、cDN
A、RNA、及びタンパク質の全部、もしくは一部の使用に
関し、甚だ多くの可能性があるので、以下の実施例等に
よって何等限定されるものでない。

【００１３】

【実施例】１） ディファレンシャルディスプレイ（Dif
ferential Display）解析による遺伝子の同定 マウスの精巣の半数体細胞で特異的に発現する遺伝子を
探索するために、分析用及び分離用の蛍光mRNA ディフ
ァレンシャルディスプレイ（以下DD）の手法を用いた。
すなわち、精巣に半数体の細胞が含まれている成熟した
雄マウス及び半数体細胞が形成されてない未成熟（生後
17日齢）の雄マウスを用意し、それぞれ精巣を摘出し、
AGPC（Alkaline Guanidine Phenol Chloroform）法によ
ってトータルDNA（total RNA）を調製した。一方、成熟
した雄マウスの精巣からエルトリエーション法によっ
て、精細胞（Round Spermatids、半数体の細胞）を単離
し、前記と同様の手法でトータル RNAを調製した。トー
タル RNAの調製に際しては、試料に混入する恐れのある
微量のDNAは、DNase処理によって除去しておいた。

【００１４】分析用のDD法は基本的にはGene Hunter社
のマニュアルに従って実施した。先ず、上記トータル R
NAから逆転写反応によってcDNAをそれぞれ調製した。次
に、このcDNA（0.02μg RNA相当）をテンプレートとし
て、上流側のArbitralプライマー（AP6、5'-AAGCTTGCAC
CAT-3'）（配列番号３）とIRDで蛍光標識された下流側
のAnchorプライマー（HT15-C、5'-AAGCTTTTTTTTTTTTTTT
C-3'）（配列番号４）とを加えてPCRを行った。このと
きPCRは、Perkin Elmer社のPC-9600型Thermal Cyclerを
用い、94℃で2分、40℃で5分、72℃で5分の保温の後、9
4℃で15秒、40℃で2分、72℃で1分の保温を29回繰り返
し、さらに72℃で5分の保温、という実施プログラムの
下で行った。PCR増幅されたDNA断片は、LiCor社のDNAシ
ーケンサー（DNA4000）を用いて解析した。

【００１５】図１Aは、成熟マウス精巣、未成熟マウス
精巣、及び単離した精細胞から調製されたRNAのそれぞ
れをDD分析した結果を比較したものである。成熟精巣と
精細胞とで検出され、未成熟精巣では検出されない蛍光
バンドが、目的の遺伝子由来のDNA断片と判断されるこ
とから、鎖長が約760bpのDNA断片が同定された（図中、
矢印で示す）。

【００１６】次に、IRDの替わりにTexas Redで蛍光標識
されたアンカー（Anchor）プライマーを用いて、分析用
DDと全く同一のPCR条件下で調製用のDDを行った。図１B
は、７M尿素を含む４％ポリアクリルアミドゲル中でPC
R産物の電気泳動を行って、タカラの蛍光イメージスキ
ャナー（FMBIO II）を用いて解析した結果を示したもの
である。図から明らかなように、目的のDNAバンドは容
易に同定することが可能であった。そこで、マーカーDN
Aの易動度を参照しながら目的のバンドをゲルから切り
出し、常法に従い抽出した。そして、抽出したDNA断片
をテンペレートとしてPCR法で再増幅し、元のバンドと
同一の移動度を示すことを前記ゲル電気泳動法によって
確認するとともに、TAクローニングキットを用いてサブ
クローニングした。いくつかのコロニーを拾い、常法に
したがってシーケンスしたところ、766bpの塩基鎖長を
もつDNA断片であることが分かった。該DNA断片の塩基配
列を下に、BLASTを用いてホモロジー検索を行ったとこ
ろ、ショウジョウバエのGerm Cell Less遺伝子（gcl）
と高い相同性を示す新規な遺伝子であることが判明し
た。そこで、半数体（haploid）細胞で特異的に発現す
るマウスのgcl遺伝子という意味で、該遺伝子をmgclhと
呼ぶことにした。

【００１７】２） cDNA のクローニングと塩基配列の決
定 mgclhの転写産物であるmRNAの全塩基配列を決定し、合
成されるタンパク質のアミノ酸配列を推定するために、
前記DNA断片をプローブとして用い、BALB/cマウスの精
細胞（/pUC118）由来のcDNAライブラリーのスクリーニ
ングを行った。すなわち、アレイ化した5万個のクロー
ンをグリッドしたナイロンメンブレンを標的として、³²
Ｐで標識した該DNA断片をプローブとして、ストリンジ
ェントな条件（５０％フォルムアミド、１０％デキスト
ランサルフェート、１％ＳＤＳ、５×Denhard's溶液、
２×ＳＳＣ中で４２℃、１６時間）下で、コロニーハイ
ブリダイゼーションを行った。そして、ストリージェン
トな条件（０．１％ＳＤＳ，０．１×ＳＳＣで６５℃、
１５分）で洗浄操作を４回行った後、オートラジオグラ
フィーを実施して、Ｘ線フィルムを感光するスポットを
探索した。スクリーニングの結果、７つの独立したクロ
ーンが得られた。シーケンス解析をしたところ、図２に
示す塩基配列（配列番号１）をもち、図３に示すアミノ
酸（配列番号２）をコードしているcDNAであることが判
明した。又、図２及び図３で示したクローン以外にも６
種の転写産物由来のクローンが同定され、互いに数塩基
あるいはそれ以上の複数の塩基置換が確認され、それぞ
れ１，２，３，４，５，９個のアミノ酸が置換した多型
性を示す遺伝子であることがわかった。すなわち図３の
アミノ酸配列を基本型とするならば、１０番目のアミノ
酸がＲからＳ、２３番がＡからＧ、３２番がＧからＶ、
７６番がＳからＹ、１１５番がＡからＴ、１２０番がＧ
からＤ、１８２番がＱからＫ、２６７番がＦからＩ、２
７８番がＭからＴ、３２５番がＤからＮ、４６４番がＮ
からＫ、４６５番がＥからＱなど多数のアミノ酸の置換
が確認された。一方、図３のアミノ酸配列を基準とし
て、アミノ酸レベルのホモロジー解析を行ったところ、
mgclhは、ショウジョウバエのgcl（dgcl）との間で25％
/43％（同一性％/類似性％）、マウスのdip（mdip）と
の間で45％/61％のホモロジーを持つことがわかった。

【００１８】３） 遺伝子のクローニングと塩基配列の
決定 mgclh 遺伝子の全塩基配列を決定するために、BALB/cマ
ウスのゲノムDNAのBACライブラリーをスクリーニングし
たところ、5個の独立したクローンが得られた。前記cDN
Aの塩基配列の情報を下に、多数のプライマーを設計
し、PCRで増幅されるDNA断片の鎖長の分析結果から、遺
伝子構造を推定した。その結果、mgclh遺伝子はコーデ
ィング領域にイントロンを全く含まない稀有な遺伝子
（イントロンレス）であることが判明した。又、遺伝子
多型をもつことも明らかになった。

【００１９】４） 他の哺乳動物由来の遺伝子及びcDNA
のクローニングと塩基配列の決定 マウス以外の哺乳動物のgclh遺伝子（遺伝子ホモロー
グ）及び cDNAは、マウスの遺伝子（mgclh）の塩基配
列情報に基づき、ディジェネレーティング（degenerati
ng） PCR法によってクローニングし、マウスと同様の手
法で塩基配列を決定した。すなわち、ヒト精巣poly(A)+
RNAは米国Clontech社から購入し、その0.125ngをＲＴ−
ＰＣＲ様のテンペレートとして用いた。また、ウシ精巣
トータルＲＮＡは、前記の方法によって成熟したウシの
精巣から調製し、その1.25ngをテンペレートとした。セ
ンスプライマー（5'-CTGGGAAGAACATGGTGTTTACACAA-3'）
（配列番号５）とアンチセンスプライマー（5'-TAAAGTG
CCACACTTGATGTACCA-3'）（配列番号６）とを共通のプラ
イマーとし、９４℃で２分、４０℃で５分、７２℃で５
分の保温を行った後、９４℃で１５秒、４０℃で２分、
７２℃で１分の保温を３４回繰り返し、７２℃で５分の
保温という増幅条件で、ディジェネレーティングＰＣＲ
を実施した。前記アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ
増幅産物の分析を行ったところ、ヒト及びウシのいずれ
の系においてもマウスのそれと同様のサイズのＤＮＡ断
片が観察された。

【００２０】そこで、当該ＤＮＡ断片をゲルから切り出
し、ＴＡベクターにサブクローニングした後、シーケン
ス反応を行った結果、ヒトとウシいずれの塩基配列も酷
似していた。そこで更に広範な領域をカバーするセンス
プライマー（5'-AATGCCTCAACCAAGAAGCCTCTG-3'）（配列
番号７）と前記アンチセンスプライマー（5'-TAAAGTGCC
ACACTTGATGTACCA-3'）（配列番号６）とを用いて、通常
のＰＣＲ条件下、すなわち９４℃で５分の熱変性後、９
４℃で２０秒、５８℃で３０秒、７２℃で２分の反応を
３０回繰り返した後、７２℃で５分の保温を行った。ア
ガロースゲル電気泳動後、増幅ＤＮＡ断片（７４７ｂ
ｐ）をゲルから切り出し、ＴＡベクターにサブクローニ
ングした後、シーケンスを決定したところ、ヒト（hgcl
h）及びウシ（bgclh）のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの塩
基配列はマウスのそれと酷似し、いずれもマウスと同
様、複数の遺伝子コピーを持ち、複数の塩基置換のある
遺伝子多型が確認され、９５から９９％のアミノ酸が一
致する極めて保存性の高い遺伝子であることが判明し
た。

【００２１】５） ノーザン法による遺伝子発現の解析 mgclh遺伝子が果たして半数体細胞で特異的に発現する
遺伝子であるか、精巣以外の組織で発現することがない
かを調べるため、ノーザン解析を行った。すなわち、前
に述べたAGPC法によって、精巣、脳、肺臓、腎臓、肝
臓、心臓、脾臓などの組織、或いは精細胞とP3U1細胞か
らRNAを調製し、それぞれ5μgのRNAをホルマリンゲルを
用いて電気泳動した。電気泳動後、RNAをナイロンメン
ブレンにトランスファーしたのち、前記³²Ｐで標識した
mgclhDNA断片をプローブとしてハイブリダイゼーション
反応を行った。その結果を図４Aの上部に示す。また、
図４Aの下部は、どの組織でも発現することが知られて
いるG3PDH遺伝子を同一の試料で比較した。図４Aから明
らかなように、mgclh遺伝子の転写産物は鎖長約2.1kbの
mRNAで、精巣で特異的に発現し、半数体精細胞で強く発
現することが判明した。更には、マウスでクローニング
されたショウジョウバエのgclと相同性の高い別の遺伝
子であるmdipと比較したのが、図４Bである。mdip遺伝
子は、精巣及び精細胞で強い発現がみられ、転写産物の
サイズも類似しているけれども、実験に用いた全ての組
織、細胞で共通に発現していた。この実験結果から判断
すると、mgclhとmdipとは、発現様式においても明らか
に異なることが確定した。

【００２２】次に、mgclh遺伝子が***形成過程のどの
ような時期で発現するかを調べるため、生後6〜25日齢
の若齢（未成熟）マウスと生後10週齢の成熟マウスの精
巣及び前記単離精細胞から調製したRNAを用いてノーザ
ン解析を行った。その結果が図５である。図５から明ら
かなように、mgclh遺伝子は生後22日齢以降に発現する
遺伝子であり、単離した精細胞で強く発現している遺伝
子であることが分かった。通常、マウスは生後20日齢で
成熟、つまり***形成が開始されることから判断する
と、該遺伝子は、***形成期の半数体細胞に特異的に発
現する遺伝子で、***形成に重要な役割を果たしている
ことが示唆される。

【００２３】６） 雌雄のゲノムDNAの定量サザン解析に
よる比較 雌雄のマウスゲノム間でmgclh遺伝子の量的な差がある
か、つまり該遺伝子が何れの染色体（常染色体、X染色
体、Y染色体）上に座位しているか、また、ゲノム上の
遺伝子が単一型か増幅型（複数の遺伝子コピーとして存
在している）かを調べるために、定量サザン解析を行っ
た。すなわち、雌雄のマウスの肝臓から、常法に従って
ゲノムDNAをそれぞれ調製した。各DNAは制限酵素Eco R
I、Hind III及びPst I処理によってそれぞれ断片化され
た。このとき、各DNA試料に混在するRNAはRNase A処理
によって除去された。等量の各DNA試料を0.75％アガロ
ースゲル、1xのTBE緩衝液中で電気泳動した後、常法に
従ってDNAをナイロンメンブレンにトランスファーし、
前記³²Ｐ標識した該遺伝子用のDNAプローブ及び以下に
述べる各種DNA評価用のプローブを用いてハイブリダイ
ゼーション反応を行った。オートラジオグラフィー後、
スキャナーによってバンドの放射線強度をデジタイズ
し、NIH-Imageを用いて遺伝子量を測定した。図６にEco
RIとHind IIIで切断したマウスゲノムDNAのサザン解析
及びその定量結果の一例を示す。

【００２４】図６で、評価用のプローブとして用いたX1
はX染色体上に座位する増幅型の遺伝子であり、雌雄で
共通に存在する複数のバンドが観察されるも、雌雄間の
遺伝子量の比であるXX/XY 比（Ratio）が約2であった。
これに対して、Y染色体上に座位する増幅型の遺伝子Y1
は、雄のゲノムだけに複数のバンドが観察され、比は0
であった。そして、常染色体上に座位する単一型の遺伝
子であるS1及びS2は、雌雄に共通の一本のバンドが出現
し、比が約１となった。mgclh遺伝子の定量サザン解析
の結果、雌ゲノムでのシグナルが雄のそれの約2倍であ
り、複数のバンドが観察され、シグナル強度は単一の遺
伝子のそれより10倍程度も高いことが判明した。したが
って、該遺伝子はX染色体上に座位し、約10倍のコピー
をもつ増幅型の遺伝子である可能性が高いと判断され
た。

【００２５】７） 染色体上の座位の決定 mgclh遺伝子がX染色体上のどこの部域に座位している
か、また、増幅遺伝子のそれぞれがX染色体上にクラス
ターを形成して局在しているか、散在しているかを明ら
かにするために、FISH解析を行った。すなわち、mgclh
を含むBACのクローン化DNAを、ニックトランスレーショ
ン法を用いてジゴキシゲニン-dUTP（DIG-dUTP）でラベ
ルし、プローブを作製した。ラベルしたプローブは、分
断化した全マウスゲノムDNAと一緒に、マウス線維芽細
胞の***中期の染色体とハイブリダイゼーションさせ
た。洗浄後、フルオレセイン（fluorescein）標識され
た抗ジゴキシゲニン抗体を加えてインキュベートした
後、DAPIでカウンター染色し、蛍光顕微鏡下で特異的な
シグナルを観察した。予備実験で、特異的なシグナルが
X染色体のproximal regionにあることが推定できたの
で、本実験においては、X染色体のテロメア領域と特異
的に反応することが確認されているプローブと同時にハ
イブリダイゼーション反応を行った。その結果を図７A
に示す。この図で、一対のドット状のシグナルがＸ染色
体のテロメア特異的プローブ由来のシグナル（図中、矢
印）で、図中、ロッドで示されるX染色体のセントロメ
ア領域近傍の最強の蛍光シグナルが、mgclh遺伝子の座
位を示す特異的シグナルである。また、５つの独立した
クローンの全てにおいてFISH解析を実施した結果、何れ
のクローンでも図７Ａと同一の領域にシグナルが見ら
れ、DAPIのバンドからヘテロクロマチン-ユウクロマチ
ンの境界付近に局在していることがわかった。以上の結
果、mgclh遺伝子は遺伝子マップ上では、 XA1.2-A1.3領
域に座位することが確定した（図７Ｂ）。

【００２６】８） in situ ハイブリダイゼーション法
による精巣での遺伝子発現の解析 mgclh遺伝子が精巣の精細胞だけに特異的に発現する遺
伝子であるかどうかを明らかにするために、mgclh-mRNA
の精巣内での局在及び***形成過程における発現挙動を
in situ ハイブリダイゼーション法によって解析した。
すなわち、mgclh遺伝子のコーディング領域をブルース
クリプト（bluescript）ベクターに組み込み、リボプロ
ーブを調製するためのクローンを作成した。そして、T7
プロモーター、あるいはT3プロモーターを用いてin vit
ro トランスクリプション（transcription）反応を行
い、ジゴキシゲニン-UTP（DIG-UTP）標識されたcRNA
（アンチセンスRNA）プローブを作成した。一方、雄マ
ウスの精巣を4％パラフォルムアルデヒド/リン酸緩衝液
で灌流固定するか、或いは摘出後、ブアン液で固定した
精巣を用意して、常法にしたがってパラフィン包埋し
た。パラフィン包埋したサンプルブロックは、ミクロト
ームで厚さ6μｍの切片にスライスして実験に用いた。

【００２７】脱パラフィン後の切片はProteinase Kで処
理した後、100ngのDIG標識したリボプローブを含むハイ
ブリダイゼーション液を用いて、42℃、14〜16時間のハ
イブリダイゼーション反応を行った。洗浄後、抗DIG抗
体-アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートと反応
させ、NBT/BCIP試薬で発色させた。そして、サフラニン
Oでカウンター染色した後、顕微鏡下でシグナルを観察
した。

【００２８】図８及び図９は、精巣の精細管におけるmg
clh遺伝子の発現とmRNAの分布をinsitu ハイブリダイゼ
ーション法によって経時的に解析したときの組織像を示
した写真である。ここで、図８はステージIからVIま
で、図９はステージVIIからXIIまでの精細管である。ま
た、写真のコラム１は、NBT/BCIP発色とサフラニン染色
の併用、２は、NBT/BCIPの単独発色、３がセンス鎖を用
いたネガティブコントロール、そして、４がコラム１の
拡大写真である。図８及び９から明らかなように、mgcl
h遺伝子の発現を示す褐色のシグナルは、ステージIの精
細管の精細胞（ステップ１精細胞）から始まり、ステー
ジX〜XIまで観察された。興味あることには、ステージI
では、強いシグナルが見られる精細胞とシグナルが全く
見られない精細胞とが混在し、ステージの進行と共にシ
グナルが近傍の精細胞へと広がり、シグナル強度も徐々
に減衰することが分かった。そして、ステージVでは、
ほとんど全ての精細胞で中等度のシグナルが観察される
ようになった。また、ステージが更に進むとシグナルは
精細管の内腔側へと徐々に移動していくことが分かっ
た。

【００２９】この現象は、mgclh遺伝子がX染色体上に座
位していることに起因していると考えることができる。
すなわち、減数***を終えた直後の半数体の精細胞に
は、X染色体をもつものとY染色体をもつものとが1対1の
割合で存在することになる。したがって、X染色体上に
座位するmgclh遺伝子の転写産物（mRNA）は、半数の精
細胞だけに限定してラベルされる筈である。しかし、精
細胞間には通常、細胞間橋（intercellular bridge）が
あり、この架橋を介して転写産物などの物質移動が可能
である。したがって、最初、X染色体をもつ精細胞だけ
に限定されていたシグナルが、時間の経過とともに全精
細胞で観察されるようになった理由も説明できる。

【００３０】精巣において細胞間橋が形成されることの
意義を解明することが、生物学上の重要課題の一つとさ
れている。しかし、諸説があり、今日まで有力な証拠が
得られてはいなかった。今回、本発明者らが発見し、ク
ローニングしたmgclh遺伝子は、X染色体上に座位し、精
巣の半数体細胞で特異的に発現する遺伝子であることは
既に述べた。本発明者らはこの遺伝子、つまり半数体の
生殖細胞で発現する遺伝子の出現こそが、進化の過程で
細胞間橋を獲得することになった生物学的要因ではない
だろうかと考えている。すなわち、ショウジョウバエの
gcl遺伝子がショウジョウバエの生殖細胞形成に不可欠
な遺伝子であるように、gclとホモロジーの高いgclh遺
伝子が哺乳動物の生殖細胞（***）形成に不可欠な遺伝
子であると仮定するならば、精細胞間に細胞間橋を敢え
て形成せざるを得なかった生物学的必然性をこの現象の
中に見出すことができる。もし細胞間橋がなかったとし
たら、X***しか形成されず、Y***は形成されないから
である。本発明者らは、このように、性分化、性染色体
分化に基づく半数体精細胞の遺伝子分配こそが、細胞間
橋の形成を促した生物学的要因とはいえないだろうかと
考えている。

【００３１】

【発明の効果】本発明の新規精巣特異的遺伝子又は新規
ＤＮＡを用いれば、以下の方法が可能となる。 （１）遺伝子診断ができる。該遺伝子、cDNA及びRNAの
塩基配列の全部または一部を用いて、該遺伝子の一塩基
変異、欠失、挿入、置換などの突然変異にもとづく疾患
（例えば不妊）等の遺伝子診断、又は遺伝子多型の解析
が可能である。例えば、ヒト、家畜などの哺乳動物の細
胞から、常法によって抽出、精製されたゲノムＤＮＡ又
はＲＮＡをテンペレートとし、これに該遺伝子の塩基配
列情報に基づいて設計することのできる一組のプライマ
ー（合成ＤＮＡオリゴマー、センス鎖及びアンチセンス
鎖）によって、診断対象とする該遺伝子の特定領域のＤ
ＮＡをＰＣＲ増幅又はＲＴーＰＣＲ増幅によって取得す
る。しかる後に、増幅ＤＮＡ断片を、アガロースゲル電
気泳動法（ＡＧＥ）、又は変性グラジエントゲル電気泳
動法（ＤＧＧＥ）、又は単鎖構造多型（ＳＳＣＰ）解
析、又は制限酵素切断鎖長多型（ＲＦＬＰ）解析、又は
塩基配列特異的熱溶出クロマトグラフ（ＳＳＴＥＣ）解
析、又は塩基配列（ＰＥＣ）解析等によって遺伝子異常
又は遺伝子変異又は遺伝子多型の有無に基づく遺伝子診
断が可能となる。

【００３２】（２）性判別ができる。該遺伝子がＸ染色
体上に座位することから、該遺伝子を標的とする***等
の細胞又は組織を対象とした家畜などの性判別に利用で
きる。例えば前記ＦＡＣＳなどの細胞分別装置によって
分画された***の一部を、スライドグラス上に塗布、固
定、プロテアーゼ処理した後、該遺伝子の全部又は一部
を含むプローブを用いて前記ＦＩＳＨ解析を行えば、分
別***の性判別が可能である。また受精後間もない家畜
の初期胚などから一部の細胞を摘出、ＤＮＡを抽出し、
該遺伝子の一部をプローブとして前に述べた定量サザン
解析を行うか、又はタックマン法などの定量ＰＣＲ技術
を用いて、家畜の出産前の性判別が可能となる。

【００３３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kachiku Kairyo Jigyodan; Gunma University <120> Novel gene expressing specifically in testis <130> J76543A1 <160> <210> 1 <211> <212> DNA <213> Mus <400> 1 acagcaatgcctcaaccaagaagcctctgcgagagcttgttctaggaattttcatcaatg 60 gggcttttagtcagcagggtcttgagatgcagggattccagtctgttagagccacagcca 120 gaagccatagccggagccagctacattcctggcagtcgcaagcgaaaaagaaacagtttg 180 gaggagttggcaacaagttctaatgttcatggacctcaaaaccagggaatgtatccacat 240 caagttctcaactacatctactggaaaagggttaagatctcatctaatgatgcttatcaa 300 aacttatttttggacgggcatgatagcgacattaaaatccgtgctctgggaagaacatgg 360 tgtttacacaaagtatttttatgtcagtcaggctactttgctaacattctcaaaggtact 420 tggagagaatcacaccatggtgttataaatctgatcattaagaatgaggatattgatacc 480 cgatctctgcattttgtgtttggtgctctgtacacggatgcggatttgtcaataacacct 540 ctggaagttcctcaagttttggcagcagcatgcctgcttcgagtggatcgagtaattcag 600 cagtgtgaaggaatcatgaaagaaactatcaacaggaacactgtgtgctcctattatttg 660 gcagcagaaacctatagattaaaagctgtaaagacgagatgctttgaatggcttctttgc 720 aatttgatggtacatccaagtgtggcactttacaaggaagtagatatgaagttgatgtat 780 cttctagcactgtcttctgacttactagtcatgcaaaaggagattgatgtatataccaca 840 ctaaaaatatggatgatcctttatcttaatccatgctggaacggaaccatgaaacagctt 900 ttacaacacgcaaacaactggctttccacccacatggcatatattgataacatcagtttt 960 cttgaaagtgaagaaggactaatatttcaaccagtgtttaaaaagctgagatttcagcac 1020 atcatctgtgacttgacttccacaactattcttgaacaagatcgactaatacctatggca 1080 tggttgtcacccatttacaaacaacagtggttgactttgctgcgaacacaagaatatggg 1140 gtaattggaccacaagttatcaatgaacaagaacttgaagaatgcaccatgaggtgtggt 1200 acaatgatccccaaagatggaagatatacttggaagtggtcagttggacgacttggcttt 1260 cctttacgtgtgacctttaccaggcagtgtgtaattttaaggcaacggtgtcagaggtgt 1320 gatggttctgcttgccacaaccatatccgaaatgtcatattcagaataactttggtgtgt 1380 tttgattccaacaaaagagtaactttcagaaagacaacaggttataaaatcctcaccttt 1440 gaatataacgaggagcaaattgtaatgaaattggatagtgatgttctaaccttccctatg 1500 tgtatattctgcaatttcctttttgtaaacctaggaaatgcagaaaacaagtaatcttat 1560 caattattagactgtaagcattttacaagtattgaatggctcatttaatatgaaggctgt 1620 gtaatgactacagtgaggaagaccaaaaacaaattcaatattctttggagtctagtacca 1680 ccagaagtgactgcttccctccatcaccttatttccatgtatttctgaagaaaaccttta 1740 cttccaacaaagtatttgtcaaatcaaataaacctaatcttctgatttaaatttaccatc 1800 gagatccaagcttggaatggaaataagagactatatttgcaaggtaaaacatctcaaaca 1860 acttgttaagtagatttggccctagctaaaattgagacaaaataaaatcatgccattgtt 1920 gaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 1940 <210> 2 <211> 498 <212> PRT <213> Mus <400> 2 Met Gly Leu Leu Val Ser Arg Val Leu Arg Cys Arg Asp Ser Ser 1 5 10 15 Leu Leu Glu Pro Gln Pro Glu Ala Ile Ala Gly Ala Ser Tyr Ile 20 25 30 Pro Gly Ser Arg Lys Arg Lys Arg Asn Ser Leu Glu Glu Leu Ala 35 40 45 Thr Ser Ser Asn Val His Gly Pro Gln Asn Gln Gly Met Tyr Pro 50 55 60 His Gln Val Leu Asn Tyr Ile Tyr Trp Lys Arg Val Lys Ile Ser 65 70 75 Ser Asn Asp Ala Tyr Gln Asn Leu Phe Leu Asp Gly Asp His Ser 80 85 90 Asp Ile Lys Ile Arg Ala Leu Gly Arg Thr Trp Cys Leu His Lys 95 100 105 Val Phe Leu Cys Gln Ser Gly Tyr Phe Ala Asn Ile Leu Lys Gly 110 115 120 Thr Trp Arg Glu Ser His His Gly Val Ile Asn Leu Ile Ile Lys 125 130 135 Asn Glu Asp Ile Asp Thr Arg Ser Leu His Phe Val Phe Gly Ala 140 145 150 Leu Tyr Thr Asp Ala Asp Leu Ser Ile Thr Pro Leu Glu Val Pro 155 160 165 Gln Val Leu Ala Ala Ala Cys Leu Leu Arg Val Asp Arg Val Ile 170 175 180 Gln Gln Cys Glu Gly Ile Met Lys Glu Thr Ile Asn Arg Asn Thr 185 190 195 Val Cys Ser Tyr Tyr Leu Ala Ala Glu Thr Tyr Arg Leu Lys Ala 200 205 210 Val Lys Thr Arg Cys Phe Glu Trp Leu Leu Cys Asn Leu Met Val 215 220 225 His Pro Ser Val Ala Leu Tyr Lys Glu Val Asp Met Lys Leu Met 230 235 240 Tyr Leu Leu Ala Leu Ser Ser Asp Leu Leu Val Met Gln Lys Glu 245 250 255 Ile Asp Val Tyr Thr Thr Leu Lys Ile Trp Met Ile Leu Tyr Leu 260 265 270 Asn Pro Cys Trp Asn Gly Thr Met Lys Gln Leu Leu Gln His Ala 275 280 285 Asn Asn Trp Leu Ser Thr His Met Ala Tyr Ile Asp Asn Ile Ser 290 295 300 Phe Leu Glu Ser Glu Glu Gly Leu Ile Phe Gln Pro Val Phe Lys 305 310 315 Lys Leu Arg Phe Gln His Ile Ile Cys Asp Leu Thr Ser Thr Thr 320 325 330 Ile Leu Glu Gln Asp Arg Leu Ile Pro Met Ala Trp Leu Ser Pro 335 340 345 Ile Tyr Lys Gln Gln Trp Leu Thr Leu Leu Arg Thr Gln Glu Tyr 350 355 360 Gly Val Ile Gly Pro Gln Val Ile Asn Glu Gln Glu Leu Glu Glu 365 370 375 Cys Thr Met Arg Cys Gly Thr Met Ile Pro Lys Asp Gly Arg Tyr 380 385 390 Thr Trp Lys Trp Ser Val Gly Arg Leu Gly Phe Pro Leu Arg Val 395 400 405 Thr Phe Thr Arg Gln Cys Val Ile Leu Arg Gln Arg Cys Gln Arg 410 415 420 Cys Asp Gly Ser Ala Cys His Asn His Ile Arg Asn Val Ile Phe 425 430 435 Arg Ile Thr Leu Val Cys Phe Asp Ser Asn Lys Arg Val Thr Phe 440 445 450 Arg Lys Thr Thr Gly Tyr Lys Ile Leu Thr Phe Glu Tyr Asn Glu 455 460 465 Glu Gln Ile Val Met Lys Leu Asp Ser Asp Val Leu Thr Phe Pro 470 475 480 Met Cys Ile Phe Cys Asn Phe Leu Phe Val Asn Leu Gly Asn Ala 485 490 495 Glu Asn Lys <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 aagcttgcac cat 13 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 aagctttttt tttttttttc 20 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ctgggaagaa catggtgttt acacaa 26 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 taaagtgcca cacttgatgt acca 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 aatgcctcaa ccaagaagcc tctg 24

【図面の簡単な説明】

【図１】 （A）分析用のDifferential Display 解析に
よって精巣及び精細胞で特異的に発現する遺伝子を発見
し、（B）分離用のDifferential DisplayによってそのD
NA断片を単離したときの図である。

【図２】 マウスのgclh遺伝子（mgclh）のcDNAの塩基
配列（配列番号１）を示す図である。

【図３】 mgclh遺伝子がコードしているタンパク質の
アミノ酸配列（配列番号２）を１文字表記で示す図であ
る。

【図４】 各種の組織や細胞を用いてmgclh遺伝子（A）
及びmdip遺伝子（B）の発現を比較したノーザン解析の
一例で、mgclh遺伝子の精巣特異的な発現を示す図であ
る。

【図５】 マウスの発生過程、***形成過程からみたmg
clh遺伝子の発現の時期を示す写真である。

【図６】 Eco RI及びHind IIIで切断したマウスゲノム
DNAのサザン解析の写真及びその定量結果の一例を示す
図である。

【図７】 mgclh遺伝子の染色体上の座位を決定するた
めのFISH解析の一例を示す写真（A）とマウスX染色体の
遺伝子マップ（B）を示す図である。

【図８】 ***形成過程におけるmgclh遺伝子の発現とm
RNAの精巣内局在を解析するために用いたin situ ハイ
ブリダイゼーション法の一例を示す写真である。

【図９】 ***形成過程におけるmgclh遺伝子の発現とm
RNAの精巣内局在を解析するために用いたin situ ハイ
ブリダイゼーション法の一例を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近藤 壽彦 群馬県前橋市上小出町二丁目10番地の１ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA11 HA01 HA11 4H045 AA10 BA10 CA40 EA26 FA74

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物のX染色体上に座位し、精巣の
   半数体細胞で特異的に発現する遺伝子であって、ショウ
   ジョウバエのgcl遺伝子とそのコードするアミノ酸配列
   の相同性が２５％以上であることを特徴とする遺伝子。
2. 【請求項２】 上記哺乳動物が、マウス、ヒト、及び
   ウシからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１
   又は２記載の遺伝子。
3. 【請求項３】 配列番号１に示す塩基配列からなるＤ
   ＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
   ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号２に示すアミノ酸配列におい
   て１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／また
   は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
   するＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号２に示すアミノ酸配列もしく
   は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が
   置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列から
   なるタンパク質。
6. 【請求項６】 請求項３又は４記載のＤＮＡの転写産
   物であるＲＮＡ。