JPH10501966A

JPH10501966A - ヒトｄｎａトポイソメラーゼｉ−アルファ

Info

Publication number: JPH10501966A
Application number: JP7529608A
Authority: JP
Inventors: ウェイ，イン−フェイ; アダムス，マーク・ディ; フレイシュマン，ロバート・ディ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-05-18
Filing date: 1994-05-18
Publication date: 1998-02-24
Also published as: AU7511894A; WO1995031538A1; US20060234342A1; EP0763104A1; EP0763104A4

Abstract

(57)【要約】ヒトhＴopＩ−αポリペプチドおよびそのようなhＴopＩ−αポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）を開示する。組換え技術によりそのようなポリペプチドを製造する方法、並びにそのようなポリペプチドに対する抗体およびアンタゴニスト／阻害剤も提供される。抗腫瘍剤等の治療目的のためhＴopＩ−αの作用を阻害し、自己免疫疾患またはレトロウイル感染を検出し、および結腸の腺がんを治療するための抗体およびアンタゴニスト／阻害剤の使用方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩ−アルファ本発明は、新しく同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、並びにそのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。より詳しくは、本発明のポリペプチドはヒトのＤＮＡトポイソメラーゼＩ−アルファ（hＴopＩ−α）である。本発明はそのようなポリペプチドの作用の阻害にも関する。ＤＮＡトポイソメラーゼＩおよびIIは、ＤＮＡ鎖がお互いを通過することを可能にする方法でＤＮＡ鎖を切断し、再結合することを触媒し、ＤＮＡのトポロジーを変化させる。タイプＩのトポイソメラーゼは２本鎖ＤＮＡを認識するが、ＤＮＡを緩和する行程において一つの鎖を切断するのみである。一方、タイプIIの酵素は２本鎖ＤＮＡの両鎖を切断する。両酵素は、超コイル状ＤＮＡを緩和すること、二本鎖ＤＮＡを結ぶことおよびほどくこと並びにつなぐことおよび切ることを含む、様々な類似のトポロジー的な相互変換を行うことができる。トポイソメラーゼＩはＡＴＰ非依存性であり、一方トポイソメラーゼIIはエネルギーを必要とする。トポイソメラーゼＩおよびIIは両方とも、転写および複製に必要なトポロジー的な相互変換を提供することができる。例えば、トポイソメラーゼＩは有効なインビトロのＤＮＡ複製のための必要な結合を切る活性を提供することができる( Ｍinden等、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６０：９３１６(１９８５))。しかしトポイソメラーゼIIもＨela細胞溶解物によるＳＶ４０ＤＮＡの複製を促進することができる(Ｙang等、Ｐroceedings of the Ｎational Ａcademy of Ｓciences ，Ｕ.Ｓ.Ａ.、８４：９５０(１９８７))。酵母における遺伝的研究により、複製および転写の両方がトポイソメラーゼＩまたはIIのいずれかを欠く単一の変異体で進行することが明らかになった(Ｇoto等、Ｐroceeding of the Ｎational Ａcademy of Ｓciences，Ｕ.Ｓ.Ａ.、８２：７１７８(１９８５))。両トポイソメラーゼを欠いた細胞では転写および複製は劇的に減少する(Ｕemura等、ＥＭＢＯＪournal、５：１００３(１９８６))。いくつかの方面の証拠は、トポイソメラーゼＩは転写の間に通常機能することを示唆する。該酵素は活発に転写される場所に優先的に局在することが免疫蛍光により（Ｆleishmann等、Ｐroceedings of the Ｎational Ａcademy of Ｓciences，Ｕ.Ｓ.Ａ.、８１：６９５８(１９８４)）および転写されたＤＮＡとの共免疫沈降により（Ｇilmore等、Ｃell、４４：４０１(１９８６)）示された。更にトポイソメラーゼ解裂部位は転写されたＤＮＡ中の、およびその周辺の領域にマップされた(Ｂonner等、Ｃell、４１：５４１(１９８５))。それにもかかわらず、少なくとも酵母では、トポイソメラーゼIIは、転写においてトポイソメラーゼＩの機能の明らかに代わりをすることができる。すべての細胞は転写および複製に関してトポイソメラーゼＩおよびIIを用いるが、大量の転写および複製を有する細胞、例えばガン細胞はずっと大きいトポイソメラーゼＩおよびII濃度を有する。トポイソメラーゼＩは自己免疫疾患を分類するのに用いられている。自己免疫疾患は動物の免疫系がそれ自身の組織を攻撃する疾患である。しばしば、様々な種類の自己免疫疾患は、産生される自己抗体の特異性に基づいてキャラクタライズできる。例えば結合組織自己免疫疾患、進行性全身性硬化症（強皮症としても知られる）を有する患者の血清はトポイソメラーゼＩのようなヌクレア抗原に対する抗体をしばしば含むことはよく知られている。従ってトポイソメラーゼＩと反応性の抗体の存在を正確に検出する能力は、強皮症を有する患者の適切な治療の予後および計画の評価、またはモニターを大いに助けることができる。３６４５塩基対のヒトトポイソメラーゼＩcＤＮＡクローンおよび７２３位にチロシンの代わりにフェニルアラニンを有するタンパク質をコードするcＤＮＡの変異体は、安定にトランスフェクトされた赤ん坊のハムスターの腎臓細胞中で２〜５倍過発現する。この過発現の結果は、チロシン７２３が酵素活性に必須であることを示し、これはヒトトポイソメラーゼＩにおける活性部位チロシンであるという、酵母酵素との相同性比較に基づく予言と一致する(Ｍadden，Ｋ.Ｒ．およびＣhampoux，Ｊ.Ｊ.、Ｃancer Ｒesearch，５２：５２５〜５３２(１９９２))。ヒトトポイソメラーゼＩをコードするcＤＮＡクローンも自己免疫抗トポイソメラーゼＩ血清でスクリーニングした発現ベクターライブラリーから単離されている。その配列データは、触媒的に活性な６７.７ＫＤaフラグメントはカルボキシル末端よりなることを示す(Ｄ'Ａrpa，Ｐ.等、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.、８５：２５４３〜２５４７(１９８８))。真核生物のトポイソメラーゼＩに対する自己抗体についての少なくとも１つのエピトープをコードする真核生物トポイソメラーゼＩポリペプチドをコードする cＤＮＡ分子、およびこれらのcＤＮＡ分子を発現できるクローニングビークルは米国特許第５,０７０,１９２号に開示されている。本発明の一態様によれば、hＴopＩ−αである新規な成熟ポリペプチド、並びにそのフラグメントアナログおよび誘導体が提供される。本発明のポリペプチドはヒト起源である。本発明の他の態様によれば、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が提供される。本発明の更なる態様によれば、組換え技術によるそのようなポリペプチドの製造方法が提供される。本発明の更なる態様によれば、そのようなポリペプチドに対する抗体が提供され、該抗体はガンおよび自己免疫疾患を検出するため診断に使用し得る。本発明の更なる態様によれば、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニスト／阻害剤が提供され、例えば抗腫瘍剤としてそのようなポリペプチドの作用を阻害し、自己免疫疾患を検出し、結腸の腺がんおよびレトロウイルス感染を治療するため治療に使用し得る。本発明のこれらの、および他の態様は本明細書の教示から当業者に明らかであろう。次の図は本発明の態様の説明であり、請求の範囲に包含される本発明の範囲を限定するものではない。図１は、hＴopＩ−αのcＤＮＡおよび対応する推定されたアミノ酸配列を示す。示されたアミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは該ポリペプチドの成熟形である。アミノ酸についての標準的な１文字省略を用いる。図２は、アミノ酸レベルでのhＴopＩ−αおよびヒトトポイソメラーゼＩの比較を示す。上のラインがhＴopＩ−αである。本発明の一態様によれば、図１の推定されたアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９４年３月１８日にＡＴＣＣ寄託第７５７１４号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは胎児脳cＤＮＡライブラリーから得られた。それはヒトトポイソメラーゼＩと相同性である。それは約６０１個のアミノ酸残基のタンパク質をコードする読み取り枠（オープンリーディングフレーム）を有し、それはヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩと構造的に関連し、アミノ酸レベルで８６％の類似性および７０％の同一性を示す。更に、hＴo pＩ−αは、Ｄ'Ａrpa等により示されたヒトトポイソメラーゼＩと８３％の類似性および６７％同一性を示す。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形、またはＤＮＡの形(該ＤＮＡはcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む)であり得る。該ＤＮＡは２本鎖または１本鎖であり得、一本鎖の場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１に示すコード配列または寄託されたクローンの配列と同一であってもよく、または遺伝コードの重複または縮重の結果として図１のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ、成熟したポリペプチドをコードする異なったコード配列であってもよい。。図１の成熟ポリペプチド、または寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコード配列のみ; 成熟ポリペプチドのコード配列およびリーダー若しくは分泌配列またはプロプロテイン配列等の付加的コード配列; 成熟ポリペプチドのコード配列(および場合により付加的コード配列)およびイントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の非コード配列５'および／または３'等の非コード配列を含み得る。「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」の語は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、および付加的なコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明は、図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上に記載したポリヌクレオチドの変異体に更に関する。ポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの非天然の変異体であり得る。従って本発明は、図１に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされた同じ成熟ポリペプチド、並びにそのようなポリヌクレオチドの変異体を含み、該変異体は図１のポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体は、削除変異体、置換変異体および付加または挿入変異体を含む。上に示したように、該ポリヌクレオチドは、図１に示すコード配列または寄託されたクローンのコード配列の、天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有してもよい。当業者に知られているように、アレル変異体は１以上のヌクレオチドの置換、削除または付加を有し、コードされたポリペプチドの機能を実質的に変更しない、別の形のポリヌクレオチド配列である。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に枠内で(in frame)融合したコード配列も有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製に役立つpＱＥ− ９ベクターにより提供されるヘキサヒスチジンのタグ(tag)であってもよく、哺乳動物宿主、例えばＣＯＳ−７細胞を用いる場合には、マーカー配列はヘマググルチニン(ＨＡ)タグであってもよい。ＨＡタグはインフルエンザヘマググルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する(Ｗilson，Ｉ等、Ｃell、３７:７６７(１９８４))。本発明はさらに、その配列間に少なくとも５０％、好ましくは７０％の同一性があるなら、上述の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、上述のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で「ストリンジェント条件」とは、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。好ましい態様で上述のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的な機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。本明細書で言及する寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するプタペスト条約の条件下に保持されるであろう。これらの寄託は単に当業者に便利のためにのみ行なわれるのであり、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１２の下に必要とされるという自認ではない。寄託された物に含まれるポリヌクレオチドの配列、およびそれによってコードされるアミノ酸配列は本明細書の一部を構成し、本明細書の配列の記述と矛盾する場合に照らし合わせる。寄託した物を作り、使用しまたは販売するには実施権が必要で、そのような実施権はここでは許可しない。本発明は、図１の推定アミノ酸配列または寄託されたcＤＮＡによりコードされたアミノ酸配列を有するhＴopＩ−αポリペプチド、並びにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に更に関する。図１のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドに言及する場合の「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」の語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを言う。従ってアナログには、プロタンパク質部分の解裂により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを産生するプロタンパク質が含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドであってもよく、好ましくは組換えポリペプチドである。図１のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、(i)１以上のアミノ酸残基が同型( conserved)の、または非同型のアミノ酸残基(好ましくは同型アミノ酸残基)で置換されており、そのような置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによりコードされたものであってもよく、コードされたものでなくてもよいもの、(ii)１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または(iii)成熟ポリペプチドが該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)等の他の化合物と融合しているもの、または(iv)リーダー若しくは分泌配列または成熟ポリペプチドの精製に用いられる配列またはプロタンパク質配列等の、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離された形で好ましくは提供され、好ましくは均一にまで精製される。「単離された」の語は、その物質がその元の環境(例えば、それが天然のものであれば天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、同じポリヌクレオチドもしくはＤＮＡまたはポリペプチドが、天然の系における共存物質のいくつかまたはすべてから分離されているなら、単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、そのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の部分でないという点において、なお単離されている。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造にも関する。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで宿主細胞は遺伝的に操作され得る(トランスデュースされ、トランスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。ベクターは例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージ等であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはhＴopＩ−α遺伝子を増幅するのに適するように改変された従来の栄養培地で培養できる。温度、pＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞について前に用いられたものであり、当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは組換え技術によりペプチドを製造するのに用い得る。したがって、例えばそのポリヌクレオチドを様々なポリペプチド発現用ベクターのいずれかに含ませ得る。そのようなベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体、細菌のプラスミド、ファージＤＮＡ、バクロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドをファージＤＮＡと組合せたベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病等のウイルスＤＮＡを含む。しかし、他のいずれのベクターもそれらが宿主中で複製可能で、成育可能である限り用い得る。適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクター中に挿入し得る。一般にＤＮＡ配列は、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に当業界で知られた方法により挿入する。そのような方法等は当業者の範囲内にあると考えられる。発現ベクター中のＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．coliのlacまたはtrp、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核または真核細胞もしくはそれらのウイルス中で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを挙げる。発現ベクターは翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終了をも含む。ベクターは発現を増幅するための適当な配列をも含み得る。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合のジヒドロフォレートリダクターゼまたはネオマイシン耐性、Ｅ．coliにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性等のトランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特性を提供する１以上の選択可能なマーカー遺伝子を好ましくは含む。上記した適当なＤＮＡ配列、および適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを用いて適当な宿主をトランスフォームし、宿主にタンパク質を発現させる。適当な宿主の代表的な例として、Ｅ．coli、Ｓtreptomycos、Ｓalmonella typ himurium 等の細菌細胞、酵母等の真菌細胞、ＤrosophilaおよびＳf９等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowes melanoma等の動物細胞、植物細胞等を挙げ得る。適当な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。より詳細には、本発明は上に広く記載した配列の１以上を含んでなる組換え構築物をも含む。その構築物は、その中に本発明の配列を順または逆方向で挿入されているプラスミドまたはウイルスベクター等のベクターを含んでなる。この好ましい態様では、構築物は該配列に作動可能に結合した例えばプロモーターを含む制御配列を更に含む。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、商業的に入手できる。次のベクターを例として挙げる。細菌用: p ＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、pbＳ、pＤ１０、ファージスクリプト、psiＸ１７４、pbluescriptＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８a、pＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene); ptrc９９Ａ、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３ −３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharmacia)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、p ＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかしながら、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能で生存可能である限り用い得る。プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いていずれかの所望の遺伝子から選択できる。２つの適当なベクターはpＫＫ２３２−８およびpＣＭ７である。個々の名前の付けられた細菌プロモーターは、lacＩ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gp t、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびtrpを含む。真核プロモーターはＣＭＶ即時、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉを含む。適当なベクターおよびプロモーターの選択は当業者のレベルの範囲に十分ある。更なる態様において、本発明は上記構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高級真核細胞、酵母細胞等の低級真核細胞であり得、または宿主細胞は細菌細胞等の原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって行うことができる(Ｄavi s，Ｌ.、Ｄibner，Ｍ.、Ｂattey，Ｌ.、Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂ iology(１９８６))。宿主細胞中の構築物を通常の方法で用いて、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造できる。別法として、本発明のポリペプチドは通常のペプチド合成機によって合成的に製造することができる。成熟タンパク質は適当なプロモーターの制御下に哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用い、そのようなタンパク質を製造することもできる。原核および真核宿主で用いる適当なクローニングおよび発現ベクターはＳambrook等、Ｍolecular Ｃloning: ＡＬaboratory Ｍanual，第２編(Ｃol d Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク、１９８９)により記載されている。その開示は本明細書の一部を構成する。高級真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することにより増加する。エンハンサーはプロモーターに作用しその転写を増加させる、通常約１０〜３００bpのＤＮＡのシス作用性因子である。例としては複製起源の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー(b p１００〜２７０)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起源の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。一般に、組換え発現ベクターは複製起源、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えばＥ．coliのアンピシリン耐性遺伝子、Ｓ．cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、および下流の構造遺伝子の転写を指示する高度に発現される遺伝子由来のプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼ(ＰＧＫ)等の解糖系の酵素、α因子、酸性ホスホターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから誘導できる。ヘテロロガスな構造配列が、翻訳開始および終了配列、並びに好ましくは、翻訳されたタンパク質のペリプラズム領域または細胞外の培地への分泌を指図することのできるリーダー配列と共に適当な相(phase)へ組立てられる。場合によっては、ヘテロロガスな配列は、所望の特徴、例えば発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端の確認（identification）ペプチドを含む融合タンパク質をコードできる。細菌で使用する有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終了シグナルと共に、機能的なプロモーターを有する作動可能なリーディング相(reading phase)に挿入することにより構築される。そのベクターは１以上の表現型選択可能なマーカーおよび複製起源を含んでなり、ベクターの維持を保証し、所望なら宿主内部での増幅を与える。トランスフォーメーション用の適当な原核宿主は、Ｅ．coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhimurium 、およびＰseudomonas属、Ｓtreptmyces属、およびＳt aphylococcus属内の様々な種を含むが、他のものも選択の問題として用い得る。代表的な、しかし非限定的な例として、細菌に使用する有用な発現ベクターは、よく知られたクローニングベクターpＢＲ３２２(ＡＴＣＣ３７０１７)の遺伝子要素を含む商業的に入手可能なプラスミド由来の、選択可能なマーカーおよび細菌の複製起源を含むことができる。そのような商業的なベクターは、例えばp ＫＫ２２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、スエーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadison、ウィスコンシン、米国)を含む、これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と結合させる。適当な宿主株のトランスフオーメーション、および宿主株の適当な細胞密度までの増殖の後、選択したプロモーターを適当な手段(例えば温度シフトまたは化学誘導)により誘導し、細胞をさらなる期間培養する。細胞は典型的には遠心分離によって収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発現に用いる微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、ソニケーション、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む、従来のいずれの方法によっても破壊できる。そのような方法は当業者に周知である。様々な哺乳動物細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることもできる。哺乳動物発現系の例は、Ｇluzman、Ｃell、２３:１７５(１９８１)により記載されたサルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合性のベクターを発現できる他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨelaおよびＢＨＫ細胞系を含む。哺乳動物発現ベクターは、複製起源、適当なプロモーターおよびエンハンサーを含み、必要ないずれかのリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列、５'に隣接する非転写配列も含むであろう。ＳＶ４０スプライスに由来するＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位を用いて必要な非転写遺伝要素を提供し得る。ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む方法により、組換え細胞培養物から回収し、精製し得る。成熟のタンパク質の立体配置を完成させるために必要に応じてタンパク質の再生工程も用い得る。最後に高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終的な精製工程のために用い得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、もしくは化合的合成法の産物であるか、または原核もしくは真核宿主(例えば培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞)からの組換え技術により製造し得る。組換え製造方法に用いる宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチドは最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。本発明のポリペプチドは類似の生物学的活性を有する他の分子を同定するのに有用である。このスクリーニングの例は、知られたＤＮＡ配列を用いることによりhＴopＩ−α遺伝子のコード領域を単離して、オリゴヌクレオチドプローブを合成することである。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを用いて、ヒトcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのプローブがライブラリーのいずれのメンバーにハイブリダイズするかを決定する。本発明は、hＴopＩ−αと特異的に相互作用し、およびそれと結合する薬剤を同定するための、薬剤のスクリーニング方法をも提供し、その方法はhＴopＩ− αをコードするＤＮＡ分子を含んでなる哺乳動物細胞を多数の薬剤と接触させ、哺乳動物細胞に結合する薬剤を検出し、それによってhＴopＩ−αと特異的に相互作用し、および結合する薬剤を確認することを含んでなる。様々な検出方法を用い得る。その薬剤は検出可能なマーカー物質と結合させることにより「標識」してもよい(例えば放射ラベルまたはビオチン等の非放射ラベル)。薬剤候補を、よく知られた放射リガンド結合法を用いて、トランスフェクトされた細胞中で発現されたhＴopＩ−αタンパク質に高アフィニティーで結合する化学物質を選択することにより確認する。本発明の配列は染色体同定にも価値がある。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して特異的に標的にし、ハイブリダイズさせることができる。さらに染色体上の特定の部位を同定する現在の必要がある。現在染色***置をマークするのに利用できる、実際の配列データ(リピートポリモルフィズム)に基いた染色体マーキング試薬はわずかしかない。本発明による染色体へのＤＮＡのマッピングは、これらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一歩である。簡単に言うと、cＤＮＡからのＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５bp)を調製することにより、配列を染色体にマップする。cＤＮＡのコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡの１以上のエクソンをスパン(span)しないプライマーを急速に選択し、増幅方法を複雑（complicate）にする。これらのプライマーを、個々のヒトの染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに次に用いる。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを生じるであろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させる速い方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明を用いて、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプールからのフラグメントのパネルを用いて類似の方法でサブローカリゼーションを行うことができる。染色体へマッピングするのに同様に用いることができる他のマッピング戦略は、in situハイブリダイゼーション、ラベルしたフローソートした染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションを含む。中期染色体スプレッドへのcＤＮＡクローンの蛍光インサイテュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を用いて正確な染色***置を一工程で提供できる。この技術は５００〜６００塩基という短いcＤＮＡで用いることができるが、２０００b pより大きいクローンは、簡単な検出のための十分なシグナル強度で、ユニークな染色***置へのより大きい結合可能性を有する。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが由来するクローンの使用を要し、長ければ長いほどよい。例えば２０００bpは良好であり、４０００はより良好であり、４０００以上は良好な結果、合理的な時間のパーセントを得るのに多分必要ない。この技術をレビューするには、Ｖerma等、Ｈ uman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂasic Ｔechniqnes，Ｐergamon Ｐre ss、ニューヨーク(１９８８)を参照する。一度ある配列が正確な染色***置にマップされると、その染色体上のその配列の物理的な位置を遺伝マップデータと関連づけることができる。そのようなデータは例えばＶ．ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan(ジョンホプキンス大学のウエルチメディカルライブラリーを介してオンラインで利用できる )中に見出される。同じ染色体領域にマップされた遺伝子と病気との間の関係を次に結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))により確認される。物理的マッピングと遺伝的マッピングの現在の分析により、病気と関連づけられた染色体領域に正確に位置づけられたcＤＮＡは５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の一つであり得る。(これは１メガベースのマッピングレゾリューションと２０kb当り１遺伝子を仮定する)。ポリペプチド、それらのフラグメント若しくは他の誘導体、またはそれらのアナグロ、またはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を製造するための免疫源として用い得る。これらの抗体は例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明は、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体並びにＦabフラグメントまたはＦab発現ライブラリーの生成物をも含む。当業界で知られた様々の方法をそのような抗体およびフラグメントの製造に用い得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成した抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはそのポリペプチドを動物に、好ましくは人でない動物に、投与することにより得ることができる。かく得られた抗体はそのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、全体の本来のポリペプチドを結合する抗体を作り出すのに用いることができる。そのような抗体を用いて次にそのポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離できる。モノクローナル抗体を調製するために、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与えるどのような技術も使用できる。例としては、ハイブリドーマ技術( ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５６:４９５−４９７)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozbor等、１９８３、Ｉmmunolog y Ｔoday ４:７２)、およびヒトモノクローナル抗体を作るＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃole等、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔhe rapy中、Ａlan Ｒ．Ｌiss,Ｉnc．、７７−９６頁)がある。単鎖抗体の製造について記載された技術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原性ポリペプチド生産物に対する単鎖抗体を製造するのに適応させることができる。本発明は宿主からの試料中のhＴopＩ−αの濃度を測定する診断アッセイにも関する。そのようなアッセイの例は、hＴopＩ−α抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイであり、該抗体を西洋ワサビパーオキシダーゼ等のインディケーター酵素に結合させて、非常に特異的で感度の高い検定システムを作る。パーオキシダーゼの結合した抗体を杭原に結合させた後、パーオキシダーゼを用いて、測定可能であり、その濃度が試料中の抗原量に関係づけられる着色した生成物を作ることができる。その酵素の触媒的性質のため、そのシステムはシグナルを大いに増幅する。高レベルのオキザリル−Ｃ oＡデカルボキシラーゼは、あるヒトの結腸癌細胞がhＴopＩ−αのレベルが増加するので、癌を表す。それらは、強皮症、慢性関節リウマチおよびＡＩＤＳ関連症候群等の自己免疫疾患をも表す。本発明のポリペプチドに対する抗体のレベルを測定するのに用い得る免疫アッセイの他の例は、直接または間接フォーマットでの競合的および非競合的免疫アッセイである。例としてはラジオイムノアッセイ、サンドイッチ（イムノメトリック）アッセイおよびウエスタンブロットアッセイがある。本発明のhＴopＩ− αに結合する抗体の検出は、生理学的試料について免疫組織化学アッセイを含む、順、逆または同時モードで行う免疫アッセイを用いて行うことができる。用いる免疫アッセイの種類に拘わらず、使用したhＴopＩ−αの濃度は、ルーチンな実験を用いて当業者により容易に測定できる。本発明のhＴopＩ−αは、標識し、多くの異なる担体に結合させ、そのポリペプチドと特異的に反応する抗体の存在を検出するのに用いることができる。周知の担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトを含む。担体の性質は可溶性または不溶性のいずれかであり得る。本発明は、本発明のポリペプチドの機能を減少させ、または失くすのに用い得る、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト／阻害剤分子にも関する。アンタゴニストの例は抗体であり、または、ある場合にはhＴopＩ−αポリペプチドに結合するオリゴヌクレオチドである。阻害剤の例はポリペプチドの触媒部位に結合し、そして触媒部位を占める少分子であり、それによって触媒部位が基質に接近できないようにし、その結果正常な生物学的活性が阻害される。少分子の例に小さいペプチド、またはペプチド様分子を含むが、これらに限定されない。阻害剤の他の例は、アンチセンス技術を用いてインビボでhＴopＩ−αを阻害するアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を用いて、３重ヘリックス形成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝子発現を制御できる。その両方の方法とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５ 'コード部分を用いて、長さで約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドをデザインする。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるようデザインし(３重ヘリックス、Ｌee等、Ｎucl．Ａci ds Ｒes.、６：３０７３(１９７９)；Ｃooney等、Ｓcience、２４１：４５６( １９８８)；およびＤervan等、Ｓcience、２５１：１３６０（１９９１）参照) 、それによりhＴopＩ−αの転写および生産を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでmＲＮＡにハイブリダイズし、mＲＮＡ分子のhＴo pＩ−αへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏkano、Ｊ．Ｎeurochem.、５６：５６０(１９９１)；Ｏlgodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression、ＣＲＣＰress，Ｂoca Ｒaton、フロリダ(１９８８)。 hＴopＩ−αの特異的阻害は腫瘍細胞ＤＮＡ複製を妨げることにより腫瘍細胞増殖を阻害するであろうから、アンタゴニスト／阻害剤は腫瘍を治療するのに用い得る。アンタゴニスト／阻害剤は、hＴopＩ−αを阻害し、それによってウイルスの開始と複製を阻げることによりレトロウイル感染を治療するのにも用い得る。アンタゴニスト／阻害剤は結腸の腺癌を治療するのにも用い得る。何故なら転移は癌細胞のＤＮＡ転写を妨げることにより防がれるからである。本発明は、hＴopＩ−αおよび／またはヒトトポイソメラーゼＩのアンタゴニスト／阻害剤を同定する、hＴopＩ−αを用いるアッセイにも関する。ＤＮＡ、h ＴopＩ−αおよび可能性あるアンタゴニスト／阻害剤を、hＴopＩ−αが一本鎖ＤＮＡに作用するのに十分な時間適当な条件下に一緒にする。次にＤＮＡを例えばゲル電気泳動で分析して、hＴopＩ−αが適当に機能するかどうかを決定でき、この方法で有効なアンタゴニスト／阻害剤が存在するか否か決定できる。本発明の化合物、例えばアンタゴニスト／阻害剤を適当な薬学的担体と組合せて用い得る。そのような組成物は治療的に有効量のアンタゴニスト／阻害剤および薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む。そのような担体は、食塩水、緩衝化された食塩水、デキストローズ、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せを含むが、それらに限定されない。その調合物は投与様式に適合させるべきである。本発明は本発明の薬学的組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含む薬学的なパックまたはキットをも提供する。そのような容器には、薬学的または生物学的製品の製造、使用、販売を規制する政府当局により定められた形の通知を付してもよく、その通知はヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表す。更に本発明のポリペプチドは他の治療用化合物と組合せて用いてもよい。薬学的組成物は、その作用が望ましくない状態、例えばレトロウイル感染に導く場合、hＴopＩ−αがＤＮＡ転写および複製を促進するのを有効に阻止するのに有効な量、投与し得る。本発明を次の実施例によって更に記述するであろう。しかし本発明はそのような実施例に限定されるものでないことを理解すべきである。すべての部または量は特にことわらない限り重量による。次の実施例の理解を促進するために、いくつかのしばしば用いる方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は先行するpおよび／またはそれに続く大文字および／または数字により示す。出発プラスミドは商業的に入手可能で限定されずに公的に入手できるか、公開された方法に従い入手可能なプラスミドから構築できる。さらに記載されたものに同等のプラスミドは当業界で知られ、当業者に明らかであろう。ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡのある配列のみに作用する制限酵素でＤＮＡを触媒的に解裂することをいう。本明細書で用いる様々な制限酵素は商業的に入手でき、その反応条件、コファクターおよび他の必要条件は当業者に知られているように用いられた。分析目的のために、典型的には１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２０μlの緩衝溶液中で約２単位の酵素と共に用いる。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的のために、典型的には５〜５０μgのＤＮＡをより大きい体積中で２０〜２５０単位の酵素で消化する。個々の制限酵素のための適当な緩衝剤および基質量は製造者により指定されている。３７℃における約１時間のインキュベーション時間を通常用いるが、供給者の指示に従い変更してよい。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。解裂したフラグメントの大きさによる分離は、Ｇoeddel,Ｄ等、Ｎucleic Ａc id Ｒes．、８:４０５７(１９８０)により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「ライゲーション」とは、２つの２本鎖核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成する工程をいう(Ｍaniatis,Ｔ．等、同書、１４６ページ)。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートすべきＤＮＡの約当量の０.５μg 当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に公知の緩衝液および条件を用いて行い得る。ことわらない限り、トランスフォーメーションは、Ｇraham,ＦおよびＶan de r Ｅb,Ａ、Ｖirology、５２:４５６−４５７(１９７３)の方法に記載された如く行った。実施例１ＣＯＳ細胞中での組換えhＴopＩ−αの発現プラスミド，pcＤＮＡtopＩＨＡの発現を、１）ＳＶ４０複製起源、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ.coli複製起源、４）ＣＭＶプロモーターとその後のポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニル化部位を含むベクターpcＤＮＡＩ／Ａmp（インビトロゲン）から誘導する。全体のhＴopＩ−α プリカーサをコードするＤＮＡフラグメントおよび３'末端にフレーム内で融合したＨＡタグを、ベクターのポリリンカー領域にクローンした。それ故組換えタンパク質発現はＣＭＶプロモーターによって指図される。ＨＡタグは以前に記載されたインフルエンザヘマググルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する(Ｉ．Ｗilson、Ｈ．Ｎiman、Ｒ．Ｈeighten、Ａ．Ｃherenson、Ｍ．Ｃonnol lyおよびＲ．Ｌerner、１９８４、Ｃell ３７、７６７)。ＨＡタグを我々の標的タンパク質に融合すると、ＨＡエピトープを認識する抗体による組換えタンパク質の検出を容易にする。プラスミド構築戦略は以下のようである。 hＴopＩ−αをコードする発現プラスミドpcＤＮＡＴopＩ−α ＡＴＣＣ＃７５７１４を、次の２つのプライマーを用いるpＢＬＴopＩ−αでのＰＣＲにより構築した：５'プライマー５'−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＧＣＧＴＧＧＴＧＣＧＧ−３' は、bＡＭ hi部位およびその後の開始コドンから出発するＨhＴopＩ−αコード配列の１５ヌクレオチドを含む；３'配列５'−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣ−３'は、ＸbaＩ部位に相補的な配列、翻訳停止コドン、ＨＡタグおよびhＴopＩ−αコード配列（停止コドンを含まず）の最後の１８ヌクレオチドを含む。それ故ＰＣＲ産物は、Ｂam ＨＩ部位、活性なhＴopＩ−αコード配列、およびその後のフレーム内に融合したＨＡタグ、ＨＡタグに隣接する翻訳停止コドン、およびＸbaＩ部位を含む。ＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクター、pcＤＮＡＩ／ＡmpをＢam ＨＩおよびＸbaＩ制限酵素で消化し、ライゲートした。ライゲーション混合物を、Ｅ．coli株ＳＵＲＥ（Ｓtratagene Ｃlonin g Ｓystems、１１０９９Ｎorth Ｔorrey Ｐines Ｒoad、Ｌa Ｊolla、ＣＡ９２０３７から入手できる）にトランスフォームした。トランスフォームした培養物をアンピシリン培地プレートにプレートし、耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡをトランスフォーマントから単離し、正しいフラグメントの存在について制限分析により調べた。組換えhＴopＩ−αの発現のためにＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−デキストラン法によりその発現ベクターでトランスフェクトした(Ｊ．Ｓambrook、Ｅ．Ｆritsch、Ｔ．Ｍaniatis、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬabor atory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress(１９８９))。hＴopＩ −α ＨＡタンパク質の発現をラジオラベリングおよび免疫沈降法により検出した(Ｅ．Ｈarlow、Ｄ．Ｌane、Ａntibodies：ＡＬaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress(１９８８))。細胞をトランスフェクション２日後 ³⁵Ｓ−システインで８時間標識した。次に培地を集め、細胞を洗剤で溶解した(Ｒ１ＰＡ緩衝液(１５０mＭＮaＣl、１％ＮＰ−４０、０.１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０.５％ＤＯＣ、５０mＭトリス、pＨ７.５))(Ｗi lson，Ｉ等、上書、３７：７６７(１９８４))。細胞溶解物および培地の両方を、ＨＡ特異的なモノクローナル抗体で沈澱させた。沈澱したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。実施例２ h ＴopＩ−αのインビトロ転写および翻訳 hＴopＩ−αのインビトロ転写および翻訳を、ＴＮＴＣoupled Ｒeticulocyt e Ｌysate Ｓystem（Ｐromega、Ｍadison、Ｗ1）を用いて行った。用いたプラスミドベクターはpＢＬＳＫである。hＴopＩ−αをコードするcＤＮＡをＥcoＲＩ〜ＸhoＩ方向にクローンした。ＥcoＲＩ部位は遺伝子の５'末端を規定し、Ｘh oＩ部位は遺伝子の３'末端を規定する。その遺伝子はＴ３方向に挿入した。Ｔ３は、特定のプロモーターを認識し、ＤＮＡをmＲＮＡに転写するバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを規定する。１μgのpＢＬＳＫhＴopＩαを２５μlのＴＮＴラビット網状赤血球溶解物、２μlのＴＮＴ反応緩衝液、１μlのＴ３ＲＮＡポリメラーゼ、１μlのメチオニンを除いたアミノ酸混合物(１mＭ)、４μlの１０mＣi／mlの ³⁵Ｓ−メチオニン(１,０００Ｃi／mmol)、１μlのＲＮasinリボヌクレアーゼ阻害剤（４０Ｖ／μl）と、最終容積５０μl、３７℃で、１.５時間インキュベートした。５μlの反応混合物をローディング緩衝液と混合し、５分間煮沸し、タンパク質を分離するため１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードした。そのゲルを次に１０％酢酸、１０％メタノールで室温で３０分固定し、Ａmpli fy溶液（Ａmersham）中に室温で１.５時間浸漬し、乾燥し、オートラジオグラフにかけた。このシステムでのhＴopＩ−αの認められた分子量は７０ＫＤであり、この値は配列により予言される分子量と一致する。実施例３ヒトの組織におけるhＴopＩ−αの発現パターンノーザンブロット分析を行ってヒト組織におけるhＴopＩ−α発現レベルを調べた。全細胞ＲＮＡ試料をＲＮＡzol^TMＢＳystem（Ｂiotecx Ｌaboratories，Ｉnc．６０２３Ｓouth Ｌoop Ｅast、Ｈouston、ＴＸ７７０３３）で単離した。それぞれのヒト組織から単離した約１０μgの全ＲＮＡを１％アガロースゲルで分離し、ナイロンフィルターにブロットした（Ｓambrook，Ｆritsch and Ｍaniatis、Ｍolecular Ｃloning、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress(１９８９ ))。ラベリング反応をＳtratagene Ｐrime−Ｉt キットに従い５０ng ＤＮＡフラグメントで行った。標識したＤＮＡをＳelect−Ｇ−５０カラムで精製した(５Ｐrime−３Ｐrime，Ｉnc．５６０３Ａrapahoe Ｒoad，Ｂoulder、ＣＯ８０３０３)。次にフィルターを、放射活性な標識した完全鎖長のhＴopＩ−α遺伝子と、１,０００,０００cpm／mlで、０.５ＭＮaＰＯ₄、pＨ７.４および７％ＳＤＳ中で一晩６５℃でハイブリダイズさせた。０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで室温で２度および６０℃で２度洗浄した後、フィルターをインテンシファイングスクリーンに−７０℃で一晩さらした。hＴopＩαについてのメッセージＲＮＡはすべての組織に存在し、卵巣、睾丸、肺、脾臓および前立腺に豊富である。本発明の様々な改変および変更は上記の教示を考慮すれば可能であり、それ故請求の範囲の範囲内にあり、本発明は特に記載した以外でも行い得る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１２月１４日【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/02 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 21/04 9356−4ＨＣ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 9152−4ＢＣ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｎ 5/10 9051−4ＣＡ６１Ｋ 48/00 9/90 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 // Ａ６１Ｋ 38/00 9735−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 48/00 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/64 ＡＢＡＣ１２Ｐ 21/08 9051−4Ｃ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者アダムス，マーク・ディアメリカ合衆国20878メリーランド州ノース・ポトマック、ダフィーフ・ドライブ 15205番 (72)発明者フレイシュマン，ロバート・ディアメリカ合衆国20008ワシントン・ディ・シー、ノースウエスト・ナンバー134、ウッドリー・ロード2800番

Claims

【特許請求の範囲】１．（a）図１の推定アミノ酸配列を有するhＴopＩ−αポリペプチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログまたは誘導体をコードするポリヌクレオチド；（b）ＡＴＣＣ寄託番号第７５７１４号に含まれるcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するhＴopＩ−αポリペプチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログまたは誘導体をコードするポリヌクレオチド；よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．ポリヌクレオチドが図１の推定アミノ酸配列を有するhＴopＩ−αをコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ寄託番号第７５７１４号のcＤＮＡによりコードされるhＴopＩ−αポリペプチドをコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．図１に示すhＴopＩ−αのコード配列を有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。８．ＡＴＣＣ寄託番号第７５７１４号として寄託されたhＴopＩ−αのコード配列を有する請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。１０．請求項９のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞。１１．請求項１０に記載の宿主細胞から、該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現させることを含んでなるポリペプチドの製造方法。１２．請求項９に記載のベクターで細胞を遺伝的に操作することを含んでなる、ポリペプチドを発現することのできる細胞の製造方法。１３．請求項２に記載のＤＮＡにハイブリダイズでき、hＴopＩ−α活性を有するポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。１４．（ｉ）図１の推定アミノ酸配列を有するhＴopＩ−αポリペプチド並びにそのフラグメント、アナログおよび誘導体、および（ii）ＡＴＣＣ寄託第７５７１４号のcＤＮＡによりコードされるhＴopＩ−αポリペプチド並びにそのポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体、よりなる群から選択されるポリペプチド。１５．ポリペプチドが図１の推定アミノ酸配列を有するhＴopＩ−αである請求項１４のポリペプチド。１６．請求項１４に記載のポリペプチドに対する抗体。１７．請求項１４に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト／阻害剤。１８．hＴopＩ−αを阻害する必要を有する患者の治療方法であって、患者に治療的に有効量の請求項１７に記載のアンタゴニスト／阻害剤を投与することを含む方法。１９．請求項１４に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含んでなる薬学的組成物。２０．hＴopＩ−αの作用を妨げるに有効なアンタゴニスト／阻害剤の決定方法であって、ＤＮＡ、hＴopＩ−αおよび可能性あるアンタゴニスト／阻害剤を一緒にし； hＴopＩ−αがＤＮＡに作用するのを可能にする有効な条件下に一緒にしたものをインキュベートし；そしてアンタゴニスト／阻害剤がhＴopＩ−αの作用を有効に妨げたか否かを決定する；ことを含んでなる方法。