WO2016181011A1 - Método para promover la regeneración muscular - Google Patents
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- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
Definitions
- the present invention relates to the field of biotechnology, in particular the use of the expression of miRNA-106b and / or the Pitx2 gene for the treatment or prevention of muscular dystrophies.
- Skeletal muscle has the ability to repair and regenerate due to the presence of resident stem cells, called muscle satellite cells.
- satellite cells constitute a small, dispersed population of mitotically and physiologically quiescent cells, marked by their expression of the transcription factor Pax7 ( Figure 1).
- Satellite stem cells of the adult muscle are a lineage from the Pax3 / pax7 + embryonic myogenic progenitor cells that remain in the adult muscle in a quiescence state and after an injury they are activated, proliferate and enter the myogenic differentiation program due to the positive regulation of the myf5, MyoD and myogenin myogenic determination genes thus forming new myoblasts that eventually fuse together to generate new muscle tissue (Figure 1).
- Muscular dystrophies are a group of genetic conditions characterized by progressive degenerative muscle disorders. One of the most serious characteristics in these pathologies is the gradual loss of skeletal muscle tissue due to chronic degeneration accompanied by poor regeneration. Its most common forms in childhood are Duchenne (DMD) and Becker (BMD) muscular dystrophies and are characterized as inherited recessive disorders linked to the X chromosome caused by mutations in the dystrophin gene. Dystrophin plays an important structural role in muscle fiber serving as a connection between the extracellular matrix and the cytoskeleton.
- DGC dystrophin-associated glycoprotein complex
- compositions comprising a compound capable of: a. increase the expression of the Pitx2 gene in the muscle satellite stem cells of a human or animal subject with respect to that observed in the absence of the compound in said cells; and / or b. reduce the expression of miRNA-106b in the satellite muscle stem cells of a human or animal subject with respect to that observed in the absence of the compound in said cells.
- Figure 1 Embryonic origin of muscle satellite cells. (Buckingham and Vincent, Current Opinion in Genetics & Development, 2009)
- Figure 2. A and B) Overexpression of Pitx2 in mouse satellite cells by transfection with the bicistronic lentiviral vector LVX-Pitx2c-ZSGreen.
- FIG. 3 A) The expression of Myf5 (qRT-PCR) increases in satellite cells that overexpress Pitx2 and B) quantification by immunohistochemistry shows a significant increase in Myf5 + cells. C) Overexpression of miR-106b leads to a decrease in Myf5 expression validating it as the target of this miRNA.
- Figure 4 Analysis by qRT-PCR of overexpression of Pitx2c in the muscles of MDX mice injected with dystrophic satellite cells transfected with the LVX-Pitx2c-ZS-Green vector lentiviral vector compared to the muscle injected with cells transfected with the lentivirus empty (LVX-ZS-Green vector); percentage of fibers formed "de novo" (ZS-Green + cells) in the transplanted muscles after 15 days and representative image.
- FIG. 1 Expression profiles for miR-106b, Myf5, MyoD and myogenin in tibialis anterioris muscle after cardiotoxin injection in mice. D0-D15: days after cardiotoxin injection.
- Figure 8. Expression profiles for miR-106b, Myf5, MyoD and myogenin in tibialis anterioris muscle after injection of anti-miR106b compound (miRNA inhibitor) in TA muscle of mice. D0-D15: days after injection of anti-miR compound.
- Figure 9 Staining with e-MyHC antibody in muscles injected with anti-miR-106b compound and control 15 days after muscle injection and quantification of e-MyHC + myofibers.
- Figure 10 Quantification of centralized nuclei and cross-sectional area in tibialis anterioris (TA) muscles, muscles injected with anti-miR-106b compound in front of control muscles.
- TA tibialis anterioris
- the term "muscle satellite stem cells" of a human or animal subject constitutes a small population, dispersed of mitotically and physiologically quiescent cells, marked by their expression of the transcription factor.
- Pax7 Satellite stem cells of the adult muscle are a lineage from the Pax3 / Pax7 + embryonic myogenic progenitor cells that remain in the adult muscle in a quiescent state and after an injury they are activated, proliferate and enter the myogenic differentiation program due to the positive regulation of the myf5, MyoD and myogenin myogenic determination genes thus forming new myoblasts that eventually fuse together to generate new muscle tissue ( Figure 1).
- the term “muscle satellite stem cells” refers to a cell located between the basal lamina and the skeletal muscle sarcolemma, preferably of the adult skeletal muscle, and marked by the expression of the transcription factor Pax7, from a muscular progeny. Pax3 / pax7 + of embryonic myogenic progenitor cells.
- RNA-106b preferably refers to Ensembl single stranded RNA: ENSG00000208036 MIM: 612983; miRBase: MI0000734 or an RNA polynucleotide sequence that has an identical nucleotide sequence at least 90%, 92%, 94%, 96%, 98% or 99% based on the identity of the totality of the nucleotides of said sequence, to the Ensembl nucleotide sequence: ENSG00000208036 MIM: 612983; miRBase: MI0000734.
- an RNA polynucleotide sequence that has an identical nucleotide sequence at least 90%, 92%, 94%, 96%, 98% or 99% based on the identity of all the nucleotides of said sequence, at Ensembl nucleotide sequence: ENSG00000208036 MIM: 612983; miRBase: MI0000734 and that has the function of regulating the expression of other genes using the ribo-interference route.
- hsa-miR-106b-5p miRNA inhibitor (ID: MH 10067; Cat: 4464084, Ambion) refers to a nucleotide sequence of stranded RNA Simple chemically modified and designed to specifically bind and inhibit endogenous miR-106b molecules.
- the term "Pitx2 gene” is a member of the family of homeodomain bicoid transcription factors that plays an important role in morphogenesis (Genbank polynucleotide sequence reference with accession number NM_000325 Identifying Homo sapiens paired-like homeodomain 2 (PITX2))
- the term “increase” or “increase” refers to increases above the baseline level. For example, basal levels are normal at in vivo levels before, or in the absence of, the addition of an activator compound.
- reduction or “reduce” or “inhibit” or “inhibition” refers to reductions below the baseline level.
- basal levels are normal at in vivo levels before, or in the absence of, the addition of an inhibitor compound.
- Optional or “optionally” means that the event or circumstance described below may or may not occur, and that the description includes cases in which said event or circumstance occurs and cases in which it does not.
- the terms “prevent”, “preventing” and “prevention” refer to methods to prevent or prevent the development of a disease or disorder or delay the recurrence or occurrence of one or more symptoms of a disorder in a subject resulting from the administration of a prophylactic agent.
- pharmaceutically acceptable carrier is intended to include the formulation used to stabilize, solubilize and be mixed in some way with active ingredients that are administered to live animals, including humans. This includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents and absorption retardants, and the like, compatible with pharmaceutical administration. Except to the extent that any conventional media or agent is incompatible with the active compound, such use in the compositions is contemplated.
- disease is intended to be generally synonymous, and is used interchangeably with the terms “disorder” and “condition” (as in the medical condition), in which all reflect an abnormal condition of the body or of one of its parts that impairs normal functioning and is typically manifested by distinctive signs and symptoms.
- combination therapy means the administration of two or more therapeutic agents to treat a therapeutic condition or disorder described in the present description. Such administration encompasses the co-administration of these therapeutic agents in a substantially simultaneous manner, such as in a single capsule having a fixed ratio of active ingredients or in multiple separate capsules for each active ingredient. In addition, such administration also encompasses the use of each type of therapeutic agent in a sequential manner. In any case, the treatment regimen will provide beneficial effects of the combination of compounds in the treatment of the conditions or disorders described herein.
- terapéuticaally effective is intended to qualify the amount of active ingredients used in the treatment of a disease or disorder. This amount will be necessary to achieve the objective of reducing or eliminating said disease or disorder.
- subject refers to all mammals, including humans. Examples of subjects include, but are not limited to, humans, cows, dogs, cats, goats, sheep, pigs, and rabbits.
- the references described are also individually and specifically incorporated herein as a reference for the material contained therein which is discussed in the phrase upon which said reference is based.
- the present invention addresses the problem of providing new therapies that are effective in the treatment of muscular dystrophies, increasing the ability to regenerate the lost tissue, as a result of muscular dystrophy, of skeletal muscle stem cells.
- the authors of the present invention have evaluated the contribution of the Pitx2 gene in the regulation of tissue-specific transcription of different microRNAs during myogenesis.
- the analysis of gene expression profiles (microRNA-microarrays) in a myoblast cell line (Sol8 cell line) has led to identify the authors of the present invention a series of microRNAs (miRNAs) that are differentially regulated in Sol8 myoblasts that overexpress Pitx2 (see figure 2).
- miR-106b was altered in a context in which muscle regeneration is not satisfactorily completed, such as in DMD (Duchenne muscular dystrophies ). In this sense, it was shown that the expression of miR-106b clearly increases in the muscles of MDX mice, an animal model widely used for human DMD (Figure 7). Therefore, it was then considered whether by decreasing the expression of miR-106b muscle regeneration in dystrophic mice could be modulated.
- DMD Digienne muscular dystrophies
- cardiotoxin and miRNA inhibitor hsa-miR-106b-5p (ID: MH 10067; Cat: 4464084, Ambion) were injected into the TA muscle (tibialis anterioris muscle) of MDX mice from 4 months old (1, 7 nmol per injection). After injection of miRNA inhibitor, muscles were removed 1, 3 and 15 days after injection of anti-miR-106b compound for analysis. The results clearly show that the injection of anti-miR-106b compound can decrease the presence of miR-106b.
- the decrease in miR-106b coincides with myogenic differentiation waves as observed by regulation by increasing Myf5, MyoD and myogenin which indicates that decreased levels of miR-106b induced by Injection of anti-miR106b compound can promote muscle differentiation (Figure 8).
- composition of the present invention relates to the use of a composition (hereinafter “composition of the present invention") comprising a compound capable of - increase the expression of the Pitx2 gene, activating compound, in the satellite muscle stem cells of a human or animal subject with respect to that observed in the absence of the compound in said cells;
- the first aspect of the invention relates to a composition comprising a compound capable of
- “Increase the expression of the Pitx2 gene” means the increase on the baseline, or in comparison with the control, by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%, or 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40,
- Activating compounds can be identified by a screening method that allows the ability to activate Pitx2 to be identified in a compound, which comprises contacting a cell, preferably a muscle satellite stem cell, with a compound suspected of activating Pitx2; testing the content of the cells to determine the amount and / or biological activity of Pitx2, and compare the determined amount and / or the biological activity of Pitx2 to a predetermined level, at which a change in said amount and / or the biological activity of Pitx2 is indicative of a compound that activates Pitx2.
- the detection is performed by quantitative real-time RT-PCR, using specific primers for each isoform.
- satellite muscle stem cells are understood as stem cells, or pre-muscle cells, which serve to aid in the regeneration of adult skeletal muscle. Following proliferation (when satellite cells are activated) and subsequent differentiation (when they begin to express transcription factors that compromise them towards a myogenic lineage (myoblasts)), satellite cells merge with each other or with adjacent muscle fibers damaged, which increases the number of myionuclei in the fibers for growth and repair.
- the activation and proliferation of satellite cells is necessary in order to meet the formation needs of new muscle fibers to regenerate muscle. Differentiation is necessary so that satellite cells can first become myoblasts and after the fusion process, into fibers.
- a preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention, wherein said medicament is used to promote muscle regeneration in the treatment of dystrophinopathy or dystrophy.
- said dystrophinopathy or dystrophy is selected from the list consisting of Duchenne muscular dystrophy and Becker muscular dystrophy.
- composition of the invention wherein said compound, activator compound, is a DNA polynucleotide (hereinafter polynucleotide of the invention) comprising a sequence selected from the list consisting of: - the Genbank polynucleotide sequence with access number NM_000325 or its complementary sequence;
- polynucleotide DNA sequence encoding an identical amino acid sequence at least 90%, 92%, 94%, 96%, 98% or 99% based on the identity of all the amino acids of said sequence, at amino acid sequence of
- Genbank polynucleotide sequence with access number NM_000325 is identified as Homo sapiens paired-like homeodomain 2 (PITX2), transcript variant 3, mRNA.
- Said nucleotide sequence is set forth below: GTTAGGCCAACAGGGAAGCGCGGAGCCGCAGATCTGGTCCGTCGCTCGCCTGGGTGCCT GGAGCTGAGCTGCGGCAAGGCCCGGCTCCTGTTCGACCGCCCGAGGGGTGTGCGTGTGTGTG CGCGTTGCGGAGGGTGCGCTCAGAGGGCCGCGTCGTGGCTGCAGCGGCTGCTGCCGCC GCAGGGGATCTAATATCACCTACCTGTCCCTGTCACTCTTGACACTTCTCTGTCAGGGCTG CCGCGTGGGGGGGGGGCGGGCAGAGCGCGGTCGGCGTTAGCTTTCCTTATTGGAGGGGGG TTCTTGGGGGAGGGAGGAAGGGGGTCTTTGCCCACTCTTGTTTCGCTTTGGA
- amino acid sequence with access number NP_000316 (SEQ ID NO 2) is identified as pituitary homeobox 2 isoform c [Homo sapiens]. Said amino acid sequence is set forth below:
- the degree of identity of an amino acid sequence is based on the identity of all the amino acids of said sequence.
- nucleotides may be included within the polynucleotides of the invention.
- a number of different types of polynucleotide modification are known in the art. These include methyl phosphate and phosphorothioate main chains, addition of acridine or polylysine chains at the 3 'and 5' ends of the molecule.
- polynucleotides described herein can be modified by any method available in the art.
- polynucleotides according to the invention can be produced recombinantly, synthetically or by any means available to those skilled in the art. They can also be cloned by standard techniques. Polynucleotides are typically provided in isolated and / or purified form.
- composition of the invention wherein the compound is a DNA polynucleotide comprising a sequence selected from the list consisting of the polynucleotide sequence. with access number NM_000325 (SEQ ID NO 1) or its complementary sequence or a polynucleotide sequence encoding an identical amino acid sequence at least 99%, based on the identity of all the amino acids of said sequence, to the sequence amino acid with access number NP_000316.
- the polynucleotides of the invention can be transported, without degradation, by plasmid or viral vectors that include a nucleic acid expression promoter in the cells in which it is delivered. .
- the activator compounds of the invention may comprise any of the polynucleotides of the invention described above or a plasmid or a vector capable of transporting or delivering said polynucleotides, preferably by means of a viral vector.
- Viral vectors are, for example, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, polio virus, AIDS virus, neuronal trophic virus, Sindbis and other RNA viruses, including among them, viruses with the structure of HIV. Viral families that share the properties of these viruses that make them suitable for use as vectors are also preferred. Retroviruses are Maloney murine leukemia viruses, MMLV, and retroviruses that express the desirable properties of MMLV as a vector. Retroviral vectors are capable of carrying a larger genetic payload, that is, a gene or marker transgene, than other viral vectors, and for this reason they are a commonly used vector. However, they are not as useful in nonproliferative cells.
- Adenovirus vectors are relatively stable and easy to work, have high titers, and can be sent in the aerosol formulation, and can transfect cells that do not divide.
- Smallpox viral vectors are large and have several sites for gene insertion, which are thermostable and can be stored at room temperature.
- a preferred embodiment is a viral vector that has been designed to suppress the host organism's immune response, caused by viral antigens.
- the activator compounds may comprise, in addition to the described polynucleotides of the invention, plasmids or vectors or the peptides of the invention, for example, lipids such as liposomes, such as cationic liposomes (eg, DOTMA, DOPE, DC-cholesterol) or anionic liposomes.
- lipids such as liposomes, such as cationic liposomes (eg, DOTMA, DOPE, DC-cholesterol) or anionic liposomes.
- the liposomes may further comprise proteins to facilitate the particular cell direction, if desired.
- the administration of a composition comprising a compound and a cationic liposome that can be administered to afferent blood to a target organ.
- the activator can be administered as a component of a microcapsule that can be targeted to specific cell types, such as cardiomyocytes, or where the Diffusion of the compound or administration of the microcapsule compound is designed for a specific type or dose.
- another preferred embodiment of the first aspect of the invention or of any of its preferred embodiments refers to the use of the composition of the invention, wherein said compound is a vector or plasmid capable of transporting or delivering the sequence of polynucleotides, as defined in the context of the present invention, to muscle satellite stem cells.
- said vector is a viral vector that encodes the polynucleotide sequence as defined above. More preferably said viral vector selected from the list consisting of adenoviral, lentiviral, retroviral and adeno-associated vectors.
- Another preferred embodiment of the first aspect of the invention or of any of its preferred embodiments relates to the use of the composition of the invention, wherein said medicament comprises satellite stem cells of muscle of a human or animal subject treated, transformed, transfected. or transduced with the compound defined in the first aspect of the invention or in any of its preferred embodiments.
- said cells treated, transformed, transfected or transduced with the compound are cells of autologous origin. More preferably, said transformed cells, transfected or transduced with the compound, are satellite muscle stem cells of a human subject suffering from dystrophinopathy or dystrophy.
- reducing the expression of miRNA-106b in the satellite stem cells of muscle of a human or animal subject with respect to that observed in the absence of the compound in said cells amplifies the population of myoblasts satellite cell derivatives during the differentiation processes of regenerative myogenesis. It is important to clarify that this reduction must occur in satellite stem cells of muscle of a human or animal subject, that is, in those cells located between the basal lamina and the skeletal muscle sarcolemma marked by the expression of the transcription factor Pax7 and from of a Pax3 / pax7 + muscle progeny of embryonic myogenic progenitor cells.
- a second aspect of the present invention relates to a composition
- a composition comprising a compound, inhibitor compound, capable of reducing the expression of miRNA-106b in muscle satellite cells of a human or animal subject with respect to the observed in the absence of the compound in said cells, for the preparation of medicament to promote muscle regeneration.
- inhibiting or reducing the expression of miRNA-106b means reduction on the baseline, or in comparison with a control, by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 , 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%, or 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
- the inhibitor compounds can be identified by a screening method that allows identifying in a compound the ability to inhibit or reduce the intracellular expression of miRNA-106b, which comprises contacting a cell, preferably a muscle satellite stem cell, with a compound that it is suspected that it may inhibit or reduce the expression of miRNA-106b; testing the content of the cells to determine the amount and / or biological activity of miRNA-106b expression, and compare the determined amount and / or the biological activity of miRNA-106b at a predetermined level, at which a change in said The amount and / or biological activity of miRNA-106b expression is indicative of a compound with the ability to inhibit or reduce intracellular expression of miRNA-106b.
- the detection is performed by quantitative real-time RT-PCR.
- said compound is an interference RNA (siRNA) of miRNA-106b such as an antisense RNA oligonucleotide of miRNA-106b or a polynucleotide expressing said antisense oligonucleotide.
- siRNA interference RNA
- said compound is a synthetic antisense RNA oligonucleotide of miRNA-106b which optionally presents modifications to increase its resistance to nucleases.
- said compound is the hsa-miR-106b-5p miRNA inhibitor ID: MH10067; Cat: 4464084, Ambion or a polynucleotide capable of inhibiting hsa-miR-106b-5p and having an identical nucleotide sequence in at least 90%, 92%, 94%, 96%, 98% or 99% based on the identity of the totality of the nucleotides of said sequence, to the nucleotide sequence ID: MH10067; Cat: 4464084, Ambion.
- said compound is comprised in a vector or plasmid capable of transporting or delivering said compound to muscle satellite stem cells, such as a viral vector such as adenoviral, lentiviral, retroviral and adeno-associated vectors.
- said composition comprises satellite muscle stem cells of a human or animal subject treated, transformed, transfected or transduced with a compound capable of reducing miRNA expression -106b in said cells.
- said cells treated, transformed, transfected or transduced with the compound are cells of autologous origin.
- said transformed cells, transfected or transduced with the compound are satellite muscle stem cells of a human or animal subject suffering from dystrophinopathy or dystrophy.
- said medicament is used to promote muscle regeneration in the treatment of dystrophinopathy.
- said dystrophy or dystrophinopathy is selected from the list consisting of Duchenne muscular dystrophy and Becker muscular dystrophy.
- compositions described in the second aspect of the invention can be administered in the form of a pharmaceutical composition comprising the compounds of this invention together with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
- the compounds of this invention can be administered in any conventional oral, parenteral, intramuscular or transdermal dosage form as long as said administration forms are capable of transporting and delivering any of the compounds described in the second aspect of the invention. to muscle satellite stem cells.
- composition of the second aspect of this invention can also be administered in a controlled release formulation, such as a slow release formulation or a rapid release formulation.
- a controlled release formulation such as a slow release formulation or a rapid release formulation.
- Such dosed controlled release formulations of the combination of the invention can be prepared using methods well known to those skilled in the art. The preferred administration procedure will be determined by the doctor in charge of the patient or another person skilled in the art after an evaluation of the subject's conditions and needs.
- nanoemulsions or solutions comprising nanoparticles or liposomes can be used. Said nanoemulsions or solutions can be adequately buffered. These aqueous solutions are especially suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal injection purposes.
- the methods of preparing various pharmaceutical compositions that could house or comprise the inhibitor compound of the second aspect of the invention for administration in vivo in a pharmaceutically acceptable carrier are well known as illustrated later in the description.
- said dystrophy or dystronifopathy is treated via intramuscular administration, more preferably through intramuscular administration in the lower limbs of a human or animal subject. More preferably, dystrophy or dystrophinopathy is treated through intramuscular administration, more preferably through intramuscular administration in the lower limbs of a human or animal subject, using as an compound an interference RNA (siRNA) of miRNA-106b such and as an antisense RNA oligonucleotide of miRNA-106b or a polynucleotide expressing said antisense oligonucleotide.
- siRNA interference RNA
- RNA oligonucleotide of miRNA-106b that optionally presents modifications to increase its resistance to nucleases. More preferably, using the hsa-miR-106b-5p miRNA inhibitor ID: MH 10067; Cat: 4464084, Ambion, or a polynucleotide capable of inhibiting hsa-miR-106b-5p and having an identical nucleotide sequence at least 90%, 92%, 94%, 96%, 98% or 99% based in the identity of the totality of the nucleotides of said sequence, to the nucleotide sequence ID: MH 10067; Cat: 4464084.
- a third aspect of the invention relates to a method of screening a compound capable of promoting muscle regeneration comprising:
- the DNA polynucleotides of the invention can be integrated into the genome of the host cell, usually through integration sequences. These sequences are often related to viral sequences, particularly based systems. in viruses when they are used. These viral integration systems can also be incorporated into the nucleic acids to be delivered using a delivery based non-nucleic acid addition system, such as a liposome, so that the nucleic acid contained in the delivery system can be integrated in the host genome.
- Other general techniques for integration into the host genome include, for example, systems designed to promote homologous recombination with the host genome. These systems are typically based on the flanking sequence of the nucleic acid to be expressed that has sufficient homology with a target sequence in the genome of the host cell where recombination between the nucleic acid vector and the target nucleic acid takes place, causing The supplied nucleic acid is integrated into the host genome. These systems and the methods necessary to promote homologous recombination are known to those skilled in the art.
- the activator or inhibitor compounds described herein can be administered in a pharmaceutically acceptable carrier and can be sent to the subject's cells in vivo and / or ex vivo by a variety of mechanisms well known in the art as discussed above.
- cells or tissues can be removed and kept out of the body according to standard protocols well known in the art.
- Activator or inhibitor compounds can be introduced into cells through any gene transfer mechanism, such as, for example, calcium phosphate mediated gene delivery, electroporation, microinjection or proteoliposomes.
- the transduced cells can then be infused (for example, in a pharmaceutically acceptable carrier) or homotopically transplanted into the subject by standard methods for the type of cell or tissue. Standard methods are known for the transplantation or infusion of several cells in a subject.
- the activator or inhibitor compounds of the present invention can be used in conjunction with other treatment methods.
- a method is included to increase or improve the clinical condition and the perception of well-being of a subject with dystrophy or with dystrophinopathy, which comprises administering to an individual in need thereof an effective amount of a compound.
- inhibitor activator which increases or improves the clinical status of the subject treated for a certain period of time.
- Current methods of treatment also include a method for increasing the efficacy of other agents proposed for the same disease, which comprises administering to an individual in need thereof an effective amount of an activator or inhibitor compound, and, optionally, a pharmaceutically acceptable carrier. , thus increasing the effectiveness of the other agent or agents.
- compositions comprising the activator or inhibitor compound can be administered in vivo in a pharmaceutically acceptable carrier.
- pharmaceutically acceptable is meant a material that is not biologically or otherwise undesirable, that is, the material can be administered to a subject, together with the nucleic acid or vector, without causing any undesirable biological effect or interacting in a harmful manner. with any of the other components of the pharmaceutical composition in which it is contained.
- the vehicle is selected to minimize any degradation of the active ingredient and to minimize any adverse side effects in the subject, as is well known to one skilled in the art.
- the effective dosages and administration schedules of the compositions comprising the activator or inhibitor compound described herein can be determined empirically, and making such determinations is within the skill in the art.
- the dosage ranges for administration of the compositions are those large enough to produce the desired anti-hypertrophic effect on the disorder.
- the dosage should not be so large as to cause adverse side effects, such as unwanted cross reactions, anaphylactic reactions, and the like.
- the dosage will vary with the age, condition, sex and extent of the disease in the patient, the route of administration, or if other drugs are included in the regimen, and can be determined by one skilled in the art.
- the dosage can be adjusted by the individual doctor in case of any contraindication.
- the dose may vary, and may be administered in one or more daily dose administrations, for one or several days. Guidance can be found in the literature for appropriate dosages for the given classes of pharmaceutical products.
- Example 1 Pitx2 and muscle regeneration Based on the results shown in the figures, and taking into account that, interestingly, the expression of Pitx2 is significantly increased during mouse muscle regeneration and decreased in the murine model of Duchenne muscular dystrophy (DMDmdx mice), we carry out an experimental approach of "in vivo" cell transplantation to test if Pitx2 could improve the regenerative capacity of satellite cells isolated from dystrophic muscles. It is important to note that the possibility of modifying the regenerative capacity of the dystrophic cells themselves is a significant advantage for their therapeutic application in humans (possibility of using dystrophic patient cells). The results obtained show that Pitx2 overexpression improves muscle regeneration carried out by dystrophic satellite cells, increasing muscle regeneration in MDX mice. Thus, our results demonstrate that the transplantation of dystrophic satellite cells by overexpressing Pitx2 in DMDmdx mice leads to:
- transfection with the bicistronic lentiviral vector LVX-Pitx2c-ZSGreen resulted in the overexpression of Pitx2 in mouse satellite cells. Additionally, this overexpression, see figure 2 section C), resulted in a decreased expression of the miRNAs: miR-15b, miR-106b, miR-23b and miR-503 (qRT-PCR), both in the cells in early stages of Activation (EPq) as in more advanced stages of activation (EPa) (qRT-PCR).
- transfection with the bicistronic lentiviral vector LVX-Pitx2c-ZSGreen leads to a decrease in the expression of the cyclin D1 and cyclin D2 cell cycle control genes (qRT -PCR) indicating that, similar to what occurs in myoblasts, the Pitx2-miRNAs pathway controls proliferation in satellite cells.
- the qRT-PCR analysis shows the overexpression of Pitx2c in the muscles of MDX mice injected with dystrophic satellite cells transfected with the LVX-Pitx2c-ZS- lentiviral vector Green vector compared to muscle injected with cells transfected with the empty lentivirus (LVX-ZS-Green vector); percentage of fibers formed "de novo" (ZS-Green + cells) in the transplanted muscles after 15 days and representative image.
- figure 4 section B shows how the decrease in miR-31 expression in transplanted muscles with cells that overexpress Pitx2 leads to an increase in dystrophin expression levels as well as a significant increase. of the fibers expressing dystrophin.
- FIG. 4 section C shows the functional improvement of DMDmdx mice injected with cells that overexpress Pitx2.
- Figure 4 section F shows how the expression levels of cyclines D1 and D2 as well as the transcription factor Myf5 were increased in the transplanted muscles with cells that overexpress Pitx2 indicating that the Pitx2-miRNAS molecular cascade is conserved in the " ⁇ n vivo" transplant system.
- Example 3 Regulation by decrease of m ⁇ R-106b in vivo mediated by injection of anti-m ⁇ R106b compound improves the process of myogenic regeneration in DMDmdx mice.
- Example 4 Regulation by decrease of m ⁇ R-106b in vivo mediated by injection of anti-m ⁇ R106b compound improves the process of myogenic regeneration in DMDmdx mice.
- miR-106b To further explore the role of miR-106b during muscle repair, it was investigated whether miR-106b expression was altered in a context in which muscle regeneration is not satisfactorily completed, such as in DMD. In this sense, it was shown that the expression of miR-106b clearly increases in the muscles of MDX mice, an animal model widely used for human DMD (Figure 7).
- the new myofiber formation was also analyzed using e-MyHC antibody and it was found that the number of myofibers positive for e-MyHC was enhanced in muscles treated with anti-miR compound compared to the control which demonstrates that the newly formed myofibers increased after injection of anti-miR-106b compound (Figure 9). Furthermore, histological analysis of TA of mdx / J Dmd mice 15 days after treatment with anti-miR-106b compound clearly shows an increase in the percentage of fibers with centralized nuclei ( Figure 10). In addition, treatment with anti-miR-106b compound induced a shift in the size distribution of regenerating fibers to the upper area classes. Together, these results indicate that the regenerative potential was enhanced in DMD / mdx satellite cells after injection of anti-miR-106b compound ( Figure 10).
- Treadmill tests were performed on DMD / mdx mice injected with anti-miR106b compound until exhaustion 30 days after treatment with anti-miR-106b compound. As illustrated in Figure 11, the run time and distance were 50% to 95% higher, respectively, in mice treated with anti-miR-106b compound with respect to the control, indicating that compound injection anti-miR-106b strengthens physical performance.
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Abstract
La presente invención resuelve el problema de proporcionar nuevas terapias que resulten eficaces en el tratamiento de las distrofias musculares a través de la utilización de composiciones que comprendan un compuesto capaz de reducir la expresión del miRNA-106b en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células.
Description
Método para promover la regeneración muscular.
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere al campo de la biotecnología, en particular a la utilización de la expresión del miRNA-106b y/o del gen Pitx2 para el tratamiento o la prevención de las distrofias musculares.
Antecedentes de la invención
La siguiente discusión de los antecedentes de la invención se proporciona meramente para ayudar al lector a comprender la invención.
El músculo esquelético tiene la capacidad de repararse y regenerarse debido a la presencia de células madre residentes, denominadas células satélite de músculo. En el tejido muscular maduro las células satélite constituyen una población pequeña, dispersa de células mitóticamente y fisiológicamente quiescentes, marcados por su expresión del factor de transcripción Pax7 (Figura 1). Las células madre satélite del músculo adulto son un linaje procedente de las células progenitoras miogénicas embrionarias Pax3/pax7+ que permanecen en el músculo adulto en un estado de quiescencia y después de una lesión se activan, proliferan y entran en el programa de diferenciación miogénica debido a la regulación positiva de los genes de determinación miogénica myf5, MyoD y miogenina formando así nuevos mioblastos que eventualmente se fusionan entre sí para generar nuevo tejido muscular (Figura 1).
Las distrofias musculares son un grupo de afecciones genéticas caracterizadas por trastornos degenerativos del músculo de carácter progresivo. Una de las características más graves en estas patologías consiste en la pérdida gradual de tejido muscular esquelético debido a una degeneración crónica acompañada por una regeneración deficiente. Sus formas más comunes en la infancia son las distrofias musculares de Duchenne (DMD) y Becker (BMD) y se caracterizan por ser trastornos hereditarios recesivos ligados al cromosoma X causados por mutaciones en el gen de la distrofina. La distrofina juega un papel estructural importante en la fibra muscular sirviendo de conexión entre la matriz extracelular y el citoesqueleto. La región N- terminal de esta proteína se une a la proteína del citoesqueleto actina, mientras que el extremo C-terminal es parte del complejo glicoprotéico asociado a la distrofina (DGC) que conecta con la membrana de la fibra muscular (sarcolema). A falta de distrofina, la tensión mecánica conduce a rupturas en el sarcolema causando una necrosis muscular progresiva, pérdida de la ambulación independiente al comienzo de la adolescencia, cardiomiopatía, insuficiencia respiratoria, y la muerte prematura en los individuos afectados.
En la actualidad no hay curación para las distrofias musculares y las terapias existentes son ineficaces. Aunque, es probable que las terapias génicas puedan proporcionar una cura para estas enfermedades existen importantes obstáculos que limitan su aplicación. Así, se han realizado enfoques potenciales que han ido desde las estrategias de aumento de genes usando vectores virales o plásmidos destinados a la restauración de la expresión de distrofina, hasta la regulación positiva de genes que podrían utilizarse para superar la falta de expresión del gen desertado. Aunque algunos de estos enfoques han demostrado ser parcialmente eficaces, los resultados obtenidos hasta el momento han puesto de manifiesto sus numerosas limitaciones. En particular, la pérdida progresiva de la expresión del gen terapéutico observado después del tratamiento ha indicado claramente que la modificación de la fibra madura por sí sola no es suficiente para mantener los efectos beneficiosos obtenidos por este enfoque terapéutico.
Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar nuevas terapias que resulten eficaces en el tratamiento de las distrofias musculares, especialmente mediante la identificación de nuevas aproximaciones para mejorar la regeneración muscular en estos pacientes.
Breve descripción de la invención La presente invención resuelve el problema de proporcionar nuevas terapias que resulten eficaces en el tratamiento de las distrofias musculares a través de la utilización de composiciones que comprendan un compuesto capaz de: a. aumentar la expresión del gen Pitx2 en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células; y/o b. reducir la expresión del miRNA-106b en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Origen embrionario de las células satélite de músculo. (Buckingham and Vincent, Current Opinión in Genetics& Development, 2009)
Figura 2. A y B) Sobreexpresión de Pitx2 en células satélite de ratón mediante transfeccion con el vector lentiviral bicistrónico LVX-Pitx2c-ZSGreen. C) La expresión de los miRNAs: miR-15b, miR-106b, miR-23b y miR-503 (qRT-PCR) esta disminuida en las células satélite que sobre- expresan Pitx2, tanto en las células en estadios tempranos de activación (EPq) como en estadios más avanzados de activación (EPa) (qRT-PCR). D) La transfeccion con el vector lentiviral bicistrónico LVX-Pitx2c-ZSGreen conduce a una disminución de la expresión de los genes de control de ciclo celular ciclina D1 y ciclina D2 (qRT-PCR) indicando que, de forma similar a lo que ocurre en mioblastos, la vía Pitx2-miRNAs controla proliferación en células satélite. E) Cuantificación por inmunohistoquímica del número de células en proliferación (KÍ67+) en cultivos de células satélite sobre-expresando Pitx2.
Figura 3. A) La expresión de Myf5 (qRT-PCR) aumenta en las células satélite que sobreexpresan Pitx2 y B) la cuantificación por inmunohistoquímica muestra un aumento significativo de las células Myf5+. C) La sobreexpresión del miR-106b conduce a una disminución de la expresión de Myf5 validándolo como target de este miRNA. D: Actividad normalizada de la luciferasa del 3'-UTR Myf5 luciferasa repórter (WT Myf5 3'-UTR), con el plásmido vacío (Vector) o co-transfectando con pre-miR-106b muestra la pérdida de la actividad luciferasa con el miR-106b. No hay pérdida de la actividad luciferasa cuando la miR- 106b "seed sequence" fue mutada.
Figura 4. A) Análisis mediante qRT-PCR de sobreexpresión de Pitx2c en los músculos de ratones MDX inyectados con células satélite distróficas transfectadas con el vector lentiviral LVX- Pitx2c-ZS-Green vector en comparación con los músculo inyectados con células transfectadas con el lentivirus vacío (LVX-ZS-Green vector); porcentaje de fibras formadas "de novo" (ZS-Green + cells) en los músculos trasplantados después de 15 días e imagen representativa. B) La disminución de la expresión de miR-31 en los músculos trasplantados con células sobreexpresando Pitx2 conduce a un aumento en los niveles de expresión de distrofina así como a un aumento significativo de las fibras que expresan distrofina. C) Treadmill test muestra la mejora funcional de ratones DMDmdx inyectados con células que sobreexpresan Pitx2. D) Análisis inmunohistoquímico de células en proliferación (KÍ67+) después de 15 días del trasplante celular. E) Análisis de expresión mediante qRT-PCR de los miRNAs modulados por Pitx2 en el músculo de los ratones DMDmdx a los que se les realizó el trasplante celular con células que sobreexpresan Pitx2. F) Los niveles de expresión de las ciclinas D1 y D2 así como del factor de transcripción Myf5 estaban aumentados en los músculos trasplantados con células que sobreexpresan Pitx2 indicando que la cascada molecular Pitx2-miRNAs está conservada en el sistema de trasplante "¡n vivo".
Figura 5. LNA in situ para miR-106b. Expresión conjunta con marcador específico de células satélite (Pax7) (Lozano Velasco et al; Mol Cell Biol, 2015)
Figura 6. Perfiles de expresión para miR-106b, Myf5, MyoD y miogenina en músculo tibialis anterioris tras la inyección de cardiotoxina en ratones. D0-D15: días tras la inyección de cardiotoxina.
Figura 7. miR-106b se regula por incremento en ratones DMD/mdx (n=6). Figura 8. Perfiles de expresión para miR-106b, Myf5, MyoD y miogenina en músculo tibialis anterioris tras la inyección de compuesto anti-miR106b (inhibidor de miRNA) en músculo TA de ratones. D0-D15: días tras la inyección de compuesto anti-miR.
Figura 9. Tinción con anticuerpo e-MyHC en músculos inyectados con compuesto anti-miR- 106b y control 15 días tras la inyección en el músculo y cuantificación de miofibras e-MyHC+.
Figura 10. Cuantificación de núcleos centralizados y área de sección transversal en músculos tibialis anterioris (TA), músculos inyectados con compuesto anti-miR-106b frente a músculos de control.
Figura 11. Análisis de recuperación funcional mediante Treadmill test: obsérvese que la distancia y el tiempo mejoraron significativamente en ratones DMD/mdx inyectados con compuesto anti-miR-106b (n=6). Descripción detallada de la invención
Definiciones
Tal y como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el término "células madre satélite de músculo" de un sujeto humano o animal constituye una población pequeña, dispersa de células mitóticamente y fisiológicamente quiescentes, marcados por su expresión del factor de transcripción Pax7 (Figura 1). Las células madre satélite del músculo adulto son un linaje procedente de las células progenitoras miogénicas embrionarias Pax3/Pax7+ que permanecen en el músculo adulto en un estado de quiescencia y después de una lesión se activan, proliferan y entran en el programa de diferenciación miogénica debido a la regulación positiva de los genes de determinación miogénica myf5, MyoD y miogenina formando así nuevos mioblastos que eventualmente se fusionan entre sí para generar nuevo tejido muscular (Figura 1). Preferiblemente, el término "células madre satélite de músculo" se refiere a una célula localizada entre la lamina basal y el sarcolema del músculo esquelético, preferiblemente del músculo esquelético adulto, y marcada por la expresión del factor de transcripción Pax7, procedente de una progenie muscular Pax3/pax7+ de células progenitoras miogénicas embrionarias.
Tal y como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el término "miRNA-106b" se refiere, preferiblemente, al ARN monocatenario Ensembl:ENSG00000208036 MIM:612983; miRBase:MI0000734 o a una secuencia polinucleotídica de ARN que presenta una secuencia nucleotídica idéntica en al menos el 90%, 92%, 94%, 96%, 98% o 99% basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dicha secuencia, a la secuencia nucleotídica Ensembl:ENSG00000208036 MIM:612983; miRBase:MI0000734. Preferiblemente, una secuencia polinucleotídica de ARN que presenta una secuencia nucleotídica idéntica en al menos el 90%, 92%, 94%, 96%, 98% o 99% basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dicha secuencia, a la secuencia nucleotídica Ensembl:ENSG00000208036 MIM:612983; miRBase:MI0000734 y que presenta la función de regular la expresión de otros genes utilizando la ruta de ribo-interferencia.
Tal y como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el término "inhibidor de miARN hsa-miR-106b-5p (ID:MH 10067; Cat: 4464084, Ambion)" se refiere a una secuencia nucleotídica de ARN de cadena simple modificada químicamente y diseñada para unirse específicamente e inhibir moléculas endógenas de miR-106b.
Tal como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el término "gen Pitx2" es un miembro de la familia de factores de transcripción bicoid homeodominio que juega un papel relevante en la morfogénesis (Referencia secuencia polinucleotídica del Genbank con número de acceso NM_000325 identificativa de Homo sapiens paired-like homeodomain 2 (PITX2)) El término "aumento" o "aumentar" se refiere a aumentos por encima del nivel basal. Por ejemplo, los niveles básales son normales en los niveles in vivo antes de, o en ausencia de, la adición de un compuesto activador.
El término "reducción" o "reducir" o "inhibir" o "inhibición" se refiere a reducciones por debajo del nivel basal. Por ejemplo, los niveles básales son normales en los niveles in vivo antes de, o en ausencia de, la adición de un compuesto inhibidor.
En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a un número de términos que se definirán para tener los siguientes significados:
"Opcional" u "opcionalmente" significa que el suceso o circunstancia descrito posteriormente puede o no ocurrir, y que la descripción incluye casos en los que dicho evento o circunstancia ocurre y casos en los que no.
Como se usa aquí, los términos "prevenir", "previniendo" y "prevención" se refieren a los métodos para evitar o impedir el desarrollo de una enfermedad o trastorno o retardar la recurrencia o la aparición de uno o más síntomas de un trastorno en un sujeto resultante de la administración de un agente profiláctico.
El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir la formulación utilizada para estabilizar, solubilizar y ser mezclado de alguna manera con ingredientes activos que se administran a los animales vivos, incluyendo los seres humanos. Esto incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, tal uso en las composiciones está contemplado.
El término "enfermedad", como se usa aquí, pretende ser sinónimo generalmente, y se usa de manera intercambiable con los términos "trastorno" y "condición" (como en la condición médica), en que todos reflejan una condición anormal del cuerpo o de una de sus las partes que perjudica el funcionamiento normal y se manifiesta típicamente por signos distintivos y síntomas.
El término "terapia de combinación" significa la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar una afección o trastorno terapéutico descrito en la presente descripción. Dicha administración abarca la co-administración de estos agentes terapéuticos de una manera sustancialmente simultánea, tal como en una sola cápsula que tiene una relación fija de ingredientes activos o en múltiples cápsulas separadas para cada ingrediente activo. Además, tal administración también abarca el uso de cada tipo de agente terapéutico de una manera secuencial. En cualquier caso, el régimen de tratamiento proporcionará efectos beneficiosos de la combinación de compuestos en el tratamiento de las afecciones o trastornos descritos en la presente.
La frase "terapéuticamente eficaz" pretende calificar la cantidad de ingredientes activos utilizados en el tratamiento de una enfermedad o trastorno. Esta cantidad será la necesaria para lograr el objetivo de reducir o eliminar dicha enfermedad o trastorno.
El término "sujeto" se refiere a todos los mamíferos, incluyendo los seres humanos. Los ejemplos de sujetos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, vacas, perros, gatos, cabras, ovejas, cerdos, y conejos.
A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones. Las descripciones de estas publicaciones en su totalidad se incorporan por referencia en esta solicitud a fin de describir más completamente el estado de la técnica a la que ésta pertenece. Las referencias descritas son también individualmente y específicamente incorporadas aquí como referencia por el material contenido en ellas que es discutido en la frase sobre la que se basa dicha referencia.
Descripción de la invención
La presente invención aborda el problema de proporcionar nuevas terapias que resulten eficaces en el tratamiento de las distrofias musculares, aumentando la capacidad de regenerar el tejido perdido, como resultado de la distrofia muscular, de las células madre de músculo esquelético. Con este propósito los autores de la presente invención han evaluado la contribución del gen Pitx2 en la regulación de la transcripción, específica de tejido, de distintos microRNAs durante la miogénesis. Los análisis de perfiles de expresión génica (microRNA-microarrays) en una línea celular de mioblastos (línea celular Sol8) ha llevado a identificar a los autores de la presente invención una serie de microRNAs (miRNAs) que son regulados diferencialmente en mioblastos Sol8 que sobreexpresan Pitx2 (ver figura 2). Los análisis de los efectos de dichos microRNAs en la proliferación de mioblastos y la identificación de sus supuestas dianas demuestran que Pitx2 regula un subconjunto de microRNAs que presenta un profundo efecto en la progresión del ciclo celular de mioblastos (miR15b, miR-23b, miR-106b y miR-503). Adicionalmente, los autores de la invención encontraron que esta vía Pitx2-miRNAs también regula la proliferación celular en células satélite aisladas del músculo esquelético de ratón (Figura 1). Estos resultados indican que Pitx2 actúa amplificando la población de mioblastos derivados de células satélite durante los procesos de diferenciación de la miogénesis regenerativa (Figura 3). Adicionalmente, estos resultados demuestran que reducir la expresión de miRNA-106b en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células, amplifica la población de mioblastos derivados de células satélite durante los procesos de diferenciación de la miogénesis regenerativa (ver figuras 3 y 4). Es más, los resultados muestran claramente que miR-106b se regula por disminución durante el intervalo temporal comprendido entre los días 3 y 7 tras la inyección de cardiotoxina (Figura 6). Curiosamente, tal como se muestra en los ejemplos, en el día 3 desde la inyección de compuesto anti-miR-106b se encontró una clara regulación por incremento de Myf5, MyoD y miogenina respaldando la noción de que se requiere regulación por disminución
de m¡R-106b para una diferenciación miogénica apropiada durante el proceso de regeneración muscular (Figura 6). Además, para explorar adicionalmente el papel de miR-106b durante la reparación muscular, se investigó si la expresión de miR-106b se alteraba en un contexto en el que la regeneración muscular no se completa satisfactoriamente, tal como en DMD (distrofias musculares de Duchenne). En este sentido, se demostró que la expresión de miR-106b aumenta claramente en los músculos de ratones MDX, un modelo animal ampliamente usado para DMD humanas (Figura 7). Por tanto, a continuación se consideró si disminuyendo la expresión de miR-106b podría modularse la regeneración muscular en ratones distróficos. Para tratar esta cuestión se desarrolló una estrategia mediante la cual se inyectaron cardiotoxina e inhibidor de miARN hsa-miR-106b-5p (ID:MH 10067; Cat: 4464084, Ambion) en el músculo TA (músculo tibialis anterioris) de ratones MDX de 4 meses de edad (1 ,7 nmol por inyección). Tras la inyección de inhibidor de miRNA, se extirparon los músculos a 1 , 3 y 15 días tras la inyección de compuesto anti-miR-106b para análisis. Los resultados muestran claramente que la inyección de compuesto anti-miR-106b puede disminuir la presencia de miR-106b. De manera interesante, tal como se muestra en los ejemplos, la disminución de miR-106b coincide con ondas de diferenciación miogénica tal como se observa mediante regulación por incremento de Myf5, MyoD y miogenina lo que indica que niveles disminuidos de miR-106b inducidos mediante inyección de compuesto anti-miR106b pueden fomentar la diferenciación muscular (Figura 8).
Finalmente, se realizaron "Treadmill tests" en ratones DMD/mdx inyectados con compuesto anti-miR106b hasta el agotamiento 30 días tras el tratamiento con compuesto anti-miR-106b. Tal como se ilustra en la figura 1 1 , el tiempo y la distancia de carrera fueron del 50% al 95% superiores, respectivamente, en ratones tratados con compuesto anti-miR-106b con respecto al control, lo que indica que la inyección de compuesto anti-miR-106b fortalece el rendimiento físico.
Tomados en conjunto los resultados revelaron que miR-106b desempeña un papel clave durante el proceso de regeneración muscular en ratones. Además, los datos presentados aquí demostraron que la inyección intramuscular de compuesto anti-miR-106b puede mejorar la capacidad de regeneración en ratones DMD.
Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de una composición (de aquí en adelante "composición de la presente invención") que comprende un compuesto capaz de
- aumentar la expresión del gen Pitx2, compuesto activador, en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células; y/o
- reducir la expresión del miRNA-106b, compuesto inhibidor, en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células; para la elaboración de un medicamento para promover la regeneración muscular. Alternativamente, el primer aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende un compuesto capaz de
- aumentar la expresión del gen Pitx2, compuesto activador, en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células; y/o
- reducir la expresión del miRNA-106b, compuesto inhibidor, en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células; para su uso en promover la regeneración muscular.
Por "aumenta la expresión del gen Pitx2" se entiende el aumento sobre la línea de base, o en comparación con a control, por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 , 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65 , 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 , 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más veces. Los compuestos activadores se pueden identificar mediante un método de cribado que permita identificar en un compuesto la capacidad de activar Pitx2, que comprende poner en contacto una célula, preferiblemente una célula madre satélite de músculo, con un compuesto que se sospecha que pueda activar Pitx2; ensayando el contenido de las células para determinar la cantidad y/o actividad biológica de Pitx2, y comparar la cantidad determinada y/o la actividad biológica de Pitx2a un nivel predeterminado, en el que un cambio de dicho importe y/o la actividad biológica de Pitx2 es indicativa de un compuesto que activa Pitx2. En una realización preferida, la detección se realiza por RT-PCR cuantitativa en tiempo real, usando cebadores específicos para cada isoforma.
En el contexto de la presente invención por células madre satélite de músculo se entiende células madre, o pre-células musculares, que sirven para ayudar a la regeneración del músculo esquelético adulto. A raíz de la proliferación (cuando las célula satélite se activan) y la diferenciación posterior (cuando comienzan a expresar factores de transcripción que las comprometen hacia un linaje miogénico (mioblastos)), las células satélite se fusionan entre sí o con las adyacentes fibras musculares dañadas, lo que aumenta el número de mionucleos en las fibras para el crecimiento y la reparación. La activación y proliferación de células satélite es necesario a fin de satisfacer las necesidades de formación de nuevas fibras musculares para regenerar el músculo. La diferenciación es necesaria para que las células satélite puedan convertirse primero en mioblastos y tras el proceso de fusión, en fibras.
Una realización preferida del primer aspecto de la invención, se refiere al uso de la composición de la invención, donde dicho medicamento se usa para promover la regeneración muscular en el tratamiento de una distrofinopatía o distrofia. Preferiblemente, donde dicha distrofinopatía o distrofia se selecciona de la lista que consiste en la distrofia muscular de Duchenne y la distrofia muscular de Becker.
Otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, se refiere al uso de la composición de la invención, donde dicho compuesto, compuesto activador, es un polinucleótido de ADN (de aquí en adelante polinucleótido de la invención) que comprende una secuencia seleccionada de la lista que consiste en: - la secuencia polinucleotídica del Genbank con número de acceso NM_000325 o su secuencia complementaria;
- una secuencia que híbrida selectivamente con la secuencia de (a); y
- una secuencia polinucleotídica de ADN que codifica para una secuencia aminoacídica idéntica en al menos el 90%, 92%, 94%, 96%, 98% o 99% basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia, a la secuencia aminoacídica del
Genbank con número de acceso NP_000316.
En el contexto de la presente invención, la secuencia polinucleotídica del Genbank con número de acceso NM_000325 (SEQ ID NO 1) se identifica como Homo sapiens paired-like homeodomain 2 (PITX2), transcript variant 3, mRNA. Dicha secuencia nucleotídica se expone a continuación:
GTTAGGCCAACAGGGAAGCGCGGAGCCGCAGATCTGGTCCGTCGCTCGCCTGGGTGCCT GGAGCTGAGCTGCGGCAAGGCCCGGCTCCTGTTCGACCGCCCGAGGGGTGTGCGTGTG CGCGTTGCGGAGGGTGCGCTCAGAGGGCCGCGTCGTGGCTGCAGCGGCTGCTGCCGCC GCAGGGGATCTAATATCACCTACCTGTCCCTGTCACTCTTGACACTTCTCTGTCAGGGCTG CCGCGTGGGGGGGGGGCGGGCAGAGCGCGGTCGGCGTTAGCTTTCCTTATTGGAGGGG TTCTTGGGGGAGGGAGGGAGAGAAGAAGGGGGTCTTTGCCCACTCTTGTTTCGCTTTGGA GCTTGGAAGCCTGCTCCCTAAAGACGCTCTGAGTGGTGCCCTTCTGCCCACATCCCATGT CTTCGTTTGCCCGCTGACTTTCCGTCTCCGGACTTTTTCGCTTGAGCCTTCCGGAGGAGAC GGGGGCAGCTTGGCTTGAGAACTCGGCGGGGGTTGCGTCCCCTGGCTCTCCCCGCAGCG GGGAAACTCCGCGCCTAGAGCGCGACCCGGAGCGGGCAGCGGCGGCTACGGGGGCTCG GCGGGGCAGTAGCCAAGGACTAGTAGAGCGTCGCGCTCCCTCGTCCATGAACTGCATGAA AGGCCCGCTTCACTTGGAGCACCGAGCAGCGGGGACCAAGCTGTCGGCCGTCTCCTCAT CTTCCTGTCACCATCCCCAGCCGTTAGCCATGGCTTCGGTTCTGGCTCCCGGTCAGCCCC GGTCGCTGGACTCCTCCAAGCACAGGCTGGAGGTGCACACCATCTCCGACACCTCCAGCC CGGAGGCCGCAGAGAAAGATAAAAGCCAGCAGGGGAAGAATGAGGACGTGGGCGCCGA GGACCCGTCTAAGAAGAAGCGGCAAAGGCGGCAGCGGACTCACTTTACCAGCCAGCAGC TCCAGGAGCTGGAGGCCACTTTCCAGAGGAACCGCTACCCGGACATGTCCACACGCGAA GAAATCGCTGTGTGGACCAACCTTACGGAAGCCCGAGTCCGGGTTTGGTTCAAGAATCGT CGGGCCAAATGGAGAAAGAGGGAGCGCAACCAGCAGGCCGAGCTATGCAAGAATGGCTT CGGGCCGCAGTTCAATGGGCTCATGCAGCCCTACGACGACATGTACCCAGGCTATTCCTA CAACAACTGGGCCGCCAAGGGCCTTACATCCGCCTCCCTATCCACCAAGAGCTTCCCCTT CTTCAACTCTATGAACGTCAACCCCCTGTCATCACAGAGCATGTTTTCCCCACCCAACTCTA TCTCGTCCATGAGCATGTCGTCCAGCATGGTGCCCTCAGCAGTGACAGGCGTCCCGGGCT CCAGTCTCAACAGCCTGAATAACTTGAACAACCTGAGTAGCCCGTCGCTGAATTCCGCGGT GCCGACGCCTGCCTGTCCTTACGCGCCGCCGACTCCTCCGTATGTTTATAGGGACACGTG TAACTCGAGCCTGGCCAGCCTGAGACTGAAAGCAAAGCAGCACTCCAGCTTCGGCTACGC CAGCGTGCAGAACCCGGCCTCCAACCTGAGTGCTTGCCAGTATGCAGTGGACCGGCCCG TGTGAGCCGCACCCACAGCGCCGGGATCCTAGGACCTTGCCGGATGGGGCAACTCCGCC CTTGAAAGACTGGGAATTATGCTAGAAGGTCGTGGGCACTAAAGAAAGGGAGAGAAAGAG AAGCTATATAGAGAAAAGGAAACCACTGAATCAAAGAGAGAGCTCCTTTGATTTCAAAGGG ATGTCCTCAGTGTCTGACATCTTTCACTACAAGTATTTCTAACAGTTGCAAGGACACATACA CAAACAAATGTTTGACTGGATATGACATTTTAACATTACTATAAGCTTGTTATTTTTTAAGTTT AGCATTGTTAACATTTAAATGACTGAAAGGATGTATATATATCGAAATGTCAAATTAATTTTA TAAAAGCAGTTGTTAGTAATATCACAACAGTGTTTTTAAAGGTTAGGCTTTAAAATAAAGCAT GTTATACAGAAGCGATTAGGATTTTTCGCTTGCGAGCAAGGGAGTGTATATACTAAATGCC ACACTGTATGTTTCTAACATATTATTATTATTATAAAAAATGTGTGAATATCAGTTTTAGAATA GTTTCTCTGGTGGATGCAATGATGTTTCTGAAACTGCTATGTACAACCTACCCTGTGTATAA
CATTTCGTACAATATTATTGTTTTACTTTTCAGCAAATATGAAACAAATGTGTTTTATTTCATG GGAGTAAAATATACTGCATACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
En el contexto de la presente invención, la secuencia aminoacídica con número de acceso NP_000316 (SEQ ID NO 2) se identifica como pituitary homeobox 2 isoform c [Homo sapiens]. Dicha secuencia aminoacídica se expone a continuación:
MNCMKGPLHLEHRAAGTKLSAVSSSSCHHPQPLAMASVLAPGQPRSLDSSKHRLEVHTISDTS SPEAAEKDKSQQGKNEDVGAEDPSKKKRQRRQRTHFTSQQLQELEATFQRNRYPDMSTREEI AVWTNLTEARVRVWFKNRRAKWRKRERNQQAELCKNGFGPQFNGLMQPYDDMYPGYSYNN WAAKGLTSASLSTKSFPFFNSMNVNPLSSQSMFSPPNSISSMSMSSSMVPSAVTGVPGSSLN SLNNLNNLSSPSLNSAVPTPACPYAPPTPPYVYRDTCNSSLASLRLKAKQHSSFGYASVQNPA SNLSACQYAVDRPV En el contexto de la presente invención, el grado de identidad de una secuencia aminoacídica se basa en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia.
En esta realización de la invención, dentro de los polinucleótidos de la invención se pueden incluir en ella nucleótidos sintéticos o modificados. Un número de tipos diferentes de modificación de polinucleótidos son conocidos en la técnica. Estos incluyen metilfostato y cadenas principales de fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y 5 'de la molécula. Para los fines de la presente invención, se debe entender que los polinucleótidos descritos en este documento pueden ser modificados por cualquier método disponible en la técnica.
Los polinucleótidos de acuerdo con la invención se puede producir recombinantemente, sintéticamente o mediante cualquier medio disponible para los expertos en la técnica. También pueden ser clonados por técnicas estándar. Los polinucleótidos se proporcionan típicamente en forma aislada y/o purificada.
Otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, se refiere al uso de la composición de la invención, donde el compuesto es un polinucleótido de ADN que comprende una secuencia seleccionada de la lista que consiste en la secuencia polinucleotídica con número de acceso NM_000325 (SEQ ID NO 1) o su secuencia complementaria o una secuencia polinucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica idéntica en al menos el 99%, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia, a la secuencia aminoacídica con número de acceso NP_000316.
En un aspecto preferido de la invención adicional, los polinucleótidos de la invención, tales como los expuestos anteriormente, pueden ser transportados, sin degradación, por vectores plasmídicos o virales que incluyen un promotor de expresión del ácido nucleico en las células en las que es suministrado.
Así, en una realización adicional de la invención, los compuestos activadores de la invención pueden comprender cualquiera de los polinucleótidos de la invención descritos anteriormente o un plásmido o un vector capaz de transportar o suministrar dichos polinucleótidos, preferiblemente mediante un vector viral.
Los vectores virales son, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes, virus vaccinia, virus de la polio, virus del SIDA, virus trófico neuronal, Sindbis y otros virus de ARN, incluyendo entre éstos, virus con la estructura del VIH. También se prefieren las familias virales que comparten las propiedades de estos virus que los hacen adecuados para su uso como vectores. Los retrovirus son virus de la leucemia murina de Maloney, MMLV, y retrovirus que expresan las propiedades deseables de MMLV como un vector. Los vectores retrovirales son capaces de llevar una carga útil genética más grande, es decir, un gen o transgén marcador, que otros vectores virales, y por esta razón son un vector comúnmente usado. Sin embargo, no son tan útiles en células no proliferativas. Los vectores de adenovirus son relativamente estables y fáciles de trabajar, tienen títulos elevados, y se puede enviar en la formulación de aerosol, y pueden transfectar células que no se dividen. Los vectores virales de la viruela son grandes y tienen varios sitios para la inserción de genes, que son termoestables y pueden almacenarse a temperatura ambiente. Una realización preferida es un vector viral que ha sido diseñado con el fin de suprimir la respuesta inmunitaria del organismo huésped, provocados por los antígenos virales.
Los compuestos activadores pueden comprender, además de los polinucleótidos descritos de la invención, plásmidos o vectores o los péptidos de la invención, por ejemplo, lípidos tales como los liposomas, tales como liposomas catiónicos (por ejemplo, DOTMA, DOPE, DC- colesterol) o liposomas aniónicos.
Los liposomas pueden comprender además proteínas para facilitar la dirección a célula en particular, si se desea. La administración de una composición que comprende un compuesto y un liposoma catiónico que se puede administrar a la sangre aferente a un órgano diana. Además, el activador se puede administrar como un componente de una microcápsula que pueden ser dirigidos a tipos de células específicas, tales como cardiomiocitos, o donde la
difusión del compuesto o la administración del compuesto de la microcápsula está diseñado para un tipo específico o una dosis.
Por lo tanto, otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, se refiere al uso de la composición de la invención, en el que dicho compuesto es un vector o plásmido capaz de transportar o suministrar la secuencia de polinucleótidos, tal y como se define ésta en el contexto de la presente invención, a las células madre satélite de músculo. Preferiblemente dicho vector es un vector viral que codifica para la secuencia de polinucleótidos tal y como ésta queda definida arriba. Más preferiblemente dicho vector viral seleccionado de la lista que consiste en vectores adenovirales, lentivirales, retrovirales y adenoasociados.
Otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, se refiere al uso de la composición de la invención, en el que dicho medicamento comprende células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto definido en el primer aspecto de la invención o en cualquiera de sus realizaciones preferidas. Preferiblemente, dichas células tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto, son células de origen autólogo. Más preferiblemente, dichas células transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto, son células madre satélite de músculo de un sujeto humano que padece una distrofinopatía o una distrofia.
Por otro lado y tal y como se ha comentado con anterioridad, reducir la expresión del miRNA- 106b en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células amplifica la población de mioblastos derivados de células satélite durante los procesos de diferenciación de la miogénesis regenerativa. Es importante matizar que dicha reducción se debe producir en células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal, es decir, en aquellas células localizada entre la lámina basal y el sarcolema del músculo esquelético marcadas por la expresión del factor de transcripción Pax7 y procedentes de una progenie muscular Pax3/pax7+ de células progenitoras miogénicas embrionarias. Para ello, la terapia debe estar orientada a conseguir ese objetivo, es decir, la terapia debe permitir la reducción efectiva de los niveles del miRNA- 106b en dichas células. Por consiguiente, un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende un compuesto, compuesto inhibidor, capaz de reducir la expresión del miRNA- 106b en células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la
observada en ausencia del compuesto en dichas células, para la elaboración de medicamento para promover la regeneración muscular.
En el contexto de la presente invención, por "inhibir o reducir la expresión del miRNA-106b" se entiende la reducción sobre la línea de base, o en comparación con a control, por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 , 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65 , 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 , 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más veces.
Los compuestos inhibidores se pueden identificar mediante un método de cribado que permita identificar en un compuesto la capacidad de inhibir o reducir la expresión intracelular del miRNA-106b, que comprende poner en contacto una célula, preferiblemente una célula madre satélite de músculo, con un compuesto que se sospecha que pueda inhibir o reducir la expresión del miRNA-106b; ensayando el contenido de las células para determinar la cantidad y/o actividad biológica de la expresión del miRNA-106b, y comparar la cantidad determinada y/o la actividad biológica del miRNA-106b a un nivel predeterminado, en el que un cambio de dicho importe y/o la actividad biológica de la expresión de miRNA-106b es indicativa de un compuesto con la capacidad de inhibir o reducir la expresión intracelular del miRNA-106b. En una realización preferida, la detección se realiza por RT-PCR cuantitativa en tiempo real.
En una realización preferida del segundo aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, dicho compuesto es un ARN de interferencia (ARNip) del miRNA-106b tal y como un oligonucleótido antisentido de RNA del miRNA-106b o un polinucleótido que exprese dicho oligonucleótido antisentido. Preferiblemente, dicho compuesto es un oligonucleótido sintético antisentido de RNA del miRNA-106b que opcionalmente presenta modificaciones para incrementar su resistencia a las nucleasas. Más preferiblemente, dicho compuesto es el inhibidor de miARN hsa-miR-106b-5p ID: MH10067; Cat: 4464084, Ambion o un polinucleótido capaz de inhibir el hsa-miR-106b-5p y que presente una secuencia nucleotídica idéntica en al menos en el 90%, 92%, 94%, 96%, 98% o 99% basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dicha secuencia, a la secuencia nucleotídica ID:MH10067; Cat: 4464084, Ambion. Más preferiblemente, dicho compuesto está comprendido en un vector o plásmido capaz de transportar o suministrar dicho compuesto a las células madre satélite de músculo, tal y como un vector viral como por ejemplo vectores adenovirales, lentivirales, retrovirales y adenoasociados.
En aún otra realización preferida del segundo aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, dicha composición comprende células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con un compuesto capaz de reducir la expresión del miRNA-106b en dichas células. Preferiblemente, dichas células tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto, son células de origen autólogo. Más preferiblemente, dichas células transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto, son células madre satélite de músculo de un sujeto humano u animal que padece una distrofinopatía o una distrofia. En otra realización preferida del segundo aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, dicho medicamento se usa para promover la regeneración muscular en el tratamiento de una distrofinopatía.
En otra realización preferida del segundo aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, dicha distrofia o distrofinopatía se selecciona de la lista que consiste en la distrofia muscular de Duchenne y la distrofia muscular de Becker.
Se hace notar que las composiciones descritas en el segundo aspecto de la invención, o en cualquiera de sus realizaciones preferidas, se pueden administrar en forma de composición farmacéutica que comprende los compuestos de esta invención junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. De esta manera, los compuestos de esta invención se pueden administrar en cualquier forma de dosificación oral, parenteral, intramuscular o transdermal convencional siempre y cuando dichas formas de administración sean capaces de transportar y suministrar cualquiera de los compuestos descritos en el segundo aspecto de la invención a las células madre satélite de músculo.
La composición del segundo aspecto de esta invención se puede administrar también en una formulación de liberación controlada, tal como una formulación de liberación lenta o una de liberación rápida. Tales formulaciones dosificadas de liberación controlada de la combinación de la invención se pueden preparar usando procedimientos bien conocidos por aquellos expertos en la materia. El procedimiento de administración preferido se determinará por el médico a cargo del paciente u otra persona experta en la técnica después de una evaluación de las condiciones y necesidades del sujeto. Para los objetivos de administración parenteral, se pueden emplear nanoemulsiones o soluciones que comprendan nanopartículas o liposomas. Dichas nanoemulsiones o soluciones se pueden tamponar adecuadamente. Esta soluciones acuosas son especialmente adecuadas para objetivos de inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En
cualquier caso, son bien conocidos los procedimientos de preparación de diversas composiciones farmacéuticas que pudiesen albergar o comprender el compuesto inhibidor del segundo aspecto de la invención para su administración in vivo en un vehículo farmacéuticamente aceptable tal y como se ilustra más adelante en la descripción.
Preferiblemente, dicha distrofia o distronifopatia se trata vía la administración intramuscular, más preferiblemente a través de la administración intramuscular en los miembros inferiores de un sujeto humano o animal. Más preferiblemente, la distrofia o distrofinopatía se trata a través de una administración intramuscular, más preferiblemente a través de la administración intramuscular en los miembros inferiores de un sujeto humano o animal, usando como compuesto un ARN de interferencia (ARNip) del miRNA-106b tal y como un oligonucleótido antisentido de RNA del miRNA-106b o un polinucleótido que exprese dicho oligonucleótido antisentido. Preferiblemente, utilizando un oligonucleótido sintético antisentido de RNA del miRNA-106b que opcionalmente presente modificaciones para incrementar su resistencia a las nucleasas. Más preferiblemente, utilizando el inhibidor de miARN hsa-miR-106b-5p ID:MH 10067; Cat: 4464084, Ambion, o un polinucleótido capaz de inhibir el hsa-miR-106b-5p y que presente una secuencia nucleotídica idéntica en al menos en el 90%, 92%, 94%, 96%, 98% o 99% basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dicha secuencia, a la secuencia nucleotídica ID:MH 10067; Cat: 4464084.
Por último, un tercer aspecto de la invención se refiere a un método de cribado de un compuesto capaz de promover la regeneración muscular que comprende:
1. Seleccionar compuestos a partir de una librería de compuestos;
2. Testar si alguno de dichos compuestos es capaz de:
a. aumentar la expresión del gen Pitx2 en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células; y/o
b. reducir la expresión del miRNA-106b en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células; y
3. Seleccionar aquel o aquellos compuestos capaces de llevar a cabo el mencionado en cualquiera de los apartados anteriores. En el contexto de la presente invención, los polinucleótidos de ADN de la invención, tales como los descritos anteriormente, que se suministran a las células, se pueden integrar en el genoma de la célula huésped, normalmente a través de secuencias de integración. Estas secuencias están a menudo relacionadas con las secuencias virales, particularmente en sistemas basados
en virus cuando se utilizan. Estos sistemas de integración virales también pueden ser incorporados en los ácidos nucleicos que se van a entregar usando un sistema de adición de ácido no nucleico basada de entrega, tal como un liposoma, de modo que el ácido nucleico contenido en el sistema de suministro puede integrarse en el genoma del hospedador.
Otras técnicas generales para la integración en el genoma del huésped incluyen, por ejemplo, sistemas diseñados para promover la recombinación homologa con el genoma del huésped. Estos sistemas se basan típicamente en la secuencia de flanqueo del ácido nucleico a expresar que tiene una homología suficiente con una secuencia diana en el genoma de la célula huésped donde la recombinación entre el vector de ácido nucleico y el ácido nucleico diana tiene lugar, haciendo que el ácido nucleico suministrado sea integrado en el genoma del huésped. Estos sistemas y los métodos necesarios para promover la recombinación homologa son conocidos por los expertos en la técnica. Los compuestos activadores o inhibidores descritos en la presente memoria se pueden administrar en un vehículo farmacéuticamente aceptable y se puede enviar a las células del sujeto in vivo y / o ex vivo mediante una variedad de mecanismos bien conocidos en la técnica como se ha comentado anteriormente. Si los métodos ex vivo se emplean, las células o los tejidos pueden eliminarse y mantenerse fuera del cuerpo según protocolos estándar bien conocidos en la técnica. Los compuestos activadores o inhibidores se pueden introducir en las células a través de cualquier mecanismo de transferencia de genes, tales como, por ejemplo, suministro de genes mediado por fosfato de calcio, electroporación, microinyección o proteoliposomas. Las células transducidas pueden entonces infundirse (por ejemplo, en un vehículo farmacéuticamente aceptable) o ser homotópicamente trasplantadas en el sujeto por métodos estándar para el tipo de célula o tejido. Los métodos estándar son conocidos para el transplante o infusión de varias células en un sujeto. Los compuestos activadores o inhibidores de la presente invención se pueden utilizar en conjunto con otros métodos de tratamiento.
Además, proporcionado en la presente memoria, se incluye un método para aumentar o mejorar el estado clínico y la percepción de bienestar de un sujeto con distrofia o con una distrofinopatia, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de un compuesto activador inhibidor, lo que aumenta o mejora el estado clínico del sujeto tratado por un cierto período de tiempo.
Los métodos actuales de tratamiento incluyen también un método para aumentar la eficacia de otros agentes propuestos para la misma enfermedad, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de un compuesto activador o inhibidor, y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable, aumentando así la eficacia del otro agente o agentes.
En cualquier caso, las composiciones que comprenden el compuesto activador o inhibidor se pueden administrar in vivo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material puede administrarse a un sujeto, junto con el ácido nucleico o vector, sin causar ningún efecto biológico indeseable o interactuar de una manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido. El vehículo, naturalmente, se selecciona para minimizar cualquier degradación del ingrediente activo y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el sujeto, como es bien conocido para un experto en la técnica.
Las dosificaciones efectivas y los calendarios de administración de las composiciones que comprenden el compuesto activador o inhibidor descritos en este documento pueden ser determinadas empíricamente, y hacer tales determinaciones está dentro de la experiencia en la técnica. Los intervalos de dosificación para la administración de las composiciones son aquellos lo suficientemente grandes para producir el deseado efecto anti-hipertrófico en el trastorno. La dosificación no debe ser tan grande como para causar efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas, y similares. Generalmente, la dosificación variará con la edad, condición, sexo y extensión de la enfermedad en el paciente, la vía de administración, o si otros fármacos se incluyen en el régimen, y puede ser determinada por un experto en la técnica. La dosificación puede ser ajustada por el médico individual en caso de cualquier contraindicación. La dosis puede variar, y puede ser administrada en una o más administraciones de dosis diarias, durante uno o varios días. Se pueden encontrar orientaciones en la bibliografía para las dosificaciones apropiadas para las clases dadas de productos farmacéuticos.
El siguiente ejemplo sirve meramente para ilustrar la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1. Pitx2 y regeneración muscular
En base a los resultados mostrados en las figuras, y teniendo en cuenta que, interesantemente, la expresión de Pitx2 está significativamente aumentada durante la regeneración muscular en ratón y disminuida en el modelo murino de Distrofia muscular de Duchenne (ratones DMDmdx), llevamos a cabo un aproximación experimental de trasplante de células "in vivo" para testar si Pitx2 podía mejorar la capacidad regenerativa de las células satélite aisladas de músculos distróficos. Es importante señalar que la posibilidad de modificar la capacidad regenerativa de las propias células distróficas supone una ventaja significativa para su aplicación terapéutica en humanos (posibilidad de utilizar las células del paciente distrófico). Los resultados obtenidos permiten poner de manifiesto que la sobreexpresion Pitx2 mejora la regeneración muscular llevada a cabo por las células satélite distróficas aumentando la regeneración muscular en ratones MDX. Así, nuestros resultados demuestran que el trasplante de células satélite distróficas sobreexpresando Pitx2 en ratones DMDmdx conduce a:
- Un aumento en el número de miofibras formadas "de novo" (Figura 4A);
- Reprime la expresión de miR- 31 produciendo una restauración de la distrofina (Figura 4B)
- Produciendo finalmente una mejora funcional del músculo muy significativa (Figura 4C).
Por lo tanto, estos análisis nos llevan a identificar a miR- 31 como un miRNA regulado por Pitx2 durante la regeneración muscular . Además , también hemos obtenido evidencias adicionales que muestra que la vía de Pitx2-miRNAs controlando la proliferación celular está también presente en nuestro modelo de trasplante celular "in vivo" en ratones DMDmdx (Figuras 4D-F). En conjunto, estos resultados colocan a Pitx2 como molécula reguladora de diferentes miRNAs que desempeñan un papel fundamental en los circuitos moleculares que controlan la proliferación y/o diferenciación de las células satélite. Revelando el importante papel de Pitx2 en la biología celular de las células satélite del músculo esquelético e identificando funciones desconocidas de Pitx2 modulando la miogénesis regenerativa en el músculo distrófico.
Ejemplo 2. Exposición detallada de los resultados de la invención.
En primer lugar, tal y como se muestra en la figura 2, apartados A) y B), la transfección con el vector lentiviral bicistrónico LVX-Pitx2c-ZSGreen resultó en la sobreexpresion de Pitx2 en células satélite de ratón. Adicionalmente, esta sobreexpresion, ver figura 2 apartado C), resultó en una expresión disminuida de los miRNAs: miR-15b, miR-106b, miR-23b y miR-503 (qRT- PCR), tanto en las células en estadios tempranos de activavión (EPq) como en estadios más avanzados de activación (EPa) (qRT-PCR).
Por otro lado, tal y como se muestra en la figura 2 D), la transfección con el vector lentiviral bicistrónico LVX-Pitx2c-ZSGreen conduce a una disminución de la expresión de los genes de control de ciclo celular ciclina D1 y ciclina D2 (qRT-PCR) indicando que, de forma similar a lo que ocurre en mioblastos, la via Pitx2-miRNAs controla proliferación en células satélite.
En segundo lugar, tal y como se ilustra en la figura 3 A), la expresión de Myf5 (qRT-PCR) aumenta en las células satélite que sobreexpresan Pitx2, es más, la cuantificación por inmunohistoquímica, ver figura 3 apartado B), muestra un aumento significativo de las células Myf5+. Por otro lado, de acuerdo a la figura 3 apartado C), la sobreexpresión del miR-106b conduce a una disminución de la expresión de Myf5 validándolo como target de este miRNA. Más aún, la actividad normalizada de la luciferasa del 3'-UTR Myf5 luciferasa repórter (WT Myf5 3'-UTR) con el plásmido vacío (Vector) o co-transfectando con pre-miR-106b muestra la pérdida de la actividad luciferasa indicando una represión de la expresión de Myf5 por miR- 106b demostrando, por tanto, que Myf5 es un target directo para el miR-106b. No hay pérdida de la actividad luciferasa cuando la miR-106b "seed sequence" fue mutada, demostrando así la especificidad de unión del miR-106b a estas "seed sequence" del 3'UTR de Myf5 (ver figura 3 apartado D))
En tercer lugar, tal y como se muestra en la figura 4 apartado A), el análisis mediante qRT- PCR muestra la sobreexpresión de Pitx2c en los músculos de ratones MDX inyectados con células satélite distroficas transfectadas con el vector lentiviral LVX- Pitx2c-ZS-Green vector en comparación con los músculo inyectados con células transfectadas con el lentivirus vacío (LVX- ZS-Green vector); porcentaje de fibras formadas "de novo" (ZS-Green + cells) en los músculos trasplantados después de 15 días e imagen representativa. Por otro lado, la figura 4 apartado B), muestra como la disminución de la expresión de miR-31 en los músculos trasplantados con células que sobre-expresan Pitx2 conduce a un aumento en los niveles de expresión de distrofina así como a un aumento significativo de las fibras que expresan distrofina. Adicionalmente, los autores de la presente invención llevaron a cabo un Treadmill test, ver figura 4 apartado C), donde se muestra la mejora funcional de ratones DMDmdx injectados con células que sobreexpresan Pitx2. Por último, la figura 4 apartado F, muestra como los niveles de expresión de las ciclinas D1 y D2 así como del factor de transcripción Myf5 estaban aumentados en los músculos trasplantados con células que sobreexpresan Pitx2 indicando que la cascada molecular Pitx2-miRNAS está conservada en el sistema de trasplante "¡n vivo". Ejemplo 3. La regulación por disminución de m¡R-106b in vivo mediada por inyección de compuesto anti-m¡R106b mejora el proceso de regeneración miogénica en ratones DMDmdx.
Los ejemplos anteriores han mostrado que m¡R-106b selecciona como target el 3'UTR de mRNA de Myf5 así como que la regulación por disminución de miR-106b en células satélite recién aisladas conduce al aumento de la población de células Myf5+. Además, se ha detectado mediante análisis in situ de LNA que miR-106b desempeña un patrón de expresión tisular compatible con la expresión marcada en células satélite (Figura 5). Estos resultados revelaron un papel para miR-106b que fomenta poblaciones de células satélite más óptimas para compromiso miogénico y sugieren que miR-106b desempeña un papel importante en la regulación de la activación y diferenciación de células satélite durante la regeneración muscular. Por tanto, para explorar adicionalmente estos hallazgos, se decidió en primer lugar analizar su perfil de expresión (el perfil de expresión de miR-106b) durante el proceso de regeneración muscular en ratones. Los resultados muestran claramente que miR-106b se regula por disminución durante el intervalo temporal comprendido entre los días 3 y 7 tras la inyección de cardiotoxina (Figura 6). Curiosamente, en el día 3 desde la inyección de compuesto anti-miR-106b se encontró una clara regulación por incremento de Myf5, MyoD y miogenina respaldando la noción de que se requiere regulación por disminución de miR-106b para una diferenciación miogénica apropiada durante el proceso de regeneración muscular (Figura 6).
Ejemplo 4. La regulación por disminución de m¡R-106b in vivo mediada por inyección de compuesto anti-m¡R106b mejora el proceso de regeneración miogénica en ratones DMDmdx.
Para explorar adicionalmente el papel de miR-106b durante la reparación muscular, se investigó si la expresión miR-106b se alteraba en un contexto en el que la regeneración muscular no se completa satisfactoriamente, tal como en DMD. En este sentido, se demostró que la expresión de miR-106b aumenta claramente en los músculos de ratones MDX, un modelo animal ampliamente usado para DMD humana (Figura 7).
En resumen, se observó que la expresión de miR-106b disminuye durante la regeneración muscular pero aumenta cuando la regeneración muscular no es satisfactoria. Por tanto, a continuación se consideró si disminuyendo la expresión de miR-106b podía modularse la regeneración muscular en ratones distróficos. Para tratar esta cuestión se desarrolló una estrategia mediante la cual se inyectaron cardiotoxina e inhibidor de miARN hsa-miR-106b-5p (ID:MH 10067; Cat: 4464084, Ambion) en el músculo TA (músculo tibialis anterioris) de ratones MDX de 4 meses de edad (1 ,7 nmol por inyección). Tras la inyección de inhibidor de miRNA, se extirparon los músculos a 1 , 3 y 15 días tras la inyección de compuesto anti-miR-106b para análisis. Los resultados muestran claramente que la inyección de compuesto anti-miR-106b puede disminuir la presencia de miR-106b.
De manera interesante, la disminución de miR-106b coincide con ondas de diferenciación miogénica tal como se observa mediante regulación por incremento de Myf5, MyoD y miogenina lo que indica que niveles disminuidos de miR-106b inducidos mediante inyección de compuesto anti-miR106b pueden fomentar la diferenciación muscular (Figura 8).
También se analizó la nueva formación de miofibras usando anticuerpo e-MyHC y se encontró que el número de miofibras positivas para e-MyHC se potenciaba en músculos tratados con compuesto anti-miR en comparación con el control lo que demuestra que las miofibras recién formadas aumentaron tras la inyección de compuesto anti-miR-106b (Figura 9). Además, análisis histológicos de TA de ratones Dmd mdx/J 15 días tras el tratamiento con compuesto anti-miR-106b muestran claramente un incremento en el porcentaje de fibras con núcleos centralizados (Figura 10). Además, el tratamiento con compuesto anti-miR-106b indujo un desplazamiento en la distribución del tamaño de fibras en regeneración hacia las clases de área superior. En conjunto, estos resultados indican que el potencial regenerativo se potenciaba en células satélite de DMD/mdx tras la inyección de compuesto anti-miR-106b (Figura 10).
Ejemplo 5. Evaluación del rendimiento funcional.
Para evaluar el rendimiento funcional se realizaron Treadmill tests en ratones DMD/mdx inyectados con compuesto anti-miR106b hasta el agotamiento 30 días tras el tratamiento con compuesto anti-miR-106b. Tal como se ilustra en la figura 11 , el tiempo y la distancia de carrera fueron del 50% al 95% superiores, respectivamente, en ratones tratados con compuesto anti-miR-106b con respecto al control, lo que indica que la inyección de compuesto anti-miR-106b fortalece el rendimiento físico.
Tomados en conjunto los resultados revelaron que miR-106b desempeña un papel clave durante el proceso de regeneración muscular en ratones. Además, los datos presentados aquí demostraron que la inyección intramuscular de compuesto anti-miR-106b puede mejorar la capacidad de regeneración en ratones DMD.
Claims
1. Uso de una composición que comprende un compuesto capaz de reducir la expresión del miRNA-106b en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células, para la elaboración de un medicamento para promover la regeneración muscular, donde por células madre satélite de músculo se entiende una célula localizada entre la lamina basal y el sarcolema del músculo esquelético, y marcada por la expresión del factor de transcripción Pax7, procedente de una progenie muscular Pax3/pax7+ de células progenitoras miogénicas embrionarias.
2. El uso según la reivindicación 1 , donde dicho compuesto se selecciona de la lista que consiste en: a. ARN de interferencia (ARNip) del miRNA-106b; b. un oligonucleótido antisentido de RNA del miRNA-106b; y c. el inhibidor de miARN hsa-miR-106b-5p ID:MH10067; Cat: 4464084, o un polinucleótido capaz de inhibir el hsa-miR-106b-5p que presente una secuencia nucleotídica idéntica en al menos el 90%, basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dicha secuencia, a la secuencia nucleotídica ID:MH 10067; Cat: 4464084.
3. El uso según la reivindicación 2, donde dicho compuesto es el inhibidor de miARN hsa- miR-106b-5p ID:MH10067; Cat: 4464084, o un polinucleótido capaz de inhibir el hsa- miR-106b-5p que presente una secuencia nucleotídica idéntica en al menos el 90% basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dicha secuencia, a la secuencia nucleotídica ID:MH 10067; Cat: 4464084.
4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho compuesto está comprendido en un vector o plásmido capaz de transportar o suministrar dicho compuesto a las células madre satélite de músculo.
5. El uso según la reivindicación 4, en el que dicho vector es un vector viral.
6. El uso según la reivindicación 5, donde vector viral es seleccionado de la lista que consiste en vectores adenovirales, lentivirales, retrovirales y adenoasociados.
7. El uso según la reivindicación 1 , donde dicho compuesto se selecciona de la lista que consiste en células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal tratadas,
transformadas, transfectadas o transducidas con un compuesto capaz de reducir la expresión del miRNA-106b seleccionados de la lista que consiste en los compuestos enumerados en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6.
8. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho medicamento se usa para promover la regeneración muscular en el tratamiento de una distrofinopatia.
9. El uso según la reivindicación 8, donde dicha distrofinopatia se selecciona de la lista que consiste en la distrofia muscular de Duchenne y la distrofia muscular de Becker.
10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicha composición se administra intramuscularmente en un sujeto humano.
1 1. El uso según la reivindicación 10, donde dicha composición se administra intramuscularmente en los miembros inferiores de un sujeto humano.
12. El uso según la reivindicación 1 1 , donde dicha composición comprende el compuesto tal y como se define éste en la reivindicación 3.
13. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde dicho sujeto humano padece una distrofinopatia.
14. El uso según la reivindicación 13, donde dicha distrofinopatia se selecciona de la lista que consiste en la distrofia muscular de Duchenne y la distrofia muscular de Becker.
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