ES2714290T3 - Composiciones de salto de exón para el tratamiento de la distrofia muscular - Google Patents

Abstract

Un nucleótido antisentido que tiene la siguiente estructura**Fórmula** en la que**Fórmula** y en la que ^ = la estereoquímica del centro de fósforo no está definida; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCION

Composiciones de salto de exon para el tratamiento de la distrofia muscular

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a compuestos y composiciones antisentido novedosos adecuados para facilitar los saltos de exon en el gen de la distrofina humana. Tambien proporciona metodos para inducir el salto de exon usando las composiciones antisentido novedosas adaptadas para su uso en los metodos de la invencion.

Antecedentes de la invencion

Las tecnologfas antisentido estan siendo desarrolladas usando una gama de estrategias químicas que afectan a la expresion genica a diferentes niveles (transcripcion, corte y empalme, estabilidad, traduccion). Mucha de esta investigacion se ha enfocado en el uso de compuestos antisentido para corregir o compensar los genes anormales o asociados con la enfermedad en un amplio abanico de indicaciones. Las moleculas antisentido son capaces de inhibir la expresion genica con especificidad, y debido a esto, muchos de los esfuerzos de busqueda que conciernen a oligonucleotidos como moduladores de la expresion genica se han enfocado en la inhibicion de la expresion de genes dirigidos o de la funcion de elementos activacion en cis. Los oligonucleotidos antisentido estan normalmente dirigidos contra el ARN, ya sea la cadena sentido (por ejemplo, ARNm), o la cadena menos en el caso de algunas dianas de ARN viral. Para lograr un efecto deseado de la regulacion a la baja del gen espedfico, los oligonucleotidos generalmente promueven el deterioro del ARNm dirigido, bloquean la traduccion del ARNm o bloquean la funcion de elementos de ARN activacion en cis, por lo cual se previene efectivamente la smtesis nueva de la protema diana o la replicacion del ARN viral.

Sin embargo, dichas tecnicas no son utiles cuando el objetivo es para regular al alza la produccion de la protema nativa o compensar mutaciones que inducen la terminacion prematura de la traduccion, tal como mutaciones sin sentido o de cambio de marco. En estos casos, la transcripcion del gen defectuoso no debe ser sometida a degradacion dirigida o inhibicion esterica, por lo que la qrnmica de oligonucleotidos antisentido no debe promover el deterioro del ARNm diana ni el bloqueo de la traduccion.

En una variedad de enfermedades geneticas, los efectos de las mutaciones sobre la expresion eventual de un gen se pueden modular a traves de un proceso de salto de exon dirigido durante el proceso de corte empalme. El proceso de corte y empalme esta dirigido por la compleja maquinaria multi-componente que proporciona uniones exon-intron adyacentes en el pre-ARNm en proximidad cercana y realiza la escision de enlaces fosfodiester en los extremos de los intrones con su posterior reforma entre exones que se empalman juntos. Este proceso complejo y altamente preciso es mediado por motivos de secuencia en el pre-ARNm que son relativamente cortos, segmentos de ARN semiconservados a los cuales se unen varios factores de empalme nuclear que participan en la union de reacciones de empalme. Al cambiar la forma en la que la maquinaria de corte y empalme lee o reconoce los motivos implicados en el procesamiento del pre-ARNm, es posible crear moleculas de ARNm cortado y empalmado diferencialmente. Ahora se ha reconocido que la mayona de los genes humanos son cortados y empalmados alternativamente durante la expresion del gen normal, aunque los mecanismos implicados no han sido identificados. Bennett et al. (Patente US-6.210.892) describe la modulacion antisentido del procesamiento del ARNm celular de tipo silvestre usando analogos de oligonucleotidos antisentido que no inducen la escision mediada por la ARNasa H del ARN diana. Esto resulta util para poder generar ARNm cortados y empalmados alternativamente que carecen de exones espedficos (por ejemplo, como se describe por (Sazani, Kole, et al. 2007) para la generacion de receptores de la superfamilia del TNF solubles que carecen de exones que codifican dominios que se extienden a traves de la membrana.

En los casos donde una protema normalmente funcional se termina prematuramente debido a mutaciones en la misma, un medio para la restauracion de cierta produccion de protema funcional a traves de la tecnologfa antisentido ha demostrado ser posible mediante la intervencion durante los procesos de corte y empalme, y si se pueden eliminar los exones asociados con mutaciones que causan la enfermedad espedficamente de algunos genes, algunas veces se puede producir un producto de protema acortada que tiene propiedades biologicas similares a la protema nativa o tiene suficiente actividad biologica para mejorar la enfermedad causada por mutaciones asociadas con el exon (ver por ejemplo, Sierakowska, Sambade et al. 1996; Wilton, Lloyd et al. 1999; van Deutekom, Bremmer-Bout et al. 2001; Lu, Mann et al. 2003; Aartsma-Rus, Janson et al. 2004). Kole et al. (Patentes US-5.627.274; US-5.916.808; US-5.976.879; y US-5.665.593) divulga metodos para combatir el corte y empalme aberrante usando analogos de oligonucleotidos antisentido modificados que no promueven el deterioro del pre-ARNm dirigido. Bennett et al. (Patente US-6.210.892) describe tambien la modulacion antisentido del procesamiento del ARNm celular de tipo silvestre utilizando analogos de oligonucleotidos antisentido que no inducen escision mediada por la ARNasa H del ARN diana.

El proceso de salto de exon dirigido es probable que sea particularmente util en genes largos donde hay muchos exones e intrones, donde hay redundancia en la constitucion genetica de los exones o donde una protema es capaz de funcionar sin uno o mas exones particulares. Los esfuerzos para redirigir el procesamiento genico para el tratamiento de enfermedades geneticas asociadas con truncamientos causados por mutaciones en varios genes se han enfocado en el uso de oligonucleotidos antisentido que: (1) solapen totalmente o parcialmente con los elementos involucrados en el proceso de corte y empalme; o (2) unan el pre-ARNm en una posicion lo suficientemente cercana al elemento para interrumpir la union y la funcion de los factores de corte y empalme que normalmente podnan mediar una reaccion de empalme particular que se produce en dicho elemento.

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es causada por un defecto en la expresion de la protema distrofina. El gen que codifica la protema contiene 79 exones dispersos en mas de 2 millones de nucleotidos del ADN. Cualquier mutacion exonica que cambia el marco de lectura del exon, o introduce un codon de detencion, o que se caracteriza por la eliminacion de un exon o exones totalmente fuera del marco, o duplicaciones de uno o mas exones, tiene el potencial de alterar la produccion de distrofina funcional, dando como resultado la DMD.

Se ha determinado que una forma menos severa de distrofia muscular, la distrofia muscular de Becker (BMD) se produce cuando una mutacion, normalmente una delecion de uno o mas exones, da como resultado un marco de lectura correcto a lo largo de la transcripcion de la distrofina entera, de tal modo que traduccion del ARNm en la protema no se termina prematuramente. Si la union de los exones en direccion 5' y direccion 3' en el procesamiento de un pre-ARNm de distrofina mutado mantiene el marco de lectura correcto del gen, el resultado es un ARNm que codifica una protema con una eliminacion interna corta que retiene cierta actividad, dando como resultado un fenotipo de Becker.

Durante muchos anos se ha sabido que las deleciones de un exon o exones que no alteran el marco de lectura de una protema distrofina dana lugar a un fenotipo BMD, mientras que una delecion del exon que causa un cambio del marco dara lugar a la DMD (Monaco, Bertelson et al. 1988). En general, las mutaciones de distrofina que incluyen mutaciones puntuales y las deleciones del exon que cambian el marco de lectura y asf interrumpen la traduccion de la protema apropiada tienen como resultado la DMD. Cabe senalar que algunos pacientes con BMD y DMD tienen deleciones de exon que abarca multiples exones.

La modulacion del corte y empalme del pre-ARNm de la distrofina mutante con oligorribonucleotidos antisentido se descrito tanto in vitro como in vivo (ver por ejemplo, Matsuo, Masumura et al. 1991; Takeshima, Nishio et al. 1995; Pramono, Takeshima et al. 1996; Dunckley, Eperon et al. 1997; Dunckley, Manoharan et al. 1998; Errington, Mann et al. 2003).

El primer ejemplo de salto de exon espedfico y reproducible en el modelo de raton mdx fue descrito por Wilton et al. (Wilton, Lloyd et al. 1999). Dirigiendo una molecula antisentido al sitio de corte y empalme del donante, se indujo el salto del exon 23 sistematico y eficiente en el ARNm de la distrofina 6 horas despues del tratamiento de las celulas cultivadas. Wilton et al. tambien describen el direccionamiento a la region aceptora del pre-ARNm de la distrofina de raton con oligonucleotidos antisentido mas largos. Mientras que el primer oligonucleotido antisentido dirigido al sitio de corte y empalme del donante en el intron 23 indujo el salto de exon sistematico reducido en mioblastos cultivados primarios, se vio que este compuesto es mucho menos eficiente en cultivos de celulas inmortalizadas que expresan altos niveles de distrofina. Sin embargo, con una direccionamiento refinado y diseno de oligonucleotidos antisentido, la eficiencia de eliminacion del exon espedfico se incremento en casi un orden de magnitud (Mann, Honeyman et al.

2002).

Estudios recientes han comenzado a abordar el desafm de lograr la expresion sostenida de distrofina acompanada por efectos adversos mmimos en los tejidos afectados por la ausencia de distrofina. La inyeccion intramuscular de un oligonucleotido antisentido dirigido al exon 51 (PR0051) en el musculo tibial anterior en cuatro pacientes con DMD tuvo como resultado saltos espedficos del exon 51 sin efectos adversos clmicamente aparentes (Mann, Honeyman et al. 2002; van Deutekom, Janson et al. 2007). En los estudios dirigidos a la administracion sistemica de un oligomero de morfolino de fosforodiamidato antisentido conjugado a un peptido de penetracion celular (PPMO) dirigido al exon 23 en los ratones mdx dieron lugar a una produccion sostenida y elevada de protema distrofina en los musculos esqueleticos y cardiacos sin toxicidad detectable (Jearawiriyapaisarn, Moulton et al. 2008; Wu, Moulton et al. 2008; Yin, Moulton et al. 2008).

Los recientes ensayos clmicos que prueban la seguridad y eficacia de oligonucleotidos de intercambio de corte y empalme (SSO) para el tratamiento de la DMD se basan en tecnologfa SSO para inducir el corte y empalme alternativo del pre-ARNm por bloqueo esterico del espliceosoma (Cirak et al., 2011; Goemans et al., 2011; Kinali et al., 2009; van Deutekom et al., 2007).

A pesar de estos exitos, sigue existiendo una necesidad de oligomeros antisentido mejorados dirigidos a multiples exones de la distrofina y composiciones de administracion mejoradas y metodos para aplicaciones terapeuticas para la DMD.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona un oligonucleotido antisentido que tiene la siguiente estructura:

en la que

y

en la que A = la estereoquímica del centro de fosforo no esta definida; o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende el oligonucleotido antisentido de acuerdo con la presente invencion y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne.

El oligomero antisentido esta unido químicamente a una molecula de polietilenglicol.

La invencion proporciona un oligomero antisentido, en el que el oligomero tiene la siguiente estructura:

H53A (+36+60).

En la presente memoria se divulgan ademas oligomeras antisentido que tienen las siguientes estructuras:

H53A (+30+57),

H53A (+30+56), y

H53A (+30+55).

De acuerdo con un aspecto, la invencion proporciona una molecula antisentido capaz de unirse a una diana seleccionada en el pre-ARNm de la distrofina humana para inducir el salto de exon.

La presente divulgacion incluye secuencias antisentido dirigidas al exon 53, identificadas a continuacion.

H53A(+36+60): 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (SEQ ID NO:1).

El oligomero antisentido hibrida espedficamente con el sitio de hibridacion H53A (+36+60), y tiene la secuencia: SEQ ID NO: 1.

El oligonucleotido antisentido de acuerdo con la presente invencion esta unido químicamente a un resto de polietilenglicol.

En otro aspecto, la invencion proporciona composiciones farmaceuticas que incluyen los oligonucleotidos antisentido de acuerdo con la presente invencion, y una solucion salina que incluye un tampon fosfato.

En otro aspecto, la invencion proporciona una molecula antisentido, como se define en la presente memoria para su uso en el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad genetica en la que existe una mutacion en un gen que codifica una protema particular y el efecto de la mutacion puede ser anulado por salto de exon. El tratamiento comprende las etapas de: (a) seleccionar una molecula antisentido de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria; y (b) administrar la molecula a un paciente que necesite tal tratamiento.

En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne.

Estos y otros objetos y caractensticas se entenderan mejor cuando la siguiente descripcion detallada se lea junto con las figuras.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1A muestra una estructura ilustrativa de un oligomero de morfolino con un enlace fosforodiamidato. La Figura 1B muestra un conjugado de un peptido rico en arginina y un oligomero antisentido.

La Figura 1C muestra un conjugado como en la Figura 1B (no de acuerdo con la invencion), en la que los enlaces de la cadena principal contienen uno o mas grupos cargados positivamente.

Las Figuras 1D-G muestran el segmento de subunidad de repeticion de oligonucleotidos de morfolino ilustrativos, designados de D a G.

Las Figuras 2A-2B representan un esquema de reaccion para la preparacion de un conector para la smtesis en fase solida y un soporte solido para la smtesis de oligomeros.

La Figura 3 representa una grafica que muestra las actividades relativas de oligomeros antisentido ilustrativos para la induccion del salto del exon 53 en mioblastos primarios cultivados. El ARN aislado de mioblastos primarios tratados con los oligomeros indicados se sometieron a amplificacion por RT-PCR anidada espedfica del exon 53, seguido por electroforesis en gel y cuantificacion de la intensidad de banda. Los datos se trazan como % de salto de exon por PCR, es decir, la intensidad de la banda del producto con salto de exon en relacion con el producto de PCR de longitud completa.

La Figura 4 representa una grafica que muestra las actividades relativas de oligomeros antisentido ilustrativos para la induccion del salto del exon 53 en celulas de rabdomiosarcoma humanas cultivadas. El ARN aislado de celulas de rabdomiosarcoma tratadas con los oligomeros indicados se sometieron a amplificacion por RT-PCR anidada espedfica del exon 53, seguido por electroforesis en gel y cuantificacion de la intensidad de banda. Los datos se trazan como % de salto de exon por PCR, es decir, la intensidad de la banda del producto con salto de exon en relacion con el producto de PCR de longitud completa.

Las Figuras 5A-B representan graficas que muestran las actividades relativas de oligomeros antisentido ilustrativos para la induccion del salto del exon 53 en mioblastos primarios cultivados. El ARN aislado de mioblastos primarios tratados con los oligomeros indicados se sometieron a amplificacion por RT-PCR anidada espedfica del exon 53, seguido por electroforesis en gel y cuantificacion de la intensidad de banda. Los datos se trazan como % de salto de exon por PCR, es decir, la intensidad de la banda del producto con salto de exon en relacion con el producto de PCR de longitud completa.

Descripcion detallada de la invencion

Las realizaciones de la presente invencion se refieren generalmente a compuestos antisentido mejorados y metodos de uso de los mismos, que estan disenados espedficamente para inducir el salto de exon en el gen de la distrofina humana. La distrofina juega un papel vital en la funcion muscular, y varias enfermedades relacionadas con el musculo se caracterizan por formas mutantes de este gen. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los compuestos antisentido mejorados descritos en la presente memoria inducen el salto de exon en formas mutadas del gen de la distrofina humana, tales como los genes mutados de la distrofina en la distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la distrofia muscular de Becker (BMD).

Debido a los eventos de corte y empalme aberrante del ARNm causados por mutaciones, estos genes humanos de la distrofina mutados expresan la protema distrofina defectuosa o no expresan ninguna distrofina medible en absoluto, una condicion que conduce a diversas formas de distrofia muscular. Para remediar esta condicion, los compuestos antisentido de la presente invencion hibridan con regiones seleccionadas de un ARN pre-procesado de un gen de la distrofina humana mutada, inducen el salto del exon y el corte y empalme diferencial que de lo contrario dana lugar a un corte y empalme aberrante del ARNm de la distrofina y asf permiten que las celulas musculares produzcan un transcrito de ARNm que codifica una protema distrofina funcional. En algunas realizaciones, la protema distrofina resultante no es necesariamente la forma de “tipo silvestre” de distrofina, sino mas bien una forma de distrofina truncada, incluso funcional o semi-funcional.

Incrementando los niveles de protema distrofina funcional en celulas musculares, estas y realizaciones relacionadas son utiles en la profilaxis y el tratamiento de la distrofia muscular, especialmente aquellas formas de distrofia muscular, como DMD y BMD, que se caracterizan por la expresion de protemas distrofina defectuosas debido al corte y empalme aberrante de ARNm. Los oligomeros espedficos descritos en la presente memoria proporcionan el direccionamiento espedfico al exon de la distrofina respecto a otros oligomeros en uso y ofrecen de este modo ventajas significativas y practicas sobre metodos alternativos de tratamiento de formas relevantes de distrofia muscular.

El oligomero antisentido divulgado en la presente memoria tiene el listado de secuencias de la SEQ ID NO: 1, que se detalla a continuacion:

H53A(+36+60): 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (SEQ ID NO: 1).

A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente memoria tienen el mismo significado al comunmente entendido por un experto en la materia a la cual pertenece esta invencion. Aunque cualquiera de los metodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aqrn se pueden usar en la practica o prueba de la presente invencion, ahora se describen los metodos y materiales preferidos. Para los propositos de la presente invencion, los siguientes terminos se definen a continuacion.

I. Definiciones

Por “aproximadamente” se entiende una cantidad, nivel, valor, numero, frecuencia, porcentaje, dimension, tamano, cantidad, peso o longitud que vana tanto como 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % respecto a una cantidad, nivel, valor, numero, frecuencia, porcentaje, dimension, tamano, cantidad, peso o longitud de referencia.

Los terminos “complementario” y “complementariedad” se refieren a polinucleotidos (es decir, una secuencia de nucleotidos) relacionados por las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia “T-G-A (5'-3'), es complementaria de la secuencia “T-C-A (5'-3')”. La complementariedad puede ser “parcial”, en la que solo algunas de las bases de los acidos nucleicos se combinan de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases. O, puede ser complementariedad “completa” o “total” entre los acidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de acido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficiencia y la fuerza de la hibridacion entre las cadenas de acido nucleico. Aunque frecuentemente se desea la complementariedad perfecta, algunas realizaciones pueden incluir uno o mas pero preferiblemente 6, 5, 4, 3, 2 o 1 errores de apareamiento con respecto al ARN diana. Se incluyen las variaciones en cualquier ubicacion dentro del oligomero. En ciertas realizaciones, las variaciones en la secuencia cerca del extremo de un oligomero son generalmente preferibles a las variaciones en el interior, y si estan presentes habitualmente estan dentro de aproximadamente 6, 5, 4, 3, 2 o 1 nucleotidos del extremo 5' y/o 3'.

Las expresiones “peptido de penetracion celular” y “CPP” se usan indistintamente y se refieren a peptidos de penetracion celular cationicos, tambien llamados peptidos de transporte, peptidos vehfculo, o dominios de transduccion de peptido. Los peptidos, como se muestra en la presente memoria, tienen la capacidad de inducir la penetracion celular en el 100 % de las celulas de una poblacion de cultivo celular dada y permiten la translocacion macromolecular dentro de multiples tejidos in vivo tras la administracion sistemica. Una realizacion preferida de CPP es un peptido rico en arginina, como se describe ademas posteriormente.

Las expresiones “oligomero antisentido” y “compuesto antisentido” y “oligonucleotido antisentido” se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de subunidades dclicas, llevando cada una un radical de apareamiento de bases, unido por enlaces inter-subunidad que permiten a los radicales de apareamiento de bases hibridarse con la secuencia diana en un acido nucleico (generalmente un ARN) mediante el apareamiento de bases de Watson-Crick, para formar un heteroduplex acido nucleico: oligomero dentro de la secuencia diana. Las subunidades dclicas estan compuestas de ribosa u otra azucar pentosa o, en una realizacion preferida, un grupo morfolino (vease la descripcion de oligomeros de morfolino posterior). El oligomero puede tener complementariedad de secuencia exacta o similar a la secuencia diana; las variaciones en la secuencia cercanas al extremo de un oligomero son generalmente preferibles a las variaciones en el interior.

Dicho oligomero antisentido puede disenarse para bloquear o inhibir la traduccion del ARNm o para inhibir el procesamiento de corte y empalme del pre-ARNm natural, y puede decirse que es “dirigido a” o “dirigido contra” una secuencia diana con la que fubrida. La secuencia diana es normalmente una region que incluye un codon de inicio AUG de un ARNm, un oligomero de supresion de traduccion, o un sitio de corte y empalme de un ARNm preprocesado, un oligomero de supresion de corte y empalme (SSO). La secuencia diana para un sitio de corte y empalme puede incluir una secuencia de ARNm que tiene su extremo 5' de 1 a 25 pares de bases en direccion 3' de una union de aceptador de corte y empalme normal en un ARNm pre-procesado. Una secuencia diana preferida es cualquier region de un ARNm pre-procesado que incluye un sitio de corte y empalme o que esta contenida totalmente dentro de una secuencia de codificacion de exon o abarca un aceptador de corte y empalme o sitio donador. Generalmente se dice que un oligomero esta “dirigido contra” una diana biologicamente relevante, tal como una protema, virus o bacterias, cuando esta dirigido contra el acido nucleico de la diana de la manera descrita anteriormente.

Los terminos “oligomero de morfolino” o “PMO” (oligomero de fosforamidato o fosforodiamidato morfolino) se refieren a un analogo de oligonucleotido compuesto de estructuras de subunidad de morfolino, donde (i) las estructuras estan unidas entre sf por enlaces que contienen fosforo, de uno a tres atomos de longitud, preferiblemente dos atomos de longitud, y preferiblemente son sin carga o cationicos, que unen el nitrogeno del morfolino de una subunidad a un carbono 5' exodclico de una subunidad adyacente, y (ii) cada anillo morfolino lleva un radical de apareamiento de bases de purina o pirimidina efectivo para unirse, mediante un enlace de hidrogeno especifico de la base, a una base en un polinucleotido. Vease, por ejemplo, la estructura en la Fórmula I, que muestra un tipo de enlace fosforodiamidato preferido. La expresion “estructura del anillo morfolino” puede usarse indistintamente con la expresion “subunidad de morfolino”. El nitrogeno colgante unido al fosforo esta disustituido con metilo. El radical de apareamiento de bases purina o pirimidina es habitualmente adenina, citosina, guanina o timina. La smtesis, estructuras y caractensticas de union de los oligomeros de morfolino se detallan en las Patentes de los Estados Unidos numeros. 5.698.685, 5.217.866, 5.142.047, 5.034.506, 5.166.315, 5.521.063, 5.506.337, 8.076.476, 8.299.206 y 7.943.762 (enlaces cationicos). Los enlaces modificados de la inter-subunidad y los grupos terminales estan detallados en la solicitud PCT US2011/038459 y en la publicacion WO/2011/150408.

Una “subunidad del aminoacido” o “resto aminoacido” puede referirse a un resto de a-aminoacido (-CO-CHR-NH-) o un resto p u otro aminoacido (por ejemplo, -CO-(CH2)ⁿCHR-NH-), donde R es una cadena lateral (que puede incluir hidrogeno) y n es de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4.

La expresion “aminoacidos naturales” se refiere a un aminoacido presente en protemas que se encuentran en la naturaleza. El termino “aminoacidos no naturales” se refiere a aquellos aminoacidos que no esta presentes en protemas que se encuentran en la naturaleza, ejemplos de los cuales incluyen beta-alanina (p-Ala), acido 6-aminohexanoico (Ahx) y acido 6-aminopentanoico

Un “exon” se refiere a una seccion definida de acido nucleico que codifica una protema o una secuencia de acido nucleico que esta representada en la forma madura de una molecula de ARN despues de haber eliminado por corte y empalme porciones de un ARN previamente procesado (o precursor). La molecula madura de ARN puede ser un ARN mensajero (ARNm) o una forma funcional de un ARN no codificante, tal como ARNr o ARNt. El gen de la distrofina humana tiene aproximadamente 79 exones.

Un “intron” se refiere a una region de acido nucleico (dentro de un gen) que no se traduce en una protema. Un intron es una seccion no codificante que se transcribe en un precursor de ARNm (pre-ARNm) y que posteriormente se elimina por corte y empalme durante la formacion del ARN maduro.

Una “cantidad efectiva” o “cantidad terapeuticamente efectiva” se refiere a una cantidad de compuesto terapeutico, como un oligomero antisentido, administrado a un sujeto mairnfero, como una dosis unica o como parte de una serie de dosis, que es eficaz para producir un efecto terapeutico deseado. Para un oligomero antisentido, este efecto normalmente se consigue mediante la inhibicion de la traduccion o del procesamiento de corte y empalme natural de una secuencia diana seleccionada.

“Salto de exon” se refiere generalmente al proceso por el cual un exon entero o una parte del mismo, se elimina de un determinado ARN previamente procesado y de este modo se excluye su presencia en el ARN maduro, tal como el ARNm maduro que se traduce en una protema. Por lo tanto, la porcion de la protema que de lo contrario es codificada por el exon saltado no esta presente en la forma expresada de la protema, normalmente creando una forma alterada, aunque todavfa funcional, de la protema. En algunas realizaciones, el exon que se salta es un exon aberrante del gen de la distrofina humana, que puede contener una mutacion u otra alteracion en su secuencia que de lo contrario causana un corte y empalme aberrante. En algunas realizaciones, el exon que se salta es uno o mas de los exones 1-79 del gen de la distrofina, aunque el exon 53 del gen de la distrofina humana es el preferido.

La “distrofina” es una protema citoplasmatica en forma de barra y una parte vital del complejo proteico que conecta el citoesqueleto de una fibra muscular a la matriz extracelular circundante a traves de la membrana celular. La distrofina contiene varios dominios funcionales. Por ejemplo, la distrofina contiene un dominio de union de actina aproximadamente en los aminoacidos 14-240 y un dominio de barra central aproximadamente en los aminoacidos 253-3040. Este dominio central grande esta formado por 24 elementos triple helice de tipo espectrina de aproximadamente 109 aminoacidos, que tienen homologfa con la alfa-actinina y la espectrina. Las repeticiones por lo general estan interrumpidas por cuatro segmentos de no repeticion, ricos en prolina, tambien conocidos como regiones bisagra. Las repeticiones 15 y 16 estan separadas por un tramo de 18 aminoacidos que parece proporcionar un sitio principal para la escision proteolftica de la distrofina. La identidad de secuencia entre la mayona de las repeticiones vana entre 10-25 %. Una repeticion contiene tres helices alfa: 1, 2 y 3. Las helices alfa 1 y 3 estan formadas cada una por 7 vueltas de helice, interactuando probablemente como una bobina en espiral a traves de una interfaz hidrofoba. La helice alfa 2 tiene una estructura mas compleja y esta formada por segmentos de cuatro y tres vueltas de helice, separadas por un resto de glicina o prolina. Cada repeticion esta codificada por dos exones, normalmente interrumpidos por un intron entre los aminoacidos 47 y 48 en la primera parte de la helice alfa 2. El otro intron se encuentra en diferentes posiciones en la repeticion, generalmente dispersado en la helice 3. La distrofina contiene tambien un dominio rico en cistema aproximadamente en los aminoacidos 3080-3360), incluyendo un segmento rico en cistema (es decir, 15 cistemas en 280 aminoacidos) que muestra homologfa con el dominio C-terminal de la alfa-actinina del moho del fango (Dictyostelium discoideum). El dominio carboxi-terminal se situa aproximadamente en los aminoacidos 3361-3685.

El amino terminal de la distrofina se une a la F-actina y el carboxi terminal se une al complejo proteico asociado con distrofina (DAPC) en el sarcolema. El DAPC incluye distroglicanos, sarcoglicanos, integrinas y caveolina, y las mutaciones en cualquiera de estos componentes causan distrofias musculares heredadas de forma autosomica. El DAPC se desestabiliza cuando la distrofina esta ausente, lo que se traduce en niveles disminuidos de las protemas componentes y a su vez conduce al dano progresivo de la fibra y fuga de la membrana. En varias formas de distrofia muscular como la distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la distrofia muscular de Becker (BMD), las celulas musculares producen una forma alterada y funcionalmente defectuosa de distrofina, o ninguna distrofina, principalmente debido a las mutaciones en la secuencia del gen lo que conduce a un corte y empalme incorrecto. La expresion predominante de la protema distrofina defectuosa, o la falta completa de distrofina o una protema tipo distrofina, conduce a una progresion rapida de la degeneracion muscular, como se senalo anteriormente. En este sentido, una protema distrofina “defectuosa” puede caracterizarse por las formas de distrofina que se producen en ciertos sujetos con DMD o BMD, como se conoce en la tecnica, o por la ausencia de distrofina detectable.

Como se utiliza en la presente memoria, los terminos “funcion” y “funcional” y similares se refieren a una funcion biologica, enzimatica o terapeutica.

Una protema distrofina “funcional” se refiere generalmente a una protema distrofina con suficiente actividad biologica para reducir la degradacion progresiva del tejido muscular que es otra caractenstica de la distrofia muscular, por lo general en comparacion con la forma alterada o “defectuosa” de la protema distrofina que esta presente en ciertos sujetos con DMD o BMD. En algunas realizaciones, una protema distrofina funcional puede tener aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % (incluyendo todos los numeros enteros entre estos) de la actividad biologica in vitro o in vivo de distrofina de tipo silvestre, medido segun tecnicas de rutina en la tecnica. Por ejemplo, la actividad relacionada con la distrofina en cultivos musculares in vitro pueden medirse segun el tamano de los miotubos, la organizacion (o desorganizacion) de las miofibrillas, la actividad contractil y el agrupamiento espontaneo de receptores de acetilcolina (vease, por ejemplo, Brown et al., Journal of Cell Science.

112:209-216, 1999). Los modelos animales tambien son recursos valiosos para el estudio de la patogenia de la enfermedad y proporcionan un medio para probar actividades relacionadas con la distrofina. Dos de los modelos animales mas utilizados para la investigacion de la DMD son el raton mdx y la distrofia muscular en Golden retriever (GRMD), que son negativos para distrofina (vease, por ejemplo, Collins & Morgan, Int J Exp Pathol 84 165-172, 2003). Estos y otros modelos animales pueden utilizarse para medir la actividad funcional de diversas protemas distrofina. Se incluyen las formas truncadas de distrofina, como aquellas formas que son producidas por algunos de los compuestos antisentido de salto del exon de la presente Invencion.

Se entiende por “aislado” el material que substancialmente o esencialmente esta exento de componentes que normalmente lo acompanan en su estado nativo. Por ejemplo, un “polinucleotido aislado” como se usa en la presente memoria, puede referirse a un polinucleotido que ha sido purificado o eliminado de las secuencias que lo flanquean en estado natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que ha sido eliminado de las secuencias que estan normalmente adyacentes al fragmento.

Como se utiliza en la presente memoria, “longitud suficiente” se refiere a un oligonucleotido antisentido que es complementario a por lo menos 8, mas normalmente 8-30, nucleobases contiguas un pre-ARNm de distrofina diana.

Por “mejora” o “que mejora”, o “aumento” o “que aumenta”, o “estimula” o “que estimula”, se refiere generalmente a la capacidad de uno o mas compuestos o composiciones antisentido para producir o causar una mayor respuesta fisiologica (es decir, efectos aguas abajo) en una celula o un sujeto, en comparacion con la respuesta causada por un compuesto no antisentido o un compuesto control. Una respuesta fisiologica medible puede incluir aumento de la expresion de una forma funcional de una protema distrofina, o mayor actividad biologica relacionada con la distrofina en el tejido muscular, entre otras respuestas aparentes del conocimiento de la tecnica y la descripcion en el presente memoria. El aumento de la funcion muscular puede tambien medirse, incluyendo los aumentos o mejoras en la funcion muscular en aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %. El porcentaje de fibras musculares que expresan una distrofina funcional tambien puede ser medido, incluyendo la expresion de distrofina aumentada en aproximadamente 1 %, 2 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de las fibras musculares. Por ejemplo, se ha demostrado que aproximadamente el 40 % de mejora de la fundon muscular puede ocurrir si el 25-30 % de fibras expresan distrofina (vease, por ejemplo, DelloRusso et al, Proc Natl Acad Sci USA 99: 12979-12984, 2002). Una cantidad “incrementada” o “aumentada” es normalmente una cantidad “estadfsticamente significativa” y pueden incluir un aumento que es de 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o mas veces (por ejemplo, 500, 1.000 veces) (incluyendo todos los numeros enteros y puntos decimales entre estos y por encima de 1), por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) la cantidad producida por un compuesto no antisentido (la ausencia de un agente) o un compuesto control.

El termino “reduce” o “inhibe” puede referirse generalmente a la capacidad de uno o mas compuestos antisentido de la invencion PARA “disminuir” una respuesta celular o fisiologica relevante, como un smtoma de una enfermedad o afeccion descritas en la presente memoria, medido de acuerdo con las tecnicas habituales en la tecnica de diagnostico. Respuestas fisiologicas o celulares relevantes (in vivo o in vitro) seran evidentes los expertos en la materia y pueden incluir reducciones en los smtomas de la patologfa de distrofia muscular o reduccion en la expresion de las formas defectuosas de distrofina, como las formas alteradas de distrofina que se expresan en personas con DMD o BMD. Una “disminucion” en una respuesta puede ser estadfsticamente significativa en comparacion con la respuesta producida por un compuesto no antisentido o una composicion de control y puede incluir un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % , 95 % o 100 % de disminucion, incluyendo todos los numeros enteros entre estos.

“Tratamiento” de un individuo (por ejemplo, un mairnfero, tal como un ser humano) o una celula es cualquier tipo de intervencion utilizada en un intento de alterar el curso natural del individuo o celula. El tratamiento incluye, pero no se limita a, la administracion de una composicion farmaceutica, y puede ser realizado profilacticamente o posterior a la iniciacion de un evento patologico o contacto con un agente etiologico. El tratamiento incluye cualquier efecto deseable sobre los smtomas o patologfa de una enfermedad o afeccion asociadas con la protema distrofina, como en ciertas formas de distrofia muscular, y puede incluir, por ejemplo, cambios o mejoras mmimos en uno o mas marcadores medibles de la enfermedad o afeccion a tratar. Tambien se incluyen tratamientos “profilacticos”, que pueden ser dirigidos a la reduccion de la velocidad de progresion de la enfermedad o afeccion a tratar, retrasar el comienzo de esa enfermedad o afeccion, o reducir la severidad de su comienzo. “Tratamiento” o “profilaxis” no indica necesariamente la erradicacion completa, cura, o prevencion de la enfermedad o condicion, o sus smtomas asociados.

Un “sujeto”, como se usa en la presente memoria, incluye cualquier animal que exhibe un smtoma, o esta en riesgo de exhibir un smtoma, que puede ser tratado con un compuesto antisentido de la invencion, tal como un sujeto que tiene o esta en riesgo de tener DMD o BMD, o cualquiera de los smtomas asociados con estas afecciones (por ejemplo, perdida de fibra muscular). Los sujetos adecuados (pacientes) incluyen animales de laboratorio (por ejemplo, raton, rata, conejo o cobaya), animales de granja y animales domesticos o mascotas (tal como un gato o un perro). Los primates no humanos y, preferiblemente, los pacientes humanos, estan incluidos.

“Alquilo” o “alquileno” se refieren a un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificada saturado que contiene de 1 a 18 carbonos. Los ejemplos incluyen sin limitacion, metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, terc-butilo, npentilo y n-hexilo. La expresion “alquilo inferior” se refiere a un grupo alquilo, como se define en la presente memoria, que contiene entre 1 y 8 carbonos.

“Alquenilo” se refiere a un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificada insaturado que contiene de 2 a 18 carbonos y que comprende al menos un enlace doble de carbono-carbono. Los ejemplos incluyen sin limitacion etenilo, propenilo, iso-propenilo, butenilo, iso-butenilo, terc-butenilo, n-pentenilo y n-hexenilo. La expresion “alquenilo inferior” se refiere a un grupo alquenilo, como se define en la presente memoria, que contiene entre 2 y 8 carbonos. “Alquinilo” se refiere a un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificada insaturado que contiene de 2 a 18 carbonos que comprende al menos un enlace triple carbono-carbono. Los ejemplos incluyen sin limitacion etinilo, propinilo, iso-propinilo, butinilo, iso-butinilo, terc-butinilo, pentinilo y hexinilo. La expresion “alquinilo inferior” se refiere a un grupo alquinilo, como se define en la presente memoria, que contiene entre 2 y 8 carbonos.

“Cicloalquilo” se refiere a un radical alquilo mono o poli-dclico. Los ejemplos incluyen sin limitacion ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo.

“Arilo” se refiere a un radical hidrocarburo aromatico dclico que contiene 18 carbonos que tienen uno o mas anillos cerrados. Los ejemplos incluyen sin limitacion fenilo, bencilo, naftilo, antracenilo, fenantracenilo y bifenilo.

“Aralquilo” se refiere a un radical de la formula RaRb donde Ra es una cadena de alquileno segun lo definido anteriormente y Rb es uno o mas radicales arilo segun lo definido anteriormente, por ejemplo, bencilo, difenilmetilo y similares.

“Tioalcoxi” se refiere a un radical de formula -SRc donde Rc es un radical alquilo tal como se define en la presente memoria. El termino “tioalcoxi inferior” se refiere a un grupo alcoxi, tal como se define en la presente memoria, que contiene entre 1 y 8 carbonos.

“Alcoxi” se refiere a un radical de formula -ORda donde Rd es un radical alquilo tal como se define en la presente memoria. La expresion “alcoxi inferior” se refiere a un grupo alcoxi, tal como se define en la presente memoria, que contiene entre 1 y 8 carbonos. Los ejemplos de grupos alcoxi incluyen, sin limitacion, metoxi y etoxi.

“Alcoxialquilo” se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo alcoxi.

“Carbonilo” se refiere al radical C(=O)-.

“Guanidinilo” se refiere al radical H2N(C=NH2)-NH-.

“Amidinilo” se refiere al radical H2N(C=NH2)CH-.

“Amino” se refiere al radical NH2.

“Alquilamino” se refiere a un radical de la formula -NHRd o -NRdRd donde cada Rd es, independientemente, un radical alquilo tal como se define en la presente memoria. La expresion “alquilamino inferior” se refiere a un grupo alquilamino, como se define en la presente memoria, que contiene entre 1 y 8 carbonos.

“Heterociclo” significa un anillo heterodclico, monodclico de 5 a 7 miembros o bidclico de 7 a 10 miembros que es saturado, insaturado o aromatico, y que contiene de 1 a 4 heteroatomos seleccionados independientemente de nitrogeno, oxfgeno y azufre y en el que los heteroatomos de nitrogeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, y el heteroatomo de nitrogeno pueden estar opcionalmente cuaternizado, incluyendo anillos bidclicos en los cuales cualquiera de los heterociclos anteriores estan fusionados con un anillo de benceno. El heterociclo puede estar a traves de cualquier heteroatomo o atomo de carbono. Los heterociclos incluyen heteroarilos como se define mas adelante. Asf, ademas de los heteroarilos citados a continuacion, los heterociclos tambien incluyen morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperizinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiopiranilo y similares.

“Heteroarilo” significa un anillo heterociclo aromatico de 5 a 10 miembros y que tiene al menos un heteroatomo seleccionado de nitrogeno, ox^geno y azufre y que contiene al menos 1 atomo de carbono, que incluye sistemas de anillo mono- y bidclicos. Los heteroarilos representativos son piridilo, furilo, benzofuranilo, tiofenilo, benzotiofenilo, quinolinilo, pirrolilo, indolilo, oxazolilo, benzoxazolilo, imidazolilo, benzimidazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, isoxazolilo, pirazolilo, isotiazolilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, cinolinilo, ftalazinilo y quinazolinilo.

Las expresiones “alquilo opcionalmente sustituido”, “alquenilo opcionalmente sustituido”, “alcoxi opcionalmente sustituido”, “tioalcoxi opcionalmente sustituido”, “alquiloamino opcionalmente sustituido”, “alquilo inferior opcionalmente sustituido”, “alquenilo inferior opcionalmente sustituido”, “alcoxi inferior opcionalmente sustituido “, “tioalcoxi inferior opcionalmente sustituido”, “alquilamino inferior opcionalmente sustituido” y “heterociclilo opcionalmente sustituido” significan que, cuando esta sustituido, al menos un atomo de hidrogeno es reemplazado con un sustituyente. En el caso de un sustituyente oxo (=O) se reemplazan dos atomos de hidrogeno. En este sentido, los sustituyentes incluyen: deuterio, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, oxo, halogeno, -CN, -ORx, NRxRy, NRxC(=O)Ry, NRxSO2Ry, -NRxC(=O)NRxRy, C(=O)Rx, C(=O)ORx, C(=O)NRxRy, -SOmRx y -SOmNRxRy, en la que m es 0, 1 o 2, Rx y Ry son iguales o diferentes e independientemente hidrogeno, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido o cicloalquilo opcionalmente sustituido y cada uno de dicho alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido y sustituyentes cicloalquilo opcionalmente sustituidos pueden sustituirse ademas con uno o mas de oxo, halogeno, -CN, -ORx, NRxRy, NRxC(=O)Ry, NRxSO2Ry, -NRxC(=O)NRxRy, C(=O)Rx, C(=O)ORx, C(=O)NRxRy, -SOmRx y -SOmNRxRy.

Un sistema de nomenclatura de molecula antisentido se propuso y se publico para distinguir entre las diferentes moleculas antisentido (vease Mann et al., (2002) J Gen Med 4, 644-654). Esta nomenclatura se convirtio en especialmente relevante a la hora de probar varias moleculas antisentido ligeramente diferentes, todas dirigidas contra la misma region diana, como se muestra posteriormente:

H#A/D(x:y).

La primera letra senala la especie (por ejemplo H: humano, M: murino, C: canino). “#” senala el numero de exon de la distrofina diana. “A/D” indica el sitio de corte y empalme del aceptor o donante al principio y al final del exon, respectivamente, (x y) representan las coordenadas de hibridacion donde “-” o “+” indican secuencias intronicas o exonicas respectivamente. Por ejemplo, A(-6+18) indicana las ultimas 6 bases del intron que precede al exon diana y las primeras 18 bases del exon diana. El sitio de corte y empalme mas cercano sena el aceptador de modo que estas coordenadas inan precedidas de una “A”. La descripcion de las coordenadas de hibridacion en el sitio de corte y empalme del donador podnan ser D(+2-18) donde las 2 ultimas bases exonicas y las 18 primeras bases intronicas corresponden al sitio de hibridacion de la molecula antisentido. Las coordenadas de hibridacion totalmente exonicas estanan representadas por A(+65+85), es decir, el sitio entre el nucleotido 65 y el nucleotido 85 desde el inicio de este exon.

II. Oligonucleotidos antisentido

Cuando la molecula o moleculas antisentido estan dirigidas a secuencias de nucleotidos implicadas en el corte y empalme de los exones dentro de las secuencias del pre-ARNm, el corte y empalme normal del exon se puede inhibir, lo que provoca que la maquinaria de corte y empalme evite el exon dirigido total del ARNm maduro. En muchos genes, la delecion de un exon entero llevana a la produccion de una protema no funcional a traves de la perdida de importantes dominios funcionales o la interrupcion del marco de lectura. En algunas protemas, sin embargo, es posible acortar la protema mediante la delecion de uno o mas exones dentro de la protema, sin alterar el marco de lectura, y sin alterar gravemente la actividad biologica de la protema. Normalmente, dichas protemas tienen una funcion estructural y/o poseen dominios funcionales en sus extremos. La distrofia muscular de Duchenne se debe a mutaciones que impiden la smtesis de un producto del gen de la distrofina funcional, por lo general alterando el marco de lectura. Los oligonucleotidos antisentido que inducen un salto de exon de la region del gen de la distrofina que contiene la mutacion pueden permitir que las celulas musculares produzcan una transcripcion de ARNm maduro que codifica la protema distrofina funcional. La protema distrofina resultante no es necesariamente de la forma “tipo silvestre” de distrofina, sino que es una forma truncada, incluso funcional o semi-funcional de distrofina. La presente invencion describe moleculas antisentido capaces de unirse a las dianas del pre-ARNm de la distrofina especificadas en el exon 53, y redireccionar el procesamiento de este gen.

El oligonucleotido antisentido y el ARN diana son complementarios entre sf cuando un numero suficiente de posiciones correspondientes de cada molecula esta ocupado por nucleotidos que pueden unir hidrogeno entre sf, de tal forma que se produce la union estable y espedfica entre el oligonucleotido y la diana. Asf, “espedficamente hibridizable” y “complementarlo” son terminos que se utilizan para indicar un grado suficiente de complementariedad o apareamiento exacto de tal forma que se produce la union estable y espedfica entre el oligonucleotido y el objetivo. Se sabe en la tecnica que la secuencia de una molecula antisentido no necesita ser 100 % complementaria con la de su secuencia diana para ser espedficamente hibridizable. Una molecula antisentido es espedficamente hibridizable cuando la union del oligonucleotido a la molecula diana interfiere con la funcion normal del ARN diana, y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la union no espedfica del oligonucleotido antisentido a secuencias no diana en las condiciones en las que se desea una union espedfica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de los ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos.

La delecion del exon no debe conducir a un cambio del marco de lectura en el ARNm transcrito acortado. Asf, si en una secuencia lineal de tres exones el extremo del primer exon codifica dos de tres nucleotidos en un codon y el siguiente exon se elimina, entonces el tercer exon en la secuencia lineal debe iniciarse con un nucleotido unico que sea capaz de completar el triplete de nucleotidos para un codon. Si el tercer exon no comienza con un nucleotido unico, se producira un cambio de marco de lectura que podna conducir a la generacion de una protema no funcional o truncada.

Se apreciara que las reordenaciones del codon en el extremo de los exones en protemas estructurales no siempre pueden romperse al final de un codon, por lo tanto puede ser necesario eliminar mas de un exon del pre-ARNm para asegurar la lectura en el marco del ARNm. En dichas circunstancias, puede ser necesario seleccionar una pluralidad de oligonucleotidos antisentido por el metodo de la invencion en el que cada uno se dirige a una region diferente responsable de inducir el corte y empalme de los exones que se eliminaran.

Para evitar la degradacion del pre-ARNm durante la formacion del duplex con las moleculas antisentido, las moleculas antisentido se pueden adaptar para minimizar o prevenir la escision por la ARNasa H endogena. Esta propiedad es muy preferida ya que el tratamiento del ARN con los oligonucleotidos no metilados ya sea intracelularmente o en extractos crudos que contienen ARNasa H conduce a la degradacion del pre-ARNm: duplex de oligonucleotidos antisentido. Un ejemplo de moleculas antisentido que cuando forman duplex con el ARN no son escindidas por la ARNasa H celular son los derivados de 2'-O-metilo. Los oligorribonucleotidos 2'-O-metilo son muy estables en un ambiente celular y en los tejidos animales, y sus duplex con el ARN tienen valores de Tm mas altos que sus contrapartes ribo o dexosirribo. La metilacion de la posicion 2' hidroxirribosa y la incorporacion de una cadena principal de fosfotioato son una estrategia comun para producir moleculas que se asemejan superficialmente al ARN pero que son mucho mas resistentes a la degradacion de la nucleasa.

Las moleculas antisentido que no activan la ARNasa H se pueden preparar de acuerdo con tecnicas conocidas (vease, por ejemplo, Patente US-5.149.797). Dichas moleculas antisentido, que pueden ser secuencias de desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, simplemente contienen cualquier modificacion estructural que dificulta o impide estericamente la union de la ARNasa H a una molecula duplex que contiene el oligonucleotido como su miembro, modificacion estructural que no dificulta substancialmente ni interrumpe la formacion del duplex. Debido a que las porciones del oligonucleotido involucradas en la formacion del duplex son sustancialmente diferentes de aquellas porciones involucradas en la union de la ARNasa H a estas, existen numerosas moleculas antisentido que no activan la ARNasa H. Por ejemplo, dichas moleculas antisentido pueden ser oligonucleotidos en los que al menos uno, o todos, de los restos de fosfato con puente internucleotido son fosfatos modificados, tales como metil fosfonatos, metil fosforotioatos, fosforomorfolatos, fosforopiperazidatos y fosforamidatos. Por ejemplo, cualquiera de uno de los restos de fosfato con puente internucleotido se puede modificar como se describe. En otro ejemplo no limitante, dichas moleculas antisentido son moleculas en las que al menos uno, o todos, de los nucleotidos contienen un radical alquilo inferior 2' (por ejemplo, alquilo saturado o insaturado, lineal o ramificado de C¹-C⁴ , tal como metilo, etilo, etenilo, propilo, 1-propenilo, 2-propenilo e isopropilo). Por ejemplo, cualquiera de los nucleotidos puede ser modificado como se describe.

Los oligonucleotidos pueden incluir tambien modificaciones o sustituciones de nucleobase (referida a menudo en la tecnica simplemente como “base”).

Las bases de purina comprenden un anillo de pirimidina condensado con un anillo de imidazol, como se describe en la formula general:

La adenina y la guanina son las dos nucleobases de purina que se encuentran mas comunmente en los acidos nucleicos

Las bases de pirimidina comprenden un anillo de pirimidina de seis miembros como se describe en la formula general:

La citosina, el uracilo y la timina son las bases de pirimidina que se encuentran mas comunmente en los acidos nucleicos.

El oligonucleotido antisentido esta unido químicamente a un resto que mejora la actividad, la distribucion celular o la captacion celular del oligonucleotido. El resto es una cadena de polietilenglicol.

Las moleculas antisentido utilizadas de acuerdo con esta invencion pueden producirse convenientemente y rutinariamente mediante la tecnica bien conocida de smtesis en fase solida. El equipo para dicha smtesis se puede adquirir en varios proveedores que incluyen, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, California). Un metodo para sintetizar los oligonucleotidos en un soporte solido modificado se describen en la Patente US-4.458.066.

Se puede emplear adicionalmente o como alternativa cualquier otro medio para dicha smtesis conocido en la tecnica. Es bien conocido usar tecnicas similares para preparar oligonucleotidos tal como los fosforotioatos y derivados alquilados. En una realizacion automatizada de este tipo, se utilizan dietil-fosforamiditas como materiales de partida y pueden sintetizarse como se describe por Beaucage, et al., (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862.

Las moleculas antisentido de la invencion se sintetizan in vitro y no incluyen composiciones antisentido de origen biologico. Las moleculas de la invencion tambien pueden ser mezcladas, encapsuladas, conjugadas o asociadas de otra manera con otras moleculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moleculas dirigidas al receptor, formulaciones orales, rectales, topicas u otras, para favorecer la absorcion, distribucion y/o absorcion

A. Oligomeros de morfolino

Los oligomeros de morfolino que tienen enlaces en la cadena principal que contienen fosforo se ilustran en las Figuras 1A-1C. Un oligomero de morfolino unido a fosforodiamidato tal como se muestra en la Figura 1C, esta modificado para contener grupos cargados positivamente en preferiblemente 10 % -50 % de sus enlaces de la cadena principal. Los oligomeros de morfolino con enlaces en la cadena principal no cargados, incluidos los oligonucleotidos antisentido, se detallan, por ejemplo, en (Summerton y Weller 1997) y en las patentes de los Estados Unidos de propiedad conjunta Numeros 5.698.685, 5.217.866, 5.142.047, 5.034.506, 5.166.315, 5.185.444, 5.521.063, 5.506.337, 8.076.476, 8.299.206 y 7.943.762. Los oligomeros de morfolino con enlaces modificados que incluyen enlaces cargados se pueden encontrar en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.°: 2012/0065169. Las propiedades importantes de las subunidades basadas en morfolino incluyen: 1) la capacidad de unirse en forma oligomerica mediante enlaces en la cadena principal estables, cargados positivamente o no cargados; 2) la capacidad para soportar una base de nucleotido (por ejemplo, adenina, citosina, guanina, timidina, uracilo e inosina) de tal forma que el polfmero formado se puede hibridar con un acido nucleico diana de base complementaria, incluyendo ARN diana, valores de Tm superiores a aproximadamente 45 °C en oligonucleotidos relativamente cortos (por ejemplo, 10-15 bases); 3) la capacidad del oligonucleotido para transportarse activamente o pasivamente en celulas de mairnferos; y 4) la capacidad del heteroduplex ARN:oligonucleotido antisentido para resistir la degradacion de la ARNasa y la ARNasa H, respectivamente.

Las estructuras de la cadena principal ilustrativas de los oligonucleotidos antisentido de la materia objeto reivindicada incluyen los tipos de subunidad de morfolino mostrados en las Figuras 1D-G, cada una unida por un enlace por un enlace de subunidad que contiene fosforo, cargado positivamente o no cargado. La Figura 1D muestra un enlace que contiene fosforo que forma la cadena principal con unidad repetitiva de cinco atomos, donde los anillos de morfolino estan unidos por un enlace de fosfoamida de 1 atomo. La Figura 1E muestra un enlace que produce una cadena principal con unidad repetitiva de 6 atomos. En esta estructura, el atomo Y que enlaza el carbono 5' morfolino con el grupo de fosforo puede ser azufre, nitrogeno, carbono o, preferentemente, oxfgeno. El radical X colgante del fosforo puede ser fluor, un alquilo o alquilo sustituido, un alcoxi o alcoxi sustituido, un tioalcoxi o tioalcoxi sustituido, o nitrogeno no sustituido, monosustituido, o disustituido, que incluyen estructuras dclicas, tales como morfolinas o piperidinas. Alquilo, alcoxi y tioalcoxi incluyen preferiblemente 1-6 atomos de carbono. Los radicales Z son azufre u oxfgeno, y son preferiblemente oxfgeno.

Los enlaces que se muestran en las Figuras 1F y 1G estan disenados para cadenas principales de longitud unitaria de 7 atomos. En la estructura IF, el radical X es como en la estructura IE, y el radical Y puede ser metileno, azufre, o, preferiblemente, oxfgeno. En la Estructura 1G, los radicales X e Y son como en la Estructura IE. Los oligonucleotidos morfolino particularmente preferidos incluyen aquellos compuestos de estructuras de subunidad de morfolino de la forma que se muestra en la Figura IE, donde X = NH2, N(CH3)2 o 1-piperazina u otro grupo cargado, Y=O y Z=O.

Un oligonucleotido sustancialmente no cargado puede modificarse, de acuerdo con un aspecto de la invencion, para incluir enlaces cargados, por ejemplo, hasta aproximadamente 1 por cada 2-5 enlaces no cargados, tal como aproximadamente 4-5 por cada 10 enlaces no cargados. En ciertas realizaciones, la mejora optima en la actividad antisentido puede ser observada cuando aproximadamente 25 % de los enlaces de la cadena principal son cationicos. En ciertas realizaciones, la mejora puede observarse con un pequeno numero por ejemplo, 10-20 % de enlaces cationicos, o donde el numero de enlaces cationicos esta en el intervalo de 50-80 %, tal como aproximadamente 60 %.

Se proporcionan oligomeros que tienen cualquier numero de enlaces cationicos, incluyendo oligomeros enlazados completamente cationicos. Preferiblemente, sin embargo, los oligomeros estan parcialmente cargados, y tienen, por ejemplo, 10 %-80 %. En realizaciones preferidas, aproximadamente de 10 % a 60 %, y preferiblemente de 20 a 50 % de los enlaces son cationicos.

En una realizacion, los enlaces cationicos se entremezclan a lo largo de la cadena principal. Los oligomeros parcialmente cargados preferiblemente contienen por lo menos dos enlaces no cargados consecutivos; es decir, el oligomero preferiblemente no tiene un patron estrictamente alternante a lo largo de toda su longitud.

Tambien se consideran los oligomeros que tienen bloques de enlaces cationicos y bloques de enlaces no cargados; por ejemplo, un bloque central de enlaces no cargados puede estar flanqueado por bloques de enlaces cationicos, o viceversa. En una realizacion, el oligomero tiene regiones 5', 3' y centrales de una longitud aproximadamente igual, y el porcentaje de enlaces cationicos en la region central es mayor de aproximadamente 50 %, preferiblemente mayor de aproximadamente 70 %.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido pueden prepararse mediante smtesis en fase solida gradual, que emplean metodos detallados en las referencias citadas anteriormente, y posteriormente con respecto a la smtesis de oligonucleotidos que tienen una mezcla de enlaces de la cadena principal cationicos y no cargados. En algunos casos, puede ser deseable anadir radicales qmmicos adicionales al compuesto antisentido, por ejemplo, para mejorar la farmacocinetica o para facilitar la captura o deteccion del compuesto. Dicho radical puede unirse covalentemente, de acuerdo con metodos sinteticos estandar. Por ejemplo, la adicion de un radical de polietilenglicol o de otro polfmero hidrofilo, por ejemplo, uno que tiene 1-100 subunidades monomericas, puede ser util para aumentar la solubilidad.

Un radical indicador, tal como la fluorescema o un grupo radiomarcado, puede unirse para fines de deteccion. Como alternativa, el marcador indicador unido al oligomero puede ser un ligando, tal como un antfgeno o biotina, capaz de unir un anticuerpo marcado o estreptavidina. Al seleccionar un radical para la union o modificacion de un compuesto antisentido, se desea generalmente por supuesto seleccionar compuestos qmmicos de grupos que sean biocompatibles y que probablemente sean tolerados por un sujeto sin efectos secundarios indeseables.

Cada estructura de anillo morfolino soporta un radical de apareamiento de bases, para formar una secuencia de radicales de apareamiento de bases que se disena normalmente para hibridar con una diana antisentido seleccionada en una celula o en un sujeto a tratar. El radical de apareamiento de bases puede ser una purina o pirimidina que exista en el ADN o ARN nativo (por ejemplo, A, G, C, T o U).

III. Formulaciones y modos de administracion

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona formulaciones o composiciones adecuadas para la administracion terapeutica de oligomeros antisentido de acuerdo con la presente invencion. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la presente invencion proporciona composiciones farmaceuticamente aceptables que comprenden una cantidad terapeuticamente efectiva de uno o mas de los oligomeros de acuerdo con la presente invencion, formulados conjuntamente con uno o mas vehuculos (aditivos) y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables. Aunque es posible que un oligomero de la presente invencion se administre solo, es preferible administrar el compuesto como una formulacion (composicion) farmaceutica.

Los metodos para la administracion de moleculas de acido nucleico se describen, por ejemplo, en Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2:139; and Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar; Sullivan et al., PCT WO 94/02595. Estos y otros protocolos pueden ser utilizados para la administracion de practicamente cualquier molecula de acido nucleico, incluyendo los oligomeros aislados de la presente invencion.

Como se detalla a continuacion, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden ser especialmente formuladas para la administracion en forma solida o lfquida, incluyendo las adaptadas para lo siguiente: (1) administracion oral, por ejemplo, soluciones orales (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), comprimidos, por ejemplo, los destinados a la absorcion bucal, sublingual y sistemica, bolos, polvos, granulos, pastas para su uso en la lengua; (2) administracion parenteral, por ejemplo, por via subcutanea, intramuscular, intravenosa o inyeccion epidural como, por ejemplo, una solucion esteril o suspension o formulacion de liberacion sostenida; (3) aplicacion topica, por ejemplo, como una crema, pomada, o un parche de liberacion controlada o aerosol aplicado sobre la piel; (4) por via vaginal o intrarrectal, por ejemplo, como un pesario, crema o espuma; (5) por via sublingual; (6) ocular; (7) via transdermica; o (8) por via nasal.

La frase “farmaceuticamente aceptable” se utiliza en la presente memoria para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmaceuticas que estan dentro del alcance del criterio medico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de los seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritacion, reaccion alergica, u otro problema o complicacion, acorde con una relacion razonable de riesgo-beneficio.

La frase “vetnculo farmaceuticamente aceptable” como se usa en la presente memoria se refiere a un material, composicion o vetnculo farmaceuticamente aceptable, como una carga lfquida o solida, diluyente, excipiente, auxiliar de fabricacion (por ejemplo, lubricante, talco, estearato de magnesio, calcio o zinc o acido esterico) o material que encapsula el disolvente, implicado en llevar o transportar el compuesto en cuestion de un organo, o parte del cuerpo, a otro organo o parte del cuerpo. Cada vetnculo debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los demas componentes de la formulacion y no perjudicial para el paciente.

Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vetnculos farmaceuticamente aceptables incluyen, sin limitacion: (1) azucares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidon de mafz y almidon de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetil celulosa de sodio, etil celulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodon, aceite de girasol, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de mafz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) esteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tales como hidroxido de magnesio e hidroxido de aluminio; (15) acido algmico; (16) agua apirogena; (17) solucion salina isotonica; (18) solucion de Ringer; (19) alcohol etflico; (20) soluciones de pH tamponadas; (21) poliesteres, policarbonatos y/o poliantndridos; y (22) otras sustancias compatibles no toxicas empleadas en las formulaciones farmaceuticas.

Otros ejemplos no limitantes de agentes adecuados para la formulacion con los oligomeros antisentido de la presente invencion incluyen: acidos nucleicos conjugados con PEG, acidos nucleicos conjugados con fosfolfpidos, acidos nucleicos que contienen radicales lipofilos, fosforotioatos, inhibidores de la P-glicoprotema (como Pluronic P85) que pueden potenciar la entrada de farmacos en varios tejidos; polfmeros biodegradables, tales como microesferas de poli(DL-lactido-coglicolido) para la administracion de liberacion sostenida despues de la implantacion (Emerich, D F et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.; y nanopartfculas cargadas, como las fabricadas de polibutilcianoacrilato, que pueden administrar medicamentos a traves de la barrera hematoencefalica y pueden alterar los mecanismos de captacion neuronal (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999).

La invencion tambien incluye el uso de la composicion farmaceutica que comprende liposomas de superficie modificada que contienen lfpidos de poli(etilenglicol) (modificado con PEG, ramificado y no ramificado o combinaciones de los mismos, o liposomas de circulacion prolongada o liposomas stealth). Los oligomeros para uso en la invencion pueden comprender tambien de moleculas de PEG unidas covalentemente de varios pesos moleculares. Estas formulaciones ofrecen un metodo para aumentar la acumulacion de medicamentos en los tejidos diana. Esta clase de vetnculos de farmacos resiste la opsonizacion y la eliminacion por el sistema mononuclear fagocftico (MPS o RES), permitiendo asf tiempos de circulacion en la sangre mas prolongados y mayor exposicion en el tejido para el farmaco encapsulado (Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). Estos liposomas han demostrado que se acumulan selectivamente en los tumores, probablemente por extravasacion y captura en los tejidos diana neovascularizados (Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Los liposomas de circulacion prolongada mejoran la farmacocinetica y farmacodinamia del ADN y ARN, especialmente en comparacion con los liposomas cationicos convencionales que se sabe que se acumulan en los tejidos del MPS (Liu et al., J. Biol. Chem.

1995, 42, 24864-24870; Choi et al., Publicacion Internacional PCT N.° WO 96/10391; Ansell et al., Publicacion Internacional PCT N.° WO 96/10390; Holland et al., Publicacion Internacional PCT N.° WO 96/10392). Los liposomas de circulacion prolongada tambien protegen a los medicamentos de la degradacion por nucleasas en un mayor grado en comparacion con los liposomas cationicos, basado en su capacidad para evitar la acumulacion en los tejidos metabolicamente agresivos de MPS como el dgado y el bazo.

En una realizacion adicional, la presente invencion incluye composiciones farmaceuticas de oligomero preparadas para la administracion como se describe en las Patentes de Estados Unidos Numeros 6.692.911. 7.163.695 y 7.070.807. En este sentido, en una realizacion, la presente invencion proporciona un oligomero de la presente invencion en una composicion que comprende copolfmeros de lisina e histidina (HK) (como se describe en las Patentes de Estados Unidos Numeros 7.163.695, 7.070.807 y 6.692.911) solos o en combinacion con PEG (por ejemplo, PEG ramificado o no ramificado o una mezcla de ambos), en combinacion con PEG y un radical de direccionamiento o cualquiera de los anteriores en combinacion con un agente reticulante. En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona oligomeros antisentido en composiciones que comprenden polihistidina modificada con acido gluconico o polihistidina gluconilada/transferrina-polilisina. Un experto en la materia tambien reconoce que se pueden sustituir los aminoacidos con propiedades similares a His y Lys dentro de la composicion.

Ciertas realizaciones de los oligomeros de acuerdo con la invencion pueden contener un grupo funcional basico, tales como amino o alquilamino y son, por lo tanto, capaces de formar sales farmaceuticamente aceptables con acidos farmaceuticamente aceptables. La expresion “sales farmaceuticamente aceptables” a este respecto se refiere a las sales de adicion de acido inorganicas y organicas, relativamente no toxicas, de compuestos de la presente invencion. Estas sales pueden prepararse in situ en el vefuculo de administracion o en el proceso de fabricacion de la forma farmaceutica, o por la reaccion por separado de un compuesto purificado de la invencion en su forma de base libre con un acido organico o inorganico aislado y aislando la sal formada durante la purificacion posterior. Las sales representativas incluyen las sales bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato y laurilsulfonato y similares. (Vease, por ejemplo, Berge et al. (1977) “Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci. 66:1-19).

Las sales farmaceuticamente aceptables de los oligomeros de acuerdo con la presente invencion incluyen las sales no toxicas convencionales o sales de amonio cuaternario de los compuestos, por ejemplo, de acidos organicos o inorganicos no toxicos. Por ejemplo, sales convencionales no toxicas incluyen aquellas derivadas de acidos inorganicos tales como acido clorfudrico, bromfudrico, sulfurico, sulfamico, fosforico, mtrico y similares; y las sales preparadas a partir de acidos organicos tales como acido acetico, propionico, sucdnico, glicolico, estearico, lactico, malico, tartarico, dtrico, ascorbico, palmftico, maleico, hidroximaleico, fenilacetico, glutamico, benzoico, salidlico, sulfamlico, 2-acetoxi-benzoico, fumarico, toluenosulfonico metanosulfonico, etanodisulfonico, oxalico, isotionico y similares.

En algunas realizaciones, los oligomeros de acuerdo con la presente invencion pueden contener uno o mas grupos con funcionalidad acido y, por lo tanto, son capaces de formar sales farmaceuticamente aceptables con bases farmaceuticamente aceptables. La expresion “sales farmaceuticamente aceptables” en estos casos se refiere a las sales de adicion de base inorganicas y organicas, relativamente no toxicas, de los compuestos de la presente invencion. Estas sales tambien se pueden preparar in situ en el vefuculo de administracion o en el proceso de fabricacion de la forma farmaceutica, o por la reaccion por separado del compuesto purificado en su forma de acido libre con una base adecuada, como el hidroxido, carbonato o bicarbonato de un cation metalico farmaceuticamente aceptable, con amomaco o con una amina primaria, secundaria o terciaria organica farmaceuticamente aceptable. Las sales alcalinas o alcalinoterreas representativas incluyen las sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio y similares. Las aminas organicas representantes utiles para la formacion de sales de adicion de base incluyen etilamina, dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares. (Vease, por ejemplo, Berge et al., supra).

En las composiciones tambien pueden estar presentes agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, asf como agentes colorantes, agentes de liberacion, agentes de recubrimiento, edulcorantes, agentes saborizantes y de perfume, conservantes y antioxidantes.

Ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como acido ascorbico, clorhidrato de cistema, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes metalicos, tales como acido dtrico, acido etilendiamina tetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico, y similares.

Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion incluyen aquellas adecuadas para administracion oral, nasal, topica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosis unitaria y pueden prepararse mediante cualesquiera metodos bien conocidos en la tecnica de la ciencia farmaceutica. La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material veldculo para producir una forma farmaceutica unitaria variara dependiendo del hospedador que se va a tratar, y el modo particular de administracion. La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material vefuculo para producir una forma farmaceutica unitaria generalmente sera aquella cantidad del compuesto que produce un efecto terapeutico. Generalmente, del cien por cien, esta cantidad variara de aproximadamente 0,1 por ciento a aproximadamente 99 por ciento de principio activo, preferiblemente de aproximadamente 5 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, mas preferiblemente de aproximadamente 10 por ciento a 30 por ciento.

En ciertas realizaciones, una composicion farmaceutica de la presente invencion comprende un excipiente seleccionado de ciclodextrinas, celulosas, liposomas, agentes formadores de micelas, por ejemplo, acidos biliares, y vetnculos polimericos, por ejemplo, poliesteres y poliantndridos; y un oligomero de la presente invencion. En ciertas realizaciones, una formulacion antes mencionada convierte en biodisponible por via oral a un oligomero de la presente invencion.

Los metodos de preparacion de estas composiciones farmaceuticas incluyen la etapa de asociar un oligomero de la presente invencion con el vetnculo y, opcionalmente, uno o mas componentes accesorios. En general, las composiciones farmaceuticas se preparan asociando uniforme e mtimamente un compuesto de la presente invencion con vetnculos lfquidos o vetnculos solidos finamente divididos o ambos, y despues, si es necesario, dando forma al producto.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion adecuadas para la administracion oral pueden estar en forma de capsulas, sellos, pfldoras, comprimidos, pastillas para chupar (usando una base de sabor, generalmente sacarosa y acacia o tragacanto), polvos, granulos, o como una solucion o una suspension en un lfquido acuoso o no acuoso, o como una emulsion lfquida de aceite en agua o agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (utilizando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia) y/o como enjuagues bucales y similares, conteniendo cada una una cantidad predeterminada de un oligonucleotido antisentido de la presente invencion como un principio activo. Un oligonucleotido antisentido de la presente invencion tambien puede administrarse como un bolo, electuario o pasta.

En las formas farmaceuticas solidas de la invencion para la administracion oral (capsulas, comprimidos, pfldoras, grageas, polvos, granulos, trocisco y similares), el principio activo se puede mezclar con uno o mas vetnculos farmaceuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato dicalcico y/o cualquiera de lo siguiente: (1) cargas o extendedores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y/o acido silfcico; (2) aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarosa y/o acacia; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidon de patata o tapioca, acido algmico, ciertos silicatos, y carbonato de sodio; (5) agentes retardadores de la disolucion, tales como parafina; (6) aceleradores de la absorcion, tales como compuestos de amonio cuaternario y agentes tensioactivos, tales como poloxamero y lauril sulfato de sodio; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetflico, monoestearato de glicerol, y agentes tensioactivos no ionicos; (8) absorbentes, tales como caolm y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles solidos, lauril sulfato de sodio, estearato de zinc, estearato de sodio, acido estearico, y sus mezclas; (10) agentes de color; y (11) agentes de liberacion controlada tales como crospovidona o etil celulosa. En el caso de las capsulas, comprimidos y pfldoras, las composiciones farmaceuticas tambien pueden comprender agentes tamponantes. Las composiciones solidas de un tipo similar tambien pueden utilizarse como cargas en capsulas de gelatina blanda y dura utilizando dichos excipientes como lactosa o azucar de leche, asf como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Un comprimido puede fabricarse por compresion o moldeado, opcionalmente con uno o mas componentes adicionales. Los comprimidos pueden prepararse usando aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetil celulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante (por ejemplo, glicolato almidon de sodio o carboximetilcelulosa de sodio reticulada), agente tensioactivo o de dispersion. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse moldeando en una maquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente lfquido inerte.

Los comprimidos y otras formas farmaceuticas solidas de las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, tales como grageas, capsulas, pfldoras y granulos, pueden marcarse o prepararse opcionalmente con revestimientos y cubiertas, tales como revestimientos entericos y otros revestimientos bien conocidos en la tecnica de la formulacion de productos farmaceuticos. Tambien se pueden formular con el fin de proporcionar una liberacion lenta o controlada del principio activo que se esta usando, por ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa en proporciones variables para proveer el perfil de liberacion deseado, otras matrices polimericas, liposomas y/o microesferas. Pueden formularse para liberacion rapida, por ejemplo, en forma liofilizada. Pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtracion a traves de un filtro de retencion de bacterias, o mediante la incorporacion de agentes de esterilizacion en forma de composiciones solidas esteriles que se pueden disolver en agua esteril, o algun otro medio inyectable esteril inmediatamente antes de su uso. Estas composiciones tambien pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composicion tal que liberan solo el principio o principios activos, o preferiblemente, en una cierta porcion del tracto gastrointestinal, opcionalmente de una manera retardada. Ejemplos de composiciones de incorporacion que se pueden usar incluyen sustancias polimericas y ceras. El principio activo tambien puede estar en forma micro-encapsulada, si es apropiado, con uno o mas de los excipientes antes descritos.

Las formas farmaceuticas Ifquidas para la administracion oral de los oligonucleotidos antisentido de la invencion incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmaceuticamente aceptables. Ademas del principio activo, las formas farmaceuticas lfquidas pueden contener diluyentes inertes frecuentemente usados en la tecnica, tales como por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etflico, alcohol isopropflico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bendlico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceite de semilla de algodon, cacahuate, mafz, germen, oliva, ricino y sesamo), glicerol, alcohol tetrahidrofunlico, polietilenglicoles y esteres de acido graso de sorbitan, y sus mezclas.

Ademas de los diluyentes inertes, las composiciones orales tambien pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspension, agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes, aromaticos y conservantes.

Las suspensiones, ademas de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspension como por ejemplo, alcoholes isoesteanlicos etoxilados, polioxietilensorbitol y esteres de sorbitan, celulosa microcristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y sus mezclas.

Las formulaciones para administracion rectal o vaginal se pueden presentar como un supositorio, que se puede preparar mezclando uno o mas compuestos de la invencion, con uno o mas excipientes o veldculos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera de supositorio o un salicilato, y que es solido a temperatura ambiente pero lfquido a la temperatura corporal y, por tanto, se fundira en el recto o cavidad vaginal y liberara el compuesto activo.

Las formulaciones o formas farmaceuticas para la administracion topica o

transdermica de un oligomero como se proporciona en la presente memoria incluyen polvos, aerosoles, pomadas, pastas, espumas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhaladores. Los oligomeros activos se pueden mezclar en condiciones esteriles con un vehfculo farmaceuticamente aceptable, y con cualquier conservante, tampon o propelente que se necesite. Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, ademas de un compuesto activo de esta invencion, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidon, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, acido silfcico, talco y oxido de zinc o sus mezclas.

Los polvos y aerosoles pueden contener, ademas de un oligomero de la presente invencion, excipientes tales como lactosa, talco, acido silfcico, hidroxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los aerosoles, ademas pueden contener propelentes habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos no sustituidos volatiles, tales como butano y propano.

Los parches transdermicos tienen la ventaja adicional de proporcionar una administracion controlada de un oligomero de la presente invencion al cuerpo. Tales formas farmaceuticas pueden formarse disolviendo o dispensando el oligomero en el medio adecuado. Para incrementar el flujo del agente a traves de la piel tambien se pueden utilizar potenciadores de la absorcion. La velocidad de tal flujo puede controlarse proporcionando una membrana de control de la velocidad o dispersando al agente en una matriz polimerica o gel, entre otros metodos conocidos en la tecnica.

Las composiciones farmaceuticas adecuadas para la administracion parenteral pueden comprender uno o mas oligomeros de la invencion en combinacion con una o mas soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas, isotonicas, esteriles farmaceuticamente aceptables o polvos esteriles que pueden ser reconstituidos en soluciones o dispersiones inyectables esteriles justo antes del uso, que pueden contener azucares, alcoholes, antioxidantes, tamponantes, bacteriostaticos, solutos que convierten a la formulacion en isotonica con la sangre del receptor destinado o agentes de suspension o espesantes. Ejemplos de veldculos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden utilizar en las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano requerido de partfcula en el caso de las dispersiones y mediante el uso de agentes tensioactivos.

Estas composiciones tambien pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevencion de la accion de los microorganismos sobre los oligomeros en cuestion puede asegurarse por la inclusion de varios agentes a antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, acido sorbico y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro de sodio y similares en la composicion. Ademas, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede conseguirse por la inclusion de agentes que retrasan la absorcion, tales como el monoestearato de aluminio y la gelatina.

En algunos casos, para prolongar el efecto de un farmaco, es deseable conseguir la absorcion lenta del farmaco de la inyeccion subcutanea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspension lfquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua, entre otros metodos conocidos en la tecnica. La velocidad de absorcion del farmaco entonces depende de su velocidad de disolucion, que a su vez, puede depender entonces del tamano del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, la absorcion retardada de una forma farmaceutica administrada por via parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el farmaco en un vehfculo oleoso. Las formas de deposito inyectables se preparan formando matrices microencapsuladas de los oligomeros en cuestion en polfmeros biodegradables tales como polilactido-poliglicolido. Dependiendo de la relacion entre oligomero y polfmero y la naturaleza del polfmero particular utilizado, se puede controlar la velocidad de liberacion del oligomero. Ejemplos de otros polfmeros biodegradables incluyen poli(ortoesteres) y poli(anfndridos). Las formulaciones inyectables de deposito tambien se pueden preparar atrapando el farmaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.

Cuando se administran los oligomeros de la presente invencion como productos farmaceuticos, a los seres humanos y animales, estos se pueden administrar per se o como una composicion farmaceutica que contiene, por ejemplo, de 0,1 a 99 % (mas preferentemente de 10 a 30 %) del principio activo en combinacion con un vefnculo farmaceuticamente aceptable.

Como se senalo anteriormente, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden administrarse por via oral, parenteral, topica o por via rectal. Por lo general se dan en formas convenientes para cada via de administracion. Por ejemplo, se administran en comprimidos o en forma de capsula, por inyeccion, inhalacion, locion oftalmica, pomada, supositorio, etc., administracion por inyeccion, perfusion o inhalacion; topica en locion o pomada; y rectal en supositorios.

Las frases “administracion parenteral” y “administrado por via parenteral” como se usa en la presente memoria significa modos de administracion distintos de la administracion enteral y topica, generalmente por inyeccion e incluye, sin limitacion inyeccion y perfusion intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, e intraesternal.

Las frases “administracion sistemica,” “administrado sistemicamente”, “administracion periferica” y “administrado perifericamente” como se utiliza en la presente memoria significa la administracion de un compuesto, farmaco u otro material diferente al que se introduce directamente en el sistema nervioso central, que entra en el sistema del paciente, y asf se somete al metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, la administracion subcutanea. Independientemente de la via de administracion seleccionada, el oligonucleotido antisentido de la presente invencion, que se puede usar en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, se formulan en formas farmaceuticas farmaceuticamente aceptables por metodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Los niveles reales de dosificacion de los ingredientes activos en las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden variar con el fin de obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapeutica deseada para un paciente, composicion y modo de administracion particulares, sin ser toxicos para el paciente.

El nivel de dosificacion seleccionado dependera de una variedad de factores que incluyen la actividad del oligomero particular de la presente invencion empleado, o el ester, sal o amida del mismo, la via de administracion, el tiempo de administracion, la velocidad de excrecion o metabolismo del oligomero particular que se emplea, la tasa y el grado de absorcion, la duracion del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales usados en combinacion con el oligomero particular utilizado, la edad, sexo, peso, condicion, salud en general e historial medico previo del paciente que se esta tratando y factores similares bien conocidos en la tecnica de la medicina.

Un medico o veterinario que tenga experiencia en la tecnica puede determinar y prescribir facilmente la cantidad efectiva de la composicion farmaceutica necesaria. Por ejemplo, el medico o veterinario podna comenzar con dosis de los compuestos de la invencion usados en la composicion farmaceutica a niveles mas bajos de los requeridos para lograr el efecto terapeutico deseado e incrementar gradualmente la dosificacion hasta que se consiga el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la invencion sera esa cantidad del compuesto que es la dosis mas baja eficaz para producir un efecto terapeutico. Dicha dosis efectiva por lo general dependera de los factores descritos anteriormente. En general, las dosis por via oral, intravenosa, intracerebroventricular y subcutaneas de los compuestos de esta invencion para un paciente, cuando se utilizan para los efectos indicados, variaran de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal al dfa.

Si se desea, la dosis diaria efectiva del compuesto activo puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas sub-dosis administradas por separado a intervalos apropiados durante todo el dfa, opcionalmente, en formas farmaceuticas unitarias. En ciertas situaciones, la dosificacion es una administracion al dfa. En algunas realizaciones, la dosificacion es una o mas administraciones cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 dfas, o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12 semanas, o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses, segun sea necesario, para mantener la expresion deseada de una protema distrofina funcional.

Las moleculas de acido nucleico pueden administrarse a las celulas por una variedad de metodos conocidos para aquellos familiarizados con la tecnica, incluyendo, pero sin limitarse a, encapsulacion en liposomas, por iontoforesis, o por incorporacion de otros vehffculos, tal como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocapsulas biodegradables, y microesferas bioadhesivas, tal como se describe en la presente memoria y es conocido en la tecnica. En ciertas realizaciones, puede utilizarse la tecnologfa de microemulsion para mejorar la biodisponibilidad de agentes farmaceuticos lipofilos (insolubles en agua). Los ejemplos incluyen trimetrina (Dordunoo, S. K., et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, 17(12), 1685-1713, 1991 y REV 5901 (Sheen, C. P., et al., J Pharm Sci 80(7), 712-714, 1991). Entre otros beneficios, la microemulsion ofrece una mayor biodisponibilidad por absorcion dirigida preferencialmente al sistema linfatico en lugar del sistema circulatorio, lo cual evita el hffgado, y previene la destruccion de los compuestos en la circulacion hepatobiliar.

En un aspecto de la invencion, las composiciones farmaceuticas micelas formadas a partir de un oligomero como se proporciona en la presente memoria y al menos un vehffculo anfffilo, en el cual las micelas tienen un diametro promedio de menos de aproximadamente 100 nm. Las realizaciones mas preferidas proporcionan micelas que tienen un diametro promedio de menos de aproximadamente 50 nm, y realizaciones incluso mas preferidas proporcionan micelas que tienen un diametro promedio de menos de aproximadamente 30 nm, o incluso menos de aproximadamente 20 nm.

Aunque se contemplan todos los vehffculos anfffilos adecuados, los vehffculos actualmente preferidos generalmente son aquellos que tienen un estado generalmente reconocido como seguro (GRAS), y que pueden solubilizar el compuesto de la presente invencion y microemulsionar en una etapa posterior, cuando la solucion entra en contacto con una fase de agua compleja (tal como la que existe en el tracto gastrointestinal humano). Por lo general, los ingredientes anfffilos que satisfacen estos requisitos tienen valores HLB (equilibrio hidrofilo-lipofilo) de 2-20, y sus estructuras contienen a radicales alifaticos de cadena lineal en el intervalo de C-6 a C-20. Los ejemplos son gliceridos grasos glicolizados con polietileno y polietilenglicoles.

Los ejemplos de vehffculos anfffilos incluyen gliceridos de acidos grasos polietilenglicolizados saturados y monoinsaturados, tales como aquellos obtenidos de varios aceites vegetales total o parcialmente hidrogenados. Dichos aceites pueden consistir ventajosamente en tri-, di- y monogliceridos de acido graso y di- y monoesteres de polietilenglicol de los acidos grasos correspondientes, con una composicion de acido graso particularmente preferida que incluye acido caprico 4-10, acido caprico 3-9, acido laurico 40-50, acido miffstico 14-24, acido palmffico 4-14 y acido estearico 5-15 %. Otra clase util de vehffculos anfffilos incluye sorbitan parcialmente esterificado y/o sorbitol, con acidos grasos saturados o monoinsaturados (serie SPAN) o los analogos etoxilados correspondientes (serie TWEEN).

Los vehffculos anfffilos comercializados pueden ser particularmente utiles, incluyendo la serie Gelucire, Labrafil, Labrasol o Lauroglicol (todos fabricados y distribuidos por Gattefosse Corporation, Saint Priest, Francia), PEG-monooleato, PEG-di-oleato, PEG-mono-laurato y di-laurato, lecitina, polisorbato 80, etc., (producido y distribuido por un numero de empresas en Estados Unidos y en todo el mundo).

En ciertas realizaciones, la administracion puede realizarse usando liposomas, nanocapsulas, microparffculas, microesferas, parffculas lipfdicas, vesfculas y similares, para la introduccion de las composiciones de la presente invencion en las celulas del hospedador adecuadas. En particular, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden formular para la administracion encapsulada en una parffcula de ffpido, un liposoma, una vesfcula, una nanoesfera, una nanoparffcula o similares. La formulacion y uso de dichos vehffculos de administracion pueden realizarse mediante tecnicas convencionales y conocidas.

Los poffmeros hidrofilos adecuados para su uso en la presente invencion son aquellos que son facilmente solubles en agua, pueden unirse covalentemente a ffpidos formadores de vesfculas, y que son tolerados in vivo sin efectos toxicos (es decir, son biocompatibles). Los poffmeros adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), acido polilactico (tambien denominado polilactido), acido poliglicolico (tambien denominado poliglicolido), un copoffmero de acido polilactico-poliglicolico y poli(alcohol vimlico). En ciertas realizaciones, los poffmeros tienen un peso molecular de aproximadamente 100 o 120 daltons hasta aproximadamente 5.000 o 10.000 daltons, o de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 5.000 daltons. En otras realizaciones, el poffmero es polietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 daltons, o que tiene un peso molecular de aproximadamente 300 a aproximadamente 5.000 daltons. En ciertas realizaciones, el poffmero es polietilenglicol de 750 daltons (PEG(750)). Los poffmeros tambien pueden ser definidos por el numero de monomeros que contienen; una realizacion preferida de la presente invencion utiliza poffmeros de al menos aproximadamente tres monomeros, dichos poffmeros de PEG consisten en tres monomeros (aproximadamente de 150 daltons).

Otros poffmeros hidrofilos que pueden ser adecuados para su uso en la presente invencion incluyen polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropil metacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, y celulosas derivadas tales como hidroximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa.

En ciertas realizaciones, una composicion farmaceutica de la presente invencion comprende un poKmero biocompatible seleccionado del grupo que consiste en poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polfmeros de esteres acnlicos y metacnlicos, poKmeros de polivinilo, poliglicolidos, polisiloxanos, poliuretanos y sus co-polfmeros, celulosas, polipropileno, polietilenos, poliestireno, polfmeros de acido lactico y acido glicolico, poliantndridos, poli(orto)esteres, poli(acido butico), poli(acido valerico), poli(lactido-co-caprolactona), polisacaridos, protemas, acidos polihialuronicos, policianoacrilatos y combinaciones, mezclas, o copolfmeros de los mismos.

Las ciclodextrinas son oligosacaridos dclicos, que consisten en 6, 7 u 8 unidades de glucosa, designadas por la letra griega a, p, o y, respectivamente. Las unidades de glucosa estan unidas por enlaces a-1, 4-glucosfdicos. Como consecuencia de la conformacion de silla de las unidades de azucar, todos los grupos hidroxilo secundarios (en C-2, C-3) se encuentran en un lado del anillo, mientras que todos los grupos hidroxilo primarios en C-6 se situan en el otro lado. Como resultado, las caras externas son hidrofilas, lo que hace que las ciclodextrinas sean solubles en agua. Por el contrario, las cavidades de las ciclodextrinas son hidrofobas, ya que estan revestidas por el hidrogeno de los atomos C-3 y C-5, y por oxfgenos tipo eter. Estas matrices permiten la formacion de complejos con una variedad de compuestos relativamente hidrofobos, que incluyen, por ejemplo, compuestos de esteroides tales como 17a-estradiol (vease, por ejemplo, van Uden et al. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 38:1-3-113 (1994)). La formacion de complejos tiene lugar mediante interacciones de Van der Waals y mediante la formacion de enlaces de hidrogeno. Para una revision general de la química de las ciclodextrinas, vease, Wenz, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:803­ 822 (1994).

Las propiedades fisicoquímicas de los derivados de ciclodextrina dependen en gran medida de la clase y el grado de sustitucion. Por ejemplo, su solubilidad en agua vana de insoluble (por ejemplo, triacetil-beta-ciclodextrina) a 147 % soluble (p/v) (G-2-beta-ciclodextrina). Ademas, son solubles en muchos disolventes organicos. Las propiedades de las ciclodextrinas permiten el control sobre la solubilidad de varios componentes de formulacion al aumentar o disminuir su solubilidad.

Se han descrito numerosas ciclodextrinas y metodos para su preparacion. Por ejemplo, Parmeter (I), et al. (Patente US-3.453.259) y Gramera, et al. (Patente US-3.459.731) describen ciclodextrinas electroneutras. Otros derivados incluyen ciclodextrinas con propiedades cationicas [Parmeter (II), Patente US-3.453.257], ciclodextrinas reticuladas insolubles (Solms, Patente US-3.420.788) y ciclodextrinas con propiedades anionicas [Parmeter (III), Patente US-3.426.011]. Entre los derivados de ciclodextrina con propiedades anionicas, se han anadido a la ciclodextrina original acidos carboxflicos, acidos fosforosos, acidos fosfinosos, acidos fosfonicos, acidos fosforicos, acidos tiofosfonicos, acidos tiosulfmicos, y acidos sulfonicos [vease, Parmeter (III), supra]. Ademas, se han descrito derivados de sulfoalquil eter ciclodextrina por Stella, et al. (Patente US-5.134.127).

Los liposomas consisten en al menos una membrana bicapa de lfpido que incluye un compartimento interno acuoso. Los liposomas pueden caracterizarse por el tipo de membrana y por el tamano. Las vesfculas unilaminares pequenas (SUV) tienen una sola membrana y por lo general vanan entre 0,02 y 0,05 pm de diametro; las vesfculas unilaminares grandes (LUVS) son normalmente mayores de 0,05 pm. Las vesfculas grandes oligolaminares y las vesfculas multilaminares tienen multiples capas de membrana, generalmente concentricas, son normalmente mayores de 0,1 pm. Los liposomas con varias membranas no concentricas, es decir, varias vesfculas mas pequenas contenidas dentro de una vesfcula grande, se llaman vesfculas multivesiculares.

Un aspecto de la presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden liposomas que contienen un oligomero de la presente invencion, donde la membrana del liposoma esta formulada para proporcionar un liposoma con una mayor capacidad de carga. Como alternativa o adicionalmente, el oligonucleotido antisentido de la presente invencion puede estar contenido en, o adsorbido sobre, la bicapa liposomica del liposoma. Un oligonucleotido antisentido de la presente invencion puede anadirse con un agente tensioactivo de lfpido e introducirse dentro del espacio interno de liposoma; en estos casos, la membrana del liposoma esta formulada para resistir los efectos que puedan alterar el agregado de agente activo-tensioactivo.

De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, la bicapa lipfdica de un liposoma contiene lfpidos derivados con polietilenglicol (PEG), de tal manera que las cadenas de PEG se extienden desde la superficie interna de la bicapa lipfdica hasta el espacio interior encapsulado por el liposoma, y desde el exterior de la bicapa lipfdica hasta el ambiente circundante.

Los agentes activos contenidos dentro de los liposomas de la presente invencion estan en forma solubilizada. Los agregados del agente tensioactivo y agente activo (tal como emulsiones o micelas que contienen el agente activo de interes) pueden ser atrapados en el espacio interior de los liposomas de acuerdo con la presente invencion. Un agente tensioactivo actua dispersando y solubilizando el agente activo, y puede seleccionarse de cualquier agente tensioactivo alifatico, cicloalifatico o aromatico adecuado, que incluye pero no se limita a lisofosfatidilcolinas (LPG) biocompatibles de diferentes longitudes de cadena (por ejemplo, de aproximadamente C14 a aproximadamente C20). Los lfpidos derivados de polfmeros tales como los PEG-lfpidos tambien pueden ser utilizados para la formacion de micelas ya que actuan inhibiendo la fusion micela/membrana, y dado que la adicion de un polfmero a las moleculas de agente tensioactivo disminuye la CMC del agente tensioactivo contribuye a la formacion de la micela. Los preferidos son agentes tensioactivos con CMC en el intervalo micromolar; agentes tensioactivos con CMC mayores pueden utilizarse para preparar micelas atrapadas con liposomas de la presente invencion.

Los liposomas de acuerdo con la presente invencion pueden prepararse por cualquiera de una variedad de tecnicas que se conocen en la tecnica. Vease, por ejemplo, Patente US-4.235.871; Solicitudes PCT publicadas WO 96/14057; New RRC, Liposomes: A practlcal approach, IRL Press, Oxford (1990), paginas 33-104; Lasic DD, Liposomes from physics to applications, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1993. Por ejemplo, se pueden preparar liposomas de la presente invencion mediante la difusion de un lfpido derivado con un polfmero hidrofilo en liposomas preformados, tal como mediante la exposicion de liposomas preformados a micelas compuestas de polfmeros injertados con lfpido, en las concentraciones de lfpido correspondientes al porcentaje final en moles de ifpido derivado que se desea en el liposoma. Los liposomas que contienen un polfmero hidrofilo pueden estar formados tambien por homogeneizacion, hidratacion del campo lipfdico o tecnicas de extrusion, como son conocidos en la tecnica.

En otro procedimiento de formulacion ilustrativo, el agente activo se dispersa primero por sonicacion en una lisofosfatidilcolina u otro agente tensioactivo de CMC bajo (incluyendo lfpidos injertados con polfmero) que solubiliza facilmente las moleculas hidrofobicas. La suspension micelar resultante del agente activo se utiliza entonces para rehidratar una muestra de lfpido seca que contiene un porcentaje en moles adecuado de lfpido injertado con polfmero, o colesterol. El lfpido y la suspension de agente activo se forma entonces en liposomas que usan tecnicas de extrusion como son conocidos en la tecnica, y los liposomas resultantes son separados de la solucion no encapsulada por separacion en columna estandar.

En un aspecto de la presente invencion, los liposomas se preparan de modo que tengan tamanos sustancialmente homogeneos en un intervalo de tamano seleccionado. Un metodo de dimensionamiento efectivo implica extruir una suspension acuosa de liposomas a traves de una serie de membranas de policarbonato que tienen un tamano de poro uniforme seleccionado; el tamano de poro de la membrana se corresponded aproximadamente con los tamanos mas grandes de liposomas producidos mediante extrusion a traves de esa membrana. Vease por ejemplo, Patente US-4.737.323 (12 de abril de 1988). En ciertas realizaciones, se pueden utilizar reactivos, tales como DharmaFECT® y Lipofectamine® para introducir polinucleotidos o protemas en las celulas.

Las caractensticas de liberacion de una composicion farmaceutica de la presente invencion dependen del material de encapsulamiento, la concentracion del farmaco encapsulado, y la presencia de modificadores de la liberacion. Por ejemplo, la liberacion puede ser manipulada para ser dependiente de pH, por ejemplo, usando un recubrimiento sensible al pH que libera solo en un pH bajo, como en el estomago, o un pH mas alto, como en el intestino. Un recubrimiento enterico puede utilizarse para prevenir que la liberacion ocurra hasta despues del paso a traves del estomago. Pueden utilizarse multiples recubrimientos o mezclas de cianamida encapsuladas en diferentes materiales para obtener una liberacion inicial en el estomago, seguido por una liberacion posterior en el intestino. La liberacion tambien puede ser manipulada por la inclusion de sales o agentes de formacion de poro, que pueden aumentar la absorcion de agua o liberacion de farmaco por difusion desde la capsula. Tambien pueden utilizarse los excipientes que modifican la solubilidad del farmaco para controlar la tasa de liberacion. Los agentes que intensifican la degradacion de la matriz o la liberacion desde la matriz tambien se pueden incorporar. Pueden anadirse al farmaco, anadirse como una fase separada (es decir, en forma de partfculas), o pueden ser co-disueltos en la fase de polfmero dependiendo del compuesto. En la mayona de los casos la cantidad debe ser entre 0,1 y treinta por ciento (p/p de polfmero). Los tipos de intensificadores de la degradacion incluyen sales inorganicas tales como sulfato de amonio y cloruro de amonio, acidos organicos tal como acido cftrico, acido benzoico y acido ascorbico, bases inorganicas tales como carbonato de sodio, carbonato de potasio, carbonato de calcio, carbonato de zinc, e hidroxido de zinc, y bases organicas tales como sulfato de protamina, espermina, colina, etanolamina, dietanolamina y trietanolamina y agentes tensioactivos tales como Tween® y Pluronic®. Los agentes de formacion de poros que anaden microestructura a las matrices (es decir, compuestos solubles en agua tales como sales inorganicas y azucares) se agregan en forma de partfculas. El intervalo es generalmente entre uno y treinta por ciento (p/p de polfmero).

La absorcion tambien puede ser manipulada alterando el tiempo de residencia de las partfculas en el intestino. Esto puede lograrse, por ejemplo, recubriendo la partfcula con, o seleccionando como el material de encapsulamiento, un polfmero adhesivo mucosal. Los ejemplos incluyen la mayona de polfmeros con grupos carboxilo libres, tal como quitosano, celulosas y especialmente poliacrilatos (como se usa en la presente memoria, poliacrilatos se refiere a polfmeros que incluyen grupos acrilato y grupos acrilato modificados tales como cianoacrilatos y metacrilatos).

Un oligomero puede ser formulado para estar contenido dentro, o, adaptado para liberarse mediante un dispositivo quirurgico o medico o implante. En ciertos aspectos, un implante puede ser recubierto o bien tratado con un oligomero. Por ejemplo, pueden utilizarse hidrogeles u otros polfmeros, tales como polfmeros biocompatibles y/o biodegradables, para recubrir un implante con las composiciones de la presente invencion (es decir, la composicion puede adaptarse para su uso con un dispositivo medico usando un hidrogel u otro polfmero). Los polfmeros y copolfmeros para dispositivos medicos de recubrimiento con un agente son bien conocidos en la tecnica. Los ejemplos de implantes incluyen, pero no se limitan a, stents, stents de elucion de farmaco, suturas, protesis, cateteres vasculares, cateter de dialisis, injertos vasculares, valvulas cardfacas protesicas, marcapasos cardiacos, desfibriladores cardioversores implantables, agujas IV, dispositivos de ajuste y formacion osea, tales como pernos, tomillos, placas y otros dispositivos, y matrices de tejido artificial para la cicatrizacion de heridas.

Ademas de los metodos proporcionados en la presente memoria, los oligomeros para su uso de acuerdo con la invencion pueden formularse para la administracion de cualquier manera conveniente para su uso en medicina humana o veterinaria, por analogfa con otros productos farmaceuticos. Los oligomeros antisentido y sus formulaciones correspondientes pueden administrarse solos o en combinacion con otras estrategias terapeuticas en el tratamiento de la distrofia muscular, tal como trasplante de mioblasto, terapias con celulas madre, administracion de antibioticos aminoglucosidos, inhibidores de proteasoma y terapias de regulacion al alza (por ejemplo, regulacion al alza de utrofina, un paralogo autosomico de distrofina).

Las vfas de administracion descritas solo tienen como objetivo servir de grna puesto que un profesional con experiencia sera capaz de determinar facilmente la via optima de administracion y cualquier dosificacion para cualquier animal y afeccion en particular. Se han probado multiples enfoques para introducir material genetico nuevo funcional en las celulas, tanto in vitro como in vivo (Friedmann (1989) Science, 244:1275-1280). Estos enfoques incluyen la integracion del gen a expresarse en retrovirus modificados (Friedmann (1989) supra; Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S-5079S); integracion en vectores no retrovirus (por ejemplo, vectores virales adeno-asociados) (Rosenfeld, et al. (1992) Cell, 68:143-155; Rosenfeld, et al. (1991) Science, 252:431-434); o la administracion de un transgen ligado a un elemento potenciador de promotor heterologo mediante liposomas (Friedmann (1989), supra; Brigham, et al. (1989) Am. J. Med. Sci., 298:278- 281; Nabel, et al. (1990) Science, 249:1285-1288; Hazinski, et al. (1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209; y Wang and Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84:7851-7855); acoplado a sistemas de transporte basados en cation, espedficos de ligando (Wu and Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624) o el uso de vectores de expresion de Ad N desnudo (Nabel et al. (1990), supra); Wolff et al. (1990) Science, 247:1465-1468). La inyeccion directa de los transgenes en tejido produce solo expresion localizada (Rosenfeld (1992) supra); Rosenfeld et al. (1991) supra; Brigham et al. (1989) supra; Nabel (1990) supra; y Hazinski et al. (1991) supra). The Brigham et al. group (Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278-281 and Clinical Research (1991) 39 (resumen)) han descrito la transfeccion in vivo solo de pulmones de los ratones tras la administracion intravenosa o intratraqueal de un complejo de liposomas-ADN. Un ejemplo de un artfculo de revision de procedimientos de terapia genica es: Anderson, Science (1992) 256:808-813.

IV. Ejemplos

Materiales y Metodos

Condiciones de tratamiento de celulas y cultivo tisular

Se sembraron celulas de rabdomiosarcoma humanas (ATCC, CCL-136; celulas RD) en matraces T75 tratados con cultivo de tejidos (Nunc) a 1,5 x 106 celulas/matraz en 24 ml de DMEM calentado con L-glutamina (HyClone), suero bovino fetal 10 % y solucion antibiotica de penicilina-estreptomicina 1 % (CelGro); despues de 24 horas, los medios se aspiraron, las celulas se lavaron una vez en PBS calentado y se agrego medio fresco. Las celulas se cultivaron hasta el 80 % de confluencia en una incubadora a 37°C en 5,0 % de CO2 y se cosecharon usando tripsina. Los oligomeros de morfolino fosforodiamidato liofilizados (PMO) se suspendieron de nuevo en aproximadamente 0,5 a 2,0 mM en agua libre de nucleasa; para verificar la molaridad, se midieron soluciones de PMO usando un espectrofotometro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Los PMO se administraron a las celulas RD con nucleoporacion segun las instrucciones del fabricante y el kit SG (Lonza). Los PMO fueron probados en diferentes concentraciones, como se indica (por ejemplo, 2,5, 5, 10, 12,5, 20 y 25 micromolar). Las celulas fueron incubadas durante 24 horas despues de la nucleoporacion a aproximadamente 2-3 x 105 celulas por pocillo de una placa de 12 o 24 pocillos (n = 2 o 3) y despues se sometieron a la extraccion de ARN como se describe a continuacion.

Los mioblastos humanos primarios fueron cultivados en medio de crecimiento de celulas del musculo esqueletico (PromoCell) utilizando tecnicas estandar. La nucleoporacion de los PMO a diferentes concentraciones se realizo como se describe para las celulas RD anteriores. Las celulas se sembraron por triplicado en pocillos de una placa de 12 pocillos en medio de crecimiento PromoCell y se dejo incubar durante 24 horas antes de la extraccion de ARN como se describe a continuacion.

Extraccion de ARN y amplificacion por PCR

Se extrajo ARN de celulas tratadas con PMO (celulas RD o mioblastos humanos primarios) usando el kit de aislamiento de ARN de 96 pocillos RNAspin de GE Healthcare y sometido a RT-PCR anidada usando tecnicas estandar y los siguientes pares de cebadores. Cebadores externos: directo 5'-CTTGGACAGAACTTACCGACTGG-3' (SEQ ID NO: 22), inverso 5'-GTTTCTTCCAAAGCAGCCTCTCG-3'(SEQ ID NO: 23); cebadores internos: directo 5'-GCAGGATTTGGAACAGAGGCG-3'(SEQ ID NO: 25), inverso 5'-CATCTACATTTGTCTGCCACTGG-3'(SEQ ID NO: 25). El salto del exon se midio por electroforesis en gel o mediante el bioanalizador Caliper LabChip y se represento graficamente el porcentaje de salto del exon (es decir, intensidad de la banda del producto en el que se salto el exon respecto al producto de PCR de longitud completa) como se muestra en las Figuras 3-5.

Preparation de subunidades de morfolino, PMO y PMO con enlaces inter-subunidad modificados

Esquema 1: Ruta sintetica general del PMO y subunidades de PMO modificadas

En referencia al Esquema de reaccion 1, en el que B representa un radical de apareamiento de bases y PG representa un grupo protector, las subunidades de morfolino se pueden preparar a partir del ribonucleosido correspondiente (1) como se muestra. La subunidad de morfolino (2) puede ser opcionalmente protegida por reaccion con un precursor de grupo protector adecuado, por ejemplo cloruro de tritilo. El grupo protector 3' generalmente se elimina durante la smtesis del oligomero en estado solido como se describe en mas detalle a continuacion. El radical de apareamientos de bases puede estar convenientemente protegido para la smtesis del oligomero en fase solida. Los grupos protectores adecuados incluyen benzoflo para adenina y citosina, fenilacetilo para guanina y pivaloiloximetilo para hipoxantina (I). El grupo pivaloiloxlmetilo se puede introducir en la posicion N1 de la base heterodclica de hipoxantina. Aunque se puede emplear una subunidad desprotegida de hipoxantina, los rendimientos de las reacciones de activacion son muy superiores cuando la base esta protegida. Otros grupos protectores adecuados incluyen los divulgados en la Patente US-8.076.476, que se incorpora aqu por referencia en su totalidad.

La reaccion de 3 con el compuesto de fosforo activado 4a o 4b da como resultado subunidades morfolino con el radical de enlace deseado (5a o 5b). Hay que senalar que los radicales R1 y/o L1 tambien se pueden instalar en el anillo heterodclico Z despues de la formacion del enlace P-O o incluso despues que la subunidad se haya incorporado en un oligomero.

Los compuestos de estructura 4a o 4b se pueden preparar usando cualquier numero de metodos conocidos por aquellos expertos en la materia, incluyendo aquellos descritos en los ejemplos. El acoplamiento con el radical morfolino procede a continuacion como se ha senalado mas arriba.

Los compuestos de estructura 5a o 5b se pueden usar en la smtesis del oligomero en fase solida para la preparacion de oligomeros que comprenden los enlaces inter-subunidad. Tales metodos son bien conocidos en la tecnica. Brevemente, un compuesto de estructura 5a o 5b se puede modificar en el extremo 5' para contener un conector unido a un soporte solido. Una vez soportado, se elimina el grupo protector de 5a o 5b (por ejemplo, tritilo en el extremo 3') y la amina libre reacciona con un radical fosforoso activado de un segundo compuesto de estructura 5 (o un analogo del mismo). Esta secuencia se repite hasta obtener la longitud oligo deseada. El grupo protector en el extremo 3' terminal puede eliminarse o dejarse si se desea una modificacion 3'. El oligo se puede retirar del soporte solido usando cualquier metodo, o tratamiento de ejemplo con una base para escindir el enlace con el soporte solido.

La preparacion de oligomeros de morfolino en general y de oligomeros de morfolino espedficos de la invencion se describe con mas detalle en los ejemplos.

Ejemplo 1

Preparacion de oligomeros de morfolino

La preparacion de los compuestos de la invencion se realiza utilizando el siguiente protocolo:

Preparacion de carbamato de tritil fenil piperazina 35 (Figura 2): A una suspension enfriada del compuesto 11 en diclorometano (6 ml/g 11) se anadio una solucion de carbonato de potasio (3,2 eq) en agua (4 ml/g de carbonato de potasio). A esta mezcla de dos fases se anadio lentamente una solucion de cloroformiato de fenilo (1,03 eq) en diclorometano (2 g/g de cloroformiato de fenilo). La mezcla de reaccion se calento a 20 °C. Una vez finalizada la reaccion (1-2 horas), se separaron las capas. La capa organica se lavo con agua y se seco sobre carbonato de potasio anhidro. El producto 35 se aislo por cristalizacion en acetonitrilo.

Preparacion de alcohol de carbamato 36: Se suspendio hidruro de sodio (1,2 eq) en 1-metil-2-pirrolidinona (32 ml/g de hidruro de sodio). A esta suspension se agregaron trietilenglicol (10,0 eq) y el compuesto 35 (1,0 eq). La suspension resultante se calento a 95 °C. Una vez finalizada la reaccion (1-2 horas), se enfrio la mezcla a 20 °C. A esta mezcla se agrego diclorometano/metil terc-butil eter 30 % (v:v) y agua. La capa organica que contiene el producto se lavo sucesivamente con NaOH acuoso, acido sucdnico acuoso y cloruro de sodio acuoso saturado. El producto 36 se aislo por cristalizacion en diclorometano/metil terc-butil eter/heptano.

Preparacion de acido de la cola 37: A una solucion del compuesto 36 en tetrahidrofurano (7 ml/g 36) se anadio anfndrido sucdnico (2,0 eq) y DMAP (0,5 eq). La mezcla se calento a 50 °C. Una vez finalizada la reaccion (5 horas), la mezcla se enfrio a 20 °C y se ajusto a pH 8,5 con NaHCO3 acuoso. Se anadio metil terc-butil eter y el producto fue extrafdo en la capa acuosa. Se anadio diclorometano, y la mezcla se ajusto a pH 3 con acido dtrico acuoso. La capa organica que contiene el producto se lavo con una mezcla de tampon citrato pH = 3 y cloruro de sodio acuoso saturado. Esta solucion de diclorometano de 37 fue utilizada sin aislamiento en la preparacion del compuesto 38.

Preparacion de 38: A la solucion del compuesto 37 se anadio imida del acido N-hidroxi-5-norbornen-2,3-dicarboxflico (HONB) (1,02 eq), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,34 eq) y despues clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) (1,1 eq). La mezcla se calento a 55 °C. Una vez finalizada la reaccion (4-5 horas), la mezcla se enfrio a 20 °C y se lavo sucesivamente con acido dtrico 0,2 M/salmuera 1:1 y salmuera. Se cambio el disolvente de la solucion de diclorometano a acetona y despues a N,N-dimetilformamida y el producto se aislo por precipitacion en acetona/N,N-dimetilformamida en cloruro de sodio acuoso saturado. El producto crudo se resuspendio varias veces en agua para eliminar los restos de N,N-dimetilformamida y las sales.

La introduccion de la “cola” activada en la resina cargada con ancla se realizo en dimetil imidazolidinona (DMI) mediante el procedimiento utilizado para la incorporacion de las subunidades durante la smtesis en fase solida. Preparacion del soporte solido para la smtesis de oligomeros de morfolino: Este procedimiento se realizo en un recipiente de peptido con camisa, silanizado (ChemGlass, NJ, USA) con una frita de vidrio de porosidad gruesa (40­ 60 pm), agitador superior y llave de teflon de 3 vfas para permitir que el N2 burbujee a traves de la frita o tras extraccion con vado.

Las etapas de tratamiento/lavado de la resina en el procedimiento siguiente consiste en dos operaciones basicas: fluidizacion de la resina o reactor de lecho agitado y extraccion en disolvente/solucion. Para la fluidizacion de la resina, se coloco la llave de paso para permitir el flujo ascendente de N2 a traves de la frita y se anadio al reactor el tratamiento/lavado de la resina especificado y se dejo impregnar y mojar completamente la resina. Se inicio entonces la mezcla y la suspension de la resina se mezclo durante el tiempo especificado. Para la extraccion en disolvente/solucion, se detuvo la mezcla y el flujo de N2 y se inicio la bomba de vado y a continuacion se coloco la llave de paso para permitir la evacuacion del tratamiento/lavado de resina para su eliminacion. Todos los volumenes de tratamiento/lavado de resina fueron de 15 ml/g de resina a menos que se indique lo contrario.

A una resina de aminometilpoliestireno (malla 100-200, carga de ~1,0 mmol/g basado en la sustitucion de nitrogeno; 75 g, 1 eq, Polymer Labs, Reino Unido, parte N.° 1464-X799) en un recipiente de peptido con camisa, silanizado se anadio 1-metil-2-pirrolidinona (NMP; 20 ml/g resina) y la resina se dejo hinchar con el mezclado durante 1-2 horas. Tras la evacuacion del disolvente hinchado, la resina se lavo con diclorometano (2 x 1-2 min), diisopropiletilamina 5 % en isopropanol/diclorometano 25 % (2 x 3-4 min) y diclorometano (2 x 1-2 min). Despues de la evacuacion del lavado final, la resina fue tratada con una solucion de anclaje disulfuro 34 en 1-metil-2- pirrolidinona (0,17 M; 15 ml/g de resina, ~2,5 eq) y la mezcla de resina/reactivo fue calentada a 45 °C durante 60 horas. Al finalizar la reaccion, se interrumpio el calentamiento y la solucion de anclaje fue evacuada y la resina se lavo con 1-metil-2-pirrolidinona (4 x 3-4 min) y diclorometano (6 x 1-2 min). La resina fue tratada con una solucion de 10 % (v/v) de dicarbonato de dietilo en diclorometano (16 ml/g; 2 x 5-6 minutos) y luego se lavo con diclorometano (6 x 1-2 min). La resina 39 (vease la Figura 3) se seco en una corriente de N2 durante 1-3 horas y despues a vado hasta un peso constante (± 2 %). Rendimiento: 110-150 % del peso original de la resina.

Determinacion de la carga de resina de aminometilpoliestireno-disulfuro: La carga de la resina (numero de sitios reactivos potencialmente disponibles) se determina mediante un analisis espectrometrico para el numero de grupos trifenilmetilo (tritil) por gramo de resina.

Un peso conocido de resina seca (25 ± 3 mg) se transfiere a un matraz aforado silanizado de 25 ml y se agrega ~5 ml de 2 % (v/v) de acido trifluoroacetico en diclorometano. Los contenidos se mezclan agitando suavemente y luego se dejan reposar durante 30 minutos. El volumen se lleva hasta 25 ml con acido trifluoroacetico adicional 2 % (v/v) en diclorometano y el contenido se mezcla a fondo. Usando una pipeta de desplazamiento positivo, se transfiere una alfcuota de la solucion que contiene tritilo (500 pl) a un matraz aforado de 10 ml y se completa el volumen hasta 10 ml con acido metanosulfonico.

El contenido de cation tritilo en la solucion final se mide por absorbancia UV a 431,7 nm y la carga de resina se calculo en grupos tritilo por gramo de resina (pmol/g) usando los volumenes, diluciones, coeficiente de extincion (e: 41 jm o f1 cm'1) y peso de la resina adecuados. El ensayo se realizo por triplicado y se calculo una carga promedio. El procedimiento de carga de la resina en este ejemplo proporcionara la resina con una carga de aproximadamente 500 pmol/g. Una carga de 300-400 pmol/g se obtiene si se realiza la etapa de incorporacion del anclaje de disulfuro durante 24 horas a temperatura ambiente.

Carga de la cola: Utilizando la misma configuracion y volumenes en cuanto a la preparacion de la resina de aminometilpoliestireno-disulfuro, se puede introducir la cola en un soporte solido. La resina de anclaje cargada fue desprotegida primero en condiciones acidas y el material resultante se neutralizo antes del acoplamiento. Para la etapa de acoplamiento, se uso una solucion de 38 (0.2 M) en DMI que contiene 4-etilmorfolina (NEM, 0,4 M) en lugar de la solucion de anclaje de disulfuro. Despues de 2 horas a 45 °C, la resina 39 se lavo dos veces con diisopropiletilamina 5 % en isopropanol/diclorometano 25 % y una vez con DCM. A la resina se anadio una solucion de anhudrido benzoico (0,4 M) y NEM (0,4 M). Despues de 25 minutos, la camisa del reactor se enfrio a temperatura ambiente, y la resina se lavo dos veces con diisopropiletilamina 5 % en isopropanol/diclorometano 25 % y ocho veces con DCM. La resina 40 se filtro y se seco a alto vado. La carga de la resina 40 se define como la carga de la resina aminometilpoliestireno-disulfuro 39 original usada en la carga de la cola.

Smtesis en fase solida: Los oligomeros de morfolino se prepararon en un sintetizador automatizado de peptidos AMS-422 de Gilson en columnas de reaccion de propileno Gilson de 2 ml (parte N.° 3980270). Se coloco un bloque de aluminio con canales para el flujo de agua alrededor de las columnas conforme se saturan en el sintetizador. El AMS-422 anadira alternativamente soluciones de reactivo/lavado, se mantuvo durante un tiempo especificado y evacuara las columnas usando vado.

Para los oligomeros en el intervalo de hasta aproximadamente 25 subunidades de longitud, se prefiere la resina de aminometilpoliestireno-disulfuro con la carga cerca de 500 pmol/g de resina. Para los oligomeros mas grandes, se prefiere una resina de aminometilpoliestireno-disulfuro con una carga de 300-400 pmol/g de resina. Si se desea una molecula con cola en 5', se elige la resina que se ha cargado con la cola siguiendo las mismas directrices de carga. Se prepararon las siguientes soluciones de reactivo:

Solucion de destritilacion: acido cianoacetico 10 % (p/v) en diclorometano/acetonitrilo 4:1; Solucion de neutralizacion: diisopropiletilamina 5 % en diclorometano/isopropanol 3:1; solucion de acoplamiento: subunidad de morfolino activada 0,18 M (o 0,24 M para los oligomeros que han crecido hasta mas de 20 subunidades) de la base y tipo de enlace deseados y N-etilmorfolina 0,4 M, en 1,3-dimetilimidazolidinona. Se uso diclorometano (DCM) como un lavado de transicion separando los diferentes lavados de solucion de reactivo.

En el sintetizador, con el bloque fijado a 42 °C, se anadio a cada columna que contiene 30 mg de resina de aminometilpoliestireno-disulfuro (o resina de cola) 2 ml de 1 -metil-2-pirrolidinona y se dejo asentar a temperatura ambiente durante 30 minutes. Despues de lavar 2 veces con 2 ml de diclorometano, se empleo el siguiente ciclo de smtesis:

Etapa Volumen Dispensacion Tiempo de retencion Detritilacion 1,5 ml Colector 15 segundos

Detritilacion 1,5 ml Colector 15 segundos

Detritilacion 1,5 ml Colector 15 segundos

Detritilacion 1,5 ml Colector 15 segundos

Detritilacion 1,5 ml Colector 15 segundos

Detritilacion 1,5 ml Colector 15 segundos

Detritilacion 1,5 ml Colector 15 segundos

DCM 1,5 ml Colector 30 segundos

Neutralizacion 1,5 ml Colector 30 segundos

Neutralizacion 1,5 ml Colector 30 segundos

Neutralizacion 1,5 ml Colector 30 segundos

Neutralizacion 1,5 ml Colector 30 segundos

Neutralizacion 1,5 ml Colector 30 segundos

Neutralizacion 1,5 ml Colector 30 segundos

DCM 1,5 ml Colector 30 segundos

Acoplamiento 350-500 Ml Jeringa 40 minutos

DCM 1,5 ml Colector 30 segundos

Neutralizacion 1,5 ml Colector 30 segundos

Neutralizacion 1,5 ml Colector 30 segundos

DCM 1,5 ml Colector 30 segundos

DCM 1,5 ml Colector 30 segundos

DCM 1,5 ml Colector 30 segundos

Las secuencias de los oligomeros individuales se programaron en el sintetizador para que cada columna reciba la solucion de acoplamiento apropiada (A, C, G, T, I) en la secuencia apropiada. Cuando el oligomero de una columna habfa completado la incorporacion de su subunidad final, la columna se eliminaba del bloque y se realizaba manualmente un ciclo final con una solucion de acoplamiento que comprendfa cloruro de 4-metoxitrifenilmetilo (0,32 M en DMI) que contiene 4-etilmorfolina 0,89 M.

Escision de la resina y la eliminacion de bases y grupos protectores de la cadena principal: Despues de la metoxitritilacion, la resina se lavo 8 veces con 2 ml de 1-metil-2-pirrolidinona. Se anadio un ml de una solucion de escision que consiste en 1,4-ditiotreitol (DTT) 0,1 M y trietilamina 0,73 M en 1-metil-2-pirrolidinona, la columna se tapo, y se dejo asentar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Despues de este tiempo, la solucion se dreno en un vial de Wheaton de 12 ml. La resina visiblemente encogida, se lavo dos veces con 300 pl de solucion de escision. A la solucion se anadio 4,0 ml de amomaco acuoso concentrado (almacenado a -20°C), el vial se tapo hermeticamente (con tapa de rosca alineada de Teflon), y la mezcla se sometio a movimientos circulares para mezclar la solucion. El vial se coloco en un horno a 45 °C durante 16-24 horas para efectuar la escision de la base y los grupos protectores de la cadena principal.

Purificacion del producto crudo: La solucion de amonolisis en vial se elimino del horno y se dejo enfriar a temperatura ambiente. La solucion se diluyo con 20 ml de amomaco acuoso al 0,28 % y se paso a traves de una columna de 2,5 x 10 cm que contiene resina Macroprep HQ 35 (BioRad). Se uso un gradiente de sal (A: 0,28 % de amomaco con B: cloruro de sodio 1M en 0,28 % de amomaco; 0-100 % de B en 60 min) para eluir el pico que contiene metoxitritilo. Las fracciones combinadas se agruparon y procesaron dependiendo del producto deseado.

Desmetoxitritilacion de oligomeros de morfolino: Las fracciones agrupadas de la purificacion de Macroprep se trataron con H³PO⁴ 1M para disminuir el pH a 2,5. Despues de la mezcla inicial, las muestras se asentaron a temperatura ambiente durante 4 minutos, tras lo cual se neutralizan a pH 10-11 con amomaco 2,8 %/agua. Los productos se purificaron por extraccion en fase solida (SPE).

Empaquetamiento y acondicionamiento de la columna SPE: Amberchrome CG-300M (Rohm and Haas; Philadelphia, PA) (3 ml) se empaqueta en columnas fritadas de 20 ml (columnas de cromatograffa BioRad Econo-Pac (732-1011)) y la resina se enjuaga con 3 ml de lo siguiente: 0,28 % de NH⁴OH/8O % de acetonitrilo; NaOH 0,5M/20 % de etanol; agua; 50 mM H³PO⁴/80 % de acetonitrilo; agua; NaOH 0,5 M/20 % de etanol; agua; 0,28 % de NH⁴OH.

Purificacion de SPE: La solucion de desmetoxitritilacion se cargo en la columna y la resina se lavo tres veces con 3­ 6 ml de amomaco acuoso 0,28 %. Se coloco un vial de Wheaton (12 ml) bajo la columna y el producto se eluyo con dos lavados con 2 ml de acetonitrilo 45 % en amomaco acuoso 0,28 %

Aislamiento del producto: Las soluciones se congelaron en hielo seco y los viales se colocaron en un liofilizador para producir un polvo blanco esponjoso. Las muestras se disolvieron en agua, se filtraron a traves de un filtro de 0,22 micrometros (Pall Life Sciences, filtro de jeringa Acrodisc de 25 mm, con una membrana HT Tuffryn de 0,2 micrometros) utilizando una jeringa y la densidad optica (OD) se midio en un espectrofotometro UV para determinar las unidades de OD del oligomero presente, asf como dispensar una muestra para analisis. Las soluciones se colocaron de nuevo en viales de Wheaton para liofilizacion.

Analisis de oligomeros de morfolino por MALDI: La espectrometna de masas MALDI-TOF se utilizo para determinar la composicion de fracciones en purificaciones asf como para proporcionar evidencia de la identidad (peso molecular) de los oligomeros. Las muestras se aplicaron tras la dilucion con solucion de acido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinamico (acido sinapmico), 3,4,5-trihidoxiacetofenona (THAP) o acido alfa-ciano-4-hidoxicinamico (HCCA) como matrices.

Ejemplo 2

Usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1, se sintetizo el siguiente PMO, H53A(+36+60), SEQ ID NO: 1 (5'-GTTGCCTCcGGTTCTGAAGGTGTTC-3') y se uso en los ejemplos.

Ejemplo de referencia 3

Usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1, se sintetizo el siguiente PMO, H53A(+30+57), SEQ ID NO: 2 (5'-GCC TCC GGT TCT GAA GGT GTT CTT GtA C-3') y se uso en los Ejemplos.

Ejemplo de referencia 4

Usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1, se sintetizo el siguiente PMO, H53A(+30+56), SEQ ID NO: 3 (5'-CCT CCG GTT CTG AAG GTG TTC TTG TAC-3') y se uso en los Ejemplos.

Ejemplo de referencia 5

Usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1, se sintetizo el siguiente PMO, H53A(+30+55), SEQ ID NO: 4 (5'-CTC CGG TTC T^gA AGG TGT TCT TGT AC-3') y se uso en los Ejemplos.

Ejemplo de referencia 6

Usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1, se sintetizo el siguiente PMO, H53A(+33+57), SEQ ID NO: 5 (5'-GCC TCC GGT TCT GAA GGT GTT CTT G-3') y se uso en los Ejemplos.

Ejemplo 7

Salto del exon 53

Se diseno una serie de oligomeros antisentido que se dirigen al exon 53 de la distrofina humana y se sintetizaron de la siguiente manera:

(Las SEQ ID NOs: 2 a 9 no son de acuerdo con la invencion)

Los oligomeros antisentido anteriores se evaluaron para determinar la eficacia del salto del exon mediante el tratamiento de los mioblastos humanos primarios en las diferentes concentraciones indicadas. En estos experimentos, se usaron los oligomeros antisentido correspondientes a H53A(+33+60), y H53A(+31+55) como oligomeros comparativos. Como se muestra en las Figuras 3 y 4, el oligomero H53A(+36+60) (SEQ ID NO: 1) fue muy efectivo en inducir el salto del exon 53 en celulas de mioblasto humano primario. H53A(+31+55) (SEQ ID NO: 7) y H53A(+22+46) (SEQ ID NO: 8) tambien indujeron el salto del exon 53, pero en un menor grado que H53A(+33+60) (SEQ ID NO: 6) y H53A(+36+60) (SEQ ID NO: 1). Como se muestra en la Figura 3, H53A(+33+60) y H53A(+36+60) (SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 1, respectivamente) fueron muy efectivos en inducir el salto del exon 53 en mioblastos cultivados en comparacion con otros oligonucleotidos antisentido muy activos.

Los oligomeros antisentido adicionales anteriores se evaluaron para determinar la eficacia del salto del exon mediante el tratamiento de las celulas RD en las diferentes concentraciones indicadas. En estos experimentos, el oligomero antisentido correspondiente a H53A(+33+60) (SEQ ID NO: 6) se uso como un oligomero comparativo. Como se muestra en la Figura 4, los oligomeros H53A(+30+57), H53a (+30+56), H53A(+30+55) y H53A(+33+57) (SEQ ID NO: 2-5, respectivamente) son comparables en actividad al oligomero H53A(+33+60) (SEQ ID NO: 6).

En otro experimento, un oligomero antisentido de la invencion se probo para determinar el salto del exon 53 en mioblastos humanos primarios en comparacion con los oligonucleotidos antisentido publicados. Ademas del H53A(+23+47) (SEQ ID NO: 9) descrito antes, H53A(+39+69), H53A(+39+62), y H53A(+45+69) (SEQ ID NOs: 10, 11, y 12, respectivamente) de la patente US-8.232.384; h53AON1 (+45+62) (SEQ ID NO: 13) del documento WO2004/083446; y PMO3(+32+56) y PMO8(+36+56) (SEQ ID NOs: 14 y 15, respectivamente) del documento WO2012/029986 se compararon con un oligomero ilustrativo de la invencion H53A(+36+60) (SEQ ID NO:1). Como se muestra en las Figuras 5A y 5B, se determino que el oligomero que mostraba la CE50 mas baja era el H53A(+36+60) SEQ ID NO: 1. Esto se confirmo sometiendo los resultados a un analisis de regresion de tres parametros dentro del programa GraphPad Prism para generar los valores CE50 como se muestra en la siguiente tabla.

REFERENCIAS

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Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Un nucleotido antisentido que tiene la siguiente estructura:

en la que

y

en la que ^ = la estereoquímica del centro de fosforo no esta definida; o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

2. Una composicion farmaceutica que comprende el oligonucleotido antisentido de la reivindicacion 1 y un vehnculo farmaceuticamente aceptable.

3. La composicion de la reivindicacion 2 para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne.