ES2386738T3

ES2386738T3 - Composiciones y métodos de uso para anticuerpos de C-MET

Info

Publication number: ES2386738T3
Application number: ES07754114T
Authority: ES
Inventors: David Raymond Stover; Josef Prassler; Catrin Berger; Bodo Brocks
Original assignee: Novartis Pharma GmbH; Novartis AG
Current assignee: Novartis Pharma GmbH; Novartis AG
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2012-08-28
Anticipated expiration: 2027-03-29
Also published as: BRPI0709917A2; TW200815470A; JP5536445B2; PE20080352A1; CN103183738B; EP2004693B1; CN101415730A; EP2004693A2; JP2009532026A; AR060241A1; AU2007245181A1; US8101727B2; RU2008142833A; CL2007000851A1; US20090175860A1; WO2007126799A3; CA2646048A1; WO2007126799A2; KR20080113218A; MX2008012485A

Abstract

Un antígeno humano humanizado o una porción de enlazamiento a antígeno de los mismos que comprende unaregión en enlazamiento antígeno que es específico para una proteína diana c-Met, en donde el anticuerpo o la porciónde enlazamiento a anticuerpo del mismo comprende los CDRs del VL y los dominios de:(a) anticuerpo 5091 de SEQ ID NOs. 34 y 66(b) anticuerpo 5097 de EQ ID NOs. 37 y 67;(c) Anticuerpo 5098 de SEQ ID NOs. 38 y 68; o(d) Anticuerpo 5185 de SEQ ID NOs. 53 y 71.

Description

Composiciones y métodos de uso para anticuerpos de c-Met

La presente invención se relaciona con composiciones que contienen anticuerpos que específicamente se enlazan a la proteína objetivo c-Met, métodos para hacer estos anticuerpos, y métodos de uso para tratar condiciones proliferativas, tales como cánceres y metástasis, y condiciones inflamatorias.

El receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, denominado aquí como c-Met, es un receptor tirosina quinasa que ha demostrado ser sobreexpresado y/o mutar en una variedad de enfermedades malignas, especialmente un cierto número de mutaciones c-Met se encuentran en diversos tumores en fase sólida. El ligando c-Met, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), también conocido como factor de dispersión (SF), se enlaza a c-Met a una ruta que está implicada en la invención y metástasis de células tumorales (Ma et al., 2003 Cancer and Metastasis Reviews. 22:309-325).

La interacción HGF con c-Met inicia una cascada de eventos intracelulares (Derman et al., 1996 J Biol Chem 23; 271(8):4251-4255). El enlazamiento de HGF da como resultado la activación de la actividad intrínseca de la tirosina quinasa de c-Met y la autofosfoliración de varios residuos de tirosina sobre el dominio intracelular (Ma et al., 2003 Cancer and Metastasis Reviews. 22:309-325). La interacción de la ruta HGF/c-Met da como resultado una amplia dispersión de respuestas celulares incluyendo la dispersión celular, angiogénesis, proliferación, motilidad celular potenciada, invasión y metástasis. El antagonismo puede actuar para inhibir la autofosforilación y/o para inducir la internalización del c-Met de la superficie y/o para subregular la actividad de c-Met. La WO 2005/016382 divulgas anticuerpos y porciones enlazantes de antígenos de los mismos que se enlazan a c-Met, y actúan predominantemente como antagonistas de c-Met. En el Ejemplo 1 se divulgan los anticuerpos IgG2 humanos a c-Met, los cuales tienen valores de KD de menos de 2.0 x 10-9 M.

Las células tumorales pueden invadir los bordes de un tejido, degradad y remodelar la matriz extracelular circundante, de tal manera que las células tumorales puedan migrar a través de los bordes del tejido de la matriz extracelular permitiendo la diseminación y formación de metástasis. La señalización de HGF/c-Met es una ruta que media el crecimiento normal y maligno invasivo. Las mutaciones en sentido equivoco de c-Met han sido identificadas en una variedad de cánceres, localizada la mayoría de estas mutaciones en el dominio de la quinasa. Los mutantes se caracterizan por actividad incrementada de la quinasa promoviendo por lo tanto las acciones biológicas de c-Met.

Hay necesidad de composiciones y métodos para tratar cánceres, metástasis de cánceres y condiciones inflamatorias, tales como agentes que interfieran con la señalización de HGF/c-Met en la cual la actividad de c-Met contribuye a la invasión y/o metástasis.

El receptor de tirosina quinasa c-Met está involucrado en los procesos de migración, invasión y morfogénesis que acompañan la embriogénesis y la regeneración de tejidos. Varias líneas de evidencia han indicado que el c-Met también juega un papel en la patogénesis tumoral. La activación de mutaciones de la línea del germen dentro del dominio de la quinasa de c-Met están asociadas con el desarrollo de carcinoma de las células renales papilares hereditario (PRCC). Las mutaciones dentro del dominio de la quinasa también se han reportado aunque raramente, en formas esporádicas de PRCC, en carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello y en carcinoma gástrico. Niveles elevados de c-Met, junto con si ligando único HGF/SF, se observan con amplia frecuencia en tumores múltiples clínicamente relevantes. Una correlación entre la expresión incrementada y la progresión de la enfermedad, metástasis y mortalidad de los pacientes se ha reportador en varios cánceres, incluyendo de vejiga, seno, y carcinoma gástrico en leimiosarcoma y glioblastoma.

Los anticuerpos de la invención se enlazan específicamente a c-Met con alta afinidad y modulan el efecto de c-Met de la enfermedad. Los anticuerpos que antagonizan con los niveles o actividad de c-Met se contemplan para el tratamiento e enfermedades proliferativas o enfermedades inflamatorias. Las enfermedades proliferativas que se consideran tratables por los anticuerpos de la invención incluyen especialmente cánceres. Los anticuerpos que agonizan los niveles o actividad de c-Met se consideran para la regeneración de órganos, curación de heridas, regeneración de tejidos.

Se divulga aquí un anticuerpo que se enlaza selectivamente a la proteína de c-Met, o una porción inmunológicamente activa de este anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo. El anticuerpo o porción inmunológicamente activa de este anticuerpo es de un mamífero, que tiene un origen tal como un roedor, humano o camélido, o es un anticuerpo humanizado. En particular, el anticuerpo anti-c-Met se caracteriza por tener una región de enlazamiento de antígenos que se específica para la proteína objetivo c-Met y el fragmento anticuerpo funcional se enlaza a c-Met o un fragmento de c-Met. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal, en particular, el anticuerpo o porción inmunológicamente activa de este anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Aspectos adicionales de la solicitud incluyen, por ejemplo, un fragmento funcional, tal como una porción de enlazamiento al antígeno, o un fragmento tal provisto sobre un andamio o marco no tradicional o no basado en la inmunoglobulina.

El anticuerpo o fragmento funcional de este anticuerpo se enlaza a la proteína objetivo, c-Met, con un KD de 2.0 x 10-5 M

o menos, 2.0 x 10-6 M o menos, 2.0 x 10-7 M o menos, 2.0 x 10-8 M o menos, o 2.0 x 10-9 M o menos. En un aspecto relacionado, el anticuerpo o fragmento funcional de este anticuerpo tiene una rata de salida (Koff) para la proteína objetivo c-Met de 1.0 x 10-2 por segundo o más pequeño,1.0 x 10-3 por segundo o más pequeño, 1 x 10-4 por segundo o más pequeño, o 1.0 x 10-5 por segundo o más pequeño. En un aspecto relacionado, el anticuerpo o fragmento funcional de este anticuerpo se enlaza a la proteína objetivo c-Met con un KD de 2.0 x 10-5 M o menos, 2.0 x 10-6 M o menos, 2.0 x 10-7 M o menos, 2.0 x 10-8 M o menos, o 2.0 x 10-9 M o menos, e inhibe el enlazamiento de HGF a c-Met. En un aspecto relacionado, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo antagoniza con la actividad de c-Met.

En ciertos aspectos, el anticuerpo o fragmento funcional de este anticuerpo se enlaza a la proteína objetivo c-Met y modula, esto es, bien sea activa (agoniza) o inhibe (antagoniza) la actividad de c-Met, incluyendo pero no limitándose a la fosforilación, especialmente la autofosforilación.

El agonismo o activación de la fosforilación de c-Met estimula al menos una de las actividades seleccionadas del grupo de regeneración de órganos, curación de heridas y regeneración de tejidos, particularmente donde el órgano es riñón, hígado, páncreas, pulmón, estómago, intestino, piel, timo o tiroides.

En un aspecto, el anticuerpo de la aplicación antagoniza c-Met, donde el antagonismo da como resultado en al menos una actividad selecciona de: inhibición de la proliferación celular, inhibición de la migración celular, inhibición de la supervivencia celular, inhibición de la metástasis y/o inhibición del enlazamiento de HGS o de la inducción de la internalización de c-Met. En la mayoría de la realizaciones, el antagonista del anticuerpo c-Met de la invención puede utilizarse en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, especialmente un cáncer o una enfermedad inflamatoria.

El enlazamiento está determinado por uno o más ensayos que pueden utilizarse para medir la actividad en la cual se trata bien de antagonismo o de agonismo por parte del anticuerpo. Los ensayos miden al menos uno de los efectos del anticuerpo sobre un ligando c-Met que incluye al menos: inducción de una actividad de la enzima de la ruta de transducción de la seña de c-Met; inducción de la expresión de un gen de la ruta de la transducción de la señal de c-Met; enlazamiento directo basado en electroquimioluminisencia a c-Met; ensayo inmunosorbente enlazado con enzima del enlazamiento de c-Met; y proliferación, supervivencia, migración o metástasis de una célula. Si el anticuerpo tiene un efecto antagonistico esto se determina comparando los resultados de los controles que carecen del ligando natural HGF. Así, un anticuerpo antagonistico bloquea la inducción de c-Met incluso en presencia de HGF, mientras que un anticuerpo agonístico produce la inducción en la ausencia de HGF.

En otro aspecto, la solicitud provee secuencias de aminoácidos nucleótidos asilados que proveen anticuerpos y la secuencia de nucleótidos aislados codificadora seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 1-30, 73-76, y 85-88. En un aspecto relacionado, la solicitud provee secuencias de aminoácidos aislados codificadas por estas secuencias de nucleótidos, respectivamente, y variantes conservadoras de estas secuencias de aminoácidos. En otro aspecto relacionado, la secuencia de nucleótidos aislada de cada una de las SEQ ID NOs 1-20 codifica una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de enlazamiento al antígeno. En aun otro aspecto relacionado, la secuencia nucleótidos aislada de cada SEQ ID NOs: 21-30 codifica una secuencia de aminoácidos de un antígeno que se enlaza a una cadena pesada.

En otro aspecto, la solicitud provee una secuencia de aminoácidos aislados seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 3172, 77-84 y 89-96, y variantes conservadoras de estas secuencias. En un aspecto relacionado, la secuencia de aminoácidos aislados de cada SEQ ID NOs: 31-54 incluye un antígeno que se enlaza a cadena liviana. En otro aspecto relacionado, la secuencia de aminoácidos aislada de cada una de SEQ ID NOs: 55-72 incluye un antígeno que se enlaza a una cadena pesada.

En un cierto aspecto, la solicitud proporciona una secuencia de aminoácidos aislada que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 por ciento de identidad con las SEQ ID NOs: 31-72, 77-84 y 89-96. En una realización relacionada, la invención proporciona una secuencia de nucleótidos aislada que tiene al menos 60, 70, 80, 90, 95 o 99 por ciento de identidad con una secuencia representada en SEQ ID NOs: 1-30, 73-76 y 89-96.

En aun otro aspecto la solicitud proporciona una región de enlazamiento con antígeno aislado de cualquiera de estos anticuerpos, o un fragmento funcional de cualquiera de estos anticuerpos. Así en ciertos aspectos, la solicitud proporciona a una región de enlazamiento al antígeno aislada que tiene una cadena ligera codificada por una cadena de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 1-20. En un aspecto relacionado, la solicitud proporciona una región de enlazamiento a antígenos aislada que tiene una cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 21-30. En otro aspecto relacionado, la solicitud proporciona una región de enlazamiento a antígeno aislada que tiene una cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 1-20, y una cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 21-34.

En un aspecto relacionado, la solicitud proporciona una región de enlazamiento a antígeno aislada que tiene una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 31-54. En otro aspecto relacionado, la solicitud provee una región de enlazamiento a antígeno aislada que tiene una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 55-72. En aun otro aspecto relacionado, la solicitud proporciona una región de enlazamiento a antígeno aislada que tiene una cadena ligera con un secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 31-54 y variantes conservadoras de estas secuencias, y una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 55-72 y variantes conservadoras de estas secuencias.

En otro aspecto, la solicitud proporciona una región de enlazamiento a antígeno aislada que tiene una cadena ligera de Ig lambda codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 73. En un aspecto relacionado, la solicitud provee una región de enlazamiento a antígeno aislada que tiene una cadena ligera de Ig kappa codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 74-76.

En un aspecto adicional, la solicitud proporciona una región de enlazamiento a antígeno aislada que tiene una cadena ligera de Ig lambda con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 77-80. En otro aspecto relacionado, la solicitud proporciona una región de enlazamiento a antígeno aislada que tiene una cadena ligera de Ig kappa con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 81-84.

En otro aspecto, la solicitud proporciona un anticuerpo humano o humanizado aislado o un fragmento funcional del anticuerpo, teniendo el anticuerpo una región de enlazamiento al antígeno que es específica para epítopo encontrado en la proteína c-Met, de tal forma que el anticuerpo o los fragmentos funcionales se enlazan a los receptores de superficie de c-Met en una célula, y evita o mejora el desarrollo o metástasis de un cáncer. En un aspecto relacionado, la solicitud proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento funcional que tiene una región de enlazamiento a antígeno que es específica para un epítopo de la proteína objetivo c-Met, conteniendo el epítopo uno o más residuos de aminoácido de un dominio extracelular (ECD) de c-Met. En un aspecto relacionado, el epítopo es un epítopo conformacional.

En aun otro aspecto, el anticuerpo aislado o el fragmento funcional tal como se describen anteriormente es un fragmento de anticuerpo Fab o scFv, o es un nanocuerpo de camelido. El Fab o el scFv en ciertos aspectos son monovalentes. La naturaleza monovalente del anticuerpo es particularmente adecuada para un agente diseñado para antagonizar la proteína de c-Met. En un cierto aspecto, cualquiera de los anticuerpos IgG es un IgG. En un aspecto relacionado, a cualquiera de los anticuerpos anteriores es un IgG1, IgG2, IgG3 o un IgG4. En un aspecto particular el IgG es un IgG4. En un aspecto más específico, el IgG4 es codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 85-88. En aun otro aspecto relacionado, el IgG4 es codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60, 70, 80, 90, 95 o 99 por ciento de identidad con una secuencia seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 85-88. En un aspecto adicional relacionado, la IgG4 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 89-96, y variantes conservadoras de estas secuencias. Alternativamente, el anticuerpo anti-c-Met es un IgA, un IgD, un IgE o un IgM.

En otro aspecto la solicitud proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los anteriores anticuerpos o fragmentos funcionales o variantes conservadoras de estos anticuerpos, y un vehículo excipiente farmacéuticamente aceptable del mismo.

En aun otro aspecto, la solicitud proporciona un animal transgénico o una célula transgénica que porta un gen que codifica cualquiera de los anteriores anticuerpos o fragmentos funcionales de ellos.

En ciertos aspectos, la solicitud proporciona un método para tratar un trastorno o condición relacionados con c-Met el cual involucra administrar a un sujeto que así lo requiere una cantidad efectiva de cualquiera de las composiciones farmacéuticas anteriores. El trastorno o condición es un cáncer o una condición inflamatoria.

En un aspecto, el cáncer es esofágico, de seno, de riñón, incluyendo pero no limitándose a carcinoma de células renales papilares, glioma, cabeza y cuello, epitelial, de pulmones, piel, leucemia, linfoma, mieloma, de cerebro, pancreático, gástrico, gastrointestinal, de estómago, de colon, de intestino, de hígado, genital, urinario, melanoma o de próstata, así como otros tumores conocidos para los experimentados en la técnica. En una realización particular, el cáncer es de hígado o esofágico o es un sarcoma. Más particularmente el cáncer se selecciona del grupo consistente de cáncer de cerebro, cáncer de estómago, cáncer genital, cáncer urinario, cáncer de próstata, cáncer de vejiga (superficial e invasivo muscular), cáncer de seno, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer colorrectal, glioma (incluyendo glioblastoma, astrositoma anaplástico, oligoastrositoma, oligodendroglioma), cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (HCC) incluyendo HCC de la niñez, cáncer de cabeza y cuello (incluyendo carcinoma de las células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo), carcinoma de las células Hurthel, cáncer epitelial, cáncer de piel, melanoma, incluyendo melanoma maligno, mesotelioma, linfoma, mieloma incluyendo mieloma múltiple, leucemias, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas (incluyendo todos los subtipos histológicos: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma broncoalveolar , carcinoma de células grandes y adenoescamoso de tipo mixto), cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de células renales incluyendo cáncer de células renales papilares esporádico, Tipo 1 y Tipo 2, y cáncer de células renales de células claras; sarcomas, en particular osteosarcomas, sarcomas de células claras y sarcomas de tejidos blandos (incluyendo rabdomiosarcomas alveolar y embrional, sarcomas de la parte alveolar suave); carcinoma de tiroides (papilar y otros subtipos). En un aspecto dado, una condición inflamatoria de ejemplo se debe a una infección. En un aspecto, el método de tratamiento seria el bloque de la infección patogénica. En un aspecto particular, la infección es una infección bacteriana, incluyendo, por ejemplo una infección por listeria. Véase, por ejemplo Shen et al. Cell 103: 501-10, (2000). No significando que se limita a un mecanismo de acción, se cree que está bacteria utiliza una proteína de enlazamiento de c-Met para internalizarse a sí misma. Los anticuerpos de la invención bloquearían está interacción, previniendo por lo tanto la internalización. En otro aspecto, el tratamiento estimula un tratamiento una respuesta celular, por ejemplo, una respuesta a la curación de una herida.

En ciertos aspectos, cualquiera de los métodos anteriores involucra la administración adicional de una agente quimioterapéutico. En un aspecto relacionado, el agente quimioterapéutico es un agente anticáncer. Las combinaciones específicas se proporcionan a través de la solicitud.

En un aspecto relacionado, cualquiera de los métodos anteriores involucra la administración adicional de un inhibidor específico de la ruta. El inhibidor específico de la ruta puede ser un agente quimioterapéutico o puede ser un agente biológico, por ejemplo, tal como anticuerpos. Inhibidores específicos de la ruta incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de EGFR, VEGFR, etc.

En aun otros aspecto, la solicitud proporciona un método para tratar una célula no deseada que involucra poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos funcionales de estos anticuerpos. En un aspecto relacionado, la célula porta el c-Met sobre la superficie celular. En otro aspecto relacionado, el método anterior involucra adicionalmente el tratamiento de la célula con un agente quimioterapéutico o radiación. En un aspecto relacionado a varios de los métodos anteriores, después de la administración al sujeto o de poner en contacto la célula, estos métodos pueden involucrar adicionalmente la observación de la mejora o retardo del desarrollo o metástasis del cáncer.

En aun otro aspecto, la solicitud proporciona un método para identificar una de célula que porta el receptor de superficie c-Met, involucrando el método para poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos funcionales de tal manera que los anticuerpos o fragmentos funcionales tengan un marcador detectable. Por ejemplo, el marcador es radiactivo, fluorescente, magnético, paramagnético o quimioluminiscente. En un aspecto relacionado, el método anterior involucra adicionalmente una etapa de generación de imágenes o de separación de la célula. Por ejemplo, la separación de la célula es aislamiento de la célula que porta el c-Met a partir de una población más grande de células. En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano o humanizado anterior es un anticuerpo sintético, por ejemplo, un polipéptido producido por un sintetizador de aminoácidos en fase sólida.

En otro aspecto, la solicitud proporciona una composición farmacéutica que incluye cualquiera de los anteriores anticuerpos o fragmentos funcionales de estos anticuerpos y un agente terapéutico adicional. El agente terapéutico adicional se selecciona del grupo consistente de una agente anticáncer; un antibiótico; un agente antiinflamatorio; un factor de crecimiento, y citoquina.

La solicitud incluye adicionalmente un método para prevenir o tratar enfermedades proliferativas o enfermedades, tales como un cáncer, en un mamífero, particularmente un humano, con una combinación de agentes farmacéuticos que comprenden:

(a) un antagonista de c-Met de la invención; y

(b) uno o más agentes farmacéuticos activos;

en donde al menos un agente farmacéuticamente activo es un agente terapéutico anticáncer.

La solicitud divulga adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprende:

a) un antagonista de anticuerpo c-Met;

b) un agente farmacéuticamente activo; y

c) un vehículo farmacéuticamente aceptable;

en donde al meno un agente activo farmacéuticamente es un agente terapéutico anticáncer.

La solicitud divulga adicionalmente un paquete o producto comercial que comprende:

a) una formulación farmacéutica de un antagonista del anticuerpo de c-Met; y b) una formulación farmacéutica de un agente farmacéuticamente activo para uso simultáneo, concurrente, separado o secuencial;

donde en al menos un agente farmacéuticamente activo es una agente terapéutico anticáncer.

En un cierto aspecto, la solicitud proporciona un anticuerpo aislado que tiene una primera secuencia de aminoácidos que es una cadena pesada tal como SEQ ID NOs: 55-72, o una secuencia que tiene al menos 60, 70, 80, 90, 95 o 99 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 55-72; y una segunda secuencia de aminoácidos que es una cadena ligera tal como SEQ ID NOs: 31-54, o una secuencia que tiene al menos 60, 70, 80, 90, 95 o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 31-54.

En aun otro aspecto, la solicitud proporciona un inmunoconjugado que tiene un primer componente el cual es un anticuerpo o fragmento tal como se describieron anteriormente y un segundo componente el cual es una segunda secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, el segundo compuesto del inmunoconjugado es una citotoxina o es una proteína o anticuerpo enlazante que tiene una especificidad de enlazamiento para un objetivo que es diferente de c-Met. Por ejemplo, el objetivo de la especificidad de enlazamiento diferente de c-Met es un antígeno de tumor o una proteína asociada a un tumor sobre una superficie de una célula cancerosa. En ciertos aspectos, la solicitud proporciona cualquiera de los anteriores anticuerpos como un anticuerpo biespecífico.

En otro aspecto, la solicitud proporciona un kit que tiene cualquiera de los anteriores anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. En algunos aspectos, el kit contiene adicionalmente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable del mismo. En otros aspectos relacionados, cualquiera de los anticuerpo anteriores en el kit está presente en unaj dosis unitaria. En aun otro aspecto relacionado, el kit incluye instrucciones para el uso en la administración de cualquiera de los anticuerpos anteriores, o fragmentos funcionales de estos anticuerpos, a un sujeto, o para uso de investigación o selección.

Agentes terapéuticos que antagonizan la actividad de c-Met podrían predecirse agentes terapéuticos que antagonizan la actividad de c-Met para que tengan un efecto benéfico sobre el tratamiento de un amplio rango de tumores relevantes. Incluidos en la invención son anticuerpos completamente humanos que directamente se enlazan al dominio extracelular de c-Met y bloquean la interacción con HGF/SF. A la vista de los diversos aspectos divulgados en la presente solicitud, la presente invención se relaciona con un anticuerpo humano o humanizado aislado o una porción enlazante al antígeno del mismo que comprende una región de enlazamiento al antígeno la cual es específica para la proteína objetivo c-Met, en donde el anticuerpo o la porción de enlazamiento al antígeno del mismo comprende los CDR de los dominios VL y VH de:

(a): Anticuerpo 5091 (SEQ ID NOs. 34 y 66)

(b): Anticuerpo 5097 (SEQ ID NOs. 37 y 67):

(c): Anticuerpo 5098 (SEQ ID NOs. 38 y 68): o

(d): Anticuerpo 5185 (SEQ ID NOs. 53 y 71).

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo o porción de enlazamiento de antígeno del mismo de acuerdo con la invención y tal como se describe aquí anteriormente, en donde el anticuerpo o la porción de enlazamiento del antígeno del mismo inhibe el enlazamiento de HGF a c-Met. En una realización específica, el anticuerpo humano o humanizado aislado o la porción de enlazamiento al antígeno del mismo de acuerdo con la invención, y tal como se describió aquí anteriormente, comprende los CDR de los dominios VL y VH de: Anticuerpos 5091 (SEQ ID NOs 34 y 66). En otra realización específica, el anticuerpo humano o humanizado o la porción de enlazamiento al antígeno del mismo de acuerdo con la invención y tal como se describió aquí anteriormente comprende los CDR de los dominios VL y VH del anticuerpo 5097 (SEQ ID NOs. 37 y 67). En aun otra realización específica, el anticuerpo humano o humanizado aislado o porción de enlazamiento de antígeno del mismo de acuerdo con la invención y tal como se describió aquí anteriormente, comprende los CDR de los dominios VL y VH del anticuerpo 5098 (SEQ ID NOs. 38 y 68).

En aun otra realización específica, el anticuerpo humano o humanizado aislado o la porción de enlazamiento al antígeno del mismo de acuerdo con la invención tal como se describió aquí anteriormente, comprende los CDR de los dominios VL y VH de: Anticuerpos 5185 (SEQ ID NOs. 53 y 71). En una realización de la invención, el anticuerpo o la porción de enlazamiento del anticuerpo del mismo de acuerdo de la invención y tal como se describen aquí anteriormente, se enlazan a la proteína objetivo c-Met y activan o inhiben la fosforilación de c-Met.

En una realización, el anticuerpo aislado de acuerdo con la invención y tal como se describió aquí anteriormente es una IgG, particularmente una IgG1, una IgG2, una IgG3 o una IgG4. En una realización específica, el anticuerpo aislado de la IgG4 es codificado por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOs: 85 y 89; o SEQ ID NOs: 88 y 92; o SEQ ID NOs: 87 y 91: o SEQ ID NO: 86 y 89, y variantes conservadoras de las mismas. En una realización, la invención proporciona un anticuerpo humano o humanizado aislado o una porción enlazante a antígeno de los mismos de acuerdo con la invención y tal como se describe aquí anteriormente, para uso como medicamento.

De acuerdo con lo anterior, la invención se relaciona adicionalmente con el uso del anticuerpo y de la porción enlazante a anticuerpo del mismo de acuerdo con la invención y tal como se describe aquí anteriormente en la preparación de un medicamento. En una realización, un anticuerpo aislado o una porción de enlazamiento a antígeno del mismo de acuerdo con la invención y tal como se describen aquí se proporciona de tal manera que es un fragmento de anticuerpo Fab o scFv o un nanocuerpo de camelido.

En una realización, el anticuerpo aislado o porción enlazante al antígeno del mismo de acuerdo con la invención y tal como se describe aquí anteriormente, se enlaza con un epítopo conformacional. En aun otra realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo o una porción de enlazamiento al antígeno del mismo de acuerdo con la invención y tal como se describe aquí anteriormente y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable del mismo. En una realización, la composición farmacéutica comprende adicionalmente un agente terapéutico adicional, particularmente un agente terapéutico adicional el cual se selecciona del grupo consistente de un agente anticáncer; un antibiótico; un agente antiinflamatorio; un factor de crecimiento; y una citoquina. La invención se relaciona adicionalmente con un animal transgénico no humano que porta un gen que codifica un anticuerpo o una porción de enlazamiento al antígeno del mismo de acuerdo con la invención y tal como se describe aquí anteriormente. Se proporciona adicionalmente un anticuerpo o una porción de enlazamiento al antígeno del mismo de acuerdo con la invención y tal como se describe aquí anteriormente para el uso en el tratamiento del cáncer o de una condición inflamatoria. En una realización, la invención se relaciona con el uso del anticuerpo o de una porción de enlazamiento del mismo de acuerdo con la invención tal como se describe aquí anteriormente, la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer o de una condición inflamatoria.

En una realización específica, el cáncer se selecciona del grupo consistente de cáncer de cerebro, cáncer de estómago, cáncer genital, cáncer urinario, cáncer de próstata, cáncer de vejiga (superficial e invasivo muscular), cáncer de seno, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer colorrectal, glioma (incluyendo glioblastoma, astrositoma anaplástico, oligoastrositoma, oligodendroglioma), cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (HCC) incluyendo HCC de la niñez, cáncer de cabeza y cuello (incluyendo carcinoma de las células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo), carcinoma de las células Hurthel, cáncer epitelial, cáncer de piel, melanoma, incluyendo melanoma maligno, mesotelioma, linfoma, mieloma incluyendo mieloma múltiple, leucemias, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas (incluyendo todos los subtipos histológicos: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma broncoalveolar, carcinoma de células grandes y adenoescamoso de tipo mixto), cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de células renales incluyendo cáncer de células renales papilares esporádico, Tipo 1 y Tipo 2, y cáncer de células renales de células claras; sarcomas, en particular osteosarcomas, sarcomas de células claras y sarcomas de tejidos blandos (incluyendo rabdomiosarcomas alveolar y embrional, sarcomas de la parte alveolar suave); carcinoma de tiroides (papilar y otros subtipos), pero se selecciona particularmente del grupo del grupo de cánceres consistente de hígado, renal y esofágico. En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención tal como se describe aquí anteriormente, se utiliza en combinación con un agente quimioterapéutico, particularmente un agente quimioterapéutico el cual es un agente anticáncer.

En aun otra realización el anticuerpo o porción enlazante al antígeno del mismo de acuerdo con la invención y tal como se describió aquí anteriormente, para uso como herramienta de diagnostico. En una realización específica el anticuerpo

o porción enlazante al antígeno del mismo de acuerdo con la invención tal como se describe aquí comprende adicionalmente un marcador que es radiactivo, fluorescente, magnético, paramagnético o quimioluminiscente.

En una realización, la invención proporciona un imunoconjugado que comprende un primer componente el cual es un anticuerpo o una porción enlazante al antígeno del mismo de acuerdo con la invención y tal como se describió aquí anteriormente. En una realización, el inmunoconjugado comprende un segundo componente que tiene una secuencia de aminoácidos, particularmente una citotoxina o una segunda secuencia, la cual es una proteína de enlazamiento o un anticuerpo que tiene una especificidad de enlazamiento para un objetivo que es diferente de c-Met. En una realización específica, el inmunoconjugado es un anticuerpo biespecífico. En una realización, la invención provee un kit que comprende un anticuerpo o porción enlazante de antígeno del mismo de acuerdo con la invención y tal como se describió aquí anteriormente, en donde el anticuerpo es una dosis unitaria y comprende adicionalmente instrucciones. En una realización específica, el kit comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable del mismo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una alineación de secuencia de las cadenas VH de la invención, delimitando adicionalmente las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 de cada cadena.

La figura 2 es una alineamiento de las cadenas lambda VL de la invención, delimitando adicionalmente las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 de cada cadena.

La figura 3 es un alineamiento de secuencia de las cadenas kappa VL de la invención, delimitando adicionalmente las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 de cada cadena.

La presente solicitud divulga anticuerpos aislados, particularmente anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos humana o humanizada que se enlaza específicamente a c-Met, específicamente a una porción extracelular de la proteína c-Met y que inhiben propiedades funcionales de c-Met. En ciertos aspectos, los anticuerpos se derivan a partir de secuencias de cadenas pesadas y ligeras y/o comprenden características estructurales particulares tales como regiones CDR que comprenden secuencias de aminoácidos particulares. La solicitud proporciona anticuerpos aislados, métodos para hacer tales anticuerpos, ensayos para detectar tales anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas que comprenden tales anticuerpos y composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. La solicitud también divulga métodos para utilizar los anticuerpos para inhibir, por ejemplo, antagonizar, la función de c-Met con el fin de inhibir el desarrollo de un trastorno o condición asociados con la presencia del receptor celular objetivo c-Met que da como resultado el tratamiento de una enfermedad proliferativa, por ejemplo, un cáncer o una condición inflamatoria. La solicitud en un aspecto diferente también divulga anticuerpos que activan, esto es, agonizan, la fosforilación de c-Met, y métodos de uso de anticuerpos agonísticos, los cuales se estimulan, por ejemplo, la regeneración de órganos, curación de heridas o regeneración de tejidos.

En un aspecto dado, la condición inflamatoria es una infección. Es un aspecto, el método de tratamiento seria bloquear la infección patogénica. En un aspecto particular, la invención es una infección bacteriana, que incluye, por ejemplo, una infección por Listeria.

Con el fin de que la presente invención pueda ser entendida más fácilmente, se definen ciertos términos para tener los significados aquí, excepto que se requiera otra cosa en el contexto. A través de la descripción detallada se encontraran definiciones adicionales.

Un “polipéptido c-Met” o “receptor de c-Met” o “c-Met” se refieren al receptor de tirosina quinasa que enlaza el factor de crecimiento de hepatocitos. Ejemplos específicos incluyen, por ejemplo, un polipéptido humano codificado por la secuencia de nucleótidos provista en GenBank accno. NM_000245, o la proteína humana codificada por la secuencia de polinucleótidos provista en GenBank accno. NM_000236, o el dominio extracelular de las mismas. La proteína precursora de la cadena individual primaria es escindida después de la postraducción para producir las subunidades alfa y beta las cuales están enlazadas por un disulfuro para formar el receptor maduro. El receptor tirosina quinasa de c-Met está involucrado en procesos celulares, que incluyen, por ejemplo, los procesos de migración, invasión y morfogénesis que acompañan la hembriogénesis y la regeneración de tejidos.

La expresión “enfermedad o condición relacionados con c-Met” se refiere a cualquier enfermedad, trastorno o condición que resulta de la expresión indeseada o falta de expresión, regulación indeseada o falta de regulación o actividad indeseada o falta de actividad, de c-Met, o que puede ser modulada o tratada o curada por la modulación de la expresión o la actividad de c-Met. Por ejemplo, la activación de la ruta HGF/c-Met puede esperarse en una gran proporción de pacientes con cáncer o en pacientes cuya enfermedad es impulsada realmente por alteraciones relacionadas con la ruta de c-Met. Por ejemplo, una sobrerregulación puede deberse a diferentes mecanismos tales como la sobreexpresión de HGF y/o c-Met, o la activación constitutiva por mutación de c-Met. Un trastorno o condición relacionado con c-Met incluye, pero no se limita a, por ejemplo, enfermedades y trastornos proliferativos y enfermedades y trastornos inflamatorios. Las enfermedades proliferativas incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, cánceres que incluyen, por ejemplo, gástrico, esofágico, de seno, de riñón incluyendo carcinoma de células renales papilares, glioma, de cabeza y cuello, epitelial, de pulmones, de piel, leucemia, linfoma, mieloma, de cerebro, pancreático, gástrico, gastrointestinal, de estómago, de intestino, de colon, de hígado, genital, urinario, melanoma y próstata, así como otros tumores conocidos para los experimentados en la técnica. Las enfermedades incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, infección bacteriana, incluyendo por ejemplo, por Listeria. Trastornos adicionales se describen aquí y en, por ejemplo Online Mendelian Inheritance in Man ("OMIM") entries for, e.g., Met proto-oncogene in OMIN accno. 164860 and for Hepatocyte Growth Factor / Scatter Factor in OMIM accno. 142409. Otros ejemplos serán conocidos para los experimentados en la técnica, por ejemplo, tal como lo revisa Corso et al., TRENDS in Mol. Med. 11(6): 2841 (2005) and Christensen et al., Cancer Letts. 225: 1-26 (2005).

El término “respuesta inmune” se refiera a cualquier actividad de linfocitos, células que presentan antígenos, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por estas células o por el hígado (incluyendo la producción y/o secreción de anticuerpos, citoquinas y complementos) que da como resultado el enlazamiento selectivo a, el daño de, la destrucción de, o la eliminación del cuerpo humano de los patógenos invasores, células o tejidos infectados con los patógenos, células cancerosas o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Una “ruta de transducción de señal” se refiere a la relación causal bioquímica que se inicia generalmente mediante una interacción proteína-proteína tal como el enlazamiento de un factor de crecimiento o un receptor, que da como resultado la transmisión de una señal de una porción de una célula a otra porción de una célula. En general, la transmisión involucra la fosforilación específica de uno o más residuos de tirosina, serina o treonina en una o más proteínas en la serie de reacciones que producen la transducción de la señal. Los procesos penúltimos incluyen típicamente eventos nucleares, que dan como resultado un cambio en la expresión del gen.

Un “receptor de superficie” incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y capaces de la transmisión de tal señal a través de la membrana del plasma de una célula. Un ejemplo de un receptor de superficie celular de la presente invención es c-Met, al cual se enlaza una molécula de proteína de factor de crecimiento, por ejemplo, un factor de crecimiento de hepatocito (HGF).

El término “anticuerpo” abarca cualquier unidad estructural que tenga funciones de enlazamiento similares a la inmunoglobulina. El término incluye moléculas de anticuerpos enteras y cualquier fragmento de enlazamiento al antígeno (esto es, “porción de enlazamiento al antígeno”) o cadenas sencillas de los mismos, anticuerpos de camélidos que incluyen, por ejemplo, nanocuerpos, constructos de enlazamiento de despliegue de fagos. Un anticuerpo de origen natural es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas livianas (L) interconectadas con puentes disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como VH) y una región constante de cadena pesada está compuesta de tres dominios, CH1, CH2 Y CH3. Hay solamente dos tipos de cadena liviana: lamba y kappa. Cada cadena liviana está compuesta de una región de cadena variable liviana (abreviada aquí como VL) y una región constante de cadena liviana. La región constante de cadena liviana está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes complementaria (CDR), interexpresadas con regiones que son más conservadas, regiones denominadas de marco (FR). Como se encuentra en la naturaleza, cada VH y VL está compuesto de tres CDR y cuatro FR dispuestos desde el terminal amino hasta el terminal carboxi en el siguiente orden FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlazamiento que interactúa con antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en el enlazamiento de la inmunoglobulina a los tejidos o factores huésped, incluyendo diversas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras), y el primer componente (CLQ) del sistema de complemento clásico. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal.

El término “porción enlazante al antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “porción del antígeno”) se refiere a una longitud completa o uno o más fragmentos de un anticuerpo que tienen la capacidad de enlazarse específica a un antígeno (por ejemplo, una porción de c-Met). Se ha demostrado que la función de enlazamiento al antígeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo mediante fragmentos de una molécula de anticuerpo incluyendo un fragmento de Fab, el cual es un fragmento monovalente consistente de los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2, el cual es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que tiene los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de una secuencia de aminoácidos sencilla de una cadena de anticuerpos; un fragmento dAb (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), el cual tiene un dominio VH; y una región determinante de complementariedad aislada (CDR).

La referencia a un fragmento de anticuerpo que contiene las porciones enlazantes al antígeno puede contemplar el fragmento aislado o conjugado a unidades estructurales químicas o biológicas, o fragmentos enlazados a marcos o andamios derivados de inmunoglobulina no tradicionales, incluyendo pero no limitándose a, por ejemplo, anquirinas, fibronictinas, anticuerpos de dominio, lipocalina, inmunofarmacéuticos modulares pequeños, maxicuerpos, nanocuerpos, proteína A, afilina, gamma cristalina y otros andamios contemplados conocidos para los experimentados en la técnica.

Adicionalmente, aunque en una molécula de anticuerpo de origen natural hay dos cadenas que tienen dominios Fv, VL y VH, los cuales están codificados por genes separados, pueden ser unidos utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazante sintético que les permite ser expresado de forma recombinante en una cadena de proteína individual en la cual las regiones VL y VH de una molécula monovalente (conocida como cadena sencilla Fv (scFv); véase, por ejemplo Bird et al., 1988 Science 242:423-426; and Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena también abarcados dentro del término porción enlazante al antígeno de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas para los experimentados en la técnica, y los fragmentos se seleccionan en cuanto a su utilidad de la misma forma puesto que son anticuerpos intactos u otros fragmentos de los mismos.

Un “anticuerpos aislado” se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que específicamente se enlaza a un determinante que es un conjunto de aminoácidos sobre c-Met está sustancialmente libre de anticuerpos que se enlazan específica y sustancialmente a antígenos diferentes a c-Met). Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a una proteína c-Met tal como c-Met humana, sin embargo, tiene reactividad cruzada con otros antígenos, tales como las moléculas de c-Met de otras especies, o con proteínas que tienen una alta cantidad de homología a una secuencia de aminoácidos de un c-Met humana. Adicionalmente, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material y/o agentes químicos celulares.

Los términos “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal” se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo, todas las cuales comparten una composición molecular sencilla. Una composición de un anticuerpo monoclonal despliega así una especificidad y afinidad de enlazamiento sencilla para epítopo particular.

Tal como se utiliza aquí, el término “anticuerpo policlonal” se refiere a una composición de anticuerpos que tiene una población heterogénea de anticuerpos. Los anticuerpos policlonales se derivan frecuentemente del suero conservado de animales inmunizados o de humanos seleccionados.

El término “anticuerpo humano”, tal como se utiliza aquí, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales al menos uno y generalmente ambas regiones de marco y CDR se derivan de secuencias de origen humano. Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también es derivada de tales secuencias humanas, por ejemplo, secuencias de línea germinal humana o versiones mutadas de secuencias germinales humanas. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones tales como sustituciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica para el sitio in vitro o por mutación somática in vivo).

El término “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a anticuerpos que despliegan una especificidad de enlazamiento sencilla que tiene regiones variables en la cuales tanto las regiones de marco como CDR se derivan a partir de secuencias humanas. En una realización, lo anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada, generalmente de origen humano, y un transgen de cadena liviana, generalmente de origen humano, fusionados en una célula inmortalizada, generalmente de origen humano. El término “anticuerpo humano recombinante”, tal como se utiliza aquí, incluye anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo un ratón) que es transgénico o transcromosómico para la inmunoglobulina humana. Los genes o un hibridoma preparado a partir del mismo, anticuerpos a aislados a partir de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfectoma, anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humana combinacional recombinante, y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucre de división de toda o una porción de una o más secuencias de genes de inmunuglobulina humana en otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las cuales el marco y las regiones CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de líneas germinales humanas. En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a una mutagénesis in vitro (o, cuando un animal transgénico para secuencias de IgG humana es usado, en mutagénesis somática in vivo), de tal forma que las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras que se derivan de una línea germinal relacionada de la humana de las secuencias VH y VL, puede no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Tal como se utiliza aquí “isótopo” se refiere a la clase de anticuerpos (IgA, IgD, IgM, IgE, o IgG, tal como IgG1, un IgG2, e IgG3 o IgG4) que es proporcionado por el gen de la región constante de cadena pesada.

Los términos “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “ un anticuerpo específico para un antígeno” se utilizan de forma intercambiable aquí con el término “un anticuerpo que se enlaza específicamente a un antígeno”.

Tal como se utiliza aquí, un anticuerpo que “se enlaza específicamente a la c-Met” se entiende que se refiere a un anticuerpo que se enlaza a c-Met cuando KD of 2.0 x 10-5 M o menos, 2.0 x 10-6 M o menos, 2.0 x 10-7 M o menos, 2.0 x 10-8 M o menos, o 2.0 x 10-9 M o menos. Tal como se utiliza aquí, el término “reactividad cruzada” se refiere a un anticuerpo o población de anticuerpos que pertenece a epítopes en otro antígenos, esto puede ser causado bien sea por avidez o especificidad bajas del anticuerpo o antígenos distintos múltiples que tienen identidad o epítopes similares. La reactividad cruzada algunas veces es deseable cuando se desea el enlazamiento general a un grupo relacionado de antígenos o cuando se intentan marcaciones de cruce de especies si la secuencia de epítope de antígeno no es conservada altamente en la revolución.

Un anticuerpo que “reacciona cruzado con antígeno diferente al c-Met humana” se refiere a un anticuerpo que se enlaza a un antígeno con un KD de 0.5 x 10-7 M o menos, 5 x 10-8 M o menos, o 2 x 10-9 M o menos. Un anticuerpo “no reacciona cruzado” con un antígeno particular se entiende que se refiere a un anticuerpo que se enlaza a ese antígeno, si al final, con un KD de 0.5 x 10-8 M o mayor, o una KD de 5-10-7 o 5 x 10-6 o mayor. En ciertas realizaciones, tales anticuerpos no reaccionan cruzados con el antígeno que exhibe un enlazamiento indetectable esencialmente contra estas proteínas en ensayos de enlazamiento estándar.

Tal como se utiliza aquí, un anticuerpo que “inhibe el enlazamiento a c-Met” se refiere a un anticuerpo que inhibe el enlazamiento del ligando HGF/SF al receptor de superficie de c-Met con un Ki of 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM o menos, 0.75 nM o menos, 0.5 nM o menos, o 0.25 nM o menos.

Tal como se utiliza aquí, un anticuerpo que, “inhibe la actividad de la transducción de la señal de c-Met” se entiende que se refiere a un anticuerpo que inhibe la actividad proliferativa inducida por c-Met u otra actividad inducida con un IC50 menor de 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1.0 nM, 0.5 nM, o menos.

El término “Kassoc” o “Ka”, tal como se utilizan aquí, se entiende que se refieren a la rata de asociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular, y el término “Kdis” o “kD” tal como se utiliza aquí, pretende referirse a la rata de disociación de una interacción particular anticuerpo y en antígeno. El término “kD” tal como se utiliza aquí y entiende que se entiende a la constante de disociación, la cual se obtiene de la relación de Kd a Ka (por ejemplo Kd/ Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de KD para anticuerpos pueden determinarse utilizando métodos bien establecidos en la técnica. Un método para determinar el KD de un anticuerpo es utilizando resonancia de plasmón de superficie, o utilizando un sistema biosensor tal como un sistema Biacore®.

Tal como se utiliza aquí, el término anticuerpo “anticuerpo agonista” o “anticuerpo activador” pretende referirse a un anticuerpo que incrementa uno o más actividades de c-Met en al menos 20%-40% cuando se agrega a una célula, tejido u organismo que expresa c-Met. En algunas realizaciones, el anticuerpo activa la actividad de c-Met por al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más de 100%. En algunas realizaciones, un anticuerpo de un agonista de la invención incrementa al menos una actividad de c-Met en diez veces. En general, este incremento se observa en ausencia del inductor biológico, HGF. Sin embargo, en algunas realizaciones, tal como en un control para un ensayo, el anticuerpo de activación es agregado en presencia de HGF.

Tal como se utiliza aquí, el término “afinidad” se refiere a la fuerza de la interacción entre el anticuerpo y una porción del antígeno y una porción del antígeno conocida como el “epítopo”, y un sitio antigénico sencillo. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del “brazo” del anticuerpo interactúa a través de fuerzas no covalentes débiles con el antígeno y númerosas localizaciones atómicas o residuos de aminoácidos del anticuerpo; en general, cuanto mayor sea el número de tales interacciones, más fuerte es la afinidad del anticuerpo al antígeno.

Tal como se utiliza aquí, el término “avidez” se refiere a una medida informativa de la estabilidad global o del complejo anticuerpo-antígeno. Se controla por tres factores principales: afinidad anticuerpo-epítopo; la valencia de cada uno de antígeno y anticuerpo; y la disposición estructural o configuración tridimensional de estas partes interactuantes. Finalmente estos factores definen la especificidad del anticuerpo, esto es, la probabilidad de que el anticuerpo particular se enlace a un epítopo de un antígeno preciso y la estabilidad y duración del enlace.

Con el fin de obtener una sonda que tenga una avidez más alta, puede construirse un conjugado dimérico (dos moléculas de una proteína o polipéptido acoplada a un marcador FACS), haciendo así interacciones de baja afinidad (tales como sucede con un anticuerpo de línea germinal) o detectarse más fácilmente por FACS. Otro medio para incrementar la avidez del enlazamiento involucra la generación de dímeros o multímeros de cualquiera de los constructos divulgados aquí de los anticuerpos c-Met. Tales multímeros pueden ser generador a través de enlaces covalentes entre diferentes módulos individuales, por ejemplo, imitando, el enlazamiento natural a terminal C y N o para limitar los dímeros de anticuerpo que se mantienen juntos a través de sus regiones constantes. Los enlaces diseñados en la interface Fc/Fc pueden ser covalentes o no covalentes. Además, los asociados de dimerización o multimerización diferentes a Fc pueden utilizarse en la construcción de híbridos de anticuerpos de anti-c-Met tales como anticuerpos bifuncionales, para crear tales estructuras de orden mayor.

Tal como se usa aquí, el término “alta afinidad” para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10-8 M o menos, 10-9M o menos, o10-10M o menos. Sin embargo, enlazamiento con “afinidad más alta” puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, enlazamiento de “alta afinidad” para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que un KD of 10-7M o menos, o 10-8M o menos. Tal como se utiliza aquí, el término “sujeto” incluye cualquier mamífero, incluyendo un humano, un mamífero no humano u otro animal.

El término “animal no humano” incluye todos los vertebrados, por ejemplo mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas y no mamíferos tales como aves, anfibios, reptiles, etc.

El término “optimizado” significa que una secuencia de nucleótidos ha sido alterada para codificar una secuencia de aminoácidos utilizando codones que son preferidos en la producción de células u organismos, generalmente una célula eucariote, por ejemplo, una célula de una levadura tal como Pichia, una célula de un mamífero tal como la célula ovárica de hámster chino (CHO) o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se manipula para retener completamente o cuanto sea posible la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de inicio original, lo que también es conocido como la secuencia “padre”. Las secuencias optimizadas aquí han sido manipuladas para tener codones con diferentes secuencias de nucleótidos que son preferidas en células humanas, sin embargo la expresión optimizada de estas secuencias en otras células eucariotes también se prevé aquí. La secuencias de aminoácidos de los anticuerpos codificados aquí por secuencias de nucleótidos optimizadas también se denominan como optimizadas.

En las siguiente subsecciones se describen diversos aspectos de la invención en mayor detalle.

Los ensayos estándar para evaluar la capacidad de enlazamiento de los anticuerpos hacia c-Met de diversas especies son conocidos en la técnica, incluyendo por ejemplo, ELISA, inmunoprecipitación western y RIA. Ensayos adecuados son conocidos para las personas experimentadas en la técnica. Véase, por ejemplo, F. Ausubel, et al., ed. 2006, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. La cinética de enlazamiento (por ejemplo, afinidad de enlazamiento) de los anticuerppos también puede establecerse por ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como el análisis Biacore, análisis para evaluar los efectos de los anticuerpos sobre propiedades funcionales de c-Met (por ejemplo, la inducción de la internalización del receptor, inhibiendo el enlazamiento del factor de crecimiento a c-Met, inhibiendo la autofosforilación de c-Met, inhibiendo la activación de la ruta de c-Met, evitando o mejorando por lo tanto la proliferación, o ensayos de quinasa) que se describen aquí.

De acuerdo con lo anterior, un anticuerpo que “inhiba” una o más de estas propiedades funcionales de c-Met (por ejemplo, actividades bioquímicas, inmunoquímicas, celulares, fisiológicas u otras biológicas; tal como se determinan de acuerdo con las metodologías conocidas en la técnica y descritas aquí, se relaciona con un antagonismo estadísticamente significativo o descenso en la actividad particular relativa a la vista en ausencia de anticuerpo (por ejemplo, o en presencia de un anticuerpo de control de especificidad irrelevante). Un anticuerpo que inhibe la actividad de c-Met tiene efectos de tal forma que genera un descenso significativo estadísticamente de al menos 10% del parámetro medido, al menos 50%, 80% o 90%, y en ciertas realizaciones un anticuerpo de la invención puede inhibir más de 95%, 98% o 99% de la actividad funcional de c-Met. En general, el descenso de la actividad se mide utilizando un evento de inducción, tal como una adición de HGF.

Alternativamente, un anticuerpo que “agoniza” una o más de estas propiedades funcionales del c-Met (por ejemplo, actividades bioquímica, inmunoquímica, celular, fisiológica u otras; tal como se determina de acuerdo con la metodologías conocidas en la técnica y descritas aquí, se relaciona con un incremento significativo estadísticamente en la actividad particular con respecto a la que se observa en ausencia del anticuerpo (por ejemplo, o en la presencia de un anticuerpo de control de especificidad irrelevante). Un anticuerpo que estimula o agoniza la actividad de c-Met efectúa tal incremento estadísticamente significativo en al menos 10% del parámetro medido, en al menos 50%, 80% o 90%, y en ciertas realizaciones un anticuerpo de la invención puede agonizar más de 95%, 98% o 99% o más, de la actividad funcional del c-Met.

Anticuerpos recombinantes

Los anticuerpos de la invención son anticuerpos recombinantes, aislados y caracterizados estructuralmente tal como se describe en los ejemplos. Las secuencias de nucleótido VH de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NOs: 21-30 respectivamente. Las tablas C-E proporcionan ejemplos de secuencias de nucleótidos VH de diferentes anticuerpos de la invención. Las secuencias VL de los anticuerpos se muestran en la SEQ ID NOs: 1-20 respectivamente. (Las tablas C-E proporcionan ejemplos de secuencias de nucleótidos VL de diferentes anticuerpos de la invención). Las secuencias de nucleótidos de cadena ligera lambda y kappa de Ig de los anticuerpos se muestran en la SEQ ID NOs: 73-76 y en las tablas C-E. Las secuencias de nucleótidos IgG4 de los anticuerpos se muestran en la SEQ ID NOs: 85-88 y en las tablas C-E. Otros anticuerpos pueden incluir nucleótidos que han sido mutados, bien sea que tengan al menos 60, 70, 80, 90, 95 o 99 de identidad con las secuencias descritas anteriormente.

Las secuencias de aminoácidos VH de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NOs: 55-72 respectivamente y en las tablas A-B y E. Las secuencias de aminoácidos VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 31-54 respectivamente y en las tablas A-B y E. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera lambda de ig se muestran en SEQ ID NOs: 77-80 respectivamente y en las tablas A-B y E. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera kappa de Ig de los anticuerpos se muestran en la SEQ ID NOs: 81-84 respectivamente y en las tablas A-B y E. Las secuencias de aminoácidos de IgG 4 de los anticuerpos se muestran en la SEQ ID NOs: 89-96 respectivamente y en las tablas A-B y E. Los anticuerpos adicionales pueden incluir aminoácidos que hayan sido mutados, y retienen al menos 60, 70, 80, 90, 95 o 99 de identidad con las secuencias descritas anteriormente.

Puesto que cada uno de los anticuerpos puede enlazarse a un sitio en una porción extracelular de c-Met, pueden “mezclarse y enfrentarse” VH / VL (secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos), cadena ligera lambda de VH /Ig (secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos) y cadena ligera kappa de VH /Ig (secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos) para producir combinaciones adicionales de moléculas enlazantes anti-c-Met. El enlazamiento de c-Met de tales anticuerpos puede probarse utilizando los ensayos de enlazamiento descritos anteriormente y en los ejemplos (por ejemplo ELISA). Las secuencias VH,VL, de cadena ligera lambda de Ig y cadena ligera kappa de Ig de los anticuerpos de la presente solicitud son particularmente adecuados para novedosas combinaciones, puesto que estos anticuerpos utilizan secuencias VH ,VL, de cadena ligera lambda de Ig y cadena ligera kappa de Ig derivadas de las mismas o similares secuencias de la línea germinal y exhiben así una similitud estructural.

De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, la solicitud proporciona un anticuerpo recombinante aislado o una porción enlazante de antígeno del mismo que tiene al menos: una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 55-72; y una región variable de cadena ligera (VL VL) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 3154; donde el anticuerpo específicamente se enlaza a c-Met.

Ejemplos de combinaciones de cadenas pesadas y ligeras incluyen al menos: VH de SEQ ID NO: 65 y un VL de SEQ ID NO: 32; o a VH de SEQ ID NO: 66 y un VL de SEQ ID NO: 34;o un VH de SEQ ID NO: 67 y un VL de SEQ ID NO: 37;o un VH de SEQ ID NO: 68 y un VL de SEQ ID NO: 38;o un VH de SEQ ID NO: 69 y un VL de SEQ ID NO: 51;o un VH de SEQ ID NO: 70 y un VH de SEQ ID NO: 52;o un VH de SEQ ID NO: 71 y un VL de SEQ ID NO: 53;o un VH de SEQ NO: 72 y un VL de SEQ ID NO: 54;o un VH de SEQ ID NO: 55 y un VL de SEQ ID NO:31;o un VH de SEQ ID NO: 58 y un VL de SEQ ID NO: 36;o un VH de SEQ ID NO: 61 y un VL de SEQ NO: 41;o un VH de SEQ ID NO: 62 y un VL de SEQ ID NO:

45. Las tablas A-B ilustran ejemplos de pares “mezclados y enfrentados” de secuencias de aminoácidos VH yVL de diferentes anticuerpos para la solicitud. Las figuras 1-3 son tablas que ilustran ejemplos de una secuencia de aminoácidos VH yVL que ilustra las regiones FR y CDR que pueden ser provistas sobre andamios alternativos para proveer constructos que tengan la misma o similar actividad antagonística a c-Met como los anticuerpos aquí.

De acuerdo con lo anterior, en otro aspecto, la solicitud provee un anticuerpo recombinante aislado o una porción enlazante de antígeno del mismo que tiene al menos: una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 55-72 y una cadena ligera lambda de Ig que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 77-80, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a c-Met.

Ejemplos de combinaciones de VH/cadena ligera lambda de Ig incluyen al menos: una VH de SEQ ID NO: 66 y una cadena ligera lambda de Ig de SEQ ID NOs: 77; o una VH de SEQ ID NOs: 65 y cadena ligera lambda de Ig de SEQ ID NO: 78; o una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 y una cadena ligera lambda de Ig de SEQ ID NO: 79; o una región VH de la SEQ ID NO: 70 y una cadena lambda de Ig de SEQ ID NO: 80.

De acuerdo con lo anterior, en otro aspecto, la solicitud proporciona un anticuerpo recombinante aislado o una porción enlazante de antígeno del mismo que tiene al menos: una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 55-72 y una cadena ligera kappa de ig que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NO: 81-84 en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a c-Met.

Ejemplos de combinaciones de VH/cadena ligera kappa de Ig incluyen al menos: una región VH de SEQ ID NO: 71 y una cadena ligera kappa de Ig de SEQ ID NO: 81; o una región VH de SEQ ID NO: 68 y una cadena ligera kappa de Ig de SEQ ID NO: 82; o una región VH de SEQ ID NO: 67 y una cadena ligera kappa de Ig de SEQ ID NO: 83; o una región VH de SEQ ID NO: 72 y una cadena ligera kappa de SEQ ID NO: 84.

En otro aspecto, la solicitud proporciona un anticuerpo recombinante aislado o una porción enlazante de antígeno del mismo que tiene al menos: una cadena VH que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 21-30 y una cadena VL que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NO: 1-20.

Asi, ejemplos de combinaciones de cadena pesada y ligera incluyen al menos: a VH como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 21 y una cadena ligera variable como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1;o un VH como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 24 y una cadena ligera variable como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6;o un VH como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQID NO: 11; or aVH como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15;o un VH como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29 y una cadena ligera variable como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18;o un VH como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 30 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQID NO: 20;o un VH como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 22 y una cadena ligera variable como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1;o un VH como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23 y una cadena ligera variable como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1;o un VH como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 24 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQID NO: 7;o un VH como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 24 y una cadena ligera variable como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8;o un VH como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 24 y una cadena ligera variable como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9;o un VH como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 24 y una cadena ligera variable como región que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10. Véanse las Tablas A-B que ilustran ejemplos de pares "mixtos y coincidentes" de secuencias de nuclótidos VH yVL de diferentes anticuerpos de la solicitud de los pares de las secuencias de nucleótidos VH yVL.

En otro aspecto, las solicitud proporciona un anticuerpo recombinante aislado o una porciones de enlazamiento de antígeno del mismo que tiene al menos: una cadena de VH que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 21-30, y una cadena ligera lambda de Ig que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NO: 73.

Así un ejemplo de una combinación VH/cadena ligera lambda de Ig incluye: una región de VH que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23 y una cadena ligera de lambda Ig que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 73.

En otro aspecto, la solicitud proporciona un anticuerpo recombinante aislado o una porción enlazante de antígeno del mismo que tiene la menos: una cadena VH que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 21-30 y una cadena ligera kappa de Ig que tiene una secuencia de nucleótidos del grupo consistente de SEQ ID NOs: 74-76.

Los ejemplos de las combinaciones de VH y cadena ligera kappa de Ig incluyen al menos: una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 24 y una región variable de cadena ligera kappa de Ig que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 74; o una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25 y una región variable de cadena ligera kappa de Ig que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 75; o una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27 y una región variable de cadena ligera kappa de Ig que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 76.

Tal como se utiliza aquí, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que son “el producto de” o “derivadas de” una secuencia de línea germinal particular si las regiones variables del anticuerpo se obtienen a partir de un sistema que utilice genes de inmunoglobulina de línea germinal humana. Tales sistemas incluyen la inmunización de un ratón transgénico que porta genes de inmunoglobulina humanos con el antígeno de interés, o la selección de una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana desplegada en un fago con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es el producto de o derivado a partir de una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana puede identificarse como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con la secuencia de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la línea germinal humana y seleccionado la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana que es más cercana en secuencia (esto es, mayor porcentaje de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es el producto de o es derivado de un secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana particular puede contener diferencias en aminoácidos en comparación con la secuencia de la línea germinal. Tales diferencias se deben, por ejemplo, a al menos una mutación somática de origen natural o una introducción intencional de una mutación dirigida a un sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado atípicamente es al menos 90% idéntico en secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de línea germinal humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano, como de origen humano en comparación con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la línea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la línea germinal murínica). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 60%, 70%, 80%, 90% o al menos 95% o incluso al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntico en secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Típicamente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de línea germinal humana en particular no desplegará más de diez diferencias en aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de la inmunoglobulina de la línea germinal humano. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede desplegar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia en aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal.

Anticuerpos de identidad

En aun otro aspecto, un anticuerpo divulgado aquí tiene al menos secuencias de nucleótidos de cadena pesada y ligera de la región variable, o secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera de región variable, o secuencias de nucleótidos lambda de Ig, o secuencias de aminoácidos de lambda Ig, o secuencias de nucleótidos kappa de Ig, o secuencias de aminoácidos kappa de Ig o secuencias de nucleótidos de IgG4, o secuencias de aminoácidos de IgG 4 que tendrán homología o identidad con las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de los anticuerpos descritos aquí, y en donde los anticuerpos descritos aquí, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-c-Met de la invención, esto es, demuestran la actividad o actividades funcionales madre. Las actividades funcionales madre pueden ser antagonísticas o agonísticas. En muchos aspectos, la actividad es antagonística.

Por ejemplo, la solicitud proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción de enlazamiento del mismo, que tiene una región VH y una región de cadena variable ligera, tal como la región VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la menos 80%, 90%, 95% o 99% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 55-72, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 31-54, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a c-Met y el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades antagonísticas funcionales: el anticuerpo induce la internalización del receptor de c-Met o el anticuerpo inhibe el enlazamiento de un factor de crecimiento de proteína a c-Met, o el anticuerpo inhibe la autofosforilación de c-Met evitando por la tanto la activación de la ruta de c-Met, o el anticuerpo inhibe la sobreregulación de la ruta de c-Met resultante de la transducción de la señal, o el anticuerpo inhibe el enlazamiento de c-Met, por lo tanto previniendo o mejorando la proliferación, supervivencia, migración o invasión o cambios en la morfología celular, y especialmente evitando o mejorando el cáncer tal como tumor de crecimiento y o metástasis.

En un aspecto alternativo, el anticuerpo es responsable y activa la fosforilación de c-Met estimulando una respuesta celular. En una realización, la respuesta celular es una respuesta de curación de heridas.

En un ejemplo adicional, la solicitud proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción de enlazamiento al antígeno del mismo con 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 77-80. En aspectos adicionales, el anticuerpo se enlaza específicamente a c-Met, y el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades funcionales: el anticuerpo activa e induce la internalización del receptor de c-Met, el anticuerpo inhibe el enlazamiento de un factor de crecimiento proteínico a c-Met, con tal división que por lo tanto evita la activación del receptor, por ejemplo, evitando la subrregulación en la ruta de prevención resultante de la activación de c-Met o la señal de transducción, o el anticuerpo previene o mejora la proliferación, supervivencia celular, migración, invasión o cambios en la morfología, o el anticuerpo antagoniza la actividad de c-Met, evitando por lo tanto o mejorando el cáncer tal como crecimiento de tumor o una metástasis.

En un aspecto alternativo, el anticuerpo activa la fosforilación de c-Met estimulando una respuesta celular.

En otro ejemplo la solicitud proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción de enlazamiento de antígeno del mismo, que tiene una cadena ligera kappa de Ig: la cadena ligera de kappa de Ig tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 81-84; el anticuerpo se enlaza específicamente a c-Met y el anticuerpo exhibe al menos una de las propiedades funcionales provistas anteriormente y a través de la específicación. En una realización alternativa, el anticuerpo activa la fosforilación de c-Met estimulando una respuesta celular.

En otro aspecto, la solicitud proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción del enlazamiento del antígeno del mismo en el cual el anticuerpo es una IgG4 de tal manera que la IgG4 tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad con un secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 89-96. El anticuerpo se enlaza específicamente a c-Met y el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades funcionales provistas anteriormente y a través de la específicación. En un aspecto alternativo, el anticuerpo es agonístico, y activa la fosforilación de c-Met estimulando una respuesta celular.

En diversos aspectos, el anticuerpo puede exhibir uno o más, dos o más, o tres o más de las propiedades funcionales antogonísticas discutidas aquí. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado

o un anticuerpo quimérico.

En otro aspecto, la solicitud proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción enlazante de antígeno del mismo, que tiene una región VH y una región de cadena ligera variable de tal forma que la región VH es codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 21-30; la región variable de cadena ligera es codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 1-20; el anticuerpo codificado se enlaza específicamente a c-Met, y el anticuerpo exhibe al menos una de las propiedades funcionales provistas anteriormente y a lo largo de la específicación. En un aspecto alternativo, el anticuerpo activa la fosforilación de c-Met estimulando una respuesta celular.

En un ejemplo adicional, la solicitud proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción enlazante de antígeno del mismo, que tiene una cadena ligera Ig lambda de tal forma que la cadena ligera de Ig lambda codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NO: 73; el anticuerpo específicamente se enlaza a c-Met, y el anticuerpo exhibe al menos una de las propiedades funcionales provistas anteriormente y a lo largo de la específicación. En un aspecto alternativo, el anticuerpo es agonístico y activa la fosforilación de c-Met estimulando una respuesta celular.

En otro ejemplo, la solicitud proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción enlazante a antígeno del mismo, que tiene una cadena ligera Ig kappa en donde: la cadena ligera Ig kappa codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 74-76; el anticuerpo se enlaza específicamente a c-Met y el anticuerpo exhibe al menos una de las propiedades funcionales provistas anteriormente y a lo largo de la específicación. En un aspecto alternativo, el anticuerpo activa la fosforilación de c-Met estimulando una respuesta celular.

En otro aspecto, la solicitud proporciona una anticuerpo recombinante aislado, o una porción enlazante a antígeno del mismo en la cual el anticuerpo es una IgG4 en la cual la IgG4 es codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 8588; el anticuerpo codificado se enlaza específicamente a c-Met y el anticuerpo exhibe al menos una de las propiedades funcionales provistas anteriormente y a lo largo de la específicación. En un aspecto alternativo, el anticuerpo está agonístico, y activa la fosforilación de c-Met estimulando una respuesta celular.

En diversos aspectos, al anticuerpo puede exhibir 1 o más, 2 o más, o 3 de las propiedades antagonísticas funcionales discutidas aquí. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimérico.

En otros aspectos, las secuencias de aminoácidos VH y/o VL pueden ser 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias definidas anteriormente. El anticuerpo que tiene regiones VH yVL que tiene una identidad alta (esto es 80% o mayor) con las regiones VH yVL de SEQ ID NOs: 31-72 respectivamente, puede obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NOs: 31-72, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado para la función retenida (esto es, las funciones fijadas anteriormente) utilizando los ensayos funcionales descritos aquí.

En otros aspectos, las regiones variables de las secuencias de nucleótidos de cadena pesada y/o cadena liviana pueden tener 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con las secuencias fijadas anteriormente. El anticuerpo que tiene una cadena pesada y una cadena liviana de región variable con alta (esto es, 80% o más) identidad con respecto a las cadenas pesadas de la región variable de SEQ ID NO: 21-30 y cadenas ligeras de la región variable de SEQ ID NO: 1-20 respectivamente, puede obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que contienen SEQ ID NOs: 1-30 seguida por pruebas del anticuerpo alterado codificado para la función retenida (esto es, las funciones fijadas anteriormente) utilizando los ensayos funcionales descritos aquí.

En otros aspectos, las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de Ig lambda pueden tener 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con las secuencias definidas anteriormente, el anticuerpo que tiene una cadena ligera de lambda Ig con una identidad alta (esto es 80% o más) con las cadenas ligeras de lambda Ig de SEQ ID NOs: 77-80 respectivamente, pueden obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican SEQ ID NOs: 77-80, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado para la función retenida (esto es, las funciones fijadas anteriormente) utilizando los ensayos funcionales descritos aquí.

En otros aspectos, la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de Ig lambda puede ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% Idéntica a la secuencia definida más arriba. Un anticuerpo que tiene una cadena ligera Ig lambda con alta (esto es, 80% o mayor) identidad a la cadena ligera de Ig lambda de SEQ ID NO: 73 respectivamente, pueden obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que comprenden SEQ ID NO: 73 seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado en cuanto a la retención de funciones (i.e., las funciones definidas más arriba) usando los ensayos funcionales descritos aquí.

En otros aspectos, las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de Ig kappa puede ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% Idéntica a las secuencias definidas más arriba. Un anticuerpo que tiene una cadena ligera Ig kappa con alta (esto es, 80% o mayor) identidad a las cadenas ligeras de Ig kappa de SEQ ID NOs: 81-84 respectivamente, pueden obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican SEQ ID NOs: 81-84, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado en cuanto a la retención de funciones (i.e., las funciones definidas más arriba) usando los ensayos funcionales descritos aquí.

En otros aspectos, la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de Ig kappa puede ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica u homóloga la secuencia definida más arriba. Un anticuerpo que tiene una cadena ligera Ig kappa con alta (esto es, 80% o mayor) identidad a la cadena ligera de Ig kappa de SEQ ID NOs: 74-76 respectivamente, pueden obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que comprenden SEQ ID NOs: 74-76 seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado en cuanto a la retención de funciones (i.e., las funciones definidas más arriba) usando los ensayos funcionales descritos aquí.

En otros aspectos, el anticuerpo que es una IgG4 puede ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% Idéntica a la secuencia de aminoácidos definida más arriba. Una IgG4 con alta (esto es, 80% o mayor) identidad con las composiciones de IgG4 de SEQ ID NOs: 89-96 respectivamente, pueden obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican SEQ ID NOs: 89-96, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado derivado por mutagénesis en cuanto a la retención de funciones ction (i.e., las funciones definidas más arriba) usando los ensayos funcionales descritos aquí.

En otros aspectos, el anticuerpo is an IgG4 that is 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% Idéntica a the nucleotide sequence definida más arriba. An IgG4 con alta (esto es, 80% o mayor) identidad con the IgG4’s de SEQ ID NOs: 85-88 respectivamente, pueden obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que comprenden SEQ ID NOs: 85-88 seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado en cuanto a la retención de funciones (i.e., las funciones definidas más arriba) usando los ensayos funcionales descritos aquí.

Tal como se utiliza aquí, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias y estos términos se utilizan de forma intercambiable aquí. La identidad porcentual entre las dos secuencias de una función del número de posiciones idénticas compartido por las secuencias (esto es, porcentaje de homología = # de porciones idénticas/# total de posiciones x 100), que tiene en cuenta el número de brechas, y la longitud de cada brecha, las cuales necesitan ser introducidas para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre las dos secuencias puede lograrse utilizando un algoritmo matemático, tal como se describe en los ejemplos no limitantes más adelante.

El porcentaje de identidad entre las dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos puede determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988), los cuales han sido incorporados en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad de longitud de brecha de 12 y una penalidad de brecha de 4. Además, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias de aminoácidos o las dos secuencias de nucleótidos puede determinarse utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970) el cual ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando bien sea una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de brecha de 16, 14, 12,10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

Adicionalmente o alternativamente, las secuencias de proteínas de la presente invención pueden utilizarse adicionalmente como una “secuencia de interrogación” para llevar a cabo una búsqueda contra bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden llevarse a cabo utilizando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden llevarse a cabo con el programa XBLAST, marcación=50, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de anticuerpos de la invención. Para obtener alineaciones con brechas para propósitos de comparación, puede utilizarse el Gapped BLAST tal como lo describen en Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, los parámetros de fondo de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden utilizarse. Véase http:lwww.ncbi.nhn.nih.gov.

Las condiciones que permitirán que las secuencias de nucleótidos hibriden a las secuencias de nucleótidos mostradas aquí pueden determinarse de acuerdo con técnicas conocidas. La hibridación de las secuencias de nucleótidos se llevan a cabo bajo condiciones de restricción reducida, restricción media e incluso condiciones restrictivas.

Condiciones de baja restricción de ejemplo son un regulador que contiene 35-40% de formamida con solución 5x Denthard, SDS al 0.5% y 1x SSPE a 37ºC. Condiciones de restricción media de ejemplo son un regulador que contiene 40-45 de formamida con solución 5x de Denthard, SDS al 0.5% y 1x SSPE a 42ºC. Condiciones de restricción alta de ejemplo son un regulador que contiene 50% de formamida con solucion 5x de Denthard, SDS al 0.5% y 1x SSPE a 42ºC

o temperatura superior, dependiendo del porcentaje G+C y la longitud de los polinucleótidos. Véase J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.) (Cold Spring Harbor Laboratory).

La hibridación de secuencias de nucleótidos bajo cualquiera de las condiciones de restricción de ejemplos anteriores se lleva a cabo en solución y se recolecta sobre un filtro. Alternativamente, la hibridación de las secuencias de nucleótidos bajo cualquiera de las condiciones de restricción de ejemplo anteriores se lleva a cabo en geles, por ejemplo, por inmunoprecipitación Southern Blotting.

Anticuerpos con modificaciones conservadoras.

En ciertos aspectos, un anticuerpo de la solicitud tiene una región VH que incluye secuencias seleccionadas del grupo de SEQ ID NOs: 55-72 y una región variable de cadena ligera que incluye secuencias seleccionadas del grupo de SEQ ID NOs: 31-54, de tal manera que una o más de estas secuencias tienen secuencias de aminoácidos específicadas con base en los anticuerpos descritos aquí o en modificaciones conservadoras de los mismos, y los anticuerpos tienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-c-Met de la invención. De acuerdo con lo anterior, la solicitud proporciona un anticuerpo aislado, o una porción de enlazamiento a antígeno del mismo, que tiene una cadena VH y una cadena VL de tal manera que la cadena VH tiene secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NOs: 55-72 y modificaciones conservadoras de los mismos; y la cadena VL tiene secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NOs: 31-54 y modificaciones conservadoras de la misma; el anticuerpo se enlaza específicamente a c-Met; y el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades funcionales: el anticuerpo activa e induce la internalización del receptor c-Met, el anticuerpo inhibe el enlazamiento del factor de crecimiento de proteína a c-Met, previniendo por lo tanto con tal inhibición la activación del receptor, por ejemplo, evitando la sobrerregulación de la ruta resultante de la activación de c-Met y/o la transducción de la señal, o evitando el anticuerpo

o mejorando la proliferación celular, la supervivencia celular, migración, invasión o cambios en morfología, o el anticuerpo antagoniza la actividad de c-Met, previniendo por lo tanto o mejorando el cáncer tal como crecimiento del tumor o metástasis.

En un aspecto alternativo, el anticuerpo es agonístico y activa la fosforilación de c-Met estimulando una respuesta celular.

En ciertos aspectos, el anticuerpo de la solicitud es una cadena ligera de Ig lambda que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs:77-80, de tal manera que una o más de estas secuencias tienen secuencias de aminoácidos derivadas de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpo descritos aquí, teniendo modificaciones conservadoras de las mismas, de tal manera que los anticuerpos derivados retengan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpo anti-c-Met de la invención. De acuerdo con lo anterior, la solicitud proporciona un anticuerpo original aislado, o una porción de enlazamiento a antígeno del mismo, que tiene una cadena ligera Ig lambda de tal forma que la cadena ligera de Ig tiene secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NOs: 77-80 y modificaciones conservadoras de las mismas; el anticuerpo se enlaza específicamente a c-Met; y el anticuerpo exhibe al menos una de las propiedades antagonísticas funcionales descritas aquí.

En otros aspectos, la solicitud proporciona un anticuerpo con una cadena ligera de Ig kappa que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID NOs: 81-84, de tal manera que uno o más de estos anticuerpos tiene una secuencia de aminoácidos derivada de los anticuerpos descritos aquí, que tiene modificaciones conservadoras de los mismos, y en donde los anticuerpos demuestran las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-c-Met originales de la invención. De acuerdo con lo anterior, la solicitud proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlazamiento a antígeno del mismo, que tiene una cadena ligera de Ig kappa de tal forma que la cadena ligera de Ig kappa tiene secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NOs: 81-84 y modificaciones conservadoras de las mismas; el anticuerpo se enlaza específicamente a c-Met; y el anticuerpo exhibe al menos una de las propiedades funcionales provistas aquí.

En otros aspectos, un anticuerpo de la solicitud es una IgG4 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 89-96, donde una o más de estas secuencias tiene una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos de origen de los anticuerpos descritos aquí o modificaciones conservadoras de las mismas, y los anticuerpos demuestran las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-c-Met de la invención. De acuerdo con lo anterior, la solicitud proporciona una anticuerpo aislado, o una porción de enlazamiento a antígeno de la misma en la cual el anticuerpo es una IgG4, en donde: la IgG4 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 89-96 y modificaciones conservadoras de las mismas; el anticuerpo se enlaza específicamente a c-Met; y el anticuerpo exhibe al menos una de las propiedades antagonísticas funcionales descritas aquí.

En una realización alternativa, el anticuerpo es agonístico y activa la fosforilación de c-Met estimulando una respuesta celular.

En diversos aspectos, el anticuerpo puede exhibir uno o más, dos o más o tres o más de las propiedades funcionales antagonísticas listadas y discutidas anteriormente. Tales anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos.

Tal como se utiliza aquí, el término “modificaciones de secuencia conservadoras” se entiende que se refiere a modificaciones en aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de enlazamiento del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y eliminaciones de aminoácidos tal como se describe aquí. Las modificaciones puede introducirse en un anticuerpo de la invención mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR.

Las sustituciones conservadoras de aminoácidos reemplazan un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente que tiene una cadena lateral química y físicamente similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares son conocidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con las cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, aspargina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invención pueden ser reemplazados con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales, y los anticuerpos alterados pueden ser probados en cuanto a la función retenida utilizando los ensayos funcionales descritos aquí.

Armazón de anticuerpos

Puede emplearse una amplia variedad de armazones o andamiajes de anticuerpos/inmunoglibulina y en tanto el polipéptido resultante incluya una o más regiones de enlazamiento que sean específicas para la proteína c-Met de las secuencias de ejemplo aquí. Tales armazones o andamios incluyen idiotipos principales de inmunoglobulinas humanas,

o fragmentos de las mismas (tales como las divulgadas aquí en la presente) se incluyen inmunoglobulinas de otras especies animales, que tienen preferiblemente aspectos humanizados. Anticuerpos de cadena pesada sencilla tales como los identificados en camélidos son de interés particular en este aspecto. Armazones, andamios y fragmentos novedosos continúan siendo descubiertos y desarrollados por los experimentados en la técnica.

Alternativamente, armazones o andamiajes no inmunoglobulina futuros o conocidos pueden emplearse, en tanto contengan una región de enlazamiento específica para la proteína c-Met. Tales compuestos se conocen aquí como “polipéptidos que comprenden una región de enlazamiento específica para c-Met”. Armazones o andamios no inmunoglobulina conocidos incluyen andectinas (fibronectinas) (CompoundTherapeutics, Inc., Waltham, MA), ankirina (Molecular PartnersAG,Zurich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd (Cambridge, MA) y Ablynx nv (Zwijnaarde, Belgica)), lipocalina (anticalina) (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), inmunofarmacéuticos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxicuerpos (Avidia, Inc. (Mountain View, CA)), proteína A (Affibody AG, Suecia) y afilina (gamma cristalina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania).

Anticuerpos que se enlazan al mismo epítope como anticuerpos anti-c-Met de la invención

En otro aspecto, la solicitud proporciona anticuerpos que se enlazan al mismo epítopo como lo hacen diversos anticuerpos anti-c-Met de la invención provistos aquí. Tales anticuerpos adicionales pueden identificarse con base en su capacidad para competencia cruzada (por ejemplo, para inhibir competitivamente el enlazamiento de, en una manera estadísticamente significativa) con otros anticuerpos de la invención en pruebas estándar de enlazamiento con c-Met. La capacidad de el anticuerpo de prueba para inhibir el enlazamiento de los anticuerpos que tienen habilidad conocida para enlazarse a la c-Met humana demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con ese anticuerpo. Tal anticuerpo puede, de acuerdo con una teoría no limitante, enlazarse al mismo epítopo o a uno relacionado (por ejemplo, uno similar estructuralmente o espacialmente próximo) en c-Met humana como el anticuerpo con el cual compite. Tales anticuerpos pueden prepararse y aislarse tal como se describe en los ejemplos.

Anticuerpos cámelidos

Las proteínas anticuerpo obtenidas a través de miembros de la familia de camellos y dromedarios (Camelus bactrianus y Calelus dromaderius) incluyendo miembro novedosos en el mundo como especies de llama (Lama paccos, Lama glama y Lama vicugna) se han caracterizado con respecto a tamaño, complejidad estructural y antigenicidad en sujetos humanos. Ciertos anticuerpos de IgG a partir de ésta familia de mamíferos tal como se encuentran en la naturaleza carecen de cadenas ligeras, y por lo tanto tienen estructuras que son distintas de la estructura cuaternaria típica de cuatro cadenas que tiene dos pesadas y dos cadenas ligeras, características de los anticuerpos de otros animales. Véase PCT/EP93/02214 (WO 94/04678 publicada el 3 de marzo de 1994).

Una región del anticuerpo de los camélidos que es el dominio variable sencillo pequeño identificado como VHH puede obtenerse por manipulación genética para producir una proteína pequeña que tiene una alta afinidad por un objetivo, dando como resultado una proteína derivada de anticuerpo de bajo peso molecular conocida como “nanocuerpo camélido”. Véase la patente de los Estados Unidos 5,759,808 emitida el 2 de Junio de 1998; véase también Stijlemans,

B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; and Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520. Las bibliotecas manipuladas de anticuerpos de camélidos y fragmentos de anticuerpos son disponibles comercialmente, por ejemplo, en Ablynx, Ghent, Belgica. Tal como se sabe en la técnica para otros anticuerpos de origen no humano, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo camélido puede alterarse por vía recombinante para obtener una secuencia que recuerde más cercanamente una secuencia humana, esto es, el nanocuerpo puede ser humanizado. Así, la baja antigenicidad natural de los anticuerpos de los camélidos hacia humanos puede reducirse adicionalmente.

El nanocuerpo camélido tiene un peso molecular de aproximadamente un décimo que el de una molécula de IgG humana, y la proteína tiene un diámetro físico de solamente unos pocos nanómetros. Una consecuencia del pequeño tamaño es la capacidad de los nanocuerpos de los camélidos para enlazarse con sitios antigénicos que son funcionalmente invisibles para proteínas anticuerpo más grandes, esto es, los nanocuerpos de los camélidos son útiles como reactivos para detectar antígenos que de otra manera son crípticos usando técnicas inmunológicas clásicas, y también son útiles como agentes terapéuticos posibles. Por ejemplo, aun otra consecuencia del tamaño pequeño es que un nanocuerpo de camélido puede inhibir como resultado del enlazamiento a un sitio específico en un surco o paso estrecho de una proteína objetivo, y por lo tanto puede servir con una capacidad que recuerda más cercanamente la función de fármaco de bajo peso molecular clásico que la del anticuerpo de alto peso molecular clásico.

El bajo peso molecular y el tamaño compacto dan como resultado adicionalmente que los nanocuerpos camélidos sean extremadamente termoestables, estables a pHs extremos y estables a una digestión proteolítica y tengan baja antigenicidad. Otra consecuencia es que los nanocuerpos de camélidos fácilmente se mueven del sistema circulatorio hacia los tejidos, esto es, se extravasan, e incluso cruzan la barrera sangre-cerebro y también pueden ser manipulados para tratar desordenes que afectan el tejido nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar adicionalmente el transporte de fármacos a través de la barrera sangre-cerebro. Véase la solicitud de patente de los Estados Unidos 20040161738 publicada el 19 de agosto de 2004. Estos rasgos combinados con la baja antigenicidad de los humanos indican un gran potencial terapéutico. Adicionalmente, estas moléculas pueden expresarse completamente en celulas procariotas tales como E. coli y expresarse como proteínas de fusión con bacteriófagos, y las proteínas así expresadas son funcionales.

De acuerdo con la anterior, una característica de la presente invención es un anticuerpo o nanocuerpo de camélido que tiene alta afinidad por la proteína c-Met objetivo. En ciertas realizaciones aquí, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se produce de forma natural en el animal camélido, esto es, producido por el camélido después de inmunización con la proteína objetivo c-Met o una fragmento de péptido de la misma, utilizando técnicas descritas aquí para otros anticuerpos, o se produce por vía recombinante en un animal camélido transgénico. Alternativamente, el nanocuerpo camélido anti-c-Met se manipula, esto es, es producido por selección por ejemplo a partir de una biblioteca de proteínas de nanocuerpos de camélidos apropiadamente mutagenizadas que desplieguen fago utilizando procedimientos de panoramización, como c-Met como objetivo tal como se describe en los ejemplos aquí. Los nanocuerpos manipulados pueden adicionalmente personalizarse mediante ingeniería genética para tener una vida media en un sujeto receptor desde 45 minutos hasta dos semanas.

Anticuerpos manipulados y modificados

A partir de un anticuerpo de la invención puede prepararse utilizando un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL, secuencias de cadena ligera de Ig lambda o secuencias de cadena ligera de Ig kappa mostradas aquí como material de partida, esto es, como secuencia de origen, para manipular un anticuerpo derivado modificado, el cual es un anticuerpo modificado, el cual puede tener propiedades alteradas y mejoradas en comparación con el anticuerpo de partida. Un anticuerpo puede ser manipulado modificando uno o más residuos en una o más regiones variables (esto es, VH y/o VL) o dentro de la cadena ligera de Ig lambda solamente, o dentro de la cadena ligera de Ig kappa solamente, dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones de la armazón. Adicionalmente

o alternativamente, un anticuerpo puede ser manipulado modificando residuos dentro de la región constante, por ejemplo para alterar una función efectora del anticuerpo.

Un tipo de manipulación en la región variable que puede llevarse a cabo es el injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con antígenos objetivo predominantemente a través de residuos de aminoácidos que están localizados en las cadenas pesada y liviana de regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Por esta razón las secuencias de aminoácidos con CDRs son más diversas entre anticuerpo individuales que las secuencias por fuera de los CDR. Puesto que las secuencias de CDR son responsables por la mayor parte de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar los anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpo específicos de origen natural construyendo vectores de expresión que incluyen las secuencias de CDR a partir del anticuerpo de origen natural, injertado sobre secuencias de armazón a partir de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; patente de los Estados Unido No. 5,225,539 para winter, y patentes de los Estados Unidos Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 and 6,180,370 para Queen et al.).

Tales secuencias de armazón pueden obtenerse a partir de bases de datos de ADN públicas o referencias publicadas que incluyen secuencias genéticas de anticuerpos de línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de línea germinal para regiones genéticas variables de cadenas pesada y liviana humanas puede encontrarse en la base de datos de secuencias de línea germinal humana “VBase” (disponible en internet en www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase) asi como en Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836. Se ha encontrado que en ciertos casos es beneficioso mutar residuos dentro de las regiones de armazón para mantener o potenciar la capacidad de enlazamiento al antígeno del anticuerpo (véase por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 and 6,180,370 para Queen et al).

Otro tipo de modificación en la región variable es la mutación de residuos de aminoácidos dentro de las regiones VH y/o VL CDR1, CDR2 y/o CDR3 para mejorar de esa manera una o más propiedades de enlazamiento (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés, conocida como “maduración de la afinidad”. La mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis mediada por PCR puede ejecutarse para introducir las mutaciones, y el efecto del consecuencia sobre el enlazamiento a los anticuerpo u otra propiedad funcional de interés se evalúa por ensayos in vitro o in vivo tal como se describe aquí y se provee en los ejemplos. Pueden introducirse modificaciones conservadoras (como las discutidas anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. Típicamente, no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR, aunque también se prevén alteraciones adicionales.

Los anticuerpos manipulados incluyen aquellos en los cuales las modificaciones se han hecho a los residuos de la armazón dentro de VH y/o VL, y/o cadenas ligeras de Ig lambda y/o cadenas ligeras de Ig kappa, por ejemplo para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente, tales modificaciones en la armazón se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, una metodología es “retromutar” uno o más de los residuos de la armazón al de la secuencia de línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido mutación somática puede contener residuos de la armazón que difieren de la secuencia de línea germinal de la cual se deriva el anticuerpo. Tales residuos pueden ser identificados comparando las secuencias de la armazón del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de las cuales se deriva el anticuerpo. Para regresar las secuencias de la región de armazón a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas son retromutadas a los residuos de la línea germinal, por ejemplo, por mutagenesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR. Tales anticuerpos retromutados también están abarcados dentro de la solicitud.

Otro tipo de modificaciones de la armazón involucra la mutación de uno o más residuos dentro de la región de la armazón, o incluso con una o más regiones de CDR, para eliminar epítopos de células T para reducir así la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Esta metodología se denomina también como “desinmunizacion” y se describe en mayor detalle en la patente de los Estados Unidos No. 20030153043 by Carr et al.

Además o alternativamente a las modificaciones hechas con la armazón o las regiones CDR, los anticuerpos de la invención pueden manipularse para incluir modificaciones dentro de la Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tal como vida media en suero, fijación por complemento, enlazamiento al receptor Fc, y/o citotoxicidad dependiente de antígenos. Además, un anticuerpo de la invención puede ser modificado químicamente (por ejemplo, pueden unirse una o más unidades estructurales químicas al anticuerpo) o pueden modificarse para alterar su glicosilación una vez para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se escribe en más detalle más adelante. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU de Kabat.

La región de bisagra de CH1 puede ser modificada del tal manera que el número de residuos de cisteína en la región debisagra se altera, por ejemplo, se incrementa o disminuye. Ésta metodología se describe adicionalmente en la patente de los Estados Unidos No. 5,677,425 de Bodmer et al. El número de residuos de cisteina en la región bisagra de CH1 puede alterarse para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas liviana y pesada o para incrementar y disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otro aspecto, la región de Bisagra Fc de un anticuerpo puede ser mutada para hacer la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, una o más mutaciones de aminoácidos se introducen en la interfaz de dominio CH2-CH3 del fragmento Fc-Bisagra del tal manera que el anticuerpo tenga un enlazamiento impedido a la proteína A deestafilococo (SpA) con respecto al enlazamiento en SpA del domino de Fc-Bisagra nativo. Ésta metodología se describe en más detalle en la patente de los Estados Unidos No. 6,165,745 de Ward et al.

En otro aspecto, el anticuerpo puede ser modificado para incrementar su vida media biológica. Hay varias metodologías posibles. Por ejemplo, una o más de las siguientes mutaciones pueden ser introducidas: T252L, T254S, T256F tal como describe en la patente de los Estados Unidos No. 6,277,375 de Ward. Alternativamente, para incrementar la vida media biológica, el anticuerpo puede ser alterado dentro de la región CH1 o CL para contener un epítopo de enlazamiento de receptor salvaje tomado de dos bucles de un dominio CH2 sobre una región Fc de una IgG, tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos No. 5,869,046 y 6,121,022 de Presta et al.

En aun otros aspectos, la función de Fc puede ser alterada reemplazando al menos un residuo de aminoácidos con un residuo de aminoácidos diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden ser reemplazados con un aminoácido o residuo de aminoácido diferente de tal manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por ese ligando efector pero retiene la capacidad de enlazamiento al antígeno del anticuerpo original. El ligando efector al cual se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un recepetor Fc o elcomponente C1 de complemento. Ésta metodología está descrita en más detalle en la patente de los Estados Unidos 5,624,821 y 5,648,260, ambas de Winter et al.

En otro aspecto uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente de tal manera que el anticuerpo tenga enlazamiento a Clq alterado y/o unacitotoxicidad reducida o abolida dependiente del complemento (CDC). Ésta metodología se describe en mayor detalle en la patente de los Estados Unidos No. 6,194,551 de Idusogie et al.

En otro aspecto, uno o más residuos de aminoácidos pueden ser alterados para por lo tanto alterar la capacidad elanticuerpo para fijar un complemento. Ésta metodología se describe adicionalmente en la publicación de PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.

En aun otro aspecto, la región Fc puede ser modificada para incrementar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para incrementar la afinidad del anticuerpo por un recepto Fcy modificando uno o más aminoácidos. Ésta metodología está descrita adicionalmente en la publicación de PCT WO 00/42072 de Presta. Además, los sitios de enlazamiento sobre IgG1 para FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcRn han sido mapeadas y se han descrito variantes con enlazamientos mejorados (véase Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Los anticuerpos que tiene tales regiones de Fc modificadas están dentro del alcance de las composiciones aquí.

En aun otro aspecto, la glicosilación de un anticuerpo puede ser modificada. Por ejemplo, puede hacerse un anticuerpo aglicosilado (esto es, el anticuerpo carece de glicosilación). La aglicosilación puede alterarse para, por ejemplo, incrementar la afinidad del anticuerpo para el antígeno de c-Met objetivo. Tales modificaciones de carbohidratos pueden lograrse mediante: por ejemplo, alteración de uno o más sitios de glicosilación con la secuencia de anticuerpos. Por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos pueden hacer que el de cómo resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de la armazón en la región variable para por lo tanto eliminar la glicosilación en ese sitio. Tal aglicosilación puede incrementar la capacidad del anticuerpo por el antígeno. Tal metodología se describe en mayor detalle en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,714,350 y 6,350,861 de Co et al.

Adicionalmente o alternativamente, puede hacerse un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo que tenga cantidades reducidas hipofugosiladas de residuos fugosilo o un anticuerpo que tenga estructuras visectantes GclNac incrementadas. Tales patrones de glicosilación alterados han demostrado incrementar la actividad de anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidrato pueden ser logradas, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con maquinaria enzimática de glicosilacion alterada. Las células con maquinaria de glicosilacion alterada han sido descritas en la técnica y pueden ser utilizadas como células huésped para expresar anticuerpos recombinantes de la invención y producir por lo tanto un anticuerpo con glicosilacion alterada. Por ejemplo, la EP 1,176,195 de Hang et al. describe una línea celular con gen FUT8 de funcionalidad perturbada, el cual codifica una fucosil transferasa, de tal forma que los anticuerpos expresados en tal línea celular exhiben ipufucosilación. La publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea celular CHO variante, células Lecl3, con capacidad reducida para enlazar la fucosa a los carbohidratos enlazados con Asn(297), y dando como resultado una hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields, RL. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al. Describe líneas celulares manipuladas para expresar glicosil transferasas modificantes con glicoproteínas (por ejemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) de tal manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares manipuladas exhiben estructuras GlcNac bisectantes incrementadas lo cual da como resultado una actividad de ADCC incrementada de los anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).

Otra modificación de los anticuerpos aquí que es contemplada por la solicitud es la pegilación. Un anticuerpo puede ser pegilado para, por ejemplo incrementar la vida media biológica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, se hace reaccionar típicamente con polietilenglicol (PEG) como un derivado éster o aldehído reactivo de el PEG, bajo condiciones en las cuales uno o más grupos PEG se unen de forma covalente al anticuerpo o al fragmento del anticuerpo. La pegilación puede llevarse a cabo mediante una reacción de acilación o mediante una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactivo (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Tal como se utiliza aquí, el término “polietilenglicol” pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que hayan sido utilizadas para formar derivados de otras proteínas, tales como mono (C1-C10) alcoxi-o ariloxipolietilen glicol o polietilenglicol maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en la técnica y pueden aplicarse a los anticuerpos de la invención. Véase por ejemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al. y EP 0 401 384 por Ishikawa et al.

Métodos para manipular anticuerpos

Tal como se discutió anteriormente, los anticuerpos anti-c-Met que tienen secuencias VH, VL, de cadena ligera de Ig lambda, o de cadena ligera de Ig kappa mostradas aquí pueden utilizarse para manipular anticuerpos adicionales anti-c-Met mediante la modificación de residuos en las secuencias VH y/o VL, y/o de las cadenas ligeras de Ig lambda, y/o en las cadenas ligeras de Ig kappa, modificando la región constante unida a las mismas. Así, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de un anticuerpo anti-c-Met de la invención pueden utilizarse para crear estructuralmente anticuerpos relacionados anti-c-Met que retengan al menos una propiedad funcional de los anticuerpos antagonísticos o agonísticos originales de la invención, tal como el enlazamiento a c-Met humana y también la inhibición de una o más propiedades funcionales de c-Met (por ejemplo, induciendo la internalización, evitando la activación, por ejemplo, una superregulación resultante de la transducción de señales, previniendo o mejorando la proliferación, supervivencia, migración, invasión o cambios en morfología celular o el anticuerpo inhibe el enlazamiento del receptor de c-Met previniendo o mejorando cáncer tal como crecimiento del tumor y/o metástasis) o en el caso agonístico, activando la fosforilación de c-Met y estimulando una respuestas celular así como otras propiedades funcionales provistas aquí.

Por ejemplo, una o más regiones CDR de los anticuerpos de la presente invención, o mutaciones de las mismas, pueden combinarse de forma recombinante con regiones de armazón conocida y/o otros CDR para crear anticuerpos adicionales manipulados por via recombinante anti-c-Met de la invención, tal como se discutió anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen las descritas en la sección previa. El material de partida para el método de manipulación es uno o más de las secuencias de VH y/o VL provistas aquí, o una o más de las regiones CDR de las mismas para ser utilizadas como secuencia original. Para crear el anticuerpo manipulado, no es necesario preparar realmente (esto es, expresar como una proteína) un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias de VH y/o VL provistas aquí, o una o más de las regiones CDR de las mismas. Adicionalmente, la información contenida en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos se utiliza como material de partida para técnicas mutacionales conocidas en la técnica, para crear una secuencia o secuencias de “segunda generación” derivadas de la secuencia original y luego las secuencias de nucleótidos “segunda generación” se prepara y se expresa como proteína.

De acuerdo con lo anterior, en ciertos aspectos, la solicitud proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-c-Met que tiene como material original de partida una secuencia de anticuerpos de VH que tiene una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 55-72 y una secuencia de anticuerpos VL que tiene una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 31-54. El método involucra alterar al menos un residuo de aminoácidos dentro de la secuencia original de los anticuerpos de VH y/o VL para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada. Y expresar la secuencia de anticuerpos alterada como proteína.

En otros aspectos, la solicitud proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-c-Met que comprende: una secuencia de anticuerpos de cadena ligera de Ig lambda que tiene una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 77-80, y la alteración de al menos un residuo de aminoácidos dentro de la secuencia del anticuerpo de cadena ligera de Ig lambda para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como proteína.

En aspectos relacionados, la solicitud proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-c-Met que comprende: una secuencia de anticuerpo de cadena ligera de Ig kappa que tiene una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 81-84; alterar al menos un residuo de aminoácidos dentro de la secuencia de anticuerpo de cadena ligera de Ig kappa para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como proteína.

El anticuerpo alterado puede exhibir una o más, dos o más, o tres o más de las propiedades funcionales discutidas aquí.

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden establecerse utilizando pruebas estándar disponibles en la técnica y/o descritas aquí, tales como las fijadas en los ejemplos (por ejemplo, ELISA).

En ciertos aspectos de los métodos de manipulación de anticuerpos de la invención, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente o selectivamente a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación del anticuerpo anti-c-Met y los anticuerpos resultantes modificados anti-c-Met pueden expresarse y seleccionarse en cuanto a la actividad de enlazamiento y/o otras propiedades funcionales tal como se describe aquí. Se han descrito métodos mutacionales en la técnica. Por ejemplo, la publicación PCT WO 02/092780 de Short describe métodos para crear y seleccionar

5 mutaciones de anticuerpos utilizando mutagénesis por saturación, ensamblaje por ligación sintética, o una combinación de los mismos. Alternativamente, la publicación PCT WO 03/074679 de Lazar et al. describe métodos para utilizar métodos de selección computacionales para optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos.

Anticuerpos de la invención

10 Las secuencias de nucleótidos y polipéptidos de los anticuerpos de la invención se proporcionan más adelante. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de los anticuerpos de primera selección se proveen en la Tabla A y en la TablaC, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de los anticuerpos mejorados por afinidad en comparación con los anticuerpos originales se proveen la Tabla B y Tabla D, respectivamente.

15 Tabla A: Secuencias de aminoácidos de regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos anti-c-Met Fab originales

Tabla B: Secuencias de aminoácidos de regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos mejorados en la afinidad de anti-c-Met Fab

Se contemplan secuencias de nucleótidos adicionales relacionadas dentro del alcance de la solicitud, por ejemplo, cambios en bases por balanceo, utilización optimizada de codones, secuencias optimizadas para la expresión en huésped, por ejemplo, modificaciones para eliminar secuencias de empalme cripticas y mutaciones conservadoras. Las secuencias de polipéptidos relacionadas adicionales que se contemplan dentro del alcance de la solicitud tienen, por ejemplo, cambios conservadores de aminoácidos, o contienen secuencias de aminoácidos adicionales tales como pestañas 6xHis u otras pestañas o se fusionan a una segunda secuencia de polipéptidos, o contienen cambios de residuos que reducen la respuesta inmune a la terapia con anticuerpos, o que tienen residuos FR1, FR2, FR3 o FR4 modificados. Las regiones FR y CDR están provistas en las figuras 1-3. Las secuencias de CDR preferidas son las provistas en las figuras.

Las enfermedades dependientes de la proteína quinasa son especialmente enfermedades proliferativas, preferiblemente un tumor benigno o especialmente maligno, más preferiblemente carcinoma del cerebro, riñón, hígado, glándula adrenal, vejiga, seno, estómago (especialmente tumores gástricos), o varios, colon, recto, próstata, páncreas, vagina, tiroides, sarcoma, glioblastomas, mieloma múltiple o cáncer gastrointestinal, especialmente carcinoma de colon o adenoma colorrectal, o un tumor de cuello y cabeza, una hiperproliferación epidérmica, especialmente soriasis, hiperplasia de la próstata, una neoplasia, especialmente de carácter epitelial, preferiblemente carcinoma mamario, o una leucemia, especialmente en cuanto la c-Met esté involucrada. Son capaces de generar la regresión de tumores y evitar la formación de metástasis tumorales y el crecimiento de metástasis (también micro). Además pueden utilizarse en hiperproliferación epidérmica (por ejemplo, soriasis), en hiperplasia de próstata, en el tratamiento de neoplasias, especialmente de carácter epitelial, por ejemplo carcinoma de mamas y en leucemias. Es posible también utilizar los anticuerpos de la invención en el tratamiento de enfermedades del sistema inmune en tanto estén involucradas varias o, especialmente, proteínas quinasas de tirosina individuales y/o (adicionalmente, proteínas quinasas de serina/treonina; adicionalmente, los anticuerpos de la invención también pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central o periférico donde la transmisión de señales por al menos una de las proteína quinasas tirosina y/o (adicionalmente) proteína quinasa serina/treonina están involucradas.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento funcional de este anticuerpo se enlaza a la proteína objetivo c-Met y modula, esto es, bien sea activa o inhibe, la fosforilación de c-Met. En ciertas realizaciones, la activación de la fosforilación de c-Met estimula al menos una de una actividad seleccionada del grupo de regeneración de órganos, curación de heridas y regeneración de tejidos. En una realización relacionada, el órgano es piel, riñón, hígado, páncreas, pulmón, intestino, timo o tiroides. En realizaciones alternativas, los anticuerpos para c-Met bloquearían la infección patogénica, particularmente infección por Listeria, o mejorar enfermedades patológicas tales como malaria (Carrolo, et al., Nature Med. 9: 1363-1369, 2003).

Los anticuerpos que muestran inhibición de c-Met son útiles en el tratamiento de cáncer de colon, incluyendo metástasis, por ejemplo, en el hígado, y de carcinoma de pulmón de células no pequeñas. Los anticuerpos de anti-c-Met también pueden utilizarse en el tratamiento de carcinoma renal papilar hereditario (Schmidt, L. et al. Nat. Genet. 16, 6873, 1997) y otras enfermedades proliferativas en las cuales las c-Met está sobreexpresada o está activada constitutivamente por mutaciones (Jeffers and Vande Woude. Oncogene 18, 5120-5125,1999; y la referencia citada aquí) o reordenamiento cromosómicos (por ejemplo, TPR-MET; Cooper et al. Nature 311, 29-33, 1984; Park. et al. Cell 45, 895-904, 1986). Los antagonistas de los anticuerpos de la invención son especialmente útiles para el tratamiento de una célula no deseada, en particular una célula asociada con una condición relacionada con c-Met tal como cáncer, una metástasis o una condición inflamatoria. Cánceres de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, esofágico, de seno, de riñón incluyendo pero no limitándose a carcinoma celular renal papilar, glioma, de cabeza y cuello, epitelial, de pulmones, de piel; leucemia, linfoma, mieloma, cerebro, pancreático, gástrico, gastrointestinal, de estómago, de intestino, de colon, de hígado, genital, urinario, melanoma y próstata. Cánceres y condiciones adicionales se proveen aquí o son conocidas en la técnica.

Adicionalmente, los anticuerpos que muestran antagonismo de c-Met son útiles en el tratamiento de el cáncer de vejiga (superficial e invasivo muscular), cáncer de seno, cáncer cervical, cáncer colorrectal, glioma (incluyendo glioblastoma, astrocitoma anaplástico, oligoastrocitoma, oligodendroglioma), cáncer esofágico, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular (HCC), incluyendo HCC de la niñez, cáncer de cabeza y cuello (incluyendo carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo), carcinoma de células de Hurthel, melanoma maligno, mesotelioma, mieloma múltiple, leucemias, cáncer de pulmón de células no pequeñas (incluyendo todos los subtipos histológicos: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma broncoalveolar, carcinoma de células grandes y de tipo adenoescamoso mixto), cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de células renales incluyendo cáncer de células renales hereditario y papilar esporádico, tipo I y II y cáncer de células renales de células claras; sarcomas, en particular osteosarcomas, sarcomas de células claras, y sarcomas de tejidos blandos (incluyendo rabdomiosarcomas alveolares y embrionarios, sarcomas alveolares de parte blanda); carcinoma de tiroides (papilar y otros subtipos).

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un método para tratar un trastorno o condición relacionado con c-Met, el cual involucra administrar a un sujeto que así lo requiere una cantidad efectiva de cualquiera de las anteriores composiciones farmacéuticas. El trastorno o condición es un cáncer o una condición inflamatoria. En otra realización relacionada, el cáncer es esofágico, de seno, de riñón, de cabeza y cuello, epitelial, de pulmón, leucemia, linfoma, mieloma, de cerebro, pancreático, de estómago, de colon, de hígado, genital, urinario, melanoma o próstata. En una realización particular el cáncer es de hígado o esofágico.

En ciertas realizaciones, cualquiera de los métodos anteriores involucra administrar adicionalmente un agente quimioterapéutico. En una realizacion relacionada, el agente quimioterapéutico es un agente anticáncer.

En aun otra realización, la invención provee un método para tratar una célula no deseada que involucra poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpo anteriores o fragmentos funcionales de estos anticuerpos. En una realización relacionada, la célula porta un receptor c-Met. En otra realización relacionada, el método anterior involucra adicionalmente tratar la célula con un agente quimioterapéutico o radiación.

En una realización alternativa, el anticuerpo responde y activa la fosforilación de c-Met estimulando una respuesta celular, tal como en la curación de heridas.

En otra realización, la invención provee una composición farmacéutica que incluye cualquiera de los anticuerpos o fragmentos funcionales anteriores de estos anticuerpos y agente terapéutico adicional. El agente terapéutico adicional se selecciona del grupo consistente de un agente anticáncer; un antibiótico; un agente antiinflamatorio; un factor de crecimiento; y una citoquina.

Moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos de la invención

Otro aspecto de la solicitud es pertinente a las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención. Ejemplos de secuencias de VH se muestran en SEQ ID NOs: 21-30. Ejemplos de secuencias de VL se muestran en SEQ ID NOs: 1-20. Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos de Ig lambda se muestra en SEQ ID NO:

73. Ejemplos de secuencias de nucleótidos de Ig kappa se muestran en SEQ ID NOs: 74-76. Ejemplos de secuencias de nucleótidos de IgG4 se muestran en SEQ ID NOs: 85-88.

Los ácidos nucleicos provistos aquí que codifican los anticuerpos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular, o pueden ser ácidos nucleicos en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se alisa o se hace sustancialmente puro cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos o proteínas nucleicas celulares, mediante técnicas estándar, que incluyen tratamiento alcalino/SDS, formación de bandas con CsCl, cromatografía de columna, electroforesis en gel de agarosa y otras técnicas bien conocidas en el arte. Véase, F. Ausubel, et al., ed. 2006, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York. Tal ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede contener o no secuencias intrónicas. En una realización, el ácido nucleico es una molécula de ADNc. El ácido nucleico puede estar presente en un vector tal como un vector de despliegue de fago o en un vector plásmido recombinante.

Los ácidos nucleicos pueden obtenerse utilizando técnicas estándar de biología molecular. Para anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos que portan genes de inmunoglobulina humanos tal como se describe adicionalmente más adelante), ADNc que codifican las cadenas liviana y pesadas del anticuerpo hecho por el hibridoma pueden obtenerse por amplificación estándar por PCR o técnicas de clonación de ADNc. Para anticuerpos obtenidos a partir de una biblioteca de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, utilizando técnicas de despliegue de fagos), ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede ser recuperado a partir de diversos clones de fagos que también son miembros de la biblioteca.

Una vez que se obtiene los fragmentos de ADN que codifican los segmentos de VH y VL, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente por técnicas de ADN recombinante estándar, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable a genes de cadena de anticuerpos de longitud completa, a fragmentos de genes Fab o a un gen scFv ligando los nucleótidos de codificación en vectores conocidos. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se enlaza operativamente a otra molécula de ADN, o a un fragmento que codifica otra proteína, tal como una región constante de un anticuerpo o un enlazante flexible. El término “enlazado operativamente” tal como se utiliza en este contexto, se entiende con el significado de que dos fragmentos de ADN se unen en una manera funcional, por ejemplo, de tal forma que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN puedan permanecer en el marco, o de tal manera que la proteína se exprese bajo el control de un promotor deseado.

El ADN aislado que codifica la región VH puede ser convertido en un gen de cadena pesada de longitud completa enlazando operativamente el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifique las regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de los genes de la región constante de cadena pesada humanas son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo Kabat, E. A., el al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y pueden obtenerse fragmentos de ADN que abarcan estas regiones por amplificación estándar con PCR. La región constante de cadena pesada puede ser una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD de región constante. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede ser enlazado operativamente a otra molécula de ADN que codifica solamente la región constante de la cadena pesada CH1.

El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como un gen de cadena liviana Fab) enlazando operativamente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena de luz humana son conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación estándar con PCR. La región constante de cadena ligera puede ser una región kappa o lambda constantes. Para crear un gen scFv los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se enlazan operativamente a otro fragmento que codifica un enlazante flexible, por ejemplo, codificando la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de tal forma que las secuencias de VH y VL puedan expresarse como una proteína de cadena sencilla contigua, con las regiones VL y VH enlazadas mediante el enlazante flexible (véase, por ejemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et at., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:58795883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554).

Producción de anticuerpo monoclonales de la invención

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) pueden producirse mediante una variedad de técnicas, incluyendo una metodología de anticuerpo monoclonal convencional, por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas estándar de Kohler and Milstein, 1975 Nature 256:495. Pueden emplearse muchas técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B.

Un sistema animal para preparar hibridomas es un sistema murínico. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión son conocidas en el arte. Los asociados de fusión (por ejemplo, células de mieloma murínicas) y los procedimientos de fusión también son conocidos.

Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención pueden prepararse con base en la secuencia de un anticuerpo monoclonal murínico preparado como se describió anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y liviana pueden obtenerse a partir del hibridoma murínico de interés y manipularse para que contengan secuencias de inmunoglobulina no murínica (por ejemplo humana) utilizando técnicas de biología molecular estándar. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murínicas pueden enlazarse a regiones constantes humanas utilizando métodos conocidos en la técnica (véase por ejemplo, patente de los Estados Unidos No. 4,816,567 de Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR murínicas pueden insertarse en una armazón humano utilizando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,225,539 de Winter, y las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen.et al.).

En una cierta realización, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra c-Met pueden generarse utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmune humano en vez del sistema del ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones denominados aquí como ratones HuMab y ratones KM, respectivamente, y se denominan colectivamente aquí como ratones con “Ig humana”.

Los ratones HuMab® (Medarex, Inc.) contienen un gen de inmunoglobulina humana miniloci que codifican secuencias de inmunoglobulinas humanas reorganizadas de cadena pesada (p y y) y de cadena ligera K, junto con mutaciones objetivo que inactivan los loci de las cadenas endógenas ! y K (véase por ejemplo, Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859). De acuerdo con lo anterior, los ratones exhiben expresión reducida de IgM o K de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de las cadenas pesada y liviana humana introducidos sufren con mutación de clase y mutación somática para generar IgGK monoclonal humana (Lonberg, N. et al., 1994 supra; reviewed in Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, and Harding F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y uso de los ratones HuMab, y de las modificaciones genéticas llevadas a cabo por tales ratones, se describe adicionalmente en Tailor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at, 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Tailor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; and Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851,. Véase adicionalmente las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; and 5,770,429; todo hasta Lonberg y Kay; la patente de los Estados Unidos No. 5,545,807 de Surani et al.; las publicaciones PCT Nos. WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y la publicación PCT No. WO 01/14424 de Korman et al.

En otra realización, la producción de los anticuerpos humanos de la invención puede ser disparada (“elevada”) utilizando un ratón que porte secuencias sobre transgenes y transcromosomas de inmunoglobulina humana tales como un ratón que porta un transgen de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Tales ratones, denominados aquí como “ratones KM”, se describen en detalle en la publicación PCT WO 02/43478 de Ishida et al.

Aun adicionalmente, sistemas animales transgénicos alternativos que expresen genes de inmunoglobulina humanos están disponibles en la técnica y pueden utilizarse para producir los anticuerpos anti-c-Met de la invención. Por ejemplo, un sistema transgénico alternativo denominado como Xenomouse (Abgenix, Inc.) puede utilizarse; tales ratones están descritos, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 y 6,162,963 de Kucherlapati et al.

Adicionalmente, hay disponibles en la técnica y pueden utilizarse sistemas alternativos transcromosómicos que expresan genes de inmunoglobulina humana para generar anticuerpos anti-c-Met de la invención. Por ejemplo, los ratones que portan tanto un transcromosoma de cadena pesada como un transcromosoma de cadena liviana humanas, denominados como “ratones TC” puede utilizarse aquí; tales ratones están descritos en Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Adicionalmente, se han descrito en la técnica vacas que portan transcromosomas humanos de cadena pesada y ligera (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894) y pueden utilizarse para generar los anticuerpos anti-c-Met de la invención.

Los anticuerpos humanos o los anticuerpos monoclonales humanos también pueden prepararse utilizando métodos de despliegue de fagos para bibliotecas de selección de genes de inmunoglobulina humanos. Tales métodos de despliegue de fagos para identificar y clonar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica. Véase por ejemplo: patentes de los Estados Unidos Nos. 5,223,409; 5,403,484; y 5,571,698 de Ladner et al.; patentes de los Estados Unidos Nos. 5,427,908 y 5,580,717 de Dower et al.; patentes de los Estados Unidos Nos. 5,969,108 y 6,172,197 de McCafferty et al.; y patentes de los Estados Unidos Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 de Griffiths et al.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también pueden prepararse utilizando ratones SCID en los cuales se han reconstituido células inmunes humanas de tal forma que pueda generarse una respuesta anticuerpo humana por inmunización. Tales ratones se describen por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,476,996 y 5,698,767 de Wilson et al.

Generación de anticuerpos monoclonales humanos contra c-Met

c-Met humana extracelular recombinante purificada expresada en E. coli (R & D Systems, Minneapblis, MN), o c-Met humana recombinante purificada conjugada con hemocianina de lapa (KLH), se utiliza como antígeno. También se contemplan otras fuentes de c-Met expresadas consideradas dentro del alcance de la invención, incluyendo, por ejemplo, c-Met aislada a partir de sistemas de expresión tales como baculovirus, células CHO y otras conocidas para los experimentados en la técnica.

Anticuerpos monoclonales completamente humanos para c-Met se preparan utilizando cepas HCo7, HCo12 y HCo17 de ratones transgénicos HuMab y la cepa KM de ratones transgénicos transcromosómicos, cada una de los cuales expresa los genes y anticuerpo humano. En cada una de estas cepas de ratones, el gen de cadena ligera kappa endógeno de ratón puede ser perturbado homozigóticamente tal como se describe en Chen et al., 1993 EMBO J.12:811-820 y el gen de cadena pesada de raton endógeno puede ser perturbado homozigóticamente tal como se describe en el ejemplo 1 de la publicación PCT WO 01109187. Cada una de estas cepas de ratones porta un transgen humano de cadena ligera kappa, KCo5, tal como se describe en Fishwild et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851. La cepa HCo7 el transgen de cadena pesada humano HCo7 tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,545,806; 5,625,825; y 5,545,807. La cepa HCo12 porta el transgen de cadena pesada humano HCo12 tal como se describe en el ejemplo 2 de la publicación PCT WO 01/09187. La cepa HCo17 porta el transgen de cadena pesada humano HCo17. La cepa KNM contiene el transcromosoma SC20 tal como se describe en la publicación PCT WO 02/443478.

Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para c-Met, se inmunizan ratones HuMab y ratones KM con c-Met extracelular recombinante purificado expresado en E.coli o con el conjugado c-Met-KLH como antígeno. Los esquemas generales de inmunización para ratones HuMab se describen en Lonberg, N. et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. Et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851 y la publicación PCT WO 98/24884. Los ratones de 6-16 semanas de edad en la primera infusión del antígeno. Una preparación recombinante purificada (5-50 !g) del antígeno c-Met (por ejemplo purificado a partir de células de E. coli transfectadas que expresan el dominio celular de c-Met) se utiliza para inmunizar los ratones HuMab y los ratones KM intraperitonealmente, subcutáneamente (Sc) o por inyección en las almohadillas de las patas.

Los ratones transgénicos son inmunizados dos veces con antígeno en adyuvante de Freund completo o adyuvante de Ribi bien sea por via intraperitoneal (IP), subcutánea (Sc) o en las almohadillas de los pies (FP), seguido por inmunización con IP, Sc o FP de 3-21 dias (hasta un total de 11 inmunizaciones) con el antígeno en adyuvante completo de Freund o Ribi. La respuesta inmune se monitorea por sangrados retroorbitales. El plasma es seleccionado por ELISA y los ratones con título suficiente de inmunoglobulina humana anti-c-Met se utilizan para las fusiones. Los ratones son potenciados por vía intravenosa con antígeno 3 y 2 días antes del sacrificio y remoción del bazo. Típicamente, se llevan a cabo 10-35 funciones por cada antígeno. Se inmunizan varias docenas de ratones para cada antígeno. Se inmunizaron con c-Met un total de 82 ratones de la cepas HCo7, HCo12, HCo17 y KM.

Para accionar los ratones HuMab o KM que producen anticuerpos que se enlazan con c-Met, los sueros de los ratones inmunizados pueden probarse con ELISA tal como lo describe Fishwild, D. et al., 1996. En resumen, en un protocolo de ejemplo, las placas de microtitulación se recubren con c-Met recombinante purificado de E. coli a 1-2 !g/ml en PBS, 50 !l/pozo incubado a 4ºC durante la noche y luego se bloquean con 200 !l/pozo de suero de pollo al 5% en PBS/Tween (0.05%). Pueden utilizarse otras concentraciones y fuentes alternativas. Las diluciones del plasma a partir de ratones inmunizados con c-Met se agregan a cada pozo y se incuban durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan con PBS/Tween y luego se incuban con un anticuerpo policlonal IgG Fc de cabra anti-humano conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se desarrollan con un sustrato ABTS (Sigma, A-1888, 0.22 mg/ml) y se analizan por espectrofotómetro a una longitud de honda I de 415495 nm. Alternativamente, son posibles otros tipos de detección, y pueden proveerse por una persona experimentada en la técnica. Los ratones que desarrollan los títulos más altos de anticuerpos anti-c-Met se utilizan para obtener las células para las fusiones. Las fusiones se llevan a cabo y se prueban los sobrenadantes de hibridoma en cuanto la actividad anti-c-Met mediante ELISA.

Los esplenocitos de ratón aislados a partir de los ratones HuMab y ratones KM, se fusionan en una línea celular de mieloma de ratón con base en protocolos estándar utilizando PEG. Los hibridomas resultantes se seleccionan entonces para la producción de anticuerpos específicos para los antígenos. Las suspensiones celulares individuales de los linfocitos esplénicos a partir de ratones inmunizados se fusionan hasta un cuarto del número de células de mieloma de ratón no secretantes SP2/0 (ATCC, CRL 1581), con PEG al 50% (Sigma). Las células son sembradas en placa a aproximadamente 1x105/pozo en placas de microtitulación de fondo plano, seguidas por una incubación de aproximadamente dos semanas en medio selectivo que contiene 10% de suero bovino fetal, 10% de medio acondicionado P388D 1(ATCC, CRL TIB-63), 3-5% de factor de clonación de Origen® (IGEN) en DMEM (Mediatech, CRL 10013, con alta glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio), más HEPES 5 mM, 2-mercaptohetanol 0.055 mM, 50 mg/l de gentamicina y lx HAT (Sigma, CRL P-7185). Después de 1-2 semanas, las células se cultivan en medio en el cual se reemplaza el HAT con HT. Se seleccionan entonces los pozos individuales por ELISA en busca de anticuerpos de IgG monoclonales humanos anti-c-Met. Una vez que se ha presentado un crecimiento extenso del hibridoma, el medio se monitorea usualmente después de 10-14 días. Los hibridomas secretantes de anticuerpos se siembran de nuevo, se seleccionan de nuevo y, si aun son positivos para anticuerpos monoclonales humanos de IgG, anti-c-Met se subclonan al menos dos veces por dilución limitante. Los subclones estables son cultivados entonces in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpos en un medio de cultivo de tejidos para caracterización posterior.

Inmunización de ratones con Ig humano

Ratones con Ig humano usados para generar anticuerpos humanos de la invención se inmunizan con un preparación purificada o enriquecida de antígeno c-Met y c-Met recombinante, o una proteína de fusión de c-Met, tal como lo describe Lonberg, N. et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845851; y la publicación PCT WO 98124884 y WO 01/14424.

Los ratones tienen de 6 a 16 semanas de edad en la primera infusión. Por ejemplo, se utiliza una preparación purificada

o recombinante (5-50 !g) de antígeno de c-Met para inmunizar los ratones Ig humana intraperitonealmente.

Los procedimientos detallados para generar anticuerpos monclonales completamente humanos para c-Met se describen más arriba. La experiencia acumulada con diversos antígenos ha mostrados que los ratones transgénicos responden cuando se inmunizan inicialmente por vía intraperitoneal (IP) con un antígeno en adyuvante de Freund completo, seguido por inmunizaciones IP (hasta una total de seis) con antígeno en adyuvante de Freund incompleto una semana de promedio. Sin embargo, los adyuvantes diferentes a Freund también se encuentran como efectivos. Además, las células completas en ausencia de adyuvantes se encuentran altamente inmunogénicas. La respuesta inmune puede ser monitoreada durante el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma obtenidas de sangrados retroorbitales. El plasma puede ser seleccionado por ELISA, y los ratones con suficiente título de inmunoglobulina antic-Met humana pueden utilizarse para las fusiones. Los ratones pueden ser potenciados por vía intravenosa con antígeno tres días antes del sacrificio y del retiro del bazo. Se espera que puedan necesitarse de dos a tres fusiones para cada inmunización. Se inmunizan típicamente entre 6 y 24 ratones para cada antígeno. Usualmente se utilizan ambas cepas HCo7 y HCo12. Además, ambos transgenes HCo7 y HCo12 pueden ser cruzados entre si en un ratón individual que tiene dos diferentes transgenes de cadena pesada humanos (HCo7-HCo12).

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos

Para generar hibridomas que produzcan anticuerpos monoclonales humanos de la invención, los esplenocitos y/o las células de los nódulos linfáticos de ratones inmunizados se aíslan y fusionan con una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se seleccionan para la producción de anticuerpos específicos para antígenos. Por ejemplo, las suspensiones de células sencillas de linfocitos esplénicos a partir de ratones inmunizados se fusionan hasta una sexta parte del número de células de mieloma de ratón no secretantes P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con PEG al 50%. En una realización de ejemplo, las células son sembradas en placas de microtitulación de fondo plano, seguidas por una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene suero fetal de Clon al 20%, medio condicionado al 18% “653”, Origen® al 5% (IGEN), Lglutamina 4 mM, piruvato de sodio 1mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptohetanol 0.055 mM, 50 unidades mg/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 !g/ml de gentamicina y 1X HAT (Sigma; el HAT se agrega 24 horas después de la fusión). Después de aproximadamente 2 semanas, pueden cultivarse las células en un medio en el cual HAT se reemplaza con HT. Los pozos individuales pueden ser seleccionado entonces por ELISA en búsqueda de anticuerpos IgM e IgG monoclonales humanos. Una vez que se presenta el crecimiento extenso del hibridoma, el medio puede ser analizado, usualmente después de 10-14 días. Los hibridomas secretantes de anticuerpo pueden ser resembrados, seleccionados de nuevo, y si aun son positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclones pueden ser subclonados al menos dos veces por dilución limitante. Los subclones estables pueden ser cultivados entonces in vitro para generar cantidades pequeñas del anticuerpo en un medio de cultivo de tejidos para su caracterización.

Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, se cultivan hibridomas seleccionados en matraces rotatorios de dos litros para purificación de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes son filtrados y concentrados antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida se verifica mediante electroforesis por gel y cromatografía liquida de alto rendimiento para asegurar su pureza. La solución reguladora se cambia a PBS, y la concentración se determina por OD280 utilizando extinción de un coeficiente 1.43. Los anticuerpos monoclonales se dividen en alícuotas y se almacenan a -80ºC.

Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos de la invención también se producen en transfectomas de células huésped utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfeccion genética tal como es bien conocido en la técnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, los ADN que codifican cadenas livianas y pesadas parciales o de longitud completa, pueden obtenerse por técnicas de biología molecular estándar (por ejemplo, amplificación por PCR o clonación de ADNc utilizando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y los de DHA pueden ser insertados en vectores de expresión de tal forma que los genes estén enlazados operativamente a secuencias de control transcripcionales y translacionales. En este contexto, el término “enlazado operativamente” se entiende con el significado de que un gen de un anticuerpo está ligado a un vector de tal manera que las secuencias de control transcripcional y de traducción dentro del vector sirven para su función buscada de regular la transcripción y traducción del gen anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se escogen de manera que sean compatibles con la célula huésped de expresión usada. El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en un vector separado o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión por métodos estándar (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios sobre el fragmento genético del anticuerpo y el vector, o ligación en extremos romos sino hay presentes sitios de restricción). Las regiones variables de cadena liviana y pesada de los anticuerpos descritas aquí pueden utilizarse para crear genes de anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpos insertándolos en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena liviana del isotipo deseado de tal manera que el segmento VH está enlazado operativamente a los segmentos CH dentro del vector y el segmento VL está enlazado operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo a partir de una célula huésped. El gen de cadena de anticuerpo puede ser clonado en el vector de tal manera que el péptido de señal está enlazado en el marco al terminal amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido señal heteróloga (esto es, un péptido de señal de una proteína no inmunoglobulina).

Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena del anticuerpo en una célula huésped. El término “secuencia reguladora” se entiende como incluyendo promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de la cadena del anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Será evidente para aquellas personas experimentadas en la técnica que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la selección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras para la expresión en células huésped de mamíferos incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamíferos, tales como los promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus 40 de simio (SV40), adenovirus (por ejemplo el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), y polioma. Alternativamente, pueden utilizarse secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de P-globina. Aun adicionalmente, elementos reguladores compuestos de secuencias a partir de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRa, el cual contiene secuencias del promotor temprano SV40 y la repetición de terminal largo del tipo I de virus de leucemia de células T humanas (Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

Además de los genes de cadena de los anticuerpos y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la apelación pueden portar secuencias adicionales, tales como las secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (por ejemplo, orígenes de la replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células huésped en las cuales se ha introducido el vector (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, típicamente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células huésped dhfr con selección/amplificación con metrotexato), y el neogen (para selección de G418).

Para la expresión de las cadenas livianas y pesadas, el vector de expresión que codifica las cadenas pesadas y livianas es transfectado en una célula huésped por técnicas estándar. Las diversas formas del término (transfección) se considera que abarcan una amplia variedad de técnicas utilizadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano. Teóricamente es posible expresar los anticuerpos de la invención tanto en células huésped procariotas como eucariotas. La expresión de anticuerpos en células eucariotas, en particular células de huéspedes mamíferos, se discute porque tales células eucariotas como en particular las células de mamíferos, y más probablemente que las células procariotas para ensamblar y secretar un anticuerpo apropiadamente plegado e inmunológicamente activo. La expresión procariota de los genes de anticuerpos ha sido reportada como ineficiente para la producción de altos rendimientos de anticuerpos activos (Boss, M. A. and Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:1213).

Las células huésped de mamíferos para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) incluyendo dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 utilizadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, tal como se describe en R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621, células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En particular, para el uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión es el sistema de expresión del gen GS mostrado en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338,841. Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpos en células huésped de mamíferos, los anticuerpos son producidos cultivando las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se cultivan las células huésped. Los anticuerpos pueden ser recuperados a partir del medio de cultivo utilizando métodos estándar de purificación de proteínas.

Inmunoconjugados

En otro aspecto, la presente invención caracteriza un anticuerpo anti-c-Met, o fragmento del mismo, conjugado a una unidad estructural terapéutica, tal como citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor), o una radiotoxina. Tales conjugados se denominan aquí como “inmunoconjugados”. Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se denominan “inmunotoxinas”. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea nocivo para las células (por ejemplo las especializadas). Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihydroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1 -dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Agentes terapéuticos incluyen también, por ejemplo antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, quitotosina arabinósido, 5-fluorouracil decarbazina), agentes de ablación (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa, clorambucil, melphalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino, antraciclinas (e.g., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (e.g., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Otros ejemplos de citotoxinas terapéuticas que pueden conjugarse a un anticuerpo de la invención incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas y auristatinas y derivados de las mismas. Un ejemplo de un conjugado anticuerpo de caliqueamicina es disponible comercialmente (MilotargTm; Wyeth-Ayerst).

Las citotoxinas pueden conjugarse con anticuerpos de la invención utilizando tecnología de enlazamiento disponible en el arte. Ejemplos de tipos de enlazantes que pueden ser utilizados para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioéteres, ésteres disulfuros y enlazantes que contienen péptidos. Un enlazante puede ser escogido de tal manera que por ejemplo, sea susceptible a la escisión con pH bajo con el compartimiento lisosomal o susceptible a la escisión por proteasas, tales como proteasas expresadas preferencialmente en tejidos tumorales tales como las catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D).

Para discusión adicional de los tipos de citotoxinas, enlazantes y métodos para la conjugación de agentes terapéuticos en anticuerpos, véase también Saito, G. et al., 2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al., 2003 Cancer Immunol. lmmunother. 52:328-337; Payne, G., 2003 Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M., 2002 Nat. Rev. Cancer 2:750763; Pastan, I. and Kreitman, R. J., 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, CJ., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser conjugados a un isótopo radiactivo para generar radiofarmaceuticos citotóxicos, también denominados como radioinmunoconjugados. Ejemplos de isótopos radiactivos que pueden ser conjugados a anticuerpos para ser utilizados en diagnóstico y terapéuticamente incluyen, pero no se limitan a, yodo131, indio111, itrio90, y lutecio177. Los métodos para preparar radioinmunoconjugados están establecidos en el arte. Ejemplo de radioinmunoconjugados están disponibles comercialmente, incluyendo ZevalinTM (DEC Pharmaceutical) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), y pueden utilizarse métodos similares para preparar radioinmunoconjugados utilizando los anticuerpos de la invención.

Los conjugados de anticuerpos de la invención pueden ser utilizados para modificar una respuesta biológica dada, y la unidad estructural fármaco no debe considerarse como limitada a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la unidad estructural fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxinas de Pseudomonas, o toxina de Difteria; una proteína tal como un factor de necrosis tumoral o interferón-y; o, modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), factor de estimulación de la colonia de macrófagos en granulocitos (GM-CSF), factor estimulador de las colonias de granulocitos (G-CSF) u otros factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugar tales unidades estructurales terapéuticas a los anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo Amon et al.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Helistrom et at., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Inmunol. Rev, 62:119-58 (1982). Bispecific molecules

En otro aspecto, la presente invención caracteriza moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-c-Met, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o porciones enlazantes al antígeno de las mismas pueden ser convertidas en derivados o enlazadas a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se enlace a al menos dos sitios de enlace diferentes o moléculas objetivo. El anticuerpo de la invención puede en efecto ser convertido en derivado o enlazado a más de otra molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas para enlazarse a más de dos sitios de enlazamiento diferentes y/o moléculas objetivo; tales moléculas multiespecíficas también se consideran abarcadas por el término “molécula biespecífica” tal como se utiliza aquí. Para crear una molécula biespecífica de la invención, el anticuerpo de la invención puede ser enlazado funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de alguna otra manera) con una o más moléculas de enlazamiento, tales como otro anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, péptido o imitador de enlazamiento, tal como resulta con una molécula biespecífica.

En ciertas realizaciones, las moléculas biespecíficas están dirigidas contra otro receptor de tirosina quinasa, incluyendo pero no limitándose a, por ejemplo, cRon o EGFR, u otros objetivos en la ruta del c-Met. Los objetivos de moléculas biespecíficas adicionales incluyen receptores y ligandos buscados por agentes terapéuticos anticáncer, tales como los provistos aquí.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de enlazamiento para c-Met y una segunda especificidad de enlazamiento para un segundo epítopo objetivo. Por ejemplo, el segundo epítopo objetivo es un receptor Fc, por ejemplo, FcyRI humano (CD64) o un receptor Fca humano (CD89). Por lo tanto, la invención incluye moléculas biespecíficas capaces de enlazarse tanto a células efectoras que expresan FcyR, Fca o FcsR, por ejemplo, monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMN), y con células objetivo que expresan c-Met. Estas moléculas biespecíficas apuntan a células que expresan c-Met con respecto a células efectoras y disparan las actividades de las células efectoras mediadas por el receptor Fc, tales como fagocitosis de una célula que expresa c-Met, citotoxicida mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), liberación de citoquina o generación del anión superóxido .

Adicionalmente, para la invención en la cual la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir adicionalmente una tercera especificidad de enlazamiento, además de una especificidad en enlazamiento anti-Fc y una especificidad de enlazamiento anti-c-Met. Por ejemplo, la tercera especificidad en enlazamiento podría una porción de un factor antipotenciación (EF), por ejemplo, una molécula que se enlaza a una proteína de superficie involucrada en una actividad citotóxica y que por lo tanto incrementa la respuestas inmune contra la célula objetivo. La “porción del factor antipotenciación” puede ser un anticuerpo, un fragmento funcional de anticuerpo o un ligando que se enlaza a una molécula dada, por ejemplo, un antígeno o un receptor, y por lo tanto da como resultado una potenciación del efecto de los determinantes de enlazamiento para el receptor Fc sobre un antígeno de célula objetivo.

La “porción del factor de antipotenciación” puede enlazarse con un receptor Fc sobre un antígeno celular objetivo. Alternativamente, la porción del factor de antipotenciación podría enlazarse a una entidad que sea diferente de la entidad a la cual se enlazan las especificidades primera y segunda de enlazamiento. Por ejemplo, la porción del factor de antipotenciación puede enlazarse a una célula T citotóxica (por ejemplo, mediante CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD44, ICAM-1 u otras células inmunes lo que da como resultado una respuestas inmune incrementada contra la célula objetivo).

En una realización, las moléculas biespecíficas de la invención comprenden como especificidad en enlazamiento al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, que incluye, por ejemplo, un Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv o una cadena sencilla Fv. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena liviana o cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o un constructo de cadena individual tal como se describe en Ladner et al, patente de los Estados Unidos No. 4,946,778.

En una realización, la especificidad de enlazamiento para un receptor Fcy es provista por un anticuerpo monoclonal, cuyo enlazamiento es bloqueado por la inmunoglobulina G human (IgG). Tal como se utiliza aquí, el término “receptor de IgG” se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena y localizados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas de receptores transmembranales o solubles los cuales están agrupados en tres clases de receptor Fy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32), y FcyRIII (CD 16). En otra realización, el receptor Fcy es un FcyRI humano de alta afinidad. El FcyRI humano es una molécula de 72 kDa y tiene alta afinidad para IgG monomérica (108-109 M-1).

La producción y caracterización de ciertos anticuerpos monoclonales anti-Fcy está descrita por Fanger et al. en la publicación PCT WO88/00052 y la patente de los Estado Unidos No. 4,954,617. Estos anticuerpos se enlazan a un epítopo de FcyRI, FcyRII o FcyRIII en un sitio que es distinto del sitio de enlazamiento de Fcy del receptor, y asi, su enlazamiento no está bloqueado sustancialmente por niveles fisiológicos de IgG. Los anticuerpos específicos anti-FcyRI útiles en está invención son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma que produce mAb 32 está disponible en la American Type Culture Collection, ATCC Accession No. HB9469. En otras realizaciones, el anticuerpo receptor anti-Fcy es una forma humanizada de anticuerpo monoclonal 22 (H22). La producción y caracterización del anticuerpo H22 está descrita en Graziano, R.F. et al., 1995 J. Immunol 155 (10): 4996-5002 y la publicación PCT WO94/10332. La línea celular productora del anticuerpo 1122 fue depositada American Type Culture Collection en la designación HA022CL1 y tiene el número de acceso CRL 11177.

En aun otras realizaciones, la especificidad de enlazamiento para un receptor Fc está provista por un anticuerpo que se enlaza a un receptor humano IgA, por ejemplo, un receptor FcaRI de Fc-a (CD89), cuyo enlazamiento no tiene que ser bloqueado por inmunoglobulina A humana (IgA). El término “receptor de IgA” se considera que incluye un producto genético de un gen (FcaRI) localizado en el cromosoma 19. Este gen es conocido por codificar varias isoformas transmembranales ligadas alternativamente de 55 a 110 kDa. El FcaRI (CD89) es expresado constitutivamente en monocitos/macrófagos, granulocitos eosinofílicos y neutrofílicos, pero no sobrepoblaciones de células no efectoras. El FcaRI tiene una afinidad intermedia o mediana (5 x 107 M-1) tanto para IgA1 como IgA2, lo cual se incrementa por exposición a las citoquinas tales como G-CSF o GM-CSF (Morton, H.C. et al., 1996 Critical Reviews in Immunology 116:423-440). Se han descrito cuatro anticuerpos monoclonales específicos de FcaRI, identificados como A3, A59, A62 y A77, los cuales se enlazan a FcaRI por fuera del dominio de enlazamiento del ligando IgA (Monteiro, R.C. et al., 1992

J. Immunol. 148:1764).

FcaRI y FcyRI son receptores disparadores para uso en las moléculas biespecíficas de la invención puesto que son expresados primariamente sobre células efectoras inmunes, por ejemplo, monocitos, PMN, macrófagos y células dendríticas; expresados a altos niveles (por ejemplo 5000-1000000 por celula); mediadores de actividades citotóxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitosis); presentación de antígenos potenciada mediada de los antígenos, incluyendo autoantígenos, que apuntan a ellos.

Otros anticuerpos que pueden ser empleados en las moléculas biespecíficas de la invención son anticuerpos monoclonales murínicos, quiméricos y humanizados.

Las moléculas biespecíficas de la presente invención pueden prepararse conjugando las especificidades de enlazamiento constituyentes, por ejemplo, las especificidades anti-FcR y anti-c-Met, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de enlazamiento de la molécula biespecífica puede generarse separadamente luego conjugarse con otra. Cuando las especificidades de enlazamiento son proteínas o péptidos, puede utilizarse una variedad de agentes de acoplamiento o entrecruzamiento para conjugación covalente. Ejemplos de agentes de entrecruzamiento incluyen proteína A, carbodiimida N-succinimidil-S-acetil-tioacetate (SATA), 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), o-fenilenedimaleimide (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionate (SPDP), and sulfosuccinimidil 4(N-maleimidometil) ciclohaxane-1-carboxilate (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros métodos incluyen los descritos en Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,1118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), y Glennie et al., 1987 J. Immunol.

139: 2367-2375). Los agentes de conjugación SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Los anticuerpos se conjugan por un puente de sulfhidrilo de las regiones bisagra del terminal C de las dos cadenas pesadas. En una realización particular, la región bisagra se modifica para contener un número impar de residuos sulfhidrilo, por ejemplo, uno, antes de la conjugación.

Alternativamente, los genes que codifican ambas especificidades de enlazamiento pueden ser manipulados en el mismo vector y expresados y ensamblados, por ejemplo, como una proteína de fusión, en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)2 o proteína de fusión x Fab para ligando. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de cadena sencilla que comprende un anticuerpo de cadena sencilla y un determinante de enlazamiento, o una molécula biespecífica de cadena sencilla que comprende dos determinantes de enlazamiento. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de cadena. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas están descritos por ejemplo en la patente de los Estados Unidos No. 5,455,030; patente de los Estados Unidos No. patente de los Estados Unidos No. 4,881,175; patente de los Estados Unidos No. 5,132,405; patente de los Estados Unidos No. 5,091,513; patente de los Estados Unidos No. 5,476,786; patente de los Estados Unidos No. 5,013,653; patente de los Estados Unidos No. 5,258,498; y patente de los Estados Unidos No. 5,482,858.

El enlazamiento de moléculas biespecíficas a sus objetivos específicos puede confirmarse, por ejemplo, mediante ensayos inmunosorbentes enlazados con enzima (ELISA), radioinmunoensayos (REA), análisis por FACS, bioensayos (por ejemplo, inhibición del crecimiento) o ensayo de inmunoprecipitación Western. Cada uno de estos ensayos detecta en general la presencia de complejos proteína-anticuerpo de interés particular empleando un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos del anticuerpo FcR pueden detectarse utilizando, por ejemplo, un anticuerpo enlazado a una enzima o un fragmento de anticuerpo que reconozca y específicamente se enlace a los complejos del anticuerpo FcR. Alternativamente, los complejos pueden detectarse utilizando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado radiactivamente y utilizado en inmunoensayo. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado radioactivamente y utilizado en radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub; B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986,). El isótopo radiactivo puede ser detectado por medios tales como el uso de un contador y o un cantador de centelleo o una autorradiografia.

Pruebas para la modulación de la actividad de c-Met (agonismo o antagonismo)

Los anticuerpos anti-c-Met se prueban en cuanto a su capacidad agonística o antagonística de c-Met. El agonismo es la capacidad para reemplazar el efector positivo HGF enlazando a y activando un c-Met, por ejemplo, un receptor de c-Met humana portado sobre una célula de una línea celular establecida en cultivo, o portado sobre una línea celular primaria establecida a partir de una muestra de un tejido humano, o proteína c-Met purificada que es comercialmente disponibles (R&D Systems #358 MT) la cual se inmoviliza sobre una placa de ensayo sobre una perla. Una medida de la actividad agonística es la concentración del efector, en este caso un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aquí, que produce 50% de control de la actividad de HGF, esto es, EC50. El EC50 puede determinarse utilizando una prueba de enlazamiento al ligando tal como se determina mediante una técnica inmunológica estándar tal como ELISA, RIA o una prueba basada en células tales como dispersión celular, crecimiento en agar blando y/o ensayo de invasión de matriz (ensayo de tubulumorfogénesis). Preferiblemente la actividad inhibidora EC50 es menor de 5 !g/ml, menos de 1 !g/ml, menor de 0.5 !g/ml, menor de 0.1 !g/ml e incluso preferiblemente de 50 !g/ml, tal como se mide, por ejemplo, mediante ELISA. El antagonismo es la capacidad de evitar la interacción con e inhibir la acción del efector positivo HGF por enlazamiento al receptor c-Met, por ejemplo, un c-Met humana portado sobre una celula de una línea celular establecida en cultivo, o portado sobre una línea celular primaria establecida a partir de una muestra de tejido humano, o de proteína c-Met purificada que es comercialmente disponible (R&D Systems #358 MT) la cual se inmoviliza sobre una placa de prueba o sobre una perla. Una medida de la actividad antagonística es la concentración del efector, en este caso un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aquí, el cual inhibe 50% de la actividad de control de HGF, esto es, IC50. El IC50 puede determinarse utilizando una prueba de enlazamiento de ligandos tal como se determina mediante una técnica inmunológica estándar tal como ELISA, RIA o mediante un ensayo basado en células tales como dispersión celular, crecimiento en agar blando y/o ensayo de invasión de matriz (ensayo de tubulumorfogénesis). Preferiblemente la actividad inhibidora IC50 es menor de 5 !g/ml, menos de 1 !g/ml, menor de 0.5 !g/ml, menor de 0.1 !g/ml, e incluso preferiblemente de 50 !g/ml, medida, por ejemplo, mediante ELISA.

Ensayo de modulación de fosforilación de c-Met por anticuerpos agonísticos o antagonísticos anti-c-Met

El agonismo o antagonismo por anticuerpos anti-c-Met de la invención se mide por activación o inhibición de la fosforilación de c-Met en células con y sin estimulación con HGF. Las células de una línea celular tal como células A549 se siembran en placa a una densidad de 3 x 104 celulas por pozo en un volumen total de 100 !l/pozo de DMEM suplementado con FBS al 10% en placas tratadas para cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pozos (Costar, #3595). Las placas se incuban a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5 % durante 24 horas, después de lo cual el medio es aspirado suavemente de cada pozo de las placas y se agrega un volumen de 100 !l/pozo de DMEM. Las placas se incuban a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% durante 24 horas, después de lo cual una muestra de anticuerpo purificado que se va probar, 100 !l por pozo del anticuerpo o una dilución, se agrega a las células en el pozo diluidas en DMEM. Como control negativo para la falta de activación, se agrega una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tiene una especificidad conocida no relacionada con los determinantes del epítopo c-Met), o un regulador, a los pozos designados.

Las células se incuban a 37ºC durante un periodo de tiempo corto (por ejemplo, dos horas) o un periodo de tiempo más largo (por ejemplo, 24 horas). Cuando sea apropiado, las células se estimulan mediante la adición de HGF en medio DMEM libre de suero a una concentración final de 200 ng/pozo. En general, cuando se ensaya la actividad agonística de los anticuerpos, excepto para el control positivo (no tratado con anticuerpos), se omite el HGF de los pozos de anticuerpo de la muestra de prueba. En general, cuando se prueba la actividad la actividad antagonística de los anticuerpos, se incluye el HGF en los pozos del anticuerpo de la muestra de prueba. Las placas se incuban adicionalmente durante 10 minutos a 37ºC, luego se aspira suavemente el medio de los pozos de las placas. Las células se lavan PBS frio y la solución se aspira suavemente desde las placas. Las células se someten a lisis con 50 !l de regulador de lisis (regulador de lisis NP-40: NaCl 120 mM NaCl, Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NP-40 1%; EDTA 1 mM, EGTA 6mM, NaF 20mM, benzamidina 1 mM con Na3VO4 0.5 mM recién añadido y PMSF 0.1 mM. Las placas se agitan a temperatura ambiente durante 15 minutos, y luego se almacenan a -80ºC hasta que se requieran para ELISA.

Se utiliza un ELISA para determinar los niveles de fosforilación de c-Met. Para la preparacion de las placas para ELISA, Nunc-ImmunoTM Plate, MaxiSorbTM Surface (VWR International AG, NN391-8786) se lava dos veces con regulador de lavado (PBS-0.05%Tween Biorad #670-6531); y se agregan100 !l de un anticuerpo de captura monoclonal de c-Met (DO-24) en PBS. Las placas se incuban durante la noche a 4ºC se levan tres veces con PBS-0.05% Tween. Los sitios de enlazamiento no específicos se bloquean 200 !l/pozo de BSA al 3% en PBS-T durante dos horas a temperatura ambiente, con agitación. Inmediatamente antes del uso se retira la solución de bloqueo.

Los lisados de células congeladas se fusionan agitando a temperatura ambiente y se agregan 40 !l de lisado las placas Nunc-Immuno y las placas se incuban a 4ºC durante 4 horas. Las placas se lavan 3 veces con PBS-T, Y 50 !l/pozo de anticuerpo antifosfotirosina PY20-HRP (ZYMED, # 03-7722) 0.2 !g/ml en albúmina de suero bovino al 3% en PBS-T. Las placas se incuban durante la noche a 4ºC y se lavan 3 veces con PBS-T. El PBS-T se aspira y se agregan 90 !l/pozo de sustrato de fosfatasa alcalina (CDR-Star, TROPIX, #MS100RY) y se desarrolla a la vez que se agita suavemente durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las placas se leen utilizando un lector de placas de 96 pozos.

Estos resultados demuestran que los miembros de la clase antagonística de los anticuerpos anti-c-Met inhiben la capacidad del HGF para estimular la fosforilación de c-Met.

Modulación de la proliferación inducida por HGF con clones agonísticos y antagonísticos de anticuerpos anti-c-Met

Se lleva a cabo un ensayo para medir el efecto antagonístico o agonístico de anticuerpos anti-c-Met, en ausencia o por simulación con HGF. Células de una línea celular, tal como 4MBr-5, se siembran a una densidad de 3 x 1013 células por pozo en un volumen total de 100 !l/pozo de F12K de Ham suplementado con FBS al 10% en placas de cultivo de tejido tratadas de 96 pozos de fondo plano (Costar, #3610). Las placas se incuban a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% durante dos horas, después de las cuales se agregan 50 !l del medio que contiene el anticuerpo purificado que se va a probar. Como control negativo de falta de modulación, se agrega una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tenga una especificidad conocida no relacionada con los determinantes del epítopo de c-Met), o regulador, a pozos designados. Las placas se incuban a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% durante una hora, después de lo cual se agregan 50 !l del medio solo o 50 !l del medio con contenido de HGF (por ejemplo, aproximadamente 0.5 !g/!l a aproximadamente 50 ng/ml). Las placas se incuban a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% durante 72 horas, después de lo cual se prueba la incorporación de BrdU utilizando el ensayo de proliferación celular ELISA BrdU (Roche) catálogo No. 1 669 915. En breve se agregan 20 !m/pozo de solución de BrdU (#1) y las placas se incuban durante 22 horas a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5%. El medio se retira suavemente y la placa se seca durante una hora a 60ºC. Se agregan 200 !l de FixDenat (solución #2) y las placas se incuban a temperatura ambiente con agitación suave durante 30 minutos. La solución se retira cuidadosamente y agregan 100 !l/pozo de solución de trabajo anti-BrdU. Las placas se incuban a temperatura ambiente con agitación suave durante 90 minutos. La solución se retira cuidadosmente y los pozos se lavan tres veces con 200 !l de solución de lavado. La solución se elimina suavemente y las placas con adición de solución de sustrato 100 !l/pozo se miden a A405 nm.

Estos resultados muestran que la proliferación estimulada por HGF de células que expresan los niveles de c-Met se inhibe en células que han sido tratadas con clones del anticuerpo de anti-c-Met.

Modulación de la migración celular dependiente de c-Met con una clase antagonistica de anticuerpos de anti-c-Met.

Las células de ciertas líneas celulares, tales como células NCI-H44I que expresan c-Met, son conocidas por migrar en respuesta a un gradiente de concentración de HGF. Los ensayos se llevan a cabo utilizando células NCI-H44I donde la habilidad de los anticuerpos anti-c-Met para modular la migración a través de una membrana perforada (Boyden Chamber Assay) a partir de una área de baja concentración de HGF hacia un área de alta concentración de HGF se mide en este caso.

La migración celular se prueba utilizando un ensayo de migración celular con QCMTM quimiotaxis 8 !m de 96 pozos. De acuerdo con lo anterior, 24 horas antes de la prueba las células se lavan dos veces con PBS estéril y se mantienen sin nutrición en DMEM que contiene FBS al 1% a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5%. Subsecuentemente las células se tratan con tripsina y se resuspenden a 1.0 x 106 células por ml en presencia de una concentración apropiada del anticuerpo purificado durante 30 minutos a 37ºC. Como control negativo para la falta de modulación, se agrega una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tiene una especificidad conocida no relacionada con los determinantes del epítopo de c-Met), o un regulador, a los pozos designados.

Bajo condiciones estériles se retira la tapa de la placa de la cámara de migración y se agregan 150 !l del medio libre de suero que contiene 50 ng/ml de HGF (R&D catalogo No. 294-HGN) a los pozos de la bandeja alimentadora (cámara inferior). Se agregan suavemente 100 !l de 5-10 x 104 células en DMEM con FBS al 1% preincubadas con anticuerpo a la cámara superior. La placa se cubre y se incuba durante 16 horas a 37ºC en CO2 4-6%. Siguiendo las instrucciones de los fabricantes, las células/medio en la cámara superior se descartan y la cámara se coloca en una bandeja de alimentación de 96 pozos en la cual se ha agregado una solución de desprendimiento de células precalentada de 150 !l/poz. Las células se desalojan incubando durante 30 minutos a 37ºC con agitación suave periódica. Subsecuentemente, se agregan 50 !l de CyQuant GR Dye prediluido a cada pozo de la bandeja de alimentación. La placa se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente y 150 !l de la mezcla se transfieren a una nueva placa de 96 pozos adecuada para la medición de fluorescencia utilizando un juego de filtros de 480/520 nm. Los datos obtenidos muestran que una clase de clones anti-c-Met antagonísticos son capaces de inhibir una consecuencia biológica de la activación de c-Met, a saber, la migración estimulada por HGF de células NCI-H44I a través de una membrana de microporos.

Determinación de las constantes de afinidad KD de anticuerpos de anti-c-Met por BIACORETM

La afinidad de enlazamiento del anticuerpo purificado se determina utilizando resonancia de superficie por plasmón utilizando el instrumento BIACORETM 3000 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.), siguiendo los protocolos del fabricante, tal como se describió anteriormente para anticuerpos antagonísticos.

Determinación de las constantes de afinidad (KD) de anticuerpos de anti-c-Met con citometría

La afinidad de enlazamiento de anticuerpos purificados para c-Met expresado en la superficie de células de carcinoma de pulmón humando A549 y células de pulmón cynomolgus se determina por citometría de flujo utilizando el citómetro de flujo BDTM Biosciences LSR de acuerdo con los protocolos del fabricante, tal como se describió anteriormente para los anticuerpos antagonísticos.

Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la presente invención provee una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales, o porciones de enlazamiento a antígeno de los mismos, de la presente invención, formulada junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinación de (por ejemplo dos o más diferentes) anticuerpos, o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o biespecíficos) que se enlaza a diferentes epítopos sobre el antígeno objetivo o que tiene actividades complementarias.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden ser administradas en terapias de combinación, esto es, combinados con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención combinado con al menos otro agente anticáncer o antiinflamatorio. Ejemplos de agentes terapéuticos que pueden ser utilizados en combinación se describen en mayor detalle más abajo en la sección de usos de los anticuerpos de la invención.

Tal como se utiliza aquí, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y anifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción que son fisiológicamente compatibles. El vehículo debe ser adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo, esto es, el anticuerpo, inmunoconjugado o molécula biespecífica, puede ser recubierto con un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a una sal que no afecta la actividad biológica deseada del compuesto original y no imparte ningún efecto toxicológico indeseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición ácida y sales de adición básica. Las sales de adición ácida incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácidos clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso, así, como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanóicos fenilsustituidos, ácidos hidroxialcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos alifáticos y ácidos aromáticos sulfónicos. Las sales de adición básica incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio asi como de aminas orgánicas no toxicas, tales como N,N’-dibenciletilenediamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenediamina, procaína.

Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen al menos: antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio; antioxidantes oleosolubles, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico.

Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos y no acuosos adecuados que pueden ser empleados en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilénglicol, polietilénglicol), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de surfactantes.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsificantes, y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede asegurarse bien sea por procedimientos de esterilización, supra, y por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéuticamente aceptable puede alcanzarse mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en el arte. Excepto en el caso de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la invención. También pueden incorporarse compuestos suplementarios activos en las composiciones.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento. La composición puede formularse en forma de una solución, microemulsion, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una concentración alta del fármaco. El vehículo puede ser un solvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilénglicol y polietilénglicol líquido), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. En muchos casos, se pueden incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcareses, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prologada de las composiciones inyectables puede lograrse mediante la inclusión en la composición de un agente que retarde la absorción por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguida por la esterilización por microfiltración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicionalmente deseado a partir de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.

La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinado con un material portador para producir una forma dosificación individual variará dependiendo del sujeto que está siendo tratado, y del modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinado con un material portador para producir una forma de dosificación individual generalmente será esa cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En general, aparte de 1%, esta cantidad variará desde aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 99% de ingrediente activo, desde aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 70%, o desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 30% del ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un bolo individual, varias dosis divididas pueden administrarse con el tiempo o la dosis puede ser reducida o incrementada proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en formas de dosificación unitarias para facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. Las formas de dosificación unitarias tal como se usan aquí se refieren a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que van a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéuticamente requerido. La específicación de las formas de dosificación unitarias de la invención son dictadas por y directamente dependientes de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico en particular que se busca, y las limitaciones inherentes en la técnica para componer tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.

Para la administración del anticuerpo, la dosificación varia desde aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más usualmente de 0.01 a 5 mg/kg del peso corporal del huésped. Por ejemplo las dosificaciones pueden ser de 0.3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del rango de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento de ejemplo abarca la administración de una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada tres meses o una vez cada tres a seis meses. Los regímenes de dosificación para un anticuerpo anti-c-Met de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal por administración intravenosa, siendo dado el anticuerpo utilizando uno de los siguientes esquemas de dosificación: cada cuatro semanas para seis dosificaciones, luego cada tres semanas; 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido por 1 mg/kg peso corporal cada tres semanas.

En algunos métodos, dos o más anticuerpos de las mismas o diferentes especificidades de enlazamiento se administran simultáneamente, en cuyo casi la dosificación de cada anticuerpo administrado cae dentro de los rangos indicados. Un anticuerpo se administra usualmente en ocasiones múltiples. Los intervalos entre las dosificaciones individuales pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o anualmente. Los intervalos pueden ser irregulares según lo indiquen los niveles de medición en sangre del anticuerpo con respecto al antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para alcanzar una concentración en plasma del anticuerpo de aproximadamente 1-1000 !g/ml y algunos métodos alrededor de 25-300 !g/ml.

Alternativamente, puede administrarse un anticuerpo como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia variarán dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguido por los anticuerpo humanizados, los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no humanos. La dosificación y frecuencia de la administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente no frecuentes durante un largo periodo de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, se requiere a veces una dosificación relativamente alta en intervalos de tiempo relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o termine o hasta que el paciente muestra una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de lo anterior, el paciente puede recibir la administración en un régimen profiláctico.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar de tal manera que se obtenga una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para alcanzar la respuesta terapéutica deseada para un paciente en particular, composición y modo de administración sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas o el éster, sal o amida del mismo, la ruta de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto en particular que está siendo empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones en particular empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica previa del paciente que está siendo tratado y factores similares bien conocidos en las técnicas medicas.

Una “dosificación terapéuticamente efectiva” de un anticuerpo anti-c-Met de la invención da como resultado un descenso en la severidad de los síntomas de la enfermedad, un incremento en la frecuencia y duración de los periodos de enfermad libres de síntomas, o una prevención de incapacidad o inhabilidad debido a la aflicción por la enfermedad. Los síntomas de la enfermedad incluyen criterios diagnósticos estándar de cáncer, tales como estado, tamaño del tumor primario, miembro y tamaño de las metástasis, o extensión de la inflamación.

Una composición de la presente invención puede administrarse mediante una o más rutas de administración utilizando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Tal como será evidente para el experto en la técnica, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las rutas de administración para anticuerpos de la invención incluyen intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras rutas parenterales de administración, por ejemplo, por inyección o infusión. La frase “administración parenteral” tal como se utiliza aquí significa modos de administración diferentes a la administración entérica y tópica, usualmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intrarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraestemal.

Alternativamente, un anticuerpo de la invención puede ser administrado mediante una ruta no parenteral, tal como una ruta de administración tópica, epidérmica o por mucosas, por ejemplo, intranasálmente, oralmente, vaginalmente, rectalmente, por vía sublingual o tópica.

Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos que protejan el compuesto contra una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transtérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilen acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son conocidos en general por las personas experimentadas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización, una composición terapéutica de la invención puede administrarse mediante un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tales como los dispositivos mostrados en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 o 4,596,556. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen al menos la patente de los Estados Unidos No. No. 4,487,603, que muestra una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicaciones a una velocidad controlada; la patente de los Estados Unidos No. 4,486,194, la cual muestra un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la patente de los Estados Unidos No. 4,447,233, la cual muestra una bomba de infusión de medicamentos para administrar medicación a una rata de infusión precisa; la patente de los Estados Unidos No. 4,447,224, la cual muestra un aparato de infusión implantable de flujo variable para administración continua de un fármaco; la patente de los Estados Unidos No. 4,439,196, la cual muestra un sistema de administración de fármaco osmótico que tiene compartimientos de cámaras múltiples; y la patente de los Estados Unidos No. 4,475,196, la cual muestra un sistema de administración de fármaco osmótico. Mucho otros tales implantes, sistemas de administración y módulos son conocidos por los experimentados en la técnica.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden formularse para asegurar una distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera/sangre-cerebro (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la BBB (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de manufactura de liposomas, véase por ejemplo las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más unidades estructurales que son transportados selectivamente hacia el interior de células u órganos específicos, potenciando así la administración de fármacos buscada (véase, por ejemplo, V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685). Unidades estructurales de direccionamiento de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo la patente de los Estados Unidos 5,416,016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor surfactante de proteína A (Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134); p120 (Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090); véase tambien K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273.

Las combinaciones

La invención se relaciona adicionalmente con un método para prevenir o tratar enfermedades o enfermedades proliferativas tales como un cáncer, en un mamífero, particularmente un humano, con una combinación de agentes farmacéuticos que comprenden.

(a): una composición antagonista de anticuerpo c-Met; y

(b): uno o más agentes farmacéuticamente activos.

La invención se relaciona adicionalmente con composiciones farmacéuticas que comprenden:

(a): una composición antagonista de anticuerpo c-Met;

(b): un agente farmacéuticamente activo; y

(c): un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se relaciona adicionalmente con un paquete o producto comercial que comprende:

(a): una formulación farmacéutica de una composición antagonista de anticuerpo c-Met; y

(b): una formulación farmacéutica de un agente farmacéuticamente activo para uso simultáneo, concurrente, separado o secuencial.

Los agentes farmacéuticamente activos El término “agente farmacéuticamente activo” es un término amplio que cubre muchos agentes farmacéuticamente activos que tienen diferentes mecanismos de acción. Las combinaciones de estos con anticuerpos/composiciones de antagonista de c-Met pueden dar como resultado mejoras en la terapia contra el cáncer. En general, los agentes farmacéuticamente activos se clasifican de acuerdo con el mecanismo de acción. Muchos de los agentes disponibles son antimetabolitos de las rutas de desarrollo de diversos tumores, o reaccionan con el ADN de las células tumorales. También son agentes que inhiben enzimas, tales como la topoisomeraza I y la toposiomerasa II, o que son agentes antimitóticos.

Por el término “agente farmacéuticamente activo” se entiende específicamente cualquier agente farmacéuticamente activo diferente a la composición de antagonista de anticuerpo c-Met o un derivado del mismo. Incluye, pero no se limita

a:

i. un inhibidor de aromatasa

ii. un antiestrógeno, un antiandrógeno o un agonista de la gonadorreina

iii. un inhibidor de topoisomerasa I o un inhibidor de topoisomerasa 2;

iv.: un agente activo microtúbulo, un agente alquilante, un antimetabolito antineoplástico o un compuesto de platino;

v.: un compuesto que apunta/hace disminuir una actividad de proteína o lípido quinasa o una actividad de proteína

o lípido fosfatasa, un compuesto antiangiogénico adicional o un compuesto que induzca procesos de diferenciación celular;

vi. anticuerpos monoclonales;

vii. un inhibidor de ciclooxigenasa, un bisfosfonato, un inhibidor de heparanasa, un modificador de la respuesta biológica;

viii. un inhibidor de isoformas oncogénicas de Ras;

ix.: un inhibidor de telomerasa;

x.: un inhibidor de proteasa, un inhibidor de una matriz de metaloproteinasa, un inhibidor de una metionina aminopeptidasa o un inhibidor de proteasoma;

xi. agentes utilizados en el tratamiento de enfermedades malignas hematológicas o compuestos que apuntas, hacen disminuir o inhiben la actividad Flt-3;

xii. un inhibidor de HSP90;

xiii. anticuerpos antiproliferativos;

xiv. un inhibidor de histona desacetilisa (HDAC);

xv. un compuesto que apunta a, disminuye o inhibe la actividad/función de la serina/treonina en la mTOR quinasa;

xvi. un antagonista del receptor de somatostatina;

xvii. un compuesto antileucémico;

xviii. metodologías de daño de células tumorales;

xix. un enlanzate EDG;

xx. un inhibidor de la ribonucleótido reductasa;

xxi. un inhibidor de la S-adenocilmetionina descarboxilasa;

xxii. un anticuerpo monoclonal de BEGF o BEGFR;

xxiii. terapia fotodinámica;

xxiv. un esteroide angioestático;

xxv. un implante que contiene corticosteroides;

xxvi. un antagonista del receptor AT1; y

xxvii. un inhibidor ACE.

El término “inhibidor de aromatasa”, tal como se utiliza aquí, se relaciona con un compuesto que inhibe la producción de estrógenos, esto es, la conversión de los sustratos androstenedioana y testosterona en estrona y estradiol, respectivamente. El término incluye, pero no se limita a, esteroides, especialmente atamestano, exemestano y formestano; y, en particular, no esteroides, especialmente aminoglutetimida, rogletimida, piridoglutetimida, trilostano, testolactona, cetoconazol, vorozol, fadrozol, anastrozol y letrozol. El exemestano se comercializa como AROMASIN. El formestaton como LENTARON; el fradozol como AFEMA; el anastrazol como ARIMIDEX; el letrozol como FEMARA o FEMAR; la aminoglutetimida como ORIMETEN. Una combinación que comprende el agente activo farmacéuticamente el cual es un inhibidor de aromatasa es particularmente útil para el tratamiento de los tumores positivos al receptor de hormonas, por ejemplo, tumores de seno.

El término “anti-estrógeno”, tal como se utiliza aquí, se relaciona con un compuesto que antagoniza el efecto de los estrógenos a nivel del receptor de estrógenos. El término incluye, pero no se limita a, tamoxifen, fulvestrant, raloxifene y raloxifene clorhidrato. Tamoxifen puede ser administrado en la forma en que es comercializado, e.g., NOLVADEX; y raloxifene clorhidrato es comercializado como EVISTA. El Fulvestrant puede formularse como se divulga en la patente de los Estados Unidos No. 4,659,516 y se comercializa como FASLODEX. Una combinación que comprende un agente farmacéuticamente activo el cual es un antiestrógeno es particularmente útil para el tratamiento de tumores positivos a receptores de estrógeno, por ejemplo, tumores de seno.

El término “antiandrógeno” tal como se utiliza aquí, se relaciona con cualquier sustancia que sea capaz de inhibir los efectos biológicos de hormonas androgénicas e incluye, pero no se limita a bicalutamida (CASODEX), el cual puede formularse por ejemplo, tal como se divulga en la patente de los Estados Unidos No. 4,636,505.

El término “agonista de gonadorrelina”, tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a abarelix, goserelina y acetato de goserelina. La goserelina está divulgada en la patente de los Estados Unidos No. 4,100,274 y se comercializa como ZOLADEX. El abarelix puede formularse, por ejemplo, como se divulga en la patente de los Estados Unidos No. 5,843,901.

El término “inhibidor de topoisomerasa I”, tal como se utiliza aquí, incluye, pero no se limita a, topotecan, gimatecan, irinotecan, camtotecian y sus análogos, 9-nitrocampotesina y un conjugado de camptotesina macromolecular PNU166148 (compuesto A1 en WO 99/17804). El irinotecan puede administrarse, por ejemplo, en la forma en que es comercializado, por ejemplo, bajo la marca CAMPTOSAR. El topotecan puede administrarse, por ejemplo, en la forma en que es comercializado, por ejemplo la marca HYCAMTIN.

El término “inhibidor de topoisomerasa II”, tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita, a las antraciclinas, tales como doxorubucina incluyendo las formulaciones liposómicas, por ejemplo CAELYX, daunorobicina, incluye la formulación liposómica, por ejemplo DAUNOSOME, epirrubicina, idarrubicina y nemorrubicina; las anthraquinonas mitoxantrona y losoxantrona; las podofilotoxinas etopósido and tenipósido. Etopósido es comercializado como ETOPOPHOS; tenipósido como VM 26-BRISTOL; doxorrubicin como ADRIBLASTIN o ADRIAMICINA; epirrubicina como FARMORUBICIN; idarrubicina como ZAVEDOS; y mitoxantrona como NOVANTRON.

El término “agente activo en microtúbulos”, tal como se utiliza aquí, se relaciona con agentes estabilizadores de los microtúbulos, desestabilizadores de los microtúbulos y e inhibidores de la polimerización de microtubulina incluyendo, pero no limitándose a, taxanos, por ejemplo: paciltaxel y docetaxel; alcaloides vinca, e.g., vinblastina, especialmente sulfato de vinblastina; vincristina, especialmente sulfato de vincristina y vinorrelbina; discodermolidas; cochichina y epotilona y derivados de los mismos, por ejemplo epotilona Bo un derivado de la misma. Paclitaxel es comercializado como TAXOL; docetaxel commo TAXOTERE; sulfato de vinblastina como VINBLASTIN R.P; y el sulfato de vincristina como FARMISTIN. También se incluyen las formas genéricas de paclitaxel así como diversas formas de dosificación de paclitaxel. Las formas genéricas de paclitaxel incluyen, pero no se limitan a clorhidrato de betaxolol, diversas formas de dosificación de paclitaxel incluyen, pero no se limitan a paclitaxel en nanopartículas de albúmina comercializado como ABRAXANE; ONXOL, CYTOTAX Discodermolida pueden obtenerse, e.g., como se divulga en la patente de los Estados Unidos No. 5,010,099. También se incluyen derivados de epotilona los cuales se divulgan en la patente de los Estados Unidos No. 6,194,181, WO 98/10121, WO 98/25929, WO 98/08849, WO 99/43653, WO 98/22461 y WO 00/31247. Se prefieren especialmente Epotolina A y/o B.

El término “agente alquilante”, tal como se utiliza aquí, incluye, pero no se limita a ciclofosfamida, ifosfamida, melphalan

o nitrosourea (BCNU o Gliadel), o temozolamida (TEMODAR).Ciclofosfamida pueden ser administrados, e.g., en la forma en que es comercializado, e.g., bajo la marca comercial CICLOSTIN; y ifosfamida como HOLOXAN.

El término “anti-metabolito anti-neoplástico” incluye, pero no se limita a, 5-fluorouracil (5-FU); capecitabina; gemcitabina; ADN agentes desmetilantes, tal como 5-azacitidina y decitabina; metotrexato; edatrexato; y antagonistas del ácido fólico tales como, pero no limitándose a, pemetrexed. Capecitabina puede ser administrada, e.g., en la forma en que es comercializado, e.g., bajo la marca comercial XELODA; y gemcitabina como GEMZAR.

El término “compuesto de platino”, tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a carboplatino, cis-platino, cisplatino, oxaliplatino, satraplatino y agentes de platino tales como ZD0473. El carboplatino puede administrarse, por ejemplo, en la forma como es comercializado, por ejemplo, CARBOPLAT; y el oxaliplatino como ELOXATIN.

El término “compuesto que apunta a/hacen disminuir una actividad de proteína o quinasa lipídica; o la actividad de una proteína o fosfatasa lipídica; o compuestos antiangiogénicos adicionales”, tal como se utiliza aquí, incluye, pero no se limita a inhibidores de la proteína tirosina quinasa y/o serina y/o treonina quinasa o inhibidores de quinasa lipídica, por ejemplo:

i) compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de receptores del factor de crecimiento endotelial bascular (VEGF), tales como compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad VEGF, especialmente compuestos que inhiben el recepto de VEGF, tales como, pero no limitándose a, derivados de 7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (AEE788); BAY 43-9006; compuestos de isolcolina, divulgada en WO 00/09495 tal como (4-tert-butil-fenil)-94-piridin-4-ilmetilisoquinolin-1-il)-amina (AAL881); y

ii) compuestos que apunta a, hacen disminuir o inhiben la actividad de receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), tales como compuestos que apunta a, hacen disminuir o inhiben la actividad de PDGFR, especialmente compuestos que inhiben el receptor de PDGFR, por ejemplo, Nderivado de fenil-2-pirimidina-amina, e.g., imatinib, SU101, SU6668 y GFB-111;

iii) compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de los receptores del factor de crecimiento

de fibroblastos (FGFR);

iv) compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad del receptor del factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1R), tales como compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de IGF-1R, especialmente compuestos que inhiben el receptor IGF-1R, especialmente compuestos que inhiben el receptor IGF-1R. Los compuesto incluyen pero no se limitan a los compuestos divulgados en WO 02/092599 y derivados del mismo de derivados de 4-amino-5-fenil-7-ciclobutil-pirrolo[2,3-d]pirimidina (AEW541);

v) compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de la familia de tirosina quinasa del receptor de Trk;

vi) compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de la familia de tirosina quinasa del receptor de Axl;

vii) compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad del receptor de c-Met;

viii) compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de la tirosina quinasa del receptor de Ret;

ix) compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de la tirosina quinasa del receptor Kit/SCFR;

x) compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de la tirosina quinasas del receptor de c-kit (parte de la familia PDGFR), tal como compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de tirosina quinasa del receptor de c-kit, especialmente compuestos que inhiben el receptor c-kit, por ejemplo, imatinib;

xi) compuestos que apunta a, hacen o disminuir o inhiben la actividad de miembros de la familia c-Abl y sus productos de fusión genética, por ejemplo, quinasa BCR-Abl, tales como compuestos que apuntan a disminuir inhibir la actividad de los miembros de la familia c-Abl y sus productos de fusión genética, por ejemplo, derivado N-fenil-2-pirimidina-amina, e.g., imatinib, PD180970, AG957, NSC 680410 o PD173955 de ParkeDavis; BMS354825

xii) compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de miembros de la familia de proteína quinasa C (PKC) y de la familia Raf de serina/treonina quinasas, miembros de la familia MEK, SRC, JAK, FAK, PDK y Ras/MAPK, o familia de la PI(3) quinasa, o de la familia relacionada con PI(3)-quinasa y/o miembros de la familia de quinasas dependiente de ciclina, (CDK) y son especialmente aquellos derivados de la estaurosporina, divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 5,093,330, e.g., midostaurina; ejemplos decompuestos adicionales incluyen, e.g., UCN-01; safingol; BAY 43-9006; Briostatina I; Perifosina; Ilmofosina; RO 318220 y RO 320432; GO 6976; Isis 3521; LY333531/LY379196; compuestos de isoquinolina, tales como los divulgados en WO 00/09495; FTIs; PD184352 o QAN697, un inhibidor de P13K;

xiii) compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de proteína-tirosina quinasa, tal como imatinib mesilate (GLEEVEC); tirfostina o pirimidilaminobenzamida y derivados de los mismos (AMN107). A tirfostina preferiblemente un compuesto de peso molecular bajo (Mr <1500) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, especialmente un compuesto seleccionado de la clase de compuestos bencilidenemalonitrilo o de las clases de compuestos S arilbencenemalonitrilo o bisubstrato quinolina, más especialmente cualquier compuesto seleccionado del grupo consistente de Thryphostin A23/RG-50810, AG 99, Tyrphostin AG 213, Tyrphostin AG 1748, Tyrphostin AG 490, Tyrphostin B44, Tyrphostin B44 (+) enantiomer, Tyrphostin AG 555, AG 494, Tyrphostin AG 556; AG957 y adaphostin (ácido 4-{[(2,5dihidroxifenil)metil]amino}-benzoico adamantil éster, NSC 680410, adaphostin);

xiv) compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de la familia del factor de crecimiento epidérmico del tirosina quinasas del receptor (EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 como homo-o heterodímeros), tal como compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de la familia de factores de crecimiento epidérmico son especialmente compuestos proteínas o anticuerpos que inhiben la familia del receptor de EGF de tirosina quinasa, e.g., receptor EGF, ErbB2, ErbB3 y ErbB4 o se enlazan a EGF a ligandos relacionados con EGF, y son en particular aquellos compuestos, proteínas o anticuerpos monoclonales genérica y específicamente divulgados en WO 97/02266, e.g., el compuesto del Ejemplo 39, or in EP 0 564 409, WO 99/03854, EP 0520722, EP 0 566 226, EP 0 787 722, EP 0 837 063, U.S. Patent No. 5,747,498, WO 98/10767, WO 97/30034, WO 97/49688, WO 97/38983 y, especialmente, WO 96/30347, e.g., compuesto conocido como CP 358774, WO 96/33980, e.g., compuesto ZD 1839; y WO 95/03283, e.g., compuestoZM105180, e.g., trastuzumab (HERCEPTIN®), cetuximab, Iressa, OSI-774, CI 1033, EKB-569, GW-2016, E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 o E7.6.3, y derivados de 7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina divulgados en WO 03/013541, erlotinib y gefitinib. Erlotinib puede ser administrado en la forma en que es comercializado, e.g. TARCEVA, y gefitinib como IRESSA, anticuerpos mnoconales humanos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico incluyendo ABX-EGFR; y

xv) compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad/función de la serina/treonina TORquinasa son especialmente compuestos, proteínas o anticuerpos que apuntan a/inhiben a miembros de la familia de la mTOR quinasa, e.g., RAD, RAD001, CCI-779, ABT578, SAR543, rapamicina y derivados/análogos de los mismos, AP23573 y AP23841 de Ariad, everolimus (CERTICAN) y sirolimus. CERTICAN (everolimus, RAD) un inhibidor de la señal de proliferación de investigación novedosa que previene la proliferación de células T y de células de músculos lisos vasculares.

Cuando se refiere a anticuerpos, se incluyen anticuerpos monoclonales intactos, nanocuerpos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos en tanto exhiban la actividad biológica deseada.

La frase “compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de una proteína o de una fosfatasa lipídica” tal como se utiliza aquí incluye pero no se limita a inhibidores de fosfatasa 1, fosfatasa 2A, PTEN o CDC25, e.g., ácido okadaico o un derivado del mismo. El término “anticuerpos monoclonales”, tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a bevacizumab, cetuximab, trastuzumab, Ibritumomab tiuxetan, denosumab, anti-CD40, anti-GM-CSF, y tositumomab y yodo I131. Bevacizumab puede ser administrado en la forma en que es comercializado, e.g. AVASTIN; cetuximab como ERBITUX; trastuzumab como HERCEPTIN; Rituximab como MABTHERA; Ibritumomab tiuxetan como ZEVULIN; anti-RANKL como denosumab (AMG 162), anti-CD40 como HCD122 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos 2002-01 06371), y tositumomab y iodine I131 como BEXXAR.

La frase “compuestos antiangiogénicos adicionales” incluye pero no se limita a compuestos que tienen otro mecanismo para su actividad, por ejemplo, no relacionado con la inhibición de proteínas o quinasas lipídicas, por ejemplo, talidomida (THALOMID) y TNP-470.

La frase “compuestos que inducen los proceso de diferenciación celular” tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a ácido retinoico, a-, y-or 8-tocoferol or a-, y-or 8 tocotrienol.

El término “inhibidor de ciclooxigenasa” tal como se utiliza aquí incluye, pero no se limita a e.g., inhibidores de Cox-2, ácido 2-arilaminofenilacético 5-alquil sustituido y derivados, tal como celecoxib(CELEBREX), rofecoxib (VIOXX), etoricoxib, valdecoxib, un ácido 5-alquil-2-arilaminofenilacético, e.g., ácido 5-metil-2-(2’-cloro-6’-fluoroanilino)fenil acético, lumiracoxib.

El término “bifosfonato” tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a ácidos etridónico, clodrónico, tiludrónico, pamidrónico, alendrónico, ibandrónico, risedrónico and zoledrónico. El ácido "etridónico" puede ser administrado, e.g., en la forma en que es comercializado, e.g., DIDRONEL; "ácido dodrónico" como BONEFOS; "ácido tiludrónico" como SKELID; "ácido pamidrónico" commo AREDIA; "ácido alendrónico " as FOSAMAX; "ácido ibadrónico" como BONDRANAT; "ácido risedrónico" como ACTONEL; y "ácido zoledrónico" como ZOMETA.

El término “inhibidor de heparanasa” tal como se utiliza aquí, se refiere a compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la degradación del sulfato de heparina. El término incluye, pero no se limita a, PI88.

El término “modificador de la respuesta biológica”, tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a linfoquina o interferones, por ejemplo, interferón y.

El término “inhibidor de las isoformas oncogénicas de Ras”, tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a H-Ras, K-Ras o N-Ras, tal como se usa aquí, se refiere a compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad oncogénica de Ras, e.g., un inhibidor de la farnesil transferasa (FTI), e.g., L-744832, DK8G557 o R115777 (ZARNESTRA).

El término “inhibidor de telomerasa”, tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de la telomerasa. Los compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de la actividad de la telomerasa son especialmente compuestos que inhiben el receptor de telomerasa, por ejemplo, telomestatina.

El término “inhibidor de la matriz de metaloproteinasa” o (inhibidor MMP), tal como se utiliza aquí, incluye, pero no se limita a, inhibidores peptidomiméticos y no peptidomiméticos del colágeno; derivados de tetraciclina, por ejemplo el inhibidor peptidomimético de hidroxamato batimastat; y su análogo oralmente biodisponible marimastat (BB-2516), prinomastat (AG3340), metastat (NSC 683551) BMS 279251, BAY 12-9566, TAA211, MMI270B o AAJ996.

El término “inhibidor de metionina aminopeptidasa”, tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a compuestos que apuntan, hacen disminuir o inhiben la actividad de metionina aminopeptidasa. Los compuestos que apunta a, hacen disminuir o inhiben la actividad de la metionina aminopeptidasa son, por ejemplo, bengamida o un derivado de la misma.

El término “inhibidores de proteasoma”, tal como se utiliza aquí, incluye compuestos que apuntan a, hacen o disminuir o inhiben la actividad del proteosoma. Los compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad del proteosoma incluyen, pero no se limitan a PS-341; MLN 341. bortezomib o Velcade.

La frase “agente usado en el tratamiento de enfermedades malignas y hematológicas”, tal como se utiliza aquí, incluye, pero no se limita a inhibidores de tirosina quinasa similar a FMS, por ejemplo, compuestos que apuntan, hacen disminuir o inhiben la actividad de receptores de tirosina quinasa similares a FMS (Flt-3R); interferon, 1-b-D arabinofuransilcitosina (ara-c) y bisulfan; e inhibidores de ALK, e.g., compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la quinasa de linfoma anaplástico.

La frase “compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de Flt-3” tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a compuestos, proteínas o anticuerpos que inhiben Flt-3, e.g., N-benzoil-estaurosporina, midostaurina, un derivado de la estaurosporina , SU11248 y MLN518.

El término “inhibidores de HSP90”, tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad intrínseca de ATPasa del HSP90; la degradación, direccionamiento, disminución o inhibición de las proteínas cliente de HSP90 a través de la ruta dl proteosoma de ubiquitina. Los compuestos que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad intrínseca de ATPasa de HSP90 son especialmente compuestos, proteínas o anticuerpos que inhiben la actividad de ATPasa de HSP90, por ejemplo 17-alilamino,17 demetoxigeldanamicina (17AAG), un derivado de geldanamicina; otros compuestos relacionados con geldanamicina; radicicol e inhibidores de HDAC.

El término “un anticuerpo antiproliferativo” tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a, trastuzumab (HERCEPTIN), trastuzumab-DM1, erlotinib (TARCEVA), bevacizumab (AVASTIN), rituximab (RITUXAN), PRO64553 (anti-CD40) y anticuerpo 2C4. Por anticuerpo se entiende, por ejemplo, anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos en tanto exhiban la actividad biológica deseada.

El término “inhibidor de HDAC”, tal como se utiliza aquí se relaciona con compuestos que inhiben la histona desacetilasa y que poseen actividad antiproliferativa, esto incluye pero no se limita a los compuestos divulgados en WO 02/22257, especialmente N-hidroxi-3-[4-[[(2-hidroxietil)[2-(1H-indol-3-il)etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida, y Nhidroxi-3-[4-[[[2-(2-metil-1H-indol-3-il)-etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida y sales farmacéuticamente aceptable de la misma (LBH589). Incluye especialmente de manera adicional suberoilanilida del ácido hidroxámico (SAHA); ácido[4-(2-aminofenilcarbamoil)-bencil]-carbámico piridin-3-ilmetil éster y derivados de los mismos; ácido butírico, piroxamida, tricostatina A, Oxamflatin, apicidina, Depsipeptide; depudecin y trapoxin.

La frase “compuesto que apunta a, hace disminuir o inhibe la actividad/función de la serina/treonina mTOR quinasa” tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a compuestos, proteínas o anticuerpos que apuntan/inhiben miembros de la familia de la mTOR quinasa, por ejemplo, RAD, RAD001, CCI-779, ABT578, SAR543, rapamicina y derivatives/analogs thereof, AP23573 and AP23841 from Ariad, everolimus (CERTICAN) y sirolimus(RAPAMUNE), CCI779 y ABT578. CERTICAN (everolimus, RAD) un inhibidor de señales de proliferación en investigación novedosa que evita la proliferación de células T y de células musculares lisas vasculares.

El término “anatagonista del receptor de somatostatina” tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a agentes que apuntan a, tratan o inhiben el receptor de somatostatina, tal como octreoride y SOM230.

El término “compuesto antileucémico” tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a Ara-C, un análogo de pirimidina que es el derivado de 2’--hidroxi ribosa (arabinósido) de la desoxicitidina. También se incluye el análogo de purina de la hipoxantina, 6-mercaptopurina (6-MP) y fosfato de fluoradabina. La frase “metodologías de daño de células tumorales” se refiere a metodologías tales como radiación por ionización. El término “radiación por ionización” citado anteriormente y de aquí en adelante, significa radiación por ionización que ocurre puesto que bien sean rayos electromagnéticos, tales como los rayos X y rayos gamma; o partículas, tales como las partículas alfa, beta y gamma. La radiación por ionización se provee, pero no se limita a terapia de radiación y es conocida en la técnica. Véase Hellman, Cancer, 4th Edition, Vol. 1, Devita et al., Eds., pp. 248-275 (1993).

El término “enlazante de EDG” tal como se utiliza aquí, incluye, pero no se limita a, una clase de inmunosupresores que modulan la recirculación de linfocitos, tales como FTY720.

El término “inhibidor de la ribonucleotido reductasa” tal como se utiliza aquí, incluye, pero no se limita a, análogos nucleósidos de pirimidina o purina que incluyen, pero no se limitan a fludarabina y/o ara-C; 6-tioguanina; 5-FU; cladribine; 6-mercaptopurina, especialmente en combinación con ara-C contra ALL; y/o pentostatina. Inhhibidores de ribonucleótido reductasa son especialmente hidroxiurea o derivados de 2-hidroxi-1H-isoindol-1,3-diona, tal como PL-1, PL-2, PL-3, PL-4, PL-5, PL-6, PL-7 o PL 8: Véase Nandy et al., Acta Oncologica, Vol. 33, No. 8, pp. 953-961 (1994).

El término “inhibidores de la S-adenosilmetionina descarboxilasa”, tal como se utiliza aquí, incluye, pero no se limita a los compuestos divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 4,461,076.

La frase “anticuerpos monoclonales de VEGF o VEGFR”, tal como se utiliza aquí, incluye, pero no se limita a compuestos divulgados en WO 98/35958, por ejemplo, 1-(4-cloroanilino)-4-(4-piridilmetil)ftalazina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, e.g., el succinato, o en WO 00/09495, WO00/27820, WO00/59509,WO98/11223, WO00/27819 y EP 0 769 947; los descritos por Prewett et al., Cancer Res, Vol. 59, pp. 5209-5218 (1999); Yuan et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 93, pp. 14765-14770 (1996); Zhu et al., Cancer Res, Vol. 58, pp. 3209-3214 (1998); and Mordenti et al., Toxicol Pathol, Vol. 27, No. 1, pp. 14-21 (1999) in WO 00/37502 and WO 94/10202; ANGIOSTATIN, descrita por O’Reilly et al., Cell, Vol. 79, pp. 315-328 (1994); ENDOSTATIN, descrito por O’Reilly et al., Cell, Vol. 88, pp. 277-285 (1997); amidas de ácido antranílico; ZD4190; ZD6474; SU5416; SU6668; bevacizumab; o anticuerpos anti-VEGF o anticuerpos del receptor anti-VEGF, e.g:, rhuMAb y RHUFab; aptámeroVEGF, e.g., Macugon; FLT-4 inhibitors; inhibidores de FLT-3; anticuerpo VEGFR-2 IgG; Angiozyme (RPI 4610); y Avastan.

El término “terapia fotodinámica”, tal como se utiliza aquí, se refiere a terapia que utiliza ciertos agentes químicos conocidos como agentes de fotosensibilización para tratar o evitar cánceres. Ejemplos de terapia fotodinámica incluyen, pero no se limitan a tratamientos con agentes, tales como, por ejemplo VISUDYNE y porfímero sodio.

El término “esteroide angioestático”, tal como se utiliza aquí, incluye, pero no se limita a agentes que bloquean o inhiben la angiogénesis, tales como, por ejemplo, anecortave, triamcinolona, hidrocortisona, 11-epihidrocotisol, cortexolona, 1.7 -hidroxiprogesterona, corticosterona, desoxicorticosterona, testosterona, estrona and dexametasona.

La frase “implantes que contienen corticosteroides” tal como se utiliza aquí, incluye, pero no se limita a agentes, tales como, por ejemplo, fluocinolona y dexametasona.

El término “antagonista del receptor AT1” tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a agentes tales como DIOVAN.

El término “inhibidor de ACE” tal como se utiliza aquí, incluye pero no se limita a CIBACEN, benazepril, enazepril (LOTENSIN), captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, moexipril, quinapril, ramipril, perindopril y trandolapril.

Otros agentes activos farmacéuticamente incluyen, pero no se limitan a, alcaloides vegetales, agentes y antagonistas hormonales, modificadores de la respuesta biológica, preferiblemente linfosinas o interferones, oligonucleótidos o derivas de oligonucleótidos antisentido; o agentes misceláneos o agentes con mecanismos de acción diferentes o desconocidos.

Se comprenden de la misma forma los correspondientes estereoisómeros, así como las correspondientes modificaciones cristalinas, por ejemplo, solvatos y polimorfos, los cuales se divulgan aquí. Los compuestos usados como ingredientes activos en las combinaciones divulgadas aquí pueden prepararse y administrarse tal como se describe en los documentos citados, respectivamente.

La estructura de los agentes activos identificados por número de código, nombres genéricos o comerciales pueden tomarse de la edición actual del compendio estándar “The Merck Index” o a partir de bases de datos, por ejemplo, Patents International, por ejemplo, IMS World Publications, o las publicaciones mencionadas más arriba y más adelante.

Debe entenderse que las referencias a los componentes (a) y (b) pretenden incluir también las sales farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias activas. Si las sustancias activas comprendidas por los componentes (a) y/o

(b) tienen, por ejemplo, al menos un centro básico, pueden formar sales de adición ácida. Las sales de adición ácida correspondientes también pueden formarse teniendo, si se desea, un centro básico presente adicionalmente. Las sustancias activas que tienen un grupo ácido, por ejemplo, COOH, pueden formar sales con bases. Las sustancias activas comprendidas en los componentes (a) y/o (b) o sales farmacéuticamente aceptables de las mismas también pueden usarse en forma de hidrato o incluir otros solventes usados para la cristalización.

Así, en un primer aspecto, la presente invención se relaciona con un método para la prevención o tratamiento de enfermedades proliferativas o enfermedades que son disparadas por angiogénesis persistente en un mamífero, preferiblemente un paciente humano, que comprende tratar el paciente concurrente o secuencialmente con cantidades farmacéuticamente efectivas de una combinación de:

(a): una composición antagonista de anticuerpo de c-Met; y

(b): un agente farmacéuticamente activo.

En un aspecto, la presente solicitud provee una preparación farmacéutica que comprende:

(a): una composición antagonista de anticuerpo de c-Met; y

(b): uno o más agentes farmacéuticamente activos seleccionados del grupo consistente de un inhibidor de aromatasa; un antiestrógeno; un antiandrógeno; un agonista de gonadorrelina; un inhibidor de topoisomerasa I, un inhibidor de topoisomerasa II; un agente activo a microtúbulos; un agente alquilante; un antimetabolito

antineoplástico; un compuesto de platino; un compuesto que apunte a/haga disminuir la actividad de una proteína o una quinasa lipídica o la actividad de una proteína o una fosfatasa lipídica; un compuesto antiangiogénico; un compuesto que induzca los procesos de diferenciación celular. Anticuerpos monoclonales; un inhibidor de ciclooxigenasa, un bifosfonato; un inhibidor de heparanasa; un modificador de la respuesta biológica; un inhibidor de las isoformas oncogénicas de Ras; un inhibidor de telomerasa; un inhibidor de proteasa; un inhibidor de matriz de metaloproteinasa, un inhibidor de metionina aminopeptidasa; un inhibidor de proteasoma; agentes que apuntan a, hacen disminuir o inhiben la actividad de Flt-3; un inhibidor de HSP90; anticuerpos antiproliferativos; un inihibidor de HDAC; un compuesto que apunta a, hace disminuir o inhibe la actividad/función de serina/treonina mTOR quinasa; un antagonista del receptor de somatostatina; un compuesto antileucémico; una metodología para daño de células tumorales; un enlazante de EDG; un inhibidor de ribonucleótido reductasa; un inhibidor de S-adenosilmetionina descarboxilasa; un anticuerpo monoclonal de VEGF o VEGFR; terapia fotodinámica; un esteroide angiestático; un implante que contiene corticosteroides; un antagonista de receptor de AT1; y un hibidor de ACE.

Cualquiera de las combinaciones de los componente (a) y (b), el método para tratar un animal de sangre caliente que comprende administrar estos dos componentes, una composición farmacéutica que comprende estos dos componentes para uso simultáneo, separado o secuencial, el uso de la combinación para el retardo de la progresión o el tratamiento de una enfermedad proliferativa o para la manufactura de una preparación farmacéutica para estos propósitos o un producto comercial que comprende tal combinación de componentes (a) y (b), todo como se menciono o definió anteriormente, se denominara también subsecuentemente como una combinación de la invención (de tal manera que este término se refiere a cada una de estas realizaciones que así puede reemplazar este término cuando sea apropiado).

La administración simultánea puede, por ejemplo, tener lugar en la forma de una combinación fija con dos o más ingredientes activos, o por la administración simultanea de dos o más ingredientes activos que se formulan independientemente. El uso (administración) secuencial significa preferiblemente la administración de uno (o más) componentes de una combinación en un punto del tiempo, otros componentes en un punto del tiempo diferente, esto es, de una forma dispersa crónicamente, preferiblemente de tal manera que la combinación muestre más eficiencia que los compuestos individuales administrados independientemente (especialmente mostrando sinergismo). Uso (administración) separado significa preferiblemente administración de los componentes de la combinación independientemente uno de otro en diferentes puntos del tiempo, preferiblemente con el significado de que los componentes (a) y (b) se administran de tal manera que no se superponen niveles en sangre medibles de ambos compuestos presentes en una manera superpuesta (al mismo tiempo).

También combinaciones de dos o más administraciones secuenciales, separadas o simultáneas son posibles, preferiblemente de tal manera que la combinación de fármacos componentes muestre un efecto terapéutico conjuntado que excede el efecto encontrado cuando los fármacos componentes de la combinación se usan independientemente con intervalos de tiempo tan grandes que no puede encontrarse un efecto mutuo en su eficiencia terapéutica, un efecto sinérgico que se prefiere especialmente.

El término “retardo de la progresión” tal como se utiliza aquí significa la administración de la combinación a pacientes que están en preetapa o una etapa temprana, de la primera manifestación, o un relapso de la enfermedad que se va a tratar, en cuyos pacientes, por ejemplo, se diagnostica una preforma de la enfermedad correspondiente o pacientes que están en condición, por ejemplo, durante un tratamiento médico o una condición resultante de un accidente, bajo la cual es probable que se desarrolle una enfermedad correspondiente.

“Activo terapéuticamente de manera conjunta” o “efecto terapéutico conjunto” significa que los compuestos pueden administrarse separadamente (en una forma dispersa en el tiempo, especialmente una forma específica en secuencia) en intervalos de tiempo tales que preferiblemente, en el animal de sangre caliente, especialmente humano, que se va a tratar, muestra aun una interacción (preferiblemente sinérgica) (efecto terapéutico conjunto). Si este es el caso, puede determinarse entre otras siguiendo los niveles en sangre, mostrando que ambos compuestos están presentes en la sangre del humano que se va a tratar al menos durante ciertos intervalos de tiempo.

“Farmacéuticamente efectivo” se refiere preferiblemente a una cantidad que es terapéuticamente o en un sentido más amplio también profilácticamente efectiva contra la progresión de una enfermedad proliferativa.

El término “un paquete comercial” o “un producto”, tal como se utiliza aquí define especialmente un “conjunto de partes” en el sentido de que los componentes (a) y (b) tal como se definen anteriormente pueden ser dosificados independientemente o mediante el uso de combinaciones diferentes fijas con cantidades distinguibles de los componentes (a) y (b), esto es, simultáneamente o en diferentes puntos del tiempo. Además, estos términos comprenden un paquete comercial que comprende “especialmente combinando” como componentes e ingredientes activos (a) y (b) junto con instrucciones para uso simultáneo, secuencial (disperso en el tiempo, en secuencias especificas de tiempo, preferencialmente) o (menos preferencialmente) separado de los mismos en un retardo de progresión o tratamiento de una enfermedad proliferativa. Las partes del conjunto de partes pueden, por ejemplo, administrarse simultáneamente o dispersas en el tiempo, esto es en diferentes puntos de tiempo con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del conjunto de partes. Muy preferiblemente, los intervalos de tiempo se escogen de tal manera que el efecto sobre la enfermedad tratada en el uso combinado de las partes es mayor que el efecto que se obtendría con el uso de solamente cualquiera de los asociados de combinación (a) y (b) (según puedan determinarse de acuerdo con métodos estándar). La relación de las cantidades totales del asociado de combinación (a) al asociado de combinación (b) que se va a administrar en la preparación combinada puede variarse, por ejemplo, con el fin de copar las necesidades de una subpoblación de pacientes que se va a tratar o las necesidades de un paciente individual cuyas diferentes necesidades pueden deberse a la enfermedad en particular, edad, sexo, peso corporal, etc. de los pacientes. Preferiblemente, hay al menos un efecto beneficioso, por ejemplo, un potenciamiento mutuo del efecto de los asociados de combinación (a) y (b), en particular un efecto más aditivo, el cual por lo tanto podría alcanzarse con dosis inferiores de cada uno de los fármacos combinados, respectivamente, que tolerable en el caso de un tratamiento con los fármacos individuales solamente sin combinación, produciendo efectos ventajosos adicionales, por ejemplo, menos efectos colaterales o un efecto terapéutico combinado que una dosificación no efectiva de uno o ambos de los asociados de combinación (componentes) (a) y (b), y muy preferiblemente una sinergia fuerte de los asociados de combinación (a) y (b).

Tanto en el caso del uso de la combinación de componentes (a) y (b) del paquete comercial, también es posible cualquier combinación de uso simultáneo, secuencial y separado, significando que los componentes (a) y (b) pueden administrarse en un punto del tiempo simultáneamente, seguidos por la administración de solamente un componente con una toxicidad más baja para el huésped bien sea de manera crónica, por ejemplo, más de 3-4 semanas de dosificación diaria, en un punto del tiempo posterior y subsecuentemente el otro componente de la combinación de ambos componentes en un punto de tiempo aun posterior (en el transcurso de un tratamiento de combinación de fármacos subsecuente para un efecto antitumoral óptimo.

La combinación de la invención también puede aplicarse en combinación con otros tratamientos, por ejemplo, intervención quirúrgica, hipertermia y/o terapia de radiación.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden prepararse por medio convencionales y estos son adecuados para administración entérica, tal como oral o rectal, y parentérica en mamíferos incluyendo el hombre, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor de VEGF y al menos un agente farmacéuticamente activo solo o en combinación con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, especialmente los adecuados para aplicación entérica o parenteral.

Las composiciones farmacéuticas comprenden desde aproximadamente 0.00002 hasta aproximadamente 100%, especialmente, por ejemplo en el caso de diluciones para infusión que están listas para el uso, de 0.0001 a 0.02%, o, por ejemplo, en el caso de concentrados para inyección o infusión o especialmente formulaciones parentéricas, desde aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 95%, preferiblemente desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 90%, más preferiblemente desde aproximadamente 20% hasta aproximadamente 60% de ingrediente activo (peso a peso, en cada caso). Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden estar, por ejemplo, en formas de dosis unitaria, tal como en la forma de ampollas, viales, grajeas, tabletas, bolsas de infusión o cápsulas.

La dosificación efectiva de cada uno de los asociados de combinación empleados en una formulación de la presente invención puede variar dependiendo del compuesto particular o de las composiciones farmacéuticas empleadas, del modo de administración, de la condición que está siendo tratada y de la severidad de la condición que está siendo tratada. Un médico, doctor o veterinario de experiencia normal puede determinar fácilmente la cantidad efectiva de cada uno de los ingredientes activos necesarios para prevenir, tratar o inhibir el progreso de la condición.

Las trifostinas, especialmente la adafostina, se administran preferiblemente a un animal de sangre caliente, especialmente un humano en un dosificación en el rango de aproximadamente 1-6000 mg/día, más preferiblemente 255000 mg/día, lo más preferiblemente 50-4000 mg/día. A menos que se establezca otra cosa aquí, el compuesto se administra preferiblemente de 1 a 5, especialmente de 1 a 4 veces por día. Las preparaciones farmacéuticas para la terapia de combinación para administración entérica o parenteral son, por ejemplo, aquellas en formas de dosificación unitaria, tales como tabletas recubiertas con azúcar, cápsulas o supositorios, y adicionalmente ampollas. Sino se indica otra, estas formulaciones se preparan por medio convencionales, por ejemplo, por medio de mezclado convencional, granulación, recubrimiento con azúcar, procesos de disolución o liofilización. Será evidente que el contenido unitario de una sociedad o de combinación contenido en un dosis individual de cada forma de dosificación no necesita por si mismo constituir una cantidad efectiva puesto que la cantidad necesaria efectiva puede ser alcanzada por administración de una pluralidad de unidades de dosificación. Una persona experimentada en la técnica tiene la capacidad para determinar las cantidades farmacéuticamente efectivas apropiadas de los componentes de la combinación.

Preferiblemente, los compuestos o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se administran a manera de formulación farmacéutica oral en la forma de una tableta, capsula o jarabe; o como una inyección parenteral si es apropiado.

En la preparación de las composiciones para administración oral, puede emplearse cualquier medio farmacéuticamente aceptable tal como agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservantes, agentes colorantes.

Portadores farmacéuticamente aceptables incluyen almidones, azúcares; celulosas microcristalinas, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglomerantes, agentes desintegrantes.

Soluciones del ingrediente activo y también suspensiones, especialmente soluciones o suspensiones isotónicas, son útiles para la administración parenteral del ingrediente activo, siendo posible, por ejemplo en el caso de composiciones liofilizadas que comprenden el ingrediente activo solo o junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, manitol, para tales soluciones o suspensiones que se van a producir antes del uso.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser esterilizadas y/o pueden comprender excipientes, por ejemplo, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes y/o emulsificantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica y/o reguladores y se preparan de una manera conocida perse, por ejemplo, por medio proceso de disolución o liofilización convencionales. Las soluciones o suspensiones pueden comprender sustancias que incrementan la viscosidad, tales como carboximetilcelulosa de sodio, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinilpirrolidonao gelatina. Las suspensiones en aceite en aceite comprenden como componente oleoso aceites vegetales, sintéticos o semisintéticos habituales para propósitos de inyección.

El agente isotónico puede ser seleccionado de cualquiera de los conocidos en la técnica, por ejemplo, manitol, dextrosa, glucosa y cloruro de sodio. La formulación para infusión puede ser diluida con el medio acuoso. La cantidad de medio acuoso empleada como diluyente se escoge de acuerdo con la concentración deseada del ingrediente activo en la solución en infusión. Las soluciones en infusión pueden contener otros excipientes empleados comúnmente en formulaciones para ser administradas por vía intravenosa tales como antioxidantes.

La presente invención se relaciona adicionalmente con “una combinación preparada”, tal como se utiliza aquí, define especialmente un “conjunto de partes” en el sentido de que los asociados de combinación (a) y (b) como se definieron anteriormente pueden dosificarse independientemente o mediante el uso de combinaciones fijas diferentes con cantidades distinguibles de los asociados de combinación (a) y (b), esto es, simultáneamente o en puntos del tiempo diferentes. Las partes de los conjuntos de partes pueden ser administradas entonces, por ejemplo, simultáneamente o dispersarse cronológicamente, esto es en diferentes puntos del tiempo y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del conjunto de partes. La relación de las cantidades totales del asociado de combinación (a) con respecto al asociado de combinación (b) que se van a administrar en la preparación combinada puede variarse, por ejemplo, con el fin de copar las necesidades de una subpoblación de pacientes que se va a tratar o las necesidades del paciente individual con base en la severidad de cualquiera de los efectos colaterales que el paciente experimenta.

Usos y métodos de la invención

Los anticuerpos (e inmunoconjugados y moléculas biespecíficas) de la presente invención tienen utilidades en diagnostico in vitro e in vivo y terapéuticas. Por ejemplo, estas moléculas pueden administrarse a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o in vivo, o en un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de trastornos. El término “sujeto” tal como se utiliza aquí se entiende que incluye animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos, tales como los primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, y no mamíferos, tales como aves, anfibios y reptiles. Los métodos son particularmente adecuados para tratar pacientes humanos que tienen un trastorno asociado con una expresión aberrante de c-Met. Cuando los anticuerpos de c-Met se administran junto con otro agente, los dos pueden ser administrados en cualquier orden o simultáneamente.

En una realización, los anticuerpos (y los inmunoconjugados y moléculas biespecíficas) de la invención pueden ser utilizados para detectar niveles de c-Met, o niveles de células que contienen c-Met. Esto puede lograrse, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra (tal como una muestra in vitro) y una muestra de control con el anticuerpo anti-c-Met bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y el c-Met. Cualquier complejo formado entre el anticuerpo y el c-Met se detecta y compara en la muestra y el control. Por ejemplo, pueden ejecutarse métodos de detección estándar, bien conocidos en la técnica, tales como ELISA y citometria de flujo, usando las composiciones de la invención. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, la solicitud proporciona adicionalmente métodos para detectar la presencia de c-Met (por ejemplo, antígeno c-Met humana) en una muestra, o medir la cantidad de c-Met, comprendiendo poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con un anticuerpo de la invención, o una porción de enlazamiento de antígeno del mismo, la cual se enlaza específicamente a c-Met, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o una porción del mismo y c-Met. La formación de un complejo se detecta entonces, en donde una diferencia en la formación de complejo entre la muestra comparada con la muestra de control es indicativa de la presencia de c-Met en la muestra.

También dentro del alcance de la invención hay conjuntos que consisten de las composiciones (por ejemplo, anticuerpos, anticuerpos humanos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas) de la invención e instrucciones para el uso. El kit puede contener adicionalmente al menos un reactivo adicional, o uno o más anticuerpos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo que tiene una actividad complementaria que se enlaza a un epítopo del antígeno objetivo distinto del primer anticuerpo). Los kits típicamente incluyen una etiqueta que indica el uso pretendido del contenido del kit. El término etiqueta incluye cualquier escritura, o material de registro suministrado sobre o con el kit, o que de alguna otra manera acompaña el kit.

Habiendo sido descrita completamente la invención, se ilustra a continuación por los siguientes ejemplos y reivindicaciones, son ilustrativos y no pretenden ser adicionalmente limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos humanos específicos de c-Met a partir de la biblioteca HuCAL GOLD®

Los anticuerpos terapéuticos contra la proteína c-Met humana se generan por selección de clones que tienen altas afinidades de enlazamiento, utilizando como fuente de anticuerpos proteínas variables en una biblioteca de presentación de fagos disponible comercialmente, la biblioteca MorphoSys HuCAL GOLD®. La HuCAL GOLD® es una biblioteca Fab (Knappik et al., 2000 J.Mol. Biol. 296:57-86; Krebs et al., 2001 J Immunol. Methods 254:67-84; Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem. 278(40):38194-38205), en las cuales todos los CDR están diversificados por una mutacion apropiada, y la cual emplea la tecnología CysDisplay™ para enlazar los fragmento Fab a la superficie del fago (WO 01/05950 Löhning 2001).

Procedimientos generales: rescate de fagémidos, amplificación de fagos y purificación

La biblioteca HuCAL GOLD® se amplifica en un medio bacteriano rico estándar (2xYT) que contiene 34 !g/ml de cloranfenicol y 1% de glucosa (2xYT-CG). Desde pues de la infección de células en un OD600nm de 0.5 con fagos auxiliares VCSM 13 (incubación de mezcla de células y fago durante 30 minutos a 37ºC sin agitación seguido por 30 minutos a 37ºC agitando a 250 rpm), las celulas son centrifugadas (4120 g; 5 min; 4

ND}, se resuspenden en 2xYT/34 !g/ml de cloranfenicol/ 50 !g/ml de kanamicina/ 0.25 mM de IPTG, y se hacen crecer durante la noche a 22ºC. Al final de este periodo se retiran las células por centrifugación y los fagos se precipitan dos veces desde PEG desde el sobrenadante, y se resuspenden en PBS/20% de glicerol y se almacenan a -80ºC.

La amplificación de fagos entre dos rondas de paneo se lleva a como sigue: células de la cepa TG1 en fase logarítmica media de E. coli se infectan con fagos que se eluyen provenientes de la selección con proteína c-Met y se siembran sobre agar LB suplementado con 1% de glucosa 34 !g/ml de cloranfenicol (placas LB-GC). Después de la incubación durante la noche de las placas a 30ºC, se raspan las colonias bacterianas de la superficie del agar y se usan para inocular el caldo 2xYT-CG para obtener un OD600nm de 0.5, y luego se agregan fagos auxiliares VCSM13 para obtener una infección productiva como se describió anteriormente. Preexperimentos para paneo en solución utilizando perlas magnéticas Strep-Tactin

Se ha reportado que la Strep-tag 2 tiene baja afinidad por la matriz Strep-Tactin (KD~1 !m de acuerdo con Voss y Skerra, 1997 Protein Eng. 10:975-982), por lo tanto, se ejecuta un preexperimento para establecer la adecuabilidad del uso de perlas MagStrep recubiertas con Strep-Tactin para la captura del antígeno durante las selecciones de anticuerpos; y para evitar la perdida de antígeno durante los paneos.

Para ese propósito, se incuban 8 mg de perlas MagStrep con 46 !g de c-Met marcada con His-Strep durante una hora a temperatura ambiente y la muestra se divide en cuatro tubos Eppendorf prebloqueados. Un tubo sirve como control positivo (sin lavado) y las otras tres muestras se lavan con diferentes restricciones de acuerdo con el manual HuCAL GOLD® en su sección de paneo. La detección del enlazamiento del c-Met marcada con His-Strep a las perlas MagStrep (perlas magnéticas recubiertas con Strep-Tactin obtenida de IBA, Göttingen, Alemania) se lleva acabo en BioVeris utilizando un anticuerpo anti-c-Met de cabra y un anticuerpo de detección anticabra marcado con Rubidio.

Como se muestra en las figuras aquí, no hay una perdida significativa de c-Metc-Met c-Met marcada con His-Strep detectable cuando las perlas no lavadas se comparan con las perlas lavadas con diferentes restricciones de HuCAL® . Así, la c-Met marcada con His-Strep parece ser adecuada para uso en los paneos en solución con las perlas magnéticas recubiertas con Strep-Tactin (perlas MagStrep).

Selección por paneo de anticuerpos específicos para c-Met de la biblioteca

Para la selección de anticuerpos que reconocen la c-Met humana, se aplican dos estrategias de paneo. En general, los anticuerpos del fago HuCAL GOLD® se dividen en cuatro depósitos que comprenden diferentes combinaciones de genes maestros VH (un depósito contiene VH1/5 IK; el depósito dos contiene VH3 IK; el depósito 3 contiene VH2/4/6 IK; y el depósito cuatro contiene VH1-6 IK). Estos depósitos se someten individualmente a dos rondas de paneo en solución sobre c-Met marcada con His-Strep capturado sobre perlas magnéticas StrepTactin (perlas Mega Strep; IBA), y para la tercera ronda de selección solamente, bien sea el c-Met marcada con His-Strep capturado sobre perlas magnéticas StrepTactin o la proteína c-Met humana marcada con APP capturado por perlas Streptavidin (Dynabeads® M-280 Streptavidin; Dynal) con un anticuerpo anti-APP biotinilado.

Específicamente, para el paneo en solución utilizando c-Met marcada con His-Strep acoplado con perlas magnéticas StrepTactin se aplica el siguiente protocolo: se preparan tubos prebloqueados (tubos Eppendorf de 1.5 ml) por tratamiento con 1.5 ml 2x ChemiBLOCKER diluido 1:1 con PBS durante la noche a 4ºC. Las perlas prebloqueadas se preparan por tratamiento como sigue: 580 !l (28 mg de perlas) de perlas magnéticas StrepTactin se lavan una vez con 589 !l de PBS y se resuspenden en 580 !l 1x ChemiBLOCKER (diluido en un volumen 1 por PBS). El bloqueo de las perlas se ejecuta en tubos prebloqueados durante la noche a 4ºC.

Las partículas de fago diluidas en PBS hasta un volumen final de 500 !l para cada condición de paneo se mezclan con 500 !l 2x ChemiBLOCKER/0.1% Tween y se mantienen durante una hora a temperatura ambiente sobre una rueda giratoria. La preadsorción de las partículas de fago para la eliminación de StrepTactin o fagos de enlazamiento a las perlas se lleva a cabo dos veces: 160 !l de perlas magnéticas StrepTactin (4 mg) se agregan a las partículas de fago bloqueadas, y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre una rueda giratoria. Después de la separación de las perlas mediante un dispositivo magnético (Dynal MPC-E), el sobrenadante del fago (~1.1 ml) se transfiere a un tubo de reacción fresco bloqueado y se repite la preadsorción utilizando 160 !l de perlas bloqueadas durante 30 minutos. Luego, se agrega c-Met marcada con His-Strep bien sea 400 nm o 100 nm, a las partículas de fago bloqueadas en tubo de reacción de 1.5 ml fresco, bloqueado y la mezcla se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente sobre una rueda rotatoria.

Los complejos fago-antígeno se capturan utilizando bien sea 320 !l o 160 !l de perlas magnéticas StrepTactin agregadas a los depósitos de paneo que contienen 400 nm o 100 nm de fago, respectivamente, los cuales se incuban entonces durante 20 minutos a temperatura ambiente sobre una rueda rotatoria. Las partículas de fago enlazadas a las perlas magnéticas Strep-Tactin se recolectan de nuevo con el separador de partículas magnético.

Las perlas se lavan entonces siete veces con PBS/0.05% de Tween (PBST), seguido por lavado otras tres veces solamente con PBS. La elución de las partículas de fago desde las perlas StrepTactin se lleva a cabo por la adición de 200 !l de DTT 20 mM en Tris-HCl 20 mM, pH 8.0 a cada tubo durante 10 minutos. El eluido se recolecta, y las perlas se lavan una vez con 200 !l de PBS y el eluido en PBS se agrega al eluido en DTT. Ésta muestra eluida es utilizada para infectar 14 ml de un cultivo de E. coli TG-1 que se ha cultivado previamente sobre un OD600nm de 0.6-0.8.

Después de la infección y subsecuente centrifugación durante 10 minutos a 5000 rpm, cada pella bacteriana es resuspendida en 500 !l 2x de medio YT, sembrada sobre placas de agar 2xYT-CG e incubada durante la noche a 30ºC. A la mañana siguiente, las colonias resultantes son raspadas de las placas y el fago se prepara por rescate y amplificación como se describió anteriormente.

La segunda ronda de los paneos en solución de c-Met marcada con His-Strep se lleva acabo de acuerdo con el protocolo de la primera ronda, excepto que se usan cantidades decrecientes del antígeno (50 nm y 10 nm) y la restricción del procedimiento de lavado se altera apropiadamente.

Se aplican dos estrategias de paneo diferentes para la tercera ronda de selección: el rendimiento de fago amplificado de la segunda ronda de paneo se divide y se somete a dos condiciones de paneo diferentes. La primera parte del rendimiento de fago se utiliza para la estrategia de paneo estándar sobe c-Met marcada con His-Strep capturado sobre perlas de StrepTactin como se describió más arriba (las cantidades de antígeno son 10 nM o 1 nM, respectivamente).

La segunda variación de paneo para la tercera ronda de selección se lleva a cabo sobre c-Met humana marcada con APP. La proteína c-Met marcada con APP a una concentración final de 50 nM o 10 nM se mezcla con 1 ml de partículas de fago de la segunda ronda prelimpiadas, y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante hora sobre una rueda rotatoria. En paralelo, se prebloquean 8 mg de Dynabeads M-280 Streptavidin (Dynal) incubadas con 40 !g de anticuerpo anti-APP de ratón biotinilado durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre una rueda rotatoria seguida por dos etapas de lavado con PBST. Los complejos preformados que consisten de fago-anticuerpos enlazados a c-Met marcada con APP se capturan mediante las perlas magnéticas de M-280 Streptavidin recubiertas con anti-APP durante 30 minutos a temperatura ambiente. La elución y amplificación del fago se llevan a cabo como se describió anteriormente.

Subclonación y expresión de los fragmentos de Fab solubles

Los insertos de codificación de Fab de los fagémidos de HuCAL GOLD® se subclonan en el vector de expresión pMORPH®X9_Fab_FH (véase figuras) con el fin de facilitar la expresión rápida y eficiente de Fab soluble. Para este propósito, el ADN del plásmido de los clones seleccionados se digiere con enzimas endonucleasas de restricción XbaI/EcoRI, con lo cual se escinde el inserto que codifica Fab (ompA-VLCL y phoA-Fd). Este inserto se clona entonces en el vector de expresión de pMORPH®X9_Fab_FH digerido con XbaI/EcoRI.

Las proteínas Fab se expresan a partir de este vector, y como resultado portan dos pestañas de terminal C (FLAG™ y 6xHis, respectivamente) tanto para detección como purificación.

Microexpresión de anticuerpos HuCAL GOLD® en E.coli

Para obtener cantidades suficientes de proteína codificada por cada uno de los clones obtenidos anteriormente, se seleccionan colonias bacterianas individuales resistentes a cloranfenicol después de la subclonación de los Fab seleccionados en el vector de expresión pMORPH®X9 Fab FH. Cada una de estas colonias se utiliza entonces para inocular los pozos de una placa de microtitulación estéril de 96 pozos; cada pozo contiene 100 !l de medio 2xYT-CG por pozo, y las bacterias se cultivan durante la noche a 37ºC. Se transfiere una muestra (5 !l) de cada cultivo de E. coli TG-1 a una placa de microtitulación estéril de 96 pozos prellenada con 100 !l de medio 2xYT suplementado con 34 !g/ml de cloranfenicol y 0.1% de glucosa por pozo. Las placas de microtitulación se incuban a 30ºC con agitación a 400 rpm sobre un agitador de microplaca hasta que los cultivos estén ligeramente turbios (aproximadamente 2-4 horas) y con OD600nm de aproximadamente 0.5.

Para la expresión en el formato de estas placas, 20 !l de medio 2xYT suplementado con 34 !g/ml de cloranfenicol y IPTG 3 mM (isopropil-1-D-tiogalactopiranosido) se añade por pozo (concentración final de 0.5 mM de IPTG), las placas de microtitulación se sellan con una tapa permeable a los gases, y se incuban durante la noche a 30ºC agitando a 400 rpm.

Generación de lisados de células enteras (extractos de BEL)

A cada una de las placas de expresión, se agregan 40 !l de regulador BEL (2xBBS/ EDTA: 24.7 g/l de ácido bórico,

18.7 g NaCl/l, 1.49 g de EDTA/l, pH 8.0) que contenía 2.5 mg/ml de lisozima, y las placas y se incuban durante una hora a 22ºC sobre una agitador de microplacas de titulación (400 rpm). Los extractos BEL se utilizan para el análisis de enlazamiento de FMAT (véase ejemplo 2).

Expresión de cantidades en microgramos de los anticuerpos HuCAL GOLD® Fab en E.coli y purificación

La expresión de los fragmentos de Fab codificados por pMORPH®X9_Fab_FH en células de E. coli TG1 F se lleva a cabo en tubos plásticos de 50 ml. Para este propósito, los precultivos inoculados con clones individuales se cultivan en medio 2xYT-CG durante la noche a 30ºC. A la mañana siguiente, se utilizan 50 !l de cada precultivo para inocular 25 ml de medio 2xYT suplementado con 34 !g/ml de cloranfenicol, IPTG 1 mM, y glucosa al 0.1% en tubos plásticos estériles de 50 ml, y se incuban durante la noche a 30ºC. Se recolectan entonces las células de E. coli, se congelan las pellas de células y finalmente se deshacen con Bug Buster (Novagen). Los fragmentos de Fab se aíslan utilizando agarosa Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Alemania).

Expresión de cantidades en miligramos de anticuerpos de HuCAL GOLD® Fab en E. coli y purificación

La expresión de fragmentos de Fab codificados por HuCAL GOLD® Fab en células TG1 F se lleva a cabo en cultivos en matraces en agitación utilizando 750 ml de medio 2xYT suplemantado con 34 !g/ml de cloranfenicol. Los cultivos se agitan a 30ºC hasta que el OD600nm alcanza 0.5. La expresión se induce mediante la adición de IPTG 0.75 mM seguido por incubación durante 20 horas a 30ºC. La células se deshacen utilizando lisozima y los fragmentos Fab se aíslan mediante cromatografía sobre Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Alemania).

Las concentraciones de proteína se determinan por espectrofotometría UV (Krebs et al., 2001).

Ejemplo 2: Identificación de anticuerpos HuCAL® específicos para c-Met

Los extractos de BEL de clones individuales de E. coli seleccionados para las estrategias de paneo antes mencionadas se analizan mediante la tecnología de ensayo de microvolúmenes fluorométrica (FMAT™, el analizador 8200 Cellular Detection System, Applied Biosystems), para identificar los clones que codifican los Fab específicos para C-Met.

Análisis de enlazamiento basado en la tecnología de ensayo de microvolumen fluorométrico (FMAT) para la detección de Fab enlazantes a c-Met de lisados bacterianos

Para la detección de anticuerpos Fab de enlazamiento a c-Met de lisados de E. coli (extractos BEL) se analiza en enlazamiento con el sistema de detección celular FMAT 8200 (Applied Biosystems). Para acoplar c-Met marcada con His-Strep sobre perlas M-450 Expoxy (Dynal), se transfiere una muestra de 300 !l de perlas M-450 Epoxy (1.2 x 108 perlas) a una tubo de reacción y se captura con un separador de partículas magnético. El sobrenadante se retira y las perlas se lavan cuatro veces en 1 ml de regulador de fosfato de sodio 100 mM, pH 7.4. Para el recubrimiento con antígeno, se agrega 60 !g de c-Met marcada con His-Strep a la suspensión de perlas en 150 !l de regulador de fosfato de sodio 100 mM, pH 7.4. La suspensión antígeno-perlas se incuba durante 16 hora a temperatura ambiente sobre una rueda rotatoria. Las perlas recubiertas se lavan entonces tres veces con PBS y se resuspenden en un volumen final de 250 !l de PBS.

Para cada placa de 384 pozos, se prepara una mezcla de 20 ml de PBS que contiene BSA al 3%, Tween-20 al 0.005%, 4 !l de perlas recubiertas con c-Met (1.9 x 106 perlas) y 4 !l de anticuerpo de detección Cy5™. Se dispensa una muestra de 45 !l de ésta solución por pozo en una placa de fondo negro/claro de FMAT de 384 pozos (Applied Biosystems). Se agrega el extracto de BEL (5 !l) que contiene Fab a cada pozo. Las placas FMAT se incuban a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente las placas se analizan en el sistema de detección celular

8200 (Applied Biosystems).

Se obtienen clones positivos, y se analizan las secuencias de las cadenas pesada y liviana de clones que producen señales positivas especificas en FMAT. Se identifican clones anti-c-Met únicos (no redundantes) que muestran un enlazamiento suficientemente fuerte a c-Met humana. Estos clones se expresan, purifican y prueban en cuanto a su afinidad en ensayos funcionales.

Determinación de las afinidades nanomolares utilizando resonancia de superficie en plasmon

Utilizando estos clones, se lleva a cabo el análisis cinético SPR sobre un chip CM5 (Biacore, Suecia), que ha sido recubierto con una densidad de aproximadamente 400 RU bien sea de c-Met humana recombinante, en acetato de sodio 10 mM pH 4.5 utilizando químicamente de acoplamiento con EDCNHS amina. Se inmoliza una cantidad comparable de albúmina de suero humana (HSA) sobre la celda de flujo de referencia. Se utiliza PBS (NaCl 136 mM, KCl 2.7 mM, Na2HP0 10 mM, KH2PO4 1.76 mM pH 7.4) como regulador de desarrollo. Las preparación de Fab se aplican en series de concentración de 16-500 nM a una velocidad de flujo de 20 !l/minuto. La fase de asociación se define en 60 segundos y la fase de disociación en 120 segundos. La Tabla 1 muestra una resumen de las afinidades en nM a c-Met humana aquí.

Tabla 1. Afinidades de Fabs seleccionados con c-Met humana

Anticuerpo: KD [nM] humano c-Met BIAcore

4536: 1.4

4537: 1.7

4541: 2.6

4682: 11.2

4687: 0.8

4690: 66

Ejemplo 3: análisis cuantitativo de afinidades de enlazamiento: detección de candidatos de c-Met anithumanos que enlazan c-Met de longitud completa

Determinación de la afinidad

Con el fin de caracterizar adicionalmente los anticuerpos anti-c-Met, la afinidad de c-Met humana y de cynomolgus de longitud completa se determina. Se lavan células GTL16, se CHO que sobreepxpresan c-Met de cynomolgus o células 4MBr-5 de resus, se tripsinizan y se suspenden en PBS que contiene FCS al 3% (FCS al 3%/PBS) a 4ºC. Se resuspenden 2-5 x 105 células/muestra en 140 !l de FCS al 3%/PBS que contiene 5 !g/ml de Fab anti-c-Met purificados

o diluciones seriadas del mismo. Como control positivo se usan 5 !g/ml de DO24 (IgG2a de ratón), anithumano. Las células incuban durante 30-60 minutos a 4ºC antes de ser convertidas en pellas por centrifugación durante 2 minutos a 2000 rpm (716 g) a 4ºC y se lavan en 200 !l de FCS al 3%/PBS helado. Las células son convertidas de nuevo en pellas por centrifugación y se elimina cuidadosamente el PBS. Las células se resuspenden en 100 !l de IgG (H+L) antihumano de cabra conjugado (Jackson Cat No. 109-116-088) diluido 1:200 en FCS al 3%/NaN3 0.02%/PBS; para el control positivo se utiliza IgG (H+L)-PE de cabra antiratón conjugado (Jackson Cat No. 115-116-146) diluido 1:200 en FCS al 3%/PBS. Las muestras se incuban en oscuridad durante 30-60 minutos a 4ºC. Después de la centrifugación y lavado en 200 !l de FCS al 3%/NaN3/PBS al 0.2% las células se resuspenden en 100 !l de FCS al 3%/PBS y se ensayan utilizando la disposición FACS o FACS-Calibur.

Los datos de afinidad resumidos sobre c-Met humana y de cynomolgus se muestran en la Tabla 2 aquí. Todo los seis Fab probados mostrados en la Tabla 2 demuestran tener afinidad con c-Met humana por debajo de 100 nM. Adicionalmente, nueve clones producen anticuerpos con afinidades menores de 10 nM. En todos los caso probados, las afinidades por c-Met de cynomolgus y ratón son casi idénticas a las de c-Met humana.

Tabla 2. Datos de afinidad de Fab seleccionados sobre c-Met humana, de resus y de cynomolgus Ejemplo 4: Producción de inmunoglobulinas de HuCAL®

Anticuerpo: KD[nM] humano c-Met GTL-16 KD [nM] cyno c-Met CHOcMet cyno KD [nM] resus c-Met 4MBr-5

4536: 0.4 0.5 0.1

4537: 2.6 ND 0.1

4541: 0.5 ND 0.1

4682: 1.2 0.3 0.3

4687: 5.7 1.1 1.2

4690: 1.1 ND 0.1

Conversión en el formato IgG

La dimerización mediada por anticuerpos puede dar como resultado la activación agonística de la actividad de la c-Met tirosina quinasa. Por lo tanto la Fab seleccionadas sobre la base de c-Met purificadas por enlazamiento se convierten en el formato IgG. Con el fin de expresar inmunoglobulina de longitud completa (Ig) subclonan fragmentos de dominios variables de cadenas pesadas (VH) y liviana (VL) a partir de los vectores de expresión pMORPH®X9_FH Fab bien sea en las series de vectores pMORPH®_h_Ig o pMORPH®2_h_Ig para IgG1 humana e IgG4 humana. Las enzimas de restricción EcoRI, MfeI, y BlpI se utilizan para subclonar el fragmento del dominio VH en pMORPH®_h_IgG1 y pMORPH®_h_IgG4. Las enzimas de restricción MfeI y BlpI se utilizan para subclonar el fragmento del domino VH en pMORP®2_h_IgG1f and pMORPH®2_h_ IgG4. La subclonación del fragmento del dominio VL en pMORPH®_h_IgK y pMORPH®2_h_IgK se lleva a cabo utilizando los sitios EcoRV y BsitWI, mientras que se subclona pMORPH® h lgA y pMORPH®2 h lgA2 utilizando EcoRV yHpal.

Expresión transiente y purificación de IgG humana

Se transfectan células HEK293 con una cantidad equimolar de vectores de expresión de cadena pesada y liviana de IgG. A los 4 o 5 días después de la transfección, se recolecta el sobrenadante del cultivo celular. Después de ajustar el pH del sobrenadante a 8.0 de filtración estéril, la solución se somete a una cromatografía de columna estándar de proteína A (Poros 20A, PE Biosystems).

Conversión de Fab originales en los formatos IgG1 e IgG4

En paralelo al inicio de la maduración por afinidad, se clonan insertos en los vectores de expresión pMORPH®_h_IgG1 and pMORPH®_h_IgG4. La expresión a escala pequeña se lleva a cabo por transfección transiente de células HEK293 y las inmunoglobulinas de longitud completa se purifican a partir del sobrenadante de cultivo celular.

Identificación de candidatos de c-Met IgG antihumanos que modulan la proliferación dependiente de c-Met

Los diferentes anticuerpos específicos para c-Met resultantes seleccionados de la biblioteca HuCAL GOLD® se convierten entonces en el formato IgG y se prueban en cuanto a su potencia para inhibir la proliferación impulsada por HGF.

La actividad funcional de cada uno de los clones seleccionados se establece utilizando un ensayo incorporación BrdU por estimulación con HGF de células 4MBr-5. Las células 4MBr-5 siembran a una densidad de 3 x 103 células por pozo en un volumen total de 100 !l por pozo de Ham s F12K suplementado con FBS al 10% en placas tratadas para cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pozos (Costar, #3610). Las placas se incuban a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% durante dos horas, después de lo cual se agregan 50 !l del medio que contiene el anticuerpo purificado que se va a probar. Como control negativo para la carencia de modulación, se agrega una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tiene una especificidad conocida no relacionada con los determinantes del epítopo de c-Met), o un regulador, a los pozos designados. Las placas se incuban a 37ºC en atmósfera de CO2 durante una hora, después de lo cual se agregan 50 !l del medio solo o 50 !l que contienen HGF (por ejemplo aproximadamente 0.5 !g/!l hasta aproximadamente 50 ng/ml). Las placas se incuban a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% durante 72 horas después de las cuales se ensaya la incorporación de BrdU utilizando la prueba BrdU de ELISA (Roche) catalogo 1 669 915. Rápidamente, se agrega solución de BrdU 20 !m/pozo (1) y las placas se incuban durante 22 horas a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5%. Se elimina cuidadosamente el medio y la placa se seca durante 1 hora a 60ºC. Se agregan 200 !l de FixDenat (solución #2) y las placas se incuban a temperatura ambiente con agitación suave durante 30 minutos. La solución se retira cuidadosamente y se agregan 100 !l/pozo de solución de trabajo anti-BrdU. Las placas se incuban a temperatura ambiente con agitación suave durante 90 minutos. La solución se retira cuidadosamente y los pozos se lavan tres veces con 250 !l de solución de lavado. La solución se elimina cuidadosamente y las placas con 100 !l/pozo de solución agregada se miden a A405 nm. Determinación de EC50.

Los datos que muestran la concentración efectiva para el 50% de inhibición de la proliferación estimulada por HGF para los clones de anticuerpos que tienen la afinidad mayor por c-Met se muestra en la Tabla 3 aquí. Los datos muestran que las concentraciones efectivas de EC50 varían desde 4 nM con un valor medio entre 6 y 150 nM.

Identificación de candidatos de c-Met IgG antihumanos que modulan la migración dependiente de c-Met

La migración celular en respuesta a una estimulación con HGF se prueba utilizando células NCI-H441 en la prueba de migración celular por quimiotaxis QCM™ en 96 pozos de 8 !M. Como se describió anteriormente, 24 horas antes de hacer el ensayo las células se lavan dos veces con PBS estéril y se someten a carencia de nutrientes en FBS al 1% que contiene DMEM a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5%. Subsecuentemente, las células son tripsinizadas y resuspendidas a 1.0 x 106 por ml en presencia una concentración apropiada del anticuerpo purificado durante 30 minutos a 37ºC como control negativo para la falta de modulación, se agrega una muestra de un anticuerpo no

5 relacionado (que tiene una especificidad conocida relacionada con los determinantes del epítopo de c-Met), o un regulador, a los pozos designados.

Bajo condiciones estériles se retira la tapa de la placa de cámara de migración y se agregan 150 !l de medio libre de

10 suero que contiene 50 ng/ml de HGF (R&D catalogo No. 294-HGN) a los pozos de la bandeja de alimentación (cámara inferior). Se agregan 100 !l de 5-10 x 104 células en DMEM con FBS al 1% preincubadas con anticuerpo a la cámara superior. La placa se cubre y se incuba durante 16 horas a 37ºC en CO2 al 4-6%. Siguiendo las instrucciones de los fabricantes, las células/medio en la cámara superior se descartan y la cámara se coloca en una bandeja alimentadora de 96 pozos a la cual se han agregado 150 !l/pozo de solución de desprendimiento celular precalentada. Las células se

15 desalojan incubando durante 30 minutos a 37ºC con agitación suave periódica. Subsecuentemente, se agrega 50 !l de CyQuant GR Dye prediluido a cada pozo de la bandeja de alimentación. La placa se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente y se transfieren 150 !l de la mezcla a una nueva placa de 96 pozos adecuada para la medición de fluorescencia utilizando un conjunto de filtros de 480/520 nm.

20 Los datos que muestran la concentración efectiva para el 50% de inhibición de la migración estimulada por HGF para los clones de anticuerpos que tienen la mayor afinidad por c-Met se muestra en la Tabla 3 aquí. Los datos muestran que las concentraciones efectivas EC50 varían desde 0.14 nm, con un valor medio entre 0.27 y 0.61 nm.

Tabla 3. Concentración efectiva para 50% de inhibición de Fab seleccionados

Fab: EC50 [nM] de inhibición de proliferación impulsada por HGF 4MBr-5 EC50 [nM] inhibición de migración impulsada por HGF NCI-H441

4536: 4 0.61

4537: 150 0.14

4541: 200 0.27

4687: 6 1.68

Ejemplo 5: Maduración de la afinidad de Fab anti-c-Met seleccionados por intercambio paralelo de los casetes LCDR3 y HCDR2

30 Para optimizar las afinidades de los anticuerpos descritos aquí para c-Met para un depósito de fragmentos de Fab originales, se retiran el LCDR3, el marco 4 y la región constante de las cadenas livianas (405 bp) de cada Fab original utilizando Bpil y Sphl, y se reemplaza por un repertorio de LCDR3 diversificado junto con el marco 4 y el dominio constante. Una muestra de 0.5 !g del vector del depósito de enlazamiento se liga con un exceso molar de tres veces del

35 fragmento del inserto que porta los LCDR3 diversificados.

En una metodología similar, se diversifica el HCDR2 utilizando los sitios Xhol y BssHII, y las regiones del marco de conexión se mantienen constantes. Con el fin de incrementar la eficiencia de clonación, el HCDR2 original se reemplaza por una secuencia de relleno de 590 bp antes de la inserción del casete diversificado HCDR2.

40 Las mezclas de ligación de las diferentes bibliotecas se someten a electroporación en 4 ml de células de E. coli TOP10 F’ (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) que producen de 2 x 107 hasta 2 x 108 de colonias independientes. La amplificación de las bibliotecas se lleva a cabo como se describió anteriormente (Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem. 278(40):38194-38205). Para control de calidad se seleccionan aleatoriamente varios clones por biblioteca y se

45 secuencian ((SequiServe, Vaterstetten, Alemania), utilizando cebadores CFR84 (VL) y OCAL_Seq_Hp (VH).

Selección de candidatos para maduración de la afinidad

Seis candidatos seleccionados para la maduración seleccionados (“Fabs originales”) se seleccionan utilizando las

50 siguientes propiedades: las afinidades a c-Met humana menores de 10 nM, con reactividad cruzada significativa con c-Met de cynomolgus, EC50 menor de 250 nM y niveles buenos a moderados de expresión de Fab en E. coli y actividad en el formato IgG en la proliferación impulsada por c-Met y pruebas de migración. Las propiedades de los fragmentos de Fab seleccionados se proveen en la Tabla 4.

55 Tabla 4. Propiedades de Fab seleccionados Generacion de bibliotecas de Fab seleccionadas para maduración de afinidad

Anticuerpo: KD [nM] humano c-Met BIAcore KD [nM] humano c-Met GTL-16 KD [nM] cyno c-Met CHOcyno c-Met Expresión deFab [mg/l] EC50 [nM] 4Mbr-5 Proliferación IgG EC50 [nM] NCI-H441 Migración IgG

4536: 1.4 1.7 229.1 6.3 4 0.61

4537: 1.7 1.5 12.7 7.4 150 0.14

4541: 2.6 1.7 0.6 5.3 200 0.27

4687: 0.8 4.0 1.3 1.4 6 1.68

5 Con el fin de obtener clones que tengan afinidad y actividad inhibidora incrementadas de los anticuerpos anti-c-Met, los clones de Fab seleccionados mostrados en el ejemplo previo se someten a rondas adicionales de diversificación y selección, un proceso conocido como maduración de afinidad. Para este propósito, se diversifican regiones CDR utilizando casetes de maduración LCDR3 y HCDR2 correspondientes preconstruidos por mutagénesis con trinucleótidos (Virnekäs et al., 1994 Nucleic Acids Res. 22:5600-5607; Nagy et al., 2002 Nature Medicine 8:801-807).

10 Los fragmentos Fab para el detector de expresión pMORPH®X9_Fab_FH se subclonal el vector fagémido pMORPH®25 (véase la patente de los Estados Unidos 6,753,136). Este vector provee la proteína de fago pIII fusionada en el terminal N a un residuo de sisteina así como a una sisteina del terminal C a la cadena del anticuerpo Fd y permite así un despliegue enlazado a disulfuro de los respectivos fragmentos de Fab sobre la superficie del fago. Se aplican dos

15 estrategias diferentes en paralelo para optimizar tanto la afinidad como la eficacia de los Fab originales.

Se generan cinco bibliotecas de Fab de anticuerpo del fago en las cuales el LCDR3 de cinco de los seis clones originales se reemplaza por un repertorio de secuencias de CDR3 de cadena ligera individual. (La maduración de LCDR3 de un clon no se lleva a cabo, puesto que este clon tiene un sitio de restricción adicional Bpil en una de las

20 regiones CDR y la encima de restricción Bpil se utiliza para el procedimiento de clonación de la biblioteca).

En paralelo, la región HCDR2 de cada clon original se reemplaza mediante un repertorio de secuencias de CDR2 de cadena pesada individual. Cada Fab original se escinde y se reemplaza con un agente de relleno de 590 bp. Este agente de relleno de ADN facilita la separación de las bandas de vectores de digestión sencilla de las de digestión doble

25 y reduce la señal de fondo de los Fab originales de alta afinidad durante los paneos de maduración. En una etapa subsecuente, el agente de relleno se escinde de los plásmidos que codifican Fab de cada clon original y se reemplaza por el casete de maduración HCDR2 altamente diversificado.

Las bibliotecas de maduración de afinidad grandes de más de 2 x 107 miembros se generan mediante procedimientos

30 de clonación estándar, y los clones diversificados se transforman en células E. coli TOP10F’ electrocompetentes (Invitrogen). Los fagos que presentan Fab se preparan como se describió anteriormente.

Los depósitos de maduración se construyen con el fin de facilitar el subsecuente proceso de selección: el depósito 1a consiste de las bibliotecas de LCDR3-1; el depósito 1b consiste de las bibliotecas HCDR2-1; el depósito 2a consiste de

35 las bibliotecas LCDR3-2; y el depósito 2b consiste de las bibliotecas HCDR2-2.

Para cada depósito el paneo se ejecuta en solución utilizando cantidades decrecientes de c-Met marcada con His-Strep y fago-antigéno capturado por perlas Strep-Tactin. En paralelo, cada depósito se aplica en paneos utilizando cantidades decrecientes de c-Met biotinilado, que se captura sobre placas recubiertas con Neutravidin. Con el fin de incrementar la

40 restricción del paneo y de seleccionar velocidades mejoradas, se ejecuta una competición con Fab originales purificados así como con antígeno no marcado durante periodos de incubación prolongados.

Inmediatamente después del paneo los depósitos de fagémidos enriquecidos se subclonan en el vector de expresión pMORPH®X9_FH. Los clones sencillos son seleccionados y la expresión de los genes en los Fab se induce con IPTG.

Estrategias de paneo de maduración

Los procedimientos de paneo utilizados en los cuatro depósitos de anticuerpos se llevan a cabo con c-Met marcada con His-Strep y con c-Met marcada con His-Strep biotionilado en solución durante dos o tres rondas, respectivamente. Para

50 cada una de las estrategias de paneo, se utiliza competición con las proteínas Fab originales purificadas o con c-Met no etiquetado con APP, así como bajas concentraciones de antígeno y lavado extensivo, para incrementar la restricción.

El paneo de la solución sobre c-Met no marcado etiquetado con His-Strep se lleva en dos rondas de selección principalmente de acuerdo con el protocolo estándar descrito en el Ejemplo 1. Excepciones a estos procedimientos son la aplicación de cantidades reducidas de antígeno (disminuyendo desde 5 nM hasta 1 nM), la alta restricción del procedimiento de lavado bien sea con o sin competidor, y periodos de incubación prologandos de los anticuerpo-fagos junto con el antígeno.

Para la primera ronda de selección utilizando c-Met biotinilado, los pozos de una placa Neutravidin se lavan dos veces con 300 !l de PBS. Los pozos se bloquean con 2 x ChemiBLOCKER (Chemicon, Temecula, CA) diluido 1:1 en PBS (regulador de bloqueo). Antes de las selecciones, se bloquean también los fagos HuCAL GOLD® con un volumen de regulador de bloqueo que contiene Tween-20 al 0.1% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las preparaciones de los fagos bloqueados se transfieren en alícuotas de 100 !l a los pozos de una placa recubierta con Neutravidin durante 30 minutos a temperatura ambiente. Esta etapa de preadsorción se repite una vez. Las preparaciones de fagos bloqueados y prelavados se incuban con c-Met biotinilado 5 nM durante 2 horas a 22ºC sobre una rueda rotatoria. Se agrega una muestra que contiene Fab original y APP-c-Met o un control positivo que no contiene competidor y las muestras se incuban durante la noche a 4ºC sobre una rueda rotatoria.

Los complejos antígeno-fago se capturan en los pozos de una placa de Neutravidin durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de extensas etapas de lavado, las partículas de fago enlazadas se eluyen mediante la adición de 200 !l de DTT 20 nM en Tris 10 nM pH 8.0 por pozo durante 10 minutos a temperatura ambiente. El eluido es retirado y se agrega a 14 ml de células de E. coli TG1 cultivadas hasta un OD600nm de 0.6-0.8. Los pozos se enjuagan una vez con 200 !l de PBS y ésta solución se agrega también a las células de E. coli TG1. La infección con fagos de E. coli permite durante 45 minutos a 37ºC sin agitación. Después de centrifugar durante 10 minutos a 5000 rpm, las pellas bacterianas se resuspenden en 500 !l de medio 2xYT, se siembran sobre placas de agar 2xYT-CG y se incuban durante la noche a 30ºC. Las colonias se recolectan por raspado de la superficie de las placas y las partículas de fago se rescatan y amplifican como se describió anteriormente.

La segunda y tercera rondas de la selección se llevan a cabo como se describió anteriormente para la primera ronda de selección, excepto que las condiciones de lavado son más restrictivas y las concentraciones de antígeno son 1 y 0.1 nM, respectivamente.

Análisis de enlazamiento basado en electroluminiscencia (BioVeris) de Fab de enlazamiento a c-Met

Para la detección de fragmentos de anticuerpos específicos para c-Met de afinidad mejorada en lisados de E. coli (extractos BEL), se utiliza un BioVeris M-384 SERIES® Workstation (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido). La prueba se lleva a cabo en placas de microtitulación de polipropileno de 96 pozos y PBS suplementado con BSA al 0.5% y Tween-20 al 0.02% como regulador de ensayo. Se inmoviliza c-Met humana biotinilada en perlas paramagnéticas M-280 Streptavidin (Dynal) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se agrega una dilución

1:25 de la solución de reserva de perlas por pozo. Muestras de 100 !l de extracto de BEL diluido y perlas se incuba durante la noche a temperatura ambiente sobre un agitador. Para la detección, se usa (Fab)’2 antihumano (Dianova) marcado con BV-tagTM de acuerdo con las instrucciones del proveedor (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido).

Se analiza un conjunto de clones escogidos aleatoriamente por el método descrito anteriormente. Un subconjunto de estos clones que da los valores más altos se escoge para análisis posterior en titulación de equilibrio en solución.

Determinación de las afinidades picomolares utilizando titulación de equilibrio en solución (SET)

Para la determinación del KD, se utilizan fracciones de monómero (al menos 90% de contenido de monómero, analizado por SEC analítico; Superdex75, Amersham Pharmacia) de Fab. La determinación de afinidad basada en electroquimioluminiscencia (ECL) en solución y la evaluación de los datos se ejecutan básicamente como lo describe Haenel et al., 2005. Una cantidad constante de Fab se equilibra con diferentes concentraciones (diluciones en serie 3’’) de c-Met humana (concentración de partido 4 nM) en solución. Se agrega c-Met humana biotinilada acoplada a perlas paramagnéticas (M-280 Streptavidin, Dynal), y BV-tag™ (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido) como marcador para (Fab)’’2 antihumano (Dianova) y la mezcla se incuba durante 30 minutos. Subsecuentemente, se cuantifica la concentración de Fab no enlazado por detección por ECL utilizando el analizador M-SERIES® 384 (BioVeris Europe).

Para este propósito se seleccionan clones individuales y se purifican en agarosa Ni-NTA en la escala !g. Se determina las afinidades preliminares mediante titulación en equilibrio en solución de 4 puntos (SET) en BioVeris. A partir de estos datos, se seleccionan los clones que muestran afinidades. Estos Fab se purifican en la escala de mg. Las afinidades finales se determinan a partir de dos lotes independientes de cada clon Fab utilizando una medición SET de 8 puntos y c-Met humana, de ratón y de cynomolgus.

La determinación de afinidad para c-Met de ratón y cynomolgus se hace esencialmente como se describió más arriba utilizando c-Met de raton (R&D Systems) y c-Met de cynomolgus como analito en solución en vez de c-Met humana.

Para la detección de Fab libre, se usa c-Met humana biotinilado acoplado a perlas paramagnéticas. Las afinidades se calculan se acuerdo con método conocidos por las personas experimentadas en la técnica, por ejemplo, Haenel et al., 2005 Anal Biochem 339.1:182-184.

5 Utilizando las condiciones de ensayo descritas anteriormente, las afinidades para los Fab anti-c-Met optimizados en afinidad se determinan en solución. Las afinidades se determinan para anticuerpos con KD por debajo de 4.6 pM para c-Met humana. Los análisis basados en FAC de enlazamiento a cyno-c-Met expresados en células CHO, tal como se describió anteriormente se llevan a cabo en este caso. Las afinidades se resumen en la Tabla 5 aquí.

10 Tabla 5. Afinidades de Fab

Afinidad [pM]:titulación en equilibrio en solución: KD [pM] cyno c-Met CHO-cyno c-Met

Anticuerpo 5091 5097 5098 5185: c-Met humana 1.4±0.5 3.6±0.9 2.1±1:0.5 4.6±3.9 Cyno c-Met 90 0.68 0.3±0.1 0.29

Ejemplo 6: Caracterización de Fab de c-Met antihumana optimizado en afinidad. Técnicas de saturación FACS

15 Se determina la especificidad de enlazamiento de los Fab maduros en presencia de suero humano al 50% (HS). Las diluciones seriadas de Fab de anti-c-Met optimizadas se incuban en presencia bien sea de suero humano al 50% en presencia de BSA al 2.8%. Se establece el enlazamiento de saturación de FACS a células GTL-16. Las células GTL 16 se lavan, tripsinizan y se suspenden en PBS que contiene FCS al 3% (FCS al 3%/PBS) a 4ºC. Se resuspenden 2-5 x

20 105 células/muestra en 140 !l de FCS al 3%/PBS que contiene 5 !g/ml de Fab anti-c-Met optimizado purificado o diluciones en serie del mismo. Como control positivo se usan 5 !g/ml de D024 (IgG2a de ratón), de c-Met antihumana. Las células se incuban durante 30-60 minutos a 4ºC antes de ser convertidas en pellas por centrifugación durante 2 minutos a 2000 rpm (716 g) a 4ºC y se lavan en 200 !l de FCS al 3%/PBS helado. Las células se convierten de nuevo en pellas por centrifugación y se elimina cuidadosamente el PBS. Las células se resuspenden en 100 !l de IgG (H+L)

25 PE antihumano de cabra conjugado (Jackson Cat No. 109-116-088) diluido 1: 200 en FCS al 3%/PBS. Para el control positivo se usa IgG (H+L)-PE antiratón de cabra conjugado (Jackson Cat No. 115-116-146) diluido 1:200 en FCS al 3%/PBS. Las muestras se incuban en la oscuridad durante 30-60 minutos a 4ºC. Después de la centrifugación y lavado en 200 !l de FCS/PBS al 3% las células de resuspenden en 100 !l de FCS al 3%/PBS y se ensayan utilizando la disposición FACS o el FACS-Calibur.

30 Las curvas de enlazamiento de Ejemplos se muestran en la Tabla 6, las cuales resumen la actividad de enlazamiento de los Fab de anti-c-Met optimizadas en presencia de suero humano al 50% en comparación con la actividad de enlazamiento en BSA al 2.8%, la cual varia desde 83.3% hasta 100%. El valor medio encontrado es 90.2%, así se encuentra que los Fab anti-c-Met se enlazan completamente al objetivo en presencia de suero humano.

Tabla 6. Actividad de enlazamiento de Fab

Anticuerpo: Actividad de enlazamiento w/50% suero humano vs 2.8%BSA(%).

5091: 83.8

5097: 90.2

5098: 100

5185: *

*Enlazamiento de 5185 no se analiza aun en término de EC50 puesto que no se alcanza la saturación.

40 Conversión de Fab candidatos anti-c-Met optimizados en el formato IgG

La dimerización mediada por anticuerpos puede dar como resultado la activación agonística de la actividad de tirosina quinasa de c-Met. Por lo tanto los Fab optimizados, seleccionados sobre la base de c-Met purificado enlazante, se convierten en el formato IgG. Con el fin de expresar fragmentos de dominio variable de inmunoglobulina (Ig) de longitud 45 completa de cadena pesada (VH) y livianas (VL) se subclonan desde los vectores de expresión de Fab

pMORPH®X9_FH bien sea en las series de vector pMORPH®_h_Ig o pMORPH®2_h_Ig para IgG1 humana y IgG4 humana. Las enzimas de restricción EcoRI, MfeI, y BlpI se utilizan para subclonar el fragmento del domino VH en pMORPH®2_h_IgG1f y pMORPH®2_h_IgG4. Las enzimas de restricción MfeI y BlpI se utilizan para subclonar el fragmento del dominio VH en pMORPH®2_h_IgG1f y pMORPH®2_h_IgG4. La subclonación del fragmento del dominio VL en pMORPH®_h_IgK y pMORPH®2_h_IgK se ejecuta utilizando los sitios EcoRV y BsiWI, mientras que se subclona

en pMORPH® h lgA y pMORPH®2 h lgA2 que se hace utilizando EcoRV y Hpal.

Expresión transiente y purificación de IgG humana

Las células HEK293 se transfectan con una cantidad equimolar de vectores de expresión de IgG de cadena pesada y ligera. En los días 4 o 5 después de la trasnfección, se recolecta el sobrenadante del cultivo celular. Después de ajustar el pH del sobrenadante a 8.0 y de filtrar en condiciones de esterilidad, la solución se somete a una cromatografía de columna estándar de proteína A (Poros 20A, PE Biosystems).

Identificación de los candidatos de IgG de c-Met antihumana optimizados modulando la proliferación dependiente de c-Met.

Los anticuerpos específicos de c-Met optimizados resultantes seleccionados de la biblioteca HuCAL GOLD® se convierten entonces en el formato IgG y se prueban en cuanto a su potencia para inhibir la proliferación impulsada por HGF.

La actividad funcional de cada uno de los clones seleccionados se establece utilizando un ensayo de incorporación BrdU sobre estimulación por HGF de células 4Mbr-5. Las células 4Mbr-5 se siembran a una densidad de 3 x 103 células por pozo en un volumen total de 100 !l/pozo de de Ham F12K suplementado con FBS al 10% en placas tratadas con cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pozos (Costar, #3610). Las placas se incuban a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% durante dos horas, después de lo cual se agregan 50 !l del medio que contiene el anticuerpo purificado que va a ser probado. Se agrega un control negativo para carencia de modulación, una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tiene una especificidad conocida no relacionada con los determinante del epítopo de c-Met) o un regulador, a los pozos designados. Las placas se incuban a 37ºC en atmósfera de CO2 al 5% durante 1 hora, después de lo cual, se agregan 50 !l del medio solo o 50 !l que contienen HGF (por ejemplo, aproximadamente 0.5 !g/!l hasta aproximadamente 50 ng/ml). Las placas se incuban a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% durante 72 horas, después de lo cual se prueba la incorporación de BrdU utilizando el ensayo BrdU de proliferación ELISA (Roche) Cat No. 1 669

915. Rápidamente, se agregan 20 !m/pozo de solución de BrdU (#1) y las placas se incuban durante 22 horas a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5%. Se retira cuidadosamente el medio y la placa se seca durante 1 hora a 60ºC. Se agregan 200 !l de FixDenat (solución #2) y las placas se incuban a temperatura ambiente con agitación suave durante 30 minutos. La solución se retira suavemente y se agrega 100 !l/pozo de solución de trabajo de anti-BrdU. Las placas se incuban a temperatura ambiente con agitación suave durante 90 minutos. La solución se retira cuidadosamente y los pozos se lavan 3 veces con 250 !l de solución de lavado. La solución se retira cuidadosamente y las placas con 100 !l/pozo se solución de sustrato agregado se miden a A405 nm. Determinación de EC50.

Los datos que muestran la concentración efectiva, para 50% de inhibición de proliferación estimulada por HGF para los clones de anticuerpos que tienen la mayor afinidad por c-Met se muestra en la Tabla 7 aquí. Los datos muestran que las concentraciones efectivas de EC50 varían desde 0.13 nm, con un valor medio entre 0.5 nm y 1.3 nm.

Tabla 7. Actividad inhibidora de candidatos anti-c-Met optimizados en la formación de IgG sobre proliferación estimulada por HGF

Anticuerpo: EC50 [nM] Inhibición de proliferación impulsada por HGF 4MBr-5 en suero al 10%

5091: 1.3

5097: 1.6

5098: 0.5

5185: 0.13

Técnicas de ensayo de enzimas enlazadas inmunosorbentes (ELISA)

Se determina la especificidad en el enlazamiento de Fab maduros en presencia de suero humano al 50% (HS). Diluciones seriadas de anticuerpo biotinilado humano recombinante en TBS se recubren sobre placas de microtitulación Neutravidin durante 2 horas a temperatura ambiente, a partir de 8 ng anticuerpo por pozo hasta una concentración de 125 ng de anticuerpo por pozo. Después de recubrir con el antígeno, los pozos se bloquean con TBS/Tween al 0.05% (TBS-T) suplementado con BSA al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Los Fab purificados descritos anteriormente se diluyen bien sea en TBS/BSA al 4% o TBS/HS al 50% hasta una concentración final de 1 !g/ml, se agregan a los pozos recubiertos y bloqueados y las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la detección, se utiliza una anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP) anti FLAG (dilución 1:5000 en TBST) y el sustrato fluorogénico AttoPhos (Roche). Después de cada incubación, los pozos de la placas de microtitulación se lavan con TBST cinco veces, excepto después de la etapa final de incubación con el anticuerpo secundario marcado cuando los pozos se lavan tres veces. La fluorescencia se mide en un lector de placas TECAN Spectrafluor.

La migración celular en respuesta a la estimulación con HGF se prueba utilizando células NCI-H441 en el ensayo de migración celular de quimiotaxis QCM™ 8 mM 96-pozos. Tal como se describió anteriormente, 24 horas antes de la prueba las células se lavan dos veces con PBS estéril y se dejan sin nutrición en DMEM que contiene 1% FBS a 37ND en una atmósfera al 5% de CO2. Subsecuentemente, las células son tripsiniadas y re suspendidas a 1.0 x 106 células por mL en la presencia de una concentración apropiada del anticuerpo purificado durante 30 minutos a 37 °C. Como un control negativo para la falta de modulación, se agrega a pozos designados una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tiene una especificidad conocida no relacionada con las determinantes del epítopo c-Met), o un regulador.

Bajo condiciones estériles se retira la tapa de la placa de la cámara de migración y se agregan 150 mL de medio libre de suero que contiene 50 ng/ml HGF (R&D Cat No. 294-HGN) a los pozos de la bandeja alimentadora (cámara inferior). 100 mLof 5-10 x 104 células en DMEM con 1%FBS pre incuban los con anticuerpos se agregan cuidadosamente a la cámara superior. La placa se cubre y se incuba durante 16 horas a 37 °C en 4-6% CO2. Siguiendo las instrucciones del fabricante, las células/medios en la cámara superior se descartan y la cámara se coloca en una bandeja alimentadora de 96 pozos en la cual se ha agregado 150 mL/pozo de solución precalentada de desprendimiento de células. Las células se desalojan incuban durante 30 minutos a 37 °C con agitación suave periódica. Subsecuentemente, se agregan 50 ml de CyQuant GR Dye prediluido a cada pozo de la bandeja alimentadora. La placa se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente y se transfieren 150 mL de la mezcla transferida a una nueva placa de 96 pozos adecuada para la medición de la fluorescencia usando un conjunto de filtros de 480/520 nm .

Los datos que muestran la concentración efectiva para una inhibición del 50% de la migración estimulada por HGF de los clones de anticuerpos que tienen la afinidad más grande por c-Met se muestra en la tabla 8 aquí. Los datos muestran que las concentraciones efectivas EC50 varían desde 0.61 nM, con un valor medio entre 0.73 nM y 0.76 nM.

Tabla 8. Actividad inhibidora de candidatos anti-c-Met optimizados en la formación de IgG en migración estimulada por HGF

Anticuerpo: Inhibición EC50 [nM] de migración de NCI-H441 impulsada por HGF en suero al 1%

5091: 0.61 ± 0.22

5097: 0.76 ± 0.69

5098: 0.73 ± 1.1

5185: 1:2 ± 1.3

Ejemplo 7: modulación de autofosforilación de c-Met estimulada por HGF por parte de anticuerpos antagónicos seleccionados y-c-Met

El agonismo o el antagonismo por los anticuerpos anti-c-Met de la invención se miden mediante la activación o inhibición de la fosforilación de c-Met en células con o sin una estimulación con HGF. Las células de una línea celular tal como las células A549 se siembran en placa a una densidad de 3 X 104 células por pozo en un volumen total de 100 ml/pozo de DMEM suplementado con 10% FBS en placas tratadas para cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pozos (Costar, #3595). Las placas se incuban a 37 ND en una atmósfera al 5% de CO2 durante 24 horas, después de los cuales el medio se aspira suavemente desde cada pozo de las placas y se agrega un volumen de 100 ml/pozo de DMEM. Las placas se incuban a 37 °C en humanos será al 5% de CO2 durante 24 horas, después de las cuales se agrega a las células una muestra de un anticuerpo purificado que se va a probar, 100 ml por pozo del anticuerpo o una dilución en el pozo diluido con. Como control negativo para la falta de activación, se agrega una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tenga una especificidad conocida no relacionada con los determinantes de epítopo de c), o un regulador a los pozos designados.

Las células se incuban a 37 °C durante un periodo corto de tiempo (, por ejemplo, 2 horas) un período de tiempo más largo (por ejemplo, 24 horas). Cuando sea apropiado, las células son estimuladas mediante la adición de The HGF en medio DMEM libre de suero a una concentración final de 200 ng/pozo. En general, cuando se prueba la actividad agonista de los anticuerpos, excepto por el control positivo (no tratado con anticuerpos), se omite el HGF de los pozos de anticuerpos de muestra de prueba. En general, cuando se prueba la actividad antagonista de los anticuerpos, se incluye HGF en los pozos de anticuerpos de muestra de prueba. Las placas se incuban adicionalmente durante 10 minutos a 37 °C, luego el medio es aspirado suavemente desde los pozos de las placas. Las células se lavan con PBS frío que contiene y la solución se aspira suavemente desde las placas. Las células se someten a lisis con 50 ml de regulador de lisis (regulador de lisis NP-40: 120 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 6mM EGTA, 20mM NaF, 1 mM Benzamidina con 0.5 mM Na3VO4, recién añadido y 0.1mM PMSF). Las placas se agitan a temperatura ambiente durante 15 minutos, y luego se almacenan a -80 °C hasta que sean requeridas para ELISA. [0419] se usa un ELISA para determinar los niveles de fosforilación de c-Met. Para la preparación de las placas para ELISA se lava 2 veces Nunc-ImmunoTM Plate, MaxiSorbTM Surface (VWR International AG, NN391 -8786) con regulador de lavado (PBS-0.05%Tween Biorad #670-6531), y se agregan 100 ml de anticuerpo de captura de c-Metmonoclonal (DO-24) en PBS. Las placas se incuban durante la noche a 4 °C lavadas 3 veces con PBS-0.05%Tween. Se bloquean los sitios de emplazamiento no específico con 200 ml/pozo de 3% BSA en PBS-T durante 2 horas a temperatura ambiente, con agitación. Inmediatamente antes del uso se elimina la solución de bloqueo.

Las células lisadas congeladas se funden por agitación a temperatura ambiente y se agregan 40 ml de lisado a las placas Frozen Nunc-Immuno y las placas se incuban a 4 °C durante 4 horas. Las placas se lavan tres veces con PBS-T, y 50 ml/pozo de 0.2 mg/ml de anticuerpo antifosfotirosina PY20-HRP (ZYMED, # 03-7722) en 3% albúmina de suero bovino -PBS-T. Las placas se incuban durante la noche a 4 °C y se lavan 3 veces con PBS-T. El PBS-T se aspira y se agregan 90 ml/pozo de sustrato de fosfatasa alcalina (CDR-Star, TROPIX, #MS100RY) y se desarrolla con agitación suave durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las placas se leen utilizando un lector de placas de 96 pozos.

Los datos que muestran la concentración efectiva para una inhibición del 50% de la migración estimulada por HGF de los clones de anticuerpos que tienen la mayor afinidad por c-Met se muestran en la tabla 9 aquí. Los datos muestran que las concentraciones efectivas EC50 varían desde 0.166 nM, con un valor medio entre 0.193 y 0.219 nM.

Tabla 9. Actividad inhibidora de candidatos optimizados anti-c-Met en la formación de IgG en la autofosforilación del receptor estimulada por HGF

Antibody: EC50 [nM] Inhibition of HGF stimulated c-Met autofosforilation in A549

5091: 0.193

5097: 0.166

5098: 0.419

5185: 0.219

Ejemplo 8: secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos de genes optimizados para la expresión

Para incrementar la expresión en mamíferos, se introducen cambios en las cadenas pesadas y livianas de Fabs aquí para la optimización del uso de codones para la expresión en células de mamíferos. Se sabe que varias estructuras de actuación cis negativa disminuye la expresión en mamíferos. El proceso de optimización aquí elimina los sitios de actuación cis negativa (tales como sitios de división o señales poli(A)) los cuales tienen una influencia negativa en la expresión. El proceso de optimización aquí enriquece adicionalmente el contenido de GC, para prolongar la vida media del mRNA.

Se optimizan regiones de cadena liviana y pesada utilizando un clon de un Fab y se aísla por selección con un despliegue de facto. Por lo tanto las secuencias de nucleótidos codifican cada una de las cadenas livianas y pesadas completas de este y otros clones se optimizan cada una utilizando estos procedimientos.

Proceso de optimización para cadenas VH y VL

Para optimizar la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de cada una de las cadenas VL y VH, se adapta el uso del codón a la desviación del codón de genes de mamíferos, especialmente H. sapiens,. Además, las regiones con un contenido muy alto (> 80%) o muy bajo (< 30%) de GC son reducidas o eliminadas cuando sea posible.

Durante el proceso de optimización, se evitan las siguientes estructuras de secuencias con actuación en cis: cajas internas TATA, sitios chi y sitios de entrada ribosómica, extensiones de secuencias ricas en AT o ricas en GC, elementos de secuencias de estructura de inestabilidad de ARN (ARE), elementos de secuencia de ARN inhibidor (INS), elementos de secuencia de respuesta a cAMP (CRS), secuencias repetidas y estructuras secundarias de ARN, sitios de división donadores y aceptadores incluyendo sitios crípticos, y puntos de ramificación. Excepto como se indica, la introducción de los sitios MluI y HindIII se edita en el proceso de optimización de la secuencia de nucleótidos de la cadena VL. Excepto como se indica, la introducción de los sitios MlyI y BstEII se edita en el proceso de optimización de la secuencia de nucleótidos de la cadena VH.

Secuencias de aminoácidos de las cadenas VH y VL optimizadas para expresión

El uso de codón está adaptado al de los mamíferos para permitir ratas de expresión más altas y más estables en una célula de mamífero para las secuencias de aminoácidos optimizadas resultantes para las cadenas VH and VL del clon descrito anteriormente.

Los histogramas pueden utilizarse para mostrar los porcentajes de los codones de secuencia para cada una de las secuencias madre y los genes optimizados respectivamente, y analiza la clase de calidad de las secuencias de nucleótidos respectivos que codifican las cadenas VH y VL. El valor de calidad tal como se utiliza aquí significa que el codón más frecuente utilizado para un aminoácido dado en el sistema de expresión deseado se define como 100, y los codones restantes se escalan de acuerdo con la frecuencia de uso (Sharp, P.M., Li, W.H., Nucleic Acids Res. 15 (3),1987).

Adicionalmente, el índice de adaptación de codón (CAI) es un número que describe qué tan bien los codones desde la secuencia de nucleótidos coinciden con la preferencia de utilización del codón del organismo objetivo. El valor máximo de CAI se fija en 1.0, por lo cual se considera que un CAI de > 0.9 permite alta expresión. Se encuentra que el CAI para la cadena VL antes de la optimización es 0.73, y después de la optimización, se determina que el CAI es 0.95. De la misma forma, el CAI para la cadena VH antes de la optimización se encuentra en 0.74, y después de la optimización se determina que es 0.98.

El contenido de GC en la cadena VL se incrementa desde la secuencia progenitora para la secuencia optimizada.

Optimización para la expresión de cadenas ligeras y cadenas pesadas de longitud completa

El proceso de optimización se aplica a cada una de las secuencias de nucleótidos progenitoras de longitud completa de las cadenas livianas y las secuencias de nucleótidos progenitora de longitud completa de las cadenas pesadas.

El proceso de optimización se usa para construir las secuencias de nucleótidos de cadena ligera asociadas con los números de clones progenitores. Adicionalmente, el proceso de optimización se usa para construir las secuencias de nucleótidos de cadena pesada asociadas con los números de clones progenitores.

Tabla E. Listado de secuencias de la invención

Ab Ref. No. –Tipo de cadena: SEQ ID NO: SECUENCIA

04536 VL: 1

05087 VL: 2

05088 VL: 3

05091 VL: 4

05092 VL: 5

04687 VL: 6

05097 VL: 7

LISTADO DE SECUENCIAS DE LA INVENCIÓN

5 <110> Novartis AG

<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE USO PARA ANTICUERPOS DE c Met

<130> ON/4-34782A

<150> US 60/787556

<151> 2006-03-30

10 <160> 96

<170> Patentin version 3.3

<210> 1

<211> 327

<212>: ADN 15 <213> Homo sapiens

<900> 1

<210> 2

<211> 330

<212>: ADN 20 <213> Homo sapiens

<400> 2 <210> 3

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4

10 <210> 5

<211> 327

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5 <210> 6

<211> 342

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 339

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

10 <210> 8

<211> 342

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9 <211> 342

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 342

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 10

10 <210> 11

<211> 324

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 11 <210> 12

<211> 324

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 324

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 13

10 <210> 14

<211> 324

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 14 <210> 15 .

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 15

5 <210> 16

•: 330

•: 330

<212>: ADN 10 <213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 327

<212>: ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 17 <210> 18

<211> 327

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 324

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 19

10 <210> 20

<211> 369

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 20 <210> 21

<211> 363

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 363

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 22.

10 <210> 23

<211> 363

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400>23 <210> 24

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 339

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25

10 <210> 26

<211> 342

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 26 <210> 27

<211> 363

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 348

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 28

10 <210> 29

<211> 375

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 29 <210> 30

<211> 336 <212>. ADN

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31 <210> 32

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(110)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:51

<400> 32

10 <210> 33

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33 <210> 34

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(110)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:52

<400> 34 <210> 35

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36 <210> 37

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37 <210> 38

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

5 <210> 39

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 10 <221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(114)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:53

<400> 39 <210> 40 <211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(114)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:54

<400> 40 <210> 41

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42 <210> 43

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44 <210> 45

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45 <210> 46

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46

<210> 47

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47 <210> 48

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

<210> 49 <211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(110)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:32

<400> 51

<210> 52

<211> 110

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(110)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:34

15 <400> 52 <210> 53 <211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(114)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:39

<400> 53 <210> 54

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(114)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:40

<400> 54

<210> 55

10 <211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> <221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(121)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:65 y SEQ ID NO:66

<400> 55

<210> 56 5 <211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS 10 <222> (1)..(121)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:69 y SEQ ID NO:70

<400> 56 <210> 57

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 10 <221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(113)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:67 y SEQ ID NO:68

<400> 58 <210> 59 <211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(113)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:71 y SEQ ID NO:72

<400> 59 <210> 60

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60 <210> 61

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61 <210> 62

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

<210> 63

<211> 125

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63 <210> 64

<211> 123

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64

<210> 65

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(121)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:66

5 <400> 65

<210> 66

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(121)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:65

<400> 66 <210> 67

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(113)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:58 y SEQ ID NO:68

<400> 67

<210> 68

10 <211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(113)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:58 y SEQ ID NO:67

<400> 68

<210> 69 5 <211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS 10 <222> (1)..(121)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:56 y SEQ ID NO:70

<400> 69 <210> 70 <211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(121)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:56 y SEQ ID NO:69

<400> 70 <210> 71

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(113)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:59 y SEQ ID NO:72

<400> 71 <210> 72

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS MISCELÁNEAS

<222> (1)..(113)

<223> Idéntica a SEQ ID NO:59 y SEQ ID NO:71

<400> 72 <210> 73

<211> 642

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 73

<210> 74

<211> 660

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 74 <210> 75

<211> 660

<212> . ADN

<213> Homo sapiens

<400> 75

<210> 76

<211> 657

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 76

10 <210> 77

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

<210> 78

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78 <210> 79

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79 <210> 80

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80 <210> 81

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 81 <210> 82

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82 <210> 83

<211> 218

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 83 <210> 84

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 84 <210> 85

<211> 1347

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 85 <210> 86

<211> 1323

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 86 <210> 87

<211> 1323

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 87 <210> 88

<211> 1323

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 88 <210> 89

<211> 448

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 89

<210> 90

<211> 440

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 90

<210> 91

<211> 440

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 91

<210> 92

<211> 440

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 92

<210> 93

<211> 448

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 93

<210> 94

<211> 448

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 94

<210> 95

<211> 448

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 95

<210> 96

<211> 440

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 96

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un antígeno humano humanizado o una porción de enlazamiento a antígeno de los mismos que comprende una región en enlazamiento antígeno que es específico para una proteína diana c-Met, en donde el anticuerpo o la porción de enlazamiento a anticuerpo del mismo comprende los CDRs del VL y los dominios de:

(a)

anticuerpo 5091 de SEQ ID NOs. 34 y 66

(b)

anticuerpo 5097 de EQ ID NOs. 37 y 67;

(c)

Anticuerpo 5098 de SEQ ID NOs. 38 y 68; o

(d)

Anticuerpo 5185 de SEQ ID NOs. 53 y 71.
2.

El anticuerpo o porción de enlace al antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo la porción de enlace al antígeno del mismo inhibe el enlace de HGF a c-Met.
3.

El anticuerpo o porción de enlace al antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, donde el anticuerpo o la porción de enlace a antígeno del mismo se enlaza a la proteína objetivo c-Met y activa o inhibe la fosforilación de c-Met.
4.

El anticuerpo aislado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, el cual es una IgG humana.
5.

El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 4, el cual es una IgG1, una IgG2, una IgG3 o una IgG4.
6.

El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la IgG4 es codificada por una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos respectivamente de SEQ ID NO: 85 y 89; o SEQ ID NO: 88 y 92; o SEQ ID NO: 87 y 91; o SEQ ID NO: 86 y 90, y variantes conservadoras de las mismas.
7.

Un anticuerpo humano humanizado aislado o una porción de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para uso como un medicamento.
8.

El anticuerpo aislado o la porción de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el cual es un fragmento de anticuerpo Fab o scFv.
9.

El anticuerpo aislado o porción de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18, el cual se enlaza a un epítopo conformacional.
10.

Una composición farmacéutica que comprende al -1 anticuerpo o una porción de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable del mismo.
11.

Un animal transgénico no humano que porta un gen que codifica un anticuerpo o una porción de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
12.

Un anticuerpo o una porción de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1-9 para uso en el tratamiento de cáncer o de una condición inflamatoria.
13.

Uso del anticuerpo o porción de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1-9, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer o una condición inflamatoria.
14.

El anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 12 o el uso de acuerdo con la reivindicación 13, donde el cáncer se selecciona The antibody according to claims 12 or the use according to claim 13, wherein the cancer is selected from the group consisting of brain cancer, stomach cancer, genital cancer, urinary cancer, del grupo consistente de cáncer de cerebro, cáncer de estómago, cáncer genital, cáncer urinario, cáncer de próstata, cáncer de vejiga (superficial e invasivo de los músculos), cáncer de seno, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer colo rectal, glioma (incluyendo glioblastoma, anaplastic astrocytoma, oligoastrocytoma, oligodendroglioma), cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, cáncer de hígado, carcinoma hepatocellular (HCC) incluyendo HCC infantil, cáncer de cabeza y cuello (incluyendo carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células de Hurthle, cáncer epitelial, cáncer de piel, melanoma incluyendo melanoma maligno, mesotelioma, linfoma, mieloma incluyendo mieloma múltiple, leucemias, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de células pulmonares no pequeñas (incluyendo todos los subtipos histológicos: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma broncoalveolar, carcinoma de células grandes, tipo mixto adenoescamosos), cáncer de células pulmonares pequeños, cáncer de ovarios, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer del riñón, cáncer renal incluyendo cáncer hereditario y esporádico de las células renales papilares, Tipo I y Tipo II, cáncer renal de las células claras; sarcomas, en particular osteosarcomas, sarcoma de las células claras, y sarcomas de los tejidos blandos (incluyendo rabdomiosarcomas alveolares y embrionales, sarcomas de partes alveolares blandas); carcinoma de tiroides (papilar y de otros subtipos).
15.

El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el cáncer se selecciona del grupo de cánceres que consisten de hígado, renal y esofágico.
16.

El anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 12 -15, para uso en combinación con un agente quimioterapéutico.
17.

El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el agente quimioterapéutico es un agente anti cáncer

agent.
18.

Un anticuerpo o porción de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para uso como una herramienta de diagnóstico.
19.

El anticuerpo o porción de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el anticuerpo

o una porción de enlace a antígeno del mismo comprende adicionalmente un marcador que es radioactivo, fluorescente, magnético, paramagnético, o quimioluminiscente.
20.

La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende adicionalmente un agente terapéutico adicional.
21.

La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo consistente de un agente anti cáncer; un antibiótico; un agente antiinflamatorio; un factor de crecimiento; y una citoquina.
22.

Un inmunoconjugado que comprende un primer componente que es un anticuerpo o una porción de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-9.
23.

El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende un segundo componente que tiene una segunda secuencia de aminoácidos.
24.

El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 23, donde la 2ª secuencia es una citotoxina.
25.

El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 23, donde la segunda secuencia es una proteína de enlace o anticuerpo que tiene una especificidad de enlace para un objetivo que es diferente de c-Met.
26.

El inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 -25, el cual es un anticuerpo biespecífico.
27.

Un kit que comprende un anticuerpo o una porción de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con 1-9, en donde el anticuerpo es una dosis unitaria y comprende adicionalmente instrucciones.
28.

El kit de acuerdo con la reivindicación 27, que comprende adicionalmente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables del mismo.
29.

El anticuerpo humano o humanizado aislado o porción de enlace a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de enlace a antígeno del mismo comprende los CDRs dominios VL y VH de: Anticuerpo 5091 de SEQ ID NOs. 34 y 66.
30.

El anticuerpo humano o humanizado aislado o porción de enlace a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de enlace a antígeno del mismo comprende los CDRs dominios VL y VH de: Anticuerpo 5097 de SEQ ID NOs. 37 y 67.
31.

El anticuerpo humano o humanizado aislado o porción de enlace a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de enlace a antígeno del mismo comprende los CDRs dominios VL y VH de: Anticuerpo 5098 de SEQ ID NOs. 38 y 68.
32.

El anticuerpo humano o humanizado aislado o porción de enlace a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de enlace a antígeno del mismo comprende los CDRs dominios VL y VH de: Anticuerpo 5185 de SEQ ID NOs. 53 y 71