CN101415730B - c-Met抗体的组合物和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了结合蛋白靶标c-Met，特别是结合位于c-Met细胞外结构域中的表位的抗体和片段，还提供了所述抗体的使用方法和试剂盒，以及用于治疗有害细胞，特别是与c-Met相关状况例如癌症、转移或炎症相关联的细胞的方法。

Description

c-Met抗体的组合物和使用方法
技术领域
本发明涉及包含特异性结合蛋白质靶标c-Met的抗体的组合物，制备这些抗体的方法，以及治疗增生性病症(例如癌症和转移)以及炎症的使用方法。
背景
肝细胞生长因子受体，本文称作c-Met，是一种受体酪氨酸激酶，其已经被证明在多种恶性肿瘤中过表达和/或突变，特别地，在多种实体期肿瘤中发现许多c-Met突变。c-Met配体，肝细胞生长因子(HGF)，也称作分散因子(SF)，以涉及肿瘤细胞入侵和转移的途径结合c-Met(Ma等，2003，Cancer and Metastasis Reviews.，22：309-325)。
HGF与c-Met的相互作用起始一连串细胞内事件(Derman等，1996，J Biol Chem23；271(8)：4251-4255)。HGF的结合导致c-Met内在酪氨酸激酶活性的激活和细胞内结构域上若干酪氨酸残基的自体磷酸化(Ma等，2003，Cancer and Metastasis Reviews.，22：309-325)。HGF/c-Met途径的激活导致广泛的细胞应答，包括细胞分散、血管发生、增殖、细胞运动性提高、侵入和转移。拮抗作用可以起抑制自体磷酸化和/或诱导表面c-Met的内在化和/或下调c-Met活性的作用。
肿瘤细胞可以侵入组织边界，降解和重构周围的细胞外基质，从而使得肿瘤细胞可以通过细胞外基质组织边界迁移，允许传播和形成转移。HGF/c-Met信号是介导正常和恶性侵入生长的途径。已经在多种癌症中鉴定出c-Met的错义突变，大多数突变位于激酶结构域中。突变体的特征是酪氨酸激酶活性提高，由此促进c-Met的生物学作用。
需要治疗癌症，癌症转移和炎症的组合物和方法，例如干扰HGF/c-Met信号途径的药剂，在所述信号途径中c-Met活性有助于侵入和/或转移。
发明概述
受体酪氨酸激酶c-Met涉及迁移、侵入和形态发生的过程，其伴随着胚胎发生和组织再生。若干条证据已经表明c-Met还在肿瘤发病中发挥作用。c-Met激酶结构域内种系突变的激活与遗传性乳突状肾细胞癌(PRCC)的发病相关联。虽然数量很少，但是在个别形式的PRCC中，头颈鳞状细胞癌中和在胃癌中也已经报道了激酶结构域内的突变。在多种临床相关肿瘤中以高频率观察到c-Met与其独特配体HGF/SF一起被提高的水平。表达增加与疾病进程、转移和患者死亡率之间的关联已经在若干种癌症中报道，包括膀胱、乳腺和胃癌、平滑肌肉瘤和成胶质细胞瘤。
本发明抗体以高亲和性特异性结合c-Met并调节疾病的c-Met作用。期望将拮抗c-Met水平或活性的抗体用于治疗增生性疾病或炎性疾病。据认为可以通过本发明抗体治疗的增生性疾病尤其包括癌症。期望将激活c-Met水平或活性的抗体用于器官再生、伤口愈合、组织再生等等。
本发明的实施方案提供选择性结合c-Met蛋白的抗体，或这种抗体的免疫活性部分或功能性抗体片段。在一个实施方案中所述抗体或这种抗体的免疫活性部分来自哺乳动物，其具有例如啮齿动物，人或骆驼科(camelid)动物的来源，或者是人源化抗体。在特定实施方案中，抗c-Met抗体的特征是具有对于靶蛋白c-Met特异性的抗原结合区，以及结合c-Met或其片段的抗体或其部分。所述抗体可以是多克隆或单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗体或这种抗体的免疫活性部分是单克隆抗体。本发明的其它实施方案包括例如功能性片段(例如抗原结合部分)，或在非传统或非免疫球蛋白结构或框架基础上提供的这种片段。
在另一个实施方案中，所述抗体或这种抗体的功能性片段以2.0×10-5M或更小，2.0×10-6M或更小，2.0×10-7M或更小，2.0×10-8M或更小，或2.0×10-9M或更小的KD结合靶蛋白c-Met。在相关实施方案中，所述抗体或这种抗体的功能性片段对于靶蛋白c-Met具有1.0×10-2每秒或较小，1.0×10-3每秒或较小，1×10-4每秒或较小，或1.0×10-5每秒或较小的解离速率(off rate)(Koff)。在相关实施方案中，所述抗体或这种抗体的功能性片段以2.0×10-5M或更小，2.0×10-6M或更小，2.0×10-7M或更小，2.0×10-8M或更小，或2.0×10-9M或更小的KD结合靶蛋白c-Met，并抑制HGF结合c-Met。在相关实施方案中，所述抗体或其功能性片段拮抗c-Met活性。
在某些实施方案中，所述抗体或这种抗体的功能性片段结合靶蛋白c-Met并调节，即激活(激动)或抑制(拮抗)c-Met活性，该活性包括但不限于磷酸化，特别是自体磷酸化。在某些实施方案中，c-Met磷酸化的激动或激活刺激器官再生、伤口愈合和组织再生活性中的至少一种。在相关实施方案中，所述器官是肾、肝、胰、肺、胃、肠、皮肤、胸腺或甲状腺。
在优选的实施方案中，本发明的抗体拮抗c-Met，其中拮抗作用导致选自下列的至少一种活性：细胞增殖的抑制，细胞迁移的抑制，细胞存活的抑制，转移的抑制和/或HGS结合的抑制或c-Met内在化作用的诱导。在大多数实施方案中，可以将本发明c-Met抗体拮抗剂用于治疗增生性疾病，特别是癌症或炎性疾病。
在相关实施方案中，通过一种或多种测定法来测定所述结合，所述测定法可以用来测量抗体拮抗性或激动性的活性。所述测定法测量抗体对c-Met配体的至少一种作用，其至少包括：c-Met信号转导途径酶活性的诱导；c-Met信号转导途径基因表达的诱导；基于电化学发光的直接结合c-Met；结合c-Met的酶联免疫吸附测定；以及细胞的增殖、存活、迁移或转移。通过与缺少HGF天然配体的对照相比较来测定抗体是否具有拮抗或激动作用。因而拮抗性抗体即使在HGF存在的情况下也阻抑c-Met诱导，而激动性抗体则在HGF缺失的情况下引发诱导。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的氨基酸和提供抗体的核苷酸序列以及选自SEQ ID NO：1-30、73-76和85-88的编码性分离核苷酸序列。在相关实施方案中，本发明提供分别由这些核苷酸序列编码的分离氨基酸序列，以及这些氨基酸序列的保守变体。在另一个相关实施方案中，SEQ ID NO：1-20中每一个分离的核苷酸序列都编码抗原结合轻链的氨基酸序列。在又一个相关实施方案中，SEQ ID NO：21-30中每一个分离的核苷酸序列都编码抗原结合重链的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供选自SEQ ID NO：31-72、77-84和89-96的分离氨基酸序列，以及这些序列的保守变体。在相关实施方案中，SEQ ID NO：31-54中每一个分离的氨基酸序列都包括抗原结合轻链。在另一个相关实施方案中，SEQ ID NO：55-72中每一个分离的氨基酸序列都包括抗原结合重链。
在某一实施方案中，本发明提供与SEQ ID NO：31-72、77-84和89-96具有至少50，60，70，80，90，95或99％的同一性的分离氨基酸序列。在相关实施方案中，本发明提供与SEQ ID NO：1-30，73-76和89-96中所述序列具有至少60，70，80，90，95或99％的同一性的分离核苷酸序列。
在又一个实施方案中，本发明提供这些抗体中任一个分离的抗原结合区或这些抗体中任一个功能性片段。因而在某些实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有由选自SEQ ID NO：1-20的核苷酸序列编码的轻链。在相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有由选自SEQ ID NO：21-30的核苷酸序列编码的重链。在另一个相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有由选自SEQ ID NO：1-20的核苷酸序列编码的轻链和由选自SEQ ID NO：21-34的核苷酸序列编码的重链。
在相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有选自SEQID NO：31-54的氨基酸序列的轻链。在另一个相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有选自SEQ ID NO：55-72的氨基酸序列的重链。在又一个相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有选自SEQ ID NO：31-54的氨基酸序列以及这些序列保守变体的轻链，和选自SEQ ID NO：55-72的氨基酸序列以及这些序列保守变体的重链。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有由SEQID NO：73的核苷酸序列编码的Igλ轻链。在相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有由选自SEQ ID NO：74-76的核苷酸序列编码的Igκ轻链。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有选自SEQ ID NO：77-80的氨基酸序列的Igλ轻链。在另一个相关实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有选自SEQ ID NO：81-84的氨基酸序列的Igκ轻链。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的人或人源化抗体或该抗体的功能性片段，所述抗体具有对于c-Met蛋白中发现的表位有特异性的抗原结合区，从而使得该抗体或功能性片段结合细胞上c-Met表面受体，并预防或改善癌症的发展或转移。在相关实施方案中，本发明提供分离的抗体或功能性片段，其具有对靶蛋白c-Met的表位有特异性的抗原结合区，所述表位包含c-Met细胞外结构域(ECD)的一个或多个氨基酸残基。在相关实施方案中，所述表位是构象表位。
在又一个实施方案中，如上所述的分离抗体或功能性片段是Fab或scFv抗体片段，或是骆驼科纳米抗体(nanobody)。在某些实施方案中所述Fab或scFv是单价的。抗体的单价性质特别适合用于设计拮抗c-Met蛋白的试剂。在某一实施方案中，任一种IgG抗体是IgG。在相关实施方案中，以上抗体中的任一种是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。在特定实施方案中，所述IgG是IgG4。在更加具体的实施方案中，所述IgG4由选自SEQ ID NO：85-88的核苷酸序列编码。在又一个相关实施方案中，所述IgG4由与选自SEQ ID NO：85-88的序列具有至少60，70，80，90，95或99％的同一性的核苷酸序列编码。在另一个相关实施方案中，所述IgG4具有选自SEQ ID NO：89-96的氨基酸序列以及这些序列的保守变体。或者，本文的抗c-Met抗体是IgA，IgD，IgE或IgM。
在另一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含以上抗体或功能性片段或这些抗体保守变体中的至少一种，以及其可药用载体或赋形剂。
在又一个实施方案中，本发明提供转基因动物或转基因细胞，其携带编码以上抗体或其功能性片段中的任一种的基因。
在某些实施方案中，本发明提供治疗c-Met相关病症或状况的方法，其包括向需要其的受试者施用有效量的以上药物组合物中的任一种。所述病症或状况是癌症或炎症。
在一个实施方案中，所述癌症是食道癌，乳腺癌，肾癌包括但不限于乳突状肾细胞癌、神经胶质瘤、头颈癌、上皮癌、肺癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑癌、胰腺癌，胃癌、胃肠癌、胃癌、结肠癌、肠癌、肝癌、生殖器癌症、泌尿器癌症、黑素瘤或***癌，以及本领域技术人员已知的其它肿瘤。在特定实施方案中，所述癌症是肝癌或食道癌，或是肉瘤。更加具体地，所述癌症选自脑癌、胃癌、生殖器癌症、泌尿器癌症、***癌、膀胱癌(浅表和肌肉侵入型)、乳腺癌、***、结肠癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤(包括成胶质细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突星形细胞瘤(oligoastrocytoma)、少突神经胶质细胞瘤)、食道癌、胃癌、胃肠癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)包括小儿HCC、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌、鼻咽癌)、胡尔特尔细胞癌、上皮癌、皮肤癌、黑素瘤包括恶性黑素瘤，间皮瘤，淋巴瘤，骨髓瘤包括多发性骨髓瘤、白血病、肺癌包括非小细胞肺癌(包括所有组织学亚型：腺癌、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、大细胞癌和腺鳞癌混合型)、小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、肾癌、肾细胞癌包括遗传性和偶发性乳突状肾细胞癌、I型和II型，以及透明细胞肾细胞癌；肉瘤，特别是骨肉瘤、透明细胞肉瘤和软组织肉瘤(包括肺泡状和胚胎性横纹肌肉瘤，肺泡状柔软部分肉瘤)；甲状腺癌(乳突状和其它亚型)。
在给定实施方案中，一种例示性炎症是由于感染造成的。在一个实施方案中，治疗方法将是阻抑病原体感染。在特定实施方案中，感染是细菌感染，包括例如李斯特菌属(Listeria)细菌的感染。参见例如Shen等，Cell，103：501-10，(2000)。并不意味着局限于作用机制，据认为细菌利用c-Met结合蛋白将其自身内在化。本发明抗体将会阻抑这种相互作用，由此阻止内在化作用。在另一个实施方案中，所述治疗刺激细胞应答，例如伤口愈合应答。
在某些实施方案中，以上方法的任一种都包括进一步施用化疗剂。在相关实施方案中，化疗剂是抗癌剂。在整篇申请中提供了具体的组合。
在相关实施方案中，以上方法的任一种都包括进一步施用途径特异性抑制剂。所述途径特异性抑制剂可以是化疗剂或者可以是生物制剂，例如抗体。途径特异性抑制剂包括但不限于EGFR、VEGFR等的抑制剂。
在又一个实施方案中，本发明提供处理有害细胞的方法，其包括将所述细胞与以上抗体或这些抗体的功能性片段中的任一种相接触。在相关实施方案中，所述细胞在细胞表面上具有c-Met。在另一个相关实施方案中，以上方法进一步包括用化疗剂或放射处理细胞。
在涉及若干种上述方法的实施方案中，在对受试者给药或接触细胞后，这些方法可以进一步包括观察癌症进行或转移的改善或延迟。
在又一个实施方案中，本发明提供鉴定具有c-Met表面受体的细胞的方法，该方法包括将细胞与以上抗体或功能性片段中的任一种相接触，从而使得所述抗体或功能性片段具有可检测的标记。例如，所述标记是放射性的、荧光的、磁性的、顺磁性的或化学发光的标记。相关实施方案中，以上方法进一步包括成像或分离细胞的步骤。例如分离细胞是从更大群细胞中分离出具有c-Met的细胞。
在另一个实施方案中，以上人或人源化抗体或抗体片段是合成的抗体，例如通过固相氨基酸合成仪生产的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包括以上抗体或这些抗体的功能性片段中的任一种和其它治疗剂。所述其它治疗剂选自抗癌剂；抗生素；消炎剂；生长因子和细胞因子。
本发明还涉及用药剂的组合来预防或治疗哺乳动物，特别是人的增生性疾病或疾病(如癌症)的方法，所述药剂的组合包括：
(a)本发明的c-Met拮抗剂；和
(b)一种或多种药学活性剂；
其中至少一种药学活性剂是抗癌治疗剂。
本发明还涉及药物组合物，其包含：
(a)c-Met抗体拮抗剂；
(b)药学活性剂；和
(c)可药用载体；
其中至少一种药学活性剂是抗癌治疗剂。
本发明还涉及商用包装件或产品，其包含：
(a)c-Met抗体拮抗剂的药物制剂；和
(b)同时、共同、单独或连续使用的药学活性剂的药物制剂；
其中至少一种药学活性剂是抗癌治疗剂。
在某一实施方案中，本发明提供分离的抗体，其具有第一氨基酸序列，其是重链例如SEQ ID NO：55-72或与选自SEQ ID NO：55-72的序列具有至少60，70，80，90，95或99％序列同一性的序列；和第二氨基酸序列，其是轻链例如SEQ ID NO：31-54，或与选自SEQ ID NO：31-54的序列具有至少60，70，80，90，95或99％序列同一性的序列。
在又一个实施方案中，本发明提供免疫缀合物，其具有为上述抗体或片段的第一组分，和为第二种氨基酸序列的第二组分。例如，所述免疫缀合物的第二种化合物是细胞毒素，或是对于不同于c-Met的靶标具有结合特异性的结合蛋白或抗体。例如，结合特异性不同于c-Met的靶标是肿瘤抗原或癌细胞表面上的肿瘤相关蛋白。在某些实施方案中，本发明提供任何以上抗体为双特异性的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供具有任何以上抗体或抗体片段的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒还包含其可药用载体或赋形剂。在其它相关实施方案中，试剂盒中的任何以上抗体都以单位剂量形式存在。在又一个相关实施方案中，该试剂盒包括用于向受试者施用任何以上抗体，或这些抗体的功能性片段，或针对研究用途或筛选的说明书。
预计拮抗c-Met活性的治疗剂对于广泛的临床相关肿瘤的治疗将具有有益效果。本发明中包括完全人抗体，其直接结合c-Met的细胞外结构域并阻抑与HGF/SF的相互作用。
附图简述
图1是本发明VH链的序列比对，进一步限定了每条链的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4区。
图2是本发明VLλ链的序列比对，进一步限定了每条链的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4区。
图3是本发明VLκ链的序列比对，进一步限定了每条链的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4区。
发明详述
本发明涉及分离的抗体，特别是具有人或人源化氨基酸序列的抗体，其特异性结合c-Met，特异性结合c-Met蛋白的细胞外部分并且其抑制c-Met的功能特性。在某些实施方案中，本发明的抗体源自特定重和轻链序列和/或包含特定的结构特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供分离的抗体，制备这些抗体的方法，检测这些抗体的测定法，包含这些抗体的免疫缀合物和双特异性分子，以及包含本发明的抗体、免疫缀合物或双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及利用所述抗体抑制，即拮抗c-Met功能的方法，以便抑制与细胞受体靶标c-Met的存在相关联的疾病或状况的发展，从而治疗增生性疾病，例如癌症或炎症。在不同的实施方案中本发明还涉及激活，即激动c-Met磷酸化作用的抗体，和使用激动性抗体的方法，所述抗体刺激例如器官再生、伤口愈合或组织再生。
在给定的实施方案中，炎症是感染。在一个实施方案中，治疗方法将会是阻抑病原体感染。在特定实施方案中，所述感染是细菌感染，包括例如李斯特菌属细菌的感染。
为了使得本发明可以被更加容易地理解，将某些术语定义为具有本文的意义，除非上下文另外说明。其它定义在整个详述中给出。
“c-Met多肽”或“c-Met受体”或“c-Met”指结合肝细胞生长因子的受体酪氨酸激酶。具体的实例包括例如由GenBank登录号NM_000245中提供的核苷酸序列编码的人多肽，或由GenBank登录号NP_000236中提供的多肽序列编码的人蛋白质或其细胞外结构域。原始的单链前体蛋白质在翻译后被剪切以产生α和β亚基，其通过二硫键连接以形成成熟受体。受体酪氨酸激酶c-Met参与细胞过程包括，例如伴随胚胎发生和组织再生的迁移、侵入和形态发生的过程。
短语“c-Met相关病症或状况”指任何源自c-Met的不利表达或缺乏表达，不利调控或缺乏调控，或有害活性或缺乏活性，或可以通过调节c-Met表达或活性来进行调节、治疗或治愈的疾病、病症或状况。例如在大部分癌症患者中，或在其疾病确实由与c-Met途径相关的变化驱动的患者中，可以预期HGF/c-Met途径的激活。例如上调可以归因于不同的机制，象HGF和/或c-Met的过表达，或通过c-Met突变的组成型激活。c-Met相关病症或状况包括但不限于，例如增生性疾病和紊乱和炎性疾病和紊乱。增生性疾病包括但不限于，例如癌症，其包括例如，胃癌、食道癌、乳腺癌、肾癌包括乳突状肾细胞癌、神经胶质瘤、头颈癌、上皮癌、肺癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑癌、胰腺癌、胃肠癌、胃癌、肠癌、结肠癌、肝癌、生殖器癌症、泌尿器癌症、黑素瘤、和***癌以及本领域技术人员已知的其它肿瘤。炎性疾病包括但不限于，例如细菌感染，包括例如由李斯特菌属细菌引起的感染。在本文和例如在Online MendelianInheritance in Man(“OMIM”)端口中描述了其它病症，例如，OMIN登录号164860的Met原癌基因和OMIM登录号142409的肝细胞生长因子/散布因子。其它实例对于本领域技术人员来说将是已知的，例如如Corso等，TRENDS in Mol.Med.，11(6)：2841(2005)和Christensen等，Cancer Letts.，225：1-26(2005)所综述的，将这两篇文献通过引用方式而合并入本文。
术语“免疫应答”是指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由这些细胞或由肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体的产生和/或分泌)的任何活性，其导致选择性结合、损伤、破坏或从人体中消除侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞，或者在自身免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。
“信号转导途径”指一般由蛋白质-蛋白质相互作用例如生长因子结合受体起始的生物化学因果关系，导致信号从细胞一部分传递到细胞的另一部分。通常，所述传递包括在引发信号转导的系列反应中一种或多种蛋白质上一个或多个酪氨酸，丝氨基或苏氨酸残基的特异性磷酸化作用。倒数第二个过程一般包括核事件，导致基因表达的改变。
“表面受体”包括例如能够接收信号并能够将这种信号穿过细胞质膜传递的分子和分子复合物。本发明细胞表面受体的一个实例是c-Met，生长因子蛋白分子，例如肝细胞生长因子(HGF)结合于其上。
术语“抗体”包括具有免疫球蛋白样结合功能的任何部分。该术语包括完整的抗体分子和任何抗原结合片段(即“抗原-结合部分”)或其单链，骆驼科抗体包括例如纳米抗体，噬菌体展示结合构建体等等。天然发生的抗体是糖蛋白，其包含至少两条通过二硫键互联的至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链由重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域：CH1，CH2和CH3组成。只有两种类型的轻链：λ和κ。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区还可以细分为高变区，称作互补决定区(CDR)，其与更加保守的区，称为构架区(FR)的区域一起交替散布。如在自然中所发现的，每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排布：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫***的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体***的第一组分(Clq)。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
术语抗体的“抗原结合部分”(或者简称为“抗原部分”)表示具有与抗原(例如c-Met的一部分)特异性结合能力的抗体的全长或一个或多个片段。业已显示，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体分子的片段实现。包含抗体的抗原结合部分的结合片段的实例包括Fab片段，其是由VL，VH，CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，其是包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；具有VH和CH1结构域的Fd片段；具有抗体链单个氨基酸序列的VL和VH结构域的Fv片段；具有VH结构域的dAb片段(Ward等，1989，Nature341；544-546)；和分离的互补决定区(CDR)。
关于包含抗原结合部分的抗体片段，可以包括分离的片段或缀合到化学或生物学部分上，或缀合到附于非传统免疫球蛋白衍生的框架或支架结构上的片段，所述框架或支架结构包括但不限于例如锚蛋白、粘连蛋白、结构域抗体、脂笼蛋白、小模块式免疫药物、maxybodies、纳米抗体、蛋白质A、affilin、γ-晶体蛋白和泛素，以及其它本领域技术人员已知和预料到的支架结构。
另外，尽管天然发生的抗体分子中存在具有Fv结构域VL和VH的两条链，VL和VH由分离的基因编码，但可以利用重组方法将其用一个合成接头连接起来，所述合成接头使其能够作为单一蛋白链重组表达，其中VL和VH区形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等，1988，Science242：423-426和Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.，85：5879-5883)。这样的单链抗体也包括在术语抗体的抗原结合部分内。利用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体或其其它片段相同的方式对所述片段筛选效用。
“分离的抗体”指基本上不含其它具有不同抗原特性的抗体的抗体(例如，特异性结合c-Met上一组氨基酸决定簇的分离抗体，基本上不含特异性和实质上结合c-Met之外抗原的抗体)。不过，特异性结合c-Met蛋白例如人c-Met的分离抗体与其它抗原具有交叉反应性，如来自其它物种的c-Met分子，或与人c-Met氨基酸序列具有高度同一性的蛋白质。另外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学品。
术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指抗体分子的制品，其全部共有单一分子组分。因而单克隆抗体组合物显示对特定表位单一的结合特性和亲和性。
本文所用的术语“多克隆抗体”指具有异质抗体群的抗体组合物。多克隆抗体通常源自经免疫动物或源自选定人的收集(pooled)的血清。
本文所用的术语“人抗体”意在包括具有可变区的抗体，其中至少一个并且一般是框架区和CDR区都源自人源的序列。另外，如果抗体包含恒定区，所述恒定区也源自这种人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变体。本发明人抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的突变如取代)。
术语“人单克隆抗体”是指展示单一结合特异性的抗体，这些抗体具有可变区，其中框架区和CDR区两者都源自人序列。在一实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤生产，该杂交瘤包括从转基因非人动物，例如转基因小鼠中获得的B细胞，该动物携带包括一般为人源的重链转基因和一般为人源的轻链转基因的基因组，其融合到一般为人源的永生化细胞中。
本文所用的术语“重组人抗体”，包括通过重组方法制备，表达，生成或分离的人抗体，如从转基因或转染色体(transchromosome)人免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠)或尤其制备的杂交瘤中分离的抗体，从经转化表达人抗体的宿主细胞，例如从转染瘤中分离的抗体，从重组的组合人抗体文库中分离的抗体和通过任何其它方法制备，表达，生成或分离的抗体，所述其它方法包括将一种或多种人免疫球蛋白基因序列的全部或一部分剪接到其它DNA序列上。这样的重组人抗体具有可变区，其中框架区和CDR区源自人种系免疫球蛋白序列。然而在某些实施方案中，可以对这样的重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列为转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，从而使得所述重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是尽管来源于人种系VH和VL序列并且与之相关，但可能并不天然存在于体内人抗体种系所有组成成分中的序列。
本文所用的，“同种型”指由重链恒定区基因提供的抗体类别(例如IgA、IgD、IgM、IgE或IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异性的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合抗原的抗体”相互换用。
本文所用的“特异性结合人c-Met”的抗体意在指以2.0×10-5M或更小，2.0×10-6M或更小，2.0×10-7M或更小，2.0×10-8M或更小或2.0×10-9M或更小的KD结合人c-Met的抗体。本文所用的术语“交叉反应性”指结合其它抗原表位的抗体或抗体群。这可由抗体的低抗体亲抗原性或者低特异性引起，或者由具有同一性或者非常相似表位的多个特殊抗原引起。当希望一般性结合相关组的抗原或如果当抗原表位序列在进化上不是高度保守而尝试跨物种标记时，交叉反应性某些时候是所需的。
“与人c-Met之外的抗原交叉反应”的抗体指以0.5×10-7M或更小，5×10-8M或更小或2×10-9M或更小的KD结合该抗原的抗体。“不与特定抗原交叉反应”的抗体意指如果能完全以1.5×10-8M或更大或5-10×10-7M或5×10-6M或更大的KD结合该抗原的抗体。在某些实施方案中，标准结合测试中，不与抗原交叉反应的抗体显示基本上与这些蛋白质不可检测的结合。
本文所用的“抑制结合c-Met”的抗体指抑制HGF/SF配体以10nM或更小，5nM或更小，1nM或更小，0.75nM或更小，0.5nM或更小或0.25nM或更小的Ki结合c-Met表面受体的抗体。
本文所用的“抑制c-Met信号转导活性”的抗体意指以小于10nM，5nM，2.5nM，1.0nM，0.5nM或更小的IC50抑制c-Met诱导的增生活性或其它诱导活性的抗体。
本文所用的术语“Kassoc”或“Ka”意指特定抗体-抗原相互作用的缔合比率，本文所用的术语“Kdis”或“KD”，意指特定抗体-抗原相互作用的解离比率。本文所用的术语“KD”意指获自Kd对Ka(即Kd/Ka)比率并表示为摩尔浓度(M)的解离常数。可以利用本领域公认的方法测定抗体的KD值。测定抗体的KD的方法是通过利用表面等离子体共振，或利用生物传感器***例如***。
本文所用的术语“激动剂抗体”或“激活性抗体”意指当添加至表达c-Met的细胞、组织或器官时，将一种或多种c-Met诱导的活性提高至少20％-40％的抗体。在一些实施方案中，所述抗体激活c-Met活性至少50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，100％或大于100％。在一些实施方案中，本发明激动剂抗体将c-Met的至少一种活性提高10倍。一般地，这种提高在缺乏生物学诱导剂HGF的情况下观察到。不过，在一些实施方案中，例如测定的对照中，激活性抗体在存在HGF的情况下添加。
本文所用的术语“亲和性”指在单一抗原性位点上抗体和称作“表位”的抗原部分之间相互作用的强度。在每一个抗原性位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力与抗原在抗体的多个原子位置或氨基酸残基原子上相互作用；一般地，这种相互作用的数目越大，抗体对抗原的亲和性就越强。
本文所用的术语“抗体亲抗原性”指抗体-抗原复合物的总体稳定性或强度的信息性测量。其由三种主要因素控制：抗体-表位亲和性；每种抗原和抗体的价；这些相互作用部分的结构排列或三维构型。最终这些因素限定抗体的特异性，即特定抗体结合精确抗原表位的可能性以及键的稳定性和持续时间。
为了获得具有较高抗体亲抗原性的探针，可以构建二聚体缀合物(偶联到FACS标记上的两分子抗体蛋白质或多肽)，从而使得低亲和性的相互作用(例如与种系抗体)更加容易通过FACS检测。另一种提高抗原结合的抗体亲抗原性方法包括生成c-Met抗体的任何本文所述构建体的二聚体或多聚体。这种多聚体可以通过单个模块之间的共价结合生成，例如通过模仿天然C-至-N-末端结合或通过模仿抗体二聚体，所述抗体二聚体通过其恒定区保持在一起。改造入Fc/Fc界面的键可以是共价的或非共价键。此外，可以将Fc之外的二聚或多聚部分用于构建抗-c-Met抗体杂合物，例如双功能性抗体，以生成这种更高级的结构。
本文所用对于IgG抗体的“高度亲和性”术语指对于靶抗原具有10-8M或更小，10-9M或更小或10-10M或更小的KD的抗体。不过，“高度亲和性”结合可以对其它抗体同种型而变化。例如对于IgM同种型的“高度亲和性”结合指具有10-7M或更小或10-8M或更小的KD的抗体。
本文所用术语“受试者”包括包括人的任何哺乳动物，或非人哺乳动物，或其它动物。
术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛和非哺乳类例如鸟类、两栖类、爬行动物等。
术语“优化的”指核苷酸序列已被改变以利用在生产细胞或生物中优选的密码子编码氨基酸序列，所述细胞一般为真核细胞，例如例如毕赤酵母(Pichia)的酵母细胞，哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞。对优化的核苷酸序列进行改造，完全或尽可能地保留由最初核苷酸序列，也称作“亲本”序列所编码的氨基酸序列。本文优化的核苷酸已经被改造成具有人细胞中优选的核苷酸序列密码子，不过这里还预想这些序列在其它真核细胞中优化表达。本文中由优化的核苷酸序列所编码的抗体的氨基酸序列也称为优化的。
在下面的小节中进一步详述本发明的各个方面。
评估抗体对于各物种c-Met结合能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹和RIA。合适的测定法对于本领域技术人员来说是已知的。参见例如，F.Ausubel等编著，2006，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。抗体的结合动力学(例如结合亲和性)也可以通过本领域已知的标准测定法来评定，例如通过Biacore分析。本文描述了评估抗体对于c-Met功能特性的作用(例如诱导受体的内在化作用、抑制生长因子结合c-Met、抑制c-Met自体磷酸化、抑制c-Met途径激活，由此预防或改善增殖或激酶测定)的测定法。
因此，抑制根据本领域已知和本文所述方法所测定的这些c-Met功能特性(例如生化、免疫化学、细胞、生理学或其它生物学活性等等)中的一种或多种的抗体相对于缺少抗体所观察(例如或者存在不相关特异性的对照抗体)到的涉及统计学上显著地拮抗或降低特定活性。抑制c-Met活性的抗体影响这种统计学上显著地降低测量参数的至少10％，至少50％，80％或90％，在某些实施方案中本发明抗体可以抑制大于95％，98％或99％的c-Met功能活性。一般地，在诱导事件，例如添加HGF之后测量活性的降低。
或者，“激动”根据本领域已知和本文所述方法所测定的这些c-Met功能特性(例如生化、免疫化学、细胞、生理学或其它生物学活性等等)中的一种或多种的抗体相对于缺少抗体所观察(例如或者存在不相关特异性的对照抗体)到的涉及统计学上显著地提高特定活性。刺激或激动c-Met活性的抗体影响这种统计学上显著地提高测量参数的至少10％，至少50％，80％或90％，在某些实施方案中本发明抗体可以激动大于95％，98％或99％或更大的c-Met功能活性。
重组抗体
本发明抗体是重组抗体，如实施例中所述进行分离和结构表征。抗体VH核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：21-30中。表C-E提供本发明不同抗体的VH核苷酸序列实例。抗体VL核苷酸序列分别显示于SEQ IDNO：1-20中。(表C-E提供本发明不同抗体的VL核苷酸序列实例)。抗体Igλ和κ轻链核苷酸序列显示于SEQ ID NO：73-76和表C-E中。抗体IgG4核苷酸序列显示于SEQ ID NO：85-88和表C-E中。本发明其它抗体包括已经被突变，但与上述序列具有至少60，70，80，90，95或99％同一性的核苷酸。
抗体VH氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：55-72和表A-B和E中。抗体VL氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：31-54和表A-B和E中。Igλ轻链氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：77-80和表A-B和E中。抗体Igκ轻链氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：81-84和表A-B和E中。抗体IgG4氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：89-96和表A-B和E中。本发明其它抗体包括已经被突变，但保留与上述序列至少60，70，80，90，95或99％同一性的氨基酸。
由于这些抗体每种都能够结合c-Met细胞外部分上的位点，所以可以将VH/VL(核苷酸序列和氨基酸序列)，VH/Igλ轻链(核苷酸序列和氨基酸序列)，和VH/Igκ轻链(核苷酸序列和氨基酸序列)“混合和匹配”以产生本发明抗c-Met结合分子的其它组合。可以利用上述和实施例中(例如ELISA)的结合测定法对这些抗体的c-Met结合进行测试。本发明抗体的VH，VL，Igλ轻链和Igκ轻链序列特别适于进行新的组合，因为这些抗体使用源自相同或相似种系序列的VH，VL，Igλ轻链和Igκ轻链序列，并且因而显示结构相似性。
因此，在一方面，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其至少具有：包含选自SEQ ID NO：55-72的氨基酸序列的重链可变区(VH)；含选自SEQ ID NO：31-54的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；其中所述抗体特异性结合c-Met。
重和轻链组合的实例至少包括：SEQ ID NO：65的VH和SEQ IDNO：32的VL；或SEQ ID NO：66的VH和SEQ ID NO：34的VL；或SEQ ID NO：67的VH和SEQ ID NO：37的VL；或SEQ ID NO：68的VH和SEQ ID NO：38的VL；或SEQ ID NO：69的VH和SEQ ID NO：51的VL；或SEQ ID NO：70的VH和SEQ ID NO：52的VL；或SEQ IDNO：71的VH和SEQ ID NO：53的VL；或SEQ ID NO：72的VH和SEQID NO：54的VL；或SEQ ID NO：55的VH和SEQ ID NO：31的VL；或SEQ ID NO：58的VH和SEQ ID NO：36的VL；或SEQ ID NO：61的VH和SEQ ID NO：41的VL；或SEQ ID NO：62的VH和SEQ IDNO：45的VL。表A-B举例说明了本发明不同抗体的VH和VL氨基酸序列的“混合和匹配”实例。图1-3是举例说明VH和VL氨基酸序列实例的表，举例说明了可以由替代结构提供的FR和CDR区，以提供具有与本文抗体相同或相似c-Met拮抗活性的构建体。
因此，在另一方面，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其至少具有：包含选自SEQ ID NO：55-72的氨基酸序列的VH区和包含选自SEQ ID NO：77-80的氨基酸序列的Igλ轻链，其中所述抗体特异性结合c-Met。
VH/Igλ轻链组合的实例至少包括：SEQ ID NO：66的VH和SEQ IDNO：77的Igλ轻链；或SEQ ID NO：65的VH和SEQ ID NO：78的Igλ轻链；或包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的VH区和SEQ ID NO：79的Igλ轻链；或SEQ ID NO：70的VH区和SEQ ID NO：80的Igλ轻链。
因此，在另一方面，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其至少具有：包含选自SEQ ID NO：55-72的氨基酸序列的VH区和包含选自SEQ ID NO：81-84的氨基酸序列的Igκ轻链，其中所述抗体特异性结合c-Met。
VH/Igκ轻链组合的实例至少包括：SEQ ID NO：71的VH区和SEQID NO：81的Igκ轻链；或SEQ ID NO：68的VH区和SEQ ID NO：82的Igκ轻链；或SEQ ID NO：67的VH区和SEQ ID NO：83的Igκ轻链；或SEQ ID NO：72的VH区和SEQ ID NO：84的Igκ轻链。
在另一方面，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其至少具有：包含选自SEQ ID NO：21-30的核苷酸序列的VH链和包含选自SEQID NO：1-20的核苷酸序列的VL链。
因而重和轻链组合的实例至少包括：包含SEQ ID NO：21的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO：24的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO：27的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO：28的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：15的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO：29的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：18的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO：30的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：20的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO：22的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO：23的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO：24的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO：24的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO：24的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO：24的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列的轻链可变区。参见表A-B举例说明了本发明不同抗体的VH和VL核苷酸序列的“混合和匹配”配对的实例，以便更具体的示例VH和VL核苷酸序列的配对。
在另一方面，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其至少具有：包含选自SEQ ID NO：21-30的核苷酸序列的VH链和包含选自SEQID NO：73的核苷酸序列的Igλ轻链。
因而VH/Igλ轻链组合的实例包括：包含SEQ ID NO：23的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：73的核苷酸序列的Igλ轻链。
在另一方面，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其至少具有：包含选自SEQ ID NO：21-30的核苷酸序列的VH链和包含选自SEQID NO：74-76的核苷酸序列的Igκ轻链。
因而VH和Igκ轻链组合的实例至少包括：包含SEQ ID NO：24的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：74的核苷酸序列的Igκ轻链可变区；或包含SEQ ID NO：25的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：75的核苷酸序列的Igκ轻链可变区；或包含SEQ ID NO：27的核苷酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：76的核苷酸序列的Igκ轻链可变区。
本文所用的人抗体包含重或轻链可变区，其是特定种系序列的“产物”或“源于”特定种系序列，条件是抗体的可变区获自使用人种系免疫球蛋白基因的***。这种***包括用目标抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或用目标抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。可以通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择与人抗体序列在序列上最接近(即最大的％同一性)的人种系免疫球蛋白序列，来鉴定是人种系免疫球蛋白序列的产物或源于人种系免疫球蛋白序列的人抗体。是特定人种系免疫球蛋白序列的产物或源于特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可能包含与种系序列相比有差异的氨基酸。这种差异归因于例如至少一个天然发生的体细胞突变或有意导入的定点突变。不过，选定的人抗体一般与人种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列在氨基酸序列上至少90％相同，并且包含这样的氨基酸残基，即当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如小鼠种系序列)比较时，所述氨基酸残基鉴定人抗体为人源的。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上可以与种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列具有至少60％，70％，80％，90％或至少95％或甚至至少96％，97％，98％或99％的同一性。一般，源自特定人种系序列的人抗体将会显示与人种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体将会显示与种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列不超过5个，甚至不超过4，3，2或1个氨基酸的差异。
同一性抗体
在又一个实施方案中，本发明抗体至少具有与本文所述抗体的氨基酸和核苷酸序列具有同一性或同一性的可变区重和轻链核苷酸序列，或可变区重和轻链氨基酸序列，或Igλ核苷酸序列，或Igλ氨基酸序列，或Igκ核苷酸序列，或Igκ氨基酸序列，或IgG4核苷酸序列，或IgG4氨基酸序列，其中所述抗体保留本发明抗c-Met抗体的所需功能特性，即显示亲本功能活性。所述亲本功能活性可以是拮抗性的或激动性的。在大多数实施方案中，所述活性是拮抗性的。
例如，本发明提供分离的重组抗体或其具有VH区和轻链可变区的抗原结合部分，从而所述VH区包含与选自SEQ ID NO：55-72的氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的氨基酸序列，轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：31-54的氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的氨基酸序列，其中所述抗体特异性结合c-Met并且所述抗体显示下列功能性拮抗特性中的至少一种：所述抗体诱导c-Met受体的内在化作用、所述抗体抑制蛋白质生长因子结合c-Met、所述抗体抑制c-Met的自体磷酸化，由此阻止c-Met途径的激活、所述抗体抑制源自信号转导的c-Met途径上调、或所述抗体抑制c-Met结合，由此预防或改善细胞增殖，存活，迁移，侵入或形态变化，尤其是预防或改善癌症，例如肿瘤生长和/或转移。
在备选的实施方案中，所述抗体是响应性的并且激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。在一个实施方案中，所述细胞应答是伤口愈合应答。
在另一个实施例中，本发明提供分离的重组抗体或其具有Igλ轻链的抗原结合部分，从而所述Igλ轻链包含与选自SEQ ID NO：77-80的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述抗体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示下列功能特性中的至少一种：所述抗体激活诱导c-Met受体的内在化作用、所述抗体抑制蛋白质生长因子结合c-Met，由此用这种抑制阻止受体的激活，例如阻止源自c-Met激活和/或信号转导的途径上调、或者所述抗体预防或改善细胞增殖，细胞存活，迁移，侵入或形态变化、或者所述抗体拮抗c-Met活性，由此预防或改善癌症，例如肿瘤生长和/或转移。
在备选的实施方案中，所述抗体激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组抗体或其具有Igκ轻链的抗原结合部分，其中所述Igκ轻链具有与选自SEQ ID NO：81-84的氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列；所述抗体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示以上和整个说明书中提供的功能特性中的至少一种。在备选的实施方案中，所述抗体激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是IgG4，从而IgG4具有与选自SEQ ID NO：89-96的氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列；所述抗体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示以上和整个说明书中提供的功能特性中的至少一种。在备选的实施方案中，所述抗体是激动性的，并且激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在多个实施方案中，所述抗体可以显示本文所讨论拮抗功能特性中的一种或更多种，两种或更多种，或三种或更多种。所述抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组抗体或其具有VH区和轻链可变区的抗原结合部分，从而VH区由与选自SEQ ID NO：21-30的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列所编码；轻链可变区由与选自SEQ ID NO：1-20的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列所编码；编码的抗体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示以上和整个说明书中提供的功能特性中的至少一种。在备选的实施方案中，所述抗体激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在又一个实施例中，本发明提供分离的重组抗体或其具有Igλ轻链的抗原结合部分，从而Igλ轻链由与选自SEQ ID NO：73的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列所编码；编码的抗体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示以上和整个说明书中提供的功能特性中的至少一种。在备选的实施方案中，所述抗体是激动性的并且激活c-Met磷酸化作用，刺激细胞应答。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组抗体或其具有Igκ轻链的抗原结合部分，其中Igκ轻链由与选自SEQ ID NO：74-76的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列所编码；所述抗体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示以上和整个说明书中提供的功能特性中的至少一种。在备选的实施方案中，所述抗体激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是IgG4，其中所述IgG4由与选自SEQ ID NO：85-88的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列所编码；编码的抗体特异性结合c-Met，并且所述抗体显示以上和整个说明书中提供的功能特性中的至少一种。在备选的实施方案中，所述抗体是激动性的并且激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在多个实施方案中，所述抗体可以显示本文所讨论的拮抗功能特性中的一种或更多种，两种或更多种，或三种。所述抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其它实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与以上给出的序列具有50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。具有分别与SEQ ID NO：31-72的VH和VL区具有高度(即80％或更大)同一性的VH和VL区的抗体，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)编码SEQ ID NO：31-72的核酸分子，随后利用本文所述功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，重链和/或轻链核苷酸序列的可变区可以与以上给出的序列具有60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。具有分别与SEQ ID NO：21-30的可变区重链和SEQ ID NO：1-20的可变区轻链具有高度(即80％或更大)同一性的可变区重链和轻链的抗体，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)包含SEQ ID NO：1-30的核酸分子，随后利用本文所述功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，Igλ轻链氨基酸序列可以与以上给出的序列具有50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。具有分别与SEQ ID NO：77-80的Igλ轻链具有高度(即80％或更大)同一性的Igλ轻链的抗体，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)编码SEQ ID NO：77-80的核酸分子，随后利用本文所述功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，Igλ轻链核苷酸序列可以与以上给出的序列具有60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。具有分别与SEQ ID NO：73的Igλ轻链具有高度(即80％或更大)同一性的Igλ轻链的抗体，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)包含SEQ ID NO：73的核酸分子，随后利用本文所述功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，Igκ轻链氨基酸序列可以与以上给出的序列具有50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。具有分别与SEQ ID NO：81-84的Igκ轻链具有高度(即80％或更大)同一性的Igκ轻链的抗体，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)编码SEQ ID NO：81-84的核酸分子，随后利用本文所述功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，Igκ轻链核苷酸序列可以与以上给出的序列具有60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。具有分别与SEQ ID NO：74-76的Igκ轻链具有高度(即80％或更大)同一性的Igκ轻链的抗体，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)包含SEQ ID NO：74-76的核酸分子，随后利用本文所述的功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即，上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，所述抗体是可以与以上给出的氨基酸序列具有50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的IgG4。分别与SEQ ID NO：89-96的IgG4组合物具有高度(即80％或更大)同一性的IgG4，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)编码SEQ ID NO：89-96的核酸分子，随后利用本文所述的功能测定法对编码的源于诱变而改变的抗体测试保留的功能(即，上面给出的功能)而获得。
在其它实施方案中，所述抗体是与以上给出的核苷酸序列具有60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的IgG4。分别与SEQ ID NO：85-88的IgG4具有高度(即80％或更大)同一性的IgG4，可以通过诱变(例如定点或PCR-介导的诱变)包含SEQ ID NO：85-88的核酸分子，随后利用本文所述的功能测定法对编码的改变的抗体测试保留的功能(即上面给出的功能)而获得。
本文所用的两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的百分比同一性等同于所述两种序列之间的百分比同一性，这些术语在本文中可以交换使用。两种序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置的数目/位置总数×100)，为了优化两种序列的比对，该函数应考虑需要引入的缺口数目以及每个缺口长度。两个序列之间的序列比较和百分比同一性测定可以利用数学运算法来完成，如下面非限制性实施例中所述的。
两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以利用并入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17，1988)来测定，并使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分为12以及缺口罚分为4的参数。此外，可以用已经并入到GCG软件包的GAP程序(可得自http://www.gcg.com)中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453，1970)算法，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵以及缺口权重为16、14、12、10、8、6、或4和长度权重为1、2、3、4、5或6，测定两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的百分同一性。
此外或备选地，本发明蛋白质序列还可以进一步用作“查询序列”，对公共数据库进行搜索，以便例如鉴定相关序列。这样的搜索可以用Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215：403-10的XBLAST程序(版本2.0)来进行。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序，分值＝50，字长＝3来进行，以获得与本发明抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得加入缺口的比对以供比较，可以如Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25(17)：3389-3402中所述，利用Gapped BLAST。当用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
根据已知技术可以测定允许核苷酸序列杂交到本文所示核苷酸序列上的条件。核苷酸的杂交在降低的严谨性，中等严谨性或甚至是严谨条件下进行。根据G+C％和多核苷酸的长度而定，示例性低严谨条件是37℃的包含35-40％甲酰胺与5×Denhardt氏溶液，0.5％SDS和1×SSPE的缓冲液。示例性中等严谨性条件是42℃的包含40-45％甲酰胺与5×Denhardt氏溶液，0.5％SDS和1×SSPE的缓冲液。示例性高度严谨性条件是42℃或更高的温度的包含50％甲酰胺与5×Denhardt氏溶液，0.5％SDS和1×SSPE的缓冲液。参见J.Sambrook等，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版)(Cold Spring Harbor Laboratory)。
在任何以上示例性严谨条件下的核苷酸序列杂交都是在溶液中进行并在滤膜上收集。或者在任何以上示例性严谨条件下的核苷酸序列杂交都是在凝胶中进行的，例如DNA印迹法。
具有保守性修饰的抗体
在某些实施方案中，本发明抗体具有包括选自SEQ ID NO：55-72的序列的VH区和包括选自SEQ ID NO：31-54的序列的轻链可变区，从而这些序列中的一种或多种具有基于本文所述抗体的特定氨基酸序列或其保守性修饰，并且所述抗体具有本发明抗c-Met抗体的所需功能特性。因此，本发明提供分离的抗体或其具有VH链和VL链的抗原结合部分，从而VH链具有选自SEQ ID NO：55-72的氨基酸序列及其保守性修饰，VL链具有选自SEQ ID NO：31-54的氨基酸序列及其保守性修饰；所述抗体特异性结合c-Met；并且所述抗体显示下列功能特性中的至少一种：所述抗体激活诱导c-Met受体的内在化作用，所述抗体抑制蛋白质生长因子结合c-Met，由此用这种抑制阻止受体的激活，例如阻止源自c-Met激活和/或信号转导的途径上调，或者所述抗体预防或改善细胞增殖，细胞存活，迁移，侵入或形态变化，或者所述抗体拮抗c-Met活性，由此预防或改善癌症例如肿瘤生长和/或转移。
在备选的实施方案中，所述抗体是激动性的并且激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在某些实施方案中，本发明抗体是具有选自SEQ ID NO：77-80的氨基酸序列的Igλ轻链，从而这些序列中的一种或多种具有源自本文所述抗体的氨基酸序列并具有保守性修饰的氨基酸序列，从而衍生的抗体保留本发明抗c-Met抗体的所需功能特性。因此，本发明提供分离的亲本抗体或其具有Igλ轻链的抗原结合部分，从而Igλ轻链具有选自SEQ ID NO：77-80的氨基酸序列及其保守修饰；所述抗体特异性结合c-Met；并且所述抗体显示本文所述的功能性拮抗特性中的至少一种。
在备选的实施方案中，所述抗体是激动性的并且激活刺激细胞应答的c Met磷酸化作用。
在其它实施方案中，本发明提供具有Igκ轻链的抗体，所述Igκ轻链具有选自SEQ ID NO：81-84的氨基酸序列，从而这些抗体中的一种或多种具有源自本文所述抗体的氨基酸序列并具有其保守性修饰，并且其中所述抗体显示本发明亲本抗c-Met抗体的功能特性。因此，本发明提供具有Igκ轻链的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，从而Igκ轻链具有选自SEQ ID NO：81-84的氨基酸序列及其保守性修饰形式；所述抗体特异性结合c-Met；并且所述抗体显示本文提供的功能特性中的至少一种。
在备选的实施方案中，所述抗体激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在其它实施方案中，本发明抗体是IgG4，其具有选自SEQ ID NO：89-96的氨基酸序列，其中这些序列中的一种或多种具有源自本文所述抗体亲本氨基酸序列的氨基酸序列或其保守性修饰，并且所述抗体显示本发明抗c-Met抗体的所需功能特性。因此，本发明提供分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是IgG4，其中：IgG4具有选自SEQ ID NO：89-96的氨基酸序列及其保守性修饰；所述抗体特异性结合c-Met；并且所述抗体显示本文所述功能性拮抗特性中的至少一种。
在备选的实施方案中，所述抗体是激动性的并且激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在多个实施方案中，所述抗体可以显示出上面讨论列出的拮抗功能特性中的一种或更多种，两种或更多种，或三种或更多种。这些抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
本文所用的术语“保守性序列修饰”意指这样的氨基酸修饰，其不会显著影响或改变包含所述氨基酸序列的抗体的结合特异性。这类保守性修饰包括本文所述的氨基酸取代，添加和缺失。通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR-介导的诱变，将修饰导入本发明抗体中。
保守性氨基酸取代用具有化学和物理学相似侧链的不同氨基酸残基来替代氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族是本领域已知的。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电核极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β分枝侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，本发明抗体CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其它氨基酸替代，并且可以利用本文所述的功能测定法对变化的抗体测试保留的功能。
抗体框架
可以采用许多种抗体/免疫球蛋白框架或支架结构，只要得到的多肽包括一种或多种结合区，其对于本文示例性序列的c-Met蛋白具有特异性。这类框架或支架结构包括人免疫球蛋白或其片段(例如本文其它处所披露的那些)的5种主要同种型，并包括其它动物物种的免疫球蛋白，其优选为人源化方面的。单一重链抗体例如在骆驼科动物中鉴定的那些在这一方面特别令人感兴趣。新的框架、支架结构和片段不断被本领域技术人员所发现和开发。
或者，可以采用已知的或未来的非免疫球蛋白框架和支架结构，只要其包含特异性针对c-Met蛋白的结合区。本文将这些化合物称作“包含c-Met-特异性结合区的多肽”。已知的非免疫球蛋白框架或支架结构包括Adnectins(纤连蛋白)(Compound Therapeutics，Inc.，Waltham，MA)，锚蛋白(Molecular Partners AG，Zurich，瑞士)，结构域抗体(Domantis，Ltd(Cambridge，MA)和Ablynx nv(Zwijnaarde，比利时))，脂笼蛋白(Anticalin)(Pieris Proteolab AG，Freising，德国)，小模块式免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.，Seattle，WA)，maxybodies(Avidia，Inc.(Mountain View，CA))，蛋白质A(Affibody AG，瑞典)和affilin(γ晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，Halle，德国)。
结合与本发明抗c-Met抗体相同表位的抗体
在另一个实施方案中，本发明提供抗体，其与本文提供的本发明各种抗c-Met抗体结合相同表位。在标准c-Met结合测定中，可以基于与本发明其它抗体交叉竞争的能力(例如以统计学上显著意义的结合的竞争性抑制)而鉴定这些另外的抗体。抑制抗体(已知具有结合人c-Met能力)结合的受试抗体的能力表明受试抗体可以与该抗体竞争。根据非限制性理论，这样的抗体可以与其所竞争的抗体结合人c-Met上相同或相关的(例如结构类似或空间接近)的表位。如实施例中所述可以制备和分离这类抗体。
骆驼科抗体
已经对由骆驼和单峰骆驼家族成员(双峰驼(Camelus bactrianus)和Calelus dromaderius)获得的抗体蛋白质进行了关于大小、结构复杂性和在人受试者中的抗原性表征，所述骆驼和单峰骆驼家族成员包括新大陆成员例如美洲驼(llama)物种(Lama paccos，大羊驼(Lama glama)和大羊驼(Lama vicugna))。在自然界中发现来自这种哺乳动物科的某些IgG抗体缺少轻链，因而具有与具有两条重链和两条轻链的典型四链结构明显不同的结构，所述四链结构是来自其它动物的抗体的特征。参见PCT/EP93/02214(1994年3月3日公开的WO94/04678)。
骆驼科抗体的区域，被鉴定为VHH的小的单一可变结构域，可以通过遗传工程改造来获得产生对靶标具有高度亲和性的小蛋白，导致一种低分子量抗体来源的蛋白质，称作“骆驼科纳米抗体”。见1998年6月2日发布的美国专利5,759,808；还见Stijlemans，B.等，2004，J Biol Chem，279：1256-1261；Dumoulin，M.等，2003，Nature，424：783-788；Pleschberger，M.等，2003，Bioconjugate Chem，14：440-448；Cortez-Retamozo，V.等，2002，Int J Cancer，89：456-62；和Lauwereys，M.等，1998，EMBOJ，17：3512-3520。骆驼科抗体和抗体片段经改造过的文库可以，例如从Ablynx，Ghent，Belgium商购。如本领域对于其它非人源抗体已知的，可以重组改变骆驼科抗体的氨基酸序列，以获得更加近似人序列的序列，即纳米抗体可以被人源化。因而骆驼科抗体对人的天然低抗原性可以再减弱。
骆驼科纳米抗体具有人IgG分子大约十分之一的分子量，并且所述蛋白只有几纳米的物理直径。小尺寸的一个结果是骆驼科纳米抗体结合对于较大抗体蛋白而言为功能上不可识别的抗原性位点的能力，即骆驼科纳米抗体可用作检测抗原的试剂，而所述抗原对于利用经典免疫技术而言是隐蔽的，骆驼科纳米抗体还可用作可能的治疗剂。小尺寸的又一个结果例如是骆驼科纳米抗体能够结合到靶蛋白凹槽或狭缝中特定位点而产生抑制性结果，因此能够形成这样的能力，其比经典高分子量抗体更近似地模仿经典低分子量药物的功能。
低分子量和紧凑的尺寸还导致骆驼科纳米抗体极端热稳定，对于极端pH稳定和对于蛋白水解消化稳定，并且具有低抗原性。另一个结果是骆驼科纳米抗体容易从循环***移入组织内，即外渗，甚至穿过血脑屏障并因而可以进行改造来治疗影响神经组织的病症。纳米抗体还可以促进药物转运穿过血脑屏障。参见公布于2004年8月19日的美国专利申请20040161738。这些特征结合对人的低抗原性表明极大的治疗潜力。另外，这些分子可以在原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)中完全表达，其作为与噬菌体的融合蛋白而表达，这样表达的蛋白质是功能性的。
因此，本发明一个特征是对靶蛋白c-Met具有高度亲和性的骆驼科抗体或纳米抗体。在本文某些实施方案中，骆驼科抗体或纳米抗体天然产生于骆驼科动物中，即利用本文对其它抗体所述的技术，在用靶蛋白c-Met或其肽片段免疫后由骆驼科动物产生，或在转基因骆驼科动物中重组产生。或者，对抗c-Met骆驼科纳米抗体进行改造，即，如本文实施例中所述以c-Met作为靶标，利用淘选方法例如由噬菌体文库通过选择来产生，所述噬菌体展示适当诱变的骆驼科纳米抗体蛋白。可以通过遗传工程来进一步定制改造的纳米抗体，以便在受体受试者体内具有45分钟到两周的半衰期。
经改造或修饰的抗体
可以利用具有一种或多种本文所示的VH和/或VL序列，Igλ轻链序列或Igκ轻链序列的抗体作为起始材料(即作为亲本序列)来制备本发明抗体，以改造衍生修饰的抗体，所述抗体是经修饰的抗体，与起始抗体相比其可以具有变化和改善的特征。可以通过在一个或两个可变区(即VH和/或VL)或只在Igλ轻链内，或只在Igκ轻链内，在一个或多个CDR区和/或在一个或多个框架区内修饰一个或多个残基来改造抗体。此外或备选地，可以通过修饰恒定区内的残基，例如改变抗体的效应子功能来改造抗体。
可以进行的一类可变区改造是CDR移植。抗体主要通过位于重和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，在各种抗体间CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更加多变。由于CDR序列负责大多数的抗体-抗原相互作用，有可能通过构建表达载体来表达模仿特定天然发生抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包括来自天然发生抗体的CDR序列，其移植到来自具有不同特性的不同抗体框架序列上(参见例如Riechmann，L.等，1998，Nature，332：323-327；Jones，P.等，1986，Nature，321：522-525；Queen，C.等，1989，Proc.Natl.Acad；参见U.S.A.86：10029-10033；授予winter的美国专利5,225,539，和授予Queen等的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
这类框架序列可以获自包括种系抗体基因序的公共DNA数据库或公开发表的参考文献。例如，人重和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(可从互联网获得，网址为www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，以及在Kabat，E.A.，等，1991，Sequence of Proteinof Immunological Interest，第5版，U.S.，Department of Health and humanServices，NIH出版号91-3242；Tomlinson，I.M.，等，1992，J.Mol.Biol.，227：776-798；和Cox，J.P.L.等，1994，Eur.J Immunol.，24：827-836中发现；每一篇的内容都通过引用的方式而合并入本文。已经发现在某些情况下诱变框架区内的残基对于保持或提高抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如，授予Queen等的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是VH和/或VL的CDR1，CDR2和/或CDR3区内氨基酸残基的突变，由此提高目标抗体的一种或多种结合特性(例如亲和性)，称作“亲和性突变”。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变来导入突变，通过本文所述的和在实施例中提供的体外或体内测定法来评估对于抗体结合或另一种目标功能特性的重要影响。可以引入保守性修饰(如上面讨论的)。突变可以是氨基酸取代，添加或缺失。一般CDR区内不超过一个，两个，三个，四个或五个残基被改变，尽管还可以预想另外的变化。
本发明经改造的抗体包括那些抗体，其中对VH和/或VL，和/或Igλ轻链，和/或Igκ轻链内的框架残基进行修饰，以便例如改善抗体的特性。一般进行这类框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”为相应种系序列的框架残基。更加具体地，已经进行过体细胞突变的抗体可以包含与该抗体源自的种系序列不同的框架残基。通过比较抗体框架序列与该抗体源自的种系序列可以鉴定这类残基。为了将框架区序列回复为其的种系构型，通过例如定点诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变回复突变为种系残基。这类回复突变的抗体也包括在本发明中。
另一种类型的框架修饰包括在框架区内，或甚至在一个或多个CDR区内突变一个或多个残基，以便除去T细胞表位，由此减弱抗体的潜在免疫原性。这种方法也称作“去免疫”并在Carr等的美国专利公开20030153043中作进一步描述。
除了在框架或CDR区内制作的修饰之外或备选地，可以对本发明抗体进行改造以便在Fc区内包括修饰，一般地以改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期，补体结合，Fc受体结合，和/或抗原依赖型细胞毒性。另外，可以对本发明抗体进行化学修饰(例如，可以将一个或多个化学部分附着在抗体上)或进行修饰以便改变其糖基化，再来改变抗体的一种或多种功能特性。下面进一步详述这些实施方案中的每一种。Fc区的残基编号是Kabat的EU索引的编号。
在一个实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰从而改变(例如提高或降低)铰链区中半胱氨酸残基的数目。在Bodmer等的美国专利5,677,425中对这一方法作进一步描述。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目，以便例如促进轻和重链的组装，或提高或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变以便降低抗体的生物学半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变导入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，从而使得抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白质A(SpA)结合。在Ward等的美国专利6,165,745中对这一方法作了进一步详述。
在另一个实施方案中，对抗体进行修饰以便提高其生物学半衰期。多种方法是可能的。例如，在授予Ward的美国专利6,277,375中所述，可以导入下列突变中的一种或多种：T252L、T254S、T256F。或者，如在Presta等的美国专利5,869,046和6,121,022中所述为了提高生物学半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体以便包含取自IgG的Fc区中CH2结构域的两个环内的补救(salvage)受体结合表位。
在又一个实施方案中，可以通过用不同氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以便改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基代替一个或多个氨基酸，从而使得抗体对效应子配体具有改变的亲和性但保留亲本抗体的抗原-结合能力。对于其亲和性改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。在Winter等的美国专利5,624,821和5,648,260中对这一方法作了进一步详述。
在另一个实施方案中，可以用不同的氨基酸残基代替选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸，从而使得抗体具有改变的C1q结合和/或减弱或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在Idusogie等的美国专利6,194,551中对这一方法作了进一步详述。
在另一个实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，由此改变抗体结合补体的能力。在Bodmer等的PCT公开文本WO94/29351中对这一方法作了进一步描述。
在又一个实施方案中，通过修饰一个或多个氨基酸而修饰Fc区，以便提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或来提高抗体对Fcγ受体的亲和性。在Presta的PCT公开文本WO00/42072中对这一方法作了进一步描述。另外，已经对人IgG1上对FcγRl，FcγRII，FcγRIII和FcRn的结合位点进行作图并已经描述了结合改善的变体(参见Shields，R.L.等，2001J.Biol.Chem.276：6591-6604)。具有这类经修饰Fc区的抗体在本文组合物的范围内。
在又一个实施方案中，对抗体糖基化进行修饰。例如，可以制备糖苷化(aglycoslated)的抗体(即缺少糖基化作用的抗体)。例如可以改变糖基化以提高抗体对c-Met靶抗原的亲和性。这种糖修饰可以通过例如改变抗体序列内糖基化作用的一个或多个位点来实现。例如可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致一个或多个可变区读码框内糖基化作用位点的消除，由此消除该位点上的糖基化作用。这种糖苷化作用(aglycosylation)可以提高抗体对抗原的亲和性。在Co等的美国专利5,714,350和6,350,861中对这种方法作了进一步详述。
此外或备选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有岩藻糖基残基数量减少的hypofucosylated抗体或具有等分GlcNac结构增多的抗体。已经证明这种改变的糖基化作用模式提高抗体的ADCC活性。这种糖修饰可以通过，例如在具有改变的糖基化作用酶学机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化作用机制的细胞已经在现有技术中描述并且可以用作宿主细胞，其中表达本发明重组抗体，由此产生具有改变的糖基化作用的抗体。例如，Hang等的EP 1,176,195描述了具有功能被破坏的FUT8基因的细胞系，所述FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，从而使得在这种细胞中表达的抗体显示hypofucosylation。Presta的PCT公开文本WO03/035835描述了CHO细胞系变体，Lecl3细胞，其将岩藻糖附着于Asn(297)-连接的糖上的能力减弱，也导致在该宿主细胞中所表达抗体的hypofucosylation(还参见Shields，R.L.等，2002，J.Biol.Chem.，277：26733-26740)。Umana等的PCT公开文本WO99/54342描述了这样的细胞系，其经改造来表达糖蛋白修饰型糖基转移酶(例如β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))，从而使得在经改造细胞系中表达的抗体显示增多的等分GlcNac结构，其导致抗体ADCC活性提高(还参见Umana等，1999，Nat.Biotech.，17：176-180)。
本发明所预期的抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体聚乙二醇化，例如以提高抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了对抗体聚乙二醇化，一般在一个或多个PEG基团共价连于抗体或抗体片段上的条件下将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。聚乙二醇化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水性聚合物)酰化反应或通过烷化反应来实施。本文所用的术语“聚乙二醇”意在包括已被用来衍生其它蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是糖苷化的抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的并且可以应用于本发明抗体。参见例如Nishimura等的EP 0154 316和Ishikawa等的EP 0 401 384。
改造抗体的方法
如上面所讨论的，具有本文所示VH，VL，Igλ轻链或Igκ轻链序列的抗c-Met抗体可以通过修饰VH和/或VL，和/或Igλ轻链，和/或Igκ轻链序列中的残基，或通过修饰连接其的恒定区而改造其它抗c-Met抗体。因而，本发明另一方面，本发明抗c-Met抗体的结构特征被用来生成结构上相关的抗c-Met抗体，其保留本发明亲本拮抗或激动性抗体的至少一种功能特性，例如结合人c-Met还有抑制c-Met的一种或多种功能特性(例如，诱导内在化作用、阻止激活、例如源自信号转导的上调、预防或改善细胞增殖，存活，迁移，侵入或形成变化、或者所述抗体抑制c-Met受体结合，预防或改善癌症，例如肿瘤生长和/或转移)，或在激动性的情况下，激活c-Met磷酸化作用以及刺激细胞应答，以及本文所提供的功能特性。
例如，如上所讨论的，可以将本发明抗体的一个或多个CDR区，或其突变与已知框架区和/或其它CDR重组组合以生成另外的，重组改造的本发明抗c-Met抗体。其它类型的修饰包括前节中所述的那些。改造方法用作亲本序列的起始材料是本文提供的一个或多个VH和/或VL序列或其一个或多个CDR区。为了生成改造的抗体，不必实际制备(即表达为蛋白质)具有本文提供的一个或多个VH和/或VL序列，或其一个或多个CDR区的抗体。而是，将包含在核苷酸或氨基酸序列中的信息用作本领域已知突变技术中的起始材料来生成源自起始序列的“二代”序列，随后制备“二代”核苷酸序列并表达为蛋白质。
因此，在某些实施方案中，本发明提供制备抗c-Met抗体的方法，所述抗体具有作为起始亲本材料的VH抗体序列和VL抗体序列，所述VH抗体序列具有选自SEQ ID NO：55-72的序列，所述VL抗体序列具有选自SEQ ID NO：31-54的序列。该方法包括改变VH和/或VL抗体亲本序列内至少一个氨基酸残基以生成至少一种经改变的抗体序列；和将所述经改变的抗体序列表达为蛋白质。
在其它实施方案中，本发明提供制备抗c-Met抗体的方法，该抗体包括具有选自SEQ ID NO：77-80的序列的Igλ轻链抗体序列，并改变Igλ轻链抗体序列内的至少一个氨基酸残基以生成至少一种经改变的抗体序列；和将所述经改变的抗体序列表达为蛋白质。
在相关实施方案中，本发明提供制备抗c-Met抗体的方法，该抗体包括具有选自SEQ ID NO：81-84的序列的Igκ轻链抗体序列，并改变Ig Igκ轻链抗体序列内至少一个氨基酸残基以生成至少一种经改变的抗体序列；和将所述经改变的抗体序列表达为蛋白质。
所述经改变的抗体可以显示本文所讨论的功能特性中的一种或更多种，两种或更多种，或三种或更多种。
可以利用本领域已有的和/或本文所述的标准测定法，例如在实施例中给出的那些(例如ELISA)，来评估所述经改变的抗体的功能特性。
在本发明改造抗体的方法的某些实施方案中，可以在全部或部分抗c-Met抗体编码序列上随机或选择性地导入突变，并且如本文所述可以表达得到的经修饰抗c-Met抗体并筛选结合活性和/或其它功能特性。突变方法已在现有技术中描述过。例如，Short的PCT公开文本WO02/092780描述了利用饱和诱变、合成性连接组装或其组合来生成和筛选抗体突变的方法。或者Lazar等的PCT公开文本WO03/074679描述了利用计算机筛选法来优化抗体的生理化学特性的方法。
本发明抗体
下面提供了本发明抗体的核苷酸和多肽序列。亲本或初筛抗体的氨基酸和核苷酸序列分别在表A和表C中提供。与亲本抗体相比亲和性修饰的抗体的氨基酸和核苷酸序列分别在表B和表D中提供。
表A：亲本抗c-MetFab抗体的重和轻链可变区氨基酸序列
 
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表B：亲和性提高的抗c-Met Fab抗体的重和轻链可变区氨基酸序列
 
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表C：亲本抗c-Met Fab抗体的重和轻链可变区核苷酸序列
 
04536VH：CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAATTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATCAATCCGTGGACTGGCAATACGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGGTTTTTTTTATTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
04536VL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGGCTTATGATTCTTCTATGCTTCGTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
04687VH：CAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGGTATCGATCCGTTTGGCACTGCGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGTTTATCAGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
04687VL：GATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATTATAATCATCCTCATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG
04541VH：CAGGTGCAATTGCAAGAAAGTGGTCCGGGCCTGGTGAAACCGGGCGAAACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTTTCCGGAGGTAGCATTTCTTCTTCTTCTTATTATTGGAATTGGATTCGCCAGGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATTGGCGAGATCTATTTTGGCTGGACCTATTATAATCCGAGCCTGAAAGGCCGGGTGACCATTAGCGTTGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGAAACTGAGCAGCGTGACGGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTTATGAGTTTCATGGTTATACTACTTTTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
04541VL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATAATATTGGTTCTTATTATGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATAATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGATTTTCCTTCTATTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
04537VH：CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGAAAGCCTGAAAATTAGCTGCAAAGGTTCCGGATATTCCTTTTCTAATTATTGGATTGGTTGGGTGCGCCAGATGCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATGGGCTTTATCTTTCCGGATACTAGCTATACCCGTTATTCTCCGAGCTTTCAGGGCCAGGTGACCATTAGCGCGGATAAAAGCATTAGCACCGCGTATCTTCAATGGAGCAGCCTGAAAGCGAGCGATACGGCCATGTATTATTGCGCGCGTGTTAAGCTTATTACTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
04537VL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTCTTCGTTCTTATTTTGTTTCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATGATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGCTTCTTGGGATACTCTTTCTGATGTTGAGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
04690VH：CAGGTGCAATTGCAACAGTCTGGTCCGGGCCTGGTGAAACCGAGCCAAACCCTGAGCCTGACCTGTGCGATTTCCGGAGATAGCGTGAGCTCTAATTCTGCTGCTTGGGGTTGGATTCGCCAGTCTCCTGGGCGTGGCCTCGAGTGGCTGGGCCGTATCTATTATCGTAGCAAGTGGGTTAACGATTATGCGGTGAGCGTGAAAAGCCGGATTACCATCAACCCGGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGCAACTGAACAGCGTGACCCCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCAGGGTGCTGTTTATCCTGGTCCTTATGGTTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
04690VL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATAAGCTTGGTTCTTATTTTGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATGATAATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTTTGGTATTTCTAATTTTTATGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
04682VH：GATATCGTGCTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGTGGCGCACCAGGTCAGCGTGTGACCATCTCGTGTAGCGGCAGCAGCAGCAACATTGGTTCTAATTATGTGATTTGGTACCAGCAGTTGCCCGGGACGGCGCCGAAACTTCTGATTTATGATGATACTAATCGTCCCTCAGGCGTGCCGGATCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCACCAGCGCGAGCCTTGCGATTACGGGCCTGCAAAGCGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCTCTACTTATGATAATTATCAGGCTGGTTGGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
 
04682VL：CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGAAAGCCTGAAAATTAGCTGCAAAGGTTCCGGATATTCCTTTACTAATTATGGTATTGCTTGGGTGCGCCAGATGCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATCTATCCGTCTGATAGCTATACCAATTATTCTCCGAGCTTTCAGGGCCAGGTGACCATTAGCGCGGATAAAAGCATTAGCACCGCGTATCTTCAATGGAGCAGCCTGAAAGCGAGCGATACGGCCATGTATTATTGCGCGCGTATGTCTTATGATTATCAGCATCAGGCTCCTTCTATGGATTCTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
表D：亲和性提高的抗c-Met Fab抗体的重和轻链可变区核苷酸序列
 
05078VH：CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAATTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATTGATCCTTGGAATGGTCAGACTAATTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTCACCATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGGTTTTTTTTATTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05078VL＝04536VLGATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGGCTTATGATTCTTCTATGCTTCGTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05079VH：CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAATTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGTTATTGATCCTTGGAATGGTATTACTAATTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTCACCATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGGTTTTTTTTATTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05079VL＝04536VLGATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGGCTTATGATTCTTCTATGCTTCGTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05087VH＝04536VHCAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAATTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATCAATCCGTGGACTGGCAATACGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGGTTTTTTTTATTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05087VL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGCTAATTATCATGATTCTTGGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05088VH＝04536VHCAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAATTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATCAATCCGTGGACTGGCAATACGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGGTTTTTTTTATTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05088VL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCG ACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGCTTCTGATTATACTTCTTGGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05091VH＝04536VHCAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAATTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATCAATCCGTGGACTGGCAATACGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGGTTTTTTTTATTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
 
05091VL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGCTCATTATCATGATATTTGGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05092VH＝04536VHCAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAATTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATCAATCCGTGGACTGGCAATACGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGGTTTTTTTTATTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05092VL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGGCTCATGATTCTCTTTATTCTCGTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05081VH：CAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGGTATTGATCCTATTATGGGTACTGAGTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGTTTATCAGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05081VL＝04687VLGATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATTATAATCATCCTCATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG
05082VH：CAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGAGATTGATCCTGTTATTGGTGAGACTGATTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGTTTATCAGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05082VL＝04687VLGATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATTATAATCATCCTCATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG
05097VH＝04687VHCAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGGTATCGATCCGTTTGGCACTGCGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGTTTATCAGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05097VL：GATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATGCTTTTGGTTGGACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG
05098VH＝04687VHCAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGGTATCGATCCGTTTGGCACTGCGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGTTTATCAGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05098VL：GATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCTTCAGTATTCTGATGAGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG
 
05100VH＝04687VHCAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGGTATCGATCCGTTTGGCACTGCGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGTTTATCAGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05100VL：GATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATGCTTATGAGCCTAATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG
05101VH＝04687VHCAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGGTATCGATCCGTTTGGCACTGCGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGTTTATCAGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05101VL：GATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCTTCAGTATGCTTTTTCTCCTTGGACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG
05093VH＝04541VHCAGGTGCAATTGCAAGAAAGTGGTCCGGGCCTGGTGAAACCGGGCGAAACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTTTCCGGAGGTAGCATTTCTTCTTCTTCTTATTATTGGAATTGGATTCGCCAGGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATTGGCGAGATCTATTTTGGCTGGACCTATTATAATCCGAGCCTGAAAGGCCGGGTGACCATTAGCGTTGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGAAACTGAGCAGCGTGACGGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTTATGAGTTTCATGGTTATACTACTTTTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05093VL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATAATATTGGTTCTTATTATGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATAATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGATTCTTATATTTTTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05094VH＝04541VHCAGGTGCAATTGCAAGAAAGTGGTCCGGGCCTGGTGAAACCGGGCGAAACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTTTCCGGAGGTAGCATTTCTTCTTCTTCTTATTATTGGAATTGGATTCGCCAGGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATTGGCGAGATCTATTTTGGCTGGACCTATTATAATCCGAGCCTGAAAGGCCGGGTGACCATTAGCGTTGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGAAACTGAGCAGCGTGACGGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTTATGAGTTTCATGGTTATACTACTTTTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05094VL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATAATATTGGTTCTTATTATGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATAATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCTCTACTTATGATGCTTTTACTTTTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05095VH＝04541VHCAGGTGCAATTGCAAGAAAGTGGTCCGGGCCTGGTGAAACCGGGCGAAACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTTTCCGGAGGTAGCATTTCTTCTTCTTCTTATTATTGGAATTGGATTCGCCAGGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATTGGCGAGATCTATTTTGGCTGGACCTATTATAATCCGAGCCTGAAAGGCCGGGTGACCATTAGCGTTGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGAAACTGAGCAGCGTGACGGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTTATGAGTTTCATGGTTATACTACTTTTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
0509SVL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATAATATTGGTTCTTATTATGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATAATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGATAAGTATGTTTTTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05102VH＝04537VHCAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGAAAGCCTGAAAATTAGCTGCAAAGGTTCCGGATATTCCTTTTCTAATTATTGGATTGGTTGGGTGCGCCAGATGCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATGGGCTTTATCTTTCCGGATACTAGCTATACCCGTTATTCTCCGAGCTTTCAGGGCCAGGTGACCATTAGCGCGGATAAAAGCATTAGCACCGCGTATCTTCAATGGAGCAGCCTGAAAGCGAGCGATACGGCCATGTATTATTGCGCGCGTGTTAAGCTTATTACTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
 
05102VL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTCTTCGTTCTTATTTTGTTTCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATGATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGCTTCTTGGGATCCTCCTTCTGCTTTTGAGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05105VH＝04537VHCAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGAAAGCCTGAAAATTAGCTGCAAAGGTTCCGGATATTCCTTTTCTAATTATTGGATTGGTTGGGTGCGCCAGATGCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATGGGCTTTATCTTTCCGGATACTAGCTATACCCGTTATTCTCCGAGCTTTCAGGGCCAGGTGACCATTAGCGCGGATAAAAGCATTAGCACCGCGTATCTTCAATGGAGCAGCCTGAAAGCGAGCGATACGGCCATGTATTATTGCGCGCGTGTTAAGCTTATTACTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05105VL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTCTTCGTTCTTATTTTGTTTCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATGATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGCTTCTTGGGATAATGATCATTTTGAGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05106VH＝04690VHCAGGTGCAATTGCAACAGTCTGGTCCGGGCCTGGTGAAACCGAGCCAAACCCTGAGCCTGACCTGTGCGATTTCCGGAGATAGCGTGAGCTCTAATTCTGCTGCTTGGGGTTGGATTCGCCAGTCTCCTGGGCGTGGCCTCGAGTGGCTGGGCCGTATCTATTATCGTAGCAAGTGGGTTAACGATTATGCGGTGAGCGTGAAAAGCCGGATTACCATCAACCCGGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGCAACTGAACAGCGTGACCCCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCAGGGTGCTGTTTATCCTGGTCCTTATGGTTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05106VL：GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATAAGCTTGGTTCTTATTTTGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATGATAATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGGTTCTTGGGCTTATCTTGGTGATGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05174VH＝05078VHCAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAATTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATTGATCCTTGGAATGGTCAGACTAATTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTCACCATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGGTTTTTTTTATTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05174VL＝05087VLGATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGCTAATTATCATGATTCTTGGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05184VH＝05078VHCAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAATTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATTGATCCTTGGAATGGTCAGACTAATTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTCACCATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGGTTTTTTTTATTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05184VL＝05091VLGATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGCTCATTATCATGATATTTGGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG
05185VH＝05081VHCAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGGTATTGATCCTATTATGGGTACTGAGTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGTTTATCAGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05185VL＝05100VLGATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATGCTTATGAGCCTAATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG
 
05186VH＝05081VHCAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGGTATTGATCCTATTATGGGTACTGAGTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGTTTATCAGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
05186VL＝05101VLGATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCTTCAGTATGCTTTTTCTCCTTGGACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG
包括在本发明范围内的其它相关核苷酸序列为具有例如摆动碱基改变、优化的密码子使用、用于宿主表达的优化序列(例如去除隐蔽剪接序列的修饰)和保守性突变的序列。包括在本发明范围内的其它相关多肽序列为具有例如保守性氨基酸改变、或包含额外氨基酸序列(例如6×His标签或其它标签或融合至第二种多肽序列)、或包含减弱对抗体治疗的免疫应答的残基改变、或其具有经修饰的FR1，FR2，FR3或FR4残基。FR和CDR区在图1-3中提供。在附图中提供了优选的CDR序列。
蛋白质激酶依赖型疾病是特别的增生性疾病，优选是良性或特别是恶性肿瘤，更优选是脑癌，肾癌，肝癌，肾上腺癌，膀胱癌，乳腺癌，胃癌(特别是胃肿瘤)，卵巢癌，结肠癌，直肠癌，***癌，胰腺癌，肺癌，***癌，甲状腺癌，肉瘤，成胶质细胞瘤，多发性骨髓瘤或胃肠癌(特别是结肠癌或结肠直肠腺瘤)，或头颈肿瘤，表皮过度增生(特别是牛皮癣)，***增生，瘤形成(特别是上皮特征的，优选乳腺癌)，或白血病(特别是涉及c-Met的)。其能够带来肿瘤的衰退并防止肿瘤转移的形成以及转移(也是微小转移)的生长。此外其能够用于表皮过度增生(例如牛皮癣)，***增生，用于瘤形成治疗(特别是上皮特性的瘤形成，例如乳腺癌)，以及用于白血病。可以使用本发明抗体治疗免疫***疾病，其涉及几种或，特别地单个酪氨酸蛋白激酶和/或(其它)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；另外，还可以使用本发明抗体治疗中枢或外周神经递***疾病，所述疾病涉及由至少一种酪氨酸蛋白激酶和/或(其它)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶引起的信号传递。
在某些实施方案中，所述抗体或这种抗体的功能性片段结合靶蛋白c-Met并调节(即激活或抑制)c-Met磷酸化作用。在某些实施方案中，c-Met磷酸化作用的激活刺激选自器官再生，伤口愈合和组织再生的至少一种活性。在相关实施方案中，所述器官是皮肤，肾，肝，胰，肺，肠，胸腺或甲状腺。在备选的实施方案中，抗c-Met的抗体将阻抑病原感染，特别是李斯特菌属细菌的感染或改善病原性疾病诸如疟疾(Carrolo等，NatureMed.，9：1363-1369，2003。
显示对c-Met有抑制作用的抗体可用于治疗结肠癌，包括转移(例如在肝中的转移)和非小细胞肺癌。抗c-Met抗体还可以用于治疗遗传性乳突状肾癌(Schmidt，L.等，Nat.Genet.，16，68-73，1997)和其它增生性疾病，其中c-MET由突变(Jeffers和Vande Woude.，Oncogene18，5120-5125，1999及其中的参考文献)或染色体重排(例如TPR-MET；Cooper等，Nature，311，29-33，1984；Park.等，Cell，45，895-904，1986)而过表达或组成型激活。本发明抗体拮抗剂尤其可用于治疗有害细胞，特别是与c-Met相关状况相关联的细胞，所述c-Met相关状况例如癌症，转移或炎症。例示性的癌症包括但不限于，例如食道癌、乳腺癌、肾癌(包括但不限于乳突状肾细胞癌)、神经胶质瘤、头颈癌、上皮癌、肺癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑癌、胰腺癌，胃癌、胃肠癌、胃癌、肠癌、结肠癌、肝癌、生殖器癌症、泌尿器癌症、黑素瘤和***癌。其它癌症和状况在本文中提供或是本领域已知的。
另外，显示对c-Met有拮抗性的抗体可以用于治疗膀胱癌(浅表和肌肉侵入型)、乳腺癌、***、结肠直肠癌、神经胶质瘤(包括成胶质细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤)、食道癌、胃癌、肝细胞癌(HCC)(包括小儿HCC)、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌、鼻咽癌)、胡尔特尔细胞癌、恶性黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、白血病，非小细胞肺癌(包括所有组织学亚型：腺癌、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、大细胞癌和腺鳞状混合型)、小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、肾细胞癌包括遗传型和偶发型乳突状肾细胞癌、I型和II型，以及透明细胞肾细胞癌；肉瘤，特别是骨肉瘤、透明细胞肉瘤和软组织肉瘤(包括肺泡状和胚胎性横纹肌肉瘤，肺泡状柔软部分肉瘤)；甲状腺癌(乳突状和其它亚型)。
在某些实施方案中，本发明提供治疗c-Met相关病症或状况的方法，其包括向需要其的受试者施用有效量的任何以上药物组合物。所述病症或状况是癌症或炎症。在另一个相关实施方案中，所述癌症是食道癌、乳腺癌、肾癌、头颈癌、上皮癌、肺癌，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑癌、胰腺癌，胃癌，结肠癌、肝癌、生殖器癌症、泌尿器癌症、黑素瘤或***癌。在特定实施方案中，所述癌症是肝癌或食道癌。
在某些实施方案中，任何以上方法都包括还施用化疗剂。在相关实施方案中，所述化疗剂是抗癌剂。
在又一个实施方案中，本发明提供治疗有害细胞的方法，其包括将所述细胞与以上抗体或这些抗体的功能性片段中的任一种相接触。在相关实施方案中，所述细胞具有c-Met受体。在另一个相关实施方案中，以上方法还包括用化疗剂或放射处理细胞。
在备选的实施方案中，例如在伤口愈合中，所述抗体是反应性的并且激活刺激细胞应答的c-Met磷酸化作用。
在另一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包括以上抗体或这些抗体的功能性片段中的任一种和其它治疗剂。所述其它治剂选自抗癌剂；抗生素；消炎剂；生长因子和细胞因子。
编码本发明抗体的核酸分子
本发明另一方面涉及编码本发明抗体的核酸分子。VH序列的实例显示于SEQ ID NO：21-30中。VL序列的实例显示于SEQ ID NO：1-20中。Igλ核苷酸序列的实例显示于SEQ ID NO：73中。Igκ核苷酸序列的实例显示于SEQ ID NO：74-76中。IgG4核苷酸序列的实例显示于SEQ ID NO：85-88。
本文提供的编码抗体的核酸可以存在于完整细胞中，细胞裂解物中，或可以是以部分纯化或基本纯的形式存在的核酸。当通过标准技术从其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白质)纯化时，核酸是分离的或表现为基本上纯的，所述标准技术包括碱/SDS处理，CsCl结合，柱层析，琼脂糖电泳和其它本领域公知的技术。参见，F.Ausubel等编著，2006，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing andWiley Interscience，New York。本发明核酸可以是例如DNA或RNA并且可以或不可以包含内含子序列。在一个实施方案中，所述核酸是cDNA分子。所述核酸可以存在于例如噬菌体展示载体的载体中或重组质粒载体中。
本发明核酸可以通过利用标准分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(如下面进一步描述的，例如由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于获自免疫球蛋白基因文库(例如利用噬菌体展示技术)的抗体，编码该抗体的核酸可以由该文库多个噬菌体克隆成员中回收。
一旦获得编码VH和VL片段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术对这些DNA片段再操作，例如通过将编码核苷酸连接入已知的载体中，将可变区基因转变为全长抗体链基因，Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段有效地连接至另一种DNA分子或编码另一种蛋白质的片段，所述另一种蛋白质例如抗体恒定区或柔韧性的接头。上下文中所用术语“有效地连接”，意指两条DNA片段以功能性方式连接，例如从而使得由两条DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内，或从而使得蛋白质在所需启动子的控制下表达。
通过将编码VH的DNA有效地连接至编码重链恒定区(CH1，CH2和CH3)的另一种DNA分子上，可以将分离的编码VH区的DNA转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat，E.A.等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)，并且包括这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。所述重链恒定区可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以有效地连接至只编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子上。
通过将编码VL的DNA有效地连接至编码轻链恒定区CL的另一种DNA分子上，可以将分离的编码VL区的DNA转变成全长轻链基因(以及转变成Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat，E.A.，等，1991，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)并且包括这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了生成scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段有效地连接至编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一个片段上，从而使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，VL和VH区由柔性接头连接(参见例如，Bird等，1988，Science，242：423-426；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，85：5879-5883；McCafferty等，1990，Nature，348：552-554)。
本发明单克隆抗体的生产
可以通过多种技术来生产单克隆抗体(mAb)，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，1975，Nature，256：495的标准体细胞杂交技术。可以采用许多生产单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒或致瘤转化。
制备杂交瘤的动物***是鼠***。小鼠体内产生杂交瘤的方法已充分建立。分离经免疫脾细胞并用于融合的免疫方案和技术是本领域已知的。融合部分(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列可以制备本发明嵌合或人源化抗体。由目标鼠杂交瘤可以获得编码重和轻链免疫球蛋白的DNA，并利用标准分子生物学技术改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如为了生成嵌合抗体，可以利用本领域已知方法将鼠可变区连接至人恒定区(参见例如授予Cabilly等的美国专利4,816,567)。为了生成人源化抗体，可以利用本领域已知方法将鼠CDR区***人框架区中(参见例如授予Winter的美国专利5,225,539，和授予Queen等的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
在某一实施方案中，本发明抗体是人单克隆抗体。这些直接抗c-Met的人单克隆抗体可以利用携带部分人免疫***而非小鼠***的转基因或转染色体小鼠来生成。这些转基因和转染色体小鼠分别包括本文称作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文总称为“人Ig小鼠”。
HuMAb小(Medarex，Inc.)包含人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，其编码未重排的人重(μ和γ)和K轻链免疫球蛋白序列，以及靶向的突变，其失活内源性μ和K链基因座(参见例如，Lonberg等，1994，Nature，368(6474)：856-859)。因此，该小鼠显示出表达减弱的小鼠IgM或K，并且在对免疫的应答中，导入的人重和轻链转基因进行转换和体突变以生成高亲和性人IgGK单克隆(Lonberg，N.等，1994同上；Lonberg，N.，1994，Handbook of Experimental Pharmacology，113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.，1995，Intern.Rev.Immunol.，13：65-93，和Harding，F.和Lonberg，N.，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.，764：536-546中综述)。HuMAb小鼠的制备和用途，以及由这种小鼠携带的基因组修饰在Taylor，L.等，1992，Nucleic Acids Research，20：6287-6295；Chen，J.等，1993，International Immunology，5：647-656；Tuaillon等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，94：3720-3724；Choi等，1993，Nature Genetics，4：117-123；Chen，J.等，1993，EMBO J.，12：821-830；Tuaillon等，1994，J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等，1994，International Immunology，579-591；和Fishwild，D.等，1996，Nature Biotechnology，14：845-851中进一步描述，特此将所有文献的全部内容通过引用的方式并入本文。还参见全部都授予Lonberg和Kay的美国专利5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429；授予Surani等的美国专利5,545,807；全部属于Lonberg和Kay的PCT公开WO92103918，WO93/12227，WO94/25585，WO97113852，WO98/24884和WO99/45962；和属于Korman等的PCT公开WO01/14424。
在另一个实施方案中，本发明人抗体的生产可以利用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠而得到(“培育”)，例如在携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠中得到的。这类小鼠，本文称作“KM小鼠”，在Ishida等的PCT公开WO02/43478中详述。
另外，备选的表达人免疫球蛋白基因的转基因动物***是本领域已有的并且能够用来培育本发明抗c-Met抗体。例如，可以使用称作Xeno小鼠(Abgenix，Inc.)的备选转基因***；这类小鼠在例如授予Kucherlapati等的美国专利5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。
另外，备选的表达人免疫球蛋白基因的转染色体动物***是本领域已有的并且能够用来培育本发明抗c-Met抗体。例如，可以使用称作“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；这类小鼠在Tomizuka等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，97：722-727中描述。另外，携带人重和轻链转染色体的牛已经在现有技术中描述(Kuroiwa等，2002，Nature Biotechnology，20：889-894)并且能够用来培育本发明抗c-Met抗体。
还可以利用筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备人抗体或人单克隆抗体。这种用来鉴定和克隆人抗体的噬菌体展示方法已在本领域确立。参见例如：授予Ladner等的美国专利5,223,409；5,403,484；和5,571,698；授予Dower等的美国专利5,427,908和5,580,717；授予McCafferty等的美国专利5,969,108和6,172,197等；和授予Griffiths等的美国专利5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
还可以利用SCID小鼠来制备本发明人单克隆抗体，已经向所述SCID小鼠体内重构入人免疫细胞，从而使得在免疫后能够产生人抗体应答。这类小鼠在例如授予Wilson等的美国专利5,476,996和5,698,767中描述。
抗c-Met的人单克隆抗体的生成
将在大肠杆菌中表达的纯化的重组细胞外人c-Met(R&D Systems，Minneapolis，MN)或缀合到钥孔血蓝蛋白(KLH)上的纯化重组人c-Met用作抗原。表达c-Met的其它来源也包括在本发明范围内，包括例如分离自表达***的c-Met，所述表达***例如杆状病毒，CHO细胞和本领域技术人员已知的其它表达***。
利用HuMab转基因小鼠的HCo7，HCo12和HCo17品系和转基因转染色体小鼠的KM品系来制备抗c-Met的完全人单克隆抗体，上述每种小鼠都表达人抗体基因。在这些小鼠品系的每一种中，可以如在Chen等，1993，EMBO J.12：811-820中所述纯合性破坏内源的小鼠κ轻链基因，并且可以如在PCT公开文本WO01109187的实施例1中所述纯合性破坏内源的小鼠重链基因。这些小鼠品系中的每一种都携带人κ轻链转基因，KCo5，如Fishwild等，1996，Nature Biotechnology，14：845-851中所述。HCo7品系携带HCo7人重链转基因，如在美国专利5,545,806；5,625,825和5,545,807中所述。HCo12品系携带HCo12人重链转基因，如在PCT公开文本WO01/09187的实施例2中所述。HCo17品系携带HCo17人重链转基因。KNM品系包含SC20转染色体，如在PCT公开文本WO02/43478中所述。
为了生成抗c-Met的完全人单克隆抗体，用大肠杆菌中表达的纯化重组c-Met细胞外结构域或用c-Met-KLH缀合物作为抗原免疫HuMab小鼠和KM小鼠。对于HuMab小鼠一般性的免疫方案在Lonberg，N.等，1994，Nature368(6474)：856-859；Fishwild，D.等，1996，Nature Biotechnology，14：845-851和PCT公开文本WO98/24884中描述。在第一次灌注抗原时小鼠为6-16周龄。使用c-Met抗原的纯化的重组制品(5-50μg)(例如，由表达c-Met细胞外结构域的转染大肠杆菌细胞纯化的)通过腹膜内、皮下(Sc)或通过爪垫注射来免疫HuMab小鼠和KM小鼠。
通过腹膜内(IP)、皮下(Sc)或通过爪垫(FP)途径用完全Freund氏佐剂或Ribi佐剂配制的抗原对转基因小鼠免疫两次，接下来用不完全Freund氏佐剂或Ribi佐剂配制的抗原进行3-21天IP，Sc或FP免疫(总共至多11次免疫)。通过眼眶后放血来监测免疫应答。通过ELISA对血浆进行筛选，并将具有足够效价的抗c-Met人免疫球蛋白的小鼠用于融合。在处死和移除脾之前的3和2天，用抗原静脉内对小鼠进行加强。一般，对于每种抗原进行10-35个融合。每种抗原免疫数十只小鼠。用c-Met免疫82只HCo7，HCo12，HCo17小鼠和KM小鼠品系。
为了选择产生结合c-Met的抗体的HuMab或KM小鼠，可以通过如Fishwild，D.等，1996所述ELISA对来自免疫小鼠的血清进行测试。简言之，在示例性的方案中，用来自大肠杆菌的纯化重组c-Met包被微量滴定板，c-Met浓度为1-2μg/ml的PBS，50μl/孔，4℃过夜培育，随后用PBS/Tween(0.05％)配制的5％鸡血清以200μl/孔进行封闭。还可以使用其它备选的浓度和来源。向每孔中加入来自c-Met免疫的小鼠血浆稀释液，并于环境温度下培育1-2小时。用PBS/Tween洗涤板，随后将板与缀合了辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG Fc多克隆抗体一起于室温培育1小时。洗涤后，用ABTS底物(Sigma，A-1888，0.22mg/ml)对板进行显色并通过以波长λ为415-495nm的分光光度计进行分析。或者，其它类型的检测是可能的，并且可以由本领域技术人员提供。利用形成最高滴度抗c-Met抗体的小鼠来获得用于融合的细胞。进行融合并通过ELISA对杂交瘤上清液测试抗c-Met活性。.
基于利用PEG的标准方案将分离自HuMab小鼠和KM小鼠的小鼠脾细胞融合到小鼠骨髓瘤细胞系。随后对得到的杂交瘤筛选抗原特异性抗体的产生。用50％PEG(Sigma)将来自免疫小鼠脾淋巴细胞的单细胞悬浮液融合到其四分之一数目的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1581)。以大约1x105/孔将细胞铺于平底微量滴定板中，随后在选择性培养基中培育大约两周，所述选择性培养基包含10％胎牛血清，10％P388D1(ATCC，CRL TIB-63)条件培养基，DMEM中含3-5％
Figure G2007800120247D0056125136QIETU
(IGEN)集落因子(Mediatech，CRL10013，高葡萄糖，L-谷酰胺和丙酮酸钠)及5mM HEPES，0.055mM的2-巯基乙醇，50mg/l庆大霉素和1xHAT(Sigma，CRL P-7185)。1-2周后，将细胞培养在这样的培养基中，其中HAT用HT代替。随后通过ELISA对各个孔筛选人抗c-Met单克隆IgG抗体。一旦出现广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天后监测培养基。重新对分泌抗体的杂交瘤铺板，再次筛选，并且如果仍然对人IgG为阳性，则通过有限稀释将抗c-Met单克隆抗体亚克隆至少两次。随后体外培养稳定的亚克隆以便在组织培养基中产生少量的抗体以用作进一步表征。
人Ig小鼠的免疫
如Lonberg，N.等，1994，Nature，368(6474)：856-859；Fishwild，D.等，1996，Nature，Biotechnology14：845-851和PCT公开文本WO98124884和WO01/14424中所述，用c-Met抗原和/或重组c-Met或c-Met融合蛋白的纯化或富集的制品免疫人Ig小鼠，来培育本发明人抗体。在第一次灌注时小鼠为6-16周龄。例如使用c-Met抗原的纯化或重组制品(5-50μg)腹膜内免疫人Ig小鼠。
以上描述了生成抗c-Met的完全人单克隆抗体的详细过程。用各种抗原累积的经验显示当最初用完全Freund氏佐剂配制的抗原腹膜内(IP)免疫，随后用不完全Freund氏佐剂配制的抗原每隔一周IP免疫(总数高达6次)时，转基因小鼠产生应答。不过，发现Freund氏之外的佐剂也是有效的。此外，在不存在佐剂的情况下也发现完整细胞是高度免疫原性的。在免疫方案的进行中能够使用通过眼眶取血获得的血浆样品而监测免疫应答。血浆可以通过ELISA筛选，并且可以将具有足够滴度的抗c-Met人免疫球蛋白的小鼠用于进行融合。在处死和移除脾之前3天可以用抗原静脉内加强小鼠。预计对于每次免疫可能需要进行2-3次融合。在6-24只小鼠间对每种抗原进行一般免疫。通常使用HCo7和HCo12两种品系。此外，HCo7和HCo12两种转基因可以一起育种为具有两种不同人重链转基因的单一小鼠(HCo7/HCo12)。
生成产生人单克隆抗体的杂交瘤
为了生成本发明产生人单克隆抗体的杂交瘤，由免疫小鼠分离脾细胞和/或淋巴节细胞并融合至合适的永生化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。对所得到的杂交瘤筛选抗原特异性抗体的产生。例如通过50％的PEG使来自经免疫小鼠脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与其1/6数量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融合。在例示性实施方案中，将细胞铺在平底微量滴定板上，然后在选择培养基中培育2周，该培养基含有20％胎克隆血清，18％“653”条件培养基，5％(IGEN)，4mM L-谷胺酰胺，1mM丙酮酸钠，5mM HEPES，0.055mM2-巯基乙醇，50单位/毫升青霉素，50μg/ml链霉素，50μg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma；HAT在融合之后24小时添加)。大约两周之后，可以将细胞培养在HAT被HT替代的培养基中。然后可以通过ELISA筛选每一个孔中的人单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生了广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天之后对培养基进行分析。可以将分泌抗体的杂交瘤重新铺平板，再次筛选，并且如果仍然对人IgG呈阳性，可以通过有限稀释亚克隆单克隆抗体至少2次。然后在体外培养稳定的亚克隆，以便在组织培养基中制备少量用于进行表征的抗体。
为了纯化人单克隆抗体，所选择的杂交瘤在2L摇瓶中生长以用于单克隆抗体纯化。上清液过滤并浓缩后进行蛋白A-琼脂糖亲和层析(Pharmacia，Piscataway，NJ)。洗脱的IgG通过凝胶电泳和高效液相层析检查以确保纯度。缓冲溶液换成PBS，在OD280用1.43消光系数测定浓度。单克隆抗体分成等份并储存于-80℃。
生成产生单克隆抗体的转染瘤
还利用例如本领域公知的重组DNA技术与基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中生产本发明抗体(例如Morrison，S.(1985)Science229：1202)。
例如，为表达抗体或其抗体部分，可以通过标准分子生物学技术(例如，利用表达目标抗体的杂交瘤进行PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并将所述DNA***表达载体，使得所述基因有效地连接至转录和翻译调控序列。在本文中，术语“有效地连接”意指抗体基因连接至载体中，使得该载体内的转录和翻译调控序列发挥其调控该抗体基因转录和翻译的既定功能。选择该表达载体和表达调控序列使之与所用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因***单独的载体中，或更通常的是将这两个基因***同一表达载体中。通过标准方法(例如连接该抗体基因片段和载体上的互补限制位点、或如果没有限制位点存在就进行平端连接)将所述抗体基因***该表达载体。可以利用本文所述抗体的轻链和重链可变区来生成任何抗体同种型的全长抗体基因，其是通过将它们***已经编码所需要同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体，使得该VH区段有效地连接至该载体内的CH区段并使该VL区段有效地连接至该载体内的CL区段。另外或备选地，该重组表达载体可以编码便于该抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将该抗体链基因克隆入该载体，使得该信号肽在读码框内连接至该抗体链基因的氨基端。该信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除所述抗体链基因之外，本发明重组表达载体还携带调控所述抗体链基因在宿主细胞中表达的调控序列。术语“调控序列”意在包括启动子、增强子和调控所述抗体链基因转录或翻译的其它表达调控元件(例如多腺苷酸化信号)。这种调控序列例如描述于Goeddel(Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA1990)。本领域技术人员会理解该表达载体的设计，包括调控序列的选择可以取决于多种因素，例如欲转化宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括指导在哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴肾病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤的启动子和/或增强子。备选地，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或者P-珠蛋白启动子。另外，调控元件由来自不同来源的序列组成，例如SRa启动子***，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复(Takebe，Y.等，1988，Mol.Cell.Biol.，8：466-472)。
除了抗体链基因和调控序列之外，本发明重组表达载体还可以携带其它序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和可选择的标记基因。所述可选择的标记基因有利于选择已经导入载体的宿主细胞(参见例如Axel等的美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，一般地可选择的标记基因赋予已经导入载体的宿主细胞药物抗性，例如G418，潮霉素或氨甲蝶呤抗性。可选择的标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于以氨甲蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染入宿主细胞中。各种形式的术语“转染”意在包括通常用于将外源DNA导入原核生物宿主细胞或真核生物宿主细胞的各种各样的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。理论上在原核生物宿主细胞或真核生物宿主细胞中都可能表达本发明抗体。讨论了在真核细胞中，特别是在哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为这些真核生物细胞、尤其是哺乳动物细胞较原核生物细胞更可能装配和分泌适当折叠的免疫活性抗体。已经报道抗体基因的原核表达对于高产量活性抗体的生产是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.，1985，Immunology Today，6：12-13)
用于表达本发明重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin，1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，和例如在R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所描述的DHFR选择标记一起使用)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，对于使用NSO骨髓瘤细胞，另一种表达***是WO87/04462，WO89/01036和EP338,841中所示的GS基因表达***。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足够长时间，使抗体在宿主细胞中表达，或者所述抗体分泌入宿主细胞在其中生长的培养基中而生产抗体。利用标准蛋白纯化方法可从培养基中回收抗体。
免疫缀合物
在另一方面，本发明涉及缀合到治疗性部分例如细胞毒素，药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素上的抗c-Met抗体或其片段。这些缀合物本文称作“免疫缀合物”。包括一种或者多种细胞毒素的免疫缀合物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的(例如杀伤性)的任何试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-巯鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、脱落剂(ablating agent)(例如氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亚硝脲氮芥(BSNU)和洛莫司汀(CCNU))、环磷酰胺、白消胺、二溴甘露糖醇、链佐星、丝裂霉素C和顺铂(II)(DDP)顺铂、蒽环霉素类(例如柔红霉素(以前称之为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素(以前称之为actinomycin)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))、以及抗有丝***剂(例如长春新碱和长春碱)。
可以缀合到本发明抗体上的治疗性细胞毒素的其它例子包括duocarmycins，卡齐霉素，美登素和auristatins及其衍生物。卡齐霉素抗体缀合物的一个实例是可商购的(MylotargTm；Wyeth-Ayerst)。
利用本领域已有的连接技术可以将细胞毒素缀合到本发明抗体上。已经用来将细胞毒素缀合到抗体上的接头类型包括但不限于，腙，硫醚，酯，二硫化物和包含肽的接头。可以选择这样的接头，其例如对于溶酶体内通过低pH的剪切易感，或对蛋白酶剪切易感，所述蛋白酶例如优选在肿瘤组织中表达的蛋白酶，例如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。
对于细胞毒素类型、将治疗剂缀合到抗体上的接头和方法的讨论，还参见Saito，G.等，2003，Adv.Drug Deliv.Rev.，55：199-215；Trail，P.A.等，2003，Cancer Immunol.Immunother.，52：328-337；Payne，G.，2003，Cancer Cell，3：207-212；Allen，T.M.，2002，Nat.Rev.Cancer，2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.，2002，Curr.Opin.Investig.Drugs，3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.，2001，Adv.DrugDeliv.Rev.53：247-264。
本发明抗体还可以缀合到放射性同位素上以生成细胞毒性放射性药剂，也称作放射性免疫缀合物。可以缀合到抗体上用于诊断或治疗用途的放射性同位素的实例包括但不限于，碘131、铟111、钇90和镥177。制备放射性免疫缀合物的方法已在本领域确立的。放射性免疫缀合物的实例是可商购的，包括ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(CorixaPharmaceuticals)，并且可以利用类似方法用本发明抗体来制备放射性免疫缀合物。
本发明抗体缀合物可以用来改进给定的生物学应答，并且药物部分并不限于经典的化疗剂。例如，所述药物部分可以是具有所需生物学活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可以包括例如酶学活性的毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、篦麻毒蛋白A、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素或白喉(Diphtheria)毒素；蛋白质(例如肿瘤坏死因子或干扰素γ)；或生物学应答效应物，例如淋巴因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其它生长因子。
用来将这种治疗性部分缀合到抗体上的技术是公知的，参见例如，Amon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(编著)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery”，Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等人(编著)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：AReview”，Monoclonal Antibodies′84：Biological And ClinicalApplications，Pinchera等人(编著)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy，Baldwin等人(编著)，pp.303-16(Academic Press1985)，和Thorpe等人，“The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Inmunol.Rev.，62：119-58(1982)。
双特异性分子
在另一方面，本发明涉及包含本发明抗c-Met抗体或其片段的双特异性分子。本发明抗体或其抗原结合部分可以衍生或连接至另一个功能性分子(例如另一种肽或蛋白质，例如受体的另一种抗体或配体)以生成结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。事实上本发明抗体可以衍生或连接至一个以上其它功能性分子上以生成多特异性分子，其结合超过两个不同的结合位点和/或靶分子；这种多特异性分子也将包括在本文所用术语“双特异性分子”中。为了生成本发明双特异性分子，可以将本发明抗体功能性连接(例如，通过化学偶联，遗传融合，非共价关联或其它方式)至一个或多个其它结合分子上从而得到双特异性分子，所述其他结合分子例如是另一种抗体，抗体片段，肽或结合类似物。
在某些实施方案中，双特异性分子直接抗其它受体酪氨酸激酶，包括但不限于，例如cRon或EGFR或c-Met途径中的其它靶标。其它双特异性分子靶标包括被抗癌治疗剂，例如本文提供的那些所靶向的受体和配体。
因此，本发明包括双特异性分子，其至少包含一种针对c-Met的第一结合特异性部分和针对第二种靶表位的第二结合特异性部分。例如，第二种靶表位为Fc受体，例如人FcγRl(CD64)或人Fcα受体(CD89)。所以，本发明包括能够结合表达FcγR，FcαR或FcεR的效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN)，和表达c-Met的靶细胞的双特异性分子。这些双特异性分子将表达c-Met的细胞靶向至效应细胞并引发Fc受体介导的效应细胞活性，例如表达c-Met的细胞的噬菌作用，抗体依赖型细胞介导的细胞毒性(ADCC)，细胞因子释放，或超氧阴离子的生成。
此外，对于双特异性分子为多特异性的发明，除了抗Fc结合特异性部分和抗c-Met结合特异性部分之外，所述分子还可以包括第三结合特异性部分。例如，所述第三结合特异性部分可以是抗增强因子(EF)部分，例如结合涉及细胞毒活性的表面蛋白质分子，并由此提高针对靶细胞的免疫应答。“抗增强因子部分”可以是抗体，功能性抗体片段或结合给定分子，例如抗原或受体的配体，由此导致Fc受体或靶细胞抗原的结合决定子的作用增强。
“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶细胞抗原。或者抗增强因子部分可以结合这样的实体，其不同于第一和第二结合特异性部分所结合的实体。例如，抗增强因子部分可以结合细胞毒性T细胞(例如通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD44、ICAM-1或其它免疫细胞，其导致针对靶细胞的免疫应答提高)。
在一个实施方案中，本发明双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段(其包括例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv)作为结合特异性部分。所述抗体还可以是轻链或重链二聚体，或其最小片段，例如Ladner等美国专利4,946,778中所述的Fv或单链构建体，特此通过引用的方式将其内容并入本申请。
在一个实施方案中，Fcγ受体的结合特异性部分由单克隆抗体提供，其结合不被人免疫球蛋白G(IgG)所阻抑。本文所用的术语“IgG受体”指位于染色体1上的八个γ-链基因中的任何一个。这些基因编码总共十二条跨膜或可溶性受体同工型，其可分成三个Fγ受体类别：FcγRl(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在另一个实施方案中，Fcγ受体是人高亲和性FcγRI。人FcγRI是72kDa分子，并且具有对单聚IgG的高亲和性(108-109M-1)。
Fanger等在PCT公开文本WO88/00052和在美国专利4,954,617中描述了某些抗Fcγ单克隆抗体的生产和特征，将其教导全部通过引用方式而并入本申请。这些抗体在不同于受体Fcγ结合位点的位点上结合FcγRI，FcγRII或FcγRIII的表位，因而其的结合基本上不被IgG的生理水平所阻抑。可用于本发明的具体抗FcγRI抗体为mAb22，mAb32，mAb44，mAb62和mAb197。产生mAb32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心获得，ATCC登录号HB9469。在其它实施方案中，抗Fcγ受体抗体是人源化形式的单克隆抗体22(H22)。在Graziano，R.F.等，1995，J.Immunol155(10)：4996-5002和PCT公开文本WO94/10332中描述了H22抗体的生产和特征。产生H22抗体的细胞系保藏于美国典型培养物保藏中心，命名为HA022CL1，登录号CRL11177。
在又一个实施方案中，对于Fc受体的结合特异性部分由结合人IgA受体(例如Fc-α受体FcαRI(CD89))的抗体提供，其的结合不一定被人免疫球蛋白A(IgA)所阻抑。术语“IgA受体”意在包括位于染色体19上的一个基因(FcαRI)的基因产物。已知这种基因编码55到110kDa的几种可变剪接的跨膜同工型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞，嗜酸性细胞和嗜中性粒细胞上组成性表达，但在非效应细胞群上并非如此。FcαRI对于IgAl和IgA2都具有中间或中等亲和性(5×107M-1)，其在接触细胞因子例如G-CSF或GM-CSF后提高(Morton，H.C.等，1996，CriticalReviews in Immunology116：423-440)。已经描述过鉴定为A3，A59，A62和A77的四种FcαRI-特异性单克隆抗体，其在IgA配体结合结构域之外结合FcαRI(Monteiro，R.C.等，1992，J.Immunol.，148：1764)。
FcαRI和FcγRI是用在本发明双特异性分子中的触发受体，因为其主要在免疫效应细胞上表达，例如单核细胞，PMN，巨噬细胞和树突状细胞；以高水平表达(例如5,000-100,000/细胞)；是细胞毒活性的中介体(例如ADCC、噬菌作用)；介导靶向其抗原(包括自体抗原)的抗原呈递增加。
可以用在本发明双特异性分子中的其它抗体是鼠源，嵌合和人源化单克隆抗体。
利用本领域已知的方法，可以通过缀合组成性结合特异性部分，例如用抗FcR和抗c-Met结合特异性部分制备本发明双特异性分子。例如，可以分别生成双特异性分子的每种结合特异性部分并且随后彼此缀合。当结合特异性部分是蛋白质或肽时，可以利用多种偶联或交联剂进行共价缀合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5′-二硫化二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，和磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等，1984，J.Exp.Med.，160：1686；Liu，MA等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82：8648)。其它的方法包括在Paulus，1985，Behring Ins.Mitt.，No.78，118-132；Brennan等，1985，Science，229：81-83，和Glennie等，1987，J.Immunol.，139：2367-2375中所述的那些。缀合剂为SATA和磺基-SMCC，二者都可由Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。
通过两个重链C端铰链区的硫氢键接合抗体。在特定的实施方案中，该铰链区在连接前修饰成含有奇数的硫氢残基，例如一个。
可选择地，两个结合特异性部分的编码基因能够改造入同一个载体中并在同一个宿主细胞中例如作为融合蛋白进行表达和装配。当双特异性分子是mAb×mAb，mAb×Fab，Fab×F(ab’)2或配体×Fab融合蛋白时，本方法尤其有用。本发明双特异性分子可以是包含单链抗体和结合决定子的单链分子，或包含两个结合决定子的单链双特异性分子。双特异性分子可以至少包含两个单链分子。双特异性分子的制备方法，例如在美国专利5,260,203；美国专利5,455,030；美国专利4,881,175；美国专利5,132,405；美国专利5,091,513；美国专利5,476,786；美国专利5,013,653；美国专利5,258,498；和美国专利5,482,858中进行了描述。
双特异性分子与其特异性靶标的结合能通过，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定法确认。每种分析一般检测采用对目标复合物特异性的标记试剂(例如抗体)是否存在特定的目标蛋白质-抗体的复合物。例如FcR-抗体复合物能够采用例如酶联抗体或抗体片段进行检测，该抗体或抗体片段识别和特异性结合到抗体-FcR复合物上。备选地，复合物能够使用任意各种其他免疫测定法来检测。例如抗体能进行放射性标记并用于放射性免疫测定(RIA)(参见例如Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，March，1986，在此通过引用的方式合并入本申请)。放射性同位素能够通过例如γ计数器或闪烁计数器或放射自显影术的方法进行检测。
测定c-Met活性(激动性或拮抗性)的调节
测定抗c-Met抗体是否具有c-Met激动性或拮抗性活性。激动性是通过结合和激活c-Met来代替阳性效应子HGF的能力，例如在培养物中建立的细胞系上携带的或由人组织样品建立的原代细胞系上携带的人c-Met受体，或可以商购固定在测定板或珠上的纯化c-Met蛋白(R&D Systems#358MT)。激动性活性的度量是效应子(在本文中为抗体或抗体片段)产生对照HGF活性的50％(即EC50)的浓度。如通过标准免疫学技术例如ELISA、RIA或通过基于细胞的测定法(例如细胞散布，软琼脂生长和/或基质侵入测定(tubulomorphogenesis测定))所测定的，利用配体结合测定法可以测定EC50。如通过ELISA所测量的，优选EC50抑制性活性小于5μg/ml，小于1μg/ml，小于0.5μg/ml，小于0.1μg/ml，甚至优选小于50ng/ml。拮抗性是通过结合c-Met受体阻止与阳性效应子HGF相互作用并抑制其作用的能力，例如在培养物中建立的细胞系上携带的，或由人组织样品建立的原代细胞系上携带的人c-Met，或可以商购固定在测定板或珠上的纯化c-Met蛋白(R&D Systems#358MT)。拮抗性活性的度量是效应子(在本文中为抗体或抗体片段)抑制对照HGF活性的50％(即IC50)的浓度。如通过标准免疫学技术例如ELISA、RIA或通过基于细胞的测定法(例如细胞散布，软琼脂生长和/或基质侵入测定(tubulomorphogenesis测定))所测定的，利用配体结合测定法可以测定IC50。如通过ELISA所测量的，优选IC50抑制性活性小于5μg/ml，小于1μg/ml，小于0.5μg/ml，小于0.1μg/ml，甚至优选小于50ng/ml。
测定激动性或拮抗性抗c-Met抗体的c-Met磷酸化作用的调节
通过有或无HGF的刺激激活或抑制细胞中的c-Met磷酸化来测定本发明抗c-Met抗体的激动性或拮抗性。将例如A549细胞的细胞系细胞以3×104细胞每孔的密度在96孔平底组织培养物处理板(Costar，#3595)上接种于总体积100μl/孔DMEM中，所述DMEM添加了10％FBS。将板于37℃在含5％CO2的大气中培育24小时，其后由所述板的每个孔中轻柔地吸出培养基并加入100μl/孔体积的DMEM。将板于37℃在含5％CO2的大气中培育24小时，其后向孔中稀释于DMEM中的细胞加入待测的纯化抗体样品(100μl/孔的抗体或稀释液)。作为缺乏激活的阴性对照，向指定孔中加入不相关抗体(具有与c-Met表位决定簇不相关的已知特性)样品或缓冲液。
将细胞于37℃培育短时期(例如2小时)或更长的时期(例如24小时)。适当的时候，通过加入无血清DMEM培养基中最终浓度为200ng/孔的HGF来刺激细胞。一般来说，当测定抗体的激动性活性时，除了阳性对照(未用抗体处理)之外，测试样品抗体孔中都没有加入HGF。一般来说，当测定抗体的拮抗性活性时，样品抗体孔中包括HGF。将板再于37℃培育10min，随后从所述板的孔中轻柔地吸出培养基。用冷PBS洗涤细胞并从板中轻柔地吸出溶液。用50μl裂解缓冲液(NP-40裂解缓冲液：120mM NaCl，50mM Tris-HCl pH7.5，1％NP-40，1mM EDTA，6mMEGTA，20mM NaF，1mM苯甲脒，新添加0.5mM Na3VO4，和0.1mMPMSF)裂解细胞。在室温下将所述板摇晃15分钟，随后保存于-80℃，直到需要进行ELISA。
利用ELISA测定c-Met磷酸化水平。对于ELISA板的制备，用洗涤缓冲液(PBS-0.05％Tween Biorad#670-6531)将Nunc-ImmunoTM板，MaxiSorbTM表面(VWR International AG，N°391-8786)洗涤两次，并加入100μl含c-Met单克隆捕获抗体(DO-24)的PBS。将板于4℃培育过夜并用PBS-0.05％Tween洗涤三次。用200μl/孔含3％BSA的PBS-T于室温伴随摇晃将非特异性结合位点封闭2小时。除去封闭液后立即进行使用。
通过在室温下摇晃融解冷冻的细胞裂解物并向Nunc-Immuno板中加入40μl裂解物并将板在4℃下培育4小时。用PBS-T将板洗涤三次，并加入50μl/孔含0.2μg/ml抗磷酸酪氨酸抗体PY20-HRP(ZYMED，#03-7722)的3％牛血清白蛋白-PBS-T。将板在4℃下培育过夜并用PBS-T洗涤三次。吸出PBS-T并加入90μl/孔的碱性磷酸酶底物(CDR-Star，TROPIX，#MS100RY)并在轻柔地摇晃的同时于室温下显色45min。利用96孔板读取器读取所述板。
这些结果表明拮抗类的抗c-Met抗体成员有抑制HGF刺激c-Met磷酸化的能力。
用抗c-Met抗体的激动性和拮抗性克隆调节HGF诱导的增殖
在缺失HGF的情况下或用HGF刺激后，进行测定来测量抗c-Met抗体的拮抗性或激动性作用。将例如4MBr-5细胞系的细胞，以3×103细胞/孔的密度于96孔平底组织培养物处理板(Costar，#3610)中接种在总体积100μl/孔的添加了10％FBS的Ham′s F12K里。将所述板于37℃在含5％CO2的大气中培育2小时，其后添加50μl包含待测纯化抗体的培养基。作为缺少调节的阴性对照，向指定孔中添加不相关抗体(具有与c-Met表位决定簇不相关的已知特性)样品或缓冲液。将所述板于37℃在含5％CO2的大气中培育1小时，其后添加50μl单独的培养基或50μl包含HGF(例如大约0.5μg/μl到大约50ng/ml)的培养基。将所述板于37℃在含5％CO2的大气中培育72小时，其后利用细胞增殖ELISA，BrdU-测定(Roche)Cat No.1669915测定BrDU掺入。简言之，加入20μl/孔的BrdU溶液(#1)并将所述板于37℃在含5％CO2的大气中培育22小时。轻柔地去除培养基并将所述板于60℃干燥1小时。加入200μl FixDenat(溶液#2)并将所述板于室温伴随轻柔地摇晃培育30分钟。轻柔地去除溶液并加入100μl/孔的抗BrDU工作溶液。将所述板于室温伴随轻柔地摇晃培育90分钟。轻柔地去除溶液并用250μl洗涤溶液将孔洗涤三次。轻柔地去除溶液并于A405nm测量添加了100μl/孔底物溶液的板。
这些结果表明，在已经用拮抗性抗c-Met抗体克隆处理过的细胞中，由HGF刺激的表达c-Met的细胞的增生水平受到抑制。
用拮抗类抗c-Met抗体调节c-Met-依赖型细胞迁移
已知某些细胞系的细胞(例如表达c-Met的NCI-H441细胞)应答HGF浓度梯度而迁移。利用NCI-H441细胞进行测定，其中测量抗c-Met抗体调节通过穿孔膜(Boyden Chamber Assay)从低HGF浓度区到高HGF浓度区的迁移的能力。
利用QCMTM趋化性8μM96孔细胞迁移测定法来测定细胞迁移。因此，在测定前24小时用无菌PBS将细胞洗涤两次并在包含1％FBS的DMEM中于37℃在含5％CO2的大气中饥饿处理细胞。随后，将细胞用胰蛋白酶处理并在适当浓度的纯化抗体存在的情况下，以1.0×106细胞/mL于37℃进行重悬30min。作为缺乏调节的阴性对照，向指定孔中添加不相关抗体(具有与c-Met表位决定簇不相关的已知特性)样品或缓冲液。
在无菌条件下除去迁移室的盖子并向加样盘(较低的室)的孔中添加150μl无血清培养基，其包含50ng/mlHGF(R&D Cat No.294-HGN)。向上面室中轻柔地加入100μl用抗体预培育过的含5-10×104细胞的DMEM，所述DMEM含有1％FBS。盖上板并于37℃在4-6％CO2下培育16小时。根据生产商的说明书，弃去上面室中的细胞/培养基并将该室置入96-孔加样盘中，所述盘中已经加入了150μl/孔预温的细胞解离溶液。伴随着周期性的轻柔地搅动，通过于37℃培育30分钟来移动细胞。随后，向加样盘的每个孔中加入50μl预稀释的CyQuant GR染料。将所述盘于室温培育15分钟并将150μl混合物转移至新的适于使用480/520nm过滤装置进行荧光测量的96孔板中。
获得的数据显示一类拮抗性抗c-Met抗体克隆能够抑制c-Met激活的生物学后果，即抑制HGF刺激的NCI-H441细胞穿过微孔膜的迁移。
通过BIACORE TM 测定抗c-Met抗体的亲和常数K D
如上面对于拮抗性抗体所述的那样，按照生产商的方案，使用BIACORETM3000仪(Pharmacia Biosen sor AB，Uppsala，Sweden andPiscataway，N.J.)利用表面等离子体共振测定纯化抗体的结合亲和性。
用流式细胞术测定抗c-Met抗体的亲和性常数(K D )
如上面对于拮抗性抗体所述的那样，按照生产商的方案，使用BDTMBiosciences LSR流式细胞仪通过流式细胞术测定纯化抗体对于在人A549肺癌细胞和短尾猴(cynomolgus)肺细胞表面表达的c-Met的结合亲和性。
药物组合物
在另一方面，本发明提供组合物(例如药物组合物)，其包含本发明单克隆抗体或其抗原结合部分中的一种或组合及一同配制的可药用载体。这种组合物可以包括本发明抗体，或免疫缀合物或双特异性分子的一种或组合(例如两种或多种不同的上述组分)。例如，本发明药物组合物可以包含结合靶抗原上不同表位或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物或双特异性分子)。
本发明药物组合物还可以在联合治疗中施用，即联合其它药剂。例如所述联合治疗可以包括本发明抗c-Met抗体和至少一种其它抗癌或消炎剂。可以用于联合治疗中的治疗剂实例在下面关于本发明抗体用途的小节中更详细地描述。
本文所用“可药用载体”包括生理相容的任何和所有溶剂、分散剂、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。所述载体应当适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物(即抗体、免疫缀合物或双特异性分子)可以包被在一种材料中，以保护化合物不受可能失活该化合物的酸和其它自然条件的影响。
本发明药物化合物可以包括一种或多种可药用盐。“可药用盐”指不影响亲本化合物所期望的生物活性并且不添加任何不需要的毒理学作用的盐(参见Berge，S.M.等人，1977，J.Pharm.Sci.，66：1-19)。这些盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些从例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷等无毒无机酸以及例如脂肪族的单和二羧酸、苯取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族酸和芳香族磺酸等无毒有机酸衍生的盐。碱加成盐包括从如钠、钾、镁、钙等碱土金属，以及从例如N，N’-联苯乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二羟乙基胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒有机胺类衍生的盐。
本发明药物组合物还可以包括可药用抗氧化剂。可药用抗氧化剂的例子至少包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫酸钠等；脂溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)，丁化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可以用在本发明药物组合物中的合适水性和非水性载体包括水、乙醇、多元醇类(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其适当的混合物、植物油，(如橄榄油)、及可注射有机酯(如油酸乙酯)。可以通过例如使用包被物(如卵磷脂)，在分散液的情况中保持所需颗粒大小及使用表面活性剂来保持适当的流动性。
这些组合物还可以包含佐剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。预防微生物的出现可以通过同上文的灭菌程序，以及通过引入各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、酚山梨酸等)来确保。组合物中可能还需要包括等渗试剂(如糖、氯化钠等)。此外，可以通过加入延缓吸收的试剂如一硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
可药用载体包括无菌水溶液或分散液和无菌粉末，用于临时制备无菌可注射的溶液或分散液。将这种介质和试剂用于药物活性物质为本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，则可在本发明药物组合物中应用这些介质和试剂。补充的活性化合物也能掺入到组合物中。
治疗组合物通常在生产和储存条件下必须是无菌和稳定的。组合物可制成适合高药物浓度的溶液、微乳剂、脂质体或其他有序结构。载体可以是溶剂或分散媒介，其含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散液的情况下保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。在许多情况下，组合物中可以包括等渗剂(如糖)、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠之一。通过在组合物中加入延长吸收的物质如一硬脂酸盐和明胶而延长可注射组合物的吸收。
无菌注射溶液可以通过在合适溶剂中加入所需量的活性化合物和所需上述列举成分的一个或组合，接着进行无菌微量过滤来制备。一般地，分散液通过将活性化合物和所需如上面列举的其他成分掺入到无菌载体中而制备，该载体含有基本的分散介质。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末情况下，无菌粉末的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，该法从其先前无菌过滤过的溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
能与载体物质组合以产生单一剂量形式的活性成分的量视治疗中受试者和特定给药方式而发生变化。能与载体物质组合以产生单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。一般地，在其与可药用载体的组合中，按100％计，这个量范围是约0.01％到约99％的活性成分，约0.1％到约70％或约1％到约30％的活性成分。
调整剂量方案以提供最优的所需反应(例如治疗反应)。例如可以施用一次团注，可以随时间施用几次分开的剂量或可以根据治疗情况紧急情况所指示的将该剂量按比例减少或增加。为给药方便和剂量统一，以剂量单位形式配制胃肠外组合物非常有用。这里所用的剂量单位形式是指适于作为单位剂量用于在治疗的受试者的物理分离的单位；每个单位包含经计算可以产生所需治疗效果的预定量活性化合物和所需药物载体。本发明剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特征和所要达到的特定疗效，以及在这种活性化合物配药用于治疗个体敏感性的领域中所固有的限制而指定并直接依赖于其。
对于施用的抗体，剂量范围从大约0.0001到100mg/kg宿主体重，更常用0.01到5mg/kg宿主体重。例如剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或1-10mg/kg体重。例示性的治疗方案需要一周给药一次，每两周给药一次，每三周给药一次，每四周给药一次，一个月给药一次，每3个月给药一次或每3-6个月给药一次。本发明抗c-Met抗体的剂量方案包括静脉内给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，利用下列剂量方案中的一种来给予抗体：每四周六次剂量，随后每三个月；每三周；3mg/kg体重一次，随后每三周1mg/kg体重。
在一些方法中，同时给药具有相同或不同结合特异性的两种或多种抗体，在这种情况下，每种抗体给药的剂量落在所指定的范围内。抗体通常多次给药。单一剂量间时间间隔可以是，例如一周、一个月、三个月或一年。根据测量患者体内血液中针对靶抗原的抗体水平的提示，间隔时间也可以是不规律的。在一些方法中，调整剂量以使得血浆抗体浓度达到1-1000μg/ml，以及在一些方法中为约25-300μg/ml。
备选地，抗体能作为持续的释放制剂给药，在这种情况下，需要降低给药频率。剂量和频率视患者体内抗体半衰期而变化。一般人抗体表现最长的半衰期，接下来是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药的剂量和频率视处理是预防还是治疗而变化。在预防应用中，给药剂量相对低，给药间隔时间相对长。一些患者余生持续接受治疗。在治疗应用中，有时要求给药剂量相对高，给药间隔时间相对短，直到病情进行被减弱或终止，或直到患者表现出病症部分或完全改善。此后病人按照预防方案进行给药。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，从而获得可以有效达到特定病人所需治疗反应的活性成分量、组合物和给药方式，而对病人无毒。选定的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所使用的本发明特定组合物或其酯、盐或胺的活性，给药途径、给药时间、所使用特定化合物的排出速率、疗程、其它与所使用特定组合物联合使用的药物、化合物和/或物质、受治病人的年龄、性别、体重、状况、一般健康和以往病史等医学领域中熟知的因素。
“治疗有效量”的本发明抗c-Met抗体导致疾病症状严重程度降低，无疾病症状期的频率和持续时间增加，或预防由于疾病痛苦带来的损害或失能。疾病症状包括癌症的标准性诊断标准，例如原发肿瘤的阶段、大小，转移的数量和大小，或炎症程度。
本发明的组合物可以利用一种或多种本领域已知的方法，通过一种或多种给药途径进行给药。本领域技术人员将会理解，给药的途径和/或模式将取决于所需的结果。本发明抗体的给药途径包括静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其它胃肠外给药途径，例如通过注射或输注。本文所用的短语“胃肠外给药”意指除了肠和局部给药之外通常通过注射的给药模式，包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眼框内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，本发明抗体可以通过非胃肠外途径给药，例如局部、表皮或黏膜给药途径，例如鼻内、口服、***、直肠、舌下或局部给药。
可以用将保护化合物免于快速释放的载体制备活性化合物，例如控释制剂，包括植入物、经皮药膏和微囊递送***。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚甘醇酸(polyglycolicacid)，胶原蛋白，多正酯类(polyorthoesters)和聚乳酸。许多用于制备这些制剂的方法已申请专利或为本领域技术人员所公知。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
可以用本领域已知的医学装置来施用治疗性组合物。例如，在一个实施方案中，可以用无针皮下注射装置来施用本发明治疗性组合物，例如在美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。可用于本发明公知移植物和组件的实例至少包括：美国专利4,487,603，其公开了用于以控制速率分散药物的可移植的微输注泵；美国专利4,486,194，其公开了从皮肤给药的治疗装置；美国专利4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药物药物输注泵；美国专利4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可移植的可变流速输注装置；美国专利4,439,196，其公开了具有多室间隔间的渗透药物递送***，该***；和美国专利4,475,196号，其公开了渗透药物递送***。将这些专利并入本文作为参考。许多其他这些移植物、递送***和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，可以配制本发明抗体来确保体内适当的分布。例如血脑屏障(BBB)排斥许多高度亲水性化合物。为了确保在需要时本发明治疗性化合物穿过BBB，可以将其配制在例如脂质体中。关于生产脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。所述脂质体可以包含选择性运输到特定细胞或器官中的一个或多个部分，由此提高靶向药物的递送(参见例如，V.V.Ranade，1989J.Cline Pharmacol.29：685)。例示性的靶向性部分包括叶酸或生物素(参见例如，授予Low等的美国专利5,416,016)；mannosides(Umezawa等，1988，Biochem.Biophys.Res.Commun.，153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等，1995，FEBS Lett.，357：140；M.Owais等，1995，Antimicrob.Agents Chemother.，39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等，1995，Am.J.Physiol.，1233：134)；p120(Schreier等，1994，J.Biol.Chem.，269：9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen，1994，FEBS Lett.，346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler，1994，Immunomethods，4：273。
组合
本发明还涉及用药剂的组合预防或治疗哺乳动物，特别是人体增生性疾病或疾病如癌症的方法，所述药剂的组合包括：
(a)c-Met抗体拮抗剂组合物；和
(b)一种或多种药学活性剂。
本发明还涉及药物组合物，其包含：
(a)c-Met抗体拮抗剂组合物；
(b)药学活性剂；和
(c)可药用载体。
本发明还涉及商业包装件或产品，其包含：
(a)c-Met抗体拮抗剂组合物的药物制剂；和
(b)同时、共同、单独或连续使用的药学活性剂的药物制剂。
药学活性剂
术语“药学活性剂”是广义术语，其覆盖了具有不同作用机制的许多药学活性剂。这些中的一些与C-Met拮抗剂抗体/组合物的组合可以导致癌症治疗改善。一般地，根据作用机制来对药学活性剂进行分类。许多已有的药剂是各种肿瘤发展途径中的抗代谢剂，或与肿瘤细胞DNA反应。还有抑制酶(例如拓扑异构酶I和拓扑异构酶II)或是抗有丝***剂的药剂。
术语“药学活性剂”特别意指除了c-Met抗体拮抗剂组合物或其衍生物之外的药学活性剂。其包括但不限于：
i.芳化酶抑制剂；
ii.抗***，抗雄激素或促***释放素激动剂；
iii.拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂；
iv.微管激活剂，烷化剂，抗瘤抗代谢物或铂化合物；
v.靶向/降低蛋白质或脂质激酶活性或蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物，其它抗血管发生化合物或诱导细胞分化过程的化合物；
vi.单克隆抗体；
vii.环加氧酶抑制剂，二磷酸酯，乙酰肝素酶(heparanase)抑制剂，生物学应答修饰剂；
viii.Ras致癌同工型的抑制剂；
ix.端粒酶抑制剂；
x.蛋白酶抑制剂，基质金属蛋白酶抑制剂，甲硫氨酸氨肽酶抑制剂或蛋白酶体抑制剂；
xi.用于治疗血液学恶性肿瘤的药剂或靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物；
xii.HSP90抑制剂；
xiii.抗增生性抗体；
xiv.组蛋白去乙酰基酶(HDAC)抑制剂；
xv.靶向、降低或抑制丝氨酸/苏氨酸mTOR激酶活性/功能的化合物；
xvi.促生长素抑制素受体拮抗剂；
xvii.抗白血病化合物；
xviii.肿瘤细胞破坏方法；
xix.EDG结合剂；
xx.核糖核苷酸还原酶抑制剂；
xxi.S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂；
xxii.VEGF或VEGFR的单克隆抗体；
xxiii.光动力学疗法；
xxiv.制管张素类固醇；
xxv.包含皮质类固醇的植入物；
xxvi.AT1受体拮抗剂；和
xxvii.ACE抑制剂。
本文所用的术语“芳化酶抑制剂”，涉及抑制***产生的化合物，即抑制将底物雄甾烯二酮和睾丸甾酮分别转变为雌酮和***。该术语包括但不限于类固醇，特别是阿他美坦，依西美坦和福美司坦；特别是非类固醇类，尤其是氨鲁米特，roglethimide，吡鲁米特，曲洛司坦，睾内酯，ketokonazole，伏氯唑，法倔唑，阿那曲唑和来曲唑。商购的依西美坦为AROMASIN；福美司坦为LENTARON；法倔唑为AFEMA；阿那曲唑为ARIMIDEX；来曲唑为FEMARA或FEMAR；氨鲁米特为ORIMETEN。包含药学活性剂为芳化酶抑制剂的本发明组合特别可用于治疗激素受体阳性肿瘤，例如乳腺肿瘤。
本文所用的术语“抗***”，涉及在***受体水平上拮抗***作用的化合物。该术语包括但不限于，它莫西芬，氟维司群，雷洛昔芬和盐酸雷洛昔芬。它莫西芬能够以其购买形式施用，例如NOLVADEX；盐酸雷洛昔芬的购买形式为EVISTA。氟维司群可以如美国专利4,659,516中所公开的那样进行配制并且其市售商品为FASLODEX。包含药学活性剂为抗***的本发明组合特别可用于治疗***受体阳性肿瘤，例如乳腺肿瘤。
本文所用的术语“抗雄激素”，涉及能够抑制雄性激素生物学作用的任何物质，包括但不限于，比卡鲁胺(CASODEX)，其可以例如根据美国专利4,636,505所公开的进行配制。
本文所用的术语“促***释放素”，包括但不限于阿巴瑞克、戈舍瑞林和醋酸戈舍瑞林。戈舍瑞林在美国专利4,100,274中公开并且其市售商品为ZOLADEX。Abarelix可以例如，如在美国专利5,843,901中所公开的那样进行配制。
本文所用的术语“拓扑异构酶I抑制剂”，包括但不限于拓扑替康、gimatecan、伊立替康、camptothecian及其类似物、9-硝基喜树碱和大分子喜树碱缀合物PNU-166148(化合物A1，wO99/17804中)。伊立替康能够例如以其市售形式施用，例如商标为CAMPTOSAR。拓扑替康能够例如以其市售形式施用，例如商标为HYCAMTIN。
本文所用的术语“拓扑异构酶II抑制剂”，包括但不限于蒽环类，例如多柔比星(包括脂质体制剂，例如CAELYX)，柔红霉素(包括脂质体制剂，例如DAUNOSOME)，表柔比星、伊达比星和奈莫柔比星；蒽醌米托蒽醌和洛索蒽醌；以及鬼臼毒素(podophillotoxines)依托泊苷和替尼泊苷。依托泊苷的市售商品为ETOPOPHOS；替尼泊苷为VM26-BRISTOL；多柔比星为ADRIBLASTIN或ADRIAMYCIN；表柔比星为FARMORUBICIN；伊达比星为ZAVEDOS；而米托蒽醌为NOVANTRON。
本文所用的术语“微管活性剂”，涉及微管稳定剂，微管解聚剂和微管蛋白聚合抑制剂，包括，但不限于，紫杉类，例如紫杉醇和多西他赛；长春花生物碱，例如长春碱，特别是硫酸长春碱；长春新碱，特别是硫酸长春新碱和长春瑞滨；discodermolide；秋水仙素和其epothilonesand衍生物，例如埃坡霉素B或其衍生物。紫杉醇的市售商品为TAXOL；多西他赛为TAXOTERE；硫酸长春碱为VINBLASTIN R.P；而硫酸长春新碱为FARMISTIN。还包括一般形式的紫杉醇以及各种剂量形式的紫杉醇。一般形式的紫杉醇包括但不限于盐酸倍他洛尔。各种剂量形式的紫杉醇包括但不限于白蛋白纳米颗粒紫杉醇，其市售商品为ABRAXANE；ONXOL，CYTOTAX。可以获得Discodermolide，例如美国专利5,010,099中所公开的。还包括埃坡霉素衍生物，其在美国专利6,194,181，WO98/10121、WO98/25929、WO98/08849、WO99/43653、WO98/22461和WO00/31247中公开。特别优选埃坡霉素A和/或B。
本文所用的术语“烷化剂”，包括但不限于环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥或亚硝基脲(BCNU或Gliadel)或temozolamide(TEMODAR)。环磷酰胺能够以其购买形式施用，例如在CYCLOSTIN商标下；异环磷酰胺为HOLOXAN。
术语“抗肿瘤抗代谢物”包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)；卡培他滨；吉西他滨；DNA脱甲基化试剂、例如5-氮杂胞苷和地西他滨；氨甲蝶呤；依达曲沙；和叶酸拮抗剂，例如但不限于培美曲唑。卡培他滨能够例如以其购买的形式施用，例如商标为XELODA；吉西他滨的商标为GEMZAR。
本文所用的术语“铂化合物”，包括但不限于碳铂、顺铂(cis-platin)、顺铂(cisplatinum)、奥沙利铂、沙铂和铂试剂例如ZD0473。碳铂能够例如以其购买的形式施用，例如CARBOPLAT；以及为ELOXATIN的奥沙利铂。
本文所用的术语“靶向/降低蛋白质或脂质激酶活性；或蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物；或其它抗血管发生的化合物”，包括但不限于蛋白质酪氨酸激酶和/或丝氨酸和/或苏氨酸激酶抑制剂或脂质激酶抑制剂，例如：
i)靶向、降低或抑制血管内皮生长因子受体(VEGF)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制VEGF活性的化合物，特别是抑制VEGF受体的化合物，例如但不限于7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶衍生物(AEE788)；BAY43-9006；在WO00/09495中公开的isolcholine化合物，例如(4-叔丁基-苯基)-94-吡啶-4-基甲基-异喹啉-1-基)-胺(AAL881)；和
ii)靶向、降低或抑制血小板衍生生长因子受体(PDGFR)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制PDGFR活性的化合物，特别是抑制PDGF受体的化合物，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如imatinib、SU101、SU6668和GFB-111；
iii)靶向、降低或抑制成纤维生长因子受体(FGFR)活性的化合物；
iv)靶向、降低或抑制***受体1(IGF-1R)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制IGF-IR活性的化合物，特别是抑制IGF-1R受体的化合物。化合物包括但不限于WO02/092599中公开的化合物及其衍生物4-氨基-5-苯基-7-环丁基-吡咯并[2，3-d]嘧啶衍生物(AEW541)；
v)靶向、降低或抑制Trk受体酪氨酸激酶家族活性的化合物；
vi)靶向、降低或抑制Axl受体酪氨酸激酶家族活性的化合物；
vii)靶向、降低或抑制c-Met受体活性的化合物；
viii)靶向、降低或抑制Ret受体酪氨酸激酶活性的化合物；
ix)靶向、降低或抑制Kit/SCFR受体酪氨酸激酶活性的化合物；
x)靶向、降低或抑制C-kit受体酪氨酸激酶(PDGFR家族的一部分)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制c-Kit受体酪氨酸激酶家族活性的化合物，特别是抑制c-Kit受体的化合物，例如imatinib；
xi)靶向、降低或抑制cAbl家族成员及其基因融合产物(例如BCR-Abl激酶的活性的化合物)，例如靶向、降低或抑制c-AbI家族成员及其基因融合产物活性的化合物，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如来自ParkeDavis的imatinib、PD180970、AG957、NSC680410或PD173955；BMS354825。
xii)靶向、降低或抑制丝氨酸/苏氨酸激酶家族的蛋白质激酶C(PKC)和Raf家族成员，MEK、SRC、JAK、FAK、PDK的成员和Ras/MAPK家族成员，或PI(3)激酶家族，或PI(3)-激酶相关激酶家族成员，和/或细胞周期蛋白依赖型激酶家族(CDK)成员活性的化合物，特别是在美国专利5,093,330中公开的那些星孢菌素衍生物，例如米哚妥林；其它化合物的实例包括，例如UCN-01；沙芬戈；BAY43-9006；苔藓抑素1；哌立福新；伊莫福新；RO318220和RO320432；GO6976；Isis3521；LY333531/LY379196；isochinoline化合物，例如在WO00/09495中公开的那些；FTI；P13K抑制剂PD184352或QAN697；
xiii)靶向、降低或抑制蛋白质-酪氨酸激酶的活性的化合物，例如甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC)；酪氨酸磷酸化抑制剂或嘧啶基氨基苯甲酰胺及其衍生物(AMN107)。酪氨酸磷酸化抑制剂优选是低分子量化合物(Mr<1500)或其可药用盐，特别是选自苯亚甲基丙二腈类或S-芳基苯丙二腈(S arylbenzenemalonirile)或双底物喹啉类化合物的化合物，更加特别是选自酪氨酸磷酸化抑制剂A23/RG-50810、AG99、酪氨酸磷酸化抑制剂AG213、酪氨酸磷酸化抑制剂AG1748、酪氨酸磷酸化抑制剂AG490、酪氨酸磷酸化抑制剂B44、酪氨酸磷酸化抑制剂B44(+)对映体、酪氨酸磷酸化抑制剂AG555、AG494、酪氨酸磷酸化抑制剂AG556；AG957和adaphostin(4-{[(2，5-二羟基苯基)甲基]氨基}-苯甲酸金刚烷基酯、NSC680410、adaphostin)的任何化合物；
xiv)靶向、降低或抑制受体酪氨酸激酶(同源二聚体或异源二聚体EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4)的表皮生长因子家族活性的化合物，例如靶向、降低或抑制表皮生长因子受体家族活性的化合物，特别是抑制EGF受体酪氨酸激酶家族成员，例如EGF受体、ErbB2、ErbB3和ErbB4，或结合EGF或EGF相关配体的化合物、蛋白质或抗体，特别是在WO97/02266中一般性和特别公开的那些化合物，蛋白质或单克隆抗体，例如实施例39的化合物，或在EP 0 564 409、WO 99/03854、EP 0520722、EP0 566 226、EP 0787 722、EP 0 837 063、美国专利5,747,498、WO98/10767、WO97/30034、WO97/49688、WO97/38983中公开的那些化合物、蛋白质或单克隆抗体，特别是WO96/30347中公开的例如称作CP358774的化合物，WO96/33980中公开的例如化合物ZD1839；和WO95/03283中公开的例如化合物ZM105180，例如曲妥单抗(trastuzumab)(HERCEPTIN
Figure G2007800120247D0082130022QIETU
)、西妥昔单抗(cetuximab)、Iressa、OSI-774、CI1033、EKB-569、GW-2016、E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3或E7.6.3，和在WO03/013541中公开的7H-吡咯并-[2，3-d]嘧啶衍生物、erlotinib和gefitinib。可以将Erlotinib以其购买形式施用，例如TARCEVA，而gefitinib为IRESSA，其为抗包括ABX-EGFR的表皮生长因子受体的人单克隆抗体；和
xv)靶向、降低或抑制丝氨酸/苏氨酸mTOR激酶活性/功能的化合物，特别是靶向/抑制mTOR激酶家族成员的化合物，蛋白质或抗体，例如RAD、RAD001、CCI-779、ABT578、SAR543、雷帕霉素及其衍生物/类似物，来自Ariad的AP23573和AP23841、依维莫司(CERTICAN)和西罗莫司。CERTICAN(依维莫司，RAD)是防止T细胞和血管平滑肌细胞增殖的研究性新型增殖信号抑制剂。
当提及抗体时，其包括完整的单克隆抗体，纳米抗体，多克隆抗体，由至少2个完整抗体形成的多特异性抗体，和抗体片段(条件是其显示所需的生物学活性)。
本文所用的短语“靶向、降低或抑制蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物”包括但不限于磷酸酶1、磷酸酶2A、PTEN或CDC25的抑制剂，例如岗田酸或其衍生物。
本文所用的术语“单克隆抗体”，包括但不限于贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗、曲妥单抗、伊莫单抗(Ibritumomabtiuxetan)、狄诺塞麦单抗(denosumab)、抗CD40、抗GM-CSF以及托西莫单抗(tositumomab)和碘I131。贝伐单抗能够以其购买形式施用，例如AVASTIN；西妥昔单抗为ERBITUX；曲妥单抗为HERCEPTIN；利妥昔单抗(Rituximab)为MABTHERA；伊莫单抗为ZEVULIN；抗RANKL为狄诺塞麦单抗(AMG162)、抗CD40为HCD122(美国专利申请2002-0106371)、和托西莫单抗和碘I131为BEXXAR。
短语“其它抗血管形成的化合物”包括但不限于对于其活性具有另一种例如与蛋白质或脂质激酶抑制无关的机制的化合物，例如萨立度胺(THALOMID)和TNP-470。
本文所用的短语“诱导细胞分化过程的化合物”，包括但不限于视黄酸，α-，γ-或δ-生育酚或α-，γ-或δ-生育三烯酸。
本文所用的术语“环加氧酶抑制剂”包括但不限于，例如Cox-2抑制剂、5-烷基取代的2-芳基氨基苯基乙酸和衍生物，如塞来考昔(CELEBREX)、罗非考昔(VIOXX)、艾托考昔、伐地考昔或5-烷基-2-芳基氨基苯基乙酸，例如5-甲基-2-(2’-氯-6’-氟苯胺基)苯基乙酸、lumiracoxib。
本文所用的术语“二磷酸酯”，包括但不限于etridonic、氯膦酸、替鲁膦酸、帕米膦酸、阿仑棒酸、伊班膦酸、利塞膦酸和唑来膦酸。“Etridonic酸”可以以其市售的形式例如DIDRONEL施用；“氯膦酸”以BONEFOS的形式施用；替鲁膦酸以SKELID的形式施用；“帕米膦酸”以AREDIA的形式施用；“阿仑棒酸”以FOSAMAX的形式施用；“伊班膦酸”以BONDRANAT的形式施用；“利塞膦酸”以ACTONEL的形式施用；而“唑来膦酸”以ZOMETA的形式施用。
本文所用的术语“乙酰肝素酶抑制剂”，指靶向、降低或抑制肝素硫酸降解的化合物，该术语包括但不限于PI88。
本文所用的术语“生物反应调节物”包括但不限于淋巴因子或干扰素，例如干扰素γ。
本文所用的术语“Ras致癌同工型的抑制剂”，包括但不限于H-Ras、K-Ras或N-Ras，用于本文时，指靶向，降低或抑制Ras的致癌活性的化合物，例如法尼基转移酶抑制剂(FTI)，例如L-744832、DK8G557或R115777(ZARNESTRA)。
本文所用的术语“端粒酶抑制剂”，包括但不限于靶向，降低或抑制端粒酶活性的化合物。靶向，降低或抑制端粒酶活性的化合物尤其是抑制端粒酶受体的化合物例如telomestatin。
本文所用的术语“基质金属蛋白酶抑制剂”或(MMP抑制剂)，包括但不限于，胶原蛋白拟肽(peptidomimetic)和非拟肽抑制剂；四环素衍生物，例如氧肟酸盐拟肽抑制剂巴马司他；及其口服利用类似物马立马司他(BB-2516)，普啉司他(AG3340)，metastat(NSC683551)BMS279251，BAY12-9566，TAA211，MMI270B或AAJ996。
本文所用的术语“甲硫氨酸氨肽酶抑制剂”，包括但不限于靶向，降低或抑制甲硫氨酸氨肽酶抑制剂活性的化合物。靶向，降低或抑制甲硫氨酸氨肽酶抑制剂活性的化合物是例如bengamide或其衍生物。
本文所用的术语“蛋白酶体抑制剂”，包括靶向，降低或抑制蛋白酶体活性的化合物。靶向，降低或抑制蛋白酶体活性的化合物包括，但不限于，PS-341；MLN341.bortezomib或Velcade。
本文所用的短语“用于治疗血液恶性肿瘤的药剂”，包括但不限于，FMS-样酪氨酸激酶抑制剂，例如靶向，降低或抑制FMS-样酪氨酸激酶受体(Flt-3R)活性的化合物；干扰素，1-b-D-***呋喃糖基胞嘧啶(ara-c)和bisulfan；和ALK抑制剂，例如靶向，降低或抑制间变性淋巴瘤激酶活性的化合物。
本文所用的短语“靶向，降低或抑制Flt-3活性的化合物”包括但不限于抑制Flt-3的化合物，蛋白质或抗体，例如N-苯甲酰基-十字孢碱、米哚妥林、十字孢碱衍生物、SU11248和MLN518。
本文所用的术语“HSP90抑制剂”，包括但不限于靶向，降低或抑制HSP90的内在ATP酶活性的化合物；通过泛素蛋白酶体途径降解，靶向，降低或抑制HSP90客户(client)蛋白质的化合物，靶向，降低或抑制HSP90的内在ATP酶活性的化合物尤其是抑制HSP90的ATP酶活性的化合物，蛋白质或抗体，例如17-烯丙基氨基，17-脱甲氧基格尔德霉素(17AAG)，格尔德霉素衍生物；其他的格尔德霉素相关化合物；根赤壳菌素和HDAC抑制剂。
本文所用的术语“抗增殖抗体”，包括但不限于曲妥单抗(HERCEPTIN)，曲妥单抗-DM1、erlotinib(TARCEVA)、贝伐单抗(AVASTIN)、利妥昔单抗(RITUXAN)、PRO64553(抗CD40)和2C4抗体。所谓抗体意为例如完整的单克隆抗体、多克隆抗体、形成自至少两个完整抗体的多特异性抗体和抗体片段(只要其显示需要的生物活性)。
本文所用的术语“HDAC抑制剂”，涉及抑制组蛋白去乙酰基酶并且具有抗增殖活性的化合物。这包括但不限于在WO02/22577中公开的化合物，尤其是N-羟基-3-[4-[[(2-羟乙基)[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺(propenamide)，和N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺及其药用盐(LBH589)。其还尤其包括辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)；[4-(2-氨基-苯羰基)-苄基]-氨基甲酸吡啶-3-基甲酯及其衍生物；丁酸，苯苄吡咯烷，曲古抑菌素A，Oxamflatin，apicidin、缩酚酸肽；depudecin和trapoxin。
本文所用的短语“靶向，降低或抑制丝氨酸/苏氨酸mTOR激酶的活性/功能的化合物”包括但不限于靶向/抑制mTOR激酶家族成员的化合物、蛋白质或抗体，例如RAD、RAD001、CCI-779、ABT578、SAR543、雷帕霉素及其衍生物/类似物、来自Ariad的AP23573和AP23841，依维莫司(CERTICAN)和西罗莫司(RAPAMUNE)，CCI-779和ABT578。CERTICAN(依维莫司，RAD)为一种研究开发的防止T-细胞和血管平滑肌细胞增殖的新型增殖信号抑制剂。
本文所用的术语“促生长素抑制素受体拮抗剂”，包括但不限于靶向，治疗或抑制促生长素抑制素受体的药剂，例如奥曲肽和SOM230。
本文所用的术语“抗白血病化合物”，包括但不限于Ara-C，嘧啶类似物、其是脱氧胞苷的2′-α-羟基核糖(阿糖胞苷)衍生物。此外还包括次黄嘌呤的嘌呤类似物，6-巯基嘌呤(6-MP)和磷酸氟达拉滨。
短语“破坏肿瘤细胞的方法”指如电离辐射的方法。在上下文中术语“电离辐射”指作为电磁射线(如X-射线和γ射线)或粒子射线(如α，β，γ粒子射线)发生的电离辐射。电离辐射提供在但不限于辐射疗法中并且是本领域已知的。参见Hellman，Cancer，第4版，Vol.1，Devita等编著，pp.248-275(1993)。
本文所用的术语“EDG结合剂”，包括但不限于调节淋巴细胞再循环的一类免疫抑制剂，例如FTY720。
本文所用的术语“核糖核苷酸还原酶抑制剂”，包括但不限于，嘧啶或嘌呤核苷类似物包括但不限于氟达拉滨和/或ara-C；6-巯鸟嘌呤；5-FU；克拉屈滨；6-巯基嘌呤(尤其与ara-C组合针对ALL)和/或喷司他丁。核糖核苷酸还原酶抑制剂尤其是羟基脲或2-羟基-1H-异吲哚-1，3-二酮衍生物，例如PL-1、PL-2、PL-3、PL-4、PL-5、PL-6、PL-7或PL8。参见Nandy等，Acta Oncologica，Vol.33，No.8，pp.953-961(1994)。
本文所用的术语“S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂”，包括但不限于在美国专利5,461,076中公开的化合物。
本文所用的短语“VEGF或VEGFR的单克隆抗体”，包括但不限于，在WO98/35958中公开的化合物，例如1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)2，3-二氮杂萘或其可药用盐，例如琥珀酸盐或在WO00/09495、wO00/27820、WO00/59509、WO98/11223、WO00/27819和EP0769947中公开的化合物；在Prewett等，Cancer Res，Vol.59，pp.5209-5218(1999)；Yuan等，Proc Natl Acad Sci USA，Vol.93，pp.14765-14770(1996)；Zhu等，Cancer Res，Vol.58，pp.3209-3214(1998)；和Mordenti等，Toxicol Pathol，Vol.27，No.1，pp.14-21(1999)，在WO00/37502和WO94/10202中描述的那些；由O’Reilly等，Cell，Vol.79，pp.315-328(1994)描述的ANGIOSTATIN；由O’Reilly等，Cell，Vol.88，pp.277-285(1997)描述的ENDOSTATIN；邻氨基苯甲酸酰胺；ZD4190；ZD6474；SU5416；SU6668；贝伐单抗；或抗VEGF抗体或抗VEGF受体抗体，例如rhuMAb和RHUFab；VEGF适配体，例如Macugon；FLT-4抑制剂；FLT-3抑制剂；VEGFR-2IgG1抗体；Angiozyme(RPI4610)；和Avastan。
本文所用的术语“光动力学疗法”，指使用某些已知为光敏化药剂的化学品来治疗或预防癌症的疗法。光动力学疗法的实例包括但不限于用药剂如例如VISUDYNE和卟吩姆钠进行的治疗。
本文所用的术语“制管张素类固醇”，包括但不限于阻断或抑制血管发生的药剂如，例如阿奈可他、曲安西龙、氢化可的松、11-α-epihydrocotisol、11-脱氧皮甾醇、17α-羟基孕酮、肾上腺酮、去氧皮质酮、睾酮、雌酮和***。
本文所用的短语“包含皮质类固醇的植入物”，包括但不限于试剂，例如氟轻松和***。
本文所用的术语“AT1受体拮抗剂”，包括但不限于试剂，例如DIOVAN。
本文所用的术语“ACE抑制剂”，包括但不限于CIBACEN、贝那普利、enazepril(LOTENSIN)、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利、喹那普利、雷米普利、培哚普利和群多普利。
其它的药学活性剂包括但不限于植物生物碱、激素药剂和拮抗剂、生物反应调节物，优选地淋巴因子或干扰素，反义寡核苷酸或寡核苷酸衍生物；或混杂的药剂或具有其它或未知作用机制的药剂。
在引用专利申请或科技出版物的情况中，特别是关于各个化合物权利要求和其中工作实施例的终产物的情况中，特此将终产物的主题，药物制剂和权利要求通过参考这些出版物的方式合并入本申请。类似地还包括相应的立体异构体，以及相应的晶体调节物，例如在本文公开的溶剂化物和多晶型物。可以制备这样的化合物，其用作在本文公开的组合中的活性成分并且分别如引用的文献所述给药。
由代号标识一般名称或商品名称的活性剂结构可以来自标准纲要“The Merck Index”的现行版本或来自数据库例如专利国际，例如IMS世界出版物或上面或下面提及的出版物。将其相应的内容特此通过引用的方式合并入本文。
要理解的是提及成分(a)和(b)意味着还包括任一种活性物质的药用盐。如果包括成分(a)和/或(b)的活性物质具有，例如至少一个碱性中心，其可以形成酸加成盐。如果需要，还可以形成这样相应的酸加成盐，其具有另外的碱性中心。具有酸基团例如COOH的活性物质可以与碱形成盐。包括成分(a)和/或(b)的活性物质或其可药用盐也可以以水合物的形式使用或包括用于结晶的其他溶剂。
因此，在第一方面，本发明涉及预防治疗由持续血管发生引起的哺乳动物，优选人患者中的增生性疾病或疾病的方法，所述方法包括同时或顺序用药用有效量的下列组合治疗患者：
(a)c-Met抗体拮抗剂组合物；和
(b)药学活性剂。
在优选的实施方案中，本发明提供包含下列各项的药物制剂：
(a)c-Met抗体拮抗剂组合物；和
(b)一种或多种药学活性剂，其选自下列各项：芳香酶抑制剂；***对抗剂；抗雄激素；促***释放素激动剂；拓扑异构酶I抑制剂；拓扑异构酶II抑制剂；微管激活剂；烷化剂；抗瘤抗代谢物；platin化合物；靶向/降低蛋白质或脂质激酶活性或蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物，抗血管发生化合物；诱导细胞分化过程的化合物；单克隆抗体；环加氧酶抑制剂；二磷酸酯；乙酰肝素酶抑制剂；生物反应调节物；Ras致癌同工型的抑制剂；端粒酶抑制剂；蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白质酶抑制剂，甲硫氨酸氨肽酶抑制剂；蛋白酶体抑制剂；靶向，降低或抑制Flt-3活性的药剂；HSP90抑制剂；抗增殖性抗体；HDAC抑制剂；靶向，降低或抑制丝氨酸/苏氨酸mTOR激酶的活性/功能的化合物；促生长素抑制素受体拮抗剂；抗白血病化合物；肿瘤细胞破坏方法；EDG结合剂；核糖核苷酸还原酶抑制剂；S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂；VEGF或VEGFR的单克隆抗体；光动力学疗法；制管张素类固醇；包含皮质类固醇的植入物；AT1受体拮抗剂；和ACE抑制剂。
成分(a)和(b)的组合，包含施用这两种成分的治疗温血动物的方法，包含这两种成分用于同时，分别或顺序应用的药物组合物，将所述组合用于延缓增殖疾病进展或治疗增殖疾病的应用或用于制备用于这些目的的药物制剂的用途或包含成分(a)和(b)的所述组合的商业产品，上述提及或定义的全部的任一种，也随后被称为本发明合(从而使该术语指这些实施方案的每一种，因此适合时所述实施方案可以替代该术语)。
同时施用可以例如以与两种或多种活性成分的一种固定组合的形式发生，或通过同时施用独立配制的两种或更多种活性成分进行。顺序使用(施用)优选地意味着在一个时间点施用一种(或多种)成分，在不同的时间点施用其他的成分，即以长期分级的方式进行，优选地使所述组合显示比独立施用的单一化合物更加有效(分别显示协同作用)。分别使用(施用)优选地意为彼此独立地在不同的时间点施用所述组合的成分，优选地意为这样施用成分(a)和(b)从而不存在以重叠方式(同时)进行时的两种化合物的可测量血液水平的重叠。
此外，顺序施用，分别施用和同时施用的两种或多种的组合是可能的，优选地使组合成分-药物显示联合的治疗效果，其超过当以这样大的时间间隔独立使用组合成分-药物时发现的效果，所述时间间隔使其在治疗效力上没有发现共同的作用，尤其优选协同作用。
本文所用的术语“延缓进展”意为将所述组合在首次病征或在待治疗疾病复发的预先阶段或早期阶段施用给患者，其中在所述患者中已经诊断了相应疾病的预先形式或所述患者处于这样的情况中，例如在医药治疗或由可能发展相应的疾病的事件导致的情况。
“联合治疗活性”或“联合治疗效果”意为所述化合物可以单独(以长期分级的方式，尤其是顺序特异性的方式)以这样的时间间隔给药，其在所述时间间隔中，优选地在温血动物，尤其是待治疗的人中还显示(优选地协同)相互作用(联合治疗效果)。如果情况如此，可以特别通过根据血液水平来确定，所述血液水平显示两种化合物至少在某些时间间隔过程中存在于待治疗的人的血液中。
“药用有效”优选地涉及针对增生性疾病的进展在治疗上有效的量，或在更广泛意义上也指预防有效的量。
本文所用术语“商业包装”或“产品”，以这样的意义特别定义“各个部分的试剂盒”，所述意义为可以独立地给药或通过使用不同量的成分(a)和(b)的不同固定组合给药，即同时或以不同的时间点给药成分(a)和(b)。此外，这些术语包括这样的商业包装，所述商业包装包括(特别组合)作为活性成分的成分(a)和(b)，以及用于同时，顺序(长期分级，优选地以时间特异性顺序)或(较不优选地)分别使用其来延缓增生性疾病的进展或治疗增生性疾病的说明书。各种部分的试剂盒的各种部分可以接着例如同时或长期分级进行施用，所述长期分级在不同的时间点并且对于各种部分的试剂盒的任何部分具有相同或不同的时间间隔。非常优选地，可以这样选择时间间隔从而使在组合应用各个部分对被治疗的疾病的效果大于通过仅使用组合部分(a)和(b)任一种获得的效果(如可以根据标准方法所确定的)。在组合制剂中组合部分(a)的总量与待施用的组合部分(b)的比率可以改变例如以适应待治疗患者亚群的需要或具有不同需要的每个患者的需要，所述不同的需要可以根据患者的具体的疾病，年龄，性别，体重等而定。优选存在至少一种有益效果，例如对组合部分(a)和(b)的作用的共同提高，特别是超过累加效应，所述增加可以用组合药物中的每种分别比在仅用单一药物而没有联合治疗的情况下耐受剂量更低的剂量来获得，还产生另外的有益作用，例如更少副作用或非有效剂量的一种或两种组合部分(成分)(a)和(b)的组合治疗效果，并且非常优选地是组合部分(a)和(b)的强协同作用。
在使用成分(a)和(b)的组合和商业包装两种情形中，同时使用，顺序使用和分别使用的任何组合也是可能的，意味着可以将成分(a)和(b)以一个时间点同时施用，随后仅施用具有更低宿主毒性的一种成分，其随后在较后的时间点长期地例如超过3-4周的每日给药，再给药另一种成分或在更迟的时间点给药两种成分的组合(在随后的对于最佳抗肿瘤效果的药物联合治疗过程)等。
本发明的组合还可以用于与其他治疗组合，例如外科手术干预，高温和/或放射疗法。
根据本发明药物组合物可以通过常规方式进行制备并且是适合于肠内，例如口或直肠的那些和肠胃外施用给哺乳动物包括人，其包括治疗有效量的VEGF抑制剂和仅至少一种药学活性剂或组合以一种或多种药用载体，尤其是适合于肠内或肠胃外应用的那些。
所述药物组合物包括大约0.00002到大约100％的活性成分(在每种情况中，重量/重量)，尤其是例如在即用的输注稀释的情况中的0.0001到0.02％的活性成分或例如在注射或输注浓缩物或尤其是肠胃外制剂的情况中，大约0.1％到大约95％，优选大约1％到大约90％的活性成分，更加优选大约20％到大约60％的活性成分。根据本发明药物组合物可以例如以单位剂型的形式存在，例如以安瓿，小瓶，糖衣丸(dragées)，片剂，输注袋或胶囊的形式存在。
在本发明制剂中应用的每种组合配部分的有效剂量可以根据所用的具体化合物或药物组合物，施用方式，治疗的疾病和治疗疾病的严重性而改变。普通内科医生，临床医生或兽医可以容易地确定必需的每种活性成分的有效量以防止，治疗或抑制疾病的进展。
酪氨酸磷酸化抑制剂，尤其是Adaphostin优选以大约1-6000mg/天，更加优选25-5000mg/天，最优选50-4000mg/天的剂量施用于温血动物，尤其是人。除非在本文另外指出，所述化合物优选每天施用1-5次，尤其是1-4次。
用于肠内或肠胃外施用的进行联合治疗的药物制剂是例如以单位剂型存在的那些，如糖包被的片剂，胶囊或栓剂，以及安瓿。如果另外没有指出，将这些制剂通过常规方法，例如通过常规混合，制粒，糖包衣，溶解或冻干方法进行制备。要理解的是，包含在每种剂型中的每个剂量中的组合部分的单位含量不需要本身构成有效量，因为必需的有效量可以通过施用多个剂量单位达到。本领域技术人员具有确定组合成分适合的药物有效量的能力。
优选地，所述化合物或其药用盐作为口服药物制剂的形式施用，以片剂，胶囊或糖浆的形式施用；或如果适合作为肠胃外注射剂的形式施用。
在制备用于口服施用的组合物时，可以使用任何药用介质如水，乙二醇，油类，醇类，调味剂，防腐剂，着色剂。药用载体包括淀粉，糖，微晶纤维素，稀释剂，成粒剂，润滑剂，粘合剂，崩解剂。
将活性成分的溶液，以及此外的混悬液，尤其是等渗的水溶液或混悬液用于肠胃外施用活性成分，其在例如只包含活性成分或与可药用载体例如甘露醇一起的冻干组合物的情形中，在使用前产生所述溶液或混悬液是可能的。所述药物组合物可以被灭菌和/或可以包含赋形剂，例如防腐剂，稳定剂，湿润剂和/或乳化剂，增溶剂，用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂，并且以本身已知的方式进行制备，例如通过常规溶解或冻干方法进行制备。所述溶液或混悬液可以包含增加粘度的物质例如羧甲基纤维素钠，羧甲基纤维素，葡萄糖，聚乙烯吡咯烷酮或明胶。在油中的混悬液包含常规用于注射目的的植物油，合成油或半合成油作为油成分。
等渗剂可以选自本领域已知那些的任一种，例如甘露醇，葡萄糖，葡萄糖和氯化钠。输注制剂可以用水性介质稀释。用作稀释剂的水性介质的量根据在输注剂中活性成分需要的浓度选择。输注剂可以包含常规用于静脉内施用的制剂中的其它赋形剂如抗氧化剂。
本发明还涉及“组合的制剂”，其用于本文时，尤其以这样的意义定义“各种部分的试剂盒”，所述意义为将如上定义的组合部分(a)和(b)单独给药或通过使用与不同量的组合部分(a)和(b)的不同固定组合给药，即同时或在不同时间点进行。各种部分的试剂盒的各种部分可以接着例如同时或长期分级的方式施用，即对于各种部分的试剂盒的任何部分在不同的时间点和以相等或不同的时间间隔进行。在组合制剂中组合部分(a)的总量与待施用的组合部分(b)的比率可以变化，例如以适应于待治疗的患者亚群的需要或每个患者基于患者经历的任何副作用的严重性的需要。
本发明用途和方法
本发明抗体(和免疫缀合物以及双特异性分子)具有体外和体内诊断和治疗应用性。例如这些分子可以在体外或体内施用于培养物中的细胞，或可以施用于受试者，例如在体内施用以治疗，预防或诊断各种疾病。本文所用的术语“受试者”意欲包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物，如非人灵长类动物，绵羊，狗，猫，牛，马，鸡和非哺乳动物如鸟，两栖动物和爬行动物。所述方法特别适合于治疗具有与异常c-Met表达相关的疾病的人患者。当抗c-Met的抗体与另一种药剂一起施用时，两者可以以任一顺序或同时进行施用。
在一个实施方案中，本发明抗体(和免疫缀合物和双特异性分子)可以用于检测c-Met的水平，或包含c-Met的细胞的水平。这可以在容许在抗体和c-Met之间形成复合物的条件下，例如通过使样品(如体外样品)和对照样品与抗c-Met抗体接触来实现。在样品和对照中检测并比较在抗体和c-Met之间形成的任何复合物。例如可以利用本发明的组合物进行本领域公知的标准检测方法如ELISA和流式细胞术。
因此，在一方面，本发明还提供用于检测样品中c-Met(例如人c-Met抗原)存在的方法，或测量c-Met的量的方法，所述方法包括在容许在抗体或其部分和c-Met之间形成复合物的条件下，使样品和对照样品与本发明与c-Met特异性结合的抗体或其抗原结合部分接触。接着检测复合物的形成，其中样品与对照样品比较在复合物形成中的差异指示样品中c-Met的存在。
本发明范围还包括试剂盒，所述试剂盒由本发明的组合物(例如抗体、人抗体、免疫缀合物和双特异性分子)和使用说明书组成。所述试剂盒还可以包含至少一种另外的试剂，或一种或多种本发明其他抗体(例如具有结合靶抗原上不同于第一抗体的表位的互补活性的抗体)。试剂盒典型地包括指示试剂盒内容物的预期应用的标记。术语标记包括在试剂盒中或与其一起提供或以另外方式伴随试剂盒的任何书面或记录的材料。
已经充分描述了本发明，下面将进一步通过实施例和权利要求来说明本发明，其仅是举例说明性的并不意味着进一步的限制。本领域技术人员将认识或能够利用常规实验确定本文所述的具体方法的许多等价物。所述等价物在本发明和权利要求的范围内。将整个申请中引用的所有参考文献，包括授权的专利和公布的专利申请的内容通过引用的方式合并入本申请。
实施例
实施例1：从HuCAL
Figure G2007800120247D00941
文库中产生人c-Met-特异性抗体使用在商购噬菌体展示文库，MorphoSys HuCAL
Figure G2007800120247D00942
文库中的抗体变体蛋白质作为来源，通过选择具有高结合亲和性的克隆产生抗人c-Met蛋白的治疗性抗体。HuCAL
Figure G2007800120247D0094130338QIETU
是Fab文库(Knappik等，2000J.Mol.Biol.，296：57-86；Krebs等，2001，J Immunol.Methods，254：67-84；Rauchenberger等，2003，J Biol Chem.，278(40)：38194-38205)，其中所有的CDR通过适合的突变而多样化，并且其应用CysDisplayTM技术来将Fab片段连接到噬菌体表面(WO01/05950
Figure G2007800120247D0095130353QIETU
2001)。
一般方法：噬菌粒复苏，噬菌体扩增和纯化
在标准富集细菌培养基(2xYT)中扩增HuCAL
Figure G2007800120247D00951
文库，所述培养基包含34μg/ml的氯霉素和1％的葡萄糖(2×YT-CG)。在用VCSM13辅助噬菌体感染OD600nm为0.5的细胞后(在37℃，不振荡的情况下，培养细胞和噬菌体的混合物30分钟，随后在37℃在250转/分钟振荡30分钟)，将细胞离心(4120g；5min；4℃)并重新悬浮在2xYT/34μg/ml氯霉素/50μg/ml卡那霉素/0.25mM IPTG中，并在22℃培养过夜。在该时期结束时，通过离心移去细胞，并且从上清液中将噬菌体进行PEG-沉淀2次，再重新悬浮在PBS/20％甘油中并且贮存在-80℃。
如下进行在两轮淘选之间的噬菌体扩增：用在以c-Met蛋白选择后洗脱的噬菌体感染对数中期的大肠杆菌菌株TG1细胞，并且将其接种到补充了1％的葡萄糖和34μg/ml氯霉素的LB-琼脂上(LB-CG平板)。在30℃将平板过夜温育后，将细菌菌落从琼脂表面上刮落，并且用于接种2×YT-CG肉汤以获得0.5的OD600nm，接着将VCSM13辅助噬菌体加入以获得如上所述的生产性感染。
利用Strep-Tactin磁珠进行溶液淘选的预实验
已经报道Strep-tag II具有对于Strep-Tactin基质的低亲和性(KD～1μM根据Voss和Skerra，1997，Protein Eng.，10：975-982)，因此进行预实验以评估利用Strep-Tactin包被的MagStrep珠在抗体选择过程中捕获抗原的适宜性，并且在淘选过程中避免抗原损失。
为此目的，在室温将8mg的MagStrep珠与46μg的His-Strep-标记的c-Met一起温育1小时，并且将样品分在四个预先封闭的Eppendorf管中。一个管作为阳性对照(没有洗涤)，将另外三个样品根据HuCAL
Figure G2007800120247D00961
手册淘选部分用不同严谨性进行洗涤。利用山羊抗c-Met抗体和铷标记的抗山羊检测抗体，在BioVeris中检测His-Strep-标记的c-Met与MagStre珠(Strep-Tactin包被的磁珠获自IBA，，德国)的结合。
如在本文的图中所显示，当将未洗涤的珠与以不同的严谨性洗涤的那些珠进行比较时，在Strep-Tactin-包被的珠中没有可检测的His-Strep-标记的c-Met的明显损失。因此，His-Strep-标记的c-Met似乎适合用在以Strep-Tactin-包被的磁珠(MagStrep珠)进行的溶液淘选中。
通过淘选来自文库的c-Met特异性抗体进行选择
对于选择识别人c-Met的抗体，应用两次淘选策略。
一般地，将HuCAL
Figure G2007800120247D00963
噬菌体-抗体分成四个库，所述库包含VH主导基因的不同组合(库1包含VH1/5λκ；库2包含VH3λκ；库3包含VH2/4/6λκ，并且库4包含VH1-6λκ)。将这些库分别于捕获在StrepTactin磁珠(Mega Strep珠；IBA)上的His-Strep-标记的c-Met进行两轮溶液淘选，并且对于第三轮选择，仅在捕获在StrepTactin磁珠上的His-Strep-标记的c-Met或被链霉抗生物素蛋白珠用生物素酰化的抗APP抗体捕获的APP-标记的人c-Met蛋白进行淘选。
具体而言，对于利用与StrepTactin磁珠偶联的His-Strep-标记的c-Met进行的溶液淘选，进行如下方法：通过在4℃用1.5ml的以PBS稀释为1：1的2×ChemiBLOCKER过夜处理来制备预封闭的管(1.5ml的Eppendorf管)。通过如下处理制备预先封闭的珠：用580μlPBS洗涤580μl(28mg珠)StrepTactin磁珠一次并且将其重新悬浮在580μl1×ChemiBLOCKER(稀释在1倍体积的1×PBS中)中。在4℃，在预封闭的管中进行珠的封闭过夜。
将用于每次淘选条件在PBS中稀释到最终体积500μl的噬菌体颗粒与500μl2×ChemiBLOCKER/0.1％吐温混合并且在室温，在旋转的轮上保持1小时。进行去除StrepTactin或珠结合的噬菌体的噬菌体颗粒预吸附两次：将160μl封闭的StrepTactin磁珠(4mg)加入封闭的噬菌体颗粒中，并且在室温，在旋转的轮上温育30分钟。通过磁力装置(Dynal MPC-E)分离所述珠后，将噬菌体上清液(～1.1ml)转移到新鲜封闭的反应管中并且利用160μl封闭的珠重复预吸附30分钟。接着，将400nM或100nM的His-Strep-标记的c-Met加入在新鲜，封闭的1.5ml反应管中的封闭噬菌体颗粒中，并且将混合物在室温，在旋转的轮上温育60分钟。
利用分别被加入400nM或100nM噬菌体淘选库中的320μl或160μl封闭的StrepTactin磁珠捕获噬菌体-抗原复合物，接着将其在室温在旋转的轮上温育20分钟。用磁力颗粒分离器将结合到StrepTactin磁珠上的噬菌体颗粒再次收集。
接着，用PBS/0.05％吐温(PBST)将珠洗涤七次，随后仅用PBS再洗涤3次。通过加入在10mM Tris-HCl，pH8.0中的200μl20mM DTT到每个管中达10分钟，将噬菌体颗粒从StrepTactin磁珠洗脱。收集洗脱物，用200μl PBS将所述珠洗涤一次，并且将PBS洗脱物加入DTT洗脱物中。将该洗脱样品用于感染14ml的大肠杆菌TG-1培养物，所述培养物预先培养到OD600nm为0.6-0.8。
在感染和随后在5000转/分钟离心10分钟后，将每个细菌沉淀物重新悬浮在500μl2×YT培养基中，并且接种到2×YT-CG琼脂平板上，并且在30℃温育过夜。次日早晨，将得到的菌落从平板刮落，并且通过如上所述的复苏和扩增制备噬菌体。
根据第一轮的方法，进行关于His-Strep-标记的c-Met的第二轮溶液淘选，除了使用减少量的抗原(50nM，和10nM)，并且适宜地改变洗涤方法的严谨性。
将两种不同的淘选策略应用于第三轮选择：将第二轮淘选扩增的噬菌体产出物分成两个部分，使其经历两种不同的淘选条件。将第一半部分的噬菌体产出物用于如上所述的关于捕获在StrepTactin珠上的人His-Strep-标记的c-Met的标准淘选策略(抗原量分别是10nM或1nM)。
用于第三轮选择的第二淘选部分在人APP-标记的c-Met上进行。将50nM或10nM终浓度的APP-标记的c-Met蛋白与1ml的预先清洗的第二轮噬菌体颗粒进行混合，并且将混合物在室温在旋转的轮上温育1小时。作为平行，将8mg预先封闭的Dynabead珠M-280链霉抗生物素蛋白(Dynal)与40μg的生物素酰化的小鼠抗APP抗体在室温，在旋转的轮上一起温育30分钟，随后用PBST进行两轮洗涤步骤。由结合到APP-标记的c-Met上的噬菌体抗体组成的预先形成的复合物在室温由抗APP包被的M-280链霉抗生物素蛋白磁珠捕获30分钟。如上所述进行噬菌体洗脱和扩增。
可溶性Fab片段的亚克隆和表达
将选择的HuCAL
Figure G2007800120247D00981
噬菌粒的Fab-编码***物亚克隆到表达载体
Figure G2007800120247D00982
_Fab_FH(参见图)中，从而促进可溶性Fab的快速和有效的表达。为此目的，将选择的克隆的质粒DNA用限制性核酸内切酶XbaI和EcoRI进行消化，由此切下Fab-编码的***物(ompA-VLCL和phoA-Fd)。接着，将该***物克隆到XbaI/EcoRI-消化的表达载体
Figure G2007800120247D00983
X9_Fab_FH中。
从该载体表达Fab蛋白质，并且作为结果携带两个C端标记物(分别为FLAGTM和6xHis)以进行检测和纯化。
HuCAL
Figure G2007800120247D00984
Fab抗体在大肠杆菌中的微量表达
为了获得足量的由上述获得的每个克隆编码的蛋白质，在将选择的Fab亚克隆到
Figure G2007800120247D00985
_Fab_FH表达载体中后，选择氯霉素-抗性的单细菌菌落。接着，将这些菌落的每一个用于接种无菌的96-孔微量滴定板的孔，其中每个孔包含100μl2×YT-CG培养基/孔，并将细菌在37℃培养过夜。将每个大肠杆菌TG-1培养物的样品(5μl)转移到新鲜无菌96-孔微量滴定板中，所述板每孔用补充了34μg/ml氯霉素和0.1％葡萄糖的100μl2×YT培养基预先填充。在30℃，将微量滴定板在微量滴定板振荡器上以400转/分钟振荡的情况下温育直到培养物轻微浑浊(～2-4小时)，其OD600nm为大约0.5。
对于以这些板的形式表达，每孔加入补充了34μg/ml氯霉素和3mMIPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)的20μl2×YT培养基(IPTG的终浓度为0.5mM)，将微量滴定板用透气带密封，并且在30℃，400转/分钟振荡温育过夜。
产生全细胞裂解物(BEL提取物)
向表达板的每个孔中，加入包含2.5mg/ml溶菌酶的40μlBEL缓冲液(2xBBS/EDTA：24.7g/l硼酸，18.7gNaCl/l，1.49g EDTA/l，pH8.0)，并且将板在微量滴定板振荡器上在22℃温育1小时(400转/分钟)。将BEL提取物用于通过FMAT进行的结合分析(参见实施例2)。
微克量的HuCAL
Figure G2007800120247D00991
Fab抗体在大肠杆菌中的表达和纯化
在50ml塑料管中进行由
Figure G2007800120247D00992
_Fab_FH编码的Fab片段在大肠杆菌TG1F细胞中的表达。为此目的，将用单一克隆接种的预培养物在2×YT-CG培养基中，在30℃培养过夜。次日早晨，将50μl的每种预培养物用于接种在无菌50ml塑料管中的补充了34μg/ml氯霉素，1mM IPTG和0.1％葡萄糖的25ml2×YT培养基，并且在30℃温育过夜。收集大肠杆菌细胞，将细胞沉淀物冷冻并最终用Bug Buster(Novagen)破坏。利用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen，Hilden，德国)分离Fab片段。
毫克量的HuCAL
Figure G2007800120247D00993
Fab抗体在大肠杆菌中的表达和纯化
利用750ml补充了34μg/ml氯霉素的2×YT培养基，在振荡器烧瓶培养中进行由
Figure G2007800120247D00994
_Fab_FH编码的Fab片段在TG1F细胞中的表达。将培养物在30℃振荡直到OD600nm达到0.5。通过加入0.75mM IPTG随后在30℃温育20小时来诱导表达。将细胞用溶菌酶破裂，并且通过Ni-NTA色谱法(Qiagen，Hilden，德国)分离Fab片段。通过UV-分光光度计确定蛋白质的浓度(Krebs等，2001)。
实施例2：鉴定c-Met-特异性
Figure G2007800120247D01001
抗体
通过荧光测定微量体积测定技术(FMATTM，8200细胞检测***分析仪，应用生物***)分析上述淘选策略选择的每个大肠杆菌克隆的BEL提取物，以鉴定编码c-Met-特异性Fab的克隆。
进行基于荧光测定微量体积测定技术的结合分析(FMAT)检测来自 细菌裂解物的c-Met-结合的Fab
为了检测来自大肠杆菌裂解物(BEL提取物)的c-Met-结合的Fab抗体，用FMAT8200细胞检测***(应用生物***)分析结合。为了将His-Strep-标记的c-Met偶联到M-450Expoxy珠(Dynal)上，将300μlM-450Epoxy珠(1.2x108珠)的样品转移到反应管中并且用磁性颗粒分离器捕获。去除上清液，并且用1ml的100mM磷酸钠缓冲液pH7.4将所述珠洗涤4次。对于抗原包被，将60μg His-Strep-标记的c-Met加入在150μl100mM磷酸钠缓冲液，pH7.4中的珠混悬液。在室温，在旋转的轮上，温育抗原-珠混悬液16小时。接着用PBS洗涤包被的珠三次，并且在250μlPBS终体积中重新悬浮。
对于每个384-孔板，制备包含3％BSA，0.005％吐温-20，4μlc-Met-包被的珠(1.9x106珠)和4μlCy5TM检测抗体的20ml PBS的混合物。将45μl的该溶液的样品分配到384-孔FMAT黑/清晰底的板(应用生物***)的每个孔中。在每个孔中加入包含Fab的BEL提取物(5μl)。在室温过夜温育FMAT板。次日早晨，将所述板在8200细胞检测***中进行分析(应用生物***)。
获得阳性克隆，并且分析在FMAT中产生阳性、特异性信号的克隆的重链和轻链序列。鉴定了显示与人c-Met充分强烈结合的独特的(非过多)的抗c-Met克隆。表达这些克隆，纯化并且测试亲和性和进行功能测定。
利用表面等离子体共振确定纳摩尔亲和性
利用这些克隆，利用标准EDC-NHS胺偶联化学试剂，在已经用～400RU密度的重组人c-Met包被的CM5芯片(Biacore，Sweden)上，在10mM乙酸钠pH4.5中进行动力学SPR分析。将相当量的人血清白蛋白(HSA)固定在参照流动池中。使用PBS(136mM NaCI，2.7mM KCI，10mM Na2HPO4，1.76mM KH2PO4pH7.4)作为运行缓冲液。以20μl/分钟的流速应用16-500nM的浓度系列中的Fab制备物。将结合相设定在60秒，分离相设定在120秒。将与人c-Met的以nM表示的亲和性的总结显示在本文的表1中。
表1.选定的Fab与人，c-Met的亲和性
 
抗体 KD[nM]人c-MetBIAcore      
4536 1.4
4537 1.7
4541 2.6
4682 11.2
4687 0.8
4690 66.0
实施例3：结合亲和性的量化分析：确定结合全长c-Met的抗人c-MetFab候选物
亲和性测定
为了进一步表征抗c-Met抗体，测定与全长人和短尾猴c-Met的亲和性。在4℃，将过量表达短尾猴c-Met的GTL16，CHO细胞或恒河猴4MBr-5细胞洗涤，用胰蛋白酶消化，并且悬浮在包含3％FCS(3％FCS/PBS)的PBS中。将2-5x105细胞/样品重新悬浮在140μl的包含5μg/ml的纯化抗c-Met Fab或其系列稀释物的3％FCS//PBS中。作为阳性对照，使用5μg/ml的DO24(小鼠IgG2a)，抗人c-Met。将细胞在4℃温育30-60分钟，之后在4℃在2000转/分钟(716g)离心2分钟进行沉淀，并且在200μl的冰冷的3％FCS/PBS中进行洗涤。将细胞再次通过离心沉淀并且轻柔去除PBS。将细胞重悬在100μl的以1:200稀释在3％FCS/0,02％NaN3/PBS中PE缀合的山羊抗人IgG(H+L)(Jackson CatNo.109-116-088)；对于阳性对照，使用以1:200稀释在3％FCS/PBS中PE缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)(Jackson Cat No.115-116-146)。将样品在暗处，在4℃温育30到60分钟。在离心并且在200μl的3％FCS/0,02％NaN3/PBS中洗涤后，将细胞重悬在100μl的3％FCS/PBS中并且利用FACS-阵列或FACS-Calibur测定。
将对于人和短尾猴c-Met的亲和性数据总结显示在本文表2中。发现在表2中显示的所有6种测试的Fab具有对于人c-Met低于100nM的亲和性。此外，9个克隆产生亲和性少于10nM的抗体。在所有测试的情形中，关于短尾猴和小鼠c-Met的亲和性几乎与关于人c-Met的亲和性相同。
表2.选定的Fab对于人，恒河猴和短尾猴c-Met的亲和性数据
 
抗体 KD[nM]人c-MetGTL-16   KD[nM]cynoc-MetCHO-c-Met cyno KD[nM]恒河猴c-Met4MBr-5           
4536 0.4 0.5 0.1
4537 2.6 ND 0.1
4541 0.5 ND 0.1
4682 1.2 0.3 0.3
4687 5.7 1.1 1.2
4690 1.1 ND 0.1
实施例4：
Figure G2007800120247D01031
免疫球蛋白的产生
转化为IgG形式
抗体介导的二聚化可以导致c-Met酪氨酸激酶活性的激活。因此，将基于结合纯化的c-Met选择的Fab转化为IgG形式。为了表达全长免疫球蛋白(Ig)，将重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域片段从
Figure G2007800120247D01032
X9_FHFab表达载体亚克隆到人IgG1和人IgG4的
Figure G2007800120247D01033
_h_Ig或
Figure G2007800120247D01034
2_h_Ig载体中。将限制性酶EcoRI，MfeI和BlpI用于将VH结构域片段亚克隆到
Figure G2007800120247D01035
_h_IgG1和_h_IgG4中。将限制性酶MfeI和BlpI用于将VH结构域片段亚克隆到
Figure G2007800120247D01037
2_h_IgG1f和
Figure G2007800120247D01038
2_h_IgG4中。利用EcoRV和BsiWI位点，将VL结构域片段亚克隆到
Figure G2007800120247D01039
_h_Igκ和
Figure G2007800120247D010310
2_h_Igκ中，而利用EcoRV和HpaI，将其亚克隆到
Figure G2007800120247D010311
_h_Igλ和
Figure G2007800120247D010312
2_h_Igλ2中。
瞬时表达和纯化人IgG
用等摩尔量的IgG重和轻链表达载体转染HEK293细胞。在转染后的4或5天，收集细胞培养物上清液。在将上清液的pH调节到8.0并且无菌过滤后，将溶液进行标准蛋白质A柱层析(Poros20A，PE生物***)。
将亲本Fab转化为IgG1和IgG4形式
与亲和性成熟的开始平行，将***物克隆到
Figure G2007800120247D010313
_h_IgG1和
Figure G2007800120247D010314
_h_IgG4表达载体中。通过瞬时转染HEK293细胞进行小规模表达，并且将全长免疫球蛋白从细胞培养物上清液中纯化。
鉴定调节c-Met依赖型增殖的抗人c-Met IgG候选物
接着，将得到的选自HuCAL
Figure G2007800120247D010315
文库不同的c-Met-特异性抗体转化为IgG形式并且测试抑制HGF驱动增殖的潜力。
在HGF刺激4MBr-5细胞后，利用BrdU结合测定评估每个选定克隆的功能活性。将4MBr-5细胞以3×103细胞/孔的密度接种在96-孔平底组织培养物处理板(Costar，#3610)的总体积100μl/孔Ham氏F12K中，所述Ham氏F12K补充了10％FBS。将所述板在含5％CO2的大气中，37℃温育2小时，随后加入50μl包含待测试纯化抗体的培养基。作为缺乏调节的阴性对照，将不相关抗体(具有与c-Met表位决定簇不相关的已知特异性)的样品或缓冲液加入指定孔中。将所述板在含5％CO2的大气中，37℃温育1小时，随后加入单独50μl培养基或50μl包含HGF(例如大约0.5μg/μl至大约50ng/ml)的培养基。将所述板在37℃，含5％CO2的大气中温育72小时，随后利用细胞增殖ELISA，BrdU-测定(Roche)Cat No.1669915测定BrDU结合。简单地，加入20μM/孔BrdU溶液(#1)并且将所述板在37℃，含5％CO2的大气中温育22小时。将培养基轻柔去除并且将所述板在60℃干燥1小时。加入200μ1FixDenat(溶液#2)并且将所述板在室温温育30分钟，伴随轻柔振荡。将溶液轻柔去除且加入100μl/孔的抗BrDU工作溶液。将所述板在室温温育90分钟，伴随轻柔振荡。将所述溶液轻柔去除并且用250μl洗涤溶液洗涤所述孔三次。将所述溶液轻柔去除并且在A405nm测量加入100μl/孔底物溶液的板。
EC50测定
本文表3显示了对于c-Met具有最大亲和性的抗体克隆，其显示50％抑制HGF刺激增生的有效浓度的数据。数据显示有效浓度EC50从4nM开始变动，其间具有介于6和150nM的中间值。
调节c-Met依赖型迁移的抗人c-Met IgG候选物的鉴定
利用NCI-H441细胞在QCMTM趋化性8μM96孔细胞迁移测定法中测定响应于HGF刺激的细胞迁移。如上所述，在测定前24小时，用无菌PBS将细胞洗涤两次并在包含1％FBS的DMEM中于37℃，含5％CO2的大气中进行饥饿处理。随后，将细胞用胰蛋白酶处理并在适当浓度的纯化抗体存在情况下，以1.0×106细胞/mL于37℃进行重悬30min。作为缺乏调节的阴性对照，向指定孔中添加不相关抗体(具有与c-Met表位决定簇不相关的已知特性)样品或缓冲液。
在无菌条件下除去迁移室板的盖子并向加样盘的孔中(较低的室)添加150μl无血清培养基，其包含50ng/ml HGF(R&D Cat No.294-HGN)。向上面室中轻柔地加入100μl含有1％FBS的DMEM，其中具有与抗体预培育过的5-10×104细胞。盖上板并于37℃，4-6％CO2的条件下培育16小时。根据生产商的说明书，弃去上面室中的细胞/培养基并将该室置入96-孔加样盘中，所述盘中已经加入了150μl/孔预温的细胞解离溶液。伴随着周期性轻柔搅动，通过于37℃培育30分钟来移动细胞。随后，向加样盘的每个孔中加入50μl预稀释的CyQuant GR染料。将所述盘于室温培育15分钟并将150μl混合物转移至新的适于使用480/520nm过滤装置进行荧光测量的96孔板中。
本文表3显示对于c-Met具有最大亲和性的抗体克隆显示50％抑制HGF刺激迁移的有效浓度的数据。数据显示有效浓度EC50从0.14nM开始变动，其间具有介于0.27和0.61nM的中间值。
表3.50％抑制选定Fab的有效浓度
 
Fab EC50[nM]抑制HGF驱动的增殖4MBr-5                  EC50[nM]抑制HGF驱动的迁移NCI-H441               
4536 4 0.61
4537 150 0.14
4541 200 0.27
4687 6 1.68
实施例5：通过LCDR3和HCDR2盒的平行交换进行的选定抗c-MetFab的亲和性成熟
为了优化本文所述抗体对c-Met的亲和性，对于亲本Fab片段库，利用BpiI和SphI去除每个亲本Fab轻链的LCDR3，框架4和恒定区(405bp)，并由不同的LCDR3以及框架4和恒定结构域的所有组成成分替代。将0.5μg结合物库载体样品与3倍摩尔数过量的携带各种LCDR3的***片段连接。
在类似的方法中，利用XhoI和BssHII位点来多样化HCDR2，并保持连接框架区恒定。为了提高克隆效率，在用590bp填充序列代替亲本HCDR2后***各种HCDR2盒。
将不同文库的连接混合物电穿孔入4ml大肠杆菌TOP10F′细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，产生2x107到2x108个独立菌落。如先前所述进行文库的扩增(Rauchenberger等，2003J Biol Chem.278(40)：38194-38205)。对于质量控制，随机选择每个文库若干克隆并利用引物CFR84(VL)和OCAL_Seq_Hp(VH)进行测序(SequiServe，Vaterstetten，德国)。
亲和性成熟候选物的选择
利用下列特性选择六种选定的成熟候选物(“亲本Fab”)：对人c-Met小于10nM的亲和性，其对短尾猴c-Met具有显著的交叉反应性，EC50小于250nM，良好地调节大肠杆菌中Fab的表达水平和在c-Met驱动的增殖和迁移测定中，IgG形式的活性。表4提供了选定Fab片段的特性。
表4.选定Fab的特性
 
抗体 KD[nM]人c-MetBIAcore KD[nM]人c-MetGTL-16 KD[nM]cyno c-MetCHO-cynoc-Met     Fab表达[mg/l] EC50[nM]4Mbr-5增殖IgG    EC50[nM]NCI-H441迁移IgG     
4536 1.4 1.7 229.1 6.3 4 0.61
4537 1.7 1.5 12.7 7.4 150 0.14
4541 2.6 1.7 0.6 5.3 200 0.27
4687 0.8 4.0 1.3 1.4 6 1.68
生成亲和性成熟的选定Fab文库
为了获得具有抗c-Met抗体的提高的亲和性和抑制性活性的克隆，对前面实施例中所示的选定Fab克隆作进一轮的多样化和选择，其称作亲和性成熟的过程。为此目的，利用通过三核苷酸诱变预构建的相应LCDR3和HCDR2成熟盒多样化CDR区(
Figure G2007800120247D0107131341QIETU
等，1994，Nucleic Acids Res.，22：5600-5607；Nagy等，2002，Nature Medicine，8：801-807)。
将来自表达载体
Figure G2007800120247D01071
X9_Fab_FH的Fab片段亚克隆入噬菌体粒载体
Figure G2007800120247D01072
25(参见美国专利6,753,136)。这种载体提供N端融合至半胱氨酸残基上的噬菌体蛋白pIII以及融合到Fd抗体链上C端半胱氨酸，由此允许各个Fab片段在噬菌体表面上的二硫键连接展示。同时应用两种不同的策略以优化亲本Fab的亲和性和效力。
生成五种噬菌体抗体Fab文库，其中六种亲本克隆中五种的LCDR3被各个轻链CDR3序列的所有组成成分所替代。(不进行一个克隆的LCDR3成熟，因为此克隆CDR区其中之一具有额外的BpiI限制性位点而BpiI限制酶被用于文库克隆过程。)
同时，将每个亲本克隆的HCDR2区用各个重链CDR2序列的所有组成成分替代。剪切掉每个亲本Fab并替代以590bp填充序列。这种DNA填充物有利于从双消化载体条带中分离单一消化载体并在成熟淘选过程中减弱高亲和性亲本Fab的背景。在接下来的步骤中，从每个亲本克隆的编码Fab的质粒中剪切所述填充序列并替代以高多样化的HCDR2成熟盒。
通过标准克隆方法制成超过2x107个成员的大规模亲和性成熟文库，并将多样化的克隆转化入电感受态大肠杆菌TOP10F′细胞(Invitrogen)中。如上所述制备呈现Fab的噬菌体。
构建成熟库以便促进随后的选择过程：由LCDR3-1文库组成库1a；由HCDR2-1文库组成库1b；由LCDR3-2文库组成库2a；和由HCDR2-2文库组成库2b。
对于每种库在溶液中利用减少量的His-Strep-标记的c-Met和Strep-Tactin珠进行的噬菌体抗原捕获进行淘选。同时，利用减少量的生物素酰化的c-Met将每种库应用于淘选中，所述c-Met捕获到Neutravidin涂布的板上。为了提高淘选的严谨性和选择提高的解离速率，在延长的培育期中用纯化的亲本Fab以及未标记的抗原进行竞争。
在淘选后立即将富集的噬菌体粒库亚克隆入
Figure G2007800120247D0108131432QIETU
表达载体中。挑出单一亚隆，并用IPTG诱导Fab基因的表达。
成熟淘选策略
在溶液中分别以His-Strep-标记的c-Met和以生物素酰化的His-Strep-标记的c-Met进行淘选步骤两至三个循环，所述淘选步骤使用四种抗体库。对于每种淘选策略，利用与纯化亲本Fab蛋白质或与未标记APP-标记的c-Met的竞争，以及低抗原浓度和充分洗涤，来提高严谨性。
主要根据实施例1中标准方案对未标记His-Strep-标记的c-Met的溶液淘选进行超过两轮选择。这些步骤的不同之处是应用抗原的量减少(从5nM降低到1nM)，提高有或无竞争剂的洗涤步骤的严谨性，以及抗体-噬菌体与抗原的培育期延长。
对于利用生物素酰化的c-Met进行的第一轮选择，用300μl PBS将Neutravidin板的孔洗涤两次。用1:1稀释于PBS(封闭缓冲液)中的2×ChemiBLOCKER(Chemicon，Temecula，CA)封闭孔。在选择之前，还用相同体积的包含0.1％Tween-20的封闭缓冲液于室温将HuCAL
Figure G2007800120247D01091
噬菌体封闭30分钟。将100μl封闭过的噬菌体制品等份样品于室温转移至Neutravidin包被板上，培育30分钟。将此预吸附步骤重复一次。将封闭过的和预清洁的噬菌体制品与5nM生物素酰化的c-Met一起于22℃在旋转轮上培育2小时。加入包含亲本Fab和APP-c-Met的样品，或不包含竞争剂的阳性对照，并将样品于4℃在旋转轮上培育过夜。
将抗原噬菌体复合物于室温捕获在Neutravidin板的孔中。在充分洗涤步骤后，通过于室温每孔加入200μl以10mM Tris pH8.0制备的20mMDTT洗脱结合的噬菌体颗粒10min。移除洗脱物并加入到生长至OD600nm0.6-0.8的14ml大肠杆菌TG1细胞中。用200μl PBS将孔漂洗一次并且也将这种溶液加入到大肠杆菌TG1细胞中。噬菌体感染大肠杆菌在没有摇晃的情况下于37℃进行45min。5000转/分钟离心10min后，将每种细菌沉淀物重悬于500μl2×YT培养基中，铺在2×YT-CG琼脂糖板上并于30℃培育过夜。通过从板表面刮取收集菌落并如上所述进行噬菌体颗粒复苏和扩增。
如上面对于第一轮选择所述的那样进行第二和第三轮选择，不同之处是洗涤条件更加严谨并且抗原浓度分别为1nM和0.1nM。
对结合c-Met的Fab进行基于电化学发光(BioVeris)的结合分析
为了检测大肠杆菌裂解物(BEL提取物)中亲和性提高的c-Met特异性抗体片段，使用BioVeris M-384
Figure G2007800120247D01092
Workstation(BioVerisEurope，Witney，Oxfordshire，UK)。在96孔聚丙烯微量滴定板中以添加了0.5％BSA和0.02％Tween-20的PBS作为测定缓冲液进行测定。根据供应商的说明书将生物素酰化的人c-Met固定在M-280链霉亲和素顺磁珠(Dynal)上。每孔加入1:25稀释的珠储存液。将100μl稀释的BEL提取物和珠的样品于室温在震荡器上培育过夜。根据供应商的说明书(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)，使用标记了BV-tagTM的抗人(Fab)’2(Dianova)进行检测。
通过上述方法分析一组随机挑取的克隆。选择给出最高值的那些克隆子集在溶液平衡滴定中作进一步分析。
利用溶液平衡滴定(SET)测定皮摩尔亲和性
对于KD测定，使用Fab的单体级分(至少90％单体含量，通过分析性SEC进行分析；Superdex75，Amersham Pharmacia)。基本如Haenel等，2005所述，进行溶液中的基于电化学发光(ECL)的亲和性测定和数据评估。在溶液中将恒定量的Fab与不同浓度(系列3n稀释)的人c-Met(4nM起始浓度)平衡。加入偶联到顺磁珠(M-280链霉亲和素，Dynal)上的生物素酰化的人c-Met，和BV-tagTM(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)标记的抗人(Fab)’2(Dianova)并将混合物培育30min。随后，利用
Figure G2007800120247D01101
384分析仪(BioVeris Europe)通过ECL检测量化未结合Fab的浓度。
为此目的，选择单一克隆并通过Ni-NTA琼脂糖以μg规模进行纯化。在BioVeris中通过4点溶液平衡滴定(SET)测定初步亲和性。由这些数据，选择显示亲和性的克隆。以mg规模纯化这些Fab。利用8点SET测量和人、小鼠和短尾猴c-Met对每个Fab克隆的两个独立批次测定最终亲和性。
基本如上所述利用小鼠c-Met(R&D Systems)和短尾猴c-Met作为溶液中的分析物而非人c-Met，进行小鼠和短尾猴c-Met的亲和性测定。对于游离Fab的测定，使用偶联到顺磁珠上的生物素酰化的人c-Met。根据本领域技术人员已知的方法来计算亲和性，例如Haenel等，2005，AnalBiochem，339.1：182-184中公开的。
利用如上所述的测定条件，在溶液中测定经亲和性优化的抗c-MetFab的亲和性。测定的抗体亲和性，抗人c-Met的KD低于4.6pM。如上所述，进行CHO细胞上表达的cyno-c-Met的结合的基于FAC的分析。亲和性总结在本文的表5中。
表5.Fab的亲和性
 
亲和性[pM]：溶液平衡滴定 KD[pM]cynoc-MetCHO-cyno c-Met   
抗体5091509750985185 人c-Met2.4±0.53.6±0.92.1±0.54.6±3.9 Cyno c-Met900.680.3±0.10.29     
实施例6：亲和性优化的抗人c-Met Fab的特征
FACS饱和技术
测定50％人血清(HS)存在时成熟Fab的结合特异性。在50％人血清或2.8％BSA存在的情况下培育优化的抗c-Met Fab的连续稀释物。评估对于GTL-16细胞的FACS饱和结合。洗涤GTL16细胞，用胰蛋白酶处理，并于4℃混悬于包含3％FCS的PBS(3％FCS/PBS)中。将2-5x105个细胞/样品重悬于140μl包含5μg/ml纯化的优化抗c-Met Fab或其连续稀释物的3％FCS/PBS中。作为阳性对照，使用5μg/ml DO24(小鼠IgG2a)，抗人c-Met。将细胞在4℃培育30-60分钟后，于4℃2000转/分钟(716g)离心2分钟沉淀并在200μl冷却的3％FCS/PBS中洗涤。再次通过离心沉淀细胞并将PBS轻柔地除去。将细胞重悬于以1:200稀释在3％FCS/PBS里的100μl山羊抗人IgG(H+L)PE缀合物中(Jackson目录号109-116-088)；对于阳性对照使用以1:200稀释在3％FCS/PBS里的山羊抗小鼠IgG(H+L)-PE缀合物中(Jackson目录号115-116-146)。将样品于4℃黑暗中培育30-60分钟。在离心并在200μl3％FCS/PBS中洗涤后，将细胞重悬于100μl3％FCS/PBS中并利用FACS阵列或FACS-Calibur测定。
例示性的结合曲线显示于表6中，其总结了与存在2.8％BSA中的结合活性相比，优化抗c-Met Fab在50％人血清存在情况下的结合活性，其范围从83.3％到100％。发现中间值为90.2％，由此发现抗c-Met Fab在人血清存在的情况下完全结合靶标。
表6.Fab的结合活性
 
抗体 结合活性w/50％人血清对2.8％BSA(％)                          
5091 83.8
5097 90.2
5098 100
5185 ＊
＊ 由于未达到饱和关于EC50未分析5185的结合
优化抗c-Met候选Fab转变为IgG形式
抗体介导的二聚化作用可以导致c-Met酪氨酸激酶活性的激动性激活。所以在结合纯化c-Met基础上将选择的优化Fab转变为IgG形式。为了表达全长免疫球蛋白(Ig)，对于人IgG1和人IgG4，将重(VH)和轻链(VL)的可变结构域片段从
Figure G2007800120247D01121
X9_FH Fab表达载体亚克隆入_h_Ig或
Figure G2007800120247D01123
2_h_Ig载体系列中。使用限制性酶EcoRI，MfeI，和BlpI将VH结构域片段亚克隆入
Figure G2007800120247D01124
_h_IgG1和
Figure G2007800120247D01125
_h_IgG4。使用限制性酶MfeI和BlpI将VH结构域片段亚克隆入
Figure G2007800120247D01126
2_h_IgG1f和2h_I_gG4中。利用EcoRV和BsiWI位点将VL结构域片段亚克隆入
Figure G2007800120247D01128
_h_Igκ和
Figure G2007800120247D01129
2_h_Igκ中，而利用EcoRV和HpaI亚克隆入
Figure G2007800120247D01131
_h_Igλ和
Figure G2007800120247D01132
2_h_Igλ2中。
人IgG的瞬时表达和纯化
用等摩尔量的IgG重和轻链表达载体转染HEK293细胞。在转染后的第4或5天，收集细胞培养物上清液。在将上清液的pH调节到8.0和无菌过滤后，将溶液进行标准蛋白质A柱层析(Poros20A，PE Biosystems)。
鉴定调节c-Met依赖型增殖的优化抗人c-Met IgG候选物
随后将得到的选自HuCAL
Figure G2007800120247D01133
文库的优化c-Met-特异性抗体转变成IgG形式并测试抑制HGF驱动增殖的潜力。
在HGF刺激4MBr-5细胞后，利用BrdU掺入测定法评估每种选定克隆的功能活性。在96孔平底组织培养物处理板(Costar，#3610)中将4MBr-5细胞以3×103细胞每孔的密度接种在总体积100μl/孔Ham氏F12K中，所述Ham氏F12K添加了10％FBS。将板于37℃，含5％CO2的大气中培育2小时，其后加入50μl包含待测纯化抗体的培养基。作为缺乏调节的阴性对照，将不相关抗体的样品(具有与c-Met表位决定簇不相关的已知特性)或缓冲液加入到指定孔中。将板于37℃，含5％CO2的大气中培育1小时，其后加入50μl的单独培养基或50μl包含HGF的培养基(例如大约0.5μg/μl到大约50ng/ml)。将板于37℃，含5％CO2的大气中培育72小时，其后用细胞增殖ELISA，BrdU-测定(Roche)目录号1669915测定BrDU掺入。简言之，加入20μM/孔的BrdU溶液(#1)并将板于37℃，含5％CO2的大气中培育22小时。轻柔地去除培养基并将板于60℃干燥1小时。加入200μl FixDenat(溶液#2)并将板于室温伴随着轻柔地摇晃培育30分钟。轻柔地去除溶液并加入100μl/孔抗BrDU工作溶液。将板于室温伴随着轻柔地摇晃培育90分钟。轻柔地去除溶液并用250μl洗涤溶液将孔洗涤三次。轻柔地去除溶液并加入100μl/孔的底物溶液，于A405nm测量板。
EC50测定
本文表7显示对于c-Met具有最大亲和性的抗体克隆显示50％抑制HGF刺激增殖的有效浓度的数据。数据显示有效浓度EC50为从0.13nM开始变动，具有介于0.5nM和1.3nM的中间值。
表7.IgG形式的优化抗c-Met候选物对HGF刺激的增殖的抑制活性
 
抗体 EC50[nM]HGF驱动的增殖的抑制10％血清中的4MBr-5         
5091 1.3
5097 1.6
5098 0.5
5185 0.13
酶联免疫吸附测定(ELISA)技术
测定存在50％人血清(HS)时成熟Fab的结合特异性。将TBS中的人重组的，生物素酰化抗体的连续稀释液于室温包被到Neutravidin微量滴定板上2小时，从8ng抗体每孔到125ng抗体每孔的浓度。在包被抗原后，用添加了1％BSA的TBS/0.05％Tween(TBS-T)于室温将孔封闭1小时。将上述纯化的Fab稀释在TBS/4％BSA或TBS/50％HS中，终浓度为1μg/ml，加入到包被和封闭过的孔中并将板于室温培育1小时。为了进行检测，使用抗FLAG碱性磷酸酶(AP)-缀合的抗体(1:5000稀释于TBST中)和荧光底物AttoPhos(Roche)。每次培育后，都用TBST将微量滴定板的孔洗涤五次，不同之处是在最后使用标记的二抗培育步骤后，洗涤孔三次。在TECAN光谱仪板读取器中测量荧光。
调节c-Met依赖型迁移的抗人c-Met IgG候选物的鉴定
利用NCI-H441细胞在QCMTM趋化性8μM96孔细胞迁移测定法中测定响应于HGF刺激的细胞迁移。如上所述，在测定前24小时，用无菌PBS将细胞洗涤两次并在包含1％FBS的DMEM中于37℃，含5％CO2的大气中进行饥饿处理。随后，将细胞用胰蛋白酶处理并在适当浓度的纯化抗体存在的情况下，以1.0×106细胞/mL于37℃进行重悬30min。作为缺乏调节的阴性对照，向指定孔中添加不相关抗体(具有与c-Met表位决定簇不相关的已知特性)样品或缓冲液。
在无菌条件下除去迁移室板的盖子并向加样盘的孔中(较低的室)添加150μl无血清培养基，其包含50ng/ml HGF(R&D Cat No.294-HGN)。向上面室中轻柔地加入100μl含有1％FBS的DMEM，其中含有抗体预培育的5-10×104个细胞。盖上板并于37℃，4-6％CO2下培育16小时。根据生产商的说明书，弃去上面室中的细胞/培养基并将该室置入96-孔加样盘中，所述盘中已经加入了150μl/孔预温的细胞解离溶液。伴随着周期性的轻柔地搅动，通过于37℃培育30分钟来移动细胞。随后，向加样盘的每个孔中加入50μl预稀释的CyQuant GR染料。将所述盘于室温培育15分钟并将150μl混合物转移至新的适于使用480/520nm过滤装置进行荧光测量的96孔板。
对于c-Met具有最大亲和性的抗体克隆显示50％抑制HGF刺激迁移的有效浓度的数据显示于本文表8中。数据显示有效浓度EC50为从0.61nM开始变动，具有介于0.73nM和0.76nM的中间值。
表8.IgG形式的优化抗c-Met候选物对HGF刺激的迁移的抑制活性
 
抗体 EC50[nM]抑制HGF驱动的迁移1％血清中的NCI-H441      
5091 0.61±0.22
5097 0.76±0.69
5098 0.73±1.1
5185 1.2±1.3
实施例7：通过选定拮抗性抗c-Met抗体调节HGF刺激的c-Met自体磷酸化作用
通过有或无HGF刺激激活或抑制细胞中c-Met磷酸化来测量本发明抗c-Met抗体的激动性或拮抗性。将例如A549细胞的细胞系细胞以3×104细胞每孔的密度在96孔平底组织培养物处理板(Costar，#3595)上接种于总体积100μl/孔的DMEM中，所述DMEM添加了10％FBS。将板于37℃，含5％CO2的大气中培育24小时，其后由所述板的每个孔中轻柔地吸出培养基并加入100μl/孔体积的DMEM。将板于37℃在含5％CO2的大气中培育24小时，其后向孔中稀释于DMEM的细胞加入待测的纯化抗体样品，100μl/孔的抗体或稀释液。作为缺乏激活的阴性对照，向指定孔中加入不相关抗体(具有与c-Met表位决定簇不相关的已知特性)样品或缓冲液。
将细胞于37℃培育短时期(例如2小时)或更长的时期(例如24小时)。适当的时候，通过加入HGF的无血清DMEM培养基刺激细胞，其中HGF最终浓度为200ng/孔。一般来说，当测定抗体的激动性活性时，除了阳性对照(未用抗体处理)之外，测试样品抗体孔中都没有HGF。一般来说，当测定抗体的拮抗性活性时，在样品抗体孔中包括HGF。将板于37℃再培育10min，随后从所述板的孔中轻柔地吸出培养基。用冷PBS洗涤细胞并从板中轻柔地吸出溶液。用50μl裂解缓冲液(NP-40裂解缓冲液：120mM NaCl，50mM Tris-HClpH7.5，1％NP-40，1mM EDTA，6mMEGTA，20mM NaF，1mM苯甲脒，新添加0.5mM Na3VO4和0.1mMPMSF)裂解细胞。在室温下将所述板摇晃15分钟，随后保存于-80℃，直到需要进行ELISA。
用ELISA测定c-Met磷酸化水平。对于ELISA板的制备，用洗涤缓冲液(PBS-0.05％Tween Biorad#670-6531)将Nunc-ImmunoTM板，MaxiSorbTM表面(VWR International AG，N°391-8786)洗涤两次，并加入100μl c-Met单克隆捕获抗体(DO-24)的PBS溶液。将板于4℃培育过夜并用PBS-0.05％Tween洗涤三次。用200μl/孔3％BSA的PBS-T于室温伴随摇晃封闭非特异性结合位点2小时。除去封闭液后立即进行使用。
通过在室温下摇晃融解冷冻的细胞裂解物，并向Nunc-Immuno板中加入40μl裂解物后将板在4℃下培育4小时。用PBS-T将板洗涤三次，及加入50μl/孔的0.2μg/ml抗磷酸酪氨酸抗体PY20-HRP(ZYMED，#03-7722)的3％牛血清白蛋白-PBS-T。将板在4℃下培育过夜并用PBS-T洗涤三次。吸出PBS-T并加入90μl/孔的碱性磷酸酶底物(CDR-Star，TROPIX，#MS100RY)并在轻柔地摇晃的同时于室温下显色45min。利用96孔板读取器读取所述板。
对于c-Met具有最大亲和性的抗体克隆显示50％抑制HGF刺激迁移的有效浓度的数据显示于本文表9中。数据显示有效浓度EC50为从0.166nM变动，具有介于0.193nM和0.219nM的中间值。
表9.IgG形式的优化抗c-Met候选物对HGF刺激的受体自体磷酸化作用的抑制活性
 
抗体 EC50[nM]于A549中抑制HGF刺激的c-Met自体磷酸化
5091 0.193
5097 0.166
5098 0.419
5185 0.219
实施例8：对于表达优化的基因的氨基酸序列和核苷酸序列
为了提高哺乳动物表达，向本文的Fab的重和轻链中导入改变，用于优化在哺乳动物细胞中表达所使用的密码子。已知若干阴性顺式作用模体降低在哺乳动物中的表达。本文的优化步骤去除负面影响表达的阴性顺式作用位点(例如剪接位点或多(A)信号)。本文的优化步骤还富集GC含量，以延长mRNA半衰期。
利用Fab的克隆优化可变轻和重链区并通过用噬菌体展示选择来进行分离。随后利用这些方法对编码这一和其它克隆的每一种完整轻和重链的核苷酸序列一一进行优化。
V H 和V L 链的优化过程
为了优化每一种VL和VH链的核苷酸序列和氨基酸序列，采用哺乳动物，特别是人类(H.sapiens)基因所偏好使用的密码子。此外，在可能的情况下减少或消除极高(>80％)或极低(<30％)GC含量的区域。
在优化过程中，避免下列顺式作用序列模体：内部TATA-盒，chi-位点和核糖体进入位点，AT-富集或GC-富集序列区段，RNA不稳定模体(ARE)序列元件，抑制性RNA序列元件(INS)，cAMP响应性(CRS)序列元件，重复序列和RNA二级结构，包括隐含位点的剪接供体和受***点和分枝点。除非指明，在优化VL链核苷酸序列的过程中避免导入MluI和HindIII位点。除非指明，在优化VH链核苷酸序列的过程中避免导入MlyI和BstEII位点。
对于表达优化的V H 和V L 链的氨基酸序列
对于上述克隆的VH和VL链所得到的优化氨基酸序列采用哺乳动物密码子使用偏好以便确保在哺乳动物细胞中获得更高和更稳定的表达率。
可以使用柱状图以分别显示每一种亲本序列和优化基因的序列密码子百分率，并分析编码VH和VL链的相关核苷酸序列的质量类别。本文所用的质量值意指在所需表达***中对于给定氨基酸最常用的密码子被设定为100，剩余的密码子根据使用频率来进行打分。(Sharp，P.M.，Li，W.H.，Nucleic Acids Res.15(3)，1987)。
另外，密码子适应指数(CAI)是描述核苷酸序列的密码子匹配靶标生物密码子的使用偏好的程度。CAI的最大值设定为1.0，因而>0.9的CAI被认为可以获得高表达。据发现优化前VL链的CAI为0.73，而在优化后，经测定CAI为0.95。类似地，优化前VH链的CAI为0.74，而在优化后，经测定为0.98。
由亲本序列至优化序列，VL链中的GC含量提高。
全长轻链和重链表达的优化
对每一种轻链的亲本全长核苷酸序列和重链的亲本全长核苷酸序列应用优化方法。
利用所述优化方法来构建与亲本克隆号相关联的轻链核苷酸序列。另外，利用所述优化方法来构建与亲本克隆号相关联的重链核苷酸序列。
表E.本发明序列表
 
Ab参考号-链类型 SEQ IDNO：   序列
04536VL 1 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGGCTTATGATTCTTCTATGCTTCGTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                       
05087VL 2 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGCTAATTATCATGATTCTTGGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                    
05088VL 3 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGCTTCTGATTATACTTCTTGGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                    
05091VL 4 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGCTCATTATCATGATATTTGGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                    
05092VL 5 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGGCTCATGATTCTCTTTATTCTCGTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                       
04687VL 6 GATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATTATAATCATCCTCATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG        
05097VL 7 GATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATGCTTTTGGTTGGACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG           
05098VL 8 GATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCTTCAGTATTCTGATGAGCCTTGGACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG        
05100VL 9 GATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATGCTTATGAGCCTAATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG        
 
05101VL 10 GATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAATAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAATTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGACGTGGCGGTGTATTATTGCCTTCAGTATGCTTTTTCTCCTTGGACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG        
04541VL 11 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATAATATTGGTTCTTATTATGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATAATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGATTTTCCTTCTATTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                          
05093VL 12 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATAATATTGGTTCTTATTATGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATAATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGATTCTTATATTTTTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                          
05094VL 13 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATAATATTGGTTCTTATTATGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATAATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCTCTACTTATGATGCTTTTACTTTTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                          
05095VL 14 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATAATATTGGTTCTTATTATGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATAATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGATAAGTATGTTTTTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                          
04537VL 15 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTCTTCGTTCTTATTTTGTTTCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATGATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGCTTCTTGGGATACTCTTTCTGATGTTGAGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                    
05102VL 16 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTCTTCGTTCTTATTTTGTTTCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATGATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGCTTCTTGGGATCCTCCTTCTGCTTTTGAGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                    
05105VL 17 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTCTTCGTTCTTATTTTGTTTCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATGATGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGCTTCTTGGGATAATGATCATTTTGAGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                       
04690VL 18 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATAAGCTTGGTTCTTATTTTGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATGATAATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTTTGGTATTTCTAATTTTTATGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                       
05106VL 19 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATAAGCTTGGTTCTTATTTTGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATGATAATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGG
 
CAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGGTTCTTGGGCTTATCTTGGTGATGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG                          
04682VL 20 CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGAAAGCCTGAAAATTAGCTGCAAAGGTTCCGGATATTCCTTTACTAATTATGGTATTGCTTGGGTGCGCCAGATGCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATCTATCCGTCTGATAGCTATACCAATTATTCTCCGAGCTTTCAGGGCCAGGTGACCATTAGCGCGGATAAAAGCATTAGCACCGCGTATCTTCAATGGAGCAGCCTGAAAGCGAGCGATACGGCCATGTATTATTGCGCGCGTATGTCTTATGATTATCAGCATCAGGCTCCTTCTATGGATTCTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA                               
04536VH 21 CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAATTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATCAATCCGTGGACTGGCAATACGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGGTTTTTTTTATTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA                                     
05078VH 22 CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAATTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATTGATCCTTGGAATGGTCAGACTAATTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTCACCATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGGTTTTTTTTATTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA                                     
05079VH 23 CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAATTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGTTATTGATCCTTGGAATGGTATTACTAATTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTCACCATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGGTTTTTTTTATTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA                                     
04687VH 24 CAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGGTATCGATCCGTTTGGCACTGCGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGTTTATCAGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA           
05081VH 25 CAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGGTATTGATCCTATTATGGGTACTGAGTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGTTTATCAGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA           
05082VH 26 CAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCTATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGAGATTGATCCTGTTATTGGTGAGACTGATTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGTTTATCAGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA        
04541VH 27 CAGGTGCAATTGCAAGAAAGTGGTCCGGGCCTGGTGAAACCGGGCGAAACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTTTCCGGAGGTAGCATTTCTTCTTCTTCTTATTATTGGAATTGGATTCGCCAGGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATTGGCGAGATCTATTTTGGCTGGACCTATTATAATCCGAGCCTGAAAGGCCGGGTGACCATTAGCGTTGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGAAACTGAGCAGCGTGACGGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTTATGAGTTTCATGGTTATACTACTTTTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA                                     
04537VH 28 CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGAAAGCCTGAAAATTAGCTGCAAAGGTTCCGGATATTCCTTTTCTAATTATTGGATTGGTTGGGTGCGCCAGATGCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATGGGCTTT
 
ATCTTTCCGGATACTAGCTATACCCGTTATTCTCCGAGCTTTCAGGGCCAGGTGACCATTAGCGCGGATAAAAGCATTAGCACCGCGTATCTTCAATGGAGCAGCCTGAAAGCGAGCGATACGGCCATGTATTATTGCGCGCGTGTTAAGCTTATTACTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA  
04690VH 29 CAGGTGCAATTGCAACAGTCTGGTCCGGGCCTGGTGAAACCGAGCCAAACCCTGAGCCTGACCTGTGCGATTTCCGGAGATAGCGTGAGCTCTAATTCTGCTGCTTGGGGTTGGATTCGCCAGTCTCCTGGGCGTGGCCTCGAGTGGCTGGGCCGTATCTATTATCGTAGCAAGTGGGTTAACGATTATGCGGTGAGCGTGAAAAGCCGGATTACCATCAACCCGGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGCAACTGAACAGCGTGACCCCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCAGGGTGCTGTTTATCCTGGTCCTTATGGTTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA                         
04682VH 30 GATATCGTGCTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGTGGCGCACCAGGTCAGCGTGTGACCATCTCGTGTAGCGGCAGCAGCAGCAACATTGGTTCTAATTATGTGATTTGGTACCAGCAGTTGCCCGGGACGGCGCCGAAACTTCTGATTTATGATGATACTAATCGTCCCTCAGGCGTGCCGGATCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCACCAGCGCGAGCCTTGCGATTACGGGCCTGCAAAGCGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCTCTACTTATGATAATTATCAGGCTGGTTGGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG              
04536VL 31 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQAYDSSMLRVFGGGTKLTVLGQ                                         
05087VL 32 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYANYHDSWVFGGGTKLTVLGQ                                        
05088VL 33 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYASDYTSWVFGGGTKLTVLGQ                                        
05091VL 34 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYAHYHDIWVFGGGTKLTVLGQ                                        
05092VL 35 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQAHDSLYSRVFGGGTKLTVLGQ                                         
04687VL 36 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNHPHTFGQGTKVEIKRT                                    
05097VL 37 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYAFGWTFGQGTKVEIKRT                                     
05098VL 38 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLQYSDEPWTFGQGTKVEIKRT                                    
05100VL 39 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYAYEPNTFGQGTKVEIKRT                                    
05101VL 40 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLQYAFSPWTFGQGTKVEIKRT                                    
04541VL 41 VLDIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSYYVYWYQQKPGQAPVLVIYDDNDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYDFPSIVFGGGTKLTVLGQ                                        
05093VL 42 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSYYVYWYQQKPGQAPVLVIYDDNDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYDSYIFVFGGGTKLTVLGQ                                          
05094VL 43 DIELTQPPSVSVAPGQTARISGSGDNIGSYYVYWYQQKPGQAPVLVIYDDNDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCSTYDAFTFVFGGGTKLTVLGQ                                          
05095VL 44 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSYYVYWYQQKPGQAPVLVIYDDNDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYDKYVFVFGGGTKLTVLGQ                                          
04537VL 45 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSLRSYFVSWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCASWDTLSDVEVFGGGTKLTVLGQ                                        
05102VL 46 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSLRSYFVSWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCASWDPPSAFEVFGGGTKLTVLGQ                                        
 
05105VL 47 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSLRSYFVSWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCASWDNDHFEVFGGGTKLTVLGQ                                         
04690VL 48 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDKLGSYFVYWYQQKPGQAPVLVIYDDDNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSFGISNFYVFGGGTKLTVLGQ                                         
05106VL 49 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDKLGSYFVYWYQQKPGQAPVLVIYDDDNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCGSWAYLGDVFGGGTKLTVLGQ                                          
04682VL 50 DIVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVIWYQQLPGTAPKLLIYDDTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQSEDEADYYCSTYDNYQAGWVFGGGTKLTVLGQ                                      
05174VL 51 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYANYHDSWVFGGGTKLTVLGQ                                        
05184VL 52 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYAHYHDIWVFGGGTKLTVLGQ                                        
05185VL 53 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYAYEPNTFGQGTKVEIKRT                                    
05186VL 54 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLQYAFSPWTFGQGTKVEIKRT                                    
04536VH 55 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMNWVRQAPGQGLEWMGIINPWTGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGFFYYTPSDLWGQGTLVTVSS                             
05078VH 56 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMNWVRQAPGQGLEWMGIIDPWNGQTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGFFYYTPSDLWGQGTLVTVSS                             
05079VH 57 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMNWVRQAPGQGLEWMGVIDPWNGITNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGFFYYTPSDLWGQGTLVTVSS                             
04687VH 58 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIDPFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYQDVWGQGTLVTVSS                                     
05081VH 59 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIDPIMGTEYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYQDVWGQGTLVTVSS                                     
05082VH 60 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGEIDPVIGETDYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYQDVWGQGTLVTVSS                                    
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04537VH 62 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSNYWIGWVRQMPGKGLEWMGFIFPDTSYTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVKLITDYWGQGTLVTVSS                                  
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序列表
<110>诺瓦提斯公司
<120>c-Met抗体的组合物和使用方法
<130>ON/4-34782A
<150>US 60/787556
<151>2006-03-30
<160>96
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>327
<212>DNA
<213>人
<400>1
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<211>330
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<210>5
<211>327
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<212>DNA
<213>人
<400>20
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<212>DNA
<213>人
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tca                                                                  363
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<211>363
<212>DNA
<213>人
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<212>DNA
<213>人
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<211>339
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<213>人
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gaactgagca gcctgcgtag cgaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgtttatcag    300
gatgtttggg gccaaggcac cctggtgacg gttagctca                           339
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<212>DNA
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<210>27
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<212>DNA
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<400>27
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acctgcaccg tttccggagg tagcatttct tcttcttctt attattggaa ttggattcgc    120
caggcccctg ggaagggtct cgagtggatt ggcgagatct attttggctg gacctattat    180
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ctgaaactga gcagcgtgac ggcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtggttat    300
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tca                                                                  363
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<212>DNA
<213>人
<400>28
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tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat    240
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cttattactg attattgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca                 348
<210>29
<211>375
<212>DNA
<213>人
<400>29
caggtgcaat tgcaacagtc tggtccgggc ctggtgaaac cgagccaaac cctgagcctg     60
acctgtgcga tttccggaga tagcgtgagc tctaattctg ctgcttgggg ttggattcgc    120
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cgtcagggtg ctgtttatcc tggtccttat ggttttgatg tttggggcca aggcaccctg    360
gtgacggtta gctca                                                     375
<210>30
<211>336
<212>DNA
<213>人
<400>30
gatatcgtgc tgacccagcc gccttcagtg agtggcgcac caggtcagcg tgtgaccatc     60
tcgtgtagcg gcagcagcag caacattggt tctaattatg tgatttggta ccagcagttg    120
cccgggacgg cgccgaaact tctgatttat gatgatacta atcgtccctc aggcgtgccg    180
gatcgtttta gcggatccaa aagcggcacc agcgcgagcc ttgcgattac gggcctgcaa    240
agcgaagacg aagcggatta ttattgctct acttatgata attatcaggc tggttgggtg    300
tttggcggcg gcacgaagtt aaccgttctt ggccag                              336
<210>31
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>31
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Tyr Asp Ser Ser Met Leu Arg
                85                  90                  95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
            100                 105
<210>32
<211>110
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(110)
<223>与SEQID NO：51相同
<400>32
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Asn Tyr His Asp Ser
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1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Ser Asp Tyr Thr Ser
                85                  90                  95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
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            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
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Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala His Tyr His Asp Ile
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Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
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1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
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<212>PRT
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Arg Thr
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Thr
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<212>PRT
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Arg Thr
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Arg Thr
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<212>PRT
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(114)
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Gly
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
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Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr
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Arg Thr
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<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>41
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Val
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
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Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Phe Pro Ser Ile Val
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
            100                 105
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<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>42
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Val
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
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Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Tyr Ile Phe Val
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
            100                 105
<210>43
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>43
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Val
            20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Asp Ala Phe Thr Phe Val
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
            100                 105
<210>44
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>44
AspIle Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Val
            20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Lys Tyr Val Phe Val
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
            100                 105
<210>45
<211>110
<212>PRT
<213>人
<400>45
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Phe Val
            20                  25                  30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Thr Leu Ser Asp Val
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            100                 105                 110
<210>46
<211>110
<212>PRT
<213>人
<400>46
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Phe Val
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Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
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Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
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                85                  90                  95
Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
            100                 105                 110
<210>47
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>47
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Phe Val
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Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asn Asp His Phe Glu
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            100                 105
<210>48
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>48
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
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    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
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Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
            100                 105
<210>49
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>49
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
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        35                  40                  45
Asp Asp Asp Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
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<211>112
<212>PRT
<213>人
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
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            20                  25                  30
Tyr Val Ile Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asp Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Asp Asn Tyr Gln
                85                  90                  95
Ala Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
            100                 105                 110
<210>51
<211>110
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(110)
<223>与SEQ ID NO：32相同
<400>51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Asn Tyr His Asp Ser
                85                  90                  95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
            100                 105                 110
<210>52
<211>110
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(110)
<223>与SEQ ID NO：34相同
<400>52
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala His Tyr His Asp Ile
                85                  90                  95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
            100                 105                 110
<210>53
<211>114
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(114)
<223>与SEQ ID NO：39相同
<400>53
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Gly
            20                  25                  30
Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
                85                  90                  95
Ala Tyr Glu Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr
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<211>114
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(114)
<223>与SEQ ID NO：40相同
<400>54
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Gly
            20                  25                  30
Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr
                85                  90                  95
Ala Phe Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr
<210>55
<211>121
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(121)
<223>与SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66相同
<400>55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asn Pro Trp Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>56
<211>121
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(121)
<223>与SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70相同
<400>56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asp Pro Trp Asn Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>57
<211>121
<212>PRT
<213>人
<400>57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Asp Pro Trp Asn Gly Ile Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>58
<211>113
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(113)
<223>与SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68相同
<400>58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Asp Pro Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65                  70                  75                  80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
<210>59
<211>113
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(113)
<223>与SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72相同
<400>59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Asp Pro Ile Met Gly Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65                  70                  75                  80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
<210>60
<211>114
<212>PRT
<213>人
<400>60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Asp Pro Val Ile Gly Glu Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser
<210>61
<211>121
<212>PRT
<213>人
<400>61
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Phe Gly Trp Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Tyr Glu Phe His Gly Tyr Thr Thr Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>62
<211>116
<212>PRT
<213>人
<400>62
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Phe Ile Phe Pro Asp Thr Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Lys Leu Ile Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210>63
<211>125
<212>PRT
<213>人
<400>63
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Val Asn Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Ala Val Tyr Pro Gly Pro Tyr Gly Phe
            100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>64
<211>123
<212>PRT
<213>人
<400>64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Ser Tyr Asp Tyr Gln His Gln Ala Pro Ser Met Asp Ser
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>65
<211>121
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(121)
<223>与SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：66相同
<400>65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asn Pro Trp Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Gly Phe  Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>66
<211>121
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(121)
<223>与SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：65相同
<400>66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asn Pro Trp Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Asp Pro Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65                  70                  75                  80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Asp Pro Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65                  70                  75                  80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Asp Pro Trp Asn Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Asp Pro Ile Met Gly Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65                  70                  75                  80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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Ser
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<211>113
<212>PRT
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Asp Pro Ile Met Gly Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
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Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
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tcgtgtagcg gcgattctat tggtaataag tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg    120
caggcgccag ttcttgtgat ttatgctgat tctgatcgtc cctcaggcat cccggaacgc    180
tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa    240
gacgaagcgg attattattg ccagtcttat gctcattatc atgatatttg ggtgtttggc    300
ggcggcacga agttaaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc    360
ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac    420
ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga    480
gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg    540
agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa    600
gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca                       642
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<212>DNA
<213>人
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gatatcgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgtgcgacc     60
attaactgca gaagcagcca gtctattctt tatggtatta acaataattt tctgggttgg    120
taccagcaga aaccaggtca gccgccgaaa ctattaattt attgggcttc tactcgtgaa    180
agcggggtcc cggatcgttt tagcggctct ggatccggca ctgattttac cctgaccatt    240
tcgtccctgc aagctgaaga cgtggcggtg tattattgcc agcagtatgc ttatgagcct    300
aatacctttg gccagggtac gaaagttgaa attaaacgta cggtggctgc accatctgtc    360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg    420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa    480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc    540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa    600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag    660
<210>75
<211>660
<212>DNA
<213>人
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gatatcgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgtgcgacc     60
attaactgca gaagcagcca gtctattctt tatggtatta acaataattt tctgggttgg    120
taccagcaga aaccaggtca gccgccgaaa ctattaattt attgggcttc tactcgtgaa    180
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tcgtccctgc aagctgaaga cgtggcggtg tattattgcc ttcagtattc tgatgagcct    300
tggacctttg gccagggtac gaaagttgaa attaaacgta cggtggctgc accatctgtc    360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg    420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa    480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc    540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa    600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag    660
<210>76
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<212>DNA
<213>人
<400>76
gatatcgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgtgcgacc     60
attaactgca gaagcagcca gtctattctt tatggtatta acaataattt tctgggttgg    120
taccagcaga aaccaggtca gccgccgaaa ctattaattt attgggcttc tactcgtgaa    180
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<211>214
<212>PRT
<213>人
<400>77
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala His Tyr His Asp Ile
                85                  90                  95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
        115                 120                 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
    130                 135                 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
                165                 170                 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
            180                 185                 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
        195                 200                 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
    210
<210>78
<211>214
<212>PRT
<213>人
<400>78
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Asn Tyr His Asp Ser
                85                  90                  95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
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Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
    130                 135                 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
                165                 170                 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
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Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
        195                 200                 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
    210
<210>79
<211>214
<212>PRT
<213>人
<400>79
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Asn Tyr His Asp Ser
                85                  90                  95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
        115                 120                 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
    130                 135                 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
                165                 170                 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
            180                 185                 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
        195                 200                 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
    210
<210>80
<211>214
<212>PRT
<213>人
<400>80
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asn Lys Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
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Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
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Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
    130                 135                 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
                165                 170                 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
            180                 185                 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
        195                 200                 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
    210
<210>81
<211>219
<212>PRT
<213>人
<400>81
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Gly
            20                  25                  30
Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
                85                  90                  95
Ala Tyr Glu Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
        115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
            180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
<210>82
<211>219
<212>PRT
<213>人
<400>82
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Gly
            20                  25                  30
Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr
                85                  90                  95
Ser Asp Glu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
        115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
            180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
<210>83
<211>218
<212>PRT
<213>人
<400>83
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Gly
            20                  25                  30
Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
                85                  90                  95
Ala Phe Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
        115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
    130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
                165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
            180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
        195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
<210>84
<211>219
<212>PRT
<213>人
<400>84
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Gly
            20                  25                  30
Ile Asn Asn Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr
                85                  90                  95
Ala Phe Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
        115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
            180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
<210>85
<211>1347
<212>DNA
<213>人
<400>85
caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg     60
agctgcaaag cctccggata tacctttactg gttattata tgaattgggt ccgccaagcc    120
cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcatt atcaatccgt ggactggcaa tacgaattac    180
gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatg acccgtgata ccagcattag caccgcgtat    240
atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgatcct    300
ggtttttttt attatactcc ttctgatctt tggggccaag gcaccctggt gacggttagc    360
tcagcttcca ccaagggacc atccgtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc    420
gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg    480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc    540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag    600
acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag    660
tccaaatatg gtcccccatg cccatcatgc ccagcacctg agttcctggg gggaccatca    720
gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc    780
acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg    840
gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg    900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac    960
aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc   1020
aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc   1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg   1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac   1200
tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag   1260
gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag   1320
agcctctccc tgtctctggg taaatga                                       1347
<210>86
<211>1323
<212>DNA
<213>人
<400>86
caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg      60
agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatgcta tttcttgggt gcgccaagcc     120
cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt attgatccta ttatgggtac tgagtatgct     180
cagaagtttc agggtcgggt gaccattacc gcggatgaaa gcaccagcac cgcgtatatg     240
gaactgagca gcctgcgtag cgaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgtttatcag     300
gatgtttggg gccaaggcac cctggtgacg gttagctcag cttccaccaa gggaccatcc     360
gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc acctccgaga gcacagccgc cctgggctgc     420
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc     480
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc     540
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acgaagacct acacctgcaa cgtagatcac     600
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagtcca aatatggtcc cccatgccca     660
tcatgcccag cacctgagtt cctgggggga ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc     720
aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc     780
caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc     840
aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc     900
gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc     960
ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agagccacag    1020
gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc    1080
ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg    1140
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac    1200
agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg    1260
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa    1320
tga                                                                  1323
<210>87
<211>1323
<212>DNA
<213>人
<400>87
caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg     60
agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatgcta tttcttgggt gcgccaagcc    120
cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt atcgatccgt ttggcactgc gaattacgcg    180
cagaagtttc agggccgggt gaccattacc gcggatgaaa gcaccagcac cgcgtatatg    240
gaactgagca gcctgcgtag cgaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgtttatcag    300
gatgtttggg gccaaggcac cctggtgacg gttagctcag cttccaccaa gggaccatcc    360
gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc acctccgaga gcacagccgc cctgggctgc    420
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc    480
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc     540
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acgaagacct acacctgcaa cgtagatcac     600
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagtcca aatatggtcc cccatgccca     660
tcatgcccag cacctgagtt cctgggggga ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc     720
aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc     780
caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc     840
aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc     900
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tga                                                                  1323
<210>88
<211>1323
<212>DNA
<213>人
<400>88
caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg     60
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gaactgagca gcctgcgtag cgaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgtttatcag    300
gatgtttggg gccaaggcac cctggtgacg gttagctcag cttccaccaa gggaccatcc    360
gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc acctccgaga gcacagccgc cctgggctgc    420
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc    480
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc    540
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acgaagacct acacctgcaa cgtagatcac    600
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagtcca aatatggtcc cccatgccca    660
tcatgcccag cacctgagtt cctgggggga ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc    720
aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc    780
caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc    840
aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc    900
gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc    960
ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agagccacag    1020
gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc    1080
ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg    1140
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac    1200
agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg    1260
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa    1320
tga                                                                  1323
<210>89
<211>448
<212>PRT
<213>人
<400>89
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asn Pro Trp Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
                245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
            260                 265                 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
        275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
    290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
                325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
            340                 345                 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
        355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
    370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
                405                 410                 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
            420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210>90
<211>440
<212>PRT
<213>人
<400>90
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Asp Pro Ile Met Gly Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65                  70                  75                  80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
        115                 120                 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
    130                 135                 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
                165                 170                 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
            180                 185                 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
        195                 200                 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala
    210                 215                 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225                 230                 235                 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
                245                 250                 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
            260                 265                 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
        275                 280                 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
    290                 295                 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305                 310                 315                 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
                325                 330                 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
            340                 345                 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
        355                 360                 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
    370                 375                 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385                 390                 395                 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
                405                 410                 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
            420                 425                 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440
<210>91
<211>440
<212>PRT
<213>人
<400>91
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Asp Pro Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65                  70                  75                  80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
        115                 120                 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
    130                 135                 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
                165                 170                 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
            180                 185                 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
        195                 200                 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala
    210                 215                 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225                 230                 235                 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
                245                 250                 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
            260                 265                 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
        275                 280                 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
    290                 295                 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305                 310                 315                 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
                325                 330                 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
            340                 345                 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
        355                 360                 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
    370                 375                 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385                 390                 395                 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
                405                 410                 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
            420                 425                 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440
<210>92
<211>440
<212>PRT
<213>人
<400>92
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Asp Pro Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65                  70                  75                  80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
        115                 120                 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
    130                 135                 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
                165                 170                 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
            180                 185                 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
        195                 200                 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala
    210                 215                 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225                 230                 235                 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
                245                 250                 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
            260                 265                 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
        275                 280                 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
    290                 295                 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305                 310                 315                 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
                325                 330                 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
            340                 345                 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
        355                 360                 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
    370                 375                 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385                 390                 395                 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
                405                 410                 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
            420                 425                 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440
<210>93
<211>448
<212>PRT
<213>人
<400>93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asn Pro Trp Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
                245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
            260                 265                 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
        275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
    290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
                325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
            340                 345                 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
        355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
    370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
                405                 410                 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
            420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210>94
<211>448
<212>PRT
<213>人
<400>94
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asp Pro Trp Asn Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
                245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
            260                 265                 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
        275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
    290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
                325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
            340                 345                 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
        355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
    370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
                405                 410                 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
            420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210>95
<211>448
<212>PRT
<213>人
<400>95
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asp Pro Trp Asn Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Tyr Thr Pro Ser Asp Leu Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
                245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
            260                 265                 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
        275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
    290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
                325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
            340                 345                 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
        355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
    370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
                405                 410                 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
            420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210>96
<211>440
<212>PRT
<213>人
<400>96
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Asp Pro Ile Met Gly Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65                  70                  75                  80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Val Tyr Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
        115                 120                 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
    130                 135                 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
                165                 170                 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
            180                 185                 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
        195                 200                 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala
    210                 215                 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225                 230                 235                 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
                245                 250                 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
            260                 265                 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
        275                 280                 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
    290                 295                 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305                 310                 315                 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
                325                 330                 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
            340                 345                 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
        355                 360                 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
    370                 375                 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385                 390                 395                 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
                405                 410                 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
            420                 425                 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440

Claims (30)

1.特异性结合靶蛋白c-Met的分离的人或人源化抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含下述VL和VH区的CDR：
(a)如SEQ ID NOs.34所示的抗体5091的VL的CDR和如SEQ IDNOs.66所示的抗体5091的VH区的CDR；
(b)如SEQ ID NOs.37所示的抗体5097的VL的CDR和如SEQ IDNOs.67所示的抗体5097的VH区的CDR；
(c)如SEQ ID NOs.38所示的抗体5098的VL的CDR和如SEQ IDNOs.68所示的抗体5098的VH区的CDR；或
(d)如SEQ ID NOs.53所示的抗体5185的VL的CDR和如SEQ IDNOs.71所示的抗体5185的VH区的CDR，
其中所述抗体的抗原结合部分是Fab或scFv。
2.根据权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含下述的VL和VH区：
(a)如SEQ ID NOs.34所示的抗体5091的VL和如SEQ ID NOs.66所示的抗体5091的VH区；
(b)如SEQ ID NOs.37所示的抗体5097的VL和如SEQ ID NOs.67所示的抗体5097的VH区；
(c)如SEQ ID NOs.38所示的抗体5098的VL和如SEQ ID NOs.68所示的抗体5098的VH区；或
(d)如SEQ ID NOs.53所示的抗体5185的VL和如SEQ ID NOs.71所示的抗体5185的VH区。
3.根据权利要求1或2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制HGF结合c-Met。
4.根据权利要求1或2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分调节c-Met磷酸化。
5.根据权利要求4的抗体或其抗原结合部分，其中激活c-Met磷酸化刺激选自器官再生，伤口愈合和组织再生的活性中的至少一种。
6.根据权利要求5的抗体或其抗原结合部分，其中所述器官或组织选自肾、肝、胰、肺、肠、皮肤、胸腺和甲状腺。
7.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体与c-Met的结合由选自下列多种拮抗性或激动性的测定法中的至少一种测定：配体诱导的c-Met信号转导途径酶活性；配体诱导的c-Met信号转导途径基因表达；配体与c-Met基于电化学发光的结合；配体结合c-Met的酶联免疫吸附测定；和细胞的增殖，存活，迁移或转移。
8.根据权利要求1的分离的抗体，其是IgG。
9.根据权利要求8的分离的抗体，其是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。
10.根据权利要求9的分离的抗体，其中所述IgG4抗体由SEQ ID NO：85和89、或者由SEQ ID NO：88和92、或者由SEQ ID NO：87和91或者由SEQ ID NO：86和90的核苷酸序列编码。
11.根据权利要求1的分离的人或人源化抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分特异结合细胞上的c-Met表面受体，并预防或改善癌症的进行或转移，或预防或改善炎症。
12.根据权利要求1或2的分离的人或人源化抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分特异结合c-Met细胞外结构域的氨基酸序列。
13.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-12中任一项的抗体或抗原结合部分，以及可药用载体或赋形剂。
14.一种转基因细胞，其携带编码根据权利要求1-12中任一项的抗体或其抗原结合部分的基因。
15.根据权利要求13的药物组合物在制备用于治疗c-Met相关病症或状况的药物中的用途，其中所述相关病症或状况选自乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、包括非小细胞肺癌的肺癌、胰腺癌和甲状腺癌的癌症或炎症。
16.根据权利要求15的用途，其中所述包括非小细胞肺癌的肺癌包括所有组织学亚型：腺癌、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、大细胞癌和腺鳞癌混合型。
17.根据权利要求16的用途，其中所述用途还包括施用化疗剂。
18.根据权利要求17的用途，其中所述化疗剂是与抗体缀合的。
19.根据权利要求1-12中任一项的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗表达c-Met的癌细胞的药物中的用途。
20.根据权利要求19的用途，还包括用化疗剂或放射来处理细胞。
21.根据权利要求19-20中任一项的用途，其中在施用或接触后，该用途还包括观察癌症进行或转移的改善或延迟。
22.一种鉴定表达c-Met的细胞的体外非诊断性方法，该方法包括将细胞与根据权利要求1-12中任一项的抗体或其抗原结合部分相接触，其中所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测标记。
23.根据权利要求22的方法，其中所述标记是放射性的，荧光的，磁性的，顺磁性的或化学发光的标记。
24.根据权利要求22的方法，还包括成像或分离细胞的步骤。
25.根据权利要求13的药物组合物，还包括另外的治疗剂。
26.根据权利要求25的药物组合物，其中另外的治疗剂选自抗癌剂；抗生素；消炎剂；生长因子和细胞因子。
27.包含根据权利要求1-12中任一项的抗体或其抗原结合部分的免疫缀合物，所述免疫缀合物进一步包含细胞毒素。
28.包含根据权利要求1-12中任一项的抗体或其抗原结合部分的试剂盒。
29.根据权利要求28的试剂盒，还包括可药用载体或赋形剂。
30.根据权利要求29的试剂盒，其中所述抗体以单位剂量的形式存在并且还包括向受试者给药的使用说明书。
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