CN106986932A - 一种c‑Met表位肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种c‑Met表位肽，其氨基酸序列含有SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或含有对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列。该c‑Met表位肽可以用于产生抗原呈递细胞、主要组织相容性抗原复合物或细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，还能应用于制备治疗如肝癌的癌症的药物中。

Description

一种c-Met表位肽及其应用
技术领域
本发明属于分子免疫学领域，涉及抗原表位肽，具体涉及HLA-A0201限制性c-Met蛋白细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的表位肽及其应用。
背景技术
肝细胞肝癌(以下简称“肝癌”)是恶性程度高、预后差的消化道恶性肿瘤，在世界范围内居癌症发病率的第六位，在癌症引起的死亡中位于第二位。它本质上是一种多基因异常疾病，涉及癌基因的过表达和抑癌基因的突变、缺失，从而使肿瘤细胞逃避了正常生长调控机制，自主进行增殖和侵袭。虽然近年来传统治疗方法(包括手术、化疗和靶向药物治疗)有所改善，但其预后差，肝癌的复发率和转移率仍居高位，肝癌患者的总生存率仍不理想。目前认为这些患者复发的根源是因为体内存在微小残留病灶，因此，需要寻求一种有效的方法，使得接受根治治疗或放化疗后患者体内的微小残留病灶能被有效清除。
免疫治疗就是一种非常合适的选择。有学者用独特型抗原给肝癌患者接种以进行免疫治疗，但是这种治疗疗效让人失望，一部分原因被归咎于这种独特型抗原的免疫原性不够强。因此，我们迫切的需要发现一种大部分患者共有的新型的肿瘤抗原来改善免疫治疗对肝癌的疗效。理想的肿瘤抗原应该在不同起源的肿瘤细胞表面表达，在正常组织中低表达或者不表达，而且在肿瘤细胞的生长及生存中不可或缺，这样肿瘤细胞才不可能通过不表达或者下调表达该抗原以逃避免疫攻击。
细胞毒性T细胞可以通过细胞表面表达的MHC I类分子识别肽段，从而与靶细胞结合达到杀伤靶细胞的目的。MHC I类分子及抗原特异性肽段决定了CTL细胞杀伤靶细胞时的MHC限制性和抗原特异性。中国汉族人群MHCI类分子HLA A位点0201表达率超过50％，故选择这一MHCI类分子广泛表达的位点研究CTL细胞抗原特异性。
因此，本领域技术人员致力于开发一种HLA-A0201限制性c-Met蛋白细胞毒性T淋巴细胞识别的表位肽。
发明内容
有鉴于现有技术中肿瘤特异性抗原的免疫原性不够强等问题，本发明提供了一种c-Met表位肽及其应用。
本发明的第一方面提供了一种c-Met表位肽，其选自以下任一项：
1)含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；
2)含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；
3)通过对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，该肽能与HLA-A0201分子形成复合物而被HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。
进一步地，上述c-Met表位肽为SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的肽。
本发明的第二方面提供了一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码上述c-Met表位肽的氨基酸序列。
本发明的第三方面提供了一种抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞脉冲以上述c-Met表位肽。
本发明的第四方面提供了一种主要组织相容性抗原复合物，其包括HLA-A0201分子和上述c-Met表位肽。
本发明的第五方面提供了一种细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，该细胞毒性T淋巴细胞诱导剂的活性成分包括：
1)如上所述的c-Met表位肽；
2)如上所述的抗原呈递细胞；或
3)如上所述的主要组织相容性抗原复合物。
本发明的第六方面提供了一种癌症疫苗，该癌症疫苗的活性成分包括：
1)如上所述的c-Met表位肽；
2)如上所述的抗原呈递细胞；或
3)如上所述的主要组织相容性抗原复合物。
进一步地，上述癌症为肝癌。
本发明还提供了上述抗原表位肽在制备治疗癌症的药物中的应用。
优选地，癌症为肝癌。
免疫治疗一直是医学领域研究的热点，众多研究者寻找到许多肿瘤的治疗靶点，比如肝癌中的EBV-C-MET和LMP2a等，但这些靶点都有各自的局限性，这就需要我们不断寻找新的肝癌治疗靶点，以最终达到个体化治疗的目的：对于每位患者检测其体内各种肿瘤抗原的表达情况，根据其强弱选择合适的靶点，以达到最佳的治疗效果，这种个体化的有差异的治疗也许是今后肿瘤免疫治疗的发展方向。
c-Met，又名肝细胞生长因子受体，是一种由MET基因编码的具有酪氨酸激酶活性的蛋白质。c-Met的磷酸化激活，可以引起其下游通路靶点的活化，如PI3K/Akt和MAPK/Erk通路。通过激活这些通路，c-Met参与了包括细胞增殖、凋亡、骨架重排、分化等进程。在恶性肿瘤中，c-Met可以促进肿瘤细胞的增殖与转移。c-Met与多种恶性肿瘤的不良预后有关，可以作为这些肿瘤的治疗靶点，包括肺癌、胃癌、淋巴瘤等。在肝癌中，c-Met的表达水平比癌旁组织的显著增高，与肝癌的增殖和转移密切相关。通过使用c-Met抑制剂或RNA干扰技术，使得c-Met的表达下调，可以在体内外观察到肝癌的增殖和转移能力显著下降。
推测在肝癌中广泛表达的c-Met蛋白，实际在肿瘤特别是肝癌细胞中起到抗凋亡分子的作用，c-Met蛋白也是一种理想的恶性肿瘤包括肝癌的免疫治疗直接靶点。
本发明通过在线筛选获得两条高积分肽段aa1211和aa948，然后通过T2细胞亲和性和稳定性实验进一步筛选出具备高亲和力及稳定性的肽段aa1211。合成该他气短的五聚体后分别在健康供者及患者外周血中检测到不同水平的c-Met-CTL，证明该表位肽是在生理及病理情况下自然存在的，为后续实验的进行提供了必要条件。
通过上述抗原表位肽，在专制抗原提呈细胞(如DC)的辅助下，运用CTL细胞的特性，将能通过作用于c-Met蛋白来阻断免疫耐受及免疫忽视，提高其免疫原性。建立了来自于健康供者的c-Met蛋白特异性细胞毒性T细胞，这些细胞毒性T细胞能否有效地杀伤肝癌细胞，并且对正常造血细胞没有杀伤作用。据推测，在c-Met-CTL细胞下调了肿瘤细胞c-Met表达后，将会极大的恢复正常的活化T淋巴细胞的清除肿瘤作用。
附图说明
图1是本发明一个实施例的T2细胞亲和实验结果图。其中，阴性对照FLU-matrix为流感基质蛋白，阳性对照为HIV pol，aa1211和aa948为两条预测的肽段。
图2是本发明一个实施例的T2细胞结合稳定性实验结果图。
图3是本发明一个实施例的c-Met-CTL细胞表型测定结果图。
图4是本发明一个实施例的c-Met-CTL增殖实验结果图。
图5是本发明一个实施例的c-Met-CTL杀伤实验结果图。
图6是本发明一个实施例的c-Met-CTL细胞功能实验结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本发明的保护范围。
以下具体实施方式中使用的试剂，如无特殊说明，均可直接购买获得。
流式细胞仪购自BECKMAN COULTER，型号为Navios。
T2细胞购自ADCC。
FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2购自ebioscience。
FITC标记的CD8+单克隆抗体购自ebioscience。
多肽的合成可以通过现有技术中的任何方法进行，如固相肽合成法等。
氨基酸的替换：通过氨基酸替换可以获得类似或等同活性的突变体肽，该替换可以用具有与替换前的氨基酸的电荷、可溶性、亲水性/疏水性、极性类似的氨基酸进行。
T2细胞亲和性和稳定性分析的原理：T2细胞缺乏内源性抗原肽提呈中必须的抗原加工相关转运蛋白，其本身表面只有少量空载的HLA-A0201分子表达且极不稳定。但当HLA-A0201分子表面MHC I类分子和与HLA-A0201分子结合力强的肽段结合后，HLA-A0201的表达情况会增强并稳定。并且，HLA-A0201分子和肽段的结合力越强，T2细胞表面的HLA-A0201分子降解就越少，表现为HLA-A0201分子的表达量越高。因此，可以直接用T2细胞表面HLA-A0201分子表达的强弱来反应所预测表位肽与HLA-A0201的结合能力。
同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
实施例1：HLA-A0201限制性c-Met蛋白CTL表位肽预测及合成
(1)c-Met蛋白氨基酸序列的确定：
通过在Genbank数据库中查找c-Met蛋白序列，找到了Genbank登录号为：NP_001002963.1的c-Met蛋白，它由1382个氨基酸残基组成，具体如SEQ ID No.1所示。
(2)c-Met蛋白表位肽的在线预测：
利用表位肽预测数据库
a：https://www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform及
b：http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)
提供的服务对HLA-A0201限制性c-Met蛋白表位肽进行独立的初步预测，选择其中得分最高的数条表位肽，之后用超基序及量化基序方案对初步预测出的CTL表位肽进行修饰，以进一步提高积分。修饰后得分最高的两条表位肽如表1所示：
表1 c-Met蛋白表位肽与人HLA-A0201亲和力预测积分
(得分Ia和得分IIb分别代表使用上方a网站和b网站各自预测的分数。
(3)多肽的合成、纯化与鉴定：
通过生物合成手段，合成、纯化及鉴定了表1中的两个肽段aa1211和aa948(上海波泰生物科技公司)。
(4)对照肽：
选取文献报道中的HLA A0201阳性肽和阴性肽作为对照。这两条肽分别为：
阳性肽HIV pol：ILKEPVHGV(SEQ ID No.4)；
阴性肽：流感病毒基质蛋白肽段(FLU-matrix肽段)：GILGFVFTL(SEQ ID No.5)。
实施例2：T2细胞表位肽结合亲和及稳定性实验
借助T2细胞的特性进行HLA-A0201与肽段的亲和能力及稳定性测定。
(1)T2细胞亲和实验
收集T2细胞，用4℃的无菌PBS离心洗涤三次，加入无血清1640培养基，2×105/孔细胞接种于24孔细胞培养板中，设立实验组及对照组，每组重复三个副孔，将未加肽刺激的T2细胞作为空白对照，每孔加入相应的实验肽段(aa1211和aa948)及对照肽段(阳性对照：HIV pol肽段；阴性对照：流感病毒基质蛋白肽段FLU-matrix)(终浓度50μM)，同时加入β2微球蛋白(终浓度2.5μg/ml)。将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中孵育18h，再次收集细胞，4℃PBS洗涤三次，加入FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2(2μl/孔)，4℃避光孵育15分钟，4℃PBS洗涤3次，用流式细胞仪检测平均荧光强度。
用荧光系数(FI)作为衡量亲和力指标，荧光系数>1的表位肽被认为与HLA-A0201分子具有高亲和力，荧光系数由以下公式计算得到：
荧光系数(FI)＝(样本平均荧光强度-空白对照平均荧光强度)/空白对照平均荧光强度。
亲和性实验结果如图1所示，aa1211的用荧光系数(FI)大于1，这表明aa1211与HLA-A0201分子具有高亲和力；aa948的用荧光系数(FI)略小于1，表明aa948与HLA-A0201分子的亲和力弱于aa1211与HLA-A0201分子的亲和力，但是，与阴性对照FLU-matrix相比，仍具有较高的亲和性。
(2)T2细胞表位肽结合稳定性实验
收集T2细胞，1×105/孔接种于96孔细胞培养板中，加入无血清1640培养基、β2微球蛋白以及相应的实验肽段(aa1211和aa948)，实验组设置三个副孔。将细胞置于5％CO2培养箱中孵育18h，再次收集细胞，洗涤后加入无血清1640培养基、胞外布雷菲德菌素共同孵育1h，收集细胞，洗涤后再次加入含有胞外布雷菲德菌素(0.5μg/ml)的无血清1640培养基，放入培养箱中孵育，于不同的时间点(0、2、4、8、12、24h)收集细胞。加入FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2(10μl/孔)，用流式细胞仪检测平均荧光强度，计算出每个时间点的FI，用此衡量表位肽诱导的HLA-A0201的表达情况。
结合稳定性实验结果如图2所示，在孵育24h时，肽段aa1211仍然能和HLA-A0201分子保持较好的亲和性，这说明肽段aa1211的结合稳定性好；肽段aa948在孵育12小时时，仍能保持它本身的最佳亲和性，但是孵育24小时后，亲和性下降，说明其在24小时的结合稳定性变弱。因此，肽段aa948的亲和性和结合稳定性比肽段aa1211稍差。
实施例3：肽段aa1211相应五聚体阳性细胞毒性T细胞检测
根据实施例2中的结果，肽段aa1211的亲和性和结合稳定性都比较好，因此，针对肽段aa1211进行进一步地实验。
肽段aa1211相应五聚体是根据T细胞活化的双识别原理，用生物工程技术将MHCⅠ类分子重链α与β2微球蛋白在体外组装，并结合抗原表位肽形成一个能够与相应TCR特异性结合的单体，再将5个单体组装在一起形成五聚体。
选取一名健康供者及七名肝癌确诊未缓解患者，检测其外周血中c-Met表位肽五聚体阳性的CD8+细胞数目。收集健康供者及肝癌确诊未缓解患者外周血5ml，用淋巴细胞分离液分离方法提取外周血单个核细胞，将细胞计数后取1×106个细胞，溶于100μl PBS中，加入2μl肽段aa1211对应的PE标记的五聚体及同型对照，常温避光孵育40分钟后，冰面放置1分钟，加入FITC标记的CD8+单克隆抗体，4℃避光15分钟，取出后以4℃PBS洗3次，用500μlPBS重悬后用流式细胞仪进行检测。
流式结果判读如表2所示，表明肽段aa1211是c-Met蛋白在患者体内或者胞内裂解后的天然产物，为生理状态下产生的表位肽片段，并且健康供者体内c-Met-CTL水平明显低于肝癌患者。
表2 aa1211的五聚体阳性的CD8+细胞数目检测结果
实施例4：体外验证c-Met蛋白特异性细胞毒性T细胞对肝癌细胞细胞溶解作用并研究其特性
1)诱导生成细胞毒性T细胞：
通过具有稳定的HLA-A0201+的健康供者的外周血，分离外周血单个核细胞，诱导培养DC细胞及细胞毒性T细胞(CTL)。经过4周后，通过流式细胞仪技术的检测，得到CD8+阳性及五聚体阳性细胞比例超过10％以上的c-Met-CTL，用以完成后续实验，检测结果如表3所示。
1.1)获取HLA-A0201+健康供者外周血单个核细胞
(1).抽取HLA-A0201+健康供者外周血约20ml，肝素钠抗凝。
(2).将外周血加入50ml无菌离心管中，并加入等体积无菌PBS。
(3).分2个50ml离心管，将约40ml稀释的外周血缓慢加入40ml淋巴细胞分离液上，使两者分两层(分两管操作)。
(4).离心400g 18min(相当于1500rpm/min)，离心机选择慢加速及慢减速程序。
(5).吸出在液相交界处的雾状细胞层(即单个核细胞层)，装入另一10ml离心管中。
(6).将单个核细胞用无菌PBS重悬，300g 10min(每次用10ml左右的冲洗液量)。
(7).离心结束后弃上清，用保存于冰面的红细胞裂解液4ml重悬并混合吹打，4℃冰箱放置10分钟，再以300g 10分钟离心，弃上清。
(8).将单个核细胞用无菌PBS洗两遍，300g 10min(每次用10ml左右的冲洗液量)。
(9).用8ml含有10％FBS的1640培养基重悬单个核细胞。
1.2)诱导生成DC细胞
(1).将提取的单个核细胞按照每孔1×106个加入24孔板中，37℃，5％二氧化碳培养箱中静置2h，使单核细胞贴壁。
(2).吸尽24孔板中的细胞悬液，并用含有10％FBS的1640培养基0.5ml轻轻冲刷每孔，重复三次，按需要决定是否收集吸出的细胞悬液(其中含有单个核细胞)。
(3).每孔加入1ml含有10％FBS的1640培养基，并加入GM-CSF 10ng/ml及IL-410ng/ml。
(4).每3日半量换液一次，换液时同样加入GM-CSF 10ng/ml及IL-410ng/ml，第5日半量换液，加入GM-CSF 10ng/ml、IL-4 10ng/ml及TNF-α10ng/ml，48h后DC细胞成熟。
(5).加入aa27或aa670肽段，浓度为50ng/ml，37℃，5％二氧化碳培养箱中静置2-4h。
(6).30Gy伽马射线照射成熟的DC细胞。
(7).吸除所有上清，准备加入淋巴细胞或者诱导的CTL细胞。
1.3).PBMC来源CTLs的产生
(1).第一次淋巴细胞与DC细胞共培养时，将2.1.2.b步骤中的细胞悬液收集并以1000转10分钟离心，后用含有IL-2 50IU/ml、IL-7 2.5ng/ml及IL-155ng/ml的10％FBS的1640培养基重悬，将淋巴细胞计数后与成熟DC细胞按照10：1比例混合。
(2).每2-3日半量换液一次，同时加入IL-2 50IU/ml、IL-7 2.5ng/ml及IL-155ng/ml。
(3).第7日新的DC成熟后，将淋巴细胞吹打后吸出，移入新生成DC孔中并与之共培养。
(4).每次与新的DC细胞共培养前，需取样检测特异性，一般与DC共培养4次。
1.4)CTL细胞CD8及五聚体双阳性率的检测
(1)取5×105个培养的CTL细胞(每次与DC共培养后第7天)，加入无菌PBS 5ml，以1000转10分钟离心，弃上清，以100μl无菌PBS重悬.
(2)在细胞悬液中加入5μl带有荧光标记的MHC/肽多聚体(Epimer)，室温避光反应15分钟。置细胞于冰上，孵育1分钟。加入抗-CD8-FITC。在冰上继续避光反应20分钟。
(3)PBS洗涤液洗细胞3次，400xg 5分钟，细胞沉淀重悬于适量PBS洗涤液中。
(4)细胞流式仪分析，分析结果如表3所示，经过4周后，通过流式细胞仪技术的检测，得到CD8+阳性及五聚体阳性细胞比例分别为22％和12.1％。超过10％以上的c-Met-CTL，可以用于完成后续实验。
表3 c-Met-CTL细胞五聚体阳性率
第一周 第四周
CD8+ 15％ 22％
c-Met-ctls 4.7％ 12.1％
2)CTL细胞表型测定：
抗原特异性CTL细胞表型应与初始(naive)T细胞有所区别，借助CD45RO及CD45RA检测诱导生产的CTL细胞与同一来源健康供者外周血表型区别，一般认为，特异性CTL细胞中CD8+的细胞高表达CD45RO，低表达CD45RA；相应的未经过与DC细胞共培养的健康供者外周血PBMC中，CD8+的细胞高表达CD45RA，低表达CD45RO。
1.取3×106个培养的CTL细胞(第四次与DC共培养后5天)，加入无菌PBS5ml，以1000转10分钟离心，弃上清，以100μl无菌PBS重悬。同时取未经过与DC共培养的外周血PBMC作为对照组。
2.在细胞悬液中加入5μl带有荧光标记的MHC/肽多聚体(Epimer)，室温避光反应15分钟。置细胞于冰上，孵育1分钟。加入抗-CD8-FITC及抗-CD45RA-APC或抗CD45RO-APC。在冰上继续避光反应20分钟。
3.PBS洗涤液洗细胞3次，400xg 5分钟，细胞沉淀重悬于适量PBS洗涤液中。
4.细胞流式仪分析。结果如图3所示，表明诱导生成的特异性CTL细胞中CD8+的细胞高表达CD45RO，低表达CD45RA，是有功能的CTL细胞。
3)CTL细胞增殖实验：
在流式细胞学检测方法中，用CFSE标记CTL细胞，并将其与照射过的HLA-A0201+的肝癌细胞株共培养，以检测C-MET-CTL是否会表现出特定的细胞增殖。一般认为只有在与HLA-A0201+的肝癌细胞株共培养时，c-Met-CTL细胞才表现出明显的增殖，在没有任何抗原刺激的情况下，c-Met-CTL细胞不增殖，在MHC不匹配的情况下，c-Met-CTL细胞也不增殖。通过这个实验，将论证c-Met-CTL细胞对肝癌细胞的作用是否受限于抗原特异性及MHC I类分子限制性。
取经过与DC细胞共培养四周的CTLs细胞进行实验。
CCK-8试剂盒法，取经过与DC细胞共培养四周的CTLs细胞进行实验：
(1).获取DC细胞，详见本文方法学2.1.2，DC细胞在24孔板中诱导成熟。
(2).DC细胞成熟后分为实验组及对照组：实验组的DC细胞加入筛选出的肽段aa1211冲击(50ng/ml)，对照组的DC不加入肽段。
(3).放入37℃5％二氧化碳培养箱培养2-4小时后，将实验组及对照组DC细胞从培养箱取出，弃上清，以少量培养基重悬DC细胞并计数。
(4).取出共培养四周的CTLs细胞，吹打重悬后计数。
(5).将实验组及对照组的DC细胞分别与CTLs细胞按照梯度混合共培养，设置三个梯度：DC细胞与CTLs细胞的比例分别为：4:1、20:1及100：1。
(6).混合的几组细胞重新计数，取96孔板，每孔接种1×105个细胞，培养基为含有10％FBS的1640培养基，不加任何细胞因子，放入37℃5％二氧化碳培养箱培养12小时。此时应将细胞分为以下几组：实验组、对照组及空白对照组，每组设4个复孔，每孔均加入10μlCCK-8试剂。
(7).12小时后取出96孔板，震荡10分钟，采用双波长酶标仪读取450nm波长吸光度(OD)值，均应减除空白对照组OD值。
(8).根据第12小时时间点测得OD值绘制改点各组细胞增殖情况。
结果如图4所示，负载肽段的DC细胞才可以刺激CTL细胞增殖，形成特异性的c-Met-CTL细胞。加入肽段aa1211冲击后，T细胞出现了明显的增殖。
4)CTL细胞杀伤实验：
取经过与DC细胞共培养四周的CTLs细胞进行实验。
用流式细胞学靶细胞PI及CFSE双标染色方法检测c-Met-CTL细胞对HLA-A0201±的原代肝癌细胞及肝癌细胞株的特异性溶解作用。
(1).取10×106个培养的CTL细胞，加入无菌PBS5ml，以1000转10分钟离心，弃上清，以10ml无菌PBS重悬，使其达到每1ml有1×106个细胞。
(2).加入CFSE使其终浓度为3μM，放入37℃二氧化碳培养箱孵育15分钟，每5分钟摇匀细胞。
(3).取出细胞后加入等量胎牛血清放入4℃冰箱终止10分钟。
(4).用无菌PBS洗涤三次，每次为1000转10分钟。
(5).用含有10％FBS的1640重悬，使细胞浓度达到1×106/ml。
(6).将细胞分组移入24孔培养板中，每孔CTL细胞为1×106个。各实验组为CTL细胞分别按10：1比例加入HLA-A0201+肝癌细胞株或原代细胞、HLA-A0201-肝癌细胞株或原代细胞)，每组设3个复孔。
(7).效靶细胞混合培养4小时后，取出并收集各组细胞，用PBS重悬后1000转离心10分钟，弃上清；
(8).以100μlPBS重悬，避光加入PI，4℃避光15分钟后上流式细胞仪进行检测。
结果如图5所示。其中，HepG2是HLA A2肝癌细胞株；LM3和Hep3B是非HLA A2肝癌细胞株；P1、P2为HLA A2患者，表面培养的CTL细胞只杀伤HLA A2的细胞株及原代细胞，而不能杀伤HLA非A2的细胞。
5)c-Met-CTLs细胞功能测定：
为了衡量c-Met-CTL细胞杀伤肝癌细胞株的效能，将借助测量CD107a在c-Met-CTL细胞表面的表达，评估其细胞杀伤肝癌细胞时的脱颗粒作用，脱粒作用即CD107a在CTL细胞释放细胞毒颗粒时会短暂的在CTL细胞膜表面表达。
(1).取1×106个培养的CTLs细胞，以1000转10分钟离心，弃上清，用含有10％FBS的1640重悬，使体积为333μl。
(2).两组分别取2×106个培养的肝癌细胞株(HLA-A0201-及HLA-A0201+各一组)，以1000转10分钟离心，弃上清，用含有10％FBS的1640重悬，使体积为667μl。
(3).将CTL细胞333μl与靶细胞(HLA-A0201-及HLA-A0201+各一组)667μl混合，共1ml。
(4).将效靶细胞混合液放入V型底96孔培养板中，每孔100μl，共10孔。
(5).将放有细胞的96孔板放入37℃5％二氧化碳培养箱中，培养4小时(对96孔板进行离心1000转5分钟)。
(6).培养4h后取出培养板，吹匀并吸出每孔细胞悬液，将10孔细胞混合。
(7).向效靶细胞混合液中加入5ml无菌PBS，混匀后以1000转10分钟离心，弃上清。以100μl无菌PBS重悬效靶细胞混合液，加入2μl抗-CD8-FITC及10μl抗-CD107a-PC5在冰上避光反应20分钟。
(8).用无菌PBS洗涤液洗细胞3次，400xg 5分钟，细胞沉淀重悬于500μlPBS中。用流式细胞仪进行检测。
结果如图6所示，其中，HepG2是HLA A2细胞株；LM3是指HLA A2细胞株。结果表明，HLA A2的肿瘤细胞才能刺激培养的CTL细胞增殖，并且高表达CD107a，说明功能良好，非A2的细胞无法刺激CTL表达CD107a，未经过培养的PBMC细胞即使和A2的肿瘤细胞共培养也无法表达CD107a。
序列表
<110> 海口市人民医院
<120> 一种c-Met表位肽及其应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1382
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> c-Met
<400> 1
Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe
1 5 10 15
Thr Leu Val Gln Lys Ser Tyr Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Val Lys
20 25 30
Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala
35 40 45
Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Val Leu His Lys His His Ile Tyr Leu
50 55 60
Gly Ala Val Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Asp Lys Asp Leu Gln Lys
65 70 75 80
Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Ser
85 90 95
Pro Cys Gln Asp Cys Ser His Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp
100 105 110
Glu Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Leu Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp
115 120 125
Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val His Arg Gly Thr Cys Gln Arg His
130 135 140
Ile Leu Pro Pro Ser Asn Ile Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys
145 150 155 160
Met Tyr Ser Ser Gln Ala Asp Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys
165 170 175
Val Val Ser Ala Leu Gly Thr Lys Val Leu Ile Ser Glu Lys Asp Arg
180 185 190
Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Asp His Pro
195 200 205
Asp His Ser Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Gln
210 215 220
Asp Gly Phe Lys Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro
225 230 235 240
Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser
245 250 255
Asn His Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala
260 265 270
Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Val Asp Ser Gly
275 280 285
Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys
290 295 300
Arg Arg Lys Arg Ser Thr Arg Glu Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala
305 310 315 320
Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala His Leu Ala Lys Gln Ile Gly Ala
325 330 335
Asn Leu Asn Asp Asp Ile Leu Tyr Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro
340 345 350
Asp Ser Ala Glu Pro Met Asn Arg Ser Ala Val Cys Ala Phe Pro Ile
355 360 365
Lys Tyr Val Asn Glu Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val
370 375 380
Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn
385 390 395 400
Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Asn Asp Glu
405 410 415
Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met
420 425 430
Gly Gln Phe Asn Gln Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys
435 440 445
Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met
450 455 460
Gln Val Val Val Ser Arg Ser Gly Leu Ser Thr Pro His Val Asn Phe
465 470 475 480
Arg Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Ala Ile Val Glu His Pro
485 490 495
Leu Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Val Thr Gly Lys Lys Ile Thr
500 505 510
Arg Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Glu His Phe Gln Ser Cys Ser
515 520 525
Gln Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp
530 535 540
Arg Cys Val His Leu Glu Glu Cys Pro Thr Gly Ala Trp Thr Gln Glu
545 550 555 560
Val Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Glu Val Phe Pro Thr Ser Ala Pro Leu
565 570 575
Glu Gly Gly Thr Val Leu Thr Val Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg
580 585 590
Arg Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Lys Val Phe Leu Gly Asn
595 600 605
Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Thr Asn Met Leu Lys
610 615 620
Cys Thr Val Gly Pro Ala Val Asn Glu His Phe Asn Ile Ser Ile Ile
625 630 635 640
Ile Ser Asn Gly Arg Gly Thr Ala Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val
645 650 655
Asp Pro Ile Ile Thr Ser Ile Ser Pro Ser Tyr Gly Pro Lys Asn Gly
660 665 670
Gly Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser
675 680 685
Arg His Ile Ser Met Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser
690 695 700
Asp Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Ala Thr Ala Thr Glu
705 710 715 720
Phe Pro Ile Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Met Asn Ser
725 730 735
Phe Ser Tyr Gln Glu Asp Pro Ile Val Tyr Ala Ile His Pro Thr Lys
740 745 750
Ser Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Ala Val Gly Lys Asn Leu
755 760 765
Asn Ser Val Ser Val Leu Arg Met Val Ile Asp Val His Glu Thr Arg
770 775 780
Arg Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile
785 790 795 800
Cys Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu
805 810 815
Lys Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile His Ser Lys Tyr Phe
820 825 830
Asp Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro
835 840 845
Val Met Ile Ser Ile Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn
850 855 860
Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn
865 870 875 880
Lys Ser Cys Glu Thr Ile Tyr Ser Asp Ser Lys Ala Val Leu Cys Lys
885 890 895
Val Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Asn Glu Leu Asn Ile Glu Trp
900 905 910
Lys Gln Ala Val Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro
915 920 925
Asp Gln Asn Phe Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Ile Ser Ile Ser Thr
930 935 940
Ile Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Phe Leu Trp Leu Lys Arg Lys Lys
945 950 955 960
Gln Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val
965 970 975
His Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro
980 985 990
Thr Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe
995 1000 1005
Pro Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg
1010 1015 1020
Gln Val Gln Tyr Pro Leu Thr Asp Leu Ser Pro Met Leu Thr Ser
1025 1030 1035
Gly Asp Ser Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His
1040 1045 1050
Ile Asp Leu Ser Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln
1055 1060 1065
His Val Val Ile Gly Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe Asn Glu
1070 1075 1080
Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr Leu
1085 1090 1095
Leu Asp Asn Asp Asp Lys Lys Ile His Cys Ala Val Lys Ser Leu
1100 1105 1110
Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln Phe Leu Thr Glu
1115 1120 1125
Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu Ser Leu
1130 1135 1140
Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val Val Leu
1145 1150 1155
Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn Glu
1160 1165 1170
Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln
1175 1180 1185
Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe Val His
1190 1195 1200
Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr
1205 1210 1215
Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys
1220 1225 1230
Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val
1235 1240 1245
Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr
1250 1255 1260
Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu Met
1265 1270 1275
Thr Arg Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile
1280 1285 1290
Thr Val Tyr Leu Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr
1295 1300 1305
Cys Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp His Pro
1310 1315 1320
Arg Ala Glu Leu Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser Arg Ile
1325 1330 1335
Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr Val His Val
1340 1345 1350
Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr Pro Ser
1355 1360 1365
Leu Leu Ser Ser Gln Asp Asn Ile Asp Gly Glu Gly Asp Thr
1370 1375 1380
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aa1211
<400> 2
Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr Val
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aa948
<400> 3
Leu Leu Leu Gly Leu Phe Leu Trp Leu
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV pol
<400> 4
Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLU-matrix
<400> 5
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5

Claims (10)

1.一种c-Met表位肽，其特征在于，其选自以下任一项：
1)含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；
2)含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；
3)通过对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，所述肽能与HLA-A0201分子形成复合物而被HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。
2.如权利要求1所述的c-Met表位肽，其特征在于，所述c-Met表位肽为SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的肽。
3.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1中所述的c-Met表位肽的氨基酸序列。
4.一种抗原呈递细胞，其特征在于，所述抗原呈递细胞脉冲以权利要求1或2所述的c-Met表位肽。
5.一种主要组织相容性抗原复合物，其特征在于，包括HLA-A0201分子和如权利要求1或2所述的c-Met表位肽。
6.一种细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，其特征在于，所述细胞毒性T淋巴细胞诱导剂的活性成分包括：
1)如权利要求1或2所述的c-Met表位肽；
2)如权利要求4所述的抗原呈递细胞；或
3)如权利要求5所述的主要组织相容性抗原复合物。
7.一种癌症疫苗，其特征在于，所述癌症疫苗的活性成分包括：
1)如权利要求1或2所述的c-Met表位肽；
2)如权利要求4所述的抗原呈递细胞；或
3)如权利要求5所述的主要组织相容性抗原复合物。
8.如权利要求5所述的癌症疫苗，其特征在于，所述癌症为肝癌。
9.如权利要求1或2所述的c-Met表位肽在制备治疗癌症的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症为肝癌。
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