ES2337782T3 - Metodos para tratar o prevenir enfermedades autoinmunitarias con compuestos de 2,4-pirimidindiamina. - Google Patents

Metodos para tratar o prevenir enfermedades autoinmunitarias con compuestos de 2,4-pirimidindiamina. Download PDF

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Rajinder Singh
Ankush Argade
Donald G. Payan
Jeffrey Clough
Holger Keim
Catherine Sylvain
Hui Li
Somasekhar Bhamidipati
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Abstract

Un compuesto de 2,4-pirimidindiamina para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria distinta de colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, y enfermedad inflamatoria del intestino idiopática, en el que el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es: un compuesto de formula estructural (I): **(Ver fórmula)** o una sal, hidrato, solvato y/o un N-óxido del mismo, en la que: L1 y L2 son cada uno un enlace directo; R2 se selecciona del grupo que consiste en fenilo monosustituido en la posición 3 ó 5 con un grupo R8, fenilo di- o tri-sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R8, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo; R4 se selecciona del grupo que consiste en fenilo sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R8, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo; en la que, para R2 y R4, cada uno de dicho heteroarilo opcionalmente sustituido, independientemente entre sí, se selecciona del grupo que consiste en: **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** en las que: p es un número entero de uno a tres; cada - - - representa independientemente un enlace sencillo o un doble enlace; R35 es hidrógeno o R8; X se selecciona del grupo que consiste en CH, N y N-O; cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S y NH; cada Y1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, SO, SO2, SONR36, NH y NR37; cada Y2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en CH, CH2, O, S, N, NH y NR37; R36 es hidrógeno o alquilo; R37 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y un progrupo seleccionado del grupo que consiste en arilo, arilalquilo, heteroarilo, Ra, Rb, -CRaRb-O-C(O)R8, -CRaRb-O-PO(OR8)2, -CH2-O-PO(OR8)2, -CH2-PO(OR8)2, -C(O)-CRaRb-N(CH3)2, -CRaRb-O-C(O)-CRaRb-N(CH3)2, -C(O)R8, -C(O)CF3 y -C(O)-NR8-C(O)R8; R38 se selecciona del grupo que consiste en alquilo y arilo; A se selecciona del grupo que consiste en O, NH y NR38; R9, R10, R11 y R12 se selecciona cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, halógeno, haloalcoxi, aminoalquilo e hidroxialquilo, o, como alternativa, R9 y R10 y/o R11 y R12 se toman juntos para formar un cetal; cada Z se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi, ariloxi, éster, y carbamato; Q se selecciona del grupo que consiste en -OH, -OR8, -NRcRc, -NR39-CHR40-Rb, -NR39-(CH2)m-Rb y -NR39-C(O)-CHR40-NRcRc; R39 y R40 se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo y NHR8; R5 se selecciona del grupo que consiste en -CN, -NC, fluoro, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), haloalcoxi (C1-C3), perhaloalcoxi (C1-C3), -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)CF3 y -C(O)OCF3; R6 es hidrógeno; R8 se selecciona del grupo que consiste en Re, Rb, Re sustituido con uno o más del mismo o diferente Ra o Rb, -ORa sustituido con uno o más del mismo o diferente Ra o Rb, -B(ORa)2, -B(NRcRc)2, -(CH2)m-Rb, -(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-Rb, -S-(CH2)m-Rb, -O-CHRaRb, -O-CRa(Rb)2, -O-(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-CH[(CH2)mRb]Rb, -S-(CHRa)m-Rb, -C(O)NH-(CH2)m-Rb, -C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -S-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -O-(CHRa)m-C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -S-(CHRa)m-C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -NH-(CH2)m-Rb, -NH-(CHRa)m-Rb, -N[(CH2)mRb]2, -NH-C(O)-NH-(CH2)m-Rb, -NH-C(O)-(CH2)m-CHRbRb y -NH-(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)m-Rb; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros; cada Rb es un grupo adecuado seleccionado independientemente del grupo que consiste en =O, -ORd, haloalquiloxi (C1-C3), =S, -SRd, =NRd, =NORd, -NRcRc, halógeno, -CF3, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)Rd, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc, -S(O)2NRcRc, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)2NRcRc, -C(O)Rd, -C(O)ORd, -C(O)NRcRc, -C(NH)NRcRc, -C(NRa)NRcRc, -C(NOH)Ra, -C(NOH)NRcRc, -OC(O)Rd, -OC(O)ORd, -OC(O)NRcRc, -OC(NH)NRcRc, -OC(NRa)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NR3C(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NRaC(O)]nORd, -[NHC(O)]nNRcRc, -[NRaC(O)]nNRcRc, -[NHC(NH)]nNRcRc y -[NRaC(NRa)]n NRcRc; cada Rc es independientemente Ra, o, como alternativa, dos Rc se toman juntos con el átomo de nitrógeno al que están enlazados para formar un cicloheteroalquilo o heteroarilo de 5 a 8 miembros que puede incluir opcionalmente uno o más de los mismos o diferentes heteroátomos adicionales, y que puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes Ra o grupos Rb adecuados; cada Rd es independientemente un Ra; cada Re se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros; cada m es independientemente un número entero de 1 a 3; y cada n es independientemente un número entero de 0 a 3; o el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 7.4.214 a 7.4.244, 7.4.250 a 7.4.252, 7.4.256 a 7.4.258, 7.4.262 a 7.4.269, 7.4.272 a 7.4.276, 7.4.278 a 7.4.280, 7.4.283 a 7.4.289, 7.4.296, 7.4.298 a 7.4.302, 7.4.304, 7.4.305, 7.4.308 a 7.4.313, 7.4.315, 7.4.317, y 7.4.318; con las condiciones de que en la fórmula (I): (1)cuando R2 es un fenilo sustituido, entonces R5 es diferente de ciano o -C(O)NHR, en el que R es hidrógeno o alquilo (C1-C6); (2)cuando R2 y R4 son cada uno independientemente un indol sustituido o no sustituido, entonces R2 y R4 están unidos al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular; y (3)el compuesto no sea **(Ver fórmula)**

Description

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Métodos para tratar o prevenir enfermedades autoinmunitarias con compuestos de 2,4-pirimidindiamina.
2. Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente a compuestos de 2,4-pirimidindiamina y a composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos para uso en el tratamiento o prevención de enfermedades autoinmunitarias y/o los síntomas asociados con ellas.
3. Antecedentes de la invención
La reticulación de los receptores Fc, tales como el receptor de elevada afinidad por IgE (FcERI) y/o el receptor de elevada afinidad por IgG (Fc\gammaRI), activa una cascada de señalización en mastocitos, basófilos y otras células inmunitarias que da como resultado la liberación de mediadores químicos responsables de numerosos sucesos adversos. Por ejemplo, tal reticulación conduce a la liberación de mediadores preformados de reacciones de hipersensibilidad anafiláctica de tipo I (inmediata), tales como histamina, desde los sitios de almacenamiento en gránulos vía la desgranulación. También conduce a la síntesis y liberación de otros mediadores, incluyendo leucotrienos, prostaglandinas y factores activadores de plaquetas (PAF), que desempeñan papeles importantes en reacciones inflamatorias. Mediadores adicionales que se sintetizan y se liberan con la reticulación de receptores Fc incluyen citocinas y óxido nítrico.
La cascada o cascadas de señalización activadas por la reticulación de receptores Fc tales como FceRI y/o Fc\gammaRI comprenden un conjunto de proteínas celulares. Entre los propagadores de señales intracelulares más importantes están las tirosina cinasas. Y, una tirosina cinasa importante implicada en las rutas de transducción de señales asociadas con la reticulación de los receptores Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI, así como otras cascadas de transducción de señales, es Syk cinasa (véase Valent et al., 2002, Intl. J. Hematol. 75(4):257-362 para un repaso).
Puesto que los mediadores liberados como resultado de la reticulación de los receptores Fc\varepsilonRI y Fc\gammaRI son responsables de, o desempeñan papeles importantes en, la manifestación de numerosos sucesos adversos, sería muy deseable la disponibilidad de compuestos capaces de inhibir la cascada o cascadas de señalización responsables de su liberación. Además, dado el papel crítico que Syk cinasa desempeña en esta(s) y en otra(s) cascada(s) de señalización de receptores, también sería muy deseable la disponibilidad de compuestos capaces de inhibir Syk cinasa.
El documento WO 01/600.816 describe inhibidores de cinasas. El documento WO 01/64656 describe 2,4-di(hetero)arilamino-(oxi)-5-pirimidinas como agentes antineoplásicos. El documento WO 00/39101 describe derivados de pirimidina que son útiles como agentes contra el cáncer. El documento US-A-5958935 describe 2-anilinopirimidinas sustituidas útiles como inhibidores de proteína cinasas. El documento WO 01/47897 describe compuestos N-heterocíclicos que bloquean la producción de citocinas vía inhibición de p38 cinasa. El documento WO 00/58305 describe compuestos que son moduladores de la actividad de receptores de quimiocinas. El documento WO 03/063794, que se publicó el 7 de agosto de 2003, describe compuestos de 2,4-pirimidindiamina que inhiben las cascadas de señalización de los receptores de IgE y/o IgG que conducen a la liberación de mediadores químicos. El documento WO 03/078.404, que se publicó el 25 de septiembre de 2003, describe derivados de pirimidina útiles en trastornos en los que la inhibición de zap-70 y/o Syk desempeña un papel, o provocados por un mal funcionamiento de cascadas de señalización conectadas con FAK. El documento WO 03/076.437, publicado el 18 de septiembre de 2003, describe 2-heteroarilpirimidinas inhibidoras de CDK. El documento WO 03/002.544, publicado el 9 de enero de 2003, describe inhibidores N-heterocíclicos de la expresión de TNF-\alpha. El documento WO 03/026.664, publicado el 3 de abril de 2003, describe derivados de 2-fenilamino-4-(5-pirazolilamino)-pirimidina como inhibidores de cinasas, en particular inhibidores de SRC cinasas. El documento GB-A-2.373.186 describe combinaciones farmacéuticas de un antagonista de CCR3 y un compuesto que es útil en el tratamiento de asma, enfermedad alérgica o inflamación.
4. Sumario de la invención
Los compuestos usados en la invención generalmente comprenden un "núcleo" de 2,4-pirimidindiamina que tiene la siguiente estructura y convención numérica:
1
Los compuestos usados en la invención están sustituidos en el nitrógeno de C2 (N2), para formar una amina secundaria, y además están sustituidos en la posición C5. Los compuestos también están sustituidos en el nitrógeno de C4 (N4), para formar una amina secundaria. El sustituyente en N2, así como los sustituyentes opcionales en las otras posiciones, puede oscilar ampliamente en carácter y propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, el sustituyente o sustituyentes pueden ser un alquilo ramificado, de cadena lineal o cíclico, un heteroalquilo ramificado, de cadena lineal o cíclico, un arilo mono- o policíclico, un heteroarilo mono- o policíclico, o combinaciones de estos grupos. Estos grupos sustituyentes pueden estar sustituidos adicionalmente, como se describirá con más detalle más abajo.
Los sustituyentes de N2 y/o N4 están unidos directamente a sus átomos de nitrógeno respectivos.
Los sustituyentes en las posiciones N2, N4 y C5 pueden estar sustituidos adicionalmente con uno o más de los mismos o diferentes grupos sustituyentes. La naturaleza de estos grupos sustituyentes puede variar ampliamente. Los ejemplos no limitantes de grupos sustituyentes adecuados incluyen alquilos ramificados, de cadena lineal o cíclica, arilos mono- o policíclicos, heteroalquilos ramificados, de cadena lineal o cíclicos, heteroarilos mono- o policíclicos, halos, haloalquilos ramificados, de cadena lineal o cíclicos, hidroxilos, oxos, tioxos, alcoxis ramificados, de cadena lineal o cíclicos, haloalcoxis ramificados, de cadena lineal o cíclicos, trimetoxis, ariloxis mono- o policíclicos, heteroariloxis mono- o policíclicos, éteres, alcoholes, sulfuros, tioéteres, sulfanilos (tioles), iminas, azos, azidas, aminas (primarias, secundarias y terciarias), nitrilos (cualquier isómero), cianatos (cualquier isómero), tiocianatos (cualquier isómero), nitrosos, nitros, diazos, sulfóxidos, sulfonilos, ácidos sulfónicos, sulfamidas, sulfonamidas, ésteres sulfámicos, aldehídos, cetonas, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, amidinas, formadinas, aminoácidos, acetilenos, carbamatos, lactonas, lactamas, glucósidos, gluconúridos, sulfonas, cetales, acetales, tiocetales, oximas, ácidos oxámicos, ésteres oxámicos, etc., y combinaciones de estos grupos. Los grupos sustituyentes que poseen funcionalidades reactivas pueden estar protegidos o no protegidos, como es bien conocido en la técnica.
La presente invención proporciona un compuesto de 2,4-pirimidindiamina para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria distinta de enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, intestino inflamatorio, y enfermedad inflamatoria idiopática del intestino, en el que el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es:
un compuesto de fórmula estructural (I):
2
o una sal, hidrato, solvato y/o un N-óxido del mismo, en la que:
\quad
L^{1} y L^{2} son cada uno un enlace directo;
\quad
R^{2} se selecciona del grupo que consiste en fenilo monosustituido en la posición 3 ó 5 con un grupo R^{8}, fenilo di- o tri-sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{8}, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo;
\quad
R^{4} se selecciona del grupo que consiste en fenilo sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{8}, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo; en la que, para R^{2} y R^{4}, cada uno de dicho heteroarilo opcionalmente sustituido, independientemente entre sí, se selecciona del grupo que consiste en:
3 
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
3000 
\vskip1.000000\baselineskip
4
4000 
\vskip1.000000\baselineskip
en las que:
\quad
p es un número entero de uno a tres;
\quad
cada - - - representa independientemente un enlace sencillo o un doble enlace;
\quad
R^{35} es hidrógeno o R^{8};
\quad
X se selecciona del grupo que consiste en CH, N y N-O;
\quad
cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S y NH;
\quad
cada Y^{1} se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, SO, SO_{2}, SONR^{36}, NH y NR^{37};
\quad
cada Y^{2} se selecciona independientemente del grupo que consiste en CH, CH_{2}, O, S, N, NH y NR^{37};
\quad
R^{36} es hidrógeno o alquilo;
\quad
R^{37} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y un progrupo seleccionado del grupo que consiste en arilo, arilalquilo, heteroarilo, R^{a}, R^{b}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)R^{8}, -CR^{a}R^{b}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-PO(OR^{8})_{2}, -C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -C(O)R^{8}, -C(O)CF_{3} y -C(O)-NR^{8}-C(O)R^{8};
\quad
R^{38} se selecciona del grupo que consiste en alquilo y arilo;
\quad
A se selecciona del grupo que consiste en O, NH y NR^{38};
\quad
R^{9}, R^{10}, R^{11} y R^{12} se selecciona cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, halógeno, haloalcoxi, aminoalquilo e hidroxialquilo, o, como alternativa, R^{9} y R^{10} y/o R^{11} y R^{12} se toman juntos para formar un cetal;
\quad
cada Z se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi, ariloxi, éster, y carbamato;
\quad
Q se selecciona del grupo que consiste en -OH, -OR^{8}, -NR^{c}R^{c}, -NR^{39}-CHR^{40}-R^{b}, -NR^{39}-(CH_{2})_{m}-R^{b} y -NR^{39}-C(O)-CHR^{40}-NR^{c}R^{c};
\quad
R^{39} y R^{40} se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo y NHR^{8};
\quad
R^{5} se selecciona del grupo que consiste en -CN, -NC, fluoro, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), haloalcoxi (C1-C3), perhaloalcoxi (C1-C3), -C(O)R^{a}, -C(O)OR^{a}, -C(O)CF_{3} y -C(O)OCF_{3};
\quad
R^{6} es hidrógeno;
\quad
R^{8} se selecciona del grupo que consiste en R^{e}, R^{b}, R^{e} sustituido con uno o más del mismo o diferente R^{a} o R^{b}, -OR^{a} sustituido con uno o más del mismo o diferente R^{a} o R^{b}, -B(OR^{a})_{2}, -B(NR^{c}R^{c})_{2}, -(CH_{2})_{m}-R^{b}, -(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -S-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -O-CHR^{a}R^{b}, -O-CR^{a}(R^{b})_{2}, -O-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-CH[CH_{2})_{m}R^{b}]R^{b}, -S-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -S-(CH_{2})_{m}-C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -O-(CHR^{a})_{m}-C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -S-(CHR^{a})_{m}-C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -N[(CH_{2})_{m}R^{b}]_{2}, -NH-C(O)-NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -NH-C(O)-(CH_{2})_{m}-CHR^{b}R^{b} y -NH-(CH_{2})_{m}-C(O)-NH-(CH_{2})_{m}- R^{b};
\quad
cada R^{a} se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
\quad
cada R^{b} es un grupo adecuado seleccionado independientemente del grupo que consiste en =O, -OR^{d}, haloalquiloxi (C1-C3), =S, -SR^{d}, =NR^{d}, =NOR^{d}, -NR^{c}R^{c}, halógeno, -CF_{3}, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO_{2}, =N_{2}, -N_{3}, -S(O)R^{d}, -S(O)_{2}R^{d}, -S(O)_{2}OR^{d}, -S(O)NR^{c}R^{c}, -S(O)_{2}NR^{c}R^{c}, -OS(O)R^{d}, -OS(O)_{2}R^{d}, -OS(O)_{2}OR^{d}, -OS(O)_{2}NR^{c}R^{c}, -C(O)R^{d}, -C(O)OR^{d}, -C(O)NR^{c}R^{c}, -C(NH)NR^{c}R^{c}, -C(NR^{a})NR^{c}R^{c}, -C(NOH)R^{a}, -C(NOH)NR^{c}R^{c}, -OC(O)R^{d}, -OC(O)OR^{d}, -OC(O)NR^{c}R^{c}, -OC(NH)NR^{c}R^{c}, -OC(NR^{a})NR^{c}R^{c}, -[NHC(O)]_{n}R^{d}, -[NR^{a}C(O)]_{n}R^{d}, -[NHC(O)]_{n} OR^{d}, -[NR^{a}C(O)]_{n}OR^{d}, -[NHC(O)]_{n}NR^{c}R^{c}, -[NR^{a}C(O)]_{n}NR^{c}R^{c}, -[NHC(NH)]_{n}NR^{c}R^{c} y -[NR^{a}C(NR^{a})]_{n}NR^{c} R^{c};
\quad
cada R^{c} es independientemente R^{a}, o, como alternativa, dos R^{c} se toman juntos con el átomo de nitrógeno al que están enlazados para formar un cicloheteroalquilo o heteroarilo de 5 a 8 miembros que puede incluir opcionalmente uno o más de los mismos o diferentes heteroátomos adicionales, y que puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes R^{a} o grupos R^{b} adecuados;
\quad
cada R^{d} es independientemente un R^{a};
\quad
cada R^{e} se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
\quad
cada m es independientemente un número entero de 1 a 3; y
\quad
cada n es independientemente un número entero de 0 a 3; o
\quad
el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 7.4.214 a 7.4.244, 7.4.250 a 7.4.252, 7.4.256 a 7.4.258, 7.4.262 a 7.4.269, 7.4.272 a 7.4.276, 7.4.278 a 7.4.280, 7.4.283 a 7.4.289, 7.4.296, 7.4.298 a 7.4.302, 7.4.304, 7.4.305, 7.4.308 a 7.4.313, 7.4.315, 7.4.317, y 7.4.318;
\quad
con las condiciones de que en la fórmula (I):
(1)
cuando R^{2} es un fenilo sustituido, entonces R^{5} es diferente de ciano o -C(O)NHR, en el que R es hidrógeno o alquilo (C1-C6);
(2)
cuando R^{2} y R^{4} son cada uno independientemente un indol sustituido o no sustituido, entonces R^{2} y R^{4} están unidos al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular; y
(3)
el compuesto no sea
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5 
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\quad
Se describen profármacos de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina. Tales profármacos pueden ser activos en su forma de profármaco, o pueden ser inactivos hasta que se convierten en condiciones fisiológicas u otras condiciones de uso en una forma de fármaco activo. En los profármacos, uno o más grupos funcionales de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina están incluidos en prorrestos que se escinden de la molécula en las condiciones de uso, típicamente mediante hidrólisis, escisión enzimática o algún otro mecanismo de escisión, para producir los grupos funcionales. Por ejemplo, se pueden incluir grupos amino primario o secundario en un prorresto de amida que se escinde en condiciones de uso para generar el grupo amino primario o secundario. De este modo, los profármacos incluyen tipos especiales de grupos protectores, denominados "progrupos", que enmascaran uno o más grupos funcionales de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina que se escinden en las condiciones de uso para dar un compuesto farmacéutico de 2,4-pirimidindiamina activo. Los grupos funcionales en el compuesto de 2,4-pirimidindiamina que se pueden enmascarar con progrupos para la inclusión en un prorresto incluyen, pero no se limitan a, aminas (primarias y secundarias), hidroxilos, sulfanilos (tioles), carboxilos, carbonilos, fenoles, catecoles, dioles, alquinos, fosfatos, etc. En la técnica se conocen miríadas de progrupos adecuados para enmascarar tales grupos funcionales para producir prorrestos que son escindibles en las condiciones deseadas de uso. Todos estos progrupos, solos o en combinaciones, se pueden incluir en los profármacos de la invención. Ejemplos específicos de prorrestos que producen grupos amina primaria o secundaria que se pueden incluir en los profármacos incluyen, pero no se limitan a, amidas, carbamatos, iminas, ureas, fosfenilos, fosforilos y sulfenilos. Los ejemplos específicos de prorrestos que producen grupos sulfanilo que se pueden incluir en los profármacos incluyen, pero no se limitan a, tioéteres, por ejemplo derivados S-metílicos (monotio-, ditio-, oxitio-, aminotioacetales), sililtioéteres, tioésteres, tiocarbonatos, tiocarbamatos, disulfuros asimétricos, etc. Los ejemplos específicos de prorrestos que se escinden para producir grupos hidroxilo que se pueden incluir en los profármacos incluyen, pero no se limitan a, sulfonatos, ésteres y carbonatos. Ejemplos específicos de prorrestos que producen grupos carboxilo que se pueden incluir en los profármacos incluyen, pero no se limitan a, ésteres (incluyendo ésteres de sililo, ésteres y tioésteres de ácido oxámico), amidas e hidrazidas.
En un ejemplo, los profármacos son compuestos según la fórmula estructural (I) en los que el grupo protector de R^{c} y R^{d} es un progrupo.
La sustitución de los hidrógenos unidos a N2 y N4 en las 2,4-pirimidindiaminas de fórmula estructural (I) por sustituyentes afecta adversamente a la actividad de los compuestos. Sin embargo, como apreciarán los expertos, estos nitrógenos se pueden incluir en prorrestos que, en condiciones de uso, se escinden para producir 2,4-pirimidindiaminas según la fórmula estructural (I). De este modo, en otro ejemplo, los profármacos son compuestos según la fórmula estructural (II):
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6 
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incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-óxidos del mismo, en la que:
\quad
R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{1} y L^{2} son como se define previamente para la fórmula estructural (I); y
\quad
R^{2b} y R^{4b} son cada uno, independientemente entre sí, un progrupo.
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En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones para uso según la invención, comprendiendo la composición uno o más compuestos y un vehículo, excipiente o diluyente apropiado. La naturaleza exacta del vehículo, excipiente o diluyente dependerá del uso deseado para la composición, y puede oscilar desde adecuada o aceptable para usos veterinarios a adecuada o aceptable para uso humano.
Se describen intermedios útiles para sintetizar los compuestos y profármacos de 2,4-pirimidindiamina. En un ejemplo, los intermedios son 4-pirimidinaminas según la fórmula estructural (III):
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7 
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incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-óxidos del mismo, en la que R^{4}, R^{5}, R^{6} y L^{2} son como se define anteriormente para la fórmula estructural (I); LG es un grupo saliente tal como, por ejemplo, -S(O)_{2}Me, -SMe o halo (por ejemplo, F, Cl, Br, I); y R^{40} es hidrógeno o un progrupo.
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En otro ejemplo, los intermedios son 2-pirimidinaminas según la fórmula estructural (IV):
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8 
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incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-óxidos de las mismas, en la que R^{2}, R^{5}, R^{6} y L^{1} son como se define previamente para la fórmula estructural (I); LG es un grupo saliente, tal como, por ejemplo, -S(O)_{2}Me, -SMe o halo (por ejemplo, P, Cl, Bar, I) y R^{2c} es hidrógeno o un progrupo.
Todavía en otro ejemplo, los intermedios son 4-amino- o 4-hidroxi-2-pirimidinaminas según la fórmula estructural (V):
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incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-óxidos de las mismas, en la que R^{2}, R^{5}, R^{6} y L^{1} son como se define previamente para la fórmula estructural (I), R^{7} es un grupo amino o hidroxilo, y R^{2c} es hidrógeno o un progrupo.
En otro ejemplo, los intermedios son citosinas sustituidas en N4 según la fórmula estructural (VI):
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incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-óxidos de las mismas, en la que R^{4}, R^{5}, R^{5} y L^{2} son como se define previamente para la fórmula estructural (I), y R^{4c} es hidrógeno o un progrupo.
Se describen métodos para sintetizar los compuestos y profármacos de 2,4-pirimidindiamina. En un ejemplo, el método implica hacer reaccionar una 4-pirimidinamina según la fórmula estructural (III) con una amina de la fórmula HR^{26}N-L^{1}-R^{2}, en la que L^{1}, R^{2} y R^{2c} son como se define previamente para la fórmula estructural (IV), para producir una 2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural (I) o un profármaco según la fórmula estructural
(II).
En otro ejemplo, el método implica hacer reaccionar una 2-pirimidinamina según la fórmula estructural (IV) con una amina de la fórmula R^{4}-L^{2}-NHR^{40}, en la que L^{4}, R^{4} y R^{4c} son como se define previamente para la fórmula estructural (III), para producir una 2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural (I) o un profármaco según la fórmula estructural (II).
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Todavía en otro ejemplo, el método implica hacer reaccionar una 4-amino-2-pirimidinamina según la fórmula estructural (V) (en la que R^{7} es un grupo amino) con una amina de la fórmula R^{4}-L^{2}-NHR^{4c}, en la que L^{2}, R^{4} y R^{4c} son como se define para la fórmula estructural (III), para producir una 2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural (I) o un profármaco según la fórmula estructural (II). Como alternativa, la 4-amino-2-pirimidinamina se puede hacer reaccionar con un compuesto de fórmula R^{4}-L^{2}-LG, en la que R^{4} y L^{2} son como se define previamente para la fórmula estructural (I), y LG es un grupo saliente.
Todavía en otro ejemplo, el método implica halogenar una 4-hidroxi-2-pirimidinamina según la fórmula estructural (V) (R^{7} es un grupo hidroxilo) para producir una 2-pirimidinamina según la fórmula estructural (IV), y hacer reaccionar esta pirimidinamina con una amina apropiada, como se describe anteriormente.
Todavía en otro ejemplo, el método implica halogenar una citosina sustituida en N4 según la fórmula estructural (VI) para producir una 4-pirimidinamina según la fórmula estructural (III), y hacer reaccionar esta pirimidinamina con una amina apropiada, como se describe anteriormente.
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina usados en la invención son potentes inhibidores de la desgranulación de inmunocitos, tales como mastocitos, basófilos, neutrófilos y/o eosinófilos. De este modo, se describen métodos para regular, y en particular inhibir, la desgranulación de tales células. El método implica generalmente poner en contacto una célula que se desgranula con una cantidad de un compuesto o profármaco de 2,4-pirimidindiamina, o una sal aceptable, hidrato, solvato, N-óxido y/o composición del mismo, efectiva para regular o inhibir la desgranulación de la célula. El método se puede poner en práctica en contextos in vitro o en contextos in vivo como un enfoque terapéutico para el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por, provocadas por o asociadas con la desgranulación celular.
Aunque no se pretende estar atados por ninguna teoría de operación, los datos bioquímicos confirman que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina ejercen su efecto inhibidor de la desgranulación, al menos en parte, bloqueando o inhibiendo la cascada o cascadas de transducción de señales iniciada por la reticulación de los receptores Fc de elevada afinidad para IgE ("Fc\varepsilonRI") y/o IgG ("Fc\gammaRI"). De hecho, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina son potentes inhibidores de la desgranulación mediada tanto por Fc\varepsilonRI como por Fc\gammaRI. Como consecuencia, los compuestos de 2,4-pirimidina se pueden usar para inhibir estas cascadas de señalización de los receptores Fc en cualquier tipo de célula que exprese tales receptores Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI, incluyendo, pero sin limitarse a, macrófagos, mastocitos, basófilos, neutrófilos y/o eosinófilos.
Los métodos también permiten la regulación de, y en particular la inhibición de, procesos aguas abajo que resultan como consecuencia de la activación de tal cascada o cascadas de señalización de los receptores Fc. Tales procesos aguas abajo incluyen, pero no se limitan a, la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI y/o mediada por Fc\gammaRI, la producción de citocinas y/o la producción y/o la liberación de mediadores lipídicos tales como leucotrienos y prostaglandinas. El método implica generalmente poner en contacto una célula que expresa un receptor Fc, tal como uno de los tipos celulares explicados anteriormente, con una cantidad de un compuesto o profármaco de 2,4-pirimidindiamina, o una sal aceptable, hidrato, disolvente, N-óxido y/o composición del mismo, eficaz para regular o inhibir la cascada de señalización del receptor Fc y/o un proceso aguas abajo afectado por la activación de esta cascada de señalización. El método se puede poner en práctica en contextos in vitro o en contextos in vivo como un enfoque terapéutico dirigido al tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por, provocadas por o asociadas con la cascada de señalización del receptor Fc, tales como enfermedades afectadas por la liberación de mediadores químicos específicos de los gránulos con la desgranulación, la liberación y/o síntesis de citocinas, y/o la liberación y/o síntesis de mediadores lipídicos tales como leucotrienos y prostaglandinas.
La presente invención proporciona los compuestos de 2,4-pirimidina definidos para uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades caracterizadas por, provocadas por o asociadas con la liberación de mediadores químicos como consecuencia de la activación de cascadas de señalización de los receptores Fc, tales como las cascadas de señalización de Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI. Los métodos se pueden poner en práctica en animales en los contextos veterinarios, o en seres humanos. Los métodos generalmente implican administrar a un sujeto animal o a un ser humano una cantidad de un compuesto o profármaco de 2,4,-pirimidindiamina o una sal aceptable, hidrato, solvato, N-óxido y/o una composición del mismo, eficaz para tratar o prevenir la enfermedad. Como se explica previamente, la activación de la cascada de señalización de los receptores Fc\varepsilonRI y Fc\gammaRI en ciertas células inmunitarias conduce a la liberación y/o síntesis de una variedad de sustancias químicas que son mediadores farmacológicos de una amplia variedad de enfermedades. Cualquiera de estas enfermedades se puede tratar o prevenir.
Por ejemplo, en mastocitos y basólilos, la activación de la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI o Fc\gammaRI conduce a la liberación inmediata (es decir, en 1-3 min. de la activación del receptor) de mediadores preformados de reacciones de hipersensibilidad atópica y/o de tipo I (por ejemplo, histamina, proteasas tales como triptasa, etc.) vía el proceso de desgranulación. Tales reacciones de hipersensibilidad atópica o de tipo I incluyen, pero no se limitan a, reacciones anafilácticas al medio ambiente y a otros alérgenos (por ejemplo, pólenes, venenos de insectos y/o animales, alimentos, fármacos, colorantes de contraste, etc.), reacciones anafilactoides, fiebre del heno, conjuntivitis alérgica, rinitis alérgica, asma alérgica, dermatitis atópica, eccema, urticaria, trastornos de la mucosa, trastornos de los tejidos, y ciertos trastornos gastrointestinales.
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La liberación inmediata de los mediadores preformados vía la desgranulación es seguida de la liberación y/o síntesis de una variedad de otros mediadores químicos, incluyendo, entre otros, el factor activador de plaquetas (PAF), prostaglandinas y leucotrienos (por ejemplo, LTC4), y la síntesis de novo y la liberación de citocinas tales como TNF\alpha, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, etc. El primero de estos dos procesos se produce aproximadamente 3-30 min. tras la activación del receptor; el último, aproximadamente 30 min-7 h tras la activación del receptor. Se piensa que estos mediadores de "etapa tardía" son responsables en parte de los síntomas crónicos de las reacciones de hipersensibilidad atópica y de tipo I enumeradas anteriormente, y además son mediadores químicos de la inflamación y enfermedades inflamatorias (por ejemplo, osteoartritis, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria idiopática del intestino, síndrome de intestino irritable, colon espástico, etc.), cicatrización de bajo grado (por ejemplo, esclerodermia, fibrosis incrementada, queloides, cicatrices post-quirúrgicas, fibrosis pulmonar, espasmos vasculares, migraña, lesión por reperfusión y postinfarto del miocardio), y complejo o síndrome seco. Todas estas enfermedades se pueden tratar o prevenir.
Enfermedades adicionales que se pueden tratar o prevenir incluyen enfermedades asociadas con patología de basófilos y/o mastocitos. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades de la piel tales como esclerodermia, cardiopatías tales como postinfarto de miocardio, enfermedades pulmonares tales como cambios o remodelación del músculo pulmonar y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y enfermedades del intestino tales como síndrome inflamatorio del intestino (colon espástico).
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina usados en la invención son también potentes inhibidores de la tirosina cinasa Syk cinasa. Se describen métodos para regular, y en particular inhibir, la actividad de Syk cinasa. El método implica generalmente poner en contacto una Syk cinasa, o una célula que comprende una Syk cinasa, con una cantidad de un compuesto o profármaco de 2,4-pirimidindiamina de la invención, o una sal aceptable, hidrato, solvato, N-óxido y/o composición del mismo, eficaz para regular o inhibir la actividad de Syk cinasa. En un ejemplo, la Syk cinasa es una Syk cinasa aislada o recombinante. En otro ejemplo, la Syk cinasa es una Syk cinasa endógena o recombinante expresada por una célula, por ejemplo un mastocito o un basófilo. El método se puede poner en práctica en contextos in vitro o en contextos in vivo como un enfoque terapéutico para el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por, provocadas por o asociadas con la actividad de Syk cinasa.
Aunque no se pretende estar atados por ninguna teoría particular de operación, se cree que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina inhiben la desgranulación celular y/o la liberación de otros mediadores químicos principalmente inhibiendo Syk cinasa que es activada a través del homodímero de la cadena gamma de Fc\varepsilonRI (véase, por ejemplo, Fig. 2). Este homodímero de la cadena gamma es compartido por otros receptores Fc, incluyendo Fc\gammaRI, Fc\gammaRIII y Fc\alphaRI. Para todos estos receptores, la transducción de señal intracelular está mediada por el homodímero de la cadena gamma común. La unión y la agregación de esos receptores da como resultado el reclutamiento y activación de tirosina cinasas tales como Syk cinasa. Como consecuencia de estas actividades de señalización común, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aquí que se metabolizan en tales compuestos de 2,4-pirimidindiamina activos se pueden usar para regular, y en particular inhibir, las cascadas de señalización de receptores Fc que tienen este homodímero de la cadena gamma, tales como Fc\varepsilonRI, Fc\gammaRI, Fc\gammaRIII y Fc\alphaRI, así como las respuestas celulares provocadas a través de estos receptores.
Se sabe que Syk cinasa desempeña un papel crítico en otras cascadas de señalización. Por ejemplo, Syk cinasa es un efector de la señalización del receptor de células B (BCR) (Turner et al., 2000, Immunology Today 21:148-154), y es un componente esencial de la señalización de integrina beta(1), beta(2) y beta(3) en neutrófilos (Mocsai et al., 2002, Immunity 16:547-558). Puesto que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aquí son potentes inhibidores de Syk cinasa, se pueden usar para regular, y en particular inhibir, cualquier cascada de señalización en la que Syk desempeñe un papel, tal como, por ejemplo, las cascadas de señalización de los receptores Fc, de BCR y de integrinas, así como las respuestas celulares provocadas mediante estas cascadas de señalización. La respuesta celular particular, regulada o inhibida, dependerá, en parte, del tipo celular específico y de la cascada de señalización del receptor, como es bien conocido en la técnica. Los ejemplos no limitantes de respuestas celulares que pueden ser reguladas o inhibidas con los compuestos de 2,4-pirimidindiamina incluyen un estallido respiratorio, adhesión celular, desgranulación celular, diseminación celular, migración celular, fagocitosis (por ejemplo, en macrófagos), flujo de iones calcio (por ejemplo, en mastocitos, basófilos, neutrófilos, eosinófilos y células B), agregación plaquetaria, y maduración celular (por ejemplo, en células B).
De este modo, en otro aspecto, se describen métodos para regular, y en particular inhibir, cascadas de transducción de señales en las que Syk desempeña un papel. El método generalmente implica poner en contacto un receptor dependiente de Syk, o una célula que expresa un receptor dependiente de Syk, con una cantidad de un compuesto o profármaco de 2,4-pirimidindiamina, o una sal aceptable, hidrato, solvato, N-óxido y/o composición del mismo, eficaz para regular o inhibir la cascada de transducción de señales. Los métodos también se pueden usar para regular, y en particular inhibir, procesos aguas abajo o respuestas celulares provocadas por la activación de la cascada de transducción de señales dependiente de Syk particular. Los métodos se pueden poner en práctica para regular cualquier cascada de transducción de señales en la que no se sabe o se ha descubierto posteriormente que Syk desempeña un papel. Los métodos se pueden poner en práctica en contextos in vitro o en contextos in vivo como un enfoque terapéutico para el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por, provocadas por o asociadas con la activación de la cascada de transducción de señales dependiente de Syk. Los ejemplos no limitados de tales enfermedades incluyen las explicadas anteriormente.
Los datos celulares y de animales también confirman que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina también se pueden usar para tratar o prevenir enfermedades autoinmunitarias y/o síntomas de tales enfermedades. Los métodos generalmente implican administrar a un sujeto que sufre una enfermedad autoinmunitaria, o que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmunitaria, una cantidad de un compuesto o profármaco de 2,4-pirimidindiamina, o una sal aceptable, N-óxido, hidrato, solvato o composición del mismo, eficaz para tratar o prevenir la enfermedad autoinmunitaria y/o sus síntomas asociados. Las enfermedades autoinmunitarias que se pueden tratar o prevenir con los compuestos de 2,4-pirimidindiamina incluyen aquellas enfermedades que están asociadas habitualmente con reacciones de hipersensibilidad no anafiláctica (reacciones de hipersensibilidad de tipo II, tipo III y/o tipo IV), y/o aquellas enfermedades que están mediadas, al menos en parte, por la activación de la cascada de señalización de Fc\gammaR en monocitos. Tal enfermedad autoinmunitaria incluye, pero no se limita a, aquellas enfermedades autoinmunitarias que se denominan frecuentemente como trastornos autoinmunitarios de órgano individual o de tipo celular individual, y aquella enfermedad autoinmunitaria que se denomina frecuentemente como trastorno autoinmunitario sistémico. Los ejemplos no limitantes de enfermedades denominadas frecuentemente como trastornos autoinmunitarios de órgano individual o de tipo celular individual incluyen: tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica autoinmunitaria, gastritis atrófica autoinmunitaria de anemia perniciosa, encefalomielitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, enfermedad de Goodpasture, trombocitopenia autoinmunitaria, oftalmia simpática, miastenia grave, enfermedad de Graves, cirrosis biliar primaria, hepatitis agresiva crónica, colitis ulcerosa y glomerulopatía membranosa. Los ejemplos no limitantes de enfermedades denominadas a menudo como trastorno autoinmunitario sistémico incluyen: lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, síndrome de Reiter, polimiositis-dermatomiositis, esclerosis sistémica, panarteritis nudosa, esclerosis múltiple y penfigoide
ampolloso.
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5. Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 proporciona un dibujo que ilustra la producción de IgE inducida por alérgenos, y la liberación consiguiente de mediadores preformados y otros mediadores químicos a partir de mastocitos;
la Fig. 2 proporciona un dibujo que ilustra la cascada de transducción de señales de Fc\varepsilonRI que conduce a la desgranulación de mastocitos y/o basófilos;
la Fig. 3 proporciona un dibujo que ilustra los puntos de acción putativos de compuestos que inhiben selectivamente aguas arriba la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI, y compuestos que inhiben la desgranulación tanto mediada por Fc\varepsilonRI como inducida por ionomicina;
la Fig. 4 proporciona gráficas que ilustran los efectos de ciertos compuestos de 2,4-pirimidindiamina, DMSO (control) y ionomicina sobre el flujo de Ca^{2+} en células CHMC;
la Fig. 5 proporciona gráficas que ilustran la inmediatez de la actividad inhibidora de los compuestos R921218 y R926495;
la Fig. 6 proporciona una gráfica que ilustra el efecto de lavado sobre la actividad inhibidora de los compuestos R921218 y R921302;
la Fig. 7 proporciona datos que muestran que concentraciones variables de los compuestos R921218 (A) y R921219 (B) inhiben la fosforilación de diversas proteínas aguas abajo de Syk cinasa en la cascada de transducción de señales del receptor de IgE en células BMMC activadas;
la Fig. 8 proporciona datos que muestran la inhibición, sensible a la dosis, de la fosforilación de Syk cinasa de un sustrato endógeno (LAT) y un sustrato peptídico en presencia de concentraciones crecientes de los compuestos R921218 (X), R921219 (Y) y R921304 (Z);
la Fig. 9 proporciona datos que muestran que la inhibición de Syk cinasa por el compuesto R921219 es competitiva con ATP;
la Fig. 10 proporciona datos que muestran que concentraciones variables de los compuestos R921219 (A) y R218218 (B) inhiben la fosforilación de proteínas aguas abajo de Syk cinasa, pero no LYN cinasa, en la cascada de transducción de señales de Fc\varepsilonRI en células CHMC activadas; también se muestra la inhibición de la fosforilación de proteínas aguas abajo de LYN cinasa, pero no Syk cinasa, en presencia de un inhibidor de LYN cinasa conocido (PP2);
las Figs. 11A-D proporcionan datos que muestran la inhibición de la fosforilación de proteínas aguas abajo de Syk cinasa en la cascada de transducción de señales de Fc\varepsilonRI en células BMMC;
la Fig. 12 es una gráfica que ilustra la eficacia del compuesto R921302 en un modelo de ratón de artritis inducida por anticuerpos contra el colágeno ("CAIA");
\newpage
la Fig. 13 es una gráfica que ilustra la eficacia del compuesto R921302 en el modelo de CAIA en comparación con otros agentes y agentes de control;
la Fig. 14 es una gráfica que ilustra la eficacia del compuesto R921302 en un modelo de rata de artritis inducida por colágeno ("CIA");
la Fig. 15 es una gráfica que ilustra la eficacia del compuesto R921302 en la inhibición de encefalomielitis autoinmunitaria experimental ("EAE") en ratones, un modelo clínico para esclerosis múltiple; y
la Fig. 16 es una gráfica que ilustra la eficacia del compuesto R921302 sobre ratones SJL tratados en el día de partida de la inmunización con 150 \mug de POLIPÉPTIDO 139-151/200 \mug de MTB (CFA).
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6. Descripción detallada de las realizaciones preferidas 6.1 Definiciones
Como se usan aquí, los siguientes términos están destinados a tener los siguientes significados:
\quad
"Alquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un radical hidrocarbonado monovalente ramificado, de cadena lineal o cíclico, saturado o insaturado, que tiene el número señalado de átomos de carbono (es decir, C1-C6 significa uno a seis átomos de carbono), que deriva de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un alcano, alqueno o alquino progenitor. Los grupos alquilo típicos incluyen, pero no se limitan a, metilo; etilos tales como metilo; etilos tales como etanilo, etenilo, etinilo; propilos tales como propan-1-ilo, propan-2-ilo, ciclopropan-1-ilo, prop-1-en-1-ilo, prop-1-en-2-ilo, prop-2-en-1-ilo, cicloprop-1-en-1-ilo; cicloprop-2-en-1-ilo, prop-1-in-1-ilo, prop-2-in-1-ilo, etc.; butilos tales como butan-1-ilo, butan-2-ilo, 2-metil-propan-1-ilo, 2-metil-propan-2-ilo, ciclobutan-1-ilo, but-1-en-1-ilo, but-1-en-2-ilo, 2-metil-prop-1-en-1-ilo, but-2-en-1-ilo, but-2-en-2-ilo, buta-1,3-dien-1-ilo, buta-1,3-dien-2-ilo, ciclobut-1-en-1-ilo, ciclobut-1-en-3-ilo, ciclobuta-1,3-dien-1-ilo, but-1-in-1-ilo, but-1-in-3-ilo, but-3-in-1-ilo, etc.; y similares. Cuando se pretenden niveles específicos de saturación, se usa la nomenclatura "alcanilo", "alquenilo" y/o "alquinilo", como se define más abajo. En realizaciones preferidas, los grupos alquilo son alquilo (C1-C6).
\quad
"Alcanilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un alquilo ramificado, de cadena lineal o cíclico, saturado, derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un alcano progenitor. Grupos alcanilo típicos incluyen, pero no se limitan a, metanilo; etanilo; propanilos tales como propan-1-ilo, propan-2-ilo (isopropilo), ciclopropan-1-ilo, etc.; butanilos tales como butan-1-ilo, butan-2-ilo (sec-butilo), 2-metil-propan-1-ilo (isobutilo), 2-metil-propan-2-ilo (t-butilo), ciclobutan-1-ilo, etc.; y similares. En realizaciones preferidas, los grupos alcanilo son alcanilo (C1-C6).
\quad
"Alquenilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un alquilo ramificado, de cadena lineal o cíclico, insaturado, que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono, derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un alqueno progenitor. El grupo puede estar en conformación cis o trans alrededor del doble o dobles enlaces. Grupos alquenilo típicos incluyen, pero no se limitan a, etenilo; propenilos tales como prop-1-en-1-ilo, prop-1-en-2-ilo, prop-2-en-1-ilo, prop-2-en-2-ilo, cicloprop-1-en-1-ilo, cicloprop-2-en-1-ilo; butenilos tales como but-1-en-1-ilo, but-1-en-2-ilo, 2-metil-prop-1-en-1-ilo, but-2-en-1-ilo, but-2-en-2-ilo, buta-1,3-dien-1-ilo, buta-1,3-dien-2-ilo, ciclobut-1-en-1-ilo, ciclobut-1-en-3-ilo, ciclobuta-1,3-dien-1-ilo, etc.; y similares. En realizaciones preferidas, el grupo alquenilo es alquenilo (C2-C6).
\quad
"Alquinilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un alquilo ramificado, de cadena lineal o cíclico, insaturado, que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono, derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un alquino progenitor. Grupos alquinilo típicos incluyen, pero no se limitan a, etinilo; propinilos tales como prop-1-in-1-ilo, prop-2-in-1-ilo, etc.; butinilos tales como but-1-in-1-ilo, but-1-in-3-ilo, but-3-in-1-ilo, etc.; y similares. En realizaciones preferidas, el grupo alquinilo es alquinilo (C2-C6).
\quad
"Alquildiilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo hidrocarbonado divalente ramificado, de cadena lineal o cíclico, saturado o insaturado, que tiene el número señalado de átomos de carbono (es decir, C1-C6 significa de uno a seis átomos de carbono), derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de cada uno de dos átomos de carbono diferentes de un alcano, alqueno o alquino progenitor, o mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un alcano, alqueno o alquino progenitor. Los dos centros radicálicos monovalentes, o cada valencia del centro radical divalente, pueden formar enlaces con los mismos átomos o con átomos diferentes. Los grupos alquildiilo típicos incluyen, pero no se limitan a, metandiilo; etildiilos tales como etan-1,1-diilo, etan-1,2-diilo, eten-1,1-diilo, eten-1,2-diilo; propildiilos tales como propan-1,1-diilo, propan-1,2-diilo, propan-2,2-diilo, propan-1,3-diilo, ciclopropan-1,1-diilo, ciclopropan-1,2-diilo, prop-1-en-1,1-diilo, prop-1-en-1,2-diilo, prop-2-en-1,2-diilo, prop-1-en-1,3-diilo, cicloprop-1-en-1,2-diilo, cicloprop-2-en-1,2-diilo, cicloprop-2-en-1,1-diilo, prop-1-in-1,3-diilo, etc.; butildiilos tales como butan-1,1-diilo, butan-1,2-diilo, butan-1,3-diilo, butan-1,4-diilo, butan-2,2-diilo, 2-metil-propan-1,1-diilo, 2-metil-propan-1,2-diilo, ciclobutan-1,1-diilo, ciclobutan-1,2-diilo, ciclobutan-1,3-diilo, but-1-en-1,1-diilo, but-1-en-1,2-diilo, but-1-en-1,3-diilo, but-1-en-1,4-diilo, 2-metil-prop-1-en-1,1-diilo, 2-metaniliden-propan-1,1-diilo, buta-1,3-dien-1,1-diilo, buta-1,3-dien-1,2-diilo, buta-1,3-dien-1,3-diilo, buta-1,3-dien-1,4-diilo, ciclobut-1-en-1,2-diilo, ciclobut-1-en-1,3-diilo, ciclobut-2-en-1,2-diilo, ciclobuta-1,3-dien-1,2-diilo, ciclobuta-1,3-dien-1,3-diilo, but-1-in-1,3-diilo, but-1-in-1,4-diilo, buta-1,3-diin-1,4-diilo, etc.; y similares. Cuando se pretenden niveles específicos de saturación, se usa la nomenclatura alcanildiilo, alquenildiilo y/o alquinildiilo. Cuando se pretende específicamente que las dos valencias estén en el mismo átomo de carbono, se usa la nomenclatura "alquilideno". En algunas realizaciones, el grupo alquildiilo es alquildiilo (C1-C6). También se prefieren grupos alcanildiilo acíclicos saturados en los que los centros radicálicos están en los carbonos terminales, por ejemplo metandiilo (metano); etan-1,2-diilo (etano); propan-1,3-diilo (propano); butan-1,4-diilo (butano); y similares (también denominados como alquilenos, definidos más abajo).
\quad
"Alquileno", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo alquildiilo saturado o insaturado, de cadena lineal, que tiene dos centros radicálicos monovalentes terminales derivados de la eliminación de un átomo de hidrógeno de cada uno de los dos átomos de carbono terminales de un alcano, alqueno o alquino progenitor de cadena lineal. El localizador de un doble enlace o un triple enlace, si está presente, en un alquileno particular, se indica entre corchetes. Los grupos alquileno típicos incluyen, pero no se limitan a, metano; etilenos tales como etano, eteno, etino; propilenos tales como propano, prop[1]eno, propa[1,2]dieno, prop[1]ino, etc.; butilenos tales como butano, but[1]eno, but[2]eno, buta[1,3]dieno, but[1]ino, but[2]ino, buta[1,3]diino, etc.; y similares. Cuando se pretenden niveles específicos de saturación, se usa la nomenclatura alcano, alqueno y/o alquino. En realizaciones preferidas, el grupo alquileno es alquileno (C1-C6) o (C1-C3). También se prefieren grupos alcano saturados de cadena lineal, por ejemplo metano, etano, propano, butano, y similares.
\quad
"Heteroalquilo", "heteroalcanilo", "heteroalquenilo", "heteroalquinilo", "heteroalquildiilo" y "heteroalquileno", por sí mismos o como parte de otro sustituyente, se refieren a grupos alquilo, alcanilo, alquenilo, alquinilo, alquildiilo y alquileno, respectivamente, en los que uno o más de los átomos de carbono están sustituidos cada uno independientemente con los mismos heteroátomos o grupos heteroatómicos, o diferentes. Los heteroátomos y/o grupos heteroatómicos típicos que pueden sustituir a los átomos de carbono incluyen, pero no se limitan a, -O-, -S-, -S-O-, -NR'-, -PH-, -S(O)-, -S(O)_{2}-, -S(O)NR'-, -S(O)_{2}NR'-, y similares, incluyendo sus combinaciones, en los que cada R' es independientemente hidrógeno o alquilo (C1-C6).
\quad
"Cicloalquilo" y "Heterocicloalquilo", por sí mismos o como parte de otro sustituyente, se refieren a versiones cíclicas de grupos "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Para grupos heteroalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición que está unida al resto de la molécula. Los grupos cicloalquilo típicos incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo; ciclobutilos tales como ciclobutanilo y ciclobutenilo; ciclopentilos tales como ciclopentanilo y ciclopentenilo; ciclohexilos tales como ciclohexanilo y ciclohexenilo; y similares. Los grupos heterocicloalquilo típicos incluyen, pero no se limitan a, tetrahidrofuranilo (por ejemplo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, etc.), piperidinilo (por ejemplo, piperidin-1-ilo, piperidin-2-ilo, etc.), morfolinilo (por ejemplo, morfolin-3-ilo, morfolin-4-ilo, etc.), piperazinilo (por ejemplo, piperazin-1-ilo, piperazin-2-ilo, etc.), y similares.
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"Puente heteroatómico acíclico" se refiere a un puente divalente en el que los átomos de la cadena principal son exclusivamente heteroátomos y/o grupos heteroatómicos. Los puentes heteroatómicos acíclicos típicos incluyen, pero no se limitan a, -O-, -S-, -S-O-, -NR'-, -PH-, -S(O)-, -S(O)_{2}-, -S(O)NR'-, -S(O)_{2}NR'-, y similares, incluyendo sus combinaciones, en los que cada R' es independientemente hidrógeno o alquilo (C1- C6).
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"Sistema de anillo aromático progenitor" se refiere a un sistema anular cíclico o policíclico insaturado que tiene un sistema de electrones \pi conjugados. Específicamente se incluyen en la definición de "sistema de anillo aromático progenitor" los sistemas de anillos condensados en los que uno o más de los anillos son aromáticos y uno o más de los anillos están saturados o insaturados, tales como, por ejemplo, fluoreno, indano, indeno, fenaleno, tetrahidronaftaleno, etc. Los sistemas de anillos aromáticos progenitores típicos incluyen, pero no se limitan a aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benceno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeno, hexaleno, indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, penta-2,4-dieno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleyadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, tetrahidronaftaleno, trifenileno, trinaftaleno, y similares, así como los diversos hidroisómeros de los mismos.
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"Arilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo hidrocarbonado aromático monovalente que tiene el número señalado de átomos de carbono (es decir, CS-C15 significa de 5 a 15 átomos de carbono), derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema de anillo aromático progenitor. Los grupos arilo típicos incluyen, pero no se limitan a, grupos derivados de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benceno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeno, hexaleno, as-indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, penta-2,4-dieno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleyadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, trifenileno, trinaftaleno, y similares, así como sus diversos hidroisómeros. En realizaciones preferidas, el grupo arilo es arilo (CS-C15), siendo incluso más preferido (CS-C10). Arilos particularmente preferidos son ciclopentadienilo, fenilo y naftilo.
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"Arilarilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo hidrocarbonado monovalente derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema anular en el que dos o más sistemas de anillos aromáticos progenitores idénticos o no idénticos están unidos directamente entre sí mediante un enlace sencillo, en el que el número de tales uniones anulares directas es uno menos el número de sistemas de anillos aromáticos progenitores implicados. Grupos arilarilo típicos incluyen, pero no se limitan a, bifenilo, trifenilo, fenil-naftilo, binaftilo, bifenil-naftilo, y similares. Cuando se especifica el número de átomos de carbono en un grupo arilarilo, los números se refieren a los átomos de carbono que comprenden cada anillo aromático progenitor. Por ejemplo, arilarilo (CS-C15) es un grupo arilarilo en el que cada anillo aromático comprende de 5 a 15 carbonos, por ejemplo bifenilo, trifenilo, binaftilo, fenilnaftilo, etc. Preferiblemente, cada sistema de anillo aromático progenitor de un grupo arilarilo es independientemente un aromático (CS-C15), más preferiblemente un aromático (CS-C10). También se prefieren grupos arilarilo en los que todos los sistemas de anillos aromáticos progenitores son idénticos, por ejemplo bifenilo, trifenilo, binaftilo, trinaftilo, etc.
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"Biarilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo arilarilo que tiene dos sistemas aromáticos progenitores idénticos unidos directamente entre sí mediante un enlace sencillo. Grupos biarilo típicos incluyen, pero no se limitan a, bifenilo, binaftilo, biantracilo, y similares. Preferiblemente, los sistemas de anillos aromáticos son anillos aromáticos (CS-C15), más preferiblemente anillos aromáticos (C5-C10). Un grupo biarilo particularmente preferido es bifenilo.
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"Arilalquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno enlazado a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp^{3}, se sustituye por un grupo arilo. Grupos arilalquilo típicos incluyen, pero no se limitan a, bencilo, 2-feniletan-1-ilo, 2-fenileten-1-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-1-ilo, 2-naftileten-1-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletan-1-ilo y similares. Cuando se pretenden restos alquílicos específicos, se usa la nomenclatura arilalcanilo, arilalquenilo y/o arilalquinilo. En realizaciones preferidas, el grupo arilalquilo es arilalquilo (C6-C21), por ejemplo el resto alcanilo, alquenilo o alquinilo del grupo arilalquilo es (C1-C6) y el resto arílico es (C5-C15). En realizaciones particularmente preferidas, el grupo arilalquilo es (C6-C13), por ejemplo el resto alcanilo, alquenilo o alquinilo del grupo arilalquilo es (C1-C3) y el resto arílico es (C5-C10).
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"Sistema de anillo aromático progenitor" se refiere a un sistema de anillo aromático progenitor en el que uno o más átomos de carbono se sustituyen cada uno independientemente por el mismo o diferentes heteroátomos o grupos heteroatómicos. Los heteroátomos o grupos heteroatómicos típicos para sustituir a los átomos de carbono incluyen, pero no se limitan a, N, NH, P, O, S, S(O), S(O)_{2}, Si, etc. Se incluyen específicamente en la definición de "sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores" sistemas de anillos condensados en los que uno o más de los anillos son aromáticos, y uno o más de los anillos están saturados o insaturados, tales como, por ejemplo, benzodioxano, benzofurano, cromano, cromeno, indol, indolina, xanteno, etc. También se incluyen en la definición de "sistema de anillo heteroaromático progenitor" aquellos anillos reconocidos que incluyen sustituyentes habituales, tales como, por ejemplo, benzopirona y 1-metil-1,2,3,4-tetrazol. Se excluyen específicamente de la definición de "sistema de anillo heteroaromático progenitor" anillos bencénicos condensados con polialquilenglicoles cíclicos tales como polietilenglicoles cíclicos. Los sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores típicos incluyen, pero no se limitan a, acridina, bencimidazol, bencisoxazol, benzodioxano, benzodioxol, benzofurano, benzopirona, benzotiadiazol, benzotiazol, benzotriazol, benzoxacina, benzoxazol, benzoxazolina, carbazol, \beta-carbolina, cromano, cromeno, cinolina, furano, imidazol, indazol, indol, indolina, indolicina, isobenzofurano, isocromeno, isoindol, isoindolina, isoquinolina, isotiazol, isoxazol, naftiridina, oxadiazol, oxazol, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalacina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, pirimidina, pirrol, pirrolicina, quinazolina, quinolina, quinolicina, quinoxalina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, tiofeno, triazol, xanteno, y similares.
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"Heteroarilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo heteroaromático monovalente que tiene el número señalado de átomos anulares (por ejemplo, "5-14 miembros" significa de 5 a 14 átomos anulares), derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de un sistema de anillo heteroaromático progenitor. Grupos heteroarilo típicos incluyen, pero no se limitan a, grupos derivados de acridina, bencimidazol, bencisoxazol, benzodioxano, benzodiaxol, benzofurano, benzopirona, benzotiadiazol, benzotiazol, benzotriazol, benzoxacina, benzoxazol, benzoxazolina, carbazol, \beta-carbolina, cromano, cromeno, cinolina, furano, imidazol, indazol, indol, indolina, indolicina, isobenzofurano, isocromeno, isoindol, isoindolina, isoquinolina, isotiazol, isoxazol, naftiridina, oxadiazol, oxazol, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalacina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, pirimidina, pirrol, pirrolicina, quinazolina, quinolina, quinolicina, quinoxalina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, tiofeno, triazol, xanteno, y similares, así como sus diversos hidroisómeros. En realizaciones preferidas, el grupo heteroarilo es un heteroarilo de 5-14 miembros, siendo particularmente preferido heteroarilo de 5-10 miembros.
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"Heteroaril-heteroarilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo heteroaromático monovalente derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de un sistema anular en el que dos o más sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores idénticos o no idénticos están unidos directamente entre sí mediante un enlace sencillo, en el que el número de tales uniones anulares directas es uno menos el número de sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores implicados. Los grupos heteroaril-heteroarilo típicos incluyen, pero no se limitan a, bipiridilo, tripiridilo, piridilpurinilo, bipurinilo, etc. Cuando se especifica el número de átomos, los números se refieren al número de átomos que comprenden cada uno de los sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores. Por ejemplo, heteroaril-heteroarilo de 5-15 miembros es un grupo heteroaril-heteroarilo en el que cada sistema de anillo heteroaromático progenitor comprende de 5 a 15 átomos, por ejemplo bipiridilo, tripuridilo, etc. Preferiblemente, cada sistema de anillo heteroaromático progenitor es independientemente un heteroaromático de 5-15 miembros, más preferiblemente un heteroaromático de 5-10 miembros. También se prefieren grupos heteroaril-heteroarilo en los que todos los sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores son idénticos.
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"Biheteroarilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo heteroaril-heteroarilo que tiene dos sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores idénticos unidos directamente entre sí mediante un enlace sencillo. Grupos biheteroarilo típicos incluyen, pero no se limitan a, bipiridilo, bipurinilo, biquinolinilo, y similares. Preferiblemente, los sistemas de anillos heteroaromáticos son anillos heteroaromáticos de 5-15 miembros, más preferiblemente anillos heteroaromáticos de 5-10 miembros.
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"Heteroarilalquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno enlazado a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp^{3}, está sustituido por un grupo heteroarilo. Cuando se pretenden restos alquílicos específicos, se usa la nomenclatura heteroarilalcanilo, heteroarilaquenilo y/o heteroarilalquinilo. En realizaciones preferidas, el grupo heteroarilalquilo es un heteroarilalquilo de 6-21 miembros, por ejemplo el resto alcanilo, alquenilo o alquinilo del heteroarilalquilo es alquilo (C1-C6) y el resto heteroarilo es un heteroarilo de 5-15 miembros. En realizaciones particularmente preferidas, el heteroarilalquilo es un heteroarilalquilo de 6-13 miembros, por ejemplo el resto alcanilo, alquenilo o alquinilo es alquilo (C1-C3) y el resto heteroarilo es un heteroarilo de 5-10 miembros.
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"Halógeno" o "halo", por sí mismos o como parte de otro sustituyente, excepto que se establezca de otro modo, se refiere a fluoro, cloro, bromo y yodo.
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"Haloalquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más de los átomos de hidrógeno se sustituye por halógeno. De este modo, el término "haloalquilo" incluye monohaloalquilos, dihaloalquilos, trihaloalquilos, etc. hasta perhaloalquilos. Por ejemplo, la expresión "haloalquilo (C1-C2)" incluye fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, 1-fluoroetilo, 1,1-difluoroetilo, 1,2-difluoroetilo, 1,1,1-trifluoroetilo, perfluoroetilo, etc.
Los grupos definidos anteriormente pueden incluir prefijos y/o sufijos que se usan habitualmente en la técnica para crear grupos sustituyentes adicionales bien reconocidos. Como ejemplos, "alquiloxi" o "alcoxi" se refiere a un grupo de la fórmula -OR'', "alquilamina" se refiere a un grupo de la fórmula -NHR'', y "dialquilamina" se refiere a un grupo de la fórmula -NR''R'', en las que cada R'' es independientemente un alquilo. Como otro ejemplo, "haloalcoxi" o "haloalquiloxi" se refiere a un grupo de la fórmula -OR''', en la que R''' es un haloalquilo.
"Grupo protector" se refiere a un grupo de átomos que, cuando se une a un grupo funcional reactivo en una molécula, enmascara, reduce o evita la reactividad del grupo funcional. Típicamente, un grupo protector se puede eliminar selectivamente según se desee durante el transcurso de una síntesis. Ejemplos de grupos protectores se pueden encontrar en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, 3ª Ed., 1999, John Wiley & Sons, NY, y Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8, 1971-1996, John Wiley & Sons, NY. Grupos protectores de amino representativos incluyen, pero no se limitan a, formilo, acetilo, trifluoroacetilo, bencilo, benciloxicarbonilo ("CBZ"), terc-butoxicarbonilo ("Boc"), trimetilsililo ("TMS"), 2-trimetilsilil-etanosulfonilo ("TES"), tritilo y grupos tritilo sustituidos, aliloxicarbonilo, 9-fluorenil-metiloxicarbonilo ("FMOC"), nitroveratriloxicarbonilo ("NVOC"), y similares. Grupos protectores de hidroxilo representativos incluyen, pero no se limitan a, aquellos en los que el grupo hidroxilo está acilado o alquilado, tales como bencilo y ésteres de tritilo, así como éteres de alquilo, éteres de tetrahidropiranilo, éteres de trialquilsililo (por ejemplo, grupos TMS o TIPPS) y éteres de
alilo.
"Profármaco" se refiere a un derivado de un compuesto de 2,4-pirimidindiamina activo (fármaco) que requiere una transformación en las condiciones de uso, tal como dentro del cuerpo, para liberar el fármaco de 2,4-pirimidindiamina activo. Los profármacos son frecuentemente, aunque no necesariamente, farmacológicamente inactivos hasta que se convierten en el fármaco activo. Los profármacos se obtienen típicamente enmascarando un grupo funcional en el fármaco de 2,4-pirimidindiamina, que se cree que se requiere en parte para la actividad, con un progrupo (definido más abajo) para formar un prorresto que sufre una transformación, tal como una escisión, en las condiciones específicas de uso para liberar el grupo funcional, y por tanto el fármaco de 2,4-pirimidindiamina activo. La escisión del prorresto puede transcurrir espontáneamente, tal como mediante una reacción de hidrólisis, o puede estar catalizada o inducida por otro agente, tal como mediante una enzima, mediante luz, mediante ácido o base, o mediante un cambio de o exposición a un parámetro físico o medioambiental, tal como un cambio de temperatura. El agente puede ser endógeno a las condiciones de uso, tal como una enzima presente en las células a las que se administra el profármaco, o las condiciones ácidas del estómago, o se puede suministrar de forma exógena.
En la técnica se conoce una amplia variedad de profármacos, así como los prorrestos resultantes, adecuados para enmascarar grupos funcionales en los compuestos de 2,4-pirimidindiamina activos para producir profármacos. Por ejemplo, un grupo funcional hidroxilo se puede enmascarar como un prorresto de sulfonato, éster o carbonato, que se puede hidrolizar in vivo para proporcionar el grupo hidroxilo. Un grupo funcional amino se puede enmascarar como un prorresto de amida, carbamato, imina, urea, fosfenilo, fosforilo o sulfenilo, que se puede hidrolizar in vivo para proporcionar el grupo amino. Un grupo carboxilo se puede enmascarar como un prorresto de éster (incluyendo ésteres y tioésteres de sililo), amida o hidrazida, que se puede hidrolizar in vivo para proporcionar el grupo carboxilo. Otros ejemplos específicos de progrupos adecuados y sus prorrestos respectivos serán manifiestos para los expertos en la técnica.
"Progrupo" se refiere a un tipo de grupo protector que, cuando se usa para enmascarar un grupo funcional en un fármaco de 2,4-pirimidindiamina activo para formar un prorresto, convierte el fármaco en un profármaco. Los progrupos están unidos típicamente al grupo funcional del fármaco vía enlaces que son escindibles en condiciones específicas de uso. De este modo, un profármaco es aquella porción de un prorresto que se escinde para liberar el grupo funcional en las condiciones específicas de uso. Como un ejemplo específico, un prorresto de amida de la fórmula -NH-C(O)CH_{3} comprende el progrupo -C(O)CH_{3}.
"Receptor Fc" se refiere a un miembro de la familia de moléculas de la superficie celular que se une a la porción Fc (que contiene la región constante específica) de una inmunoglobulina. Cada receptor Fc se une a inmunoglobulinas de un tipo específico. Por ejemplo, el receptor Fc\alpha ("Fc\alphaR") se une a IgA, el Fc\varepsilonR se une a IgE, y el Fc\gammaR se une a IgG.
La familia de Fc\alphaR incluye el receptor polimérico de Ig implicado en el transporte epitelial de IgA/IgM, el receptor Rc\alphaRI específico de la estirpe mieloide (también denominado CD89), el Fc\alpha/\muR y al menos dos receptores de IgA alternativos (para un repaso reciente, véase Monteiro y van de Winkel, 2003, Annu. Rev. Immunol., publicación electrónica avanzada). El Fc\alphaRI es expresado en neutrófilos, eosinófilos, monocitos/macrófagos, células dendríticas y células de Kupfer. El Fc\alphaRI incluye una cadena alfa y el homodímero gamma de FcR que tiene un motivo de activación (ITAM) en el dominio citoplásmico y fosforila Syk cinasa.
La familia de Fc\varepsilonR incluye dos tipos, denominados Fc\varepsilonRI y Fc\varepsilonRII (también conocido como CD23). Fc\varepsilonRI es un receptor de alta afinidad (se une a IgE con una afinidad de alrededor de 10^{10} M^{-1}) encontrado en mastocitos, basófilos y eosinófilos que ancla IgE monomérico a la superficie celular. El Fc\varepsilonRI posee una cadena alfa, una cadena beta y el homodímero de la cadena gamma explicado anteriormente. El Fc\varepsilonRII es un receptor de baja afinidad, expresado en fagocitos mononucleares, linfocitos B, eosinófilos y plaquetas. El Fc\varepsilonRII comprende una cadena polipeptídica sencilla, y no incluye el homodímero de la cadena gamma.
La familia de Fc\gammaR incluye tres tipos, denominados Fc\gamma\muRI (también conocido como CD64), Fc\gammaRII (también conocido como CD32) y Fc\gammaRIII (también conocido como CD16). Fc\gammaRI es un receptor de alta afinidad (se une a IgG1 con una afinidad de 10^{8} M^{-1}) encontrado en mastocitos, basófilos, células mononucleares, neutrófilos, eosinófilos, células dendríticas y fagocitos, que ancla IgG monomérica a la superficie celular. El Fc\gammaRI incluye una cadena alfa y el dímero de la cadena gamma compartido por Fc\alphaRI y Fc\varepsilonRI.
El Fc\gammaRII es un receptor de baja afinidad expresado en neutrófilos, monocitos, eosinófilos, plaquetas y linfocitos B. El Fc\gammaRII incluye una cadena alfa, y no incluye el homodímero de la cadena gamma explicado anteriormente.
El Fc\gammaRIII es un receptor de baja afinidad (se une a IgG1 con una afinidad de 5 x 10^{5} M^{-1}) expresado en NK, eosinófilos, macrófagos, neutrófilos y mastocitos. Comprende una cadena alfa y el homodímero gamma compartido por Fc\alphaRI, Fc\varepsilonRI y Fc\gammaRI.
Los expertos reconocerán que la estructura de la subunidad y las propiedades de unión de estos diversos receptores Fc, así como los tipos celulares que los expresan, no están completamente caracterizados. La explicación anterior refleja simplemente el estado actual de la técnica con relación a estos receptores (véase, por ejemplo, Immunobiology: The Immune System in Health & Disease, 5ª Edición, Janeway et al., Eds, 2001, ISBN 0-8153-3642-x, Figura 9.30 en la página 371), y no pretende ser limitante con respecto a la miríada de cascadas de señalización de receptores que se puede regular con los compuestos descritos aquí.
"Desgranulación mediada por el receptor Fc" o "desgranulación inducida por el receptor Fc" se refiere a la desgranulación que transcurre vía una cascada de transducción de señales del receptor Fc iniciada por la reticulación de un receptor Fc.
"Desgranulación inducida por IgE" o "desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI" se refiere a la desgranulación que transcurre vía la cascada de transducción de señales del receptor IgE iniciada por la reticulación de IgE unido a Fc\varepsilonR1. La reticulación se puede inducir mediante un alérgeno específico de IgE, o mediante otro agente de unión multivalente, tal como un anticuerpo anti-IgE. Haciendo referencia a la Fig. 2, en mastocitos y/o basófilos, la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI que conduce a la desgranulación se puede dividir en dos etapas: aguas arriba y aguas abajo. La etapa aguas arriba incluye todos los procesos que ocurren antes de la movilización del ion calcio (ilustrado como "Ca^{2+}" en la Fig. 2; véase también la Fig. 3). La etapa aguas abajo incluye la movilización del ion calcio y todos sus procesos aguas abajo. Los compuestos que inhiben la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI pueden actuar en cualquier punto a lo largo de la cascada de transducción de señales mediada por Fc\varepsilonRI. Los compuestos que inhiben selectivamente aguas arriba la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI actúan para inhibir esa porción de la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI aguas arriba del punto en el que se induce la movilización del ion calcio. En ensayos basados en células, los compuestos que inhiben selectivamente la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI aguas arriba inhiben la desgranulación de células tales como mastocitos o basófilos que son activados o estimulados con un alérgeno específico de IgE o con un agente de unión (tal como un anticuerpo anti-IgE), pero no inhiben apreciablemente la desgranulación de células que son activadas o estimuladas con agentes desgranulantes que evitan la ruta de señalización de Fc\varepsilonRI, tales como, por ejemplo, los ionóforos de calcio ionomicina y A23187.
"Desgranulación inducida por IgG" o "desgranulación mediada por Fc\gammaRI" se refiere a la desgranulación que transcurre vía la cascada de transducción de señales de Fc\gammaRI iniciada mediante la reticulación de IgG unida a Fc\gammaRI. La reticulación se puede inducir mediante un alérgeno específico de IgG o mediante otro agente de unión multivalente, tal como un anticuerpo anti-IgG o un fragmento de anticuerpo. Al igual que la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI, en mastocitos y basófilos la cascada de señalización de Fc\gammaRI también conduce a la desgranulación, que se puede dividir en las mismas dos etapas: aguas arriba y aguas abajo. Similar a la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI, los compuestos que inhiben selectivamente aguas arriba la desgranulación mediada por Fc\gammaRI actúan aguas arriba del punto en el que se induce la movilización del ion calcio. En ensayos basados en células, los compuestos que inhiben selectivamente aguas arriba la desgranulación mediada por Fc\gammaRI inhiben la desgranulación de células tales como mastocitos o basófilos que son activados o estimulados por un alérgeno específico de IgG o con un agente de unión (tal como un anticuerpo anti-IgG o fragmento), pero no inhiben apreciablemente la desgranulación de células que son activadas o estimuladas con agentes desgranulantes que evitan la ruta de señalización de Fc\gammaRI, tales como, por ejemplo, los ionóforos de calcio ionomicina y A23187.
"Desgranulación inducida por ionóforos" o "desgranulación mediada por ionóforos" se refiere a la desgranulación de una célula, tal como un mastocito o basófilo, que se produce con la exposición a un ionóforo de calcio tal como, por ejemplo, ionomicina o A23187.
"Syk cinasa" se refiere a la tirosina cinasa proteínica del bazo no receptora (citoplásmica) de 72 kDa bien conocida, expresada en células B y en otras células hematopoyéticas. Syk cinasa incluye dos dominios de homología tipo 2 con Src (SH2) de consenso en tándem, que se unen a motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina ("ITAM") fosforilados, un dominio "enlazador" y un dominio catalítico (para un repaso de la estructura y función de Syk cinasa, véase Sada et al., 2001, J. Biochem. (Tokyo) 130:177-186); véase también Turner et al., 2000, Immunology Today 21:148-154). La Syk cinasa se ha estudiado ampliamente como un efector de la señalización del receptor de células B (BCR) (Turner et al., 2000, más arriba). La Syk cinasa también es crítica para la fosforilación de tirosina de múltiples proteínas que regulan importantes rutas que parten de inmunorreceptores, tales como las cascadas de movilización de Ca^{2+} y de proteína cinasas activadas por mitógenos (MAPK) (véase, por ejemplo, la Fig. 2) y la desgranulación. La Syk cinasa también desempeña un papel crítico en la señalización de integrina en neutrófilos (véase, por ejemplo, Mocsai et al. 2002, Immunity 16:547-558).
Como se usa aquí, Syk cinasa incluye cinasas de cualquier especie animal, incluyendo, pero sin limitarse a, homo sapiens, simio, bovina, porcina, roedor, etc., reconocida por pertenecer a la familia de Syk. Se incluyen específicamente isoformas, variantes de corte y empalme, variantes alélicas, mutantes, tanto de origen natural como hechas por el hombre. Las secuencias de aminoácidos de tales Syk cinasas son bien conocidas, y están disponibles en GENBANK. Los ejemplos específicos de ARNm que codifican diferentes isoformas de Syk cinasa humana se pueden encontrar en el número de acceso de GENBANK gi|21361552|ref|NM_003177.2|, gi|496899|emb|Z29630.1|HSSYKPTK[496899] y gi|15030258|gb|BC011399.1|BC011399[15030258], que se incorporan aquí como referencia.
Los expertos apreciarán que las tirosina cinasas que pertenecen a otras familias pueden tener sitios activos o bolsillos de unión que son similares en estructura tridimensional a la de Syk. Como consecuencia de esta similitud estructural, se espera que tales cinasas, denominadas aquí como "imitadores de Syk", catalicen la fosforilación de sustratos fosforilados por Syk. De este modo, se apreciará que tales imitadores de Syk, en cuyas cascadas de transducción de señales tales imitadores de Syk desempeñan un papel, y las respuestas biológicas provocadas por tales imitadores de Syk y las cascadas de señalización dependientes de los imitadores de Syk se pueden regular, y en particular inhibir, con los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aquí.
"Cascada de señalización dependiente de Syk" se refiere a una cascada de transducción de señales en la que Syk cinasa desempeña un papel. Los ejemplos no limitantes de tales cascadas de señalización dependientes de Syk incluyen las cascadas de señalización de Fc\alphaRI, Fc\varepsilonRI, Fc\gammaRI, Fc\gammaRIII, BCR e integrina.
"Enfermedad autoinmunitaria" se refiere a aquellas enfermedades que están asociadas habitualmente a reacciones de hipersensibilidad no anafiláctica (reacciones de hipersensibilidad de tipo II, tipo III y/o tipo IV) que generalmente resultan como consecuencia de la respuesta inmunitaria humoral y/o celular propia del sujeto a una o más sustancias inmunógenas de origen endógeno y/o exógeno. Tales enfermedades autoinmunitarias se distinguen de las enfermedades asociadas con las reacciones de hipersensibilidad anafiláctica (de tipo I o mediadas por
IgE).
6.2 Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina
Los compuestos usados en la invención son generalmente compuestos de 2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural (I):
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11 
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incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-óxidos del mismo, en la que:
\quad
L^{1} y L^{2} son cada uno un enlace directo;
\quad
R^{2} se selecciona del grupo que consiste en fenilo mono sustituido en la posición 3 ó 5 con un grupo R^{8}, fenilo di- o tri-sustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8} o diferentes, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo;
\quad
R^{4} se selecciona del grupo que consiste en fenilo sustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8} o diferentes, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo;
en la que, para R^{2} y R^{4}, cada uno de dicho heteroarilo opcionalmente sustituido, independientemente entre sí, se selecciona del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
12
13
14
en las que:
\quad
p es un número entero de uno a tres;
\quad
cada - - - representa independientemente un enlace sencillo o un doble enlace;
\quad
R^{35} es hidrógeno o R^{8};
\quad
X se selecciona del grupo que consiste en CH, N y N-O;
\quad
cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S y NH;
\quad
cada Y^{1} se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, SO, SO_{2}, SONR^{36}, NH y NR^{37};
\quad
cada Y^{2} se selecciona independientemente del grupo que consiste en CH, CH_{2}, O, S, N, NH y NR^{37};
\quad
R^{36} es hidrógeno o alquilo;
\quad
R^{37} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y un progrupo seleccionado del grupo que consiste en arilo, arilalquilo, heteroarilo, R^{a}, R^{b}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)R^{8}, -CR^{a}R^{b}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-PO(OR^{8})_{2}, -C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -C(O)R^{8}, -C(O)CF_{3} y -C(O)-NR^{8}-C(O)R^{8};
\quad
R^{38} se selecciona del grupo que consiste en alquilo y arilo;
\quad
A se selecciona del grupo que consiste en O, NH y NR^{38};
\quad
R^{9}, R^{10}, R^{11} y R^{12} se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, halógeno, haloalcoxi, aminoalquilo e hidroxialquilo, o, como alternativa, R^{9} y R^{10} y/o R^{11} y R^{12} se toman juntos para formar un cetal;
\quad
cada Z se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi, ariloxi, éster, y carbamato;
\quad
Q se selecciona del grupo que consiste en -OH, -OR^{8}, -NR^{c}R^{c}, -NR^{39}-CHR^{40}-R^{b}, -NR^{39}-(CH_{2})_{m}-R^{b} y -NR^{39}-C(O)-CHR^{40}-NR^{c}R^{c};
\quad
R^{39} y R^{40} se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo y NHR^{8};
\quad
R^{5} se selecciona del grupo que consiste en -CN, -NC, fluoro, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), haloalcoxi (C1-C3), perhaloalcoxi (C1-C3), -C(O)R^{a}, -C(O)OR^{a}, -C(O)CF_{3} y -C(O)OCF_{3};
\quad
R^{6} es hidrógeno;
\quad
R^{8} se selecciona del grupo que consiste en R^{e}, R^{b}, R^{e} sustituido con uno o más del mismo o diferente R^{a} o R^{b}, -OR^{a} sustituido con uno o más del mismo o diferente R^{a} o R^{b}, -B(OR^{a})_{2}, -B(NR^{c}R^{c})_{2}, -(CH_{2})_{m}-R^{b}, -(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -S-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -O-CHR^{a}R^{b}, -O-CR^{a}(R^{b})_{2}, -O-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-CH[(CH_{2})_{m}-R^{b}]R^{b}, -S-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -S-(CH_{2})_{m}-C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -O-(CHR^{a})_{m}-C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -S-(CHR^{a})_{m}-C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -N[(CH_{2})_{m}R^{b}]2, -NH-C(O)-NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -NH-C(O)-(CH_{2})_{m}-CHR^{b}R^{b} y -NH-(CH_{2})_{m}-C(O)-NH-(CH_{2})_{m}-R^{b};
\quad
cada R^{a} se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
\quad
cada R^{b} es un grupo adecuado seleccionado independientemente del grupo que consiste en =O, -OR^{d}, haloalquiloxi (C1-C3), =S, -SR^{d}, =NR^{d}, =NOR^{d}, -NR^{c}R^{c}, halógeno, -CF_{3}, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO_{2}, =N_{2}, -N_{3}, -S(O)R^{d}, -S(O)_{2}R^{d}, -S(O)_{2}OR^{d}, -S(O)NR^{c}R^{c}, -S(O)_{2}NR^{c}R^{c}, -OS(O)R^{d}, -OS(O)_{2}R^{d}, -OS(O)_{2}OR^{d}, -OS(O)_{2}NR^{c}R^{c}, -C(O)R^{d}, -C(O)OR^{d}, -C(O)NR^{c}R^{c}, -C(NH)NR^{c}R^{c}, -C(NR^{a})NR^{c}R^{c}, -C(NOH)R^{a}, -C(NOH)NR^{c}R^{c}, -OC(O)R^{d}, -OC(O)OR^{d}, -OC(O)NR^{c}R^{c}, -OC(NH)NR^{c}R^{c}, -OC(NR^{a})NR^{c}R^{c}, -[NHC(O)]_{n}R^{d}, -[NR^{a}C(O)]_{n}R^{d}, -[NHC(O)]_{n} OR^{d}, -[NR^{a}C(O)]_{n}OR^{d}, -[NHC(O)]_{n}NR^{c}R^{c}, -[NR^{a}C(O)]_{n}NR^{c}R^{c}, -[NHC(NH)]_{n}NR^{c}R^{c} y -[NR^{a}C(NR^{a})]_{n}NR^{c}R^{c};
\quad
cada R^{c} es independientemente R^{a}, o, como alternativa, dos R^{c} se toman juntos con el átomo de nitrógeno al que están enlazados para formar un cicloheteroalquilo o heteroarilo de 5 a 8 miembros que puede incluir opcionalmente uno o más de los mismos o diferentes heteroátomos adicionales y que puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes R^{a} o grupos R^{b} adecuados;
\quad
cada R^{d} es independientemente un R^{a};
\quad
cada R^{e} se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
\quad
cada m es independientemente un número entero de 1 a 3; y
\quad
cada n es independientemente un número entero de 0 a 3; o
\quad
el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 7.4.214 a 7.4.244, 7.4.250 a 7.4.252, 7.4.256 a 7.4.258, 7.4.262 a 7.4.269, 7.4.272 a 7.4.276, 7.4.278 a 7.4.280, 7.4.283 a 7.4.289, 7.4.296, 7.4.298 a 7.4.302, 7.4.304, 7.4.305, 7.4.308 a 7.4.313, 7.4.315, 7.4.317, y 7.4.318;
\quad
con las condiciones de que en la fórmula (I):
(1)
cuando R^{2} es un fenilo sustituido, entonces R^{5} es distinto de ciano o -C(O)NHR, en el que R es hidrógeno o alquilo (C1-C6);
(2)
cuando R^{2} y R^{4} son cada uno independientemente un indol sustituido o no sustituido, entonces el R^{2} y R^{4} están unidos al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular; y
(3)
el compuesto no sea
15
L^{1} y L^{2} son cada uno un enlace directo de forma que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina usados en la invención son compuestos según la fórmula estructural (Ia):
16
incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-óxidos de los mismos, en la que R^{2}, R^{4}, R^{5} y R^{6} son como se define anteriormente para la fórmula estructural (I). Más abajo se describen realizaciones específicas adicionales de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención.
En una primera realización de los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia), R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{1} y L^{2} son como se define anteriormente para sus estructuras (I) y (Ia) respectivas, con la condición de que R^{2} no sea 3,4,5-trimetoxifenilo, 3,4,5-trialcoxifenilo (C1-C6) ni
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17 
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en la que R^{21}, R^{22} y R^{23} son como se define para R^{1}, R^{2} y R^{3}, respectivamente en la patente U.S. nº 6,235,746. En una realización específica de esta primera realización, R^{21} es hidrógeno, halo, alquilo (C1-C6) de cadena lineal o ramificado, opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{25}, hidroxilo, alcoxi (C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos fenilo o R^{25}, tiol (-SH), alquiltio (C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos fenilo o R^{25}, amino (-NH_{2}), -NHR^{26} o-NR^{26}R^{26}; R^{22} y R^{23} son cada uno, independientemente entre sí, un alquilo (C1-C6) de cadena lineal o ramificado, opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{25}; R^{25} se selecciona del grupo que consiste en halo, hidroxilo, alcoxi (C1-C6), tiol, alquiltio (C1-C6), alquilamino (C1-C6) y dialquilamino (C1-C6); y cada R^{26} es independientemente un alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos fenilo o R^{25}, o un -C(O)R^{27}, en el que R^{27} es un alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos fenilo o R^{25}.
En otra realización específica de esta primera realización, R^{21} es metoxi opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos halo, y/o R^{22} y R^{23} son cada uno, independientemente entre sí, un metilo o etilo opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos halo.
En una segunda realización de los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia), R^{2}, R^{4}, R^{5} y L^{2} son como se describe previamente para sus estructuras (I) y (Ia) respectivas, L^{1} es un enlace directo y R^{6} es hidrógeno, con la condición de que R^{2} no sea 3,4,5-trimetoxifenilo, 3,4,5-tri-alcoxifenilo (C1-C6) ni
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18 
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en la que R^{21}, R^{22} y R^{23} son como se define anteriormente en relación con la primera realización.
\vskip1.000000\baselineskip
En una tercera realización, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen uno o más de los siguientes compuestos:
\quad
N2,N4-bis(3-metilfenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R092788);
\quad
N2,N4-bis(3-clorofenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R067962);
\quad
N2,N4-bis(2,5-dimetilfenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R067963);
\quad
N2,N4-bis(3,4-dimetilfenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R067964);
\quad
N2,N4-bis(2,4-dimetilfenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R070791);
\quad
N2,N4-bis(3-bromofenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R008958);
\newpage
\quad
N2,N4-bis(morfolino)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina; y
\quad
N2,N4-bis[(3-cloro-4-metoxifenil))-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina.
En una cuarta realización, los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen compuestos según la siguiente fórmula estructural (Ib):
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19 
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en la que R^{24} es alquilo (C1-C6); y R^{21}, R^{22} y R^{23} son como se define anteriormente en relación con la primera realización.
En una quinta realización, los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen los compuestos descritos en los Ejemplos 1-141 de la patente U.S. nº 6.235.746.
En una sexta realización, los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen compuestos definidos por la fórmula (1) o fórmula 1(a) de esta patente U.S. nº 6.235.746 (véase, por ejemplo, la descripción en la Col. 1, línea 48 a Col. 7, línea 49 y Col. 8, líneas 9-36).
En una séptima realización, los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen compuestos en los que R^{5} es ciano cuando R^{2} es un fenilo sustituido; R4 es un heteroarilo de 5-15 miembros, sustituido o no sustituido; y R^{6} es hidrógeno.
En una octava realización, los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen los compuestos definidos por las fórmulas (I) y (X) del documento WO 02/04429 o cualquier compuesto descrito en el documento WO 02/04429.
En una novena realización de los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia), cuando R^{5} es ciano y R^{6} es hidrógeno, entonces R^{2} es distinto de un grupo fenilo sustituido.
En una décima realización, los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen compuestos en los que R^{2} y R^{4} son cada uno independientemente un anillo pirrólico o indólico sustituido o no sustituido que está unido al resto de la molécula vía su átomo de nitrógeno anular.
En una undécima realización, los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen compuestos definidos por las fórmulas (I) y (IV) de la patente U.S. nº 4.983.608 o o cualquier compuesto descrito en la patente U.S. nº 4.983.608.
Los expertos en la técnica apreciarán que, en los compuestos de fórmulas (I) y (Ia), R^{2} y R^{4} pueden ser iguales o diferentes, y pueden variar ampliamente. Cuando R^{2} y/o R^{4} son anillos opcionalmente sustituidos, tal como arilos o heteroarilos opcionalmente sustituidos, el anillo puede estar unido al resto de la molécula a través de cualquier carbono o heteroátomo disponible. Los sustituyentes opcionales se puede unir a cualesquiera átomos de carbono y/o heteroátomos disponibles.
En una duodécima realización de los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia), R^{2} y/o R^{4} es fenilo sustituido sujeto a las condiciones de que (1) cuando R^{6} es hidrógeno, entonces R^{2} no es 3,4,5-trimetoxifenilo o 3,4,5-trialcoxi (C1-C6)-fenilo; (2) cuando R^{2} es un fenilo 3,4,5-trisustituido, entonces los sustituyentes en las posiciones 3 y 4 no son simultáneamente metoxi o alcoxi (C1-C6); o (3) cuando R^{6} es hidrógeno y R^{4} es heteroarilo de 5-15 miembros, entonces R^{5} es distinto de ciano. Como alternativa, R^{2} está sujeto a las condiciones descritas en relación con las realizaciones primera o segunda. El grupo fenilo sustituido puede estar unido al resto de la molécula a través de cualquier átomo de carbono disponible. Ejemplos específicos de fenilos opcionalmente sustituidos incluyen fenilos que están opcionalmente mono-, di- o trisustituidos con los mismos o diferentes grupos R^{8}, en los que R^{8} es como se define previamente para la fórmula estructural (I), y sometidos a las condiciones anteriores. Cuando el fenilo está monosustituido, el sustituyente R^{8} puede estar situado en la posición orto, meta o para. Cuando está situado en la posición orto, meta o para, R^{8} se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C10), alquilo ramificado (C1-C10), -OR^{a} opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{b}, -O-C(O)OR^{a}, -O-(CH_{2})_{m}-C(O)OR^{a}, -C(O)OR^{a}, -O-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c}, -O-C(O)NR^{c}R^{c}, -O-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c}, -O-C(NH)NR^{c}R^{c}, -O-(CH_{2})_{m}-C(NH)NR^{c}R^{c} y -NH-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c}, en los que m, R^{a} y R^{c} son como se define previamente para la fórmula estructural (I). En una realización de estos compuestos, -NR^{c}R^{c} es un heteroarilo de 5-6 miembros que incluye opcionalmente uno o más de los mismos o diferentes heteroátomos adicionales. Ejemplos específicos de tales heteroarilos de 5-6 miembros incluyen, pero no se limitan a, oxadiazolilo, triazolilo, tiazolilo, oxazolilo, tetrazolilo e
isoxazolilo.
En otra realización de estos compuestos, -NR^{c}R^{c} es un anillo cicloheteroalquílico de 5-6 miembros saturado que incluye opcionalmente uno o más de los mismos o diferentes heteroátomos. Ejemplos específicos de tales cicloheteroalquilos incluyen, pero no se limitan a, pirrolidinilo, pirazolidinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo y morfolinilo.
En todavía otra realización de estos compuestos, cada R^{a} es independientemente un alquilo (C1-C6), y/o cada -NR^{c}R^{c} es NHR^{a}, en el que R^{a} es un alquilo (C1-C6). En una realización específica, R^{8} es -O-CH_{2}-C(O)NHCH_{3}. En otra realización específica, R^{8} es -OH.
Cuando el fenilo está disustituido o trisustituido, los sustituyentes R^{8} se pueden situar en cualquier combinación de posiciones. Por ejemplo, los sustituyentes R^{8} se pueden situar en las posiciones 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 3,4, 3,5, 2,3,4, 2,3,5, 2,3,6, 2,4,5, 2,4,6, 2,5,6 o 3,4,5. En una realización de compuestos que incluyen un fenilo disustituido, los sustituyentes están situados en una posición distinta de 3,4. En otra realización, están situados en 3,4. En una realización de compuestos que incluyen un fenilo trisustituido, los sustituyentes están situados en una posición distinta de 3,4,5, o, como alternativa, ninguno de dos de los sustituyentes está situado en 3,4. En otra realización, los sustituyentes están situados en 3,4,5.
Ejemplos específicos de sustituyentes R^{8} en tales fenilos di- y trisustituidos incluyen los diversos sustituyentes R^{8} descritos anteriormente en relación con los fenilos sustituidos en orto, meta y para.
En otra realización específica, los sustituyentes R^{8} útiles para sustituir tales fenilos di- y trisustituidos incluyen alquilo (C1-C6), alcoxi (C1-C6), metoxi, halo, cloro, perhaloalquilo (C1-C6), -CF_{3}, perhaloalcoxi (C1-C6) y -OCF_{3}. En una realización preferida, tales sustituyentes R^{8} están situados en 3,4 o 3,5. Ejemplos específicos de anillos fenílicos disustituidos preferidos incluyen 3-cloro-4-metoxi-fenilo, 3-metoxi-4-clorofenilo, 3-cloro-4-trifluorometoxi-fenilo, 3-trifluorometoxi-4-cloro-fenilo, 3,4-dicloro-fenilo, 3,4-dimetoxifenilo y 3,5-dimetoxifenilo, con la condición de que: cuando R^{4} es 3-cloro-4-metoxifenilo y R^{5} es halo o fluoro, y R^{6} es hidrógeno, entonces R^{2} no sea 3-cloro-4-alcoxifenilo (C1-C6) o 3-cloro-4-metoxifenilo; y/o (2) R^{2} y/o R^{4} no sea 3,4,5-trialcoxifenilo (C1-C6) o 3,4,5-trimetoxife-
nilo.
En otra realización de compuestos que incluyen un fenilo trisustituido, el fenilo trisustituido tiene la fórmula:
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20 
\vskip1.000000\baselineskip
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en la que: R^{31} es metilo o alquilo (C1-C6); R^{32} es hidrógeno, metilo o alquilo (C1-C6); y R^{33} es un grupo halo.
En una decimotercera realización de los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia), R^{2} y/o R^{4} es un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define en la reivindicación 1. Grupos heteroarilo típicos según esta decimotercera realización comprenden de 5 a 15, y más típicamente de 5 a 11 átomos anulares, e incluyen uno, dos, tres o cuatro de los mismos o diferentes heteroátomos o grupos heteroatómicos seleccionados del grupo que consiste en N, NH, O, S, S(O) y S(O)_{2}. El heteroarilo opcionalmente sustituido se puede unir a su átomo de nitrógeno en C2 o C4 respectivo o al ligador L^{1} o L^{2} a través de cualquier átomo de carbono o heteroátomo disponible, pero típicamente se une vía un átomo de carbono. Los sustituyentes opcionales pueden ser iguales o diferentes, y se pueden unir a cualquier átomo de carbono o heteroátomo disponible. En una realización de estos compuestos, R^{5} es distinto de bromo, trifluorometilo o ciano. En otra realización de estos compuestos, cuando R^{2} y R^{4} son cada uno un indol sustituido o no sustituido, entonces el anillo está unido al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular. Todavía en otra realización de compuestos que incluyen un grupo heteroarilo opcionalmente sustituido, el heteroarilo está no sustituido o está sustituido con uno a cuatro de los mismos o diferentes grupos R^{8}, en los que R^{8} es como se define previamente para la fórmula estructural (I). Los siguientes son grupos heteroarilo a partir de los cuales se pueden seleccionar R^{2}
y R^{4}:
\vskip1.000000\baselineskip
21
22
23
en las que:
\quad
p es un número entero de uno a tres;
\quad
cada \underbar{- - -} representa independientemente un enlace sencillo o un doble enlace;
\quad
R^{35} es hidrógeno o R^{8}, en el que R^{8} es como se define anteriormente para la fórmula estructural (I);
\quad
X se selecciona del grupo que consiste en CH, N y N-O;
\quad
cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S y NH;
\quad
cada Y^{1} se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, SO, SO_{2}, SONR^{36}, NH y NR^{37};
\quad
cada Y^{2} se selecciona independientemente del grupo que consiste en CH, CH_{2}, O, S, N, NH y NR^{37};
\quad
R^{36} es hidrógeno o alquilo;
\quad
R^{37} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y un progrupo, preferiblemente hidrógeno o un progrupo seleccionado del grupo que consiste en arilo, arilalquilo, heteroarilo, R^{a}, R^{b}-CR^{a}R^{b}-O-C(O)R^{8}, -CR^{a}R^{b}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{1}-PO(OR^{8})_{2}, -C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -C(O)R^{8}, -C(O)CF_{3} y -C(O)-NR^{8}-C(O)R^{8};
\quad
A se selecciona del grupo que consiste en O, NH y NR^{38};
\quad
R^{38} se selecciona del grupo que consiste en alquilo y arilo;
\quad
R^{9}, R^{10}, R^{11} y R^{12} se selecciona cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, halógeno, haloalcoxi, aminoalquilo e hidroxialquilo, o, como alternativa, R^{9} y R^{10} y/o R^{11} y R^{12} se toman juntos para formar un cetal;
\quad
cada Z se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi, ariloxi, éster y carbamato;
\quad
Q se selecciona del grupo que consiste en -OH, OR^{8}, -NR^{c}R^{c}, -NHR^{39}-C(O)R^{8}, -NHR^{39}-C(O)OR^{8}, -NR^{39}-CHR^{40}-R^{b}, -NR^{39}-(CH_{2})_{m}-R^{b} y -NR^{39}-C(O)-CHR^{40}-NR^{c}R^{c};
\quad
R^{39} y R^{40} se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo y NHR^{8}; y
\quad
R^{a}, R^{b} y R^{c} son como se define previamente para la fórmula estructural (I). Sustituyentes R^{b} preferidos para Q se seleccionan de -C(O)OR^{8}, -O-C(O)R^{8}, -O-P(O)(OR^{8})_{2} y -P(O)(OR^{8})_{2}.
\newpage
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En una realización de los heteroarilos representados anteriormente, así como otros heteroarilos de 5-15 miembros según esta realización de la invención, cada R^{8} se selecciona independientemente del grupo que consiste en R^{d}, -NR^{c}R^{c}, -(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c}, -C(O)NR^{c}R^{c}, -(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c}, -C(O)OR^{d}, -(CH_{2})_{m}-C(O)OR^{d} y -(CH_{2})_{m}-OR^{d}, en los que m, R^{c} y R^{d} son como se define previamente para la fórmula estructural (I).
En una realización específica, R^{d} y/o R^{c} se seleccionan del grupo que consiste en R^{a} y cicloalquilo (C3-C8) opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos hidroxilo, amino o carboxilo.
En otra realización de los heteroarilos representados anteriormente, cada R^{35} es un átomo de hidrógeno, una cadena carbonada de (C1-C6), incluyendo metilo, etilo, isopropilo, un grupo cicloalquilo, incluyendo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, un
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en el que x = 1-8, -CH_{2}CONHMe, -CH_{2}CH_{2}NHMe, -CH_{2}CH_{2}CONHMe, -CH_{2}CH_{2}CH_{2}NHMe o -CH_{2}CH_{2}
CH_{2}OCH_{3}.
Todavía en otra realización de los heteroarilos representados anteriormente, la conectividad del anillo aromático está en la posición 5 ó 6. Se debería entender que R^{2} o R^{4} pueden utilizar los grupos heteroarilo explicados en esta memoria descriptiva.
En una decimocuarta realización de los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia), R^{2} y R^{4} son cada uno, independientemente entre sí, un fenilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido, con la condición de que: (1) cuando L^{1} es un enlace directo y R^{6} y opcionalmente R^{5} es hidrógeno, entonces R^{2} es distinto de 3,4,5-trimetoxifenilo o 3,4,5-trialcoxifenilo (C1-C6); (2) cuando L^{1} y L^{2} son cada uno un enlace directo, R^{6} es hidrógeno y R^{5} es halo, entonces R^{2} y R^{4} no son cada uno simultáneamente 3,4,5-trimetoxifenilo o 3,4,5-trialcoxifenilo (C1-C6); (3) cuando R^{4} es 3-metoxifenilo o 3-alcoxi (C1-C6)-fenilo, y R^{2} es un fenilo 3,4,5-trisustituido, los sustituyentes situados en las posiciones 3 y 4 no son ambos simultáneamente metoxi ni alcoxi (C1-C6); (4) cuando R^{2} es un fenilo sustituido y R^{6} es hidrógeno, entonces R^{5} es distinto de ciano o -C(O)NHR, en el que R es hidrógeno o alquilo (C1-C6); y/o (5) cuando R^{2} y R^{4} son cada uno independientemente un indol sustituido o no sustituido, entonces el indol se une al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular. Como alternativa, R^{2} está sometido a las condiciones descritas en relación con la realización primera o segunda.
En esta decimocuarta realización de la invención, los sustituyentes R^{2} y R^{4} pueden ser iguales o diferentes. Los fenilo, arilo y/o heteroarilos opcionalmente sustituido específicos incluyen los ilustrados anteriormente en relación con la decimosegunda y decimotercera realización.
En una decimoquinta realización de los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia), que incluyen sus realizaciones primera a decimocuarta descritas anteriormente, R^{6} es hidrógeno y R^{5} es un grupo electronegativo. Como reconocerán los expertos, los grupos electronegativos son átomos o grupos de átomos que tienen una tendencia relativamente grande a atraer electrones hacia ellos. Ejemplos específicos de grupos electronegativos según esta decimocuarta realización incluyen, pero no se limitan a, -CN, -NC, -NO_{2}, halo, bromo, cloro, fluoro, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), fluoroalquilo (C1-C3), perfluoroalquilo (C1-C3), -CF_{3}, haloalcoxi (C1-C3), perhaloalcoxi (C1-C3), fluoroalcoxi (C1-C3), perfluoroalcoxi (C1-C3), -OCF_{3}, -C(O)R^{a}, -C(O)OR^{a}, -C(O)CF_{3} y -C(O)OCF_{3}. En una realización específica, el grupo electronegativo es un grupo electronegativo que contiene halógeno, tal como -OCF_{3}, -CF_{3}, bromo, cloro o fluoro. En otra realización específica, R^{5} es fluoro, sujeto a la condición de que el compuesto no sea ningún compuesto según la tercera realización.
En una decimosexta realización, los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia) son compuestos según la fórmula estructural (Ib):
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y sales, hidratos, solvatos y N-óxidos de los mismos, en la que R^{11} y R^{14} se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi (C1-C6) y -NR^{c}R^{c}; R^{12} y R^{13} son cada uno hidrógeno, y R^{5}, R^{6} y R^{c} son como se define anteriormente para la fórmula estructural (I).
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En una decimoséptima realización, los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia) son compuestos según la fórmula estructural (Ic):
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y sales, hidratos, solvatos y N-óxidos de los mismos, en la que:
\quad
R^{4} se selecciona del grupo que consiste en heteroarilo de 5 a 10 miembros y 3-hidroxifenilo;
\quad
R^{5} es F o -CF_{3}; y
\quad
R^{8} es -O(CH_{2})_{m}-R^{b}, en el que m y R^{b} son como se define previamente para la fórmula estructural (I). En una realización específica, R^{8} es -O-CH_{2}-C(O)NH-CH_{3} y/o R^{4} es un heteroarilo según la realización decimo- tercera.
En una decimoctava realización, los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia) incluyen cualquier compuesto seleccionado de la Tabla 1 que inhibe una cascada de transducción de señales de receptores Fc, una actividad de Syk cinasa, una cascada de transducción de señales de receptores dependientes de Syk cinasa, o la desgranulación celular como se mide en un ensayo in vitro, opcionalmente sujeto a la condición de que el compuesto no sea un compuesto excluido por la realización tercera descrita anteriormente ni/u otras realizaciones. En una realización específica, tales compuestos tienen una IC_{50} de alrededor de 20 \muM o menos, según se mide en un ensayo de desgranulación in vitro, tal como uno de los ensayos de desgranulación descritos en la sección de Ejemplos.
En una decimonona realización, los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia) incluyen cualquier compuesto seleccionado de la Tabla 1 que inhibe la cascada de los receptores Fc\gammaR1 o Fc\gammaR1 con una IC_{50} de alrededor de 20 \muM o menos según se mide en un ensayo in vitro, tal como uno de los ensayos in vitro proporcionados en la sección de Ejemplos, opcionalmente sujeto a la condición de que el compuesto no sea un compuesto excluido por la tercera realización descrita anteriormente ni/u otras realizaciones.
En una vigésima realización, los compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que R^{2} se selecciona del grupo que consiste en
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R^{4}, R^{8}, R^{a}, R^{b}, R^{c}, R^{d} son como se describe anteriormente, R^{5} es un átomo de flúor; R^{6} es un átomo de hidrógeno y cada R^{21} son independientemente un átomo de halógeno o un alquilo opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos halo, R^{22} y R^{23} son cada uno, independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno, metilo o etilo opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos halo, cada m es independientemente un número entero de 1 a 3, y cada n es independientemente un número entero de 0 a 3.
En una vigésimo primera realización, los compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que R^{4} es
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en la que R^{9} y R^{10} son como se define anteriormente, e incluyen además, cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, y R^{2} es un grupo fenilo, sustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8}, o
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en la que R^{35} es como se define anteriormente. En un aspecto particular, cuando R^{2} es un grupo fenilo, uno o más de R^{8} se selecciona de un halógeno y de un grupo alcoxi. En un aspecto, el grupo fenilo está di- o trisustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8}.
En una vigésimo segunda realización, los compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que R^{4} es
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y R^{2} es un grupo fenilo, sustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8}. En un aspecto particular, uno o más de R^{8} se selecciona de un halógeno y de un grupo alcoxi. En un aspecto, el grupo fenilo está di- o trisustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8}.
En una vigésimo tercera realización, los compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que R^{4} es un grupo fenilo sustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8}, en los que R^{2} es
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en la que R^{35} es como se define anteriormente. En realizaciones particulares, el grupo fenilo R^{4} está di- o trisustituido con los mismos o diferentes átomos de halógeno. En otra realización, R^{4} es un grupo fenilo monosustituido con un átomo de halógeno. En un aspecto, R^{35} es un grupo hidroxialquilo. En ciertos aspectos, el grupo hidroxialquilo se puede funcionalizar adicionalmente en un grupo éster, en carbamato, etc.
En una vigésimo cuarta realización, los compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que R^{4} es
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en la que R^{35} es como se define anteriormente y R^{2} es un grupo fenilo sustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8}. En un aspecto particular, R^{35} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo. En otro aspecto, el grupo fenilo R^{2} está di- o trisustituido con los mismos o diferentes grupos R^{8}, y en particular, átomos de halógeno.
En una vigésimo quinta realización, los compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que R^{4} es
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en la que R^{35} es como se define anteriormente, y R^{2} es
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en la que R^{9} y R^{10} son como se define anteriormente e incluyen adicionalmente, cada uno independientemente, un átomo de hidrógeno. En un aspecto, R^{35} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, por ejemplo metilo, y R^{9} y R^{10} son grupos alquilo, por ejemplo grupos metilo.
En una vigésimo sexta realización, los compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que R^{4} es un grupo fenilo disustituido, sustituido con los mismos o diferentes grupos R^{8}, y R^{2} es
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35 
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en la que R^{35} es como se define anteriormente. En ciertos aspectos, el grupo fenilo está sustituido con un átomo de halógeno y un grupo alcoxi, por ejemplo un grupo metoxi. En ciertas realizaciones, R^{35} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, por ejemplo un grupo metilo, o un grupo hidroxialquilo. En ciertos aspectos, el grupo hidroxialquilo se puede funcionalizar adicionalmente en un grupo éster, en un carbamato, etc.
En una vigésimo séptima realización, los compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que R^{4} es
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en las que R^{8} y R^{c} son como se define anteriormente, y R^{2} es un grupo fenilo que está sustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8}. En un aspecto particular, R^{c} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo. En otro aspecto, el grupo fenilo R^{2} está di- o trisustituido con los mismos o diferentes grupos R^{8}, y en particular, átomos de halógeno, o
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En una vigésimo octava realización, los compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que R^{4} es
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en la que Y^{1}, Y^{2} y cada R^{35} independientemente, son como se define anteriormente, y R^{2} es
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en la que R^{35} es como se define anteriormente. En un aspecto de la vigésimo octava realización con respecto a R^{4}, Y^{1} es oxígeno, Y^{2} es NH y uno o más de R^{35} o el resto R^{4} es un grupo alquilo, y en particular un grupo metilo. En ciertos aspectos de la vigésimo octava realización, dos R^{35} del resto R^{4} forman un resto dialquílico geminal, en particular un resto dialquílico geminal adyacente al NH, representado como
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En ciertos aspectos de la vigésimo octava realización, con respecto a R^{2}, R^{35} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, y en particular un grupo metilo.
En una vigésimo nona realización, los compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que R^{4} es
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en la que R^{9} y R^{10} son como se define anteriormente, o un grupo fenilo sustituido. En un aspecto, el grupo fenilo está di- o trisustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8}. En particular, el grupo fenilo puede estar di- o trisustituido con uno o más átomos de halógeno, que pueden ser iguales o diferentes. R^{2} en la vigésimo nona realización es
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en la que R^{35} es como se define anteriormente. En un aspecto de la vigésimo nona realización, R^{35} de R^{2} no es un grupo metilo. Todavía en otro aspecto de la vigésimo nona realización, R^{2} es
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En una trigésima realización, aplicable a las realizaciones primera a vigésimo nona, R^{5} es un átomo de halógeno, tal como flúor, y R^{6} es un átomo de hidrógeno.
También se describen específicamente combinaciones de las realizaciones primera a trigésima anteriores.
Los expertos en la técnica apreciarán que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aquí pueden incluir grupos funcionales que se pueden enmascarar con progrupos para crear profármacos. Tales progrupos son habitualmente, aunque no necesariamente, farmacológicamente inactivos hasta que se convierten en su forma farmacéutica activa. De hecho, muchos de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina activos descritos en la Tabla 1, más abajo, incluyen prorrestos que son hidrolizables o de otro modo escindibles en condiciones de uso. Por ejemplo, los grupos éster habitualmente sufren hidrólisis catalizada por ácidos para producir el ácido carboxílico progenitor cuando se exponen a las condiciones ácidas del estómago, o la hidrólisis catalizada por bases cuando se exponen a las condiciones básicas del intestino o la sangre. De este modo, cuando se administran oralmente a un sujeto, las 2,4-pirimidindiaminas que incluyen restos de éster se pueden considerar profármacos de su ácido carboxílico correspondiente, independientemente de si la forma de éster es farmacológicamente activa. Haciendo referencia a la Tabla 1, numerosas 2,4-pirimidindiaminas que contienen éster de la invención son activas en su forma de "profármaco" de
éster.
En los profármacos, cualquier resto funcional disponible se puede enmascarar con un progrupo para producir un profármaco. Los grupos funcionales en los compuestos de 2,4-pirimidindiamina que se pueden enmascarar con progrupos para inclusión en un prorresto incluyen, pero no se limitan a, aminas (primarias y secundarias), hidroxilos, sulfanilos (tioles), carboxilos, etc. En la técnica se conoce una miríada de progrupos adecuados para enmascarar tales grupos funcionales para producir prorrestos que son escindibles en las condiciones de uso deseadas. Todos estos progrupos, solos o en combinaciones, se pueden incluir en los profármacos.
En un ejemplo ilustrativo, los profármacos son compuestos según la fórmula estructural (I) en la que R^{a} y R^{d} pueden ser, además de sus alternativas previamente definidas, un progrupo.
La sustitución de los hidrógenos unidos a N2 y N4 en las 2,4-pirimidindiaminas de fórmula estructural (I) por sustituyentes afecta adversamente a la actividad de los compuestos. Sin embargo, como apreciarán los expertos, estos nitrógenos se pueden incluir en prorrestos que, en condiciones de uso, se escinden para producir 2,4-pirimidindiaminas según la fórmula estructural (I). De este modo, en otra realización, los profármacos son compuestos según la fórmula estructural (II):
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incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-óxidos de los mismos, en la que:
\quad
R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{1} y L^{2} son como se define previamente para la fórmula estructural (I); y
\quad
R^{2b} y R^{4b} son cada uno, independientemente entre sí, un progrupo. Ejemplos específicos de tales progrupos incluyen, pero no se limitan a, alquilo (C1-C6), -C(O)CH_{3}, -C(O)NHR^{36} y -S(O)_{2}R^{36}, en los que R^{36} es alquilo (C1-C6), arilo (C5-C15) y cicloalquilo (C3-C8).
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En los profármacos de fórmula estructural (II), los diversos sustituyentes pueden ser como se describe para las diversas realizaciones primera a vigésima previamente descritas para los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia), o combinaciones de tales realizaciones.
Los expertos en la técnica apreciarán que muchos de los compuestos y profármacos, así como las diversas especies de compuestos descritas y/o ilustradas específicamente aquí, pueden mostrar el fenómeno de tautomería, isomería conformacional, isomería geométrica y/o isomería óptica. Por ejemplo, los compuestos y profármacos pueden incluir uno o más centros quirales y/o dobles enlaces, y, como consecuencia, pueden existir como estereoisómeros, tales como isómeros de dobles enlaces (es decir, isómeros geométricos), enantiómeros y diastereómeros y sus mezclas, tales como mezclas racémicas. Como otro ejemplo, los compuestos y profármacos pueden existir en varias formas tautómeras, incluyendo la forma enólica, la forma ceto y sus mezclas. Puesto que los diversos nombres, fórmulas y dibujos de los compuestos en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones sólo pueden representar una de las posibles formas tautómeras, de isómero conformacional, de isómero óptico o de isómero geométrico, se debería entender que la invención engloba cualquiera de las formas tautómera, de isómero conformacional, de isómero óptico y/o de isómero geométrico de los compuestos o profármacos que tienen una o más de las utilidades descritas aquí, así como mezclas de estas diversas formas isómeras diferentes. En casos de rotación limitada alrededor de la estructura central de 2,4-pirimidindiamina, también son posibles atropisómeros, y también se incluyen específicamente en los compuestos de la invención.
Además, los expertos apreciarán que cuando listas de sustituyentes alternativos incluyen miembros que, dado los requisitos de valencia u otras razones, no se pueden usar para sustituir un grupo particular, la lista está destinada a ser leída en el contexto de que incluya aquellos miembros de la lista que sean adecuados para sustituir el grupo particular. Por ejemplo, los expertos apreciarán que aunque se pueden usar todas las alternativas enumeradas para R^{b} para sustituir un grupo alquilo, algunas alternativas, tales como =O, no se pueden usar para sustituir un grupo fenilo. Se entenderá que sólo se proponen combinaciones posibles de los pares de grupos sustituyentes.
Los compuestos y/o profármacos se pueden identificar mediante su estructura química o su nombre químico. Cuando la estructura química y el nombre químico entran en conflicto, la estructura química es determinante de la identidad del compuesto específico.
Dependiendo de la naturaleza de los diversos sustituyentes, los compuestos y profármacos de 2,4-pirimidindiamina de la invención pueden estar en forma de sales. Tales sales incluyen sales adecuadas para usos farmacéuticos ("sales farmacéuticamente aceptables"), sales adecuadas para usos veterinarios, etc. Tales sales pueden derivar de ácidos o bases, como es bien conocido en la técnica.
En una realización, la sal es una sal farmacéuticamente aceptable. Generalmente, las sales farmacéuticamente aceptables son aquellas sales que retienen sustancialmente una o más de las actividades farmacológicas deseadas del compuesto progenitor, y que son adecuadas para la administración a seres humanos. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácidos formadas con ácidos inorgánicos o ácidos orgánicos. Los ácidos inorgánicos adecuados para formar sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen, a título de ejemplo y no de limitación, ácidos halohídricos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, etc.), ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y similares. Los ácidos orgánicos adecuados para formar sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen, a título de ejemplo y no de limitación, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido hexanoico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido palmítico, ácido benzoico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácidos alquilsulfónicos (por ejemplo, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 1,2-etanodisulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, etc.), ácidos arilsulfónicos (por ejemplo, ácido bencenosulfónico, ácido 4-clorobencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 4-toluenosulfónico, ácidos cicloalquilsulfónicos (por ejemplo, ácido canfosulfónico, etc.), ácido 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-en-1-carboxílico, ácido glucoheptónico, ácido 3-fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciario, ácido laurilsulfúrico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido hidroxinaftoico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucónico, y
similares.
Las sales farmacéuticamente aceptables también incluyen sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto progenitor se sustituye por un ion metálico (por ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion de metal alcalino-térreo o un ion de aluminio), un ion amonio o se coordina con una base orgánica (por ejemplo, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N-metilglucamina, morfolina, piperidina, dimetilamina, dietilamina,
etc.).
Los compuestos y profármacos de 2,4-pirimidindiamina de la invención, así como sus sales, también pueden estar en forma de hidratos, solvatos y N-óxidos, como son bien conocidos en la técnica.
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6.3 Métodos de Síntesis
Los compuestos y profármacos se pueden sintetizar vía una variedad de rutas sintéticas diferentes usando materiales de partida comercialmente disponibles y/o materiales de partida preparados por métodos sintéticos convencionales. Los métodos ejemplares adecuados que se pueden usar habitualmente y/o adaptar para sintetizar los compuestos y profármacos de 2,4-pirimidindiamina de la invención se encuentran en la patente U.S. nº 5.958.935, cuya descripción se incorpora aquí como referencia. En la sección de Ejemplos se proporcionan ejemplos específicos que describen la síntesis de numerosos compuestos y profármacos, así como intermedios para ellos. Todos los compuestos de fórmulas estructurales (I), (Ia) y (II) se pueden preparar mediante adaptación normal de estos
métodos.
En los Esquemas (I)-(XI), a continuación, se describe una variedad de rutas sintéticas ejemplares que se pueden usar para sintetizar los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención. En los Esquemas (I)-(XI), compuestos con números similares tienen estructuras similares. Estos métodos se pueden adaptar de forma normal para sintetizar los profármacos según la fórmula estructural (II).
En una realización ejemplar, los compuestos se pueden sintetizar a partir de uracilos o tiouracilos sustituidos o no sustituidos como se ilustra en el Esquema (I), a continuación:
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Esquema (I)
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En el Esquema (I), R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{1} y L^{2} son como se define previamente para la fórmula estructural (I), X es halógeno (por ejemplo, F, Cl, Br o I) e Y e Y' se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en O y S. Haciendo referencia al Esquema (I), el uracilo o tiouracilo 2 se dihalogena en las posiciones 2 y 4 usando un agente halogenante estándar POX_{3} (u otro agente halogenante estándar) en condiciones estándar para producir la 2,4-bishalopirimidina 4. Dependiendo del sustituyente R^{5}, en la pirimidina 4, el haluro en la posición C4 es más reactivo con nucleófilos que el haluro en la posición C2. Esta reactividad diferencial se puede explotar para sintetizar 2,4-pirimidindiaminas según la fórmula estructural (I) haciendo reaccionar en primer lugar la 2,4-bishalopirimidina 4 con un equivalente de amina 10, produciendo la 4N-sustituida-2-halo-4-pirimidinamina 8, seguido de la amina 6 para producir una 2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural (I). Las 2N,4N-bis(sustituidas)-2,4-pirimidindiaminas 12 y 14 se pueden obtener haciendo reaccionar la 2,4-bishalopiridina 4 con 6 ó 10 en exceso, respectivamente.
En la mayoría de las situaciones, el haluro de C4 es más reactivo con nucleófilos, como se ilustra en el Esquema. Sin embargo, como reconocerán los expertos, la identidad del sustituyente R^{5} puede alterar esta reactividad. Por ejemplo, cuando R^{5} es trifluorometilo, se obtiene una mezcla 50:50 de 4N-sustituida-4-pirimidinamina 8 y la 2N-sustituida-2-pirimidinamina correspondiente. Independientemente de la identidad del sustituyente R^{5}, la regioselectividad de la reacción se puede controlar ajustando el disolvente y otras condiciones sintéticas (tales como la temperatura), como es bien conocido en la técnica.
Las reacciones representadas en el Esquema (I) pueden transcurrir más rápidamente cuando las mezclas de reacción se calientan vía microondas. Cuando se calienta de esta manera, se pueden usar las siguientes condiciones: calentamiento hasta 175ºC en etanol durante 5-20 min. en un reactor Smith (Personal Chemistry) en un tubo cerrado herméticamente (a una presión de 20 bares).
Los materiales de partida de uracilo o tiouracilo 2 se pueden adquirir de fuentes comerciales, o se pueden preparar usando técnicas estándar de química orgánica. Los uracilos y tiouracilos comercialmente disponibles que se pueden usar como materiales de partida en el Esquema (I) incluyen, a título de ejemplo y no de limitación, uracilo (Aldrich #13,078-8; Registro CAS 66-22-8); 2-tio-uracilo (Aldrich #11,558-4; Registro CAS 141-90-2); 2,4-ditiouracilo (Aldrich #15,846-1; Registro CAS 2001-93-6); 5-acetouracilo (Chem. Sources Int'12000; Registro CAS 6214-65-9); 5-azidouracilo; 5-aminouracilo (Aldrich #85,528-6; Registro CAS 932-52-5); 5-bromouracilo (Aldrich #85,247-3; Registro CAS 51-20-7); 5-(trans-2-bromovinil)-uracilo (Aldrich #45,744-2; Registro CAS 69304-49-0); 5-(trans-2-clorovinil)-uracilo (Registro CAS 81751-48-2); 5-(trans-2-carboxivinil)-uracilo; ácido uracil-5-carboxílico (hidrato del ácido 2,4-dihidroxipirimidin-5-carboxílico; Aldrich #27,770-3; Registro CAS 23945-44-0); 5-clorouracilo (Aldrich #22,458-8; Registro CAS 1820-81-1); 5-cianouracilo (Chem. Sources Int'12000; Registro CAS 4425-56-3); 5-etiluracilo (Aldrich #23,044-8; Registro CAS 4212-49-1); 5-eteniluracilo (Registro CAS 37107-81-6); 5-fluorouracilo (Aldrich #85,847-1; Registro CAS 51-21-8); 5-yodouracilo (Aldrich #85,785-8; Registro CAS 696-07-1); 5-metiluracilo (timina; Aldrich #13,199-7; Registro CAS 65-71-4); 5-nitrouracilo (Aldrich #85,276-7; Registro CAS 611-08-5); ácido uracil-5-sulfámico (Chem. Sources Int'12000; Registro CAS 5435-16-5); 5-(trifluorometil)-uracilo (Aldrich #22,327-1; Registro CAS 54-20-6); 5-(2,2,2-trifluoroetil)-uracilo (Registro CAS 155143-31-6); 5-(pentafluoroetil)-uracilo (Registro CAS 60007-38-3); 6-aminouracilo (Aldrich #A5060-6; Registro CAS 873-83-6); ácido uracil-6-carboxílico (ácido orótico; Aldrich #0-840-2; Registro CAS 50887-69-9); 6-metiluracilo (Aldrich #D11,520-7; Registro CAS 626-48-2); ácido uracil-5-amino-6-carboxílico (ácido 5-aminoorótico; Aldrich #19,121-3; Registro CAS #7164-43-4); 6-amino-5-nitrosouracilo (6-amino-2,4-dihidroxi-5-nitrosopirimidina; Aldrich #27,689-8; Registro CAS 5442-24-0); ácido uracil-5-fluoro-6-carboxílico (ácido 5-fluoroorótico; Aldrich #42,513-3; Registro CAS 00000-00-0); y ácido uracil-5-nitro-6-carboxílico (ácido 5-nitroorótico; Aldrich #18,528-0; Registro CAS 600779-49-9). Uracilos y/o tiouracilos sustituidos en 5, en 6 y 5,6-sustituidos adicionales están disponibles en General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) y/o Interchim, Francia (www.interchim.com), o se pueden preparar usando técnicas estándar. Más abajo se proporciona una miríada de referencias de libros de texto que enseñan métodos sintéticos adecuados.
Las aminas 6 y 10 se pueden adquirir de fuentes comerciales, o, como alternativa, se pueden sintetizar utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, las aminas adecuadas se pueden sintetizar a partir de nitroprecursores usando química estándar. En la sección de Ejemplos se proporcionan reacciones ejemplares específicas. Véase también Vogel, 1989, Practical Organic Chemistry, Addison Wesley Longman, Ltd. y John Wiley & Sons, Inc.
Los expertos reconocerán que, en algunos casos, las aminas 6 y 10 y/o los sustituyentes R^{5} y/o R^{6} en el uracilo o tiouracilo 2 pueden incluir grupos funcionales que requieran protección durante la síntesis. La identidad exacta de cualquier o cualquiera de los grupos protectores usados dependerá de la identidad del grupo funcional a proteger, y será manifiesta para los expertos en la técnica. Por ejemplo, en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3ª Edición, John Wiley & Sons, Inc., New York (1999), y las referencias citadas allí (en lo sucesivo "Greene y Wuts"), se puede encontrar una guía para seleccionar grupos protectores adecuados, así como estrategias sintéticas para su unión y eliminación.
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En el Esquema (Ia), a continuación, se ilustra una realización específica del Esquema (I) que utiliza 5-fluorouracilo (Aldrich #32,937-1) como material de partida:
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Esquema (Ia)
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46 
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En el Esquema (Ia), R^{2}, R^{4}, L^{1} y L^{2} son como se define previamente para el Esquema (I). Según el Esquema (Ia), el 5-fluorouracilo 3 se halogena con POCl_{3} para producir 2,4-dicloro-5-fluoropirimidina 5, que entonces se hace reaccionar con amina 6 ó 10 en exceso para producir N2,N4-bis-sustituida-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina 11 ó 13, respectivamente. Como alternativa, la 2N,4N-disustituida-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina 9 asimétrica se puede obtener haciendo reaccionar 2,4-dicloro-5-fluoropirimidina 5 con un equivalente de amina 10 (para producir 2-choro-N4-sustituida-5-fluoro-4-pirimidinamina 7) seguido de uno o más equivalentes de amina 6.
En otra realización ejemplar, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina se pueden sintetizar a partir de citosinas sustituidas o no sustituidas como se ilustra en los Esquemas (IIa) y (IIb), a continuación:
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Esquema (IIa)
47 
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Esquema (IIb)
4700
En los Esquemas (IIa) y (IIb), R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6},L^{1}, L^{2} y X son como se define previamente para el Esquema (I), y PG representa un grupo protector. Haciendo referencia al Esquema (IIa), la amina exocíclica en C_{4} de la citosina 20 se protege en primer lugar con un grupo protector PG adecuado, para producir la citosina N4-protegida 22. Para una guía específica con respecto a grupos protectores útiles en este contexto, véase Vorbrüggen y Ruh-Pohlenz, 2001, Handbook of Nucleoside Synthesis, John Wiley & Sons, NY, p. 1-631 ("Vorbrüggen"). La citosina protegida 22 se halogena en la posición C2 usando un reactivo de halogenación estándar en condiciones estándar para producir 2-cloro-4N-protegida-4-pirimidinamina 24. La reacción con la amina 6, seguido de la desprotección de la amina exocíclica en C4 y la reacción con la amina 10 produce una 2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural (I).
Como alternativa, haciendo referencia al Esquema (IIb), la citosina 20 se puede hacer reaccionar con la amina 10 o con la amina protegida 21 para producir la citosina N4-sustituida 23 ó 27, respectivamente. Estas citosinas sustituidas se pueden halogenar entonces como se describe previamente, se pueden desproteger (en el caso de la citosina N4-sustituida 27) y se pueden hacer reaccionar con la amina 6 para producir una 2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural (I).
Las citosinas comercialmente disponibles que se pueden usar como materiales de partida en los Esquemas (IIa) y (IIb) incluyen, pero no se limitan a, citosina (Aldrich #14,201-8; Registro CAS 71-30-7); N^{4}-acetilcitosina (Aldrich #37,791-0; Registro CAS 14631-20-0); 5-fluorocitosina (Aldrich #27,159-4; Registro CAS 2022-85-7); y 5-(trifluorometil)-citosina. Otras citosinas adecuadas, útiles como materiales de partida en los Esquemas (IIa), están disponibles en General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) y/o Interchim, Francia www.interchim.com, o se pueden preparar usando técnicas estándar. Más abajo se proporciona una miríada de referencias de libros de texto que enseñan métodos sintéticos adecuados.
Todavía en otra realización ejemplar, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina se pueden sintetizar a partir de 2-amino-4-pirimidinoles sustituidos o no sustituidos como se ilustra en el Esquema (III), a continuación:
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Esquema (III)
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48 
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En el Esquema (III), R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{1}, L^{2} y X son como se define previamente para el Esquema (I), y Z es un grupo saliente como se explica con más detalle en relación con el Esquema IV, más abajo. Haciendo referencia al Esquema (III), se hace reaccionar 2-qmino-4-pirimidinol 30 con una amina 6 (o una amina opcionalmente protegida 21) para producir N2-sustituido-4-pirimidinol 32, que entonces se halogena como se describe previamente para producir N2-sustituida-4-halo-2-pirimidinamina 34. La desprotección opcional (por ejemplo, si se usó la amina protegida 21 en la primera etapa), seguido de la reacción con la amina 10, da una 2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural (I). Como alternativa, el pirimidinol 30 se puede hacer reaccionar con un agente acilante 31.
Los 2-amino-4-pirimidinoles 30 comercialmente disponibles adecuados que se pueden usar como materiales de partida en el Esquema (III), incluyen, pero no se limitan a, hidrato de 2-amino-6-cloro-4-pirimidinol (Aldrich #A4702-8; Registro CAS 00000-00-0) y 2-amino-6-hidroxi-4-pirimidinol (Aldrich #A5040-1; Registro CAS 56-09-7). Otros 2-amino-4-pirimidinoles 30 útiles como materiales de partida en el Esquema (III) están disponibles en General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) y/o Interchim, Francia (www.interchim.com), o se pueden preparar usando técnicas estándar. Más abajo se proporciona una miríada de referencias de libros de texto que enseñan métodos sintéticos adecuados.
Como alternativa, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina se pueden preparar a partir de 4-amino-2-pirimidinoles sustituidos o no sustituidos como se ilustra en el Esquema (IV), más abajo:
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Esquema (IV)
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49 
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En el Esquema (IV), R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{1} y L^{2} son como se define previamente para el Esquema (I), y Z representa un grupo saliente. Haciendo referencia al Esquema (IV), el hidroxilo en C2 del 4-amino-2-pirimidiniol 40 es más reactivo con nucleófilos que el amino en C4, de forma que la reacción con la amina 6 produce N2-sustituida-2,4-pirimidindiamina 42. La reacción subsiguiente con el compuesto 44, que incluye un buen grupo saliente Z, o con la amina 10 produce una 2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural (I). El compuesto 44 puede incluir virtualmente cualquier grupo saliente que se pueda sustituir por el amino en C4 de la N2-sustituida-2,4-pirimidindiamina 42. Los grupos salientes Z adecuados incluyen, pero no se limita a, halógenos, metanosulfoniloxi (mesiloxi, "OMs"), trifluorometanosulfoniloxi ("OTf"), y p-toluenosulfoniloxi (tosiloxi; "OTs"), bencenosulfoniloxi ("besilato") y metanitrobencenosulfoniloxi ("nosilato"). Otros grupos salientes adecuados serán manifiestos para los expertos en la técnica.
Los materiales de partida de 4-amino-2-pirimidinol sustituido se pueden obtener comercialmente, o se pueden sintetizar usando técnicas estándar. Más abajo se proporciona una miríada de referencia de libros de texto que enseñan métodos sintéticos adecuados.
Todavía en otra realización ejemplar, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina se pueden preparar a partir de 2-cloro-4-aminopiridinas o 2-amino-4-cloropiridinas como se ilustra en el Esquema (V), a continuación:
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Esquema (V)
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50 
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En el Esquema (V), R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{1}, L^{2} y X son como se define para el Esquema (I), y Z es como se define para el Esquema (IV). Haciendo referencia al Esquema (V), la 2-amino-4-cloropirimidina 50 se hace reaccionar con la amina 10 para producir 4N-sustituida-2-pirimidinamina 52 que, tras la reacción con el compuesto 31 o con la amina 6, produce una 2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural (I). Como alternativa, la 2-cloro-4-aminopirimidina 54 se puede hacer reaccionar con el compuesto 44 seguido de la amina 6 para producir un compuesto según la fórmula estructural (I).
Hay comercialmente una variedad de pirimidinas 50 y 54, adecuadas para uso como materiales de partida en el Esquema (V), incluyendo, a título de ejemplo y no de limitación, 2-amino-4,6-dicloropirimidina (Aldrich #A4860-1; Registro CAS 56-05-3); 2-amino-4-cloro-6-metoxi-pirimidina (Aldrich #51,864-6; Registro CAS 5734-64-5); 2-amino-4-cloro-6-metilpirimidina (Aldrich #12,288-2; Registro CAS 5600-21-5); y 2-amino-4-cloro-6-metiltiopirimidina (Aldrich #A4600-5; Registro CAS 1005-38-5). Materiales de partida de pirimidina adicionales están disponibles en General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) y/o Interchim, Francia (www.interchim.com), o se pueden preparar usando técnicas estándar. Más abajo se proporciona una miríada de referencias de libros de texto que enseñan métodos sintéticos adecuados.
Como alternativa, las 4-cloro-2-pirimidinaminas 50 se pueden preparar como se ilustra en el Esquema (Va):
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Esquema (Va)
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51 
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En el Esquema (Va), R^{5} y R^{6} son como se define previamente para la fórmula estructural (I). En el Esquema (Va), el dicarbonilo 53 se hace reaccionar con guanidina para producir 2-pirimidinamina 51. La reacción con perácidos como ácido m-cloroperbenzoico, ácido trifluoroperacético o complejo de urea-peróxido de hidrógeno produce el N-óxido 55, que entonces se halogena para dar 4-cloro-2-pirimidinamina 50. Las 4-halo-2-pirimidinaminas correspondientes se pueden obtener usando reactivos de halogenación adecuados.
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Todavía en otra realización ejemplar, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina se pueden preparar a partir de uridinas sustituidas o no sustituidas como se ilustra en el Esquema (VI), a continuación:
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Esquema (VI)
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52 
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En el Esquema (VI), R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{1}, L^{2} y X son como se define previamente para el Esquema (I), y el superíndice PG representa un grupo protector, como se explica en relación con el Esquema (IIb). Según el Esquema (VI), la uridina 60 tiene un centro reactivo en C4, de forma que la reacción con la amina 10 o la amina protegida 21 produce citidina N4-sustituida 62 ó 64, respectivamente. La desprotección catalizada por ácidos de 62 ó 64 N4-sustituida (cuando "PG" representa un grupo protector lábil a ácidos) produce la citosina N4-sustituida 28, que se puede halogenar subsiguientemente en la posición C2 y se puede hacer reaccionar con la amina 6 para producir una 2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural (I).
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Las citidinas también se pueden usar como materiales de partida de una manera análoga, como se ilustra en el Esquema (VII), a continuación:
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Esquema (VII)
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53 
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En el Esquema (VII), R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{1}, L^{2} y X son como se define previamente en el Esquema (I), y el superíndice PG representa un grupo protector como se explica anteriormente. Haciendo referencia al Esquema (VII), al igual que la uridina 60, la citidina 70 tiene un centro reactivo en C4, de forma que la reacción con la amina 10 o la amina protegida 21 produce la citidina N4-sustituida 62 ó 64, respectivamente. Estas citidinas 62 y 64 se tratan entonces como se describe previamente para el Esquema (VI) para producir una 2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural (I).
Aunque los Esquemas (VI) y (VII) se ejemplifican con ribosilnucleósidos, los expertos apreciarán que también funcionarán los 2'-desoxirribo- y 2',3'-didesoxirribonucleósidos correspondientes, así como nucleósidos que incluyen azúcares o análogos de azúcares distintos de la ribosa.
En la técnica se conocen numerosas uridinas y citidinas útiles como materiales de partida en los Esquemas (VI) y (VII), e incluyen, a título de ejemplo y no de limitación, 5-trifluorometil-2'-desoxicitidina (Chem. Sources #ABCR F07669; Registro CAS 66,384-66-5); 5-bromouridina (Chem. Sources Int'12000; Registro CAS 957-75-5); 5-yodo-2'-desoxiuridina (Aldrich #1-775-6; Registro CAS 54-42-2); 5-fluorouridina (Aldrich #32,937-1; Registro CAS 316-46-1); 5-yodomidina (Aldrich #85,259-7; Registro CAS 1024-99-3); 5-(trifluorometil)uridina (Chem Sources Int'l 2000; Registro CAS 70-00-8), 5-trifluometil-2'-desoxiuridina (Chem. Sources Int'l 2000; Registro CAS 70-00-8). Las uridinas y citidinas adicionales que se pueden usar como materiales de partida en los Esquemas (VI) y (VII) están disponibles en General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) y/o Interchim, Francia (www.interchim.com), o se pueden preparar usando técnicas estándar. Más abajo se proporciona una miríada de referencias de libros de texto que enseñan métodos sintéticos adecuados.
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina también se pueden sintetizar a partir de pirimidinas sustituidas, tales como pirimidinas clorosustituidas, como se ilustra en los Esquemas (VIII) y (IX), más abajo:
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Esquema (VIII)
54 
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Esquema (IX)
5400
En los Esquemas (VIII) y (IX), R^{2}, R^{4}, L^{1}, L^{2} y R^{a} son como se define previamente para la fórmula estructural (I), y "Ar" representa un grupo arilo. Haciendo referencia al Esquema (VIII), la reacción de 2,4,6-tricloropirimidina 80 (Aldrich #T5,620-0; CAS#3764-01-0) con la amina 6 produce una mezcla de tres compuestos: pirimidin-mono-, di- y triaminas sustituidas 81, 82 y 83, que se pueden separar y aislar usando HPLC u otras técnicas convencionales. Las mono- y diaminas 81 y 82 se pueden hacer reaccionar adicionalmente con las aminas 6 y/o 10 para producir N2,N4,N6-trisustituidas-2,4,6-pirimidintriaminas 84 y 85, respectivamente.
Las N2,N4-bis-sustituidas-2,4-pirimidindiaminas se pueden preparar de manera análoga al Esquema (VIII) empleando como materiales de partida 2,4-dicloro-5-metilpirimidina o 2,4-dicloro-pirimidina. En este caso, no se obtiene la pirimidinamina monosustituida que corresponde al compuesto 81. En su lugar, la reacción transcurre para producir directamente la N2,N4-bis-sustituida-2,4-pirimidindiamina.
Haciendo referencia al Esquema (IX), se hace reaccionar 2,4,5,6-tetracloropirimidina 90 (Aldrich #24,671-9; CAS#1780-40-1) con amina 6 en exceso para producir una mezcla de tres compuestos: 91, 92, y 93, que se pueden separar y aislar usando HPLC u otras técnicas convencionales. Como se ilustra, la N2,N4-bis-sustituida-5,6-dicloro-2,4-pirimidindiamina 92 se puede hacer reaccionar entonces en el haluro de C6 con, por ejemplo, un agente nucleófilo 94 para producir el compuesto 95. Como alternativa, el compuesto 92 se puede convertir en la N2,N4-bis-sustituida-5-cloro-6-aril-2,4-pirimidindiamina 97 vía una reacción de Suzuki. La 2,4-pirimidindiamina 95 se puede convertir en la 2,4-pirimidindiamina 99 mediante reacción con Bn_{3}SnH.
Como reconocerán los expertos, las 2,4-pirimidindiaminas, sintetizadas vía los métodos ejemplares descritos anteriormente o por otros medios bien conocidos, también se pueden utilizar como materiales de partida y/o intermedios para sintetizar compuestos de 2,4-pirimidindiamina adicionales. En el Esquema (X), a continuación, se ilustra un ejemplo específico:
Esquema (X)
55
En el Esquema (X), R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{2} y R^{a} son como se define previamente para la fórmula estructural (I). Cada R^{a'} es independientemente un R^{a}, y puede ser el mismo o diferente del R^{a} ilustrado. Haciendo referencia al Esquema (X), el ácido carboxílico o el éster 100 se puede convertir en la amida 104 mediante reacciones con la amina 102. En la amina 102, R^{a'} puede ser igual o diferente de R^{a} del ácido o éster 100. De forma similar, el éster de carbonato 106 se puede convertir en carbamato 108.
En el Esquema (XI), a continuación, se ilustra un segundo ejemplo específico:
Esquema (XI)
56
En el Esquema (XI), R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{2} y R^{c} son como se define previamente para la fórmula estructural (I). Haciendo referencia al Esquema (XI), la amida 110 ó 116 se puede convertir en la amina 114 ó 118, respectivamente, mediante reducción boránica con complejo 112 de borano-sulfuro de metilo. Otras reacciones adecuadas para sintetizar compuestos de 2,4-pirimidindiamina a partir de materiales de partida de 2,4-pirimidindiamina serán manifiestas para los expertos en la técnica.
Aunque muchos de los esquemas sintéticos explicados anteriormente no ilustran el uso de grupos protectores, los expertos reconocerán que, en algunos casos, los sustituyentes R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{1} y/o L^{2} pueden incluir grupos funcionales que requieran protección. La identidad exacta del grupo protector usado dependerá, entre otros, de la identidad del grupo funcional que se protege y de las condiciones de reacción usadas en el esquema sintético particular, y será manifiesta para los expertos en la técnica. Por ejemplo, en Greene y Wuts, más arriba, se puede encontrar una guía para seleccionar grupos protectores y químicas para su unión y eliminación adecuados para una aplicación particular.
Los profármacos según la fórmula estructural (II) se pueden preparar mediante modificación normal de los métodos descritos anteriormente. Como alternativa, tales profármacos se pueden preparar haciendo reaccionar una 2,4-pirimidindiamina adecuadamente protegida de fórmula estructural (I) con un progrupo adecuado. Las condiciones para llevar a cabo tales reacciones y para desproteger el producto para producir un profármaco de fórmula (II) son bien conocidas.
En la técnica se conoce una miríada de referencias que enseñan métodos útiles para sintetizar de forma general pirimidinas, así como materiales de partida descritos en los Esquemas (I)-(IX). Para una guía específica, refiérase el lector a Brown, D. J., "The Pyrimidines", en The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volumen 16 (Weissberger, A., Ed.), 1962, Interscience Publishers, (una Division de John Wiley & Sons), Nueva York ("Brown I"); Brown, D.1., "The Pyrimidines", en The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volumen 16, Suplemento I (Weissberger, A. y Taylor, E. C., Ed.), 1970, Wiley-Interscience, (una Division de John Wiley & Sons), Nueva York ("Brown II"); Brown, D. J., "The Pyrimidines", en The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volumen 16, Suplemento II (Weissberger, A. y Taylor, E. C., Ed.), 1985, An Interscience Publication (John Wiley & Sons), Nueva York ("Brown III"); Brown, D. J., "The Pyrimidines" en The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volumen 52 (Weissberger, A. y Taylor, E. C., Ed.), 1994, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, p. 1-1509 ("Brown IV"); Kenner, G. W. y Todd, A., en Heterocyclic Compounds, Volumen 6, (Elderfield, R C., Ed.), 1957, John Wiley, Nueva York, Capítulo 7 (pirimidinas); Paquette, L. A., Principles of Modern Heterocyclic Chemistry, 1968, W. A. Benjamin, Inc., Nueva York, p. 1-401 (síntesis de uracilos p. 313, 315; síntesis de pirimidinas p. 313-316; síntesis de aminopirimidinas p. 315); Joule, J. A., Mills, K y Smith, G. F., Heterocyclic Chemistry, 3ª edición, 1995, Chapman and Hall, Londres, UK, p. 1-516; Vorbrüggen, H. y Ruh-Pohlenz, C., Handbook of Nucleoside Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 2001, p. 1-631 (protección de pirimidinas mediante acilación p. 90-91; sililación de pirimidinas p. 91-93); Joule, J. A., Mills, K. y Smith, G. F., Heterocyclic Chemistry, 4ª edición, 2000, Blackwell Science, Ltd, Oxford, UK, p. 1-589; y Comprehensive Organic Synthesis, Volúmenes 1-9 (Trost, B. M. y Fleming, I., Ed.), 1991, Pergamon Press, Oxford,
UK.
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6.4 Inhibición de las Cascadas de Señalización de Receptores Fc
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina activos de la invención inhiben las cascadas de señalización de receptores Fc que conducen, entre otros, a la desgranulación de las células. Como un ejemplo específico, los compuestos inhiben las cascadas de señalización de Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI que conducen a la desgranulación de células inmunitarias tales como neutrófilos, eosinófilos, mastocitos y/o basófilos. Tanto los mastocitos como los basófilos desempeñan un papel central en trastornos inducidos por alérgenos, incluyendo, por ejemplo, rinitis alérgica y asma. Haciendo referencia a la Fig. 1, con la exposición a alérgenos, que pueden ser, entre otros, polen o parásitos, se sintetizan anticuerpos IgE específicos de alérgenos mediante células B activadas por IL-4 (o IL-13) u otros mensajeros para cambiar a la síntesis de anticuerpos específicos de la clase IgE. Estos IgEs específicos de alérgenos se unen al Fc\varepsilonRI de alta afinidad. Al unirse al antígeno, los IgE unidos a Fc\varepsilonRI se reticulan y se activa la ruta de transducción de señales del receptor de IgEs, lo que conduce a la desgranulación de las células y a la liberación y/o síntesis consiguiente de un hospedante de mediadores químicos, incluyendo histamina, proteasas (por ejemplo, triptasa y quimasa), mediadores lipídicos tales como leucotrienos (por ejemplo, LTCA4), factor activador de plaquetas (PAF) y prostaglandinas (PGD2) y una serie de citocinas, incluyendo TNF-\alpha, IL-4, IL-13, IL-5, IL-6, IL-8, GMCSF, VEGF y TGF-\beta. La liberación y/o síntesis de estos mediadores desde mastocitos y/o basófilos da cuenta de las respuestas de etapa temprana y tardía inducidas por alérgenos, y están directamente ligadas a sucesos aguas abajo que conducen a un estado inflamatorio
sostenido.
Los sucesos moleculares en la ruta de transducción de señales de Fc\varepsilonRI que conducen a la liberación de mediadores preformados vía la desgranulación y liberación y/o síntesis de otros mediadores químicos son bien conocidos y se ilustran en la Fig. 2. Haciendo referencia a la Fig. 2, el Fc\varepsilonRI es un receptor heterotetrámero compuesto de una subunidad alfa que se une a IgE, una subunidad beta, y dos subunidades gamma (homodímero gamma). La reticulación de IgE unido a Fc\varepsilonRI mediante agentes de unión multivalentes (incluyendo, por ejemplo, alérgenos específicos de IgE o anticuerpos anti-IgE o fragmentos) induce la rápida asociación y activación de la cinasa Lyn relacionada con Src. Lyn fosforila motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM) en las subunidades beta y gamma intracelulares, lo que conduce al reclutamiento de Lyn adicional hacia la subunidad beta y Syk cinasa hacia el homodímero gamma. Estas cinasas asociadas a receptores, que son activadas mediante fosforilación intra- e intermolecular, fosforilan otros componentes de la ruta, tales como la Btk cinasa, LAT, y la fosfolipasa C-gamma (PLC-gamma). La PLC-gamma activada inicia rutas que conducen a la activación de la proteína cinasa C y a la movilización de Ca^{2+}, acciones las cuales son necesarias para la desgranulación. La reticulación de Fc\varepsilonRI también activa las tres clases principales de proteína cinasas activadas por mitógenos (MAP), es decir, ERK1/2, JNK1/2, y p38. La activación de estas rutas es importante en la regulación transcripcional de mediadores proinflamatorios, tales como TNF-\alpha e IL-6, así como el mediador lipídico leucotrieno C4
(LTC4).
Aunque no se ilustra, se cree que la cascada de señalización de Fc\gammaRI comparte algunos elementos comunes con la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI. De forma importante, al igual que Fc\varepsilonRI, el Fc\gammaRI incluye un homodímero gamma que es fosforilado y recluta Syk, y, al igual que Fc\varepsilonRI, la activación de la cascada de señalización de Fc\gammaRI conduce, entre otros, a la desgranulación. Otros receptores Fc que comparten el homodímero gamma, y que pueden ser regulados mediante los compuestos de 2,4-pirimidindiamina activos incluyen, pero no se limitan a, Fc\alphaRI y
Fc\gammaRIII.
La capacidad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención para inhibir las cascadas de señalización de los receptores Fc se puede determinar o confirmar de forma simple en ensayos in vitro. En la sección de Ejemplos se proporcionan ensayos adecuados para confirmar la inhibición de la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI. En un ensayo típico, las células capaces de sufrir la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI, tales como mastocitos o basófilos, se hacen crecer en primer lugar en presencia de IL-4, Factor de Células Madre (SCF), IL-6 e IgB para incrementar la expresión del Fc\varepsilonRI, se exponen a un compuesto de ensayo de 2,4-pirimidindiamina de la invención y se estimulan con anticuerpos anti-IgE (o, como alternativa, un alérgeno específico de IgE). Tras la incubación, la cantidad de un mediador químico u otro agente químico liberado y/o sintetizado como consecuencia de la activación de la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI se puede cuantificar usando técnicas estándar, y se puede comparar con la cantidad del mediador o agente liberado a partir de células de control (es decir, células que son estimuladas pero que no se exponen a compuesto de ensayo). La concentración de compuesto de ensayo que produce una reducción de 50% en la cantidad del mediador o agente, medida en comparación con células de control, es la IC_{50} del ensayo. El origen de los mastocitos o basófilos usados en el ensayo dependerá, en parte, del uso deseado de los compuestos, y será manifiesto para los expertos en la técnica. Por ejemplo, si los compuestos se usarán para tratar o prevenir una enfermedad particular en seres humanos, una fuente conveniente de mastocitos o basófilos es un ser humano u otro animal que constituye un modelo clínico aceptado o conocido para la enfermedad particular. De esto modo, dependiendo de la aplicación particular, los mastocitos o basófilos pueden derivar de una amplia variedad de fuentes animales, oscilando desde, por ejemplo, mamíferos inferiores tales como ratones y ratas, a perros, ovejas y otros mamíferos empleados habitualmente en pruebas clínicas, hasta mamíferos superiores tales como monos, chimpancés y simios, hasta seres humanos. Los ejemplos específicos de células adecuadas para llevar a cabo los ensayos in vitro incluyen, pero no se limitan a, basófilos de roedores o de seres humanos, estirpes celulares de leucemia de basófilos de rata, mastocitos primarios de ratón (tales como mastocitos de ratón derivados de médula ósea "BMMC") y mastocitos primarios de seres humanos aislados de sangre del cordón umbilical ("CHMC") u otros tejidos tales como pulmón. En la sección de Ejemplos (véase, por ejemplo, Demo et al., 1999, Cytometry 36(4):340-348 y la Solicitud Serie nº 10/053.355, presentada el 8 de noviembre de 2001, en trámite junto con la presente) se proporcionan o son bien conocidos métodos para aislar y cultivar estos tipos celulares. Por supuesto, también se pueden usar otros tipos de inmunocitos que se desgranulan con la activación de la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI, incluyendo, por ejemplo,
eosinófilos.
Como reconocerán los expertos, el mediador o agente cuantificado no es crítico. El único requisito es que sea un mediador o agente liberado y/o sintetizado como consecuencia de la iniciación o activación de la cascada de señalización de receptores Fc. Por ejemplo, haciendo referencia a la Fig. 1, la activación de la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI en mastocitos y/o basófilos conduce a numerosos sucesos aguas abajo. Por ejemplo, la activación de la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI conduce a la liberación inmediata (es decir, en 1-3 min. tras la activación del receptor) de una variedad de mediadores químicos preformados y agentes vía la desgranulación. De este modo, en una realización, el mediador o agente cuantificado puede ser específico para gránulos (es decir, presente en gránulos pero no en el citoplasma celular de forma general). Ejemplos de mediadores o agentes específicos de gránulos que se pueden cuantificar para determinar y/o confirmar la actividad de un compuesto de 2,4-pirimidindiamina de la invención incluyen, pero no se limitan a, enzimas específicas de gránulos tales como hexosaminidasa y triptasa, y componentes específicos de gránulos tales como histamina y serotonina. Los ensayos para cuantificar tales factores son bien conocidos, y en muchos casos están comercialmente disponibles. Por ejemplo, la liberación de triptasa y/o hexosaminidasa se puede cuantificar incubando las células con sustratos escindibles que fluorescen al escindirse, y cuantificando la cantidad de fluorescencia producida, usando técnicas convencionales. Tales sustratos fluorógenos escindibles están comercialmente disponibles. Por ejemplo, para cuantificar la cantidad de triptasa liberada, se pueden usar los sustratos fluorógenos Z-Gly-Pro-Arg-AMC (Z=benciloxicarbonilo; AMC=7-amino-4-metilcumarina; BIOMOL Research Laboratories, Inc., Plymouth Meeting, PA 19462, número de catalágo P-142) y Z-Ala-Lys-Arg-AMC (Enzyme Systems Products, una división de ICN Biomedicals, Inc., Livermore, CA 94550, número de catalágo AMC-246). El sustrato fluorógeno 4-metilumbeliferil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida (Sigma, St. Louis, MO, Catálogo #69585) se puede usar para cuantificar la cantidad de hexosaminidasa liberada. La liberación de histamina se puede cuantificar usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) comercialmente disponible, tal como el ensayo ELISA #IM2015 de histamina de Inmunotech (Beckman-Coulter, Inc.). En la sección de Ejemplos se proporcionan métodos específicos para cuantificar la liberación de triptasa, hexosaminidasa e histamina. Cualquiera de estos ensayos se puede usar para determinar o confirmar la actividad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la
invención.
Haciendo referencia nuevamente a la Fig. 1, la desgranulación es solamente una de varias respuestas iniciadas por la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI. Además, la activación de esta ruta de señalización conduce a la síntesis de novo y liberación de citocinas y quimiocinas tales como IL-4, IL-5, IL-6, TNF-\alpha, IL-13 y MIP1-\alpha, y la liberación de mediadores lipídicos tales como leucotrienos (por ejemplo, LTC4), factor activador de plaquetas (PAF) y prostaglandinas. En consecuencia, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención también se pueden evaluar para determinar la actividad cuantificando la cantidad de uno o más de estos mediadores liberados y/o sintetizados por células
activadas.
A diferencia de los componentes específicos de gránulos explicados anteriormente, estos mediadores de "etapa tardía" no se liberan inmediatamente tras la activación de la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI. En consecuencia, cuando se cuantifican estos mediadores de etapa tardía, se debería tener cuidado para asegurarse de que el cultivo celular activado se incuba durante un tiempo suficiente para dar como resultado la síntesis (si es necesario) y liberación del mediador que se está cuantificando. Generalmente, PAF y los mediadores lipídicos tales como leucotrieno C4 se liberan 3-30 min. tras la activación de Fc\varepsilonRI. Las citocinas y otros mediadores de etapa tardía se liberan aprox. 4-8 h tras la activación de Fc\varepsilonRI. Los tiempos de incubación adecuados para un mediador específico serán manifiestos para los expertos en la técnica. En la sección de Ejemplos se proporciona una guía específica y ensayos.
La cantidad de un mediador particular de etapa tardía liberado se puede cuantificar usando cualquier técnica estándar. En una realización, la cantidad o cantidades se pueden cuantificar usando ensayos ELISA. Los kits de ensayo ELISA adecuados para cuantificar la cantidad de TNF\alpha, IL-4, IL-5, IL-6 y/o IL-13 liberados están disponibles en, por ejemplo, Biosource International, Inc., Camarillo, CA 93012 (véase, por ejemplo, los números de catálogo KHC3011, KHC0042, KHC0052, KHC0061 y KHC0132). Los kits de ensayo ELISA adecuados para cuantificar la cantidad de leucotrieno C4 (LTC4) liberado de las células están disponibles en Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI 48108 (véase, por ejemplo, número de catalágo 520211).
Típicamente, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina activos de la invención presentarán IC_{50} con respecto a la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI y/o la liberación o síntesis de mediadores de alrededor de 20 \muM o menor, según se mide en un ensayo in vitro, tal como uno de los ensayos in vitro descritos anteriormente o en la sección de Ejemplos. Por supuesto, los expertos apreciarán que compuestos que presentan IC_{50} menores, por ejemplo del orden de 10 \muM, 1 \muM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, o incluso menores, son particularmente útiles.
Los expertos también apreciarán que los diversos mediadores explicados anteriormente pueden inducir diferentes efectos adversos o mostrar diferentes potencias con respecto al mismo efecto adverso. Por ejemplo, el mediador lipídico LTC4 es un potente vasoconstrictor - es aproximadamente 1000 veces más potente induciendo la vasoconstricción que la histamina. Como otro ejemplo, además de mediar reacciones de hipersensibilidad atópica o de tipo I, las citocinas también pueden provocar remodelación tisular y proliferación celular. De este modo, aunque los compuestos que inhiben la liberación y/o síntesis de uno cualquiera de los mediadores químicos explicados previamente son útiles, los expertos apreciarán que los compuestos que inhiben la liberación y/o la síntesis de una pluralidad de, o de incluso todos, los mediadores previamente descritos encuentran uso particular, ya que tales compuestos son útiles para mejorar o evitar completamente una pluralidad de, o incluso todos, los efectos adversos inducidos por los mediadores particulares. Por ejemplo, los compuestos que inhiben la liberación de los tres tipos de mediadores -específicos de gránulos, lipídicos y de citocinas- son útiles para tratar o prevenir reacciones de hipersensibilidad de tipo I inmediata, así como los síntomas crónicos asociados con ellas.
Los compuestos de la invención capaces de inhibir la liberación de más de un tipo de mediador (por ejemplo, específico de gránulos o de etapa tardía) se pueden identificar determinando la IC_{50} con respecto a un mediador representante de cada clase usando los diversos ensayos in vitro descritos anteriormente (u otros ensayos in vitro equivalentes). Los compuestos de la invención que son capaces de inhibir la liberación de más de un tipo de mediador mostrarán típicamente una IC_{50} para cada tipo de mediador ensayado de menos de alrededor de 20 \muM. Por ejemplo, un compuesto que muestra una IC_{50} de 1 \muM con respecto a la liberación de histamina (IC_{50}^{histamina}) y una IC_{50} de 1 nM con respecto a la síntesis y/o liberación de LTC4 (IC_{50}^{LTC4}) inhibe la liberación de mediadores tanto inmediatos (específicos de gránulos) como de etapa tardía. Como otro ejemplo específico, un compuesto que muestra una IC_{50}^{triptasa} de 10 \muM, una IC_{50}^{LTC4} de 1 \muM y una IC_{50}^{IL-4} de 1 \muM inhibe la liberación de mediadores inmediatos (específicos de gránulos), lipídicos y de citocinas. Aunque los ejemplos específicos anteriores utilizan las IC_{50} de un mediador representante de cada clase, los expertos apreciarán que se pueden obtener las IC_{50} de una pluralidad, o incluso de todos, los mediadores que comprenden una o más de las clases. La cantidad o cantidades e identidad o identidades de mediadores para los cuales se deberían de averiguar los datos de IC_{50} para un compuesto y aplicación particulares serán manifiestas para los expertos en la técnica.
Se pueden utilizar ensayos similares para confirmar la inhibición de cascadas de transducción de señales iniciadas por otros receptores Fc, tales como la señalización de Fc\alphaRI, Fc\gammaRI y/o Fc\gammaRIII, con modificación habitual. Por ejemplo, la capacidad de los compuestos para inhibir la transducción de señales de Fc\gammaRI se puede confirmar en ensayos similares a los descritos anteriormente, con la excepción de que la cascada de señalización de Fc\gammaRI se activa, por ejemplo, incubando las células con IgG y un alérgeno o anticuerpo específico de IgG, en lugar de IgE y un alérgeno o anticuerpo específico de IgE. Los tipos celulares adecuados, agentes activantes y agentes para cuantificar y confirmar la inhibición de otros receptores Fc, tales como receptores Fc que comprenden un homodímero gamma, serán manifiestos para los expertos en la técnica.
Una clase particularmente útil de compuestos incluye aquellos compuestos de 2,4-pirimidindiamina que inhiben la liberación de mediadores inmediatos específicos de gránulos y mediadores de etapa tardía con IC_{50}^{s} aproximadamente equivalentes. Por aproximadamente equivalente se quiere decir que las IC_{50}^{s} para cada tipo de mediador están dentro de alrededor de un intervalo de 10 veces uno del otro. Otra clase particularmente útil de compuestos incluye aquellos compuestos de 2,4-pirimidindiamina que inhiben la liberación de mediadores inmediatos específicos de gránulos, mediadores lipídicos y mediadores de citocinas con IC_{50}^{s} aproximadamente equivalentes. En una realización específica, tales compuestos inhiben la liberación de los siguientes mediadores con IC_{50}^{s} aproximadamente equivalentes: histamina, triptasa, hexosaminidasa, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF\alpha y LTC4. Tales compuestos son particularmente útiles para, entre otros, mejorar o evitar completamente las respuestas tanto de etapa temprana como de etapa tardía asociadas con reacciones de hipersensibilidad atópica o inmediata de tipo I.
Idealmente, la capacidad para inhibir la liberación de todos los tipos deseados de mediadores residirá en un único compuesto. Sin embargo, también se pueden identificar mezclas de compuestos que logren el mismo resultado. Por ejemplo, se puede usar un primer compuesto que inhibe la liberación de mediadores específicos de gránulos en combinación con un segundo compuesto que inhibe la liberación y/o síntesis de mediadores de citocinas.
Además de las rutas de desgranulación de Fc\varepsilonRI o Fc\gammaRI explicadas anteriormente, la desgranulación de mastocitos y/o basófilos puede ser inducida por otros agentes. Por ejemplo, la ionomicina, un ionóforo del calcio que evita la maquinaria de transducción de señales de Fc\varepsilonRI o Fc\gammaRI temprana de la célula, induce directamente un flujo de calcio que dispara la desgranulación. Haciendo referencia nuevamente a la Fig. 2, PLC\gamma activada inicia rutas que conducen, entre otros, a la movilización del ión calcio y la desgranulación subsiguiente. Como se ilustra, esta movilización de Ca^{2+} es disparada tardíamente en la ruta de transducción de señales de Fc\varepsilonRI. Como se mencionó anteriormente, y como se ilustra en la Fig. 3, la ionomicina induce directamente la movilización de Ca^{2+} y un flujo de Ca^{2+} que conduce a la desgranulación. Otros ionóforos que inducen la desgranulación de esta manera incluyen A23187. La capacidad de los ionóforos inductores de la granulación, tales como la ionomicina, para evitar las etapas tempranas de las cascadas de señalización de Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI se puede usar como una contraidentificación para identificar compuestos activos de la invención que ejercen específicamente su actividad inhibidora de la desgranulación bloqueando o inhibiendo las cascadas de señalización de Fc\varepsilonRI o Fc\gammaRI tempranas, como se explica anteriormente. Los compuestos que inhiben específicamente tal desgranulación temprana mediada por Fc\varepsilonRI o Fc\gammaRI inhiben no sólo la desgranulación y la subsiguiente liberación rápida de histamina, triptasa y otros contenidos de gránulos, sino también inhiben las rutas de activación proinflamatorias que provocan la liberación de TNF\alpha, IL-4, IL-13 y los mediadores lipídicos tales como LTC4. De este modo, los compuestos que inhiben específicamente tal desgranulación temprana mediada por Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI bloquean o inhiben no sólo reacciones agudas de hipersensibilidad atópica o de tipo I, sino también las respuestas tardías que implican múltiples mediadores inflama-
torios.
Los compuestos de la invención que inhiben específicamente la desgranulación temprana mediada por Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI son aquellos compuestos que inhiben la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI (por ejemplo, tienen una IC_{50} menor que alrededor de 20 \muM con respecto a la liberación de un mediador o componente específico de gránulos según se mide en un ensayo in vitro con células estimuladas con un agente de unión a IgE o IgG) pero que no inhiben apreciablemente la desgranulación inducida por ionóforos. En una realización, se considera que los compuestos no inhiben apreciablemente la desgranulación inducida por ionóforos si muestran una IC_{50} de la desgranulación inducida por ionóforos mayor que alrededor de 20 \muM, según se mide en un ensayo in vitro. Por supuesto, los compuestos activos que muestran IC_{50}^{s} incluso mayores de la desgranulación inducida por ionóforos, o que no inhiben en absoluto la desgranulación inducida por ionóforos, son particularmente útiles. En otra realización, se considera que los compuestos no inhiben apreciablemente la desgranulación inducida por ionóforos si muestran una diferencia mayor de 10 veces en sus IC_{50}^{s} de la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI y la desgranulación inducida por ionóforos, según se mide en un ensayo in vitro. Los ensayos adecuados para determinar la IC_{50} de la desgranulación inducida por ionóforos incluyen cualquiera de los ensayos de desgranulación descritos previamente, con la modificación de que las células son estimuladas o activadas con un ionóforo del calcio inductor de la desgranulación, tal como ionomicina o A23187 (A.G. Scientific, San Diego, CA) en lugar de anticuerpos anti-IgE o un alérgeno específico de IgE. En la sección de Ejemplos se proporcionan ensayos específicos para evaluar la capacidad de un compuesto de 2,4-pirimidindiamina particular de la invención para inhibir la desgranulación inducida por
ionóforos.
Como reconocerán los expertos, los compuestos que muestran un grado elevado de selectividad por la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI encuentran uso particular, puesto que tales compuestos se dirigen selectivamente hacia la cascada de Fc\varepsilonRI y no interfieren con otros mecanismos de la desgranulación. De forma similar, los compuestos que muestran un grado elevado de selectividad por la desgranulación mediada por Fc\gammaRI encuentran uso particular, puesto que tales compuestos seleccionan selectivamente la cascada de Fc\gammaRI y no interfieren con otros mecanismos de la desgranulación. Los compuestos que muestran un grado elevado de selectividad son generalmente 10 veces o más selectivos para la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI o Fc\gammaRI con respecto a la desgranulación inducida por ionóforos, tal como la desgranulación inducida por ionomicina.
Los datos bioquímicos y otros datos confirman que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aquí son potentes inhibidores de la actividad de Syk cinasa. Por ejemplo, en experimentos con una Syk cinasa aislada, de veinticuatro compuestos de 2,4-pirimidindiamina ensayados, todos menos dos inhibieron la fosforilación, catalizada por Syk cinasa, de un sustrato peptídico, con IC50s en el intervalo submicromolar. Los compuestos restantes inhibieron la fosforilación en el intervalo micromolar. Además, de dieciséis compuestos ensayados en un ensayo in vitro con mastocitos, todos inhibieron la fosforilación de sustratos de Syk cinasa (por ejemplo, PLC-gammaI, LAT) y proteínas aguas abajo de Syk cinasa (por ejemplo, JNK, p38, Erk1/2 y PKB, cuando se ensayaron), pero no proteínas aguas arriba de Syk cinasa en la cascada (por ejemplo, Lyn). La fosforilación de los sustratos de Lyn no se inhibió por los compuestos de 2,4-pirimidindiamina ensayados. Además, para los siguientes compuestos, se observó una elevada correlación entre su inhibición de la actividad de Syk cinasa en ensayos bioquímicos (IC_{50} en el intervalo de 3 a 1850 nM) y su inhibición de la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI en mastocitos (IC_{50} en el intervalo de 30 a 1650 nM): R950373, R950368, R921302, R945371, R945370, R945369, R945365, R921304, R945140, R945071, R940358, R940353, R940352, R940351, R940350, R940347, R921303, R940338, R940323, R940290, R940277, R940276, R940275, R940269, R940255, R935393, R935372, R935366, R935310, R935309, R935307, R935304, R935302, R935293, R935237, R935198, R935196, R935194, R935193, R935191, R935190, R935138, R927050, R926968, R926956, R926931, R926891, R926839, R926834, R926816, R926813, R926791, R926782, R926780, R926757, R926753, R926745, R926715, R926508, R926505, R926502, R926501, R926500, R921218, R921147, R920410, R909268, R921219, R908712, R908702.
En consecuencia, la actividad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención también se puede confirmar en ensayos bioquímicos o celulares de la actividad de Syk cinasa. Haciendo referencia nuevamente a la Fig.2, en la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI en mastocitos y/o basófilos, Syk cinasa fosforila LAT y PLC-gammaI, lo que conduce, entre otros, a la desgranulación. Cualquiera de estas actividades se puede usar para confirmar la actividad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención. En una realización, la actividad se confirma poniendo en contacto una Syk cinasa aislada, o un fragmento activo de la misma, con un compuesto de 2,4 pirimidindiamina en presencia de un sustrato de Syk cinasa (por ejemplo, un péptido sintético o una proteína que se sabe que es fosforilada por Syk en una cascada de señalización) y evaluando si la Syk cinasa fosforiló el sustrato. Como alternativa, el ensayo se puede llevar a cabo con células que expresan una Syk cinasa. Las células pueden expresar endógenamente la Syk cinasa, o se pueden manipular mediante ingeniería genética para que expresen una Syk cinasa recombinante. Las células pueden opcionalmente expresar también el sustrato de Syk cinasa. Las células adecuadas para llevar a cabo tales ensayos de confirmación, así como los métodos de manipulación mediante ingeniería genética de células adecuadas, serán manifiestos para los expertos en la técnica. En la sección de Ejemplos se proporcionan ejemplos específicos de ensayos bioquímicos y celulares adecuados para confirmar la actividad de los compuestos de 2,4-pirimidin-
diamina.
Generalmente, los compuestos que son inhibidores de Syk cinasa mostrarán una IC_{50} con respecto a una actividad de Syk cinasa, tal como la capacidad de Syk cinasa para fosforilar un sustrato sintético o endógeno, en un ensayo in vitro o celular en el intervalo de alrededor de 20 \muM o menos. Los expertos apreciarán que los compuestos que muestran IC_{50} menores, tales como en el intervalo de 10 \muM, 1 \muM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, o incluso menores, son particularmente útiles.
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6.5 Usos y Composiciones
Como se ha explicado previamente, los compuestos activos de la invención inhiben las cascadas de señalización de los receptores Fc, especialmente aquellos receptores Fc que incluyen un homodímero gamma, tales como las cascadas de señalización de Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI, que conducen, entre otros, a la liberación y/o síntesis de mediadores químicos desde las células, ya sea vía desgranulación u otros procesos. Como también se ha explicado, los compuestos activos también son inhibidores potentes de Syk cinasa. Como consecuencia de estas actividades, los compuestos activos de la invención se pueden usar en una variedad de contextos in vitro, in vivo y ex vivo para regular o inhibir Syk cinasa, cascadas de señalización en las que Syk cinasa desempeña un papel, cascadas de señalización de receptores Fc, y las respuestas biológicas provocadas por tales cascadas de señalización. Por ejemplo, en una realización, los compuestos se pueden usar para inhibir Syk cinasa, ya sea in vitro o in vivo, en virtualmente cualquier tipo celular que exprese Syk cinasa. También se pueden usar para regular cascadas de transducción de señales en las que Syk cinasa desempeña un papel. Tales cascadas de transducción de señales dependientes de Syk incluyen, pero no se limitan a, las cascadas de transducción de señales de Fc\varepsilonRI, Fc\gammaRI, Fc\gammaRIII, BCR e integrina. Los compuestos también se pueden usar in vitro o in vivo para regular, y en particular inhibir, respuestas celulares o biológicas provocadas por tales cascadas de transducción de señales dependientes de Syk. Tales respuestas celulares o biológicas incluyen, pero no se limitan a, estallido respiratorio, adhesión celular, desgranulación celular, diseminación celular, migración celular, agregación celular, fagocitosis, síntesis y liberación de citocinas, maduración celular y flujo de Ca^{2+}. De forma importante, los compuestos se pueden usar para inhibir in vivo Syk cinasa como un enfoque terapéutico para el tratamiento o prevención de enfermedades mediadas, ya sea totalmente o en parte, por una actividad de Syk cinasa. Los ejemplos no limitantes de enfermedades mediadas por Syk cinasa que se pueden tratar o prevenir con los compuestos son aquellas explicadas con más detalle a continuación.
En otra realización, los compuestos activos se pueden usar para regular o inhibir las cascadas de señalización de los receptores Fc y/o la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI como un enfoque terapéutico para el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizada por, provocadas por y/o asociadas con la liberación o síntesis de mediadores químicos de tales cascadas de señalización de receptores Fc o de tal desgranulación. Tales tratamientos se pueden administrar a animales en contextos veterinarios, o a seres humanos. Las enfermedades que se caracterizan por, que están provocadas por o que están asociadas con tal liberación, síntesis o desgranulación de mediadores, y que por lo tanto se pueden tratar o prevenir con los compuestos activos, incluyen, a título de ejemplo y no de limitación, reacciones alérgicas o de hipersensibilidad anafiláctica o atópicas, alergias (por ejemplo, conjuntivitis alérgica, rinitis alérgica, asma atópica, dermatitis atópica y alergias a alimentos), cicatrización de bajo grado (por ejemplo, de esclerodermia, fibrosis incrementada, queloides, cicatrices post-quirúrgicas, fibrosis pulmonar, espasmos vasculares, migraña, lesión por reperfusión y post-infarto de miocardio), enfermedades asociadas con destrucción de tejido (por ejemplo, COPD, cardiobronquitis y post-infarto de miocardio), enfermedades asociadas con inflamación tisular (por ejemplo, síndrome irritable del intestino, colon espástico y enfermedad inflamatoria del intestino), inflamación y
cicatrización.
Además de la miríada de enfermedades explicadas anteriormente, los datos empíricos celulares y de animales confirman que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aquí son también útiles para el tratamiento o prevención de enfermedades autoinmunitarias, así como los diversos síntomas asociados con tales enfermedades. Los tipos de enfermedades autoinmunitarias que se pueden tratar o prevenir con los compuestos de 2,4-pirimidindiamina generalmente incluyen aquellos trastornos que implican lesión tisular que se produce como resultado de una respuesta humoral y/o mediada por células a inmunógenos o antígenos de origen endógeno y/o exógeno. Tales enfermedades se denominan frecuentemente como enfermedades que implican reacciones de hipersensibilidad no anafiláctica (es decir, tipo II, tipo III y/o tipo IV).
Como se ha explicado previamente, las reacciones de hipersensibilidad de tipo I generalmente resultan de la liberación de sustancias farmacológicamente activas, tales como histamina, a partir de mastocitos y/o basófilos tras el contacto con un antígeno exógeno específico. Como se ha mencionado anteriormente, tales reacciones de tipo I desempeñan un papel en numerosas enfermedades, incluyendo asma alérgica, rinitis alérgica, etc.
Las reacciones de hipersensibilidad de tipo II (también denominadas como reacciones de hipersensibilidad citotóxica, citolítica dependiente del complemento o estimulante de células) se producen cuando las inmunoglobulinas reaccionan con componentes antigénicos de células o tejido, o con un antígeno o hapteno que se ha acoplado íntimamente a las células o tejido. Las enfermedades que están asociadas habitualmente con reacciones de hipersensibilidad de tipo II incluyen, pero no se limitan a, anemia hemolítica autoinmunitaria, eritroblastosis fetal y enfermedad de Goodpasture.
Las reacciones de hipersensibilidad de tipo III (también denominadas como reacciones de hipersensibilidad a complejos tóxicos, a complejos solubles, o a complejos inmunitarios) resultan de la deposición de complejos circulantes solubles de antígeno-inmunoglobulina en vasos o en tejidos, con reacciones inflamatorias agudas concomitantes en el sitio de la deposición del complejo inmunitario. Los ejemplos no limitantes de enfermedades de reacción de tipo III prototípicas incluyen la reacción de Arthus, artritis reumatoide, enfermedad del suero, lupus eritematoso sistémico, ciertos tipos de glomerulonefritis, esclerosis múltiple, y penfigoide ampolloso.
Las reacciones de hipersensibilidad de tipo IV (frecuentemente denominadas reacciones de hipersensibilidad celular, mediada por células, retrasada, o de tipo tuberculina) son provocadas por linfocitos T sensibilizados que resultan del contacto con un antígeno específico. Los ejemplos no limitantes de enfermedades citadas que impliquen reacciones de tipo IV son dermatitis de contacto y rechazo de aloinjerto.
Las enfermedades autoinmunitarias asociadas con cualquiera de las reacciones anteriores de hipersensibilidad no anafiláctica se pueden tratar o prevenir con los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención. En particular, los métodos se pueden usar para tratar o prevenir aquellas enfermedades autoinmunitarias caracterizadas frecuentemente como trastornos autoinmunitarios de un solo órgano o de un solo tipo de células, incluyendo, pero sin limitarse a: tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica autoinmunitaria, gastritis atrófica autoinmunitaria de anemia perniciosa, encefalomielitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, enfermedad de Goodpasture, trombocitopenia autoinmunitaria, oftalmia simpática, miastenia grave, enfermedad de Graves, cirrosis biliar primaria, hepatitis agresiva crónica, colitis ulcerosa y glomerulopatía membranosa, así como aquellas enfermedades autoinmunitarias caracterizadas frecuentemente por implicar un trastorno autoinmunitario sistémico, que incluyen, pero no se limitan a, lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, síndrome de Reiter, polimiositis-dermatomiositis, esclerosis sistémica, panarteritis nudosa, esclerosis múltiple y penfigoide
ampolloso.
Los expertos en la técnica apreciarán que muchas de las enfermedades autoinmunitarias enumeradas anteriormente están asociadas con síntomas graves, cuya mejora proporciona un beneficio terapéutico significativo incluso en casos en los que la enfermedad autoinmunitaria subyacente no se puede mejorar. Muchos de estos síntomas, así como sus estados mórbidos subyacentes, resultan como consecuencia de la activación de la cascada de señalización de Fc\gammaR en monocitos. Puesto que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aquí son potentes inhibidores de tal señalización de Fc\gammaR en monocitos y en otras células, los métodos encuentran uso en el tratamiento y/o prevención de una miríada de síntomas adversos asociados con las enfermedades autoinmunitarias enumeradas
anteriormente.
Como un ejemplo específico, la artritis reumatoide (RA) típicamente da como resultado hinchamiento, dolor, pérdida de movimiento y dolor por palpación de las articulaciones diana por todo el cuerpo. La RA se caracteriza por un sinovio crónicamente inflamado que está densamente poblado con linfocitos. La membrana sinovial, que es típicamente una gruesa capa celular, se hace enormemente celular y toma una forma similar a tejido linfoide, incluyendo células dendríticas, células T, B y NK, macrófagos y racimos de células plasmáticas. Este proceso, así como una plétora de mecanismos inmunopatológicos que incluyen la formación de complejos de antígeno-inmunoglobulina, eventualmente da como resultado la destrucción de la integridad de la articulación, dando como resultado deformidad, pérdida permanente de función y/o erosión ósea en o cerca de la articulación. Los métodos se pueden usar para tratar o mejorar uno cualquiera, varios o todos estos síntomas de RA. De este modo, en el contexto de RA, se considera que los métodos proporcionan beneficio terapéutico (explicado más generalmente, más abajo) cuando se logra una reducción o mejora de cualquiera de los síntomas asociados habitualmente con RA, independientemente de si el tratamiento da como resultado un tratamiento concomitante de la RA subyacente y/o una reducción en la cantidad de factor reumatoide ("RF") circulante.
Como otro ejemplo específico, el lupus eritematoso sistémico ("SLE") está asociado típicamente con síntomas tales como fiebre, dolor de la articulación (artralgias), artritis, y serositis (pleuresía o pericarditis). En el contexto de SLE, se considera que los métodos proporcionan beneficio terapéutico cuando se logra una reducción o mejora de cualquiera de los síntomas asociados habitualmente con SLE, independientemente de si el tratamiento da como resultado un tratamiento concomitante del SLE subyacente.
Como otro ejemplo específico, la esclerosis múltiple ("MS") deja lisiado al paciente perturbando la agudeza visual; estimulando la doble visión; perturbando las funciones motoras que afectan al andar y al uso de las manos; produciendo incontinencia del intestino y de la vejiga; espasticidad; y carencias sensoriales (tacto, dolor y sensibilidad a la temperatura). En el contexto de MS, se considera que los métodos proporcionan beneficio terapéutico cuando se logra una mejora o una reducción en la progresión de uno cualquiera o más de los efectos lisiantes asociados habitualmente con MS, independientemente de si el tratamiento da como resultado un tratamiento concomitante de la MS
subyacente.
Cuando se usan para tratar o prevenir tales enfermedades, los compuestos activos se pueden administrar de forma individual, como mezclas de uno o más compuestos activos, o en mezcla o combinación con otros agentes útiles para tratar tales enfermedades y/o los síntomas asociados con tales enfermedades. Los compuestos activos también se pueden administrar en mezcla o en combinación con agentes útiles para tratar otros trastornos o enfermedades, tales como esteroides, estabilizadores de la membrana, inhibidores de SLO, inhibidores de la síntesis y de receptores de leucotrienos, inhibidores del cambio del isotipo de IgE o de la síntesis de IgE, del cambio del isotipo de IgG o de la síntesis de IgG, \beta-agonistas, inhibidores de triptasa, aspirina, inhibidores de COX, metotrexato, fármacos anti-TNF, retoxina, inhibidores de PD4, inhibidores de p38, inhibidores de PDE4, y antihistaminas, por nombrar unos pocos. Los compuestos activos se pueden administrar per se en forma de profármacos o como composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto activo o profármaco.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos activos de la invención (o sus profármacos) se pueden fabricar por medio de procesos convencionales de mezclamiento, disolución, granulación, levigación obteniendo una gragea, emulsionamiento, encapsulamiento, atrapamiento o liofilización. Las composiciones se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se puedan usar farmacéuticamente.
El compuesto activo o profármaco se puede formular en la composición farmacéutica per se, o en forma de un hidrato, solvato, N-óxido o sal farmacéuticamente aceptable, como se describe previamente. Típicamente, tales sales son más solubles en disoluciones acuosas que los ácidos y bases libres correspondientes, pero también se pueden formar sales que tienen una solubilidad menor que los ácidos y bases libres correspondientes.
Las composiciones farmacéuticas pueden tomar una forma adecuada para virtualmente cualquier modo de administración, incluyendo, por ejemplo, tópica, ocular, oral, bucal, sistémica, nasal, inyección, transdérmica, rectal, vaginal, etc., o una forma adecuada para la administración mediante inhalación o insuflamiento.
Para administración tópica, el (o los) compuesto(s) activo(s) o profármaco(s) se puede(n) formular como disoluciones, geles, ungüentos, cremas, suspensiones, etc., como es bien conocido en la técnica.
Las formulaciones sistémicas incluyen aquellas diseñadas para la administración mediante inyección, por ejemplo inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal, así como aquellas diseñadas para la administración transdérmica, transmucosal, oral o pulmonar.
Las preparaciones inyectables útiles incluyen suspensiones, disoluciones o emulsiones estériles del compuesto o compuestos activos en vehículos acuosos u oleosos. Las composiciones también pueden contener agentes de formulación, tales como un agente de suspensión, un agente estabilizante y/o un agente dispersante. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo en ampollas o en recipientes de múltiples dosis, y pueden contener conservantes añadidos.
Como alternativa, la formulación inyectable se puede proporcionar en forma de polvo para la reconstitución con un vehículo adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, agua estéril libre de pirógenos, tampón, disolución de dextrosa, etc., antes del uso. Para este fin, el compuesto o compuestos activos se pueden secar mediante cualquier técnica conocida en la técnica, tal como liofilización, y se pueden reconstituir antes del uso.
Para la administración transmucosal, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera a permear. Tales penetrantes son conocidos en la técnica.
Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas, comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina, o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); agentes disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de almidón sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos se pueden revestir mediante métodos bien conocidos en la técnica con, por ejemplo, azúcares, películas o revestimientos entéricos. Los compuestos que son particularmente adecuados para administración oral incluyen compuestos R940350, R935372, R935193, R927050 y R935391.
Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, elixires, disoluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Tales preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico, cremophore^{TM} o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo, o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener tampones, sales, conservantes, saborizantes, colorantes y agentes edulcorantes, según sea
apropiado.
Las preparaciones para administración oral se pueden formular de forma adecuada para dar una liberación controlada del compuesto activo o profármaco, como es bien conocido.
Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o tabletas formulados de manera convencional.
Para las rutas de administración rectal y vaginal, el compuesto o compuestos activos se pueden formular como disoluciones (para enemas de retención), supositorios o ungüentos que contienen bases convencionales para supositorios, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Para la administración nasal o la administración mediante inhalación o insuflamiento, el (o los) compuesto(s) activo(s) o profármaco(s) se puede(n) suministrar convenientemente en forma de una pulverización en aerosol a partir de envases a presión o un nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, fluorocarbonos, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a presión, la dosis unitaria se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos para uso en un inhalador o insuflador (por ejemplo, cápsulas y cartuchos compuestos de gelatina) que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Un ejemplo específico de una formulación de suspensión acuosa adecuada para la administración nasal que usa dispositivos de pulverización nasal comercialmente disponibles incluye los siguientes ingredientes: compuesto activo o profármaco (0,5-20 mg/ml); cloruro de benzalconio (0,1-0,2 mg/ml); Polisorbato 80 (TWEEN® 80; 0,5-5 mg/ml); carboximetilcelulosa sódica o celulosa microcristalina (1-15 mg/ml); feniletanol (1-4 mg/ml); y dextrosa (20-50 mg/ml). El pH de la suspensión final se puede ajustar a un intervalo de alrededor de pH 5 a pH 7, siendo típico un pH de alrededor de pH 5,5.
Otro ejemplo específico de una suspensión acuosa adecuada para la administración de los compuestos vía inhalación, y en particular para tal administración del Compuesto R921218, contiene 1-20 mg/ml de Compuesto o profármaco, 0,1-1% (v/v) de Polisorbato 80 (TWEEN® 80), 50 mM de citrato y/o 0,9% de cloruro de sodio.
Para la administración ocular, el (o los) compuesto(s) activo(s) o profármaco(s) se puede(n) formular como una disolución, emulsión, suspensión, etc., adecuada para la administración al ojo. En la técnica se conoce una variedad de vehículos adecuados para administrar compuestos al ojo. Los ejemplos no limitantes específicos se describen en la patente U.S. nº 6.261.547; la patente U.S. nº 6.197.934; la patente U.S. nº 6.056.950; la patente U.S. nº 5.800.807; la patente U.S. nº 5.776.445; la patente U.S. nº 5.698.219; la patente U.S. nº 5.521.222; la patente U.S. nº 5.403.841; la patente U.S. nº 5.077.033; la patente U.S. nº 4.882.150; y la patente U.S. nº 4.738.851.
Para el suministro prolongado, el (o los) compuesto(s) activo(s) o profármaco(s) se puede(n) formular como una preparación de depósito para la administración mediante implante o inyección intramuscular. El ingrediente activo se puede formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados apenas solubles, por ejemplo como una sal apenas soluble. Como alternativa, se pueden usar sistemas de suministro transdérmico fabricados como un disco o parche adhesivo que libera lentamente el (o los) compuesto(s) activo(s) para absorción percutánea. Para esto, se pueden usar potenciadores de la permeación, para facilitar la penetración transdérmica del (o de los) compuesto(s) activo(s). Los parches transdérmicos adecuados se describen, por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.407.713; la patente U.S. nº 5.352.456; la patente U.S. nº 5.332.213; la patente U.S. nº 5.336.168; la patente U.S. nº 5.290.561; la patente U.S. nº 5.254.346; la patente U.S. nº 5.164.189; la patente U.S. nº 5.163.899; la patente U.S. nº 5.088.977; la patente U.S. nº 5.087.240; la patente U.S. nº 5.008.110; y la patente U.S. nº 4.921.475.
Como alternativa, se pueden emplear otros sistemas de suministro farmacéutico. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro que se pueden usar para suministrar compuesto(s) activo(s)
o profármaco(s). También se pueden emplear ciertos disolventes orgánicos, tales como dimetilsulfóxido (DMSO), aunque habitualmente al coste de una mayor toxicidad.
Si se desea, las composiciones farmacéuticas se pueden presentar en un envase o un dispositivo dispensador que puede contener una o más formas farmacéuticas unitarias que contienen el (o los) compuesto(s) activo(s). El envase puede comprender, por ejemplo, una hoja de papel metálico o plástica, tal como un envase de blíster. El envase o dispositivo dispensador puede estar acompañado por instrucciones para la administración.
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6.6 Dosis Eficaces
El (o los) compuesto(s) activo(s) o profármaco(s), o sus composiciones, generalmente se usarán en una cantidad eficaz para lograr el resultado pretendido, por ejemplo en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la enfermedad particular que se esté tratando. El (o los) compuesto(s) se puede(n) administrar terapéuticamente para lograr un beneficio terapéutico, o profilácticamente para lograr un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se quiere decir la erradicación o mejora del trastorno subyacente que se está tratando, y/o la erradicación o mejora de uno o más de los síntomas asociados con el trastorno subyacente, de forma que el paciente informa de una mejora de la sensación o estado, a pesar de que el paciente todavía puede estar padeciendo el trastorno subyacente. Por ejemplo, la administración de un compuesto a un paciente que sufre una alergia proporciona beneficio terapéutico no sólo cuando se erradica o se mejora la respuesta alérgica subyacente, sino también cuando el paciente informa de una disminución de la gravedad o duración de los síntomas asociados con la alergia tras la exposición al alérgeno. Como otro ejemplo, el beneficio terapéutico en el contexto de asma incluye una mejora de la respiración tras el comienzo de un ataque asmático, o una reducción en la frecuencia o gravedad de los episodios asmáticos. El beneficio terapéutico también incluye generalmente detener o ralentizar la progresión de la enfermedad, independientemente de si se obtiene una mejora.
Para la administración profiláctica, el compuesto se puede administrar a un paciente con riesgo de desarrollar una de las enfermedades descritas previamente. Por ejemplo, si se desconoce si un paciente es alérgico a un fármaco particular, el compuesto se puede administrar antes de la administración del fármaco, para evitar o mejorar una respuesta alérgica al fármaco. Como alternativa, se puede aplicar la administración profiláctica, para evitar el comienzo de síntomas en un paciente diagnosticado con el trastorno subyacente. Por ejemplo, un compuesto se puede administrar a un sujeto que padece alergia antes de la exposición esperada al alérgeno. Los compuestos también se pueden administrar profilácticamente a individuos sanos que están expuestos de forma repetida a agentes conocidos de una de las enfermedades descritas anteriormente, para prevenir el comienzo del trastorno. Por ejemplo, se puede administrar un compuesto a un individuo sano que está expuesto repetidamente a un alérgeno que se sabe que induce alergias, tal como látex, en un esfuerzo para prevenir que el individuo desarrolle una alergia. Como alternativa, se puede administrar un compuesto a un paciente que sufre asma antes de llevar a cabo actividades que provocan ataques de asma, para reducir la gravedad de, o evitar del todo, un episodio asmático.
La cantidad de compuesto administrado dependerá de una variedad de factores, incluyendo, por ejemplo, la indicación particular tratada, el modo de administración, si el beneficio deseado es profiláctico o terapéutico, la gravedad de la indicación tratada, y la edad y peso del paciente, la biodisponibilidad del compuesto activo particular, etc. La determinación de una dosis eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica.
Las dosis eficaces se pueden estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, se podría formular una dosis inicial para uso en animales para lograr una concentración circulante en sangre o en suero del compuesto activo que sea o que esté por encima de una IC_{50} del compuesto particular según se mide en un ensayo in vitro, tal como los ensayos de CHMC o BMMC in vitro y otros ensayos in vitro descritos en la sección de Ejemplos. El cálculo de las dosis para lograr tales concentraciones sanguíneas o séricas circulantes, teniendo en cuenta la biodisponibilidad del compuesto particular, está dentro de las capacidades del experto. Para una guía, refiérase el lector a Fingl y Woodbury, "Principios Generales" en: Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Capítulo 1, p. 1-46, última edición, Pergamon Press, y las referencias citadas allí.
Las dosis iniciales también se pueden estimar a partir de datos in vivo, tales como modelos animales. Los modelos animales útiles para ensayar la eficacia de los compuestos para tratar o prevenir las diversas enfermedades descritas anteriormente son bien conocidos en la técnica. Los modelos animales adecuados de reacciones de hipersensibilidad o alérgicas se describen en Foster, 1995, Allergy 50(21 Supl):6-9, discusión 34-38 y Tumas et al., 2001, J. Allergy Clin. Immunol. 107(6):1025-1033. Los modelos animales adecuados de rinitis alérgica se describen en Szelenyi et al., 2000, Arzneimittelforschung 50(11): 1037-42; Kawaguchi et al., 1994, Clin. Exp. Allergy 24(3):238-244 y Sugimoto et al., 2000, Immunopharmacology 48(1):1-7. Los modelos animales adecuados de conjuntivitis alérgica se describen en Carreras et al., 1993, Br. J. Ophthalmol. 77(8):509-514; Saiga et al, 1992, Ophthalmic Res. 24(1):45-50; y Kunert et al., 2001, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42(11):2483-2489. Los modelos animales adecuados de mastocitosis sistémica se describen en O'Keefe et al., 1987, J. Vest. Intern. Med. 1(2):75-80 y Bean Knudsen et al., 1989, Vet. Pathol. 26(1):90-92. Los modelos animales adecuados de síndrome hiper-IgE se describen en Claman et al., 1990, Clin. Immunol. Immunopathol. 56(1):46-53. Los modelos animales adecuados de linfoma de células B se describen en Hough et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13853-13858 y Hakim et al., 1996, J. Immunol. 157(12):5503-5511. Los modelos animales adecuados de trastornos atópicos tales como dermatitis atópica, eccema atópico y asma atópica se describen en Chan et al., 2001, J. Invest. Dermatol. 117(4):977-983 y Suto et al.,1999, Int Arch. Allergy Immunol. 120(Supl:1): 70-75. Los expertos normales pueden adaptar de forma habitual tal información para determinar las dosis adecuadas para la administración a seres humanos. En la Sección de Ejemplos se describen modelos animales adecuados adicionales.
Las cantidades de las dosis estarán típicamente en el intervalo de alrededor de 0,0001 ó 0,001 ó 0,01 mg/kg/día a alrededor de 100 mg/kg/día, pero pueden ser mayores o menores, dependiendo, entre otros factores, de la actividad del compuesto, de su biodisponibilidad, del modo de administración y otros diversos factores explicados anteriormente. La cantidad e intervalo de la dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles plasmáticos del (o de los) compuesto(s) que sean suficientes para mantener el efecto terapéutico o profiláctico. Por ejemplo, los compuestos se pueden administrar una vez por semana, varias veces por semana (por ejemplo, en días alternos), una vez por día o múltiples veces por día, dependiendo, entre otros, del modo de administración, de la indicación específica tratada y de la valoración del médico. En casos de administración local o absorción selectiva, tal como administración tópica local, la concentración local eficaz de (de los) compuesto(s) activo(s) puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Los expertos serán capaces de optimizar las dosis locales eficaces sin experimentación excesiva.
Preferiblemente, el (los) compuesto(s) proporcionará(n) beneficio terapéutico o profiláctico son provocar toxicidad sustancial. La toxicidad del (de los) compuesto(s) se puede determinar usando procedimientos farmacéuticos estándar. La relación de la dosis entre el efecto tóxico y el terapéutico (o profiláctico) es el índice terapéutico. Se prefiere(n) compuesto(s) que muestre(n) índices terapéuticos elevados.
Habiéndose descrito la invención, se ofrecen los siguientes ejemplos a título ilustrativo y no limitativo.
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7. Ejemplos 7.1 Síntesis de Materiales de Partida e Intermedios Útiles para Sintetizar los Compuestos de 2,4-Pirimidindiamina según los Esquemas (I)-(V)
Se preparó como se describe a continuación una variedad de materiales de partida y N4-monosustituida-2-pirimidinaminas y N2-monosustituida-4-pirimidindiaminas [productos de reacción de mono-sustitución nucléofila aromática (SNAR)] útiles para sintetizar los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención según los Esquemas (I)-(V). Las condiciones adecuadas para sintetizar los productos mono-SNAR se ejemplifican con la 2-cloro-N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-4-pirimidinamina (R926087).
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7.5 Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención inhiben la desgranulación mediada por el receptor Fc\varepsilonRI
La capacidad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención para inhibir la desgranulación inducida por IgE se demostró en una variedad de ensayos celulares con mastocitos humanos cultivados (CHMC) y/o células derivadas de médula ósea (BMMC) de ratón. La inhibición de la desgranulación se midió a una densidad celular tanto baja como alta, cuantificando la liberación de los factores triptasa, histamina y hexosaminidasa específicos de gránulos. La inhibición de la liberación y/o síntesis de mediadores lipídicos se evaluó midiendo la liberación de leucotrieno LTC4, y la inhibición de la liberación y/o síntesis de citocinas se monitorizó cuantificando TNF-\alpha, IL-6 e IL-13. La triptasa y hexasaminidasa se cuantificaron usando sustratos fluorógenos como se describe en sus ejemplos respectivos. La histamina, TNF\alpha, IL-6, IL-13 y LTC4 se cuantificaron usando los siguientes kits de ELISA comerciales: histamina (Immunotech #2015, Beckman Coulter), TNF\alpha (Biosource #KHC3011), IL-6 (Biosource #KMC0061), IL-13 (Biosource #KHC0132) y LTC4 (Cayman Chemical #520211). Más abajo se proporcionan los protocolos de los diversos ensayos.
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7.5.1 Cultivo de mastocitos y basófilos Humanos
Los mastocitos y basófilos humanos se cultivaron a partir de células progenitoras negativas para CD34 como se describe más abajo (véanse también los métodos descritos en la Solicitud U.S. Serie nº 10/053.355, presentada el 8 de noviembre de 2001, en trámite junto con la presente, cuya descripción se incorpora aquí como referencia).
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7.5.1.1 Preparación de medio completo STEMPRO-34
Para preparar medio completo ("CM") STEMPRO-34, se añadieron a un matraz de filtro 250 ml de medio libre de suero STEMPRO-34^{TM} ("SFM"; GibcoBRL, número de catálogo 10640). A esto se añadieron 13 ml de suplemento nutriente STEMPRO-34 ("NS"; GibcoBRL, número de catálogo 10641) (preparado como se describe con más detalle, más abajo). El recipiente del NS se enjuagó con aproximadamente 10 ml de SFM, y el enjuague se añadió al matraz de filtro. Tras la adición de 5 ml de L-glutamina (200 mM; Mediatech, número de catálogo MT 25-005-CI) y 5 ml de 100X penicilina/estreptomicina ("pen-estrep"; HyClone, número de catálogo: SV30010), el volumen se llevó hasta 500 ml con SFM, y la disolución se filtró.
El aspecto más variable de la preparación del CM es el método mediante el cual el NS se descongela y se mezcla antes de la adición al SFM. El NS se debería de descongelar en un baño de agua a 37ºC y hacerlo girar en remolinos, sin generar vórtices ni agitarlo, hasta que esté completamente en disolución. Mientras se le hace girar, obsérvese si hay lípidos que no están todavía en disolución. Si hay lípidos y el NS no tiene un aspecto uniforme, devuélvase al baño de agua y repítase el proceso de giro en remolino hasta que tenga un aspecto uniforme. Algunas veces este componente pasa a la disolución inmediatamente, algunas veces después de un par de ciclos de giro en remolino, y algunas veces no lo hace en absoluto. Si, después de un par de horas, el NS todavía no está en disolución, deséchese y descongélese una unidad reciente. No se debería de usar un NS que no parece uniforme después de la desconge-
lación.
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7.5.1.2 Expansión de las células CD34+
Una población de partida de células positivas para CD34 (CD34+) de número relativamente pequeño (1-5 x 10^{6} células) se expandió hasta un número relativamente grande de células progenitoras negativas a CD34 (alrededor de 2-4 x 10^{9} células) usando los medios de cultivo y métodos descritos más abajo. Las células CD34+ (procedentes de un único donante) se obtuvieron de Allcells (Berkeley, CA). Debido a que hay un grado de variación en la calidad y número de células CD34+ que típicamente proporciona Allcells, las células recientemente suministradas se transfirieron a un tubo cónico de 15 ml y se llevaron hasta 10 ml en CM antes del uso.
En el día 0, se llevó a cabo un recuento celular sobre las células viables (fase brillante), y las células se hicieron girar a 1200 rpm hasta un pelete. Las células se resuspendieron hasta una densidad de 275.000 células/ml con CM, que contiene 200 ng/ml de Factor de Célula Madre humano recombinante ("SCF"; Peprotech, número de catálogo 300-07) y 20 ng/ml de ligando flt-3 humano (Peprotech, número de catálogo 300-19) ("medio CM/SCF/flt-3"). En aproximadamente el día 4 ó 5, la densidad del cultivo se comprobó llevando a cabo un recuento celular, y el cultivo se diluyó hasta una densidad de 275.000 células/ml con medio CM/SCF/flt-3 reciente. En aproximadamente el día 7, el cultivo se transfirió a un tubo estéril, y se llevó a cabo un recuento celular. Las células se hicieron girar a 1200 rpm y se resuspendieron hasta una densidad de 275.000 células/ml con medio CM/SCF/flt-3
reciente.
Este ciclo se repitió, comenzando a partir del día 0, un total de 3-5 veces a lo largo del período de expansión.
Cuando el cultivo es grande y se mantiene en múltiples matraces y se va a resuspender, los contenidos de todos los cultivos se combinan en un único recipiente antes de llevar a cabo un recuento celular. Esto asegura que se logre un recuento celular exacto, y proporciona un grado de uniformidad de tratamiento para toda la población. Cada matraz se comprueba separadamente en busca de contaminación bajo el microscopio antes de la combinación, para evitar la contaminación de toda la población.
Entre los días 17-24, el cultivo puede comenzar a decaer (es decir, aproximadamente 5-10% del número total de células muere) y no se expande tan rápidamente como antes. Las células se monitorizan entonces diariamente durante este tiempo, puesto que el fallo completo del cultivo puede tener lugar en un tiempo tan corto como 24 horas. Una vez ha comenzado el decaimiento, las células se recuentan, se hacen girar a 850 rpm durante 15 minutos, y se resuspenden a una densidad de 350.000 células/ml en medio CM/SCF/flt-3, para inducir una o más divisiones de la célula. Las células se monitorizan diariamente para evitar el fallo del cultivo.
Cuando en el cultivo de células progenitoras es evidente una muerte celular mayor de 15% y hay algo de desecho en el cultivo, las células progenitoras negativas para CD34 están listas para ser diferenciadas.
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7.5.1.3 Diferenciación de células progenitoras negativas para CD34 en mastocitos de la mucosa
Se lleva a cabo una segunda fase para convertir las células progenitoras expandidas, negativas para CD34, en mastocitos de la mucosa diferenciados. Estos mastocitos humanos cultivados ("CHMC") de la mucosa derivan de células CD34+, aisladas de sangre del cordón umbilical y tratadas para formar una población proliferada de células progenitoras negativas para CD34, como se describe anteriormente. Para producir las células progenitoras negativas para CD43, el ciclo de resuspensión para el cultivo fue el mismo que el descrito anteriormente, excepto que el cultivo se sembró a una densidad de 425.000 células/ml y se añadió 15% de medio adicional en aproximadamente el cuarto o quinto día sin llevar a cabo un recuento celular. También, la composición de citocinas del medio se modificó de forma que contuviese SCF (200 ng/ml) e IL-6 humana recombinante (200 ng/ml; Peprotech, número de catálogo 200-06, reconstituida hasta 100 ug/ml en ácido acético 10 mM estéril) ("medio CM/SCF/IL-6").
Las Fases I y II juntas duran aproximadamente 5 semanas. Durante las semanas 1-3 es evidente que hay algo de muerte y desechos en el cultivo, y hay un período durante las semanas 2-5 durante el cual un pequeño porcentaje del cultivo ya no está en suspensión, sino que en su lugar está adherido a la superficie de la vasija de cultivo.
Al igual que durante la Fase I, cuando el cultivo se va a resuspender en el séptimo día de cada ciclo, los contenidos de todos los matraces se combinan en un único recipiente antes de llevar a cabo un recuento celular, para asegurar la uniformidad de toda la población. Cada matraz se comprueba separadamente en busca de contaminación bajo el microscopio antes de la combinación, para evitar la contaminación de toda la población.
Cuando los matraces se combinan, aproximadamente el 75% del volumen se transfiere al recipiente común, dejando atrás alrededor de 10 ml, más o menos, en el matraz. El matraz que contiene el volumen que queda se golpeó brusca y lateralmente para descargar las células adheridas. El golpeteo se repitió en un ángulo perpendicular al primer golpeteo, para descargar completamente las células.
El matraz se recostó formando un ángulo de 45 grados durante un par de minutos antes de que el volumen que queda se transfiriese a la vasija de recuento. Las células se hicieron girar a 950 rpm durante 15 minutos antes de sembrar a 35-50 ml por matraz (a una densidad de 425.000 células/ml).
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7.5.1.4 Diferenciación de células progenitoras negativas para CD34 en mastocitos de tipo tejido conjuntivo
Se preparó como antes una población proliferada de células progenitoras negativas para CD34, y se trató para formar un fenotipo positivo para triptasa/quimasa (tejido conjuntivo). Los métodos se llevan a cabo como se describe anteriormente para mastocitos de la mucosa, pero con la sustitución de IL-6 por IL-4 en el medio de cultivo. Las células obtenidas son típicas de mastocitos de tejido conjuntivo.
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7.5.1.5 Diferenciación de células progenitoras negativas para CD34 en basófilos
Se preparó como se describe en la Sección 7.5.1.3, anterior, una población proliferada de células progenitoras negativas para CD34, y se usó para formar una población proliferada de basófilos. Las células negativas para CD34 se tratan como se describe para mastocitos de la mucosa, pero con la sustitución de IL-6 por IL-3 (a 20-50 ng/ml) en el medio de cultivo.
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7.5.2 Activación de baja densidad celular de CHMC con IgE: ensayos de triptasa y LTC4
A placas con fondo en U de 96 pocillos duplicadas (Costar 3799) añádanse 65 ul de diluciones de compuesto o muestras de control que se han preparado en MT [137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl_{2}, 1,0 mM de MgCl_{2}, 5,6 mM de glucosa, 20 mM de Hepes (pH 7,4), 0,1% de seroalbúmina bovina (Sigma A4503)] que contiene 2% de MeOH y 1% de DMSO. Peletícense las células CHMC (980 rpm, 10 min.) y resuspéndanse en MT precalentado. Añádanse 65 ul de células a cada placa de 96 pocillos. Dependiendo de la actividad de la desgranulación para cada donante de CHMC particular, cárguense 1000-1500 células/pocillo. Mézclense cuatro veces, seguido de una incubación durante 1 h a 37ºC. Durante la incubación de 1 h, prepárese una disolución anti-IgE 6X [anticuerpo anti-IgE humana de conejo (1 mg/ml, Bethyl Laboratories A80-109A) diluido 1:167 en tampón MT]. Estimúlense las células añadiendo 25 ul de disolución anti-IgE 6X a las placas apropiadas. Añádanse 25 ul de MT a pocillos de control no estimulados. Mézclese dos veces tras la adición del anti-IgE. Incúbese a 37ºC durante 30 minutos. Durante la incubación de 30 minutos, dilúyase la disolución madre de sustrato de triptasa 20 mM [(Z-Ala-Lys-Arg-AMC2TFA; Enzyme Systems Products, #AMC-246)] 1:2000 en tampón de ensayo de triptasa [0,1 M de Hepes (pH 7,5), 10% p/v de glicerol, 10 uM de heparina (Sigma H-4898), 0,01% de NaN_{3}]. Háganse girar las placas a 1000 rpm durante 10 min. para peletizar las células. Transfiéranse 25 ul del sobrenadante a una placa de fondo negro de 96 pocillos, y añádanse a cada pocillo 100 ul de disolución de sustrato de triptasa recientemente diluida. Incúbense las placas a temperatura ambiente durante 30 min. Léase la densidad óptica de las placas a 355 nm/460 nm en un lector de placas espectrofotométrico.
El leucotrieno C4 (LTC4) también se cuantifica usando un kit de ELISA sobre muestras de sobrenadante apropiadamente diluidas (determinadas empíricamente para cada población celular de donantes de forma que la medición de las muestras cae dentro de la curva patrón) siguiendo las instrucciones del proveedor.
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7.5.3 Activación de densidad celular elevada de CHMC con IgE: Ensayos de desgranulación (triptasa, histamina), leucotrieno (LTC4) y citocina (TNF alfa, IL-13)
Mastocitos humanos cultivados (CHMC) se sensibilizaron durante 5 días con IL-4 (20 ng/ml), SCF (200 ng/ml), IL-6 (200 ng/ml), e IgE humana (CP 1035K de Cortx Biochem, 100-500 ng/ml, dependiendo de la generación) en medio CM. Después de sensibilizarlas, las células se contaron, se peletizaron (1000 rpm, 5-10 minutos), y se resuspendieron a 1-2 x 10^{6} células/ml en tampón MT. Añádanse 100 ul de suspensión celular a cada pocillo, y 100 ul de diluciones de compuesto. La concentración final de vehículo es 0,5% de DMSO. Incúbese a 37ºC (5% de CO_{2}) durante 1 hora. Después de 1 hora de tratamiento con compuesto, estimúlense las células con 6X anti-IgE. Mézclense los pocillos con las células, y déjense incubar las placas a 37ºC (5% de CO_{2}) durante una hora. Después de la incubación durante 1 hora, peletícense las células (10 minutos, 1000 rpm) y recójanse 200 ul por pocillo del sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pelete. Colóquese la placa del sobrenadante sobre hielo. Durante la etapa de 7 horas (véase a continuación), realícese el ensayo de triptasa sobre el nadante que se ha diluido 1:500. Resuspéndase el pelete celular en 240 ul de medio CM que contiene 0,5% de DMSO y una concentración correspondiente de compuesto. Incúbense las células CHMC durante 7 horas a 37ºC (5% de CO_{2}). Tras la incubación, peletícense las células (1000 rpm, 10 minutos) y recójanse 225 ul por pocillo y colóquense en -80ºC hasta que se esté listo para llevar a cabo los ensayos de ELISA. Los ensayos de ELISA se realizan sobre muestras apropiadamente diluidas (determinadas empíricamente para cada población celular de donantes, de forma que la medición de la muestra cae dentro de la curva patrón) según las instrucciones del proveedor.
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7.5.4 Activación de densidad celular elevada de BMMC con IgE: Ensayos de desgranulación (hexosaminidasa, histamina), leucotrieno (LTC4), y citocina (TNF alfa, IL-6) 7.5.4.1 Preparación de medio acondicionado con NMM
El medio acondicionado con WEHI se obtuvo haciendo crecer células mielomonocíticas murinas WEHI-3B (American Type Culture Collection, Rockville, MD) en medio Eagle modificado de Iscove (Mediatech, Hernandon, VA) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS; JRH Biosciences, Kansas City, MO), 50 \muM de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO) y 100 UI/ml de penicilina-estreptomicina (Mediatech) en un incubador con 5% de CO_{2}/95% de aire, humidificado a 37ºC. Se sembró una suspensión celular inicial a 200.000 células/ml, y después se dividió 1:4 cada 3-4 días durante un período de dos semanas. Los sobrenadantes libres de células se cosecharon, se repartieron en alícuotas y se almacenaron a -80ºC hasta que se necesitaron.
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7.5.4.2 Preparación de medio de BMMC
El medio de BMMC consiste en 20% de medio acondicionado con WEHI, 10% de FBS inactivado por calor (JHR Biosciences), 25 mM de HEPES, pH 7,4 (Sigma), 2 mM de L-glutamina (Mediatech), 0,1 mM de aminoácidos no esenciales (Mediatech), 1 mM de piruvato sódico (Mediatech), 50 \muM de 2-mercaptoetanol (Sigma) y 100 UI/ml de penicilina-estreptomicina (Mediatech) en medio RPMI 1640 (Mediatech). Para preparar el medio de BMMC, todos los componentes se añaden a una unidad filtrante de 1 l estéril, y se filtran a través de un filtro de 0,2 \mum antes del
uso.
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7.5.4.3 Protocolo
Mastocitos derivados de médula ósea (BMMC) se sensibilizaron toda la noche con SCF murino (20 ng/ml) y anticuerpo monoclonal anti-DNP (10 ng/ml, Clone SPE-7, Sigma # D-8406) en medio de BMMC a una densidad celular de 666 x 10^{3} células/ml. Después de la sensibilización, las células se contaron, se peletizaron (1000 rpm, 5-10 minutos), y se resuspendieron a 1-3 x 10^{6} células/ml en tampón MT. Añádanse 100 ul de suspensión celular a cada pocillo, y 100 ul de diluciones de compuesto. La concentración final de vehículo es 0,5% de DMSO. Incúbese a 37ºC (5% de CO_{2}) durante 1 hora. Después de 1 hora de tratamiento con compuesto, estimúlense las células con 6X estímulo (60 ng/ml de DNP-BSA). Mézclense los pocillos con las células y déjense incubar las placas a 37ºC (5% de CO_{2}) durante una hora. Después de una incubación de 1 hora, peletícense las células (10 minutos, 1000 rpm) y recójanse 200 ul por pocillo del sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pelete, y transfiéranse a un tubo limpio o a una placa de 96 pocillos. Colóquese la placa con el sobrenadante sobre hielo. Durante la etapa de 4-5 horas (véase a continuación), llévese a cabo el ensayo de hexosaminidasa. Resuspéndase el pelete celular en 240 ul de medio acondicionado con WEHI que contiene 0,5% de DMSO y la concentración correspondiente de compuesto. Incúbense las células BMMC durante 4-5 horas a 37ºC (5% de CO_{2}). Tras la incubación, peletícense las células (1000 rpm, 10 minutos) y recójanse 225 ul por pocillo y colóquense en -80ºC hasta que se esté listo para llevar a cabo los ensayos de ELISA. Los ensayos de ELISA se realizan sobre muestras apropiadamente diluidas (determinadas empíricamente para cada población celular de donantes, de forma que la medición de la muestra cae dentro de la curva patrón) siguiendo las instrucciones del proveedor.
Ensayo de hexosaminidasa: en una placa de ensayo de 96 pocillos negra sólida, añádanse 50 ul de sustrato de hexosaminidasa (4-metilumbeliferil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida; 2 mM) a cada pocillo. Añádanse 50 ul de sobrenadante celular de BMMC (véase anteriormente) a los sustratos de hexosaminidasa, colóquense a 37ºC durante 30 minutos y léase la placa a 5, 10, 15 y 30 minutos en un espectrofotómetro.
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7.5.5 Activación de basófilos con IgE o ácaro del polvo: Ensayo de liberación de histamina
El ensayo de activación de basófilos se llevó a cabo usando sangre periférica humana completa procedente de donantes alérgicos a ácaros del polvo, eliminándose la mayoría de los glóbulos rojos mediante sedimentación con dextrano. La sangre periférica humana se mezcló 1:1 con dextrano T500 al 3%, y los glóbulos rojos (RBC) se dejaron sedimentar durante 20-25 min. La fracción superior se diluyó con 3 volúmenes de D-PBS, y las células se centrifugaron durante 10 min. a 1500 rpm, a temperatura ambiente (RT). El sobrenadante se aspiró, y las células se lavaron en un volumen igual de tampón MT. Finalmente, las células se resuspendieron en tampón MT que contiene 0,5% de DMSO en el volumen de sangre original. Se mezclaron 80 ul de células con 20 ul de compuesto en presencia de 0,5% de DMSO, por triplicado, en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con fondo en V. Se ensayó un intervalo de dosis de 8 concentraciones de compuesto, dando como resultado una curva de respuesta a la dosis de 10 puntos, incluyendo una respuesta máxima (estimulada) y mínima (no estimulada). Las células se incubaron con compuesto durante 1 hora a 37ºC, 5% de CO_{2}, después de lo cual se añadieron 20 ul de 6X estímulo [1 ug/ml de anticuerpo anti-IgE (Bethyl Laboratories) o 667 au/ml de ácaro del polvo (Antigen Laboratories)]. Las células se estimularon durante 30 minutos a 37ºC, 5% de CO_{2}. La placa se hizo girar durante 10 min. a 1500 rpm a temperatura ambiente, y se cosecharon 80 ul del sobrenadante para el análisis del contenido de histamina usando el kit de ELISA para histamina suministrado por Immunotech. El ELISA se llevó a cabo según las instrucciones del
proveedor.
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7.5.6 Resultados
En la Tabla 1 se proporcionan los resultados de los ensayos de CHMC de baja densidad (Sección 7.5.2), de los ensayos de BMMC de alta densidad (Sección 7.5.4) y de los ensayos con basófilos (Sección 7.5.5). En la Tabla 2 se proporcionan los resultados de los ensayos de CHMC de alta densidad (Sección 7.5.3). En las Tablas 1 y 2, todos los valores dados son las IC_{50} (en \muM). Un valor de "9999" indica una IC_{50} > 10 \muM, sin ninguna actividad medible a una concentración de 10 \muM. La mayoría de los compuestos ensayados tuvieron unas IC_{50} de menos de 10 \muM, exhibiendo muchos de ellos unas IC_{50} en el intervalo submicromolar.
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7.6 Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina inhiben la desgranulación mediada por el receptor Fc\gammaRI
La capacidad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención para inhibir la desgranulación mediada por Fc\gammaRI se demostró con los compuestos R921218, R921302, R921303, R940347, R920410, R927050, R940350, R935372, R920323, R926971 y R940352 en ensayos similares a los descritos en la Sección 7.5, con la excepción de que las células no se cebaron con IgE, y se activaron con fragmento Fab de anti-IgG humana de conejo (Bethyl Laboratories, número de catálogo A80-105).
Todos los compuestos ensayados mostraron unas IC_{50} en el intervalo submicromolar.
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7.7 Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención inhiben selectivamente la cascada del receptor de IgE aguas arriba
Para confirmar que muchos de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención ejercen su actividad inhibidora bloqueando o inhibiendo la cascada de transducción de señales del receptor de IgE temprana, se ensayaron varios de los compuestos en ensayos celulares para determinar la desgranulación inducida por ionomicina, como se describe más abajo.
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7.7.1 Activación de densidad celular baja de CHMC con ionomicina: Ensayo de triptasa
Los ensayos para la desgranulación de mastocitos inducida por ionomicina se llevaron a cabo como se describe para los ensayos de activación de baja densidad de CHMC con IgE (Sección 7.5.2, más arriba), con la excepción de que, durante la incubación de 1 hora, se preparó una disolución 6X de ionomicina [5 mM de ionomicina (Sigma I-0634) en MeOH (madre) diluida 1:416,7 en tampón MT (2 \muM final)] y las células se estimularon añadiendo 25 \mul de la disolución 6X de ionomicina a las placas apropiadas.
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7.7.2 Activación de basófilos con ionomicina: ensayo de liberación de histamina
Los ensayos para la desgranulación de basófilos inducida por ionomicina se llevaron a cabo como se describe para el ensayo de activación de basófilos con IgE o con ácaro del polvo (Sección 7.5.5, más arriba), con la excepción de que, tras la incubación con compuesto, las células se estimularon con 20 \mul de ionomicina 2 \muM.
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7.7.3 Resultados
Los resultados de los ensayos de desgranulación inducida por ionomicina, dados como valores de IC_{50} (en \muM), se proporcionan en la Tabla 1, más arriba. De los compuestos activos ensayados (es decir, aquellos que inhiben la desgranulación inducida por IgE), la inmensa mayoría no inhibe la desgranulación inducida por ionomicina, confirmando que estos compuestos activos inhiben selectivamente la cascada de transducción de señales del receptor de IgE temprana (o aguas arriba).
Estos resultados se confirmaron para ciertos compuestos midiendo el flujo de ion calcio inducido por anticuerpos anti-IgE o inducido por ionomicina en células CHMC. En estos ensayos del flujo de Ca^{2+}, 10 \muM de R921218 y 10 \muM de R902420 inhibieron el flujo de Ca^{2+} inducido por anticuerpos anti-IgE, pero no tuvieron efecto sobre el flujo de Ca^{2+} inducido por ionomicina (véase la Fig. 4).
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7.8 El efecto inhibidor de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención es inmediato
Para ensayar la inmediatez de su efecto inhibidor, se añadieron simultáneamente ciertas 2,4-pirimidindiaminas de la invención con un activador de anticuerpo anti-IgE en los ensayos celulares descritos anteriormente. Todos los compuestos ensayados bloquearon la desgranulación inducida por IgE de células CHMC en el mismo grado que el observado cuando los compuestos se preincubaron con células CHMC durante 10 ó 30 min. antes de la reticulación del receptor.
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7.9 Cinética de la actividad farmacológica in vitro
Los compuestos R921218, R921302, R921219, R926240, R940277, R926742, R926495, R909243 y R926782 se ensayaron en experimentos de lavado. En los experimentos, células CHMC se activaron inmediatamente con anticuerpo anti-IgE en presencia de 1,25 \muM de compuesto (tiempo cero), o el compuesto se lavó tras la activación con anticuerpo anti-IgE a 30, 60 ó 120 min. La actividad inhibidora de estos compuestos disminuyó enormemente 30 min. después de la eliminación del compuesto, indicando que se requiere una exposición constante de los mastocitos a estos compuestos para una inhibición máxima de la desgranulación. Los otros compuestos ensayados produjeron resultados similares.
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7.10 Toxicidad: células T y B
La capacidad de los compuestos de la invención para ejercer su actividad inhibidora sin ser tóxicos para las células del sistema inmunitario se demostró en ensayos celulares con células B y T. A continuación se proporcionan los protocolos para los ensayos.
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7.10.1 Toxicidad de Jurkat (célula T)
Dilúyanse células Jurkat hasta 2 x 10^{5} células/ml en medio RPMI completo (10% de suero fetal bovino inactivado por calor), e incúbense a 37ºC, 5% de CO_{2} durante 18 horas. Añádanse 65 ul de células a 7,7 x 10^{5} células/ml a una placa de 96 pocillos con fondo en V (tratada con TC, Costar) que contiene 65 ul de 2X compuesto (la concentración final del vehículo es 0,5% de DMSO, 1,5% de MeOH). Mézclese, e incúbense las placas durante 18-24 h a 37ºC, 5% de CO_{2}. La toxicidad se evaluó mediante análisis citométrico de flujo de la dispersión de la luz
celular.
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7.10.2 Toxicidad de BJAB (célula B)
La estirpe de células B BJAB se cultivó en fase logarítmica en RPMI 1640 + 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 1x L-glutamina, 1x penicilina, 1x estreptavidina y 1x betamercaptoetanol a 37ºC, 5% de CO_{2}. En primer lugar, las BJAB se cosecharon, se hicieron girar y se resuspendieron en medio de cultivo hasta una concentración de 7,7 x 10^{5} células/ml. Se mezclaron 65 ul de células con 65 ul de compuesto, por duplicado y en presencia de 0,1% de DMSO, en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con fondo en V. Las células se incubaron con compuesto a diversas diluciones a 37ºC, 5% de CO_{2}. La toxicidad se evaluó mediante análisis citométrico de flujo de la dispersión de la luz celular.
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7.10.3 Toxicidad: ensayo de Cell Titer Glo
Siémbrense 50 \mul de células (1 x 10^{6}/ml) en cada pocillo que contiene 50 \mul de compuesto. La concentración final del vehículo es 0,5% de DMSO, 1,5% de MeOH. Agítense las placas durante 1 minuto para mezclar las células y el compuesto. Incúbense las placas a 37ºC (5% de CO_{2}) durante 18 horas. Al siguiente día, coséchense 50 \mul de células de cada pocillo, y añádanse a 50 \mul de reactivo Cell Titer Glo (Invitrogen). Agítense las placas durante 1 minuto. Léanse en un luminómetro.
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7.10.4 Resultados
En la Tabla 2, más arriba, se presentan los resultados de los ensayos de toxicidad de las células T y B, dados como valores de IC_{50} (en \muM). Con unas pocas excepciones (véase la Tabla 1), todos los compuestos ensayados no fueron tóxicos ni para las células B ni para las células T a las concentraciones inhibidoras efectivas. Los ensayos realizados con células B primarias produjeron resultados similares.
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7.11 Los compuestos de 2,4-pirimidina son tolerados en animales
La capacidad de los compuestos de la invención para ejercer su actividad inhibidora a dosis por debajo de aquellas que muestran toxicidad en animales se demostró con los compuestos R921218, R921219 y R921302.
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7.11.1 R921218
Se estudió R921218 en un amplio programa de estudios de seguridad no clínica que concluyeron que este agente era bien tolerado tanto en roedores como en no roedores. Para resumir el resultado del ensayo de toxicología/seguridad no clínica con R921218, este agente no produjo toxicidad limitante de la dosis por la vía de administración intranasal en no roedores (conejos y primates) o por la vía de administración oral en roedores (ratones y ratas) durante estudios de toxicidad de dosis repetidas de 14 días a dosis muchas veces por encima de la dosis anticipada que se espera que produzca eficacia en el hombre. No hubo hallazgos adversos en un conjunto de pruebas básicas de seguridad farmacológica de la función cardiovascular, respiratoria y/o del sistema nervioso central. No hubo signos de potencial mutagénico o clastogénico en el ensayo de toxicología genética, ni tampoco hubo efectos adversos tras la exposición a la piel y los ojos. Se proporciona una breve discusión de los estudios claves de
toxicología.
Se llevó a cabo un estudio de toxicidad intranasal de dosis repetidas de 14 días en macacos, a dosis de 2,1, 4,5 o 6,3 mg/kg/día. Los parámetros en vivo incluyeron: observaciones clínicas, pesos corporales, consumo alimentario, oftalmología, tensión arterial, electrocardiografía, hematología, bioquímica analítica, análisis de orina, evaluación inmunotoxicológica, necropsia macroscópica, pesos de los órganos, evaluaciones toxicocinéticas, e histopatología (incluyendo la cavidad nasal). No hubo hallazgos adversos atribuidos a R921218 en ningún parámetro del estudio, y el NOAEL (nivel de efecto adverso no observado) se consideró como 6,3 mg/kg/día.
Se llevó a cabo un estudio de toxicidad intranasal de dosis repetidas de 14 días en conejos blancos de Nueva Zelanda, a dosis de 1,7, 3,4 o 5,0 mg/kg/día. Los parámetros in vivo incluyeron: observaciones clínicas, pesos corporales, consumo alimentario, oftalmología, hematología, bioquímica analítica, necropsia macroscópica, pesos de órganos, evaluaciones toxicocinéticas, e histopatología (incluyendo la cavidad nasal). No hubo hallazgos adversos atribuidos a R921218 en ningún parámetro del estudio, y el NOAEL (nivel de efecto adverso no observado) se consideró como 5,0 mg/kg/día.
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7.11.2 R921219
En estudios piloto de hallazgo de dosis, una dosis oral de dosis única de 600 mg/kg se consideró un NOEL (nivel de efecto no observado), mientras que no se toleraron múltiples dosis (7 días) de 200 mg/kg/día y superiores.
En el ensayo in vitro de mutación inversa con Salmonella-Escherichia coli/microsomas de mamíferos (ensayo de Ames), se encontró que R921219 es positivo al ensayo en la cepa probadora TA1537, con y sin activación metabólica, confirmando los resultados de un estudio anterior. Se encontró que R921219 no afecta adversamente a ninguna de las otras 4 cepas probadoras. Se encontró que R921219 no posee potencial clastogénico cuando se estudia en un ensayo de aberración cromosómica in vitro.
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7.11.3 R921302
Se llevaron a cabo en roedores varios estudios piloto no GLP de toxicidad. En el ratón, una dosis oral de 1000 mg/kg se toleró hasta 7 días. se llevó a cabo en el ratón un estudio de toxicidad oral de 14 días, con dosis de 100, 300 y 1000 mg/kg. No se toleró una dosis de 1000 mg/kg, mientras que una dosis de 300 mg/kg dio muestras de cambios histopatológicos en la vulva. Una dosis de 100 mg/kg se consideró el NOAEL (nivel de efecto adverso no observado) en el estudio. Se llevó a cabo un estudio de toxicidad oral de 28 días en el ratón, a dosis de 100 mg/kg q.d., 100 mg/kg b.i.d., 300 mg/kg q.d. y 300 mg/kg b.i.d. R921302 no se toleró a 300 mg/kg q.d. o b.i.d. La dosis más bajas (100 mg/kg q.d. o b.i.d.) parecen bien toleradas (todavía no se conocen los resultados clínicos ni histopatológicos). Parece que, en las ratas, las dosis orales de 50, 150 y 300 mg/kg, dadas durante 32 días, son bien toleradas (todavía no se conocen los resultados clínicos ni histopatológicos).
En el ensayo in vitro de mutación inversa con Salmonella-Escherichia coli/microsoma mamífero (ensayo de Ames), se encontró que R921302 es positivo en el ensayo en la cepa probadora TA98 con S9 y TA1537, con y sin activación metabólica. Se encontró que R921302 no afecta adversamente a ninguna de las otras 3 cepas probadoras. R921302 no fue clastogénico cuando se evaluó en un ensayo de aberración cromosómica in vitro.
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7.12 Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina están oralmente biodisponibles
Se ensayaron alrededor de 50 compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención para determinar la biodisponibilidad oral. Para el estudio, los compuestos se disolvieron en diversos vehículos (por ejemplo, disolución de PEG 400, y suspensión de CMC) para la dosificación intravenosa y oral en las ratas. Tras la administración del fármaco, se obtuvieron y se extrajeron muestras de plasma. Las concentraciones en plasma de los compuestos se determinaron mediante métodos de cromatografía de líquidos de altas prestaciones/espectrometría de masas en tándem (LC/MS/MS). Se llevaron a cabo análisis farmacocinéticos basándose en los datos de concentración en plasma. Los parámetros farmacocinéticos de interés incluyeron el aclaramiento (CL), volumen de distribución en el estado estacionario (Vss), semivida terminal (t_{^{1}/_{2}}), y biodisponibilidad oral (%F).
Estos estudios farmacocinéticos indican que muchos de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina están oralmente disponibles, con %F de hasta aproximadamente 50% (en el intervalo de 0-50%). Las semividas oscilaron desde 0,5 hasta 3 h. En particular, los compuestos R940350, R935372, R935193, R927050 y R935391 mostraron buenas biodisponibilidades orales y semividas en ratas. De este modo, estos estudios confirman que estos compuestos de 2,4-pirimidindiamina son adecuados para la administración oral.
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7.13 Los compuestos son eficaces para el tratamiento de alergias
La eficacia in vivo de los compuestos R926109, R921218, R921219, R921302, R926495, R926508, R926742, R926745 y R945150 frente a alergias se evaluó en el modelo de ratón de anafilaxis cutánea pasiva (PCA). Este modelo proporciona una medida directa de la desgranulación, inducida por IgE, de mastocitos tisulares. En este modelo, los animales sensibilizados a IgE se sometieron a una exposición alergénica, y el cambio en la permeabilidad de la vasculatura dérmica que resulta de la liberación de histamina desde mastocitos se mide mediante el cambio en la cantidad de fuga del colorante al tejido circundante. La inhibición de la liberación del mediador por los compuestos que modulan la desgranulación de mastocitos se mide fácilmente extrayendo el colorante del
tejido.
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7.13.1 Protocolo de estudio y resultados
En el ensayo de PCA, los ratones se sensibilizaron de forma pasiva mediante inyección intradérmica con anticuerpos IgE anti-dinitrofenol (DNP) (Día -1). A tiempos predeterminados, los animales se tratan con el agente de ensayo (Día 0). El efecto modulador del agente sobre la desgranulación de mastocitos cutáneos se mide tras la inyección intravenosa de DNP conjugado con seroalbúmina humana (HSA-DNP), junto con el colorante azul de Evans. La reticulación resultante del receptor de IgE y el incremento subsiguiente, inducido por la desgranulación de mastocitos, en la permeabilidad vascular se determina midiendo la cantidad de extravasación de colorante al tejido. El colorante se extrae del tejido mediante formamida, y la absorbancia de este extracto se lee a 620 nm. El efecto inhibidor del tratamiento farmacéutico se da como el porcentaje de inhibición comparado con el tratamiento con vehículo, esto es, el porcentaje de reducción en A_{620}.
Se han ensayado dos compuestos como controles positivos: el antagonista de la histamina difenhidramina, y el antagonista de la serotonina ciproheptadina. Ambos mediadores (histamina y serotonina) son liberados con la desgranulación mediada por IgE a partir del mastocito de ratón. Ambos compuestos de referencia inhiben la respuesta de PCA; la ciproheptadina se usó de forma normal en experimentos subsiguientes. La ciproheptadina inhibió de forma reproducible la respuesta de la PCA en 61% +/- 4% (8 mg/kg, i.p., tiempo de pretratamiento de 30 minutos, n=23 experimentos).
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7.13.1.1 Resultados
Se observó una inhibición, dependiente de la dosis, de la pérdida vascular mediada por Fc\varepsilonR con dosis crecientes de R921218, R926109, R921219 y RR921302. Estos compuestos se administraron en una formulación en disolución (67% de PEG/33% de tampón de citrato) o una suspensión acuosa (1,5% de Avicel). Estos resultados demuestran la fuerte correlación entre los niveles plasmáticos del compuesto, la eficacia in vivo y la potencia in vitro. El compuesto más potente, R921219, fue activo con niveles de exposición circulantes de aproximadamente 10 \mug/ml (68% de inhibición a una dosis de 100 mg/kg) en comparación con R921302, una molécula relativamente menos potente, que redujo la extravasación plasmática en 42% a una dosis de 100 mg/kg. Además, la duración de la exposición al compuesto circulante se reflejó en la duración de la actividad inhibidora. R921302, que se determina que es el compuesto metabólicamente más estable en estudios farmacocinéticos, inhibió la permeabilidad vascular durante 1-2 horas antes de la señalización del receptor inducida por antígenos, después de lo cual la eficacia comenzó a disminuir. En la Tabla 3 y en la Tabla 4 se resumen estos datos.
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Se observó actividad in vivo similar con los compuestos R926495, R926508, R926742, R926745 y R926150, que fueron capaces de inhibir la respuesta de PCA tras la administración por vía oral en una formulación a base de PEG (datos no mostrados).
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7.14 Los compuestos son eficaces en el tratamiento de asma
La eficacia de los compuestos R921218, R921302, R926495, R926508, R926742 y R921219 en el tratamiento de asma se demostró en el modelo de oveja de asma alérgica. Las ovejas desarrollan broncoconstricción en minutos de exposición a antígeno inhalado (Ascaris suum), con una obstrucción máxima del caudal de aire durante la respuesta alérgica temprana (EAR). La liberación de mediadores mastocíticos preformados es probablemente responsable de esta fase temprana de la obstrucción del caudal de aire. Además de la EAR, el modelo de oveja nos permite evaluar el efecto de los compuestos en la reacción asmática tardía (LAR) y en la hipersensibilidad no específica de las vías respiratorias (AHR), que se produce como resultado de la administración tópica o local de alérgeno a la vía respiratoria. En las ovejas, la AHR se desarrolla unas pocas horas después de la exposición al antígeno, y puede durar hasta 2 semanas. Los resultados descritos más abajo demuestran el potencial de los compuestos ensayados para inhibir una cascada de sucesos que puede ser el resultado de la liberación de citocinas desde el
mastocito.
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7.14.1 Protocolo del estudio
En el modelo de oveja de asma alérgica, a las ovejas se les administran aerosoles del artículo de ensayo vía un tubo endotraqueal, seguido de una exposición aerosólica con antígeno extraído del áscari Ascaris suum, al que las ovejas son alérgicas de forma natural. La exposición alergénica conduce a bronconstricción directa (tanto EAR como LAR) y a una AHR no específica persistente. Estas tres características son similares a las observadas en asmáticos alérgicos humanos. La actividad del agente de ensayo se determina mediante cambios en la resistencia pulmonar (R_{L}), que se calcula a partir de medidas de presión transpulmonar, caudal, y volumen respiratorio. Los datos de control histórico obtenidos de las mismas ovejas tras el tratamiento salino en comparación con una exposición alergénica, muestran que se produce un incremento pronunciado de R_{L} durante la EAR, y persiste durante aproximadamente 2-3 horas tras la exposición alergénica. La LAR es un incremento menos pronunciado en R_{L}, que comienza aproximadamente 5-6 tras la exposición alergénica, y se resuelve en 8 horas tras la exposición. Veinticuatro horas después de la exposición, se midió una respuesta a la dosis frente a carbacol, para determinar la AHR, que se expresa como la dosis de carbacol requerida para incrementar R_{L} en 400% con respecto al valor inicial. (Esta medida se denomina como la concentración provocativa de carbacol que provoca un incremento de 400% en R_{L} con respecto al valor inicial (PC_{400}). Los datos se comparan frente a los datos del control histórico para el mismo individuo cuando se administra un aerosol de control de disolución salina y se expone frente a Ascaris suum.
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7.14.2 Resultado
Todos los compuestos ensayados mostraron efectos inhibidores en la LAR y la AHR, y asimismo varios de estos agentes inhibieron la EAR. En la Tabla 5 se muestra la respuesta óptima para cada compuesto en una serie de estudios para evaluar la actividad a varios tiempos de pretratamiento y usando varias formulaciones diferentes en disolución y suspensión. La eficacia de R921218 sobre la EAR parece que depende de la formulación, observándose el mayor efecto a 30 mg/oveja, administrados como un aerosol en disolución en 10% de etanol. R926495, R926742, R926508 y R921219, administrados en cuatro ovejas diferentes a 45 mg/oveja en una suspensión acuosa 60 minutos antes de la exposición al alérgeno, demuestran que la LAR y AHR están bloqueadas. Además de estos parámetros tardíos, la EAR se redujo enormemente mediante tratamiento con R921219, R926508 o R926495. Se investigó la eficacia de RR921302 usando un vehículo de 45% de PEG400/55% de tampón de citrato. En estas condiciones, R921302, administrado a 30 mg/oveja 60 minutos antes de la exposición, bloqueó la LAR y AHR, y la EAR no se vio
afectada.
Estos datos demuestran claramente que estos compuestos son capaces de bloquear las respuestas asmáticas en ovejas alérgicas. Todos los compuestos inhibieron la AHR y LAR significativamente cuando se comparan con el control histórico. La EAR fue inhibida significativamente por R921219, R926508 y R926495 (54%, 21% y 33%, respectivamente). Por el contrario, R921218, R921302 y R926742 no inhibieron la EAR cuando se administraron en una suspensión acuosa.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 5
743 
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7.15 Los compuestos son eficaces en el tratamiento de asma
La eficacia de los compuestos R921304 y R921219 en el tratamiento de asma también se demostró en un modelo de ratón de asma alérgica.
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7.15.1 Protocolo de estudio
Se sensibilizaron ratones frente a ovoalbúmina (proteína de pollo) en presencia de un adyuvante (Alum) por vía intraperitoneal en el día 0 y en el día 7. Una semana más tarde, los ratones se sometieron a una exposición intranasalmente con ovoalbúmina en los Días 14, 15 y 16 (modelo más restrictivo) o en el Día 14 (modelo menos restrictivo). Este régimen de sensibilización y exposición conduce a hipersensibilidad de las vías respiratorias e inflamación en los pulmones, que son dos características dominantes del asma alérgico humano. En el modelo de ratón, las respuestas in vivo de las vías respiratorias se miden usando un pletismógrafo de cuerpo completo que determina la PENH (pausa aumentada, Buxco Electronics). La PENH es un valor adimensional que comprende el caudal inspiratorio pico (PIF), el caudal espiratorio pico (PEF), el tiempo de inspiración, el tiempo de expiración y el tiempo de relajación, y se considera un parámetro validado de la sensibilidad de las vías respiratorias. Las respuestas frente a la exposición alergénica (OVA) se comparan con animales expuestos solamente a disolución salina. Veinticuatro horas después de la exposición, los ratones se exponen a dosis crecientes de metacolina (agonista del receptor muscarínico), lo que da como resultado una contracción del músculo liso. Los ratones expuestos a ovoalbúmina demuestran una hipersensibilidad significativa de las vías respiratorias a metacolina, cuando se comparan con los ratones expuestos a la disolución salina. Además, se observa un infiltrado celular en las vías respiratorias en animales expuestos a ovoalbúmina, cuando se comparan con los ratones expuestos a la disolución salina. Este infiltrado celular se caracteriza principalmente por eosinófilos, pero también está presente un influjo más pequeño de neutrófilos y células
mononucleares.
El uso de este modelo para la evaluación de inhibidores de pequeñas moléculas de la desgranulación de mastocitos se ha validado de varias formas. En primer lugar, usando ratones con deficiencia de mastocitos (W/W^{v}), se ha demostrado que las respuestas inducidas por ovoalbúmina dependen de la presencia de mastocitos. En los ratones con deficiencia de mastocitos, la sensibilización y exposición a ovoalbúmina no da como resultado una hipersensibilidad de las vías respiratorias ni influjo de eosinófilos. En segundo lugar, el estabilizador de mastocitos, cromolina, fue capaz de bloquear la hipersensibilidad e inflamación de las vías respiratorias inducida por ovoalbúmina (datos no mostrados). El uso de este modelo para evaluar compuestos para el tratamiento de respuestas asmáticas que pueden estar mediadas por mecanismos distintos de la estabilización de mastocitos está apoyado además por el efecto inhibidor de los esteroides dexametasona y budesonida sobre la broncoconstricción inducida por
metacolina.
7.15.2 Resultados
La eficacia de R921304 se evaluó mediante administración intranasal en 10 días consecutivos, desde el Día 7 hasta el Día 16, a una dosis de 20 mg/kg, con las últimas 3 dosis administradas 30 minutos antes de la exposición a disolución salina o a ovoalbúmina. R921304 fue capaz de inhibir la hipersensibilidad de las vías respiratorias inducida por ovoalbúmina frente a metacolina, cuando se compara con los ratones tratados con el vehículo.
En un protocolo menos restrictivo, en el que los ratones se expusieron a ovoalbúmina sólo una vez en el Día 14, R921219, administrado subcutáneamente a 70 mg/kg en 67% de PEG400/33% de tampón de citrato, 30 minutos antes de la exposición a disolución salina o a ovoalbúmina, demuestra que R921219 bloquea completamente la hipersensibilidad de las vías respiratorias inducida por ovoalbúmina y el influjo celular.
Estos resultados demuestran claramente que R921219 y R921304 son eficaces inhibiendo las respuestas de las vías respiratorias en un modelo de ratón de asma alérgica.
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7.16 Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina inhiben la fosforilación de proteínas aguas abajo de Syk cinasa en mastocitos activados
El efecto inhibidor de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina sobre la fosforilación de proteínas aguas abajo de Syk cinasa se ensayó con los compuestos R921218, R218219 y R921304 en células BMMC activadas por el receptor de IgE.
Para el ensayo, se incubaron células BMMC en presencia de concentraciones variables de compuesto de ensayo (0,08 \muM, 0,4 \muM, 2 \muM y 10 \muM) durante 1 h a 37ºC. Las células se estimularon entonces con anticuerpo anti-IgE como se describe previamente. Después de 10 min., las células se lisaron, y las proteínas celulares se separaron mediante electroforesis (SDS PAGE).
Tras la electroforesis, la fosforilación de las proteínas indicadas en Figs. 7, 10 y 11A-D se evaluó mediante inmunotransferencia. Los anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling Technology, Beverley, MA.
Haciendo referencia a las Figs. 7, 10 y 11A-D, los compuestos indicados ensayados inhibieron la fosforilación de proteínas aguas abajo de Syk, pero no aguas arriba de Syk, en la cascada de señalización del receptor de IgE, confirmando que los compuestos inhiben aguas arriba la desgranulación inducida por IgE, y que los compuestos ejercen su actividad inhibidora inhibiendo Syk cinasa.
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7.17 Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina inhiben Syk cinasa en ensayos bioquímicos
Se ensayaron varios compuestos de 2,4-pirimidindiamina para determinar la capacidad para inhibir la fosforilación, catalizada por Syk cinasa, de un sustrato peptídico en un ensayo bioquímico de polarización fluorescente con Syk cinasa aislada. En este experimento, los Compuestos se diluyeron hasta 1% de DMSO en tampón de cinasa (20 mM de HEPES, pH 7,4, 5 mM de MgCl_{2}, 2 mM de MnCl_{2}, 1 mM de DTT, 0,1 mg/ml de gammaglobulina bovina acetilada). El compuesto en 1% de DMSO (0,2% de DMSO final) se mezcló con disolución de ATP/sustrato a temperatura ambiente. Se añadió Syk cinasa (Upstate, Lake Placid NY) hasta un volumen final de reacción de 20 ul, y la reacción se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las condiciones finales de la reacción enzimática fueron 20 mM de HEPES, pH 7,4, 5 mM de MgCl_{2}, 2 mM de MnCl_{2}, 1 mM de DTT, 0,1 mg/ml de gammaglobulina bovina acetilada, 0,125 ng de Syk, 4 uM de ATP, 2,5 uM de sustrato peptídico (biotina-EQEDEPEGDYEEVLE-CONH2, SynPep Corporation). Se añadió EDTA (10 mM final)/anticuerpo anti-fosfotirosina (1X final)/trazador fosfopeptídico fluorescente (0,5X final) en tampón de dilución FP para detener la reacción para un volumen total de 40 ul según las instrucciones del fabricante (PanVera Corporation). La placa se incubó durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Las placas se leyeron en un lector de placas de polarización de la fluorescencia Polarion (Tecan). Los datos se convirtieron en cantidad de fosfopéptido presente usando una curva de calibración generada mediante competición con el competidor fosfopeptídico proporcionado en el Kit de Ensayo de Tirosina Cinasa, Green (PanVera Corporation).
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En la Tabla 6, a continuación, se muestran los resultados del ensayo:
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744
745
746
Estos datos demuestran que todos los compuestos ensayados, excepto R945142 y R909236, inhiben la fosforilación por Syk cinasa, con IC_{50} en el intervalo submicromolar. Todos los compuestos ensayados inhiben la fosforilación por Syk cinasa con IC_{50} en el intervalo micromolar.
7.18 Los compuestos son eficaces para el tratamiento de la autoinmunidad
La eficacia in vivo de ciertos compuestos de 2,4-pirimidindiamina con respecto a enfermedades autoinmunitarias se evaluó en la reacción de Arthus pasiva inversa, un modelo agudo de lesión tisular mediada por antígenos-anticuerpos, y en varios modelos de enfermedades de autoinmunidad e inflamación. Estos modelos son similares por cuanto un anticuerpo contra un antígeno específico media la enfermedad inflamatoria provocada por el complejo inmunitario (provocada por IC), y la destrucción subsiguiente de tejido. La deposición de IC en sitios anatómicos específicos (sistema nervioso central (SNC) para encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE), y sinovio para artritis inducida por colágeno (CIA)) conduce a la activación de células que expresan Fc\gammaR y Fc\varepsilonR de superficie, principalmente mastocitos, macrófagos, y neutrófilos, lo que da como resultado la liberación de citocinas, y la quimiotaxia de neutrófilos. La activación de la respuesta inflamatoria es responsable de las respuestas efectoras aguas abajo, incluyendo edema, hemorragia, infiltración de neutrófilos, y liberación de mediadores proinflamatorios. Las consecuencias de estos sucesos provocados por IC son difíciles de identificar en trastornos autoinmunitarios; no obstante, muchos investigadores han demostrado que la inhibición de la ruta de señalización de Fc\gammaR en estos modelos de animales ha dado como resultado una reducción significativa del comienzo y gravedad de la enfermedad.
7.18.1 Los compuestos son eficaces en la reacción de Arthus en el ratón
La eficacia in vivo de los compuestos R921302, R926891, R940323, R940347, y R921303 para inhibir la cascada inflamatoria provocada por IC se demostró en un modelo de ratón de la Reacción de Arthus Pasiva Inversa (reacción de RPA).
7.18.1.1 Modelo
La lesión tisular inflamatoria aguda mediada por el complejo inmunitario (IC) está implicada en una variedad de enfermedades autoinmunitarias humanas, incluyendo síndrome de vasculitis, síndrome de suero enfermo, lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide, síndrome de Goodpasture, y glomerulonefritis. El modelo experimental clásico para la lesión tisular mediada por IC es la reacción de Arthus pasiva inversa. El modelo de reacción de RPA es un método in vivo conveniente para estudiar inflamación localizada, inducida por los IC, sin efectos sistémicos. La inyección intradérmica de anticuerpos (Ab) específicos frente a albúmina de huevo de pollo (anti-IgG de OVA de conejo), seguido de la inyección intravenosa (IV) de antígenos (Ag), específicamente albúmina de huevo de pollo (ovoalbúmina, OVA), provoca deposición perivascular de los IC y una respuesta inflamatoria rápida caracterizada por edema, infiltración de neutrófilos y hemorragia en los sitios de inyección. Los aspectos del modelo de ratón de reacción de RPA se parecen a la respuesta inflamatoria de pacientes con artritis reumatoide, SLE y glomerulone-
fritis.
7.18.1.2 Protocolo de estudio
En este sistema modelo, los compuestos de ensayo se administran en varios momentos de tiempo antes de la administración de los Ab y los Ag. Se inyecta intradérmicamente una disolución de anti-IgG de OVA de conejo (50 \mug en 25 \mul/ratón), e inmediatamente le sigue una inyección intravenosa de albúmina de huevo de pollo (20 mg/kg de peso corporal) en una disolución que contiene 1% de colorante de azul de Evans. El grado de edema y hemorragia se mide en la piel dorsal de ratones C57BL/6, usando el colorante de azul de Evans como un indicador del daño tisular local. Como control se usa IgG de conejo policlonal purificado.
El tiempo de pretratamiento, en el que los compuestos de ensayo se administran antes de la exposición a Ab/Ag, depende de las propiedades farmacocinéticas (PK) de cada compuesto individual. Cuatro horas después de la inducción de la reacción de Arthus, los ratones se eutanasiaron, y los tejidos se recogieron para evaluación del edema. Este sistema modelo nos permite identificar rápidamente la actividad in vivo de muchos inhibidores.
7.18.1.3 Resultados
Todos los compuestos ensayados se administraron mediante la vía oral.
R921302, cuando se administra en ratones C57B16 a una dosis de 50 mg/kg, 100 mg/kg, y 200 mg/kg 60 minutos antes de la exposición a Ab/Ag, mostró inhibición de la formación de edema dependiente de la dosis (49,9%, 93,2%, y 99,1%, respectivamente). Además, R921302 mostró no sólo una inhibición profiláctica del edema, sino también eficacia terapéutica, en la que el edema se inhibió un 77,5% cuando el compuesto se administró 30 minutos después de la exposición a una dosis de 100 mg/kg.
R940323 y R926891 mostraron la eficacia de inhibición del edema en 32,4% y 54,9%, respectivamente, cuando se administraron a 200 mg/kg, 60 minutos antes de la exposición. Estos compuestos están mucho menos biodisponibles cuando se administran oralmente, y los niveles de exposición sistémica fueron aproximadamente 50 veces menores que el observado con R921302 (datos no mostrados). R940347 inhibió el edema en un 89% cuando se administró a una dosis de 100 mg/kg, 2 horas antes de la exposición.
El compuesto R921303 mostró una inhibición de 100%, 100% y 93,6%, de la formación del edema cuando se administra a una dosis de 200 mg/kg y un tiempo de pretratamiento de 30, 60, y 120 minutos, respectivamente. El compuesto también demostró una inhibición, dependiente de la dosis, de 65,4%, 81,2% y 100%, a dosis de 50 mg/kg, 100 mg/kg y 200 mg/kg, respectivamente. En la Tabla 7 se resumen los resultados para los compuestos ensayados.
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747
748
749 
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7.18.2 Los compuestos son eficaces en el modelo de ratón de artritis inducida por anticuerpos contra colágeno
La eficacia in vivo del compuesto R921302 frente a enfermedades autoinmunitarias se demostró en un modelo de ratón de artritis inducida por anticuerpos contra colágeno (CAIA).
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7.18.2.1 Modelo
La artritis inducida por colágeno (CIA) en roedores se usa frecuentemente como uno de los modelos experimentales para la lesión tisular mediada por IC. La administración de colágeno tipo II en ratones o ratas da como resultado una reacción inmunitaria que implica de forma característica destrucción inflamatoria de cartílago y hueso de las articulaciones distales, con hinchamiento concomitante de los tejidos circundantes. CIA se usa habitualmente para evaluar compuestos que pueden ser de uso potencial como fármacos para el tratamiento de artritis reumatoide y otras afecciones inflamatorias crónicas.
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En años recientes, ha surgido una nueva técnica en el modelo de CIA, en la que se aplican anticuerpos anti-colágeno tipo II para inducir una CIA mediada por anticuerpos. Las ventajas del método son: tiempo corto para la inducción de la enfermedad (que se desarrolla en 24-48 h después de una inyección intravenosa (IV) de anticuerpos); la artritis es inducible tanto en razas de ratón susceptibles a CIA como resistentes a CIA; y el procedimiento es ideal para identificar rápidamente agentes terapéuticos antiinflamatorios.
Se administró intravenosamente cóctel de anticuerpos monoclonales inductor de artritis Arthrogen-CIA® (Chemicon International Inc.) a ratones Balb/c (2 mg/ratón) en el Día 0. Cuarenta y ocho horas después, se inyectaron intraperitonealmente 100 \mul de LPS (25 \mug). En el Día 4, los dedos pueden parecer hinchados. En el Día 5, una o las dos patas (particularmente las patas traseras) empiezan a estar rojas e hinchadas. En el Día 6, y después, las patas rojas e hinchadas seguirán así durante al menos 1-2 semanas. Durante el estudio, los signos clínicos de la inflamación se puntúan para evaluar la intensidad del edema en las patas. La gravedad de la artritis se registra como la puntuación suma de ambas patas traseras para cada animal (puntuación máxima posible de 8). El grado de inflamación con las patas implicadas se evalúa midiendo el diámetro de las patas. Se monitorizan los cambios del peso corporal.
Los animales se tratan en el momento de la inducción de la artritis, comenzando en el Día 0. Los compuestos de ensayo y los compuestos de control se administran una vez al día (q.d.) o dos veces al día (b.i.d.), por vía oral (PO), dependiendo de los protocolos farmacocinéticas PK previamente establecidos.
Al final del estudio (1-2 semanas tras la inducción de la artritis), los ratones se eutanasiaron, y las patas se seccionaron transversalmente en la tibia distal usando una guillotina, y se pesaron. La media \pm error estándar de la media (SEM) para cada grupo se determina cada día a partir de las puntuaciones clínicas de los animales individuales, y los pesos de las patas traseras para cada grupo experimental se calculan y se registran a la terminación del estudio. Se obtiene una evaluación histopatológica de las patas.
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7.18.2.2 Resultados
La administración de R921302 suprime significativamente el desarrollo de artritis y la gravedad de la enfermedad (p<0,005), como se muestra por los cambios en las puntuaciones clínicas diarias medias de la artritis (Fig. 12). Las puntuaciones artríticas diarias medias, desde el día 4 hasta el 14, en el grupo de tratamiento, se redujeron entre 71 y 92%, en comparación con las de grupo de control con vehículo. El grado de inflamación de la pata, por medida del peso de la pata, se redujo en animales tratados con R921302, en comparación con el grupo de control con vehículo (Fig. 13). Al final del estudio, se evaluó el grado de hinchamiento midiendo el peso de las patas, lo que se indica mediante una reducción de 99,9% en el grupo tratado con R921302, en comparación con el peso medio de las patas del grupo de control con vehículo (p<0,002).
La evaluación histopatológica de las patas cortadas reveló una destacada sinovitis, consistente con CIA. Se observaron lesiones importantes en animales tratados con disolución salina o vehículo, mientras que se encontraron lesiones de menor gravedad en el grupo de tratamiento con R921302. Las articulaciones se hicieron más gruesas, con proliferación notable del sinovio. Hay un incremento de fibroblastos con una densa infiltración de neutrófilos, linfocitos, monocitos, macrófagos y células plasmáticas. Hay una proliferación vascular con congestión, hemorragia y edema. La formación de paño estaba presente en el espacio articular, y hubo destrucción de cartílago. En el grupo tratado con el fármaco, las articulaciones eran casi normales, o mostraron una inflamación limitada pero sin implicación de cartílago.
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TABLA 8 Puntuación histopatológica media del grupo (0-15)
750
Las puntuaciones clínicas artríticas y el edema de la pata se redujeron una media de 20% en animales tratados con R050 dos veces al día a una dosis de 100 mg/kg, en comparación con el control sin tratar (vehículo, p = 0,1). El edema de la pata se inhibió en aproximadamente 26% en comparación con el control sin tratar (vehículo), por medición del grosor de la pata trasera (p = 0,1). R050 no muestra artritis a una dosis de 30 mg/kg.
R070, una forma salina de R050, administrado a dosis de 50 ó 100 mg/kg dos veces al día inhibió la enfermedad clínica una media de 39,75% (p < 0,0002) o 35,28% (p < 0,0004) de inhibición, respectivamente, en comparación con el control sin tratar (vehículo). El grosor de la pata se redujo aproximadamente 50%.
R429, sal de R363, administrado dos veces al día a 50 ó 100 mg/kg mostró una media de 23,81% (p < 0,05) o 20,82% (p = 0,05) de inhibición de las puntuaciones clínicas artríticas, respectivamente, en comparación con el control no tratado (vehículo). De igual manera, el grosor de la pata se redujo.
R347 no afectó a las puntuaciones artríticas a las dosis ensayadas (30 y 100 mg/kg dos veces al día).
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7.18.3 Los compuestos son eficaces en artritis de rata inducida por colágeno
La eficacia in vivo del compuesto R921302 frente a enfermedades autoinmunitarias se demostró en un modelo de rata de artritis inducida por colágeno (CIA).
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7.18.3.1 Descripción del modelo
La artritis reumatoide (RA) se caracteriza por inflamación crónica de la articulación, conduciendo eventualmente a la destrucción irreversible de cartílago. Los IC que contienen IgG son abundantes en el tejido sinovial de pacientes con RA. Aunque todavía se debate qué papel desempeñan estos complejos en la etiología y patología de la enfermedad, IC se comunica con las células hematopoyéticas vía el Fc\gammaR.
CIA es un modelo animal ampliamente aceptado de RA que da como resultado sinovitis inflamatoria crónica caracterizada por formación de paño y degradación de la articulación. En este modelo, la inmunización intradérmica con colágeno tipo II natural, emulsionado con adyuvante incompleto de Freund, da como resultado una poliartritis inflamatoria en 10 u 11 días y la destrucción subsiguiente de la articulación en 3 a 4 semanas.
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7.18.3.2 Protocolo de estudio
Se inmunizaron ratas LOU singénicas con colágeno tipo II natural en el Día 0, y se evaluó la eficacia de R921302 en un régimen de prevención y en un régimen de tratamiento. En el protocolo de prevención, se administraron vehículo o diversas dosis de R921302 vía sonda nasogástrica comenzando en el día de inmunización (Día 0). En el protocolo de tratamiento, después de que los signos clínicos de la artritis se desarrollaron en el Día 10, se inició el tratamiento con R921302 (300 mg/kg mediante sonda nasogástrica, qd) y se continuó hasta el sacrificio en el Día 28. En ambos protocolos, las puntuaciones clínicas se obtuvieron diariamente, y los pesos corporales se midieron dos veces a la semana. En el Día 28, se obtuvieron puntuaciones radiográficas, y los niveles séricos de anticuerpo anti-colágeno II se midieron mediante ELISA.
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7.18.3.3 Resultados
Alrededor de 10 días después de la inmunización, las ratas desarrollaron CIA clínica, como se evidencia por un incremento en sus puntuaciones artríticas (Fig. 14). La puntuación artrítica media aumentó gradualmente en las ratas tratadas con vehículo solo después del Día 10, y, hacia el Día 28, la puntuación clínica media alcanzó 6,75 \pm 0,57. Las puntuaciones clínicas medias en animales tratados desde el día de la inmunización (Día 0) con la dosis elevada de R921302 (300 mg/kg/día) se redujeron significativamente (p < 0,01) en los Días 10-28 en comparación con los controles con vehículo. En las ratas tratadas con 300 mg/kg de R921302 al comienzo de la enfermedad, hubo una puntuación de la artritis significativamente menor, comenzando en el Día 16, y esta diferencia se observó hasta el final del estudio en el Día 28. Las puntuaciones radiográficas enmascaradas (escala 0-6) obtenidas en el Día 28 de CIA fueron 4,8 \pm 0,056 en el grupo del vehículo, en comparación con 2,5 \pm 0,0,16, 2,4 \pm 0,006, y 0,13 \pm 0,000001 en animales tratados una vez al día con 75, 150, y 300 mg/kg/día, respectivamente, en un régimen de prevención, y 0,45 \pm 0,031 en animales tratados una vez al día con 300 mg/kg/día al comienzo de la enfermedad. El tratamiento con R921302 a 300 mg/kg/día, ya sea profilácticamente (en inmunización) o después del comienzo de la enfermedad, impidió el desarrollo de erosiones, y redujo el hinchamiento de tejidos blandos. De forma similar, el tratamiento con R921302 dio como resultado una reducción importante de anticuerpo anti-colágeno II en el suero (datos no
mostrados).
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7.18.4 Los compuestos son eficaces en encefalomielitis autoinmunitaria experimental de ratón
La eficacia in vivo del compuesto R921302 frente a enfermedades autoinmunitarias se demostró en un modelo de ratón de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE).
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7.18.4.1 Descripción del modelo
La EAE es un modelo útil para esclerosis múltiple (MS), una enfermedad autoinmunitaria del SNC que es provocada por infiltración de inmunocitos de la materia blanca del SNC. La inflamación y la destrucción subsiguiente de mielina provocan parálisis progresiva. Al igual que la enfermedad humana, la EAE está asociada con activación periférica de células T autorreactivas con proteínas mielínicas, tales como proteína básica de mielina (MBP), proteína proteolipídica (PLP), o proteína oligodendrocítica de mielina (MOG). Las células T específicas de neuroantígenos activadas atraviesan la barrera hematoencefálica, conduciendo a infiltración focal de células mononucleares y a desmielinización. La EAE se puede inducir en razas de ratón susceptibles mediante inmunización con proteínas específicas de mielina en combinación con adyuvante. En el modelo de ratón SJL usado en estos estudios, la parálisis de las extremidades posteriores y de la cola es manifiesta hacia el Día 10 después de la inmunización, el pico de gravedad de la enfermedad se observa entre los Días 10 y 14, y se puede observar hacia el Día 35 un ciclo de remisión espontánea parcial seguido de una recaída. Los resultados descritos más abajo demuestran el potencial del agente de ensayo (R921302) para suprimir la gravedad de la enfermedad y evitar la recaída de los síntomas de la enfermedad que puede ser el resultado de la liberación de citocinas mediada por Fc\gammaR a partir de inmunoci-
tos.
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7.18.4.2 Protocolo de estudio
En el modelo murino de SJL de EAE, cada ratón se sensibilizó con PLP/CFA (para inducir EAE se usaron 150 \mug de PLP139-151 con 200 \mug de CFA en 0,05 ml de homogenado en cuatro sitios del flanco posterior para un total de 0,2 ml de emulsión). En un protocolo de supresión, se administró vehículo o diversas dosis de R921302 vía sonda nasogástrica comenzando en el día de la inmunización (Día 0). En el protocolo de tratamiento, al comienzo de la enfermedad, los animales se separaron para lograr grupos con una puntuación clínica media similar al comienzo, y se les administró vehículo o diversas frecuencias de dosis de los artículos de ensayo vía sonda nasogástrica. En ambos protocolos, las puntuaciones clínicas se monitorizaron diariamente, y los pesos corporales se midieron dos veces a la semana.
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7.18.4.3 Resultados
Alrededor de 10 días después de la inmunización con PLP, los ratones SJL desarrollaron EAE clínica, como es evidente por un incremento en sus puntuaciones clínicas medias (Fig. 15). La puntuación paralítica aumentó gradualmente en los animales tratados solamente con el vehículo desde el día de la inmunización (Día 0), y hacia el Día 14 la puntuación media alcanzó un pico de 5,1 + 0,3. En el pico de la enfermedad (Día 14), la puntuación clínica media en animales tratados con 100 mg/kg diarios o 100 mg/kg dos veces al día se redujo significativamente (p < 0,05, 4,3 + 1,3 y 4,3 + 1,4, respectivamente). Hacia el Día 16, todos los animales mostraron una remisión parcial de la gravedad clínica media, lo que es una característica del modelo de SJL. Las puntuaciones clínicas notablemente inferiores en animales tratados dos veces al día con 100 mg/kg de R921302 siguieron siendo significativas (p < 0,05) durante todo el experimento hasta que los animales se sacrificaron en el Día 30. Estas menores puntuaciones durante todo el período de tratamiento se reflejan en el índice de enfermedad acumulativo (CDI) significativamente inferior y en el incremento del índice de peso acumulativo (CWI), como se observa en la Tabla 9. En el grupo tratado solamente con el vehículo, 2/5 de los ratones recayeron. En el grupo de 100 mg/kg/día, 3/8 de los ratones recayeron. Ninguno de los ratones en el grupo de 100 mg/kg dos veces al día recayó.
TABLA 9
751
Los ratones SJL tratados con R921302 al comienzo de la enfermedad (Día 11) a una dosis de 200 mg/kg dos veces al día mostraron una disminución significativa (p = 0,003) del CDI (53,5 \pm 16,9 en animales tratados con R921302, en comparación con 72,9 \pm 8,9 en los animales tratados con el vehículo solo). Además, hubo una importante disminución en el número de recaídas en animales tratados con R921302 (2/12), en comparación con el número de recaídas en animales tratados con vehículo (7/11). Los resultados se resumen en la Tabla 10 y en la Fig. 16.
TABLA 10
752
7.18.5 Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención inhiben la activación de células T 7.18.5.1 Descripción
La capacidad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención para inhibir la activación de células T se demostró usando una variedad de ensayos que utilizan una estirpe celular de células T Jurkat y cultivos de células T primarias. La inhibición de la activación de células T Jurkat, en respuesta a la estimulación del receptor de células T (TCR), se midió cuantificando el aumento del marcador de la superficie celular CD69. La inhibición de la activación de células T primarias se midió cuantificando la liberación de citocinas, incluyendo factor alfa de necrosis tumoral (TNF), interleucina 2 (IL-2), interleucina 4 (IL-4), gamma-interferón (IFNg), y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GMSCF), en respuesta a la coestimulación de TCR/CD28.
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7.18.5.2 Identificación para la inhibición de la activación de células T Jurkat
Células T Jurkat humanas (clon N) se cultivaron de forma normal en medio RPMI 1640 (Mediatech) suplementado con 10% de suero fetal de ternera (FBS) (Hyclone), penicilina y estreptamicina. El proceso de identificación tuvo lugar a lo largo de tres días.
En el primer día de la identificación, las células cultivadas se hicieron girar en una centrífuga (1000 rpm, 5 minutos) y se resuspendieron a 3,0 X 10^{5} células/ml en RPMI + 5% de FBS. En el segundo día de la identificación, las células se hicieron girar a 1000 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en RPMI + 5% de FBS a 1,3 X 10^{5} células/ml. Se añadieron 85 \mul de esta suspensión celular a los pocillos de placas de 96 pocillos con fondo en U (Corning). Se añadieron a cada pocillo 85 \mul de compuesto o RPMI diluido + 5% de FBS (como control) solamente, y se incubó a 37ºC durante 1 hora. Las células se estimularon entonces con anti-TCR (C305) a 500 ng/ml añadiendo una disolución 8X en 25 \mul a las células colocadas en placas. Las células se incubaron entonces a 37ºC durante 20 h.
En el tercer día de la identificación, las placas se hicieron girar a 2500 RPM durante 1 minuto en una centrífugadora Beckman GS-6R, y entonces se eliminó el medio. Entonces se añadió a cada pocillo 50 \mul de disolución de tinción (dilución 1:100 de anticuerpo anti-CD69-APC (Becton Dickenson) en PBS + 2% de FBS), seguido de la incubación de las placas 4 grados durante 20 minutos en la oscuridad. Entonces se añadió a cada pocillo 150 \mul de tampón de lavado (PBS + 2% de FBS), y las placas se hicieron girar a 3000 RPM durante 1 minuto. El sobrenadante se eliminó nuevamente, y el pelete se resuspendió sometiéndolo suavemente a vórtex. Entonces se añadieron 75 \mul de PBS + 2% de FBS + Cytofix (dilución 1:4), las placas se sometieron suavemente a vórtex y se envolvieron con papel de aluminio. Las células de las placas se leyeron usando un citómetro de flujo acoplado a un sistema de manipulación de líquidos automatizado.
Se compararon concentraciones variadas de compuesto frente al disolvente sólo para determinar la inhibición de la IC_{50} de la activación de células T de cada compuesto. Las IC_{50} representativas para compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención se muestran en la Tabla 11.
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7.18.5.3 Aislamiento de células T primarias
Células PBMC 2E8-4E8 o células T proliferantes que se hicieron crecer en rIL-2 de donantes humanos sanos se suspendieron en PBS, se hicieron girar (1500 rpm, 8-10 minutos) y se resuspendieron en 100 ml de medio completo RPMI (1% de Pen-Estrep, 1% de L-glutamina, 10 mM de HEPES). Las células se colocaron en matraces T175 (37ºC, 5% de CO_{2}), y se dejó que los monocitos se adhiriesen durante 2-3 horas. Después de la unión monocítica, las células no adherentes se cosecharon, se contaron mediante un hemocitómetro, se lavaron varias veces con PBS, y entonces se resuspendieron en medio completo de Yssel (medio IMDM modificado, con 1% de suero AB humano, 1% de Pen-Estrep, 1% de L-glutamina, 10 mM de HEPES) a 1,54E6 células/ml. Entonces se añadieron 90 ul de la dilución celular a compuestos diluidos hasta 2X en medio de Yssel, y se incubó durante 30 minutos a 37ºC (5% de CO_{2}). Después de esta etapa de preincubación, la mezcla de compuesto/células se transfirió a placas de estimulación, como se describe más abajo.
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7.18.5.4 Identificación para la inhibición de la producción de citocinas en célula T primaria estimulada
Se prepararon placas de estimulación revistiendo placas de 96 pocillos con 5 \mug/ml de \alphaCD3 (BD PharMingen, número de catálogo 555336) + 10 \mug/ml de \alphaCD28 (Beckman Coulter, número de catálogo IM1376) en PBS (sin Ca^{2+}/Mg^{2+}) a 37ºC (5% CO_{2}) durante 3-5 horas. Después de la incubación con los anticuerpos de estimulación, el cóctel se retiró, y las placas se lavaron 3 veces con PBS antes de la adición de la mezcla de células T primaras/compuesto.
La mezcla de compuesto/células se transfirió a las placas de estimulación y se incubó durante 18 h a 37ºC (5% de CO_{2}). Después de la estimulación celular, se transfirieron \sim150 \mul de sobrenadante procedente de cada pocillo a placas de filtro de 96 pocillos (placas de filtro Corning PVDF), se hicieron girar (2000 rpm, 2-3 minutos) y se usó inmediatamente para medidas de ELISA o LUMINEX, o se congeló a -80ºC para un uso futuro.
Se llevaron a cabo ELISA de IL-2 usando el kit de ELISA de IL-2 humana Quantikine (R&D Systems, número de catálogo D2050) como se describe por el fabricante, y se midió la absorción en un espectofotómetro a 450 nm de longitud de onda. Se restaron los valores del blanco, y las absorbancias se convirtieron en pg/ml basándose en la curva patrón.
Se llevó a cabo la multiplexación del ensayo de Luminex para IL-2, GMSCF, IL-4 e IFNg esencialmente como se describe por el fabricante (Upstate Biotechnology). Esencialmente, se diluyeron 50 ul de muestra en 50 ul de diluyente de ensayo y 50 ul de tampón de incubación, después se incubó con 100 ul de anticuerpo de detección diluido, durante 1 h a RT en la oscuridad. La placa de filtro se lavó 2x en tampón de lavado, después se incubó con 100 ul del reactivo secundario diluido (SAV-RPE), durante 30 min a RT en la oscuridad. Finalmente, las placas se lavaron 3 veces y se realizó la identificación de las perlas y se midió la RPE fluorescente mediante el instrumento
Luminex.
Se compararon concentraciones variadas de compuesto con el disolvente sólo para determinar la inhibición de IC_{50} de la activación de las células T de cada compuesto. Las IC_{50} representativas para los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención se muestran en la Tabla 11.
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7.18.6 Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención inhiben la activación de células B 7.18.6.1 Descripción
La capacidad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención para inhibir la activación de células B se demostró usando células B primarias en un ensayo con marcador de superficie celular usando un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS). La inhibición de la activación de células B primarias en respuesta a la estimulación del receptor de células B (BCR) se midió cuantificando el aumento del marcador de la superficie celular
CD69.
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7.18.6.2 Aislamiento de células B primarias
Células B humanas primarias se aislaron de capa leucocitaria, la capa de glóbulos blancos que se forma entre los glóbulos rojos y las plaquetas cuando se centrifuga la sangre anticoagulada, o de sangre reciente usando perlas CD19-Dynal® y un FACS. La capa leucocitaria se obtuvo del Stanford Medical School Blood Centre, preparada en el mismo día por el banco de sangre, almacenada y transportada en frío (con hielo). La capa leucocitaria (aprox. 35 ml) se colocó en un recipiente cónico estéril de 500 ml para centrífugadora y se enfrió en hielo, y después se diluyó con PBS fría que contiene 0,2% de BSA (Sigma: A7638) y citrato de sodio (0,1%, Sigma: S-5570) (P-B-C) hasta un volumen total de 200 ml, y se mezcló suavemente. Se recogió sangre reciente de donantes en tubos al vacío de 10 ml que contienen heparina (1 tubo al vacío recoge aproximadamente 8,5 ml de sangre). La sangre se enfrió en hielo, se transfirió a tubos falcon de 50 ml (20 ml/tubo) o un recipiente estéril cónico de 500 ml para centrífugadora, y se diluyó con un volumen igual de P-B-C.
Se colocaron en forma de capa 25 ml de sangre diluida o capa leucocitaria sobre 15 ml de Ficoll frío, y se colocó nuevamente en hielo. La sangre colocada sobre Ficoll se centrifugó (Beckman GS-6R) durante 45 minutos a 2000 rpm, 4ºC, para separar las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de los glóbulos rojos (RBC) y granulocitos. La capa acuosa superior se aspiró entonces hasta 2,54 centímetros por encima de la capa de PBMC. Las PBMC se transfirieron desde cada 2 tubos ficoll a un tubo falcon limpio de 50 ml (= aprox. 10 ml/tubo). Las PBMC transferidas se diluyeron 5x con PBS enfriada con hielo con 0,2% de BSA (P-B), y se centrifugaron durante 20 min a 1400 rpm y 4ºC. El sobrenadante (este puede estar turbio) se aspiró entonces, y las PBMC se resuspendieron en 25 ml de P-B y las células se contaron (usando una dilución 1:5) y se mantuvieron en hielo.
Las células se seleccionaron entonces positivamente usando anticuerpo anti-CD19 acoplado a perlas magnéticas (Dynal®) según las instrucciones del fabricante. La cantidad aproximada requerida de perlas CD19-Dynal® (Dynaperlas revestidas con CD19 M-450 (pabB), Dynal®) se calculó estimando el número de células B como 5% de las PBMC contadas, y añadiendo aproximadamente 10 perlas por célula desde el lote madre de perlas (4x10^{8} perlas/ml). Las perlas CD19-Dynal® se lavaron 2x en P-B en un tubo de 5 ml usando el imán Dynal®, y después se añadieron a las PBMC suspendidas. Esta mezcla se hizo pasar entonces a través del imán Dynal® y se lavó varias veces para separar las células unidas a las perlas.
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7.18.6.3 Identificación de compuestos para la inhibición de la activación de células B
Tras la separación, las perlas y el anticuerpo se eliminaron usando Dynal® CD19-DETACHaBEAD® durante 45 min a 30ºC. El rendimiento es típicamente 2X10^{7} células B por capa leucocitaria. Las células B se lavaron y se resuspendieron como 1E6 células/ml en RPMI1640+10% de FBS+ Penicilina/Estreptavidina + 1 ng/ml de IFN\alpha8. Las células se dejaron reposar toda la noche 37ºC y 5% de CO_{2}.
\newpage
Al siguiente día, las células se lavaron y se resuspendieron en RPMI + 2,5% de FBS hasta 1X10^{6} células/ml. Las células se repartieron entonces en partes alícuotas en una placa de 96 pocillos con fondo en V (Corning), a 65 ul de células por pocillo. Mediante robot, se añadieron 65 ul de un compuesto 2x a las células con concentración final de DMSO a 0,2%, y se incubó durante 1 h a 37ºC. Las células se estimularon entonces con 20 ul de 7,5x \alpha-IgM de Jackson Laboratories (final 5 ug/ml) durante 24 h. En el día 3, las células se hicieron girar y se tiñeron para CD69, y se analizaron mediante FACS en los hepatocitos (mediante dispersión de luz).
Se compararon concentraciones variadas de compuesto frente al disolvente sólo para determinar la inhibición de IC_{50} de la activación de células B de cada compuesto. Las IC_{50} representativas para los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención se muestran en la Tabla 11.
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7.18.7 Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención inhiben la activación de macrófagos 7.18.7.1 Descripción
La capacidad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención para inhibir la activación de macrófagos diferenciados se demostró midiendo la liberación de citocinas a partir de macrófagos estimulados. La liberación de factor alfa de necrosis tumoral (TNF) e interleucina 6 (IL-6) se cuantificó en respuesta a la estimulación con IgG o LPS.
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7.18.7.2 Purificación y cultivo de macrófagos humanos
Se purificaron monocitos CD14+ a partir de PBMC (Allcells # PB002) usando el kit de aislamiento de monocitos (Miltenyi biotec #130-045-501) según las instrucciones del fabricante. La pureza se evaluó midiendo el porcentaje de células CD14+ mediante citometría de flujo. Típicamente se logró una pureza > 90%. Las células CD14+ purificadas se colocaron entonces en placas (6x10^{6} células/cápsula de TC de 150 cm en 15 ml de medio) en Macrophage-SFM (Gibco #12065-074) con 100 ng/ml de M-CSF (Pepro Tech #300-25), y se dejaron diferenciar durante cinco días. Al final de ese período, la morfología celular y los marcadores de superficie celular (CD14, HLA-DR, B7.1, B7.2, CD64, CD32, y CD16) reflejaron la presencia de macrófago diferenciado
maduro.
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7.18.7.3 Estimulación con IgG
Placas de 96 pocillos Immulon 4HBX (VWR #62402-959) se revistieron con IgG humana reunida (Jackson Immunoresearch lab#009-000-003) a 10 ug/pocillo toda la noche a 4ºC, o 1 h a 37ºC. También se revistió un control negativo, que consiste en el fragmento F(ab')2, para evaluar la estimulación de fondo. El anticuerpo no unido se eliminó por lavado 2x con 200 ul de PBS. Se añadieron a cada pocillo 20 ul de compuesto 5X, seguido de la adición de 15k células de macrófago diferenciado en 80 ul que se había raspado y liberado de las placas. Las células se incubaron durante 16 h en un incubador a 37ºC, y los sobrenadantes se recogieron para el análisis con Luminex para IL-6 y TNF\alpha, esencialmente como se describe para las células T primarias, anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
7.18.7.4 Estimulación con LPS
Para la estimulación con LPS, se añadieron 10 ul de una disolución madre 10X a la mezcla de células preincubada-compuesto, hasta una concentración final de 10 ng/ml. Las células se incubaron entonces durante 16 h a 37ºC, y los sobrenadantes se analizaron como se describe anteriormente.
Se compararon concentraciones variadas de compuesto frente al disolvente sólo para determinar la IC_{50} de cada compuesto para cada citocina. Las IC_{50} representativas para compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención se muestran en la Tabla 11.
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Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle para facilitar la comprensión, será manifiesto que se pueden realizar algunos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anejas. En consecuencia, las realizaciones descritas se han de considerar como ilustrativas y no restrictivas, y la invención no se limitará a los detalles dados aquí, sino que se puede modificar dentro del alcance y equivalentes de las reivindicaciones anejas.
Todas las referencias bibliográficas y de patentes citadas en toda esta Solicitud se incorporan como referencia en la Solicitud para todos los fines.

Claims (45)

1. Un compuesto de 2,4-pirimidindiamina para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria distinta de colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, y enfermedad inflamatoria del intestino idiopática, en el que el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es:
\quad
un compuesto de formula estructural (I):
\vskip1.000000\baselineskip
790 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
o una sal, hidrato, solvato y/o un N-óxido del mismo, en la que:
\quad
L^{1} y L^{2} son cada uno un enlace directo;
\quad
R^{2} se selecciona del grupo que consiste en fenilo monosustituido en la posición 3 ó 5 con un grupo R^{8}, fenilo di- o tri-sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{8}, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo;
\quad
R^{4} se selecciona del grupo que consiste en fenilo sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{8}, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo;
\quad
en la que, para R^{2} y R^{4}, cada uno de dicho heteroarilo opcionalmente sustituido, independientemente entre sí, se selecciona del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
791
7910
792 
\newpage
en las que:
\quad
p es un número entero de uno a tres;
\quad
cada - - - representa independientemente un enlace sencillo o un doble enlace;
\quad
R^{35} es hidrógeno o R^{8};
\quad
X se selecciona del grupo que consiste en CH, N y N-O;
\quad
cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S y NH;
\quad
cada Y^{1} se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, SO, SO_{2}, SONR^{36}, NH y NR^{37};
\quad
cada Y^{2} se selecciona independientemente del grupo que consiste en CH, CH_{2}, O, S, N, NH y NR^{37};
\quad
R^{36} es hidrógeno o alquilo;
\quad
R^{37} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y un progrupo seleccionado del grupo que consiste en arilo, arilalquilo, heteroarilo, R^{a}, R^{b}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)R^{8}, -CR^{a}R^{b}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-PO(OR^{8})_{2}, -C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -C(O)R^{8}, -C(O)CF_{3} y -C(O)-NR^{8}-C(O)R^{8};
\quad
R^{38} se selecciona del grupo que consiste en alquilo y arilo;
\quad
A se selecciona del grupo que consiste en O, NH y NR^{38};
\quad
R^{9}, R^{10}, R^{11} y R^{12} se selecciona cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, halógeno, haloalcoxi, aminoalquilo e hidroxialquilo, o, como alternativa, R^{9} y R^{10} y/o R^{11} y R^{12} se toman juntos para formar un cetal;
\quad
cada Z se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi, ariloxi, éster, y carbamato;
\quad
Q se selecciona del grupo que consiste en -OH, -OR^{8}, -NR^{c}R^{c}, -NR^{39}-CHR^{40}-R^{b}, -NR^{39}-(CH_{2})_{m}-R^{b} y -NR^{39}-C(O)-CHR^{40}-NR^{c}R^{c};
\quad
R^{39} y R^{40} se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo y NHR^{8};
\quad
R^{5} se selecciona del grupo que consiste en -CN, -NC, fluoro, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), haloalcoxi (C1-C3), perhaloalcoxi (C1-C3), -C(O)R^{a}, -C(O)OR^{a}, -C(O)CF_{3} y -C(O)OCF_{3};
\quad
R^{6} es hidrógeno;
\quad
R^{8} se selecciona del grupo que consiste en R^{e}, R^{b}, R^{e} sustituido con uno o más del mismo o diferente R^{a} o R^{b}, -OR^{a} sustituido con uno o más del mismo o diferente R^{a} o R^{b}, -B(OR^{a})_{2}, -B(NR^{c}R^{c})_{2}, -(CH_{2})_{m}-R^{b}, -(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -S-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -O-CHR^{a}R^{b}, -O-CR^{a}(R^{b})_{2}, -O-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-CH[(CH_{2})_{m}R^{b}]R^{b}, -S-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -S-(CH_{2})_{m}-C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -O-(CHR^{a})_{m}-C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -S-(CHR^{a})_{m}-C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -N[(CH_{2})_{m}R^{b}]_{2}, -NH-C(O)-NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -NH-C(O)-(CH_{2})_{m}-CHR^{b}R^{b} y -NH-(CH_{2})_{m}-C(O)-NH-(CH_{2})_{m}-R^{b};
\quad
cada R^{a} se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
\quad
cada R^{b} es un grupo adecuado seleccionado independientemente del grupo que consiste en =O, -OR^{d}, haloalquiloxi (C1-C3), =S, -SR^{d}, =NR^{d}, =NOR^{d}, -NR^{c}R^{c}, halógeno, -CF_{3}, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO_{2}, =N_{2}, -N_{3}, -S(O)R^{d}, -S(O)_{2}R^{d}, -S(O)_{2}OR^{d}, -S(O)NR^{c}R^{c}, -S(O)_{2}NR^{c}R^{c}, -OS(O)R^{d}, -OS(O)_{2}R^{d}, -OS(O)_{2}OR^{d}, -OS(O)_{2}NR^{c}R^{c}, -C(O)R^{d}, -C(O)OR^{d}, -C(O)NR^{c}R^{c}, -C(NH)NR^{c}R^{c}, -C(NR^{a})NR^{c}R^{c}, -C(NOH)R^{a}, -C(NOH)NR^{c}R^{c}, -OC(O)R^{d}, -OC(O)OR^{d}, -OC(O)NR^{c}R^{c}, -OC(NH)NR^{c}R^{c}, -OC(NR^{a})NR^{c}R^{c}, -[NHC(O)]_{n}R^{d}, -[NR^{3}C(O)]_{n}R^{d}, -[NHC(O)]_{n}OR^{d}, -[NR^{a}C(O)]_{n}OR^{d}, -[NHC(O)]_{n}NR^{c}R^{c}, -[NR^{a}C(O)]_{n}NR^{c}R^{c}, -[NHC(NH)]_{n}NR^{c}R^{c} y -[NR^{a}C(NR^{a})]_{n} NR^{c}R^{c};
\quad
cada R^{c} es independientemente R^{a}, o, como alternativa, dos R^{c} se toman juntos con el átomo de nitrógeno al que están enlazados para formar un cicloheteroalquilo o heteroarilo de 5 a 8 miembros que puede incluir opcionalmente uno o más de los mismos o diferentes heteroátomos adicionales, y que puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes R^{a} o grupos R^{b} adecuados;
\quad
cada R^{d} es independientemente un R^{a};
\quad
cada R^{e} se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
\quad
cada m es independientemente un número entero de 1 a 3; y
\quad
cada n es independientemente un número entero de 0 a 3; o
\quad
el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 7.4.214 a 7.4.244, 7.4.250 a 7.4.252, 7.4.256 a 7.4.258, 7.4.262 a 7.4.269, 7.4.272 a 7.4.276, 7.4.278 a 7.4.280, 7.4.283 a 7.4.289, 7.4.296, 7.4.298 a 7.4.302, 7.4.304, 7.4.305, 7.4.308 a 7.4.313, 7.4.315, 7.4.317, y 7.4.318;
\quad
con las condiciones de que en la fórmula (I):
(1)
cuando R^{2} es un fenilo sustituido, entonces R^{5} es diferente de ciano o -C(O)NHR, en el que R es hidrógeno o alquilo (C1-C6);
(2)
cuando R^{2} y R^{4} son cada uno independientemente un indol sustituido o no sustituido, entonces R^{2} y R^{4} están unidos al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular; y
(3)
el compuesto no sea
793 
\vskip1.000000\baselineskip
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{2} se selecciona del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros, benzodioxanilo, benzodioxolilo, benzoxazinilo, benzoxazolilo, benzopiranilo, benzotriazolilo, 1,4-benzoxazinil-2-ona, 2H-1,4-benzoxazinil-3(4H)-ona, 2H-1,3-benzoxazinil-2,4(3H)-diona, benzoxazolil-2-ona, dihidrocumarinilo, 1,2-benzopironilo, benzofuranilo, benzo[b]furanilo, indolilo, y pirrolilo, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{8}, en el que R^{8} es como se define en la reivindicación 1.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que uno o ambos de R^{2} y R^{4}, independientemente entre sí, es un heteroarilo opcionalmente sustituido.
4. El compuesto de la reivindicación 3, en el que R^{2} y R^{4} sin iguales.
5. El compuesto de la reivindicación 3 ó 4, en el que cada R^{35} se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, R^{d}, -NR^{c}R^{c}, -(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c}, -C(O)NR^{c}R^{c}, -(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c}, -C(O)OR^{d}, -(CH_{2})m-C(O)OR^{d} y -(CH_{2})_{m}-OR^{d}, en los que m, R^{c} y R^{d} son como se definen en la reivindicación 1.
6. El compuesto de la reivindicación 5, en el que cada m es uno.
7. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{2} es un heteroarilo opcionalmente sustituido que está unido al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular.
8. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{4} es un heteroarilo opcionalmente sustituido que está unido al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular.
9. El compuesto de la reivindicación 3, en el que R^{4} es
794
en la que R^{9} y R^{10} son como se definen en la reivindicación 1, e incluyen además, cada uno independientemente, un átomo de hidrógeno, y R^{2} es un grupo fenilo sustituido como se define en la reivindicación 1, o
795
en la que R^{35} es como se define en la reivindicación 1.
\vskip1.000000\baselineskip
10. El compuesto de la reivindicación 3, en el que R^{4} es
\vskip1.000000\baselineskip
796 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Y^{1} y Y^{2} y cada R^{35} son como se definen en la reivindicación 1, y R^{2} es
\vskip1.000000\baselineskip
797 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{35} es como se define en la reivindicación 1.
\vskip1.000000\baselineskip
11. El compuesto de la reivindicación 10, en el que Y^{1} es oxígeno, Y^{2} es NH, y uno o más restos de R^{35} es un grupo alquilo.
12. El compuesto de la reivindicación 11, en el que dos R^{35} enlazados al mismo átomo de carbono son cada uno metilo.
13. El compuesto de la reivindicación 12, en el que R^{4} es
\vskip1.000000\baselineskip
798 
\vskip1.000000\baselineskip
14. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{5} se selecciona del grupo que consiste en fluoro, fluoroalquilo (C1-C3), perfluoroalquilo (C1-C3), fluoroalcoxi (C1-C3) y perfluoroalcoxi (C1-C3).
15. El compuesto de la reivindicación 14, en el que R^{5} se selecciona de fluoro, -CF_{3} y -OCF_{3}.
16. El compuesto de la reivindicación 1, en el que uno o ambos de R^{2} y R^{4} son, independientemente entre sí, un fenilo sustituido con uno, dos o tres grupos R^{8}, en el que R^{8} es como se define en la reivindicación 1.
17. El compuesto de la reivindicación 16, en el que R^{2} y R^{4} son cada uno el mismo o diferente fenilo sustituido.
18. El compuesto de la reivindicación 16 ó 17, en el que el fenilo sustituido está mono-sustituido.
19. El compuesto de la reivindicación 18, en el que fenilo de R^{4} está sustituido en la posición ortho, meta, o para.
20. El compuesto de la reivindicación 18, en el que R^{8} se selecciona del grupo que consiste en alquilo (C1-C10), alquilo (C1-C10) ramificado, -OR^{d}, -O-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c}, -OC(O)NR^{c}R^{c}, -O-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c}, -O-C(O)OR^{a},
-O-(CH_{2})_{m}-C(O)OR^{a}, -O-C(NH)NR^{c}R^{c}, -O-(CH_{2})_{m}-C(NH)NR^{c}R^{c},-NH-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c}, -NH-C(O)NR^{c}R^{c} y NH-
(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c}, en los que m, R^{a}, R^{c}, y R^{d} son como se definen en la reivindicación 1.
21. El compuesto de la reivindicación 16 ó 17, en el que el fenilo sustituido está disustituido.
22. El compuesto de la reivindicación 21, en el que los sustituyentes k^{8} están situados en 2,3-; 2,4-; 2,5-; 2,6-; 3,4-; o 3,5-.
23. El compuesto de la reivindicación 21, en el que R^{8} se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C10), alquilo (C1-C10) ramificado, -OR^{a} opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{a} o R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c}, -OC(O)NR^{c}R^{c}, -O-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c}, -O-C(O)OR^{a}, -O-(CH_{2})_{m}-C(O)OR^{a}, O-C(NH)NR^{c}R^{c}, -O-(CH_{2})_{m}-C(NH)NR^{c}R^{c}-NH-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c}, -NH-C(O)NR^{c}R^{c} y -NH-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c}, en los que m, R^{a}, R^{b}, y R^{c} son como se definen en la reivindicación 1.
24. El compuesto de la reivindicación 16 ó 17, en el que el fenilo sustituido está trisustituido.
25. El compuesto de la reivindicación 24, en el que los sustituyentes R^{8} están situados en 2, 3, 4; 2, 3, 5; 2, 3, 6, 2, 4, 5; 2, 4, 6; 2, 5, 6; o 3, 4, 5.
26. El compuesto de la reivindicación 25, en el que cada R^{8} se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C10), alquilo (C1-C10) ramificado, -OR^{a} opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{a} o R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c}, -OC(O)NR^{c}R^{c}, -O-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c}, -O-C(O)OR^{a}, -O-(CH_{2})_{m}-C(O)OR^{a}, O-C(NH)NR^{c}R^{c}, -O-(CH_{2})_{m}-C(NH)NR^{c}R^{c}-NH-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c}, -NH-C(O)NR^{c}R^{c} y -NH-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c}, en los que m, R^{a}, R^{b}, y R^{c} son como se definen en la reivindicación 1.
27. El compuesto de la reivindicación 24, en el que el fenilo triasustituido tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
799 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que: R^{31} es metilo o alquilo (C1-C6); R^{32} es hidrógeno, metilo o alquilo (C1-C6); y R^{33} es un grupo halo.
28. El compuesto de la reivindicación 17, en el que R^{2} y R^{4} sin iguales.
29. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es un compuesto según la fórmula estructural (Ib):
\vskip1.000000\baselineskip
800 
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal, hidrato, solvato y/o un N-óxido del mismo, en la que R^{11} y R^{14} se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en hydroxi, alcoxi (C1-C6) y -NR^{c}R^{c}; R^{12} y R^{13} son cada uno hidrógeno; y R^{5}, R^{6} y R^{c} son como se definen en la reivindicación 1.
30. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es un compuesto según la fórmula estructural (Ic):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
801 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal, hidrato, solvato y/o un N-óxido del mismo, en la que:
\quad
R^{4} es fenilo opcionalmente sustituido con de 1 a 3 de los mismos o diferentes grupos R^{8}, o un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define en la reivindicación 1;
\quad
R^{5} y R^{8} son como se definen en la reivindicación 1; y
\quad
R^{18} es -O(CH_{2})_{m}-R^{b}, en el que m y R^{b} son como se definen en la reivindicación 1.
\vskip1.000000\baselineskip
31. El compuesto de la reivindicación 30, en el que R^{4} es un heteroarilo opcionalmente sustituido.
32. El compuesto de la reivindicación 30, en el que R^{18} es -O-CH_{2}-C(O)-NHCH_{3}.
33. El compuesto de la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste en:
\quad
N2,N4-Bis(3-aminofenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R921302);
\quad
N4-(3-Cloro-4-metoxifenil)-5-fluoro-N2-[3-[(N-metilamino)carbonilmetilenoxilfenil]-2,4-pirimidindiamina (R926891);
\quad
N4-(2,2-Dimetil-4H-benzo[1,4]oxazin-3-on)-6-il]-5-fluoro-N2-[3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-2,4-pirimidindiamina (R940323);
\quad
N4-[(2,2-Dimetil-4H-5-pirido[1,4]oxazin-3-on)-6-il]-5-fluoro-N2-[3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-2,4-pirimidindiamina (R940347); y
\quad
N4-[(2,2-Difluoro-4H-benzo[1,4]oxazin-3-on)-6-il]-5-fluoro-N2-(3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-2,4-pirimidindiamina (R921303).
\vskip1.000000\baselineskip
34. El compuesto de la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste en los compuestos 7.4.30 a 7.4.090, 7.4.101 a 7.4.138, 7.4.147 a 7.4.150, 7.4.152 a 7.4.180, 7.4.183, 7.4.186, 7.4.187, 7.4.194 a 7.4.211, 7.4.213, 7.4.245, 7.4.247 a 7.4.249, 7.4.253 a 7.4.255, 7.4.259 a 7.4.261, 7.4.270, 7.4.271, 7.4.277, 7.4.281, 7.4.282, 7.4.290 a 7.4.295, 7.4.297, 7.4.303, 7.4.306, 7.4.307, 7.4.314, 7.4.316, 7.4.319 a 7.4.329, 7.4.342 a 7.4.362, 7.4.372 a 7.4.382, y 7.4.384 a 7.4.445.
35. El compuesto de la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste en:
\quad
(S)-5-Fluoro-N2-[3-(N-metilamino)carbonilmetilenoxifenil]-N4-(2-metil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R909317);
\quad
(R)-5-Fluoro-N2-[3-(N-metilamino)carbonilmetilenoxifenil]-N4-(2-metil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R909317);
\quad
N4-(2,2-Difluoro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-N2-(3,5-dimetoxifenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R926970);
\quad
N2-(3-Cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2-difluoro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R926971);
\quad
N2-(3,5-Dicloro-4-hidroxifenil)-N4-(2,2-difluoro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R927048);
\quad
N2-(3,5-Dicloro-4-hidroxifenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R927051);
\quad
N2-(3-Cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R940358)
\quad
N2-(3-Cloro-4-metoxi-5-metilfenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R940361);
\quad
N4-(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(indazolin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R940363);
\quad
N4-(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(N1-metilindazolin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R940366);
\quad
N4-(2,2-Difluoro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(1-metilindazolin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R940368); y
\quad
N2-(3,5-Dimetoxifenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945401).
\vskip1.000000\baselineskip
36. El compuesto de la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste en:
\quad
N4-(3,3-Dimetil-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(N1-metilindazol-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R908592);
\quad
N4-(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-[1-(3-hidroxipropil)indazolin-5-il]-2,4-pirimidindiamina (R935432);
\quad
N4-(3-Cloro-4-metoxifenil)-5-fluoro-N2-[1-(3-hidroxipropil)indazolin-5-il]-2,4-pirimidindiamina (R935461);
\quad
N4-(2,2-Difluoro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(indazolin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R940364);
\quad
N4-[(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(indazolin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R940380);
\quad
N2-(3-Cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R940394);
\quad
N2-(3,5-Dimetil-4-metoxifenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R940395); y
\quad
N4-(4-Amino-1-benzopiran-6-il)-5-fluoro-N2-(indazol-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R950423).
\vskip1.000000\baselineskip
37. El compuesto de la reivindicación 1, que es N4-[(2,2-difluoro-4H-benzo[1,4]oxazin-3-on)-6-il]-5-fluoro-N2-(3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-2,4-pirimidindiamina (R921303).
38. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-37, que es para uso en la forma de una composición farmacéutica que comprende el compuesto y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
39. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-37, en el que la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en enfermedades autoinmunitarias que se denominan frecuentemente como trastornos autoinmunitarios de un solo órgano o de un solo tipo de células, y enfermedades autoinmunitarias que se denominan frecuentemente por implicar un trastorno autoinmunitario sistémico.
40. El compuesto de la reivindicación 39, en el que la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica autoinmunitaria, gastritis atrófica autoinmunitaria de anemia perniciosa, encefalomielitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, enfermedad de Goodpasture, trombocitopenia autoinmunitaria, oftalmia simpática, miastenia grave, enfermedad de Graves, cirrosis biliar primaria, hepatitis agresiva crónica, y glomerulopatía membranosa.
41. El compuesto de la reivindicación 39, en el que la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, síndrome de Reiter, polimiositis, dermatomiositis, esclerosis sistémica, panarteritis nudosa, esclerosis múltiple y penfigoide ampolloso.
42. El compuesto de la reivindicación 41, en el que la enfermedad autoinmunitaria es lupus eritematoso sistémico.
43. El compuesto de la reivindicación 41, en el que la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide.
44. El compuesto de la reivindicación 41, en el que la enfermedad autoinmunitaria es esclerosis múltiple.
45. El compuesto de la reivindicación 39, en el que la enfermedad autoinmunitaria es glomerulonefritis asociada con reacción de hipersensibilidad de tipo III.
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