JP2002523403A - キナゾリン誘導体 - Google Patents

キナゾリン誘導体

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JP2002523403A JP2000566255A JP2000566255A JP2002523403A JP 2002523403 A JP2002523403 A JP 2002523403A JP 2000566255 A JP2000566255 A JP 2000566255A JP 2000566255 A JP2000566255 A JP 2000566255A JP 2002523403 A JP2002523403 A JP 2002523403A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、白血病ならびにリンパ腫の治療に有用な新規なＪＡＫ−３インヒビターを提供する。この化合物は、日焼けおよびＵＶＢにより誘発される皮膚炎はもちろん、皮膚癌の治療または予防にも有用である。加えて、本発明の化合物はＵＶＢ照射による免疫抑制作用を防止することができ、自己免疫性疾患、炎症、および移植拒絶反応の治療または防止にも有用である。本発明はさらに、本発明の化合物を含む薬学的調合物、ならびにそれを用いた治療方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） シグナルトランスデューサーおよび転写アクチベータ（ＳＴＡＴ）は、ＤＮＡ
結合タンパク質ファミリーに属し、リン酸化により活性化されるまでは細胞質内
に存在している。このリン酸化事象は、ＪＡＫ３を含むヤーヌスファミリーのチ
ロシンキナーゼのメンバーによって触媒される（Ihle, J. N. Adv. Immunol. 60
: 1-35, 1995; Witthuhn, B. A., et al., Leukemia and Lymphoma. 32: 289-29
7, 1999）。
【０００２】 ＳＴＡＴの構造は、シグナルリング分子ならびに転写因子としての二重の役割
を反映している。全てのＳＴＡＴタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン、ＳＨ２ド
メイン、および転写の誘発に必要なトランスアクチベーションドメインを備えて
いる。刺激を与えられていない細胞においては、潜伏形態のＳＴＡＴが、主とし
て細胞質に集中している。リガンド結合は、各種膜内外細胞表面受容体の細胞内
ドメインにおいて、ＳＴＡＴタンパク質がそのＳＨ２ドメインで、チロシンリン
酸化モチーフと結合するのを促す（Horvath, C. M. and Darnell, J. E., Curr.
Opin. Cell. Biol. 9(2): 233-239., 1997; Levy, D. E., Cytokine Growth Fa
ctor Rev. 8(1): 81-90, 1997）。
【０００３】 一旦ＳＴＡＴが受容体に結合すると、受容体関与（receptor-associated）ヤ
ーヌスキナーゼ（ＪＡＫ）が、ＳＨ２ドメイン近くに位置する単一のチロシン残
基におけるＳＴＡＴをリン酸化する。その後、２個のＳＴＡＴが、特異的なＳＨ
２−ホスホチロシンの相互交換による相互作用（reciprocal SH2-phosphotyrosi
ne interactions）で二量化する。二量化したＳＴＡＴタンパク質は、他のＤＮ
Ａ結合タンパク質と複合体を形成することもできる。ＳＴＡＴ二量体／複合体は
、次に核へと移動し、そのＤＮＡ結合ドメインを利用して、標的遺伝子のプロモ
ータ内にあるＤＮＡ応答エレメントと相互作用する（Demoulin, J. B., et al.,
Mol. Cell. Biol. 16: 4710-6, 1996）。そしてＳＴＡＴは、トランスアクチ
ベーションドメインを通じ、直接または間接的にＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体
と相互作用し、標的遺伝子の転写を活性化する。異なるリガンドは特異なＪＡＫ
およびＳＴＡＴファミリーを使用し、これによりこの経路の利用がシグナル伝達
カスケードにおける特異性に対して指示を与え、かつ細胞応答の種々のアレイに
役立つ。ＪＡＫ３を含むヤーヌスキを患う年少者の初期白血病細胞中に多数発現
し、また近年の研究は、ＡＬＬ細胞におけるＳＴＡＴの活性化とアポトーシスを
規制するシグナルとを関連付けている（Demoulin, J. B., et al., Mol. Cell.
Biol. 16: 4710-6, 1996; Jurlander, J., et al., Blood. 89: 4146-52, 1997
; Kaneko, S., Suzuki, et al., Clin. Exp. Immun. 109: 185-193, 1997; and
Nakamura, N., et al., J. Biol. Chem. 271: 19483-8, 1996）。
【０００４】 従って、ＪＡＫ−３は、リンパ細胞、大食細胞、およびマスト細胞の機能にお
いて不可欠な役割を果たす重要な酵素である。ＪＡＫ−３を抑制する化合物は、
白血病、リンパ腫、移植拒絶反応（例えば、膵島移植拒絶反応）、骨髄移植適用
（例えば、移植片対宿主病）、自己免疫性疾患（例えば、糖尿病）、炎症（例え
ば、喘息、日焼けが関与する炎症、および皮膚癌）といったリンパ細胞、大食細
胞、またはマスト細胞の機能が関係する疾患または症状の治療または予防に有用
であると考えられる。このような症状および疾患の治療および／または予防に有
用な化合物ならびに方法に関しては、継続的に需要がある。
【０００５】 （発明の要約） 本発明は、投与される量の範囲においては無害であるＪＡＫ−３抑制化合物を
提供する。本発明のＪＡＫ−３インヒビターは、白血病ならびにリンパ腫の治療
に有用である。上記化合物は、日焼けおよびＵＶＢにより誘発される皮膚炎の治
療または予防はもちろん、皮膚癌の予防にも有用である。加えて、本発明の化合
物はＵＶＢ照射による免疫抑制作用を防止することができ、自己免疫性疾患、炎
症、および移植拒絶反応の治療または予防にも有用である。
【０００６】 本発明は、白血病やリンパ腫の治療に有用な医薬品を調製するための、ＪＡＫ
−３インヒビターの使用方法を提供する。
【０００７】 本発明は、移植拒絶反応の治療に有用な医薬品を調製するための、ＪＡＫ−３
インヒビターの使用方法を提供する。
【０００８】 本発明は、ＵＶＢ照射によって誘発される哺乳類の炎症反応の治療または低減
に有用な医薬品を調製するための、ＪＡＫ−３インヒビターの使用方法を提供す
る。
【０００９】 本発明は、哺乳類のプロスタグランジンＥ2の放出を抑制するのに有用な医薬
品を調製するための、ＪＡＫ−３インヒビターの使用方法を提供する。
【００１０】 本発明は、ＵＶＢによって誘発される哺乳類の皮膚水腫または血管透過性（va
scular permeability）の変化を予防または低減に有用な医薬品を調製するため
の、ＪＡＫ−３インヒビターの使用方法を提供する。
【００１１】 本発明は、ＵＶＢ照射によって誘発される哺乳類の皮膚の上皮細胞の損傷また
は突然変異頻度を防止または低減に有用な医薬品を調製するための、ＪＡＫ−３
インヒビターの使用方法を提供する。
【００１２】 本発明は、ＵＶＢ光線の腫瘍形成作用から哺乳類を防護するのに有用な医薬品
を調製するための、ＪＡＫ−３インヒビターの使用方法を提供する。
【００１３】 本発明は、哺乳類のＴ細胞の活動に影響を与えるのに有用な医薬品を調製する
ための、ＪＡＫ−３インヒビターの使用方法を提供する。
【００１４】 本発明は、自己免疫性疾患の治療に有用な医薬品を調製するための、ＪＡＫ−
３インヒビターの使用方法を提供する。
【００１５】 本発明はまた、薬物療法に使用方法するＪＡＫ−３抑制化合物を提供する。
【００１６】 本発明はまた、治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビタ
ーを投与することを含む、白血病やリンパ腫を治療するための治療方法を提供す
る。
【００１７】 本発明はまた、ＵＶＢ照射によって誘発される哺乳類の炎症反応を予防または
低減するための治療方法であって、治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡ
Ｋ−３インヒビターを投与することを含む治療方法を提供する。
【００１８】 本発明はまた、治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビタ
ーを投与することを含む、哺乳類のプロスタグランジンＥ2の放出を抑制するた
めの治療方法を提供する。
【００１９】 本発明はまた、治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビタ
ーを投与することを含む、ＵＶＢによって誘発される哺乳類の皮膚水腫または血
管透過性（vascular permeability）の変化を予防または低減するための治療方
法を提供する。
【００２０】 本発明はまた、治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビタ
ーを投与することを含む、ＵＶＢ照射によって誘発される哺乳類の皮膚の上皮細
胞の損傷または突然変異頻度を予防または低減するための治療方法を提供する。
【００２１】 本発明はまた、治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビタ
ーを投与することを含む、ＵＶＢ光線の腫瘍形成作用から哺乳類を防護するため
の治療方法を提供する。
【００２２】 本発明の代表的なＪＡＫ−３インヒビターは、Ｔ細胞に対して著しい抗増殖作
用を呈することが分かっており、さらにＩＬ２依存性の細胞増殖を抑制すること
が分かっている。従って、このような化合物は、移植合併症（例えば、ホストの
免疫系によるドナー臓器の拒絶）や、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ：graft versus
host disease）の発病等、骨髄移植に伴う合併症の治療に用いることができる
。
【００２３】 加えて、本発明の化合物はインスリン依存性糖尿病等の自己免疫性疾患の治療
および予防にも効果的である。さらにこの化合物は、気道の炎症（例えば、喘息
）の治療にも効果的である。
【００２４】 よって、本発明は、白血病、移植拒絶反応、ＧＶＨＤ、炎症、喘息、糖尿病を
含む自己免疫性疾患、皮膚における炎症に関与する癌の発生を治療（または予防
）するための治療方法であって、治療を要している哺乳類に対し有効量の式Ｉの
化合物を投与することを含む治療方法をも提供する。
【００２５】 本発明はまた、本明細書に開示の式Ｉで表される新規な化合物を提供すると共
に、式Ｉの化合物を含有する薬学的調合物を提供する。
【００２６】 本発明の医薬品ならびに方法に有用な、具体的なＪＡＫ−３インヒビターとし
ては、式Ｉで表される化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩である。
【化３】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、
（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキルチオ、
またはハロであり、ここで、Ｒ1〜Ｒ5における隣接する２個の基は、それらが結
合しているフェニル環と共に、例えばナフチル環またはテトラヒドロナフチル環
を形成する縮合環を任意に形成してもよく；さらに、Ｒ1〜Ｒ5における隣接する
２個の基により形成される前記環は、１、２、３、または４個のヒドロキシ、メ
ルカプト、アミノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、
（Ｃ1−Ｃ4）アルキルチオ、またはハロで任意に置換してもよく； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）
アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9と
Ｒ10全体としてメチレンジオキシである。好ましくは、Ｒ2とＲ3のうち少なくと
も一つがヒドロキシである。より好ましくは、Ｒ2とＲ3のうち少なくとも一つが
ヒドロキシであり、かつＲ1〜Ｒ5の少なくとも一つがハロである。
【００２７】 （図面の簡単な説明） 図１：図１は、代表的な式Ｉの化合物を、化合物５より合成する過程を示して
いる。
【００２８】 図２：[Ａ]タンパク質（青）の分子表面と触媒（ＡＴＰ結合）部位（黄色）を
示したＪＡＫ３のモデル。[Ｂ]ＪＡＫ３キナーゼドメインのホモロジーモデルの
リボンによる表示（Ｃαバックボーン）。ＷＨＩ−Ｐ１３１分子は、ＪＡＫ３の
触媒部位における空間充填（space-filling）モデルとして示されている。[Ｃ]
キナゾリンインヒビターＷＨＩ−Ｐ１３１（緑）が結合したＪＡＫ３モデルの触
媒部位をクローズアップした図。残基とインヒビターは空間補充原子として示さ
れている。溶媒に曝露された触媒部位の開口部は、比較的平面的なインヒビター
がＪＡＫ３に入り込み、結合するのに十分な大きさを有している。ポケットの開
口部は、残基Ｐｒｏ９０６、Ｓｅｒ９０７、Ｇｌｙ９０８、Ａｓｐ９１２、Ａｒ
ｇ９５３、Ｇｌｙ８２９、Ｌｅｕ８２９、およびＴｙｒ９０４（青の残基）によ
って決まる。ポケット内側の奥の壁は、Ｌｅｕ９０５（Ｃαバックボーン）、Ｇ
ｌｕ９０３、Ｍｅｔ９０２、Ｌｙｓ９０５、およびＡｓｐ９６７（ピンクの残基
）にライニングされ、またポケットの底部は、Ｌｅｕ９０５（側鎖）、Ｖａｌ８
８４、Ｌｅｕ９５６、およびＡｌａ９６６（黄色の残基）にライニングされてい
る。ポケットの頂部を決定する残基には、Ｌｅｕ８２８、Ｇｌｙ８２９、Ｌｙｓ
８３０、およびＧｌｙ８３１（最上部の青の残基）が含まれる。図面はインサイ
トＩＩプログラムを使用して作成。
【００２９】 図３：[Ａ]ＪＡＫ３ホモロジーモデルの触媒（ＡＴＰ結合）部位における非占
有空間のモデル。緑色で示されているのは、ＡＴＰに対する結合部位とジメトキ
シキナゾリンインヒビターに対する最適結合部位。緑色のキナーゼ活性部位領域
の総容積は、約５３０オングストローム（５３ｎｍ）である。モデリング研究は
、この領域への結合が著しいインヒビターまたはインヒビターのタンパク質は５
３０立方オングストローム（５３ｎｍ3）未満の容積を占有し、かつ結合部位領
域の形状に適合する分子サイズを有することが明らかとなっている。結合部位に
近接する他の領域で、測定可能な非占有容積を示すものを、ロイヤルブルー、ピ
ンク、黄色、およびライトブルーで示している。これらの結合領域は、インヒビ
ター分子（ロイヤルブルー）が結合できないか、あるいは溶媒分子（ピンク、黄
色、およびライトブルー）を占有するのに十分な大きさを有する領域を示してい
るに過ぎない。触媒部位に結合したＷＨＩ−Ｐ１３１のモデルを白で示し、緑色
の領域に積み重ねた。[Ｂ]キナゾリンＷＨＩ−Ｐ１３１（多色）、ＷＨＩ−Ｐ１
３２（ピンク）、およびＷＨＩ−Ｐ１５４（黄色）を有するＪＡＫ３の触媒部位
のモデル。各化合物は結合部位に適合するが、ＷＨＩ−Ｐ１３２（生物学的アッ
セイにおいて、ＪＡＫ３に対し不活性であることがわかっている）においては、
Ａｓｐ９６７と結合すべき位置にＯＨ基がない。ＷＨＩ−Ｐ１３１とＷＨＩ−Ｐ
１５４は、フェニル環のＣ４’の位置にＯＨ基を有しており、ＪＡＫ３のＡｓｐ
９６７と好適に相互作用でき、これにより抑制作用が強められる。[Ｃ]ＪＡＫ３
触媒部位への結合を補助すると予想されるジメトキシキナゾリン誘導体の特徴。
【００３０】 図４：[Ａ]５種の異なるタンパク質チロシンキナーゼ、すなわちＪＡＫ３（ピ
ンク）、ＢＴＫ（赤）、ＳＹＫ（ライトブルー）、ＩＲＫ（ダークブルー）、お
よびＨＣＫ（黄色）、の触媒部位における非保存性残基（nonconserved residue
s）の構成の比較。結合したＪＡＫ３インヒビターの５オングストローム（０．
５ｎｍ）以内の残基、すなわちＷＨＩ−Ｐ１３１（白）は、棒状の側鎖として示
されている。ＪＡＫ３のＣアルファバックボーンは、透視図であるため、まばら
なピンクの線で示されている。領域Ａ〜Ｆは、触媒部位において、非保存性残基
を含有するエリアに該当する（Ｂ図、ならびに結果および検討を参照されたい）
。ＨＣＫとＩＲＫの結晶構造座標、ならびにＪＡＫ３、ＢＴＫ、ＳＹＫのホモロ
ジーモデルを構造分析に用いた。［Ｂ］８種の異なるタンパク質チロシンキナー
ゼの触媒部位における非保存性残基。領域Ａ〜Ｆは、Ａに図示された触媒部位中
の場所について言及している。
【００３１】 図５：ＷＨＩ−Ｐ１３１がＪＡＫ３のチロシンキナーゼ活性度に及ぼす影響。
［Ａ］〜[Ｄ]適切なバキュロウイルス発現ベクターに感染させたＳｆ２１昆虫卵
巣細胞より免疫沈澱させたＪＡＫ３、ＪＡＫ１、およびＪＡＫ２を、ＷＨＩ−Ｐ
１３１で処理し、その後、本明細書に記載の方法で、生体外キナーゼアッセイを
行った。さらに、本明細書に記載の方法で、１０分間のキナーゼアッセイにおけ
るオートリン酸化を測定し、ＪＡＫの酵素活性度を求めた。キナーゼ活性度（Ｋ
Ａ）のレベルは、ベースライン活性度に対する割合（％ＣＯＮ）で表した。[Ｅ]
３２Ｄｃ２２−ＩＬ−２β細胞のＥＭＳＡ。ＷＨＩ−Ｐ１３１（１０μｇ／ｍｌ
＝３３．６μＭ）およびＷＨＩ−Ｐ１５４（１０μｇ／ｍｌ＝２６．６μＭ）（
ＷＨＩ−Ｐ１３２：１０μｇ／ｍｌ＝３３．６μＭは含まない。）は、３２Ｄｃ
２２−ＩＬ−２β細胞において、ＩＬ−２が引き金となるＪＡＫ−３依存性のＳ
ＴＡＴの活性化を抑制したが、ＩＬ−３が引き金となるＪＡＫ−１／ＪＡＫ−２
依存性のＳＴＡＴの活性化は抑制しなかった。
【００３２】 図６：ＷＨＩ−Ｐ１３１の特異性。適切なバキュロウイルス発現ベクターに感
染させたＳｆ２１昆虫卵巣細胞より免疫沈澱させたＪＡＫ３、ＳＹＫ、およびＢ
ＴＫと、ＮＡＬＭ−６ヒトＢ直系ＡＬＬ細胞より免疫沈澱させたＬＹＮと、Ｈｅ
ｐＧ２ヘパトーマ細胞より免疫沈澱させたＩＲＫとをＷＨＩ−Ｐ１３１で処理し
、本明細書に記載の方法で生体外キナーゼアッセイを行った。
【００３３】 図７：ＷＨＩ−Ｐ１３１は、濃度次第で(Concentration-Dependent Fashion)
、ミトコンドリア容積に影響を及ぼすことなくミトコンドリア膜を消極する（de
polarize）。ＮＡＬＭ−６ヒト白血病細胞を、表示のＷＨＩ−Ｐ１３１濃度にて
４８時間培養し、ＤｉＩＣ１で染色してミトコンドリア膜電位（Δψｍ）を推定
するか、もしくはＮＡＯで染色してミトコンドリア容積を検出し、その後、Ｈｅ
Ｎｅレーザを装備したセルソータを用いて分析を行った。ＷＨＩ−Ｐ１３１は、
濃度が上昇した消極ミトコンドリア（depolarized mitochondria）を、（Ａ図の
Ｍ１で示されるように）次第に増加させた。同様の濃度において、ミトコンドリ
ア容積[Ｂ]には著しい変化は検出されなかった。[Ｃ]ミトコンドリア容積（蛍光
緑）とミトコンドリア膜電位（蛍光色の赤／オレンジ）とを同時に分析するため
、細胞をＪＣ−１で染色した。未処理のＮＡＬＭ−６細胞［Ｄ．１］と、５０μ
ＭのＷＨＩ−Ｐ１３１で２４時間処理を行ったＮＡＬＭ−６細胞［Ｄ．２］とを
、ＪＣ−１で培養し、共焦レーザ走査検鏡法（confocal laser scanning micros
copy）により分析した。対照用細胞のミトコンドリアは、より明るいＪＣ−１蛍
光赤色で示すように、より高い膜電位（Δψｍ）を示した。ＪＣ−１蛍光赤色の
著しい減少が示すように、細胞をＷＨＩ−Ｐ１３１で処理すれば、ミトコンドリ
ア膜電位Δψｍが低下する。
【００３４】 図８：ＷＨＩ−Ｐ１３１は、ＮＡＬＭ−６白血病細胞においてアポトーシスを
誘発する。[Ａ]：１０μＭ〜５００μＭのＷＨＩ−Ｐ１３１で２４時間細胞を培
養し、生体内アポトーシスアッセイを行った。アポトーシス細胞の割合は、１３
８０細胞／１０フィールド／サンプルの平均値を調べて決定した。データ上の点
は、２回の別個の実験によって得られたデュプリケート式の合計の中間値である
。[Ｂ．１]、[Ｂ．２]：ＮＡＬＭ−６細胞を、１００μＭのＷＨＩ−Ｐ１３１で
４８時間培養した後、生体内アポトーシスアッセイを行い、レーザ走査共焦顕微
鏡を用いて分析を行った。ＤＭＳＯ（０．１％）で処理した対照用細胞[Ｂ．１]
と比較すると、ＷＨＩ−Ｐ１３１で培養した細胞[Ｂ．２]の幾つかにアポトーシ
ス核（蛍光黄色）が見られた。蛍光赤色は、よう化プロピジウムで染色した核を
表す。
【００３５】 図９：ＷＨＩ−Ｐ１３１は、ヒト白血病細胞におけるアポトーシスのＤＮＡ断
片化を誘発する。対照用細胞ならびに薬物処理した細胞のトリトン−Ｘ−１００
溶解物から得たＤＮＡを、記載の方法（２１）により分析し、その断片かを調べ
た。[Ａ]ＮＡＬＭ−６ヒトＢ直系ＡＬＬ細胞を、１、３、または１０μＭの最終
濃度の列挙したジメトキシキナゾリン化合物により、３７℃で２４時間処理した
。ＷＨＩ−Ｐ１３１はリードＪＡＫ３抑制化合物として使用され、他の化合物は
全てＪＡＫ３抑制作用を有さない対照用として含まれていた。[Ｂ]ＬＣ１；１９
ヒトＢ直系ＡＬＬ細胞と、対照用細胞ラインＳＱ２０ＢおよびＭ２４−ＭＥＴと
を、１または３μＭの最終濃度のＷＨＩ−Ｐ１３１により、３７℃で２４時間処
理した。
【００３６】 図１０：ｓｋｈ−１のマウスにおけるＵＶＢ誘発皮膚厚に対する化合物６の抑
制作用。雌のｓｋｈ−１マウスを局所的に１ｍｇ／ｃｍ2の化合物６で処理し、
その後、３５ｍｊ／ｃｍ2のＵＶＢ光線を照射した。各マウスの皮下脂肪厚を週
２回記録し、２回の測定結果の平均値を算出に用いた。中間値±ＳＥＭ（ｎ＝５
〜１４）をデータとして示した。ベヒクル処理した対照例と比較した場合、＊Ｐ
≦０．０５および＊＊Ｐ≦０．００５。
【００３７】 図１１：マウスあたりの平均損傷数に対する化合物６の抑制作用。雌のｓｋｈ
−１マウスを局所的に１ｍｇ／ｃｍ2の化合物６で処理し、その後、３５ｍｊ／
ｃｍ2のＵＶＢ光線を照射した。損傷数を週２回記録し、２回の測定結果の平均
値を算出に用いた。中間値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜１４）をデータとして示した。ベ
ヒクル処理した対照例と比較した場合、＊Ｐ＜０．０５。
【００３８】 図１２：各マウスにおける平均損傷容積に対する化合物６の抑制作用。雌のｓ
ｋｈ−１マウスを局所的に１ｍｇ／ｃｍ2の化合物６で処理し、その後、３５ｍ
ｊ／ｃｍ2のＵＶＢ光線を照射した。直系が１ｍｍ以上である損傷を週２回記録
し、２回の測定結果の平均値を算出に用いた。損傷容積は、本明細書の材料と方
法に記載の式を用いて算出した。中間値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜１４）をデータとし
て示した。ベヒクルで処理した対照と比較した場合、＊はＰ≦０．０５。
【００３９】 図１３：ＵＶＢ照射を２０週間行ったマウスの背面の形態的外観。雌のｓｋｈ
−１マウスを局所的に１ｍｇ／ｃｍ2の化合物６で処理し、その後、３５ｍｊ／
ｃｍ2のＵＶＢ光線を照射した。マウスに対し、週３回の照射を２０週間続けた
。２０週目にマウスに麻酔をかけ、背面を写真撮影した。パネルＡ：照射を行わ
ずにベヒクルで処理した対照例。パネルＢ：ＵＶＢを照射し、ベヒクルで処理し
たマウス。パネルＣ：ＵＶＢを照射し、化合物６で処理したマウス。倍率２倍。
【００４０】 図１４：化合物６は、ＵＶＢ誘発ＰＧＥ2合成を抑制する。ＨａＣａＴ細胞培
養物に、ＵＶＢ（２５ｍｊ／ｃｍ2）を照射もしくは擬似照射した（sham irradi
ated）。照射６０分前に化合物６（３〜３０（Ｍ））を添加し、さらにＵＶＢ照
射後にも再投与した。引き続き行われた６時間の培養で放出された累積ＰＧＥ2
は、ＥＩＡによって測定された。記載のデータは中間値である（ＳＥＭ（ｎ＝３
））。
【００４１】 図１５：化合物６は、表皮細胞における、ＥＧＦ刺激によるＰＧＥ2放出を抑
制する。５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを用い、化合物６の存在下と不在下の両方で集
密した（confluent）ＨａＣａＴ細胞培養物に刺激を与え、細胞を３７℃で６時
間培養した。培養後、上澄み液を収集し、培養時に放出された累積ＰＧＥ2をＥ
ＩＡにより測定した。記載のデータは中間値である（ＳＥＭ（ｎ＝５））。
【００４２】 図１６：ＵＶＢ光線による損傷後のｓｋｈ−１マウスの皮下脂肪厚に対し、化
合物６が及ぼす影響。ｓｋｈ−１マウスを化合物６（１６ｍｇ／ｋｇ; ｉ．ｐ．
ボーラス静脈内注射）で２日間前処理した。ＵＶＢ照射の日、マウスに麻酔をか
け、ＵＶＢ照射の１５分前に１.５ｍｇ／ｃｍ2の化合物６をその背面に塗りつけ
た後、ＵＶＢ光線（２５０ｍｊ／ｃｍ2）を照射した。そして、照射後１日目か
ら５日目まで、皮下脂肪厚を測定した。データは中間値で表した（ＳＥＭ（ｎ＝
５〜３４））。
【００４３】 図１７：ｓｋｈ−１マウスの皮膚における、ＵＶＢ誘発性血漿滲出の抑制。血
漿滲出に関しては、ＵＶＢ照射（２５０ｍｊ／ｃｍ2）後における図中に表示の
時期に、本明細書に記載の方法および材料により皮膚抽出物中のエバンスブルー
の吸光度を測定して評価した。記載のデータは中間値である（ＳＥＭ（ｎ＝５〜
１７））。
【００４４】 図１８：化合物６がＵＶＢ照射後４日目における皮膚形態に及ぼす影響。ｓｋ
ｈ−１マウスを化合物６（１６ｍｇ／ｋｇ; ｉ．ｐ．ボーラス静脈内注射）で２
日間前処理し、照射１５分前に１.５ｍｇ／ｃｍ2の化合物６をその背面に塗りつ
け、ＵＶＢ光線（２５０ｍｊ／ｃｍ2）を照射した。４日目にマウスに麻酔をか
け、背面を写真撮影した。倍率２倍。
【００４５】 図１９：化合物６による、ｓｋｈ−１マウスの皮膚におけるＵＶＢ誘発性の組
織学的変化の抑制。図面説明文３（Figure legend 3）に記載したのと同様の手
順により、マウスを薬物処理してＵＶＢ（２５０ｍｊ／ｃｍ2）を照射した。照
射後４８時間目に、マウスを犠牲にしてその皮膚の生体組織検査を行い、細胞組
織のパラフィン切片をヘマトキシリンとエオシンで染色した。（ａ）対照例、（
ｂ）ＵＶＢ（２５０ｍｊ／ｃｍ2）、（ｃ）化合物６＋ＵＶＢ（２５０ｍｊ／ｃ
ｍ2）。倍率４０倍。
【００４６】 図２０：ｓｋｈ−１マウスのＵＶＢ照射皮膚における表皮細胞のアポトーシス
と、化合物６によるその抑制。照射もしくは擬似照射を行ったマウスで、薬物処
理を行ったものと行わなかったものそれぞれから、照射後４８時間目に皮膚生検
材料を採取し、得られたパラフィン切片におけるアポトーシス細胞を染色した。
図面は倍率６０倍の共焦顕微鏡が捕らえた画像である。写真中、緑の染色部分が
アポトーシス細胞である。
【００４７】 図２１：ＷＨＩ−Ｐ１３１による、ＭＬＲ（Ａ）、ＰＨＡ誘発型（Ｂ）、なら
びにＣｏｎＡ誘発型（Ｃ）脾細胞増殖の、投薬量に依存した抑制。５日間（ＭＬ
Ｒ）または３日間の培養期間中（ＰＨＡおよびＣｏｎＡ）、ＷＨＩ−Ｐ１３１を
０.１、１．０、１０、および５０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。増殖は、ＷＳ
Ｔ-１比色定量アッセイにより測定された。３〜７回の別個の実験における中間
値Ｏ．Ｄ．±ＳＥＭを結果として表示した。グループ間における統計学的な差異
を、スチューデント式テストにより分析した。
【００４８】 図２２：ＷＨＩ−Ｐ１３１を０.１、１、１０、および１００μｇ／ｍＬ添加
して行われた２４時間の培養期間後に得られたアポトーシス脾細胞（ＴＵＮＥＬ
陽性）の割合のフローサイトメトリー分析。結果は中間値±ＳＥＭで表した。グ
ループ間における統計学的な差異を、スチューデント式テストにより分析した。
【００４９】 図２３：ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）ＢＭ／脾細胞移植片を移植したＣ５７ＢＬ
６（Ｈ−２b）レシピエントの主要な組織適合性バリアにおいて誘発されるＧＶ
ＨＤに対し、ＷＨＩ−Ｐ１３１の投与が及ぼす生体内予防効果。照射（７．５Ｇ
ｙ）を行ったレシピエントに、ＢＭおよび脾細胞（各２５×１０6）を移植した
。一部のレシピエントには共通遺伝子のＢＭを移植し、残りのレシピエントに対
し、本明細書の方法と材料の箇所に記載のように、２５ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ
１３１、５０ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３２、３ｍｇ／ｋｇのサイクロスポリン
Ａ、１０ｍｇ／ｍ2のメトトレキセート、または対照用ベヒクルによる処理を毎
日行った。グループ間における生存率の差異を、生命表分析、すなわちマンテル
コックステスト（Mantel-Cox test）によって分析した。
【００５０】 図２４：ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）ＢＭ／脾細胞移植片を移植されたＣ５７Ｂ
Ｌ６（Ｈ−２b）レシピエントの主要な組織適合性バリアにおいて誘発されるＧ
ＶＨＤ対し、図２３に示された複合製剤の投与が及ぼす生体内予防効果。ＷＨＩ
−Ｐ１３１（２５ｍｇ／ｋｇ）、サイクロスポリンＡ（３ｍｇ／ｋｇ）、または
サイクロスポリンＡとＷＨＩ−Ｐ１３１とを組み合わせたもの（Ａ）をｉ．ｐ．
に投与した。グループ間における生存率の差異を、生命表分析、すなわちマンテ
ルコックステスト（Mantel-Cox test）によって分析した。
【００５１】 図２５：ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）ＢＭ／脾細胞移植片を移植されたＣ５７Ｂ
Ｌ６（Ｈ−２b）レシピエントの主要な組織適合性バリアにおいて誘発されるＧ
ＶＨＤ対し、図２３に示された複合製剤の投与が及ぼす生体内予防効果。ＷＨＩ
−Ｐ１３１（２５ｍｇ／ｋｇ）、およびＷＨＩ−Ｐ１３１とメトトレキセート（
１０ｍｇ／ｋｇ）またはＷＨＩ−Ｐ１３１とメトトレキセートとを組み合わせた
ものをｉ．ｐ．に投与した。グループ間における生存率の差異を、生命表分析、
すなわちマンテルコックステスト（Mantel-Cox test）によって分析した。
【００５２】 図２６：化合物６（６０ｍｇ／ｋｇ／日）がＧＶＨＤの発生に及ぼす影響を示
している。
【００５３】 図２７：注入による第１回目のＳＴＺ投与後より２５日間の実験期間に調査さ
れた、ＬＤＳＴＺで処理したＪａｋ３欠乏雄マウスおよび野生型（ＷＴ）雄マウ
スにおける累積的糖尿病発生率（Ａ）。統計学的な差異を、生命表分析によって
得た。
【００５４】 図２８：注入による第１回目のＳＴＺ投与後から２５日間の実験期間に調査さ
れた、ＬＤＳＴＺで処理したＪａｋ３欠乏雄マウスおよび野生型（ＷＴ）雄マウ
スにおける血糖値（ｍｇ／ｄｌ）（Ｂ）。統計学的な差異を、ＡＮＯＶＡによっ
て得た。
【００５５】 図２９：注入による第１回目のＳＴＺ投与後より２５日間の実験期間に調査さ
れた、ＬＤＳＴＺで処理したＣ５７ＢＬ／６雄マウスにおける累積的糖尿病発生
率（Ａ）。統計学的な差異を、生命表分析（マンテルコックステスト）によって
得た。
【００５６】 図３０：注入による第１回目のＳＴＺ投与後より２５日間の実験期間に調査さ
れた、ＬＤＳＴＺで処理したＣ５７ＢＬ／６雄マウスにおける血糖値（ｍｇ／ｄ
ｌ）。統計学的な差異を、ＡＮＯＶＡによって得た。
【００５７】 図３１：生後５〜２５週目まで、２０ｍｇ／ｋｇ および ５０ ｍｇ／ｋｇの
ＷＨＩ−Ｐ１３１による処理を行ったＮＯＤ雌マウスにおける糖尿病発生率（Ａ
）。ＷＨＩ−Ｐ１３１処理マウスと対照用マウス間における統計学的に有意な差
異を、生命表分析（マンテルコックステスト）によって得た。
【００５８】 図３２：生後５〜２５週目あるいは１０〜２５週目まで１００ｍｇ／ｋｇのＷ
ＨＩ−Ｐ１３１による処理を行ったＮＯＤ雌マウスにおける糖尿病発生率。ＷＨ
Ｉ−Ｐ１３１処理マウスと対照用マウス間における統計学的に有意な差異を、生
命表分析（マンテルコックステスト）によって得た。
【００５９】 図３３：Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（生後２０週）、非糖尿病対照用ＮＯＤ雌マ
ウス（生後２５週）、および１００ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１による処理を
１５または２０週間行ったＮＯＤ雌マウス（生後２５週）に対して行ったＩＰＧ
ＴＴ試験。統計学的な差異を、スチューデント式テストによって得た。ＮＯＤベ
ヒクル処理を行った対照用グループと比較した場合、＊、＊＊、＊＊＊、＊＊＊
＊はそれぞれ、ｐ＜０．０５、０．０１、０．００５、および０．０００１。
【００６０】 図３４：ＮＯＤ-scid雌マウスに対する、ＷＨＩ−Ｐ１３１処理による遅れた
養子移入。ＮＯＤ-scid雌マウスに糖尿病脾細胞を１０×１０6移入し、糖尿病が
発病するまで、５０ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１による処理を毎日行った。統
計学的に有意な差異を、生命表分析（マンテルコックステスト）によって得た。
【００６１】 図３５：Ｊａｋ３-/-マウスは、島同種移植片（Ａ）を拒絶しない。ヘマトキ
シリンとエオシン（Ｂ）、および移植後１００日目に犠牲にされたＪａｋ３-/-
レシピエントの腎臓皮膜に移植された同種島移植片のインシュリン（Ｃ）の免疫
染色。記載のデータは、＞３０切片／移植片かつ６匹のマウス／グループ。倍率
１０倍。
【００６２】 図３６：ＷＨＩ−Ｐ１３１は、ＭＬＲ反応を抑制する。応答脾細胞（responde
r splenocytes）（４×１０6／ｍｌ）とスティミュレータ脾細胞（１.６×１０6 ／ｍｌ）とを混合し、５日間の培養期間に０.１、１、１０および５０ｇ／ｍｌ
の薬剤を添加した。ＷＳＴ-１比色定量アッセイにより、増殖を測定した。結果
は、６回の別個の実験における中間値Ｏ．Ｄ．±ＳＥＭで表した。ＷＨＩ−Ｐ１
３１に曝露されていない対照用細胞における増殖と比較した場合、ｐ＝０．００
９５。
【００６３】 図３７：アポトーシス脾細胞（ＴＵＮＥＬ陽性）のフローサイトメトリー分析
。ＴＵＮＥＬ染色は、０.１、１、１０および１００μｇ／ｍｌのＷＨＩ−Ｐ１
３１で脾細胞（１.５ｘ１０6）を２０時間培養した後に行われた。結果は、中間
値±ＳＥＭで表した。グループ間における統計学的な差異を、スチューデント式
テストにより分析した。
【００６４】 図３８：ＷＨＩ−Ｐ１３１（５０および７５ｍｇ／ｋｇ）、ＷＨＩ−Ｐ１３２
（５０ｍｇ／ｋｇ）、およびサイクロスポリンＡ（２０ｍｇ／ｋｇ）による処理
が、島同種移植片生存率に及ぼす影響。ｐ値は、生命表分析（マンテルコックス
テスト）によって得た。
【００６５】 図３９：１３０ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１により、１０日間処理を行った
Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞のフローサイトメトリー分析。結果は、中間値±ＳＥＭで
表した。グループ間における統計学的な差異を、スチューデント式テストにより
分析した。
【００６６】 図４０：５０ｍｇ／ｋｇ／日のＷＨＩ−Ｐ１３１または対照用ベヒクルによる
処理を移植後の１８０日間（Ａ）行った、共通遺伝子の島を移植したレシピエン
トの非絶食時の血糖値。結果は、中間値±ＳＥＭで表した。
【００６７】 図４１：図３９と同じレシピエント、および移植を行っていない対照用マウス
に対し、移植後７０日目（Ｂ）に、８時間の絶食後に行われたＩＰＧＴＴ。結果
は、中間値±ＳＥＭで表した（Ｂ、Ｃ）。
【００６８】 図４２：図３９と同じレシピエント、および移植を行っていない対照用マウス
に対し、移植後１８０日目（Ｃ）に、８時間の絶食後に行われたＩＰＧＴＴ。結
果は、中間値±ＳＥＭで表した。
【００６９】 （発明の詳細な説明） 特に言及しない限り、以下の定義を用いるものとする。ハロはフルオロ、クロ
モ、ブロモ、またはヨードである。アルキル、アルコキシ等は、直状もしくは枝
状の基を指す。しかし、「プロピル」といった単一ラジカルについて述べる場合
は直鎖状のラジカルのみを指すものとし、また「イソプロピル」といった単一ラ
ジカル（individual radical）について述べる場合は枝鎖状のラジカルのみを指
すものとする。アリールはフェニルラジカルまたは約９〜１０の環原子を有する
オルト縮合二環式炭素環式ラジカル（ortho-fused bicyclic carbocyclic radic
al）であり、少なくとも１つの環が芳香族である。ヘテロアリールには、炭素と
非ペルオキシド酸素（non-peroxide oxygen）、硫黄、およびＮ（Ｗ）（Ｗは存
在しないかもしくはH、O、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、フェニル、またはベンジル）
からなるグループより選択される１〜４のヘテロ原子とからなる５または６の還
原子を含有する単環式芳香環の環炭素を介して結合しているラジカルと、それに
より誘導される環原子が約８〜１０のオルト縮合二環式複素環のラジカル、特に
ベンゾ誘導体もしくはプロピレン、トリメチル、またはテトラメチレンジラジカ
ルを縮合して誘導したもの、が含まれる。
【００７０】 以下に列挙するラジカル、置換基、および範囲の特定値は単なる例示に過ぎず
、ラジカルおよび置換基の規定範囲内における他の規定値やその他の値を除外す
るものではない。
【００７１】 具体的には、（Ｃ1−Ｃ4）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロ
ピル、ブチル、イソブチル、またはｓｅｃ−ブチルであってもよく；（Ｃ1−Ｃ4 ）アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、、ブトキ
シ、イソ−ブトキシ、またはｓｅｃ−ブトキシであってもよく；（Ｃ1−Ｃ4）ア
ルキルチオは、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブ
チルチオ、またはイソブチルチオであってもよく；（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルは
、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、またはイソブタノイルであってもよく
；アリールは、フェニル、インデニル、またはナフチルであってもよく；ヘテロ
アリールはフリル、イミダゾリル、トリアゾリル、トリアジニル（triazinyl）
、オキサゾイル、イソオキサゾイル、チアゾリル、イソチアゾイル、ピラゾリル
、ピロリル、ピラジニル、テトラゾリル、ピリジル、（またはそのN−オキシド
）、チエニル、ピリミジニル（またはそのN−オキシド）、インドリル、イソキ
ノリル（またはそのN-オキシド）またはキノリル（またはそのN-オキシド）であ
ってよい。
【００７２】 また、当該技術分野の熟練者であれば、キラル中心を有する本発明の化合物を
、光学的に活性なラセミ化合物の形で存在させても、孤立させてもよいことを理
解するであろう。また、同質異像を呈する化合物があってもよい。本明細書に記
載の有用な特性を有する本発明の化合物は、ラセミ化合物、光学的に活性な化合
物、多形態化合物、または立体異性形化合物、またはこれらの混合物のいずれの
形態においても本発明に含まれ、また光学的に活性な形態を作成する方法（例え
ば、再結晶技術を用いたラセミ化合物形態の分解、光学的に活性な出発物質から
の合成、キラル合成、またはキラル固定相を用いたクロマトグラフィー分離）は
当技術分野では周知であり、さらに本明細書に記載の標準的なテスト、または当
技術分野において公知な類似のテストを用いてプロスタグランジンＥ2の抑制作
用を測定することも当技術分野では周知であることは理解されるべきである。
【００７３】 具体的な化合物のグループとしては、式Ｉの化合物であって、ＸがＲ11Ｎのも
のが挙げられる。具体的な化合物の他のグループとしては、式Ｉの化合物であっ
て、ＸがＨＮのものが挙げられる。
【００７４】 具体的な化合物のグループとしては、式Ｉの化合物であって、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4
、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ10がそれぞれＨであるものが挙げられる。
【００７５】 具体的な化合物のグループとしては、式Ｉの化合物であって、Ｒ3が（Ｃ1−Ｃ 4 ）アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロ、トリフルオロメチル、またはＮＲ1 2 Ｒ13であって、ＮＲ12とＲ13がそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル
、（Ｃ1−Ｃ4）アルケニル、（Ｃ1−Ｃ4）アルキニル、（Ｃ3−Ｃ8）シクロアル
キル、または複素環であるものが挙げられる。具体的な化合物の他のグループと
しては、式Ｉの化合物であって、Ｒ3がヒドロキシのものが挙げられる。
【００７６】 具体的な化合物のグループとしては、式Ｉの化合物であって、Ｒ8が（Ｃ1−Ｃ 4 ）アルコキシであるものが挙げられる。具体的な化合物の他のグループとして
は、式Ｉの化合物であって、Ｒ8がメトキシであるものが挙げられる。
【００７７】 具体的な化合物のグループとしては、式Ｉの化合物であって、Ｒ9が（Ｃ1−Ｃ 4 ）アルコキシであるものが挙げられる。具体的な化合物の他のグループとして
は、式Ｉの化合物であって、Ｒ9がメトキシであるものが挙げられる。
【００７８】 好ましい化合物は、４−（４’−ヒドロキシル−フェニル）−アミノ−６，７
ジメトキシキナゾリンＷＨＩ−Ｐ１３１、または薬学的に許容可能なその塩であ
る。
【００７９】 好ましい化合物は、４−（３’−ヒドロキシル−フェニル）−アミノ−６，７
ジメトキシキナゾリンＷＨＩ−Ｐ１８０、または薬学的に許容可能なその塩であ
る。
【００８０】 好ましい化合物は、４−（３’，５’−ジブロモ−４’−ヒドロキシル−フェ
ニル）−アミノ−６，７ジメトキシキナゾリンＷＨＩ−Ｐ９７、または薬学的に
許容可能なその塩である。
【００８１】 好ましい化合物は、４−（３’ブロモ−４’−ヒドロキシル−フェニル）−ア
ミノ−６，７ジメトキシキナゾリンＷＨＩ−Ｐ１５４、または薬学的に許容可能
なその塩である。
【００８２】 これらの化合物は、薬学的調合物に製剤することができ、ヒトの患者等、哺乳
類のホストに対し、選択された投与手順、すなわち経口または非経口、静脈、筋
肉、局所または皮下経路での投与に適合する様々な形態で投与され得る。
【００８３】 従って、これらの物質は、例えば経口投与では、不活性の希釈液や同化可能な
食用担体等の薬学的に許可可能なベヒクルと組み合わせて体系的に投与してもよ
い。これらは硬性または軟性のゼラチンカプセル外皮に内包しても、圧縮して錠
剤にしても、また、患者の規定食中の食べ物にに直接加えてもよい。経口治療投
薬においては、このような物質を１以上の医薬品添加物と組み合せることができ
、摂取可能な錠剤、口内錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル、懸濁剤、シ
ロップ剤、カシェ剤等の形で使用してもよい。これらの調合物または調製物は、
物質を少なくとも０．１％含有していなくてはならない。かかる調合物または調
製物の割合は、もちろん変更可能であり、与えられた単位剤形の重量あたりの割
合は２〜６０重量％とするのが好都合である。治療に有用な調合物中における物
質の量は、効果的な薬用量レベルが得られる程度である。
【００８４】 錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は、トラガカントゴム、アラビアゴム
、コーンスターチ、またはゼラチン等の結着剤、リン酸二カルシウム（dicalciu
m phosphate）等の付形剤、コーンスターチ、バレイショデンプン、海藻酸等の
***剤（disintegrating agent）、ステアリン酸マグネシウム等の滑剤、ショ糖
、果糖、乳糖またはアスパルテーム等の甘味剤を含有していてもよく、またはペ
パーミント、ウィンターグリーン油、 またはサクランボ香料等の着香剤を加え
てもよい。単位剤形がカプセル剤である場合、上記のタイプの材料に加え、植物
性油またはポリエチレングリコールのような液状担体を含有させてもよい。様々
な他の材料が剤皮として、そうでなければ固形の単位剤形の物質的形態を調節す
るものとして存在していてもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤を、
ゼラチン、ワックス、シェラック、または砂糖等でコーティングしてもよい。シ
ロップ剤やエリキシルは活性化合物、甘味剤としての白糖または果糖、保存剤と
してのメチルおよびプロピルパラベン、色素、およびさくらんぼ味やみかん味な
どの着香料を含有してもよい。当然ながら、単位剤形を調整するのに用いられる
いかなる材料も、薬学的に許容可能で、さらに適用される量で使用した場合にお
いて実質的に無害でなくてはならない。加えて、上記物質を持効性調合物および
デバイス（device）に組み込むようにしてもよい。
【００８５】 これら物質は、輸液または注射により静脈内または腹腔内に投与してもよい。
物質の溶液は水中で調整することができ、また非毒性表面活性薬との混合が任意
で行える。また、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、トリアセチン、
およびこれらの混合物ならびに油の中で分散液を調整することも可能である。通
常の貯蔵および使用条件下において、このような調製物は微生物の発育を防止す
る保存剤を含んでいる。
【００８６】 注射や輸液に適する医薬品剤形には、無菌水溶液または分散液や無菌粉薬が含
まれる。上記無菌粉薬は、注射や輸液用の無菌水溶液または分散液の即興調整（
extemporaneous preparation）に適合した物質を含有しており、またリポソーム
のカプセルに包まれている場合もある。いずれの場合においても、剤形は最終的
には無菌で、かつ製造および貯蔵条件下において流動的で安定でなくてはならな
い。液状の担体またはベヒクルは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば
、グリコール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコール）、植物油
、非毒性グリセリルエステル系溶剤、またはこれらの好適な成分からなる溶媒ま
たは水性分散液媒体であってもよい。好適な流動性は、例えばリポソームの形成
、また分散液の場合や界面活性剤を使用した場合には、要求された粒径を保持す
ることによって保たれる。微生物の作用は、種々の抗菌剤または抗黴剤、例えば
、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸
、チメロサール等によって防止できる。糖質、緩衝剤、塩化ナトリウム等のアイ
ソトニック剤を含有させることが好ましい場合が多い。注入可能な成分の吸収を
延長するには、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼ
ラチンを成分中に使用すればよい。
【００８７】 注入可能な無菌溶液は、先に列挙した様々な他の成分を含む適切な溶媒に所要
量の物質を組み込み、その後濾過により滅菌して調製できる。無菌溶液の調整に
用いる無菌粉薬の場合、好ましい調整方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術
であり、いずれの方法においても活性化合物と予め無菌濾過した溶液中に存在す
る補足的な所望の成分とを含む粉末が得られる。
【００８８】 局所投薬においては、物質を純粋な形態、すなわち液体の状態で使用してもよ
い。しかしながら、一般的には皮膚科学的に許可可能な担体（固形であっても液
状であってもよい）と組合せ、調合物または製剤の形で皮膚に投与することが好
ましい。
【００８９】 有用な固形担体としては、タルク、クレー、微結晶性セルロース、シリカ、ア
ルミナ等、微細に分割された固形物が挙げられる。有用な液状担体としては水、
アルコールまたはグリコールまたは水とアルコール／グリコールの混合物が挙げ
られ、このような担体中に効果を呈する程度の物資を溶解または分散させる。こ
の時非毒性界面活性剤である酸を加えてもよい。与えられた用途における特性を
最大限に活かすため、フレグランスや補足的な抗菌薬等の補助薬を添加すること
も可能である。得られた液体調合物は、吸収パッドから塗布されても、包帯およ
び他の手当用品に浸透させて用いても、ポンプ型または散霧スプレーを用いて該
当部位に吹きかけてもよい。
【００９０】 合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、修飾セル
ロース、または修飾鉱質材料等の増粘剤も、液状担体と共に用いて塗り広げ可能
なペースト、ゲル剤、軟膏剤、石けん剤等を形成し、使用者の皮膚に直接塗布す
ることが可能である。
【００９１】 上記物質を皮膚に輸送するのに使用される皮膚化学的に有用な成分の例は当技
術分野においては公知である。具体的にはジャクエットら（Jacquet et al.）（
米国特許第４，６０８，３９２号）、ジェリア（Geria）（米国特許第４，９９
２，４７８号）、スミスら（Smith et al）（米国特許第４，５５９，１５７号
）およびヴォルツマン（Wortzman）（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照
されたい。
【００９２】 本発明の有用な投薬剤は、生体外作用と生体内作用を動物モデルで比較するこ
とで決定される。マウスや他の動物、およびヒトに対する効果的な投薬剤の補外
法は当技術分野においては公知である。具体的には米国特許第４，９３８，９４
９号を参照されたい。
【００９３】 一般に、ローション剤等の液状調合物中における物質濃度は、０．１〜２５重
量％であり、好ましくは０．５〜１０重量％である。ゲル剤や粉薬のような半固
形または固形調合物における濃度は０．１〜５重量％であり、好ましくは０．５
〜２．５重量％である。
【００９４】 治療にあたって必要とされる物質の量は、選択された特有の塩によってのみな
らず、投与の経路、治療される症状の特質、および患者の年齢や症状によって変
更され、最終的には付添い医師または臨床医の自由裁量により変更される。
【００９５】 しかしながら、一般に、適切な摂取量は約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば
１日あたり体重に対して約１０〜７５ｍｇ／ｋｇの範囲であり、１日あたり患者
の体重１ｋｇに対して３〜５０ｍｇであり、好ましくは６〜９０ｍｇ／ｋｇ／日
の範囲、最も好ましくは１５〜６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【００９６】 物質は、単位剤形の形で投与するのが好都合であり、例えば、活性材料を５〜
１，０００ｍｇ、好都合には１０〜７５０ｍｇ、最も好都合には５０〜５００ｍ
ｇ含有する単位剤形の形で投与される。
【００９７】 上記物質は、血漿濃度が約０．５〜７５μＭ、好ましくは約１〜５０μＭ、よ
り好ましくは約２〜３０μＭになるよう投与されるのが理想的である。これは、
例えば物質の０．０５〜５％溶液を静脈注射によって（任意で含塩物中で）投与
するか、または物質を１〜１００ｍｇ含有する巨丸剤として投与することで可能
である。持緒点滴、または間欠的な輸液により血中濃度を０．０１〜５０ｍｇ／
ｋｇ／ｈｒに保つことが望ましい。
【００９８】 また所望の摂取量を、一回の摂取もしくは適度な間隔をあけた分割摂取（例え
ば、２、３、４、またはそれ以上の一日あたりの下位的摂取）として好都合に提
供することができる。下位的摂取そのものはさらに分割可能であり、例えば通気
器からの複数吸引や、目への数滴の適用等、緩慢に間隔を空けた不連続な投与に
分割することも可能である。
【００９９】 本発明を下記の非制限的な実施例により説明する。
【０１００】
【実施例】
融点は未補正値である。1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、バリアン・マーキュリー(V
arian Mercury)300分光器を用いてＤＭＳＯ-ｄ6またはＣＤＣｌ3中で記録した。
化学シフトは、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部基準としてゼロｐｐｍで用
いて百万分の一（ｐｐｍ）で報告される。結合定数（Ｊ）はヘルツで与えられ、
略記号ｓ、ｄ、ｔ、ｑおよびｍはそれぞれ、一重線、二重線、三重線、四重線お
よび多重線を表す。赤外線のスペクトルは、ニコレット・プロテージェ(Nicolet
PROTEGE)４６０−ＩＲ分光器で記録された。質量分光(mass spectroscopy)デー
タは、フィニガン・マット(FINNIGAN MAT)９５, VG 7070E−HF G.C.システムで
ＨＰ ５９７３質量選択検知器を用いて記録された。紫外線スペクトルは、ベッ
クマン(BECKMAN)DU 7400で、ＭｅＯＨを溶媒として用いて記録された。ＴＬＣを
、プレコートしたシリカゲルプレート（Silica Gel KGF; Whitman Inc）上で実
施した。シリカゲル（２００-４００メッシュ、Whitman Inc.）は、全カラムク
ロマトグラフィー分離に用いられた。薬品は全て試薬段階で、Aldrich Chemical
Company (Milwaukee, Wis)またはSigma Chemical Company (St. Louis, MO)か
ら購入した。
【０１０１】 化学式Ｉの代表的な化合物の合成を実施例Ｉに記す。化学式Ｉのその他の化合
物は、実施例Ｉに記載の処置と同様の工程を用いれば生成可能である。
【０１０２】 実施例１ ４-(４'-ヒドロキシル-フェニル)-アミノ-６,７-ジメトキシキナゾ
リン(６)の化学合成および特性記述
【化４】 F. Nomoto et al. Chem. Pharm. Bull. 1990, 38, 1591-1595F.に記載されて
いるように、４,５-ジメトキシ-２-ニトロ安息香酸（１）を塩化チオニルで処理
してからアンモニアと反応させて、４,５-ジメトキシ-２-ニトロベンズアミド（
２）を得る。化合物（２）中のニトロ基を硫酸銅の存在下で水素化ホウ素ナトリ
ウムを用いて還元して（C.L. Thomas Catalytic Processes and Proven Catalys
ts Academic Press, New York (1970)参照）４,５-ジメトキシ-２-アミノベンズ
アミド（３）を得、これをギ酸で環流(reflux)することにより環化して６,７-ジ
メトキシキナゾリン-４(３Ｈ)-オン(４)とした。化合物（４）を燐オキシトリク
ロライド(phosphorus oxytrichloride)で環流して化合物（５）を得たが、これ
はＸがＮＨである化学式Ｉの化合物を生成する上で有効な中間体である。化合物
（５）を必須アニリンと反応させると、以下の化学式Ｉの化合物となった。
【０１０３】
【表１】 ＊Ｒ３およびＲ４は共にベンゾである。
【０１０４】 上記同様の工程を使用するかまたは他のキナゾリン化合物を生成するための当
業者周知の工程を使用することで、化学式Ｉの化合物を生成することができる。
例えば、ＸがＳ、Ｏ、またはＣＨ2である化学式Ｉの化合物は、化学式（５）の
化合物から、図１に示すような反応により生成可能である。
【０１０５】 実施例２ 選択式(selective)ＪＡＫ３インヒビターの同定 （ＪＡＫ３キナーゼドメインのホモロジーモデル構成） ＪＡＫ３のホモロジーモデルを、E.A. Sudbeck, et al., Clinical Cancer Re
search, 1999, 5, 1569-1582に記載されているように構成した。ＪＡＫ３キナー
ゼドメインの三次元座標(coordinate)は現時点では知られていないため、ＪＡＫ
３インヒビターのドッキング分析にはＪＡＫ３の構造モデルが必要であった。Ｊ
ＡＫ３のホモロジーモデルは相同(homologous)キナーゼドメインの周知の座標を
参照用として使用することによって構成される（図２）。ＪＡＫ３ホモロジーモ
デルは、最初にＪＡＫ３のタンパク質シーケンス（Swiss-Prot #P52333, Univ.
of Geneva, Geneva, Switzerland）をGenBank（National Center for Biotechno
logy Information, Bethesda,MD）から入手し幾つかのテンプレート座標(HCK、F
GFR、およびIRKといった公知のキナーゼ構造(Sicheri, F., et al., Nature. 38
5: 602-9, 1997; Mohammadi, M., et al., Cell. 86: 577-87, 1996; Mohammadi
, M., et al., Science. 276: 955-60, 1997; and Hubbard, S. R., et al., Na
ture. 372: 746-54, 1994))に関するＪＡＫ３キナーゼドメインに最も適切なシ
ーケンス配列を判断することによって組立(build)された。これは、ＩＮＳＩＧ
ＨＴ IIプログラム(InsightII, Molecular Simulations Inc. . San Diego, CA,
1996)を用いて最初にＨＣＫ、ＦＧＦＲおよびＩＲＫのキナーゼドメインのＣα
座標を重ね、それによって最善の全構造比較を行うことで遂行された。シーケン
スはその後、それらの構造の重ねあわせに基づいて配列された（アミノ酸シーケ
ンスは、そのＣαポジションが空間的に互いに関連がある場合、共に配列された
）。その配列は、他のタンパク質シーケンと異なりタンパク質中にループがある
という特徴を示した。その構造的重ねあわせは、ＩＮＳＩＧＨＴIIプログラムの
ホモロジーモデルおよびシリコングラフィックスＩＮＤＩＧＯ２コンピューター
(Silicon Graphics, Mountain View, CA)を用いて実施された。そのシーケンス
配列は手作業で行われ、重なった各Ｃαポジションにシーケンス変動プロファイ
ル(sequence variation profile)が作成された。そのシーケンス変動プロファイ
ルはその後、他に３つのタンパク質を有するＪＡＫ３キナーゼのシーケンス配列
の基本として使用される。この工程で、ＪＡＫ３のシーケンスをプログラムに導
入して、前記のシーケンス変動プロファイルに基づいて３つの周知のキナーゼタ
ンパク質と配列させた。次に、テンプレートとしてのＨＣＫの３Ｄ座標およびＩ
ＮＳＩＧＨＴIIプログラム内のホモロジーモジュールを用いて、一組の３Ｄ座標
をＪＡＫ３キナーゼシーケンスに指定(assign)した。シーケンス挿入が生じるル
ープ領域の座標を（ループの無いＨＣＫに関して）、コンピュータープログラム
から自動的に生成されプログラムＣＨＡＩＮ (Sack, J. S., J. Mol. Graphics.
6: 244-245, 1988)を用いてより理想的な幾何学的数値になるよう手作業で調整
された限定数の起こり易さ(possibilities)の中から選択した。最後に、ＪＡＫ
３のキナーゼドメインの構成モデルを、Ｘ-ＰＬＯＲプログラムを用いてエネル
ギー最小化にかけることで、モデル構築プロセスの最中に導入された立体歪を緩
和することも可能である(Brunger, A. T. X-PLOR, A System for X-ray Crystal
lography and NMR)。モデルから好ましくない立体接触(steric contacts)を選り
分け(screen)、必要があれば側鎖等を、回転異性体ライブラリーデータベースを
用いるかまたは手作業で各側鎖を回転させることによって改造する(remodel)。
ホモロジーモデル構成の工程を、ＪＡＫ１（SWISS-PROT #P23458）およびＪＡＫ
２（Genbank #AF005216）について、ＪＡＫ３モデルを構造テンプレートとして
用いて繰り返した。ＪＡＫ１、ＪＡＫ２およびＪＡＫ３の、エネルギーを最小に
したホモロジーモデルをその後、ＪＡＫ／ジメトキシキナゾリン複合体のモデリ
ング研究目的で、ジメトキシキナゾリン化合物のエネルギー最小構造モデルと一
緒に用いた。
【０１０６】 （ＪＡＫ３キナーゼドメインのホモロジーモデルを用いたドッキング工程） ＪＡＫ／３ジメトキシキナゾリン複合体のモデリングを、プログラムＩＮＳＩ
ＧＨＴII内のドッキングモジュールを使用し、またインヒビターをタンパク質結
合部位に自動的にドッキングさせるためのプログラムの親和性組(affinity suit
e)を使用することによって遂行した（ＥＧＦＲおよびＢＴＫに関して同様の工程
が既に記載されている。Ghosh, S., et al., Clin. Can. Res. 4: 2657-2668, 1
998; Mahajan, S., et al., J. Biol. Chem. 274: 9587-9599, 1999.参照）。
各化合物の様々なドッキングポジションを、結合定数Ｋiを評価したＩＮＳＩＧ
ＨＴIIでLudi(Bohm, H. J. et al., J. Comput. Aided Mol. Des. 8: 243-56, 1
994)採点工程を使用し、想定される脂肪好性、水素結合およびインヒビターとタ
ンパク質間のファン・デル・ワールス相互作用を考慮に入れて評価した。幾つか
の異なるＰＴＫの、触媒部位残基の比較を、ＩＲＫおよびＨＣＫ、ならびにＪＡ
Ｋ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＢＴＫおよびＳＹＫのモデルのキナーゼドメインの
結晶構造座標を手作業で重ねその後、ＪＡＫ３に特有の作用部位における特徴を
同定することによって行った（図３および図４）。
【０１０７】 （キナゾリン誘導体の化学合成） 文献(Rewcastle, G. W., et al., J. Med. Chem. 38: 3482-7, 1995)に記載さ
れた工程を用いてテーブル１に挙げた化合物を合成し、特性を記した。
【０１０８】 テーブル１．プロトン付加キナゾリンとＪＡＫ３キナーゼ作用部位との推定さ
れる相互作用および、ＪＡＫ３キナーゼアッセイから測定した抑制値ＩＣ50値
【表２】
【０１０９】 （免疫複合体キナーゼアッセイ） ヨトウガの一種(fall armyworm Spodotera frugiperda)の卵巣組織から取り出
したＳｆ２１（IPLB-SF21-AE）細胞（Vassilev, A., et al., J. Biol. Chem. 2
74: 1646-1656, 1999）をインビトロゲン(Invitrogen)（Carlsbad, CA）から入
手し、１０％ＦＢＳおよび１．０％抗生物質／抗真菌性正物質（GIBCO-BRL）を
加えたグレースの昆虫細胞媒体(Grace's insect cell medium)内で２６〜２８℃
に維持した。菌株細胞を懸濁液内で、６００ｍｌの総培養体積中０．２〜１．６
×１０6／ｍｌで１リットルのベルコ(Bellco)スピナーフラスコで６０〜９０ｒ
ｐｍで維持した。細胞の生存力(viability)はトリパンブルー染料排除で判断さ
れるように、９５〜１００％で維持された。Ｓｆ２１細胞をＢＴＫ、ＳＹＫ、Ｊ
ＡＫ１、ＪＡＫ２またはＪＡＫ３について、バキュロウイルス発現ベクターに感
染させた。細胞を収穫し、溶解(lyse)させて（ｐＨ７．６のTris１０ｍＭ、Ｎａ
Ｃｌを１００ｍＭ、ノニデット(Nonidet)Ｐ−４０を１％、グリセリン１０％、
ＮａＦ５０ｍＭ、Ｎａ3ＶＯ4１００μＭ、５０μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホ
ニルフッ化物、アプロトニン(aprotonin)を１０μｇ／ｍｌ、ロイペプチンを１
０μｇ／ｍｌ)、キナーゼを溶解物から免疫沈殿させ、報告されているように、
それらの酵素作用を評価分析した(Vassilev, A., et al., J. Biol. Chem. 274:
1646-1656, 1999; Uckun, F. M., et al., Science. 22: 1096-1100, 1996; Go
odman, P. A., et al., J. Biol. Chem. 273: 17742-48, 1998; Mahajan, S., e
t al., Mol. Cell. Biol. 15: 5304-11, 1995; and Uckun, F. M., et al., Sci
ence. 267: 886-91, 1995)。免疫沈殿物を前記のようなウエスタンブロット(Wes
tern blot)分析にかけた(Vassilev, A., et al., J. Biol. Chem. 274: 1646-16
56, 1999; and Uckun, F. M., et al., Science. 22: 1096-1100, 1996)。
【０１１０】 インシュリンレセプターキナーゼ（ＩＲＫ）アッセイに関して、約８０％の合
流点(confluency)まで成長させたＨｅｐＧ２ヒトヘパトーマ細胞を、血清を含ま
ないＤＭＥＭで一度洗浄し、ＣＯ2培養器内で37℃で3時間飢餓状態にした。引き
続き、細胞を室温で10分間インシュリン（Eli Lilly and Co., Indianapolis, I
N, cat# CP-410;10ユニット／ｍｌ／１０×１０6細胞）で刺激した。このＩＲＫ
活性化ステップに続いて、血清を含まない媒体で細胞を一旦洗浄してＮＰ−４０
緩衝液内で溶解させ、ＩＲＫをその溶解物から抗ＩＲβ抗体で免疫沈殿させた（
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Cat.# sc-711, polyclonal IgG）
。免疫複合体キナーゼアッセイを実施するに先立って、ビードをキナーゼ緩衝液
(ｐＨ７．４のHepesを３０ｍＭ、ＮａＣｌを３０ｍＭ、ＭｇＣｌ2を８ｍＭ、Ｍ
ｎＣｌ2を４ｍＭ)で均衡化した。ＬＹＮを、先に報告したように、ＮＡＬＭ−６
のヒト白血病細胞の細胞溶解物全体から免疫沈殿させた（Uckun, F. M., et al.
, Science. 267: 886-91, 1995; and Uckun, F. M., et al., Journal of Biolo
gical Chemistry,. 271: 6396-6397, 1996）。
【０１１１】 ＪＡＫ３免疫複合体キナーゼアッセイ（１７、２２）で、ＫＬ−２ ＥＢＶ-変
質ヒトリンパ芽Ｂ細胞(生来のＪＡＫ３キナーゼアッセイ)または昆虫の卵巣細胞
（組み換えＪＡＫ３キナーゼアッセイ）をＮＰ-４０溶解緩衝液で溶解し（ｐＨ
８のTrisを５０ｍＭ、ＮａＣｌを１５０ｍＭ、ＥＤＴＡを５ｍＭ、ＮＰ-４０を
１％、オルトバナジウム酸ナトリウムを１００μＭ、モリブデン酸ナトリウムを
１００μＭ、アプロチニンを８μｇ／ｍｌ、ロイペプチンを５μ−ｇ／ｍｌ、お
よびＰＭＳＦを５００μＭ)、１３０００ｘｇで１０分間遠心分離して不溶解牲
の物質を除去する。ＪＡＫ３に対して生成された抗血清でサンプルを免疫沈殿さ
せた。抗血清を薄め、１５μｌでタンパク質Ａセファロースで培養することによ
って免疫複合体を集めた。ＮＰ-４０溶解緩衝液で４回洗浄後、タンパク質Ａセ
ファロースのビードを一旦キナーゼ緩衝液（ｐＨ７のＭＯＰＳを２０ｍＭ、Ｍｇ
Ｃｌ2を１０ｍＭ）で洗浄し、同じ緩衝液に再度懸濁させた。２５μＣｉ[γ-32P
] ＡＴＰ（５０００Ｃｉ/ｍＭｏｌｅ）を添加して反応を開始させ、ＡＴＰの標
識を外して(unlabel)最終濃度を5μＭとした。ＡＤＦサンプル緩衝液中で４分間
沸騰させて反応を終了させた。サンプルを９．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル上で処理(run)して標識のついた(labeled)タンパク質をオートラジオグラフィ
ーで検出した。電気泳動の後、キナーゼゲルをWhatman ３Ｍフィルター紙上に乾
燥させ、分子イメージャ(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて蛍光体撮像(phosphor
imaging)にかけ、また、フィルム上にオートラジオグラフィーした。薬剤の濃度
毎に、蛍光体撮像素子単位（ＰＩＵ）でのキナーゼ作用を基線サンプルのそれと
比較することによって、キナーゼ作用指数(KA)を判断する。幾つかの実験では、
(Uckun, F. M., et al., Clin. Can. Res. 4: 901-912, 1998)に記載されている
ような冷却キナーゼアッセイが実施された。
【０１１２】 （電気泳動シフトアッセイ（ＥＭＳＡｓ）） 前記(Goodman, P. A., et al., J. Biol. Chem. 273: 17742-48, 1998)のよう
に、32Dc11/IL2Rβ細胞（Dr. James Ihle, St. Jude Children's Research Hosp
italより提供）中のシトカイン誘発性ＳＴＡＴ活性化におけるジメトキシキナゾ
リン化合物の効果を調べる目的で、ＥＭＳＡｓを実施した。
【０１１３】 （ミトコンドリア膜ポテンシャル査定） ミトコンドリアにおける変化を測定するため、細胞を7.4μg/ml(25μM)〜30μ
g/ml(200μM)の濃度で24時間または48時間、WHI-P131で培養し、特殊な蛍光染料
で染色してフローサイトメーターで分析した。ミトコンドリア膜ポテンシャル(
ΔΨｍ)を、モレキュラー・プローブス(Molecular Probes)(Eugene, OR)から入
手した親油性カチオン5,5',6,6'-テトラクロロ-1,1',3,3'-テトラエチルベンジ
ミアゾリルカルボシアニンヨージド(tetraethlybenzimidazolylcarbocyanine io
dide)(JC-1)、およびシアニン染料、1,1',3,3,3',3'-ヘキサメチリンドジカルボ
シアニンヨージド(1,1',3,3,3',3'-hexamethylindodicarbocyanine iodide)(DiI
C1(27−29)を含む２種類の染料を使って測定した。JC-1は490nmで励起されると5
27ｎｍでモノマーになり、分極度はΔΨｍ、J-アグリゲートは、シフト放出(shi
ft emission)が590nm(30)になる様に形成される。これは、フローサイトメータ
ー上で緑色信号(527nm)および緑色−オレンジ色信号(590nm)を同時に査定し、分
極(polarize)および消極(depolarize)したミトコンドリア細胞数の指数を創造す
ることによって検出できる。DiIC1、すなわち両親媒性(amphioatheic)でカチオ
ン型のシアニン染料は電圧を印加された(energized)ミトコンドリア内で凝縮し(
concentrate)、ミトコンドリア膜電位を測定する(measure)様々な研究で使用さ
れてきた(Fujii, H., et al., Histochem J. 29: 571-581, 1997; Mancini, M.,
et al., J. Cell Biol. 138: 449-469, 1997; and Petit, P. X., et al., J.
Cell Biol. 130: 157-167, 1995)。また、細胞を、JC−1に関して記載されてい
るように、40nM濃度のDiIClで30分間暗所で染色した。細胞を、635nm励起のHeNe
レーザーを備えたバンテージ・ベクトン・ディキンソン(Vantage Becton Dickin
son )(San Jose, CA)セルソーターを用いて分析したところ、666nmに蛍光が集中
した。
【０１１４】 （ミトコンドリアの質量(mass)判断） ベクトン・ディキンソン・カリバー(Becton Dickinson Calibur)・フローサイ
トメトリーおよび蛍光染料10-ｎ-ノニル-アクリジンオレンジ（ＮＡＯ）を用い
て、相対ミトコンドリア質量を測定した。これはミトコンドリアの燐脂質カルジ
オライピンを結合し、またミトコンドリア質量の指数を得るために広く用いられ
ている（Maftah, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 185-190,
1989）。
【０１１５】 （実施例２に関する結果および説明） （ＪＡＫ３キナーゼドメインのホモロジーモデル） タンパク質／インヒビターモデリング研究で用いられるＪＡＫ３の三次元座標
を、３種類のタンパク質チロシンキナーゼ(PTKs)のキナーゼドメイン(HCK（９）
、FGFR（１１）およびIRK（３７）のキナーゼドメイン)の周知の結晶構造のシー
ケンスに合わせた構造配列に基づいて構成した。図２Ａおよび１Ｂに、ＪＡＫ３
キナーゼドメインのホモロジーモデルを示すが、これは、触媒(ATP-結合)部位付
近のヒンジ領域によってつながっているＮ-端子葉およびＣ-端子葉で構成されて
いる。触媒部位はキナーゼドメインの中心領域に位置するポケットであって、Ｎ
葉とＣ葉の界面で二枚のβシートによって限定されている。触媒部位への開口部
(opening)は溶媒と接触し易いのでATPの結合が容易である。小分子インヒビター
も触媒部位に結合可能であるため、ATP結合を抑制することでATPの作用は衰える
。ＪＡＫ３モデルを分析した結果、四辺形ポケットとして描かれるようなはっき
りした特徴を持つ触媒部位が明らかになった(図２Ｃ)。ポケットの開口部は残基
Pro906、Ser907、Gly908、Asp912、Arg953、Gly829、Leu828、およびTyr904(青
色残基、図2C)によって限定される。ポケットの奥の壁(far wall deep inside t
he pocket)は、Leu905(Cαバックボーン)、Glu903、Met902、Lys905、およびAsp
967(ピンク色の残基、図２Ｃ)でライニングされており、ポケットの底部はLeu90
5(側鎖)、Val884、Leu956、およびAla966(黄色の残基、図2c)でライニングされ
ている。ポケットの頂部を限定している残基にはLeu828、Gly829、Lys830、およ
びGly831が含まれる(一番上の青色残基、図２Ｃ)。図２Ｃおよび３Ａは、ＪＡＫ
３モデルの触媒部位の大きさが約８×１１×２０オングストローム(０．８×１
．１×２．０ｎｍ)で、結合可能な体積は約５３０オングストローム3（５３ｎｍ
3）である。モデルによれば、結合領域に対する開口部に溶媒が曝露しているた
め、幾らか平面的な分子であっても、インヒビターが入り込んで結合することが
可能になる。
【０１１６】 ＪＡＫ３キナーゼドメインの触媒部位残基のほとんどが他のPTKに比べ保存さ
れたが、独特の変動が多少観察された(図４)。このような差には、BTK、IRK、お
よびHCK/LYN(領域Ａ、図４Ａ)中のアラニン残基が含まれ、これはSYKではGluに
、ＪＡＫ３ではPro906に変化する。領域Ｂでは、チロシン残基がＪＡＫ３(Tyr90
4)、BTKおよびLYNで保存されているが、HCKではPhe（これはインヒビター結合に
関してHCKとLYNとの間の唯一の明らかな残基の相違点である）に、SYKではMetに
、およびIRKではLeuに変化している。領域Cはメチオニン残基を示すもので、こ
の残基はBTK、IRKおよびHCK/LYNでは保存されているが、ＪＡＫ３ではLeu905に
、SykではAlaに変化する。領域ＤはＪＡＫ３中のMet902を示すもので、これはSY
KおよびIRKで保存されるが、BTKではThrにそしてLYNおよびHCKでは一層小さい残
基であるAlaに変化する。ＪＡＫ３中のこのMet902は、ポケットの裏壁面に位置
しポケット体積の中心に向かって突き出ているもので、結合ポケットの形状に非
常な影響を及ぼし得る。この位置では、Met902側鎖が延びているため、BTK(Thr)
およびHCK/LYN(Ala)のような残基が少ない他のキナーゼに比べ、インヒビターと
、ポケットの裏壁面をライニングする残基およびヒンジ領域との密着が妨げられ
る恐れがある。領域EのAla966は、HCK/LYNでは保存されているがIRKではGlyに、
BTKおよびSYKではより親水性の残基Serに変化する。領域Fは、インヒビターの位
置よりさらに遠くなるが、触媒部位の中で最も保存されにくい領域であり、ＪＡ
Ｋ３にAsp912、BTKにAsn、SYKにLys、IRKにSer、およびHCK/LYNにAspを含有する
(図４)。チロシンキナーゼ間の、これら残基の差異(identity differences)が、
ＪＡＫ３キナーゼドメインの選択式インヒビターを設計する基礎となる。
【０１１７】 （ＪＡＫ３インヒビターの、構造に基づく設計および合成） 強力なインヒビターがＪＡＫ３の触媒部位にどのようにすればよく適合および
結合しその結果キナーゼ抑制が起こるかを予測するために、コンピュータードッ
キング工程が使用された(図３Ｂ)。ジメトキシキナゾリン化合物WHI-P258 (4-(
フェニル)-アミノ-6,7-ジメトキシキナゾリン)は、キナゾリン部に２つのメトキ
シ基を含有するが、それ以外の環状置換基はない。ＪＡＫ３キナーゼドメインの
ホモロジーモデルを用いての分子モデリング研究より、WHI-P258はＪＡＫ３の触
媒部位に適合するが、水素結合の相互作用が限られているためおそらくはそれほ
ど強固な結合にならないことがうかがえる。Asp967は、ＪＡＫ３の触媒部位中で
主要な残基であるが、触媒部位に結合する分子がＯＨ基のような水素結合供与基
を含有する場合、その分子との間に水素結合を形成する。しかしながら、WHI-P2
58はＯＨ基を含有していないため、Asp967と都合よく相互作用し得ない。我々は
、WHI-P258のフェニル環の４'ポジションにＯＨ基が存在するためにAsp967との
間の相互作用が加えられ、それによってＪＡＫ３への結合が強固になるのではな
いかと仮定している。この仮説をテストするために、一連のジメトキシキナゾリ
ン化合物を設計し合成した。 化合物の分子量の評価がテーブル１に示されている。
【０１１８】 ＪＡＫ３の触媒部位への結合に関して観察された設計ジメトキシキナゾリン化
合物の、構造的特徴の概要を図３Ｃに示す。テーブル１の化合物の大体の分子量
は252オングストローム(25.2nm)〜307オングストローム(30.7nm)の範囲であり、
これは小さいのでＪＡＫ３キナーゼの530オングストローム3の結合部位に十分適
合する。テーブル１ではまた、ＪＡＫ３触媒部位にドッキングされた化合物につ
いて推定された結合定数（すなわちKi値）を含む分子モデリング研究の結果を挙
げている。ドッキング研究で査定された化合物は、フェニル環の別々のポジショ
ンに類似した官能基の置換基(substitutions)を含有している。
【０１１９】 テーブル１に挙げた化合物の、最小エネルギードッキングモデル(energy-mini
mized docked model)の形状は比較的平坦で、フェニル環とキナゾリン環システ
ムとの間に約4〜18゜の二面角(dihedral angles)を持つ。この形状により、分子
がＪＡＫ３の触媒部位に、より一層適合し易くなる。挙げられた化合物は全て環
状窒素(N1)を含有し、これは、ＪＡＫ３のヒンジ領域でLeu905のＮＨと水素結合
を形成することができる。Ｎ１に陽子が加えられると、ＮＨはＪＡＫ３のLeu905
のカルボニル基と代わりに相互作用可能である。フェニル環の４'ポジションに
ＯＨ基が存在することは、ＪＡＫ３の触媒部位に結合する上で特に重要であるこ
とが予測されていた。テーブル１に示すWHI-P131（Ki=2.3μMと推定）、WHI-P15
4（Ki=1.4μMと推定）およびWHI-P97（Ki=0.6μMと推定）は、好ましいＪＡＫ３
との決定的かつ強力なＪＡＫ３抑制作用を持つことが予測された。なぜならそれ
らはＪＡＫ３のAsp967との間に水素結合を形成することができるフェニル環上に
４‘ＯＨ基を含有しており、結合の促進に寄与するからである。しかしながら、
WHI-P132の２’ＯＨ基はAsp967と相互作用するのに適切な配向となっておらず、
キナゾリン環窒素との間に分子間水素結合を形成し、この結果、ＪＡＫ３の触媒
部位に対するWHI‐P132の親和性が大幅に低下するかもしれない。比較的大きい
臭素置換基（WHI−Ｐ９７、WHI−Ｐ１５４）は、その分子が結合部位に適合可能
な場合、結合部位残基と接触する分子表面積を増加させることができる。WHI−
Ｐ１５４およびWHI−Ｐ９７のモデリングにより、フェニル環が分子の縮合環基
に対しやや傾いている場合、その臭素基を収容するのに十分な空間があることが
分かる。モデリング研究結果より、WHI-P131、WHI-P154およびWHI-P97が強力な
ＪＡＫ３抑制作用を示すという仮説が立てられた。この仮説をテストし上記ＪＡ
Ｋ３ホモロジーモデルの予想値を立証するために、我々はWHI-P131、WHI-P154、
WHI-P97およびテーブル１に挙げた他５つのジメチトキシキナゾリン化合物を合
成した。
【０１２０】 （合理的に設計したジメトキシキナゾリン化合物によるＪＡＫ３の抑制） 我々はまず、KL2EBV変換形質転換したヒトリンパ芽Ｂ細胞系から免疫沈殿させ
たヒトのＪＡＫ３の酵素作用における合成ジメトキシキナゾリン化合物の効果を
比較するために、免疫複合体キナーゼアッセイを使用した。WHI-P131、WHI-P154
、およびWHI-P97は、0.6μM〜2.3μMという非常に類似した推定Ki値を持ちミク
ロモルの濃度で非常なＪＡＫ３抑制作用を示すことが予測された（これは、推定
Ki値が25μM〜72μMであったその他の化合物はこの限りではない）が、濃度次第
では(in concentration-dependent fashion)ＪＡＫ３を抑制した。測定したＩＣ 50 の値はWHI-P131では9.1μＭ、WHI-P97では11.0μM、およびWHI-P154では27.9
μMであったが、その他のジメトキシキナゾリン化合物については全て＞３００
μＭであった(テーブル１)。WHI-P131およびWHI-P154も、バキュロウイルスベク
トル発現系に発現している組み替えマウス(murine)ＪＡＫ３に対してテストが行
われ、ＩＣ50値が２３．２μｇ／ｍｌ（≒７８μＭ、図５Ａ）および４８．１μ
ｇ／ｍｌ（≒１２８μＭ、図５Ｂ）の場合、それぞれ濃度次第でＪＡＫ３を抑制
した。WHI−Ｐ１３１およびWHI−Ｐ１５４の、組み替えＪＡＫ３を抑制する性能
は４つの別個の実験で確認された。これらのキナーゼアッセイ結果は、我々の上
記モデリング研究と適合する。
【０１２１】 重要なのは、WHI-P131およびWHI-P154が免疫複合体キナーゼアッセイでの組み
替えＪＡＫ１およびＪＡＫ２に対して検出可能な抑制作用を示さなかったという
ことである（図５Ｃおよび５Ｄ）。電気泳動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡｓ）も
、32Dc11/IL2Rβ細胞中でのシトカイン誘発性ＳＴＡＴ作用における効果を調べ
ることにより、これらのジメトキシキナゾリン化合物のＪＡＫ３特性を確認する
目的で実施された。図５Ｅに示すように、WHI-P131（10μg/ｍｌ＝33.6μM）お
よびWHI-P154（10μg/ｍｌ＝、26.6μM）（ただし、比較対照化合物WHI-P132、1
0μg/ｍｌ＝33.6μMは除く）は、ＩＬ−２で刺激後、ＪＡＫ３依存性ＳＴＡＴ作
用を抑制したが、ＩＬ−３で刺激した後、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２依存性ＳＴＡＴ作
用に影響を与えなかった。モデリング研究より、この独特な(exquisite)ＪＡＫ
３特性が一部ＪＡＫ３の触媒部位に存在するが、ＪＡＫ１およびＪＡＫ２ではグ
リセリンに変化するアラニン残基（Ａｌａ９６６）に起因すると考えられること
が示唆される。結合したジメトキシキナゾリン化合物のフェニル環付近に位置し
ているこのアラニン基はフェニル基とのさらなる疎水性接触を付与し、その結果
ＪＡＫ１およびＪＡＫ２の結合部位のこの領域ではグリセリン残基が少ない割に
高い親和力(affinity)をもたらすことができる。しかしながら、WHI-131およびW
HI-P154に対する感度においてＪＡＫ３をＪＡＫ１およびＪＡＫ２と比べるとこ
のようにかなりの差がある理由を正確に理解するには、これらのキナーゼのエッ
クス線による結晶構造の判断を待たねばならないだろう。なぜなら、触媒部位の
アミノ酸が異なるだけでも構造上の違いが顕著になるからである。
【０１２２】 （チロシンキナーゼインヒビターとしてのWHI-P131の特性） 化合物WHI-P131を、ＪＡＫ３インヒビターのこの新規のジメトキシキナゾリン
クラスに対する非ヤヌス系(non-Janus family)タンパク質チロシンキナーゼの感
度を調べる目的で設計されたさらなる実験のために選択した。ＪＡＫ３に対する
WHI-P131の抑制作用は特異なものであった。なぜなら、濃度が３５０μＭ程度ま
で高くなっても、他のタンパク質チロシンキナーゼ（テーブル１、図６）、例え
ばＺＡＰ／ＳＹＫ系チロシンキナーゼＳＹＫ（図６Ｃ）、ＴＥＣ系チロシンキナ
ーゼＢＴＫ（図６Ｄ）、ＳＲＣ系チロシンキナーゼＬＹＮ(図６Ｅ)、およびレセ
プター系チロシンキナーゼＩＲＫ(図６Ｆ)、の酵素作用に影響を与えなかったか
らである。
【０１２３】 これらＰＴＫの構造分析を、ＨＣＫ（ＬＹＮのホモロジーモデルとして機能す
る）およびＩＲＫの結晶構造を用いて実施し、ＪＡＫ３、ＢＴＫおよびＳＹＫの
ホモロジーモデルを構成した。この分析により、WHI−Ｐ１３１の特性をもたら
し得る異なるチロシンキナーゼの触媒結合部位に配置された幾つかの非保存性(n
onconserved)残基が明らかになった（図４）。ドッキングされたインヒビターに
最も近く配置されたそのような残基の一つはＪＡＫ３のAla966（図４の領域Ｅに
示されている）であり、これによってWHI−１３１の疎水性フェニル環との間に
もっとも好ましい分子表面接触が起こり得る。ＬＹＮがＪＡＫ３に保存されたAl
a（Ala966）を含有していてもWHI−１３１がＬＹＮを抑制しなかったという事実
から、他の要因（残基相違）がこの選択性に寄与していることがうかがわれる。
チロシンキナーゼの触媒部位における他の非保存性残基を領域Ａ〜Ｆに示す（図
４）。残基におけるこれらの違いは全てそうであるが、なかでも、結合したイン
ヒビターと直接接触する残基が、ＪＡＫ３に関してWHI−１３１で観察された特
性に重要な役割を果たすと考えられる。
【０１２４】 実施例２は、ＪＡＫ３キナーゼドメインの新規なホモロジーモデルを、ＪＡＫ
３の強力かつ特定のインヒビターを、構造に基いて設計および合成する上で使用
できることを証明している。
【０１２５】 最後に、そのホモロジーモデルは、ＪＡＫ３の作用部位の大きさが約８オング
ストローム×１１オングストローム×２０オングストローム（０．８×１．１×
２．０ｎｍ）でありインヒビター結合に用いられる体積は約５３０オングストロ
ーム（５３ｎｍ）であることを独自に示唆している。ＪＡＫ３キナーゼの構成ホ
モロジーモデルを用いて行われた我々のモデリング研究でも、キナゾリンインヒ
ビターを改良するための重要な機会があることが判明した。ＪＡＫ３モデルより
、ＡＴＰ−結合部位に追加の体積がありその体積をキナゾリン誘導体でより活用
できることが分かる。我々のジメトキシキナゾリン化合物の平均分子量は２７７
オングストローム3で、これは５３０オングストローム3という、結合部位の推定
総体積よりかなり少ない。この結果、フェニル環の２'および３'ポジションでや
や大き目の官能基を持つ新しいインヒビターを設計する機会が生じる。ＪＡＫ３
触媒部位への結合を容易にする目的で提案されているジメトキシキナゾリン化合
物の構造的および化学的特徴には、図３Ｃに記されている以下の特徴が含まれる
。１）フェニル環における４'−ＯＨ基の存在、２）Leu905ＮＨ付近での水素結
合アクセプター（Ｎ、カルボニル、ＯＨ）、またはLeu905カルボニル付近の水素
結合ドナー（ＮＨ、ＯＨ）の存在、３）結合部位に接近し易い、比較的平坦な分
子形状、４）ＪＡＫ３触媒部位をライニングする残基によって限定される５３０
オングストロームの空間への適合性。このように、触媒部位のＪＡＫ３残基に対
する結合が優先的に生じることが予期されるため、これを、新しい強力なＪＡＫ
３のインヒビターの設計に利用できる。
【０１２６】 抗白血病剤として作用するための化合物の性能は、当該技術で周知のアッセイ
を用いるか、または実施例３に記載のアッセイに類似のアッセイを用いて判断可
能である。
【０１２７】 実施例３ 白血病アッセイ 以下の細胞系を種々の生物学的アッセイに用いた。ＮＡＬＭ−６（プレ−Ｂ−
ＡＬＬ）、ＬＣｌ；１９（プレ−Ｂ−ＡＬＬ）、ＤＡＵＤＩ（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｒ
ＡＭＯＳ（Ｂ−ＡＬＬ）、ＭＯＬＴ−３（Ｔ−ＡＬＬ）、ＨＬ６０（ＡＭＬ）、
ＢＴ−２０（乳癌）、Ｍ２４−ＭＥＴ（メラノーマ）、ＳＱ２０Ｂ（偏平上皮癌
(squamous cell carcinoma)）、およびＰＣ３（前立腺癌）。これらの細胞系は
既に報告したように（１６、１７、２０、２４、３２、３３）培養株(culture)
中で維持されていた。細胞を、様々な濃度の化合物６を含有する処理媒体中で５
０×１０4細胞／ウェル(well)の密度で６−ウェル組織培養皿に植え付け、３７
℃、湿気がある５％ＣＯ2の環境で２４〜４８時間培養した。
【０１２８】 ヒトの白血病細胞を表すＪＡＫ３に対する化合物６の細胞毒性をテストするた
めに、白血病細胞をこのＪＡＫ３インヒビターに曝露しミトコンドリア膜電位（
ΔΨｍ）およびミトコンドリア容積におけるアポトーシス関連の変化を、特殊な
蛍光性ミトコンドリアプローブおよび多重パラメータフローフローサイトメトリ
ーを用いて監視した。ΔΨｍにおける変化を測定するために、ＤｉＩＣｌ（電圧
印加した(energized)ミトコンドリアに堆積している）が用いられた。一方、ミ
トコンドリア容積は、細胞を蛍光染料であるＮＡＯで染色することで判断した。
この染料は電圧印加とは無関係で、ミトコンドリアの内膜に結合する。ＮＡＬＭ
−６白血病細胞を７．４μｇ／ｍｌ（２５μＭ）〜６０μｇ／ｍｌ（２００μＭ
）で、２４時間または４８時間化合物６で処理すると、ＤｉＩＣｌ（２７〜２９
）を用いたフローサイトメトリーによって判断されるように、濃度依存および時
間依存性で、消極ミトコンドリアの数が増加した（図７Ａ）。図７Ａに示すよう
に、消極したミトコンドリアを有するＤｉＩＣｌ陰性(negative)細胞の割合が、
ベヒクル処理比較対照細胞の１．３％から、２００μＭの化合物６で４８時間処
理した細胞では８１．６％に増加した。化合物６でミトコンドリアの消極を誘発
した平均ＥＣ50値は、ＤｉＩＣｌ染色の減少により測定されるように、２４時間
の処理では７９．３μＭで、４８時間の処理では５８．４μＭであった。ΔΨｍ
で観察された変化は、処置済みおよび未処置のＮＡＬＭ−６細胞のＮＡＯの染色
強度が実質的に等しいことから確認されるように、ミトコンドリア容積の損失が
原因ではなかった（図７Ｂ）。ΔΨｍにおけるこの相対的な変化を確認する目的
で、我々はミトコンドリア染料であるＪＣ−１を用いた。これは通常は緑色の蛍
光を発するモノマーとして溶液中に存在し、ミトコンドリアの経膜電位によって
起こる反応で赤い蛍光を発するので二量性配置(configuration)が想定される (S
miley, S. T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88: 3671-3675, 199
1)。従って、ＪＣ−１を使用することで、ミトコンドリア容積の分析（緑色の蛍
光）とミトコンドリア経膜電位（赤／オレンジ色の蛍光）の同時分析が可能にな
る。濃度を２５μＭ〜２００μＭの範囲で増加させまた曝露時間を２４時間また
は４８時間まで増加させてＮＡＬＭ−６細胞を化合物６で処理した後、我々はΔ
Ψｍとミトコンドリア容積の間の進行性解離(progressive dissociation)を観察
した。それはＪＣ−１赤／オレンジ色蛍光における減少を伴ったが、ＪＣ−１緑
色蛍光ではそれほどの急激な減少はなかった(図７Ｃおよび７Ｄ)。
【０１２９】 図７Ｃに示すように、ＪＣ−１赤／オレンジ色の蛍光−陰性細胞の割合はベヒ
クル処理した比較対照用細胞の７９.２％から２００μＭ化合物６で４８時間処
理した細胞では１６．９％に減少した。ＪＣ−１緑色蛍光についてそれに相当す
る値は、ベヒクル処理した比較対照用細胞では９９．３％で、化合物６で処理（
２００μＭで４８時間）した細胞では９９．８％であった。化合物６で誘発した
ミトコンドリアの消極に関する平均ＥＣ50値は、ＪＣ−１赤／オレンジ色蛍光が
減少することから示されるように、２４時間処理では９４．２μＭで、４８時間
処理では５０．４μＭであった。図７Ｄでは、ベヒクル処理および化合物６処理
を行った（１００μＭで４８時間）、ＪＣ−１染色したＮＡＬＭ−６細胞の単色
（赤／オレンジ）蛍光共焦点像を比較している。これらの結果を総合すると、化
合物６がＮＡＬＭ−６ヒト白血病細胞のミトコンドリア経膜電位を非常に減少さ
せることが証明される。
【０１３０】 （アポトーシスアッセイ） 化合物６で処理後、原位置末端ジデオキシヌクレオチジル(dideoxynucleotidy
l)トランスフェラーゼを介したｄＵＴＰ末端標識化（ＴＵＮＥＬ）アッセイによ
って、細胞のアポトーシス変化を調べた。ここではApopTagアポトーシス検出キ
ット(Oncor, Gaithersburg, MD)を製造者の指示通りに使用した。詳細は我々の
先の報告に記載されている。(Zhu, D.-M., et al., Clin. Can. Res. 4: 2967-2
976, 1998; D'Cruz, O., P., G., and Uckun, F. M. Biology of Reproduction.
58: 1515-1526, 1998)。
【０１３１】 ＤＮＡのアポトーシス切片(fragmentation)を検出するために、１、３および
／または１０μＭの濃度で３７℃に２４時間曝露した後で細胞を収穫した。ＤＮ
Ａは、切片（２１）分析用のTriton-X-100溶解物から生成した。すなわち、細胞
を低張１０ｍｍｏｌ／Ｌtris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴ
Ａ、０．２％トリトン−Ｘ−１００洗剤に溶解させ、その後１１，０００ｇで遠
心分離させた。アポトーシス関連のＤＮＡを検出するために、上澄みを１．２％
アガロースゲルで電気泳動させ、エチジウムブロミドで染色後にＤＮＡ切片を紫
外線で可視化した。
【０１３２】 化合物６が白血病細胞中のアポトーシスを誘発し得ることを確認するために、
原位置ＴＵＮＥＬアッセイ方法を共焦点レーザー走査検鏡法と組み合わせて用い
る、ジゴキシゲニン共役(digoxigenin-conjugated)ＵＴＰを備えた３'−ＯＨ末
端のＴｄＴを介した標識化を採用した。１０μＭから５００μＭの範囲の濃度で
の化合物６を用いて４８時間処理した後、ＮＡＬＭ−６細胞を、ＦＩＴＣ共役抗
ジオキシゲニン（緑色の蛍光）およびよう化プロピジウム対比染色（赤色蛍光）
を用いたジオキシゲニン−ｄＵＴＰ導入に関して調べた。アポトーシス細胞の割
合は濃度次第で増加し、平均ＥＣ50値は８４．６μＭ(図８Ａ)である。図８Ｂ.
１および８Ｂ．２に、ベヒクルで処理した細胞と１００μＭ化合物６で処理した
細胞のニ色共焦検鏡点像を示す。化合物６で処理した細胞はアポトーシスの黄色
い核を示した（＝緑色と赤の蛍光が重なっている）(図８Ｂ．２)。アポトーシス
のさらなる証拠が、ＤＮＡ切片アッセイに観察された。わずかな割合のアポトー
シス細胞から放出されたＤＮＡ切片が検出中に特異な感度を示すため、アポトー
シスのＤＮＡゲルアッセイは、新しい抗白血病剤の、非特異な毒性を調べるのに
最も(uniquely)適している。
【０１３３】 図９Ａに、１μＭまたは３μＭの化合物６で処理したＮＡＬＭ−６白血病細胞
の上澄みが、アポトーシスに適合する「ハシゴ状」切片パターンを備えたオリゴ
ヌクレオゾーム長ＤＮＡ切片を含有し、一方、構造的には類似しているがＪＡＫ
３抑制作用の無いジメトキシキナゾリン化合物で処理したＮＡＬＭ−６細胞の上
澄みにはＤＮＡ切片は検出されなかった。ＪＡＫ３−陽性白血病細胞（図９Ａの
ＮＡＬＭ−６細胞および図９ＢのＬＣｌ；１９細胞）と異なり、ＪＡＫ３陰性Ｓ
Ｑ２０Ｂ扁平上皮癌細胞およびＭ２４−ＭＥＴメラノーマ細胞では、化合物６で
の処理後にアポトーシスＤＮＡ切片の証拠は見られなかった（図９Ｂ）。
【０１３４】 要約すると、これらの結果より、ＪＡＫ３の特定のチロシンキナーゼインヒビ
ター化合物６がミトコンドリア膜の消極を生じさせ、ヒトＢ−リネージＡＬＬ細
胞のアポトーシス的な死を引き起こすことが、核ＤＮＡのハシゴ状切片パターン
および、ＴｄＴが存在する場合は切片状の各ＤＮＡの曝露３'−ヒドロキシル端
部のジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰ標識化によって示されるように、実験的に証
明された。
【０１３５】 （クローン原性(clonogenic)アッセイ） クローン原性腫瘍細胞に対する化合物６の抗白血病作用を、メチルセルロース
コロニーアッセイシステムを用いて調べた。(Uckun, F. M., et al., J. Exp. M
ed. 163: 347-368, 1986; Messinger, Y., et al., Clin Cancer Res. 4: 165-7
0, 1998)。すなわち、細胞（ＲＰＭＩ−１０％のＦＢＳ中１０5／ｍｌ)を一晩か
けて化合物６で３７℃で、濃度を変えて処理した。処理後、細胞を二回洗浄し、
ペトリ皿のＲＰＭＩ−１０％ＦＭＳ−０．９％メチルセルロース中で１０4また
は１０5細胞／ｍｌで平板培養し、湿度を高めた５％ＣＯ2の培養器内で３７℃で
７日間培養した。次に、白血病細胞（または腫瘍細胞）のコロニーを、反転位相
差顕微鏡(inverted phase-contrast microscope)を用いて数えた。コロニー形成
の抑制率を、以下の式を用いて算出した。
【０１３６】 抑制％＝１−テスト培養株のコロニーの中間数／比較対照培養株のコロニーの
中間数×１００
【０１３７】 化合物６の抗白血病作用を、ＡＬＬ細胞系であるＮＡＬＭ−６、ＤＡＵＤＩ、
ＬＣｌ；１９、ＲＡＭＯＳ、ＭＯＬＴ−３およびＡＭＬ細胞系ＨＬ−６０の生体
外クローン原性成長(clonogenic growth)を抑制する性能を判断することで測定
した。テーブル１に詳しく示されているように、化合物６は濃度次第でクローン
原性成長を抑制し、ＮＡＬＭ−６細胞についてはＥＣ50値が２４．４μＭ、ＤＡ
ＵＤＩ細胞については１８．８μＭであった。１００μＭでは、化合物６による
これらの白血病細胞系の生体外コロニー形成抑制率は９９％を上回った。対照的
に、化合物６はＪＡＫ３陰性Ｍ２４−ＭＥＴメラノーマまたはＳＱ扁平上皮癌細
胞系のクローン原性成長を抑制しなかった。
【０１３８】 テーブル１：クローン原性白血病に対する化合物６の効果
【表３】 ＊細胞を化合物６で処理し、その後方法説明にあるようにコロニー形成につい
て調査した。Ｎ．Ａ．＝適用不可、Ｎ．Ｄ．＝判別不能
【０１３９】 他の研究で、化合物６はＪＡＫ３を抑制するがそれ以外のタンパク質のチロシ
ンキナーゼ、例えばＪＡＫ２、ＳＹＫ、ＢＴＫ、ＬＹＮおよびＩＲＫを抑制しな
いことが分かった。ＡＬＬ細胞はＪＡＫ２を表す。同様に、Ｓｒｃ系のＰＴＫと
ＬＹＮ、Ｚａｐ／Ｓｙｋ系ＰＴＫとＳＹＫおよびＴｅｃ系ＰＴＫとＢＴＫはＡＬ
Ｌ細胞で発現され、その接着性、増殖および生存に影響を及ぼす（Vassilev, A.
, et al., J. Biol. Chem. 274: 1646-1656, 1999; Uckun, F. M., et al., Sci
ence. 267: 886-91, 1995; Kristupaitis, D., et al., J. Biol. Chem. 273 (1
5): 9119-9123, 1998; and Xiao, J., et al., J. Biol. Chem. 271: 7659-64,
1996）。ＩＲＫは白血病細胞、特にｔ(１：１９)転座(translocation)（４１−
４３）のプレ−ＢＡＬＬ細胞で検出された唯一のレセプターＰＴＫ系構成要素で
ある。化合物６はこれらのチロシンキナーゼを抑制しないので、ＡＬＬ細胞を殺
す性能をこれらの細胞中のＪＡＫ２、ＳＹＫ、ＢＴＫ、ＬＹＮまたはＩＲＫの非
特異の抑制に帰することはできない（Kaplan, G. C., et al., Biochem. Biophy
s. Res. Commun. 159(3): 1275-82, 1989; Newman, J. D., et al., Int. J. Ca
ncer. 50(3): 500-4, 1992; Bushkin, I. and Zick, Y., Biochem. Biophys. R
es. Commun. 172(2): 676-82, 1990）。
【０１４０】 上記より、式Ｉの代表的なＪＡＫ３インヒビター（化合物６）が、急性リンパ
芽球性白血病の治療に有効な治療薬であり、化合物６が白血病細胞のアポトーシ
スを引き起こすことが分かる。従って、式ＩのジメトキシキナゾリンのようなＪ
ＡＫ３用の強力な特定のインヒビターは、子供の癌の中で最もよく見られる急性
リンパ芽球性白血病の治療に有効である。
【０１４１】 皮膚癌予防または治療用の化合物の性能を、当該技術で周知のアッセイを用い
て判断するかまたは、実施例４に記載のアッセイと同様のアッセイを用いて判断
することができる。
【０１４２】 実施例４ 皮膚癌アッセイ 生後６〜７週のメスの無毛アルビノマウス(hairless albino mice)（ｓｋｈ−
１）をCharles River Laboratories（Wilmington, MA）から購入し、制御環境（
照明を１２時間明るく１２時間暗くする、２２±１℃、相対湿度６０±１０％）
に収容した。これは、ＵＳＤＡ（米国農務省）より必要な認定を受けている。マ
ウスは、米国動物福祉法の条項および国立衛生研究所（ＮＩＨ）に従い病原体の
無い環境に５匹一グループで入れられた。マウスはすべて、圧熱滅菌済みの敷き
わらを入れたマイクロアイソレーターケージ（Lab Products, Inc., NJ）に収容
された。マウスは実験の間を通して、圧熱滅菌したペレットフードと水道水を自
由に口にすることができた。マウスの世話と実験の工程は、規定のガイドライン
に沿って実行された。
【０１４３】 緩衝液で処理したホルマリンホスフェート（１０％）をFisher scientific（S
pringfield, NJ）から入手した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびリン
酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）はSigma（St. Louis, MO）から入手した。
【０１４４】 ＵＶＢ範囲（２８０〜３２０ｎｍ）で主に発光する紫外線ランプ（8-FSX24T12
/HO/UVB）をTwinsburg、OHのNational Biological Corporationから入手した。
ＵＶＢランプの照射は、ＵＶＢメーター（National Biological Corporation, T
winsburg, OHから入手した５００Ｃモデル）を用いて各照射前に判断された。Ｕ
Ｖ光に曝露するために、３匹のマウスを３つの部屋に分かれているオープン型の
２８ｃｍ×１０ｃｍのプラスチックボックスに（一部屋にマウス１匹）配置した
。プラスチックボックスを、ＵＶＢ光線のバンク(bank)下方の中央に置いてマウ
スに３５ｍｊ／ｃｍ2の量のＵＶＢを照射した。３５ｍｊ／ｃｍ2の量のＵＶＢに
曝露する時間は３０〜３４分の範囲で変化させた。ＵＶＢランプと照射を受ける
表面との間の距離は２０ｃｍであった。
【０１４５】 （腫瘍形成プロトコール） テーブル１に示すように、マウスを５〜１４匹ずつ３つのグループに分けた。
一部のマウスには、各ＵＶＢ曝露前に背面の２ｃｍ2の面積に化合物６（１．０
ｍｇ／ｃｍ2、ＤＭＳＯに溶解）を一回適用した。化合物６を適用して１５分後
にマウスにＵＶＢ(３５ｍｊ／ｃｍ2）を照射した。ＵＶＢへのマウスの曝露は、
週３回、合計２０週間にわたって実施された。比較対照用のマウスはＵＶＢ光線
曝露前にベヒクルを処理した。
【０１４６】 テーブル１：実験設計および処理規則
【表４】
【０１４７】 マウスの皮膚厚み、および直径が１ｍｍより大きい乳頭状の皮膚損傷を毎週２
回測定および記録し、２回の測定の平均値を計算に使用した。皮膚厚み、損傷数
および損傷直径の測定は、化合物６またはベヒクルのいずれかで処理したマウス
の背面２ｃｍ2の面積のみに限定した。損傷体積を式体積＝４／３πｒ3を用いて
算出した。研究の最後に、各グループ#の５〜１９の損傷を無作為に生検し、１
０％緩衝液処理済のホルマリン中で固定した。ホルマリン固定試料をパラフィン
ブロックに埋め、４μｍ厚さで切り分けて、ヘマトキシリン−エオシン染色した
。皮膚断片の病理学的評価は、試料の区別を知らされていない公認の獣医病理学
者によって実施された。
【０１４８】 （腫瘍の病理学的分類） 腫瘍の病理学的分類は以下の通りである。１）皮膚の乳頭腫：真皮への腫瘍細
胞の侵襲的な成長を伴わない表皮肥圧性(acanthotic)表皮の腫瘍乳頭腫の成長。
腫瘍細胞は異型(atypical)には見えない。２）日光性角化症(actinic keratosis
)：過形成的、オルト角化症的(orthokeratotic)、軽症〜中程度の(mildly to mo
derately)表皮肥圧性上皮。３）顕症の(florid)日光性角化症：軽症〜中程度の
表皮肥圧性の隆線を伴う日光性角化症で、真皮表面にまで拡大したもので、表面
侵襲性の扁平上皮癌に類似する。４）ケラトアカントーマ：過形成で、表皮肥圧
性重層扁平上皮に囲まれた中央が角質で充たされたクレーターを伴う乳頭状の成
長。腫瘍の前縁がその下の真皮に突き出している。５）扁平上皮癌（ＳＣＣ）：
真皮の表面および中間部に侵襲している異型細胞の巣を持つ腫瘍。
【０１４９】 実施例４の結果 日焼けは、被害に遭った皮膚の皮膚血管拡張（紅斑）、および血管の流体滲出
物透過性増加（浮腫）によって特徴付けられるＵＶ誘発性炎症反応である。ＵＶ
Ｂ誘発性の結晶滲出物増加は、照射２４時間後の皮脂厚みの増加として検出可能
である（Berg, R. J., et al., 1998, J Invest Dermatol 110:405-9）。マウス
をＵＶＢ光線に曝露すると（グループＢ）、比較対照用のグループのマウスに比
べて皮脂厚みの増加が誘発された（図１０）。化合物６で処理したグループ（グ
ループＣ）では、比較対照（グループＡ）と同程度に皮脂厚みが増加した。しか
しながら、その皮膚厚みの増加は、ＵＶＢを照射しベヒクル処理したグループの
マウスに比べると極端に少なく、化合物６の抗炎症効果が示されていた。マウス
たちは週３回長期的に照射を受けていたので、ＵＶＢ照射マウス（グループＢと
Ｃ）では、研究の途中で皮膚の浮腫が持続的に増加しているのが観察された。し
かしながら、所定のどの時点でも、薬剤処理を行ったマウスでは化合物６によっ
て皮膚の浮腫増加が一部抑制された。
【０１５０】 皮膚をＵＶＢ放射に長期的に曝露すると、まず第一に、細かな皮膚の損傷が発
生する。損傷は、そのような放射に曝露すればそれだけ、数の上でも大きさの上
でも大きくなり得る。図１１に示すように、マウスをＵＶＢに長期的に曝露させ
ることによって、被害を受けた皮膚に細かい損傷が発現する。それは、ベヒクル
で処理しＵＶＢ照射されたグループのマウス（グループＢ）では照射１０週間程
度で最初に発現する。皮膚損傷の総数は、ＵＶＢ照射グループのマウス（グルー
プＢ）ではＵＶＢ曝露数の増加に従って指数関数的に増加した。しかしながら、
化合物６で処理したマウス（グループＣ）では、損傷の初発が遅れた。最初の損
傷は、ＵＶＢ照射から１４週間後に観察された。このグループの各マウスの損傷
の平均数もグループＢ同様に、ＵＶＢ曝露の数の増加に従って増加したが、所定
の時点ではいずれも、各マウスの損傷の平均数は常に、非処理の比較対照グルー
プ（グループＢ）に比べて少なかった。
【０１５１】 このデータから、ＵＶ曝露前に化合物６を適用すると、（ａ）腫瘍の初発が、
ＵＶＢ処理の１０週間後（グループＢ）から１４週間後にまで遅れ、（ｂ）ＵＶ
Ｂに繰り返し曝露することから生じる損傷の総数が抑制されることが分かる。
【０１５２】 ＵＶＢ照射から約１０〜１４週目の初発後、皮膚損傷はＵＶＢ曝露の数値の増
加に従って総数および大きさでも増加した。皮膚損傷の大きさを比較するために
、「材料および方法」に記載の式を用いて損傷の直径を損傷体積に変換し、マウ
ス毎の平均損傷体積を比較した。図１２に、マウス毎の平均損傷体積に関しての
化合物６処理の効果を示す。この図からみられるように、平均損傷体積は経時的
に両方のＵＶＢ照射グループのマウス(グループＢおよびＣ)で増加したが、化合
物６で処理したマウスでは、損傷体積の増加が抑制された（グループＣ、図１２
およびテーブル２（表５））。加えて、照射２０週間後の化合物６で処理したマ
ウスと非処理のマウスについて、損傷毎の平均体積の比較も行った。先に観察さ
れたように、マウス毎の平均皮膚損傷体積同様、損傷毎の平均体積もまた、化合
物６の処理によって抑制された（テーブル２（表５））。
【０１５３】 テーブル２：ｓｋｈ−１マウスにおけるＵＶＢ誘発性腫瘍形成に対する化合物
６の局所投与の抑制効果
【表５】 メスのｓｋｈ−１マウス（生後７〜８週）を、各ＵＶＢ照射（照射量は３５ｍ
ｊ／ｃｍ2）前に化合物６（１ｍｇ／ｃｍ2）またはベヒクルで局所処理した。マ
ウスをＵＶＢに２０週間、週３回曝露した。データは、２０週での５〜１４匹の
マウスからとった中間±ＳＥＭを表す。*ベヒクル処理済みの比較対照例と比べ
てＰ＜０．０５
【０１５４】 （形態的な組織病理学データ） ３グループの全てのマウスから得られた、照射２０週後のマウスの皮膚の形態
的な外観を比較した。図１３から、ＵＶＢ光線に繰り返し曝露することで、被害
を受けた皮膚の損傷数の増加が誘発される（図１３、パネルＢ）が一方で、化合
物６で処理するとそのような損傷の増殖が抑制されることが分かる。 ＵＶＢ照射２０週後のマウスの皮膚生検における組織病理学発見をテーブル３
（表６）に示す。
【０１５５】 テーブル３：ｓｋｈ−１マウスのＵＶＢ誘発性ケラトアカントーマおよび偏平
上皮細胞癌についての化合物６の局所投与の抑制効果
【表６】 メスのｓｋｈ−１マウス（生後７〜８週）を、各ＵＶＢ照射（照射量は３５ｍ
ｊ／ｃｍ2）前に化合物６（１ｍｇ／ｃｍ2）またはベヒクルで局所処理した。マ
ウスをＵＶＢに２０週間、週３回曝露した。データは、２０週でのグループ毎の
マウスの総数の割合を表す。
【０１５６】 非照射グループのマウス（グループＡ）を含む３グループ全部で、軽症〜中程
度の皮膚炎が観察されたが、これは研究の期間に週３回ベヒクル（ＤＭＳＯ）を
局所適用したことで誘発されたのではないかと考えられる。日光性角化症は、過
形成で軽症〜中程度表皮肥圧性上皮を表すもので、両方のＵＶＢ照射グループ（
グループＢおよびＣ）のほとんどの生検で顕れた。ケラトアカントーマの単純な
損傷は、ＵＶＢを照射しベヒクルで処理したグループのマウス（グループＢ）で
観察された。そのような損傷は、化合物６で処理したグループの１４匹のマウス
(グループＣ)のいずれにも観察されなかった。表面侵襲性偏平上皮癌（顕症の日
光性角化症およびＳＣＣの前駆症）およびＳＣＣの発生は、両方のＵＶＢ照射グ
ループ（グループＢおよびＣ）で認められたが、化合部物６で処理したマウス（
グループＣ）では、約２３％抑制された(テーブル３（表６）)。同様に、皮膚の
乳頭腫の発生率も化合物６によって一部抑制された。
【０１５７】 実施例４の結果より、ＵＶ照射に先立って化合物６を局所適用すると、長期的
な曝露において皮膚癌という有害な結果から皮膚が保護されることが示されてい
る。具体的にいえば、ＵＶＢ光線曝露前に皮膚に化合物６を局所適用すると、ｓ
ｋｈ−１マウスにおいて劇的に皮膚損傷形成が抑制され、腫瘍が小さくなり、腫
瘍の発病が抑制された。様々な文献が、皮膚腫瘍形成におけるＵＶＢ放射の役割
を証明している（Devary, Y., et al., 1992, Cell 71:1081-91; Ley, R. D., e
t al., 1989, Photochem Photobiol 50:1-5; Hall, E. J., et al., 1988, Am J
Clin Oncol 11:220-52; and Marks, R. 1995, Cancer 75:607-12）。皮膚細胞
のＵＶＢ照射によって、大量のアラキドン酸およびその代謝物質の放出が引き起
こされる（Konger, R. L., et al., 1998, Biochim Biophys Acta 1401:221-34.
addin ENRfu (12-15)）。アラキドン酸の酸素化処理生成物であるプロスタグラ
ンジン類は、皮膚細胞へのＵＶＢ照射後に大量に生成され（Hawk, J. L. M., an
d J. A. Parrish. 1993. Responses of Normal Skin to Ultraviolet Radiation
s. Plenum Medical Book Publishers, New York; Hruza, L. L., and A. P. Pen
tland. 1993, J Invest Dermatol 100:35S-41S; Kang-Rotondo, et al., 1993,
Am J Physiol 264:C396-401; and Grewe, M., U. et al., 1993, J Invest Der
matol 101:528-31）、腫瘍形成の様々なモデルに関連してきた（Vanderveen, E.
E., et al., 1986, Arch Dermatol 122:407-12; Cerutti, P. A., and B. F. T
rump. 1991, Cancer Cells 3:1-7）。また複数の証拠より、プロスタグランジン
類は、腫瘍の成長を刺激するのみならず、宿主の免疫監視を抑止する傾向があり
（Plescia, O. J., et al., 1975, Proc Natl Acad Sci U S A 72:1848-51; Goo
dwin, J. S. 1984. Am J Med 77:7-15）、従って、腫瘍促進を助長することが示
唆されている。高レベルのＰＧＥ2が皮膚の扁平上皮細胞および基底細胞の癌腫
で観察されており、これらの腫瘍の転移作用および侵襲作用の増加との関連性が
考えられる（Vanderveen, E. E., et al., 1986, Arch Dermatol 122:407-12; K
lapan, I., V. et al., 1992, J Cancer Res Clin Oncol 118:308-13）。プロス
タグランジン類の生成を抑制する様々な化学化合物が主要の成長を抑制すること
が既に観察されている（Snyderman, C. H., et al., 1995, Arch Otolaryngol H
ead Neck Surg 121:1017-20; Hial, V., et al., 1976, Eur J Pharmacol 37:36
7-76; Lynch, N. R., et al., 1978, Br J Cancer 38:503-12）。
【０１５８】 ＵＶＢ誘発性皮膚腫瘍形成を抑制する化合物６の性能を、急性皮膚炎を抑制す
るという、我々のこれまでの観察結果と組み合わせると、化合物６が、紫外線等
の環境要因によって誘発されるヒトの癌といった形態のものに対して有効な化学
的予防剤であることが示唆される。
【０１５９】 皮膚癌を予防または治療する化合物の性能は、当該技術で周知のアッセイを用
いて判断するかまたは実施例５に記載されているアッセイと同様のものを用いて
判断することができる。
【０１６０】 実施例５ ＵＶＢ誘発性皮膚発癌アッセイ 化合物６は、表皮細胞におけるＵＶＢ光線誘発性炎症媒介物質(mediator)の放
出を抑制する性能が非常に高いため、ＵＶＢに曝露された皮膚の炎症性反応を予
防する。
【０１６１】 生後６〜７週のメスの無毛アルビノマウス（ｓｋｈ−１）をCharles River La
boratories（Wilmington, MA）から購入した。ビッグブルー(Bigblue) （生体内
に突然変異検出用基質を含有するＬＩＺシャトルベクター）の複本を持つ遺伝子
変異ビッグブルーマウスをStratagene（La Jolla, CA）から購入した。マウスは
、米国動物福祉法の条項および国立衛生研究所（ＮＩＨ）に従い病原体の無い環
境に５匹一グループで入れられた。マウスの世話と実験の手順は、規定のガイド
ラインに沿って実行された。
【０１６２】 （表皮細胞系） 自然発生的に転換されたヒトの表皮細胞系（１６）であるＨａＣａＴを、１０
％ウシ胎仔血清を加えたダルベコ(Dulbecco)の変性イーグル媒体（ＤＭＥＭ）内
で維持した（Summit Biotech, Ft. Collins, CO）。
【０１６３】 （照射工程） ＵＶＢの範囲である２８０〜３２０ｎｍで主に発光する８−ＦＳＸ２４Ｔ１２
／ＨＯ／ＵＶＢランプ（National Biological Corporation, Twinsburg, OH）の
バンクを、マウスおよび細胞培養液を照射するために使用した。照射前には常に
、ＵＶＢメーター（Twinsburg, OH のＮational Biological Corporationより入
手した５００Ｃモデル)を用いてＵＶＢランプの放射束密度を測定した。培養液
の照射に用いたＵＶＢ光線の量は２５ｍｊ／ｃｍ2であった。麻酔をかけたマウ
スは背面の２．０ｃｍ2の面積にＵＶＢ放射を受けた。この面に、薬剤投与(drug
receiving)マウスではテスト用化合物（１．５ｍｇ／ｃｍ2）、また比較対照用
マウスではベヒクルを、照射１５分前に塗布した。ＵＶＢランプと照射を受ける
表面との距離は２０ｃｍであった。最終的にｓｋｈ−１無毛マウスが受けた放射
量は２５０ｍｊ／ｃｍ2になり、これはこのようなマウスにとっての最少紅斑量
（ＭＥＤ）（１７）のほぼ７倍を超える。ビッグブルーマウスは照射前に背中の
毛を剃られて、化合物６が存在する場合と存在しない場合とで、４００ｍｊ／ｃ
ｍ2のＵＶＢに曝露された。
【０１６４】 （プロスタグランジンＥ2アッセイ） ２４のウェル培養株皿で培養した融合性ＨａＣａＴ細胞を、１％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）（Cayman chemicals, Ann Arbor, MI）を含有する無血清ＤＭ
ＥＭで３回洗浄し、３７℃で１時間、３〜３０μＭの化合物６で培養した。培養
後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２５ｍｊ／ｃｍ2ＵＶＢ光線に曝露するかまた
は５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＥＧＦで刺激し、１％のＢＳＡを含有する無血清ＤＭＥ
Ｍを添加した。化合物６を再度投与し、細胞を３７℃で６時間培養した。刺激の
６時間後に、細胞の上澄みを採集して、細胞上澄みに放出されたＰＧＥ2を、Ｅ
ＬＩＳＡキット（Cayman chemicals, Ann Arbor, MI）と共に供給された、アセ
チルコリンエステラーゼＰＧＥ2トレーサー(tracer)および抗ＰＧＥ2抗体を用い
た競争的な（competitive）ＥＩＡによって測定した。細胞のタンパク質を、ピ
アース(Pierce)のＢＣＡタンパク質アッセイ法を用いて判断した（Smith, P. K.
, et al., 1985, Anal Biochem. 150 (1):76-8）。
【０１６５】 まず化合物６を、濃度１０ｍｇ／ｍｌでジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（
Sigma, St. Louis, MO）に溶解させ、濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように注入前に
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。毎日、マウスに１６ｍｇ／ｋｇ i
.p. ボーラス静脈内注射を−２日（すなわち、ＵＶＢ曝露の２日前）から、実験
終了まで処理した。また、薬剤を投与用のマウスには、照射１５分前に１．５ｍ
ｇ／ｃｍ2の化合物６の塗布を行った。比較対照用のマウスにはベヒクルのみ与
えられた。
【０１６６】 紫外線Ｂを照射したケラチン細胞(keratinocyte)中の主要なアラキドン酸代謝
物質の一つはプロスタグランジンＥ2であり、これは６時間程度の早期に検出可
能で、ＵＶＢ曝露後２４〜４８時間の間に最高点に達し、皮膚の浮腫と紅斑を誘
発する（Gilchrest, B. A., et al., 1981, J Am Acad Dermatol. 5 (4):411-2
2; Konger R. L., et al., 1998, Biochim. et Biophys. Acta (1401):221-34;
Woodward, D. F., et al., 1981, Agents Actions. 11 (6-7):711-7; Snyder, D
. S., and W. H. Eaglstein. 1974. Br J Dermatol. 90 (1):91-93; Snyder, D.
S., and W. Eaglstein. 1974. J Invest Dermatol. 62:47-50; and Gupta, N.,
and L. Levy. 1973, Br J Pharmacol. 47 (2):240-8）。我々は、ＵＶＢを照射
した表皮細胞中のＰＧＥ2放出に及ぼされる化合物６の効果を判断した。ヒトの
表皮細胞であるＨａＣａＴをＵＶＢ光線に曝露し、化合物６がある場合と無い場
合とで培養し、６時間の培養中に細胞上澄み中に放出された累積(cumulative)Ｐ
ＧＥ2を判断した。ＰＧＥ2放出の分析（図１４）より、ＨａＣａＴを２５ｍｊ／
ｃｍ2のＵＶＢに曝露すると、非ＵＶＢ照射比較対照例に比べて照射６時間後の
ＰＧＥ2レベルが約１１倍（１１．１１（４．２３））誘発された。ＵＶＢ光線
誘発性プロスタグランジン放出は、化合物６の濃度次第で抑制され、化合物６の
量が３０μＭの時、プロスタグランジン放出の約９０％が抑制されるのが観察さ
れた。このデータは、化合物６がＵＶＢ光線で刺激された表皮細胞におけるプロ
スタグランジンＥ2の放出を抑制することができることを示唆するものである。
【０１６７】 ＨａＣａＴのような、基本的なヒトのケラチン細胞は、その細胞表面（）に非
常に多数の官能ＥＧＦ−受容体(functional EGF-receptors)が現れている。刺激
を受けると、表皮細胞表面に存在するＥＧＦ−受容体が膜を介しての信号送信に
参加して、プロスタグランジン形成を誘発する。化合物６がプロスタグランジン
放出を抑制することは既に観察されたが、これがＥＧＦ−Ｒ活性化によるもので
あることを判断するために、我々は表皮細胞中のＥＧＦ刺激性プロスタグランジ
ン形成に対する化合物６の効果を調べた。５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＥＧＦで６時間
ＨａＣａＴを刺激することにより、刺激の無い比較対照例に対してプロスタグラ
ンジン放出の増加が約４倍誘発され（図１５）、プロスタグランジン放出で観察
された増加が、３０μＭの化合物６が存在すると抑制されたことから、（ｉ）表
皮成長因子受容体が表皮細胞中でプロスタグランジン形成を伝達し(mediate)、
（ｉｉ）化合物６がＥＧＦ−Ｒ活性化の抑制を通して、ＵＶＢ光線で刺激された
細胞中のプロスタグランジン放出を抑制することが示唆された。
【０１６８】 （形態および皮膚浮腫測定） ＵＶＢ照射皮膚の形態上の外見を視覚的に監視し、比較対照例のマウスの皮膚
と比較した。マウスの背面の皮脂厚みを、ＵＶＢ曝露前、および曝露後の５日間
にわたって毎日、０．００１５ｍｍの精度で０〜１０ｍｍの範囲の厚さを測定す
るデジタル厚み計（Mitutoyo, So. Plainfield, NJ）を用いて記録した。
【０１６９】 前記のように、プロスタグランジンＥ2は強力な炎症性仲介物質であり、ダメ
ージを受けた皮膚内で血管拡張を誘発し浮腫を悪化させる(potentate)ことが知
られている。表皮細胞を用いた我々の生体外研究において、化合物６がＵＶＢで
刺激された細胞内でのＰＧＥ2の放出を抑制することが分かったため、我々は、
化合物６が生体内でのＵＶＢ光線曝露後の皮膚の有害な炎症性反応を抑制するこ
とができるのかどうか判断したいと考えた。この研究のために、メスの無毛アル
ビノｓｋｈ−１マウスを使用し、その背面を２５０ｍｊ／ｃｍ2のＵＶＢ光線に
曝露した。マウスの背面の皮脂厚みは、照射後１日から５日の皮膚浮腫の測定結
果で判断した。図１６は、マウスを２５０ｍｊ／ｃｍ2のＵＶＢ光線に一度曝露
させると、時間次第で皮脂厚みが増加することを示すものである。化合物６は、
照射２４時間後の時点で皮膚の浮腫を効果的に抑制することができなかった。し
かしながら、照射されたグループのマウスで、ＵＶＢ曝露の４８時間後までに皮
膚厚みがそれ以上増加するのを防いだ。対照的に、同時点で比較対照用マウスの
皮膚厚みは約７０％まで増加した。照射７２時間後の時点で、化合物６で処理し
たマウスで皮膚浮腫の有意な減少が観察され、照射後５日目までに、薬剤で処理
したマウスの皮脂厚みが、ほぼ比較対照のレベルに戻った。対照的に、ベヒクル
で処理したグループでは、皮膚厚みが５日間で比較対照用マウスの皮膚厚みの計
２．５倍まで増加した。ポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ２００）に溶解
したＰ１３１を用いても同様の結果が観察された（データは示さず）。これらの
観察結果は、化合物６が、マウスのＵＶＢ光線誘発性皮膚浮腫を抑制できること
を示唆するものである。
【０１７０】 我々はまた、化合物６で処理したグループとベヒクルで処理したグループのマ
ウスで、ＵＶＢ光線曝露後の皮膚外観の形態上の変化を監視した。ＵＶＢ曝露後
の最初の２４〜４８時間で、皮膚に対する日焼けのダメージが皮膚表面の「ゾウ
肌(elephant skin)」外観として目視された。ＵＶＢ光線を照射されたマウスの
皮膚は、ピンク色の革のようになり厚くなったように見えた。炎症を誘発してか
ら１日目および２日目は、薬剤で処理したグループとベヒクルで処理したグルー
プのマウスの皮膚外観に有意差は認められなかった。しかしながら、ベヒクルを
処理されたマウスは、ＵＶＢを照射されてから３日目で、かさぶたとなって剥れ
た皮膚の薄片が数多く皮膚表面から剥がれ落ち始めているのが見られるようにな
り、５日目までにはこのグループのマウスの皮膚は固い革状になって表面に瘢痕
(scars)が発達するようになった。対照的に、化合物６で処理したグループでは
、マウスの皮膚外観が３日後に改善され、およびＵＶＢ照射後５日目までに皮膚
炎症の兆候(sign)が減少して、皮膚外観は比較対照用マウスのそれと同様であっ
た（図１８）。
【０１７１】 ＵＶＢ光線で誘発された皮膚の組織的な変化についても調べた。正常な表皮は
通常、２〜３の細胞層を有し、炎症性の細胞が、特に毛包の周囲に散在している
（図１９Ａ）。ＵＶＢを照射された皮膚では、３〜５細胞層の厚い表皮となる。
また多数の好中球が真皮中に堆積していた（図１９Ｂ）。対照的に、化合物６で
処理したマウスの皮膚は、非照射の比較対照例の皮膚に非常によく似ており（図
１９Ｃ）、１〜２細胞層の表皮と正常な真皮を有していた。従って、化合物６は
ＵＶＢを照射されたマウスの皮膚での浮腫の発達と好中球の流入を防止したので
ある。
【０１７２】 （血管透過性） 血管透過性を、アルブミン結合アニオン染料(albumin bound anionic dye)で
あるエバンズ・ブルー(Evans blue)（Sigma, St. Louis, MO）の血管からの漏れ
によって量的に分析した。エバンズ・ブルー（１％、２００（ｌ／マウス））を
尾の静脈から注入し、４時間後にマウスを殺して背側の照射を受けた皮膚の生検
を行った。その生検より、サンプルを８０℃で２時間温めることによって染料を
ホルムアミド（Sigma, St. Louis, MO）中で抽出し、ホルムアミドの吸光度を６
２０ｎｍで測定した。
【０１７３】 浮腫は多量の血漿滲出物と関わりがあるので、我々は、ＵＶＢ誘発性皮膚血管
透過性への化合物６の効果を判断した。ＵＶＢ照射後の血管透過性の変化につい
てのデータを図１７に示す。皮膚浮腫発見と一致して、ＵＶＢを照射したマウス
の皮膚の血管透過性に増加が見られた。化合物６の効果は照射後の２４時間後お
よび４８時間後は最小限度であった。しかしながら、ＵＶＢ照射の５日後に、化
合物６で処理したグループでは血管透過性が比較対照例のレベルに戻ったが、一
方、ベヒクルで処理しＵＶＢ曝露されたグループのマウスでは、血管透過性が５
倍に増加しているのが観察された。
【０１７４】 （日焼け細胞染色および組織学的研究） マウスを頚部脱臼させて殺した後、皮膚を剥がして歯科用ワックスのシート上
に広げた。１パンチ分(punch)（８ｍｍ）を取って緩衝液処理したホルマリン中
に固定した。パラフィンブロックより厚さ４〜５μｍの切片(section)を切り取
った。アポプタグプラス原位置検出キット(ApopTag Plus In situ Detection ki
t)（Oncor, Gaithersburg, MD）を用いて日焼け細胞染色を行った。このキット
は、ジゴキシゲニンで標識されたゲノムのＤＮＡの直接蛍光によって日焼け細胞
を検出するものである。簡単にいえば、ジゴキシゲニン−ヌクレオチドの残基を
触媒を介して末端デオキシオリゴヌクレオチドトランスフェラーゼ酵素(deoxynu
cleotidyl transferase enzyme)の存在下で、二本鎖または一本鎖ＤＮＡの３'−
ＯＨ端に添加し、結合したヌクレオチドを、フルオレスセインと共役(conjugate
)した抗ジゴキシゲニン抗体を用いて検出した。
【０１７５】 照射後の組織の変化を研究するために、組織切片をヘマトキシリンとエオシン
で染色し、染色したスライドを顕微鏡で調べた。
【０１７６】 ＵＶＢ光線への急激な曝露は皮膚細胞の日焼けを誘発する。前記の原位置アポ
トーシス検出キットを用いて、ＵＶＢを照射したマウスの皮膚中の日焼け細胞の
有無を検出した。光曝露の４８時間後では、ＵＶＢ照射されたマウスの皮膚に有
意数の日焼けした細胞（図２０）が観察された。対照的に、同じ時点で、化合物
６で処理したマウスでは、日焼けした細胞は非常に少ないか全く観察されなかっ
た。従って、このデータより、化合物６がマウスの皮膚でのＵＶＢ誘発性細胞死
を抑制したことが示唆されている。
【０１７７】 移植の合併症(transplant complication)を予防するかその処理を行う化合物
の性能については、当該技術で周知のアッセイを用いて判断するかまたは実施例
６に記載のアッセイと同様のものを用いて判断することが可能である。
【０１７８】 実施例６ 移植合併症 （増殖アッセイ） 生後９週目のＣ５７ＢＬ６オスから採取した脾細胞（４×１０5／μｌ）を、
フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）およびコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）で誘
発した増殖アッセイにおける応答動物(responder)として使用した。細胞を各グ
ループに３セット、ＲＰＭＩ１６４０媒体の最終体積を２００μｌとして９６ウ
ェルのマイクロプレートに適用し、１０％牛胎児血清を補った。ＰＨＡまたはＣ
ｏｎ Ａ（Sigma, St. Louis, MO）を５または２μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ添
加した。化合物６を０．１、１、１０および５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。
細胞を、３７℃の培養器で３日間かけて、５％ＣＯ２の湿気を与えた空気内で培
養した。その後、生育可能な細胞中のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼによる
テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１の開裂に基づいて(Boehringer Mannheim, Indianap
olis, IN)、細胞増殖の定量化用の比色定量のアッセイを、製造者の指示通りに
実施した。マルチスキャン(Multiskan MS)マイクロプレートスキャナで、４５０
／６９０ｎｍで吸光度を測定した。細胞増殖の値を、ＰＨＡまたはＣｏｎ Ａで
刺激した細胞増殖のＯ．Ｄ．価を、刺激されていない細胞（陰性の比較対照例）
のＯ．Ｄ．価の分だけ減らすことによって実施した。
【０１７９】 （混合型リンパ球性反応(mixed lymphocyte reaction)（ＭＬＲ）） ＭＬＲアッセイ用として、応答動物細胞（生後９週目のＣ５７ＢＬ６オスから
採取した脾細胞）を４×１０5／１００μｌの濃度で３セット、９６ウェルのマ
イクロプレートで平板培養し、マイトマイシン処理済の刺激薬（生後１０〜１２
週のＢＡＬＢ／ｃオスから採取した脾細胞）を、５０μｌ中８×１０4の濃度で
添加した。化合物６を上記濃度で、最終体積が２００μｌになるまで添加した。
細胞を５日間培養し、上記のように比色定量のＷＳＴ−１アッセイを実施した。
【０１８０】 （アポトーシス検出） Ｃ５７ＢＬ６脾細胞（３×１０6／ｍｌ）を２４のウェルプレートで２４時間
、５００μｌのＲＰＭＩ１６４０で、上記条件下で培養した。化合物６を０．１
、１、１０および１００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。原位置細胞検出キット(I
nSitu Cell Detection Kit)、フルオレスセイン(Fluorescein)（Boehringer Man
nheim, Indianapolis, I）を用いて、ＴＵＮＥＬによってアポトーシス性細胞死
を検出した。培養期間後、製造者の指示通りに細胞を洗浄、固定、透過(permeab
ilise)および染色し、ＦＡＣＳカリバー(Calibur)（Becton Dickinson, San Jos
e, Ca）を用いたフローサイトメトリーよりアポトーシスを分析した。
【０１８１】 （マウス） 骨髄移植レシピエントは生後８〜１０週のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）のオス
のマウスで、ドナーは生後６〜８週のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）のオス（いずれ
の系統もGermantown, NYのタコニック(Taconic)で購入）であった。マウスは、
特定病原体感液防止条件（ＳＰＦ）下で、ヒュー研究所(Hughes Institute)のア
ニマルケア施設で飼育された。マウスは標準的なマウス用餌（Harlan Teklad LM
-485）と水を自由に摂取することができた。レシピエントは、移植の前日から抗
生物質入りの水（サルファメトキサゾール／トリメトプリム、Hi-Tech Pharmaca
l, Amityville, NY）を与えられた。
【０１８２】 （照射） パイ型のルーサイトホルダーに収容されたレシピエントのマウスを、骨髄移植
の１日前に致死量（７．５Ｇｙ）のセシウム（JL Sheppard Labs, 47.08 rad/mi
n）で処理した。
【０１８３】 （骨髄移植（ＢＭＴ）） ドナーＢＡＬＢ／ｃの骨髄を、大腿骨とけい骨の骨幹を洗い流すことによって
、Ｌ−グルタミン（Cellgro）（Mediatech, Hendon, VA）入りのＲＰＭＩ１６４
０内に採集した。同時に、溶解緩衝液(lysis buffer)（ACK溶解緩衝液 - 0.15M
NH4Cl, 1.0M KHCO3, 0.01MNa2EDTA）によって赤血球細胞から取り出された、ド
ナー脾細胞の単個細胞浮遊液を同様に生成した。ＢＭ細胞を毛細管ピペットで攪
拌することで懸濁させ、細かい孔の開いたナイロンのセルストレーナーを通して
異物と分離した。赤血球細胞を溶解緩衝液によって取り出し、異物の塊を沈殿さ
せた(settle out)。細胞を洗浄して、尾静脈から静脈注射できるように再度懸濁
させた。標準的な接種物(inoculum)は、０．５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０に含まれ
る、２５×１０6ＢＭ細胞と２５×１０6脾細胞で構成されていた。
【０１８４】 （対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）監視） ＢＭＴレシピエントは、ＧＶＨＤの臨床証明(clinical evidence)の開始（体
重減、皮膚紅斑の発現、脱毛症(allopecia)、背瘤発生(hunching)、下痢症）お
よび９０日の観察期間中の生存について、毎日監視された。生存時間は、ＢＭＴ
の日（０日）から測定した。移植１１日以内の死亡は放射によって誘発されたも
のと見なして除外された。
【０１８５】 （薬剤処理） ＧＶＨＤ予防処置として、ＢＭＴの前日（−１日）またはＢＭＴ当日（０日）
から、マウスに対し、化合物６（WHI−Ｐ１３１）、４−(３'ヒドロキシル−フ
ェニル)−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン（WHI−Ｐ１３２、化合物７）
、サイクロスポリン（Sandimmune（登録商標） Sandoz Pharmaceuticals Ltd, B
asle, Switzerland）、メチルプレドニソロン（Depo-Medrol（登録商標）Pharma
cia & Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan）、メトトレキサート（Immunex C
orporation, Seattle, Washington）およびベヒクル比較対照剤を毎日、腹腔内(
ｉ．ｐ．)注入によって投与した。ＢＭＴ０日からの、化合物６の投与量は一回
につき２５ｍｇ／ｋｇ／日および６０ｍｇ／ｋｇ／日（３回に分けて投与）で、
化合物７の投与量は５０ｍｇ／ｋｇ／日（３回に分けて投与）であった。サイク
ロスポリン、メチルプレドニソロンおよびメトトレキサートの一回の投与量はそ
れぞれ、小児癌グループ(Children cancer group)（ＣＣＧ）プロトコール通り
、３ｍｇ／ｋｇ／日（２回に分けて投与）、１０ｍｇ／ｋｇ／日（２回に分けて
投与）、および１０ｍｇ／ｍ2／日（日１回）であった。サイクロスポリンとメ
チルプレドニソロンによる処理は、ＢＭＴの前日（−１）から始まり、実験期間
の終了まで継続されたが、一方、メトトレキサートはＢＭＴ後１、３、６、およ
び１１目に投与された。
【０１８６】 （統計的分析） 増殖アッセイで得られたデータ、ＭＬＲおよびアポトーシスのデータの統計的
分析をスチューデント式テストによって行い、一方でマンテルコックステストを
用いた生命表法によって生存データを分析した。
【０１８７】 上記アッセイからのデータを図２１〜２６に示す。図２１は、WHI−Ｐ１３１
による、ＭＬＲ(Ａ)、ＰＨＡ誘発（Ｂ）およびＣｏｎＡ誘発（Ｃ）脾細胞の増殖
抑制を投与量別に示したものである。WHI−Ｐ１３１は、５日間（ＭＬＲ）また
は３日間（ＰＨＡおよびＣｏｎＡアッセイ）の培養期間中、０．１、１、１０お
よび５０μｇ／ｍｌの濃度で添加された。ＷＳＴ−１比色定量のアッセイにより
増殖を測定した。結果を、３〜７の別々の実験の中間Ｏ．Ｄ．±ＳＥＭとして示
す。グループ間の統計的な相違は、スチューデント式テストによって分析した。
【０１８８】 自己免疫性疾患（自己免疫誘発性糖尿病(autoimmune induced diabetes)等）
を予防または治療する化合物の性能は、当該技術で周知のアッセイを用いて判断
するか、または実施例７に記載のアッセイと同様のアッセイを用いて判断するこ
とができる。
【０１８９】 実施例７ 自己免疫性疾患 Ｃ５７ＢＬ／６およびＮＯＤのマウスを、ニューヨーク州、ジャーマンタウン
のタコニック社（Taconic、Germantown、NY）より購入し、ヒューゲスインステ
ィテュートの動物保護施設（Animal care facilityof Hughes Institute）にて
、病原体の存在しない環境下で飼育した。***させたＪａｋ３遺伝子（disrupte
d Jak3 gene）と相同なＪａｋ３-/-（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９／Ｓｖ）のマウス
は、テネシー州メンフィスのセントジュードチルドレンズリサーチホスピタルの
ジェイ・エヌ・イーレ博士（Dr. J. N. Ihle, St. Jude Children's Research H
osｐital, Memｐhis, TN）のご厚意により寄贈されたものである。同型接合のＪ
ａｋ３-/-マウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配し、雑種第一代の子孫をＣ５７
ＢＬ／６マウスと戻し交配した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスとの戻し交配を３世代続
けた後、得られた子孫を異種交配し、Ｊａｋ３-/-マウスと野生型（ＷＴ）Ｊａ
ｋ３+/+マウスを得た。これらのマウスを実験に使用した。
【０１９０】 （ＬＤＳＴＺモデルの糖尿病の誘発） Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスまたはＪＡＫ３欠乏ＷＴマウス（生後８〜１０週）に
おいて、自己免疫による実験的な糖尿病（ＬＤＳＴＺ）を誘発するため、低量（
４０ｍｇ／ｋｇ）のＳＴＺ（Sigma, St Louis, MO）を５日連続で毎日腹腔内に
注入した。ＳＴＺを氷上でｐＨ４.０のクエン酸塩緩衝液に溶解し、調製後１０
分以内に注入した。マウスにおける糖尿病の発病を、ＳＴＺ投与後２週目（７日
後）より、マウスの血糖をワンタッチプロファイル糖尿病トラッキングシステム
（One Touch Ｐrofile diabetes tracking system）（Lifescan, Milｐitas, Ca
）で検査して監視した。検査において３回連続で２２０ｍｇ／ｄｌを超える糖血
が見られたマウスを糖尿病と見なし、慢性糖血の初回の検出を糖尿病初発のデー
タとした。Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスのグループを、実験開始の日から２５日目ま
で、投与量を平等に２回に分けた１００ｍｇ／ｋｇ／日のＷＨＩ−Ｐ１３１でｉ
．ｐ．に処理した。ＷＨＩ−Ｐ１３１はＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯに可溶化され
ている。よって、対照用マウスに対しては、上記と同じ条件でＰＢＳにおける１
０％ＤＭＳＯでの処理を行った。
【０１９１】 （ＷＨＩ−Ｐ１３１によるＮＯＤ雌マウスの処理および糖尿病発病の判断） ＮＯＤ雌マウスを、生後５または１０週目より、投与量の異なるＷＨＩ−Ｐ１
３１でｉ．ｐ．に毎日処理した。対照用マウスは、ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯで
処理した。上述のように、ワンタッチプロファイル糖尿病トラッキングシステム
を用い、生後１０週目よりマウスの血糖を検査し、糖尿病の発生を監視した。
【０１９２】 （腹腔内糖忍容力試験（ＩＰＧＴＴ）） ＷＨＩ-Ｐ１３１処理を行った非糖尿病ＮＯＤ雌マウスおよびベヒクル処理を
行った対照用ＮＯＤ雌マウスに対し、実験期間の終了時（ＮＯＤマウスが生後２
５週に達した時）に腹腔内糖忍容力試験（ＩＰＧＴＴ）を行った。マウスを１０
時間絶食させ、その後、グルコース溶液（体重に対し１.５ｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ
．に注入した。グルコースの注入前後に血液サンプルを採取し、０分、３０分、
６０分および１２０分の時点で血糖値を（上述のように）測定した。
【０１９３】 （組織学） 実験期間の終了時、つまり生後２５週の時点において、対照用マウスおよびＷ
ＨＩ-Ｐ１３１で処理した非糖尿病ＮＯＤ雌マウスのグループを犠牲にし、各マ
ウスにつき少なくとも２５個の島を評価して、島における特徴的な組織病理学的
損傷（膵島炎）の評価を行った。簡潔に説明すると、膵臓を除去し、１０％のホ
ルマリンに固定し、パラフィンを埋め込み、切開し、光学顕微鏡で観察できるよ
うにヘマトキシリンとエオシンで染色した。重複しない３つの膵臓レベルよりサ
ンプリングされた全ての島に対し、次のような膵島炎スコアを割り当てた。すな
わち、目に見える損傷がない場合を０、島貫入が観察されない周辺的な膵島炎で
あった場合を１、島浸潤が２５％未満であった場合を２；島浸潤が２５％を超え
た場合を３、末期段階を４とした。
【０１９４】 （ＮＯＤ-scid／scid雌マウスに対する糖尿病脾細胞の養子移入ならびに糖尿
病発生の判断）
【０１９５】 ８〜１０匹の糖尿病ＮＯＤ雌マウスより貯留した脾臓白血球の単一細胞浮遊液
を、１００メッシュのニッテクス（Nitex）を通過させて調製し、１０倍ゲイ溶
液に赤血球を溶解した。１×１０7の脾細胞のアリクオットを、生後４週のＮＯ
Ｄ／Lt-scid／scid雌マウス（The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）の静
脈内に養子移入した。ＮＯＤ-scidマウスに対するＷＨＩ−Ｐ１３１処理（５０
ｍｇ／ｋｇ）または対照用処理（ＰＢＳにおける１０％ＤＭＳＯ）を同時に開始
した。ケミストリップストリップユージーケーストリップ（Chemstrip uGK stri
ps）（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）による養子移入後の２週目よ
り、週毎にマウスの尿中の糖を検査し、糖尿病の発生を監視した。週毎の検査に
おいて、連続して５５０ｍｇ／ｄｌ（＋＋＋）を超える糖尿が見られたマウスを
糖尿病と見なし、慢性的な糖尿の初回の検出をＩＤＤＭ（インスリン依存型糖尿
病）初発のデータとした。
【０１９６】 （統計学的分析） 統計学的分析は、無対のスチューデント式テスト（ＩＰＧＴＴおよび膵島炎デ
ータ）およびＡＮＯＶＡテスト（実験グループにおける血糖レベルの差異）を用
いて行った。ＷＨＩ−Ｐ１３１処理を行ったマウスおよび対照用ＮＯＤマウスお
よびＬＤＳＴＺ処理を行ったマウスのＩＤＤＭ発生率の調査における実験結果の
違い、もしくは養子移入scidマウスのＩＤＤＭ発生率の調査における実験結果の
違いは、マンテルコックステストを用いたカプランマイヤー生命表分析（Kaplan
-Meier life table analysis）により推定した。０．０５未満のＰ値は、統計学
的に有意と見なされる。
【０１９７】 （実施例７の結果） （ＪＡＫ３欠乏マウスにおいては、ＬＤＳＴＺ糖尿病の発生が抑制される） 図２７は、ＪＡＫ３欠乏マウス、および低量のＳＴＺで処理したＷＴマウスに
おける累積的糖尿病発生率（Ａ）と血糖値（Ｂ）を示している。第１回目のＳＴ
Ｚ注入後から１４日目までに、１３／１３（１００％）のＷＴマウスが高血糖症
を発症したのに対し、糖尿病を発病したＪＡＫ３欠乏マウスは、２５日にわたる
実験期間を通じ、わずか１／１２（８．３％）に過ぎなかった（ｐ＜０．０００
１）（図２７）。ＷＴマウスの血糖は、第１回目のＳＴＺ注入後７日目から増加
し始め、９日目には高血糖レベル（＞２２０ ｍｇ／ｄｌ）に達した（図２８）
。これに対し、ＪＡＫ３欠乏マウスの血糖は、実験期間を通じて正常に保たれて
いた（ＡＮＯＶＡによるＷＴ血糖レベルと比較した場合、ｐ＜０．０００１）（
図２８）。
【０１９８】 （ＪＡＫ３キナーゼインヒビターＷＨＩ−Ｐ１３１によるＬＤＳＴＺモデルの
疾患における糖尿病発生の抑制） Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスを、第１回目のＳＴＺ注入後より、１００ ｍｇ／ｋ
ｇの ＷＨＩ−Ｐ１３１（２回投与）でｉ．ｐ．に毎日処理すると、ＬＤＳＴＺ
糖尿病の発生が抑制された（図２９）。第１回目のＳＴＺ注入後から７日目に２
０／３８（５２．６％）の対照用マウスが糖尿病を発病し、続いて９日目には糖
尿病マウスが３２／３８（８４．２％）に、１１日目には３６／３８（９７．４
％）になったのに対し、糖尿病を発病したＷＨＩ−Ｐ１３１処理マウスは７日目
で４／２０（２０％）、９日目で１０／２０（５０％）、１１日目で１３／２０
（６５％）に過ぎなかった（図２９）。図３０は、ＷＨＩ−Ｐ１３１処理マウス
は、対照用マウスと比べ、実験期間を通じて血糖値が著しく低かった（ｐ＝０.
０２７）ことを示している。
【０１９９】 （ＷＨＩ−Ｐ１３１処理によるＮＯＤ雌マウスにおけるＩＤＤＭ発生の抑制） 以下の条件で処理を毎日行ったＮＯＤ雌マウスにおけるＩＤＤＭ発生率を調べ
た：ａ）生後５〜２５週目まで２０ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１
３１で処理（図２７）；ｂ）生後５〜８、５〜２５、および１０〜２５週目まで
１００ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１で処理（図２８）。ＤＭＳＯで処理したマ
ウス（対照用）が生後１３週目で糖尿病を発病したのに対し、ＷＨＩ−Ｐ１３１
（５０ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウスは生後２２週目でようやく糖尿病を発病し
た（図２７）。２５週目の時点で、２２／３７（６０％）の対照用マウスが糖尿
病になったのに対し、５０ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１で処理したＮＯＤ雌マ
ウスで糖尿病を発病したのは２／１１（１８％）に過ぎなかった（ｐ＝０．０１
７）。また、２０ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１で毎日処理を行っても、糖尿病
発生に対する予防効果は得られず、処理されたマウスの５／９（５６％）が生後
１８週目までに糖尿病を発病した（図２７）。我々は、１００ｍｇ／ｋｇのＷＨ
Ｉ−Ｐ１３１による５〜９週間の短期間の処理が、永続的な予防効果を呈し得る
のかどうかを調べた。図２８には、生後１０週および生後２５週のＮＯＤ雌マウ
スの１０／１２（８３％）が糖尿病を発病し、このような処理が糖尿病発生の予
防にならないことが示されている。次に、１００ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１
での処理の開始を遅く（生後１０週）した場合に糖尿病予防効果が得られるのか
どうかを調べた。図２８には、生後１０週目より開始された１００ｍｇ／ｋｇの
ＷＨＩ−Ｐ１３１による処理も、生後５週目というより早い時期に開始された処
理と同じく、糖尿病予防効果を発揮することを示している。生後２５週目におけ
る糖尿病発生率は、最初の処理条件では９％（１／１１）であり（対照例と比較
した場合、ｐ＝０．００７）、処理開始が遅い場合には１８％（４／２２）であ
った（対照例と比較した場合、ｐ＝０．０２５）。
【０２００】 ＤＭＳＯ（ｎ＝３）または１００ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１で、２０週（
ｎ＝６）または１５週（ｎ＝７）処理した血糖正常のＮＯＤ雌マウスのグループ
を、実験期間終了時（生後２５週目）に絶食させ、ＩＰＧＴＴを行った。ＩＰＧ
ＴＴ試験においても、非糖尿病、非処理のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）を対
照例として用いた。結果：Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＷＨＩ−Ｐ１３１で処理した
ＮＯＤマウスの両グループにおいて、グルコースチャレンジ後の（post glucose
challenge）血糖値は相似していた。これに対し、血糖正常のＤＭＳＯ処理マウ
スは、各観察時点において、ＷＨＩ−Ｐ１３１処理マウスのいずれのグループよ
りも著しく高い血糖値を示していた。
【０２０１】 さらに、ＩＰＧＴＴ分析を行ったマウスより得た膵臓（pancreata）の膵島炎
レベルに対し、組織学的検証を行った。対照用マウス（ｎ＝３）の膵島炎スコア
は１.４３±０.１５であり、一方、生後５〜２５週の間、ＷＨＩ−Ｐ１３１で処
理されたＮＯＤ雌マウスの膵島炎スコアは０.８６±０.１２と著しく（ｐ＝０.
０２６）低かった。しかしながら、生後１０〜２５週の間、ＷＨＩ−Ｐ１３１で
処理されたＮＯＤ雌マウスの膵島炎スコアは、対照用マウスのものと変わらなか
った（１.４２±０.２４）。
【０２０２】 （ＷＨＩ−Ｐ１３１処理による養子移入されたＮＯＤscid／scid雌マウスにお
ける糖尿病発生の抑制） タイプＩ型糖尿病の自然発生的発病の前症期において、ＷＨＩ−Ｐ１３１はＮ
ＯＤ雌マウスにおける糖尿病発病に対して予防能力を呈している。よって、我々
は次に、ＮＯＤscidマウスに疾患を移入するにあたり、ＷＨＩ−Ｐ１３１が、既
に糖尿病を発病しているマウスから得たエフェクターを抑制し得るのかどうかを
調べた。２つのグループのＮＯＤscid雌マウスに対し、糖尿病のＮＯＤ雌マウス
より１×１０7の脾細胞を養子移入した。一方のグループのマウス（ｎ＝１２）
を、移入の日より毎日５０ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１で処理し、もう一方の
グループのマウス（ｎ＝１１）を、１０％のＤＭＳＯで処理した（図３４）。養
子移入後４週目に６／１１（５５％）の対照用ＮＯＤscidマウスが糖尿病を発病
し、続いて５週目には糖尿病マウスが８／１１（７３％）になったのに対し、Ｗ
ＨＩ−Ｐ１３１で処理したＮＯＤscid雌マウスで糖尿病を発病したのは実験期間
を通じ１／１２（８％）に過ぎなかった（図４）。明らかに、養子移入後の糖尿
病の発生が、ＷＨＩ−Ｐ１３１処理により著しく（ｐ＜０．００２）予防されて
いた。
【０２０３】 化合物が有する同種移植片生存率延長性能は、当該技術分野では公知のアッセ
イにより測定できる。または、実施例８で述べるアッセイと同様のアッセイによ
り測定することも可能である。
【０２０４】 実施例８ 島細胞機能を損なわない同種移植片生存率の延長 生後８〜１２週の雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b）をレシピエントとし
て用い、生後日数の同じＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）雄マウスをドナーに用いた。
いずれの血統のマウスも、ニューヨーク州、ジャーマンタウンのタコニック社よ
り購入し、ヒューゲスインスティテュートの動物保護施設にて病原体の存在しな
い環境下で飼育したものである。***させたＪａｋ３遺伝子と相同なＪａｋ３-/ - マウス（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９／Ｓｖ、Ｈ−２b）は、テネシー州メンフィス
のセントジュードチルドレンズリサーチホスピタルのジェイ・エヌ・イーレ博士
のご厚意により寄贈されたものである。同型接合のＪａｋ３-/-マウスをＣ５７
ＢＬ／６マウスと交配し、雑種第一代の子孫をＣ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配
した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスとの戻し交配を３世代続けた後、得られた子孫を異
種交配し、Ｊａｋ３-/-マウスと野生型（ＷＴ）Ｊａｋ３+/+マウスを得た。これ
らのマウスを実験に使用した。
【０２０５】 （リンパ球混合培養反応（ＭＬＲ）） ＭＬＲアッセイのため、応答細胞（responder cells）（生後１０週のＣ５７
ＢＬ／６雄マウスより得た脾細胞）を３セット（triplicates）、９６個のウェ
ルプレートで、ウシ胎児血清（Laboratories Inc., Logan, UT）を１０％添加し
たＲＰＭＩ（Life Technologies , Grand Island, NY）中で４×１０5／１００
μｌの濃度になるよう平板培養した。マイトマイシンで処理したスティミュレー
ター（生後１０〜１２週のＢＡＬＢ／ｃ雄マウスより得た脾細胞）を５０μｌ中
で８×１０4の濃度になるように添加した。また、濃度の異なるＷＨＩ−Ｐ１３
１を最終体積が２００μｌになるように添加し、培養器内のＣＯ2５％の湿潤空
気中で、３７℃で５日間細胞を培養した。その後、細胞増殖の定量化のための比
色定量アッセイを、生存能力のある細胞（viable cells）中のミトコンドリアデ
ヒドロゲナーゼ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）によるテトラゾリ
ウム塩ＷＳＴ-１の分割（cleavage）に基づき、製造業者の指示に従って行った
。吸光度の測定は、マルチスキャンＭＳマイクロプレートスキャナー（Multiska
n MS microｐlate scanner）を用いて、４５０／６９０ｎｍで行った。細胞増殖
値は、刺激を受けた細胞におけるＯ．Ｄ．値から刺激を受けていない細胞のＯ．
Ｄ．値を引いて得た（刺激を受けていない細胞のＯ．Ｄ．値は０．３７０〜０．
４５０の間である）。
【０２０６】 （アポトーシスの検出） Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞（３×１０6／ｍｌ）を、上記の条件下で、２４個のウ
ェルプレート中で５００μｌのＲＰＭＩ−１６４０で培養した。ＷＨＩ−Ｐ１３
１を、０.１、１、１０および１００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。アポトーシ
ス細胞死は、インサイチュ細胞検出キット（InSitu Cell Detection Kit）、フ
ルオレセイン（Fluorescein）（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を用
い、ＴＵＮＥＬにより検出した。培養期間終了後、製造業者の指示に従い、細胞
の洗浄、固定、浸透化、および染色を行った。アポトーシスの分析は、ファクス
カリバー（FACS Calibur）（Becton Dickinson, San Jose, Ca）を用い、フロー
サイトメトリーにより行った。
【０２０７】 （フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析） 脾細胞の単一細胞浮遊液を、ＷＨＩ−Ｐ１３１（１３０ｍｇ／ｋｇ／日）で処
理したマウス、もしくはベヒクル処理したＣ５７ＢＬ／６マウスより調製し、赤
血球を溶菌緩衝液に溶解し、脾細胞（１×１０6）を以下の抗マウス単一クロー
ン性抗体（Ａｂ）、すなわち抗ＣＤ３-ＦＩＴＣ Ａｂ（クローン１４５-２Ｃ１
１）、抗ＣＤ４-ＦＩＴＣ Ａｂ（クローンＧＫ１.５）、抗-ＣＤ８-ＰE Ａｂ （
クローン５３-６.７）、および 抗-ＣＤ１９-ＰＥ Ａｂ（クローン１Ｄ３）、の
１：１００希釈液で染色した。Ａｂは全てカリフォルニア州、サンディエゴ、フ
ァーミンゲン（Pharmingen, San Diego, Ca）より購入したものである。染色し
た脾細胞は、上記のようにファクスカリバーにより分析した。
【０２０８】 （島の分離） シェトヴィックらが以前に述べたように（Cetkovic-Cvrlje M, et al., 1997,
Diabetes, 46: 1975-1982）、３〜４ｍｌのコラゲナーゼＰ（３ｍｇ／ｍｌ）（
Boehringer Mannheim, Indianaｐolis, IN）とデオキシリボヌクレアーゼ（０.
１ ｍｇ／ｍｌ）（Sigma, St. Louis, MO）を用いた胆管潅流により、ＢＡＬＢ
／ｃ雄マウスよりランゲルハンスの島組織を分離した。精密観察機器下において
、３、４回島を手で摘み、島より外分泌組織、血管、リンパ節、およびリンパ管
を取り除き、移植の準備を整えた。
【０２０９】 （同種移植片移植および薬物治療） ４００個の移植片をハミルトンシリンジ（Hamilton syringe）に配置し、各糖
尿病レシピエントマウスの左腎被膜に移植した。レシピエントは、移植１週間前
に、１回のストレプトゾトシン（２００ｍｇ／ｋｇ; Sigma, St. Louis, MO）の
ｉ．ｐ．への投与により糖尿病とされていた。血糖値の測定は、ワンタッチプロ
ファイルグルコースモニターシステム（One Touch Profile glucose monitor sy
stem）（Lifescan, Milｐitas, Ca）を用いて行った。３５０ｍｇ／ｄｌを超え
る糖血の糖尿病マウスのみを、移植レシピエントとして使用した。連続的に血糖
を測定することで、同種移植片の機能を監視した。最初の移植片機能（primary
graft function）は、移植３日後における２００ ｍｇ／ｄｌ未満の血糖で定義
され、移植片拒絶反応は最初の移植片機能期間の後、２回連続で測定された２５
０ｍｇ／ｄｌを超える血糖の上昇により定義された。レシピエントは、高投薬量
（２０ｍｇ／ｋｇ）のサイクロスポリンＡ（Sigma, St. Louis , MO）、ＷＨＩ
−Ｐ１３１（５０および７５ｍｇ／ｋｇ、３回に分けて投薬）、ＷＨＩ−Ｐ１３
２（５０ｍｇ／ｋｇ、３回に分けて投薬）、または対照用ベヒクルにより、移植
の日から拒絶反応が起こるまで、毎日処理を施された。注入は全てｉ．ｐ．に行
われた。
【０２１０】 （共通遺伝子の島移植レシピエントに対する腹腔内糖忍容力試験（ＩＰＧＴＴ
）） 共通遺伝子の島移植片（４００個のＣ５７ＢＬ／６の島）を移植され、ＷＨＩ
−Ｐ１３１または対照用ベヒクルで２ヶ月間処理されたＣ５７ＢＬ／６レシピエ
ントに対し、ＩＰＧＴＴを行った。マウスを１０時間絶食させ、グルコース溶液
（体重に対し１.５ｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．に注入した。グルコースの注入前後に
血液サンプルを採取し、０分、３０分、６０分および１２０分の時点で血糖値を
（上述のように）測定した。
【０２１１】 （組織病理学的研究） 同種移植片を移植した、ベヒクル処理した対照用Ｃ５７ＢＬ／６レシピエント
（ｎ＝３）ならびにＷＨＩ−Ｐ１３１で処理したＣ５７ＢＬ／６レシピエント（
ｎ＝５）を移植後１４日目に犠牲にし、Ｊａ３-/-のレシピエント（ｎ＝６）を
移植後１００日目に犠牲にし、共通遺伝子の島移植片を移植してベヒクル処理し
た対照用Ｃ５７ＢＬ／６レシピエント（ｎ＝４）ならびにＷＨＩ−Ｐ１３１で処
理したＣ５７ＢＬ／６レシピエント（ｎ＝５）を移植後１８０日目に犠牲にした
。移植片を有する腎臓を摘出し、１０％のホルマリンに固定し、パラフィンに埋
め込んだ。移植片エリアの連続する切片を切開し、ヘマトキシリンとエオシンで
染色した。インシュリン染色のため、免疫ペルオキシダーゼ法により、ポリクロ
ーン性のモルモットの抗インシュリン抗体（Gpx Insulin, Dako, Carpinteria,
Ca）の１：１００希釈液、ならびにセイヨウワサビペルオキシダーゼに接合した
（conjugated）二次的抗体（Guinea Pig Immunoglobulins HRＰ, Dako, Carpint
eria, Ca）で切片を染色した。そして切片をヘマトキシリンで短時間で対比染色
し、検査のため光学顕微鏡に載置した。
【０２１２】 （統計学的分析） 統計学的分析は、無対のスチューデント式テスト（ＭＬＲおよびＦＡＣＳデー
タ）を用いて行った。薬剤処理グループと対照用グループ間における同種移植片
拒絶反応の実験結果の違いは、マンテルコックステストを用いたカプランマイヤ
ー生命表分析（Kaplan-Meier life table analysis）により推定した。０．０５
未満のＰ値は、統計学的に有意と見なされる。
【０２１３】 （実施例８の結果） （Ｊａｋ３-/-マウスは島同種移植片を拒絶しない） ＳＴＺにより糖尿病とされたＪＡＫ３欠乏雄マウス（ｎ＝６）およびそのＷＴ
同腹子（ｎ＝７）に対し、腎臓皮膜にＢＡＬＢ／ｃ島を移植し、移植後１００日
間血糖値を測定した。参照用ＷＴマウスの島同種移植片は、１２.９±１．１の
ＭＳＴで拒絶されたのに対し、Ｊａｋ３-/-レシピエントの島同種移植片は、全
て移植後１００日間生存した（図３５）。移植片の組織学的分析によれば、島の
形態を完全に保った移植片エリアのわずかな単核浸潤（データは示されていない
）に対する浸潤は見受けられなかった。
【０２１４】 （ＷＨＩ−Ｐ１３１により誘発されるＭＬＲレスポンスの抑制） ０.１、１、１０および５０μｇ／ｍｌの濃度で添加されたＷＨＩ−Ｐ１３１
は、ＭＬＲにおける同種反応性（alloreactive）脾細胞の増殖を、投薬量次第で
抑制した（図３６）。０．１ｇ／ｍｌの濃度のＷＨＩ−Ｐ１３１によれば、統計
学的に有意な（ｐ＝０.００９５）ＭＬＲレスポンスの減少が誘発されたのに対
し、レスポンスの完全な停止（得られたＯ．Ｄ．値は刺激を与えない対照例のＯ
．Ｄ．レベルより低い）は、０．１μｇ／ｍｌのＷＨＩ−Ｐ１３１の添加によっ
て得られた（図３６）。次に、我々は、ＭＬＲレスポンスが抑制される理由は、
ＷＨＩ−Ｐ１３１が誘発するリンパ球死であるのかどうかに関するテストを行っ
た。このため、濃度の異なるＷＨＩ−Ｐ１３１を添加し、２０時間の培養期間の
後に、アポトーシス脾細胞（ＴＵＮＥＬ陽性）を測定した。図３７は、観察培養
期間において、０.１および１μｇ／ｍｌのＷＨＩ−Ｐ１３１を添加して培養し
た脾細胞のアポトーシス細胞死は参照用細胞の場合と相違しないが、１０および
１００μｇ／ｍｌのＷＨＩ−Ｐ１３１を添加した場合には、アポトーシス細胞死
が対照用細胞死と比べて著しく増加した（それぞれｐ＝０．００８およびｐ＜０
．０００１）ことを示している。従って、低薬剤濃度（０.１および１μｇ／ｍ
ｌ）で得られたＭＬＲ抑制に対するＷＨＩ−Ｐ１３１の効果は、細胞死によって
誘発されたものではないと考えられる。
【０２１５】 （レシピエントに対するＷＨＩ−Ｐ１３１が処理島同種移植片生存率を延長し
た） 対照用Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３９）は、ＢＡＬＢ／ｃ島同種移植片を、
１４.１±０.９の平均生存期間（ＭＳＴ）で拒絶した。レシピエント（ｎ＝１０
）を２０ｍｇ／ｋｇという高投薬量のＣｓＡ（１８）で毎日処理した場合、島同
種移植片の生存率（ＭＳＴ＝２７.９±４.６日）が著しく向上した（ｐ＝０.０
００５）（図３８）。５０ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１での処理（ｎ＝１４）
または７５ ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１での処理（ｎ＝１４）は、島同種移
植片生存率（それぞれ、ＭＳＴ＝２４.７±３.４ および ２５.３±３.８）を延
長するにあたって、対照例と比べると（それぞれ、ｐ＝０.０００２および０.０
０１）、ＣｓＡ処理と同様に効果を呈していた（図３８）。
【０２１６】 対照用ベヒクルで処理した血糖正常のレシピエント（ｎ＝３）の島同種移植片
を移植１４日後に採取し組織学的に検証した結果、リンパ球の侵入と大規模な島
の破損が観察され、インシュリンの免疫染色がはっきりと観察された。この観察
結果は、５０ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１で処理を行ったレシピエント（ｎ＝
５）の島同種移植片と著しい対照をなしていた。ＷＨＩ−Ｐ１３１で処理したレ
シピエントの島同種移植片においては、リンパ球の侵入は見られたものの、広範
囲にわたる島の破損はなかった。同じ時点で採取されたベヒクル処理を行った高
血糖の同種移植片（ｎ＝４）には、リンパ球が完全に侵入しており、インシュリ
ン生産細胞は全く残っていなかった。
【０２１７】 以下の実験は、生体内の脾細胞個体群に対するＷＨＩ−Ｐ１３１処理の効果を
研究するために行われた。Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに対し、１３０ｍｇ／ｋｇの
ＷＨＩ−Ｐ１３１による処理（ｎ＝７）および対照用にベヒクルによる処理（ｎ
＝５）を１０日間行った。ベヒクル処理を行ったマウスにおける脾細胞の総数は
、１５４±８.５×１０6であったが、ＷＨＩ−Ｐ１３１処理を行ったマウスにお
いては、脾細胞の総数は１１９±９．４×１０6と減少していた（ｐ＝０.０２５
）。ＷＨＩ−Ｐ１３１処理マウスおよびベヒクル処理マウス間において、ＣＤ３
＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合に差はなかった（
データは示されていない）。しかしながら、図６には、ＷＨＩ−Ｐ１３１処理マ
ウスおよびベヒクル処理マウス間において、研究を行った細胞増殖の数にわずか
な差が見受けられたことが示されている。従って、ＷＨＩ−Ｐ１３１処理マウス
においては、ＣＤ３＋脾細胞の数が、ベヒクル処理マウスの４６.９±２.６×１
０6と比べて、３７.７±３.２×１０6まで減少していた（しかしながら、統計学
的に有意ではない。ｐ＝０.０６１７）。ＷＨＩ−Ｐ１３１処理を行ったマウス
におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の数１６.８±１.２×１０6（ｐ＝０.０４１６）、なら
びにＢ細胞の数５７.１±５.３×１０6（ｐ＝０.０２６７）は、対照用マウスに
おけるそれぞれの細胞数２０.５±０.６×１０6および７８.２±６.１×１０6と
比べて減少していた（図３９）。
【０２１８】 （移植された共通遺伝子の島の機能は、長期にわたるＷＨＩ−Ｐ１３１処理後
も保たれる） この研究は、５０ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１による長期間（１８０日）の
処理が、共通遺伝子の島移植片の機能に及ぼす影響をテストするために行われた
。図４０に示されるように、対照用にベヒクル処理した共通遺伝子のレシピエン
ト（ｎ＝４）とＷＨＩ−Ｐ１３１で処理した共通遺伝子のレシピエント（ｎ＝５
）におけるの非絶食時の血糖値は、移植後の１８０日間の実験期間を通じて相違
しなかった。、ＩＰＧＴＴを処理７０日目に行った。対照用レシピエントとＷＨ
Ｉ−Ｐ１３１処理レシピエントにおけるの非絶食時の血糖値は、この時、それぞ
れ１０２.０±６.７と１２４.６±１０.８ｍｇ／ｄｌであった。ＩＰＧＴＴテス
ト結果は、移植も処理も行っていないＣ５７ＢＬ／６雄マウス、移植を行ったベ
ヒクル処理レシピエント（対照用）、および移植を行ったＷＨＩ−Ｐ１３１処理
レシピエントにおいて、島機能には著しい差がないことを示している（図４１）
。実験期間の終了時に、再度ＩＰＧＴＴテストを行った。非絶食時の血糖値は、
この時、対照用レシピエントで１２０.９±１２.５ｍｇ／ｄｌ、ＷＨＩ−Ｐ１３
１処理レシピエントで１１５.２±９.２ｍｇ／ｄｌであった。ここでもＩＰＧＴ
Ｔテスト結果は、ＷＨＩ−Ｐ１３１処理を行ったレシピエントの島機能は、対照
用レシピエントおよび移植を行っていないＣ５７ＢＬ／６マウスのいずれの島機
能とも相違しないことを示している
【０２１９】 ベヒクル処理を行った対照例ならびにＷＨＩ−Ｐ１３１処理を行った共通遺伝
子島移植片の光学顕微鏡による評価の各例が図８に示されている。ヘマトキシリ
ンとエオシンによるベヒクル処理対照例ならびにＷＨＩ−Ｐ１３１処理移植片の
染色は、これらの移植片において著しい形態的な変化が見られなかったことを示
している。免疫組織化学分析により、ＷＨＩ−Ｐ１３１処理移植片におけるイン
シュリン発現は、ベヒクル処理を行った対照用レシピエントの移植片におけるイ
ンシュリン発現に匹敵することが確認された。
【０２２０】 あらゆる出版物、特許、および特許文献が、それぞれ別個に、引照をもって本
明細書に組み込まれている。本発明は、各種の特定の、および好ましい実施態様
および技術を参照して記載されている。しかしながら、本発明の精神および請求
範囲内において、多くの変更や改良を加えてもよいことは当然理解されるべきで
あろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、代表的な式Ｉの化合物を、化合物５より合成する過程を示している。
【図２】 [Ａ]タンパク質（青）の分子表面と触媒（ＡＴＰ結合）部位（黄色）を示した
ＪＡＫ３のモデル。[Ｂ]ＪＡＫ３キナーゼドメインのホモロジーモデルのリボン
による表示（Ｃαバックボーン）。ＷＨＩ−Ｐ１３１分子は、ＪＡＫ３の触媒部
位における空間充填（space-filling）モデルとして示されている。[Ｃ]キナゾ
リンインヒビターＷＨＩ−Ｐ１３１（緑）が結合したＪＡＫ３モデルの触媒部位
をクローズアップした図。残基とインヒビターは空間補充原子として示されてい
る。溶媒に曝露された触媒部位の開口部は、比較的平面的なインヒビターがＪＡ
Ｋ３に入り込み、結合するのに十分な大きさを有している。ポケットの開口部は
、残基Ｐｒｏ９０６、Ｓｅｒ９０７、Ｇｌｙ９０８、Ａｓｐ９１２、Ａｒｇ９５
３、Ｇｌｙ８２９、Ｌｅｕ８２９、およびＴｙｒ９０４（青の残基）によって決
まる。ポケット内側の奥の壁は、Ｌｅｕ９０５（Ｃαバックボーン）、Ｇｌｕ９
０３、Ｍｅｔ９０２、Ｌｙｓ９０５、およびＡｓｐ９６７（ピンクの残基）にラ
イニングされ、またポケットの底部は、Ｌｅｕ９０５（側鎖）、Ｖａｌ８８４、
Ｌｅｕ９５６、およびＡｌａ９６６（黄色の残基）にライニングされている。ポ
ケットの頂部を決定する残基には、Ｌｅｕ８２８、Ｇｌｙ８２９、Ｌｙｓ８３０
、およびＧｌｙ８３１（最上部の青の残基）が含まれる。図面はインサイトＩＩ
プログラムを使用して作成。
【図３】 [Ａ]ＪＡＫ３ホモロジーモデルの触媒（ＡＴＰ結合）部位における非占有空間
のモデル。緑色で示されているのは、ＡＴＰに対する結合部位とジメトキシキナ
ゾリンインヒビターに対する最適結合部位。緑色のキナーゼ活性部位領域の総容
積は、約５３０オングストローム（５３ｎｍ）である。モデリング研究は、この
領域への結合が著しいインヒビターまたはインヒビターのタンパク質は５３０立
方オングストローム（５３ｎｍ3）未満の容積を占有し、かつ結合部位領域の形
状に適合する分子サイズを有することが明らかとなっている。結合部位に近接す
る他の領域で、測定可能な非占有容積を示すものを、ロイヤルブルー、ピンク、
黄色、およびライトブルーで示している。これらの結合領域は、インヒビター分
子（ロイヤルブルー）が結合できないか、あるいは溶媒分子（ピンク、黄色、お
よびライトブルー）を占有するのに十分な大きさを有する領域を示しているに過
ぎない。触媒部位に結合したＷＨＩ−Ｐ１３１のモデルを白で示し、緑色の領域
に積み重ねた。[Ｂ]キナゾリンＷＨＩ−Ｐ１３１（多色）、ＷＨＩ−Ｐ１３２（
ピンク）、およびＷＨＩ−Ｐ１５４（黄色）を有するＪＡＫ３の触媒部位のモデ
ル。各化合物は結合部位に適合するが、ＷＨＩ−Ｐ１３２（生物学的アッセイに
おいて、ＪＡＫ３に対し不活性であることがわかっている）においては、Ａｓｐ
９６７と結合すべき位置にＯＨ基がない。ＷＨＩ−Ｐ１３１とＷＨＩ−Ｐ１５４
は、フェニル環のＣ４’の位置にＯＨ基を有しており、ＪＡＫ３のＡｓｐ９６７
と好適に相互作用でき、これにより抑制作用が強められる。[Ｃ]ＪＡＫ３触媒部
位への結合を補助すると予想されるジメトキシキナゾリン誘導体の特徴。
【図４】 [Ａ]５種の異なるタンパク質チロシンキナーゼ、すなわちＪＡＫ３（ピンク）
、ＢＴＫ（赤）、ＳＹＫ（ライトブルー）、ＩＲＫ（ダークブルー）、およびＨ
ＣＫ（黄色）、の触媒部位における非保存性残基（nonconserved residues）の
構成の比較。結合したＪＡＫ３インヒビターの５オングストローム（０．５ｎｍ
）以内の残基、すなわちＷＨＩ−Ｐ１３１（白）は、棒状の側鎖として示されて
いる。ＪＡＫ３のＣアルファバックボーンは、透視図であるため、まばらなピン
クの線で示されている。領域Ａ〜Ｆは、触媒部位において、非保存性残基を含有
するエリアに該当する（Ｂ図、ならびに結果および検討を参照されたい）。ＨＣ
ＫとＩＲＫの結晶構造座標、ならびにＪＡＫ３、ＢＴＫ、ＳＹＫのホモロジーモ
デルを構造分析に用いた。［Ｂ］８種の異なるタンパク質チロシンキナーゼの触
媒部位における非保存性残基。領域Ａ〜Ｆは、Ａに図示された触媒部位中の場所
について言及している。
【図５】 ＷＨＩ−Ｐ１３１がＪＡＫ３のチロシンキナーゼ活性度に及ぼす影響。［Ａ］
〜[Ｄ]適切なバキュロウイルス発現ベクターに感染させたＳｆ２１昆虫卵巣細胞
より免疫沈澱させたＪＡＫ３、ＪＡＫ１、およびＪＡＫ２を、ＷＨＩ−Ｐ１３１
で処理し、その後、本明細書に記載の方法で、生体外キナーゼアッセイを行った
。さらに、本明細書に記載の方法で、１０分間のキナーゼアッセイにおけるオー
トリン酸化を測定し、ＪＡＫの酵素活性度を求めた。キナーゼ活性度（ＫＡ）の
レベルは、ベースライン活性度に対する割合（％ＣＯＮ）で表した。[Ｅ]３２Ｄ
ｃ２２−ＩＬ−２β細胞のＥＭＳＡ。ＷＨＩ−Ｐ１３１（１０μｇ／ｍｌ＝３３
．６μＭ）およびＷＨＩ−Ｐ１５４（１０μｇ／ｍｌ＝２６．６μＭ）（ＷＨＩ
−Ｐ１３２：１０μｇ／ｍｌ＝３３．６μＭは含まない。）は、３２Ｄｃ２２−
ＩＬ−２β細胞において、ＩＬ−２が引き金となるＪＡＫ−３依存性のＳＴＡＴ
の活性化を抑制したが、ＩＬ−３が引き金となるＪＡＫ−１／ＪＡＫ−２依存性
のＳＴＡＴの活性化は抑制しなかった。
【図６】 ＷＨＩ−Ｐ１３１の特異性。適切なバキュロウイルス発現ベクターに感染させ
たＳｆ２１昆虫卵巣細胞より免疫沈澱させたＪＡＫ３、ＳＹＫ、およびＢＴＫと
、ＮＡＬＭ−６ヒトＢ直系ＡＬＬ細胞より免疫沈澱させたＬＹＮと、ＨｅｐＧ２
ヘパトーマ細胞より免疫沈澱させたＩＲＫとをＷＨＩ−Ｐ１３１で処理し、本明
細書に記載の方法で生体外キナーゼアッセイを行った。
【図７】 ＷＨＩ−Ｐ１３１は、濃度次第で(Concentration-Dependent Fashion)、ミト
コンドリア容積に影響を及ぼすことなくミトコンドリア膜を消極する（depolari
ze）。ＮＡＬＭ−６ヒト白血病細胞を、表示のＷＨＩ−Ｐ１３１濃度にて４８時
間培養し、ＤｉＩＣ１で染色してミトコンドリア膜電位（Δψｍ）を推定するか
、もしくはＮＡＯで染色してミトコンドリア容積を検出し、その後、ＨｅＮｅレ
ーザを装備したセルソータを用いて分析を行った。ＷＨＩ−Ｐ１３１は、濃度が
上昇した消極ミトコンドリア（depolarized mitochondria）を、（Ａ図のＭ１で
示されるように）次第に増加させた。同様の濃度において、ミトコンドリア容積
[Ｂ]には著しい変化は検出されなかった。[Ｃ]ミトコンドリア容積（蛍光緑）と
ミトコンドリア膜電位（蛍光色の赤／オレンジ）とを同時に分析するため、細胞
をＪＣ−１で染色した。未処理のＮＡＬＭ−６細胞［Ｄ．１］と、５０μＭのＷ
ＨＩ−Ｐ１３１で２４時間処理を行ったＮＡＬＭ−６細胞［Ｄ．２］とを、ＪＣ
−１で培養し、共焦レーザ走査検鏡法（confocal laser scanning microscopy）
により分析した。対照用細胞のミトコンドリアは、より明るいＪＣ−１蛍光赤色
で示すように、より高い膜電位（Δψｍ）を示した。ＪＣ−１蛍光赤色の著しい
減少が示すように、細胞をＷＨＩ−Ｐ１３１で処理すれば、ミトコンドリア膜電
位Δψｍが低下する。
【図８】 ＷＨＩ−Ｐ１３１は、ＮＡＬＭ−６白血病細胞においてアポトーシスを誘発す
る。[Ａ]：１０μＭ〜５００μＭのＷＨＩ−Ｐ１３１で２４時間細胞を培養し、
生体内アポトーシスアッセイを行った。アポトーシス細胞の割合は、１３８０細
胞／１０フィールド／サンプルの平均値を調べて決定した。データ上の点は、２
回の別個の実験によって得られたデュプリケート式の合計の中間値である。[Ｂ
．１]、[Ｂ．２]：ＮＡＬＭ−６細胞を、１００μＭのＷＨＩ−Ｐ１３１で４８
時間培養した後、生体内アポトーシスアッセイを行い、レーザ走査共焦顕微鏡を
用いて分析を行った。ＤＭＳＯ（０．１％）で処理した対照用細胞[Ｂ．１]と比
較すると、ＷＨＩ−Ｐ１３１で培養した細胞[Ｂ．２]の幾つかにアポトーシス核
（蛍光黄色）が見られた。蛍光赤色は、よう化プロピジウムで染色した核を表す
。
【図９】 ＷＨＩ−Ｐ１３１は、ヒト白血病細胞におけるアポトーシスのＤＮＡ断片化を
誘発する。対照用細胞ならびに薬物処理した細胞のトリトン−Ｘ−１００ライセ
ートから得たＤＮＡを、記載の方法（２１）により分析し、その断片かを調べた
。[Ａ]ＮＡＬＭ−６ヒトＢ直系ＡＬＬ細胞を、１、３、または１０μＭの最終濃
度の列挙したジメトキシキナゾリン化合物により、３７℃で２４時間処理した。
ＷＨＩ−Ｐ１３１はリードＪＡＫ３抑制化合物として使用され、他の化合物は全
てＪＡＫ３抑制作用を有さない対照用として含まれていた。[Ｂ]ＬＣ１；１９ヒ
トＢ直系ＡＬＬ細胞と、対照用細胞ラインＳＱ２０ＢおよびＭ２４−ＭＥＴとを
、１または３μＭの最終濃度のＷＨＩ−Ｐ１３１により、３７℃で２４時間処理
した。
【図１０】 ｓｋｈ−１のマウスにおけるＵＶＢ誘発皮膚厚に対する化合物６の抑制作用。
雌のｓｋｈ−１マウスを局所的に１ｍｇ／ｃｍ2の化合物６で処理し、その後、
３５ｍｊ／ｃｍ2のＵＶＢ光線を照射した。各マウスの皮下脂肪厚を週２回記録
し、２回の測定結果の平均値を算出に用いた。中間値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜１４）
をデータとして示した。ベヒクル処理した対照例と比較した場合、＊Ｐ≦０．０
５および＊＊Ｐ≦０．００５。
【図１１】 マウスあたりの平均損傷数に対する化合物６の抑制作用。雌のｓｋｈ−１マウ
スを局所的に１ｍｇ／ｃｍ2の化合物６で処理し、その後、３５ｍｊ／ｃｍ2のＵ
ＶＢ光線を照射した。損傷数を週２回記録し、２回の測定結果の平均値を算出に
用いた。中間値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜１４）をデータとして示した。ベヒクル処理
した対照例と比較した場合、＊Ｐ＜０．０５。
【図１２】 各マウスにおける平均損傷容積に対する化合物６の抑制作用。雌のｓｋｈ−１
マウスを局所的に１ｍｇ／ｃｍ2の化合物６で処理し、その後、３５ｍｊ／ｃｍ2 のＵＶＢ光線を照射した。直系が１ｍｍ以上である損傷を週２回記録し、２回の
測定結果の平均値を算出に用いた。損傷容積は、本明細書の材料と方法に記載の
式を用いて算出した。中間値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜１４）をデータとして示した。
ベヒクルで処理した対照と比較した場合、＊はＰ≦０．０５。
【図１３】 ＵＶＢ照射を２０週間行ったマウスの背面の形態的外観。雌のｓｋｈ−１マウ
スを局所的に１ｍｇ／ｃｍ2の化合物６で処理し、その後、３５ｍｊ／ｃｍ2のＵ
ＶＢ光線を照射した。マウスに対し、週３回の照射を２０週間続けた。２０週目
にマウスに麻酔をかけ、背面を写真撮影した。パネルＡ：照射を行わずにベヒク
ルで処理した対照例。パネルＢ：ＵＶＢを照射し、ベヒクルで処理したマウス。
パネルＣ：ＵＶＢを照射し、化合物６で処理したマウス。倍率２倍。
【図１４】 化合物６は、ＵＶＢ誘発ＰＧＥ2合成を抑制する。ＨａＣａＴ細胞培養物に、
ＵＶＢ（２５ｍｊ／ｃｍ2）を照射もしくは擬似照射した（sham irradiated）。
照射６０分前に化合物６（３〜３０（Ｍ））を添加し、さらにＵＶＢ照射後にも
再投与した。引き続き行われた６時間の培養で放出された累積ＰＧＥ2は、ＥＩ
Ａによって測定された。記載のデータは中間値である（ＳＥＭ（ｎ＝３））。
【図１５】 化合物６は、表皮細胞における、ＥＧＦ刺激によるＰＧＥ2の放出を抑制する
。５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを用い、化合物６の存在下と不在下の両方で集密した
（confluent）ＨａＣａＴ細胞培養物に刺激を与え、細胞を３７℃で６時間培養
した。培養後、上澄み液を収集し、培養時に放出された累積ＰＧＥ2をＥＩＡに
より測定した。記載のデータは中間値である（ＳＥＭ（ｎ＝５））。
【図１６】 ＵＶＢ光線による損傷後のｓｋｈ−１マウスの皮下脂肪厚に対し、化合物６が
及ぼす影響。ｓｋｈ−１マウスを化合物６（１６ｍｇ／ｋｇ;ｉ．ｐ．ボーラス
静脈内注射）で２日間前処理した。ＵＶＢ照射の日、マウスに麻酔をかけ、ＵＶ
Ｂ照射の１５分前に１.５ｍｇ／ｃｍ2の化合物６をその背面に塗りつけた後、Ｕ
ＶＢ光線（２５０ｍｊ／ｃｍ2）を照射した。そして、照射後１日目から５日目
まで、皮下脂肪厚を測定した。データは中間値で表した（ＳＥＭ（ｎ＝５〜３４
））。
【図１７】 ｓｋｈ−１マウスの皮膚における、ＵＶＢ誘発性血漿滲出の抑制。血漿滲出に
関しては、ＵＶＢ照射（２５０ ｍｊ／ｃｍ2）後における図中に表示の時期に、
本明細書に記載の方法および材料により皮膚抽出物中のエバンスブルーの吸光度
を測定して評価した。記載のデータは中間値である（ＳＥＭ（ｎ＝５〜１７））
。
【図１８】 化合物６がＵＶＢ照射後４日目における皮膚形態に及ぼす影響。ｓｋｈ−１マ
ウスを化合物６（１６ｍｇ／ｋｇ;ｉ．ｐ．ボーラス静脈内注射）で２日間前処
理し、照射１５分前に１.５ｍｇ／ｃｍ2の化合物６をその背面に塗りつけ、ＵＶ
Ｂ光線（２５０ｍｊ／ｃｍ2）を照射した。４日目にマウスに麻酔をかけ、背面
を写真撮影した。倍率２倍。
【図１９】 化合物６による、ｓｋｈ−１マウスの皮膚におけるＵＶＢ誘発性の組織学的変
化の抑制。図面説明文３（Figure legend 3）に記載したのと同様の手順により
、マウスを薬物処理してＵＶＢ（２５０ｍｊ／ｃｍ2）を照射した。照射後４８
時間目に、マウスを犠牲にしてその皮膚の生体組織検査を行い、細胞組織のパラ
フィン切片をヘマトキシリンとエオシンで染色した。（ａ）対照例、（ｂ）ＵＶ
Ｂ（２５０ｍｊ／ｃｍ2）、（ｃ）化合物６＋ＵＶＢ（２５０ｍｊ／ｃｍ2）。倍
率４０倍。
【図２０】 ｓｋｈ−１マウスのＵＶＢ照射皮膚における表皮細胞のアポトーシスと、化合
物６によるその抑制。照射もしくは擬似照射を行ったマウスで、薬物処理を行っ
たものと行わなかったものそれぞれから、照射後４８時間目に皮膚生検材料を採
取し、得られたパラフィン切片におけるアポトーシス細胞を染色した。図面は倍
率６０倍の共焦顕微鏡が捕らえた画像である。写真中、緑の染色部分がアポトー
シス細胞である。
【図２１】 ＷＨＩ−Ｐ１３１による、ＭＬＲ（Ａ）、ＰＨＡ誘発型（Ｂ）、ならびにＣｏ
ｎＡ誘発型（Ｃ）脾細胞増殖の、投薬量に依存した抑制。５日間（ＭＬＲ）また
は３日間の培養期間中（ＰＨＡおよびＣｏｎＡ）、ＷＨＩ−Ｐ１３１を０.１、
１．０、１０、および５０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。増殖は、ＷＳＴ-１比
色定量アッセイにより測定された。３〜７回の別個の実験における中間値Ｏ．Ｄ
．±ＳＥＭを結果として表示した。グループ間における統計学的な差異を、スチ
ューデント式テストにより分析した。
【図２２】 ＷＨＩ−Ｐ１３１を０.１、１、１０、および１００μｇ／ｍＬ添加して行わ
れた２４時間の培養期間後に得られたアポトーシス脾細胞（ＴＵＮＥＬ陽性）の
割合のフローサイトメトリー分析。結果は中間値±ＳＥＭで表した。グループ間
における統計学的な差異を、スチューデント式テストにより分析した。
【図２３】 ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）ＢＭ／脾細胞移植片を移植したＣ５７ＢＬ６（Ｈ−
２b）レシピエントの主要な組織適合性バリアにおいて誘発されるＧＶＨＤに対
し、ＷＨＩ−Ｐ１３１の投与が及ぼす生体内予防効果。照射（７．５Ｇｙ）を行
ったレシピエントに、ＢＭおよび脾細胞（各２５×１０6）を移植した。一部の
レシピエントには共通遺伝子のＢＭを移植し、残りのレシピエントに対し、本明
細書の方法と材料の箇所に記載のように、２５ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１、
５０ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３２、３ｍｇ／ｋｇのサイクロスポリンＡ、１０
ｍｇ／ｍ2のメトトレキセート、または対照用ベヒクルによる処理を毎日行った
。グループ間における生存率の差異を、生命表分析、すなわちマンテルコックス
テスト（Mantel-Cox test）によって分析した。
【図２４】 ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）ＢＭ／脾細胞移植片を移植されたＣ５７ＢＬ６（Ｈ
−２b）レシピエントの主要な組織適合性バリアにおいて誘発されるＧＶＨＤ対
し、図２３に示された複合製剤の投与が及ぼす生体内予防効果。ＷＨＩ−Ｐ１３
１（２５ｍｇ／ｋｇ）、サイクロスポリンＡ（３ｍｇ／ｋｇ）、またはサイクロ
スポリンＡとＷＨＩ−Ｐ１３１とを組み合わせたもの（Ａ）をｉ．ｐ．に投与し
た。グループ間における生存率の差異を、生命表分析、すなわちマンテルコック
ステスト（Mantel-Cox test）によって分析した。
【図２５】 ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）ＢＭ／脾細胞移植片を移植されたＣ５７ＢＬ６（Ｈ
−２b）レシピエントの主要な組織適合性バリアにおいて誘発されるＧＶＨＤ対
し、図２３に示された複合製剤の投与が及ぼす生体内予防効果。ＷＨＩ−Ｐ１３
１（２５ｍｇ／ｋｇ）、およびＷＨＩ−Ｐ１３１とメトトレキセート（１０ｍｇ
／ｋｇ）またはＷＨＩ−Ｐ１３１とメトトレキセートとを組み合わせたものをｉ
．ｐ．に投与した。グループ間における生存率の差異を、生命表分析、すなわち
マンテルコックステスト（Mantel-Cox test）によって分析した。
【図２６】 化合物６（６０ｍｇ／ｋｇ／日）がＧＶＨＤの発生に及ぼす影響を示している
。
【図２７】 注入による第１回目のＳＴＺ投与後より２５日間の実験期間に調査された、Ｌ
ＤＳＴＺで処理したＪａｋ３欠乏雄マウスおよび野生型（ＷＴ）雄マウスにおけ
る累積的糖尿病発生率（Ａ）。統計学的な差異を、生命表分析によって得た。
【図２８】 注入による第１回目のＳＴＺ投与後から２５日間の実験期間に調査された、Ｌ
ＤＳＴＺで処理したＪａｋ３欠乏雄マウスおよび野生型（ＷＴ）雄マウスにおけ
る血糖値（ｍｇ／ｄｌ）（Ｂ）。統計学的な差異を、ＡＮＯＶＡによって得た。
【図２９】 注入による第１回目のＳＴＺ投与後より２５日間の実験期間に調査された、
ＬＤＳＴＺで処理したＣ５７ＢＬ／６雄マウスにおける累積的糖尿病発生率（Ａ
）。統計学的な差異を、生命表分析（マンテルコックステスト）によって得た。
【図３０】 注入による第１回目のＳＴＺ投与後より２５日間の実験期間に調査された、
ＬＤＳＴＺで処理したＣ５７ＢＬ／６雄マウスにおける血糖値（ｍｇ／ｄｌ）。
統計学的な差異を、ＡＮＯＶＡによって得た。
【図３１】 生後５〜２５週目まで、２０ ｍｇ／ｋｇ および ５０ ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ
１３１による処理を行ったＮＯＤ雌マウスにおける糖尿病発生率（Ａ）。ＷＨＩ
−Ｐ１３１処理マウスと対照用マウス間における統計学的に有意な差異を、生命
表分析（マンテルコックステスト）によって得た。
【図３２】 生後５〜２５週目あるいは１０〜２５週目まで１００ ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−
Ｐ１３１による処理を行ったＮＯＤ雌マウスにおける糖尿病発生率。ＷＨＩ−Ｐ
１３１処理マウスと対照用マウス間における統計学的に有意な差異を、生命表分
析（マンテルコックステスト）によって得た。
【図３３】 Ｃ５７ＢＬ／６ 雌マウス （生後２０週）、非糖尿病対照用ＮＯＤ雌マウス（
生後２５週）、および １００ ｍｇ／ｋｇ のＷＨＩ−Ｐ１３１による処理を１
５または２０週間行ったＮＯＤ雌マウス （生後２５週）に対して行ったＩＰＧ
ＴＴ試験。統計学的な差異を、スチューデント式テストによって得た。ＮＯＤベ
ヒクル処理を行った対照用グループと比較した場合、＊、＊＊、＊＊＊、＊＊＊
＊はそれぞれ、ｐ＜０．０５、０．０１、０．００５、および０．０００１。
【図３４】 ＮＯＤ-scid雌マウスに対する、ＷＨＩ−Ｐ１３１処理による遅れた養子移入
。ＮＯＤ-scid雌マウスに糖尿病脾細胞を１０ × １０6移入し、糖尿病が発病す
るまで、５０ ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１による処理を毎日行った。統計学
的に有意な差異を、生命表分析（マンテルコックステスト）によって得た。
【図３５】 Ｊａｋ３-/-マウスは、島同種移植片（Ａ）を拒絶しない。ヘマトキシリンと
エオシン（Ｂ）、および移植後１００日目に犠牲にされたＪａｋ３-/-レシピエ
ントの腎臓皮膜に移植された同種島移植片のインシュリン（Ｃ）の免疫染色。記
載のデータは、＞３０切片／移植片かつ６匹のマウス／グループ。倍率１０倍。
【図３６】 ＷＨＩ−Ｐ１３１は、ＭＬＲ反応を抑制する。応答脾細胞（responder spleno
cytes）（４ × １０6／ｍｌ）とスティミュレータ脾細胞（１.６ × １０6／ｍ
ｌ）とを混合し、５日間の培養期間に０.１、 １、 １０および ５０ｇ／ｍｌの
薬剤を添加した。ＷＳＴ-１比色定量アッセイにより、増殖を測定した。結果は
、６回の別個の実験における中間値Ｏ．Ｄ．±ＳＥＭで表した。ＷＨＩ−Ｐ１３
１に曝露されていない対照用細胞における増殖と比較した場合、ｐ＝０．００９
５。
【図３７】 アポトーシス脾細胞（ＴＵＮＥＬ陽性）のフローサイトメトリー分析。ＴＵＮ
ＥＬ染色は、０.１、１、１０および１００μｇ／ｍｌのＷＨＩ−Ｐ１３１で脾
細胞（１.５ｘ１０6）を２０時間培養した後に行われた。結果は、中間値±ＳＥ
Ｍで表した。グループ間における統計学的な差異を、スチューデント式テストに
より分析した。
【図３８】 ＷＨＩ−Ｐ１３１（５０および ７５ｍｇ／ｋｇ）、ＷＨＩ−Ｐ１３２（５０
ｍｇ／ｋｇ）、およびサイクロスポリンＡ（２０ｍｇ／ｋｇ）による処理が、島
同種移植片生存率に及ぼす影響。ｐ値は、生命表分析（マンテルコックステスト
）によって得た。
【図３９】 １３０ｍｇ／ｋｇのＷＨＩ−Ｐ１３１により、１０日間処理を行ったＣ５７Ｂ
Ｌ／６脾細胞のフローサイトメトリー分析。結果は、中間値±ＳＥＭで表した。
グループ間における統計学的な差異を、スチューデント式テストにより分析した
。
【図４０】 ５０ｍｇ／ｋｇ／日のＷＨＩ−Ｐ１３１または対照用ベヒクルによる処理を移
植後の１８０日間（Ａ）行った、共通遺伝子の島を移植したレシピエントの非絶
食時の血糖値。結果は、中間値±ＳＥＭで表した。
【図４１】 図３９と同じレシピエント、および移植を行っていない対照用マウスに対し、
移植後７０日目（Ｂ）に、８時間の絶食後に行われたＩＰＧＴＴ。結果は、中間
値±ＳＥＭで表した（Ｂ、Ｃ）。
【図４２】 図３９と同じレシピエント、および移植を行っていない対照用マウスに対し、
移植後１８０日目（Ｃ）に、８時間の絶食後に行われたＩＰＧＴＴ。結果は、中
間値±ＳＥＭで表した。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年４月２３日（２００１．４．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ5 はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、またはハロ； Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミ
ノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）ア
ルキルチオ、またはハロ； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
とＲ10全体としてメチレンジオキシである。
【化２】
【化３】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、またはハロ； Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミ
ノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）ア
ルキルチオ、またはハロ； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
とＲ10全体としてメチレンジオキシである。
【化４】
【化５】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、またはハロ； Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミ
ノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）ア
ルキルチオ、またはハロ； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
とＲ10全体としてメチレンジオキシである。
【化６】
【化７】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、またはハロ； Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミ
ノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）ア
ルキルチオ、またはハロ； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
とＲ10全体としてメチレンジオキシである。
【化８】
【化９】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、またはハロ； Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミ
ノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）ア
ルキルチオ、またはハロ； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
とＲ10全体としてメチレンジオキシである。
【化１０】
【化１１】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、またはハロ； Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミ
ノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）ア
ルキルチオ、またはハロ； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
とＲ10全体としてメチレンジオキシである。
【化１２】
【化１３】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、またはハロ； Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミ
ノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）ア
ルキルチオ、またはハロ； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
とＲ10全体としてメチレンジオキシである。
【化１４】
【化１５】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、またはハロ； Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミ
ノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）ア
ルキルチオ、またはハロ； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
とＲ10全体としてメチレンジオキシである。
【化１６】
【化１７】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、またはハロ； Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミ
ノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）ア
ルキルチオ、またはハロ； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
とＲ10全体としてメチレンジオキシである。
【化１８】
【化１９】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、またはハロ； Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミ
ノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）ア
ルキルチオ、またはハロ； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
とＲ10全体としてメチレンジオキシである。
【化２０】 式中、Ｒ3'はＨまたはハロ； Ｒ4'はＯＨ； Ｒ5'はＨまたはハロ； Ｒ6'はＨ； Ｒ9'およびＲ10'はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ 4）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9 'とＲ10'全体としてメチレンジオキシである。
【化２１】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、またはハロ； Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミ
ノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）ア
ルキルチオ、またはハロ； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
とＲ10全体としてメチレンジオキシである。
【化２２】 式中、Ｒ3'はＨまたはハロ； Ｒ4'はＯＨ； Ｒ5'はＨまたはハロ； Ｒ6'はＨ； Ｒ9'およびＲ10'はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ 4）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9 'とＲ10'全体としてメチレンジオキシである。
【化２３】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、またはハロ； Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミ
ノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）ア
ルキルチオ、またはハロ； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
とＲ10全体としてメチレンジオキシである。
【化２４】 式中、Ｒ3'はＨまたはハロ； Ｒ4'はＯＨ； Ｒ5'はＨまたはハロ； Ｒ6'はＨ； Ｒ9'およびＲ10'はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ 4）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9 'とＲ10'全体としてメチレンジオキシである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 29/00 35/00 35/00 35/02 35/02 37/00 37/00 37/06 37/06 43/00 １０５ 43/00 １０５ １１１ １１１ １１２ １１２ // Ａ６１Ｋ 31/517 Ａ６１Ｋ 31/517 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マラヴィヤ、ラヴィ アメリカ合衆国、55126 ミネソタ州、シ ョアヴュー、モントレイ コート ノース 951 (72)発明者 リウ、クスィン−ピン アメリカ合衆国、55449 ミネソタ州、ブ レイン、88ス アヴェニュー エヌイー 2712 Ｆターム(参考） 4C084 AA17 NA14 ZA592 ZA892 ZB012 ZB082 ZB112 ZB212 ZB262 ZB272 ZC122 ZC202 ZC352 4C086 AA01 AA02 AA03 BC46 MA01 MA04 NA14 ZA59 ZA89 ZB01 ZB08 ZB11 ZB21 ZB26 ZB27 ZC12 ZC20 ZC35

Claims (42)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式Ｉで表される化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩。 【化１】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ
    、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキルチオ
    、またはハロであり、ここで、Ｒ1〜Ｒ5における隣接する２個の基は、それらが
    結合しているフェニル環と共に、例えばナフチル環またはテトラヒドロナフチル
    環を形成する縮合環を任意に形成してもよく；さらにここで、Ｒ1〜Ｒ5における
    隣接する２個の基により形成される前記環は、１、２、３、または４個のヒドロ
    キシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アル
    コキシル、（Ｃ1−Ｃ4）アルキルチオ、またはハロで任意に置換してもよく； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
    ）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
    とＲ10全体としてメチレンジオキシである。 ただし、前記化合物は、４−（４Ｎ−ヒドロキシ−フェニル）−アミノ−６，
    ７−ジメトキシキナゾリンではないと規定する。
  2. 【請求項２】 ＸがＲ11Ｎである請求項１に記載の化合物。
  3. 【請求項３】 ＸがＨＮである請求項１に記載の化合物。
  4. 【請求項４】 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ10がそれぞれＨである
    請求項１に記載の化合物。
  5. 【請求項５】 Ｒ3は（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロ、
    トリフルオロメチル、またはＮＲ12Ｒ13であり、ここで、Ｒ12とＲ13はそれぞれ
    独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルケニル、（Ｃ1−Ｃ4）
    アルキニル、（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル、または複素環である請求項１に記載
    の化合物。
  6. 【請求項６】 Ｒ3がヒドロキシである請求項１に記載の化合物。
  7. 【請求項７】 Ｒ2またはＲ3がヒドロキシである請求項１に記載の化合物。
  8. 【請求項８】 Ｒ2またはＲ3がヒドロキシであり、Ｒ1からＲ5のいずれか１が
    ハロである請求項１に記載の化合物。
  9. 【請求項９】 Ｒ2またはＲ3がヒドロキシである請求項１に記載の化合物。
  10. 【請求項１０】 Ｒ8が（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシである請求項１に記載の化合
    物。
  11. 【請求項１１】 Ｒ9が（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシである請求項１に記載の化合
    物。
  12. 【請求項１２】 ４−（３’‐ヒドロキシル−フェニル）−アミノ−６，７−
    ジメトキシキナゾリン、４−（３’，５’−ジブロモ−４’−’ヒドロキシル−
    フェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、もしくは４−（３’−ブ
    ロモ−４’−ヒドロキシル−フェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリ
    ンまたは薬学的に許容可能なそれらの塩である請求項１に記載の化合物。
  13. 【請求項１３】 式Ｉで表される化合物または薬学的に許容可能なその塩と、
    薬学的に許容可能な担体とを含む薬学的調合物。 【化２】 式中、ＸはＨＮ、Ｒ11Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、またはＲ11ＣＨ； Ｒ11は水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、または（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル； Ｒ1〜Ｒ8はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ
    、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキルチオ
    、またはハロであり、ここで、Ｒ1〜Ｒ5における隣接する２個の基は、それらが
    結合しているフェニル環と共に、例えばナフチル環またはテトラヒドロナフチル
    環を形成する縮合環を任意に形成してもよく；さらにここで、Ｒ1〜Ｒ5における
    隣接する２個の基により形成される前記環は、１、２、３、または４個のヒドロ
    キシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4）アル
    コキシ、（Ｃ1−Ｃ4）アルキルチオ、またはハロで任意に置換してもよく； Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立して水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4
    ）アルコキシ、ハロ、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイルであるか；またはＲ9
    とＲ10全体としてメチレンジオキシである。
  14. 【請求項１４】 Ｒ2またはＲ3がヒドロキシである請求項１３に記載の調合物
    。
  15. 【請求項１５】 Ｒ2またはＲ3がヒドロキシであって、Ｒ1からＲ5のいずれか
    １がハロである請求項１３に記載の調合物。
  16. 【請求項１６】 式Ｉの化合物が、４−（３’‐ヒドロキシル−フェニル）−
    アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、４−（３’，５’−ジブロモ−４’−
    ヒドロキシル−フェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、もしくは
    ４−（３’−ブロモ−４’−ヒドロキシル−フェニル）−アミノ−６，７−ジメ
    トキシキナゾリンまたは薬学的に許容可能なそれらの塩である請求項１３に記載
    の調合物。
  17. 【請求項１７】 ４−（４’−ヒドロキシル−フェニル）−アミノ−６，７−
    ジメトキシキナゾリンまたは薬学的に許容可能なその塩と、薬学的に許容可能な
    担体とを含む薬学的調合物。
  18. 【請求項１８】 白血病やリンパ腫の治療に有用な医薬品を調製するための、
    ＪＡＫ−３インヒビターの使用方法。
  19. 【請求項１９】 臓器移植拒絶反応の治療または予防に有用な医薬品を調製す
    るための、ＪＡＫ−３インヒビターの使用方法。
  20. 【請求項２０】 ＵＶＢ照射によって誘発される哺乳類の炎症反応の予防また
    は低減に有用な医薬品を調製するための、ＪＡＫ−３インヒビターの使用方法。
  21. 【請求項２１】 哺乳類のプロスタグランジンＥ２の放出の抑制に有用な医薬
    品を調製するための、ＪＡＫ−３インヒビターの使用方法。
  22. 【請求項２２】 ＵＶＢによって誘発される哺乳類の皮膚水腫または血管透過
    性（vascular permeability）の変化の予防または低減に有用な医薬品を調製す
    るための、ＪＡＫ−３インヒビターの使用方法。
  23. 【請求項２３】 ＵＶＢ照射によって誘発される哺乳類の皮膚の上皮細胞の損
    傷または突然変異頻度の予防または低減に有用な医薬品を調製するための、ＪＡ
    Ｋ−３インヒビターの使用方法。
  24. 【請求項２４】 ＵＶＢ光線の腫瘍形成作用から哺乳類を防護するのに有用な
    医薬品を調製するための、ＪＡＫ−３インヒビターの使用方法。
  25. 【請求項２５】 哺乳類のＴ細胞の活動を抑制するのに有用な医薬品を調製す
    るための、ＪＡＫ−３インヒビターの使用方法。
  26. 【請求項２６】 自己免疫性疾患の治療に有用な医薬品を調製するための、Ｊ
    ＡＫ−３インヒビターの使用方法。
  27. 【請求項２７】 骨髄移植後の移植片対宿主病（graft versus host disease
    ）の予防または治療に有用な医薬品を調製するための、ＪＡＫ−３インヒビター
    の使用方法。
  28. 【請求項２８】 前記ＪＡＫ−３インヒビターが請求項１〜１２に記載の化合
    物である請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の使用方法。
  29. 【請求項２９】 前記ＪＡＫ−３インヒビターが４−（４’−ヒドロキシル−
    フェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリンまたは薬学的に許容可能な
    その塩である請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の使用方法。
  30. 【請求項３０】 治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビ
    ターを投与することを含む、哺乳類の白血病やリンパ腫を治療するための治療方
    法。
  31. 【請求項３１】 治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビ
    ターを投与することを含む、哺乳類の移植拒絶を治療または予防するための治療
    方法。
  32. 【請求項３２】 治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビ
    ターを投与することを含む、紫外線Ｂの照射によって誘発される哺乳類の炎症反
    応を予防または低減するための治療方法。
  33. 【請求項３３】 治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビ
    ターを投与することを含む、哺乳類のプロスタグランジンＥ2の放出を抑制する
    ための治療方法。
  34. 【請求項３４】 治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビ
    ターを投与することを含む、ＵＶＢによって誘発される哺乳類の皮膚水腫または
    血管透過性（vascular permeability）の変化を予防または低減するための治療
    方法。
  35. 【請求項３５】 治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビ
    ターを投与することを含む、紫外線Ｂの照射によって誘発される哺乳類の皮膚の
    上皮細胞の損傷または突然変異頻度を予防または低減するための治療方法。
  36. 【請求項３６】 治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビ
    ターを投与することを含む、ＵＶＢ光線の腫瘍形成作用から哺乳類を防護するた
    めの治療方法。
  37. 【請求項３７】 治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビ
    ターを投与することを含む、哺乳類のＴ細胞の活動を抑制するための治療方法。
  38. 【請求項３８】 治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビ
    ターを投与することを含む、自己免疫性疾患を治療または予防するための治療方
    法。
  39. 【請求項３９】 治療を要している哺乳類に対し有効量のＪＡＫ−３インヒビ
    ターを投与することを含む、骨髄移植後の移植片対宿主病を治療または予防する
    ための治療方法。
  40. 【請求項４０】 化合物が請求項１〜１２に記載の化合物である請求項３０〜
    ３９のいずれか１項に記載の方法前記方法。
  41. 【請求項４１】 前記ＪＡＫ−３インヒビターが４−（４’−ヒドロキシル−
    フェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリンまたは薬学的に許容可能な
    その塩である請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 医学的治療に使用するための請求項１〜１２のいずれか１項
    に記載の化合物。
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