ES2327530T3 - Expresion optimizada de l1 de hpv 45 en levaduras. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína L1 de HPV45 expuesta en la SEC ID Nº 2, estando la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEC ID Nº 1.
Description
Expresión optimizada de L1 de HPV 45 en
levaduras.
La presente invención se refiere, en líneas
generales, a la terapia del virus del papiloma humano (HPV). Más
específicamente, la presente invención se refiere a polinucleótidos
sintéticos que codifican la proteína L1 de HPV45, y a vectores
recombinantes y huéspedes que comprenden dichos polinucleótidos. La
presente invención también se refiere a partículas tipo virus (VLP)
de HPV45, produciéndose dichas VLP expresando L1 de HPV 45
recombinante o L1 + L2 en células de levadura y a su uso en vacunas
y composiciones farmacéuticas para prevenir y tratar el
HPV.
HPV.
Hay más de 80 tipos de virus del papiloma humano
(HPV), muchos de los cuales se han asociado con una amplia
diversidad de fenotipos biológicos, desde verrugas proliferativas
benignas hasta carcinomas malignos (para una revisión, véase
McMurray y col., Int. J. Exp. Pathol. 82(1):
15-33 (2001)). HPV6 y HPV11 son los tipos más
habitualmente asociados con verrugas benignas y/o condiloma
acuminado no maligno de la mucosa genital o respiratoria. HPV16 y
HPV18 son los tipos de elevado riesgo más frecuentemente asociados
con carcinomas in situ e invasivos del cuello del útero, la
vagina, la vulva y el canal anal. Más del 90% de los carcinomas
cervicales están asociados con infecciones por HPV16, HPV18 o los
tipos oncogénicos menos frecuentes HPV31, -33, -45, 52 y 58
(Schiffman y col., J. Natl. Cancer Inst. 85(12):
958-64 (1993)). La observación de que se detecta
ADN de HPV en más del 90% de los cánceres cervicales proporciona
fuertes evidencias epidemiológicas de que los HPV causan carcinoma
cervical (véase Bosch y col., J. Natl. Cancer Inst. 87(11):
796-802 (1995)).
Los papilomavirus son virus de ADN,
icosaédricos, sin envuelta, pequeños (50-60 nm), que
codifican hasta ocho genes tempranos y dos tardíos. Las fases de
lectura abierta (ORF) de los genomas virales se denominan E1 a E7,
y L1 y L2, donde "E" indica temprano y "L" indica tardío.
L1 y L2 codifican proteínas de la cápsida del virus, mientras que
los genes E están asociados con funciones tales como la replicación
viral y la transformación celular.
La proteína L1 es la proteína principal de la
cápsida y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La
proteína L2 es la proteína minoritaria de la cápsida. Los datos
inmunológicos sugieren que la mayor parte de la proteína L2 es
interna a la proteína L1 en la cápsida viral. Las proteínas tanto L1
como L2 están altamente conservadas entre diferentes
papilomavirus.
La expresión de la proteína L1 o una combinación
de las proteínas L1 y L2 en levaduras, células de insecto, células
de mamífero o bacterias conduce al auto-ensamblaje
de partículas tipo virus (VLP) (para una revisión, véase Schiller y
Roden, en Papillomavirus Reviews: Current Research on
Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information,
pág. 101-12 (1996)). Las VLP son morfológicamente
similares a viriones auténticos y son capaces de inducir elevados
títulos de anticuerpos neutralizantes después de su administración
en un animal. Como las VLP no contienen el genoma viral
potencialmente oncogénico, presentan una alternativa segura al uso
de virus vivos en el desarrollo de vacunas contra HPV (para una
revisión, véase Schiller y Hidesheim, J. Clin. Virol. 19:
67-74 (2000)). Por esta razón, los genes L1 y L2 se
han identificado como dianas inmunológicas para el desarrollo de
vacunas profilácticas y terapéuticas para infección y enfermedad por
HPV.
El desarrollo y comercialización de vacunas
contra HPV se ha visto impedido por dificultades asociadas con la
obtención de elevados niveles de expresión de genes exógenos en
organismos huésped transformados de forma satisfactoria, limitando
la producción de proteína purificada. Por lo tanto, a pesar de la
identificación de secuencias de nucleótidos de tipo silvestre que
codifican proteínas L1 de HPV tales como la proteína L1 de HPV45,
sería muy deseable desarrollar una fuente fácilmente renovable de
proteína L1 de HPV en bruto que utiliza secuencias de nucleótidos
que codifican L1 de HPV45 que están optimizadas para su expresión en
la célula huésped pretendida. Además, sería útil producir grandes
cantidades de VLP de L1 de HPV45 que tengan propiedades que
confieren inmunidad de las proteínas nativas para su uso en el
desarrollo de vacunas.
Tobery y col., Vaccine, 21 (2003)
1539-47, describen los efectos del sistema de
suministro de vacuna sobre respuestas inmunes específicas de L1 de
HPV16 en macacos rhesus inmunizados. El documento WO 01/14416
describe genes de HPV que tienen codones optimizados para su
expresión en células huésped humanas. Zhou y col., J. Virology, 73
(1999) 4972-82, analiza los factores que controlan
la expresión de genes L1 de papilomavirus en células replicantes y
no replicantes.
La presente invención se refiere a composiciones
para su uso en procedimientos para provocar o potenciar la
inmunidad contra productos proteicos expresados por genes L1 de
HPV45, que se han asociado con cáncer cervical.
La presente invención se refiere a moléculas de
ADN sintético que codifican la proteína L1 de HPV45. Los codones de
las moléculas sintéticas están diseñados de modo que se usen los
codones preferidos por una célula de levadura. Las moléculas
sintéticas pueden usarse como fuente de proteína L1 de HPV45, que
puede auto-ensamblarse en VLP. Dichas VLP pueden
usarse en una vacuna basada en VLP.
Específicamente, la presente invención comprende
una molécula de ácido nucleico sintética que codifican la proteína
L1 de HPV45 expuesta en la SEC ID Nº 2, comprendiendo dicha molécula
de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC
ID Nº 1.
También se proporcionan vectores recombinantes y
células huésped recombinantes, tanto procariotas como eucariotas,
que contienen las moléculas de ácido nucleico descritas en toda esta
memoria descriptiva.
La presente invención se refiere adicionalmente
a un procedimiento para expresar una proteína L1 de HPV45 en una
célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un vector
que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína L1 de
HPV45 en una célula huésped de levadura; en el que la molécula de
ácido nucleico tiene codones optimizados para su expresión óptima
en la célula huésped de levadura y; (b) cultivar la célula huésped
de levadura en condiciones que permitan la expresión de dicha
proteína L1 de HPV45; comprendiendo el ácido nucleico una secuencia
de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 1 (secuencia 45 L1 R).
En una realización preferida de la invención, la
levadura se selecciona entre el grupo constituido por:
Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris,
Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, y
Schizosaccharomyces pombe.
La presente invención también se refiere a
procedimientos para fabricar una vacuna que comprenda partículas
tipo virus (VLP) de HPV45.
En una realización alternativa de este aspecto
de la invención, la vacuna comprende adicionalmente VLP de al menos
un tipo adicional de HPV. El al menos un tipo adicional de HPV puede
ser cualquier tipo de HPV de interés, incluyendo cualquier tipo de
HPV descrito en la técnica o aquellos identificados posteriormente.
En una realización preferida, el tipo de HPV es un tipo que está
asociado con un fenotipo clínico tal como verrugas o cáncer
cervical. En una realización preferida adicional, el al menos un
tipo adicional de HPV se selecciona entre el grupo constituido por:
HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52,
HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, y HPV68.
Como se usa en toda la memoria descriptiva y en
las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un",
"una" y "el", "la" incluyen la referencia plural
salvo que el contexto indique claramente lo contrario.
Como se usa en toda la memoria descriptiva y las
reivindicaciones adjuntas, se aplican las siguientes definiciones y
abreviaturas:
- El término "promotor" se refiere a un sitio de reconocimiento en una cadena de ADN a la que se une la ARN polimerasa. El promotor forma un complejo de iniciación con la ARN polimerasa para iniciar y dirigir la actividad transcripcional. El complejo puede modificarse activando las secuencias llamadas "potenciadores" o "secuencias activadoras cadena arriba" o inhibiendo secuencias llamadas "silenciadores".
- El término "vector" se refiere a algunos medios por los que pueden introducirse fragmentos de ADN en un organismo huésped o tejido huésped. Hay diversos tipos de vectores incluyendo plásmidos, virus (incluyendo adenovirus), bacteriófagos y cósmidos.
- La denominación "secuencia 45 L1 de tipo silvestre" se refiere a la secuencia de ADN de L1 de HPV45 descrita en este documento como SEC ID Nº 3 (45 L1 wt). Aunque la secuencia de ADN de L1 de HPV 45 de tipo silvestre se ha descrito previamente, no es poco frecuente encontrar variaciones de secuencia minoritarias entre ADN obtenidos de aislados clínicos. Por lo tanto, se aisló una secuencia representativa de ADN 45 L1 de tipo silvestre de muestras clínicas que habían demostrado previamente que contenían ADN de HPV 45 (véase el Ejemplo 1). La secuencia 45 L1 de tipo silvestre se usó como secuencia de referencia para comparar las secuencias 45 L1 de codones optimizados descritas en este documento (véase la Figura 1).
- La denominación "L1 R de HPV 45" o "45 L1 R" se refiere a una secuencia de nucleótidos ejemplar de L1 de HPV45 sintética (SEC ID Nº 1), descrita en este documento, donde la secuencia estaba reconstruida para que comprendiera codones que son preferidos para su expresión de elevado nivel en una célula de levadura.
- La expresión "cantidad eficaz" significa que se introduce suficiente composición de vacuna para producir los niveles adecuados del polipéptido, de modo que provoque una respuesta inmune. Un especialista en la técnica reconoce que este nivel puede variar.
- Una "sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere al reemplazo de un resto aminoacídico por otro resto aminoacídico, químicamente similar. Ejemplos de dichas sustituciones conservativas son: sustitución de un resto hidrófobo (isoleucina, leucina, valina, o metionina) por otro; sustitución de un resto polar por otro resto polar de la misma carga (por ejemplo, arginina para lisina; ácido glutámico para ácido aspártico).
- El término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo un ser humano.
- "VLP" significa partícula tipo virus o partículas tipo virus.
- "Sintético" significa que el gen L1 de HPV45 se creó para que contuviera una secuencia de nucleótidos que no es igual que la secuencia de nucleótidos presente en el gen L1 de HPV45 de tipo silvestre de origen natural señalado (45 L1 wt, SEC ID Nº 3). Como se ha indicado anteriormente, en este documento se proporcionan moléculas sintéticas que comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende codones que son preferidos para su expresión en células de levadura. Las moléculas sintéticas proporcionadas en este documento codifican la misma secuencia de aminoácidos que el gen L1 de HPV45 de tipo silvestre (SEC ID Nº 2).
La Figura 1 es una alineación de secuencia de
ADN que muestra los nucleótidos que se alteraron en el gen L1 de
HPV45 sintético de la presente invención (SEC ID Nº 1, indicado como
"45 L1 R") (Véase el Ejemplo 2). La secuencia de referencia es
la secuencia 45 L1 de tipo silvestre (SEC ID Nº 3, indicada como
"45 L1 wt"; véase el Ejemplo 1). Los nucleótidos alterados se
indican en su localización correspondiente. El número de nucleótido
está contenido dentro de los paréntesis. Nucleótidos idénticos en la
secuencia reconstruida 45 L1 se indican con puntos.
La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos
y de aminoácidos en código de una letra de L1 de HPV 45 sintética
reconstruida. El número de nucleótido se indica a la izquierda.
La Figura 3 muestra una transferencia de
Northern sondeada específicamente para el ARN de L1 de HPV 45 en
condiciones de elevada rigurosidad (véase el Ejemplo 4). El carril
(1) contiene 5 \mug de ARN de L1 R de HPV 45 y el carril (2)
contiene 10 \mug de ARN de L1 R de HPV 45. Es evidente un único
transcrito de ARN de longitud completa en la transferencia. La
flecha a la izquierda indica la posición predicha de un transcrito
de L1 de HPV 45 de longitud completa.
La Figura 4 muestra una transferencia de Western
de L1 wt de HPV 45 y tres aislados L1 R de HPV 45. Los contenidos
de los carriles son: 45 L1 wt (carril 1), 45 L1 R nº 4 (carril 2),
45 L1 R nº 7 (carril 3), 45 L1 R nº 11 (carril 4), control de L1 de
HPV 16 (carril 5). Se cargaron quince microgramos de extracto
proteico de levadura total en cada carril de un gel
SDS-PAGE al 10%. Se usó un
anti-suero policlonal de cabra contra una proteína
de fusión TrpE-L1 de HPV 45 para identificar
específicamente la proteína L1 de HPV 45. La flecha a la izquierda
indica la posición de 55 kDa.
La Figura 5 muestra una parte de los datos de
dos experimentos ELISA en ng de VLP/\mug de proteína total (véase
el Ejemplo 7). Se muestra una comparación entre 45 L1 wt y dos
clones diferentes de 45 L1 R. La expresión de la VLP de L1 de HPV
45 reconstruida era aproximadamente 2 veces mayor que la de 45 L1
wt.
La Figura 6 muestra una muestra representativa
de VLP de HPV 45 compuestas de moléculas proteicas de L1 R de HPV
45, descritas en este documento, que se visualiza por microscopía
electrónica de transmisión (véase el Ejemplo 8). La barra
representa aproximadamente 100 nm.
La mayoría de los carcinomas cervicales están
asociados con infecciones de tipos oncogénicos específicos de virus
del papiloma humano (HPV). La presente invención se refiere a
composiciones y procedimientos para provocar o potenciar la
inmunidad contra los productos proteicos expresados por genes de
tipos oncogénicos de HPV. Específicamente, la presente invención
proporciona polinucleótidos que codifican la proteína L1 de HPV45,
que se auto-ensamblan en partículas tipo virus (VLP)
de HPV45 y describe el uso de dichos polinucleótidos y VLP en
composiciones farmacéuticas y vacunas para la prevención y/o
tratamiento de cáncer asociado a HPV.
Se ha presentado la secuencia de nucleótidos de
L1 de HPV45 de tipo silvestre (Nº de Acceso Genbank NC_001590;
véase también Delius y Hofmann, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 186:
13-31 (1994)). La presente invención proporciona
moléculas de ADN sintético que codifican la proteína L1 de HPV45.
Las moléculas sintéticas de la presente invención comprenden una
secuencia de codones, en la que los codones se han alterado para que
usen los codones preferidos por una célula de levadura para la
expresión de elevado nivel. Las moléculas sintéticas pueden usarse
como una secuencia codificante para la expresión de la proteína L1
de HPV45, que pueden auto-ensamblarse en VLP.
Dichas VLP pueden usarse en una vacuna basada en VLP para
proporcionar inmunoprofilaxis eficaz contra infección por
papilomavirus a través de la neutralización de la inmunidad mediada
por anticuerpos y células.
La expresión de VLP de HPV en células de
levadura ofrece las ventajas de ser rentable y adaptarse fácilmente
al cultivo a gran escala en fermentadores. Sin embargo, muchas
proteínas L1 de HPV, incluyendo L1 de HPV45 se expresan a niveles
en células de levadura que son inferiores a los deseables para su
aumento a escala comercial.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a secuencias génicas de L1 de HPV45 que están
"optimizadas" para una expresión de elevado nivel en un
entorno celular de levaduras.
Puede existir un codón "triplete" de cuatro
bases nucleotídicas posibles en más de 60 formas variantes. Como
estos codones proporcionan el mensaje para solamente 20 aminoácidos
diferentes (así como el inicio y terminación de la transcripción),
algunos aminoácidos pueden estar codificados por más de un codón, un
fenómeno conocido como redundancia de codones. Por razones no
completamente comprendidas, los codones alternativos no están
uniformemente presentes en el ADN endógeno de diferentes tipos de
células. De hecho, parece que existe una jerarquía o
"preferencia" natural variable para ciertos codones en ciertos
tipos de células. Como un ejemplo, el aminoácido leucina está
especificado por cualquiera de seis codones de ADN incluyendo CTA,
CTC, CTG, CTT, TTA, y TTG. El análisis exhaustivo de las
frecuencias de uso de codones del genoma para microorganismos ha
revelado que el ADN endógeno de E. coli contiene de forma más
habitual el codín que especifica leucina CTG, aunque el ADN de
levaduras y los mohos del fango más habitualmente incluyen un codón
que específica leucina TTA. En vista de esta jerarquía,
generalmente se cree que la probabilidad de obtener elevados niveles
de expresión de un polipéptido rico en leucina por un huésped de
E. coli dependerá en alguna medida de la frecuencia del uso
de codones. Por ejemplo, es probable que un gen rico en codones TTA
se exprese mal en E. coli, mientras que un gen rico en CTG
probablemente se expresará enormemente en este huésped. Asimismo, un
codón preferido para la expresión de un polipéptido rico en leucina
en células huésped de levadura sería TTA.
Las implicaciones de los fenómenos de
preferencia de codones sobre las técnicas de ADN recombinante son
manifiestas, y el fenómeno puede servir para explicar muchos fallos
anteriores para conseguir elevados niveles de expresión de genes
exógenos en organismos huésped transformados de forma satisfactoria
- puede estar presente repetidamente un codón menos
"preferido" en el gen insertado y la maquinaria de la célula
huésped para la expresión puede ni funcionar de forma tan eficaz.
Este fenómeno sugiere que genes sintéticos que se han diseñado para
que incluyan codones preferidos de la célula huésped proyectada
proporcionan una forma óptima de material genético foráneo para la
práctica de la expresión de proteínas recombinantes. Por tanto, un
aspecto de la presente invención es un gen L1 de HPV45 que tiene
codones optimizados para su expresión de elevado nivel en una célula
de levadura. En una realización preferida de la presente invención,
se ha descubierto que el uso de codones alternativos que codifican
la misma secuencia proteica puede eliminar las limitaciones en la
expresión de proteínas L1 de HPV45 por células de levadura.
De acuerdo con la presente invención, segmentos
del gen L1 de HPV45 se convirtieron en secuencias que tienen
secuencias traducidas idénticas pero con uso de codones alternativo
como se describe por Sharp y Cowe (Synonymous Codon Usage in
Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7: 657-678
(1991)). La metodología consiste generalmente en identificar
codones en la secuencia de tipo silvestre que no estén habitualmente
asociadas con genes de levadura elevadamente expresados y
remplazarlos con codones óptimos para su elevada expresión en
células de levadura. La nueva secuencia génica después se
inspecciona para secuencias indeseadas generadas por estos
reemplazos de codones (por ejemplo, secuencias "ATTTA",
creación involuntaria de sitios de reconocimiento de corte y
empalme de intrones, sitios de enzimas de restricción indeseados,
elevado contenido en GC, presencia de señales de terminación de la
transcripción que reconocen las levaduras, etc.). Las secuencias
indeseables se eliminan por sustitución de los codones existentes
con diferentes codones que codifican el mismo aminoácido. Los
segmentos génicos sintéticos después se ensayan para su expresión
mejorada.
Se usaron los procedimientos descritos
anteriormente para crear segmentos génicos sintéticos para L1 de
HPV45, produciendo un gen que comprende codones optimizados para su
expresión de elevado nivel en un entorno celular de levaduras.
Aunque el procedimiento anterior proporciona un resumen de la
metodología para diseñar genes de codones optimizados para su uso
en vacunas contra HPV, los especialistas en la técnica comprenden
que puede conseguirse una eficacia de vacuna similar o expresión
aumentada de genes por variaciones minoritarias en el procedimiento
o por variaciones minoritarias en la secuencia.
Por consiguiente, la presente invención puede
adaptarse para proporcionar un polinucleótido sintético que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento
biológicamente activo o forma mutante de una proteína L1 de HPV45,
comprendiendo secuencia polinucleotídica codones optimizados para su
expresión en una célula huésped de levadura. Dichas formas mutantes
de la proteína L1 de HPV45 incluyen, aunque sin limitación:
sustitución de aminoácidos conservativas, truncamientos
amino-terminales, truncamientos
carboxi-terminales, deleciones, o adiciones.
Cualquiera de dicho fragmento y/o mutante biológicamente activo
codificará una proteína o fragmento proteico que imita al menos
sustancialmente las propiedades inmunológicas de la proteína L1 de
HPV45 que se expone en la SEC ID Nº 2. Los polinucleótidos
sintéticos de la presente invención codifican moléculas de ARNm que
expresan una proteína funcional L1 de HPV45 para que sea útil en el
desarrollo de una vacuna contra HPV terapéutica o profiláctica.
Un aspecto de la presente invención es una
molécula de ácido nucleico de codones optimizados que codifica la
proteína L1 de HPV45 expuesta en la SEC ID Nº 2, comprendiendo dicha
molécula de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos expuesta en
la SEC ID Nº 1.
La presente invención también se refiere a
vectores recombinantes y células huésped recombinantes, tanto
procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido
nucleico descritas en toda esta memoria descriptiva.
El ADN sintético de HPV45 o fragmentos del mismo
construidos a través de los procedimientos descritos en este
documento pueden expresarse de forma recombinante por clonación
molecular en un vector de expresión que contenga un promotor
adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción
apropiados, y transferirse en células huésped procariotas o
eucariotas para producir L1 de HPV45 recombinante. Las técnicas para
dichas manipulaciones se describen completamente por Sambrook y
col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1989); Current
Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., Green Pub.
Associates and Wiley-Interscience, Nueva York
(1988); Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose y col.,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York,
(1990)).
La presente invención se refiere adicionalmente
a un procedimiento para expresar una proteína L1 de HPV45 en una
célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un vector
que comprende un ácido nucleico expuesto en la SEC ID Nº 1 en una
célula huésped de levadura; y, (b) cultivar la célula huésped de
levadura en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína
L1 de HPV45.
Los genes sintéticos de la presente invención
pueden ensamblarse en un casete de expresión que comprende
secuencias diseñadas para proporcionar una expresión eficaz de la
proteína L1 de HPV45 en la célula huésped. El casete
preferiblemente contiene el gen sintético, con secuencias de control
de la transcripción y la traducción relacionadas unidas de forma
funcional al mismo, tal como un promotor, y secuencias de
terminación. En una realización preferida, el promotor es el
promotor GAL1 de S. cerevisiae, aunque los
especialistas en la técnica reconocerán que puede usarse cualquiera
de otros promotores de levaduras conocidos tales como los promotores
GAL10, GAL7, ADH1, TDH3, o PCK, u otros
promotores génicos eucariotas. Un terminador de la transcripción
preferido es el terminador ADHI de S. cerevisiae,
aunque también pueden usarse otros terminadores de la transcripción
conocidos. La combinación del promotor GAL1 - terminador
ADH1 es particularmente preferida.
Otro aspecto de la presente invención es
procedimientos para producir VLP de HPV45, y procedimientos para
usar VLP de HPV45. Las VLP pueden auto-ensamblarse
cuando L1, la proteína principal de la cápsida de papilomavirus
humanos y animales, se expresa en levaduras, células de insecto,
células de mamífero o bacterias (para una revisión, véase Schiller
y Roden, en Papillomavirus Reviews: Current Research on
Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information,
pág. 101-12 (1996)). También pueden producirse VLP
de HPV morfológicamente indistintas expresando una combinación de
las proteínas de la cápsida L1 y L2. Las VLP están compuestas de 72
pentámeros de L1 en una estructura icosaédrica T=7 (Baker y col.,
Biophys. J. 60(6): 1445-56 (1991)).
Las VLP son morfológicamente similares a
viriones auténticos y son capaces de inducir elevados títulos de
anticuerpos neutralizantes después de su administración en un
animal. La inmunización de conejos (Breitburd y col., J. Virol.
69(6): 3959-63 (1995)) y perros (Suzich y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(25):
11553-57 (1995)) con VLP demostró inducir tanto
anticuerpos neutralizantes como protección contra infección
experimental por papilomavirus. Sin embargo, como las VLP no
contienen el genoma viral potencialmente oncogénico y pueden
auto-ensamblarse cuando se expresan a partir de un
único gen, presentan una alternativa segura al uso de virus vivos
en el desarrollo de vacunas contra HPV (para una revisión, véase
Schiller y Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74
(2000)).
Marais y colaboradores (J. Med. Virol. 60:
331-336 (2000)) describen VLP de HPV 45, que se
produjeron en células de insecto a partir de un gen L1 de HPV45
expresado en baculovirus. La expresión de VLP en células de insecto
no es ventajosa para el desarrollo de vacunas a causa de los
elevados costes asociados. Además, a menudo es difícil aumentar en
escala la expresión de genes L1 de HPV en cultivo celular de insecto
a los grandes volúmenes necesarios para el desarrollo de productos
comerciales. No se han descrito VLP de HPV 45 producidas en células
de levadura. La expresión de VLP de HPV en células de levadura
ofrece las ventajas de ser rentable y adaptarse fácilmente al
cultivo a gran escala en fermentadores. Además, el genoma de
levaduras puede alterarse fácilmente para asegurar la selección de
levaduras transformadas recombinantes con crecimiento y potencial de
expresión aumentados.
Otro aspecto más de la presente invención es un
procedimiento para producir VLP de HPV45, que comprende: (a)
transformar levaduras con una molécula de ADN recombinante que
codifica la proteína L1 de HPV45 o las proteínas L1 + L2 de HPV45;
(b) cultivar la levadura transformada en condiciones que permitan la
expresión de la molécula de ADN recombinante para producir la
proteína de HPV45 recombinante; y (c) aislar la proteína de HPV45
recombinante para producir VLP de HPV45; en el que
la levadura se transforma con un gen L1 de HPV45
de codones optimizados que comprende una secuencia de nucleótidos
expuesta en la SEC ID Nº 1.
También se describe un procedimiento para
inducir una respuesta inmune en un animal que comprende administrar
dichas partículas tipo virus de HPV45 al animal.
Otra utilidad más de la presente invención es un
procedimiento para prevenir o tratar el cáncer cervical asociado a
HPV que comprende administrar a un mamífero una vacuna que comprende
dichas VLP de HPV45.
Esta memoria descriptiva también se refiere a un
procedimiento para fabricar una vacuna que comprende partículas
tipo virus (VLP) de HPV45 producidas por el procedimiento descrito
anteriormente.
En una realización alternativa de este aspecto
de la invención, la vacuna comprende adicionalmente VLP de al menos
un tipo adicional de HPV. En una realización preferida, el al menos
un tipo adicional de HPV se selecciona entre el grupo constituido
por: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51,
HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, y HPV68.
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, la vacuna comprende adicionalmente VLP de HPV16.
En otra realización preferida de la invención,
la vacuna comprende adicionalmente VLP de HPV16 y VLP de HPV18.
En otra realización preferida de la invención,
la vacuna adicionalmente comprende opcionalmente VLP de HPV6 y VLP
de HPV11 y/o adicionalmente VLP de HPV31.
En otra realización preferida más de la
invención, la vacuna comprende adicionalmente VLP de HPV6, VLP de
HPV11, VLP de HPV16 y VLP de HPV18.
Dichas vacunas pueden usarse solas a
dosificaciones apropiadas definidas por ensayo rutinario para
obtener la inhibición óptima de la infección por HPV45 minimizando
al mismo tiempo cualquier toxicidad potencial. Además, puede ser
deseable la co-administración o administración
secuencial de otros agentes.
La cantidad de partículas tipo virus a
introducir en un destinatario de la vacuna dependerá de la
inmunogenicidad del producto génico expresado. En general, se
administra una dosis inmunológica o profilácticamente eficaz de
aproximadamente 10 \mug a 100 \mug, y preferiblemente de
aproximadamente 20 \mug a 60 \mug de VLP directamente en tejido
muscular. También se contempla la inyección subcutánea, introducción
intradérmica, impresión a través de la piel, y otros modos de
administración tales como suministro intraperitoneal, intravenoso,
o por inhalación. También se contempla que pueden proporcionarse
vacunaciones de refuerzo. También es ventajosa la administración
parenteral, tal como intravenosa, intramuscular, subcutánea u otros
medios de administración con adyuvantes tales como alumbre o
adyuvante de aluminio de Merck, al mismo tiempo con o después de la
introducción parenteral de la vacuna de la presente invención.
Los siguientes ejemplos ilustran, aunque no
limitan la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La secuencia de L1 de HPV 45 se ha descrito
previamente (Nº de Acceso Genbank NC_001590; véase Delius y Hofmann
Curr. Top. Microbiol. Immunol. 186: 13-31 (1994)).
No es poco común, sin embargo, encontrar variaciones de secuencia
minoritarias entre ADN obtenidos de aislados clínicos. Para
determinar una secuencia de tipo silvestre representativa de L1 de
HPV45, se aisló el ADN de cuatro muestras clínicas que habían
demostrado previamente que contenían ADN de HPV 45. Las secuencias
de L1 de HPV 45 se amplificaron en una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) usando la ADN polimerasa Taq y los
siguientes cebadores: HPV 45 L1 F 5' - C C A C C A C C A C C
T A T A T A G G T A T T C - 3' (SEC ID Nº 4) y HPV45 L1 B 5'
- C A A A C A T A C A T A T A T G T G C T A A C A - 3 ' (SEC ID Nº
5). Los productos amplificados se sometieron a electroforesis en
geles de agarosa y se visualizaron por tinción con bromuro de
etidio. Las bandas de L1 de - 1500 pb se escindieron y se purificó
el ADN usando el kit de purificación por PCR rápida QIA (Qiagen,
Hilden, Alemania). Después se ligó el ADN a un vector de clonación
TA (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), se transformó E. coli
con la mezcla de ligamiento y se sembró en agar LB con ampicilina
más IPTG y X-gal para la selección de colonias
azules/blancas. Las placas se invirtieron y se incubaron durante 16
horas a 37ºC.
Se realizó una PCR de colonias sobre ocho
colonas blancas originadas a partir de los cuatro aislados clínicos
que se habían amplificado por PCR. El ADN de L1 de HPV 45 se
amplificó por PCR usando los cebadores HPV 45 L1 F y HPV 45 L1 B.
El protocolo de PCR específico contaba de 25 ciclos de 15 segundos a
98ºC (desnaturalización), 30 segundos a 50ºC (hibridación) y 2
minutos a 68ºC (extensión). Los productos de PCR se visualizaron por
tinción con bromuro de etidio después de electroforesis en gel de
agarosa. Varias colonias de cada aislado contenían bandas de L1. La
segunda colonia de cada aislado se cultivó en medio LB con
ampicilina, agitando a 37ºC durante 16 horas. Se realizaron
minipreparaciones para extraer el ADN plasmídico de las
colonias.
Se realizó la secuenciación del ADN en los
plásmidos que contenían el ADN de L1 de HPV 45 amplificado y clonado
de los cuatro aislados clínicos. Las secuencias de ADN y
aminoácidos traducidas se compararon entre sí y las secuencias de
L1 de HPV 45 de Genbank. El análisis de secuencia de los cuatro
aislados clínicos reveló que ninguna secuencia era idéntica a la
secuencia de Genbank. Se eligió el plásmido de L1 de HPV 45 del
aislado nº 33 como la secuencia representativa 45 L1 de tipo
silvestre (wt) y se menciona en este documento como la "secuencia
45 L1 de tipo silvestre" (SEC ID Nº 3, véase la Figura 1). Esta
secuencia contenía una deleción de nueve nucleótidos, tres
aminoácidos, que mantenía la fase de lectura de la secuencia
posterior, cinco mutaciones puntuales que producían cinco cambios
de aminoácidos y ocho mutaciones puntuales silenciosas adicionales.
Los aminoácidos 495-497 de la secuencia de Genbank
están delecionados en 45 L1 wt. Los aminoácidos de Genbank números
23 (S\rightarrowN), 55 (N\rightarrowS), 303 (I\rightarrowT),
357 (S\rightarrowN), y 356 (Q\rightarrowH) representan los
cinco cambios de aminoácidos (aa de Genbank \rightarrow aa de 45
L1 wt). Las 8 mutaciones silenciosas estaban distribuidas en toda
la secuencia. Véase la Figura 1.
La secuencia 45 L1 de tipo silvestre se
amplificó usando los cebadores LS-112 5' - C
T C A G A T C T C A C A A A A C A A A A T G G C T T T G T G G C G G
C C T A G T G A C - 3' (SEC ID Nº 6) y HPV 45 L1 EAS 5' - G
A C A G A T C T T A T T T T T T A C T A C G T A T A C G T A C A C G
- 3' (SEC ID Nº 7) para añadir extensiones BglII. La PCR se
realizó usando la polimerasa Vent. El producto de PCR se
visualizó por tinción con bromuro de etidio de un gel de agarosa.
La banda de - 1500 pb se escindió y se purificó el ADN usando el kit
de extracción de gel QIAEX II (Qiagen). El producto de PCR después
se digirió con BglII a 37ºC durante 2 horas y se purificó
usando el kit de purificación de PCR rápida QIA. El producto de PCR
de L1 de HPV 45 digerido con BglII se ligó a pGAL110
digerido con BamHI (descrito en Hofmann y col., Virology 209:
506-18 (1995)) y se transformó E. coli DH5
con la mezcla de ligamiento.
Las colonias se exploraron por PCR para el
inserto de L1 de HPV 45 en la orientación correcta. La secuencia y
la orientación se confirmaron por secuenciación de ADN. El clon
seleccionado se llamó pGAL110-HPV 45 L1 nº 6. Este
clon se digirió con PstI, EcoRI y HindIII para
determinar el perfil de fragmentos de restricción del gen L1 de HPV
45 en el vector pGAL110. Los fragmentos de ADN se sometieron a
electroforesis en geles de agarosa. El perfil de fragmentos de
restricción resultante se visualizó por tinción con bromuro de
etidio y se vio con luz UV.
Se preparó una maxipreparación de ADN. Células
de Saccharomyces cerevisiae se hicieron competentes por
formación de esferoplastos con Glusulasa y se transformaron con
pGAL110-HPV 45 L1 nº 6. La mezcla de transformación
de levaduras se sembró en agar con superficie de sorbitol Leu(-) en
placas de sorbitol Leu(-) y se incubaron invertidas durante
5-7 días a 30ºC. Las colonias se tomaron y se
sembraron en estrías para el aislamiento clonal en placas de
sorbitol Leu(-). Las colonias aisladas se cultivaron posteriormente
en 5 ml de sorbitol Leu(-) Ade(-) 5 X con glucosa al 1,6% y
galactosa al 4% en cultivos de tubo rotatorio a 30ºC para inducir
al transcripción y expresión proteica
de L1.
de L1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se han descrito los codones preferidos por
levaduras (Sharp, Paul M y Cowe, Elizabeth 1991 Synonymous Codon
Usage in Saccharomyces cerevisiae YEAST 7:
657-678). La expresión de la proteína L1 wt de HPV
45 era detectable; sin embargo, para obtener la expresión aumentada
necesaria para el desarrollo de productos comerciales, se
reconstruyó el gen L1 de HPV 45 utilizando codones preferidos por
levaduras. Dicha secuencia reconstruida proporcionaría expresión
aumentada de L1 de HPV45, que sería un avance significativo sobre el
tipo silvestre para su uso en el desarrollo de vacunas. Cuando se
reconstruyó la secuencia utilizando secuencias de codones
optimizados para levaduras, la secuencia de nucleótidos de 45 L1 wt
se alteró en 392 posiciones para producir 45 L1 R (R =
reconstrucción). La secuencia de aminoácidos, sin embargo, no estaba
alterada. Las secuencias de nucleótidos (SEC ID Nº 1) y aminoácidos
(SEC ID Nº 2) de L1 R de HPV 45 se muestran en la Figura 2.
La estrategia empleada para reconstruir el gen
fue diseñar largos oligómeros con sentido y antisentido solapantes
que abarcan el gen, sustituyendo los nucleótidos con secuencias de
codones preferidos de levaduras manteniendo al mismo tiempo la
secuencia de aminoácidos original. Estos oligómeros se usaron en
lugar del ADN molde en una reacción de PCR. Se diseñaron cebadores
de amplificación adicionales y se usaron para amplificar las
secuencias reconstruidas a partir de los oligómeros de molde. Se
usó la ADN polimerasa Pfu en la PCR de 25 ciclos.
Las condiciones óptimas para la amplificación
era específicas de sección, sin embargo la mayoría empleaban un
programa que se parece a 94ºC durante 5 minutos (desnaturalización)
seguido de 25 ciclos de 95ºC durante 30 segundos
(desnaturalización), 55-50ºC durante 30 segundos
(hibridación), y 72ºC durante 1,5 minuto (extensión), seguido de
una extensión final de 7 minutos a 72ºC y 4ºC mantenida. Los
productos de PCR se examinaron por electroforesis en gel de
agarosa. Las bandas del tamaño apropiado se escindieron y se
purificó el ADN en gel. Los fragmentos amplificados después se
usaron como molde para ensamblar el gen L1 de HPV 45 reconstruido de
1533 nt.
Después de la reconstrucción, se purificó en gel
la banda de 1533 nt, se ligó a pCR4 Blunt (Invitrogen) y se
transformaron células de E. coli TOP10 con la mezcla de
ligamiento. Las colonias se cultivaron en 4 ml de LB con ampicilina
y el ADN plasmídico se extrajo por técnicas de minipreparación
convencionales. Se secuenció el ADN plasmídico para confirmar la
presencia de los cambios deseados para la reconstrucción 45 L1. La
45 L1 R (reconstrucción) se re-amplificó a partir de
pCR4Blunt-45 L1 R para añadir extensiones
BamHI a ambos extremos más una secuencia líder no traducida
5' de levaduras cadena arriba del codón de inicio ATG. El fragmento
amplificado se clonó como anteriormente y se secuenció el ADN
plasmídico. El plásmido, pCR4 Blunt-45 L1 R (Bam),
se digirió con BamHI y los fragmentos de ADN se sometieron a
electroforesis en un gel de agarosa. El fragmento 45 L1 R (Bam) de
-1550 pb se purificó en gel, se ligó a pGAL110 digerido con
BamHI y se introdujo por transformación en TOP10F' E.
coli (Invitrogen).
Las colonias se exploraron por PCR para el
inserto L1 R de HPV 45 en la orientación correcta en pGAL110. La
secuencia y la orientación se confirmaron por secuenciación de ADN.
Se preparó una maxipreparación de ADN plasmídico y se usó para la
transformación de células de S. cerevisiae que se habían
hecho competentes por formación de esferoplastos. Las levaduras
transformadas se sembraron en agar con superficie de sorbitol
Leu(-) en placas de sorbitol Leu(-), que se incubaron invertidas
durante 7 días. Las colonias se sembraron en estrías para el
aislamiento clonal en placas de sorbitol Leu(-). Las colonias
aisladas se cultivaron posteriormente en 5 ml de sorbitol
Leu(-)
Ade(-) 5 X con glucosa al y galactosa 4% en cultivos de tubo rotatorio a 30ºC para inducir la transcripción y expresión proteica de L1. Después de 48 horas, se sedimentó un volumen de cultivo equivalente a una DO_{600} = 10, se retiró el sobrenadante y se congelaron los sedimentos y se almacenaron a 70ºC.
Ade(-) 5 X con glucosa al y galactosa 4% en cultivos de tubo rotatorio a 30ºC para inducir la transcripción y expresión proteica de L1. Después de 48 horas, se sedimentó un volumen de cultivo equivalente a una DO_{600} = 10, se retiró el sobrenadante y se congelaron los sedimentos y se almacenaron a 70ºC.
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Ejemplo
3
Los sedimentos celulares de levaduras
transformadas inducidas a expresar L1 de HPV 45 por inducción con
galactosa se descongelaron en hielo, se suspendieron en 0,8 ml de
reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) y se incubaron a
temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió un volumen de un
quinto de cloroformo al vial. Después se agitó vigorosamente
durante 15 segundos para mezclar y se incubó a temperatura ambiente
durante 3 minutos. Después de una centrifugación de 5 minutos a 13
k rpm, la fase superior se recogió y se transfirió a un nuevo vial.
Se añadieron 0,4 ml de isopropanol y se incubaron a temperatura
ambiente durante 10 minutos. La centrifugación para sedimentar el
ARN se realizó a 13 k rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se
decantó, se lavó el sedimento de ARN con EtOH al 75% y se repitió
la centrifugación. Se decantó el sobrenadante y se dejó que el
sedimento de ARN se secara al aire durante 15 minutos seguido de
suspensión en agua libre de RNasa. Se realizó una
espectrofotometría para determinar la concentración de ARN en la
muestra usando la suposición de que una lectura de A_{260} a 1 =
40 \mug/ml de ARN cuando la A_{260/2}80 es
1,7-2,0.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se moldeó un gel de
agarosa-formaldehído al 1,1%. Se combinaron cinco y
diez microgramos de ARN con tampón desnaturalizante
(concentraciones finales: formaldehído al 6%, formamida al 50% y
MOPS 0,1 x) y se calentaron a 65ºC durante 10 minutos. Se añadió un
volumen de un décimo de tampón de carga de gel y se cargó la muestra
en el gel. La electroforesis se realizó a 75 voltios en tampón MOPS
1 x durante - 3 horas. El gel se lavó durante 60 minutos en SSC 10
x.
El ARN se transfirió a una membrana de nylon
Hybond-N+ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) por
acción capilar durante 16 horas en SSC 10 x. El ARN después se fijó
a la membrana de nylon por reticulación usando la función de
auto-reticulación del Stratagene UV Stratalinker
(Stratagene La Jolla, CA). Después de la fijación, se dejó que la
membrana de nylon se secara al aire.
Se usó el Kit I de Marcaje y Detección de ADN
Roche DIG High Prime (F. Hoffmann-La Roche Ltd.,
Basel, Suiza) para marcar secuencias de ADN de 45 L1 R con DIG a
usar como sonda para detectar el ARN de 45 L1 R en la transferencia
de Northern. La pre-hibridación, hibridación y
desarrollo inmunológico usando un anticuerpo conjugado con
fosfatasa alcalina anti-DIG se realizaron según las
recomendaciones del fabricante. En resumen, la transferencia se
pre-hibridó a 37ºC durante 30 minutos con agitación
suave. Se desnaturalizó la sonda calentando a 95ºC durante 5
minutos e inactivando en hielo. Se añadió la sonda a la solución de
hibridación y se aplicó a la membrana durante 4 horas a 44,6ºC con
agitación suave. Después se retiró la solución de hibridación y la
transferencia se lavó dos veces durante 5 minutos en SSC 2 x con
SDS al 0,1% a temperatura ambiente, seguido de un lavado adicional
a 65ºC con SSC 0,5 x y SDS al 0,1%. Después se bloqueó la
transferencia durante 30 minutos y se aplicó anticuerpo conjugado
con fosfatasa alcalina anti-DIG a una dilución
1:5000 durante 30 minutos. La transferencia se lavó y se determinó
la presencia de ARN unido a la sonda por detección del sustrato
NBT/BCIP del anticuerpo unido anti-DIG conjugado
con fosfatasa alcalina.
El análisis inicial de levaduras que expresan 45
L1 wt sugirió que había transcripción y traducción de L1 de HPV 45
funcional; sin embargo, la secuencia estaba reconstruida con
secuencias de codones preferidos de levaduras para obtener un nivel
aumentado de expresión, útil para el desarrollo de vacunas. La
secuencia 45 L1 reconstruida estaba diseñada para omitir cualquier
posible sitio de terminación de la transcripción prematuro para
asegurar una transcripción robusta. El análisis de transferencia de
Northern del transcrito 45 L1 R reveló que se generaban transcritos
de longitud completa (Figura 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se descongelaron en hielo sedimentos celulares
de levadura congelados de cultivos inducidos con galactosa
equivalentes a DO_{600}= 10, y se suspendieron en 300 \mul de
tampón PC (Na_{2}HPO_{4} 100 mM y NaCl 0,5 M, pH 7,0) con PMSF
2 mM. Se añadieron perlas de vidrio de 0,5 mm lavadas en ácido, ~0,5
g/tubo. Los tubos se agitaron con nórtica durante 3 ciclos de 5
minutos a 4ºC con una pausa de 1 minuto. Se añadieron 7,5 \mul de
TritonX100 al 20% y se repitió la agitación con vórtice durante 5
minutos a 4ºC. Los tubos se pusieron en hielo durante 15 minutos, y
después se centrifugaron durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante
se transfirió a un tubo de microfuga estéril, se etiquetó como
extracto proteico de levaduras total, se fechó y se almacenó a
-70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se analizó el extracto proteico de levaduras
total de veinte colonias de levadura aisladas para cada construcción
45 L1 por transferencia de Western para confirmar la expresión de
proteína 45 L1 después de la inducción con galactosa.
Se combinaron diez microgramos de extracto
proteico de levaduras total con tampón de carga de
SDS-PAGE y se calentaron a 95ºC durante 10 minutos.
Las proteínas se cargaron en un gel de SDS-PAGE al
10% y se sometieron a electroforesis en tampón
Tris-Glicina. Después de la separación de proteínas,
las proteínas se sometieron a transferencia de Western desde el gel
a nitrocelulosa y se bloqueó la transferencia en tampón diluyente 1
x (Kirkegaard and Perry Laboratories) durante 1 hora a temperatura
ambiente con balanceo. La transferencia se lavó tres veces y
después se incubó con una dilución 1:2500 de suero de cabra
anti-trpE-L1 de HPV 45 a
temperatura ambiente durante 16 horas. La transferencia después se
lavó tres veces y se incubó con una dilución 1:2500 de anticuerpo
anti-cabra conjugado con HRP durante 1 h. La
transferencia se lavó de nuevo tres veces y se aplicó sustrato de
detección NBT/BCIP (Kirkegaard and Perry Laboratories). Las
proteínas inmunorreactivas se detectaron en forma de bandas púrpura
sobre la transferencia.
Los resultados demuestran que en todos los
casos, se detectó la proteína 45 L1 como una banda inmunorreactiva
distinta sobre la nitrocelulosa correspondiente a aproximadamente 57
kDa (Figura 4). La proteína 16 L1, que es de aproximadamente 55
kDa, se incluyó como control positivo, junto con extracto proteico
de levaduras total libre de L1 de HPV como control negativo (datos
no mostrados).
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Ejemplo
7
Las células de levadura que expresan L1 de HPV
45 se cultivaron por una diversidad de procedimientos incluyendo
cultivos de tubo rotatorio, matraces de agitación y fermentadores.
Las levaduras se lisaron y se prepararon extractos proteicos para
determinar la cantidad de partículas tipo virus (VLP) de L1 de HPV
45 producida por microgramo de proteína total. Se diseñó un ELISA
tipo sándwich para demostrar la expresión de VLP de L1 de HPV
45.
El anticuerpo monoclonal (mAb) H18R.5, que
reconoce VLP de L1 de HPV de tipo tanto 18 como 45, se usó para
unirse a las VLP de 45 L1 encontradas en los extractos proteicos de
levadura. Las proteínas no unidas se lavaron y se aplicó
H45.10B11.A5 un mAb específico del tipo de VLP de L1 de HPV 45 y de
conformación, como anticuerpo de detección. Se unieron VLP 45 L1
verdaderas, conformacionalmente correctas y se facilitó la detección
por el uso de un anticuerpo anti-IgG1 de ratón
conjugado con HRP y sustrato TMB.
Específicamente, se usó H18R.5 para revestir el
fondo de placas de 96 pocillos Immulon 4 HBX durante una noche a
4ºC. Las placas se lavaron tres veces con PBS y Tween 20 al 0,05%,
seguido de bloqueo con solución de bloqueo (PBS + Tween 20 al 0,05%
+ BSA al 1%). Las placas se lavaron tres veces y se aplicaron
antígenos (lisados de células de levadura totales diluidos en
solución de bloqueo a 100 \mu/ml), a la fila A por duplicado. Se
aplicaron patrones de referencia de VLP de L1 de HPV 45 purificadas
a la fila A columnas 1 y 2 a 3300 ng/ ml en 100 \mug/ml de
proteína de levadura total. Las muestras de referencia y de ensayo
después se diluyeron en serie de factor dos hacia abajo en cada
columna. Después de tres horas a temperatura ambiente se retiró el
exceso de antígeno por aspiración y la placa se lavó 3 veces. El
sobrenadante celular que contenía el mAb específico de conformación
para VLP de L1 de HPV 45 H45.10B11.A5 se diluyó 1:80 en solución de
bloqueo y se aplicó a cada pocillo durante una hora a temperatura
ambiente. Las placas se lavaron tres veces y se aplicó un
anticuerpo anti-IgG1 de ratón conjugado con HRP
diluido 1:8000 en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura
ambiente. Las placas se lavaron y se aplicó TMB (Pierce) durante 5
minutos para detectar los complejos de anticuerpo conjugados con
HRP. La reacción de detección se detuvo por la adición de
H_{2}SO_{4} 2 M. Las placas se leyeron a una longitud de onda
de 450 nm y se determinó la concentración de VLP de L1 de HPV 45
por comparación con los patrones de referencia en ng de VLP/\mug
de proteína
total.
total.
Se muestra una comparación entre 45 L1 wt y dos
clones diferentes de 45 L1 R, todos ensayados por duplicado, en la
Figura 5. La expresión de VLP de L1 de HPV 45 reconstruido era
aproximadamente 2 veces mayor que los resultados observados para 45
L1 wt (Figura 6).
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Ejemplo
8
Para demostrar que la proteína 45 L1 de hecho se
auto-ensamblaba para formar capsómeros pentaméricos
de L1, que a su vez se auto-ensamblan en partículas
tipo virus, se analizó un extracto proteico de 45 L1 R parcialmente
purificado por ME de transmisión.
Se cultivaron células de levadura en condiciones
de fermentación a pequeña escala, se sedimentaron y los sedimentos
se sometieron a tratamientos de purificación. El sedimento y los
extractos de levadura aclarados se analizaron por
inmunotransferencia para demostrar la expresión y retención de
proteína L1 a través del procedimiento de purificación. Los
extractos de levadura aclarados después se sometieron a
centrifugación en un lecho de sacarosa al 45% y el sedimento
resultante se suspendió en tampón para su análisis por microscopía
electrónica (ME) de transmisión.
Se muestra una muestra representativa de las VLP
de 45 L1 R producidas en la Figura 6. El diámetros de las
partículas esféricas en esta muestra en bruto variaba entre 40 y 60
nm presentando algunas partículas una serie regular de
capsómeros.
<110> Merck & Co., Inc.
\hskip1cmBryan, Janine T.
\hskip1cmBrownlow, Michelle K.
\hskip1cmSchultz, Loren D.
\hskip1cmJansen, Kathrin U.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> EXPRESIÓN OPTIMIZADA DE L1 DE HPV 45
EN LEVADURAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21500-PCT.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/506.812
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
29-09-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1533
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L1R de HPV45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 510
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del Papiloma Humano Tipo
45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1533
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del Papiloma Humano Tipo
45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaccaccac ctatataggt attc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaacataca tatatgtgct aaca
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcagatctc acaaaacaaa atggctttgt ggcggcctag tgac
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacagatctt attttttact acgtatacgt acacg
\hfill35
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<210> 8
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<211> 1533
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L1R de HPV45 - Antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
Claims (13)
1. Una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína L1 de HPV45
expuesta en la SEC ID Nº 2, estando la secuencia de ácido nucleico
expuesta en la SEC ID Nº 1.
2. Un vector que comprende la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 1.
3. Una célula huésped que comprende un vector de
la reivindicación 2.
4. La célula huésped de la reivindicación 3, en
la que la célula huésped se selecciona entre el grupo constituido
por: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha,
Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis,
Kluyveromyces lactis, y Schizosaccharomyces pombe.
5. Un procedimiento para producir partículas
tipo virus (VLP) de L1 de HPV45, que comprende:
(a) transformar levaduras con una molécula de
ADN de acuerdo con la reivindicación 1;
(b) cultivar las levaduras transformadas en
condiciones que permitan la expresión de la molécula de ADN para
producir una proteína de papilomavirus recombinantes; y
(c) aislar la proteína de papilomavirus
recombinante para producir las VLP de L1 de HPV45.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en
el que la levadura se selecciona entre el grupo constituido por
Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polimorpha,
Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis,
Kluyveromyces lactis, y Schizosaccharomyces pombe.
7. Un procedimiento para fabricar una vacuna
para el tratamiento o prevención de infecciones por HPV que
comprende la producción de VLP de L1 de HPV45 por el procedimiento
de la reivindicación 5.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en
el que la vacuna comprende VLP de al menos un tipo adicional de
HPV.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que el al menos un tipo adicional de HPV se selecciona entre el
grupo constituido por: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33,
HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, y
HPV68.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que el al menos un tipo de HPV comprende HPV16.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que la vacuna comprende adicionalmente VLP de HPV18.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que la vacuna comprende adicionalmente VLP de HPV6 y VLP de
HPV11.
13. El procedimiento de la reivindicación 11 o
reivindicación 12, en el que la vacuna comprende adicionalmente VLP
de HPV31.
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